JP3336006B2 - メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５ - Google Patents

メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５

Info

Publication number
JP3336006B2
JP3336006B2 JP50783191A JP50783191A JP3336006B2 JP 3336006 B2 JP3336006 B2 JP 3336006B2 JP 50783191 A JP50783191 A JP 50783191A JP 50783191 A JP50783191 A JP 50783191A JP 3336006 B2 JP3336006 B2 JP 3336006B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
cdna
melanoma
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP50783191A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06501837A (ja
Inventor
ホーフトン、アラン・エヌ
ビジャヤサラデイ、セタルリ
Original Assignee
スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23976841&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3336006(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ filed Critical スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ
Publication of JPH06501837A publication Critical patent/JPH06501837A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3336006B2 publication Critical patent/JP3336006B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
    • C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1990年３月22日に出願された米国特許出
願第497,431号の一部継続出願であり、その内容は参照
として本出願に組み込まれる。
この出願の全体を通して、種々の刊行物が引用され
る。これら刊行物の開示は、本発明が関係する技術の状
態をより完全に記述するために、その全体が参照として
この出願に組み込まれる。
〔発明の背景〕
ヒト癌細胞についての免疫原性決定因子の分子的同定
は、癌に対する免疫応答を理解するための基礎を提供す
る。ヒトメタノーマ細胞に関しては、免疫認識のための
ターゲットとして、下記の二つのクラスの抗原が注目さ
れている。
１）自系メラノーマ細胞によってのみ発現する独特な抗
原（Old,L.J.（1981）,Cancer immunology:The search
for Specificity.G.H.A.Clowes Memorial Lecture,Canc
er Res.41:361;Carey,T.E.,T.Takahashi,L.A.Resnick,
H.F.Oettgen,and L.J.Old.（1976）,Cell surface anti
gens of human malignant melanoma.I.Mixed hemadsorp
tion assay for humoral immunity to cultured autolo
gous melanoma cells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.73:327
8;Real,F.X.,M.J.Mattes,A.N.Houghton,H.F.Oettgen,K.
O.Lloyd,and L.J.Old.（1984）,Class 1（unique）anti
gens of human melanoma:Identification of a 90,000
dalton cell surface glycoprotein by autologous ant
ibody,J.Exp.Med 160:1219） および ２）通常、メラノサイト系統の細胞によって発現する分
化抗原（Houghton,A.N.,M.C.Taormina,H.Ikeda,T.Watan
abe,H.F.Oettgen,and L.J.Old.（1980）,Serological s
urvey of normal humans for natural antibody to cel
l surface antigens of melanoma,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.77:4260;Houghton,A.N.,M.Eisinger,A.P.Albino,J.
G.Cairncross,and L.J.Old.（1982）,Surface antigens
of melanocytes and melanoma:Markers of melanocyte
differentiation and melanoma subsets,J.Exp.Med.15
6:1755;Houghton,A.N.,F.X.Real,L.J.Davis,C.Cardon−
Cardo,and L.J.Old.（1987）,Phenotypic heterogeneit
y of melanoma:Relation to the differentiation prog
ram of melanoma cells,J.Exp.Med.164:812）。メラノ
サイトの分化抗原は、メラノサイトが分化する間に発現
する他の十分定義された表現型特性（その最も特徴的な
ものはメラノソーム内でのメラニン色素の合成である）
に対するそれらの関係によって定義されている（Hought
on,A.N.,M.Eisinger,A.P.Albino,J.G.Cairncross,and
L.J.Old.（1982）,Surface antigens of melanocytes a
nd melanomas:Markers of melanocyte differentiation
and melanoma subsets,J.Exp.Med.156:1755;Houghton,
A.N.,F.X.Real,L.J.Davis,C.Cardon−Cardo,and L.J.Ol
d.（1987）,Phenotypic hetetogeneity of melanoma:Re
lation to the differentiation program of melanoma
cells,J.Exp.Med.164:812）。
臨床観察は、正常色素細胞によって発現する抗原に対
する免疫応答が転移メラノーマの進路に影響を及ぼす可
能性を示唆している。特に、メラノーマを持つ患者の皮
膚発疹およびハイポピグメンテーションは良好な予後と
関連付けられている（Nordlund,J.J.,J.M.Kirkwood,B.
M.Forget,G.Milton,D.M.Albert,and A.B.Lerner.（198
3）Vitiligo in patients with metastatic melanoma:a
good prognosis sign,J.Am.Acad.Dermatol.9:689;Byst
ryn,J.C.,D.Rigel,R.J.Friedman,and A.Kopf.（1987）P
rognostic significance of hypopigmentation in mali
gnant melanoma,Arch.Dermatol.123:1053）。これに関
連して、メラノソーム抗原は免疫系によって認識するこ
とが可能である。これは、転移メラノーマを持つ患者の
血清IgG抗体による自系メラノーマ細胞からのgp75抗原
の免疫沈降により示されている（Mattes,J.M.,T.M.Thom
son,L.J.Old,and K.O.Lloyd.（1983）A pigmentation−
associated,differentiation antigen of human melano
ma defined by a procipitating antibody in human se
rum,J.Cancer.32:717）。gp75抗原はメラノソームのポ
リペプチドであって、色素が形成されたメラノサイトお
よびメラノーマによって合成される最も多量に存在する
糖タンパクである（Tai,T.,M.Eisinger,S.Ogata,and K.
O.Lloyd.（1983）Glycoproteins as differentiation m
arkers in human malignant melanoma and melanocyte
s,Cancer Res.43:2773）。表皮メラノサイト、良性の色
素形成病変、並びに一次および転移メラノーマはgp75を
発現するが、他の細胞型は発現しない（Thomson,T.M.,
F.X.Real,S.Murakami,C.Cardon−Cardo,L.J.Old,and A.
N.Houghton.（1988）Differentiation antigens of mel
anocytes and melanoma:Analysis of melanosome and c
ell surface markers of human pigmented cells with
monoclonal antibodies,J.Invest.Dermatol.90:459）。
この発明においては、gp75cDNAが、ｂ（褐色）遺伝子座
をマップするマウス遺伝子に由来するアミノ酸およびヌ
クレオチド配列と、ほぼ90％の同一性を有していること
が示される。この褐色遺伝子座は、外皮の色を決定し、
合成されるメラニンの型に影響を及ぼす部位であり、gp
75が合成されるメラニンの型を調整し、もしくは影響を
及ぼしていることが示唆される。
転移メラノーマを持つ患者の血清中のIgG抗体がgp75
を免疫沈降させることが見出されているという事実は、
gp75に対する免疫寛容を破壊することが可能であること
を示している。したがって、この発明は、メラノーマに
対するワクチンとして使用される、gp75cDNAを有する発
現ベクターを提供する。このベクターにより、マウスモ
ノクローナル抗体TA99により単離および精製されたgp75
ポリペプチドからペプチドのアミノ酸配列が決定され、
かつこのペプチド配列に基づくオリゴヌクレオチドを用
いるスクリーニングによりcDNAクローンが単離された。
〔発明の要約〕
この発明は、その配列がgp75もしくはそれらの断片の
アミノ酸配列をコードする、単離核酸分子を提供する。
この発明は、さらに、gp75核酸分子の単離cDNA分子、
並びに図３に示すヌクレオチド配列を有するGP75核酸分
子の断片の単離cDNA分子およびそれらから誘導されるア
ミノ酸配列を提供する。
この発明はまた、それが投与される被検体において、
gp75に対する抗体の産生を刺激または増強するワクチン
を提供する。
この発明は、さらに、被検体におけるgp75に対する抗
体の産生を刺激または増強する方法を提供する。この方
法は、抗体産生の刺激もしくは増強のために、この発明
のワクチンの有効量を被検体に投与することを含む。
この発明は、さらに、癌の再発を治療し、予防し、ま
たは遅らせる方法を提供する。この方法は、癌の再発の
治療、予防または遅延のために、この発明のワクチンの
有効量を被検体に投与することを含む。
〔図面の簡単な説明〕
図1:mAb TA99およびAU血清により認識されたタンパ
ク質の免疫沈降およびペプチド組成分析。
A.SK−MEL−19からの125I標識溶解物からのmAb TA99に
よる免疫沈殿物の一次元SDS−PAGE（レーン１）、正常
ヒト血清（レーン２）並びに1/75（レーン３）および10
/76（レーン４）からのAU血清。
B.gp75もしくはエンドＨで処理した（部分的に脱グリコ
シル化した）gp75に相当するバンドをSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルから切り出し、SDS−PAGE上において、S.a
ureus V8プロテアーゼで制限消化することによりペプチ
ド組成を解析した。−、gp75;＋、エンドＨで部分的に
脱グリコシル化したgp75。オートラジオグラフ露光は、
TA99に対して２日間およびAUペプチドに対して５日間で
あった。
図2:gp75由来の３種のペプチドのアミノ酸配列。下線
を付したアミノ酸残基は、マウスcDNA pMT4（Shibanar
a,S.,Y.Tomita,T.Sakakura,C.Nagai,B.Chaudhuri,and
R.Muller.（1986）Cloning and expression of cDNA en
coding mouse tyrosinase,Nucleic Acid Res.14:2413）
から予測される残基と異なるものである。gp75由来の３
種のペプチドのアミノ酸配列。
図3:gp75の部分的cDNA配列。ヌクレオチド778からヌ
クレオチド1524までの５′−３′部分的cDNA断片が描写
される。
図4:gp75をコードする完全長のcDNAの単離。2.7kb g
p75cDNAインサートを含む部分的制限地図が示される。G
P75の全2.7kb cDNAの最初の18ヌクレオチドを含む部分
的ヌクレオチド配列が５′−３′方向に示される。
〔発明の詳細な説明〕
この発明は、その配列がgp75またはその断片をコード
する単離核酸分子を提供する。
この発明は、さらに、その一態様において、gp75の断
片のアミノ酸配列がasn−thr−val−glu−gly−tyr−se
r−asp−pro−thr−gly−lys−tyr−asp−pro−ala−va
lであることを提供する。他の態様においては、アミノ
酸配列は、met−phe−val−thr−ala−pro−asp−asn−
leu−gly−tyr−thr−tyr−gluである。さらに別の態様
においては、アミノ酸配列は、asn−phe−asp−ser−th
r−leu−ileu−ser−pro−asn−ser−val−phe−serで
ある。
この発明は、さらに、gp75核酸分子の単離cDNA分子並
びに図３に示すヌクレオチド配列を有するgp75核酸分子
の断片の単離cDNA分子およびそれらに由来するアミノ酸
配列を提供する。
GP75E−１と称するE.coli株DH5αが、ATCC受入番号
（Accession No.） として、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリ
ーランド、U.S.A.20852に寄託されている。このGP75E−
１は、pcvExと称するプラスミドベクターと全長2.7kbの
GP75cDNAインサート（図４参照）とを含むpGP75E−１プ
ラスミドを有する。この寄託は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタペスト条約（ブタペスト
条約）の規約に従ってなされた。
全長2.7kbのcDNAを含むプラスミドは、この分野で公
知の方法（Maniatis,T.,E.F.Frish,and J.Sambrook,198
9,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Sprin
g Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY 1.38−1.
39,1.42−1.343）により、寄託されたE.coliホスト株か
ら回収することができる。このプラスミドからの2.7kb
のGP75cDNAの単離は、この分野で公知の方法により、Ec
oR Iを使用する制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて行
なうことができる。
加えて、この発明は、ホストにおける発現に適合した
gp75核酸分子もしくは断片のcDNA分子と結合したベクタ
ーの複製に必須のDNA配列を有する発現ベクターを提供
する。この発現ベクターは、ワクチニアウイルス、もし
くは、好ましくはイムクロン（Imclone）ベクターであ
ってもよい。
この発明はまた、それが投与される被検体において、
gp75に対する抗体の産生を刺激し、または増強させるた
めのワクチンであって、cDNA分子を有する発現ベクタ
ー、有効量のアジュバントおよび調薬上許容し得る担体
を含有するワクチンを提供する。好ましくは、被検体は
人間であり、gp75はアジュバントに結合されている。ア
ジュバントは微生物アジュバントであっても、または他
のいかなる調薬上の試薬であってもよい。
さらに、この発明は、それが投与される被検体におい
て、gp75に対する抗体の産生を刺激し、または増強させ
るためのワクチンを提供する。このワクチンは、gp75 l
核酸分子もしくは断片のcDNA分子に由来するアミノ酸配
列または被検体における抗体産生を刺激もしくは増強す
るに有効な量の精製gp75もしくはその断片、有効量のア
ジュバント、および調薬上許容し得る担体を含有しても
よい。被検体は人間であり、gp75はアジュバントに結合
していることが好ましい。アジュバントは、微生物アジ
ュバントまたは他のいかなる調薬上の試薬であってもよ
い。
この発明はまた、被検体における、gp75に対する抗体
の産生を刺激または増強する方法を提供する。この方法
は、抗体の産生を刺激もしくは増強するに有効な投与量
で、この発明のワクチンを被検体に投与することを含
む。
この発明はさらに、癌を患う被検体における癌の治療
方法を提供する。この方法は、癌の治療に有効な投与量
でこの発明のワクチンを被検体に投与することを含む。
この発明は、さらに、癌を患う被検体における癌の予
防方法を提供する。この方法は、癌の予防に有効な投与
量でこの発明のワクチンを被検体に投与することを含
む。この発明はまた、癌に感受性のある被検体における
癌の再発を遅らせる方法を提供する。この方法は、癌の
再発を遅らせるに有効な投与量でこの発明のワクチンを
被検体に投与することを含む。
癌の再発を治療し、予防し、かつ遅らせる方法は、メ
ラノーマのような癌に対するものであってもよい。この
ワクチンは、再発の危険が高い患者におけるメラノーマ
または一次メラノーマのような癌の予防に有用である。
これらの方法において、gp75はアジュバントに結合し
ていてもよい。加えて、ワクチンを投与する前に被検体
に有効量のシクロホスファミドを投与することもでき
る。
この発明は、以下の実験詳述項において説明される。
これらの項はこの発明の理解を助けるために示されるも
のであり、以下の請求の範囲に示されるように、いかな
る意味でもこの発明を限定することを意図するものでは
なく、限定すると解釈されるものでもない。
実験 １ 材料および方法 組織培養 メラノーマ細胞株SK−MEL−19を、ウシ胎児血清（FC
S）がSerumPlus 10％（v/v）（Hazelton Research Pro
ducts Inc.,Lenexa,KS）に置き換えられたことを除い
て、１％非必須アミノ酸およびペニシリンおよびストレ
プトマイシンを加えたMEMで増殖させた。
gp75の単離および精製 20mM Tris/HCl、pH7.5、5mM MgCl2、2mM PMSFにお
いて細胞をホモジネートし、100,000×ｇで遠心分離す
ることにより、メラノーマ細胞株SK−MEL−19から後核
膜分画（post−nuclear membrane fraction）を単離し
た。この膜を20mM Tris/HCl、pH7.5、3M KClおよび5m
M EDTAにおいて可溶化し、100,000×ｇで遠心分離し
た。不溶タンパク分画を、20mM Tris/HCl pH7.5、0.5
％デオキシコール酸ナトリウムに再懸濁した。デタージ
ェント可溶タンパクを、100,000×ｇで遠心分離するこ
とにより集めた。この上清を、20mM Tris/HCl、pH7.
5、0.15M NaClおよび2mM CHAPSに対して透析し、20mM
Tris/HCl、pH7.5、0.15M NaClおよび2mM（３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］１
−プロパンスルホネート（CHAPS）（緩衝液Ａ）で平衡
化したMono Q（HR 5/5、Pharmacia LKB Biotechnology
Inc.Piscataway,NJ）カラムにかけた。緩衝液Ａ中の０
−1.0M NaCl直線勾配で結合タンパクを溶出させた。分
画は、競合阻害アッセイによりgp75について検定を行な
った。gp75を含有する分画をプールし、Con Aカラム緩
衝液（1mM CaCl1、1mM MnCl2および2mM PMSFを含有
する、10mM Tris/HCl、pH7.5）に対して透析してCon A
−セファロースカラムにかけた。カラム緩衝液で洗浄す
ることにより、非結合タンパクを除去た。Con Aに結合
したタンパク質は、Con Aカラム緩衝液中の0.25M α−
Ｄ−メチルマンノピラノシドを用いてCon Aに結合した
タンパク質を溶出させた。gp75を含有する分画をプール
して、10mM Tris/HCl、pH7.5、2mM CHAPSおよび2mM
PMSF（CB）に対して透析し、マウスモノクローナル抗体
（mAb）TA99（Thomson,T.M.,J.M.Mattes,L.Roux,L.J.Ol
d,and K.O.Lloyd（1985）Pigmentation−associated gl
ycoprotein of human melanoma and melanocytes:Defin
ition with a mouse monoclonal antibody,J.Invest.de
rmatol.85:169）Affi−Gel 10アフィニティカラムにか
けた。このゲルを、各々6mlのCB、CB＋1M NaCl、CB、
およびCB＋2mM CHAPSで逐次的に洗浄した。結合gp75を
2mM CHAPSを含有する0.1Mグリシン−HCl、pH3.1でカラ
ムから溶出させた。
gp75の競合阻害アッセイ 精製の間、30ng/ml mAb TA99のメタノール：アセトン
（1:1vol/vol）に固定されたSK−MEL−19細胞への結合
を阻害する分画の能力を酵素免疫検定（ELISA）によっ
て測定することにより、gp75をモニターし、定量した
（Houghton,A.N.,H.Brooks,R.J.Cote,M.C.Taormina,H.
F.Oettgen and L.J.Old.（1983）Detection of cell su
rface and intracellular antigens by human monoclon
al antibodies:hybrid cells derived from lymphocyte
s of patients with malignant melanoma,J.Exp.Med.15
8:53）。
免疫沈降、ゲル電気泳動およびペプチドマッピング クロラミンＴ法によるSK−MEL−19のCon A−セファロ
ース結合タンパク分画のヨウ素化、並びにmAb TA99およ
びAU血清を用いる免疫沈降を記述の通りに行なった（Ma
ttes,J.M.,T.M.Thomson,L.J.Old,and K.O.Lloyd.（198
3）A pigmentanion−associated,differentiation anti
gen of human melanoma defined by a precipitating a
ntibody in human serum,Int.J.Cancer.32:717）。タン
パク質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）により解析した（Laemmli,U.K.（1970）Cleava
ge of structural proteins during assembly of of th
e head of bacteriophage T4,Nature.227:680）。エン
ドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）消化のために、免疫沈
降物を0.4％ SDSに懸濁させ、100℃で５分間加熱し、1m
UのエンドＨを用いて、100mMクエン酸緩衝液、pH5.5中
において37℃で16時間消化した。オファーレルに従い、
アンフォリン（ampholines）pH5−７（LKB−Produkter,
Bromma,Sweden）を用いる二次元電気泳動を行なった
（Ｏ′Farrel,P.H.（1975）High resolution two−dime
nsional electrophoresis of proteins,J.Biol.Chem.25
0:4007）。免疫沈降したgp75のペプチドマッピングは、
Clevelandら（Cleveland,D.W.,S.G.Fischer,M.W.Kirsch
ner,and U.K.Laemmli.（1977）Peptide mapping by lim
ited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and ana
lysis by gel electrophoresis.J.Biol.Chem.252:110
2）に従い、SDS−PAGEにおいて、スタフィロコッカス・
オウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ
（V8プロテアーゼ）（Boehringer Mannheim Biochemica
ls.Indianapolis,IN）を用いる制限タンパク分解により
行なった。
ペプチド配列決定 ペプチド配列決定は、ハーバード大学マイクロケミス
トリー施設で行なった。ニトロセルロース上にエレクト
ロブロットした（electroblotted）精製gp75（12μｇ）
を、Aebersold（Aebersold,R.H.,J.Leavitt,R.A.Saaved
ra,and L.E.Hood.（1987）Internal amino acid sequen
ce analysis of proteins separated by one−or two−
dimensional gel electrophoresis after in situ pro
tease digestion on nitrocellulose,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA.84:6970）に従い、V8プロテアーゼ（1:20W/W）
で消化し、得られたペプチドをBrownlee RP−300 2.1
×100mm C8カラムで38℃で分離した。V8プロテアーゼ
消化物からの幾つかのピークをプールし、乾燥した。50
μの8M尿素/0.4M重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.0、
５μの100mMジチオトレイトールを添加し、50℃で15
分間加熱することにより、完全還元およびアルキル化を
行なった。その後、試料を45mMヨード酢酸5mと共に室
温で15分間インキュベートし、蒸留水140μで希釈し
た。さらに、還元かつアルキル化されたペプチド分画を
トリプシン（1:25W/W）を用いて37℃で一晩消化した。
配列決定しようとする分画をポリブレン・プレサイクル
ド（precycled）・ガラスファイバーフィルターに直接
適用し、ABI 477Aプロテイン・シーケンサーで配列決定
した。アミノ酸は、ABI 120AオンラインHPLCを用いて分
離した。各ペプチドについて、最低20サイクル行なっ
た。ルーチンの実験室条件の下でのHPLCの反復収率は93
％であった。最も信頼性の高い結果を有するペプチドの
アミノ酸配列のみを報告する。
gp75cDNAのクローニングおよび配列決定 メラノーマ細胞株SK−MEL−19からcDNAライブラリー
を構築した。前に記述された方法（Bouchard,B.,B.Full
er,S.Vijayasaradhi,and A.N.Houghton.（1989）Induct
ion of pigmentation in mouse fibroblasts by expres
sion of human tyrosinase,J.Exp.Med.169:2029）に従
って、gp75cDNAクローンの単離にオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた。このオリゴヌクレオチドプローブの配
列は、 ５′CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC
３′ であった。GP75−１と称する2.0kbのcDNAクローンの配
列決定を行なった（Stratagene Cloning Systems,La Jo
lla,CA）。GP75−１のヌクレオチド配列は、受入番号X
51455としてEMBLデータバンクに寄託されている（図３
参照）。
結果および考察 マウスmAb TA99およびメラノーマ患者AUからの血清は
いずれも75kDaの抗原を免疫沈降させ、かつmAb TA99はA
U血清によって沈殿するgp75抗原を予め一掃する（precl
ear）（Thomson,T.M.,J.M.Mattes,L.Roux,L.J.Old,and
K.O.Lloyd（1985）Pigmentation−associated glycopro
tein of human melanoma and melanocytes:Definition
with a mouse monoclonal antibody,J.Invest.Dermato
l.85:169）。mAb TA99はメラノーマ細胞株SK−MEL−19
からgp75を精製するために用いられたので、mAb TA99が
AU血清に認識されるgp75抗原のみを検出したことを確か
めることが重要である。以前の研究において、我々は、
mAb TA99はヒトチロシナーゼ、同様に色素形成されたメ
ラノサイト中に発現する75−80kDaの糖タンパク質と反
応しないことを示した（Bouchard,B.,B.Fuller,S.Vijay
asaradhi,and A.N.Houghton.（1989）Induction of pig
mentation in mouse fibroblasts by expression of hu
man tyrosinase,J.Exp.Med.169:2029）。しかしなが
ら、これらの実験からは、mAb TA99がSK−MEL−19によ
って発現する他のポリペプチドと交差反応する可能性を
除外することはできなかった。
mAb TA99およびAU血清抗体によって免疫沈降したタン
パク質を、一次元および二次元SDS−PAGEおよびS.オウ
レウスV8プロテアーゼを用いる制限タンパク分解を利用
するペプチドマップにより解析した。mAb TA99およびAU
血清抗体の両者により沈殿したタンパク質は、同一の分
子量（75kDa）、同一等電点（isoelectric point:5.5−
5.9）、およびペプチド組成（図１）を有しており、TA9
9およびAU血清は同一のgp75分子を認識することが確認
された。
gp75抗原は、材料および方法に記載された通りに精製
した。アフィニティー精製したgp75をペプチド配列決定
に利用した。V8プロテアーゼおよびトリプシンを用いる
精製gp75のタンパク分解開裂により、３種の内部ペプチ
ドのアミノ酸配列が得られた。この３種のペプチドの配
列を図２に示す。Shibaharaらによって単離されたマウ
スcDNAクローン、pMT4、から推定されるアミノ酸配列と
90％一致した（pMT4のアミノ酸位置247−260、333−34
9、および428−441）（Shibahara,S.,Y.Tomita,T.Sakak
ura,C.Nagar,B.Chaudhuri,and R.Muller.（1986）Cloni
ng and expression of cDNA encoding mouse tyrosinas
e,Nucleic Acid Res.14:2413）。オリゴヌクレオチドプ
ローブはgp75のペプチド配列から誘導され、ヒトメラノ
ーマ細胞株SK−MEL−19から構築されたcDNAライブラリ
ーのスクリーニングに用いられた。２種のcDNAクローン
（1.8および2.0kb）が、SK−MEL−19のcDNAライブラリ
ーから単離された。cDNAクローン（GP75−１および−
２）の部分的なヌクレオチド配列（その１つは図３に示
されている）は、pMT4と（オープン・リーディング・フ
レーム内のヌクレオチド649−1437の間で）88.6％の同
一性を示した。GP75−１および−２の推定アミノ酸配列
は、pMT4の推定アミン酸配列と、アミノ酸残基219−467
の間で93.6％の同一性を示した。gp75のcDNA配列とヒト
チロシナーゼとは、チロシナーゼのヌクレオチド618−1
344の間で、55.3％の同一性があった（Bouchard,B.,B.F
uller,S.Vijayasaradhi,and A.N.Houghton.（1989）Ind
uction of pigmentation in mouse fibroblasts by exp
ression of human tyrosinase,J.Exp.Med.169:2029）。
ヒトgp75とマウスpMT4遺伝子の推定正生物との緊密な
相同製は、gp75の可能な構造および機能にいく筋かの光
を当てる。pMT4クローンはマウスメラノサイトから単離
された（Shibahara,S.,Y.Tomita,T.Sakakura,C.Nagar,
B.Chaudhuri,and R.Muller.（1986）Cloning and expre
ssion of cDNA encoding mouse tyrosinase,Nucleic Ac
id Res.14:2413）。元来、pMT4 cDNAは、マウスｃ（ア
ルビノ）遺伝子座にマップされるマウスチロシナーゼを
コードすると考えられていた。しかしながら、さらなる
研究は、pMT4がマウスチロシナーゼから区別されること
を示した（Yamamoto,H.,S.Takeuchi,T.Kubo,K.Makino,
A.Nakata,T.Shinoda,and T.Takeuchi.（1987）Cloning
and sequencing of mouse tyrosinase cDNA,Jpn.J.Gene
tics.62:271;Muller,G.,S.Ruppert,E.Schimd,and G.Sch
utz（1988）Functional analysis of alternatively sp
liced tyrosinase gene3 transcripts,EMBO（Eur,Mol.B
iol.Organ.J.）7:2723;Jackson,I.,（1988）A cDNA enc
oding tyrosinase−related protein maps to the brow
n locus in mice,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:4392）。
同様に、gp75とヒトチロシナーゼの推定アミノ酸配列と
は（アミノ酸残基208−459の間で）制限された同一性
（43.1％）があるにもかかわらず、gp75の配列はヒトチ
ロシナーゼの配列とは区別される。gp75およびpMT4生成
物の機能は、マウスにおいてpMT4が、外皮の色を調節す
る領域（Silvers,W.K.,（1979）Comparative genetics
of coat colour in mammals,In:The Coat Colors in Mi
ce,Springer Verlag,New York.1）であるｂ（褐色）遺
伝子座にマップされるという発見（Jackson,I.J.（198
8）A cDNA encoding tyrosinase−related protein map
s to the brown locus in mice Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.85:4392）により示唆される。gp75とpMT4の推定アミ
ノ酸配列との相同性は、マウス褐色遺伝子座遺伝子生成
物のヒト類似体の正式な同定を可能にする。メラノソー
ムへの偏在およびチロシナーゼとの構造的な類似性に基
づくと、gp75分子はメラニン合成を調節し、合成される
メラニンの型を決定している可能性がある。
メラノソーム決定因子および他の細胞内抗原が、メラ
ノソーマの免疫治療の潜在的な標的ではないことは認識
されている。しかしながら、最近、抗原保有細胞（anti
gen−presenting cells）によって細胞内タンパク質が
処理され、細胞障害性Ｔ細胞（CTL）に対するペプチド
として存在し得ることが明らかとなってきた（Townsen
d,A.R.M.,and H.Bodmer.（1989）Antigen recognition
by class I−restricted T lymphocytes,Ann.Rev.Immun
ol.7:601）。この発見は、メラノーマに対するＴ細胞応
答が腫瘍細胞内で発現する分子に向けられ得るという理
論的な可能性を開くものである。もしくは、その代わり
に、通常成熟する間にメラノサイトの外部に移送される
メラノソームの成分が腫瘍細胞周囲の細胞外空間に集積
し、または局在的な組織壊死が細胞内生成物の放出およ
び堆積を誘導する可能性がある。gp75の近付き易さに対
する支援においては、nu/nuマウス中のヒトメラノーマ
異種移植片に放射性標識TA99 mAbが特異的に局在し、こ
れは腫瘍部位内における抗体に対する抗原の有用性を示
している（Welt,S.,J.M.Mattes,R.Grando,T.M.Thomson,
R.W.Leonard,P.B.Zanzonico,R.E.Bigler,S.Yeh,H.F.Oet
tgen,and L.J.Old.（1987）Monoclonal antibody to an
intracellular antigen images human melanoma trans
plants in nu/nu mice,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:420
0）。
メラノーマ患者AUにおけるIgG抗体は、メラノーマ細
胞および正常メラノサイトによって共有されるgp75上の
決定因子を認識した（Mattes,J.M.,T.M.Thomson,L.J.Ol
d,and K.O.Lloyd.（1983）A pigmentation−associate
d,differentiation antigen of human melanoma define
d by a precipitating antibody in human serum,Int.
J.Cancer.32:717）。gp75をコードするcDNAの単離に伴
い、gp75に対する能動免疫の戦略の研究が可能であるべ
きである。gp75に対するCTL応答を有効に誘導するため
には、少なくとも２つの要求が存在する:1）gp75に対す
る免疫寛容が破壊され、２）主要組織適合抗原により、
メラノーマ細胞上でgp75ペプチドが処理されて有効に存
在しなければならない。または、その代わりに、メラノ
サイトの分化抗原がユニーク決定因子を担持することも
可能である。正常メラノサイトによって発現される生成
物をコードする遺伝子は、悪性変換の間に変異し、もし
くは再編成され、CTLおよび抗体による認識のための新
規エピトープを生じることもある。これに関連して、ヒ
トメラノーマ細胞に対する最も特徴付けられたユニーク
抗原は、培養メラノサイトおよびメラノーマ細胞上に発
現する95−97kDaの糖タンパクである、メラノトランス
フェリンに対する決定因子である（Real,F.X.,M.J.Matt
es,A.N.Houghton,H.F.Oettgen,K.O.Lloyd,and L.J.Old.
（1984）Class 1（unique）antigens of human melanom
a.Identification of a a 90,000 dalton cell surface
glycoprotein by autologous antibody,J.Exp.Med.16
0:1219;Furakawa,K.S.,K.Furakawa,F.X.Real,L.J.Old,a
nd K.O.Lloyd.（1989）A unique antigenic epitope of
human melanoma is carried on the common melanoma
glycoprotein gp75/p97,J.Exp.Med.169:585）。この可
能性の支持においては、ヒトメラノーマ細胞のゲノムを
通して、遺伝的な抗体が高頻度で広く検出されている
（Dracopoli,N.C.,A.N.Houghton,and L.J.Old.（1985）
Loss of polymorphic restriction fragments in malig
nant melanoma:Implicarions for tumor heterogeneit
y,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:1470;Dracopoli,N.C.,B.
Alhadeff,A.N.Houghton,and L.J.Old.（1987）Loss of
heterozygosity at autosomal and x−linked lociduri
ng tumor progression in a patient with melanoma,Ca
ncer Res.47:3995）。
実験 ２ 材料および方法 λファージにおける2.7kbのGP75cDNAの単離 実験１において記述した2.0kDaのGP75 cDNA（その配
列は図３参照）をゲノムライブラリーのスクリーニング
に用いた。GP75遺伝子を有するゲノムクローンを得た。
cDNAライブラリーの構築およびスクリーニング ヒト・メラニン性メラノーマ細胞株SK−MEL−19（Hou
ghton,A.N.,M.Eisinger,A.P.Albino,J.G.Cairncross,an
d L.J.Old.1982.Surface antigens of melanocytes and
melanoma:markers of melanocyte differentiation an
d melanoma subsets.J.Exp.Med.156:1755）から調製し
たポリ（Ａ）＋選択されたmRNA（Maniatis,T.,E.F.Fris
h,and J.Sambrook.1982.Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sprin
g Harbor,NY.545pp）３μｇからcDNAライブラリーを構
築した。クレノウ酵素を用いて鈍端（blunt ended）と
し、Eco R Iリンカー（New England Biolabs,Inc.,Beve
rly,MA）を繋げた完全な長さのcDNAを合成した（Guble
r,U.,and B.J.Hoffman.1983.A simple and very effici
ent method of generating cDNA libraries.Gene（Ams
t.）.25:263）。次いで、このcDNAをウルトロゲル・ア
カ34（Ultrogel Aca 34）（Pharmacia Fine Chemicals.
Piscataway,NJ）でサイズ分画した（Watson,C.J.,and
J.F.Jackson.1985.Constructing and screening cDNA l
ibraries in λgt 10 and λgt 11.In DNA Cloning:A P
ractical Approach.D.M.Glover,editor.IRL Press Limi
ted,Oxford.79−100）。cDNA分子＞800bpを、λファー
ジベクターgt10における３×105組換え体からなるライ
ブラリーの構築に用いた（Huynh,T.V.,R.A.Young,and
R.W.Davis.1985.An alternative procedure for the sy
nthesis of double stranded cDNA for cloning in pha
ge and plasmid vector.In DNA Cloning:A Practical A
pproach.D.M.Glover,editor.IRL Press Limited,Oxfor
d.49−78）。
スクリーニングには、上で得られたゲノムクローンの
５′末端コーディング領域に基づくフラグメントを用い
た。λファージ中に2.7kbのcDNAが得られた。（Bouchar
d,B.,B.Fuller,S.Vijayasaradhi,and A.N.Houghton.（1
989）Induction of pigmentation in mouse fibroblast
s by expression of human tyrosinase,J.Exp.Med.169:
2029） 2.7kb cDNAの回収 2.7kb cDNA GP75インサートに対する、Eco R Iを用い
る制限エンドヌクレアーゼ消化を行なった。DNAはフェ
ノール・クロロホルムを用いる抽出およびエタノール沈
殿により精製した。このDNAを100μg/mのTE（pH7.6）
に再溶解した。以下の方法により、粘着末端のライゲー
ションを行なった。以下のライゲーション混合物を用意
した。１）pcvExベクターDNA 0.1μｇを無菌マイクロフ
ュージ（microfuge）管に移した。等モル量の2.7kb GP7
5 cDNAを添加した。２）H2Oを7.5μまで加え、この溶
液を45℃で５分間加温して再アニールしている粘着末端
を溶融した。この混合物を０℃に冷却した。３）その
後、10×バクテリオファージT4 DNAリガーゼ緩衝液（20
0mM Tris Cl（pH7.6）、50mM MgCl2、50mMジチオトレイ
トール、500μg/mウシ結成アルブミン（Fraction V;S
ihma）、0.1ワイス（Weiss）単位のバクテリオファージ
T4 DNAリガーゼ、および5mM ATP 1μ）を加えた。こ
の反応体を、16℃で１−４時間インキュベートした。プ
ラスミドベクターpcvExおよび2.7kb GP75 cDNAインサー
トを有し、図４に示されるプラスミドpGP75 E−１が得
られた。
有用なE.coliの作製 各ライゲーション反応体の１−２μを、以下の方法
による有用E.coliの形質転換に用いた。まず、新鮮なオ
ーバーナイト・プレートからの単一コロニーをLB5mに
接種した。その後、撹拌機中で５−７時間細胞を増殖さ
せた。次に、４フラスコ内で、LB 1に上記4mを接
種した。O.D.550＝0.15となるまで増殖させた。3Kで10
分間スピンダウン（spin down）させ、０℃で100mM Ca
Cl2 400mに再懸濁した。その後、3Kで10分間再びス
ピンダウンさせ、０℃で100mM CaCl210mに再懸濁し
た。80％グリセロール2.5mを添加した。
DH 5α E.coliの形質転換 GP75 E−１プラスミド１−20μを有用な細胞100μ
に添加した。これを氷上に20分間保持した。その後、
42℃で１分間熱衝撃を与えた後、氷に10分間戻した。こ
の細胞をマイクロフュージで10秒間回転させ、LB200μ
に再懸濁した。これを撹拌機上において37℃で45分間
インキュベートした。
得られた、pGP75 E−１プラスミドを有するE.coli
は、ATCCに寄託した。
実験 ３ 材料および方法 試薬 Ｌ−［リング−3,5−3H］チロシン（比活性46.7Ci/mm
ol）をICN（Irvine,CA）より入手した。コンカナバリン
Ａ−セファロースおよびプロテインＡ・セファロースCL
4BはPharmacia（Piscataway,NJ）製である。アフィゲ
ル−10はBio−Rad（Richmond,CA）製である。全ての電
気泳動用化学薬品はBRL（Gaithersburg,CA）製である。
デオキシコール酸（ナトリウム塩）、ノニデット（Noni
det）Ｐ−40、（３−［（３−コラミドプロピル）ジメ
チル−アミノ］１−プロパンスルホネート（CHAPS）、
フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）およびα
−Ｄ−メチルマンノピラノジド、アルカリホスフェート
結合ヤギ抗マウスIgG、アルカリホスファターゼ発色試
薬および他の試薬グレードの化学薬品はシグマ（St.Lou
is,MO）製である。HPLCグレードの水および他の試薬グ
レードの有機溶媒はフィッシャー（Fisher）（Pittsbur
gh,PA）製である。マウスMAbs TA99（IgG2A）およびF2
3（IgG2a）は、プロテインＡ・セファロースを用いて精
製した。TA99 MAbは抗gp75抗体であり（Thomson,T.M.,
Mattes,J.M.,Roux,L.,Old,L.J.and Lloyd,K.O.,Pigment
ation−associated glycoprotein of human melanoma a
nd melanocytes:definition with a mouse monoclonal
antibody,J.invest.dermat.,85,169−174,1985）、コン
トロール抗体として用いられるMAb F23は、ヒトメラノ
サイト細胞とは反応しない抗ヒト結腸カルシノーマ抗体
である。
組織培養 メラノーマ細胞株SK−MEL−19を、Vijayasaradhi,S.,
Bouchard,B.B.and Houghton,A.N.,The melanoma antige
n gp75 is the human homologue of mouse b（brown）l
ocus gene,J.exp.Med.,171,1375−1380（1990）に記述
されているように、10％セーラム・プラス（Serum Plu
s）（Hazelton,Lenexa,KS）を補ったMEMにおいて増殖お
よび継代した。
gp75の単離および精製 gp75の精製の全ての手続きは、他に特定されていない
限りは０−５℃で行なった。半融合SK−MEL−19メラノ
ーマ細胞を、ラバーポリスマンで掻き取ることにより15
0cm2フラスコから収穫し、組織培養培地に集めて遠心分
離した後、細胞（60gペレット）をPBSで洗浄した。この
細胞を、300mの20mM Tris/HCl、pH7.5、5mM MgCl2、
2mM PMSFに10分間懸濁させ、ドウンス（Dounce）ホモジ
ナイザーでホモジナイズした。細胞溶解を位相差顕微鏡
法により監視した。モホジネートを1,000gで10分間遠心
分離した後、上清を集めて10,000gで30分間遠心分離し
た。粗精製膜ペレットを、50mの20mM Tris/HCl、pH7.
5、3M KClおよび5mM EDTAに懸濁し、ドウンス・ホモジ
ナイザー内で穏やかにホモジナイズし、100,000gで90分
間遠心分離した。このペレットを、30mの20mM Tris/H
Cl、pH7.5、0.5％デオキシコール酸ナトリウムに再懸濁
し、穏やかにホモジナイズした。このホモジネートを10
0,000gで遠心分離し、上清を200−300volの20mM Tris/H
Cl、pH7.5、0.15M NaClおよび2mM CHAPSに対して24時間
透析した。透析物を100,000gで90分間遠心分離すること
により清浄にした。この工程から得られた清澄な上清
を、20mM Tris/HCl、pH7.5、0.15M NaClおよび2Mm CHAP
S（緩衝液Ａ）で平衡にしたモノＱ（Mono Q）（Pharmac
ia,HR 5/5）カラムに、スーパーループ（Superloop）
（Pharmacia）を介して流速0.5m／分で流した。カラ
ムを緩衝液A10mで洗浄し、結合タンパク質を緩衝液Ａ
の０−1.0M NaCl直線勾配30mで溶出させて、分画1m
を集めた。競合阻害検定によりgp75について分画を検定
し、陽性分画をプールして1mM CaCl2、1mM MnCl2およ
び2mM PMSFを含有するCon Aカラム緩衝液、10mM Tris/H
Cl、pH7.5、100volに対して18時間透析した。
ConA−セファロース・クロマトグラフィー 10mエコノカラム（Econo−column）（Bio−Rad）中
において、Con A−セファロース（5m）をCon Aカラム
緩衝液50mで洗浄してプールし、モノＱイオン交換ク
ロマトグラフィからの透析分画を流速1.0−1.5m／分
でこのカラムにかけた。流出液を再びカラムにかけ、流
出液の吸光度（280nm）が0.01未満になるまでカラム緩
衝液で洗浄した。Con Aに結合しているタンパク質を、C
on Aカラム緩衝液に溶解した0.25Mα−Ｄ−メチルマン
ノピラノシドで溶出させ、1.5−2mの分画を集めた。
溶出に先立って25−30℃で15−20分間溶出緩衝液を用い
てカラムをインキュベートすることにより、タンパク質
の収量が改善された。gp75を含有する分画をプールし、
10mM Tris/HCl、pH7.5、2mM CHAPSおよび2mM PMSFに対
して透析し、TA99アフィゲル10アフィニティカラムにか
けた。
TA99アフィニティクロマトグラフィー 硫酸アンモニウム沈殿、並びにそれに続くプロテイン
Ａ−セファロースおよびセファデックスＧ−25カラムで
のクロマトグラフィにより、（BALB/C×C57BL/6）F1マ
ウスの腹水からTA99 MAbを精製した。製造者用指導書に
従ってカップリング用アフィゲル10を調製し、冷カップ
リング緩衝液（CB）、50mM HEPES、pH7.6、150mM NaCl
で洗浄した。アフィゲル20m当り9mgの精製TA99 IgGを
用いて、カップリング緩衝液の合計体積6mで、カップ
リング反応を４℃で４時間行なった。未結合の部位は、
等体積の0.1MエタノールアミンHCl、pH8.0を用いて４℃
で１時間インキュベートすることによりブロックした。
その後、ゲルを、CB、CB＋1.5M NaCl、CB、および最後
に10mM Tris/HCl、pH7.5、0.15M NaClおよび2mM CHAPS
で順次洗浄した。カップリング効率は、カップリング反
応の４時間前および４時間後に、カップリング反応の清
上清中のTA99のSK−MEL−19メラノーマ細胞に対する抗
体力価をELISAによって測定することにより決定した。
カップリング効率は60−80％であり、アフィゲル10 1m
当りTA99 IgG約5mgが結合した。Con Aクロマトグラフ
ィからプールされ、透析されたタンパク溶液を、0.5m
／分の流速で2m MAb TA99−アフィゲル10カラムにか
け、溶出液を再びカラムにかけた。その後、このゲル
を、各々6mのCB、CB＋1M NaCl、CB、およびCB＋2mM C
HAPSで順次洗浄した。結合したgp75を、2mM CHAPSを含
有する0.1Mグリシン−HClを用いてカラムから溶出させ
た。
gp75に対する固相酵素免疫測定法 ELISAのために、トリプシン結合細胞（trypsinized c
ells）をマイクロウェルプレート（Microtest Plates 3
034,Falcon,Oxnard,CA）に500−2000細胞／ウェル入
れ、加湿組織培養インキュベーター中において、50％CO
2中で、37℃で48−72時間増殖させた。このプレートをP
BSで洗浄し、冷却（−20℃）メタノール：アセトン（1:
1v/v）で10分間固定した後、0.2％ナトリウムアジドを
含有する冷PBSで３回洗浄した。固定され、かつ透過性
が付与された細胞を有するプレートは４℃で保存した。
ELISAにより、新たに固定したプレートについてTA99抗
体の力価を決定した。（４℃で６か月までのプレートの
保存については、MAb TA99を用いる力価には重大な変化
は観察されなかった。）簡潔に言うと、細胞をウェル当
り10μのMAb TA99と共にインキュベートし、５％γ−
グロブリン非含有FBS（GGFFBS）を含有するPBS中に45分
間連続的に希釈した後、２％ GGFFBSを含有するPBSでプ
レートを３回洗浄し、（５％ GGFFBSでPBS中に1:200に
希釈した）アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIg
Gを各ウェルに添加して45分間インキュベートした。プ
レートを上と同様に３回洗浄し、アルカリホスファター
ゼ基質溶液（ジエタノールアミン緩衝液、pH9.8、5mM
MgCl2に溶解したｐ−フェニルジソディウムホスフェー
ト）18μを添加した。加湿チャンバー内において37℃
で15−20分間インキュベートした後、アーテク（Arte
k）（Chantilly、VA）マイクロプレートリーダー（モデ
ル210）において、405nmで光学密度を測定した。
gp75の競合阻害検定 初期の工程の間、gp75の精製を監視し、上述のよう
に、分画のSK−MEL−19細胞へのMAb TA99の結合を阻害
する能力をELISAによって測定することにより定量し
た。カラムクロマトグラフィーからの亜細胞分画もしく
は分画を、96ウェルマイクロテストプレートにおいて連
続的に希釈した。TA99抗体を最終濃度20ng/ml（SK−MEL
−19への結合の飽和直前）まで添加した。この抗原抗体
混合物を室温で30分間インキュベートした後、マイクロ
ウェルプレート中のSK−MEL−19細胞に適用した。SK−M
EL−19細胞に結合したMAb TA99の量を、上述のようにEL
ISAによって測定した。gp75の活性１単位は、SK−MEL−
19細胞に結合するMAb TA99（300ng/m）の半最大阻害
（half−maximal inhibition）に必要なタンパク質の量
と定義された。
ゲル電気泳動およびエレクトロブロッティング タンパク質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（Laemmli,U.K.,Cleavage of structural proteins d
uring assembly of the head of bacteriophage T4,Nat
ure（Lond.）,227,680−685,1970）により解析し、銀染
色（Oakley,B.R.,Kirsch,D.R.and Morris,N.R.,A simpl
ified ultrasensitive silver stain for detecting pr
oteins in acrylamide gels,Anal.Biochem.,105,361−3
63,1980）により可視化した。Ｎ−末端配列決定のため
に、トランスフォア（Transphor）装置（Hoefer,San Fr
ancisco,CA）内において、PXDF（ポリビニリデンジフル
オリド）膜（Immobilon,Millipore,bedcord,MA）上でタ
ンパク質のエレクトロブロッティングを行ない、Matsud
aira,P.,Sequence from picomole quantities of prote
ins electroblotted on to polyvinylidene difluoride
membranes.J.biol.Chem.,262,10035−10038,1987に記
述されているようにアミノ酸組成を解析した。
アミノ酸解析 PVDF膜に転写されたタンパク試料のアミノ酸解析は、
ハーバード大学マイクロケミストリー施設で行なった。
タンパク質（0.6μｇおよび0.8μｇ）を6N HCl中におい
て110℃で２時間加水分解した。Ebert,R.F.,Amino acid
analysis by HPLC:optimized conditions for chromat
ography of phenylthiocarbamyl derivatives,Anal.Bio
chem.,154,431−435,1986に記述されているように、遊
離アミノ酸をフェニルイソチオシアネートで誘導体と
し、得られたフェニルチオカルバミルアミノ酸をHPLCで
分析した。
チロシンヒドロキシラーゼ活性についての免疫沈降解析 界面活性剤可溶化（PBS中の１％ NP 40）メラノーマ
（SK−MEL−19）細胞抽出物100μｇの一定量を、３−15
μｇのMAb TA99（抗gp75）、MAb F23またはPBSと共に、
総容量45μで、連続的に混合しながら、４℃で90分間
インキュベートした。プロテインＡセファロースCL 4B
を最終濃度6mg/mまで添加した。４℃で２時間インキ
ュベートした後、４℃で５分間、15,000rpmで遠心分離
することにより上清を集めた。ペレットを１％ NP 40を
含有するPBSで５回洗浄し、同じ緩衝液50μに懸濁し
た。チロシンヒドロキシラーゼ活性は、上清およびペレ
ット中で測定した。プロテインＡセファロースを添加す
る以前に細胞抽出物中に存在した全チロシンヒドロキシ
ラーゼ活性約85％は、PBSコントロールの上清中に再現
性よく得られた。抗体およびプロテインＡセファロース
と共にインキュベートした細胞抽出物の上清において得
られた酵素活性を、PBSコントロールにおいて得られた
活性に対する割合で表わす。
チロシンヒドロキシラーゼ検定 チロシンヒドロキシラーゼ活性を、Pomerantz,S.H.,L
−Tyrosine−3,5−H assay for tyrosinase developmen
t in skin of newborn hamsters,Science,164,838−83
9,1969に記述されているように、多少の変更（Bouchar
d,B.Fuller,B.,Vijayasaradhi,S.and Houghton,A.N.,In
duction of pigmentation in mouse fibroblasts by ex
pression of human tyrosinase,J.exp.Med.,169,2029−
2042,1989）を加えて検定した。酵素活性１単位は、37
℃で１時間に3Hチロシナーゼから１μモルの3H2Oを放出
させるのに必要なタンパク質の量と定義された。
タンパク質の決定 バイオラッド・タンパク検定システム（Bio−Rad Pro
tein Assay System）を用い、染料結合法（Bradford,
M.,A rapid and ultrasensitive method for the quant
itation of microgram quantities of protein utilizi
ng the principle of protein−dye binding,Anal.Bioc
hem.,72,248−254,1976）によりタンパク質濃度を評価
した。精製gp75は、一連の既知量（10−100ng/タンパク
質バンド）の銀染色分子量マーカータンパク質に対する
ポリアクリルアミドゲル上のタンパク質バンドの染色強
度の概算により定量した。
結果および考察 メラノーマ細胞株SK−MEL−19の後核膜分画をgp75抗
原の源として用いた。この膜分画をハイ・ソルト（higt
salt）で処理した後、ハイ・ソルト不溶分画を界面活
性剤デオキシコール酸塩中で可溶化した。各ペレットを
除く全ての亜細胞分画を、SK−MEL−19細胞へのMAb TA9
9結合の阻害（gp75活性）を測定する競合ELISAによっ
て、gp75の存在について検定した。gp75は、デオキシコ
ール酸可溶化膜分画中にのみ検出され、ハイ・ソルト可
溶分画中には検出されなかった。これは、gp75の完全な
膜局在と一致する。gp75のメラノソーム膜局在は、35S
−メチオニンを用いるメラノーマ細胞の代謝パルス−チ
ェイス標識、続く（メラノソームを強化するための）不
連続ショ糖濃度勾配分画および免疫沈降分析により示さ
れた。これらの実験において、gp75は、メラノソームを
含有する、界面活性剤可溶化し、色素形成した勾配分画
からのみ免疫沈降が可能であった。
gp75の初期強化は、モノＱ（陰イオン交換）カラムで
のデオキシコール酸塩可溶膜分画の分画により行なわれ
る。結合gp75は、0.26−0.5M NaClで、電荷微小不均一
性（microheterogeneity）を示すブロードピークの活性
を有して溶出した。これは、二次元SDS−PAGE（pI 5.5
−5.9）により確認された。カラム平衡緩衝液および試
料緩衝液中における両性イオン性界面活性剤３−［（３
−コラミドプロピル）ジメチル−アミノ］１−プロパン
スルホネート（CHAPS）の存在もしくは不存在は、モノ
Ｑカラムへのgp75の結合に影響を及ぼさないが、溶出緩
衝液へのCHAPSの添加はgp75の収率を改善することが観
察された。
gp75活性を有するモノＱ分画をプールし、コンカナバ
リンＡ（Con A）カラム緩衝液中で透析してCon A−セフ
ァロースカラムにかけた。のせたタンパク質の約60％が
Con Aに結合した。結合タンパク質を0.25Mα−Ｄ−メチ
ルマンノピラノシドを用いて溶出させることで、ブロー
ドな主要ビークに小ピークが続く結果が得られる。Con
Aカラムへのgp75の結合に不均一性が存在し、これは溶
出の間のgp75活性の複数のピークにより示される。これ
は、複数のカラムを可動させる際に首尾一貫して観察さ
れる。メラノサイトおよびメラノーマ細胞におけるgp75
は、Asn−結合複合炭水化物の数もしくは塑性のいずれ
かが異なる２種の成熟携帯で存在することが観察され
た。しかしながら、Con Aへの結合における不均一性
は、gp75上のAsn−結合、抗マンノース炭水化物におけ
る検出可能な相違からは起こらない。これは、溶出され
たピーク分画の放射性ヨウ素か、およびMAb TA99を用い
たgp75の免疫沈降、それに続くエンド−β−Ｎ−アセチ
ル−グルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）消化による抗マ
ンノース炭水化物鎖の除去により示された。試験した全
てのピークは、エンドＨ消化の後にSDS−PAGE上で63−
および66−kDaのバンドを生じるgp75の２種の成熟形態
を有していた。
Con A溶出液からのgp75を含有する分画をプールし、M
Ab TA99アフィニティカラムにかけた。ELISAおよびSDS
−PAGEの銀染色によって測定されるように、アフィニテ
ィカラムの流出液中のgp75は完全に低下した。全タンパ
ク質の92％を含有する流出液をカラムにのせた。結合gp
75の溶出条件は、（「材料および方法」に記載したよう
に）ELISAによる、透過性が付与され、メタノール：ア
セトン固定されたSK−MEL−19メラノーマ細胞に対するM
Ab TA99結合の阻害に基づいて予め決定した。gp75へのM
Ab TA99の結合は、0.1MグリシンHCl緩衝液、pH3.1によ
って取り消す、すなわち逆転させることができる。0.1M
グリシンHCl緩衝液、pH3.1、を用いるカラムの溶出は、
ポリアクリルアミドゲル上の銀染色gp75バンドの強度に
よって決定されるように、カラムにのせたタンパク質1.
7mgから精製gp75約0.5ナノモルを生じた。TA99抗体アフ
ィニティカラムからのgp75の溶出はまた、銀染色ゲル上
に53、28および26kDaの追加の小バンドとして現われる
痕跡量のTA99抗体（重鎖および軽鎖）のろ過を生じる結
果となる。これらの追加のバンドは、カラムに結合した
TA99抗体に起因し、SK−MEL−19抗原調製物からではな
いことが、（１）ウサギ抗マウスIgG抗体との53−、28
−および26−kDaタンパク質の免疫沈降、および（２）
これらのバンドがSK−MEL−19溶解物の放射性ヨウ化調
製物からは生じないという実証により確認された。gp75
の精製の概要を表Ｉに示す。
１プールされ、透析された分画中のタンパク量は、ブラ
ッドフォード染料結合法（Bradcord′s dye binding me
thod）（1976）により測定した。２ 活性１単位は、MAb TA99（300/mg）のSK−MEL−19細
胞への結合の半最大阻害に必要なタンパク質量と定義さ
れた。3 TA99アフィニティカラム溶出液中の精製gp75の量は、S
DS−PAGE上の銀染色バンドの強度の概算により評価し
た。
ND.検出されず。
アフィニティ精製gp75は、アミノ酸解析に利用した。
gp75のアミノ酸組成を表IIに示す。
アミノ酸解析は、PVDF膜に転写された精製gp75の２種
の試料（600および800ng）について行なった。括弧内の
数字は検出された各アミノ酸のpmolである。Asx＝アス
パラギン酸およびアスパラギンの合計;Glx＝グルタミン
酸およびグルタミンの合成。ND＝検出されず。
gp75の３種の内部ペプチドの配列およびgp75cDNAの部
分配列は、実験１において示した。gp75のアミノ酸組成
は、アカパンカビ（N.crassa）（Lerch,K.,Longoni,C.,
and Jordi,E.,Primary structure of tyrosinase from
Neurospora crassa,J.biol.Chem.,257,6408−6413,198
2）および哺乳動物のチロシナーゼ、およびマウスｂ遺
伝子生成物（Shibahara,S.,Tomita,Y.,Sakakura,T.,Nag
er,C.,Chaudhuri,B.,and Muller,R.,Cloning and expre
ssion of cDNA eucoding mouse tyrosinase,Nucl.Acids
Res.,14,2413−2427,1986;Bouchard,B.,Fuller,B.,Vij
ayasaradhi,S.,and Houghton,A.N.,Induction of pigme
ntation in mouse fibroblasts by expression of huma
n tyrosinase,J.exp.Med.,169,2029−2042,1989;Cohen,
T.,Muller,R.M.,Tomita,Y.,and Shibahara,S.,Nucleoti
de sequence of the cDNA encoding human tyrosinase
−related protein,Nucl.Acid.Res.,18,2807,1990）の
アミノ酸配列に類似していた。エドマン分解法によって
gp75のＮ−末端配列解析を行なおうとする試みは、ブロ
ックされたＮ−末端の存在により不成功に終わった。ア
カパンカビ・チロシナーゼのＮ−末端セリン残基もま
た、この場合はアセチル基により、ブロックされている
（Lerch,K.,Longoni,C.,and Jordi,E.,Primary structu
re of tyrosinase from Neurospora crassa,J.biol.Che
m.,257,6408−6413,1982）。
gp75およびチロシナーゼの両者はメラノソームに局在
する75−kDaの膜糖タンパク質であり、類似のアミノ酸
組成、約40％のアミノ酸配列同一性（実験１参照;Cohe
n,T.,Muller,R.M.,Tomita,Y.,and Shibahara,S.,Nucleo
tide sequence of the cDNA encoding human tyrosinas
e−related protein,Nucl.Acid.Res.,18,2807,1990）、
および（チロシナーゼの触媒活性に必要な）２つの潜在
的な協同的結合部位（cooper−binding sites）を有し
ている。幾人かの探索者は、マウスgp75が、チロシナー
ゼ分子の特性であるチロシンヒドロキシラーゼ活性を有
することを提唱している（Hearing,V.J.,Jimenez,M.,An
alysis of mammalian pigmentation at the molecular
level,Pigment.Cell.Res.,2,75−85,1989）。
チロシンヒドロキシラーゼ活性は、MAb TA99を用いる
沈殿の後の、SK−MEL−19メラノーマ細胞抽出物の上清
および免疫沈降物中で測定した。TA99による酵素活性の
特別な低下は見られなかった；細胞抽出物をコントロー
ル抗体（MAb F23）もしくはMAb TA99のいずれかと共に
インキュベートした後、上清中にチロシンヒドロキシラ
ーゼ活性の94％を再現することができた（表III）。
抗体濃度を300μg/mまで増加させても、上清中にお
けるチロシンヒドロキシラーゼ活性の再現に有意の減少
は観察されなかった。免疫沈降物中では、酵素活性は再
現されなかった。これらの結果は、ヒトメラノーマ細胞
におけるほとんど全てのチロンヒドロキシラーゼ活性
が、gp75抗原とは区別される分子によるものであると説
明されることを示している。
１括弧内の数値は緩衝液コントロール（＝100％）と比
較した、上清中に再現されたチロシンヒドロキシラーゼ
活性の割合である。２ コントロールチューブは、「材料および方法」に記載
されるように、PBSと共にインキュベートされた後、プ
ロテインＡセファロースにかけた。３ マウスMAb F23（IgG2a）は、ヒトメラノサイト細胞と
反応しない抗結腸癌MAbである。
チロシンヒドロキシラーゼ活性は、精製の間に、gp75
を含有する分画においても測定した。全細胞チロシンヒ
ドロキシラーゼ活性は、後核膜の界面活性剤可溶化、モ
ノＱ陰イオン交換カラムに結合したタンパク質の勾配溶
出、およびCon A分画の間に、gp75と共に、共鈍化（co
−purified）した。これは、gp75とヒトチロシナーゼと
の実施的な相同性と一致する。しかしながら、gp75とチ
ロシンヒドロキシラーゼ活性とは、MAb TA99アフィニテ
ィカラム上で分離する。SK−MEL−19のデオキシコール
酸塩可溶化、Con A精製分画をMAb TA99アフィニティカ
ラムにかけた場合には、溶出液中において、gp75活性は
完全に低下するのに対して≧75％のチロシンヒドロキシ
ラーゼ活性が再現される（表IV）。
１酵素活性１単位は、37℃１時間で、3H−チロシンから
１マイクロモルの3H2Oを放出するのに必要なタンパクの
量である。
溶出したgp75はチロシンヒドロキシラーゼ活性を有し
てはいなかったが、カラム溶出条件が酵素活性を消失さ
せることは可能である。これらの結果は、メラノサイト
細胞における（全てでないならば）ほとんどのチロシン
ヒドロキシラーゼ活性がgp75とは区別されるタンパク質
に帰するという結論を支持する。
gp75抗原は、色素形成ヒトメラノサイトおよびメラノ
ーマにおいて発現し、色素非形成メラノーマまたはメラ
ノサイト細胞型においては検出されない膜結合糖タンパ
ク質である（Thomson,T.M.,Mattes,J.M.,Roux,L.,Old,
L.J.and Lloyd,K.O.,Pigmentation−associated glycop
rotein of human melanoma and melanocytes:definitio
n with a mouse monoclonal antibody,J.invest.Derma
t.,85,169−174,1985;Thomson,T.M.,Real,F.X.,Murakam
i,S.,Cordon−Cardo,C.,Old,L.J.and Houghton,A.N.,Di
fferentiation antigens of melanocytes and melanom
a:analysis of melanosome and cell surface markers
of human pigmented cells with monoclonal antibodie
s,J.invest.Dermat.,90,459−466,1988）。免疫電子顕
微鏡法研究は、MAb TA99がメラノソーム膜またはその近
傍に結合することを明らかにしている（Thomson,T.M.,R
eal,F.X.,Murakami,S.,Cordon−Cardo,C.,Old,L.J.and
Houghton,A.N.,Differentiation antigens of melanocy
tes and melanoma:analysis of melanosome and cell s
urface markers of human pigmented cells with monoc
lonal antibodies,J.invest.Dermat.,90,459−466,198
8）。メラノーマ細胞におけるgp75の細胞内局在は、gp7
5が免疫系に接触するのを不可能にしているように見え
る。しかしながら、メラノーマ患者で、gp75に対するIg
G抗体が検出されている（Mattes,J.M.,Thomson,T.M.,Ol
d,L.J.and Lloyd,K.O.,A pigmentation−associated,di
fferentiation antigen of human melanoma defined by
a procipitating antibody in human Int.J.Cancer,3
2,717−721,1983）。これに関連して、MAb TA99は、メ
ラノーマ患者のIgG抗体によって沈殿した同様のgp75抗
原を認識する（Vijayasaradhi,S.,Bouchard,B.B.and Ho
ughton,A.N.,The melanoma antigen gp75 is the human
homologue of mouse b（brown）locus gene,J.exp.Me
d.,171−1375−1380,1990）。静脈内注射された放射性
標識MAb TA99は、無胸腺マウスのメラノーマ異種移植片
に効率よく局在し（Welt,S.,Mattes,J.M.,Grando,R.,Th
omson,T.M.Leonard,R.W.,Zanzonico,P.B.,Bigler,R.E.,
Yeh,S.,Oettgen,H.F.and Old,L.J.,Monoclonal antibod
y to an intracellular antigen images human melanom
a trasplants in nu/nu mice,Proc,nat.Acad.Sci.（Was
h.）,84,4200−4204,1987）、これはgp75抗原が免疫系
に用いられ得ることを示唆している。
メラノソーム糖タンパクチロシナーゼは、gp75がｂ
（褐色）遺伝子座であるのに対して、マウスｃ（アルビ
ノ）遺伝子座にマップされる遺伝子によってコードされ
る。チロシナーゼおよびgp75は、多数の共有タンパク質
を有している。類似の物理学的特性に加えて、複数のク
ロマトグラフィ工程を介するgp75およびチロシナーゼ活
性の共鈍化から明らかなように、これら２つのタンパク
質は分子同一性をも共有する（アミノ酸レベルで43.1
％、およびヌクレオチドレベルで55.3％）（Vijayasara
dhi,S.,Bouchard,B.B.and Houghton,A.N.,The melanoma
antigen gp75 is the human homologue of mouse b（b
rown）locus gene,J.exp.Med.,171,1375−1380,1990;Co
hen,T.,Muller,R.M.,Tomita,Y.and Shibahara,S.,Nucle
otide sequence of the cDNA encoding human tyrosina
se−related protein,Nucl.Acids Res.,18,2807,199
0）。
抗チロシナーゼ抗体は、チロシナーゼ、ｂ（褐色）遺
伝子座タンパク質および、恐らく、関連タンパク質の一
族と交差反応する（Shibahara,S.,Tomita,Y.,Sakakura,
T.,Nager,C.,Chaudhuri,B.and Muller,R.,Cloning and
expression of cDNA encoding mouse tyrosinase,Nucl.
Acids Res.,14,2413−2427,1986;Jackson,I.J.,A cDNA
encoding tyrosinase−related protein maps to the b
rown locus in mice,Proc.nat.Acad.Sci.（Wash.）,85,
4392−4396,1988;Hearing,V.J.,and Jimenez,M.,Analys
is of mammalian pigmentation at the molecular leve
l,Pigment Cell Res.,2,75−85,1989）。したがって、
精製gp75抗体がチロシナーゼとは区別されることを示す
ことが重要であった。gp75およびチロシナーゼ酵素活性
は共鈍化したが、ほとんどのチロシナーゼ酵素活性は、
TA99アフィニティクロマトグラフィを用いる精製の間に
gp75から分離することができる。全細胞チロシンヒドロ
キシラーゼ活性のほとんどは、MAb TA99アフィニティカ
ラムの通過分中に回収され、これは、チロシンヒドロキ
シラーゼ活性がgp75とは区別される分子によって触媒さ
れることを示唆している。MAb TA99がチロシンヒドロキ
シラーゼ活性を免疫沈降させない、もしくは枯渇させな
いという事実は、この観察と一致する（表IV;Thomson,
T.M.,Mattes,J.M.,Roux,L.,Old,L.J.and Lloyd,K.O.,Pi
gmentanion−associated glycoprotein of human melan
oma and melanocytes:definition with a mouse monocl
onal antibody,J.invest.Dermat.,85,169−174,198
5）。Jimenez,M.,Malvoy,L.and Hearing,V.J.,Specific
identification of an authentic clone for mammalia
n tyrosinase,J.biol.Chem.,264,3397−3403,1989は、
マウスｂ遺伝子座タンパク質に対する抗ペプチド抗体を
使用し、ｂタンパク質がマウスメラノーマ細胞における
チロシナーゼ活性の15−30％を説明することを示唆して
いる。我々の結果は、gp75がチロシンヒドロキシナーゼ
活性を有していないことを示唆している。しかしなが
ら、gp75が、色素形成メラノーマ細胞における酵素活性
の５％を説明する非常に弱いチロシンヒドロキシラーゼ
活性を有する可能性を除外することはできない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビジャヤサラデイ、セタルリ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10028、ニューヨーク、イースト・エイ ティーファースト・ストリート 504 (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，42 （1982），ｐ．583−589 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，43 （1983），ｐ．2773−2779 Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏ Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇ ｙ，90（４）（1988）, (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/869 C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】両端がEcoR Iによって区分されたプラスミ
    ドGP75 Ｅ−１の約2.7kbの部分によってコードされるg
    p75のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子で
    あって、大腸菌内の該プラスミドがATCC受付番号68565
    でATCCに寄託された核酸分子。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の核酸分子であって、下記
    の配列を含む核酸分子。
  3. 【請求項３】両端がEcoR Iによって区分されたプラスミ
    ドGP75 Ｅ−１の約2.7kbの部分のgp75コード配列を有
    する単離された核酸分子であって、大腸菌内の該プラス
    ミドがATCC受付番号68565でATCCに寄託された核酸分
    子。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の単離された核酸分子であ
    って、下記のアミノ酸配列を有するgp75の断片をコード
    する核酸分子： Asn−Thr−Val−Glu−Gly−Tyr−Ser−Asp−Pro−Thr−
    Gly−Lys−Tyr−Asp−Pro−Ala−Val; Met−Phe−Val−Thr−Ala−Pro−Asp−Asn−Leu−Gly−
    Tyr−Thr−Tyr−Glu;もしくは Asn−Phe−Asp−Ser−Thr−Leu−Ileu−Ser−Pro−Asn
    −Ser−Val−Phe−Ser;またはこれらの何れかの組合わ
    せ。
  5. 【請求項５】請求項４に記載の単離された核酸分子であ
    って、gp75の断片の配列が、 Asn−Thr−Val−Glu−Gly−Tyr−Ser−Asp−Pro−Thr−
    Gly−Lys−Tyr−Asp−Pro−Ala−Val である核酸分子。
  6. 【請求項６】請求項４に記載の単離された核酸分子であ
    って、gp75の断片のアミノ酸配列が、 Met−Phe−Val−Thr−Ala−Pro−Asp−Asn−Leu−Gly−
    Tyr−Thr−Tyr−Glu である核酸分子。
  7. 【請求項７】請求項４に記載の単離された核酸分子であ
    って、gp75の断片のアミノ酸配列が、 Asn−Phe−Asp−Ser−Thr−Leu−Ileu−Ser−Pro−Asn
    −Ser−Val−Phe−Ser である核酸分子。
  8. 【請求項８】cDNAである請求項１に記載の単離された核
    酸分子。
  9. 【請求項９】cDNAである請求項４に記載の単離された核
    酸分子であって、下記の配列を含むcDNA分子：
  10. 【請求項１０】請求項８に記載の単離されたcDNA分子に
    よってコードされるポリペプチド。
  11. 【請求項１１】請求項８記載のcDNA分子に結合したベク
    ターの複製に必須のDNA配列を含む、宿主における発現
    に適合した発現ベクター。
  12. 【請求項１２】請求項９に記載のcDNA分子に結合したベ
    クターの複製に必須のDNA配列を含む、宿主における発
    現に適合した発現ベクター。
  13. 【請求項１３】発現ベクターがワクチニアウイルスであ
    る請求項11または12に記載の発現ベクター。
  14. 【請求項１４】発現ベクターがイムクロンベクターであ
    る請求項11または12に記載の発現ベクター。
JP50783191A 1990-03-22 1991-03-22 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５ Expired - Fee Related JP3336006B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49743190A 1990-03-22 1990-03-22
US497,431 1990-03-22
PCT/US1991/001942 WO1991014775A1 (en) 1990-03-22 1991-03-22 Gp75 as a tumor vaccine for melanoma

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001391870A Division JP2002241314A (ja) 1990-03-22 2001-12-25 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06501837A JPH06501837A (ja) 1994-03-03
JP3336006B2 true JP3336006B2 (ja) 2002-10-21

Family

ID=23976841

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50783191A Expired - Fee Related JP3336006B2 (ja) 1990-03-22 1991-03-22 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５
JP2001391870A Pending JP2002241314A (ja) 1990-03-22 2001-12-25 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001391870A Pending JP2002241314A (ja) 1990-03-22 2001-12-25 メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５

Country Status (21)

Country Link
US (2) US6168946B1 (ja)
EP (2) EP0965640A1 (ja)
JP (2) JP3336006B2 (ja)
AT (1) ATE187493T1 (ja)
AU (1) AU660412B2 (ja)
CA (1) CA2078773C (ja)
CZ (1) CZ290278B6 (ja)
DE (1) DE69131829T2 (ja)
DK (1) DK0522078T3 (ja)
ES (1) ES2141089T3 (ja)
FI (1) FI113786B (ja)
GR (1) GR3032804T3 (ja)
HK (1) HK1014732A1 (ja)
HU (1) HU218416B (ja)
IE (2) IE910820A1 (ja)
NO (1) NO311366B1 (ja)
NZ (1) NZ237532A (ja)
PL (3) PL168235B1 (ja)
PT (1) PT97103B (ja)
SK (1) SK282873B6 (ja)
WO (1) WO1991014775A1 (ja)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE910820A1 (en) * 1990-03-22 1991-09-25 Sloan Kettering Inst Cancer Gp75 as a tumor vaccine for melanoma
US7041801B1 (en) * 1995-06-07 2006-05-09 Vanderbilt University Antibodies binding to polypeptides encoded by developmentally-regulated endothelial cell locus-1
US7001600B1 (en) 1996-02-09 2006-02-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
US6083703A (en) * 1996-02-09 2000-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes
US7015312B1 (en) 1996-02-09 2006-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antibodies to the protein product encoded by ORF3 of the TRP-1 gene and compositions and kits thereof
CA2399816A1 (en) * 2000-02-15 2001-08-23 Regents Of The University Of California A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase
US6613534B2 (en) 2001-03-20 2003-09-02 Wake Forest University Health Sciences MAP-2 as a determinant of metastatic potential
US20030113919A1 (en) * 2001-08-17 2003-06-19 Aventis Pasteur, Ltd. Immunogenic targets for melanoma
US20030157720A1 (en) * 2002-02-06 2003-08-21 Expression Technologies Inc. Protein standard for estimating size and mass
US20090117034A1 (en) 2007-06-15 2009-05-07 Nanhai Chen Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
TWI384997B (zh) 2008-03-12 2013-02-11 Imclone Llc 抗酪胺酸酶相關蛋白-１（ｔｙｒｐ１）抗體

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2504010B1 (fr) * 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4808704A (en) * 1981-09-30 1989-02-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human malignant melanoma
US4806628A (en) * 1982-11-30 1989-02-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies against melanocytes
US4591572A (en) * 1983-04-01 1986-05-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Pigmentation associated, differentiation antigen of human melanoma and autologous antibody
USH819H (en) * 1984-04-30 1990-09-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Energy Palladium-109 labeled anti-melanoma monoclonal antibodies
US4851510A (en) * 1984-11-30 1989-07-25 Wadley Technologies, Inc. Monoclonal antibodies to novel melanoma-associated antigens
US4798790A (en) * 1985-07-18 1989-01-17 Sloan-Kettering Institute Monoclonal antibody specific for a pigmentation associated antigen
US5141742A (en) * 1986-02-07 1992-08-25 Oncogen Vaccines against melanoma
US5262177A (en) * 1986-02-07 1993-11-16 Oncogen Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen
US5009995A (en) * 1986-10-27 1991-04-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to melanoma cells
US5059523A (en) * 1988-05-02 1991-10-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Cell-surface glycoproteins of human sarcomas
US5009495A (en) * 1989-05-26 1991-04-23 Williams Robert D Hinge for eyeglasses
DE69033842T2 (de) 1989-08-04 2002-06-20 Schering Ag Äusserliche domäne von c-erbb-2:gp75
IE910820A1 (en) * 1990-03-22 1991-09-25 Sloan Kettering Inst Cancer Gp75 as a tumor vaccine for melanoma
US5262117A (en) * 1990-10-12 1993-11-16 Centro Sviluppo Settori Impiego S.R.L. Process for preparing thermoinsulating and/or structural formed articles and products so obtained
US6180604B1 (en) * 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２（１９８２），ｐ．５８３−５８９
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（１９８３），ｐ．２７７３−２７７９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，９０（４）（１９８８），

Also Published As

Publication number Publication date
PL168235B1 (pl) 1996-01-31
NO923659D0 (no) 1992-09-21
NO311366B1 (no) 2001-11-19
EP0522078A1 (en) 1993-01-13
IE20000918A1 (en) 2001-05-30
EP0522078B1 (en) 1999-12-08
PL169168B1 (pl) 1996-06-28
PL169105B1 (pl) 1996-06-28
AU7690691A (en) 1991-10-21
FI113786B (fi) 2004-06-15
PT97103B (pt) 1999-02-26
DK0522078T3 (da) 2000-06-13
PL289550A1 (en) 1992-07-27
CZ290278B6 (cs) 2002-07-17
IE910820A1 (en) 1991-09-25
HK1014732A1 (en) 1999-09-30
DE69131829T2 (de) 2000-06-15
JPH06501837A (ja) 1994-03-03
ES2141089T3 (es) 2000-03-16
CS76091A3 (en) 1992-02-19
HU218416B (hu) 2000-08-28
CA2078773C (en) 2001-07-03
GR3032804T3 (en) 2000-06-30
HUT62934A (en) 1993-06-28
JP2002241314A (ja) 2002-08-28
CA2078773A1 (en) 1991-09-23
US20050037462A1 (en) 2005-02-17
WO1991014775A1 (en) 1991-10-03
ATE187493T1 (de) 1999-12-15
DE69131829D1 (de) 2000-01-13
SK282873B6 (sk) 2003-01-09
NZ237532A (en) 1993-03-26
AU660412B2 (en) 1995-06-29
EP0522078A4 (en) 1993-05-26
FI924222A0 (fi) 1992-09-21
PT97103A (pt) 1991-12-31
EP0965640A1 (en) 1999-12-22
FI924222A (fi) 1992-09-21
US6168946B1 (en) 2001-01-02
NO923659L (no) 1992-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vijayasaradhi et al. The melanoma antigen gp75 is the human homologue of the mouse b (brown) locus gene product.
Radu et al. Nup155 is a novel nuclear pore complex protein that contains neither repetitive sequence motifs nor reacts with WGA.
JP3336006B2 (ja) メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５
US5891857A (en) Characterized BRCA1 and BRCA2 proteins and screening and therapeutic methods based on characterized BRCA1 and BRCA2 proteins
AU701105B2 (en) Colon cell and colon cancer cell associated nucleic acid molecules, protein and peptides
JP2004537252A (ja) 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
Vijayasaradhi et al. Purification of an autoantigenic 75‐kDa human melanosomal glycoprotein
CA2098397C (en) Physiologically active substance designated as epimorphin, genes encoding the same, and antibodies thereto
JP2001512971A (ja) 癌および腫瘍随伴性神経症候群の診断および治療におけるｕｌｉｐの使用
JPH09208492A (ja) 滑膜ホスホリパーゼ抗体
CA2113202A1 (en) Neural calcium-activated neutral proteinase inhibitors
JP2688481B2 (ja) 消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法
JPH09194502A (ja) 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
Amar-Costesec et al. Identification and characterization of the tumor-specific P1A gene product
JP4315257B2 (ja) 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
EP0368920B1 (fr) Lectines fixant le beta-d-galactoside
EP1369478A1 (en) Novel scavenger receptor class a protein
JP4037451B2 (ja) 大腸細胞および大腸癌細胞関連核酸分子、タンパク質およびペプチド
Kodama et al. Partial amino acid sequence of the major intrinsic protein (MIP) of the chicken lens deduced from the nucleotide sequence of a cDNA clone
CA2175454A1 (en) Helminth parasite antigen with aminopeptidase-like activity
JPH08217796A (ja) ヒトプロテアソームサブユニット
JP2000501603A (ja) 尿生殖洞由来増殖因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
JPH11222499A (ja) プロテアソーム抑制蛋白質およびそれをコードするポリヌクレオチド

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees