KR20060114326A - 티로시나아제 돌연변이 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 티로시나아제 단백질 및 이의 사용 방법을 기술한다. 구체적으로, 본 발명은 티로시나아제 유도된 펩타이드, 및 면역 반응을 유도하고 흑색종을 치료하는 이들의 능력을 제공한다.

Description

티로시나아제 돌연변이 및 이의 사용 방법{TYROSINASE MUTANT AND METHODS OF USE THEREOF}

본 발명은 가용성 단백질 돌연변이 및 가용성 단백질 돌연변이를 이용한 질병 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 가용성 티로시나아제 및 흑색종의 치료에서 이의 용도를 기술한다.

악성 흑색종의 발병률은 북아메리카에서 임의의 다른 유형의 인간 암 보다 신속하게 증가하고 있다 (Armstrong et al. (1994) Cancer Surv. 19-20:219-240). 흑색종은 치료가능한 암이지만, 일차적 종양은 질병 진행의 아주 초기 단계, 즉 원거리 부위로 전이되기 전에 제거되어야 한다. 미세한 전이암의 존재는 결과적으로 징후적 전이로 종종 이어질 수 있다. 따라서, 흑색종의 치료 방법을 고안할 필요가 있다.

따라서, 본 발명자들은 티로시나아제 경막 도메인의 존재 및 부재 하에서 구상 도메인의 접힘(folding) 경로를 연구하였다. 티로시나아제 (모노페놀, 3,4-디히드록시페닐알라닌: 산소 옥시도리덕타아제, EC 1. 14.18. 1)는 ER의 존재하에 성숙 분열 품질 제어(maturation quality control)가 잘 알려져 있는 타입 I 막 당단백질이다 (Petrescu et al., 2000; Halaban et al., 1997; Toyofuku et al., 2001; Branza-Nichita et al., 2000). 티로시나아제는 일반적으로 색소 생성 세포 (멜라노사이트)로서 독점적이며 흑색종에서 감별 항원(differentiation antigen)이다. 본 발명자들은 놀랍게도 경막 도메인이 부족한 가용성 티로시나아제 돌연변이가 ER 내에 보유됨을 발견하였다. 이 돌연변이는 프로테오좀에 의해 분해되며 MHC 클래스 I 분자에 의해 세포 표면 상에 나타난다.

진핵 세포에서 가용성 및 막-결합 당단백질의 접힘은 발생기의 폴리펩타이드 사슬이 트랜스로콘 공극(translocon pore)을 통해 ER 루멘으로 전위되면서 시작된다. (Hardesty et al., 1999). 상기 공정은 ER-거주 샤페론(chaperone)의 존재 하에 반복된 접힘 및 재접힘 단계에 의해 포스트-트랜스레이셔널하게 지속되며 ER을 나올 수 있는 생성물을 초래한다 (Trombetta and Helenius, 1998, Chen and Helenius, 2000). 이상 접힘 및 부적절하게 어셈블링된 단백질들은 보통 세포질 내로 재귀-전위되어 프로테아좀에 의해 분해된다 (Brodsky, 1997).

비부착성(anchor-free, 가용성)이며 막-결합된 단백질의 접힘 경로는 경막 도메인 (TM)의 지질 이중층으로 삽입과 관련된 사건 때문에 실질적으로 다를 수 있다. 트랜스로콘은 전위 동안 단백질 사슬을 위한 샤페론으로서 보호적이고 제한적인 환경 작용 그 자체를 제공하는 것으로 알려져 있다 (Chen and Helenius, 2000). 최근, TM 은 ER 지질 이중층 내로 직접적으로 통합할 수 없음이 밝혀졌다 (Mothes et al., 1997). 대신에, TM 도메인은 합성에 의해 수성 채널로 방출되며 측면 확산을 통해 지질 이중층으로 삽입된다. 확산 공정의 발생에 의한 효율성 및 속도는 TM 도메인의 소수성에 의존한다 (Heinrich et al., 2000). 예를 들어, 발생기의 사슬 은 TM 영역이 덜 소수성인 경우 보다 장시간 동안 트랜스로콘에 유지될 수 있다. 따라서, 트랜스로콘 내부 또는 근접 부위에서 발생기의 사슬에 의해 소비된 시간은 TM 영역의 아미노산 조성에 의존할 수 있다.

이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 TM 도메인이 전위 동안 발생하는 접힘과 관련된 사건에 있어서 추진력으로서 작용할 수 있음을 이론화시켰다. ER 루멘 내의 발생기의 사슬의 접힘은 렉틴 샤페론인 칼넥신 (CNX) 및 칼레티쿨린 (CRT)에 의한 모노글리코실화 N-글리칸의 인지에 기초한 품질 제어에 의해 치밀하게 조절된다 (Helenius and Aebi, 2001, Schrag et al., 2001). 연구는 품질 제어도 TM 도메인의 지질 이중층으로의 어셈블링을 모니터하고 있다는 것을 보여주는 반면 (Cannon and Creswell, 2001), 막 단백질의 접힘 과정에 있어서 TM 도메인의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

TM 도메인의 역할을 추가로 연구하기 위해, 본 발명자들은 트래피킹(trafficking)이 ER 수준에서 중지된 인간 티로시나아제 돌연변이를 구축하였다. 즉, 돌연변이 티로시나아제는 잘못 접히게되며 품질 제어 시스템에 의해 ER 내에 유지된다. 따라서, 돌연변이 티로시나아제는 분해를 위해 프로테아좀으로 재귀-전위되며, 분해에 이어서, 생성된 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자에 의해 세포 표면 상에 제공된다. 이와 같이, 본 발명의 돌연변이 티로시나아제는 흑색종 세포에 대한 CTL의 면역 반응을 향상시키도록 고안된 백신 약물로서 흑색종 면역치료에 사용될 수 있다.

면역 반응의 중요한 측면은, 특히 백신 효용성과 관련하여, 면역 시스템의 특징화된 세포에 의해 인식될 수 있도록 항원이 처리되는 방법이다. 특징적인 항원 처리 및 표시 경로가 이용되며 따라서, MHC 클래스 II 또는 클래스 I 분자에 의해 헬퍼 T 임파구 또는 세포독성 T 임파구 각각으로의 특정 항원의 세포 표면 표시는, 항원 처리 경로에 의존한다.

한 경로는 시토졸 경로인데, 이는 내인성 항원이 세포 내에서 발현되도록 처리한다. 항원은 세포의 시토졸 내에 특정화된 프로테아제 복합체에 의해 분해되며, 생성된 항원 펩타이드는 소포체 내로 운송된다. 이는 MHC 클래스 I 분자로의 항원 결합을 야기한다. 교차-제시(cross-표시)에 의해, 외인성 항원은 전문적인 항원 표시 세포의 세포질 내에서 처리될 수 있어 MHC 클래스 I 분자에 결합한다.

대안적인 경로는 소포체 경로인데, 이는 시토졸을 우회한다. 소포체에서, 항원 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자에 결합한 후, 면역 시스템의 세포독성 T 임파구에의 표시를 위해 세포 표면으로 운송된다. 일부 연구들은 면역 시스템에 의한 암의 생성 및 제거 모두에 있어서 세포독성 T 세포의 결정적 역할에 초점을 맞추고 있다 (Byrne et al., J. Immunol. 51:682 (1984); McMichael et al., N. Engl. J. Med. 309:13 (1983)). 세번째 경로는 세포 이물 흡수(endocytic) 경로로서, 전문적인 항원 표시 세포에서 발생하며, 이는 MHC 클래스 II 분자에 항원 결합을 초래하는 세포 외부에 존재하는 항원을 처리한다. 이러한 항원은 세포 이물 흡수(endocytosis)에 의해 세포 내로 수취되어, 항원을 엔도좀으로 보낸 후 리소좀으로 보낸다. 이어서, 항원은 프로테아제에 의해 분해되어 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 항원 펩타이드로 된 후 면역 시스템의 헬퍼 T 임파구에 제공을 위해 세포 표면으로 운송된다.

발명의 개요

본 발명에서는 가용성 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드가 고려되는데, 여기에서 티로시나아제 돌연변이는 소포체 내에 축적하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 티로시나아제 돌연변이는 칼넥신에 대해 감소된 친화성을 가진다. 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인 또는 하나 이상의 글리코실화 부위가 부족한 것이 또한 바람직하다. 가장 바람직하게는, 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체, 바람직하게는 보존적으로 치환된 변형체 또는 결실 단편에 의해 코딩된다.

관련 특성에 있어서, 소포체 내에 축적할 수 있는 가용성 티로시나아제 돌연변이인 흑색종 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 기술되어 있다. 바람직하게는, 흑색종 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 경막 도메인 또는 하나 이상의 글리코실화 부위가 부족하다.

티로시나아제 돌연변이는 칼넥신에 대해 감소된 친화성을 가지는 것이 또한 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에 나타난 서열을 포함한다.

소포체 내에 축적할 수 있는 가용성 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 본 발명에 개시되어 있다. 바람직하게는, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 부족하며 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩된다. 마찬가지로, 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신도 기술되어 있다.

다른 구체예에서, 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포가 고려된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에 기술된 서열, 또는 이의 변형체를 포함한다.

항원 표시 세포에 폴리펩타이드 또는 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 투여 및 세포독성 임파구 면역 반응의 유도를 포함하는 흑색종의 치료 방법, 및 경막 도메인이 결핍된 인간 티로시나아제의 절단된 형태의 구축을 포함하는 가용성 티로시나아제 돌연변이의 제조 방법도 기술되어 있다.

도면의 간단한 설명

도 1. 가용성 티로시나아제가 ER 내에 보유되며 프로테아좀에 의해 분해됨을 보여주는 파동 추적 실험( Pulse - chase experiment )

ST cDNA로 감염된 CHO 세포를 20분 동안 [³⁵S]로 펄스화하고 지정된 시간 동안 20μM의 락타시스틴의 부재 (레인 1-8) 또는 존재 (레인 9-16)하에 추적하였다. 세포 용해물을 T311 모노클로날 항체로 면역 침전시키고 면역 침전 샘플을 반으로 분할하고 (+)로 또는 (-) EndoH 로 소화시켰다. 샘플들을 환원 10% SDS-PAGE 겔 상에서 러닝하고 방사선 사진 촬영하여 시각화하였다. 분자 질량 마커는 도면의 우측에 나타내었다.

도 2. 야생형 ( WT ) 티로시나아제가 ER 로부터 배출되는 것을 보여주는 파동 추적 실험

WT 감염된 세포를 20분 동안 [³⁵S]로 펄스화하고 지정된 시간 동안 20μM의 락타시스틴의 부재 (레인 1-4) 또는 존재 (레인 9-12)하에 추적하였다. 레인 5-8의 샘플을 EndoH 로 소화시켰다. 세포 용해물을 T311 항혈청으로 면역 침전시켰다. 샘플들을 환원 10% SDS-PAGE 겔 상에서 러닝하고 방사선 사진 촬영하여 시각화하였다.

도 3. 칼넥신 및 칼레티쿨린과 WT 및 ST 티로시나아제의 회합을 보여주는 파동 추적 실험

ST (레인 1-10) 또는 WT (레인 11-20)로 감염된 CHO 세포를 [³⁵S]로 20분 펄스화 전에 1시간 동안 스타베이션 버퍼(starvation buffer)에서 배양하였다. 이후 세포를 지정된 시간 동안 추적하고 세포 용해물을 항-티로시나아제 항체 (T311 항체) 이후, 항-칼넥신 항체 (CNX) 또는 항-칼레티쿨린 항체 (CRT)로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 비환원 10% SDS- PAGE 겔 상에서 러닝하고 방사선 사진 촬영하여 시각화하였다.

도 4. 가용성 및 야생형 티로시나아제의 접힘 경로를 설명하는 파동 추적 실험

ST (레인 1-6) 또는 WT (레인 7-11)로 감염된 CHO 세포를 [³⁵S]로 20분 펄스화 전에 1시간 동안 스타베이션 버퍼(starvation buffer)에서 배양하였다. 이후 세포를 지정된 시간 동안 추적하고 세포 용해물을 항-티로시나아제 항체 (T311 항체)로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 비환원 10% SDS- PAGE 겔 상에서 러닝하고 방사선 사진 촬영하여 시각화하였다.

도 5. 가용성 티로시나아제의 핵산 서열 (서열 번호 1)

도 6. Tyrmut1 이 ER 내에 보유됨을 보여주는 파동 추적 실험.

Tyrmut1 감염된 세포를 [³⁵S]로 20분 펄스화하고 2시간 동안 추적하였다. 세포 용해물을 T311 항혈청으로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 둘로 분할하고 (+)로 또는 (-) EndoH 로 소화시켰다. 샘플들을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 러닝하고 방사선 사진 촬영하여 시각화하였다.

도 7. Tyr _ E2 키메라가 ER 내에 유지됨을 보여주는 웨스턴 블롯 실험

세포들을 Tyr_E2 구조로 감염시키고 세포 용해물들 면역 침전물을 둘로 분할하고 (+)로 또는 (-) EndoH 로 소화시켰다. 샘플들을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 러닝하고, T311 항혈청, ECL 화학 발광에 의해 블로팅하고 시각화하였다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

서론

인간 티로시나아제는 타입 I 막 당단백질이며 533개의 아미노산, 7개의 점유된 N-글리코실화 부위, 두 개의 시스테인-풍부 도메인으로 그룹화된 17 시스테인 잔기, 두 개의 구리 결합 도메인 및 하나의 C-말단 TM 도메인 (Ujvari et al., 2001)을 가진다. 본 발명자들은 경막 (TM) 도메인이 결핍된 인간 티로시나아제의 절단된 형태를 구축하였다. TM 도메인의 부재 하에서, ER 루멘 사슬은 자연적인 형태로 접히는 것이 불가능하였다. 그러나, 활성 단백질을 생산하는 절단된 사슬의 생산적 접힘은 트랜스레이션 속도가 늦추어지는 경우에 발생하는 것으로 보여졌다. 효소적으로 활성인 가용성 티로시나아제는 또한 감소된 온도에서 생산되며 생산적 접힘은 초기 단계에서 CNX 상호 작용과의 경우 모두에서 관련된다. 이러한 증거는 트랜스로콘 환경에서 TM 도메인에 있어서 사슬의 접힘과 유지의 역할을 지지해주며 따라서 CNX 와의 이의 상호작용을 촉진한다.

티로시나아제는 종양성 항원을 생성하는 흑색종 세포에서 구조적으로 발현된다. 야생형 티로시나아제는 분비 경로를 통해 운반되어 멜라노좀을 표적한다. 본 발명자들은 트래피킹이 소포체(ER) 에서 중지된 인간 티로시나아제 돌연변이를 구축하였다. 잘못 접힌 단백질은 이후 품질 제어 시스템에 의해 ER 내에 유지되며 프로테아좀에서 분해를 위해 재귀-전위된다. 세포질상 분해에 이어서, 생성된 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자에 의해 세포독성 T-림프구(CTL)에 제공된다. 이와 같이, 본 발명의 돌연변이 티로시나아제는 흑색종 세포에 대한 CTL의 면역 반응을 향상시키도록 고안된 백신 약물로서 흑색종 면역치료에 사용될 수 있다.

티로시나아제는 보통의 멜라노사이트, 흑색종 세포, 및 망막 색소 상피 세포 (RPE)에서 발현되지만, 본 발명의 돌연변이 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 운반하는 백신은 그럼에도 불구하고 흑색종의 치료에 적합하다. 따라서, 백신 약물이 정상 및 비정상 멜라노사이트를 모두 표적할 수 있는 동안은, 인간은 멜라노사이트 없이 생존할 수 있다 (Marks et al., Immunologic Research, 27, 409-425 (2003)). 예를 들어, 백신 접종은 심각한 건강 문제에 해당되지는 않는 피부 색소 장애인, 백반증(vitiligo)으로 알려진 질환을 초래할 수 있다.

본원에 기술된 흑색종 항원 또는 면역원은 인간 또는 기타 포유류와 같은 환자에서의 세포독성 T 세포 면역 반응을 야기할 수 있는 가용성 티로시나아제 돌연변이 또는 이의 절편을 의미한다. 바람직하게는, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 ER 내에 유지되며 경막 도메인이 결핍되어 있다.

용어 흑색종은, 이에 제한되지는 않지만, 흑색종, 전이성 흑색종, 멜라노사이트 또는 멜라노사이트 관련 모반 세포로부터 유도된 흑색종, 멜라노암종, 멜라노상피종, 멜라노육종, 상피내 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결절성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 말단 흑점양 흑색종, 침습성 흑색종 또는 가족성 비전형 몰(familial atypical mole) 및 흑색종 증후군을 포함한다.

조성물

CTL 면역 반응을 유도하는데 적합한 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 임의로는, 약학적으로 적합한 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이 본 발명에서 고려된다. 표적 세포로의 면역원성 조성물의 전달 후에, 본 발명의 발현된 티로시나아제는 소포체 내에 유지되고, 분해된 후 항원 표시를 위해 MHC 클래스 I 에 의해 세포 표면에 표시된다. 바람직하게는, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된다. 가장 바람직하게는, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1에 기술된 핵산 서열 또는 이의 변형체를 포함한다.

하나 이상의 글리코실화 부위를 결핍한 티로시나아제 돌연변이도 본 발명에 기술된다. 이러한 돌연변이들은 칼넥신 (글리칸에 결합하는)과 상호작용할 수 없어 잘못 접힌 폴리펩타이드를 생산해 내기 때문에, ER 내에 보유될 것으로 예상되며 소포체 관련 분해 (ERAD)에 의해 분해될 것으로 기대된다. 이러한 글리코실화 돌연변이는 경막 도메인을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 다른 적절한 티로시나아제 돌연변이는 이들이 ERAD 를 유도할 수 있기만 하면 티로시나아제 cDNA 서열로의 결실 또는 삽입에 의해 수득될 수 있다.

예를 들어, 81 위치 (Tyrmut1)에 하나의 글리칸이 결핍된 티로시나아제 돌연변이는 ER에 보유된다. 실제로, 티로시나아제는 올바른 접힘을 위해 글리칸과의 칼넥신 상호 작용에 의존하여, 특정 잔기에서 글리칸 부착을 방해하는 것은 잘못 접힘과 ER 잔류를 야기할 수 있다.

마찬가지로, 백변증(albinism)은 티로시나아제 잘못 접힘의 질병으로서 간주되며 따라서, 이 질병을 가진 사람에 의해 발현된 티로시나아제는 ER 내에 잔류한다. 흑색종의 발병률은 백변종(albino)에서는 낮기 때문에, 이는 HLA 복합체의 관계에 있어서 제시된 티로시나아제 돌연변이가 흑색종 세포에 의해 표시되는 티로시나아제 항원에 대한 내성을 없앤다는 것을 시사한다.

다른 티로시나아제 돌연변이는 ER 잔류 신호를 포함하는 다른 단백질의 경막 도메인에 의해 부착될 수 있다. 이러한 키메라 티로시나아제 돌연변이는 ER 잔류 프로파일을 가지는 단백질을 초래한다. 이러한 돌연변이는 또한 부가적으로 하나 이상의 글리코실화 부위를 결핍할 수 있다.

본 발명은 또한 T 세포에 의해 인식되는 신규한 흑색종 항원을 코딩하는 핵산 서열을 기술한다. 본원에 개시된 흑색종 항원은 바람직하게는 ER 내에 잔류하며 경막 도메인이 결핍된 가용성 돌연변이 티로시나아제 또는 이의 단편이다. 바람직하게는, 핵산 서열은 서열 번호 1에 기술된 서열을 포함한다.

본 발명의 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 흑색종 백신, 또는 흑색종의 치료를 위한, 본 발명의 가용성 티로시나아제 돌연변이 또는 티로시나아제 돌연변이로부터 유도된 면역원성 펩타이드를 포함하는 백신도 본원에 기술되어 있다. 또한, 본 발명의 백신은 약학적으로 허용가능한 담체로 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 보통 약학적 보조제를 포함하는, 당업계에 공지된 담체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, MERCK INDEX, Merck & Co.(Rahway, NJ 소재)에 기술된 물, 식염수, 버퍼, 및 다른 화합물을 포함할 것이다. 문헌[Bioreversible Carriers in Drug Design, Theory and Application, Roche (ed.), Pergamon Press, (1987)]도 참조한다. 다양한 사항들이 예를 들어, 문헌들[Gilman et al. (eds) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; Novel Drug Delivery Systems, 2nd Ed., Norris (ed.) Marcel Dekker Inc. (1989), 및 Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시가 본원에 참조로서 포함된다.

본원에 기술된 백신 제형은 먼저 인간 이전에 동물 모델 또는 비인간 영장류에서 평가될 수 있다. 통상적인 방법은 백신의 효용성을 결정하기 위해 환자의 면역 반응을 평가하는데 사용될 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 변형체도 고려한다. 한 구체예에서, 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오타이드 변형체는 본 발명에서의 사용을 위해 고려된다. 본원에서 사용된 "변형체" 는 표준, 또는 주어진, 특정 유전자 또는 단백질의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서 벗어난 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 용어, "동형," "동유형," 및 "유사체" 도 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 "변형체" 형태를 지칭한다. 하나 이상의 아미노산의 첨가, 제거 또는 치환, 또는 뉴클레오타이드 서열에서의 변화로 변형된 아미노산 서열은 "변형체" 서열로 간주될 수 있다. 변형체는 "보존적" 변화 예를 들어, 루이신의 이소루이신으로의 치환을 가질 수 있어서, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가진다. 변형체는 "비보존적" 변화, 예를 들어, 글리신의 트립토판으로의 치환을 가질 수 있다. 유사한 소수의 변화들도 아미노산의 결실 또는 삽입, 또는 모두를 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기들이 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 벡터 NTI Suite (InforMax, MD) 소프트웨어와 같은 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다.

본 발명에 따른 보존적 변형체는 일반적으로 티로시나아제 돌연변이의 총체적인 분자 구조를 유지한다. 개시된 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 개별 아미노산들의 특성을 고려하면, 일부 명확한 치환은 명백할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환" 은, 예를 들어, 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 관련 잔기의 양친매 특성에 기초하여 이루어질 수 있다.

예를 들어: (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하며; (c) 양이온 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음이온 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 보통 기 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-헬릭스를 붕괴하기 위해 이들의 능력에 기초하여 서로에 대해 치환될 수 있다. 유사하게는, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 루이신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 라이신은 α-헬릭스에서 보다 흔히 발견되는 반면, 발린, 이소루이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-평판에서 보다 흔히 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴, 및 프롤린이 순서대로 흔하게 발견된다. 일부 바람직한 치환은 하기 그룹 중에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술이 주어져 있어, 당업자는 용이하게 보존적 아미노산 변형체를 코딩하는 DNA를 구축할 수 있다.

"변형체" 는 예컨대 Maxygen 양도 특허에 기술된 바와 같은 "셔플 유전자(shuffled gene)" 도 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형체는 U.S. 6,132,970 (이의 내용은 전체가 본원에 참조로서 포함된다)에 개시된 방법 및 원리에 따라 개질된 서열의 변이체 및 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 변형체는 각각 가용성 티로시나아제 돌연변이 또는 이의 절편, 또는 가용성 티로시나아제 돌연변이 폴리펩타이드 또는 이의 절편을 코딩하는 핵산에 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 일치성을 가지고, 또는 가용성 티로시나아제 돌연변이 또는 이의 절편을 코딩하는 핵산에 낮은 정도, 중간 정도 또는 높은 정도의 엄중 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 포함한다. 혼성화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Ausubel, et al. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N.Y., Units 2.8-2.11, 3.18-3.19 및 4-6-4.9 참조). 조건들은 완전히 상보적인 프로브와 표적이 혼성화할 수 있는, 즉 각 염기쌍이 이의 상보적 염기쌍과 상호작용 해야만하는 혼성화를 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 조건은 프로브와 표적이 약 10% 이하의 부적당한 짝을 이루지만 여전히 혼성화할 수 있도록 선택될 수 있다. 적절한 조건은 예를 들어, 예비혼성화, 혼성화, 및 세척 용액에서 염의 농도를 달리하거나 또는 혼성화 및 세척 온도를 달리함으로써 선택될 수 있다. 일부 기질을 이용하면, 예비혼성화 및 혼성화 용액에 포름아미드를 첨가하여 온도를 감소시킬 수 있다. 혼성화는 60℃에서 1% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)를 가지는 5xSSC와 같은 버퍼로 낮은 엄중도에서 수행될 수 있으며, 이는 일부 부적당한 짝들을 포함하는 프로브와 표적 서열 사이의 혼성화를 허용하여 프로브/표적 복합체를 형성한다. 후속 세척은 45℃ (중간 정도의 엄중도) 또는 68℃ (높은 엄중도)에서 0.1% SDS를 갖는 0.2xSSC와 같은 버퍼로 보다 높은 엄중도에서 수행하여, 완전히 상보적인 서열을 포함하는 프로브/표적 복합체만의 혼성화를 유지한다. 배경 신호는 예컨대 SDS, 사코실, 또는 Triton X-100, 또는 블로킹제, 예컨대 연어 정자 DNA 와 같은 세제의 사용으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 사용을 위한 백신 및 면역원성 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 통상적인 방법으로 임의로 제형화될 수 있다. 따라서, 이들은 흡입 또는 주입(입 또는 코를 통한)에 의한 투여 또는 경구, 구강, 비경구 또는 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 약학 조성물은 비경구적 투여를 위해 제조된다.

경구 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제 예컨대 결합제 (예를 들어, 전젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전재 (예를 들어, 락토스, 미세결정성 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어 : 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들어 소듐 라우릴 설페이트)와의 통상적인 방법에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법으로 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클과의 조합을 위한 건식 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제 예컨대 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가 식용유); 에멀젼화제 (예를 들어 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성유); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)과의 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 제제 또한 버퍼 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적절하게 포함할 수 있다.

경구 투여용 제제는 적절하게 제형화될 수 있어 활성 화합물의 제어된 방출을 제공할 수 있다. 구강 투여를 위해 조성물은 통상적인 방법으로 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취할 수 있다.

흡입 투여용을 위해, 본 발명에 따른 티로시나아제 돌연변이는 적절한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체를 이용하여, 가압팩 또는 흡입기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 적절하게 제공될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에 용량 단위는 계량된 양을 제공하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 주입기에서의 사용을 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합 및 예컨대 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기재를 포함하게 제형화될 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 가용성 티로시나아제 돌연변이는 바람직하게는 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입을 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께, 단위 용량 단위 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다용량 콘테이너로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내에 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수와 조합을 위한 분말 형태일 수 있다.

화합물은 또한 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 포함하는 좌제 기재를 포함하는 좌제 또는 관장액과 같은 직장 투여용 조성물로 제형화될 수 있다.

상기 기술된 제형 이외에, 본 발명의 티로시나아제 돌연변이는 또한 저장소(depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 장시간 작용 제형은 주입 (예를 들어 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적절한 중합성 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 제형화될 수 있거나, 또는 난용성 유도체, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.

조성물은, 필요하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 용량 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같이 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시를 수반할 수 있다.

본 발명의 가용성 티로시나아제 돌연변이 단백질의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 구조체가 또한 본 발명에 기술된다. 바람직한 구체예에서, 티로시나아제 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1에 기재된 핵산 서열 또는 이의 변형체이다.

재조합 단백질 생산은 당업계에 잘 공지되어 있고 하기 짧게 개괄되어 있다.

박테리아용으로 유용한 발현 벡터는 실시가능한 해독 상(operable reading phase)에 적절한 번역 개시 및 종료 신호와 암께 목적하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 작용성 프로모터와 함께 삽입함으로써 구조화된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하기 위해, 가능하다면 숙주 내에 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택가능한 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질 전환을 위한 적절한 원핵성 숙주는 대장균, 바실러스 서브틸러스, 살모넬라 티피무리움 및 수도모나스, 스트렙토마이세스, 및 스타필로코커스의 속 내의 다양한 종들을 포함하지만, 기타들도 선택 물질로서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 원핵성 숙주는 대장균이다.

박테리아성 벡터는, 예를 들어, 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 코스미드-기초의 것들이다. 이러한 벡터는 선택가능한 마커 및 잘 알려진 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 성분들을 포함하는 시판되는 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 기점을 포함할 수 있다. 이러한 시판되는 벡터는, 예를 들어, GEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA), pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pKK232-8, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia)를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 벡터는 pTriex (Novagen)이다.

이러한 "백본" 섹션은 적절한 프로모터 및 발현된 구조적 서열과 조합된다. 박테리아 프로모터는 lac, T3, T7, 람다 6 P_R 또는 P_L, trp, 및 ara 을 포함한다. T7 이 바람직한 박테리아 프로모터이다.

적절한 숙주 균주의 형질 전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 이후에, 선택된 프로모터는 적절한 방법 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 활성화/유도되며 세포들은 추가적인 기간 동안 배양된다. 세포는 보통 원심분리에 의해 수확되며, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 붕괴되며, 생성된 미정제 추출물은 추가의 정제를 위해 남겨진다.

다양한 포유류 세포 배양 시스템이 재조합 단백질 발현을 위해 또한 사용될 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예는 예컨대 티미딘 키나아제-네가티브 (TK) 및 아데닌 포스포리보술 트랜스퍼라아제-네가티브 (APRT) 세포와 같은 선택된 마우스 L 세포를 포함한다. 다른 예는 문헌[Cell 23: 175 (1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주, 및 융화성(compatible) 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유류의 발현 벡터는 복제 기점, 적절한 프로모터 및 인핸서(enhancer), 및 또한 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너(splice donor) 및 수용 부위, 전사 종료 서열, 및 5' 플랭킹(flanking) 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 바이러스성 유전체로부터 유도된 DNA 서열 예를 들어, SV40 기점(origin), 초기(early) 프로모터, 인핸서, 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위가 필요한 비전사 유전 성분들을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

포유류 프로모터는 CMV 이미디어트 얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기(early and late) SV40, 레트로바이러스의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I 을 포함한다. 예시적인 포유류 벡터는 pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL (Pharmacia)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 포유류 발현 벡터는 pTriex 이다.

포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스성 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 대상 코딩 서열은 아데노바이러스 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3자 리더(tripartite leader) 서열로 라이게이션될 수 있다. 이후 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 유전체에 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비필수 영역 (예를 들어 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 이용가능하며 감염된 숙주에서 표적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래한다 (예를 들어, Logan et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659 참조).

본 발명의 핵산 서열은 또한 정상 및 질병 조직에서의 티로시나아제의 발현을 검출하기 위한 프로브로서 사용하기에 적절하다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 샘플을 핵산과 샘플 mRNA의 혼성화를 허용하는 조건 하에 핵산 서열과 접촉시킨 후 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플 내에 티로시나아제를 코딩하는 mRNA의 검출을 위한 생분석에 관한 것이다.

생분석에서 복합체의 검출은 또한 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 신호 증폭에 의한 복합체의 검출은 방사선표지 및 효소를 포함하는 여러 통상적인 표지 기술에 의해 달성될 수 있다 (Sambrook et. al., (1989) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring I Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel et al., (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York N.Y.). 방사선표지 키트도 시판된다. 생분석에서 프로브로서 사용되는 돌연변이 티로시나아제 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 일 수 있다. DNA 서열을 표지하는 바람직한 방법은 클레노브(Klenow) 효소 또는 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 이용한 ³²P 를 사용한다. RNA 또는 리보프로브 서열을 표지하는 바람직한 방법은 RNA 폴리머라아제를 이용한 ³²P 또는 ³⁵S 를 사용한다. 또한, 피리미딘 및 퓨린 고리에 화학기를 부착하는 방법 (Dale, R. N. K. et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci., 70:2238-2242; Heck, R. F. (1968) S. Am. Chem. Soc., 90:5518-5523), 화학발광에 의해 검출을 허용하는 방법 (Barton, S. K. et al. (1992) J. Am. Chem. Soc., 114:8736-8740) 및 바이오티닐화 핵산 프로브를 이용하는 방법 (Johnson, T. K. et al. (1983) Anal. Biochem., 133:125-131; Erickson, P. F. et al. (1982) J. of Immunology Methods, 51:241-249; Matthaei, F. S. et al. (1986) Anal. Biochem., 157: 123-128) 및 시판되는 제품을 이용하여 형광에 의해 검출을 허용하는 방법을 포함하는 신호 증폭을 위한 공지된 비방사선 기술이 있다. 비방사선활성 표지 키트도 시판된다.

생분석에서 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 예는 이에 제한되지는 않지만, 일차적 포유류 배양물, 연속상 포유류 세포주, 예컨대 멜라노사이트 세포주, 포유류 기관 예컨대 피부 또는 망막, 조직, 생체 검사 시험편, 종양, 병원성 시험편, 및 부검 시험편을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 이의 변형체는 가용성 티로시나아제 항원에 대한 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역 조직 염색법(immunohystostaining)을 통한 티로시나아제의 검출에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 진단 시약으로서 사용될 수 있다.

모노클로날 항체 (MAbs)는 특정 항원에 대한 항체의 동종 군집이며 항체는 단 한 유형의 항원 결합 부위를 포함하며 항원성 결정자 상에 단 하나의 에피토프에만 결합한다. 특정 항원에 대한 설치류의 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), 및 Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)]을 참고한다.

치료 방법

본 발명은 또한 개질된 티로시나아제 cDNA의 투여를 포함하는 흑색종의 치료 방법을 개시한다. 본원에 기술된 개질된 티로시나아제는 감염된/형질 도입된 항원 표시 세포(APC)의 ER 내에 잔류하는 가용성 티로시나아제 돌연변이이다. 이 단백질은 이후 처리되고 이로부터 유도된 항원성 펩타이드는 APC 상에서 HLA 분자와 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 이후 세포 용해를 위한 비정상 세포를 표적하는 세포독성 T 세포에 의해 인식된다.

바람직한 구체예에서, 가용성 티로시나아제의 DNA 는 HLA 복합체와 관련하여 가용성 티로시나아제를 발현하고 티로시나아제 항원성 펩타이드를 표시할 전문적인 항원-표시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)로 이동된다. 이는 흑색종 세포에 의해 표시되는 티로시나아제 항원에 대한 내성을 없애는 특정 CTL 클론의 프라이밍(priming)을 향상시킬 것이다.

상기 거론된 바와 같이, 흑색종 치료를 위한 백신이 본원에 기술되어 있다. 백신 접종은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 면역원은 적절한 희석제 예컨대 식염수 또는 물, 또는 완전한 또는 불완전한 아주반트에 사용될 수 있다. 추가로, 면역원은 단백질을 면역화하기 위해 담체에 결합되거나 또는 결합되지 못할 수 있다. 이러한 담체 분자의 예는 이에 제한되지는 않지만, 소 혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 등을 포함한다. 면역원 또한 지질단백질과 커플링될 수 있으며 또는 리포좀 형태로 투여될 수 있으며 또는 아주반트와 함께 투여될 수 있다. 면역원은 일회 또는 항-티로시나아제 면역 세포 또는 항-티로시나아제 항체의 현저한 역가가 생성될 때까지 주기적 간격으로 투여될 수 있다. 항-티로시나아제 면역 세포의 존재는 CTL 전구체 분석 에세이(Coulie, P. et al., (1992) International Journal Of Cancer 50:289-297)에 의한 면역화 이전 및 이후에 티로시나아제 항원에 대한 전구체 CTL (세포독성 T-임파구)의 빈도를 측정함으로써 측정될 수 있다.

본 발명의 백신 또는 면역원의 투여는 치료적 목적일 수 있다. 면역원은 질병의 개시 (또는 직후) 또는 질병의 임의의 징후 개시에 제공된다. 면역원의 치료적 투여는 질병을 약독화하는 작용을 한다.

예로서, 재조합 가용성 티로시나아제 단백질 또는 펩타이드 발현 벡터를 이용하여 제조된 백신이 사용될 수 있다. 개체에 백신을 제공하기 위해, 가용성 티로시나아제 돌연변이 핵산 서열의 모두 또는 부분을 코딩하는 유전 서열이 상기 기술된 바와 같이 발현 벡터에 삽입되며, 포유류에 면역화를 위해 도입된다. 상기 언급된 백신에 사용될 수 있는 벡터의 예는 이에 제한되지는 않지만, 결함 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 우두 바이러스성 벡터, 계두(fowl pox) 바이러스성 벡터, 또는 다른 바이러스성 벡터를 포함한다 (Mulligan, R.C., (1993) Science 260:926-932). 가용성 티로시나아제 돌연변이 핵산 서열의 모두 또는 부분을 수반하는 바이러스성 벡터는 흑색종의 임의의 증거 이전에 또는 흑색종으로 고통받는 포유류에서의 질병의 퇴행을 중개하기 위해 포유류에 도입될 수 있다. 포유류에 바이러스성 벡터를 투여하는 방법의 예로서, 이에 제한되지는 않지만, 바이러스에 대한 세포의 체외 노출, 또는 레트로바이러스 주사 또는 감염된 조직으로의 프로듀서(producer) 세포주 도입 또는 바이러스의 정맥내 투여를 포함한다. 대안적으로 가용성 티로시나아제 핵산 서열의 모두 또는 부분을 수반하는 바이러스성 벡터는 흑색종 병변에 직접 주사에 의해 국소적으로 투여될 수 있거나, 약학적으로 허용가능한 담체로 국소적으로 적용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용을 위한 가용성 티로시나아제 핵산은 서열 번호 1, 및 이의 변형체로 제공된다. 가용성 티로시나아제 핵산 서열의 모두 또는 부분을 수반하는 바이러스성 벡터의 투여될 양은 바이러스 입자의 역가에 기초한다. 예로서 투여될 면역원의 범위는 포유류, 바람직하게는 인간에 대해 10⁵ - 10¹³ 바이러스 입자이다.

면역화 이후, 백신의 효용성은 특정 세포 용해 활성, 특정 사이토킨 생성, 또는 종양 퇴행에 의해 평가된 바와 같은 항원을 인식하는 항체 또는 면역 세포의 생성에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 상기 언급된 파라미터들을 평가하는 통상적인 방법을 알 것이다. 면역화될 포유류가 이미 흑색종에 걸린 경우, 백신은 다른 치료약과 조합하여 투여될 수 있다. 다른 치료 처방의 예는 양자 T 세포 면역치료 및 사이토킨의 또는 다른 흑색종 치료 약물의 공동투여를 포함한다.

제조 방법

인간 티로시나아제의 절단된 형태를 구조화하는 것을 포함하는 가용성 티로시나아제 돌연변이의 제조방법이 본원에 기술된다. 바람직한 구체예에서, 티로시나아제 돌연변이는 칼넥신에 대해 감소된 친화성을 가진다. 또한 바람직하게는, 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인 및/또는 하나 이상의 글리코실화 부위가 결핍된다. 또한 바람직하게는, 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩된다.

본 발명을 하기 실시예를 참조로 추가로 기술하지만 이는 예시로서만 제공된다. 본 발명은 실시예에 제한되지 않으며 오히려 본원에 제공된 교시로부터 명백한 모든 변형을 포함한다.

실시예 1. 재료 및 방법

CHO 세포(European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, United Kingdom(UK)) 및 K42 세포(Dr. T. Elliott(University of Southampton) 및 Dr. M. Michalak(University Alberta)이 증여)를, 10% 태아 소 혈청(FCS, Sigma, Poole, Dorset, UK), 50 유닛/ml 페니실린, 및 50 mg/ml 스트렙토마이신(Life Technologies, Inc.)을 함유하는, RPMI 1640 배지(Life Technologies, Inc., Paisley, Scotland)에서 배양하고, 5% CO₂.로 37℃에서 유지하였다. 마우스 모노클로날 항-티로시나아제 항체(T311 항체)는 NeoMarkers(Fremont, USA)에서 구매하였다. 래빗 폴리클로날 항-칼넥신 항체는 Dr. J. Bergeron(McGill University)이 증여하였다. 래빗 항-칼레티쿨린 항체(칼레굴린 C-17 항체)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구매하였다. NB-DNJ는 Searle/Monsanto(St. Louis, MO)이 증여하였다. 방사표지된 [³⁵S] 메티오닌/시스테인은 I.C.N. Flow(Theme, Oxfordshire, UK)에서 구매하였다. CHAPS(3-[3-클로라미도프로필]-디메틸암모니노-1-프로판설페이트)는 Pierce Chemicals Co에서 구매하였다. 락타시스틴은 Calbiochem에서 구매하였다. 모든 다른 화학물질들은 Sigma Chemicals Co(St. Louis, MO)에서 구매하였다.

실시예 2. 티로시나아제 돌연변이의 구축

pcTyr 클로닝 벡터 내 인간 티로시나아제를 암호화하는 전장 cDNA는 Dr. V. J. Hearing(NCI, National Institute of Health, Bethesda, MD)이 증여하였다. WT 티로시나아제 cDNA 및 WT 루멘 도메인(456 aa) cDNA(ST)는 pcTyr를 주형으로 하고 이하 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다:

정방향 프라이머 5'-GCTATACCATGGCCCTCCTGGCTGTTTTG-3'

WT 역방향 프라이머 5'-GGCGCGCCTCGAGTAAATGGCTCTGATA-3'

ST 역방향 프라이머 5'-GTATTCTCGAGCCGACTCGCTTGTTC-3'

PCR 산물을 NcoI 및 XhoI으로 절단하고, 포유동물 발현용 pTriex1(Novagen) 내에 6HisTag과 인프레임으로 클로닝하였다. 서열은 자동화 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

CHO 세포의 형질감염 및 대사적 표지화

대수기에 있는 CHO 세포를 형질감염을 위해 6-웰 플레이트에 배양시켜, Lipofectamine Plus(Invitrogen)를 사용하여 티로시나아제 cDNA를 일시적으로 발현시키는데 사용하였다. 형질감염 24시간 후 세포를 회수하고, 긁어 모아 펠렛화하였다. 대사적 표지화를 위해, 감염된 CHO 세포(10⁷ 세포/ml)를 시스테인/메티오닌이 없는 배지에서 1 시간 동안 결핍된 상태로 두고, 20 분 동안 100-150 μCi [³⁵S] 시스테인/메티오닌으로 펄스 표지한 후, 특정 시간 동안 추적하였다. 추적 직후, 세포를 차가운 PBS에 회수하고, 20 mM N-에틸말레이미드(GEM)에서 30 분 동안 배양하여, 유리 설피드릴기를 알킬화시켰다. 그 후, 세포를 CHAPS 용해 버퍼(2% CHAPS, 200 mM NaCl 및 0.5% 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma)(루펩틴, 아프로티닌, 나트륨 EDTA, 베스타틴, AEBSF 및 E-64 함유)을 함유하는 50 mM HEPES 버퍼 pH 7.5)로 용해시켰다.

면역침전 및 SDS - PAGE

[³⁵S] 표지된 세포 용해물을 원심분리하고, 상등액을 T311 항체(1:50) 또는 항-칼넥신항체(1:1OO)와 밤새 4℃에서 배양시켰다. 그 후, 20 ㎕의 단백질 A 세파로오즈를 첨가하고, 세포 용해물을 1 시간 동안 4℃에서 배양시켰다. 슬러리를 HEPES 중 0.5% CHAPS로 3번 세척하였다. SDS 샘플 버퍼 내에서 5% 2-머캅토에탄올의 존재(환원 조건) 또는 비존재(비환원 조건)하에 5 분 동안 슬러리를 끓여 티로시나아제를 용출시켰다. 동시-면역침전 연구를 위해, 용해물을 항-칼넥신 항체(1:100)로 면역침전시키고, 세척된 슬러리를 1% SDS로 용출시킨 후, 용해 버퍼로 10배 희석하고, T311로 재침전시켰다. 결합 단백질을 천연 또는 환원 조건에서 용출시키고, 10% SDS-PAGE 겔상에서 분석하였다. 그 후, 겔을 자동방사그래피로 시각화시켰다.

DOPA 옥시다아제 분석

DOPA 옥시다아제 분석은 티로시나아제의 2번째 촉매 활성, 즉 DOPA 퀴닌을 통한 L-DOPA의 DOPAchrom으로의 전환 활성을 측정한다. 이 분석은 L-DOPA를 기질로 사용하여 겔에서 수행하였다(Negroiu et al., 2000). 형질감염 24시간 후 회수된 감염된 세포의 조 용해물 또는 세포 배양 배지를 천연 조건에서 SDS-PAGE로 러닝하고, 2.5 mg/ml L-DOPA 중에서 배양시켜 티로시나아제 활성을 시각화하였다.

면역블롯팅

상이한 cDNA로 감염되어진 용해된 CHO 세포 유래의 단백질을 10% 아크릴아미 드 겔에서 전기영동적으로 분리하고(Branza-Nichita et al., 1999), 이모빌론(immobilon) 막(Amersham International, Amersham, UK)으로 이동시켰다.

분비된 티로시나아제를 분리하기 위해, 배양 배지를 니켈 니트릴로트리아세트산-Superflow 비드(Ni-NTA)(Qiagen, Chatsworth, CA)와 밤새 4℃에서 배양하였다. 비드를 펠렛화시키고, 20 mM 이미다졸로 3번 세척한 후, 환원 SDS 샘플 버퍼로 용출시켰다. 결과 샘플을 전술한 바와 같이 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 후, 블롯을 5% 밀크, 0.1 % Tween 중에 항-티로시나아제 항체(T311)의 1:250 희석액과 2 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 면역반응성은 제조자 프로토콜에 따라 개선된 화학발광성 웨스턴 블롯팅(ECL, Amersham Corp.)으로 검출하였다.

실시예 3. 가용성 티로시나아제 돌연변이는 효소 활성을 결여하고, ER 내에 축적되며, 프로테아좀 내에서 분해된다

가용성 티로시나아제 돌연변이의 성숙화를 펄스-추적 분석으로 생체내에서 모니터링 하였으며, 모노클로날 항-티로시나아제 항체(T311)로 면역침전시켰다. 샘플을 둘로 나누고, 각각의 샘플의 절반을 Endo H 제한 효소로 절단시키고, 환원 SDS-PAGE 겔에서 비절단된 대조군의 옆에 러닝시켰다(도 1). Endo H는 고-만노스 및 하이브리드 N-글리칸만을 절단시키기 때문에, Endo H 민감도를 이용하여, 고-만노스에서 복합체 구조로 글리칸이 성숙화되는 것을 모니터링 하였다. Endo H로의 절단은 풀(pool)을 55kD에서 러닝하는 폴리펩타이드로 감소시켜준다. 5 시간의 추적 동안, 전구체는 동일한 전기영동 이동성을 가졌으며, 전체적으로 Endo H 민감도가 유지되었는데, 이는 이의 N-글리칸이 골지체에서 복합체 구조로 가공되지 않았 음을 나타내는 것이다(도 1, 레인 1,3,5,7). 1 시간 합성 이후 면역침전된 단백질의 양이 점차 감소함이 관찰되었다(도 1).

이것이 ER 내 사슬 잔류와 이후의 분해와 일치하는지를 살펴보기 위해, 본 발명자는 프로테아좀의 존재하에 동일한 실험을 수행하였다. 락타시스틴의 존재시 면역침전된 물질의 양이 비처리된 샘플에 비해 전 추적 기간 동안 증가하였음이 관찰된다(도 1). 락타시스틴이 처리된 샘플의 Endo H 분해 패턴은 비처리된 샘플과 유사한데(도 1, 레인 9, 11, 13, 15), 이는 ST가 ER 내에 보유되어, 결국에는 프로테아좀 내에서 분해되도록 표적화 됨을 제안해 주는 것이다.

ST의 성숙화를 야생형 단백질과 비교하기 위해, 본 발명자는 동일한 조건에서 동일한 벡터에 클로닝된 막 티로시나아제(WT)를 발현시켰다(도 2). Endo-H 절단 실험에서 보여주는 바와 같이, WT는 추적 거의 1 시간 내에 복합체 타입 글리칸을 취득하는 75 kD 단백질로 합성된다. 복합체 대 고-만노즈 글리칸 비의 감소는 이 시스템에서 티로시나아제가 과량발현되었음을 나타내어 주며, 이는 이미 보고된바 있다(Berson et al., 2000). 이미 살펴본 바와 같이(Halaban et al., 1997, Toyofaku et al., 2001), 락타시스틴 처리는 추적 최초 3 시간 내에 비분해된 단백질을 축적시키는데, 이는 적어도 성숙화 초기 단계에서, 막 티로시나아제가 프로테아좀 내에서 분해됨을 나타내 주는 것이다.

WT 티로시나아제와 달리, 가용성 형태로 디스플레이된 복합체 글리칸으로의 가공 결여는 당단백질의 불완전한 성숙화를 제안해준다. 이는 천연 형태를 수득하는 능력이 없는 것과 연관될 수 있다. 이 의문에 대해 답변하기 위해, 본 발명자는 DOPA-옥시다아제 분석으로 ST 돌연변이의 효소 활성을 결정하였다. ST 돌연변이는 세포 용해물 또는 배양 배지 내에서 완전히 비활성을 가진다. 이는 기질 DOPA를 DOPA chrome으로 변환시킬 수 있는 WT 티로시나아제와 다르다. 따라서, ST 사슬은 생물학적 활성이 결여된 비천연 형태로 발생된다.

실시예 4. 가용성 및 야생형 티로시나아제는 상이한 샤페론 상호 작용 패턴 및 폴딩 경로를 보여준다

ST 폴딩시 칼넥신 및 칼레티쿨린의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자는 대사적으로 표지된 감염된 세포 용해물의 항-CNX/항-CRT 및 항-티로시나아제 항체로 일련의 면역침전 실험을 수행하였다. 추적 최초 30 분 내에, ST가 CNX(도 3, 레인 1, 2) 및 CRT(도 3, 레인 6, 7)와 모두 매우 약한 상호작용을 하였다. 1 시간 추적으로 시작하여 이 상호 작용은 가시화되고, 3 시간 후에 CNX(도 3, 레인 3-5) 및 CRT(도 3, 레인 8-9) 모두 최대 수치로 증가하였다.

폴딩의 매우 초기 단계에서 CNX와 상호작용하며, 1 시간 추적시 현저한 감소를 나타내는 WT 티로시나아제의 경우 상이한 패턴이 관찰되었다(도 3, 레인 11-13). CRT의 WT 발생기의 사슬과의 약한 상호작용은 펄스 기간의 마지막에서 분명하였다.

WT 및 돌연변이 티로시나아제의 폴딩 경로를 특정하기 위해, 본 발명자는 감염된 펄스-추적된 CHO 세포에서 면역침전 실험을 수행하였으며, 비환원 SDS-PAGE 겔에 의해 샘플을 분석하였다. 이러한 조건은 디설피드 결합 형성을 초래하며, 이는 보다 조밀한 형태로 공존하여, 겔 내에서 사슬 이동성을 가속화시킨다(Branza- Nichita et al., 1999, Hebert et al., 1995).

ST는 비생산적인 폴딩 경로로 3번 이상의 산화 중간체를 통해 폴딩되며, 이는 추적 0 내지 5 시간에서의 이동성 쉬프트의 점진적인 증가로 알 수 있다(도 4, 레인 1-6). 첫번째 중간체는 환원된 샘플과 비교하여 펄스 이후(0 분-추적) 나타나는 반면, 마지막 중간체는 3 시간-추적시 관찰되는데, 이는 절단된 티로시나아제의 분해 과정의 가속화와 연관된다.

WT 단백질 폴딩을 분석함으로써, 본 발명자는 2가지의 산화 중간체를 구별할 수 있었다. 첫번째 것은 완전히 산화되지 않아 환원된 샘플과 유사한 이동 속도를 나타낸다(도 4, 레인 7,12). 30 분 동안, 사슬은 추가적으로 산화되지 않는 두번째의 중간체로 산화된다(도 4, 레인 8). 두번째 중간체의 발생은 글리칸 복합체 구조의 발생과 관련되며, 1 시간째의 CNX 상호 작용의 극적인 감소와도 관련되며, 이는 사슬이 배출 허용형(export competent conformation)으로 얻어지며, 골지 구획에 도달함을 나타내 주는 것이다. 환원된 ST(도 1, 레인 2,4,6,8) 및 WT 펄스-추적된 샘플(도 2, 레인 1-4)은 추적 기간 동안 일정한 이동성을 나타내기 때문에, 비환원 겔에서의 쉬프트는 유일하게 상이한 산화 중간체에 기인한 것이다. 비환원 조건에서, 응집체 및 디설파이드 이량체는 ST 및 WT 모두에 대해 폴딩 초기 단계에서 관찰될 수 있다(도 4). 이러한 형태는 후기 추적 지점 및 환원 조건에서는 존재하지 않는데, 이는 폴딩시 혼합된 디설파이드 중간체가 형성됨을 나타내는 것이다. 데이터는 비천연 형태로의 ST 폴딩이 WT 보다 6배나 오래 걸리며, 후기 산화된 중간체가 분해 이전에 형성됨을 보여준다.

실시예 5. TM 도메인은 사슬의 생산적 폴딩에 요구된다

폴딩이 경막 도메인의 존재에 의해 영향받는지를 조사하기 위해, 본 발명자는 타입 I 막 당단백질-티로시나아제를 모델로 사용하여, 이의 폴딩 경로를 TM 도메인이 결실된 구축물의 폴딩 경로와 비교하였다. 티로시나아제는 포유동물에서 색소 합성을 조절하는 멜라닌성 효소이다(Petrescu et al., 1997). 본 발명자는 폴딩이 글리코실화에 의존함을 이미 보고한바 있다(Branza-Nichita et al, 1999, 2000).

대사적으로 표지된 감염된 CHO 세포의 비환원 SDS-PAGE 결과로부터, 본 발명자는 가용성 구축물이 ER 내에서 보유되어 최종적으로 프로테아좀에서 분해되는 비천연 형태로 성숙화됨을 밝혔다. 이는 WT로 감염된 세포와 달리, ST로 감염된 세포 내에서의 효소 활성 부재와 연관된다. 흥미롭게도, 가용성 형태는 WT와 비교하여 산화된 중간체의 숫자가 증가된다.

2가지 형태의 티로시나아제의 폴딩 경로 또한 CNX 및 CRT와의 결합 패턴에 있어서 상이하다. 막-부착된 사슬은 폴딩 과정의 완결시까지 초기 단계로부터 개시된 CNX에 의해 도움을 받는다. 본 발명자는 마우스 막 티로시나아제의 경우 2가지의 산화 중간체의 발생과 유사한 칼넥신 의존성 폴딩에 대해 보고한바 있다(Branza-Nichita et al., 1999; Branza-Nichita et al., 2000). 대조적으로, 절두된 티로시나아제의 CNX 및 CRT에 대한 친화도는 초기에는 매우 낮지만, 분해 이전 과정의 마지막으로 갈수록 증가한다. ST의 총 3가지의 폴딩 중간체 중 2가지 이상은 CNX/CRT 상호 작용의 부재시 발생한다(다른 ER 폴딩 인자의 도움에 의한 것으 로 추정됨). 이러한 중간체는 천연 폴드에 도달할 수는 없는데, 이는 이들이 변성적인 디설피드 브리지를 가진다는 것을 내포하는 것이다. 2가지의 티오리덕타아제인, PDI 및 Erp57는 ER 내에서의 디설피드 브리지 형성 동안 발생기의 사슬과 상호작용한다(Farmery et al., 2000; Mezghrani et al., 2001). Erp57은 CNX와 결합되는 경우 사슬과 상호작용한다(Frickel et al., 2002). 티오리덕타아제 또한 막 티로시나아제 내의 S-S 결합 형성을 촉매화한다. 대조적으로, 가용성 형태의 산화된 중간체는 CNX 및 Erp57의 부재시 초기에 생성되며, 사슬은 칼넥신과 칼레티쿨린 모두가 이 단계에서 서로 결합된다 하여도, 샤페론과의 후기 상호작용에 의해 천연 형태로 될 수는 없다. 정확하게 폴딩된 사슬과 잘못 폴딩된 사슬을 구별하는 품질 조절 사이클을 가지는 단계에서, 폴딩과 분해간에는 깨지기 쉬운 평형관계가 존재한다. 잘못 폴딩된 폴리펩타이드는 GT에 의해 재글리코실화되며, CNX/CRT에 의해 사이클로 간다(Sousa 및 Parodi, 1995). 많은 가용성 또는 막-결합 단백질은 분해되기 위한 표적화 이전에 CNX 또는 CRT와 결합한다(Ellgaard 및 Helenius, 2001).

이러한 데이터는 잘못 폴딩된 ST의 재글리코실화가 폴딩의 후기 단계에서 증가되어, 분해 직전에 사슬이 변성적인 디설피드를 가지는 형태로 붕괴됨과 동시에 CNX 및 CRT 모두와의 결합이 증가함을 나타내준다. 실제로, 이것이 마지막 중간체로 산화되는 전체 티로시나아제 풀은 아니며, 사슬의 일부는 초기 분해를 위해 표적된다. 절두된 사슬의 변성적인 폴딩 및 분해는 마지막 2가지의 추적 지점과 거의 동시에 일어난다. 이는 칼넥신 사이클에서 정확하지 않게 폴딩된 사슬이 후전좌 기구로 직접 보내어 짐을 제안해준다. 또한, 이러한 데이터는 TM 도메인이 티로시나 아제의 생산적인 폴딩에 중요함을 보여준다.

TM 도메인은 트랜스로콘(translocon) 영역에서 시간 소비를 증가시킴으로써, 삽입 연관된 현상에 의해서, 단백질이 이 영역에서 급속히 확산되는 것을 방지함으로써, 이 과정에서 중요한 역할을 담당하는 것처럼 보인다. 또한, 모든 생산적인 폴딩 경로가 과정의 길이와 관계없이 비생산적인 결로 보다 중간체를 덜 포함할 수 있다는 것도 눈여겨 볼만하다. 기본적으로, 비천연 디설피드가 초기 단계에서 형성되는 경우, 사슬은 천연 경로에서보다 형태를 취하게 될 것이며, 이는 최종적으로 분해되기 위해 표적화되는 여러 산화된 중간체를 초래한다. 따라서, 폴딩 동안의 중간체 수의 증가는 경로를 비천연 폴드를 유도하도록 초래할 것이다. 이 경우, 칼넥신과의 상호 작용은 폴딩의 후기 단계보다 분해의 초기 단계에서 일어날 것이다.

실시예 6. 막 결합 티로시나아제 글리코실화 돌연변이

컨센서스 서열 Asn-Arg-Thr이 결여된 티로시나아제 돌연변이를 위치 81에 구축하였다. 이는 Asn 81을 Gln으로 돌연변이시켜, sequon을 Gln-Arg-Thr로 변화시켜 얻었다. 돌연변이 Tyrmut1의 ER 잔류를 EndoH 절단 패턴으로 도 6에 나타낸다.

실시예 7. ER 잔류 신호를 함유하는 경막 도메인을 통해 부착되어진 막 결합 티로시나아제

티로시나아제 키메라 단백질(TyrE2)을 C형 간염 바이러스 피막 단백질(HCV E2) 경막 도메인 및 티로시나아제 엑토도메인을 사용하여 구축하였다. 도 7에 나타낸대로, TyrE2 키메라를 발현하는 세포 용해물의 EndoH 절단은 ER 잔류 프로파일을 가지는 단백질을 초래한다.

예시적인 구체예

추가적인 구체예는 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 발명은 하기 번호의 구체예들로 추가로 예시된다:

1. 소포체 내에 축적할 수 있는 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드.

2. 제1 구체예의 티로시나아제 돌연변이에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 칼넥신에 대한 감소된 친화성을 가지는 것인 폴리펩타이드.

3. 제2 구체예의 티로시나아제 돌연변이에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된 것인 폴리펩타이드.

4. 제2 구체예의 티로시나아제 돌연변이에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 폴리펩타이드.

5. 제2 구체예의 티로시나아제 돌연변이에에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위가 결핍된 것인 폴리펩타이드.

6. 소포체 내에 축적할 수 있는 가용성 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 면역원성 조성물.

7. 제6 구체예의 면역원성 조성물에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 면역원성 조성물.

8. 소포체 내에 축적할 수 있는 가용성 티로시나아제 돌연변이인 흑색종 항 원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.

9. 제8 구체예의 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된 것인 폴리뉴클레오타이드.

10. 제9 구체예의 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1에서 확인된 서열 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오타이드.

11. 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신.

12. 제11 구체예의 백신에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에서 확인된 서열 또는 이의 변형체를 포함하는 것인 백신.

13. 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.

14. 제13 구체예의 숙주 세포에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 이의 변형체를 포함하는 것인 숙주 세포.

15. 항원 표시 세포에 가용성 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 투여 및 세포독성 임파구 면역 반응의 유도를 포함하는 흑색종의 치료 방법.

16. 제15 구체예의 방법에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 세포의 소포체에 축적하는 것인 방법.

17. 제16 구체예의 방법에 있어서, 가용성 티로시나아제 돌연변이는 경막 도 메인이 결핍된 것인 방법.

18. 인간 티로시나아제의 절단된 형태를 구조화하는 것을 포함하는 티로시나아제 돌연변이의 제조 방법으로서, 티로시나아제는 경막 도메인이 결핍된 것인 방법.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원 및 특허들은 본원에 참조로서 그 전체가 포함된다.

[서열목록]

Claims (23)

1. 소포체 내에 축적할 수 있는 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 칼넥신에 대한 감소된 친화성을 가지는 것인 폴리펩타이드.
3. 제2항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된 것인 폴리펩타이드.
4. 제2항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 폴리펩타이드.
5. 제2항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위가 결핍된 것인 폴리펩타이드.
6. 소포체 내에 축적할 수 있는 티로시나아제 돌연변이를 포함하는 면역원성 조성물.
7. 제6항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 면역원성 조성물.
8. 소포체 내에 축적할 수 있는 티로시나아제 돌연변이인 흑색종 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
9. 제8항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된 것인 폴리뉴클레오타이드.
10. 제9항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 서열 번호 1에서 확인된 서열 또는 이의 변형체에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오타이드.
11. 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신.
12. 제11항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에서 확인된 서열 또는 이의 변형체를 포함하는 것인 백신.
13. 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 이의 변형체를 포함하는 것인 숙주 세포.
15. 항원 표시 세포에 티로시나아제 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계 및 세포독성 임파구 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는 흑색종의 치료 방법.
16. 제15항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 세포의 소포체 내에 축적하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 경막 도메인이 결핍된 것인 방법.
18. 인간 티로시나아제의 절단된 형태를 구축화하는 단계를 포함하는 티로시나아제 돌연변이의 제조 방법으로서, 티로시나아제는 경막 도메인이 결핍된 것인 방법.
19. 제3항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위가 결핍된 것인 폴리펩타이드.
20. 제19항에 있어서, 81 위치에서의 Asn 잔기가 Gln 잔기로 변화되는 것인 폴리펩타이드.
21. 제1항에 있어서, 티로시나아제 돌연변이는 티로시나아제 키메라인 것인 폴리펩타이드.
22. 제21항에 있어서, 티로시나아제 키메라는 다른 단백질의 경막 도메인을 통해 결합된 막이고, 경막 도메인은 ER 잔류 신호를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
23. 제22항에 있어서, 티로시나아제 키메라는 C형 간염 피막 단백질 2의 경막 도메인 내의 잔류 신호를 통해 ER 내에 잔류하는 것인 폴리펩타이드.

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