PL169168B1

PL169168B1 - S p o só b wytwarzani szczepionki przeciwnowotworowej PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL169168B1
Application number: PL91307930A
Authority: PL
Inventors: Alan N Houghton; Setaluri Vijayasaradhi
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1996-06-28
Also published as: HK1014732A1; FI924222A0; ES2141089T3; FI113786B; WO1991014775A1; GR3032804T3; NO311366B1; AU660412B2; FI924222L; JP3336006B2; AU7690691A; EP0965640A1; CA2078773C; HU218416B; EP0522078B1; PL169105B1; NZ237532A; IE20000918A1; CA2078773A1; CS76091A3

Abstract

1 . Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulujacej albo wzmagajacej wytwarzanie przeciwcial skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organizmie osobnika, któ- remu podaje sie szczepionke, znamienny tym, ze antygen gp 75 albo jego fragment o sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z nukleotydowej sekwencji cDNA jak przedstawiono w tabeli 2 izoluje sie i oczyszcza a nastepnie laczy sie taka ilosc wspomnianego antygenu lub jego fragmentu która skutecznie stymuluje lub wzmaga wytwarzanie przeciwcial w organizmie osobnika, dla którego przeznaczona jest szczepionka, ze skuteczna iloscia adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nosnikiem. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej. Szczepionka wytworzona sposobem według wynalazku, stymuluje albo wzmaga wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organiźmie osobnika, któremu się ją podaje. Służy ona do leczenia, zapobiegania rozwojowi lub do opóźniania nawrotów nowotworu, zwłaszcza czerniaka.

Identyfikacja molekularna immunogennych determinant na ludzkich komórkach nowotworowych stanowi podstawę do wyjaśnienia odpowiedzi immunologicznej na nowotwór. Przedmiotem szczególnego zainteresowania stały się dwie klasy antygenów na komórkach czerniaka ludzkiego jako cele rozpoznania immunologicznego:

1) unikalne antygeny wydzielane jedynie przez autologiczne komórki czerniaka oraz

2) antygeny różnicowania, wydzielane normalnie przez komórki wywodzące się z melanocytów. Pierwsza klasa antygenów jest opisana przez L. J. Old'a, 1981, „Cancer immunology: The search for specifity“, G. H. A. Clowes Memorial Lecture. Cancer Res. 1981,41,361), T. E. Carey'ai wsp. (Carey T. E. Takahashi T., Resnick L. A., Oettgen H. F. i L. J. Old: Cell surface anitgens of malignant melanoma. I. Mixed hemadsorption assay for humoral immunity to cultured autologous melanoma cells“, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1976, 73,3278), Real'a F. X. i wsp. (Real F. X., Nattes M. J., Houghton A. N., Oettgen H. F. Lloyd K. O. i Old L. J.,“, Class 1 (unique) antigens of human melanoma, Identyfication of a 90000 dalton cell surgace glycoprotein by autologous antibody“,

J. Exp. Med. 1984, 160, 1219).

Piśmiennictwo na temat drugiej klasy antygenów to: Houghton A. N. Taormina M. C., Ikeda H., Watanabe T., Oettgen H. F. i Old L. J. „Serological survey of normal humans for natural antibody to cell surface antigens of melanoma“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4260; Houghton A. N., Eisinger M., Albino A. P., Cairncross J. G., i Old L. J.: „Surface antigens of melanocytes and melanomas. Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets“,

J. Exp. Med., 1982,156,1755; Houghton A. N., Real F. X., Davis L. J. Cardon-Cardo C. i Old L. J.: „Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells“. J. Exp. Med. 1987,164,812. Antygeny różnicowania melanocytów definiuje się na podstawie ich powiązań z innymi dobrze zdefiniowanymi cechami fenotypowymi, ujawniającymi się podczas różnicowania się melanocytów, przy czym najbardziej wyraźną cechą jest synteza barwnika melaminy w melanosomach. Zagadnienie to jest opisane w następujących pracach: Houghton A. N., Eisinger M., Albino A. P., Cairncross J. G. i Old L. J., „Surface antigens of melanocytes and melanomas. Merkers of melanocyte differentiation and melanoma subsets“, J. Exp. Med., 1982, 156, 1755; Houghton A. N., Real F. X., Davis L. J., Cardon-Cardo C. i Old L. J., „Phenotypic heterogeneity of melanoma Relation to the differentiation program of melanoma cells“, J. Exp. Med. 1987, 164, 812.

169 168

W oparciu o obserwacje kliniczne sugeruje się, że odpowiedź immunologiczna na antygeny wydzielane przez normalne komórki barwnikowe może mieć wpływ na przebieg czerniaka przerzutowego. Bielactwo i niedobarwialność u pacjentów chorych na czerniaka szczególnie kojarzy się z dobrym prognozowaniem choroby. Donosi o tym wielu autorów: Nordlund J. J., Kirkwood J. M., Forget B. M., Milton G., Albert D. M., i Lerner A. B. „Vitiligo in patients with metastatic melanoma , a good prognosis sign . J . Am , Acad. DeraiatoL, 1983, 9, 689; BystrynJ. C. , Rigel D. , Friedman R. J. i Kopf A. „Prognostic significance of hypopigmentation in malignant melanoma. Arch. Dermatol. 1987, 123, 1053. Pod tym względem antygeny melanosomalne mogą być rozpoznawane przez układ immunologiczny.

Dowodem na to jest immunoprecypitacja antygenu gp 75 z autologicznych komórek czerniaka przez przeciwciała IgG surowicy pacjentów chorych na czerniaka przerzutowego. Doświadczenie to zostało opisane przez Matters'a J. M. i wsp. (Mattes J. M., Thomson T. M., Old L. J., i Lloyd

K. O., „A pigmentation - associated, dśfferentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum Int. J. Cancer. 1983, 32 717).

Antygen gp75 jest polipeptydem melanosomalnym, występującym w największej ilości jako glikoproteina syntetyzowana przez ubarwione melanocyty i komórki czerniaka (Tai T., Eisinger M., Ogata S i Lloyd K. O., „Glycoproteins as dśfferentiation markers in human malignant melanoma and melanocytes, Cancer Res. 1983, 43, 2773; obserwacje niepublikowane). Melanocyty naskórka, łagodne zmiany zabarwione oraz czerniaki pierwotne i przerzutowe wydzielają gp 75, lecz inne typy komórek nie wydzielają tego białka (Thompson T. M., Real F. X. Murakami S., Cardon-Cardo C., Old L. J. i Houghton A. N. „Differentation antigens of melanocytes and melanoma: Analisys of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermatolog. 1988, 90,459). Jak wykazują badania wykonane przez twórców wynalazku, cDNA antygenu gp 75 wykazuje identyczność w około 90% z wyprowadzonymi sekwencjami aminokwasowymi i sekwencjami nukleotydowymi genu mysiego występującego w locus b (brunatne). Locus brunatne jest miejscem determinującym barwę skóry lub powłoki i wpływającym na typ syntetyzowanej melaniny, co wskazuje na to, że gp 75 może regulować lub wpływać na typ syntetyzowanej melaminy.

Zjawisko immunoprecypitacji antygenu gp75 przez przeciwciała IgG w surowicy pacjentów chorych na czerniaka przerzutowego świadczy o tym, że możliwe jest przezwyciężenia tolerancji na gp 75.

W niniejszym wynalazku opracowano wektory ekspresyjne zawierające cDNA dla gp75, przeznaczone do stosowania jako szczepionka przeciw czerniakowi, przy czym określono sekwencje aminokwasowe peptydów na podstawie polipeptydu gp 75, który wyizolowano i oczyszczono z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego TA99, ponadto wyizolowano klony cDNA metodą skriningu z oligonukleotydami opartymi na tych sekwencjach peptydowych.

Na figurze 1 przedstawione są wyniki immunoprecypitacji i analizy składu peptydowego białek rozpoznawanych przez mAb TA99 i surowicę AU. A. Jednokierunkowa elektroforeza SDS-PAGE immunoprecypitatów ze znakowanych jodem ¹²⁵J lizatów SK-MEL-19 strącanych przeciwciałem mAb TA99 (pasmo 1), normalnej surowicy ludzkiej (pasmo 2) i z surowicy AU z 1/75 (pasmo 3) oraz z 10/76 (pasmo 4). B. Pasma odpowiadające gp 75 albo gp 75 traktowanemu Endo H/ (częściowo zdeglikozylowanemu) wycięte w żelu SDS-polSakryloamidowegr i analizowano skład peptydowy poprzez ograniczone trawienie proteazą V8 z S. aureus na SD-PAGE.

Znak oznacza gp 75, znak „ + oznacza gp 75 częściowo zdeglikozylowany przez Endo H.

Ekspozycja autoradiograficzna trwała 2 dni dla TA99 i 5 dni dla peptydów AU.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulującej albo wzmagającej wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp75 w organiźmie osobnika, któremu podaje się szczepionkę.

Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej polega na tym, że antygen gp 75, albo jego fragment o sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z nukleotydowej sekwencji cDNA jak przedstawiono w tabeli 2, izoluje się i oczyszcza a następnie łączy się taką ilość wspomnianego antygenu lub jego fragmentu, która skutecznie stymuluje lub wzmaga wytwarzanie przeciwciał w organiźmie osobnika, dla którego przeznaczona jest szczepionka, ze skuteczną ilością adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nośnikiem.

169 168

Udało się także wyizolować cząsteczkę kwasu nukleinowego, której sekwencja koduje sekwencję aminokwasową antygenu gp 75 lub jego fragmentu.

Sekwencję aminokwasową fragmentu gp 75 stanowią następujące sekwencje: asn-thr-val-glugly-tyr-ser-asp-pro-thr-ply-lys-tyr-asp-pro-ala-val;

met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu; oraz asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.

Ponadto wyizolowano także cDNA dla cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego gp 75 jak również fragment cząsteczki cDNA dla fragmentu kwasu nukleinowego kodującego gp 75. Fragment ten posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną w tabeli 2. Na podstawie tej sekwencji nukleotydowej wyprowadzono sekwencję aminokwasową.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się adiuwant wiążący gp 75. Stosuje się adiuwanty pochodzenia mikrobiologicznego albo inny dowolny środek farmaceutyczny.

Szczepionka wytworzona sposobem według wynalazku stymuluje albo wzmaga wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw gp 75. Leczonemu osobnikowi podaje się powyższą szczepionkę w dawce skutecznie stymulującej lub wzmagającej wytwarzanie przeciwciał.

Leczenie nowotworów, zapobieganie im oraz opóźnianie nawrotów nowotworu u ludzi dotkniętych tą chorobą polega na podawaniu chorym szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku w dawce skutecznie leczącej, zapobiegającej lub opóźniającej nawrót nowotworu.

W powyższych metodach terapeutycznych antygen gp75 może być związany z adiuwantem. Dodatkowo, przed podaniem szczepionki, pacjentowi podaje się efektywną ilość cyklofosfamidu.

Przykład. Hodowla tkankowa

Prowadzono wzrost linii komórkowej czerniaka SK-MEL-19 na podłożu MEM z dodatkiem 1% niepodstawionych aminokwasów, penicyliny i streptomycyny, z tym, że zamiast płodowej surowicy bydlęcej (FBS) stosowano 10% (objętościowo) SerumPlus z firmy Hazelton Research Products Inc., Lenexa, KS.

Izolowanie i oczyszczanie gp 75

Izolowano post-jądrową frakcję błonową z linii komórek czerniaka SK-MEL-19 przez homogenizację komórek w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl (pH = 7,5), 5mM MgCL i 2mM PMSF i wirowanie (10000 Xg). Błony rozpuszczono w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl (pH = 7,5), 3 M KCl i 5 mM EDTA i odwirowano (100 000 X g). Frakcję nierozpuszczalnego białka zawieszono w 20 mM Tris HCl (pH = 7,5) z dodatkiem 0,5% dezoksycholanu sodowego. Białka rozpuszczalne w detergencie zebrano przez odwirowanie (100000Xg). Supernatant dializowano wobec 20 mM Tris HCl (pH = 7,5) z dodatkiem 0,15 M NaCl i 2 mM CHAPS i podano na kolumnę Mono Q /HR 5/5, Pharmaci LKB Biotechnology Inc. Piscataway, NJ/ zrównoważoną roztworem o składzie: 20 mM Tris HCl (pH = 7,5), 0,15 M NaCl i 2 mM (3-[(3-cholamidopropylo)dwumetyloamonio]1-propanosulfonianu (CHAPS) (bufor A). Związane białka eluowane w liniowym gradiencie 0-1,0 M NaCl w buforze A. We frakcjach oznaczono gp75 metodą kompetytywnego hamowania. Frakcje zawierające gp 75 zebrano, dializowano wobec buforu stosowanego do kolumny Con A (10 mM Tris HCl (pH = 6,5), zawierającego 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂ i 2mM PMSF) i podano na kolumnę wypełnioną Con-A-Sepharozę. Niezwiązane białka usunięto przez przemywanie buforem stosowanym do kolumny. Białka związane z kolumną Con A eluowano 0,25 M roztworem α-D-metylomannopiranozydu w buforze kolumny Con A.

Frakcje zawierające gp 75 zebrano i dializowano wobec roztworu o składzie: 10 mM Tris HCl (pH = 7,5), 2mM cHaPS i 2mM PMSF (CB) i podano na kolumnę powinowactwa Affi-Gel 10 zawierającą mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) TA99 (Thompson T. M. Mattes J. M., Roux L., Old L. J. i Lloyd K. O., „Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody. J. Inwest. Dermatol., 1985,85,169). Żel przemyto kolejno 6ml: CB, CB+1M NaCl, CB i CB + 2mM CHAPS. Związany gp75 eluowano z kolumny 0,1 M roztworu chlorowodorku glicyny o pH 3,1 zawierającym 2mM CHAPS.

Oznaczanie gp 75 w próbie kompatytywnego hamowania

Podczas oczyszczania, gp 75 monitorowano i oznaczano ilościowo na podstawie zdolności frakcji do hamowania wiązania mAb TA 99 (300 ng/ml) z komórkami SK-MEL-19 utrwalonymi w mieszaninie metanol-aceton (1:1 objętościowo) w immunologicznej próbie enzymatycznej ELISA

169 168 w sposób opisany przez Houghton'a A. N. i wsp. (Houghton A. N., Brooks H., Cote R. J., Taormina M. C., Oettgen H. F. i Old L. J., „Detection of cell surface and intracellular antigens by human monoclonal antibodies: hybrid cells derived from lymphocytes of patients with malignant melanoma J. Exp. Med. 1983, 158, Immunoprecypitacja, elektroforeza żelowa i mapowanie peptydu.

Jodowanie frakcji białkowej SK-MEL-19 związanej na kolumnie Con-A-Sepharose metodą z użyciem chloraminy T i immunoprecypitację przeciwciałem mAb TA99 i surowicą AU wykonano w sposób opisany przez Mattes'a i wsp. (Mattes J. M., Thomson T. M., Old L. J., i Lloyd K. O., „A gigmentation-asociated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum Int. J. Cancer, 1983,32,717). Białka analizowano przez elektroforezę w żel SDS-akryloamidowym (SDS-PAGE) w sposób opisany przez Laemmli'ego (Laemmli U. Κ., „Cleavage of structural proteins during assembley of the head of bacteriophage T4 Nature, 1970, 227, 680).

W celu trawienia endoglukozydazą H (Endo Η), immunoprecypitaty zawieszono w 0,4% SDS, ogrzewano do temperatury 100°C w ciągu 5 minut i trawiono jedną jednostką międzynarodową Endo H (Genzyme Corporation, Boston, MA) w 100 mM buforze cytrynianowym (pH = 5,5) w ciągu 16 godzin w temperaturze 37°C. Dwu-kierunkową elektroforezę z zastosowaniem amfolin o pH 5-7, produkcji LKB-Produkter, Bromma, Szwecja, przeprowadzono w sposób opisany przez O'Farrel'a (O'Farrel P. H., „High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins J. Biol. Chem., 1975, 250, 4007).

Mapowanie peptydów immunoprecypitatu gp 75 prowadzono metodą ograniczonej proteolizy za pomocą proteazy VB (VB protease) ze Staphylococcus sureus firmy Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, w SDS-PAGE według Cleveland'a i wsp. (Cleveland D. W., Fischer S. G., Kirschner M. W. i Laemmli U. Κ., „Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulphate and analysis by gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 1977, 252, 1102).

Sekwencjonowanie peptydów

Sekwencjonowanie peptydu przeprowadzono w zestawie „Harward University Microchemistry Facility. Oczyszczony gp75 (12/zm) po elektroforezie - naniesiony na filtr nitrocelulozowy trawiono proteazą VB (1:20, wagowo) w sposób podany przez Aebersold'a R. (Aebersold R. H., Leavitt J., Saavedra R. A. i Hood L. E., „Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocelulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 6970) i uzyskane peptydy rozdzielono na kolumnie C8 „Brownlee RP-300 o wymiarach 2.1 X 100 mm, w temperaturze 38°C. Kilka pików z trawienia proteazą V8 zebrano i wysuszono. Przeprowadzono całkowitą redukcję i alkilowanie przez dodanie 50μ\ 8M mocznika w 0,4 M buforze dwuwęglanu amonowego o pH = 8,0 i 5/zl 100 mM ditiotreitolu i ogrzewano w temperaturze 50°C w ciągu 15 minut. Następnie próbkę inkubowano z 5 pl 45 mM kwasu jodooctowego w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej i rozcieńczono 140pl wody destylowanej. Dalsze trawienie trypsyną zredukowanej i zalkilowanej frakcji peptydu (1:25, wagowo) prowadzono w ciągu doby w temperaturze 37°C. Frakcje przeznaczone do sekwencjonowania naniesiono bezpośrednio na filtry ze wstępnie modyfikowanego heksadimetryną (polybrene) włókna szklanego sekwencjonowano w zestawie do sekwencjonowania białek ABI477A. Aminokwasy rozdzielono metodą HPLC w systemie on-line w zestawie ABI 120A. Dla każdego peptydu przeprowadzono minimum 20 cykli.

Powtarzalność wyników MPLC w rutynowych warunkach laboratoryjnych wynosiła 93%. Sekwencje aminokwasowe podano tylko dla tych peptydów, dla których uzyskano wyniki o najwyższej powtarzalności.

Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA dla gp75

Bank cDNA skonstruowano z linii komórek czerniaka SK-MEL 19. Do izolacji dwu klonów cDNA gp75 stosowany sondy oligonukleotydowe, postępując w sposób opisany poprzednio (Bouchard B., Fuller B., Vijayasardhi S. i Houghton A. N., „Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med. 1989, 169, 2029). Budowa sond oligonukleotydowych była następująca:

5' CTCGAAGGTGAACCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC 3'.

169 168

Metodą Sangera i wsp. (Sanger F., Nicklen S. i Coulson A. R., „DNA sequencing with chain terminating inhibitors“, Proc. Natl. Asad. Sci. USA, 1977, 74, 5463; Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), zsekwencjonowano dwa klony cDNA (1,8 kb i 2,0 kb). Na podstawie przeprowadzonych prób stwierdzono, że zarówno mysie mAb TA99 jak i surowica AU od pacjentów z czerniakiem strącają antygen o wielkości 75 kDa, a mAb TA99 oczyszcza wstępnie antygen gp 75 strącony przez surowicę AU (Thomson T. M., Mattes J. M., Roux L., Old L. J. i Lloyd K. O. „Pigmentation-asociated glycoprotein of human melamona and metanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody. J. Invest. Dermatol. 1985, 85, 169). Chociaż mAb TA99 użyto do oczyszczania gp 75 z linii komórek czerniaka SK-MEL-19, bardzo ważne jest potwierdzenie faktu, że mAb TA99 wykrywa jedynie antygen gp 75 rozpoznawany przez surowicę AU. W poprzednich badaniach wykazaliśmy, że mAb TA99 nie reaguje z ludzką tyrozynazą glikoproteiną o wielkości 75-80 kDa, również wydzielaną w zabarwionych melanocytach (Bouchard B., Fuller R., Vijayasaradhi S. i Houghton A. N.: „Induction of pigmentation in mouse fibroblast by expression of human tyrosinase“. J. Exp. Med., 1989, 169, 2029). Jednakże na podstawie tamtych doświadczeń nie można było wykluczyć możliwości, że mAb TA99 reaguje krzyżowo z innymi polipeptydami wydzielanymi przez komórki SK-MEL-19.

Białka po immunoprecypitacji przez przeciwciała mAb TA99 i znajdujące się w surowicy AU analizowano metodą jedno- i dwukierunkowej elektroforezy SDS-PAGE oraz przez mapowanie peptydów z użyciem ograniczonej proteolizy proteazą V8 z S. aureus.

Białka strącone zarówno przez mAb TA99 jak i przez przeciwciała surowicy AU mają identyczną masę cząsteczkową (75 kFa) punkt izoelektryczny (5,5-5,9) (dane nie przedstawione) i skład peptydowy (figura 1), co potwierdza, że TA99 i surowica AU rozpoznają tę samą cząsteczkę gp75.

Antygen gp75 oczyszczono w sposób opisany wyżej. Oczyszczony metodą powinowactwa gp75 stosowano do sekwencjonowania peptydów. Sekwencje aminokwasowe trzech wewnętrznych peptydów uzyskano przez rozszczepienie proteolityczne oczyszczonego gp 75 proteazą V8 i trypsyną. Sekwencje tych trzech peptydów przedstawiono w tabeli 1. Okazało się, że istnieje 90 procentowa identyczność tych sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi wyprowadzonymi z klonu mysiego cDNA, pMT4 wyizolowanego przez Shibahara'ę i wsp. (identyczność ta występuje w pozycjach aminokwasów 247-260, 333-349 i 428-441 pMT4). (Shibahara S., Tomita Y. Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B., Muller R.: „Cloning and expresson of cDNA encoding mouse tyrosinase. Nucleic Acid Res. 1986, 14, 2413). Sondy oligonukleotydowe pochodziły z sekwencji peptydowych z gp75 i były użyte do skriningu banku cDNA skonstruowanego z linii komórkowych czerniaka ludzkiego SK-MEL-19. Z tego banku cDNA wyizolowano dwa klony cDNA, o wielkości 1,8 i 2,0 kilozasad.

Częściowe sekwencje nukleotydowe klonów cDNA (GP75-1 i GP75-2), z których jedną przedstawiono w tabeli 2, wykazują 88,6 procentową identyczność z pMT4 (między nukleotydami 649 a 1437, w otwartej fazie odczytu). Sekwencja aminokwasowa wyprowadzona na podstawie GP 75-1 i GP 75-2 wykazuje 93,6 procentową identyczność z sekwencją aminokwasową wyprowadzoną z pMT4 pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi 219 a 467. Istnieje 55,3 procentowa identyczność między sekwencjami cDNA dla gp 75 a sekwencjami dla ludzkiej tyrozynazy (Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. i Houghton A. N.: „Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase J. Exp. Med. 1989, 169,2029) pomiędzy nukleotydami 618 a 1344 dla tyrozynanzy (dane nie przytoczone).

Tabela 1

Sekwencja aminokwasowe trzech peptydów pochodzących z gp75

Asn-Thr-Val-Glu-Glv-Tvr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glv-Lvs-Tvr-Asp-Pro-Ala-Val

Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Glv-Tvr-Thr-Tvr-Glu

Asn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser

Podkreślono te reszty aminokwasowe, które różnią się od reszt wyprowadzonych na podstawie mysiego cDNA z pMT4 (Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B. i Muller R.; „Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase. Nucleic Acid Res. 1986, 14, 2413).

169 168

Ί

Tabela 2

Częściowa sekwencia cDNA dla antygenu gp 75

GGACCAGCTTTTCTCACATGGCACAGGTACCACCTCCTGCGTCTGGAGAAAGACATGC

AGGAAATGTTGCAAGAGCCTTCTTTCTCCCTTCCTTACTiGGAATrrTGCAACGGGGAA

AAATGTCTGTtjATAT^TGCA^GGATGACTTGATGGGATCCAGAAGCAACTTTGATTCC

ACTCTΛATΛAGCCCΛΛΛCTCTGTCTrTTCTCΛATGGCGΛGTGGrCTGrGACrCCrTGG

AAGATTATGArACCCTGGGAACACTTTGTAACAGCACCGAGGrGGGCCAATrAGGAG

AAATCCAGCTGGAAΆTGTGGCCAGACCAArGGrGCAACGrCπCCrGAACCACAGGAr

GTCX;CTCArGrCTΎGGAACΠΎGGTrTArTTGACACX;CX:TCCTTTTT,ArrCCAACTCrA

CAAACAGTTTCCGAAACACAGTGGAAGGTTACAGTGACCCCACGGGAAAGTATGACCC

TGCTGrrCGAAGTCTrCACAArrrGGCTCArCTATrCCrGAAT^GAACAGGGGGACAA

ACCCATrTGTCTTCCCAAGATCCrATT^'TGrCCrCCTGCACACCTTCACAGArGCAG rcrT'TGATGAArGGCrAAGGAGATACAArGCTC^ArATArCCACArrrCCATTGGAAAA

TGCCCCrArrGGACArAATAGACAArACAACArGGrGCCATrcrGGCCCCCAGrCACC

AACACAGAAATGTTTGTTACrGCrCCAGACAACCTGGGArACACTTArGAA

Ścisła homologia między ludzkim antygenem gp75 oraz produktem wyprowadzonym z mysiego genu pMT4 rzuca pewne światło na możliwą strukturę i funkcję gp75. Klon pMT4 wyizolowano z mysich komórek melanocytarnych (Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B. i Muller R.: „Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase“, Nucleic Acid Res. 1986, 14, 2413).

Początkowo uważano, że cDNA z pMT4 koduje mysią tyrozynazę, dla której pozycja w mapie genetycznej znajduje się w mysim locus c (albino). Późniejsze badania wykazały jednak, że pMT4 różni się od genu dla tyrozynazy mysiej (Yamamoto H., Takenchi S., Kudo T., Makino K., Nakata A., Shinoda A i Takeuchi T.: „Cloning and sequencing of mouse tyrosinase cDNA“, Japan J. Genetics, 1987, 62, 271; Muller G., Ruppert S. Schimd E. i Schutz G.: „Functional analysis of alternatively spliced tyrosinase gene transcripts“, Eur. Mol. Biol. Organ. J. 1988, 7,2723; Jackson

I. J.: „A cDNA encoding tyrosinaserelated protein maps to the brown locus in mice“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 4392). Podobnie, sekwencja gp75 różni się od sekwencji ludzkiej tyrozynazy, aczkolwiek istnieje ograniczony zakres identyczności (43,1%) pomiędzy gp 75 a wyprowadzoną sekwencją aminokwasową ludzkiej tyrozynazy (pomiędzy resztami aminokwasowymi 208-459).

Funkcję gp 75 i produktu pMT4 próbuje się określić na podstawie odkrycia, że miejscem pMT4 w mapie genetycznej jest locus b (brown) u myszy (Jackson I. J.: „A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice.“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 4392) a więc region, który określa barwę powłoki (Silvers W. K.: „Comparative genetics of coat colour in mammals“, The Coat Colors in Mice. Springer Verlag, Nowy Jork, 1979).

Homologia pomiędzy gp 75 a sekwencją aminokwasową wyprowadzoną z pMT4 pozwala na formalną identyfikację ludzkiego homologu produktu genu z mysiego locus b (brown). Opierając się na lokalizacji w melanosomach i podobieństwie strukturalnym do tyrozynazy, można wysunąć wniosek, że cząsteczka gp 75 reguluje proces syntezy melaniny i określa typ syntetyzowanej melaniny.

Dotychczas zakładano, że determinanty melanosomalne i inne syntezy wewnątrzkomórkowe nie stanowią potencjalnego celu w immunologicznym leczeniu czerniaka. Ostatnio jednak znaleziono dowody, że wewnątrzkomórkowe białka mogą być przetwarzane do peptydów stanowiących cel dla cytotoksycznych komórek T (CTL) przez komórki będące nośnikami antygenu (Townsend A. R. M. i Bodmer H.: „Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes“. Ann. Rev. Immunol. 1989, 7, 601). Odkrycie to stwarza teoretyczną możliwość ukierunkowania odpowiedzi komórki T na czerniaka przeciwko cząsteczkom wydzielanym w komórce nowotworowej. Alternatywnie, komponenty melanosomalne, które są normalnie transportowane poza melanocyty w procesie dojrzewania, mogą się aktualizować w przestrzeni poza-komórkowej wokół komórek nowotworowych lub tez, nekroza miejscowej tkanki może prowadzić do uwalniania i odkładania się produktów wewnątrzkomórkowych. Potwierdzeniem dostępności gp 75 jest fakt, że znakowany radioaktywnie TA99 swoiście lokalizuje się w przeszczepach czerniaka ludzkiego w myszach nu/nu, co wskazuje, że antygen ten jest dostępny dla przeciwciała w miejscu nowotworu (Welt S., Mattes J. M., Grando R., Thomson T. M., Leonard R. W. Zanzonico P. B., Bigler R. E., Yeh S., Oettgen H. F. i Old L. J.: „Monoclonal antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplants in nu/nu mice“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 4200).

169 168

Przeciwciała IgG u pacjentów z czerniakiem AU rozpoznają determinanty na gp 75, które są wspólne dla komórek czerniaka i dla normalnych melanocytów (Mattes J. M., Thomson T. M., Old

L. J., i Lloyd K. O.: „A pigmentation-associated differentation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum. Int. J. Cancer, 1983, 32, 717). Izolacja klonów cDNA, które kodują gp 75 umożliwi badanie strategii aktywnej immunizacji przeciw gp 75.

Istnieją co najmniej dwa warunki efektywnego indukowania odpowiedzi komórek CTL na gp 75:1 (musi być przezwyciężona tolerancja na gp 75 i 2) peptydy gp 75 muszą być przetworzone i efektywnie prezentowane przez główne antygeny zgodności tkankowej na komórkach czerniaka. Alternatywnie, jest możliwe, że antygeny różnicowania melanocytów są nośnikami unikalnych determinant. Geny kodujące produkty wydzielane przez normalne melanocyty mogłyby być mutowane lub przegrupowywane w procesie transformacji prowadzącej do uzłośliwienia generując nowe epitopy będące celem rozpoznawanym przez CTL i przeciwciała. W tym kontekście, najlepiej scharakteryzowanym unikalnym antygenem na komórkach ludzkiego czerniaka jest determinanta ma melanotransferynie, glikoproteinie o wielkości 95-97 kDa, wydzielanej na hodowanych melanocytach i na komórkach czerniaka (Real F. K., Mattes M. J., Houghton A. N., Oettgen H. F., Lloyd K. O. i Old L. J.: „Class 1 (unique) antigens of human melanoma. Identyfication of a 90000 dalton cell surgace glycoprotein by autologous antibody, J. Exp. Med. 1984,160,1219; Furakawa

K. S., Furakawa K., Real F. X., Old L. J. i Lloyd K. O.: „A unique antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoprotein gp 75/p 97 J. Exp. Med. 1989,169, 535). Na potwierdzenie tej możliwości, wykryto zmiany genetyczne występujące z dużą częstością i w szerokim rozprzestrzenianiu w genomie komórek czerniaka ludzkiego (Dracopoli N. C., Houghton A. N., i Old L. H.: „Loss of polymorphic restriction fragments in malignant melanoma: Implication for tumor heterogeneity. Prof. Natl. Acad. Sci. USA 1985,82,1470; Dracopoli N. C., Alhadeff B., Houghton A. N. i Old L. J. „Loss of heterozygosity at autosomal and x-linked loci durning tumor progression in a patient with melanoma, Cancer Res. 1987, 47, 3995).

A B

Fi<.1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.

Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulującej albo wzmagającej wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organiźmie osobnika, któremu podaje się szczepionkę, znamienny tym, że antygen gp 75 albo jego fragment o sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z nukleotydowej sekwencji cDNA jak przedstawiono w tabeli 2 izoluje się i oczyszcza a następnie łączy się taką ilość wspomnianego antygenu lub jego fragmentu która skutecznie stymuluje lub wzmaga wytwarzanie przeciwciał w organiźmie osobnika, dla którego przeznaczona jest szczepionka, ze skuteczną ilością adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nośnikiem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się adiuwant wiążący gp 75.