PT97103B

PT97103B - Processo para a preparacao de moleculas isoladas de acido nucleico que codificam para gp75 e de vacinas para melanoma que as contem

Info

Publication number: PT97103B
Application number: PT97103A
Authority: PT
Inventors: Alan N Houghton; Setaluri Vijayasaradhi
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-21
Publication date: 1999-02-26
Also published as: HK1014732A1; FI924222A0; ES2141089T3; FI113786B; WO1991014775A1; GR3032804T3; NO311366B1; AU660412B2; FI924222L; JP3336006B2; AU7690691A; EP0965640A1; CA2078773C; HU218416B; EP0522078B1; PL169105B1; NZ237532A; IE20000918A1; CA2078773A1; PL169168B1

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 97.103

REQUERENTE: SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CÂNCER

RESEARCH, norte-americana, com sede em 1275 York Avenue, New York, New York 10021, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE: Moléculas de ácido nucleico isoladas e vacinas contra gp75 que as contêm

INVENTORES: Alan N. Houghton,

Setaluri Vijayasaradhi,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., 22 de Março de 1990, sob ο N2.: 497,431

INPl. MCD

RF 15722

SLOAN-KETTERING INSTITUTE’ FOR CÂNCER RESEARCH

MOLÉCULAS DE ÃCIDO NUCLEICO ISOLADAS E VACINAS CONTRA GP75 QUE AS CONTÊM

Antecedentes da presente invenção

A identificação molecular de determinantes imunogénicos nas células cancerosas humanas proporciona uma base para a compreensão da resposta imunolôgica ao cancro. Nas células de melanoma humane, receberam especial atenção duas classes de antigênios, como alvos para reconhecimento imune: 1) antigenios únicos expressos somente por células de melanoma autôlogas (Old, L, J,, Câncer immunology: The search for specificity, G.H.A. Clowes Memorial Lecture. Câncer Res., 41(1981) 361; Carey, T.

E., T. Takahashi, L.A. Resnick, H. F. Oettgen, e L. J. Old,

Cell surface antigens of human malignant melanoma. I. Mixed he madsorption assay for humcral immunity to cultured autologous melanoma cells, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 73 (1976) 3278; Real, F, X., M. J. Mattes, A. N. Houghton, H. F. Oettgen, K. 0. Lloyd, e L. J. Old, Class 1 (unique) antigens of human melanoma. Identification of a 90,000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibody, J. Exp. Med, 160(1984) 1219 e 2) antigênios de diferenciação expressos normalmente por células da linhagem melanocítica (Houghton, A. N., M. C. Taormina, H. Ikeda, T. Watanabe, H. F. Oettgen, e L. J. Old, Serological survey of normal humans for natural antibody to cell surface antigens of melanoma, Proc. Natl, Acad. S'ci. USA, 77 (1980) 4260; Houghton, A. N., M. Eisinger, A. P. Albino, J. G. Cairncross, e

-2L. J. Old, Surface antigens cf melanocytes and melanomas. Mar kers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J.

Exp. Med., 156 (1982) 1755; (Houghton, A. N., F. X. Real, L. J. Davis, C. Cardon-Cardo, e L. J. Old, Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med., 164(1987) 812).Definiram-se antigénios de diferenciação de melanócitos através da sua semelhança com outras caraoterísticas fenõtipicas bem definidas expressas durante a diferenciação dos melanócitos. (Houghtcn, A. N., M. Ei singer, A. P. Albino, J. G. Cairncross, e L. J. Old, Surface antigens of melanocytes e melanomas. Markers cf melanocyte differentiaticn e melanoma subsets, J. Exp. Med., 156(1982)

1755; Houghton, A. N., F. X. Real, L. J. Davis, C. Cardon-Cardo, e L, J. Old, Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med. 164 (1987) 812), sendo a mais distinta a síntese do pigmento melanina dentro dos melanossomas.

As observações clínicas sugeriram que uma resposta imunológica dirigida contra os antigénios expressos por células de pigmentos normais devem influenciar o desenvolvimento de melancma metastãsico. Especificamente, Vitiligo e hipopigmentação nos doentes com melanoma têm sido associados como um bom prognóstico (Nordlund, J. J., J. M. Kirkwood, Β. M. Forget, G. Milton,

D. M. Albert, e A. B. Lerner, Vitiligo in patients with metasta tic melanoma: a good prognosis sign, J. Am. Acad. Dermatol., 9J1983) 689; Bystryn, J. C., D. Rigel, R. J. Friedman e A. Kopf, Prognostic significance of hypopigmentation in malignant melanoma , Arch. Dermatol. 123 (1987) 1053). Neste sentido, os antigénios dos melanomas podem ser reconhecidos pelo sistema imuni-3is

táric. Este facto foi demonstrado por imunoprecipitação do antigénio gp75 proveniente de células de melanoma autólogas per anticorpos IgG séricos de um doente com melanoma metastãsico (Mattes, J. Μ., T. M. Thomson, L. J. Old e K. 0. Llcyd. A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Câncer. 32(1983) 717) . 0 antigénio gP75 é um pelipéptido melanossomal que ê a glicoprcteína mais abundante sintetizada por melanccitos pigmentados e por melanomas (Tai, T., M. Eisinger,

S. Ogata e K. 0. Lloyd., Glycoproteins as differentiation markers in human malignant melanoma e melanocytes, Câncer Res., 43 (1983) 2773; observações não publicadas) . Os melanocitos da epiderme, lesões pigmentadas benignas e os melanomas primários metastãsiccs exprimem o antigénio gp75, o que não fazem outros tipos de células (Thomson. T. Μ., F. X. Real, S. Murakami, C. Cardon-Cardo, L. J. Old, e A. N. Houghton, Differentiation antigens of melanocytes a melanoma; Analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermatol·.,90(1988) 459) . Na presente in venção, demonstrou-se que cDNA de gp75 tem aproximadamente 90% de identidade com a sequência de aminoácidos derivada e a sequên cia nucleotídica de um gene de murganho que mapeia para o locus b (brown). 0 locus Brown ê um sítio que determina a cor do revestimento e que influencia o tipo de melanina sintetizada suge rindo que gp75 pode regular ou influenciar o tipo de melanina sintetizada.

facto de se ter verificado que os anticorpos IgG no soro de um doente com melanoma metastãsico imuncprecipitam gp75 revela que a tolerância imunolôgica contra gp75 pode ser destruí da. Esta invenção, portanto, proporciona vectores de expressão que contêm ADNc de gp75 para utilizar como uma vacina centra melanomas, tendo-se determinado as sequências de aminoácidos dos péptidos a partir do polipêptido gp75, que foi isolado e purificado pelo anticorpo monoclonal murino TA99, e tendo-se isolado clones de ADNc por sondagem com oligonuclectidos ccm base nas sequências dos péptidos.

Sumário da invenção

A presente invenção proporciona uma molécula de ãcido nucleico isolada cuja sequência codifica a sequência de aminoãcidos para gp75 ou para um seu fragmento. A presente invenção também proporciona uma molécula de ADNc isolada da molécula de ãcido nucleico gp75, assim como uma molécula de ADNc isolada de um fragmento da molécula de ãcido nucleico gp75 que tem a sequência nucleotídica que se apresenta no Quadro II e a sequên cia de aminoácidos daí derivada.

Esta invenção proporciona também vacinas que, após a sua administração a um indivíduo, estimulam ou reforçam a produção de anticorpos dirigidos contra gp75.

Esta invenção proporciona ainda um método para estimular ou reforçar a produção de anticorpos num indivíduo, dirigidos contra gp75. Este método consiste em administrar a esse indivíduo uma vacina de acordo com a presente invenção, numa dose eficaz para estimular ou reforçar a produção dos anticorpos,

A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamento, prevenção ou para retardar a recorrência de cancro. Estes métodos consistem em administrar ao indivíduo uma vaci-5na desta invenção, numa dose eficaz para tratar, prevenir ou retardar a recorrência de cancro»

Breve descrição da figura

Fig» 1. imunoprecipitação e análise da composição de péptidos de proteínas reconhecidas por mAB TA99 e soro-AU. A. Anãli se SDS-PAGE unidimensional de imunoprecipitados de lisados mar 125 cados com I de SK-MEL-19 por mAB TA99 (pista 1), soro humano normal (pista 2) e soro de AU de 1/75 (pista 3) e de 10/76 (pista 4) . B. Efectuou-se a excisão de bandas correspondentes a gp75 ou a gp75 tratado com Endo H (parcialmente desglicosilado) de SDS-gel de poliacrilamida e analiscu-se a composição peptídica por digestão limitada com protease V8 de S. aureus por SDS-PAGE. -, gp75; +, gp75 parcialmente desglicosilado com Endo H. Exposição autorradiogrãfica de 2 dias para TA99 e 5 di as para péptidos AU.

Descrição pormenorizada da presente invenção

A presente invenção proporciona uma molécula de ãcido nucleico isolada cuja sequência codifica a sequência de ami noácidos para gp75 ou para um seu fragmento.

A presente invenção também proporciona a sequência de aminoácidos para um fragmento de gp75, num aspecto desta invenção, que é asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tyr^asp-pro-ala-val. Num outro aspecto, a sequência de aminoácidos ê met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu. Ainda num outro aspecto, a sequência de aminoácidos é asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.

A presente invenção proporciona ainda uma molécula de

-6ADNc isolada da molécula de acido nucleico de gp75, assim como uma molécula de ADNc isolada de um fragmento de acido nucleico de uma molécula de acido nucleico de gp75 contendo a sequência nucleotiaica representada no Quadro II e a sequência de amincãcidos derivada desta.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona um vector de expressão que contém uma sequência de ADN essencial para a replicação do vector combinado com a molécula de ADNc da molécula de ácido nucleico gp75 ou fragmento adaptado para a expressão num hospedeiro. 0 vector de expressão pode ser o vírus da vacina ou, de preferência, um vector Imclone.

Esta invenção proporciona também uma vacina que esti mula ou reforça a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, num indivíduo ao qual se administrou essa vacina, que contêm o vector de expressão que contêm a molécula de ADNc, uma quantidade eficaz de um adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. De preferência, o indivíduo em causa ê um ser humano e gp75 liga-se ao adjuvante. 0 adjuvante pode ser um adjuvante microbiano ou qualquer outro agente farmacêutico.

A presente invenção proporciona ainda uma vacina que estimula ou reforça a produção de anticorpos dirigidos contra gp75 num indivíduo ao qual se administrou essa vacina. A vacina pode conter a sequência de aminoácidos derivada da molécula de ADNc proveniente da molécula de ácido nucleico de gp75 ou de um seu fragmento ou uma quantidade de gp75 purificado ou um seu fragmento eficaz para estimular ou reforçar a produção de anticorpos em um indivíduo, uma quantidade eficaz de um adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. De preferência, o indivíduo ê um ser humano e o gp75 liga-se ao adju-Ί vante. Ο adjuvante pode ser um adjuvante microbiano ou qualquer outro agente farmacêutico.

Esta invenção também proporciona um método para estimular ou reforçar num indivíduo a produção de anticorpos dirigidos contra gp75. 0 método consiste em administrar a esse indivíduo uma vacina de acordo com a presente invenção numa dose eficaz para estimular ou reforçar a produção de anticorpos.

A presente invenção também proporciona um método para tratar o cancro num indivíduo portador de cancro. Este método consiste em administrar a esse indivíduo uma vacina de acordo com a presente invenção numa dose eficaz para tratamento do cancro.

Esta invenção ainda proporciona um método para a prevenção do cancro num indivíduo portador de cancro. 0 método consiste em administrar ao indivíduo uma vacina desta invenção numa dose eficaz para evitar o cancro. A presente invenção também proporciona um método para retardar a recorrência de cancro num indivíduo susceptível. 0 método consiste em administrar ao indivíduo uma vacina de acordo com a presente invenção numa dose eficaz para retardar essa recorrência.

Os métodos de tratamento, de prevenção e retardamento da recorrência de cancro podem ser dirigidos para um cancro tal como o melanoma. As vacinas são. úteis para a prevenção de cancros, tais como melanoma em doentes de alto risco de recorrência ou com melanoma primário.

Nestes métodos, pode ligar-se gp75 a um adjuvante. Adicionalmente, pode administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de ciclofosfamida, antes da administração da vacina.

-8MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de tecidos: Desenvolveu-se uma linha de células de me lanoma SK-MEL-19 em meio MEM mais aminoácidos não essenciais a 1% penicilina e estreptcmicina, com a diferença de se ter subs tituído o scro de bovino fetal (FBS) por SerumPlus a 10% (v/v) (Hazelton Research Products Inc., Lenexa, KS).

Isolamento e purificação de gp75: Isolou-se uma fracção da mem brana pos-nuclear da linha de células de melanoma SK-MEL-19 por homogeneização das células em Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, MgC^ 5 mM PMSF 2 mM e centrifugação a 10 000 x g. Solubilizaram-se as membranas em Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, KCl 3M e EDTA 5 mM e centrifugaram-se a 100 000 x g. Ressuspendeu-se a fracção proteica insolúvel em Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, desoxicolato de sódio a 0,5%. As proteínas solúveis no detergente foram recolhidas por centrifugação a 100 000 x g. Dialisou-se o sobrenadante centra Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M e CHAPS 2 mM e aplicou-se a uma coluna Mono Q (HR 5/5, Pharmacia LKB Biotechno logy Inc, Piscataway, NJ) equilibrada com Tris/HCl 20 mM, pH

7,5, NaCl 0,15 M e 1-propanossulfonato de (3-/~ (3-colamidopropil)-dimetil-amónioJ (CHAPS) 2 mM (tampão A). Eluiram-se as proteínas ligadas com um gradiente linear de NaCl 0 a 1,0 M em tampão A, Analisaram-se as fracções relativamente a gp75 por meio de um ensaio de inibição competitiva.

Reuniram-se as fracções que continham gp75, dialisou'c-se centra um tampão de coluna Con A (Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, contendo CaC^ 1 mM, NmC^ 1 mM, e PMSF 2 mM) e aplicaram-se a uma coluna Con A-Sepharose. Retiraram-se as proteínas não liga das por lavagem com tampão de coluna. Eluiram-se as proteínas

-9ligadas a Ccn A com o(-D-metilmanopirancsido 0,25 M em tampão de coluna Con A. Reuniram-se as fracções que continham gp75 e dialisou-se contra Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, CHAPS 2 mM e PMSF 2 mM (CB) e aplicou-se a um anticorpo monoclcnal murino (mAb) TA99 / Thomson, T. M., J. M. Mattes, L. Roux, L. J. Old e K.O. Lloyd, Pigmentation-associated glycoprotein cf humam melanoma and melanccytes: Definition with a mouse moncclonal antibody, J. Invest. Dermatol., 85.(1985) 169, J em coluna de afinidade Affi-Gel 10, Lavou-se o gel, em sequência, com 6 ml de cada um de CB,

CB + NaCl 1M, CB e CB + CHAPS 2 mM, Eluiu-se gp75 ligado, a par tir da coluna, com glicina-HCl 0,1 M, pH 3,1, contendo CHAPS mM,

Ensaio de inibição competitiva para gp75. Durante a purificação determinou-se e doseou-se gp75 medindo a capacidade das fracções para inibirem a ligação de 300 ng/ml de mAb TA99 a células SK-MEL-19 fixadas em metanol/acetona a 1:1 (vol/vol), através de um imunoensaio de enzima (ELISA) /'Houghton, A.N., H. Brooks,

R.J, Cote, M.C. Taormina, H. F. Oettgen e L. J. Old, Detection of cell surface and intracellular antigens by human monoclonal antibodies; hybrid cells derived from lymphocytes of patients with malignant melanoma, J. Exp, Med. 158(1983) 53 J.

Imunoprecipitação, electroforese em gel e mapeação peptidica:

Efectuou-se a iodação da fraeção proteinica ligada a Con A^Sepharose de SK-MEL-19 pelo método da cloramina T e por imunoprecipitação cam mAB TA99 e soro AU, domodo descrito por Mattes, J. Μ,, T, M, Thomson, L, J, Old e K, O. Lloyd, A pigmentation-associated, differenciation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum,' Int, J, Câncer,

-1032.(1983) 717. Analisaram-se as proteínas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) / Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, '227 (1970) 680./. Para a digestão com endoglicosidase H (Endo Η), suspenderam-se os imuncprecipitados em SDS a 0,4%, aqueceu-se à temperatura de 100°C durante 5 minutos e digeriu-se com 1 mU de Endo H (Genzyme Corporation, Boston, MA) em tampão de citrato 100 mM, pH 5,5, durante 16 horas â temperatura de 37°C. Realizou-se uma electroforese bidimensional utilizando anfolinas, pH 5-7, (LKB-Produkter, Bromma, Suécia) de acordo com O’Farrel £ O'Farrel, P.H. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins, J. Biol. Chem., 250 (1975) 40007 Realizou-se a mapeação peptídica de gp75 imuncprecipitado por proteolise limitada com protease V8 de Staphilococcus aureus (protease V8), (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) em SDS-PAGE de acordo com o método de Cleveland et al, £ Cleveland, D.W., S.G. Fischer, M.W. Kirschmer e U.K, Laemmli. Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis, J, Biol. Chem., 252(1977) 1102 J.

Sèquenciação peptídica: Realizou-se a sequenciação dos péptidos na Harvard. University Microchemistrv Facility. Submeteu-se gp75 purificado (12 jig) por electromancha em nitrocelulose, a digestão com protease V8 (1:20, p/p) de acordo com Aebersold £ Aebersold, R, Η., J. Leavitt, R.A. Saavedra e L. E. Hood, Internai amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose, Proc'. Natl, Acad. Sei.

USA, 84(1987) 6970 J e separaram-se os péptidos resultantes em

-11•úma..coluna CS-JBrcwlee RP-300 2,1 x 100 mm, à temperatura de 38^C. Reuniram-se cs diversos picos provenientes da digestão com pro tease V8. Realizou-se a redução e alquilação completas mediante a adição de 50 jj.1 de ureia 8M/tampão de hidrogenocarbonato de amónio 0,4 M, pH 8,0, 5 pl de ditiotreítol 100 mM e aquecimento à temperatura de 50°C durante 15 minutos. Em seguida, in cubou-se a amostra com 50 jul de ãcido icdoacético 45 mM durante 15 minutos â temperatura ambiente e diluiu-se com 140 jj.1 de água destilada. Efectuou-se a subsequente digestão da fracção peptídica, reduzida e alquilada, com tripsina (l:25,p/p) duran te a noite à temperatura de 37°C. As fracções para sequenciação foram aplicadas directamente em filtros de fibras de vidro pré-ciclizados com polibreno e sequenciadas em um sequenciador de proteínas ABI 477A, Separaram-se os aminoácidos por cromato grafia líquida de alta pressão (HPLC) num aparelho ABI 120A, em linha. Realizou-se um mínimo de 20 ciclos para cada péptido.

rendimento repetitivo da HPLC sob condições laboratoriais de rotina foi de 93%. Apresentam-se apenas as sequências de aminoácidos daqueles pêptidos com resultados de mais confiança.

Clonagem e sequenciação de cDNA de gp75: Construiu-se uma biblio teca de cDNA a partir da linha de células de melancma SK-MEL-19 e utilizaram—se sondas oligonucleotídicas para isolar dois clones de cDNA de gp75, de acordo com métodos previamente descritos £ Bouchard B„, B, Fuller, S. Vijayasaradhi e N. Hougton, ^:‘Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase¹', J. Exp. Med., 169 (1939) 2029 J. A composição das sondas oligonucleotídicas era: £CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC 3 'j. Seçuenciaram-se os dois clones de ADNc (1,8 kb e 2,0 kb) de acordo com o método de Sanger et al.

-12£ Sanger, F. , S. Nicklen e A. R. Coulson, DNA squencing with chain-termination inhibitors, Proc.' Natl. AcacL Sei. USA.,

74(1977) 5463 J (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) .

RESULTADOS E COMENTÁRIOS

Tanto o mAb murino TA99 como o soro proveniente de um doente ccm melanoma AU imunoprecipitam um antigénio 75-kDa e mAb TA99 liberta previamente o antigénio gp75 precipitado pe lo soro de AU £ Thomson, T. M., J. M. Mattes, L. Rcux, L. J.

Old, e K, 0. Lloyd, Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermato 1., 85(1985) 169 7· Dado que o mAb TA99 foi utilizado para purificar gp75 proveniente da linha de células do melanoma SK-MEL-19, foi importante confirmar que o mAb TA99 detector apenas o antigénio gp75 reconhe eido pelo soro de AU. Em estudos anteriores, a Requerente demonstrou que mAb TA99 não reage com tirosinase humana, uma gli coproteína de 75-80 kDa também expressa em melanõcitos pigmentados £ Bouchard Β., B. Fuller, S. Vijayasaradhi e A. N. Houg| ton, Induction of pigmentation in mouse fibroblast by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med., 169(1989) 2029. Contudo, destas experiências, não se pode afirmar como regra a po.s sibilidade de mAb TA99 apresentar reacção cruzada com outros polipéptidos expressos por SK-MEL-19.

Submeteram-se as proteínas imunoprecipitadas por mAb TA99 e pelo anticorpo do soro de AU a analise por SDS-PAGE mono e bidimensional e por mapeação peptídica utilizando a proteolise limitada com protease V8 de S. aureus. As proteínas precipitadas com mAb TA99 e com anticorpos de soro de AU tinham

-13idênticas massa molecular (75 kDa) , ponto isoeléctrico (5,5 a 5,9) (dados nao apresentados) e composição peptldica (Fig. 1), confirmando que TA99 e o soro de AU reconheceram a mesma molécula de gp75.

Purificou-se o antigénio gp75 do modo descrito em Ma teriais e Métodos. Utilizou-se para a sequenciação peptídica gp75 purificado por afinidade. Obtiveram-se as sequências de aminoãcidos dos três péptidos internos por cisão proteolltica de gp75 com protease V8 e tripsina. As sequências dos três pêp tidos estão representadas no Quadro 1. Houve uma identidade de 90% com as sequências de aminoãcidos deduzidas do clone de ADNc murino, pMT4, isolado por Shibahara et al. (nas posições dos aminoãcidos 247-260, 333-349 e 428-441 de pMT4) £ Shibahara,

S,, Y, Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri e R. Muller, Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res., 14(1986) 2413 }. Derivaram-se sondas oligonu cleotidicas das sequências peptídicas de gp75 e utilizaram-se para sondar uma biblioteca de ADNc construída a partir da linha de células de melanoma humano SK-MEL-19. Isolaram-se dois clones de cDNA (1,8 e 2,0 kb) dessa biblioteca de ADNc de SK-MELvl9. As sequências nucleotídicas parciais dos clones de cDNA (gp75-l e -2), uma das quais se representa no Quadro II, exibiram 88,6% de identidade com pMT4 (entre os nucleótidos 649-1437 dentro da cadeia de leitura aberta). A sequência dos aminoãcidos derivadas de gp75-l e gp75-2 mostrou uma identidade de 93,6% com a sequência de aminoãcidos derivada de pMT4 entre os resíduos de aminoãcidos 219-467. Verificou-se uma identidade de 55,3% entre as sequências de ADN de gp75 e de tirosinase humana £ Bouchard, Β,, B. Fuller, S. Vijayasaradhi e A. N. Hougton, Induc-14tion of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. EXp. Med., 169(1989) 2029, entre os nucleótidos 618-1344 da tirosinase (dados não apresentados).

QUADRO- I

Sequência de aminoâcidos de três péptidos derivados de gp75

1, Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Prc-Ala-Val

2, Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Thx-Tyr-Glu

3, Asn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leii-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser

Letras a cheio: resíduos de aminoâcidos que diferem dos resíduos previstos a partir de ADNc murino pMT4 [ Shibahara, S.,

Y, Tomita, T, Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri e R. Muller, Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res., 14(1986) 2413 J.

·.·/··· —15—

QUADRO II

Sequência de cDNA parcial de gp75

GGACCAGCTTTTCTCACATGGCACAGGTACCACCTCCTGCGTCTGGAGAAAGACATGC

AGGAAATGTTGCAAGÀGCCTTCTTrCTCCCTTCCTTACTGGAÀTTTTGCAÀCGGGGAA

AAATGTCTGTGATATCTGCACGGATGACTTGATGGGATCGAGAAGCAACTTTGATTCC

ACTCTAATAAGCCCAAACTCTGTCTTTTCTCAATGGCGAGTGGTCTGTGACTCCTTGG

AAGATTATGATACCCTGGGAACACTTTGTAACAGCACCGAGGATGGGCCAATTAGGAG

AAATCCAGCTGGAAÀTGTGGCCAGACCAATGGTGCAACGTCTTCCTGAÀCCACAGGAT ) GTCGCTCAGTGCTTGGAAGI^GGTTTATTTGÀCACGCCTCCTTTTTATTCCAÀCTCTA

CAAACAGTTTCCGAÀACACAGTGGAAGGTTACAGTGACCCCACGGGAAAGTÀTGACCC tgctgttcgaagtcttcàcaatttggctcatctattcctgaatggaacagggggacaa ÀCCCATTTGTCTTCCCAAGATCCTATTTTTGTCCTCCTGGACACCTTCACAGATGCAG TCTTTGÀTGAATGGCTAAGGAGATACAATGCTGATATATCCACATTTCCATTGGAAAA TGCCCCTATTGGACÀTAÀTAGACAATACAACATGGTGCCATTCTGGCCCCCAGTCACC AACACAGAAATGTTTGTTACTGCTCCAGACAACCTGGGATACACTTATGAA

-16A estreita homologia entre gp75 humano e o produto deduzido do gene pMT4 murino lança alguma luz sobre a estrutura e a função possíveis de gp75. 0 clone pMT4 foi isolado de células melanocíticas murinas £ Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri e R. Muller, Clcning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res., (1986) 2413 J. Pensou-se, originalmente, que o cDNA de pMT4 codificava para a tirosinase murina, que mapeia para o Iccus murino c (albino). Contudo, estudos subsequentes demonstraram que pMT4 é distinto da tirosinase murina /Yamamoto, H., S. Takeuchi,

T, Kudo, K. Makino, A. Nakata, T. Shinoda e T. Takeuchi, Cloning and sequencing of mouse tirosinase cDNA, Jpn. J. Genetics, £2(1987) 271; Muller, G., S. Ruppert, E. Schimd e G.

Schutz, Functional analysis of alternatively spliced tyrosinase gene transcripts, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ. J.), £(1988) 2723; Jackscn I. J., A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice,' Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 85.(1988) 4392 J. Identicamente, a sequência de gp75 ê diferente da sequência da tirosinase humana, embora exista identidade limitada (43,1%) entre gp75 e a sequência de aminoãcidos derivada da tirosinase humana (nos resíduos de aminoácidos 208-459), A função de gp75 e o produto de pMT4 ê sugerida pela descoberta de que pMT4 mapeia para o locus b (brown) no murganho /”Jackson I. J., ”A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA., £5 (1988)4392 / uma região que regula a cor da pele £ Sli. vers, W, K, Comparative geneties of coat colour in mammals in The Coat Colors' in Mice, Nova Iorque, Springer Verlag, 1979, lj, A homologia entre gp75 e a sequência de aminoácidos dedu-17zida de pMT4 permite a identificação formal do homólogo humano dc produto genético do locus brown murino. Baseado na sua localização melanossomal e na similaridade de estrutura com ti rosinase, a molécula de gp75 pode regular a síntese da melanina e determinar o tipo de melanina sintetizada.

Compreende-se que os determinantes des melanossomas e outros antigénios intracelulares não são alvos potenciais para a imunoterapêutica do melanoma. Contudo, recentemente, tor nou-se evidente que as proteínas intracelulares podem ser processadas e apresentadas como péptidos para as células T citotó xicas (CTL) por células que apresentam antigénios I Townsend,

A. R. M. e H. Bodmer, Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes, Ann. Rev. Immunol.,7 (1989) 601 ]. Esta descoberta revela a possibilidade teórica das respostas das células T contra o melanoma poderem ser dirigidas contra moléculas expressas pelas células tumorais. Alternativamente, os componentes melanossomais que são transportados normalmente para fo ra do melanõcito durante a maturação, podem-se acumular no espaço extracelular em torno das células tumorais ou a necrose tecidular local pode conduzir â libertação e deposição de produ tos intracelulares. Como apoio da acessibilidade de gp75, mAb TA99 marcado com radioactividade localiza especificamente para enxertos de melanoma humano em murganhos nu/nu £ Welt, S., J. M, Mattes, R. Grando, T. M. Thomson, R. W. Leonard, P. B. Zanzonico, R. E. Bigler, S. Yeh, H. F. Oettgen e L. J. Old, Monoclonal antibody to an intracelular antigen images human mela noma transplants in nu/nu mice, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 84(1987) 4200 J, indicando a disponibilidade do antigénio para o anticorpo nos sítios do tumor.

-18Anticorpos IgG em doentes com melancma AU reconheceram determinantes de gp75 que foram partilhados entre células de melancma e melanócitos normais £ Mattes J. Μ., T. M. Thomson, L. J. Old e K. 0. Lloyd, A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Câncer, 32 (1983) 717 J⁷. Com c isolamento de clones de ADNc que codificam para gp75 deve ser possível estudar estratégias para a imunização activa contra gp75. Existem pele menos duas exigências para a indução eficaz de respostas de CTL a gp75: 1) a tolerância imunolcgica a gp75 deve ser anulada; e 2) os peptidos de gp75 devem ser processados e eficazmente apresentados pelos antigénios de his tocompatibilidade principais nas células de melanoma. Alternativamente, ê possível que os antigénios de diferenciação de me lanocitos possam transportar determinantes únicos. Os genes que codificam produtos expressos por melanócitos normais podem sofrer mutagénese ou rearranjo durante a transformação maligna gerando novos epítopes para reconhecimento por CTL e anticorpos. Neste sentido, o antigénio único melhor caracterizado nas células de melanoma humano é um determinante na melanotransfer rina, uma glicoproteína de 95-97 kDa expressa nos melanócitos de cultura e nas células de melancma £ Real, F. X., M. J. Mattes, A. N, Houghton, H, F. Oettgen, K. 0. Lloyd e L. J. Old, Class 1 (unique) antigens of human melanoma. Identification of a 90 000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibedy, J. Exp,' Med.,' 160 (1984) 1219; Furakawa, K. S., K. Furakawa, F, X. Real, L, J. Old e K. O. Lloyd, A unique antigen epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoprotein gp75/p97”, J. Exp. Med., 169(1989) 585 Em apoio

-19desta possibilidade, detectaram-se alterações genéticas com grande frequência e amplitude através do genoma de células de melanoma humano. /* Dracopoli, N. C., A. N. Houghton e L. J. Old, Lqss of polymorphic restriction fragments in malignant melano ma: Implications for tumor heterogeneity, Troe. Natl. Acad.

Sei, USA., 82(1985) 1470; Dracopoli, N. C., B. Alhadeff, A. N. Houghton e L. J. Old, Lcss of heterozygosity of autosomal and x-linked loci during tumor progression in a patient with melanoma, Câncer Res., 47(1987) 3995 J.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo facto de a sequência codificar a sequência de aminoáci dos para gp75.
2. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo facto de a sequência codificar a sequência de aminoáci. dos para um fragmento de gp75.
3. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos para um fragmento de gp75 ser a sequência

-21asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tvr-asp-pro-ala

-vai.
4. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos para um fragmento de gp75 ser a sequência met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu.
5. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos para um fragmento de gp75 ser a sequência asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.
6. - Molécula de cADN isolada, caracterizada pelo fac to de ser isolada da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.
7. - Molécula de cADN isolada da molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de conter a sequência seguinte:

-22GGACCAGCTTTTCTCACATGGCACAGGTACCACCTCCTGCGTCTGGAGAAAGACATGG

AGGAAATGTTGCAAGAGCCTTCTTTCTCCCrrTCCrTTACTGGAATTTTGCAACGGGGAA

AAATGTCTGTGATATCTGCACGGATGACTTGATGGGATCCAGAAGCAACTTTGATTCG

ACTCTAATAAGCCCAAACTCTGTCmTCTCÀATGGCGAGTGGTCTGTGACTCCTTGG

AAGATTàTGATàCCCTGGGàACACTTTGTAACAGCACCGAGGàTGGGCCàATTAGGAG

AAATCCAGCTGGAAATGTGGCCAGACCAATGGTGCAACGTCTTCCTGAÀCCACAGGAT

GTCGCTCAGTGCTTGGAAGTTGGTTTATTTGACACGCCTCCTTTTTATTCCAACTCTA

CAAACÀGTTTCCGAAACACAGTGGAAGGTTACAGTGACCCCACGGGAÀAGTATGACCC

TGCTGTTCGAAGTCTTCACAATTTGGCTCATCTATTCCTGAATGGAACAGGGGGACÀA

ACCCATTTGTGZTCCCAAGÀTCCTATTTTTGTCCTCCTGCÀCACCTTCACAGÀTGCAG

TCTTTGÀTGAATGGCTAÀGGAGATACAÀTGCTGÀTATATCCACATTTCCATTGGAÀÀA

TGCCCCTÀTTGGACATAATAGACAATACAACATGG7GCCATTCTGGCCCCCAG7CACC

AàCACAGAAàTGTTTGTTàCTGCTCCàGàCAACCTGGGATACACTTATGAA
8. - Sequência de aminoácidos, caracterizada pelo facto de derivar da molécula de cADN isolada de acordo com a reivindicação 7.
9. - Vector de expressão, caracterizado pelo facto de conter uma sequência de ADN, essencial para a replicação do vector associado com a molécula de cADN de acordo com a reivindicação 6, adaptado para a expressão em um hospedeiro.
10. - Vector de expressão, caracterizado pelo facto de conter uma sequência de ADN essencial para a replicação do vector associado com a molécula de cADN de acordo com a reivindicação 7, adaptado para a expressão em um hospedeiro.

-2311. - Vector de expressão de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo facto de ser o vírus de vacina.
12. - Vector de expressão de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo facto de ser um vector Imelone.
13. - Processo para a preparação de uma vacina para estimular e reforçar, em um indivíduo a que se administrou a vacina referida, a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, caracterizado pelo facto de se incluir um vector de expressão de acordo com a reivindicação 9, conjuntamente com uma quantidade eficaz de um agente adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
14. - Processo para a preparação de uma vacina para es. timular e reforçar, em um indivíduo a que se administrou a vacina referida, a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, caracterizado pelo facto de se incluir um vector de expressão de acordo com a reivindicação 10, conjuntamente com uma quantidade eficaz de um agente adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
15.- Processo para a preparação de uma vacina para es timular e reforçar, em um indivíduo a que se administrou a vacina referida, a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, caracterizado pelo facto de se incluir uma quantidade de gp75 purificado ou de um seu fragmento, eficaz para estimular ou re forçar a produção de anticorpos nesse indivíduo, com uma quantidade eficaz de um agente adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
16.- Processo para a preparação de uma vacina para estimular ou reforçar, em um indivíduo a que se administrou a vacina referida, a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, caracterizado pelo facto de se incluir um polipeptido codificado pela sequência de aminoácidos como descrita na reivindicação 8, eficaz para estimular ou reforçar a produção de anticorpos nesse indivíduo, conjuntamente com uma quantidade eficaz de um agente adjuvante e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
17. - Processo para a preparação de uma vacina de acor do com uma qualquer das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de o indivíduo ser um ser humano.
18. - Processo para a preparação de uma vacina de acor do com uma qualquer das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo facto de se ligar o gp75 com um agente adjuvante.
19.- Método para estimular ou reforçar em um indivíduo a produção de anticorpos dirigidos contra gp75, caracterizado pe lo facto de se administrar a esse indivíduo uma vacina preparada pelo processo de acordo com uma das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, em uma dose eficaz para estimular ou reforçar a produção de anticorpos.
20.- Método para tratar, prevenir ou retardar ã recor rencia de cancro, como por exemplo, uma melanoma, caracterizado pelo facto de se administrar a um indivíduo susceptível, uma quantidade eficaz de uma vacina preparada de acordo com o processo descrito em uma qualquer das reivindicações 13, 14, 15 ou 16, eventualmente após a administração de uma quantidade eficaz de ciclofosfamida.