FR2848221A1 - Procede de preparation d'heterocarpine recombinante - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'hétérocarpine recombinante.La séquence complète de l'hétérocarpine (SEQ. ID. NO. 10), des vecteurs d'expression comprenant un polynucléotide codant pour l'hétérocarpine, des cellules hôtes transformées ou transfectées par lesdits vecteurs d'expression ainsi qu'un procédé d'obtention d'hétérocarpine au moyen desdites cellules hôtes transformées ou transfectées sont notamment décrits.L'hétérocarpine recombinante obtenue selon l'invention peut notamment être utilisée pour préparer un médicament destiné à traiter le cancer.

Description

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Procédé de préparation d'hétérocarpine recombinante L'invention a pour objet un procédé de préparation d'hétérocarpine recombinante.

L'hétérocarpine est une protéine aux propriétés anti-cancéreuses décrite pour la première fois par la demanderesse dans la demande de brevet PCT WO 02/068461.

Cette protéine isolée possède une masse moléculaire d'environ 90,9 kDa, comporte les fragments de séquences peptidiques SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 et SEQ. ID. NO. 3 (voir la partie de la description réservée à la liste des séquences) et est susceptible d'être obtenue par extraction de cellules de plante Pilocarpus heterophyllus cultivées in vitro comme décrit dans la demande de brevet susmentionnée. Toutefois, la séquence complète de cette protéine restait inconnue à ce jour dans la mesure où le clonage n'avait pas été effectué.

La présente demande décrit à présent des polynucléotides pouvant servir d'amorce pour le clonage de l'hétérocarpine, l'ADN codant pour l'hétérocarpine, l'ARNm correspondant à l'hétérocarpine, des vecteurs d'expression contenant ledit ARNm, des cellules hôtes transformées ou transfectées avec ces vecteurs de même qu'un procédé de préparation d'hétérocarpine recombinante.

La présente invention a donc d'abord pour objet un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8. De préférence, ledit polynucléotide isolé consiste en la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8.

Elle a aussi pour objet un polynucléotide anti-sens comprenant la séquence complémentaire à celle dudit polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8. De préférence, ledit polynucléotide anti-sens consiste en la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8.

L'invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un des fragments de cette dernière, ledit polynucléotide étant tel qu'il code pour un polypeptide ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. De préférence, ledit polynucléotide isolé est tel qu'il consiste en la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un des fragments de cette dernière.

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En particulier, l'invention concerne à ce titre le polynucléotide isolé de séquence nucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou le polynucléotide isolé de séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

L'hétérocarpine, autrement dit la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10, est codée par le fragment du polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 contenu entre les bases aux positions 115 (codon initiateur ATG codant pour une méthionine) et 2437 (codon stop UAA), i. e. par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

L'invention concerne donc encore un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un des fragments de cette dernière ou bien la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un des fragments de cette dernière, le polypeptide codé par ledit polynucléotide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. De préférence, ledit vecteur d'expression comprendra la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

L'invention concerne de même une cellule hôte transformée ou transfectée avec ledit vecteur d'expression.

L'invention concerne aussi un polypeptide isolé comprenant un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou un de ses fragments, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire.

De préférence, ledit polypeptide isolé consistera en un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou en un de ses fragments. En particulier, ledit polypeptide possédera la séquence SEQ. ID. NO. 14.

L'invention a également pour objet un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé tel que décrit précédemment, et en particulier un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10 ou la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14.

L'invention concerne aussi, à titre de médicament, un polynucléotide isolé comprenant : la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments, ou la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments,

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ledit polynucléotide isolé étant tel qu'il code pour un polypetide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire.

De préférence, le polynucléotide isolé consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments, ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments.

En particulier, ledit polynucléotide isolé consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

Par ailleurs, ledit polynucléotide isolé utilisé en tant que médicament sera de préférence présent dans un vecteur viral, ledit vecteur viral étant par exemple sélectionné à partir du groupe consistant en un adénovirus, un adénovirus associé, un rétrovirus et un pox virus.

L'invention concerne aussi, à titre de médicament, un polypeptide isolé comprenant un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou un de ses fragments, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. De préférence, ledit polypeptide isolé consistera en un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou en un de ses fragments. En particulier, ledit polypeptide possédera la séquence SEQ. ID. NO. 14.

L'invention concerne encore, à titre de médicament, un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé comprenant la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. De préférence, ledit anticorps monoclonal ou ledit fragment de l'antigène de celui-ci fixe spécifiquement un polypeptide isolé consistant en la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière. Plus préférentiellement encore, ledit anticorps monoclonal ou ledit fragment de l'antigène de celui-ci fixe spécifiquement un polypeptide isolé consistant en la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la

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séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10).

Un autre objet de l'invention sera une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un polynucléotide isolé comprenant : - la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments, ou - la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments, ledit polynucléotide isolé étant tel qu'il code pour un polypetide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, avec un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables.

De préférence, le polynucléotide isolé servant de principe actif consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments.

En particulier, le polynucléotide isolé servant de principe actif consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

Ledit polynucléotide isolé incorporé dans une composition pharmaceutique selon l'invention sera de préférence présent dans un vecteur viral, ledit vecteur viral étant par exemple sélectionné à partir du groupe consistant en un adénovirus, un adénovirus associé, un rétrovirus et un pox virus.

L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide isolé comprenant un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou un de ses fragments, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. De préférence, ledit polypeptide isolé consistera en un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou en un de ses fragments.

En particulier, ledit polypeptide possédera la séquence SEQ. ID. NO. 14.

L'invention aura de plus pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé comprenant au moins un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9, ledit polypeptide

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isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ladite composition comprenant par ailleurs un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. De préférence, ladite composition pharmaceutique selon l'invention sera telle qu'elle comprenne un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé consistant en la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière.

En particulier, l'invention concernera une composition pharmaceutique comprenant un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10) avec un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un polynucléotide isolé comprenant : - la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments, ou - la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments, ledit polynucléotide isolé étant tel qu'il code pour un polypetide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative.

De préférence, le polynucléotide isolé utilisé consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un de ses fragments.

En particulier, le polynucléotide isolé utilisé consistera en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 8 ou en le polynucléotide de séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9.

Ledit polynucléotide isolé utilisé est de préférence présent dans un vecteur viral, ledit vecteur viral étant par exemple sélectionné à partir du groupe consistant en un adénovirus, un adénovirus associé, un rétrovirus et un pox virus.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide isolé comprenant un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou un de ses fragments, ledit

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polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative. De préférence, ledit polypeptide isolé consistera en un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14 ou en un de ses fragments. En particulier, ledit polypeptide possédera la séquence SEQ. ID. NO. 14.

Alternativement, toujours selon la présente invention, un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé comprenant la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, pourra être utilisé pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative. De préférence, ledit anticorps monoclonal ou ledit fragment de l'antigène de celui-ci fixera spécifiquement un polypeptide consistant en la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière.

En particulier, un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement un polypeptide isolé codé par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit, un anticorps monoclonal, ou un fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10), pourra être utilisé pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative.

Selon des variantes préférées des utilisations susmentionnées, la maladie proliférative à traiter par le polypeptide ou le polynucléotide décrits précédemment sera un cancer.

Selon des variantes encore plus préférées, le cancer sera choisi parmi le groupe consistant en le cancer de la prostate, le cancer du sein, le cancer du poumon (et en particulier le cancer du poumon à petites cellules) et le cancer colorectal. Seront encore plus particulièrement préférés le cancer du sein et le cancer du poumon à petites cellules.

L'invention offre de plus une méthode de préparation d'un polypeptide isolé comprenant la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou

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SEQ. ID. NO. 13 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ladite méthode de préparation comprenant les étapes successives suivantes : (a) culture, dans des conditions convenables pour obtenir l'expression dudit polypeptide d'une cellule hôte transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13, la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou encore un des fragments de ces dernières, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) isolement du polypeptide à partir des cultures de cellules hôtes.

De préférence, ladite méthode de préparation concernera la préparation d'un polypeptide isolé consistant en la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ladite méthode de préparation comprenant les étapes successives suivantes : (a) culture, dans des conditions convenables pour obtenir l'expression dudit polypeptide d'une cellule hôte transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13, la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou encore un des fragments de ces dernières, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) isolement du polypeptide à partir des cultures de cellules hôtes.

En particulier, ladite méthode aura pour objet la préparation du polypeptide isolé codé par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou par la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou

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SEQ. ID. NO. 13 (autrement dit, la préparation de la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10).

Selon une variante encore plus préférée de ladite méthode, celle-ci concernera la préparation de la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10 et comprendra les étapes suivantes : (a) culture, dans des conditions convenables pour obtenir l'expression dudit polypeptide d'une cellule hôte transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) isolement du polypeptide à partir des cultures de cellules hôtes.

La présente invention offre encore une méthode pour l'identification de composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire, laquelle comprend les étapes successives suivantes : (a) mise en contact de chaque composé candidat, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre à l'agent candidat de se fixer au polypeptide, avec un polypeptide isolé comprenant : - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique
SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9, - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique
SEQ. ID. NO. 13 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 13, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) détection de la fixation de chaque composé candidat audit polypeptide et identification, parmi les composés candidats, des composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire.

En particulier, ladite méthode pour l'identification de composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire comprendra, dans son étape (a), la mise en contact de chaque composé candidat, dans des conditions et pendant un

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temps suffisant pour permettre à l'agent candidat de se fixer au polypeptide, avec le polypeptide isolé codé par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit, avec la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10).

Une méthode alternative pour l'identification de composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire comprend les étapes successives suivantes : (a) mise en contact de chaque composé candidat, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre à l'agent candidat et à la cellule d'interagir, avec une cellule capable d'exprimer un polypeptide isolé comprenant : - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique
SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9, - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique
SEQ. ID. NO. 13 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 13, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire, et (b) détermination de l'effet de chaque composé candidat sur la concentration cellulaire en polypeptide et identification, parmi les composés candidats, des composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire.

En particulier, ladite méthode alternative comprendra, dans son étape (a), la mise en contact de chaque composé candidat, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre à l'agent candidat et à la cellule d'interagir, avec une cellule capable d'exprimer le polypeptide isolé codé par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit, une cellule capable d'exprimer la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10).

Selon des modes d'exécution préférés des méthodes d'identification de composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire décrites ci-dessus, les composés candidats proviendront de librairies de petites molécules issues de programmes de chimie combinatoire.

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Les propriétés pharmacologiques obtenues pour les polynucléotides et polypeptides selon l'invention rendent ces derniers aptes à une utilisation pharmaceutique. En effet, les polypeptides isolés comprenant : - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9, - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 13 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 13, qui ont au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ainsi que les polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, peuvent, selon l'invention, être administrés à des patients cancéreux afin de ralentir la progression de leurs tumeurs ou de faire régresser lesdites tumeurs.

Dans les méthodes ci-dessus, la protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire pourra en particulier être le polypeptide isolé codé par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou par la séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 (autrement dit, la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10).

Enfin, l'invention concerne les polynucléotides de séquence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5, SEQ. ID. NO. 11 et SEQ. ID. NO. 12, lesquels peuvent notamment être utilisés en tant qu'amorce dans les réactions de PCR du clonage de l'hétérocarpine.

Les différents éléments évoqués ci-dessus deviendront évidents pour l'homme du métier une fois faite la lecture de la description plus détaillée des différents aspects de l'invention.

Description détaillée des différents aspects de l'invention Comme mentionné ci-dessus, la présente invention est généralement dirigée vers des produits et des méthodes destinés à moduler la croissance cellulaire et à traiter le cancer.

La présente invention est basée, en partie, sur l'identification de séquences associées à la modulation de la prolifération cellulaire qui sont des séquences polypeptidiques et polynucléotidiques associées à la modulation de la prolifération cellulaire. De telles molécules d'ADNc peuvent être préparées à partir de préparations d'ARN ou d'ARNm

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en utilisant les techniques standard, comme la transcription inverse. De manière similaire, une protéine ou un polypeptide associé à la différenciation comprend la séquence codée par un ARNm associé à la différenciation cellulaire.

Les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent inclure un ou plusieurs polypeptides, séquences d'acides nucléiques et/ou anticorps. Les polypeptides de la présente invention comprennent au moins une portion de la protéine ou un variant de celle-ci fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire. Les séquences d'acides nucléiques de la présente invention comprennent une séquence d'ADN ou d'ARN qui code au moins pour une portion d'un tel polypeptide ou qui est complémentaire à une telle séquence codante.

Les anticorps sont des protéines du système immunitaire ou des fragments de fixation à l'antigène de celui-ci, qui sont capables de fixer une portion des polypeptides décrits ci-dessus.

fQlmJQtiç\~,J?QJyp-pJig~~j- PXQtjJJ. --(fJ.9}1JjJJ.Y~nJiml~; La présente invention a en particulier pour objet les polynucléotides de séquence SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ainsi que le polypeptide ou la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14.

L'invention comprend également les polynucléotides possédant des séquences polynucléotidiques homologues au moins à 75 %, de préférence au moins à 85 % et encore plus préférentiellement au moins à 90 % voire 95 %, aux séquences des polynucléotides décrits plus haut, notamment aux séquences SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9 et SEQ. ID. NO. 13. Cela s'applique également mutatis mutandis aux autres polynucléotides, polypeptides et protéines faisant partie de l'invention, et notamment à la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14.

Le degré d'homologie exprimé en % est calculé comme suit :
100-100 x (N'/N) avec N' représentant le nombre de nucléotides ou d'acides aminés modifiés par rapport à la séquence SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9, SEQ. ID. NO. 10, SEQ. ID. NO. 13 ou SEQ. ID. NO. 14 et N le nombre de nucléotides de la séquence SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9, SEQ. ID. NO. 10, SEQ. ID. NO. 13 ou SEQ. ID. NO. 14.

Selon l'invention, les séquences polynucléotidiques qui codent pour les polypeptides ou protéines de l'invention, et des fragments ou des protéines de fusion de ces polypeptides

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ou protéines, peuvent être utilisées pour générer des molécules d'ADN recombinant qui dirigent l'expression de ces polypeptides ou protéines, ou d'une portion active de ceux-ci, dans des cellules hôtes appropriées. Alternativement, des séquences polynucléotidiques qui s'hybrident avec des portions des séquences de polynucléotides selon l'invention peuvent également être utilisées dans des essais d'hybridation d'acides nucléiques, Southern blot, Northern blot, etc.

A cause de la dégénérescence du code génétique, d'autres séquences d'ADN codant substantiellement pour la séquence en acides aminés des polypeptides ou protéines de l'invention peuvent être utilisées pour le clonage et l'expression desdits polypeptides ou protéines. De telles séquences d'ADN incluent celles capables d'hybrider les séquences polynucléotidiques des polynucléotides de l'invention dans certaines conditions de stringence qui peuvent être ajustées de plusieurs manières. Par exemple, lors de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), la température à laquelle s'hybrident les amorces à la matrice ou les concentrations de MgCl2 dans le tampon réactionnel, peuvent être ajustés. Lors de l'utilisation de fragments d'ADN radio-marqués, ou d'oligonucléotides pour sonder des membranes, la stringence peut être ajustée en changeant les forces ioniques des solutions de lavage ou en contrôlant avec précaution la température de lavage.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue s'hybride spécifiquement avec la séquence complémentaire à la séquence SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 dans des conditions stringentes (ou des conditions de stringence fortes ). Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, et d'après Sambrook et coll.

(Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 x (% G+C) + 16,6 x log [cations] - x (% formamide) - (600/ nombre de bases) Pour la présente invention, les conditions de stringence seront dites fortes lorsque l'on utilise une température d'hybridation de 10 C en dessous de Tm et des tampons d'hybridation contenant une solution 6 x SSC (chlorure de sodium 0,9 M et citrate de sodium 0,09 M). Dans de telles conditions, les polynucléotides de séquences aspécifiques ne s'hybrideront pas avec le polynucléotide de la séquence complémentaire à la séquence SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13.

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Des séquences d'ADN altérées qui peuvent être utilisées en accord avec la présente invention incluent des délétions, des additions ou des substitutions de différents résidus nucléotidiques résultant dans une séquence qui code le même produit du gène ou de fonction équivalente. Le produit du gène peut également contenir des délétions, des additions ou des substitutions de résidus d'acides aminés dans les séquences des protéines de l'invention, qui résultent dans des changements dits silencieux, produisant ainsi des polypeptides et protéines de fonction équivalente.

De telles substitutions en acides aminés peuvent être réalisés sur la base de la polarité, de la charge, de la solubilité, de l'hydrophobicité, de l'hydrophilicité, et/ou de la nature amphipatique des résidus impliqués.

Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique, des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et l'arginine, des acides aminés avec des groupements polaires ayant des valeurs d'hydrophobicité voisines incluent la leucine, l'isoleucine, la valine ; la glycine, l'alanine ; l'asparagine, la glutamine ; la sérine, la thréonine ; la phénylalanine, la tyrosine.

Les séquences d'ADN de la présente invention peuvent être modifiées pour altérer les séquences des polynucléotides selon l'invention pour de nombreuses raisons incluant de manière non limitative des altérations qui modifient le processus et l'expression du produit du gène. Par exemple, des mutations peuvent être introduites en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple la mutagénèse dirigée, l'insertion de nouveaux sites de restriction, l'altération des glycosylations, la phosphorylation, etc.

En particulier, dans certains systèmes d'expression comme la levure, la cellule hôte peut sur-glycosyler le produit du gène. Dans un tel système, il est préférable d'altérer les séquences polynucléotidiques pour éliminer les sites de glycosylation. Dans l'étendue de la divulgation de la présente invention figurent également des séquences polynucléotidiques modifiées liées à des séquences hétérologues pour coder une protéine de fusion. La protéine de fusion (qui peut être par exemple la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14) peut être modifiée pour contenir un site de clivage localisé entre la séquence de la protéine selon l'invention (par exemple la séquence SEQ. ID. NO. 10) et la séquence de la protéine hétérologue, de telle sorte que la séquence de la protéine selon l'invention puisse être clivée de la partie hétérologue.

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Polymiç téotides codant, pour des pp.lypeptid.es .associés à, la modulation de la prolifération cellulaire : Tout polynucléotide qui code pour un polypeptide ou une portion ou un variant de celui-ci comme décrit ici fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, est couvert par la présente invention. De tels polynucléotides peuvent être simple brin (codant ou anti-sens) ou double brin et peuvent être de l'ADN (génomique, ADNc ou synthétique) ou des molécules d'ARN.

Les polynucléotides codant pour des polypeptides fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire peuvent être préparés en utilisant n'importe quelle technique disponible pour l'homme du métier. Par exemple, un tel polynucléotide peut être amplifié via une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir d'ADNc préparé à partir de cellules. Pour cette approche, des amorces spécifiques peuvent être dessinées et commandées ou synthétisées ; ces amorces sont basées sur la séquence dudit polynucléotide. Une portion amplifiée peut ensuite être utilisée pour isoler le gène complet à partir d'une banque d'ADN génomique ou à partir d'une banque d'ADNc de n'importe quelle cellule ou n'importe quel tissu, grâce à des techniques bien connues de l'homme du métier et brièvement rappelées ci-dessous.

Alternativement, un gène complet peut être construit à partir de plusieurs fragments de PCR. Les molécules d'ADNc codant pour une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ou une portion de celle-ci, peuvent également être préparées en criblant une banque d'ADNc obtenue par exemple à partir d'ARNm de cellules ou de tissus. De telles librairies peuvent être disponibles dans le commerce ou peuvent être préparées en utilisant les techniques classiques (cf. Sambrook et coll., Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Alternativement, d'autres techniques de criblage bien connues par l'homme du métier peuvent être employées.

Une molécule d'ADNc codant pour un polypeptide fixant le GHRH humain et étant associé à la modulation de la prolifération cellulaire peut être séquencée en utilisant les techniques classiques utilisant des enzymes comme le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, la Séquenase X (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Etats-Unis), la Taq polymérase (Perkin Elmer, Foster City, CA, Etats-Unis), la polymérase thermostable T7 (Amersham, Chicago, IL, Etats-Unis) ou une combinaison de polymérases recombinantes et d'exonucléases à activité de relecture comme le système d'amplification Elongase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Etats-Unis). Un système de

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séquençage automatique peut être utilisé à l'aide des instruments disponibles chez des fournisseurs commerciaux comme Perkin Elmer et Pharmacia.

La séquence partielle d'un ADNc peut être utilisée pour identifier une séquence polynucléotidique qui code pour la protéine complète associée à la modulation de la prolifération cellulaire en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Parmi ces techniques, une librairie d'ADNc est criblée en utilisant une ou plusieurs sondes polynucléotidiques en utilisant les propriétés de recombinaison de RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, Etats-Unis).

Pour les techniques d'hybridation, une séquence partielle peut être radiomarquée (par exemple par translation de coupure ou par marquage des extrémités en utilisant du 32P ou du 33P) en utilisant des techniques classiques. Une librairie de bactéries ou de bactériophages est ensuite criblée par hybridation sur des filtres contenant les colonies bactériennes dénaturées (ou les empreintes contenant les plaques de phages) avec la sonde marquée (cf. Sambrook et coll., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Les colonies positives ou plaques sont ensuite sélectionnées et amplifiées et l'ADN est isolé pour des analyses futures.

La séquence complète peut ensuite être déterminée en utilisant des techniques standard.

Les séquences chevauchantes sont ensuite assemblées en une séquence unique continue.

Une molécule d'ADNc complète peut être générée par ligature des fragments d'intérêt en utilisant des techniques classiques.

Alternativement, il existe de nombreuses techniques basées sur l'amplification pour l'obtention d'une séquence codante complète à partir d'une séquence partielle d'ADNc.

Parmi elles, l'amplification est généralement réalisée via PCR. L'ensemble des kits disponibles dans le commerce peut être utilisé pour les étapes d'amplification. Les amorces peuvent être dessinées en utilisant, par exemple, des logiciels bien connus dans le métier. Les amorces nucléotidiques sont de préférence des molécules de 20 à 30 nucléotides ayant un contenu en guanine et cytosine d'au moins 50 % et qui s'hybrident avec la séquence cible à des températures comprises entre 50 et 72 C. La région amplifiée peut être séquencée comme décrit ci-dessus et les séquences chevauchantes assemblées en une séquence continue.

Parmi les approches alternatives, des séquences adjacentes à la séquence partielle peuvent être retrouvées par amplification avec une amorce de la séquence de liaison et une amorce spécifique d'une région connue. Les séquences amplifiées sont ensuite soumises à un second cycle d'amplification.

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Des techniques additionnelles incluent la PCR de capture (Lagerstrom et coll., PCR Methods Applic. (1991), 1,111-19) et la PCR progressive (Parker et coll., Nucl. Acids.

Res. (1991), 19,3055-60). D'autres méthodes utilisant l'amplification peuvent également être employées pour l'obtention d'une séquence complète d'ADNc.

Il est possible d'obtenir une séquence d'ADNc complète en analysant les séquences déposées dans les bases publiques Expressed Séquence Tags (ESTs) disponibles à partir de GenBank. Des recherches de recouvrement des ESTs peuvent être réalisées en utilisant des programmes informatiques bien connus de l'homme du métier (par exemple NCBI BLAST) et de tels ESTs peuvent être utilisés pour générer une séquence complète continue.

Les variants des séquences polynucléotidiques décrites plus haut (notamment des séquences SEQ. ID. NO. 8, SEQ. ID. NO. 9 et SEQ. ID. NO. 13) sont également inclus dans le champ de la présente invention. Les variants polynucléotidiques peuvent contenir une ou plusieurs substitutions, délétions ou insertions (cf. aussi supra dans la partie intitulée Polynucléotides, polypeptides et protéines selon l'invention ).

Une portion de la séquence complémentaire de la séquence codante (i.e. un polynucléotide anti-sens) peut également être utilisée comme sonde ou comme modulateur de l'expression génique. Les construits d'ADNc pouvant être transcrits en ARN anti-sens peuvent être introduits dans des cellules ou dans des tissus pour faciliter la production d'ARN anti-sens. Un polynucléotide anti-sens peut être utilisé, comme décrit ici, pour inhiber l'expression d'un gène associé à la modulation de la prolifération cellulaire. La technologie anti-sens peut être utilisée pour contrôler l'expression génique en formant une triple-hélice, qui compromet la capacité de la double hélice à s'ouvrir suffisamment pour la fixation des polymérases, des facteurs de transcription ou des molécules de régulation (cf. Gee et coll. dans Huber et Carr, Molecular and Immunologie Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).

Alternativement, une molécule anti-sens peut être utilisée pour s'hybrider avec une région de contrôle du gène (par exemple un promoteur ou un site d'initiation de la transcription) et bloquer la transcription du gène, ou bloquer la traduction en inhibant la fixation des ribosomes au transcrit.

Les polynucléotides peuvent ensuite être modifiés pour augmenter leur stabilité in vivo.

Des modifications possibles incluent (mais ne sont pas limitées à) : l'addition de séquences aux extrémités 5' et/ou 3' ; l'utilisation de phosphorothioate ou de 2' O-méthyle plutôt que des liaisons phosphodiestérase dans le squelette ; et/ou l'introduction de bases comme l'inosine, la quéosine et la wybutosine de même que

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l'acétyladénine, la méthylthioadénine et d'autres formes modifiées de l'adénine, la cytidine, la guanine, la thymine et l'uridine.

D'autres variations des polynucléotides de la présente invention ont par ailleurs déjà été décrites précédemment dans la partie intitulée Polynucléotides, polypeptides et protéines selon l'invention .

Les séquences de nucléotides comme décrites dans la présente invention peuvent être jointes à d'autres séquences nucléotidiques en utilisant des techniques établies d'ADN recombinant. Par exemple, un polynucléotide peut être cloné dans un large panel de vecteurs d'expression, incluant des plasmides, des phagemides, des dérivés du phage lambda et des cosmides. Les vecteurs d'intérêt particulier incluent les vecteurs d'expression, des vecteurs de réplication et des vecteurs de séquençage. En général, un vecteur contient une origine de réplication fonctionnelle dans au moins un organisme, des sites de restriction endonucléasiques convenables et un ou plusieurs marqueurs de sélection. La présence d'autres éléments dépendra de l'utilisation spécifique souhaitée par l'homme du métier qui sélectionnera les caractéristiques du vecteur d'expression en fonction de ses besoins et des techniques disponibles.

Les polynucléotides peuvent être formulés pour entrer dans la cellule et exprimer le polypeptide correspondant. De telles formulations sont particulièrement utiles en thérapeutique comme décrit ci-après.

Les hommes du métier apprécieront qu'il existe plusieurs moyens pour exprimer un polynucléotide dans une cellule cible, et que n'importe quelle technique adéquate peut être employée. Par exemple, un polynucléotide peut être incorporé dans un vecteur viral comme un adénovirus ou un rétrovirus (mais aussi dans d'autres). Des techniques pour incorporer de l'ADN dans de tels vecteurs sont bien connues de l'homme de l'art. Un vecteur rétroviral peut transférer ou incorporer un gène pour un marqueur de sélection et/ou une entité de ciblage comme un gène codant pour le ligand d'un récepteur spécifique d'une cellule cible, afin de rendre le vecteur cible-spécifique.

D'autres formulations pour les polynucléotides incluent les systèmes de dispersion colloïdaux comme des complexes macromoléculaires, nano-capsules, microsphères, billes, et des systèmes basés sur l'utilisation des lipides incluant les émulsions huile/eau, micelles, micelles mixtes et liposomes. Le système colloïdal préféré pour une utilisation de délivrance du produit in vitro et in vivo est le liposome (i. e. une vésicule membranaire artificielle).

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Polypeptides fixant le GHRH humain et modulant la prolifération cellulaire : Dans l'étendue de la divulgation, les polypeptides de la présente invention comprennent au moins une portion de la protéine associée à la modulation de la prolifération cellulaire ou d'un variant de celle-ci, ladite portion étant immunologiquement et/ou biologiquement active. De tels polypeptides peuvent avoir n'importe quelle longueur, incluant la protéine complète, un oligopeptide (i. e. consistant en un nombre relativement limité d'acides aminés, comme 8-10 résidus, joints par des liaisons peptidiques) ou un peptide de taille intermédiaire. Un polypeptide peut également comprendre des séquences additionnelles.

De manière similaire, un polypeptide est biologiquement actif s'il possède une ou plusieurs fonctions structurales, régulatrices et/ou biochimiques à partir de la protéine native associée à la fixation du GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire.

La présence d'une activité biologique peut être déterminée selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Toutefois, par définition dans le cadre de la présente invention, un polypeptide sera considéré comme ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire dès lors que sa concentration inhibitrice CI50 mesurée dans les conditions décrites dans l'exemple 6 de la présente demande sera inférieure ou égale à 10 nM (et de préférence inférieure ou égale à 1 nM).

Par exemple, des études de comparaison de séquences peuvent indiquer une activité biologique particulière de la protéine. Les essais tendant à évaluer ladite activité peuvent alors être mis en #uvre sur la base d'essais déjà connus dans le métier. Certaines portions et d'autres variants de telles protéines devraient également montrer cette propriété selon un test in vitro ou in vivo.

Comme déjà mentionné, les polypeptides selon la présente invention peuvent comprendre une ou plusieurs portions d'un variant de la protéine endogène où la portion est immunologiquement et/ou biologiquement active (i. e. la portion présente une ou plusieurs caractéristiques antigéniques, immunogéniques et/ou biologique de la protéine complète). De préférence, une telle portion est au moins aussi active que la protéine totale lors d'essais permettant la détection de telles propriétés. Un polypeptide variant est un polypeptide qui diffère de la protéine native par des substitutions, des insertions, des délétions et/ou des modifications en acides aminés. Certains variants

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contiennent des substitutions conservatrices. Une substitution conservatrice est une substitution dans laquelle un acide aminé est substitué par un autre acide aminé ayant les mêmes propriétés, comme celles déterminées par l'homme du métier qui n'attend aucun changement dans la structure secondaire, ainsi que dans la nature hydropathique du polypeptide. Les substitutions d'acide aminé peuvent généralement être réalisées sur la base de similarité de polarité, de charge, de solubilité, d'hydrophobicité, d'hydrophylicité, et/ou de la nature amphipathique des résidus. Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique ; des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et l'arginine ; et des acides aminés non chargés polaires ayant des valeurs d'hydrophobicité similaire incluent la leucine, l'isoleucine et la valine ; glycine et l'alanine ; l'asparagine et la glutamine ; la sérine, la thréonine, la phénylalanine et la tyrosine. D'autres groupes d'acides aminés qui peuvent représenter des changements conservateurs sont notamment les suivants : (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr ; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe ; Lys, Arg, His ; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Un variant peut également, ou alternativement, contenir des changements non conservateurs.

Des variants faisant partie de cette invention incluent également des polypeptides dans lesquels la structure primaire de la protéine native est modifiée par formation de conjugués covalents ou pas avec d'autres polypeptides ou des structures chimiques comme des groupes lipidiques ou des groupes glycosyle, ou phosphate acétyle.

La présente invention inclut également des polypeptides avec ou sans motifs de glycosylation. Les polypeptides exprimés dans des systèmes d'expression de levure ou de cellules de mammifères peuvent être, en termes de poids moléculaire et de schéma de glycosylation, similaires à ou légèrement différents de la molécule native selon le système d'expression utilisé.

L'expression d'ADN chez la bactérie comme E. Coli conduit à des molécules non-glycosylées. Les sites de N-glycosylation des protéines eucaryotes sont caractérisés par le triplet d'acides aminés Asn-Al-Z où Al est n'importe quel acide aminé excepté Pro, et Z est une sérine ou une thréonine.

D'autres variations des polypeptides et protéines de la présente invention ont par ailleurs déjà été décrites précédemment dans la partie intitulée Polypeptides et polynucléotides selon l'invention .

Pour préparer un variant polypeptidique, des techniques standard de mutagenèse, comme la mutagenèse dirigée en utilisant un oligonucléotide dirigé, peuvent être utilisées.

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En général, n'importe quel vecteur d'expression connu de l'homme du métier peut être employé pour exprimer des polypeptides recombinants de cette invention. L'expression peut être obtenue dans n'importe quelle cellule hôte appropriée qui a été transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN qui code pour le polypeptide recombinant. Des cellules hôtes convenables incluent des cellules procaryotes, d'eucaryotes supérieurs ou de levure. De préférence, les cellules hôtes employées sont E. Coli, des cellules de levure ou des cellules de mammifères comme COS, CHO, HEK-293, MCF7 (cellules tumorales humaines isolées à partir d'un carcinome mammaire) ou DU 145 (cellules tumorales humaines isolées à partir d'un cancer de la prostate).

Certaines portions et d'autres variants peuvent également être générés par des moyens synthétiques en utilisant des techniques bien connues de l'homme de l'art. Par exemple, des portions et autres variants ayant moins de 500 acides aminés, de préférence moins de 100 acides aminés et plus préférentiellement moins de 50 acides aminés peuvent être synthétisés par voie chimique. Les polypeptides peuvent être synthétisés en utilisant des techniques de synthèse sur phase solide disponibles commercialement, comme la méthode de synthèse sur résine de Merrifield où les acides aminés sont séquentiellement ajoutés à une chaîne d'acides aminés en cours de synthèse (cf. Merrifield, J. Am. Chem.

Soc. (1963), 85,2149-2146). De nombreuses autres techniques de synthèse sur phase solide sont également disponibles (par exemple la méthode de Roberge et coll., Science (1995), 269,202-204). Des équipements pour la synthèse automatique de polypeptides sont commercialement disponibles chez des fournisseurs comme Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, Etats-Unis) ; la synthèse des polypeptides peut alors être réalisée en suivant les recommandations du constructeur.

Polynucléotides ou polypeptides isolés : En général, les polypeptides et polynucléotides décrits dans la présente invention sont isolés. Un polypeptide ou un polynucléotide isolé est un polynucléotide ou un peptide enlevé de son environnement original. Par exemple, une protéine naturelle est isolée si elle est séparée du matériel biologique avec lequel elle coexiste dans le système naturel. Un polynucléotide est considéré comme isolé si, par exemple, il est cloné dans un vecteur qui ne fait pas partie de l'environnement naturel.

Anticorps et. fragments de ceux-ci ~ : La présente invention fournit des agents de fixation, comme les anticorps qui fixent spécifiquement la protéine associée à la fixation du GHRH humain et étant associée à la

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modulation de la prolifération cellulaire. Un tel agent est dit comme fixant spécifiquement à la protéine de modulation de la prolifération cellulaire s'il réagit à un niveau détectable (par exemple par un essai ELISA) avec une protéine associée à la modulation de la prolifération cellulaire ou une portion ou un variant de celle-ci et ne réagit pas de manière détectable avec d'autres protéines. La fixation se réfère à une association non covalente entre 2 molécules séparées de telle sorte qu'un complexe se forme. La capacité à la fixation peut être évaluée, par exemple, par la détermination de la constante de fixation pour la formation du complexe. La constante de fixation est la valeur obtenue lorsque la valeur de la concentration du complexe est divisée par le produit des valeurs des concentration des composants. En général, 2 produits sont dits fixés lorsque la constante de fixation atteint 103 1/mol. La constante de fixation peut être déterminée en utilisant des méthodes bien connues de l'homme du métier.

N'importe quel agent capable de répondre aux critères ci-dessus peut être considéré comme un agent fixant.

Dans la présente invention, un agent de fixation est de préférence un anticorps ou un fragment de celui-ci. Les anticorps peuvent être préparés par n'importe quelle technique disponible à l'homme du métier (cf. Harlow et Lane, Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En général, les anticorps peuvent être produits par des techniques de culture cellulaire incluant la génération d'anticorps monoclonaux ou via des transfections de gènes d'anticorps dans des cellules hôtes de bactéries ou de mammifères afin de produire des anticorps recombinants.

Parmi d'autres techniques, on préférera employer celles décrites ci-après. Un immunogène contenant le polypeptide est injecté chez un groupe de mammifères (par exemple souris, rats, lapins, moutons ou chèvres). Dans cette étape, les polypeptides de la présente invention peuvent servir d'immunogènes sans modification.

Alternativement, et particulièrement pour des peptides de petite taille, une réponse immunitaire supérieure peut être induite si le polypeptide est joint à une protéine de transport comme l'albumine de sérum bovin ou l'hémocyanine de patelle. L'immunogène est injecté chez l'animal hôte, de préférence selon un schéma prédéterminé, et les animaux sont saignés périodiquement. Des anticorps polyclonaux spécifiques du polypeptide peuvent ainsi être purifiés à partir de tels antisérums, par exemple par chromatographie d'affinité en utilisant le peptide couplé à un support solide adéquat.

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Protéinesde fusion : N'importe quel gène de fusion peut être réalisé par l'homme du métier pour analyser la localisation sub-cellulaire d'une protéine selon l'invention, en particulier la localisation sub-cellulaire de la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10. De nombreuses constructions plasmidiques sont disponibles commercialement comme la protéine Glutathione S Transférase (GST) ou des protéines fluorescentes comme la Green Fluorescent Protein (GFP) ou encore et de manière non exhaustive un marquage polyHistidine.

Des cellules hôtes eucaryotes humaines (par exemple HEK-293) sont sous-cultivées durant 24 h avant le protocole de transfection permettant un métabolisme normal des cellules et une meilleure efficacité de transfection. Des concentrations croissantes (1,5 et 10 g) de vecteur seul contenant la protéine révélatrice (GFP, GST ou Tag Histidine) ou de vecteur contenant le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 8 ou le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 9 fusionnée avec la protéine révélatrice ont été réalisées en utilisant le réactif Effectene selon les recommandations du fabricant (Qiagen).

Les cellules sont ensuite analysées par microscopie confocale, par exemple, pour détecter la localisation de la protéine. Si la protéine est suspectée d'être sécrétée par exemple, les surnageants sont récupérés, lyophilisés, déposé sur gel d'acrylamide et analysés par la technique de Western blot à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine révélatrice.

Compositions pharmaceutiques : Selon certains aspects de l'invention, des produits tels que des polypeptides, anticorps et/ou acides nucléiques peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques ou des vaccins. Les compositions pharmaceutiques comprennent un ou plusieurs de ces produits et un ou des excipients (transporteurs) pharmaceutiquement acceptables.

Certaines compositions pharmaceutiques éventuellement utilisables comme vaccins pourront comprendre un ou plusieurs polypeptides et un activateur de la réponse immunitaire, comme un adjuvant ou un liposome (dans lequel le produit est incorporé).

Les compositions pharmaceutiques et les vaccins peuvent de plus contenir un système d'administration, comme des microsphères biodégradables (et par exemple les microsphères composées de copolymères d'acide lactique et d'acide glycolique ou PLGA). Les compositions pharmaceutiques et les vaccins dans l'étendue de la

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divulgation de la présente invention peuvent également contenir d'autres produits pouvant être biologiquement actifs ou inactifs.

Une composition pharmaceutique ou un vaccin peut contenir de l'ADN codant pour un ou plusieurs polypeptides comme décrit ci-dessus, de telle sorte que le polypeptide est généré in situ. Comme mentionné précédemment, l'ADN peut être présent sous n'importe quelle forme d'administration connue de l'homme du métier, y compris des systèmes d'expression d'acides nucléiques, bactériens ou viraux. Les systèmes d'expression d'acides nucléiques appropriés contiennent les séquences d'ADN nécessaires pour l'expression chez le patient.

Les systèmes d'administration basés sur une bactérie impliquent l'administration de bacterium (comme Bacillus-Cahnette-Guerrin) qui exprime une portion immunogène du polypeptide à sa surface. De préférence, l'ADN peut être introduit en utilisant un système d'expression viral (par exemple un pox virus, un rétrovirus ou un adénovirus) impliquant l'utilisation d'agents non pathogènes (défectif).

Bien que tout transporteur adéquat connu de l'homme du métier puisse être employé dans des compositions pharmaceutiques de cette invention, le type de transporteur variera selon le mode d'administration choisi. Les compositions de la présente invention pourront être formulées pour chaque mode d'administration approprié, y compris, par exemple, les voies topique, nasale, intraveineuse, intra-craniale, intra-péritonéale, sous-cutanée et intramusculaire.

Pour une administration parentérale, comme une injection sous-cutanée, le transporteur contient de préférence de l'eau, du sel, de l'alcool, de la graisse, de la paraffine ou un tampon. Pour une administration orale, tout transporteur cité ci-dessus ou un transporteur solide, comme du mannitol, du lactose, de l'amidon, du stéarate de magnésium, du talc, de la cellulose, du glucose, du sucrose et du carbonate de magnésium peut être employé. Des microsphères biodégradables peuvent aussi être utilisées comme transporteurs pour les compositions pharmaceutiques de cette invention. Pour certaines applications topiques, des formulations comme des crèmes ou des lotions sont préférées.

De telles compositions peuvent également comprendre des tampons (par exemple des solutions salines tamponnées neutres ou phosphate), des carbohydrates (par exemple du glucose, du mannose, du sucrose ou des dextranes), du mannitol, des protéines, des polypeptides ou des acides aminés comme la glycine, des antioxydants, des agents chélateurs comme l'EDTA ou la glutathione, des adjuvants (par exemple de l'hydroxyde d'aluminium) et/ou des agents protecteurs. Alternativement, les

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compositions de la présente invention peuvent se présenter sous forme d'un lyophilisat.

Des produits peuvent également être encapsulés dans des liposomes en utilisant des technologies classiques.

Selon l'invention, chacune des variétés d'adjuvants peut être utilisée dans des vaccins pour induire la réponse immunitaire. La plupart des adjuvants contient une substance protégeant l'antigène d'un catabolisme rapide, comme l'hydroxyde d'aluminium ou l'huile minérale et un stimulateur des réponses immunitaires comme le lipide A, des protéines dérivées de Bordetella Pertussis ou Mycobacteium tuberculosis. Des adjuvants adéquats sont commercialement disponibles comme, par exemple : l'adjuvant de Freund et l'adjuvant complet (Difco Laboratories, Detroit, MIY, Etats-Unis ; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ, Etats-Unis)), des microsphères biodégradables ; le lipide A monophosphoryle ; des cytokines comme le GM-CSF ou l'interleukine-2, -7 ou-12.

Les compositions décrites ci-dessus peuvent également être administrées sous forme de formulations retard (i. e. une formulation comme une capsule ou une éponge qui déclenche la libération lente du produit après administration). De telles formulations peuvent généralement être préparées en utilisant des technologies bien connues de l'homme du métier et administrées, par exemple, par voie orale, rectale ou en implantation sous-cutanée ou par implantation sur le site cible désiré. Les formulations retard peuvent contenir un polypeptide, un polynucléotide ou un anticorps dispersé dans une matrice transporteuse et/ou contenu dans un réservoir protégé par une membrane de diffusion. Les transporteurs pour l'utilisation de telles formulations sont biocompatibles et doivent également être biodégradables ; de préférence la formulation fournit un niveau relativement constant de la libération du composant actif. La quantité de produit actifcontenue dans la formulation retard dépend du site d'implantation.

Thérapie~ anticancéreuse Selon d'autres aspects de la présente invention, les produits décrits peuvent être utilisés en thérapie anticancéreuse. En particulier, les polynucléotides et polypeptides associés à la fixation du GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire peuvent être utilisés pour inhiber la croissance et induire une modulation de la prolifération cellulaire dans des tumeurs spécifiques du sein, de la prostate ou du cancer du poumon.

De tels polypeptides ou polynucléotides peuvent également être utilisés pour la thérapie de nombreux carcinomes incluant les mélanomes, les formes multiples de

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glioblastomes, les carcinomes du poumon ainsi que les cancers colorectaux. Des agents qui activent l'expression de tels polypeptides ou polynucléotides peuvent également être employés dans le cadre de ces thérapies.

Selon ces aspects de l'invention, les produits (pouvant être des polypeptides ou des acides nucléiques) sont de préférence incorporés dans des compositions pharmaceutiques comme décrit ci-dessus.

Les patients adéquats pour la thérapie sont tous les animaux à sang chaud, et de préférence l'être humain. Un patient éligible pour une thérapie selon l'invention peut ou non être diagnostiqué comme étant affecté par un cancer. Autrement dit, les compositions pharmaceutiques décrites ci-dessus peuvent ainsi être utilisées pour inhiber le développement d'un cancer à différents stades de la maladie (pour prévenir l'apparition d'un cancer ou pour traiter un patient affecté par un cancer).

Les compositions pharmaceutiques de la présente invention seront administrées de manière appropriée pour chaque cancer spécifique à traiter.

La voie, la durée et la fréquence d'administration seront déterminées en fonction de l'état du patient, du type et de la sévérité de la maladie, et de la méthode d'administration. Les voies et fréquences d'administration peuvent varier d'un individu à l'autre. En général, les compositions pharmaceutiques et les vaccins peuvent être administrés par injection (par exemple par la voie intra-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou sous-cutanée), par voie intra-nasale (par exemple par inhalation) ou par voie orale. De préférence, entre 1 et 10 doses peuvent être administrées sur une période de 52 semaines. Des protocoles alternatifs peuvent être appropriés pour chaque patient individuellement.

En général, un dosage approprié et un régime de traitement contiennent le produit actif en quantité suffisante pour fournir un bénéfice thérapeutique et/ou prophylactique. Une telle réponse peut être suivie par l'établissement d'un devenir clinique amélioré (par exemple des rémissions plus fréquentes, une survie en absence de la maladie complète, partielle ou plus longue) chez les patients traités comparés aux patients non traités ou traités par des doses moindres.

Selon d'autres aspects de la présente invention, un polypeptide peut être administré à des doses variant de 100 g à 5 mg. Les molécules d'ADN codant pour de tels polypeptides peuvent généralement être administrées en quantité suffisante pour générer des niveaux comparables de polypeptides. Des dosages appropriés peuvent généralement être déterminés en utilisant des modèles expérimentaux et/ou des essais

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cliniques. En général, l'utilisation de la dose minimum suffisante pour fournir une thérapie efficace est préférée. Les patients peuvent généralement être suivis en ce qui concerne l'efficacité de la thérapie en utilisant des essais adéquats pour les conditions de traitement ou de prévention qui apparaîtront familiers à l'homme du métier.

A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention.

Les exemples suivants sont présentés pour illustrer les procédures ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention.

EXEMPLES Exemple 1 : clonage de l'ADNc codant pour l'hétérocarpine 1.1) Extraction des ARNsà partir des cellules dePilocarpus Heterophyllus: Les cellules en culture sont conservés à-80 C avant les étapes d'extraction des ARNs totaux. L'extraction des ARNs totaux est basée sur une technique décrite dans la littérature scientifique (Chomczynski et Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162,156) à l'aide du réactif Trizol (Gibco/BRL). La qualité des ARNs ainsi extraits est analysée sur gel d'agarose 1 % en présence de bromure d'éthidium.

1.2) Synthèse des ADNc par transcription inverse : Les ARNs sont rétro-transcrits selon deux modes opératoires différents afin de dissocier et de favoriser les transcriptions inverses des parties 5' et 3' des ARNs à l'aide du kit SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech).

1. 3) Design . et synthèse ~ des .amorces pour, la .réaction --de- polymérisation en~ chaîne (PCR): L'amplification des 2 séquences spécifiques de l'ADNc de l'hétérocarpine a été réalisée par réaction de polymérisation en chaine (PCR) sur les produits de la transcription inverse en utilisant l'amorce Revl pour les produits d'ADNc spécifiques 5' et l'amorce

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Fwdl pour les produits d'ADNc spécifiques 3' de séquences respectives SEQ. ID. NO. 4 et SEQ. ID. NO. 5.

Les séquences SEQ. ID. NO. 4 et SEQ. ID. NO. 5 sont les suivantes : - SEQ. ID. NO. 4 : 5'-TCC AAG CAG CAA AAA CTA GTG ACC CAG GGG CCA TTA TAT CT-3' - SEQ. ID. NO. 5 : 5'-CGG TAT GGA CGC GGC TAT TGC TGA TGG TGT TGA TGT AA-3'

1.4) B.?,q.ç!.(Q/1. d(}.PQly.mr.(g!.(Q-'J..?.ll.ç,b.qJnf:. #çJ?) et résultats~; Les conditions de réaction incluent 0,2 M de Fwdl pour les produits d'ADNc spécifiques 3' et 0,2 M de Revl pour les produits d'ADNc spécifiques 5', 200 M dNTPs, 40 mM Tricine-KOH (pH 8,7), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)2, 3,75 g/ml BSA, 0,005% Tween-20,0,005% Nonidet-P40, et 0,5 U Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 l. Les réactions de PCR sont réalisées sur un thermocycleur Perkin-Elmer 9700 en utilisant les paramètres de cycles thermiques suivants : 5 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 72 C, 5 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 70 C pendant 10 s, et une extension de polymérisation à 72 C pendant 3 minutes et enfin 25 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 68 C pendant 10 s, et une extension de polymérisation à 72 C pendant 3 minutes.

Les produits obtenus par la PCR sont séparés sur gel d'agarose 1 % et visualisés à l'aide d'une coloration au bromure d'éthidium.

Les séquences en acides nucléiques des produits de PCR d'ADNc spécifiques 5' et spécifiques 3' sont déterminées à l'aide d'un séquenceur automatique. Il s'agit respectivement des séquences SEQ. ID. NO. 6 et SEQ. ID. NO. 7 reproduites ci-après : - SEQ. ID. NO. 6 :
1 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacgcg gggatgcccc
61 aagctaattc ttatcttttt tctttctttt tgttgttgtt ttgtcaaagc agcaatgagg
121 tctaggaatg gtgttcttca tttattcctt ttcgttcttg catggcttct gttggcggct
181 ctccatgcta actcaagttc ggatgagaga tcaacatata tagttcatat ggacaagacc
241 catatgccca aaaccttctc tagcccccac cattggtact cttcggtcgt tcgatccctc

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301 aagtctacaa agccaaccaa attaaatcgc cgtcgatcct caccacttct tgtatactct
361 tacgacaatg ctgctcatgg tttcagtgca gttttatctc aacaggaact tgaaactcta
421 aaaaagtctc caggtttcgt ctcagtttat gccgataaga cagcgacact tgacaccacc
481 catacacctg aatttctctc cctgaatact gccaacgggt tgtggcctgc ttcaaagtat
541 ggtgaagata taattgttgg tgttattgac agcggtgtct ggccggagag tgaaagttat
601 aatgatgatg gtatgggcgc tattccaagc agatggaagg gagaatgtga agctggacaa
661 gagttcaatt cctccatgtg caactcaaag cttattggag ctagatattt cgataagggt
721 atcattgcgg caaatcctgg gattaacatt agcatgaaat ctgccagaga tactatgggg
781 catgggactc acacatcctc cacagttgct gggaattatg tggatggcgt ttcattcttt
841 ggctatgcta aaggtacagc aaaaggagtg gcaccacggg cgagagtggc tatgtacaag
901 gtcatttttg acgaagggcg ctatgcatct gatgttcttg ccggtatgga cgcggctatt
961 gctgatggtg ttgatgtaat ttcaatatca atgggatttg atgagacccc gttgtatgaa 1021 gatcctatag caattgcctc attcgctgct acagagaagg gcgtagtggt ctcatcttca 1081 gcaggaaatg cagggccagc gctagggagc ttgcacaatg gaatcccatg gacgttaact 1141 gttgcagctg gaaccattga ccgttcattt gcaggcacta taactcttgg gagtggggaa 1201 accatcattg gatggacaat gttcccagcc agtgcttatg tagcagactt gccactgctt 1261 tataacaaga cttactctgc atgcaactca actcgattat tatctcaact ccgaactgac 1321 gccatcatcg tatgcgaaga agctgaagat tcggtatctg agcaaatatc tgttgtcagt 1381 gcatcgaaca ttcggggagc catatttgtt tcagattatg atgctgaatt atttgaactt 1441 ggtggtgtga ctattcctgg tgtcgtgatt agcaccaagg atgcaccggc tgtgatcagc 1501 tacgccagca atgatgtgaa acctaaggca agcatcaagt tccaacaaac tgttctgggc 1561 acaaagcctg caccagccgt ggctttctat acttctagag gtccgtcacc gagctatcca 1621 ggcatcttaa agccagatat aatggcccct gggtcactag tttttgctgc ttgga - SEQ. ID. NO. 7 :
1 cggtatggac gcggctattg ctgatggtgt tgatgtaatt tcaatatcaa tgggatttga
61 tgagaccccg ttgtatgaag atcctatagc aattgcctca ttcgctgcta cagagaaggg
121 cgtagtggtc tcatcttcag caggaaatgc agggccagcg ctagggagct tgcacaatgg
181 aatcccatgg acgttaactg ttgcagctgg aaccattgac cgttcatttg caggcactat

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241 aactcttggg agtggggaaa ccatcattgg atggacaatg ttcccagcca gtgcttatgt
301 agcagacttg ccactgcttt ataacaagac ttactctgca tgcaactcaa ctcgattatt
361 atctcaactc cgaactgacg ccatcatcgt atgcgaagaa gctgaagatt cggtatctga
421 gcaaatatct gttgtcagtg catcgaacat tcggggagcc atatttgttt cagattatga
481 tgctgaatta tttgaacttg gtggtgtgac tattcctggt gtcgtgatta gcaccaagga
541 tgcaccggct gtgatcagct acgccagcaa tgatgtgaaa cctaaggcaa gcatcaagtt
601 ccaacaaact gttctgggca caaagcctgc accagccgtg gctttctata cttctagagg
661 tccgtcaccg agctatccag gcatcttaaa gccagatata atggcccctg ggtcactagt
721 ttttgctgct tggattccaa atactgctac agcccaaatt ggtttgaata ccctcttgac
781 aagtgaatac aatatggttt ctggaacatc aatggcctgc cctcatgctg ctggtgtagc
841 tgctctcctt aagggcgcac accctgaatg gagtgcagct gctattaggt ctgcaatgat
901 gactacagca aatcccttgg ataacacact aaatccaatc cgggacaatg gtctaatcaa
961 tttcacatct gcttcacctt tagctatggg agccggccaa gttgatccta atcgggcact 1021 tgatcctggt ttgatttatg aaaccacccc acaagattat gtgagcctcc tctgcactct 1081 gaacttcacc caaaaccaaa tcctgtccat tacaagatca aaccgttaca gctgctccac 1141 ccctaatcct gatcttaact atccttcttt tattacttta cactacaaca caaatgcaac 1201 atttgttcag acttttcaca ggactgtgac taacgttgga ggaagcgcta caacttacaa 1261 ggccaagatc actgctcctc taggttctgt agttagtgtc tcaccagaca cattggcctt 1321 cagaaagcag tatgagcagc agagctacga gctcactatt gagtacaagc ctgatggtga 1381 agaaactgtt tcatttgggg aacttgtttg gattgaagaa aatgggaatc acactgtgag 1441 gagccctatt acagtgtcac cttccatgag taactttgtg tttatgggta cacaataatt 1501 gataaaaatt tgttctgatc acaactgtgg gaataatcga cgtttatgaa cccagaataa 1561 gttgtttggt cgtcttcaac attatcataa aggacttgaa tcatgtgtgt tgattttctg 1621 caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtactctg cgttgatacc actgcttgcc ctatagtgag 1681 tcgtattag

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Les séquences chevauchantes SEQ. ID. NO. 6 et SEQ. ID. NO. 7 permettent de déduire la séquence complète de l'ADNc de séquence SEQ. ID. NO. 8 codant pour l'hétérocarpine. La séquence SEQ. ID. NO. 8 est reproduite ci-après : - SEQ. ID. NO. 8 :
1 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacgcg gggatgcccc
61 aagctaattc ttatcttttt tctttctttt tgttgttgtt ttgtcaaagc agcaatgagg
121 tctaggaatg gtgttcttca tttattcctt ttcgttcttg catggcttct gttggcggct
181 ctccatgcta actcaagttc ggatgagaga tcaacatata tagttcatat ggacaagacc
241 catatgccca aaaccttctc tagcccccac cattggtact cttcggtcgt tcgatccctc
301 aagtctacaa agccaaccaa attaaatcgc cgtcgatcct caccacttct tgtatactct
361 tacgacaatg ctgctcatgg tttcagtgca gttttatctc aacaggaact tgaaactcta
421 aaaaagtctc caggtttcgt ctcagtttat gccgataaga cagcgacact tgacaccacc
481 catacacctg aatttctctc cctgaatact gccaacgggt tgtggcctgc ttcaaagtat
541 ggtgaagata taattgttgg tgttattgac agcggtgtct ggccggagag tgaaagttat
601 aatgatgatg gtatgggcgc tattccaagc agatggaagg gagaatgtga agctggacaa
661 gagttcaatt cctccatgtg caactcaaag cttattggag ctagatattt cgataagggt
721 atcattgcgg caaatcctgg gattaacatt agcatgaaat ctgccagaga tactatgggg
781 catgggactc acacatcctc cacagttgct gggaattatg tggatggcgt ttcattcttt
841 ggctatgcta aaggtacagc aaaaggagtg gcaccacggg cgagagtggc tatgtacaag
901 gtcatttttg acgaagggcg ctatgcatct gatgttcttg ccggtatgga cgcggctatt
961 gctgatggtg ttgatgtaat ttcaatatca atgggatttg atgagacccc gttgtatgaa 1021 gatcctatag caattgcctc attcgctgct acagagaagg gcgtagtggt ctcatcttca 1081 gcaggaaatg cagggccagc gctagggagc ttgcacaatg gaatcccatg gacgttaact 1141 gttgcagctg gaaccattga ccgttcattt gcaggcacta taactcttgg gagtggggaa 1201 accatcattg gatggacaat gttcccagcc agtgcttatg tagcagactt gccactgctt 1261 tataacaaga cttactctgc atgcaactca actcgattat tatctcaact ccgaactgac 1321 gccatcatcg tatgcgaaga agctgaagat tcggtatctg agcaaatatc tgttgtcagt 1381 gcatcgaaca ttcggggagc catatttgtt tcagattatg atgctgaatt atttgaactt

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1441 ggtggtgtga ctattcctgg tgtcgtgatt agcaccaagg atgcaccggc tgtgatcagc 1501 tacgccagca atgatgtgaa acctaaggca agcatcaagt tccaacaaac tgttctgggc 1561 acaaagcctg caccagccgt ggctttctat acttctagag gtccgtcacc gagctatcca 1621 ggcatcttaa agccagatat aatggcccct gggtcactag tttttgctgc ttggattcca 1681 aatactgcta cagcccaaat tggtttgaat accctcttga caagtgaata caatatggtt 1741 tctggaacat caatggcctg ccctcatgct gctggtgtag ctgctctcct taagggcgca 1801 caccctgaat ggagtgcagc tgctattagg tctgcaatga tgactacagc aaatcccttg 1861 gataacacac taaatccaat ccgggacaat ggtctaatca atttcacatc tgcttcacct 1921 ttagctatgg gagccggcca agttgatcct aatcgggcac ttgatcctgg tttgatttat 1981 gaaaccaccc cacaagatta tgtgagcctc ctctgcactc tgaacttcac ccaaaaccaa 2041 atcctgtcca ttacaagatc aaaccgttac agctgctcca cccctaatcc tgatcttaac 2101 tatccttctt ttattacttt acactacaac acaaatgcaa catttgttca gacttttcac 2161 aggactgtga ctaacgttgg aggaagcgct acaacttaca aggccaagat cactgctcct 2221 ctaggttctg tagttagtgt ctcaccagac acattggcct tcagaaagca gtatgagcag 2281 cagagctacg agctcactat tgagtacaag cctgatggtg aagaaactgt ttcatttggg 2341 gaacttgttt ggattgaaga aaatgggaat cacactgtga ggagccctat tacagtgtca 2401 ccttccatga gtaactttgt gtttatgggt acacaataat tgataaaaat ttgttctgat 2461 cacaactgtg ggaataatcg acgtttatga acccagaata agttgtttgg tcgtcttcaa 2521 cattatcata aaggacttga atcatgtgtg ttgattttct gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2581 aaagtactct gcgttgatac cactgcttgc cctatagtga gtcgtattag Dans la séquence SEQ. ID. NO. 8, l'on observe une phase ouverte de lecture avec la présence d'un codon initiateur (ATG) codant pour une méthionine initiatrice en position 115 et d'un codon stop (UAA) en position 2437. Le polynucléotide contenant la séquence codant pour l'hétérocarpine correspond à la séquence SEQ. ID. NO. 9, reproduite ci-après : - SEQ. ID. NO. 9 :
1 atgaggtcta ggaatggtgt tcttcattta ttccttttcg ttcttgcatg gcttctgttg
61 gcggctctcc atgctaactc aagttcggat gagagatcaa catatatagt tcatatggac

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121 aagacccata tgcccaaaac cttctctagc ccccaccatt ggtactcttc ggtcgttcga
181 tccctcaagt ctacaaagcc aaccaaatta aatcgccgtc gatcctcacc acttcttgta
241 tactcttacg acaatgctgc tcatggtttc agtgcagttt tatctcaaca ggaacttgaa
301 actctaaaaa agtctccagg tttcgtctca gtttatgccg ataagacagc gacacttgac
361 accacccata cacctgaatt tctctccctg aatactgcca acgggttgtg gcctgcttca
421 aagtatggtg aagatataat tgttggtgtt attgacagcg gtgtctggcc ggagagtgaa
481 agttataatg atgatggtat gggcgctatt ccaagcagat ggaagggaga atgtgaagct
541 ggacaagagt tcaattcctc catgtgcaac tcaaagctta ttggagctag atatttcgat
601 aagggtatca ttgcggcaaa tcctgggatt aacattagca tgaaatctgc cagagatact
661 atggggcatg ggactcacac atcctccaca gttgctggga attatgtgga tggcgtttca
721 ttctttggct atgctaaagg tacagcaaaa ggagtggcac cacgggcgag agtggctatg
781 tacaaggtca tttttgacga agggcgctat gcatctgatg ttcttgccgg tatggacgcg
841 gctattgctg atggtgttga tgtaatttca atatcaatgg gatttgatga gaccccgttg
901 tatgaagatc ctatagcaat tgcctcattc gctgctacag agaagggcgt agtggtctca
961 tcttcagcag gaaatgcagg gccagcgcta gggagcttgc acaatggaat cccatggacg 1021 ttaactgttg cagctggaac cattgaccgt tcatttgcag gcactataac tcttgggagt 1081 ggggaaacca tcattggatg gacaatgttc ccagccagtg cttatgtagc agacttgcca 1141 ctgctttata acaagactta ctctgcatgc aactcaactc gattattatc tcaactccga 1201 actgacgcca tcatcgtatg cgaagaagct gaagattcgg tatctgagca aatatctgtt 1261 gtcagtgcat cgaacattcg gggagccata tttgtttcag attatgatgc tgaattattt 1321 gaacttggtg gtgtgactat tcctggtgtc gtgattagca ccaaggatgc accggctgtg 1381 atcagctacg ccagcaatga tgtgaaacct aaggcaagca tcaagttcca acaaactgtt 1441 ctgggcacaa agcctgcacc agccgtggct ttctatactt ctagaggtcc gtcaccgagc

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1501 tatccaggca tcttaaagcc agatataatg gcccctgggt cactagtttt tgctgcttgg 1561 attccaaata ctgctacagc ccaaattggt ttgaataccc tcttgacaag tgaatacaat 1621 atggtttctg gaacatcaat ggcctgccct catgctgctg gtgtagctgc tctccttaag 1681 ggcgcacacc ctgaatggag tgcagctgct attaggtctg caatgatgac tacagcaaat 1741 cccttggata acacactaaa tccaatccgg gacaatggtc taatcaattt cacatctgct 1801 tcacctttag ctatgggagc cggccaagtt gatcctaatc gggcacttga tcctggtttg 1861 atttatgaaa ccaccccaca agattatgtg agcctcctct gcactctgaa cttcacccaa 1921 aaccaaatcc tgtccattac aagatcaaac cgttacagct gctccacccc taatcctgat 1981 cttaactatc cttcttttat tactttacac tacaacacaa atgcaacatt tgttcagact 2041 tttcacagga ctgtgactaa cgttggagga agcgctacaa cttacaaggc caagatcact 2101 gctcctctag gttctgtagt tagtgtctca ccagacacat tggccttcag aaagcagtat 2161 gagcagcaga gctacgagct cactattgag tacaagcctgatggtgaaga aactgtttca 2221 tttggggaac ttgtttggat tgaagaaaat gggaatcaca ctgtgaggag ccctattaca 2281 gtgtcacctt ccatgagtaa ctttgtgttt atgggtacac aataa Au polynucléotide ainsi traduit correspond une protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10, composée de 774 acides aminés et reproduite ci-après : - SEQ. ID. NO. 10 : 1MRSRNGVLHLFLFVLAWLLLAALHANSSSD 31ERSTYIVHMDKTHMPKTFSSPHHWYSSVVR 61SLKSTKPTKLNRRRSSPLLVYSYDNAAHGF 91 S A V L S Q Q E L E T L K K S P G F V S V Y A D K T A T L D 121 T T H T P E F L S L N T A N G L W P A S K Y G E D I I V G V

151 I D S G V W P E S E S Y N D D G M G A I P S R W K G E C E A 181 G Q E F N S S M C N S K L I G A R Y F D K G I I A A N P G 211 N I S M K S A R D T M G H G T H T S S T V A G N Y V D G V S

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241 F F G Y A K G T A K G V A P R A R V A M Y K V I F D E G R Y 271 A S D V L A G M D A A I A D G V D V I S I S M G F D E T P L 301 Y E D P I A I A S F A A T E K G V V V S S S A G N A G P A L 331 G S L H N G I P W T L T V A A G T I D R S F A G T I T L G 361 G E T I I G W T M F P A S A Y V A D L P L L Y N K T Y S A C 391 N S T R L L S Q L R T D A I I V C E E A E D S V S E Q I S V 421 V S A S N I R G A I F V S D Y D A E L F E L G G V T I P G V 451 V I S T K D A P A V I S Y A S N D V K P K A S I K F Q Q T V 481 L G T K P A P A V A F Y T S R G P S P S Y P G I L K P D I M 511 A P G S L V F A A W I P N T A T A Q I G L N T L L T S E Y N 541 M V S G T S M A C P H A A G V A A L L K G A H P E W S A A A
571 I R S A M M T T A N P L D N T L N P I R D N G L I N F T S A 601 S P L A M G A G Q V D P N R A L D P G L I Y E T T P Q D Y V 631 S L L C T L N F T Q N Q I L S I T R S N R Y S C S T P N P D 661 L N Y P S F I T L H Y N T N A T F V Q T F H R T V T N V G G 691 S A T T Y K A K I T A P L G S V V S V S P D T L A F R K Q Y 721 E Q Q S Y E L T I E Y K P D G E E T V S F G E L V W I E E N 751 G N H T V R S P I T V S P S M S N F V F M G T Q Exemple 2 : préparation de l'ADNc complet codant pour l'hétérocarpine pour une production d'hétérocarpine recombinante : 2.1) Préparation des ARNs à partir de culture de cellules de Pilocarpus Heterophyllus: Les cellules en culture sont conservés à -80 C avant les étapes d'extraction des ARNs totaux. L'extraction des ARNs totaux est basée sur une technique décrite dans la littérature scientifique (Chomczynski et Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162,156) à l'aide du réactifTrizol (Gibco/BRL). La qualité des ARNs ainsi extraits est analysée sur gel d'agarose 1 % en présence de bromure d'éthidium.

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2. 2) Transcription inverse à partir des ARN: Les ARNs totaux sont transcrits de manière inverse avec des amorces Oligo (dT) utilisant la transcriptase inverse Superscript comme suggéré dans le manuel du fabricant (Gibco/BRL).

2.3) R?.C!.çÜQ,lJ.. 4 'p'Q,lymr.i$'c!.(Q,ll. 1l- çljÇ{!!!f- (rr;;v. sur les produits, obtenus à partir de. la transcription, inverse : L'amplification de l'ADNc de l'hétérocarpine a été réalisée par réaction de polymérisation en chaine (PCR) sur les produits de la transcription inverse en utilisant l'amorce Fwd2 et Rev2 de séquences respectives SEQ. ID. NO. 11et SEQ. ID. NO. 12.

Les séquences SEQ. ID. NO. 11 et SEQ. ID. NO. 12 sont les suivantes : - SEQ. ID. NO. 11 : 5'-GGG GGA TCC GAG GTC TAG GAA TGG TGT TCT TCA-3' - SEQ. ID. NO. 12 : 5'-GGG CTC GAG TTG TGT ACC CAT AAA CAC AAA GTT ACT CAT GG-3' L'amorce Fwd2 correspond aux nucléotides 118 à 140 de SEQ. ID. NO. 8 et inclut un site BamHl (souligné) et trois nucléotides additionnels en partie 5' pour faciliter le clonage. L'amorce Rev2 correspond à la séquence complémentaire de la région contenant les nucléotides 2405 à 2436 de SEQ. ID. NO. 8 et inclut un site Xhol (souligné) et trois nucléotides additionnels en partie 5' pour faciliter le clonage.

Les conditions de réaction incluent 50 ng des ADNc produits de la réaction de transcription inverse décrite ci-dessus, 0,2 M de Fwd2 (SEQ. ID. NO. 11) et de Rev2 (SEQ. ID. NO. 12), 200 M dNTPs, 40 mM Tricine-KOH (pH 8,7), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(Oac),, 3,75 g/ml BSA, 0,005% Tween-20,0,005% Nonidet-P40, et 0,5 U Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 l. Les réactions de PCR sont réalisées sur un thermocycleur Perkin-Elmer 9700 en utilisant les paramètres de cycles thermiques suivants : 5 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 72 C, 5 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 70 C pendant 10 s, et une extension de polymérisation à 72 C pendant 3 minutes et enfin 25 cycles comprenant une dénaturation à 94 C pendant 5 s, une hybridation des amorces à 68 C pendant 10 s, et une extension de polymérisation à 72 C pendant 3 minutes.

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Les produits obtenus par la PCR sont séparés sur gel d'agarose 1% et visualisés à l'aide d'une coloration au bromure d'éthidium. Une bande d'environ 2,3 kb est obtenue.

La séquence en acides nucléiques du produit de PCR est vérifiée à l'aide d'un séquenceur automatique et correspond à la séquence SEQ. ID. NO. 9 ayant subi artificiellement une délétion du codon initiateur ATG afin de permettre l'expression de l'hétérocarpine recombinante à partir du vecteur pQE-TriSystem (Qiagen) en phase avec le site BamHl ainsi qu'une délétion du codon stop pour conserver la traduction en phase de la protéine et ainsi permettre la synthèse d'une séquence 8xHis dans la région C-terminale de l'hétérocarpine. Cette séquence correspond à la séquence SEQ. ID. NO. 13 reproduite ci-après : - SEQ. ID. NO. 13 :
1 gggggatccg aggtctagga atggtgttct tcatttattc cttttcgttc ttgcatggct
61 tctgttggcg gctctccatg ctaactcaag ttcggatgag agatcaacat atatagttca
121 tatggacaag acccatatgc ccaaaacctt ctctagcccc caccattggt actcttcggt
181 cgttcgatcc ctcaagtcta caaagccaac caaattaaat cgccgtcgat cctcaccact
241 tcttgtatac tcttacgaca atgctgctca tggtttcagt gcagttttat ctcaacagga
301 acttgaaact ctaaaaaagt ctccaggttt cgtctcagtt tatgccgata agacagcgac
361 acttgacacc acccatacac ctgaatttct ctccctgaat actgccaacg ggttgtggcc
421 tgcttcaaag tatggtgaag atataattgt tggtgttatt gacagcggtg tctggccgga
481 gagtgaaagt tataatgatg atggtatggg cgctattcca agcagatgga agggagaatg
541 tgaagctgga caagagttca attcctccat gtgcaactca aagcttattg gagctagata
601 tttcgataag ggtatcattg cggcaaatcc tgggattaac attagcatga aatctgccag
661 agatactatg gggcatggga ctcacacatc ctccacagtt gctgggaatt atgtggatgg
721 cgtttcattc tttggctatg ctaaaggtac agcaaaagga gtggcaccac gggcgagagt
781 ggctatgtac aaggtcattt ttgacgaagg gcgctatgca tctgatgttc ttgccggtat
841 ggacgcggct attgctgatg gtgttgatgt aatttcaata tcaatgggat ttgatgagac
901 cccgttgtat gaagatccta tagcaattgc ctcattcgct gctacagaga agggcgtagt
961 ggtctcatct tcagcaggaa atgcagggcc agcgctaggg agcttgcaca atggaatccc 1021 atggacgtta actgttgcag ctggaaccat tgaccgttca tttgcaggca ctataactct 1081 tgggagtggg gaaaccatca ttggatggac aatgttccca gccagtgctt atgtagcaga

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1141 cttgccactg ctttataaca agacttactc tgcatgcaac tcaactcgat tattatctca 1201 actccgaact gacgccatca tcgtatgcga agaagctgaa gattcggtat ctgagcaaat 1261 atctgttgtc agtgcatcga acattcgggg agccatattt gtttcagatt atgatgctga 1321 attatttgaa cttggtggtg tgactattcc tggtgtcgtg attagcacca aggatgcacc 1381 ggctgtgatc agctacgcca gcaatgatgt gaaacctaag gcaagcatca agttccaaca 1441 aactgttctg ggcacaaagc ctgcaccagc cgtggctttc tatacttcta gaggtccgtc 1501 accgagctat ccaggcatct taaagccaga tataatggcc cctgggtcac tagtttttgc 1561 tgcttggatt ccaaatactg ctacagccca aattggtttg aataccctct tgacaagtga 1621 atacaatatg gtttctggaa catcaatggc ctgccctcat gctgctggtg tagctgctct 1681 ccttaagggc gcacaccctg aatggagtgc agctgctatt aggtctgcaa tgatgactac 1741 agcaaatccc ttggataaca cactaaatcc aatccgggac aatggtctaa tcaatttcac 1801 atctgcttca cctttagcta tgggagccgg ccaagttgat cctaatcggg cacttgatcc 1861 tggtttgatt tatgaaacca ccccacaaga ttatgtgagc ctcctctgca ctctgaactt 1921 cacccaaaac caaatcctgt ccattacaag atcaaaccgt tacagctgct ccacccctaa 1981 tcctgatctt aactatcctt cttttattac tttacactac aacacaaatg caacatttgt 2041 tcagactttt cacaggactg tgactaacgt tggaggaagc gctacaactt acaaggccaa 2101 gatcactgct cctctaggtt ctgtagttag tgtctcacca gacacattgg ccttcagaaa 2161 gcagtatgag cagcagagct acgagctcac tattgagtac aagcctgatg gtgaagaaac 2221 tgtttcattt ggggaacttg tttggattga agaaaatggg aatcacactg tgaggagccc 2281 tattacagtg tcaccttcca tgagtaactt tgtgtttatg ggtacacaac tcgagccc Cette séquence code pour une protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14 reproduite ci-après : 1MAISRELVDPRSRNGVLHLFLFVLAWLLLA 31ALHANSSSDERSTYIVHMDKTHMPKTFSSP 61HHWYSSVVRSLKSTKPTKLNRRRSSPLLVY 91SYDNAAHGFSAVLSQQELETLKKSPGFVSV
121 YADKTATLDTTHTPEFLSLNTANGLWPASK
151 YGEDIIVGVIDSGVWPESESYNDDGMGAIP
181 SRWKGECEAGQEFNSSMCNSKLIGARYFDK
211 GIIAANPGINISMKSARDTMGHGTHTSSTV
241 A G N Y V D G VS F F G Y A K G T A K G V A P R A R V A M Y

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271 K V I F D E G R Y A S D V L A G M D A A I A D G V D V I S 301 S M G F D E T P L Y E D P I A I A FAATEKGVVVSS 331 S A G N A G P A L G S L H N G I P W T L T V A A G T I D R S 361 F A G T I T L G S G E T I I G W T M F P A S A Y V A D L P L 391 L Y N K T Y S A C N S T R L L S Q L R T D A I I V C E E A E 421 D S V S E Q I S V V S A S N I R G A I F V S D Y D A E L F E 451 L G G V T I P G V V I S T K D A P A V I S Y A S N D V K P K
481 A S I K F Q Q T V L G T K P A P A V A F Y T S R G P S P S Y 511 P G I L K P D I M A P G S L V F A A W I P N T A T A Q I G L 541 N T L L T S E Y N M V S G T S M A C P H A A G V A A L L K G 571 A H P E W S A A A I R S A M M T T A N P L D N T L N P I R D 601 N G L I N F T S A S P L A M G A G Q V D P N R A L D P G L 631 Y E T T P Q D Y V S L L C T L N F T Q N Q I L S I T R S N R 661 Y S C S T P N P D L N Y P S F I T L H Y N T N A T F V Q T F 691 H R T V T N V G G S A T T Y K A K I T A P L G S V V S V S P 721 D T L A F R K Q Y E Q Q S Y E L T I E Y K P D G E E T V S F 751 G E L V W I E E N G N H T V R S P I T V S P S M S N F V F M
781 G T Q L E H H H H H H H H Exemple 3 : production d'hétérocarpine recombinante par des bactéries : La partie de l'ADNc codant pour l'hétérocarpine est insérée aux sites BamHl/Xhol du vecteur d'expression pQE-TriSystem (Qiagen) et est exprimé en utilisant les bactéries E. coli M15 comme bactéries hôtes. 20 ml de milieu LB contenant 100 g/ml d'ampicilline et 25 g/ml de kanamycine sont inoculés et les bactéries mises à 37 C sous agitation pendant 12 h. A partir de cette culture, 1 litre de milieu LB contenant 100 ug/ml d'ampicilline et 25 ug/ml de kanamycine est inoculé et les bactéries sont mises sous agitation à 37 C jusqu'à l'obtention d'une densité optique à 600 nm de 0,6.

L'expression de l'hétérocarpine recombinante est réalisée par l'addition d'IPTG à la concentration finale de 1 mM pendant 4 à 5 h. Les bactéries sont ensuite récupérées par centrifugation à 4000xg pendant 20 min puis congelées dans l'azote liquide. Le culot est ensuite décongelé dans la glace pendant 15 min et suspendu dans un tampon de lyse pH 8,0 composé de 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl et 10 mM imidazole en présence de 1 mg/ml de lysozyme pendant 30 min dans la glace. La lyse est finalement complétée par une étape de sonication et les débris éliminés par centrifugation. Le lysat (4 ml) ainsi clarifié est mélangé avec 1 ml d'une suspension de matrice de nickel et mis en agitation à 4 C pendant 60 min. L'ensemble du milieu réactionnel est placé dans une colonne, lavé en présence de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 20 mM imidazole.

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L'hétérocarpine est finalement éluée avec 4x 0,5 ml de tampon constitué de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 250 mM imidazole.

Exemple 4 : productiond'Hétérocarpine recombinante par des cellules d'insectes infectées par le baculovirus : La partie de l'ADNc codant pour l'Hétérocarpine est insérée aux sites BamHl/Xhol du vecteur d'expression pQE-TriSystem (Qiagen). Le vecteur pQE-TriSystem contient les séquences virales de Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) permettant la recombinaison homologue. Le baculovirus recombinant contenant la séquence de l'hétérocarpine est préparé par co-transfection du vecteur pQE-TriSystem avec l'ADN linéarisé génomique du baculovirus dans des cellules d'insecte sf9 ou sf21 établies à partir de tissus ovarien de la larve Spodoptera frugiperda. Les cellules transfectées sont lavées avec du tampon phosphate et collectées par centrifugation à 1000xg pendant 5 min. Le culot est suspendu dans un tampon de lyse pH 8,0 composé de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 10 mM imidazole. La lyse est finallement complétée par une étape de sonication et les débris éliminés par centrifugation. Le lysat (4 ml) ainsi clarifié est mélangé avec 200 l d'une suspension de matrice de nickel et mis en agitation à 4 C pendant 60 min. L'ensemble du milieu réactionnel est placé dans une colonne, lavé en présence de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 20 mM imidazole. L'hétérocarpine est finalement éluée avec 4x 0,5 ml de tampon constitué de 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl et 250 mM imidazole.

Exemple 5: production d'Hétérocarpine recombinante par des cellules de mammifères : La partie de l'ADNc codant pour l'hétérocarpine est insérée aux sites BamHl/Xhol du vecteur d'expression pQE-TriSystem (Qiagen). Le vecteur pQE-TriSystem contient les séquences activatrices du cytomegalovirus (CMV) fusionnées au promoteur beta-actine de poulet permettant une expression hétérologue très importante. Des cellules humaines embryonnaires de rein (HEK-293) sont cultivées dans du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbeco) contenant 100 U/ml de pénicilline et 100 g/ml de sulfate de streptomycine, complémentée avec du sérum de veau f#tal à 10%. Les cellules sont sous-cultivées 24 h avant le protocole de transfection permettant un métabolisme normal des cellules et une meilleure efficacité de transfection. La transfection de 1 g de pQE-TriSystem contenant l'ADNc codant pour l'hétérocarpine a été réalisée en utilisant le réactif Effectene selon les recommandations du fabricant (Qiagen).

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Les cellules transfectées sont lavées avec du tampon phosphate et collectées par centrifugation à 1000xg pendant 5 min. Le culot est suspendu dans un tampon de lyse pH 8,0 composé de 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole en présence de 0,05% Tween 20. La lyse est finalement complétée par une étape de sonication et les débris éliminés par centrifugation. Le lysat (4 ml) ainsi clarifié est mélangé avec 200 l d'une suspension de matrice de nickel et mis en agitation à 4 C pendant 60 min. L'ensemble du milieu réactionnel est placé dans une colonne, lavé en présence de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 20 mM imidazole. L'hétérocarpine est finalement éluée avec 4x 0,5 ml de tampon constitué de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 250 mM imidazole.

Exemple 6 : mesure de la liaison au récepteur humain à GHRH : Transfections stables du récepteur humain à GHRH (hGHRH-R) : Les cellules humaines embryonnaires de reins, HEK-293, (une lignée cellulaire développée par le Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, New York) exprimant de manière stable le récepteur humain à GHRH ont été obtenues du Dr. Kelly Mayo (Northwestern University, Chicago, IL).

Culture cellulaire etpréparation membranaire : Les cellules HEK-293 transfectées de manière stable avec le récepteur humain à GHRH décrites ci-dessus sont cultivées en DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, forte teneur en glucose ; fourni par Life technologies) supplémenté avec 0,4 mg/ml de G418 (Life technologies) en présence de 10 % de sérum de veau f#tal et de 4 mM de L-glutamine (Life technologies). Les cellules sont homogénéisées dans le tampon A contenant 50 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM de chlorure de magnésium (MgCl2), 2 mM d'acide éthylèneglycol-bis(2-amino-éthyl)-N,N,N',N'-tétraacétique (EGTA) et 50 g/ml de bacitracine puis sont soumises à sonication dans le même tampon A. Les cellules ainsi homogénéisées sont centrifugées à 4 C à 39 000 g pendant 10 minutes, suspendues dans le tampon A et re-centrifugées à 4 C à 40 000 g pendant 10 minutes.

Les protéines totales membranaires sont quantifiées par la technique de Bradford. Les membranes culottées sont ainsi stockées à -80 C pour une utilisation ultérieure.

Test de liaison compétitive sur hGHRH-R : Les membranes des cellules HEK-293 transfectées de manière stable avec le récepteur humain à GHRH sont diluées à la concentration de 100 ug/ml dans le tampon réactionnel contenant 50 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM de MgCl2, 2 mM d'EGTA,

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50 ug/ml de bacitracine et 0,5 % d'albumine de sérum bovin (BSA). Les membranes sont incubées avec 0,05 nM de [125I]GHRH(1-44 amide) (Amersham) dans un volume final de 200 l en présence de concentrations croissantes d'hétérocarpine pendant 2 heures à 23 C. La réaction est arrêtée par une filtration rapide sur des filtres 96 puits GF/C pré-chargés à 0,1% en polyéthylènimine. Les filtres sont ensuite lavés trois fois à 4 C avec du tampon de lavage contenant 50 mM Tris (pH 7,4) en utilisant une station de filtration Packard 96 puits. Les filtres ainsi séchés sont submergés de 20 l de cocktail scintillant (Microscint 0, Packard) et sont soumis à un comptage sur le Topcount (Packard). L'activité non-spécifique est déterminée en présence de 100 nM de hGHRH. Une courbe dose-réponse est générée pour hGHRH (0,001 nM-100 nM) et permet de déterminer la concentration inhibitrice CI50 de protéine/ de polypeptide à laquelle 50% du GHRH humain n'est pas fixé sur le récepteur humain à GHRH.

Claims (18)

1. Revendications 1. Polynucléotide isolé comprenant la séquence SEQ. ID. NO. 8 ou un de ses fragments.
2. 2. Polynucléotide isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 8.
3. 3. Polynucléotide isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 9.
4. 4. Polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5, SEQ. ID. NO. 11 ou SEQ. ID. NO. 12.
5. 5. Polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 13.
6. 6. Polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ. ID. NO. 14 ou un de ses fragments.
7. 7. Polypeptide isolé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de séquence SEQ. ID. NO. 14.
8. 8. Vecteur d'expression contenant un polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 13.
9. 9. Cellule hôte transformée ou transfectée par un vecteur d'expression selon la revendication 8.
10. 10. Procédé de préparation d'un polypeptide isolé comprenant la protéine codée par la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou un des fragments de cette dernière ou bien par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou un des fragments de cette dernière, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, ladite méthode de préparation comprenant les étapes successives suivantes : (a) culture, dans des conditions convenables pour obtenir l'expression dudit polypeptide d'une cellule hôte transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13, la séquence complémentaire à la séquence polynucléotidique

    <Desc/Clms Page number 43>

    SEQ. ID. NO. 9 ou SEQ. ID. NO. 13 ou encore un des fragments de ces dernières, ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) isolement du polypeptide à partir des cultures de cellules hôtes.
11. 11. Anticorps ou fragment de liaison de l'antigène de celui-ci, qui fixe spécifiquement la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 10 ou la protéine de séquence SEQ. ID. NO. 14.
12. 12. En tant que médicament, un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3.
13. 13. En tant que médicament, un polypeptide selon la revendication 6 ou 7.
14. 14. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3.
15. 15. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un polypeptide selon la revendication 6 ou 7.
16. 16. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3 pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative.
17. 17. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 6 ou 7 pour préparer un médicament destiné à traiter une maladie proliférative.
18. 18. Méthode pour l'identification de composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire, laquelle comprend les étapes successives suivantes : (a) mise en contact de chaque composé candidat, dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre à l'agent candidat de se fixer au polypeptide, avec un polypeptide isolé comprenant : - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique

    SEQ. ID. NO. 9 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 9, - soit un fragment de la protéine codée par la séquence polynucléotidique

    SEQ. ID. NO. 13 ou par une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique SEQ. ID. NO. 13,

    <Desc/Clms Page number 44>

    ledit polypeptide isolé ayant au moins une activité immunologique et/ou biologique caractéristique d'une protéine fixant le GHRH humain et étant associée à la modulation de la prolifération cellulaire, et (b) détection de la fixation de chaque composé candidat audit polypeptide et identification, parmi les composés candidats, des composés susceptibles de fixer le GHRH humain et de moduler la prolifération cellulaire.