JPH06501837A - メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのＧＰ７５この出願は、１９９０年３月 ２２日に出願された米国特許出願第４９７．４３１号の−Ｈ１ａ続出願であり、 その内容は参照として本出願に組み込まれる。

この出願の全体を通して、種々の刊行物が引用される。これら刊行物の開示は、 本発明が関係する技術の状態をより完全に記述するために、その全体かり照とし てこの出願に組み込まれる。

〔発明の背景〕

ヒト癌細胞についての免疫原性決定因子の分子的同定は、癌に対する免疫応答を 理解するための基礎を提供する。ヒトメラノーマ細胞に関しては、免疫認識のた めのターゲットとして、下記の二つのクラスの抗原が注目されている。

１）自系メラノーマ細胞によってのみ発現する独特な抗原（Ｏｌｄ、Ｌｌ、　ｆ １９８１）、　Ｃａｎｃｓｒ　＋ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　５ｅａｒｃｈ 　ｆｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、　Ｇ、ｉ＾、Ｃｌｏｗｔｓ　Ｍｅｍｏｒｉ ａｌ　Ｌｅｃｔｕｒｅ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｔｓ。

４１：３６１　；　Ｃａｒｅｙ、　Ｔ、　Ｅ、　、　Ｔ、　Ｔｘｋａｈｘｓｈｉ 、　Ｌ、　Ａ、　Ｒ１５ｎｉｃｋ、　Ｈ，Ｆ、Ｏｅｔｔｇｅｎ、ａｎｄ　Ｌ、Ｊ 、０１ｄ、　（１９７６１，（ｅｌｆ　５ｕｔｔａｃｅ　ａｎ目ｇｔｎｓ　ｏｆ 　ｈｕａ＋＋ｎ　ｍａｌｉｇ＋＋ａｎｆ　ｍｅｌａｎｏｍａ、１．　Ｍｉｔｓｄ 　ｈｅｍｘｄｓｏｒｐ＋ｉｏｎ　ａｓｓａｙ　１ａｔ　ｈｕｍｏ＋ａｌ　ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ　ｔｏ　ｃｕｌｆｕｒｅｄ　ａｕｆｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｎｅｌａｎｏ ｍａ　ｃｅＩｔｓ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　７３：３２７８　；　Ｒｅａｌ、　Ｆ、　Ｘ、　、　Ｍ、　ｌ、Ｍａｌｌｅｓ 、Ａ、Ｎ、Ｒｏｕｇｈｆｏｎ、Ｒ，Ｆ、Ｏｅｔｔｇｕ、　Ｋ、０．ＬＩｏｙｄ、 ａｎｄ　Ｌ、Ｊ、ＯＩｄ、　（１９８４）、　Ｃ１ａｓｓ　］　（ｕｎｉｑｕｒ ）　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａｌｄＣｎｌｉｆｉ ｃａｊｉｏＩＩｏｆ　ａ　９θ、００１）　ｄａｌｌｏｎ　ｃｓｌｌ　５ｕ１１ ａｃｅ　ｇ１７ｃ。

ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ａｕｌｏｌｏｇｏｕｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｊ、Ｅｘｐ 、Ｍｅｄ　１６０：１２１９）および ２）通常、メラノサイト系統の細胞によって発現する分化抗原（Ｂｏｕｇｈｌｏ ｎ、Ａ、Ｎ、、　Ｍ、Ｃ，Ｔａｏｒ＋ｎ１ｎａ、　［１，１ｋｅｄａ、　Ｔ、Ｗ ａｌａｎａｂｅ、　Ｈ，Ｆ、Ｏｅｔｊｇ！ｎ、　ａｎｄ　Ｌ、１．ＯＩｄ、　（ １９８（１１，Ｓｔｔｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｕｔｖｔｙｏ１　ｎｏｒｍａｌ　ｈ ｕｍａｎｓ　ｆｏｒ　ｎｒｆｕｒａｌ　ａｎｊｉｂｏｄ７１ｏ　ｃｔｌｌ　ｓｕ ｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｍａ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７：４２６０　；Ｅｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ 、、　Ｍ、Ｅｉｓｉｎｇｅｒ、＾、Ｐ、Ａｌｂｉｎｏ、　Ｊ、Ｇ、Ｃｘ１ｒｎｃ ｔｏｓｓ。

ａｎｄ　Ｌ、　１．０１ｄ、　（１９８２）、５ｕｒｆａｃｅ　ｘｎｒｉｇｔｎ ｓ　ｏｆ　＋ｕｌａｎｏｃｙｌｔｓ　Ｊｎｄ　ｍｅｌａｎｏｍａ：　Ｍａｒｋｅ ｒｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｊｅ　ｄｉｆｆｓｒｃｎｔｉａ日ｏｎ　ａｎｄＩ Ｉｌｅｌａｎｏｍａ　５ｕｂｓｅｔｓ、１．　ＬＩＬ　Ｍｅｄ、１５６：１７５ ５　；　Ｉｌｏｕｇｈｌｏｎ、　Ａ、　Ｎ、　。

Ｆ、Ｘ、Ｒｅｘｌ、Ｌ、Ｊ、ｈｖｉｓ、Ｃ，Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａ＋ｄｏ、ａｎｄ 　Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、　（１９８７１、Ｐｈｅｎｏｊｙｐｉｃ　ｈｅｒｅｒｏｇｔ ｎｔＮ７　ｏｆ　ｍｒｌａｎｏｍａ：　Ｒ１１！ｔｉｏｎ　ｔ。

ｔｈｅ　ｄｉｆｆｓｔ！ｎｊｉＮｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏ ｍａ　ｃｅｌｌｓ、１．Ｅｘｐ、Ｍｔｄ、１６４：８１２　）。メラノサイトの 分化抗原は、メラノサイトが分化する間に発現する他の十分定義された表現型特 性（その最も特徴的なものはメラノソーム内でのメラニン色素の合成である）に 対するそれらの関係によって定義されている（Ｉｌｏｕｇｈｆｏｎ、、４．Ｎ、 、　Ｍ、Ｅｉｓｉｎｇｔｒ、　Ａ、Ｐ、Ａｌｂｉｎｏ、Ｊ、Ｇ、Ｃａ１ｒｎｃｒ ｏｓｓ、ａｎ＋Ｉ　Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、（１９８２）、　５ｕｒｆａｃｔ　ａｎｆ ｉｇ！ｎｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｊＣｓ　ａｎｄ　ｍｓ１３ｊｏｍａｓ：　 Ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃ７ｔｅ　ｄ百ｆｓｒｅｎｔｉａｌｉｏｎ ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏｍａ　５ｕｂｓｅｔｓ、ｆ、Ｅｘｐ、Ｍｔｄ、１５６：１ ７５５；Ｒｏｕｇｈｊｏｎ、ＡＮ、、Ｆ、Ｘ、Ｒｅａｌ、Ｌｊ、Ｄａｖｉｓ、　 Ｃ，Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、ａｎｄ　Ｌ、Ｊ、ＯＩｄ。

（１９８７）、　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｈｔｌｅｆｏｇｅｎｅｉｆｙ　ｏｆ　 ｍｅｌｚｎｏｍａ：　Ｒｅ１ｊｔｉｏｎｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉｌｌｅｒｔｎＨａＨ ｏｎ　ｐｒｏｇｒｊｍ　ｏｆ　＋ｕｌｘｎｏｍｘ　ｃｅｌｌｓ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、１６４：８１２　）　。

臨床観察は、正常色素細胞によって発現する抗原に対する免疫応答が転移メラノ ーマの進路に影響を及ぼす可能性を示唆している。特に、メラノーマを持つ患者 の皮膚発疹およびハイポピグメンテーションは良好な予後と関連付けられている （ＮｏｒｄＩｕｎｄ、Ｊ、Ｊ、、　Ｊ、Ｍ、Ｋｉｒｋｗｏｏｄ、　Ｂ、Ｍ、Ｆｏ ｒｇｅｔ、　Ｇ、ＭｉＨｏｎ。

Ｄ、　Ｍ、　Ａｌｂｅｒｔ、ａｎｄ　Ａ、Ｂ、Ｌｅｒｎｅｒ、（１９ｇ３Ｊ　Ｖ 目ｉ１ｉｇｏ　１ＩＩｐａ＋１ｅｎＩｓ　ｗｉｔｈ　ｍｒｌｘｓｆａｌｉｃ　ｌ ｌＩｌｅｌａｎｏｍａ：　ａ　ｇｏｏｄ　ｐｔｏｇｎｏｓｉｓ　ｓｉｇｎ、Ｊ。

Ａｍ、　Ａｃａｄ、　Ｄｅｒｍａ＋ｏ１．９：６８９　；　Ｂｙｓｊｔ７ｎ、　 ｌ、　Ｃ，、Ｄ、　Ｒｉｇｓ）、　Ｒ，Ｊ、　Ｆｒｉｅｄｍｚｎ、ａｎｄ　Ａ、 Ｋｏｐｌ、ｔ１９８７）　ｌ’ｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｃｅ 　ｏｆｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｊａｌｉｏＩＩｉｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌ ａｎｏｍａ、　Ａｒｃｂ、Ｄｅｒｔｎａｌｏｌ、１２３・１０５３）。これに関 連して、メラノサイト抗原は免疫系によって認識することが可能である。これは 、転移メラノーマを持つ患者の血清１ｇＧ抗体による自系メラノーマ細胞からの ｇｐ７５抗原の免疫沈降により示されている（Ｍａ　ｌ　Ｔｅｓ、　Ｊ、　Ｍ、 、　Ｔ、Ｍ、Ｔｈｏｍｓｏｎ、　Ｌ、１Ｏ１ｄ、！ａｄ　ｌ：、ｏ、Ｌｌｏ７ｄ 、（１９８３）　Ａ　ｐｉｇ＋ｕｎｌａｆｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｒｄ、ｄｉ ／ｆｅｒｓｌｉａｌｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｈｕａ＋ａｎ　ｍｅｌａｎ ｏｍａ　ｄｅＩｉｎｅｄ　ｂ７　ａ　ｐｒｅｃｉｐＮｘｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏ ｄ７　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｓｒｕｍ、ｆ、Ｃａｎｃｅｒ、３２ニア１７）　ｏ 　ｇ　ｐ７５抗原はメラノサイトのポリペプチドであって、色素が形成されたメ ラノサイトおよびメラノーマによって合成される最も多量に存在する糖タンパク である（Ｔａｉ、Ｔ、、　Ｍ、Ｅｉｓｉｎｇｅｒ、Ｓ、Ｏｇａｔａ、ａｎｄに、 　０．　Ｌｌｏｙｄ。

１１９８３）　ＧｌｙｃｏｐｒｏｔＰｉｎｓ　！ｓ　ｄｉｆｆ！ｒｔｎｌｉａｌ ｉｏｎ　ｍａｒｋｕｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　１Ｉｌｅｌａ ｎｏａｕ　ａｎｄ　＋ｕｌａｎｏｃ７１Ｃｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　ｈｓ、　４３： ２７７３）。表皮メラノサイト、良性の色素形成病変、並びに−次および転移メ ラノーマはｇｐ７５を発現するが、他の細胞型は発現しない（Ｔｈｏｍｓｏｎ、 Ｔ、Ｍ、、　Ｆ、Ｘ、Ｒ＊ａｌ、　Ｓ、Ｍｕｒｘｋａｍｉ、　Ｃ，Ｃａｒｄｏｎ −Ｃａｒｄｏ、Ｌ、Ｊ、ＯＩｄ、ａｎｄ　Ａ、Ｎ、ｌＩｏｕｇｈｔｏｎ、ｆ１９ ８８）　Ｄｉｆｆｅｒｓｎ１＋ａｌｌｏｎ　ａｎｔｌｇｅｆｌｓ　ｏｆ　ｍｅｌ ｘｎｏｃｙｌｅｓ　ａｎｄ　ｍｔｌａｎｏｍａ＋　Ａ１１ａ１７１１Ｓｏｆ　ｍ ｅｌａｎｏｓｏｍｅ　ａｎｄ　Ｃ！ＩＩ　５ｕｒＩｚｃｅ　ｔｎｘｒｋｔｒｓ　 ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｖＮｈ　ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｔｓ、　Ｊ、Ｉｎｖｒｓｔ、Ｄｅｒｍａｆ（１１，９ １）：４５９）　。この発明においては、ｇｐ７５ｃＤＮＡが、ｂ（檄魚）遺伝 子座をマツプするマウス遺伝子に由来するアミノ酸およびヌクレオチド配列と、 はぼ９０％の同一性を有していることが示される。この世魚遺伝子座は、外皮の 色を決定し、合成されるメラニンの型に影響を及ぼす部位であり、ｇｐ７５が合 成されるメラニンの型を調整し、もしくは影響を及ぼしていることが示唆される 。

転移メラノーマを持つ患者の血清中のＩｇＧ抗体がｇｐ７５を免疫沈降させるこ とが見出されているという事実は、ｇｐ７５に対する免疫寛容を破壊することが 可能であることを示している。したがって、この発明は、メラノーマに対するワ クチンとして使用される、ｇｐ７５ｃＤＮＡを有する発現ベクターを提供する。

このベクターにより、マウスモノクローナル抗体ＴＡ９９により単離および精製 されたｇｐ７５ポリペプチドからペプチドのアミノ酸配列が決定され、かっこの ペプチド配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いるスクリーニングによりｃＤＮ Ａクローンが単離された。

〔発明の要約〕

この発明は、その配列がｇ　ｐ　７５もしくはそれらの断片のアミノ酸配列をコ ードする、単離核酸分子を提供する。

この発明は、さらに、ｇｐ７５核酸分子の単離ｃＤＮＡ分子、並びに図３に示す ヌクレオチド配列を有するｇｐ７５核酸分子の断片の単離ｃＤＮＡ分子およびそ れらから誘導されるアミノ酸配列を提供する。

この発明はまた、それか投与される被検体において、ｇｐ７５に対する抗体の産 生を刺激または増強するワクチンを提供する。

この発明は、さらに、被検体におけるｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激または 増強する方法を提供する。この方法は、抗体産生の刺激もしくは増強のために、 この発明のワクチンの有効量を被検体に投与することを含む。

この発明は、さらに、癌の再発を治療し、予防し、または遅らせる方法を提供す る。この方法は、癌の再発の治療、予防または遅延のために、この発明のワクチ ンの有効量を被検体に投与することを含む。

〔図面の簡単な説明〕

図１　：　ｍＡｂ　ＴＡ９９およびＡＵ血清により認識されたタンパク質の免疫 沈降およびペプチド組成分析。

Ａ、ＳＫ−ＭＥＬ−１９からの１２５Ｉ標識溶解物からのｍＡｂＴＡ９９による 免疫沈殿物の一次元５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（レーン１）、正常ヒト血清（レーン２ ）並びに１／７５　（レーン３）および１０／７６　（レーン４）からのＡＵ血 清。

Ｂ、ｇｐ７５もしくはエンドＨで処理した（部分的に脱グリコジル化した）ｇｐ ７５に相当するバンドを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、５ＤＳ −ＰＡＧＥ上において、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼで制限消化する ことによりペプチド組成を解析した。−１ｇｐ７５；＋、エンドＨで部分的に脱 グリコジル化したｇｐ７５゜オートラジオグラフ露光は、ＴＡ９９に対して２日 問およびＡＵペプチドに対して５日間であった。

図２：ｇｐ７５由来の３種のペプチドのアミノ酸配列。下線を付したアミノ酸残 基は、マウスｃＤＮＡ　ｐＭＴ４　（Ｓｈｉｂａｈａｒａ、Ｓ、、　Ｙ、Ｔｏｍ ｉｊａ、　Ｔ、５ａｋａｋｕｒａ、　Ｃ，Ｎａｇａｉ、　Ｂ、Ｃｈａｕｄｈｕｒ ｉ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ、（１９８６）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｔ７ｒｏｓｉ ｎｘｓｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１４：２４１３）から予測 される残基と異なるものである。ｇｐ７５由来の３種のペプチドのアミノ酸配列 。

図３：ｇｐ７５の部分的ｃＤＮＡ配列。ヌクレオチド７７８からヌクレオチドｌ ５２４までの５’　−３’　部分的ｃＤＮＡ断片が描写される。

図４：ｇｐ７５をコードする完全長のｃＤＮＡの単離。２，７ｋｔ）　ｇｐ７５ ｃＤＮＡインサートを含む部分的制限地図が示される。ＧＰ７５の全２．７ｋｂ 　ｃＤＮＡの最初の１８ヌクレオチドを含む部分的ヌクレオチド配列が５’−３ ’方向に示される。

〔発明の詳細な説明〕

この発明は、その配列がｇｐ７５またはその断片をコードする単離核酸分子を提 供する。

この発明は、さらに、その−態様において、ｇｐ７５の断片のアミノ酸配列がａ ｓｎ−ｔｈｒ−ｖａｔ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ｔｙｒ−ｓｅｒ−ａｓｐ−ｐｒ。

−ｔｈｒ−ｇｌｙ−１ｙｓ−１ｙｒ−ａｓｐ−ｐｒｏ−ａｌ、ａ−ｖａｌである ことを提供する。

他の態様においては、アミノ酸配列は、ｍｅｔ−ｐｈｅ−ｖａｌ−１ｈｒ−ａｌ ａ−ｐｒｏ−３ｓｐ−ｘｓｎ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ｔｙｒ−ｊｈｒ−ｔｙｒ−ｇｌ ｕである。さらに別の態様においては、アミノ酸配列は、ａｓｎ−ｐｈｅ−ａｓ ｐ−ｓｅｒ−Ｉｈｒ−１ｅｕ−ｉｌｅｕ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ａｓｎ−ｓｅｒ−ｖ ａｌ−ｐｈｅ−ｓｅｔである。

この発明は、さらに、ｇｐ７５核酸分子の単離ｃＤＮＡ分子並びに図３に示すヌ クレオチド配列を有するｇｐ７５核酸分子の断片の単離ｃＤＮＡ分子およびそれ らに由来するアミノ酸配列を提供する。

ＧＰ７５Ｅ−１と称するＥ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５αか、ＡＴＣＣ受入番号（Ａｃｃ ｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　）　として、アメリカンａタイプ・カルチャー・コレク ション、ロツクヴイル、メリーランド、ｕ、ｓ、Ａ、２０８５２に寄託されてい る。このＧＰ７５Ｅ−１は、ｐｃｖＥｘと称するプラスミドベクターと全長２． ７ｋｂのＧＰ７５ｃＤＮＡインサート（図４参照）とを含むｐ　Ｇ　Ｐ　７５　 Ｅ　−１プラスミドを有する。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブタベスト条約（ブタペスト条約）の規約に従ってなされた。

全長２．７ｋｂのｃＤＮＡを含むプラスミドは、この分野で公知の方法（Ｍａｎ ｉ２ｆｉｓ、丁、、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｓｈ、ａｎｄ　Ｊ、Ｓａｍｂ＋ｏｏｋ、１ ９８９、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎ＋＋ｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐａｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ 、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１．３ｇ−１ｊ９゜１、４ ２−１．３４３　）により、寄託されたＥ、ｃｏｌｉホスト株から回収すること かできる。このプラスミドからの２．７ｋｂのＧＰ７５ｃＤＮＡの単離は、この 分野で公知の方法により、ＥｃｏＲｌを使用する制限エンドヌクレアーゼ消化を 用いて行なうことができる。

加えて、この発明は、ホストにおける発現に適合したｇｐ７５核酸分子もしくは 断片のｃＤＮＡ分子と結合したベクターの複製に必須のＤＮＡ配列を宵する発現 ベクターを提供する。

この発現ベクターは、ワクチニアウィルス、もしくは、好ましくはイムクロン（ Ｉｍｅｌｏｎｅ　）ベクターであってもよい。

この発明はまた、それが投与される被検体において、ｇｐ７５に対する抗体の産 生を刺激し、または増強させるためのワクチンであって、ｃＤＮＡ分子を有する 発現ベクター、有効量のアジュバントおよび調薬上許容し得る担体を含有するワ クチンを提供する。好ましくは、被検体は人間であり、ｇｐ７５はアジュバント に結合されている。アジュバントは微生物アジュバントであっても、または他の いかなる調薬上の試薬であってもよい。

さらに、この発明は、それが投与される被検体において、ｇｐ７５に対する抗体 の産生を刺激し、または増強させるためのワクチンを提供する。このワクチンは 、ｇ　ｐ　７５１核酸分子もしくは断片のｃＤＮＡ分子に由来するアミノ酸配列 または被検体における抗体産生を刺激もしくは増強するに有効な量の精製ｇｐ７ ５もしくはその断片、有効量のアジュバント、および調薬上許容し得る担体を含 有してもよい。被検体は人間であり、ｇｐ７５はアジュバントに結合しているこ とが好ましい。アジュバントは、微生物アジュバントまたは他のいかなる調薬上 の試薬であってもよい。

この発明はまた、被検体における、ｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激または増 強する方法を提供する。この方法は、抗体の産生を刺激もしくは増強するに有効 な投与量で、この発明のワクチンを被検体に投与することを含む。

この発明はさらに、癌を患う被検体における癌の治療方法を提供する。この方法 は、癌の治療に有効な投与量でこの発明のワクチンを被検体に投与することを含 む。

この発明は、さらに、癌を患う被検体における癌の予防方法を提供する。この方 法は、癌の予防に有効な投与量でこの発明のワクチンを被検体に投与することを 含む。この発明はまた、癌に感受性のある被検体における癌の再発を遅らせる方 法を提供する。この方法は、癌の再発を遅らせるに有効な投与蓋でこの発明のワ クチンを被検体に投与することを含む。

癌の再発を治療し、予防し、かつ遅らせる方法は、メラノーマのような癌に対す るものであってもよい。このワクチンは、再発の危険が高い患者におけるメラノ ーマまたは一次メラノーマのような癌の予防に有用である。

これらの方法において、ｇｐ７５はアジュバントに結合していてもよい。加えて 、ワクチンを投与する前に被検体に有効量のシクロホスファミドを投与すること もできる。

この発明は、以下の稟験詳述項において説明される。これらの項はこの発明の理 解を助けるために示されるものであり、以下の請求の範囲に示されるように、い かなる意味でもこの発明を限定することを意図するものではな（、限定すると解 釈されるものでもない。

実験　１ 材料および方法 組織培養 メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１９を、ウシ胎児血清（Ｆｅ２　）が５ｅｒｕ ＋ｎＰｌｕｓ　１０％　（ｖ／ｖ）　（Ｂａｕｌｔｏｎ　Ｒｔｓｅａ＋ｃｈ　Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃｌ、Ｌｅｎｅｘａ、　ＫＳ　）に置き換えられたことを 除いて、　１％非必須アミノ酸およびペニシリンおよびストレプトマイシンを加 えたＭＥＭで増殖させた。

ｇｐ７５の単離および精製 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　、、ｐＨ７，５、５ｍＭ　ＭｇＣｌ　、２ｍＭＰ ＭＳＦにおいて細胞をホモジネートし、　Ｉ（ｌｆｌ、　ＨＯｘ　ｇで遠心分離 することにより、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１９がら後接膜分画（ｐｏｓ ｔ−ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｓｍｂｒａｎｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を単離した。この 膜を２０ｍＭ　ｂｉｓ／ＨＣＩ　、　ｐＨ７，５，３Ｍ　ＭＣＩおよび５ｍＭ　 ＥＤＴＡにおいて可溶化し、＋００．　（１００Ｘ　ｇで遠心分離した。

不溶タンパク分画を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，５，０，５％デオ キシコール酸ナトリウムに再懸濁した。デタージエント可溶タンパクを、１００ ．　（１（１０Ｘ　ｇで遠心分離することにより集めた。この上清を、２０ｍＭ 　丁ｒｉｓ／ＢＣＩ　、ｐＨ７，５，０，１５Ｍ　Ｎ　！　ＣＩ　Ｐ；　ヨび２ ｍＭ　Ｃｌ１ＡＰＳ　ｌ：対して透析し、２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ　、ｐＨ７ ，５，０，１５Ｍ　ＮａＣｌおよび２ｍＭ　Ｏ−Ｃ（３−コラミドプロピル）ジ メチルーアンモニオコ１−プロパンスルホネート（ＣＢＡＰＳ　）（緩衝液Ａ） で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ（ＨＲ５１５、Ｐｈａｒｍａｃｕ　ＬＫＢ　Ｂ　Ｉａ ｌｅｃｈｎｏｌｏＨＩｎ　Ｃ，Ｐｉｓ　ＣａＮｖａｙ、　ＮＪ）カラムにかけた 。緩衝液Ａ中の０−１．０Ｍ　ＮａＣ１直線勾配で結合タンパクを溶出させた。

分画は、競合阻害アッセイによりｇｐ７５について検定を行なった。ｇｐ７５を 含ａする分画をプールし、Ｃｏｎ　Ａカラム緩衝液（ＩｍＭ　ＣａＣｌ１゜Ｉｍ Ｍ　Ｍ＋＋ＣＩ２および２ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する、ｌＯｍＭＴｒｉｓ／ＢＣ Ｉ　、ｐ　Ｈ７，５）に対して透析してＣｏｎ　Ａ−セフｙＯ−スカラムにかけ た。カラム緩衝液で洗浄することにより、非結合タンパクを除去した。Ｃｏａ　 Ａに結合したタンパク質は、Ｃａｎ　Ａカラム緩衝液中の０．２５Ｍ　α−Ｄ− メチルマンノピラノシドを用いてＣｏｎ　Ａに結合したタンパク質を溶出させた 。

ｇｐ７５を含有する分画をプールして、Ｈ）ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７， ５，２ｍ〜ｆ　ＣＨＡＰＳおよび２ｍＰｖＩ　ＰＭＳＦ　（ＣＢ）に対して透析 し、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）　ＴＡ９９　（Ｔｈｏｍｓ。

ｎ、Ｔ、Ｍ、、　Ｊ、Ｍ、Ｍａｆｔｅｓ、　Ｌ、Ｒｏｕｘ、　Ｌ、Ｊ、０１ｄ、 　ａｎｄに、０．Ｌｌｏｙｄ　（１９８５）　Ｉ’ｉｇｍ！ｎ１ａｊｉｏｎ−ａ ｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｌｙｃｏｐｒｏ＋ｓｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａ ｎｏｍａ　’ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏｃ７ｊｅｓ：　Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｗｉ ｔｈ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｔ　ａｎｙｂｏｄｙ、Ｊ、Ｉｎｖｅ ｔｔ、Ｄｓｒｍａｔｏｌ、　８５：１６９）　Ａｌｆｉ−Ｇｅｔ　１０アフイニ テイ力ラムにかけた。このゲルを、各々６ｍｌのＣＢ。

ＣＢ＋　ｌ〜ｉ　ＮａＣｌ、　ＣＢ、およびＣＢ＋　２ｍＭ　ＣＨＡＰＳで逐次 的に洗浄した。結合ｇｐ７５を２ｍＭ　ＣＢＡＰＳを含有する０、１Ｍグリシン −ＢＣＩ、ｐＨ３，ｌでカラムから溶出させた。

合を阻害する分画の能力を酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ　）によって′ａ１定する ことにより、ｇｐ７５をモニターし、定量した（Ｂｏｕｇｈｌｏｎ、Ａ、Ｎ、、 　Ｈ，Ｂｒｏｏｋｓ、　Ｒ，ｊ、Ｃｏ！ｔ、　Ｍ、Ｃ，Ｔａｏｒｍｉｎａ、Ｂ、 Ｆ、Ｏｅｆｌｇｅｎ　ａｎｄ　Ｌ、Ｊ、０１ｄ、！１９８３）　Ｄｅｌ！ｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　１ｎｆｒａｃｅｌｌｕｌａｒ 　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ｈｕＩＩｌａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ：ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｙｍ ｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍ Ｃｌａｎｏｍａ、ｌ、ＥＸｐ、Ｍｅｄ、１５８：５３）。

免疫沈降、ゲル電気泳動およびペプチドマツピングクロラミンＴ法によるＳＫ− ＭＥＬ−１９のＣｏｎ＾−セファロース結合タンパク分画のヨウ素化、並びにｍ Ａｂ　ＴＡ９９および＾υ血清を用いる免疫沈降を記述の通りに行なったＣＭａ Ｈｔｓ、　Ｊ、　Ｍ、、　Ｔ、Ｍ、Ｔｂｏｍｓｏｎ、　Ｌ、　Ｊ、０１ｄ、ａｎ ｄ　ＬＯ，ＬＩｏ７ｄ、ｆ１９８３１　Ａ　ｐｉｇａ＋ｅｎｊａｆｉｏｎ−ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ、ｄｉ（ｆｅｒｅ＋ｕｉａｊｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　 ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂ７　Ａ　ｐｒｅｃｉｐｉｔ ａｔｉｎｇ　ａｎｔ：ｂｏｄｌ　ｉｎ　）＋＋ｍａｎ　ｓｅｒｕｍ、ｆａｔ、Ｊ 、Ｃａａｃｒｒ、３２ニア１７）　ｏタンパク質は、５０５−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、 に、（１９７０）　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｊｔｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｘｓｓｅＩｎｂ１７　ｏｆ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ 　ｏｆ　ｂｘｔｌｔＢｏｐｈａｇｅ　Ｔ４．　Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０） 。エンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）消化のために、免疫沈降物を０．４％Ｓ ＤＳに懸濁させ、１００℃で５分間加熱し、　ＩｍＵのエンドＨを用いて、　１ ００ｍ　Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５，５中において３７℃で１６時間消化した。

オファ−レルに従い、アンフすリン（ａｍｐｈｏｌｉｎ＊ｓ）　ｐＨ５−７（Ｉ ＪＢ−Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ、　Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ　）を用いる二次元 電気泳動を行なった（０’Ｆａｒｒｅｌ、Ｐ、Ｈ，（１９７５１Ｈｉｇｈ　ｒｓ ｓｏｌｌｉｏａ　ｔｗｏ−ｄｉ＋ｕｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｕｓ ｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５０：４００７ ）。免疫沈降したｇｐ７５のペプチドマツピングは、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄら（Ｃ １ｅｖｅｌａｎｄ、Ｄ、Ｗ、、　Ｓ、Ｇ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、　Ｍ、Ｗ、Ｋｉｒｓ ｃｈｎｅｒ、　ａｌｌｄ　Ｕ、ＬＬａｅ＋ｕ＋Ｉｉ、（１９７７）　Ｐｒｐｔｉ ｄｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｂｙ　１１ｍ１ｔｅｄ　ｐｒｏｊｅｏ１７ｓｉｓ　ｉｎ 　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ 　ｂ７　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔ＋ｏｐｈｏ＋ｅｓｉｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２５２：１１０２　）に従い、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、スタフィロコッカス ・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ。

ｃｃｕｓ　ａｕ＋ｅｕｓ）　Ｖ８プロテアーゼ（Ｖ８プロテアーゼ）（ＢＯｅｂ ｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｂｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１ｎｄｉａｎａ ｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いる制限タンパク分解により行なった。

ペプチド配列決定 ペプチド配列決定は、バーバード大学マイクロケミストリー施設で行なった。ニ トロセルロース上にエレクトロプロットした（ｅｌｅｃｊｒｏｂｌｏＮｅｄ）精 製ｇ　ｐ　７５　（１２μｇ）を、Ａｅｂ＊ｒｓｏｌｄ　（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ 、Ｒ，Ｈ，、Ｊ、Ｌｅａｖｉｔｔ、Ｒ，Ａ、５ａａｖｅｄｒａ、ａｎｄ　Ｌ、Ｅ 、１１ｏｏｄ、（１９８７）　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅ ｑｕｓｎｃｅ　ａｎａ１７ｓｉｓ　ｏｆｐＩｏｔｅｉｎｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄ 　ｂｙ　ｏｎｅ−ｏｒ　ｔｖｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｊ ＋ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎ　５ｉｔｕ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｄｉ ｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｉｌ　ｎＨｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｐ＋ｏｃ、Ｎａ１ｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：６９７０）に従い、ｖ８プロテアーゼ（１： ２０　Ｗ／Ｗ　）で消化し、得られたペプチドをＢｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰ−３０ ０２，Ｉ　Ｘ１００　ｍｍ　Ｃ８カラムで３８℃で分離した。Ｖ８プロテアーゼ 消化物からの幾つかのピークをプールし、乾燥した。５０μｇの８Ｍ尿素１０． ４Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝ｄ、ｐＨ８，０，５μｇの１００ｍＭジチオトレイ トールを添加し、５０°Ｃで１５分間加熱することにより、完全還元およびアル キル化を行なった。その後、試料を４５ｍ　Ｍヨード酢酸５ｍｇと共に室温で１ ５分間インキュベートし、蒸留水１４１］μｇで希釈した。さらに、還元かつア ルキル化されたペプチド分画をトリプシン（１：２５　Ｗ／Ｗ）を用いて３７℃ で一晩消化した。配列決定しようとする分画をポリブレン・プレサイクルド（ｐ ｒｅｃｙｃｌｅｄ　）　・ガラスファイバーフィルターに直接適用し、ＡＢＩ４ ７７Ａプロティン・シーケンサ−で配列決定した。アミノ酸は、ＡＢｌ１２ＯＡ オンラインＨＰＬＣを用いて分離した。各ペプチドについて、最低２０サイクル 行なった。ルーチンの実験室条件の下でのＨＰＬＣの反復収率は９３％であった 。最も信頼性の高い結果を有するペプチドのアミノ酸配列のみを報告する。

ｇｐ７５ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定メラノーマ細胞株５Ｋ−１ｄＥ Ｌ−１９からｃＤＮＡライブラリーを構築した。前に記述された方法（Ｂｏｕｃ ｈａｒｄ、Ｂ、、　Ｂ、Ｆｕｌｌｅｒ、Ｓ、Ｖｉｉａ７ａｓａｒａｄｈｉ、ａｎ ｄ　Ａ、Ｎ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、（１９８９）　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｐｉ ｇｍｅｎｔａ目ｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｌｓ　ｂ７　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＩｙｒｏｓＩｎａｓｅ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、１６９：２０２９）に従って、ｇｐ７５ｃＤＮＡクローンの単離にオリゴヌ クレオチドプローブを用いた。このオリゴヌクレオチドプローブの配列は、５’ 　ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＣＡ ＣＧＡＡＣＡＴＣＴＣ３’であった。Ｇ　Ｐ　７５−１と称する２、（ｌｋｂの ｃＤＮＡクローンの配列決定を行なった（Ｓｔｒａｔｘｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　Ｓ７Ｓ７５ｔｅ、　Ｌａ　１ｏｔｌａ、ＣＡ）。Ｇ　Ｐ　７５−１のヌクレ オチド配列は、受入番号Ｘ　５１４５５としてＥＭＢＬデータバンクに寄託され ている（図３参照）。

結果および考察 マウスｍＡｂ　ＴＡ９９およびメラノーマ患者ＡＵからの血清はいずれも７５　 ｋＤａの抗原を免疫沈降させ、かつｍＡｂ　ＴＡ９９はＡＵ血清によって沈殿す るｇ　ｐ　７５抗原を予め一掃する（：ｐｒｅｃｆｅａｒ）　（Ｔｈｏｍｓｏｎ 、Ｔ、Ｍ、、Ｊ、Ｍ、Ｍａｌｌｅｓ、Ｌ、Ｒｏｕｘ、Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、ａｎｄＬ Ｏ，Ｌｌｏｙｄ　（１９８５）　Ｐｉｇｍｅｎｌａｊｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔ ｅｄ　ｇｌｙｃｏｐ「ｏｔｅｉｎｏｌ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｄ 　ｍｅｌａｎｏｃｙｊｅｓ：　Ｄｅｆｉｎｉｆｉｕ　ｗ白ｈａｍｏｕｓｅ　ｍｏ ａｏｃｌｏｎａｌ　５ｎｌｉｂｏｆ、Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｄｅ＋ｍａｔｏ１．　 ８５：１６９）。

ｍＡｂ　ＴＡ９９はメラノーマ細胞株ＳＸ−！ｄＥＬ−１９からｇｐ７５を精製 するために用いられたので、ｍＡｂ　ＴＡ９９がＡυ血清に認激されるｇｐ７５ 抗原のみを検出したことを確かめることが重要である。

以前の研究において、我々は、ｍＡｂ　ＴＡ９９はヒトチロシナーゼ、同様に色 素形成されたメラノサイト中に発現する７５７８０　ｋＤａの糖タンパク質と反 応しないことを示した（Ｂｏｕｃｈａｒｄ、Ｂ、、Ｂ、Ｆｕｌｌｅｒ、Ｓ、Ｖｉ ｉａｙａｓａｒａｄｈｉ、ａｎ（ｉＡ、Ｎ、Ｈｏｕｇｈｊｏｎ、（１９８９）　 Ｉｎｄｕｃｌｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍ＊ｎｔａｌｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｆ ｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｆｙ ｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｊ、ｈｐ、Ｍｅｄ、１６９：２１）２９）　ｏ　し力）しな から、これらの実験からは、ｍＡｂ　ＴＡ９９がＳＫ−ＭＥＬ−１９によって発 現する他のポリペプチドと交差反応する可能性を除外することはできなかった。

ｍＡｂ　ＴＡ９９およびＡｌｌ血清抗体によって免疫沈降したタンｔＺり質を、 −次元および二次元５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび互、オウレウの両者により沈殿した タンパク質は、同一の分子量（７５ｋＤａ）、同一等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒ ｉｃ　ｐｏｉｎｔ　：　５．５−５．９）　、およびペプチド組成（図１）を有 しており、ＴＡ９９およびＡＵ血清は同一のｇｐ７５分子を認鷹することが確認 された。

ｇｐ７５抗原は、材料および方法に記載された通りに精製した。アフィニティー 精製したｇｐ７５をペプチド配列決定に利用した。Ｖ８プロテアーゼおよびトリ プシンを用いる精製ｇｐ７５のタンパク分解開裂により、３種の内部ペプチドの アミノ酸配列が得られた。この３種のペプチドの配列を図２に示す。５ｈｉｂａ ｈａｒａ　らによって単離されたマウスｃＤＮＡクローン、ｐＭＴ４　、から推 定されるアミノ酸配列と９０％一致した（　ｐ　Ｍ　Ｔ　４のアミノ酸位置２４ ７−２６０．３３３−３４９、および４２８−４４１）　（Ｓｈｉｂａｈａｒｘ 、Ｓ、、　Ｙ、Ｔｏｍｉｆａ、　Ｔ、５ａｋａｋｕｒａ、　Ｃ，Ｎａｇａｒ、Ｂ 、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、ａｎｄ　Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ、（１９８６）　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ。

ｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　＋ｙｒｏｓｉｎａｓｅ、 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

１４：２４１３）。オリゴヌクレオチドプローブはｇｐ７５のペプチド配列から 誘導され、ヒトメラノーマ細胞株Ｓに−ＭＥＬ−１９から構築されたｃＤＮＡラ イブラリーのスクリーニングに用いられた。２種のｃＤＮＡクローン（１，８お よび２．０ｋｂ）が、ＳＫ−ＭＥＬ−１９のｃＤＮＡライブラリーから単離され た。ｃＤＮＡクローン（ＧＰ７５−１および−２）の部分的なヌクレオチド配列 （その１つは図３に示されている）は、ｐＭＴ４と（オープン・リーディング・ フレーム内のヌクレオチド６４９−１４３７の間で）８８．６％の同一性を示し た。Ｇ　Ｐ　７５−１および−２の推定アミノ酸配列は、ｐＭＴ４の推定アミン 酸配列と、アミノ酸残基２１９−４６７の間で９３６％の同一性を示した。Ｎａ ７５のｃＤＮＡ配列とヒトチロシナーゼとは、チロシナーゼのヌクレオチド６１ ８−１３４４の間で、５５３％の同一性かあった（Ｂｏｕｃｈａｒｄ、３．、　 Ｂ、Ｆｕｌｌｅｒ、　Ｓ、ＶｉｊＢａｓａｒａｄｈｉ、　ａｎｄ　Ａ、Ｎ、Ｈｏ ｕｇｈｌｏｎ、（１９８９）　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍｆｆｎｆｘ ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｆｉｂ＋ｏｂｌａｓ！ｓ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＬＥｘｐ、Ｍｅｄ、１６９ ：２０２９）。

ヒトｇｐ７５とマウスｐ　Ｍ　Ｔ　４遺伝子の推定正生物との緊密な相同型は、 Ｎａ７５の可能な構造および機能にいく筋かの光を当てる。ｐＭＴ４クローンは マウスメラノサイトから単離された（Ｓｂｉｂａｈａｒａ、Ｓ、、Ｙ、Ｔｏｍｉ ｔａ、Ｔ、５ａｋａｋｕｒａ、Ｃ，Ｎａｇａｒ、Ｂ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、ａｎ ｄ　Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ、（１９８６）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓ ｓｉ。

ｎ　ｏｆ　（ＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　！ｌ１ｏｕｓｅ　！ｙｒｏｓｉｎａｓ ｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５１４：２４＋３）　、元来、ｐＭＴ４ ｃＤＮＡは、マウスＣ（アルピノ）遺伝子座にマツプされるマウスチロシナーゼ をコードすると考えられていた。しかしながら、さらなる研究は、ｐ　ＭＴ４が マウスチロシナーゼから区別されることを示した（ＹａＩＩｌａｍｏ＋ｏ、Ｅ、 、Ｓ、丁ａｋｅｕｃｈｉ、Ｔ、Ｋｕｄｏ、Ｋ、ＭａｋｉＩｌｏ、Ａ、Ｎａｋａｌ ａ、Ｔ、Ｓｔ＋１ｎｏｄａ、　ａｎｄ　丁、Ｔａｋｅｕｃｈｉ、　ｔ１９８７１ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆ　ａｒｏｕｓｅ　ｔｙｒ ｏｓｉｏａｓｅ　ｃＤＮＡ、Ｊｐｎ、　１．Ｇｅｎｅｊｉｃｓ、　６２：２７１ 　；Ｍｕｆｆｅｒ、Ｇ、、Ｓ、Ｒｕｐｐｅｒ！、Ｅ、Ｓｃｈｉｍｄ、ａｌｌｄ　 Ｇ、５ｃｈｕｔｘ　（１９８８）　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　ａｌｔｔｒｎａｔｉｖｅｌｙ　５ｐｌｉｃ！ｄ　１ｙｒｏｓｉｎａｓｅ　 ｇｅｎｅ３　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、ＥＭＢＯ（Ｅｕｒ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 Ｏｒｇａｎ、Ｊ、）　７：２７２３；　Ｊａｃｋｓｏｎ、　１．、（１９８８） 　Ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｔｅｌａｔｅｄ　 ｐｒｏｌｅｉｎ　ｍａｐｓ　！ｏ　ｔｈｅ　ｂｒｏｗｎ　ｆｏｃｕｓ　ｉｎ　ｍ １ｃｃ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ、　８５・４３９２）。同様に、Ｎａ７５とヒトチロシナーゼ の推定アミノ酸配列とは（アミノ酸残基２０ｇ−４５９の間で）制限された同一 性（４３１％）があるにもかかわらず、Ｎａ７５の配列はヒトチロシナーゼの配 列とは区別される。Ｎａ７５およびｐＭＴ４生成物の機能は、マウスにおいてｐ 　Ｍ　Ｔ　４が、外皮の色を調節する領域（ＳｉＤｅｒｓＪ、Ｌ、（１９７９） 　Ｃｏａｌｐｕａｊｉｖｅ　ｇｅｎｅ目Ｃｓ　ｏｆ　ｃｏ［ｃｏｌｏｕｒ　ｉｎ 　ｍａｍｍａｌｓ、Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｃｏａｌ　Ｃｏ１ｏｒｓｉｎ　Ｍｉｃｅ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｉ）であるｂ　（［亘） 遺伝子座にマツプされるという発見（Ｊａｃｋｓｏｏ、　１．１．　（１９８８ ）Ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　１７ｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｐｓ　＋ｏ　ｔｈｔｂｒｏｗｎ　ｆｏｃｕｓ　ｉｎ　ｍ１ ｃｅ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５：４３９２）に より示唆される。Ｎａ７５とｐＭＴ４の推定アミノ酸配列との相同性は、マウス 褐色遺伝子座遺伝子生成物のヒト類似体の正式な同定を可能にする。メラノソー ムへの偏在およびチロシナーゼとの構造的な類似性に基づくと、Ｎａ７５分子は メラニン合成を調節し、合成されるメラニンの型を決定している可能性かある。

メラノソーム決定因子および他の細胞内抗原が、メラノーマの免疫治療の潜在的 な標的ではないことは認識されている。

しかしながら、最近、抗原保有細胞（ａｍｊｉｇｅ＋＋−ｐｒｅｓｕｊｉｎｇ　 ｃｅｌｆｓ）によって細胞内タンパク質が処理され、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ ）に対するペプチドとして存在し得ることが明らかとなってきた（Ｔｏｗｎｓｅ ｎｄ、Ａ、Ｒ，Ｍ、、ａｎｄ　ｌＢｏｄｍｓｒ、（１９８９）　＾ｌｉｇｅｎ　 ｔｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃｌａｓｓ　Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　丁　 １７ｍｐｈｏｃ７ｔｅｓ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７：６０１　 ）　ｏこの発見は、メラノーマに対するＴ細胞応答が腫瘍細胞内で発現する分子 に向けられ得るという理論的な可能性を開くものである。もしくは、その代わり に、通常成熟する間にメラノサイトの外部に移送されるメラノソームの成分が腫 瘍細胞周囲の細胞外空間に集積し、または局在的な組織壊死が細胞内生成物の放 出および堆に放射性標識ＴＡ９９　ｍＡｂが特異的に局在し、これは腫瘍部位内 における抗体に対する抗原の有用性を示している（Ｗｅｌｔ、Ｓ、、１．Ｍ、Ｍ ａｔｔｅｓ、　Ｒ，Ｇｒｘｎｄｏ、　Ｔ、Ｍ、Ｔｈｏｍｓｏｎ、　Ｒ，Ｗ、Ｌｔ ｏｎｓｒｄ、Ｐ、Ｂ、Ｘａｎｘｏｎｉｃｏ、　Ｒ，Ｅ、Ｂｉｇｌｅｒ、　Ｓ、Ｙ ｅｈ、　Ｈ，Ｆ、Ｏｅｆｆｇｕ、ａｎｄ　Ｌ、Ｊ、０１ｄ、（１９８７）　ＭＯ ＩＩＯＣｌＯ［１！Ｉ　ａｎｔｉｂｏｄ７　ｔｏ　ａｎ　１ｎｆｒａｃｅｌｌｕ ｌａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｍａｇｅｓ　ｈ＋、ｖａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｔ ｒａｎｓｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｎｕ／ｎｕ　ｍ１Ｃｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ、　８４：４２００）。

メラノーマ患者ＡＵにおけるＩｇＧ抗体は、メラノーマ細胞および正常メラノサ イトによって共有されるＮａ７５上の決定因子を認識した（Ｍａｊｔｒｓ、１． Ｍ、、　Ｔ、Ｍ、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｌ、Ｊ、０１ｄ、　ａｎｄ　Ｋ、０．Ｌｌｏ ｙｄ、（１９８３）　Ａ　ｐｉｇｍｅｌａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ｄ ｉｆｆｅｒ。Ｎａ７５をコードするｃＤＮＡの単離に伴い、Ｎａ７５に対する能 動免疫の戦略の研究が可能であるべきである。Ｎａ７５に対するＣＴＬ応答を有 効に誘導するためには、少なくとも２つの要求が存在する：１）Ｎａ７５に対す る免疫寛容が破壊され、２）主要組織適合抗原により、メラノーマ細胞上でＮａ ７５ペプチドが処理されて有効に存在しなければならない。または、その代わり に、メラノサイトの分化抗原かユニーク決定因子を担持することも可能である。

正常メラノサイトによって発現される生成物をコードする遺伝子は、悪性変換の 間に変異し、もしくは再編成され、ＣＴＬおよび抗体による認識のための新規エ ピトープを生じることもある。これに関連して、ヒトメラノーマ細胞に対する最 も特徴付けられたユニーク抗原は、培養メラノサイトおよびメラノーマ細胞上に 発現する９５−９７ｋ　Ｄ　ａの糖タンパクである、メラノトランスフエリンに 対する決定因子である（Ｒｅａｌ、Ｆ、Ｘ、、　Ｍ、Ｊ、ＭａＮ！ｓ、＾、Ｎ、 Ｂｏｕｇｈｔｏｎ、Ｉｌ、Ｆ、Ｏｅｔｊｇｅｎ、Ｋ、Ｏ，Ｌｌｏｙｄ、ａｎｄ　 Ｌ、Ｊ、ＯＩｄ、（１９８４）　Ｃ１ａｓｓ　ｌ　（ｕｎｉｑｕｓ）　ｘｎｔｉ ｇｅａｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ、１ｄｅｎｆｉｆｉｃａＨｏｎ 　ｏｆ　ｇ　！　９０，００１）　ｄｘＨｏｎ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｇ １７ｃｏｐｒｏｆｅｉｎ　ｂｙ　ａｕｔｏｌＢｏｕｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、１． Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６０°１２１９　；　Ｆｕｒａｋａｗａ、に、ｓ、、　Ｋ、 Ｆｕｒｘｋａｖａ、Ｆ、Ｘ、ＲｔＢ、　Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、ａｎｄ　Ｊｆ、０．Ｌ Ｉｏ７ｄ。

（１９ｇ９）　Ａ　ｕｎｉｑｕ！ａｎ＋ｉｇｅｎｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅｏｆ　ｈ ｕｍａｎ　ｔｎｔＩｘｎｏｍｘ　ｉｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｕ ＋ｍｏｎ　ｍｅｌａＩ）ｏｍａ　ｇｌＹｃｏｐｒｏｆｓｉａ　Ｎａ７５／ｐ９７ 、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６９：５８５）　、この可能性の支持においては、ヒ トメラノーマ細胞のゲノムを通して、遺伝的な抗体が高頻度で広く検出されてい る（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ、Ｎ、Ｃ，、Ａ、Ｎ」ｏｕｇｈｔｏｎ、　ａｎｄ　Ｌ、 Ｊ、０１ｄ、（１９８５）　Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｐｏ１７ｍｏｔｐｈｉｃ　ｒｅｓ ｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ａｌｓｌ ａｏｏｍａ：　Ｉｍｐｌｉｃｘｒｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｕｍｏｒ　ｈｅｔｅｒｏ ｇｅｎｅｉｌｙ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２： Ｉ４７０；　Ｄｒａｃｏｐ。

！ｉ、Ｎ、Ｃ，，Ｂ、Ａｌｈａｄｅｆｆ、　Ａ、Ｎ、Ｂｏｕｇｈｆｏｎ、　ａｎ ｄ　Ｌ、Ｊ、Ｏｌｄ、（１９８７）Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｔｒｏＢｇｏｓｉｔ ｙ　ａｌ　ａｕｔｏｓｏａ＋ａｌ　ａｎｄ　ｘ−ｌｉｎｋｅｄ　ｆｏｃｉｄｕｒ ｉＢ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉ ｔｈ　ｍ＊ｌａｎｏｍｘ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７：３９９５　）　。

実験　２ 材料および方法 λファージにおける２、７ｋｂのＧＰ７５ｃＤＮＡの単離実験１において記述し た２、０ｋＤａのＧＰ７５　ｃＤＮＡ　（その配列は図３参照）をゲノムライブ ラリーのスクリーニングに用いた。ＧＰ７５遺伝子を有するゲノムクローンを得 た。

ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニングヒト・メラニン性メラノーマ 細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１９（Ｉｌｌｏｕｇｈｊｏｎ、Ａ、Ｎ、、　Ｍ、Ｅｉｓｉ ｎｇｅｒ、　Ａ、Ｐ、Ａｌｂｉｎｏ、Ｊ、Ｇ、Ｃａ１ｒｎｃｒｏｓｓ、ａ’ｎｄ 　１．Ｊ、ＯＩｄ、１９８２．　Ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　ｍｅ ｌａｎｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｌａｎ。

ｍａ＋　＋ｎａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｊｅ　ｄｉｔｆ！ｒｅｎｔ ｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏｍａｓｕｂｓｅｔｓ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、１５６：１７５５　）から調製したポリ（Ａ）＋選択されたｍＲＮＡ　（Ｍａ ｎｉａｔｉ５Ｔ、、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｓｈ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 １９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ。

ｌｄ　ＳｐＩｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　ＨａＩｂｏｒ、　ＮＹ、　５４５ｐｐ）　３μｇからｃＤＮＡライブ ラリーを構築した。フレノウ酵素を用いて鈍端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｅｄ　）と し、Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎ ｃ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ　）を繋げた完全な長さのｃＤＮＡを合成した（ Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、、ａｎｄ　Ｂ、１．Ｈｏｆｆ＋ｎａｎ。

１９８３、　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｖｅＢ　ｅｆｌｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔ ｈｏｄ　ｏｆ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｃＤＮＡ　１ｉｂｒａｒｉｅＳ、　Ｇｅａ ｅ　（Ａｍｓｔ、）、　２５：２６３　）　ｏ次いで、このｃＤＮＡをウルトσ ゲルφアカ３４（旧ｔｒｏｇｅｌ　Ａｃａ　３４　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌｓ、Ｐｉ＋ｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）でサイズ分 画した（Ｗａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、、ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、Ｊａｃｋｓｏｎ、１９８５ ．　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　１ｉｂ ｒａｒｉｅｓ　ｉｎ　２ｇｔ　１０　ａｎｄ　２ｇｔ　１１．　Ｉｎ　ＤＮＡＣ ｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　！’ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌ ｏｖｅｒ、ｅｄｉｔｏｒ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　０ｘｆｏｒ ｄ、　７９−１００　）　。ｃＤＮＡ分子〉８００ｂｐを、λファージベクター ｇ１１０における３Ｘ１０”組換え体からなるライブラリーの構築に用いた（Ｈ ｕｙｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、　、　Ｒ，Ａ、　Ｙ。

ｕｎｇ、ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ、１９８５．　Ａｎ　ａｌｔｅｒｎａｔｉ ｖｅ　ｐｔｏｃｅｄｕｔｅ　ｆｏｒｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｄｏｕ ｂｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ｃｌｏ［ｌｉｎｇ　ｉｎｐｈａ ｇｅ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｙｅＮｏｒ、Ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： 　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄｉ ｔｏｒ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　０ｘｆｏｒｄ、　４９−７８ ）。

スクリーニングには、上で得られたゲノムクローンの５′末端コーデイング領域 に基つくフラグメントを用いた。λフアージ中に２．７ｋｂのｃＤＮＡが得られ た。（Ｂａｕｃｈａｒｄ、Ｂ、、８．Ｆｕｌｌｅｒ、Ｓ、Ｖｉｉａｙａｓａｒａ ｄｈｉ、ａｎｄ　Ａ、Ｎ、Ｉｌｏｕｇｈｊｏｎ、（１９８９）　Ｉｎｄｕｃｊｉ ｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　［１ｂｒｏｂｌａ ｓｔｓ　ｂ７　ｅｘｐｒｅｓｓｉ。

ｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｊｙｔｏｓｉｎａｓｅ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６９： ２０２９）２．７　ｋｂ　ｃＤＮＡの回収 ２、７　ｋｂ　ｃＤＮＡ　ＧＰ７５インサートに対する、Ｅｃｏ　Ｒ１を用いる 制限エンドヌクレアーゼ消化を行なった。ＤＮＡはフェノール・クロロホルムを 用いる抽出およびエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡを１００μｇ／ｍ ＲのＴＥ　（ｐＨ７，６）　ｉ：再溶解した。以下の方法により、粘着末端のラ イゲーションを行なった。以下のライゲーション混合物を用意した。１）ｐｃｖ ＥｘベクターＤＮＡ　Ｏ，１８ｇを無菌マイクロフユージ（ｍｉｃｒｏｌｕｇｅ 　）管に移した。等モル量の２．７　ｋｂ　ＧＰ７５　ｃＤＮＡを添加分間加温 して再アニールしている粘着末端を溶融した。この混合物を０℃に冷却した。３ ）その後、ＩＣＩＸ／＜クテリオファーシＴ４　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２００ ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｃ１（ｐＨ７，６）ｍΩウシ結成アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏ ｎ　Ｖ；　Ｓｉｈｍａ）、０１ワイス（Ｗｅｉｉｓ　）単位のバクテリオファー ジＴ４　ＤＮＡリガーゼ、および５ｍＭ　ＡＴＰ　１μｍ）を加えた。この反応 体を、１６℃で１−４時間インキュベートした。プラスミドベクターｐ（ｖＥｘ および２．７　ｋｂ　ＧＰ７５　ｃＤＮＡインサートを有し、図４に示されるプ ラスミドｐＧＰ７５　Ｅ−１が得られた。

有用なＥ、ｃｏｌｉの作製 各ライゲーション反応体の１−２μｇを、以下の方法による有用　Ｅ、ｃｏｌｉ の形質転換に用いた。まず、新鮮なオーｌく一ナイト・プレートからの単一コロ ニーをＬＢ５＋ｌに接種した。

その後、撹拌機中で５−７時間細胞を増殖させた。次に、４ｇフラスコ内で、Ｌ ＢＩｇに上記４ｍｎを接種した。０．Ｄ、５５゜＝０．Ｒ５となるまで増殖させ た。３にで１０分間スピンダウンＣ５ｐｉｎ　ｄｏｗｎ　）させ、０℃で１００ ｍＭ　ＣａＣａＣｌ２４Ｏ０に再懸濁した。その後、３にで１０分間再びスピン ダウンさせ、０ル２．５ｍｇを添加した。

ＤＨ５ａ　Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換 ＧＰ７５　Ｅ−１プラスミド１−２０ｇｇを有用な細胞１００μｇに添加した。

これを氷上に２０分間保持した。その後、４２°Ｃで１分間熱衝撃を与えた後、 氷にＩＯ分間戻した。この細胞をマイクロフユージで１０秒間回転させ、ＬＢ２ ００μｇに再懸濁した。

これを撹拌機上において３７℃で４５分間インキュベートした。

実験　３ 材料および方法 試薬 Ｌ−［リング−３，５−３１１チロシン（比活性４６．７　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を Ｉ　ＣＮ　（１＋ｖｉｎｅ、ＣＡ）より人手した。コンカナバリンＡ−セファロ ースおよびプロティンＡ・セファロースＣＬ４ＢはＰｈａｒｍＢｃｉａ　（Ｐｉ ｓｃａｌａｗａ７．　ＮＪ）製である。アフィゲル−１０はＢｉｏ−Ｒａｄ　（ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）製である。全ての電気泳動用化学薬品はＢ　ＲＬ　 （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＣＡ）製である。デオキシコール酸（ナトリウム 塩）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ　）　Ｐ−４０、（３−［（３−コラミドプ ロピル）ジメチル−アミノ］　ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ　）　、 フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびα−Ｄ−メチルマンノ ピラノシド、アルカリホスフェート結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、アルカリホスファ ターゼ発色試薬および他の試薬グレードの化学薬品はジグ７　（Ｓｆ、Ｌｏｕｉ ｓ、　ＭＯ）製である。ＨＰＬＣグレードの水および他の試薬グレードの有機溶 媒はフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（Ｐｉｔｆｓｂｕｒｇｈ、ＦＡ）製である。

マウスＭＡｂｓ　ＴＡ９９（ＩｇＧ　）およびＦ２３　（Ｉ　ｇ　Ｇ２ａ）は、 プロティンＡφセ２人 ファロースを用いて精製した。ＴＡ９９　ＭＡｂは抗ｇｐ７５抗体であり　（Ｔ ｈｏｍｓｏｎ、Ｔ、Ｍ、、Ｍａｔｔｅｓ、Ｊ、Ｍ、、Ｒｏｕｘ、Ｌ、、Ｏｌｄ、 Ｌ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｌｌｏ７ｄ、に、Ｏ，、Ｐｉｇｍｅｎｔａｊｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｊ ｅｄ　ｇ１７ｃｏｐｒｏｌｅｉｎｏｆ　ｈｕｌｌｏａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ａ ｎｄ　ｍｅｌａｎｏｃｙｌｅｓ：　ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏ ｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｊ、１ｎｖｅｓｔ、Ｄｓｒ ｍａｔ、、　８５．　１６９−１７４、　１９８５　）　、コントロール抗体と して用いられるＭＡｂＦ２３は、ヒトメラノサイト細胞とは反応しない抗ヒト結 腸カルシノーマ抗体である。

組織培養 メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１９を、Ｖｉｉａ７ｘｓａｒａｄｈｉ、Ｓ、、 　Ｂｏｕｃｈａｒｄ、Ｂ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ、、　Ｔｈ ｅ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｇｐ７５ｉｓ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　 ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｂ　（ｂｒｏｗｎ）　ｆｏｃｕｓ　ｇ ｅｎｅ。

１、ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７１．　１３７５−１３８０　（１９９０）に記述さ れティるように、ｌＯ％セーラム・プラス（Ｓｅｔｕｍ　Ｐｌｕｓ）　（Ｈａｕ ｌｔｏｎ、　ＬｅｎｅＸｉ、　）ＦＳ）を補ったＭＥＭにおいて増殖および継代 した。

ｇｐ７５の単離および精製 ｇｐ７５の精製の全ての手続きは、他に特定されていない限りは０４℃で行なっ た。半融合ＳＫ−ＭＥＬ−１９メラノーマ細胞を、ラバーポリスマンで掻き取る ことにより　１５０ｃｍ″フラスコから収穫し、組織培養培地に集めて遠心分離 した後、細胞（６０ｇベレット）をＰＢＳで洗浄した。この細胞を、３００ｒｒ Ｊの２０ｍＭ　Ｔｔｉｓ／ＨＣＩ　ＳｐＨ７，５，５ｍＭ　ｈｃ１２．２ｍＭ　 ＰＭＳＦに１０分間懸濁させ、ドウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーでホモ ジナイズした。細胞溶解を位相差顕微鏡法により監視した。ホモジネートを１． ０００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を集めて１０，０００　ｇで３０分間 遠心分離した。粗精製膜ペレットを、５０ｍｇの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　 、’ｐＨ７，５，３Ｍ　ＫＣＩおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡに懸濁し、ドウンス・ホ モジナイザー内で穏やかにホモジナイズし、１００．０００　ｇで９０分間遠心 分離した。このベレットを、３０ｍｆｆの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＢＣＩ、ｐＨ７ ，５，０，５％デオキシコール酸ナトリウムに再懸濁し、穏やかにホモジナイズ した。このホモジネートを１００．０００　ｇで遠心分離し、上清を２００−３ ００　ｖｏｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＩＩｃＩ、ｐＨ７，５，０，１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌおよび２ｍＭ　ＣＨＡＰＳに対して２４時間透析した。透析物を１００．０ ００　ｇで９０分間遠心分離することにより清浄にした。この工程から得られた 清澄な上清を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　、ｐＨ７，５，０，１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌおよび２ｍＭＣＨＡＰＳ　（緩衝液Ａ）で平衡にしたモノＱ　（Ｍｏｎｏ　 Ｑ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ＨＲ５１５）カラムに、スーパーループ（Ｓｕ ｐｅｒｌｏｏｐ　）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を介して流速０．５ｍｕ／分で流 した。カラムを緩衝液Ａ　１０ｒｌ！で洗浄し、結合タンパク質を緩衝液Ａの０ −１．０ＭＮａＣｌ直線勾配３０ｍＭで溶出させて、分画１ｍ、Ｑを集めた。競 合阻害検定によりｇｐ７５について分画を検定し、陽性分画をプールして１ｍＭ 　ＣａＣｌ　、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２および２ｍＭ　ＰＭＳＦを含有するＣｏｎ　 Ａカラム緩衝液、１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ　、ｐＨ７，５、１００ｖｏｌに対 して１８時間透析した。

ＣｏｎＡ−セファロース・クロマトグラフィー１０ｍ、Ｑエコツカラム（Ｅｃｏ ｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）中において、Ｃｏｌ１＾−セファ ０−ス（５ｍＮ　）をＣｏｎ　Ａカラム緩衝液５０ｍ、Ｑで洗浄してプールし、 モノロイオン交換クロマトグラフィからの透析分画を流速１．０−１．５ｍｆｆ 　／分でこのカラムにかけた。流出液を再びカラムにかけ、流出液の吸光度（２ ８０ｎｍ）が０．０１未満になるまでカラム緩衝液で洗浄した。

ＣｏｎＡに結合しているタンパク質を、Ｃｏｏ　Ａカラム緩衝液に溶解した０、 ２５　Ｍα−〇−メチルマンノピラノシドで溶出させ、１．５−２ｍｇの分画を 集めた。溶出に先立って２５−３０°Ｃで１５−２０分間溶出緩衝液を用いてカ ラムをインキュベートすることにより、タンパク質の収量が改善された。ｇｐ７ ５を含有する分画をプールし、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＢＣＩ　、ｐＨ７，５，２ ｍＭＣＢＡＰＳおよび２ｍＭ　ＰＭＳＦに対して透析し、ＴＡ９９アフィゲルｌ Ｏアフィニティカラムにかけた。

ＴＡ９９アフィニティクロマトグラフイー硫酸アンモニウム沈殿、並びにそれに 続くプロティンＡ−セファロースおよびセファデックスＧ−２５カラムでのクロ マトグラフィにより、（ＢＡＬＢ／Ｃｘ　Ｃ５７ＢＬ／６　）　Ｆ　ｌマウスの 腹水からＴＡ９９　ＭＡｂを精製した。製造者用指導書に従ってカップリング用 アフィゲルＩＯを調製し、冷力・ノブリング緩衝液（ＣＢ）　、５０ｍＭ　ＨＥ ＰＥＳＳｐＨ７，６，１５０ｍＭ　ＮａＣｌで洗浄した。アフィゲル２ｍΩ当り 　９ｍｇの精製ＴＡ９９　ＩｇＧを用いて、カップリング緩衝液の合計体積６ｍ ｌで、力・ツブリング反応を４℃で４時間行なった。未結合の部位は、等体積の ０．１ＭエタノールアミンＩＩｃＩ、ｐＨ８，０を用いて４℃で１時間インキュ ベートすることによりブロックした。その後、ゲルを、ＣＢ、　ＣＢ＋　１．５ Ｍ　ＮａＣｌ　、ＣＢ、および最後に１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ　、ｐＨ７，５ ，０，１５Ｍ　ＮａＣｌおよび：）ｍＭ　ＣＨＡＰＳで順次洗浄した。カップリ ング効率は、カップリング反応の４時間前および４時間後に、カップリング反応 の清上清中のＴＡ９９のＳＫ−ＭＥＬ−１９メラノーマ細胞に対する抗体力価を ＥＬＩＳＡによって測定することにより決定した。カップリング効率は６０−８ ０％であり、アフィゲル１０　１ｍ４７当りＴＡ９９１ｇＧ約５ｍｇか結合した 。Ｃｏｎ　Ａクロマトグラフィからプールされ、透析されたタンパク溶液を、０ ．５ｍｆＩ／分の流速で２ｍ、ＱＭＡｂ　ＴＡ９９−アフィゲル１０カラムにか け、溶出液を再びカラムにかけた。その後、このゲルを、各々６ｍ１ｌのＣＢ、 　ＣＢ＋１Ｍ　ＮａＣｌ　、　ＣＢ、およびＣＢ＋　２ｍＭ　ＣＨＡＰＳで順次 洗浄した。

結合したｇｐ７５を、２ｍＭ　ＣＨＡＰＳを含有する０、１Ｍグリシン−ＨＣｌ を用いてカラムから溶出させた。

ｇｐ７５に対する固相酵素免疫測定法 ＥＬＩＳＡのために、トリプシン結合細胞（ｆｒ７ｐｓｉｎｉｘｅｄ　ｃｅｌｌ Ｓ）をマイクロウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｊｅｓｔ　Ｐｌａｔｅｓ　３０３４ ．　Ｆａｌｃｏｎ、　０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ　）に５００−２０００細胞／ウェ ル入れ、加湿組織培養インキュベーター中において、５％Ｃ０２中で、３７℃で ４８−７２時間増殖させた。このプレートをＰＢＳで洗浄し、冷却（−２０℃） メタノール：アセトン（１：１　ｖ／ｖ）で１０分間固定した後、０．２％ナト リウムアジドを含有する冷ＰＢＳで３回洗浄した。固定され、かつ透過性が付与 された細胞を有するプレートは４℃で保存した。ＥＬＩＳＡにより、新たに固定 したプレートについてＴＡ９９抗体の力価を決定した。（４℃で６か月までのプ レートの保存については、ＭＡｂ　ＴＡ９９を用いる力価には重大な変化は観察 されなかった。）簡潔に言うと、細胞をウェル当り１０μｇのＭＡｂ　ＴＡ９９ と共にインキュベートし、５％γ−グロブリン非含有ＦＢＳ　（ＧＧＦＦＢＳ） を含有するＰＢＳ中に４５分間連続的に希釈した後、２％ＧＧＦＦＢＳを含有す るＰＢＳでプレートを３回洗浄し、（５％ＧＧＦＦＢＳでＰＢＳ中にし２００に 希釈した）アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに添加し て４５分間インキュベートシメ＝。

プレートを上と同様に３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質溶液（ジェタノ ールアミン緩衝液、ｐＨ９，８，５ｍＭμｇを添加した。加湿チャンバー内にお いて３７℃で１５−２０分間インキュベートした後、アーテク（Ａｒｊｅｋ　） 　（Ｃｈａｎｊｉｌ［ｙ　。

１／Ａ）マ・イクロプレートリーダー（モデル２１０）において、４０５ｎｍで 光学密度をａ定した。

ｇｐ７５の競合阻害検定 初期の工程の間、ｇｐ７５の精製を監視し、上述のように、分画のＳＫ−ＭＥＬ −１９細胞へのＭＡｂ　ＴＡ９９の結合を阻害する能力をＥＬＩＳＡによって測 定することにより定量した。カラムクロマトグラフィーからの亜細胞分画もしく は分画を、９６ウエルマイクロテストプレートにおいて連続的に希釈した。ＴＡ ９９抗体を最終濃度３００ｎ　ｇ／ｍ　１　（ＳＫ−ＭＥＬ−１９ヘの結合の飽 和直前）まで添加した。この抗原抗体混合物を室温で３０分間インキュベートし た後、マイクロウェルプレート中のＳＫ−ＭＥＬ−１９細胞に適用した。ＳＫ− ＭＥＬ−１９細胞に結合したＭＡｂ　Ｔ、へ９９の量を、上述のようにＥ　Ｌ　 Ｉ　Ｓ　Ａによってｐｊ定した。ｇｐ７５の活性１単位は、ＳＫ−ＭＥＬ−１９ 細胞に結合す６　ＭＡｂ　ＴＡ９９　（３００ｎ　ｇ／ｍ１））の半最大阻害（ ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　）　ｌ：必要なタンパク質 の量と定義された。

ゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングタンパク質は、５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅ＋ｎｍ１ｉ、Ｌｌ、に、、Ｃｌｅａｖａｇｅ　 ｏｆ　５ｌｒｕｃｊｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｓｓｅｍｂ １７　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４．　 Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、）。

２２７、６８０−６８５．　１９７０　）により解析し、銀染色（Ｏａｋｌｅ７ ．　Ｂ、　Ｒ６，に１ｒｓｃｈ、Ｄ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓ、Ｎ、Ｒ，、Ａ 　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｕＩｒｒａｓｅｎｓｉｆｉｖｅ　５ｉｌｖｅｒ　５ｔ ａｉｎ　ｆｏｒ　ｄｅｆｅｃｆｉＢ　ｐｒｏｌｅ：ｕｓ　ｉｎ　ａｃｒｙＩａｍ ＃ｅ　ｇｔｌｓ、　Ａｎｘｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、、１０５．　３６１−３６３ ．　１９８０　）により可視化した。Ｎ〜末端配列決定のために、トランスフォ ア（Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ　）装置（１１ｏｅ［ｅｒ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏ、　ＣＡ　）内において、ＰＶＤＦ　（ポリビニリデンジフルオリド）膜（ １ｍｍｏｂｉｌｏｎ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ　）上で タンパク質のエレクトロブロッティングを行ない、ＭａＨｕｄａｉｒａ、Ｐ、、 ５ｅｑｕ！ｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｐｉｃｏｍｏｌｅ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ 　ｐｒｏＨｉｎｓ　ｅｌｅｅｊｒｏｂｌｏ目ｅｄ　ｏｎ　ｔｏ　ｐｏ１７ｖｉｎ ７１ｉｄｅｎｅ　ｄｉ［１ｕｏｒｉｄｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｊ、ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２６２．　１００３５−１００３８、　１９８７に記述されている ようにアミノ酸組成を解析した。

アミノ酸解析 ＰＶＤＦ膜に転写されたタンパク試料のアミノ酸解析は、バーバード大学マイク ロケミストリー施設で行なった。タンパク質（０，６μｇおよび０．８Ｂｇ）を ６Ｎ　ＨＣｌ中において１１゜℃で２４時間加水分解した。Ｅｂｅｒ＋、Ｒ，Ｆ 、、　Ａｍ１ｎｏ　ａｃｉｄ　２Ｉｌａｌｙｓｉｓ　ｂ７１１ＰＬｃ：　ｏｐｆ ｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 　ｏｆｐｈｅｎｙｌｆｈｉｏｃ！ｒｂａｍｙｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、　Ａ ｎａｌ、ＢｉｏＣｈｅＩｌｌ、、　１５４．４３１−４３５．　１９８６　ｉ二 Ｊ己述されているよう１こ、遊離アミノ酸をフェニルイソチオシアネートで誘導 体とし、得られたフェニルチオカルバミルアミノ酸をＨＰＬＣで分析した。

チロシンヒドロキシラーゼ活性についての免疫沈降解析界面活性剤可溶化（ＰＢ Ｓ中の１％ＮＰ　４０）メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−１９＞細胞抽出物１００μ ｇの一定量を、３−１５μｇのＭＡｂ　ＴＡ９９　（抗ｇ　ｐ７５）　、ＭＡｂ 　Ｆ２３またはＰＢＳと共に、総容１ｔ４５μｇで、連続的に混合しながら、４ ℃で９０分間インキュベートした。プロティンＡセファロースＣＬ　４Ｂを最終 濃度６ｍｇ／ｒｒＪまで添加した。４°Ｃで２時間インキュベートした後、４° Ｃて５分間、１５．００Ｏｒｐｍで遠心分離することにより上清を集めた。ベレ ットを１％ＮＰ　４０を含有するＰＢＳで５回洗浄し、同じ緩衝液５０μｇに懸 濁した。チロシンヒドロキシラーゼ活性は、上清およびベレット中でＤ」定した 。プロティンＡセファロースを添加する以前に細胞抽出物中に存在し一ルの上清 中に再現性よ＜１与られた。抗体およびプロティンＡセファロースと共にインキ ュベートした細胞抽出物の上清において得られた酵素活性を、ＰＢＳコントロー ルにおいて得られた活性に対する割合で表わす。

チロシンヒドロキシラーゼ活性 チロシンヒドロキシラーゼ活性を、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ、Ｓ、Ｅ、、Ｌ−Ｔｙｒ ｏｓｉｎｅ−３，５−Ｈａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｙ＋ｏｓｉｎａｓｅ　ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　５ｋｉｎｏｆ、　ｎｅｗｂｏｒｎ　ｈａｍｓｔｅｒｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、１６４．　８３８−８３９．　１９６９に記述されているよう に、多少の変更（Ｂｏｕｃｈａ＋ｄ、Ｂ、Ｆｕｌｌｅ＋、Ｂ、、　Ｖｉｊａｙａ ｓａｒａｄｈｉ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ、、　Ｉｎｄｕｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍ　ｅｎｔａ＋ｉｏｎ　１ＩＩＩＩＩｏｕｓｅ　ｆｉｈｒ ｏｂｌａｓｆｓ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　！ｙｒｏｓ Ｉｎａｓｅ、Ｊ、ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６９．２０２９−２０４２．　１９８９ 　）を加えて検定した。酵素活性１単位は、３７℃で１時間に３Ｈチロシナ−質 の量と定義された。

タンパク質の決定 バイオラッド・タンパク検定システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓ ａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用い、染料結合法（Ｂｒａｄｆｏｔｄ、Ｍ、、　Ａ　ｒ ａｐｉｄａｎｄ　ｕＮｒａｓｅｎ＋１ｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｉｈｔ 　ｑｕａｎｔ目Ｎ１ｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｔｏｇｒａＩＩｌｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ 　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｌｉｌｉｘｉｎｇ　ｔｈｓ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　 。

ｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、７２．　２４８−２５４．　１９７６）によりタンパク質濃度を評価した。精 製ｇｐ７５は、一連の既知量（１０−１００ｎ　ｇ　／タンパク質バンド）の銀 染色分子量マーカータンパク質に対するポリアクリルアミドゲル上のタンパク質 バンドの染色強度の概算により定量した。

結果および考察 メラノーマ細胞株ＳＸ−ＭＥＬ−１９の後核膜分画をｇｐ７５抗原の源として用 いた。この膜分画をハイΦソルト（ｈｉｇｈ　５ａｌｔ　）で処理した後、ハイ ・ソルト不溶分画を界面活性剤デオキシコール酸塩中で可溶化した。各ベレット を除く全ての亜細胞分画を、ＳＫ−ＭＥＬ−１９細胞へのＭＡｂ　ＴＡ９９結合 の阻害（ｇｐ７５活性）を測定する競合ＥＬＩＳＡによって、ｇｐ７５の存在に ついて検定した。ｇｐ７５は、デオキシコール酸可溶化膜分画中にのみ検出され 、ハイ・ソルト可溶分画中には検出されなかった。これは、ｇｐ７５の完全な膜 局在と一致する。ｇｐ７５のメラノソーム膜局在は、３５Ｓ−メチオニンを用い るメラノーマ細胞の代謝パルス−チェイス標識、続く　（メラノソームを強化す るための）不連続ショ糖濃度勾配分画および免疫沈降分析により示された。これ らの実験において、ｇｐ７５は、メラノソームを含有する、界面活性剤可溶化し 、色素形成した勾配分画からのみ免疫沈降が可能であった。

ｇｐ７５の初期強化は、モノＱ（陰イオン交換）カラムでのデオキシコール酸塩 可溶膜分画の分画により行なわれる。結合ｇｐ７５は、０．２６−０．５Ｍ　Ｎ ａＣ１で、電荷微小不均一性（ｍｉｃｒｏｈｅｊｅｒｏｇｅｎｅｉｊｙ）を示す ブロードピークの活性を有して溶出した。これは、二次元５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ ｐ　Ｉ　５．５−５．９）により確認された。カラム平衡緩衝液および試料緩衝 液中における両性イオン性界面活性剤３−　［Ｄ−コラミドプロピル）ジメチル −アミノ］　１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＩ’Ｓ　）の存在もしくは不存 在は、モノＱカラムへのｇ　ｐ　７５の結合に影響を及ぼさないが、溶出緩衝液 へのＣＨＡＰＳの添加はｇｐ７５の収率を改善することか観察された。

ｇｐ７５活性を有するモノＱ分画をプールし、コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ 　）カラム緩衝液中で透析してＣｏｎＡ−セファロースカラムにかけた。のせた タンパク質の約６０％がＣｏｎＡに結合した。結合タンパク質を０．２５Ｍα− Ｄ−メチルマンノピラノシドを用いて溶出させることで、ブロードな主要ピーク に小ピークが続く結果が得られる。Ｃｏｎ　Ａカラムへのｇｐ７５の結合に不均 一性が存在し、これは溶出の間のｇｐ７５活性の複数のピークにより示される。

これは、複数のカラムを可動させる際に首尾一貫して観察される。メラノサイト およびメラノーマ細胞におけるｇｐ７５は、Ａｓｎ−結合複合炭水化物の数もし くは塑性のいずれかが異なる２種の成熟携帯で存在することか観察された。しか しながら、ＣｏｎＡへの結合における不均一性は、ｇｐ７５上のＡｓｎ−結合、 抗マンノース炭水化物における検出可能な相違からは起こらない。これは、溶出 されたピーク分画の放射性ヨウ素か、およびＭＡｂ　ＴＡ９９を用いたｇｐ７５ の免疫沈降、それに続くエンド−β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼＨ（エ ンドＨ）消化による抗マンノース炭水化物鎖の除去により示された。試験した全 てのピークは、エンドＨ消化の後に５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で６３−および５５−ｋ Ｄａのバンドを生じるｇｐ７５の２種の成熟形態を有していた。

Ｃｏｎ＾溶出液からのｇｐ７５を含有する分画をプールし、ＭＡｂ　ＴＡ９９ア フィニティ力ラムにかけた。ＥＬＩＳＡおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色によっ て測定されるように、アフィニティカラムの流出液中のｇｐ７５は完全に低下し た。全タンパク質の９２％を含有する流出液をカラムにのせた。結合ｇｐ７５の 溶出条件は、（「材料および方法」に記載したように）　ＥＬＩＳＡによる、透 過性が付与され、メタノール：アセトン固定されたＳＫ−ＭＥＬ−１９メラノー マ細胞に対するＭＡｂ　ＴＡ９９結合の阻害に基ついて予め決定した。ｇｐ７５ へのＭＡｂ　ＴＡ９９の結合は、０、ＩＭグリシンＩＩｃＩ緩衝液、ｐＨ３，１ によって取り消す、すなわち逆転させることかできる。０．ＩＭグリシンＨＣＩ 緩衝液、ｐＨ３，ｌ、を用いるカラムの溶出は、ポリアクリルアミドケル上の銀 染色ｇ　ｐ　７５ｔ＜’ンドの強度によって決定されるように、カラムにのせた タンパク質１．７ｍｇから精製ｇｐ７５約０５ナノモルを生じた。Ｔ　Ａ　９９ 抗体アフイニテイ力ラムからのｇｐ７５の溶出はまた、銀染色ゲル上に５３．２ ８および２６　ｋＤａの追加の小バンドとして現われる痕跡量のＴＡ９９抗体（ 重鎮および軽鎖）のろ過を生じる結果となる。これらの追加のバンドは、カラム に結合したＴ　Ａ　９９抗体に起因し、ＳＫ−ＭＥＬ−１９抗原調製物からでは ないことが、（１）ウサギ抗マウスＩｉＧ抗体との５３−５２８−および２６− ｋＤａタンパク質の免疫沈降、および（２）これらのバンドがＳＫ−ＭＥＬ−１ ９溶解物の放射性ヨウ化調製物からは生じないという実証により確認された。ｇ ｐ７５の精製の概要を表１に示す。

表　Ｉ　−ｇｌ）７５の精製 タンパク質　全タン　ｇｐ７５　比活性、１２ 分画　ハク質　活性　（単位／ｍｇ） 単位 デオキシコール酸　２３６　２５０　１．０５可溶化膜 モノＱカラム結合　６．２７　１２８　２０．４１Ｃａｎ　Ａ−セファ０−ス　 １．７３　１１８　６８．２０結合 ＴＡ　９９アフイニテイ　０．０３５　ＮＤ　−カラム溶出液 １プールされ、透析された分画中のタンパク量は、ブラッドフォード染料結合法 （Ｂｒａｄｆｏｒｄ’ｓ　ｄｙｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　）（１９７ ６）により測定した。

２活性１単位は、ＭＡｂ　ＴＡ９９　（３００／ｍ　ｇ）のＳＫ−ＭＥＬ−１９ 細胞への結合の半最大阻害に必要なタンパク質量と定義された。

３７Ａ９９アフイニテイ力ラム溶出液中の精製ｇｐ７５の量は、Ｓ　Ｄ　Ｓ　− Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ上の銀染色バンドの強度の概算により評価した。

ＮＤ、検出されず。

アフィニティ精！ｌ！ｇｐ７５は、アミノ酸解析に利用した。ｇｐ７５のアミノ 酸組成を表Ｈに示す。

表　ＩＩ　−ｇｐ７５のアミノ酸組成 残基数／　ｇ　ｐ　７５分子（ｐｍｏｌ）Ａｓｘ　６３（９７０）　Ｔｙｒ　Ｈ （２０５）Ｇ　１　ｘ　６０　（９２２）　Ｓ　ｅ　ｒ　４７　（７３０）Ｇ　 １　ｙ　５５　（８５４）　Ｈｉ　ｓ　１０　（１６０）Ａｒｇ　３３（５０２ ）　Ｔｈｒ　３４（５２５）Ａ　１　ａ　３０　（４６７）　Ｐ　ｒ　ｏ　３２ 　（４９２）Ｖａｌ　３３（５１５）　Ｍｅｔ　１（１１）１１　ｅ　１５　（ ２３５）　Ｌ　ｅ　ｕ　４１　（６２ｇ）Ｐｈｅ　２６（３９７）　Ｌｙｓ　６ （９０）アミノ酸解析は、ＰＶＤＦ膜に転写された精製ｇｐ７５の２種の試料（ ６００および８００ｎｇ）について行なった。括弧内の数字は検出された各アミ ノ酸のｐｍｏ　１である。ＡＳＩ＝アスパラギン酸およびアスパラギンの合計； 　ＧＩ！＝グルタミン酸およびグルタミンの合計。ＮＤ＝検出されず。

ｇｐ７５の３種の内部ペプチドの配列およびｇｐ７５ｃＤＮＡの部分配列は、実 験１において示した。ｇｐ７５のアミノ酸組成は、アカパンカビ（Ｎ、ｃｒａｓ ｓａ）　（Ｌｅｒｃｈ、に、、　Ｌｏｎｇｏｎｉ、Ｃ，。

ａｎｄ　Ｊｏｒｄｉ、Ｅ、、Ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｙ ｒｏｓｉｎｉｓｅ　ｆｔｏｍ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ｊ、ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５７．６４０８−６４１３．１９８２）および哺乳動物 のチロシナーゼ、およびマウスｂ遺伝子生成物（Ｓｈｉｂａｈｘｒａ、Ｓ、、　 Ｔｏｍｉｔａ、Ｙ、、　５ａｋａｋｕｔａ、Ｔ、Ｎａｇｅｒ、Ｃ，、Ｃｈａｕｄ ｈｕｒｉ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｍｕｔｔｅｒ、Ｒ，、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘ ｐｔｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｔｙｒｏ ｓｉｎａｓｅ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．　２４１３−２４２７ ．　１９８６　；Ｂｏｕｃｈａｒｄ、Ｂ、、　Ｆｕｌｌｅｒ、Ｂ、、　Ｖｉｊａ ７ａｓａｒａｄｈｉ、Ｓ。

、ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ、、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍ ｔｎｊｘｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｂｙ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔ７ｒｏｓｉｎａｓｅ、　ｌ、ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、、１６９．２０２９−２０４２．　１９８９　；Ｃｏｈｅｎ、Ｔ、、　Ｍ ｕｔｔｅｒ、Ｒ，Ｍ、、　Ｔｏｍｉｔａ、Ｙ、、ａｎｄ　５ｈｉｂａｈａｒａ、 Ｓ、、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕ！ｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅｃＤＮＡ　ｅ ｎｃｏｄｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｔｙｒｏｓｉ＋ｕｕ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔ ｅｉｎ、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１８．　２８０７．　１９９０　）のアミノ酸配列に類似 していた。エドマン分解法によってｇｐ７５のＮ−末端配列解析を行なおうとす る試みは、ブロックされたＮ−末端の存在により不成功に終わった。アカパンカ ビ・チロシナーゼのＮ−末端セリン残基もまた、この場合はアセチル基により、 ブロックされている（Ｌｅｒｃｈ、Ｌ、Ｌｏｎｇｏｎｉ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｊｏｒ ｄｉ、Ｅ、、Ｐｒｉｍａｒｙ　５ｊｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔ７ｒｏｓｉｎａｓ ｅ　ｆｒｏｍ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ｊ、ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、、２５７．６４０８−６４１３．１９８２）。

ｇｐ７５およびチロシナーゼの両者はメラノサイトに局在する７５−ｋＤａの脱 糖タンパク質であり、類似のアミノ酸組成、約４０％のアミノ酸配列同一性（実 験１膠照；　Ｃｏｈｅｎ、　Ｔ、　、　Ｍｕｆｆｅｒ、Ｒ，Ｍ、、Ｔｏｍｉｔａ 、Ｙ、、　−ａｎｄ　５ｈｉｂａｈａｒａ、Ｓ、、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅ ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　１ｙ ｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、、１８．　２８０７．１９９０　）　、および（チロシナーゼの触媒活 性に必要な）２つの潜在的な協同的結合部位（ｃｏｏｐｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ　 ５ｉｔｅｓ）を有している。役人かの探索者は、マウスｇｐ７５か、チロシナー ゼ分子の特性であるチロシンヒドロキシラーゼ活性を有することを提唱している （ＨｅａｒｉΩｇ。

Ｖ、　Ｊ、、Ｊｉｍｅｎｅｘ、Ｍ、、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍａ＋ｎｍａ ｌｉａｎ　ｐｉｇｍｅｎｆａｆｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅ ｖｅｌ、Ｐｉｇｍｅｎｔ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、、２．　７５−８５．　１９８９ ）。

チロシンヒドロキシラーゼ活性は、ＭＡｂ　ＴＡ９９を用いる沈殿の後の、ＳＫ −ＭＥＬ−１９メラノーマ細胞抽出物の上清および免疫沈降物中で測定した。Ｔ 　Ａ　９９による酵素活性の特別な低下は見られなかった；細胞抽出物をコント ロール抗体（ＭＡｂ　Ｆ２３　）もしくはＭＡｂ　ＴＡ９９のいずれかと共にイ ンキュベートした後、上清中にチロシンヒドロキシラーゼ活性の９４％を再現す ることができた（表■）。

抗体濃度を３００μｇ７ｍｆ）まで増加させても、上清中におけるチロシンヒド ロキシラーゼ活性の再現に有意の減少は観察されなかった。免疫沈降物中では、 酵素活性は再現されなかった。これらの結果は、ヒトメラノーマ細胞におけるほ とんど全てのチロシンヒドロキシラーゼ活性が、ｇｐ７５抗原とは区別される分 子によるものであると説明されることを示している。

表　ＩＩＩ　−ＭＡｂＴＡ９９を用いる免疫沈降の後のチロシンヒドロキシラー ゼ活性 ＭＡｂ　抗体濃度　μｇタンパク／ｈｒ当り（ｕｇ／ｍ’ｌ）　放出されるｃｐ ｍ　３Ｈ２０（％全酵素活性）１ 上清　ペレット 実験Ａ 緩衝液“　７７２　（１００％）１７０Ｆ２３３６０　？２７（９４％）１８９ ＴＡ９９　６０　７３５（９５％）１４０実験Ｂ 緩衝液　５５０　（２００％）４５ ＴＡ９９　６０　５３７（９７％）３７３００　５３０（９６％）４６ １括弧内の数値は緩衝液コントロール（・１００％）と比較した、上清中に再現 されたチロシンヒドロキシラーゼ活性の割合である。

ク ーコントロールチューブは、「材料および方法」に記載されるように、ＰＢＳと 共にインキュベートされた後、プロティンＡセファロースにかけた。

３マウスＭＡｂ　Ｆ２３　（ＩｇＧ、　）は、ヒトメラノサイト細胞と反、ａ 応しない抗結腸癌ＭＡｂである。

チロシンヒドロキシラーゼ活性は、精製の間に、ｇｐ７５を含有する分画におい ても′６ＪＪ定した。全細胞チロシンヒドロキシラーゼ活性は、後接膜の界面活 性剤可溶化、モノＱ陰イオン交換カラムに結合したタンパク質の勾配溶出、およ びＣｏｎ　Ａ分画の間に、ｇｐ７５と共に、共純化（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　 ）した。これは、ｇｐ７５とヒトチロシナーゼとの実施的な相同性と一致する。

しかしながら、ｇｐ７５とチロシンヒドロキシラーゼ活性とは、ＭＡｂ　ＴＡ９ ９アフィニティカラム上で分離する。

ＳＫ−ＭＥＬ−１９のデオキシコール酸塩可溶化、Ｃａｎ　Ａ精製分画をＭＡｂ 　ＴＡ９９アフィニティカラムにかけた場合には、溶出液中において、ｇｐ７５ 活性は完全に低下するのに対して≧７５％のチロシンヒドロキシラーゼ活性が再 現される（表■）。

表　ＩＶ　−ｇｐ７５精製中のチロシンヒドロキシラーゼ活性の再現 分　画　タンパク　全チロシン　比活性（μｇ）　ヒドロキシ　（単位／ｍｇ） ラーゼ活性 Ｃｏｎ　Ａ−セファロース　１６０　３４　２１５．６８力ラム結合 丁Ａ　９９アフイニテイ　１２０　２５　２１０．１３力ラム通過 ｌ酵素活性１単位は、３７℃１時間で、３トチロジンから１マイクロモルの３Ｈ ２０を放出するのに必要なタンパクの量である。

溶出したｇｐ７５はチロシンヒドロキシラーゼ活性を有してはいなかったが、カ ラム溶出条件が酵素活性を消失させることは可能である。これらの結果は、メラ ノサイト細胞における（全てでないならば）はとんどのチロシンヒドロキシラー ゼ活性がｇｐ７５とは区別されるタンパク質に帰するという結論を支持する。

ｇｐ７５抗原は、色素形成ヒトメラノサイトおよびメラノーマにおいて発現し、 色素非形成メラノーマまたはメラノサイト細胞型においては検出されない膜結合 糖タンパク質である（Ｔｈｏｍｓｏｎ、丁、Ｍ、、　Ｍａｔｔ　ｅｓ、Ｊ、Ｍ、 、　Ｒｏｕｘ、Ｌ、、　引ｄ、Ｌ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｌｌ。

７ｄ、Ｃｏ、、　Ｐｉｇｍｅｎｆａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｌｙｃ ｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏ ｃｙｔｅｓ：　ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍａｎｏｃ ｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｊ、＋ｎｖｅｓｔ、ＤｅｒｍａＬ、　８５．　 １６９−１７４．　１９８５　：丁ｈｏｍｓｏｎ、Ｔ、Ｍ、、Ｒｅａｌ、Ｆ、Ｘ 、、Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｓ、、Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、Ｃ，。

Ｏｌｄ、Ｌ、Ｊ、ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ、、Ｄｉ［ｆｅ＋ｅｎｔｉ ａｊｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎｓｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃ７＋ｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｌ ａｎｏｍａ：　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ　ａｎｄ　ｃｅ ｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｉｇｍｅｌｅｄ　 ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｆｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊ、１ ｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔ、、　９０．４５９−４６６、　１９８８）。免疫電 子顕微鏡法研究は、ＭＡｂ　ＴＡ９９がメラノソーム膜またはその近傍に結合す ることを明らかにしている（Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔ、Ｍ、、Ｒｅａｌ、Ｆ、Ｘ、、 Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｓ、、Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、Ｃ，、Ｏｌｄ、Ｌ、　Ｊ 、ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ａ、Ｎ、、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｊｉａｊｉｏｎ　ａ ｎｔｉｇｒｎｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｏｏｃｙｊｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｌａｎｏｍａ： 　ａｎａ１７ｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ　ａｎｄ　ｃｅＩｆ　ｓｕｒ ｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｉｇｍｅｎｊｅｄ　ｃｅｌｌｓ 　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊ、　１ｎｙｅｓ ｔ、ＤｅｒｍｘＬ、　９０．４５９−４６６、　１９８８　）。メラノーマ細胞 におけるｇｐ７５の細胞内局在は、ｇｐ７５が免疫系に接触するのを不可能にし ているように見える。しかしなから、メラノーマ患者で、ｇｐ７５に対するＩｇ Ｇ抗体か検出されている（Ｍａｌｌｓｓ、　Ｊ、　Ｍ、　、丁ｈｏｍｓｏｎ、Ｔ 、Ｍ、、Ｏｌｄ、１．ｌ　ａｎｄ　ＬＩｏ７ｄ、に、Ｏ，、Ａ　ｐｉｇｍｅｎｔ ａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｆｓｄ、　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎ ｔｉｇｅ［ｌｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂｙ　ａ 　ｐ「ｅｃｉｐｉｔａｔｉｎＨａｎｌｉｂｏｄ７　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　５ｅｒｕ ＩＩｌ、ｌｐ＋、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、３２．７１７−７２１゜１９８３）。こ れに関連して、ＭＡｂ　ＴＡ９９は、メラノーマ患者のＩｇＧ抗体によって沈殿 した同様のｇｐ７５抗原を認識する（Ｖｉｉａｙａｓａｒａｄｈｉ、Ｓ、、Ｂｏ ｕｃｈａｒｄ、Ｂ、Ｂ、ａｎｄ　Ｉｌｌｏｕｇｈｌｏｎ、Ａ、Ｎ、、　Ｔｈｅ　 ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｇｐ７５　ｉｓ　ｔｈｅ　ｈｕ＋ｎａｎ　 ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｂ　（ｂｒｏｗｎ）　ｆｏｃｕｓ　ｇ ｅｎｅ、Ｊ、ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７１．　１３７５−１３８０．　１９９０） 。静脈内注射された放射性標識ＭＡｂ　ＴＡ９９は、無胸腺マウスのメラノーマ 異種移植片に効率よく局在しくＷｅ　ｌ　＋、　Ｓ、　。

Ｍａｔｔｅｓ、Ｊ、Ｍ、、　Ｇｒａｎｄｏ、Ｒ，、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｔ、Ｍｌ、 　Ｌｅｏｎａｒｄ、Ｒ，Ｗ、、　１ａｎｚｏｏｉｃｏ、Ｐ、Ｂ、、Ｂｉｇｌｅｒ 、Ｒ，Ｅ、、Ｙｅｈ、Ｓ、、　Ｏｅｔｔｇｅｎ、Ｈ，Ｆ、ａｎｄ　Ｏｌｄ、Ｌ、 Ｊ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄ７　ｔｏ　ａｎ　１ｎｔｒａｃ ｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｌｉｇｓｎ　ｉｍａｇｅｓ　ｈｕｍａ［１ｍｅｌａｎｏｍ ａ　ｔｒａｓｐｌａｎ＋ｓ　ｉｎ　ｎｕ／ｎｕ　ｍ１ｃｅ、Ｐｒ。

ｃ、ｎａｆ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　（Ｗａｓｈ、）、８４．４２００−４２０４ ．　１９８７　）　、これはｇｐ７５抗原が免疫系に用いられ得ることを示唆し ている。

メラノソーム糖タンパクチロシナーゼは、ｇｐ７５がｂ（褐色）遺伝子座である のに対して、マウスＣ（アルピノ）遺伝子座にマツプされる遺伝子によってコー ドされる。チロシナーゼおよびｇｐ７５は、多数の共有タンパク質を有している 。

類似の物理学的特性に加えて、複数のクロマトグラフィ工程を介するｇｐ７５お よびチロシナーゼ活性の共純化から明らかなように、これら２つのタンパク質は 分子同一性をも共有する（アミノ酸レベルで４３．１％、およびヌクレオチドレ ベルで５５３％）　（Ｖｉｉａｙａｓａｒａｄｈｉ、Ｓ、、Ｂｏｕｃｈａｒｄ、 Ｂ、Ｂ、ａｎｄ　Ｈｏｕｇｈｊｏｎ、Ａ、ＮＩＴｈｅ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎ ｔｉｇｅｎ　ｇｐ７５　ｉｓ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｈＯｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ 　ｍｏｕｓｅ　ｂ　（ｂｒｏｗｎ）　ｆｏｃｕｓ　ｇｅｎｔ、Ｊ、ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、、１７１．　１３７５−１３８０．　１９９０　；　Ｃｏｈｅｎ、Ｔ、、Ｍ ｕｌｌｅｒ、Ｒ，Ｍ、、Ｔｏｍｉｔａ、Ｙ、ａｎｄ　５ｈｉｂａｈａｒａ、Ｓ、 、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｒｑｕ！ｎｃｒ　ｏｆ　ｔｈｅｃＤＮＡ　ｅｎｃｏ ｄｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　Ｉｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉ ｎ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３．　２８０７．　１９９０　）　。

抗チロシナーゼ抗体は、チロシナーゼ、ｂ（褐色）遺伝子座タンパク質および、 恐らく、関連タンパク質の一族と交差反応する（Ｓｈｉｂａｈａｒａ、Ｓ、、　 Ｔ’ｏｍｉｔａ、Ｙ、、　５ａｋａｋｕｒａ、Ｔ、、　Ｎａｇｅｒ。

Ｃ，、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、Ｂ、ａｎｄ　Ｍｕｌｌｅｒ、Ｒ，、ＣＩｏａｉＢ　 ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ 　Ｉｙｒｏｓｉｎａｓｅ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４．２４１３ −２４２７．　１９８６　；　Ｊａｃｋｓｏｎ、　ｌ、　Ｊ、、　Ａ　ｃＤＮＡ 　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｊ７ｒ。

５ｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｐｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂ ｒｏｗｎ　ｆｏｃｕｓ　ｉｎ　ｍ１ｃｅ、Ｐｒｏｃ、ｎａｌ＝へｃａｄ、Ｓｃ＋ 、　（Ｗａｓｈ、）、８５．４３９２−４３９６．　１９８８；Ｂｅａｒｉｎｇ 、Ｖ、　Ｊ、、ａｎｄ　ｌｉｍｅｎｅｘ、ｊ、、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍ ａｍｍａｌｉａｎ　ｐｉｇｍｅｎｌａｊｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　１ｅｖｅｌ、Ｐｉｇｍｅ＋＋ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、２，７５−８５． 　１９８９）。したがって、精製ｇｐ７５抗体かチロシナーゼとは区別されるこ とを示すことか重要であった。ｇｐ７５およびチロシナーゼ酵素活性は共純化し たが、はとんとのチロシナーゼ酵素活性は、丁Ａ９９アフィニティクロマトグラ フィを用いる精製の間にｇｐ７５から分離することができる。全細胞チロシンヒ ドロキシラーゼ活性のほとんどは、ＭＡｂ　ＴＡ９９アフィニティカラムの通過 骨中に回収され、これは、チロシンヒドロキシラーゼ活性がｇｐ７５とは区別さ れる分子によって触媒されることを示唆している。ＭＡｂ　ＴＡ９９かチロシン ヒドロキシラーゼ活性を免疫沈降させない、もしくは枯渇させないという事実は 、この観察と一致する（表Ｎ　：　丁ｈｏｍｓｏｎ、　Ｔ、　Ｍ。

、　Ｍａｔｔｅｓ、Ｊ、Ｍ、、　Ｒｏｕｘ、Ｌ、、　Ｏｌｄ、Ｌ、ｌ、ａｎｄ　 Ｌｌｏｙｄ、に、０．、Ｐｉｇｍｅｎｆａ＋１ｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇ ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ａｎｄｍｅｌ ａｎｏｃｙｌｔｓ：　ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｊｉｂ。

ｄｙ、１．１ｎｖｅｓｆ、Ｄｅｒｍｇｆ、、　８５．　１６９−１７４．　１９ ８５　）　ｏ　Ｊｉｍｃ＋＋ｓｚ、Ｍ。

、　Ｍａｌｖｏ７．Ｌ、ａｎｄ　Ｈｅａｒｉｎｇ、Ｖ、Ｊ、、　５ｐｅｃｉｆｉ ｃ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ａｎ　ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　ｃｌｏｎ ｅ　ｆｏｒ　ｍａｍＩｌｌａｌｉａｎ　ｌＨｏ５１ｎｚｓｅ、　Ｊ、ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、　２６４．３３９７−３４０３．　１９８９は、マウスｂ遺伝子座 タンパク質に対する抗ペプチド抗体を使用し、ｂタンパク質がマウスメラノーマ 細胞におけるチロシナーゼ活性の１５−３０％を説明することを示唆している。

我々の結果は、ｇｐ７５がチロシンヒドロキシラーゼ活性を有していないことを 示唆している。

しかしながら、ｇｐ７５が、色素形成メラノーマ細胞における酵素活性の５％を 説明する非常に弱いチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する可能性を除外するこ とはできない。

図　１ 一千一千 ｇｐ７５がら誘導された３種のペプチドのアミノ酸配列１、　Ａｓｎ−Ｔｈｒ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−跪−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙ ｓ−Ｔｙｒ−３、入５ｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−工１ｅｕ −５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−８ａｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−図　３ ｇｐ７５の部分ｃＤＮＡ配列 ５’　ＧＧ入ＣＣＡＧＣＴｒＴＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣ ＣＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣ，λＴＧＣＡＧＴ　Ｃ″ｒｒＴＧＡＴ Ｇ　入ＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＡＧＡＴ入Ｃ入入Ｔ（：ＣＴＧＡＴＡＴＡＴＣＣＡ ＣＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＣＭＣＡＣＡＧＡＡＡＴＧ’ｆＴｒにＴｒＡＣ ＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＣ；ＧＧＡＴＡＣＡＣＴＴＡＴＧＡＡＩ　１図 　４ ｇｐ７５をコードする完全長のｃＤＮＡの単峻区別臨靴原ヱユＩ ＥｃｏＲ工　Ｎｄａ工　）Ｉｄａ工　ＥｃｏＲニブラスミド・ベクターｐｃｖＥ ｘ ｇｐ７５　ｃＤＮ入イフィンサ ートにヱ土工五月 取可Ｕ ↓ ５’　ＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴ入ＡＧＡＧ入ＧＴＣｋＴＣ，、、コ ０国際調査報告 １＋１−１−ｍ−＾＊ｗ−ｒａ−１，−ＰＩ”Ｔ／ＩＩＱＯｉ’ｌ／ｎｌＱｔｔ Ｒ？％ｔｒ＋ｅｔ＋ｏｎｏｆＩｎｖｔｎｔｔｏｎｓｆｏｒＬａｃｋｏｆｕｎｉｔ ｙ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離された核酸分子であって、該核酸分子の配列がｇｐ７５のアミノ酸配列 をコードする核酸分子。 ２．単離された核酸分子であって、該核酸分子の配列がｇｐ７５の断片のアミノ 酸配列をコードする核酸分子。 ３．ｇｐ７５の断片のアミノ酸配列が、【配列があります】である請求の範囲第 ２項に記載の単離された核酸分子。 ４．ｇｐ７５の断片のアミノ酸配列が、【配列があります】である請求の範囲第 ２項記載の単離された核酸分子。 ５．ｇｐ７５の断片のアミノ酸配列が、【配列があります】である請求の範囲第 ２項記載の単離された核酸分子。 ６．請求の範囲第１項記載の核酸分子の、単離されたｃＤＮＡ分子。 ７．図３に示す配列を有する、請求の範囲第２項に記載の核酸分子の、単離され たｃＤＮＡ分子。 ８．請求の範囲第７項記載の単離されたｃＤＮＡ分子から誘導されるアミノ酸配 列。 ９．宿主における発現に適合した、請求の範囲第６項に記載のｃＤＮＡ分子と結 合したベクターの複製に必須のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。 １０．宿主における発現に適合した、請求の範囲第７項に記載のｃＤＮＡ分子と 結合したベクターの複製に必須のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。 １１．発現ベクターがワクチニアウイルスである請求の範囲第９項または第１０ 項に記載の発現ベクター。 １２．発現ベクターがイムクロンベクターである請求の範囲第９項または第１０ 項に記載の発現ベクター。 １３．投与される被検体におけるｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激もしくは増 強するワクチンであって、請求の範囲第９項に記載の発現ベクター、有効量のア ジュバントおよび調剤上許容し得る担体を含有するワクチン。 １４．投与される被検体におけるｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激もしくは増 強するワクチンであって、請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター、有効量の アジュバントおよび調剤上許容し得る担体を含有するワクチン。 １５．投与される被検体におけるｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激もしくは増 強するワクチンであって、該被検体における抗体産生を刺激もしくは増強するに 有効な量の精製ｇｐ７５もしくはその断片、有効量のアジュバントおよび調剤上 許容し得る担体を含有するワクチン。 １６．投与される被検体におけるｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激もしくは増 強するワクチンであって、該被検体における抗体産生を刺激もしくは増強するに 有効な量の、請求の範囲第８項に記載のアミノ酸配列によってコードされるポリ ペプチド、有効量のアジュバントおよび調剤上許容し得る担体を含有するワクチ ン。 １７．被検体が人間である請求の範囲第１３項、第１４項、第１５項または第１ ６項のいずれすに記載のワクチン。 ８．ｇｐ７５がアジュバントに結合している請求の範囲第１３項、第１４項、第 １５項または第１６項のいずれかに記載のワクチン。 １９．被検体における、ｇｐ７５に対する抗体の産生を刺激もしくは増強させる 方法であって、請求の範囲第１３項、第１４項、第１５項または第１６項のいず れかに記載のワクチンを、該抗体の産生の刺激もしくは増強に有効な投与量で該 被検体に投与することを含む方法。 ２０．癌に罹患している被検体における癌の治療方法であって、請求の範囲第１ ３項、第１４項、第１５項または第１６項のいずれかに記載のワクチンを、癌の 治療に有効な投与量で該被検体に投与することを含む方法。 ２１．癌に罹患している被検体における癌の予防方法であって、請求の範囲第１ ３項、第１４項、第１５項または第１６項のいずれかに記載のワクチンを、癌の 予防に有効な投与量で該被検体に投与することを含む方法。 ２２．癌に敏感な被検体における癌の再発を遅延させる方法であって、請求の範 囲第１３項、第１４項、第１５項または第１６項のいずれかに記載のワクチンを 、癌の再発の遅延に有効な投与量で該被検体に投与することを含む方法。 ２３．癌がメラノーマである請求の範囲第２０項、第２１項または第２２項のい ずれかに記載の方法。 ２４．ｇｐ７５がアジュバントに結合している請求の範囲第１９項、第２０項、 第２１項または第２２項のいずれかに記載の方法。 ２５．ワクチンを投与する前に、被検体に有効量のシクロホスフアミドを投与す る請求の範囲第１９項、第２０項、第２１または第２２項のいずれかに記載の方 法。