NO311366B1 - Isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra samme, samt fremgangsmåtefor å fremstille vaksine - Google Patents
Isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra samme, samt fremgangsmåtefor å fremstille vaksine Download PDFInfo
- Publication number
- NO311366B1 NO311366B1 NO19923659A NO923659A NO311366B1 NO 311366 B1 NO311366 B1 NO 311366B1 NO 19923659 A NO19923659 A NO 19923659A NO 923659 A NO923659 A NO 923659A NO 311366 B1 NO311366 B1 NO 311366B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fragment
- nucleic acid
- melanoma
- amino acid
- vaccine
- Prior art date
Links
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 13
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 40
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 21
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 21
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 20
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 17
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 17
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 17
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 16
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 15
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 15
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 101000608782 Mus musculus Tyrosinase Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 7
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 5
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 5
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 5
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 5
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000003367 Hypopigmentation Diseases 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101100154912 Mus musculus Tyrp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000003425 hypopigmentation Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 phenylthiocarbamyl amino Chemical class 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M propane-1-sulfonate Chemical compound CCCS([O-])(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149506 28 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108700000328 75kDa membrane Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101000588395 Bacillus subtilis (strain 168) Beta-hexosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 101001025146 Bartonella bacilliformis Cell division protein FtsZ Proteins 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710137943 Complement control protein C3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101000829189 Staphylococcus aureus Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710152003 Suppressor of silencing P0 Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101800003447 VP53 Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000003370 dye binding method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
- C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
- C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra samme, samt fremgangsmåte for å fremstille en vaksine.
Den molekylære identifikasjonen av immunogene determinanter på humane cancerceller, danner grunnlag for forståelsen av immunresponsen ved cancer. På humane melanomceller har to klasser av antigener fått spesiell oppmerksomhet som mål for immungjenkjennelse: 1) unike antigener uttrykt bare av autologe melanomceller (Old, L.J. (1981), Cancer immunology: The search for specificity. G.H.A. Clowes Memorial Lecture, Cancer Res. 41:361; Carey, T.E., T. Takahashi, L.A. Resnick, H.F. Oettgen og L.J. Old. (1976), Cell surface antigens of human malignant melanoma. I. Mixed hemadsorption assay for humoral immunity to cultured autologous melanoma cells, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 73:3278; Real, F.X., M.J. Mattes, A.N. Houghton, H. F. Oettgen, K.O. Lloyd og L.J. Old. (1984), Class 1 (unique) antigens of human melanoma: Identification of a 90.000 dalton cell surface glykoprotein by autologous antibody, J. Exp. MeJ 160:1219) og 2) differensieringsantigener normalt uttrykt av celler fra melanocyttisk linje (Houghton, A.N., M. C. Taormina, H. Ikeda, T. Watanabe, H.F. Oettgen og L.J. Old. (1980), Serological survey of normal humans for natural antibody to cell surface antigenes of melanoma, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4260; Houghton, A. N. , M. Eisinger, A.P. Albino, J.G. Cairncross og L. J. Old.
(1982), Surface antigens of melanocytes and melanoma: Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Exp. Med. 156:1755; Houghton, A.N., F.X. Real, L.J. Davis, C. Cardon-Cardo og L.J.Old. (1987), Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med. 164:812). Differensieringsantigener av melanocytter er blitt definert av deres forhold til andre veldefinerte fenotypiske markører uttrykt i løpet av melanocyttdifferensieringen (Houghton, A.N., M. Eisinger, A.P. Albino, J.G.Cairncross og L.J.Old. (1982), Surface antigens of melanocytes and melanomas: Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Exp. Med. 156:1755; Houghton, A.N., F. X. Real, L.J.Davis, C. Cardon-Cardo og L.J.Old. (1987) Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med. 164:812), og de mest distinktive er syntesen av pigmentet melanin innenfor melanosomer.
Kliniske observasjoner har foreslått at en immunrespons rettet mot antigener uttrykt av normale pigmentceller, kan influere på forløpet av metastatisk melanom. Vitiligo og hypopigmentering i pasienter med melanom, er spesielt blitt assosiert med en god prognose (Nordlund, J.J.,J.M.Kirkwood, B.M. Forget, G. Milton, D.M. Albert og A.B. Lerner. (1983) Vitiligo in patients with metastatic melanoma: a good prognosis sign, J.Am. Acad. Dermatol. 9:689; Bystryn, J.C., D. Rigel, R.J.Friedman og A. Kopf. (1987) Prognostic significance og hypopigmentation in malignant melanoma, Arch. Dermatol. 123:1053). I dette henseende kan melanosomale antigener bli gjenkjent av immunsystemet. Dette er blitt demonstrert ved immunopresipitering av et gp75 antigen fra autologe melanomceller fra serum IgG antistoffer til en pasient med metastatisk melanom (Mattes, J.M., T.M. Thomson, L.J. Old, og K.O. Lloyd. (1983) A pigmentation-associated, differentitation antigen of human melanoma defined by a precipitåting antibody in human serum, Int. J. Cancer. 32:717). gp75 antigenet er et melanosomalt polypeptid som er det oftest forekommende glykoproteinet syntetsiert av pigmenterte melanocytter og melanomer. (Tal, T., M. Eisinger, S.Ogata, og K.O. Lloyd. (1983). Glykoproteiner som diffe-rensieringsmarkører i humant malign melanom og melanocytter, Cancer Res. 43:2773). Epidermale melanocytter, benigne pigmenterte lesjoner og primære og metastatiske melanomer uttrykker gp75, men andre celletyper uttrykker det ikke (Thomson, T.M., F.X. Real, S. Murakami, C. Cardon-Cardo, L.J.Old, og A.N. Houghton. (1988). Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: Analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antlbodles, J. Invest. Dermatol. 90:459). Det er vist at gp75 cDNA har omtrent 90$ identitet med de oppnådde aminosyre- og nukleotidsekvensene til et musegen som er kartlagt til b (brown) locus. Brown locuset er et sete som bestemmer pels-fargen og influerer på typen av melanin som blir syntetisert, og dette tyder på at gp75 kan regulere eller innvirke på typen av melanin som blir syntetisert.
Det faktumet at IgG antistoffer i sera fra en pasient med metastatisk melanom er blitt vist å immunpresipitere gp75, demonstrerer at den immunologiske toleransen overfor gp75 kan bli brutt. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor ekspresjonsvektorer omfattende gp75 DNA for anvendelse som en vaksine overfor melanom, hvorved aminosyresekvensene til peptidene ble bestemt fra gp75 polypeptidet, som ble isolert og renset av det monoklonale antistoffet TA99 fra mus, og hvorved cDNA-kloner ble isolert ved screening med oligonuk-leotider basert på peptidsekvensene.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, kjennetegnet ved nukleinsyresekvensen:
Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra et fragment fra pg75 som omfatter: Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val; Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Thr-Tyr-Glu; og/eller Asn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser; eller en kombinasjon av hvilken som helst av de ovenfor nevnte aminosyresekvenser, kjennetegnet ved: (a) å gjenvinne plasmid pGP75 E-I som omfatter ull-lengde cDNA som koder for gp75 fra E. coli-stammen DH5a (ATCC-designasjonsnr. 68565); (b) isolere full-lengde cDNA som koder for gp75 fra plasmidet; (c) innsette det isolerte full-lengde cDNA som koder for gp75 fra trinn (b) eller et fragment derav inn i en ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens som er essensiell for replikasjon av ekspresjonsvektoren;
og
(d) tilpasse ekspresjonsvektoren fra trinn (c) i en vert for ekspresjon, for å uttrykke pg75-polypeptid eller fragment derav.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens som er essensiell for replikasjon og cDNA-molekylet som tidligere nevnt.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for å stimulere eller forsterke i et individ, til hvilket vaksinen blir administrert, produksjon av antistoffer rettet mot gp75, kjennetegnet ved: a) binding av en mengde av renset gp75-polypeptid kodet for nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, eller et fragment derav, effektiv i å stimulere eller forsterke antistoffproduksjon i individet, til en effektiv mengde av en adjuvant; og b) blande det bundne gp75 med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Oppfinnelsen omfatter ytterligere også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for å stimulere eller forsterke i et individ, til hvilket vaksinen blir administrert, produksjon av antistoffer rettet mot gp75, kjennetegnet ved: a) å tilpasse ekspresjonsvektoren ifølge krav 5, til en vert for ekspresjon, slik at den uttrykker gp75-polypeptidet eller fragment derav; b) binding av det uttrykte gp75-polypeptidet eller fragment derav til en effektiv mengde av en adjuvant;
og
c) blande det bundne gp75-polypeptidet eller fragment derav til en farmasøytisk akseptabel bærer.
Figur 1. Immunpresipitering og peptidsammensetnings-analyse av proteiner som blir gjenkjent av mAb TA99 og AU-serum.
A. En-dimensjonal SDS-PAGE av immunpresipitater fra <125>j_ merkede lysater av SK-MEL-19 ved mAb99 (kolonne 1), normalt humant serum (kolonne 2) og AU serum fra 1/75 (kolonne 3) og fra 10/76 (kolonne 4). B. Bånd tilsvarende gp75 eller gp75 behandlet med Endo H (delvis deglykosylert) ble spaltet ut fra SDS-polyakrylamidgelen og peptidsammensetningen ble analysert ved begrenset spaltning med S. aureus V8 protease på SDS-PAGE. -, gp75; +, gp75 delvis deglykosylert med Endo H. Autoradiografisk eksponering var 2 dager for TA99 og 5 dager for AU peptidene. Figur 2: Aminosyresekvensen til tre peptider avledet fra gp75. De understrekte aminosyreresidiene er de som er forskjellige fra residiene antatt fra muse cDNA pMT4 (Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri og R. Muller. (1986). Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res. 14:2413). Aminosyresekvensen til tre peptider avledet fra gp75. Figur 3: Delvis cDNA-sekvens av gpV5. 5' til 3' partiell cDNA-fragment fra nukleotid 778 til nukleotid 1524, er angitt. Figur 4: Isolering av et fullengde cDNA kodende for gp75. Et partielt restriksjonskart er representert med et 2,7kb gp75 cDNA-innskudd. En partiell nukleotidsekvens inneholdende de første nukleotidene av fullstendig 2,7 kb cDNA av gp75 er representert i 5' til 3' retningen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et isolert nukleinsyremolekyl hvor sekvensen koder for aminosyresekvensen for gp75 eller et fragment derav.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre aminosyresekvensen for et fragment av gp75 i en utførelsesform av oppfinnelsen som er asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tyr-asp-pro-ala-val. I en annen utførelsesform er aminosyresekvensen met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu. I en ytterligere annen utførelsesform er aminosyresekvensen asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et isolert cDNA-molekyl av gp75 nukleinsyremolekylet samt et isolert cDNA-molekyl av et fragment av gp75 nukleinsyremolekylet som har nukleotidsekvensen vist i figur 3 og aminosyresekvensen avledet derifra.
E.coli-stamme DH5a betegner GP75 E-I, inneholdende pGP75 E-I plasmid som omfatter plasmidvektoren betegnet pcvEx og et fullengde 2,7 kb GP75 cDNA-innskudd (se figur 4), er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. 20852, under ATCC aksesjonsnummer 68565. Deponeringene ble utført i henhold til Budapest-avtalen angående International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure (Budapest Treaty).
Plasmidet inneholdende full-lengde 2,7 kb cDNA kan bli isolert fra de deponerte E.coli-vertsstammene ved fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet (Maniatis, T. , E.F. Frish og J. Sambrook, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1,38-1,39, 1,42-1,343). Isolering av 2,7 kb GP75 cDNA fra plasmidet kan bli utført ved anvendelse av en restriks jonsendonukleasespaltning med EcoRI ved hjelp av velkjente fremgangsmåter innenfor dette fagområdet.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens vesentlig for replikasjon av vektoren kombinert med cDNA-molekylet til gp75 nukleinsyremolekylet eller fragmentet tilpasset for ekspresjon i en vert. Ekspresjonsvektoren kan være et vaksiniavirus eller fortrinnsvis en Imclone vektor.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for stimulering eller forsterkning i et individ som vaksinen blir administrert til, produksjon av antistoffer rettet mot gp75 omfattende ekspresjonsvektoren inneholdende cDNA-molekylet, en effektiv mengde av adjuvant og en farmasøytisk akseptabel bærer. Individet er fortrinnsvis et menneske og gp75 er bundet til adjuvanten. Adjuvanten kan være en mikrobiell adjuvant eller et hvilket som helst annet farmasøytisk middel.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for stimulering eller forsterkning i et individ som vaksinen blir administrert til, produksjon av antistoffer rettet mot gp75. Vaksinen kan om-fatte aminosyresekvensen avledet fra cDNA-molekylet til gp75 nukleinsyremolekylet eller fragment eller en mengde av renset gp75 eller fragment derav som er effektivt til å stimulere eller fremme antistoffproduksjonen i individet, en effektiv mengde av en adjuvant og en farmasøytisk akseptabel bærer. Individet er fortrinnsvis et menneske, og gp75 er bundet til adjuvanten. Adjuvanten kan være en mikrobiell adjuvant eller et hvilket som helst annet farmasøytisk middel.
Fremgangsmåter for behandling, forhindring og forsinking av tilbakevending av cancer, kan være rettet mot en cacner så som melanom. Vaksinene kan forhindre cancer så som melanom i pasienter som har høy risiko for tilbakevendende eller primær melanom.
I disse fremgangsmåtene kan gp75 være bundet til adjuvant. I tillegg kan en effektiv mengde cyklofosfamid bli administrert til individet før administrering av vaksinen.
Foreliggende oppfinnelse er illustrert i den eksperimentelle delen som følger. Disse delene er angitt for å behjelpe forståelsen av oppfinnelsen, men skal ikke begrense denne på noen måte.
I foreliggende søknad blir forskjellige publikasjoner refe-rert til. Beskrivelsen av disse publikasjonene er i sin helhet inkorporert som referanse inn i foreliggende oppfinnelse, for å mere fullstendig beskrive teknikkens stand som foreliggende oppfinnelse vedrører.
EKSPERIMENT 1
Materiale og metoder
Vevskultur: Melanomcellelinje SK-MEL-19 ble dyrket i MEM pluss 1$ ikke-essensielle aminosyrer, og penicillin og streptomycin, med unntagelse av at SerumPlus 10$ (v/v)
(Hazelton Research Products Inc., Lenexa, KS) ble erstattet med fetalt kalveserum (FCS).
Isolering og rensing av gp75: Post-nukleær membranfraksjon fra melanomcellelinje SK-MEL-19 ble isolert ved homogeni-sering av cellene i 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 2 mM PMSF og sentrifugering ved 10.000 x g. Membranene ble oppløst i 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 3 M KC1 og 5mM EDTA og sentrifugert ved 100.000 x g. Den uoppløselige proteinf raks j onen ble resuspendert i 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 0, 5% natriumdeoksycholat. Detergentoppløselige proteiner ble samlet ved sentrifugering ved 100.000 x g. Supernatanten ble dialysert mot 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl og 2 mM CHAPS og applisert på en Mono Q (HR 5/5, Pharmacia LKB Biotechnology Inc. Piscataway, NJ) kolonne ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl og 2 mM (3-[(3-cholamidpropyl)dimetylammonio]1-proppansulfonat (CHAPS) (buffer A). Bundede proteiner ble eluert med en lineær gradient bestående av 0-1,0 M NaCl i buffer A. Fraksjonene ble analysert for gp75 ved hjelp av en konkurrerende inhibisjonsanalyse. Fraksjoner inneholdende gp75 ble slått sammen, dialysert mot Con A kolonne buffer (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, inneholdende 1 mM CaCllt ImM MnCl2 og 2 mM PMSF) og applisert på en Con A-Sepharose-kolonne. Ubundede proteiner ble fjernet ved vasking med kolonnebuffer. Proteinet bundet til Con A ble eluert med 0,25 M a-D-metylmannopyranosid i Con A kolonnebuffer. Fraksjoner inneholdnede gp75 ble slått sammen og dialysert mot 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM CHAPS og 2 mM PMSF (CB) og tilført til et musemonoklonalt antistoff (mAb) TA99 (Thomson, T.M., J.M. Mattes, L. Roux, L.J.Old og K.O.Lloyd (1985). Pigmentation-associated glykoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermatol. 85:169). Affi-Gel 10 affinitetskolonne. Gelen ble vasket sekvensielt med 6 ml av hver av CB, CB + 1 M NaCl, CB, og CB + 2 mM CHAPS. Bundet gp75 ble eluert fra kolonnen med 0,1 M glycin-HC1, pH 3,1, inneholdende 2 mM CHAPS.
Konkurrerende inhibisjonsanalyse for gp75: I løpet av rensingen ble gp75 registrert og kvantifisert ved måling av evnen som fraksjonene har til å inhibere bindingen av 300 ng/ml mAb TA99 til SK-MEL-19-celler fiksert i metanol: aceton (1:1 vol/vol) ved enzymimmunoanalyse (ELISA) (Houghton, A.N., H. Brooks, R.J. Cote, M. C. Taormina, H.F. Oettgen og L.J.Old. (1983). Detection of cell surface and intracellular antigens by human monoclonal antibodies: hybrid cells derived from lymphocytes of patients with malignant melanoma, J. Exp. Med. 158:53).
Immunopresipltering. gelelektrof orese og peptidkart legging: Jodinering av Con A-Sepharose-bundet proteinf raks jon av SK-MEL-19 ved kloramin T-metoden og immunopresipitering med mAb TA99 og AU serum ble utført som beskrevet (Mattes, J.M., T.M. Thomson, L.J. Old, og K. 0. Lloyd. (1938) A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defines by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer. 32:717). Proteiner ble analysert ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) (Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature. 227:680). For endoglykosidase H (Endo H) spaltning, ble immunopresipitåtene suspendert i 0,4$ SDS, oppvarmet ved 100° i 5 minutter og spaltet med 1 mU Endo H (Genzyme Corporation, Boston, MA) i 100 mM sitratbuffer, pH 5,5 i 16 timer ved 37°. To-dimensjonal elektroforese ved anvendelse av amfoliner pH 5-7 (LKB-Produkter, Bromma, Sverige) ble utført ifølge 0'Farrel (0'Farrel, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J. Biol. Chem. 250:4007). Peptidkartlegging av immunpresipi-tert gp75 ble utført ved begrenset proteolyse med Staphylo-coccus aureus V8 protease (V8 protease) (Boehringer Mannheim Biochemicals. Indianapolis, IN) i SDS-PAGE ifølge Cleveland et al. (Cleveland, D.W., S.G. Fisher, M.W. Kirschner, og U.K. Laemmli. (1977) Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 252:1102).
Peptidsekvenserln<g>: Peptidsekvensering ble utført ved Harvard University Microchemistry Facility. Renset gp75 (12 pg) elektroblottet på nitrocellulose ble spaltet med V8 protease (1:20 v/v) ifølge Aebersold (Aebersold, R.H., J. Leavitt, R.A. Saavedra, og L.E. Hood. (1987) Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 84: 6970) og resulterende peptider ble separert på en Brownlee RP-300 2,1x100 mm C8 kolonne ved 30°C. Flere topper fra V8 protease spaltningen ble slått sammen og tørket. Fullstendig reduksjon og alkylering ble utført ved tilsetning av 50 pl 8 M urea/0,4 M ammoniumbikarbonatbuf f er, pH 8,0, 5 pl 100 mM ditiotreitol og oppvarming ved 50°C i 15 minutter. Prøven ble deretter inkubert med 5 pl 45 mM jodeddiksyre i 15 minutter ved romtemperatur og fortynnet med 140 pl destillert vann. Ytterligere spaltning av redusert og alkylert peptidfraksjon med trypsin (1:25 v/v) ble utført overnatt ved 37°C. Fraksjoner som skulle bli sekvensert ble direkte applisert på polybrenprecyklisert glassfiberfiltre og sekvensert på en ABI 477A proteinsekvensator. Aminosyrene ble separert med en ABI 120A online HPLC. For hvert peptid ble et minimum av 20 cykluser utført. Det repiterende utbyttet av HPLC under rutinemessige laboratoriebetingelser var 93%. Aminosyresekvenser av bare de petidene med høyest konfidensresultater er rapportert.
Kloning og sekvensering av gp75 cDNA: Et cDNA-bibliotek ble konstruert fra en melanomcellelinje SK-MEL-19. Oligonukleo-tidproben ble anvendt for å isolere en gp75 cDNA-klon ifølge metoder som er tidligere beskrevet. (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi, og A. N. Houghton. (1989). Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med. 169:2029). Sekvensen av oligonukleotidprobene var:
5' CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC 3'
En 2,0-kb cDNA-klon, betegnet GP75-1, ble sekvensert (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Nukleotidsekvensen til GP75-1 er blitt deponert til EMBL databank under aksesjonsnummer X51455. (Se figur 3).
Resultater og diskusjoner.
Både muse mAb TA99 og serum fra melanompasient AU immunopre-sipiterte et 75-kDa antigen, og mAb TA99 preklarerer gp75 antigenet presipitert av AU serumet (Thomson, T.M., J. M. Mattes, L. Roux, L.J. Old, og K.O. Lloyd (1985) Pigmentation-associated glykoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermatol. 85:169). På grunn av at mAb TA99 ble anvendt for å rense gp75 fra melanomcellelinje SK-MEL-19, var det viktig å bekrefte at mAb TA99 bare detekterte gp75 antigenet gjenkjent av AU serum. I tidligere studier har vi vist at mAb TA99 ikke reagerer med human tyrosinase, et 75-80 kDa glykoprotein også uttrykt i pigmenterte melanocytter (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi, og A. N. Houghton. (1989). Induction of pigmentation i mouse fibroblasts by expresslon of human tyrosinase, J. Exp. Med. 169:2029). Ut fra disse eksperimentene kunne vi derimot ikke utelukke muligheten av at mAb TA99 kryssreagerte med andre polypeptider uttrykt ved SK-MEL-19.
Proteiner immunopresipitert med mAb TA99 og AU serum antistoff ble analysert ved en- og todimensjonal SDS-PAGE og ved peptidkart ved anvendelse av begrenset proteolyse med S. aureus V8 protease. Proteiner presipitert med både mAb TA99 og AU serum antistoffer, har identiske molekylvekter (75 kDa), isoelektrisk punkt (5,5-5,9), og peptidsammensetning (fig. 1), som bekrefter at TA99 og AU serum gjenkjente det samme gp75 molekylet.
gp75 antigenet ble renset som beskrevet i materialer og metoder. Af f initetsrenset gp75 ble anvendt for peptid-sekvenseringen. Aminosyresekvensene til tre indre peptider ble oppnådd ved proteolyttisk spaltning av renset gp75 med V8
protease og trypsin. Sekvensene til de tre peptidene er vist i figur 2. Det var 90% identitet med aminosyresekvenser avledet fra muse-cDNA-klonen, pMT4 , isolert av Shibahara et al., (ved aminosyreposisjonene 247-260, 333-349, og 428-441 til pMT4) (Shibahara, S. , Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri og R. Muller. (1986). Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res. 14:2413). Oligonukleotidprobene ble avledet fra peptidsekvensene til gp75 og anvendt for å screene et cDNA-bibliotek konstruert fra den humat melanomcellelinjen SK-MEL-19. To cDNA-kloner (1,8 og 2,0 kb) ble isolert fra et cDNA bibliotek til SK-MEL-19. Delnukleotidsekvensene til cDNA-klonene (GP75-1 og -2), der en er vist i figur 3, viste 88,6$ identitet med pMT4 (mellom nukleotidene 649-1437 innenfor den åpne leserammen). Den avledete aminosyresekvensen til GP75-1 og -2 viste 93,6$ identitet med den avledete aminosyresekvensen til pMT4 mellom aminosyreresidiene 219-467. Det var 55,3$ identitet mellom cDNA-sekvensene til gp75 og humant tyrosinase (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi, og A. N. Houghton. (1989). Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J., Exp. Med. 169:2029) mellom nukleotidene 618-1344 av tyrosinase.
Den nære homologien mellom human gp75 og det avledete produktet av muse-pMT4-genet, viser den mulige strukturen og funksjon til gp75. pMT4-klonen ble isolert fra musemelanocyt-tiske celler (Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri og R. Muller. (1986) Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res. 14:2413). Opprinnelig var det antatt at pMT4 cDNA kodet for musetyrosinase, som er kartlagt til muse c (albino) locus. Ytterligere studier viste derimot at pMT4 er forskjellig fra musetyrosinase (Yamamote, H. , S. Takeuchi, T. Kudo, K. Makino, A. Nakata, T. Shinoda og T. Takeuchi, T. Kudo, K. Makino, A. Nakata, T. Shinoda og T. Takeuchi. (1987) Cloning and sequencing of mouse tyrosinase cDNA, Jpn. J. Genetics. 62:271; Muller, G. , S. Ruppert, E. Schimd og G. Schutz (1988) Functional analysis of alternatively spliced tyrosinase gene transcripts, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ. J.) 7:2723; Jackson, I.J. (1988) A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 85:4392). Sekvensen til gp75 er forskjellig fra sekvensen til human tyrosinase, til tross for at det er en begrenset identitet (43,1$) mellom gp75 og den avledete aminosyresekvensen til human tyrosinase (mellom aminosyreresidiene 208-459). Funksjonen av gp75 og pMT4 produktet er foreslått ved det funnet at pMT4 er kartlagt til b (brown) locuset i mus (Jackson, I.J. (1988) A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 85:4392), en region som regulerer kappefarven (Silvers, W.K. (1979) Comparative genetics of coat colour in mammals, In: The Coat in Mice, Springer Verlag, New York. 1). Homologien mellom gp75 og den avledete aminosyresekvensen til pMT4 muliggjør den formelle identifikasjonen av den humane homologen av brown locus genproduktet fra mus. Basert på den melanosomale beliggenheten og de strukturelle likhetene til tyrosinase, kan gp75 molekylet regulere melaninsyntesen og bestemme typen av melanin som blir syntetisert.
Det er blitt oppdaget at melanosomale determinanter og andre intracellulære antigener ikke er potensielle mål for immun-terapi av melanom. Det er derimot nylig blitt klart at intracellulære proteiner kan bli prosessert og presentert som peptider ovenfor cytotoksiske T-celler (CTL) av antigenpre-senterende celler (Townsend, A.R.M., og H. Bodmer. (1989) Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes, Ann. Rev. Immunol. 7:601). Dette funnet åpner for den teoretiske muligheten av at T-celle-responser overfor melanom kan være rettet mot molekyler uttrykt innenfor tumorcellen. Melanosomale komponenter som normalt blir transportert utenfor melanocyttene i løpet av modning, kan alternativt akkumulere i det ekstracellulære området rundt tumorcellene, eller så kan lokal vevsnekrose føre til frigjøring og avsetning av intracellulære produkter. På grunn av tilgjengeligheten av gp75, blir radioaktivt merket TA99 mAb spesifikt lokalisert til humane melanomxenografer i nu/nu mus (Welt, S. , J. M. Mattes, R. Grando, T.M. Thomson, R. W. Leonard, P.B. Zan-zonico, R. E. Bigler, S. Yeh. H. F. Oettgen, og L.J. Old.
(1987) Monoclonal antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplants in nu/nu mice, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 84:4200), som indikerer tilgjengeligheten av antigenet overfor antistoff innenfor tumorseter.
IgG antistoffer i melanompasienten AU gjenkjente determinant-ene på gp75 som var felles mellom melanomceller og normale melanocytter (Mattes, J. M., T. M. Thomson, L.J.Old, og K.-O. Lloyd. (1983) A pigmentation-assosciated, differentiation antigen of human melanoma defined by precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer. 32:717). Med isolering av cDNA-kloner som koder for gp75, vil det være mulig å studere strategier for aktiv immunisering overfor gp75. Det er minst to krav for effektiv induksjon av CTL-responser overfor gp75 ;
1) immuntoleranse overfor gp75 må bli brutt, og 2) gp75 peptidene må bli prosessert og effektivt presentert av hoved-histokompatibilitetsantigenene på melanomcellene. Alternativt er det mulig at differensieringsantigener av melanocytter kan bære unike determinanter. Gener som koder for produkter uttrykt for normale melanocytter, kan bli mutert eller rearran-gert i løpet av den maligne transformeringen, som danner nye epitoper for gjenkjenningen av CTL og antistoffer. I dette henseende er det best karakteriserte unike antigenet på humane melanomceller en determinant på melonotransferin, et 95-97 kDa glykoprotein uttrykt på dyrkede melanocytter og melanomceller (Real, F.X., M.J. Mattes, A.N. Houghton, H.F. Oettgen, K.O. Lloyd og L.J.Old. (1984) Class 1 (unique) antigens of human melanoma. Identification of a 90.000 dalton cell surface glykoprotein by autologous antibody, J. Exp.Med 160:1219; Furakawa, K.S., K. Furakawa, F.X. Real, L. J. Old, og K.O. Lloyd. (1989) A unique antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glykoprotein gp75/p97, J. Exp. Med. 169:585). Med grunnlag i denne muligheten er genetiske endringer blitt detektert ved høy frekvens og spredt gjennom genomet til de humane melanomcellene. (Dracopoli, N.C.A.N.' Houghton, og L.J.Old. (1985) Loss of polymorphic restriction fragments in malignant melanoma: Implications for tumor heterogeneity, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 82:1470: Dravopoli, N.C., B. Alhadeff, A.N. Houghton, and L.J.Old (1987) Loss of heterozygosity at autosomal and x-linked loci during tumor progression in a patient with melanoma, Cancer Res. 47:3995).
EKSEPERIMENT 2
Materialer og metoder
Isolering av 2. 7 kb GP75 cDNA i X f agen: 2,0 Kb GP75 cDNA fragmentet beskrevet i eksperiment 1 (for sekvens se figur 3) ble anvendt for å screene et bibliotek. En genomisk klon som inneholdt GP75-genet ble oppnådd.
cDNA- biblioteket og screening: Et cDNA-bibliotek ble konstruert fra 3 ug poly(A)+ selektert mRNA (Maniatis, T. , E.F. Frish og J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 545pp.) fremstilt fra den humane melanotiske melanomcellelinjen SK-MEL-19 (Houghton, A.N., M.Eisinger, A.P. Albino, J.G. Cairncross, og L.J.Old. 1982. Surface antigens of melanocytes and meanoma: markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets. J. Ezp. Med. 156:1755). Full-lengde cDNA ble syntetisert, gjort butt-endet ved anvendelse av Klenow-enzym og påført hale med Eco RI-linkere (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) (Gubler, U. , og B.J. Hoffman. 1983. A simple and very efficient method of generating cDNA libraries. Gene (Amst.). 25:263). cDNA ble deretter størrelsesseparert på Ultrogel Aca 34 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) (Watson, C.J., og J.F. Jackson. 1985. Constructing and screening cDNA libraries in Xgt 10 and Xgt 11. In DNA Cloning: A Practical Approach. D.M.
Glover, editor. IRL Press Limited, Oxford. 79-100). cDNA-molekylene >800 bp ble avendt for å konstruere et bibliotek av 3 x 10^ rekombinante i X fag vektor gtlO (Huynh, T.V. , R.A. Young, og R.W. Davis. 19985. An alternative procedure for the synthesis of double stranded cDNA for cloning in phage and plasmid vectors. In DNA Cloning: A Practical Approach. D.M. Glover, editor. IRL Press Limited, Oxford. 49-78).
For screening ble et fragment basert på den 5' terminalkod-ende regionen til den genomiske klonen oppnådd ovenfor, anvendt. 2,7 kb cDNA i X fag ble oppnådd. (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi, og A. N. Houghton. (1989) Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med. 169:2029).
Isolering av 2. 7 kb cDNA: Restriksjons-endonukleasespalt-ning med Eco RI ble utført på 2,7 kb cDNA GP75 innskuddet. DNA ble renset ved ekstrahering med fenolkloroform og etanolpresipitering. DNA ble påny løst opp i TE (pH 7,6) ved en konsentrasjon på 100 pg/ml. Ligering av den kohesive termini ble utført ved følgende fremgangsmåte. De følgende ligeringsblandingene ble satt opp: 1) 0,1 pg pcvEx vektor DNA ble overført til et sterilt mikrosentrifugeringsrør. En ekvimolar mengde 2,7 kb GP75 cDNA ble tilsatt. 2) H20 ble tilsatt til 7,5 pl og oppløsningen ble varmet til 45°C i 5 minutter for å smelte eventuelt kohesive termini som var dlitt sammensmeltet på ny. Blandingen ble avkjølt til 0°C. 3) Deretter ble 1 pl 10 x bakteriofag T4 DNA-ligasebuf f er (200 mM Tris Cl (pH 7,6), 50 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol, 500 pg/ml bovint serumalbumin (Fraksjon V; Sigma)) tilsatt, 0, IV/ei ss enhet bakteriofag T4 DNA-ligase og 1 pl 5mM ATP. Reaksjonene ble inkubert i 1-4 timer ved 16°C. Plasmid pGP75 E-I angitt i figur 4, som inneholder plasmidvektoren pcvEx og 2,7 kb GP75 cDNA-innskudd, ble oppnådd.
Fremstilling av kompetente E. coli: 1-2 pl av hver av ligeringsreaksjonene ble anvendt for å transformere kompetente E.coli ved følgende metode. Først ble 5 ml LB inokulert med enkeltkoloni fra frisk overnattplate. Deretter ble cellene dyrket i 5-7 timer i en rister. Deretter ble 1 liter LB i 4 liters flasker inokulert med 4 ml av det ovennevnte. Dette ble dyrket til en 0.0.550= °»15' Dette ble sentrifugert i 10 min. ved 3 K og resuspendert i 400 ml 100 mM CaCl2 ved 0°C. Dette ble påny sentrifugert i 10 ml 3K og resuspendert i 10 ml 100 mM CaCl2 ved 0°C. 2,5 ml 80% glyserol ble tilsatt.
Transformerin<g> av DH5a E. coli: 1-20 pl GP75 E-I plasmid ble tilsatt til 100 pl kompetente celler. Dette ble holdt på is i 20 min. Deretter varmesjokkbehandlet i 1 min. ved 42° C. Deretter påny plassert på Isen i 10 min. Cellene ble sentrifugert i 10 sekunder i en mikrofuge og resuspendert i 200 pl LB. Dette ble inkubert i 45 min. ved 37°C på en rister.
Resulterende E.coli inneholdende pGP75 E-I plasmid ble deponert til ATCC.
EKSPERIMENT 3
Materialer og metoder
Reagenser: L-[ring-3,5-<3>H]tyrosin (spesifikk aktivitet 46,7 Ci/mmol) ble oppnådd fra ICN (Irvin, CA). Konkanavalin A-Sepharose og protein A Sepharose CL 4B var fra Pharmacia (Piscataway, NJ). Affigel-10 var fra Bio-Rad (Richmond, CA). Alle elektroforesekjemikalier var fra BRL (Gaithersburg, MD). Deoksycholinsyre (natriumsalt), nonidet P-40, (3-[(3-chol-amidamidopropyl)dimetyl-ammonio] 1-propansulfonat (CHAPS), fenylmetansulfonyl-fluorid (PMSF) og a-D-metylmannopyranosid, alkalin-fosfatkonjugert geite-anti-muse-IgG, alkalisk fosfatasefarve-utviklingsreagens og alle andre reagenskvali-tetskjemikalier var fra Sigma (St. Louis, MO). HPLC-grad vann og andre reagens-grad organiske oppløsningsmidler var fra Fisher (Pittsburgh, PA). Muse-MAb TA99 (I TA99 (IgG2a) og F23
(IgG2a) ble renset ved anvendelse av A Sepharose. TA99 Mab er et anti-gp75 antistoff (Thomson, T.M., Mattes, J.M., Roux, L., Old L.J. og Lloyd, K.O., Pigmentation-associated glykoprotein of human melanoma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, J. invest. Dermat., 85, 169-174, 1985) og Mab F23, anvendt som kontrollantistoff, er et antihumant kolon karsinomantistoff som ikke reagerer med humane melanocyttiske celler.
Vevskultur: Melanomcellelinje SK-MEL-19 ble dyrket og ført i MEM supplementert med 10% serum pluss (Hazelton, Lenexa, KS) som beskrevet av Vijayasaradhi, S., Bouchard, B.B. og Houghton, A.N. , The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. exp. Med., 171, 1375-1380 (1990).
Isolering og rensing av gp75: Alle prosedyrene for rensing av gp75 ble utført ved 0-5° C dersom ikke annet er angitt. Semi-konfluente SK-MEL-19 melanomceller ble høstet fra 150-cm^ flasker ved skraping med en spatel, samlet i vevskultur-medium og sentrifugert, og cellen (60-g pellet) ble deretter vasket med PBS. Cellene ble suspendert i 300 ml 20-mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgClg, 2 mM PMSF i 10 min. og homogenisert i en Dounce homogenisator. Cellelysering ble registrert ved fase-kontrast-mikroskopi. Homogenatet ble sentrifugert ved 1.000 g i 10 min. og deretter ble supernatanten samlet og sentrifugert ved 10.000 g i 30 min. Den rå membranpelleten ble suspendert i 50 ml 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 3 M KC1 og 5 mM EDTA, forsiktig homogenisert i en Dounce homogenisator og sentrifugert ved 100.000 g i 90 min. Pelleten ble resuspendert i 30 ml 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 0, 5% natriumdeoksycholat og forsiktig homogenisert. Homogenatet ble sentrifugert ved 100.000 g og supernatanten ble dialysert mot 200-300 vol. 20-mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl og 2 mM CHAPS i 24 timer. Dialysatet ble klargjort ved sentrifugering ved 10.000 g i 90 min. Den klare supernatanten fra dette trinnet ble applisert på en Mono Q (Pharmacia, HR 5/5) kolonne ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl og 2 mM CHAPS (buffer A), via Superloop (Pharmacia) ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Kolonnen ble vasket med 10 ml buffer A, bundede proteiner ble eluert med en 30-ml lineær gradient bestående av 0-1,0 M NaCl i buffer A og 1 ml fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjonene ble analysert for gp75 ved en konkurrerende inhibisjonsanalyse og positive fraksjoner ble slått sammen og dialysert mot 100 vol. Con A kolonnebuffer, 10 mM Tris/HCl, pH 7,5. inneholdende 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 og 2 mM PMSF i 18 timer.
Con A- Sepharose kromatografi: Con A-Sepharose (5 ml) ble vasket med 50 ml Con A kolonnebuf fer i 10 ml Econo-kolonne (Bio-Rad) og slått sammen, dialyserte fraksjoner fra mono Q ionebyttekromatografi ble applisert på kolonnen ved en strømningshastighet på 1,0-1,5 ml/min. Eluatet ble påny applisert på kolonnen og kolonnen ble vasket med kolonnebuffer helt til absorbansen (280 nm) av eluatet var under 0,01. Proteinet bundet til Con A ble eluert med 0,25 M a-D-metylmannopyranosid i Con A kolonnebuffer og 1,5-2 ml fraksjoner ble oppsamlet. Inkubasjon av kolonnen med elueringsbuffer i 15-20 min. ved 25-30"C før eluering forbedret utbyttet av protein. Fraksjoner inneholdende gp75 ble slått sammen og dialysert mot 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM CHAPS og 2 mM PMSF og applisert på TA99 Affi-gel 10 affinitetskolonne.
TA99 affinitetskromatografi: TA99 MAb ble renset fra ascites av (BALB/c X C57BL/6) F-^ mus ved ammoniumsulf at-presipitering etterfulgt av kromatografi over protein A-Sepharose og Sephadex G-25 kolonner. Affi-gel 10 ble preparert for kobling ifølge forhandlerens instruksjoner og vasket med kald koblingsbuffer (CB), 50 mM HEPES, pH 7,6, 150 mM NaCl. Koblingsreaksjonen ble utført ved 4°C i 4 timer med 9 mg renset TA99 IgG pr. 2 ml Affi-gel i et totalt volum på 6 ml koblingsbuffer. Ukoblet sites ble blokkert ved inkubering med et likt volum 0,1 M etanolamin HC1, pH 8,0 i 1 time ved 4°C. Gelen ble deretter vasket sekvensielt med CB, CB + 1,5 M NaCl, CB, og til slutt med 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl og 2 mM CHAPS. Koblingseffektiviteten ble bestemt ved måling av antistofftiter TA99 i den klare supernatanten til koblingsreaksjonen ved ELISA mot SK-MEL-19 melanomceller før og etter 4 t koblingsreaksjonen. Koblingseffektiviteten var 60-80$ og omtrent 5 mg TA99 IgG ble koblet pr. ml Affi-gel 10. Sammenslått og dialysert proteinoppløsning fra Con A kromatografi ble applisert på 2 ml MAb TA99-Af f i-gel 10 kolonne ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. og eluatet ble påny applisert på kolonnen. Gelen ble deretter vasket sekvensielt med 6 ml av hver av CB, CB + 1 M NaCl, CB, og CB + 2 mM CHAPS. Bundet gp75 ble eluert fra kolonnen med 0,1 M glycin-HCl, pH 3,1 inneholdende 2 mM CHAPS.
Enzymbundet immunosorbentanalyse for gp75: For ELISA ble trypsinerte celler sådd ut ved 500-2000 celler/brønn i mikrobrønnskåler (Microtest Plates 3034, Falcon, Oxnard, CA) og dyrket i 48-72 t ved 37°C i 5% C02 i en fuktvevskulturin-kubator . Skålene ble vasket med PBS, fiksert med avkjølt (-20°C) metanol:aceton (1:1 v/v) i 10 min. og deretter vasket 3 ganger med kald PBS Inneholdende 0, 2% natriumsyre. Skålene med fiksert og permeabiliserte celler ble lagret ved 4"C. TA99 antistofftiter ble bestemt på friskt fikserte skåler ved ELISA. (Ingen signifikant forandring ble observert i titer med MAb TA99 ved lagring av skålene ved 4°C opptil 6 måneder). Cellene ble Inkubert med MAb TA99, 10 pl pr. brønn, og fortynnet i serie i PBS inneholdende 5% gamma-globulinrie FBS (GGFFBS) i 45 min., og deretter ble skålene vasket 3 ganger med PBS inneholdende 2% GGFFBS og alkalin-fosfatase-konjugert geite-anti-muse IgG (fortynnet 1:200 i PBS med 5% GGFFBS) og tilsatt til hver brønn og inkubert i 45 min. Skålene ble vasket tre ganger som ovenfor og 18 pl alkalin-fosfatasesubstratoppløsning (p-fenyl-dinatriumfosfat i dietanolaminbuf fer, pH 9,8. 5 mM MgClg) ble tilsatt. Etter 15-20 min. inkubasjon ved 37°C i et fuktekammer, ble den optiske tettheten målt ved 405 nm i en Artek (Chantilly, VA) mikroskålavleser (modell 210).
Konkurrerende inhlbis. ionsanalvse for gp75: I løpet av de innledende trinnene, ble rensing av gp75 registrert og kvantifisert ved måling av evnen som fraksjonene har til å inhibere bindingen av MAb TA99 til SK-MEL-19-celler ved ELISA som beskrevet ovenfor. Subcellulære fraksjoner eller fraksjoner fra kolonnekromatografi ble fortynnet i serier i 96-brønn mikrotest-skåler. TA99 antistof ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 300 ng/ml (like under metningsbindingen til SK-MEL-19). Antigen-antistoffblandingen ble inkubert ved romtemperatur i 30 min. og deretter applisert på SK-MEL-19-celler i mikrobrønnskåler. Mengden av MAb TA99 bundet til SK-MEL-19-celler ble målt ved ELISA som beskrevet ovenfor. En aktivitetsenhet av gp75 ble definert som mengden av protein nødvendig for halvmaksimal inhibisjon av MAb TA99 (300 ng/ml) binding til SK-MEL-19-celler.
Gelelektroforese og elektroblotting: Proteiner ble analysert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (Laemmli, U.K., Cleavage og structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature (Lond.), 227, 680-685, 1979) og visualisert ved sølvfarving (Oakley, B.E., Kirsch, D.R. og Morris, N.R. , A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in acrylamide gels, Anal. Biochem. , 105, 361-363, 1980). Proteinene ble elektroblottet i en Transphor apparatur (Hoefer, San Francisco, CA) på PVDF (polyvinyliden difluorid) membran (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) for N-terminal sekvensering og analyse av aminosyresammen-setningen som beskrevet av Matsudaira, P. , Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted on to polyvinylidene difluoride membranes, J. Biol. Chem., 262, 10035-10038, 1987.
Aminosvreanalvse: Aminosyreanalyse av proteinprøve overført til PVDF membran ble utført ved Harvard University Microchemistry Facility. Proteiner (0,6 ug og 0,8 pg) ble hydrolysert i 6 N HC1 i 24 t ved 110° C. Frie aminosyrer ble derivatisert med fenylisotiocyanat og de resulterende fenyltiokarbamyl-aminosyrene ble analysert ved HPLC som beskrevet av Ebert, R. F., Amino acid analysis by HPLC: optimized conditions for chromatography of phenylthiocarbamyl derivatives, Anal. Biochem., 154, 431-435, 1986.
Immunopresipiteringsanalvse for tyrosinhydroksylaseaktivitet: Aliquoter på 100 jig detergent-solubilisert ( 1% NP40 i PBS) melanom (SK-MEL-19) celleekstrakter ble inkubert med 3-15 jjg MAb TA99 (anti-gp75), MAb F23 eller PBS i et totalvolum på 45 pl ved 4°C med kontinuerlig blanding i 90 min. Protein A Sepharose CL 4B ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 6 mg/ml. Etter 2 t inkubasjon ved 4°C, ble supernatantene oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 5 min. ved 4°C. Pelletene ble vasket 5 ganger med PBS inneholdende 1% NP40 og suspendert i 50 pl av den samme bufferen. Tyrosinhydroksylaseaktivitet ble målt i supernatanter og pelleter. Omtrent 85$ av den totale tyrosinhydroksylase-aktiviteten tilstede i celleektraktene før tilsetning av protein A Sepharose, ble reproduserbart isolert i supernatantene til PBS-kontrollen. Enzymaktiviteten isolert i supernatantene til celleekstraktene inkubert med antistoff og protein A Sepharose blir uttrykt som prosentvis aktivitet isolert i PBS-kontrollen.
Tyrosinhydroks<y>laseanal<y>se: Tyros inhydroksylaseakt iviteten ble analysert som beskrevet av Pomerantz, S.H., L-tyrosine-3,5-H assay for tyrosinase development in skin of newborn hamsters, Science, 164, 838-839, 1969 med mindre modifika-sjoner (Bouchard, B., Fuller, B., Vijayasaradhi, S. og Houghton, A. N., Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. eksp. Med., 169, 2029-2042, 1989). En enhet enzymaktivitet ble definert som mengden protein nødvendig for å frigjøre 1 pmol <3>H20 fra <3>H tyrosin i 1 time ved 37 °C.
Proteinbestemmelse: Proteinkonsentrasjonen ble vurdert ved farvebindingsmetoden (Bradford, M. , A rapid and ultrasensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976) ved anvendelse av Bio-Rad Protein-analysesystemet. Renset gp75 ble kvantifisert ved vurdering av farveintensiteten til proteinbåndet på polyakrylamidgel til en serie kjente mengder (10-100 ng/protein-bånd) sølvfarvede molekylvektsmarkørproteiner.
Post-nukleær membranfraksjon av melanomcellelinjen SK-MEL-19 ble anvendt som en kilde for gp75 antigen. Membranfraksjonen ble behandlet med høysalt (3 M KC1), og høy-salt-uoppløselig fraksjon ble deretter oppløst i detergenten deoksycholat. Alle subcellulære fraksjoner, med unntagelse av den nukleære pelleten, ble analysert for tilstedeværelse av gp75 ved en konkurrerende ELISA som målte inhibisjonen av MAb TA99 bindingen til SK-MEL-19-celler (gp75 aktivitet), gp75 ble bare detektert i den deoksycholat-oppløselige membranfraksjonen, men ikke i den høy-salt-oppløselige fraksjonen. Dette er i samsvar med en indre membranlokalisering av gp75. Melanosomal membranlokalisering av gp75 ble vist ved metabolisk "pulse-chase"-merking av melanomceller med <3>^S-metionin etterfulgt av diskontinuerlig sukrosetetthets-gradient-fraksjonering (for å anrike melanosomer), og immunopresipiteringsanalyse. I disse eksperimentene kunne gp75 bare bli immunopresipitert fra detergentoppløsning, pigmentgradientfraksjoner inneholdende melanosomer.
Opprinnelig anrikning av gp75 ble utført ved en fraksjonering av deoksycholatoppløselig membranfraksjon på en Mono Q (anionbytte )kolonne. Bundet gp75 eluerte mellom 0,26-0,5 M NaCl som en bred aktivitetstopp som viste en ladnings-mikroheterogenitet. Dette ble bekreftet ved to-dimensjonal SDS-PAGE (pl 5,5-5,9). Det ble observert at tilstedeværelse eller fravær av zwitterionisk detergent 3-[(3-cholamidoprop-yl)dimetyl-ammonio]1-propansulfonat (CHAPS) i kolonneekvili-breringsbufferen og i prøvebufferen ikke påvirket bindingen av gp75 til Mono Q-kolonnen, men tilsetning av CHAPS til elueringsbufferen forbedret utbyttet av gp75.
Mono Q-fraksjonene inneholdende gp75-aktivitet ble slått sammen, dialysert i konkanavalin A (Con A) kolonnebuffer og applisert på en Con A-Sepharose-kolonne. Omtrent 60$ av applisert protein ble bundet til Con A. Eluering av bundede proteiner med 0,25 M a-D-metylmannnopyranosid resulterte i en bred hovedtopp etterfulgt av en mindre topp. Det var heterogenisitet ved binding av gp75 antigen til Con A-kolonnen, indikert ved mange topper med gp75 aktivitet i løpet av elueringen. Dette ble observert i løpet av et flertall kolonnekjøringer. Det ble observert at gp75 i melanocytter og melanomceller eksisterte som 2 modne former som er forskjellige i enten antall eller sammensetning av Asn-koblede komplekse karbohydrater. Heterogenisitet i binding til Con A fremkom ikke fra detekterbare forskjeller i Asn-koblede høymannosekarbohydrater på gp75. Dette ble vist ved radiojodinering av eluerte toppfraksjoner, og immunopresipitering av gp75 med MAb TA99 etterfulgt av fjerning av høy mannosekarbohydratkjeder ved endo-p<->N-acetyl-glukosaminidase H (Endo H) spatlning. Alle de testede toppene inneholdt 2 modne former av gp75 som, etter Endo H-spaltning, produserte 63- og 66-kDa-bånd på SDS-PAGE.
Fraksjoner fra Con A-eluatet inneholdende gp75 ble slått sammen og applisert på MAb TA99 affinitetskolonne. Det var fullstendig spaltning av gp75 i eluatet til affinitetskolonnen, som målt ved ELISA, og ved sølvfarving av SDS-PAGE. Eluatet inneholdt 92$ av det totale protein applisert på kolonnen. Betingelser for eluering av bundet gp75 ble for-bestemt på grunnlag av inhibisjon av MAb TA99-binding til permeabiliserte og metanol:aceton-fikserte SK-MEL-19 melanomceller ved ELISA (som beskrevet i "Material and Methods"). Binding av MAb TA99 til gp75 kunne bli hindret eller reversert av 0,1 M glycin/HCl-buffer, pH 3,1. Eluering av kolonnen med 0,1 M glycin/HCl-buffer ga omtrent 0,5 nmol renset gp75 fra 1,7 mg protein applisert på kolonnen, som bestemt ved intensiteten til det sølvfarvede gp75-båndet på polyakrylamidgel. Eluering av gp75 fra TA99 antistoff affinitetskolonne resulterte også i lekkasje av spormengder av TA99 antistoff (tunge og lette kjeder) som fremkom som ytterligere små bånd på 53, 28 og 26 kDa på sølvfarvet gel. Det ble bekreftet at disse ytterligere båndene hadde opprinnelse fra TA99 antistoff bundet til kolonnen og ikke fra SK-MEL-19-antigenpreparering ved: 1) immunopresipitering av 53-, 28- og 26-kDa-proteiner med kanin -anti-muse IgG-antistoff, og 2) demonstrering av disse båndene ikke hadde opprinnelse fra et radiojodinert preparat av SK-MEL-19-lysatet. En oppsummering av rensingen av gp75 er vist i tabell I.
1Mengde protein i sammenslåtte, dialyserte fraksioner ble målt ved Brådford's farvebindingsmetode (1976). - ^En enhet aktivitet ble definert som mengden av protein nødvendig for halv-maksimal inhibisjon av MAb TA99 (300/mg) binding til SK-MEL-19 celler. - <3>Mengden av renset gp75 i TA99 affinitets-kolonneeluat ble vurdert ved approksimering av intensiteten til det sølvfarvede båndet på SDS-PAGE. ND. ikke bestemt.
Affinitetsrenset gp75 ble anvendt for aminosyreanalyse. Aminosyresammensetning av gp75 er vist i tabell II.
Sekvensene til 3 indre peptider av gp75 og delsekvensen til gp75 cDNA er blitt vist i eksperiment 1. Aminosyresammenset-ningen til gp75 var lik den til N. crassa (Lerch, K. , Longoni, C. og Jordi, E. , Primary structure of tyrosinase from Neurospora crassa, J. biol. Chem., 257, 6408-6413, 1982) og pattedyr-tyrosinaser, og muse-b-gen-produktet (Shibahara, S. , Tomita, Y., Sakakura, T., Nager, C, Chaudhuri, B. og Muller, R., Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids Res., 14, 2413-2427, 1986; Bouchard, B. , Fuller, B., Vi jayasaradhi, S. og Houghton, A.N. , Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. exp. Med., 169, 2029-2042, 1989; Chohen, T., Muller, R. M. , Tomita, Y. og Shibahara, S. , Nucleotide sequence of the cDNA endocing human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18, 2807, 1990). Forsøk på å utføre N-terminal sekvensanalyse av gp75 ved Edman degraderingsmetoden var ikke vellykket på grunn av tilstede-værelsen av en blokkert N-terminus. Det N-terminale serin-residiet til N. crassa tyrosinase er også blokkert, i dette tilfelle av en acetylgruppe (Lerch, K., Longoni, C. og Jordi, E. , Primary structure of tyrosinase from Neurospora crassa, J. biol. Chem., 257, 6408-6413, 1982).
Både gp75 og tyrosinase er 75-kDa-membran glykoproteiner lokalisert til melanosomer, og har lignende aminosyresammen-setninger, omtrent 40$ aminosyresekvensidentitet (se eksperiment 1; Cohen, T. , Muller, R. M. , Tomita, Y. og Shibara, S. , Nucleotide sequence of the cDNA endocing human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18, 2807, 1990), og 2 potensielle cooper-bindingsseter (nødvendig for katalytisk tyrosinaseaktivitet). Noen forskere har foreslått at muse-gp75 har tyrosinhydroksylaseaktivitet, et karakter-trekk til tyrosinasemolekylet (Hearing, V.J. Jimenez, M. , Analysis of mamalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Res., 2, 75-85, 1989).
Tyrosinhydroksylaseaktiviteten ble målt i supernatantene og immunopresipitåtene til SK-MEL-19 melanomcelleekstraktene etter presipitering med MAb TA99. Det var ingen spesifikk reduksjon av enzymaktivitet ved TA99; 94$ av tyrosinhydroksylaseaktiviteten kunne bli isolert i supernatanten etter inkubasjon av celleekstraktene med enten et kontrollantistoff (MAb F23) eller MAb TA99 (tabell III).
Ingen signifikant reduksjon i isoleringen av tyrosinhydroksylaseaktiviteten i supernatanten ble observert med økende antistoffkonsentrasjoner opp til 300 pg/ml. Ingen enzymaktivitet ble isolert i immunopresipitatene. Disse resultatene demonstrerer at nesten hele tyrosinhydroksylaseaktiviteten i humane melanomceller kommer fra et molekyl(er) som er forskjellig fra gp75 antigenet.
Tyrosinhydroksylaseaktiviteten ble oså målt i fraksjoner inneholdende gp75 i løpet av rensingen. Total cellulær tyrosin-hydroksylaseaktivitet samrenset med gp75 i løpet av detergentsolubiliseringen av post-nukleære membraner, gradienteluering av proteiner bundet til mono Q anion-byttekolonne og Con A fraksjonering. Dette er i samsvar med den vesentlige homologien mellom gp75 og human tyrosinase. gp75 og tyrosin-hydroksylaseaktivitet blir dissosiert på MAb TA99 affinitetskolonnen. Når en deoksycholatsolubilisert, Con A-renset fraksjon av SK-MEL-19 ble applisert på en MAb TA99 affinitetskolonne, ble <75$ av tyrosin-hydroksylaseaktiviteten isolert i eluatet mens gp75-aktiviteten var fullstendig borte (tabell IV).
Til tross for at eluert gp75 ikke inneholdt tyrosin-hydroksylaseaktivitet, er det mulig at kolonneelueringsbetingelsene motvirket enzymaktiviteten. Disse resultatene understøtter den konklusjonen at nesten hele, om ikke hele, tyrosinhydroksylaseaktiviteten i melonocyttiske celler ligger i et protein som er forskjellig fra gp75.
gp75 antigenet er et membranbundet glykoprotein som blir uttrykt i pigmenterte humane melanocytter og melanomer og blir ikke detektert i ikke-pigmentere melanomer eller i ikke-mefanocyttiske celletyper (Thomson, T.M., Mattes, J.M., Roux, L. , Old L. J. og Lloyd, K.O., Pigmentation-associated glykoprotein of human melanoma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, J. invest. Dermat., 85, 169-174, 1985; Thomson, T.M., Real, F.X., Murakami, S., Cordon-Cardo, C, Old, L.J. og Houghton, A.N., Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. invest. Dermat., 90, 459-466, 1988). Studier ved immunelektronmikroskopi har vist at MAb TA99 bindes ved eller nær ved den melanosomale membranen (Thomson, T.M. , Real, F.X. , Murakami, S. , Cordon-Cardo, C, Old, L.J. og
Houghton, A.N., Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermat., 90, 459-466, 1988). Den intracellulære beliggenheten til gp75 i melanomcellene ser ut til å gjøre gp75 utilgjenge-lig for immunsystemet. IgG antistoffer mot gp75 er derimot blitt detektert i en melanompasient (Mattes, J.M., Thomson, T.M., Old, L.J. og Loyd, K.O., A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer, 32, 717-721, 1983). I dette henseende gjenkjenner MAb TA99 det samme gp75 antigenet presipitert av IgG-antistoffene i melanompasienten (Vijayasaradhi, S. , Bouchard, B.B. og Houghton, A.N. , The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Exp. Med., 171, 1375-1380, 1990). Radioaktivt merket MAb TA99 injisert intravenøst, ble lokalisert til melanomtranspalantater i atymiske mus (Welt, S. , Mattes, J.M., Grando.R.,, Thomson, T.M., Leonard, R. W., Sanzonico, P.B., Bigler, R.E., Yeh, S., Oettgen, H.F. og Old, L.J., Monoclonal antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplants in nu/nu mice, Proe. nat. Acad. Sei. (Wash.). 84, 4200-4204, 1987), og dette tyder på at gp75 antigenet er tilgjengelig for immunsystemet.
Melanosomal glykoprotein-tyrosinase blir kodet av et gen som er kartlagt til muse c (albino) locus, mens gp75 er kartlagt til b (brown) lokuset. Tyrosinase og gp75 har et antall felles egenskaper. I tillegg til lignende fysiske egenskaper som fremkommer fra samrensing av gp75 og tyrosinaseaktiviteten gjennom multiple kromatografiske trinn, deler disse 2 proteinene også molekylær identitet (43,1$ på aminosyrenivå og 55,3$ på nukleotidnivå) (Vijayasaradhi, S., Bouchard, B.B. og Houghton, A.N. , The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. exp. Med., 171, 1375-1380, 1990; Cohen, T., Muller, R.M., Tomita, Y. og Sibahara, S. , Nucleotide sequence of the cDNA endocing human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18, 2807,1990). Antityrosinase-antistoffene kryssreagerte med tyrosinase, b (brown) lokusproteinet og muligens en familie av beslektede proteiner (Shibahara, S. , Tomita, Y. , Sakakura, T. , Nager, C, Shaudhuri, B. og Muller, R., Cloning and expression af cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids Res., 14, 2413-2427, 1986; Jackson, I.J., A cDNA encoding tyrosinaserelated protein maps to the brown locus in mice, Proe. nat. Acad. Sei. (Wash.), 85, 4392-4396, 1988; Hearing, V.J., og Jimenez, M., Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Res., 2, 75-85, 1989), Det var derfor viktig å demonstrere at det rensede gp75 antigenet er forskjellig fra tyrosinase. gp75 og tyrosin-hydroksylaseaktiviteten ble samrenset, men det meste av tyrosinase-enzymaktiviteten kunne bli dissosiert fra gp75 i løpet av rensingen med TA99 affinitetskromatografi. Det meste av den totale cellulære tyrosin-hydroksylaseaktiviteten ble isolert i gjennomstrømningen av en MAb TA99 affinitetskolonne, som tyder på at tyrosin-hydroksylaseaktiviteten blir katalysert av et molekyl som er forskjellig fra gp75. I samsvar med denne observasjonen er det faktumet at MAb TA99 ikke im-munopresipiterer eller tappet tyrosinhydroksylaseaktiviteten (tabell IV; Thomson, T.M., Mattes, J.M., Roux, L., Old, L. J. og Lloyd, K.O., Pigmentation-associated glykoprotein of human melanoma and melanocytes; definition with a mouse monoclonal antibody, J. invest. Dermat., 85, 169-174, 1985). Jimenez, M. , Malvoy, L. og Hearing, V.J., Specific identification of an authentic clone for mamalian tyrosinase, J.biol. Chem., 264, 3397-3403, 1989 har anvendt antipeptid-antistoffer mot muse b locus proteinet, og har foreslått at b-proteinet står for 15-30$ av tyrosinaseaktiviteten i musemela-nomceller. Disse resultatene tyder på at gp75 ikke inneholder tyrosin-hydroksylaseaktivitet. Muligheten av at gp75 har meget svak tyrosin-hydroksylaseaktivitet som står for 5$ av enzymaktiviteten i pigmenterte melanomceller, kan ikke bli utelukket.
Claims (8)
1.
Isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, karakterisert ved nukleinsyresekvensen:
2.
Fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra et fragment fra pg75 som omfatter: Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val; Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Thr-Tyr-Glu; og/eller Asn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser; eller en kombinasjon av hvilken som helst av de ovenfor nevnte aminosyresekvenser, karakterisertved: (a) å gjenvinne plasmid pGP75 E-I som omfatter full-lengde cDNA som koder for gp75 fra E. coli-stammen DH5a (ATCC-designasjonsnr. 68565); (b) isolere full-lengde cDNA som koder for gp75 fra plasmidet; (c) innsette det isolerte full-lengde cDNA som koder for gp75 fra trinn (b) eller et fragment derav inn i en ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens som er essensiell for replikasjon av ekspresjonsvektoren; og (d) tilpasse ekspresjonsvektoren fra trinn (c) i en vert for ekspresjon, for å uttrykke pg75-polypeptid eller fragment derav.
3.
Isolert cDNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter nukleinsyresekvensen:
4 .
Isolert full-lengde cDNA-molekyl, karakterisert ved at det koder for gp75, kodet for av nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
5.
Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens som er essensiell for replikasjon og cDNA-molekylet ifølge krav 3 eller 4.
6.
Ekspresjonsvektor ifølge krav 5,karakterisert ved at ekspresjonsvektoren er vaccinia-virus eller en Imclone-vektor.
7.
Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for å stimulere eller forsterke i et individ, til hvilket vaksinen blir administrert, produksjon av antistoffer rettet mot gp75, karakterisert ved: a) binding av en mengde av renset gp75-polypeptid kodet for nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, eller et fragment derav, effektiv i å stimulere eller forsterke antistoffproduksjon i individet, til en effektiv mengde av en adjuvant; og b) blande det bundne gp75 med en farmasøytisk akseptabel bærer.
8.
Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for å stimulere eller forsterke i et individ, til hvilket vaksinen blir administrert, produksjon av antistoffer rettet mot gp75, karakterisert ved: a) å tilpasse ekspresjonsvektoren ifølge krav 5, til en vert for ekspresjon, slik at den uttrykker gp75-polypeptidet eller fragment derav; b) binding av det uttrykte gp75-polypeptidet eller fragment derav til en effektiv mengde av en adjuvant; og c) blande det bundne gp75-polypeptidet eller fragment derav til en farmasøytisk akseptabel bærer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49743190A | 1990-03-22 | 1990-03-22 | |
| PCT/US1991/001942 WO1991014775A1 (en) | 1990-03-22 | 1991-03-22 | Gp75 as a tumor vaccine for melanoma |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO923659D0 NO923659D0 (no) | 1992-09-21 |
| NO923659L NO923659L (no) | 1992-11-06 |
| NO311366B1 true NO311366B1 (no) | 2001-11-19 |
Family
ID=23976841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19923659A NO311366B1 (no) | 1990-03-22 | 1992-09-21 | Isolert nukleinsyremolekyl som koder for gp75, fremgangsmåte for å fremstille en aminosyresekvens fra samme, samt fremgangsmåtefor å fremstille vaksine |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6168946B1 (no) |
| EP (2) | EP0522078B1 (no) |
| JP (2) | JP3336006B2 (no) |
| AT (1) | ATE187493T1 (no) |
| AU (1) | AU660412B2 (no) |
| CA (1) | CA2078773C (no) |
| CZ (1) | CZ290278B6 (no) |
| DE (1) | DE69131829T2 (no) |
| DK (1) | DK0522078T3 (no) |
| ES (1) | ES2141089T3 (no) |
| FI (1) | FI113786B (no) |
| GR (1) | GR3032804T3 (no) |
| HK (1) | HK1014732A1 (no) |
| HU (1) | HU218416B (no) |
| IE (2) | IE20000918A1 (no) |
| NO (1) | NO311366B1 (no) |
| NZ (1) | NZ237532A (no) |
| PL (3) | PL168235B1 (no) |
| PT (1) | PT97103B (no) |
| SK (1) | SK282873B6 (no) |
| WO (1) | WO1991014775A1 (no) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE20000918A1 (en) * | 1990-03-22 | 2001-05-30 | Sloan Kettering Inst Cancer | GP75 As a Tumor Vaccine for Melanoma |
| US7041801B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-05-09 | Vanderbilt University | Antibodies binding to polypeptides encoded by developmentally-regulated endothelial cell locus-1 |
| US7015312B1 (en) | 1996-02-09 | 2006-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antibodies to the protein product encoded by ORF3 of the TRP-1 gene and compositions and kits thereof |
| US7001600B1 (en) | 1996-02-09 | 2006-02-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes |
| US6083703A (en) * | 1996-02-09 | 2000-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes |
| US5840839A (en) * | 1996-02-09 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein |
| AU2001241533A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-27 | The Regents Of The University Of California | A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase |
| US6613534B2 (en) | 2001-03-20 | 2003-09-02 | Wake Forest University Health Sciences | MAP-2 as a determinant of metastatic potential |
| US20030113919A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-06-19 | Aventis Pasteur, Ltd. | Immunogenic targets for melanoma |
| US20030157720A1 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-21 | Expression Technologies Inc. | Protein standard for estimating size and mass |
| JP5213075B2 (ja) | 2007-06-15 | 2013-06-19 | ジェネラックス・コーポレイション | 腫瘍の画像化および／または処置のための微生物 |
| US7951370B2 (en) | 2008-03-12 | 2011-05-31 | Imclone Llc | Anti-TYRP1 antibodies |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
| US4808704A (en) * | 1981-09-30 | 1989-02-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human malignant melanoma |
| US4806628A (en) * | 1982-11-30 | 1989-02-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies against melanocytes |
| US4591572A (en) * | 1983-04-01 | 1986-05-27 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Pigmentation associated, differentiation antigen of human melanoma and autologous antibody |
| USH819H (en) * | 1984-04-30 | 1990-09-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Energy | Palladium-109 labeled anti-melanoma monoclonal antibodies |
| US4851510A (en) * | 1984-11-30 | 1989-07-25 | Wadley Technologies, Inc. | Monoclonal antibodies to novel melanoma-associated antigens |
| US4798790A (en) * | 1985-07-18 | 1989-01-17 | Sloan-Kettering Institute | Monoclonal antibody specific for a pigmentation associated antigen |
| US5141742A (en) * | 1986-02-07 | 1992-08-25 | Oncogen | Vaccines against melanoma |
| US5262177A (en) * | 1986-02-07 | 1993-11-16 | Oncogen | Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen |
| US5009995A (en) * | 1986-10-27 | 1991-04-23 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to melanoma cells |
| US5059523A (en) * | 1988-05-02 | 1991-10-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Cell-surface glycoproteins of human sarcomas |
| US5009495A (en) * | 1989-05-26 | 1991-04-23 | Williams Robert D | Hinge for eyeglasses |
| DE69033842T2 (de) | 1989-08-04 | 2002-06-20 | Schering Ag | Äusserliche domäne von c-erbb-2:gp75 |
| IE20000918A1 (en) * | 1990-03-22 | 2001-05-30 | Sloan Kettering Inst Cancer | GP75 As a Tumor Vaccine for Melanoma |
| US5262117A (en) * | 1990-10-12 | 1993-11-16 | Centro Sviluppo Settori Impiego S.R.L. | Process for preparing thermoinsulating and/or structural formed articles and products so obtained |
| US6180604B1 (en) * | 1996-08-21 | 2001-01-30 | Micrologix Biotech Inc. | Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin |
-
1991
- 1991-03-12 IE IE20000918A patent/IE20000918A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-12 IE IE082091A patent/IE910820A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 CZ CS1991760A patent/CZ290278B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 PT PT97103A patent/PT97103B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 SK SK760-91A patent/SK282873B6/sk unknown
- 1991-03-21 NZ NZ237532A patent/NZ237532A/xx unknown
- 1991-03-22 DK DK91908003T patent/DK0522078T3/da active
- 1991-03-22 EP EP91908003A patent/EP0522078B1/en not_active Revoked
- 1991-03-22 PL PL91289550A patent/PL168235B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 EP EP99109256A patent/EP0965640A1/en not_active Withdrawn
- 1991-03-22 PL PL91307929A patent/PL169105B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 DE DE69131829T patent/DE69131829T2/de not_active Revoked
- 1991-03-22 WO PCT/US1991/001942 patent/WO1991014775A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-03-22 HU HU9203009A patent/HU218416B/hu unknown
- 1991-03-22 AU AU76906/91A patent/AU660412B2/en not_active Ceased
- 1991-03-22 JP JP50783191A patent/JP3336006B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 ES ES91908003T patent/ES2141089T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-22 CA CA002078773A patent/CA2078773C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 PL PL91307930A patent/PL169168B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 AT AT91908003T patent/ATE187493T1/de not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-09-21 NO NO19923659A patent/NO311366B1/no unknown
- 1992-09-21 FI FI924222A patent/FI113786B/fi active
-
1995
- 1995-03-24 US US08/409,794 patent/US6168946B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-28 HK HK98116009A patent/HK1014732A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-29 GR GR20000400507T patent/GR3032804T3/el not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-25 JP JP2001391870A patent/JP2002241314A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-25 US US10/877,489 patent/US20050037462A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jimenez et al. | Specific identification of an authentic clone for mammalian tyrosinase | |
| US5141742A (en) | Vaccines against melanoma | |
| AU775162B2 (en) | Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines | |
| EP0522078B1 (en) | Gp75 as a tumor vaccine for melanoma | |
| WO2003008537A2 (en) | Epitope sequences | |
| Vijayasaradhi et al. | Purification of an autoantigenic 75‐kDa human melanosomal glycoprotein | |
| JP4019040B2 (ja) | 抗原提示の調節 | |
| CA2182889C (en) | Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor | |
| JP4315257B2 (ja) | 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体 | |
| Nussbaum et al. | Site-specific antibodies to rat myelin proteolipids directed against the C-terminal hexapeptide | |
| Surman et al. | Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanoma associated antigens using gene gun immunization | |
| JPH09194502A (ja) | 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体 | |
| JPH0751065A (ja) | 糖タンパク質３９遺伝子 | |
| Nagatsu et al. | Antibodies raised against different oligopeptide segments of human dopamine-β-hydroxylase | |
| Amar-Costesec et al. | Identification and characterization of the tumor-specific P1A gene product | |
| EP1369478A1 (en) | Novel scavenger receptor class a protein | |
| Kahn-Perles et al. | Cytotoxic T lymphocyte recognition of secreted HLA class I molecules. | |
| Shiraga et al. | Purification and Characterization of Two AmineN-Sulfotransferases, AST-RB1 (ST3A1) and AST-RB2 (ST2A8), from Liver Cytosols of Male Rabbits | |
| Verdier et al. | Identification of a new, testis-specific sperm antigen localized on the principal piece of the spermatozoa tail in the fox (Vulpes vulpes) | |
| KR20060114326A (ko) | 티로시나아제 돌연변이 및 이의 사용 방법 | |
| WO1991014698A1 (en) | Marine tyrosinase gene | |
| Walker | Characterization of adenylate cyclase toxin plus macrophage and thymic peptides by mass spectrometry | |
| JPH11222499A (ja) | プロテアソーム抑制蛋白質およびそれをコードするポリヌクレオチド |