JPH09208492A - 滑膜ホスホリパーゼ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 炎症性疾患を治療するために有用な抗哺乳類
滑膜ホスホリパーゼA₂抗体を含有する治療用組成物、お
よびこの抗体を用いる哺乳類滑膜ホスホリパーゼA₂の定
量方法を提供すること。 【解決手段】 哺乳類滑膜ホスホリパ−ゼＡ₂に固有の
エピトープを認識する抗体を含む組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本出願は、1987年8月27日付
出願の米国特許出願第089,883号の一部継続出願であ
る、1988年7月6日付出願の米国特許出願第215,426号の
一部継続出願である。そしてこれらの開示内容は参考と
して本文に示されている。

【０００２】本発明は、組換え法によるタンパクの分
離、特性付け、および製造に関する。さらに詳しくは、
本発明は滑膜ホスホリパーゼA₂に関する。

【０００３】

【従来の技術】炎症性疾患は、現在衰弱疾患の重要なパ
ーセンテージを占めている。慢性関節リウマチ、全身性
狼瘡、乾癬、そしておそらくアテローム性動脈硬化症の
ような慢性症状は、関節、皮膚および血管における炎症
反応から生じる。炎症反応の中心的役割がエイコサノイ
ドと呼ばれるリン脂質代謝産物の産生であることは現在
明らかになっている。ほとんどの組織において、エイコ
サノイドの合成は複合脂質中のエステル化貯蔵物から遊
離するアラキドン酸(AA)の利用率によって制限されるこ
とが一般的に認められている。

【０００４】滑膜ホスホリパーゼA₂（PLA₂；EC3.1.1.
4）は1,2-ジアシル-sn-グリセロ-ホスホコリンのsn²か
らの脂肪酸の放出を触媒する。最もよく特性付けられて
いる種類は、哺乳類の膵臓中でチモーゲンとして分泌さ
れる消化酵素である。各種の哺乳類由来の膵臓PLA₂酵素
に対するアミノ酸配列とcDNAがクローン化されている。
例えば、O'Haraら(1976) J.Biochem 99：733〜739；Duf
tonら(1983) Eur J.Biochem 137：537〜544；Grataroli
ら(1982) Eur J Biochem 122：111〜117を参照のこと。
これらの哺乳類PLA₂酵素はヘビおよびミツバチの毒物ホ
スホリパーゼと密接な相同性がある（Duftonら、前出の
文献）。特に、重要な活性部位の残基とシステインの配
列は極めてよく保存されているようである。ウシ膵臓PL
A₂およびいくつかの毒物酵素のＸ線結晶構造解析によ
り、PLA₂酵素の構造と作用機構に関する詳細なモデルが
解明されるに至った。例えば、Renetsederら(1985) J.B
iol chem 260：11627〜11634を参照のこと。膵臓PLA₂お
よび毒物PLA₂の両者が前炎症性であることが示されてい
る（Pruzanskiら(1986) J Invest Dermatol 86：380〜3
83）。別の消化PLA₂がブタの腸から単離され、部分的な
アミノ酸配列が推定された（Vergerら(1982) Biochemis
try 21：6883〜6889）。

【０００５】膵臓PLA₂の構造は、新規なPLA₂阻害因子を
設計するためのモデルとして使用されてきた。しかし、
このアプローチは、インビボでの炎症阻害に有効である
ことが証明された薬剤を設計するには至っていない。

【０００６】しかし、PLA₂が、哺乳類の炎症性疾患にお
いて中心的役割を果たすとすれば、おそらくほとんどの
場合消化形によってではないであろう。むしろ、「細胞
性」PLA₂酵素と称される類似PLA₂酵素が炎症発現におけ
るAA放出の調節因子である可能性が高いようである。残
念ながら、これらの細胞性PLA₂酵素はよく理解されてい
ない。これは、十分な量の細胞性PLA₂酵素を得ることが
困難であり、消化形のPLA₂よりも広汎な精製を必要とす
るという事実に起因する。

【０００７】細胞形のPLA₂は、以下のものを包含する種
々の哺乳類組織や細胞型から分離されている：脳（Gray
とStrickland，1982，Can J.Biochim 60：108〜117）、
肝臓（Dewinterら，1982，Biochim Biophys Acta 712：
332〜341）、肺（Fransonら，1982，Lung 160：275〜28
4；Garciaら，1975，Biochim Biophys Res Comm 64：12
8〜135；SahuとLynn，1977，Biochim Biophys Acta 48
9：307〜317）、腸（Vergerら，1982，Biochemistry 2
1：6883〜6889），脾臓（Taramotoら，1983，J.Biochim
93：1353〜1360）、マクロファージ（TrotterとSmith,
1986, Neurochem Res 11：349〜361；LanniとFranso
n，1981，Biochim Biophys Acta 658：54〜63；Vadasと
Hay，1980，Life Science 26：1721〜1729；Vadasら，1
981，Nature 293：583；Wightmanら，1981，Biochim J
200：441〜444；Fransonら，1973，Biochim Biophys Ac
ta 296：365〜373）、白血球（TraynorとAuthi，1981，
Bochim Biophys Acta 665：571〜577；Fransonら，197
7，Biochim J 167：839〜841）、赤血球（Kramerら，19
78，Biochim Biophys Acta 507：381〜394）、腹水（Fo
rstら，1986，Biochemistry 25：8381〜8385）、軟骨細
胞（Changら，1986，J Immunol 136：1283〜1287）、お
よび血小板（Hayakawaら，1988，J Biochem103：263〜2
66；Hayakawaら，1987，J.Biochim 101：1311〜1314；J
esseとFranson，1979，Biochim Biophys Acta 575：467
〜470；Apitz-Castroら，1979，Biochim Biophys Res C
omm 91：１，63〜71）。レビューとしては、Van Den Bo
sch(1980) Biochim Biophys Acta 604：191〜246を参照
のこと。本出願人による1986年12月24日付出願の米国特
許出願第946,557号も参照されたい。

【０００８】特に興味深いのは、慢性関節リウマチ患者
の滑液のような炎症性滲出液からPLA₂を分離することで
ある。Stefanskiら、(1986) J. Biochim 100：1297〜13
03；Vadasら(1985) Life Sciences 36：579〜587；Vada
sとPruzanski(1984) Adv Inflammation Res 7：51〜5
9；Vadasら(1981) Nature 293：583〜585；Pruzanskiら
(1985) J Rheumstol 12：211〜216；Silvermanら、Amer
ican Rheumatism Ass'n：51st Annual Scientific Meet
ing（1987年6月9〜13日、Washington, D.C.）Pruzanski
ら、同上。

【０００９】これらの様々な細胞性酵素の活性について
の報告は、大きさ、至適pH、基質特異性、Ca⁺⁺要求、形
態（可溶性あるいは膜結合性）、および量が異なってい
る。これらの単離物についての完全なタンパク配列は公
的に報告されていないので（部分配列は、Vergerら、19
82、前出；Frostら、1986、前出；Hayakawaら、1987、
前出；およびHayakawaら、1988、前出に公表されてい
る）、これらの単離物のいずれかが、同じ酵素であるか
を判断することは困難である。さらに、リン脂質のsn²
部位の開裂は、PLA₁とリゾホスホリパーゼとの結合した
連続的作用からも生じ得るので、高度に精製された単離
物以外では直接PLA₁とPLA₂とを完全に識別することはむ
ずかしい。しかしながら、上記から明らかなように、こ
れらの酵素の多くは炎症反応に関連する細胞（すなわ
ち、マクロファージ、白血球、軟骨細胞、滑膜細胞な
ど）あるいは炎症性滲出液から調製されている。それに
もかかわらず、因果関係に関するデータが欠落している
ため、もしその中にあるとすれば、これらの酵素のうち
のいずれが、炎症反応において重要であるかを確定する
ことが困難であった。

【００１０】インビボで慢性関節リウマチの原因となる
形態のPLA₂が単離されれば、抗炎症薬の設計に役立つ重
要な手段を提供することになる。消化および毒物PLA₂阻
害因子に関する研究に基づいて、炎症性疾患の原因とな
るPLA₂の形態には、類似してはいるが、消化あるいは毒
物PLA₂の阻害因子が必ずしもインビボで後者の形態を阻
害しないような構造上の相違があると考えられる。従っ
て、特異的阻害因子を効果的に設計するためには、慢性
関節リウマチに関わる特異的PLA₂を、構造的に特性決定
することのできる十分な量で単離することが必要であ
る。PLA₂は、一般的に、食品加工産業（DutilhとGroge
r，1981，J Sci Food Agric 32：451〜458）および魚の
保存においても有用である。MazeaudとBilinski (1976)
J Fish Res Board Can 33：1297〜1302）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、以下
滑膜ホスホリパーゼA₂（滑膜PLA₂すなわちsPLA₂）と称
する、新しい族の哺乳類ホスホリパーゼA₂が哺乳類のゲ
ノム内にコードされており、それらはDNA配列およびア
ミノ酸配列がともに、既知のPLA₂酵素と実質的に異なる
ことが発見された。sPLA₂の遺伝子のクローニングによ
り、これらの新しい酵素の構造的特性付けができ、そし
て精製された相当量の酵素を製造する方法が提供され
る。従って本発明は、中でも、抗炎症薬の設計に役立つ
重要な手段を提供するものである。

【００１２】一実施態様において、本発明は、非相同領
域を含む二本鎖DNA構築物を含有する組成物を提供す
る。該領域は哺乳類滑膜ホスホリパーゼA₂のコード配列
を有し、該組成物は、該非相同領域を含まない構築物を
実質的に含有しない。このDNA構築物はレプリコン内に
含まれるか、あるいは含まれない。

【００１３】他の一実施態様において、本発明は、次の
工程を包含する、組換え体哺乳類滑膜ホスホリパーゼA₂
の製造方法を提供する：細胞内で機能し得るレプリコン
を含有する形質転換された細胞群を生産する工程、ここ
で；該レプリコンは該細胞内で機能し得るプロモーター
の制御下にあるコード配列を含み、該コード配列は哺乳
類滑膜ホスホリパーゼA₂をコードし、該細胞群は実質的
に他の細胞を含まない；哺乳類滑膜ホスホリパーゼを発
現する条件下で該細胞群を増殖させる工程；および該哺
乳類滑膜ホスホリパーゼA₂を回収する工程。本発明の方
法は、適当な原核細胞あるいは真核細胞発現系を使用す
ることができる。

【００１４】さらに他の実施態様において、本発明は、
実質的に夾雑タンパクを含まない哺乳類滑膜ホスホリパ
ーゼA₂を含有する組成物を提供する。

【００１５】さらに他の実施態様において、本発明は抗
哺乳類滑膜ホスホリパーゼA₂抗体、ならびに抗哺乳類滑
膜ホスホリパーゼA₂抗体を用いて炎症性疾患を治療する
方法を提供する。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳類滑膜ホ
スホリパ−ゼＡ₂に固有のエピトープを認識する抗体を
含む組成物に関する。

【００１７】本発明はまた、炎症性疾患の処置のための
治療用組成物であって、有効量の抗哺乳類滑膜ホスホリ
パーゼＡ₂抗体を含む組成物に関する。

【００１８】さらに、本発明は、試料中の哺乳類滑膜ホ
スホリパーゼＡ₂（sPLA₂）Ａ型およびＢ型を定量する方
法であって、哺乳類由来の滑液試料を提供すること、お
よび定量分析において該試料中の該哺乳類滑膜ホスホリ
パーゼＡ₂（sPLA₂）Ａ型およびＢ型の量を測定すること
を包含する方法に関する。好ましい実施態様では、上記
方法は、上記定量分析が免疫学的検定法である。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の実施には、特に記載がな
い限り、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物
学、および組換えDNA技術を使用する。そのような技術
は文献中に十分に説明されている。例えば、Maniatis、
FritschおよびSambrook、「分子クローニング：実験室
マニュアル」(1982)「DNAクローニング：実践的アプロ
ーチ」、Ｉ巻とII巻（D.N. Glover）編、1985)；「オリ
ゴヌクレオチドの合成」(H.J. Gait編、1984)；「核酸
ハイブリダイゼーション」(B.D. HamesとS.J. Higgins
編、1985)；「転写と翻訳」(B.D. HamesとS.J. Higgins
編、1984)；「動物細胞培養」(R.I. Freshney編、198
6)；「固定化細胞および酵素」(IRL Press、1986)；B.P
erbal、「分子クローニングの実践的手引」(1984)を参
照のこと。

【００２０】本発明を説明するにあたり、次の語句を以
下に述べる定義に従って使用する。

【００２１】「レプリコン」とは、インビボでDNA複製
の自律単位として機能する、すなわち、自らの制御下で
複製を行ない得る遺伝的要素（例えばプラスミド、染色
体、ウイルス）である。

【００２２】「ベクター」とは、別の１つのDNAセグメ
ントが結合し得、結合したセグメントの複製を引きおこ
す、プラスミド、ファージあるいはコスミドのようなレ
プリコンである。

【００２３】「二本鎖DNA分子」とは、正常な二本鎖ら
せん状の重合体形態のデオキシリボヌクレオチド（アデ
ニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）を指す。
この語句は、分子の一次および二次構造のみを指し、分
子を特定の三次形態に限定するものではない。従って、
この語句は、特に線形DNA分子（例えば制限断片）、ウ
イルス、プラスミド、および染色体において認められる
二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の構造を検
討するにあたり、本文中では、配列は、転写されないDN
A鎖（すなわちmRNAに相同な配列を持つ鎖）に沿って5'
末端から3'末端方向への配列のみを示す常法に従って記
述される。

【００２４】DNAの「コード配列」とは、適当な調節配
列の制御下に置かれた場合、インビボで転写され、ポリ
ペプチドに翻訳されるDNA配列である。コード配列の境
界は、5'(アミノ)末端の開始コドンと3'(カルボキシ)末
端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列
は、原核生物配列、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物
（例えば哺乳類）DNA由来のゲノムDNA配列、さらには合
成DNA配列をも包含し得るが、これらに限定されるもの
ではない。ポリアデニル化信号および転写終止配列は、
通常コード配列の3'側に位置する。

【００２５】「プロモーター配列」とは、細胞中でRNA
ポリメラーゼと結合して、下流（3'方向）のコード配列
の転写を開始させることのできるDNA調節領域である。
本発明を定義するために、プロモ−ター配列は、その3'
末端はコード配列の翻訳開始コドンまでとし、上流（5'
方向）は拡張されて、バックグラウンド以上の検出可能
なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基あ
るいは要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始
部位（ヌクレアーゼS1でのマッピングにより都合よく決
定される）、およびRNAポリメラーゼの結合を支配する
タンパク結合領域（コンセンサス配列）が認められる。
真核生物プロモーターは、常にではないがしばしば、
「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含む。原核
生物プロモーターは、−10および−35コンセンサス配列
に加えてシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列
を含む。

【００２６】プロモーター配列を結合しているRNAポリ
メラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次にコード配列
によってコードされたタンパクに翻訳される場合、コー
ド配列が細胞中でプロモーター配列の「制御下」にあ
る。

【００２７】外因性DNAが細胞壁内に導入された場合、
細胞は外因性DNAによって「形質転換」される。外因性D
NAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組込まれて
いる（共有結合的に結合）場合と組込まれていない場合
がある。原核生物および酵母においては、例えば、外因
性DNAはプラスミドなどのエピソーム成分上に保持され
ていると考えられる。真核細胞に関しては、安定して形
質転換される細胞は、外因性DNAが、染色体内に組込ま
れて、染色体の複製を通して娘細胞に遺伝されるもので
ある。この安定性は、外因性DNAを含有する娘細胞集団
からなる細胞系統、あるいはクローンを確立する、真核
細胞の能力によって証明される。「クローン」とは、単
一細胞あるいは共通の祖先から有糸分裂によって生じる
細胞集団である。「細胞系統」は、何世代にもわたって
インビトロで安定な増殖を続けることができる一次細胞
のクローンである。

【００２８】一定の長さのDNA配列にわたってヌクレオ
チドの少なくとも約85％（約90％以上が好ましく、約95
％以上が最も好ましい）が一致している場合、２つのDN
A配列は「実質的に相同である」。実質的に相同な配列
は、例えばその特定の系について定められている厳密な
条件下で、サザーンハイブリダイゼーション実験におい
て同定することができる。適切なハイブリダイゼーショ
ン条件を定めることは当業者の範囲内である。例えば、
Maniatisら、前出；DNAクローニング、Ｉ巻とII巻、前
出；核酸ハイブリダイゼーション、前出を参照のこと。

【００２９】DNA構築物の「異種（非相同）」領域と
は、より大きなDNA分子内にあり、天然ではその大きな
分子と結合した形では見出されない、同定可能なDNAセ
グメントである。従って、非相同領域が哺乳類遺伝子を
コードする場合には、その遺伝子には、通常、起源生物
のゲノムにおいては哺乳類のゲノムDNAに隣接しないDNA
が隣接している。非相同コード配列のもう１つの例は、
コード配列自体が天然には見出されない構築物である
（例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含むcDN
A、あるいは天然遺伝子とは異なるコドンを持つ合成配
列）。対立遺伝子変異あるいは自然に発生する突然変異
は、本文中で定義したようなDNAの非相同領域を生じる
ことはない。

【００３０】組成物中のタンパクの少なくとも約75重量
％が当該の特定タンパクである場合、タンパク組成物は
「実質的に夾雑タンパクを含まない」。好ましくは、こ
のタンパクは、組成物中に少なくとも約90重量％の当該
タンパク、最も好ましくは少なくとも約99％の当該タン
パクを含有する。実質的に夾雑タンパクを含まないタン
パク組成物は、当該タンパクの活性を有する単一分子量
種のみを包含することが好ましい。

【００３１】「滑膜ホスホリパーゼA₂」（滑膜PLA₂すな
わちsPLA₂）は、PLA₂活性を示し、慢性関節リウマチに
罹患している（ヒトのような）哺乳類の滑液中に認めら
れる哺乳類酵素の分類を指す。sPLA₂酵素は、炎症を起
こした滑膜組織によって、あるいはおそらく滑液中の顆
粒細胞またはマクロファージによって産生される。滑膜
PLA₂酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)
（12.5％ポリアクリルアミドゲル、0.1％SDS）によって
測定すると、約15±3KDの分子量を持つと特徴付けられ
ている。この酵素族の代表的なものは、sPLA₂Ａ型、Ｂ
型、およびＣ型である。Ａ型およびＢ型のNH₂末端アミ
ノ酸配列を図１に示す。hRASF-ピークＡおよびピークＢ
はヒト滑液から単離した２種の滑膜PLA₂である。NPは、
同時継続中の米国特許出願第946,557号に記述されてい
る「非膵臓」型のPLA₂であり、ヒト（h）、ブタ（p）お
よびラット（r）形態を包含している。「h cln 10」で
表わされる配列は、クローンλSPLA2-10（図４および
５）から誘導され、sPLA₂ Ｂ型またはＣ型配列、あるい
は異なるPLA₂であろう。いくつかの膵臓PLA₂も図中に示
す：ブタ腸PLA₂(p Intestine)、ウサギ腹水PLA₂(rab As
cites)、ラット血小板PLA₂(r platelet)；および２種の
ヘビ毒物：Crotalus atrox (C.atrox)、およびAqkistro
don piscivorus (A.pisc K-49)。ヒトcDNAクローンλPL
A₂ cDNA-4から類推したＡ型の完全なアミノ酸配列を図
７に示す。Ａ型は、検査されたすべてのタイプの関節炎
由来の滑液中に存在する。Ｂ型は、あるリウマチサンプ
ルでは全く存在せず、別のサンプルでは総活性の約33％
を占めるというように、量的に変動がある。Ｂ型は、代
表的には、リウマチ患者からのサンプルよりも変形性関
節症患者からの滑液サンプル中により高レベルで発現す
るが、やはりＡ型がsPLA₂の大部分を占めている。Ｂ型
はまた、0.5Ｍ Trisあるいは0.1％デオキシコール酸ナ
トリウムのいずれかの存在下でＡ型に比べ加水分解作用
をかなり刺激する；Ａ型は0.5Ｍ Trisによって抑制され
る。Ｃ型は、存在する場合でも、Ｂ型よりも２倍から５
倍量が少ない。これらの細胞外酵素は、（i）可溶性
で、（ii）カルシウム依存性、（iii）皮内あるいは関
節内注射される場合、組織において前炎症（proinflamm
atory）活性を有し、（iv）ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンのsn-2-アシルエステル結合に対して絶対的
な特異性を示す。この特性は、合成sPLA₂類似体および
組換えsPLA₂類似体をも含む。これらの類似体では、ア
ミノ酸配列の何らかの変化、欠失あるいは付加が上記の
特徴的活性に変化を及ぼさない。

【００３２】図１において比較した配列は、sPLA₂が14C
ys残基の数および位置に関して他のPLA₂配列、特にC. a
trox PLA₂を例とする、「II型」酵素に類似することを
示している。滑膜PLA₂も11位にCysを持たない。これは
高度に前炎症性のII型酵素（例えばクサリヘビ科のヘビ
の毒物形態、および同時継続中の米国特許出願第946,55
7号に述べられているPLA₂種）の特徴である。この比較
は、sPLA₂が、特にカルボキシ末端近くの可変領域にお
いて、他のすべての既知PLA₂配列と異なることを示して
いる。細胞膜を超えた転座に典型的なシグナルを含む20
残基のペプチド前駆体が、成熟酵素配列の上流に存在し
ており、おそらく合成中あるいは合成後に開裂すると考
えられる。

【００３３】sPLA₂ Ａ型をコードするゲノムDNAのクロ
ーン、λSPLA2-6は、1987年8月14日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(ATCC)（12301 Parklawn
Dr.Rockville, MD, U.S.A. 20852）に寄託され、受託
番号40361を与えられた。コード配列（図４および５）
はλSPLA2-6から単離され得る404bp AluＩ断片上にあ
る。sPLA₂ Ｂ型あるいはＣ型の少なくとも１つのエクソ
ンからのヒトゲノム配列を表わし、λSPLA2-10と呼ばれ
るもう１つのクローンも、1987年8月14日に受託番号403
60としてATCCに受託された。このクローンにおけるコー
ド配列は、約460bpのAluＩ断片上に含まれている。854b
pのEcoRＩ断片上にあるすべてのヒトsPLA₂ Ａ型をコー
ドし、λSPLA2 cDNA-4と称されるcDNAクローンは、1988
年5月27日に受託番号40456としてATCCに寄託された。sP
LA₂コード配列を含む発現ベクター、p86-1A（以下に述
べる）も、1988年6月27日に受託番号67735としてATCCに
寄託された。これらの寄託物はブタペスト条約により保
存される。λSPLA2-6、λSPLA2-10およびλSPLA₂ cDNA-
4のsPLA₂コード配列、ならびにpHNF86の発現カセット配
列は、本文中に参考として包含されている。本文中に開
示した配列と委託したクローンの配列との間に何らかの
相違がある場合には、クローンの配列に従う(controlli
ng)。

【００３４】適当な組織／体液源由来のsPLA₂を精製す
ることも可能であるが（以下参照）、組換え法によって
sPLA₂を産生することが好ましい。sPLA₂をコードするDN
A配列は、いくつかのアプローチのうちの１つによって
単離され得る。これらの方法は、部分的に、適当なオリ
ゴヌクレオチドプロ−ブを使用する核酸ハイブリダイゼ
ーションによる。そのようなプローブは、本文中に開示
されているsPLA₂ DNA配列またはアミノ酸配列に基づい
て合成的に構築され得るか、あるいは、やはり本文中に
述べられているゲノムsPLA₂クローンから単離すること
ができる。

【００３５】オリゴヌクレオチドプローブおよびDNAラ
イブラリーの作製および核酸ハイブリダイゼーションに
よるそれらのスクリーニングについての基本的ストラテ
ジーは、当業者にとって公知である。例えば、DNAクロ
ーニング：Ｉ巻（D.P. Glover編、1985）；核酸ハイブ
リダイゼーション（B.D. HamesとS.J. Higgins編、198
5）；オリゴヌクレオチド合成（M.J. Gate編、1984）；
T. Maniatisら、分子クローニング：実験室マニュアル
（1982）；B. Perbal、分子クローニングの実践的手引
き（1984）を参照のこと。まず、DNAライブラリーを作
製する。ライブラリーは、ヒトなどの選択された哺乳類
由来のゲノムDNAライブラリーから構成され得る。ヒト
ゲノムライブラリーは、当該技術分野で周知である。例
えば、Maniatisら（1978）Cell 15：687〜701；Lawnら
（1978）Cell 15：1157〜1174を参照のこと。DNAライブ
ラリーは逆転写によりポリ-A RNA（mRNA）から調製され
たcDNAからも構築され得る。例えば、米国特許第4,446,
325号；第4,440,859号；第4,433,140号；第4,431,7400
号；第4,370,417号；第4,363,877号を参照のこと。上記
mRNAは、滑膜組織あるいは滑液から単離した炎症性細胞
などの、sPLA₂を発現すると考えられる細胞系統あるい
は組織から単離される。cDNAライブラリー構築のための
好ましいmRNA源は、滑膜性の関節組織である。ゲノムDN
AあるいはcDNAを、ライブラリーの構築に好適なベクタ
ーにクローニングする。好ましいベクターは、いずれか
のλファージなどのバクテリオファージベクターであ
る。適当なライブラリーの構築法は当業者の範囲内であ
る。例えばB. Perbal、前出を参照のこと。

【００３６】ライブラリーが構築されれば、オリゴヌク
レオチドを用いてライブラリーをプローブしsPLA₂コー
ド配列を有するセグメントを同定することができる。一
般に、プローブは公知の核酸配列に基づくことが好まし
い。しかし、核酸配列が未知である場合には、精製され
たsPLA₂から決定されたアミノ酸配列に基づくことが望
ましい。この場合には、アミノ酸配列をコードするコド
ンに対応するようにヌクレオチド配列を選択する。遺伝
コードが冗長であるので、通常は、タンパクの特定領域
をコードする可能性のあるヌクレオチド配列の全部ある
いはそのうちの妥当な数をカバーする、いくつかのオリ
ゴヌクレオチドを合成することが必要となる。したがっ
て、プローブの基礎とする領域を選択する際に、コドン
が高度に変性しているアミノ酸を、その領域が含まない
ことが一般的に好ましい。しかしながら、ライブラリー
を作製した哺乳類においてめったに使用されないコドン
を含むプローブは作製する必要がないと考えられる。

【００３７】一定条件において、かなり長いプローブお
よび／または対応する核酸配列が極めて高度な冗長性を
有するアミノ酸配列の領域を含むプローブを作製するこ
とが望ましいことは、当業者に理解されるであろう。完
全な遺伝子、あるいは遺伝子の実質的な部分をカバーす
るプローブもまた、予想される相同性の度合いに依存す
るが、適切である。PLA₂の性質が種系統を超えて高度に
保存されるため、ヒトのクローンλSPLA2 cDNA-4などの
１つの種由来の完全な長さのsPLA2 cDNAプローブは、他
の１つの種から作製したライブラリーをスクリーニング
するために容易に使用できる。その他の場合には、２組
のプローブの各々を遺伝子の異なる領域に同時に使用す
ることが望ましいと考えられる。使用するプローブの正
確な長さは決定的ではないが、一般に、約14から約20塩
基対のプローブが通常有効であることは、当該技術分野
において認識されている。約25から約60塩基対という、
より長いプローブも使用され得る。

【００３８】当該技術分野において周知のように、標準
的手法を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを放射性
ヌクレオチドあるいはビオチンなどのマーカーで標識す
る。次に標識した一組のプローブをスクリーニングステ
ップにおいて使用する。このステップは、標準的手法に
従って、一本鎖のプローブをライブラリー由来の単離し
たssDNAにハイブリダイズすることからなる。厳密なハ
イブリダイゼーション条件あるいは寛容なハイブリダイ
ゼーション条件のどちらかが、プローブの長さ、プロー
ブとライブラリーが同じ種由来のものであるかどうか、
そして種同士が進化的に近いか遠いかといったいくつか
の要素に依存して用いられ得る。これらの要素はこれら
に限定されるものではない。相同な配列を単離し、バッ
クグラウンドのハイブリダイゼーションから検出しうる
ように、ハイブリダイゼーションの条件を最適化するこ
とは当業者の範囲内である。基本的に必要なのは、ハイ
ブリダイゼーション条件が十分に厳密で選択的なハイブ
リダイゼーションが生じ得ることである；すなわち、選
択的なハイブリダイゼーションとは、より低い度合の相
同性による非特異的結合あるいはハイブリダイゼーショ
ンとは異なり、最小限の核酸相同性（たとえば、少なく
とも約75％）によるハイブリダイゼーションである。一
般的には、「核酸ハイブリダイゼーション」前出を参照
のこと。陽性ハイブリダイゼーションによってスクリー
ンされたライブラリー由来のクローンが同定されれば、
制限酵素分析とDNAの配列決定によってクローンをさら
に特性付けて、特定のクローンがsPLA₂のコード配列を
含有することを確認することができる。

【００３９】λsPLA2-10におけるsPLA₂のエクソンのク
ローンなどの部分ゲノミッククローンは、いくつかの手
法の１つによって完全なクローンに拡張することができ
る。「染色体ウォーキング(chromosome walking)」法を
用いてクローンを5'または3'方向に拡張し、遺伝子コー
ド領域全体を包含することを確認することができる。次
いで、これらのクローンの制限断片が、例えば、sPLA₂
cDNAで、プローブされ得る。これらのエクソン内に膵臓
PLA₂に対する十分な相同性が存在すれば、sPLA₂のその
他のエクソンもやはり膵臓sPLA₂クローンによって同定
されうる。非sPLA₂ cDNAプローブを使用する場合には、
とくに保存される領域（例えばアミノ酸残基44〜52）に
対応するオリゴヌクレオチドでプローブすることが特に
好ましく、それによっておこり得る相違（例えばAsp₄₉
がLys₄₉へ変化する）が予測できる。

【００４０】ゲノミッククローン中の他のコード領域
は、新しいM13-ジデオキシ配列決定法を用いて、クロー
ニングしたエクソンの下流のDNAの直接塩基配列決定に
より容易に同定され得る。次にその配列は、３つの読み
取り枠すべてについて検索され、オープンリーディンク
フレームが明らかになる。その他のエクソンはイントロ
ンスプライシングシグナルによって両側が限定され、保
存されたアミノ酸をコードするはずであるから、その他
のエクソンも明らかになるであろう。

【００４１】さらに詳しくは、sPLA₂ Ｂ型あるいはＣ型
のエクソンの正しい遺伝子コード配列がわかれば、以下
の手段の１つまたはそれ以上によって酵素のタンパクコ
ード領域全体を得るために使用することができる。ま
ず、エクソン自体だけを含むDNAを大量に得、ハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用できるように、λク
ローンからエクソンを取り出し、pBR322のようなより好
ましいベクターに組み込む。その代わりに、コード領域
の単一領域（例えば、アミノ酸残基6-25）に対応する60
-merオリゴヌクレオチドを合成することもできる。どち
らも、腹膜細胞、膿、内皮組織、末梢血白血球、リンパ
球、およびマクロファージなどの様々な起源から得たmR
NAのノ−ザンブロットのためのハイブリダイゼーション
プローブとして使用できる。さらに、分化U-937およびH
L60などの各種細胞系統由来のmRNAも試験することがで
きる。次に、検出しうるレベルの、ハイブリダイズする
mRNAを含む何らかの組織あるいは細胞源を使用してcDNA
ライブラリーを作製し、そのあと同じプローブでスクリ
ーニングして、sPLA₂をコードする完全な長さのcDNAを
検出する。実際に、以下に述べるように、このストラテ
ジーは、クローンλSPLA2 cDNA-4のようなsPLA₂Ａ型を
コードする完全な長さのcDNAをクローン化する。

【００４２】その代わりとして、mRNAのための良好な組
織源がない場合には、Ｂ型あるいはＣ型タンパクから内
部配列を得ることが必要になるであろう。これは、例え
ば、常法によって（以下に述べる）精製したピークＡ物
質をStaph-V8でタンパク分解し、次に還元的アルキル化
を行い、消化産物をHPLCによって分離することにより実
施されうる。分離された酵素断片に対応する溶出ピーク
は前記のようにして配列決定される。あるいは、cDNAク
ローンからの推定アミノ酸配列を使用してもよい。得ら
れた配列から、オリゴヌクレオチドが設計され得、その
他のエクソンを位置づけるためのハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用するために製造される。最後に、
正しい成熟タンパクがコードされるように単離したエク
ソンを互いに結合させる。

【００４３】sPLA₂遺伝子の最長の挿入部を含有する哺
乳類ゲノミッククローン（部分あるいは全体）は、ネオ
マイシンやメタロチオネイン耐性遺伝子などのマ−カー
を含むプラスミドDNAとともに、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞にコトランスフェクトされ得る。抗
生物質G418およびCd⁺⁺の存在下で選択された生存細胞な
らびに生存クローンは、抽出したRNAのノーザンブロッ
トにおいてsPLA₂ハイブリダイジング転写物の存在に関
して分析される。次いで、所望の転写物を含有するクロ
ーンは、cDNAライブラリー構築のためのmRNA起源として
使用され得る。

【００４４】滑膜PLA₂は、慢性関節リウマチあるいは乾
癬に罹患した患者からのヒト滑液より精製され得る。そ
の精製のプロトコールば、以下に詳細に述べるが、十分
な量の天然sPLA₂の精製を、正確なアミノ酸配列決定を
行うのに十分な純度で実施することを初めて可能にした
ものである。精製したsPLA₂から導かれるアミノ酸配列
は、天然sPLA₂の核酸配列の単離において有用なプロー
ブの設計、あるいはsPLA₂のアミノ酸配列をコードする
合成核酸配列の設計を可能にする。

【００４５】図１のNH₂末端に示されるようなアミノ酸
残基の配列を有する合成sPLA₂ペプチドに対して、特異
的抗血清あるいはモノクローナル抗体（後述）が調製さ
れ得る。特に好ましいのは、１位から26位にまで伸びる
ペプチドである。これは該タンパクに独特な領域であ
り、それに対する抗体は、選択された組織、細胞抽出
物、あるいは体液中に存在するsPLA₂のいずれをも免疫
沈降させるために使用され得る。次いで、この供給源か
らの精製sPLA₂は、配列決定し、以下に述べるように特
異的プローブを設計するための基礎として使用すること
ができる。既知のPLA₂類からのその他の領域に対する抗
体もまた使用され得る。精製された天然あるいは組換え
sPLA₂もまた、抗原として有用である。

【００４６】上述したように、sPLA₂をコードするDNA配
列はクローニングを行うよりもむしろ合成により調製さ
れ得る。このDNA配列は、sPLA₂アミノ酸配列についての
適切なコドンによって設計され得る。一般に、その配列
が発現のために使用されるのであれば、所望する宿主に
おいては、好適なコドンを選択する。完全な配列は、標
準的方法によって調製され、完全なコード配列中に組み
込まれた重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。
例えば、エッジ(Edge)（1981）Nature 292：576；ナン
バイールら（Nambair et al.）(1984) Science 223：12
99；ジェイら（Jay et al.）(1984) J Biol Chem 259：
6311を参照されたい。

【００４７】合成DNA配列は、sPLA₂の類似体あるいは
「変異タンパク」を発現する遺伝子の簡便な構築を可能
にする。あるいは、変異タンパクをコードするDNAは、
天然sPLA₂遺伝子あるいはcDNAの部位特異的変異によっ
て調製され、そして、変異タンパクは従来のポリペプチ
ド合成法を用いて直接調製することができる。変異タン
パクの構築において特に興味深いのはＡ型における触媒
的な（catalytic）His₄₈残基をGlnのような他のアミノ
酸に置換することである。48位の変異タンパクは、内因
性の炎症性PLA₂酵素に結合し、それによって不活性ダイ
マーを形成することにより、PLA₂抑制因子として働き得
る。変異のためのその他の潜在的標的にはＮ末端近く
（７、10および16位）の３つの塩基性残基が含まれ、そ
れらは膜関連性基質との相互作用に関わると考えられ
る。酸性残基（例えばGluあるいはAsp）の置換によっ
て、これらの部位のいずれか１つまたは全部が変化した
変異タンパクは、膜結合性あるいは複合基質に対する活
性が低下し得る。

【００４８】部位特異的変異は、限られたミスマッチを
除いて、変異を起こさせる一本鎖ファージDNAに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、
所望の変異が達成される。簡単に述べると、合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用してファージに相
補的なストランドの合成を指示し、生じる２本鎖DNAを
ファージを保持する宿主細菌に形質転換する。形質転換
細菌の培養物を寒天培地にプレートし、ファージを有す
る単一の細胞からプラークが形成される。

【００４９】理論的には、新しいプラークの50％が、変
異形態を一本鎖として有するファージを含む。50％は元
の配列を有している。生じたプラークは、正確な対合の
ハイブリダイゼーションを可能にするが、元のストラン
ドとのミスマッチのハイブリダイゼーションは妨げられ
るような温度において、リン酸化された合成プライマー
を用いてハイブリダイズさせる。そのあとプローブとハ
イブリダイズしたプラークを取り出し、培養し、そして
DNAを回収する。

【００５０】sPLA₂についてのコード配列が調製され、
あるいは単離されると、それは適当なベクターまたはレ
プリコンにクローン化され、それによってsPLA₂コード
配列を持たないベクターを実質的に含まない（例えば、
他のライブラリーのクローンを含まない）組成物中に保
持され得る。数多くのクローニングベクターが当業者に
は既知であり、適当なクローニングベクターを選ぶこと
は選択の問題である。クローニングのための組換えDNA
ベクターおよびそれらが形質転換し得る宿主細胞の例は
次のものを含む：種々のバクテリオファージλベクター
（大腸菌、E.coli）、pBR322（大腸菌）、pACYC177（大
腸菌）、pKT230（グラム陰性細菌）、pGV1106（グラム
陰性細菌）、pLAFR1（グラム陰性細菌）、pME290（非大
腸菌グラム陰性細菌）、pHV14（大腸菌および枯草菌Bac
illus subtilis）、pBD9（バチルス属菌Bacillus）、pI
J61（ストレプトミセス属Streptomyces）、pUC6（スト
レプトミセス属）、アクチノファージ、φC31（ストレ
プトミセス属）、YIp5（サッカロミセス属Saccharomyce
s）、YCp19（サッカロミセス属）、およびウシ乳頭ウイ
ルス（哺乳類細胞）。一般には、DNAクローニング：Ｉ
巻およびII巻、前出；T.マニアティスら、前出；B.パー
バル、前出、を参照されたい。

【００５１】本発明によれば、sPLA₂をコードするDNA配
列を、この発現構築物を含むベクターによって形質転換
された宿主細胞中のRNAに転写するために、哺乳類sPLA₂
のコード配列は、プロモーター、リポソーム結合部位
（細菌発現のための）および、必要に応じて、オペレー
ター（本文中ではまとめて「調節」要素という）の制御
下に置かれる。コード配列はシグナルペプチドあるいは
リーダー配列を含む場合と含まない場合とがある。コー
ド配列がシグナルペプチドを含む場合には、それはsPLA
₂シグナル配列であり得、あるいはそうではない。例え
ば細菌においては、成熟sPLA₂は、sPLA₂シグナルペプチ
ドを含まないコード配列の発現によるか、あるいは翻訳
後のプロセッシングにおいて細菌宿主により除去される
リーダー配列を含むコード配列の発現によって調製され
ることが好ましい。例えば、米国特許第4,431,739号；
4,425,437号；4,338,397号を参照されたい。

【００５２】発現ベクターは、sPLA₂コード配列が適切
な調節配列によってベクター内に位置づけられるように
本発明により構築される。制御配列に関してのコード配
列の位置づけおよび方向性は、コード配列が制御配列の
「制御」下で転写される（すなわち、制御配列でDNA分
子に結合するRNAポリメラーゼがコード配列を転写す
る）ような位置づけおよび方向性である。制御配列は、
上述したクローニングベクターのように、ベクターヘの
挿入前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード
配列は既に制御配列と適当な制限部位を含む発現ベクタ
ーに直接クローン化され得る。原核生物および酵母にお
けるsPLA₂の発現の場合には、制御配列は必然的にコー
ド配列と非相同になる。宿主細胞が原核細胞であれば、
コード配列がイントロンを含まないことも必要である
（例えばcDNA）。選択された宿主細胞が哺乳類細胞であ
れば、制御配列はsPLA₂コード配列に相同な場合と非相
同な場合があり、コード配列はイントロンを合むゲノム
DNAあるいはcDNAのいずれでもよい。酵母においてはゲ
ノムあるいはcDNAのいずれかのコード配列が発現され得
る。

【００５３】多くの原核性発現ベクターが当該技術にお
いて既知である。例えば、米国特許第4,440,859号；4,4
36,815号；4,431,740号；4,431,739号；4,428,941号；
4,425,437号；4,418,149号；4,411,994号；4,366,246
号；4,342,832号；さらに英国特許公開GB2,121,054号；
GB2,008,123号；GB2,007,675号；および欧州特許公開第
103,395号を参照されたい。好ましい原核発現系は大腸
菌である。その他の好ましい発現ベクターは、真核発現
系において使用するためのものである。例えば、1985年
12月16日出願の、同一出願入による米国特許出願第809,
163号を参照されたい。その開示内容をここに参考とし
て引用する。好ましい真核性発現系はワクシニアウイル
スを用いたもので、これは当該技術分野では周知であ
る。例えば、マケットら（Mackett et al.）(1984) J V
irol 49：857；「DNAクローニング」II巻、191〜211
頁、前出、PCT特許公開第WO86/07593号を参照された
い。酵母発現ベクターは当該技術において公知である。
例えば、米国特許第4,446,235号；4,443,539号；4,430,
428号を、さらに欧州特許公開第103,409号；100,561
号；96,491号を参照されたい。もう１つの好ましい発現
系は、ベクターpHS1であり、これはチャイニーズハムス
ター卵巣細胞を形質転換する。このベクターの使用は、
1985年12月4日出願の、ここにその開示内容が参考とし
て含まれている、PCT特許公開第WO87/02062号および同
一出願人による米国特許出願第804,692号に開示されて
いる。

【００５４】発現系および選択する宿主に依存して、sP
LA₂タンパクが発現される条件下で、上述した発現ベク
ターによって形質転換された宿主細胞を増殖させること
により、sPLA₂が生産される。次に、宿主細胞から酵素
タンパクを分離して精製する。発現系が増殖培地中に酵
素を分泌する場合には、細胞を含有しない培地から直接
タンパクを精製することができる。sPLA₂タンパクが分
泌されない場合には、細胞溶解産物から分離する。適切
な増殖条件および回収方法の選択は当該技術の範囲内で
ある。

【００５５】天然、組換えあるいは合成sPLA₂ペプチド
（完全長またはサブユニット）は、ポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体を生産するために使用することが
できる。ポリクローナル抗体が所望である場合には、精
製したsPLA₂ペプチドを使用して選択した哺乳類（例え
ば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫し、後日
免疫した動物から血清を採取し、既知の工程に従って処
理する。sPLA₂に加えて、種々の抗原に対するポリクロ
ーナル抗体を含む組成物が、免疫アフィニティークロマ
トグラフィーにより、抗sPLA₂ではない抗体を実質的に
含まずに調製され得る。

【００５６】モノクローナル抗sPLA₂抗体もまた、開示
内容から当業者により容易に生産され得る。ハイブリド
ーマによってモノクローナル抗体を産生する一般的方法
は周知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は、融合以
外の手法、例えば、腫瘍DNAによるＢリンパ球の直接形
質転換、あるいはエプスタイン−バーウイルスによるト
ランスフェクション、によっても創製され得る。例え
ば、M. シュライアーら(M. Schreier et al.)「ハイブ
リドーマ技術」(1980)、ハマーリングら(Hammerling et
al.)、「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリド
ーマ」(1981)；ケネットら(Kennett et al.)、「モノク
ローナル抗体」(1989)を参照されたい。さらに、米国特
許第4,341,761号；4,399,121号；4,427,783号；4,444,8
87号；4,451,570号；4,466,917号；4,472,500号；4,49
1,632号；4,493,890号もまた参照されたい。

【００５７】sPLA₂ペプチドに対して産生したモノクロ
ーナル抗体のパネルは、種々の特性（すなわち、アイソ
タイプ、エピトープ、親和性など）に関してスクリーニ
ングすることができる。特に興味深いのはsPLA₂の活性
を中和するモノクローナル抗体である。そのようなモノ
クローナルは、PLA₂活性の測定において容易に同定され
得る。親和性の高い抗体は、天然あるいは組換えsPLA₂
の免疫アフィニティー精製においても有用である。

【００５８】ヒト肺組織において発現される膵臓PLA₂の
発見は、膵臓PLA₂が炎症性疾患においてこれまで考えら
れていた以上の役割を果たし得ることを示している。従
って、ここで述べる他のいかなる形態のPLA₂に対する抗
体も（ポリクローナルおよびモノクローナル）、炎症性
疾患の治療のために使用され得る。抗膵臓PLA₂抗体が、
抗sPLA₂抗体に閉してここで述べたように、産生され得
る。疾患が、例えば急性エンドトキシンショックであれ
ば、適切な治療方法は、従来の静脈内経路により、有効
用量の抗PLA₂抗体（例えば抗滑膜PLA₂）で患者を処置す
ることである。局所的な急性炎症の治療では、抗sPLA₂
抗体による処置を、おそらく筋肉内注射によって行うこ
とが適切である。慢性関節リウマチ患者の関節のような
局所的慢性炎症は、抗sPLA₂抗体の非経口的投与によっ
て治療することが特に好ましい。これらの組成物は、変
形性関節症のような他の形態の関節炎を治療する上でも
有用であり得る。エンドトキシンショックはPLA₂レベル
の上昇をひき起こすので、抗PLA₂抗体を、グラム陰性病
原菌およびそれらの毒素に対する他の治療法（例えば抗
LPS療法）と組み合わせて投与することが望ましいと考
えられる。PLA₂は肺の界面活性物質の単層を攻撃するこ
とも知られているので、呼吸器系統の疾病（例えば、成
人呼吸困難症候群）では、代替肺界面活性リン脂質であ
るジパルミトイルホスファチジルコリンと組み合わせ
て、吸入により抗PLA₂抗体を投与することが望ましいと
考えられる。sPLA₂変異タンパクのようなPLA₂拮抗剤も
また、抗体の代わりに使用され得る。

【００５９】適切な治療方法（すなわち、用量、投与頻
度、全身投与を行うか、あるいは局所を行うか、など）
の決定は当該技術の範囲内である。投与にあたっては、
薬学的に許容される非経口賦形剤を配合して、単位用量
の注射形態（溶液、懸濁液、乳剤など）に抗体を処方す
る。そのような賦形剤は通常、非毒性であり治療効果を
持たない。かかる賦形剤の例には、水、生理食塩水、リ
ンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。処理
された油やオレイン酸エチルのような非水性賦形剤もま
た使用され得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５
％（重量／重量）ヒトアルブミンである。この賦形剤
は、等張性および化学的安定性を高める物質（例えば、
緩衝剤および保存剤）のような、少量の添加物を含有し
てもよい。抗体は、代表的には、そのような賦形剤中に
約１μg/mlから10μg/mlの濃度で処方される。

【００６０】抗sPLA₂抗体は診断の用途においても有用
である。例えば、慢性関節リウマチ患者から分離した滑
液は、全部ではないとしても、主としてＡ型種のPLA₂を
含むことを示す。これに対して、変形性関節症の患者か
らのサンプルは、代表的には、評価しうる量のＢ型なら
びにＡ型を、50mM Trisの存在下での活性を基準とする
と、通常Ａ型対Ｂ型を２：１の割合で含む。そのため、
本発明は、ヒト（あるいは他の哺乳類）由来の滑液サン
プルを提供し、そしてsPLA₂のＡ型およびＢ型の量を検
定において定量的に測定して比較する方法、特に診断方
法を意図する。例えば、定量的免疫学的検定においてＡ
型あるいはＢ型に特異的な抗sPLA₂抗体を使用すれば、
２つのタイプの関節炎を識別することができる。Ａ型あ
るいはＢ型に特異的な抗体は、従来の免疫学的検定の様
式（例えば、同種あるいは異種の、放射免疫検定法ある
いはELISA）に組み入れることができる。各種の様式は
当業者に既知である、例えば、「免疫学的検定：実践的
手引き」（D.W.チャン(Chang)およびM.T.パールスタイ
ン(Perlstein)編、1987）を参照されたい。この文献の
開示内容は参考としてここに引用される。免疫学的検定
以外の定量分析法も、Ａ型およびＢ型sPLA₂の相対的レ
ベルを測定するために使用され得る。

【００６１】一般に、組換え法によるsPLA₂の生産によ
り、夾雑タンパクを実質的に含まない酵素組成物が提供
され得る。高レベルの純度を得るための能力は、in viv
oの供給源に比べて実質的な量のsPLA₂を生産することが
できる組換え発現系の結果である。従って、組換え培養
に従来の手法を適用することにより、現在非分解性およ
び非毒物性供給源から入手しうる細胞系PLA₂組成物より
も実質的に純度の高いsPLA₂組成物が生産され得る。

【００６２】本発明の精製sPLA₂組成物はいくつかの面
において有用である。まず最初に、デューティルおよび
グレガー（Dutilh & Greger）(1981) J Sci Food Agric
32：451〜458が述べているように、食品加工技術にお
いて使用され得る。さらに、sPLA₂組成物は魚の酸敗の
開始を遅らせるために使用され得る。例えば、マゾード
およびビリンスキー（Mazeaud & Bilinski）(1976) J F
ish Res Board Can 333：1297〜1302を参照されたい。

【００６３】精製sPLA₂は、しかし、炎症抑制剤の設計
およびスクリーニングにおける手段として特に有用であ
る。まず、本発明によりミリグラム量の物質が得られ得
る。ミリグラム量は、結晶化することができ、Ｘ線回析
およびコンピューター解析を用いた三次元の研究を可能
にする。これは、分子の形に関する演繹を可能にし、そ
れによってsPLA₂が通常示す酵素活性の抑制因子として
使用しうる物質の適当な形が決定され得る。アンギオテ
ンシンＩからアンギオテンシンIIへの転換のための触媒
である「転換酵素」に関しては、既に阻害因子が設計さ
れている。一般に、これらの拮抗物質は「ジペプチド」
であって、それらの転換酵素との相互作用は、転換酵素
と特異的に相互作用する「ジペプチド」の能力を高める
ような、ペプチド結合に関与する「残基」の修飾によっ
て安定化される。従ってペプチド結合は、特定の選ばれ
たカルボン酸およびアミン類（必ずしもアミノ酸とは限
らない）に結合する。これらの「ジペプチド」は、所望
するターゲットである転換酵素の外形と相補するような
三次元構造の立体配置を有する。同様の鍵と鍵穴の空間
配置は、本発明の結晶化sPLA₂の表面外形に相補的に設
計された分子から生し得る。「表面」が、内側に面し得
る湾曲面を含むこと、特に活性部位を含むことは明らか
である。さらに、「相補的」という語句は、「適合す
る」空間的立体配座に加えて、タンパクとその表面外形
に対合する分子との間の相互作用が誘引的かつ正である
ことを意味することが理解され得る。これらの相互作用
は、水素結合、イオン、あるいは疎水的親和性であり得
る。

【００６４】従って、本発明は、組換えsPLA₂の表面の
三次元外形に相補的な三次元外形により特徴づけられ
る、sPLA₂に対してのペプチド拮抗物質（２〜15アミノ
酸）を意図する。この明細書においては、ペプチドとい
う語により、拮抗物質が、残基数よりも少ない数に対応
するカルボン酸アミド結合を含むことを意味する。カル
ボン酸およびアミンに関連する物質はα−アミノ酸であ
る必要はない。

【００６５】第２に、三次元構造決定の助けを得なくて
も、本発明の精製sPLA₂は、評価を行うための特別なア
プローチとしてin vitroでsPLA₂抑制因子をスクリーニ
ングする際の試薬として重要である。現在入手しうる不
純なsPLA₂調製物は、試験結果への夾雑物の影響のた
め、まぎらわしいデータを生じる。例えば、それ自体が
sPLA₂にとっての抑制物質、活性化物質、あるいは基質
となる夾雑物は、評価を妨害する。従って、sPLA₂抑制
物質についての現在のスクリーニング方法の実質的な改
良は、精製されたヒトsPLA₂タンパクを利用し得るか否
かに左右される。

【００６６】ここに記載されているsPLA₂組成物は制癌
剤としても有用であり得る。例えば、悪性腫瘍内部ある
いはその周囲へsPLA₂を直接注入し、および必要に応じ
て腫瘍切除術と組み合わせて注入を行うことにより、高
レベルの、マクロファージの強力な化学的誘引物質およ
び活性化物質となる。次にこれらの活性化されたマクロ
ファージは、局所的な腫瘍の抑制あるいは除去を促進し
得る。

【００６７】本発明によるsPLA₂は、さらにワクチン組
成物におけるアジュバントとして適用される。ワクチン
の処方は、当該技術において公知である。通常、ワクチ
ン処方物は、薬学的に許容される非経口賦形剤中に抗原
（類）（例えば、弱毒化ウイルス、死滅ウイルス、ウイ
ルスポリペプチドのサブユニット、死滅菌、細菌性線毛
など）を含む。本発明の改良されたワクチン組成物は、
sPLA₂アジュバントに加えて、付加的なアジュバントを
含み得る。最終的なワクチン処方物中のsPLA₂の濃度
は、当業者により容易に決定され得る。代表的には、必
ずしも常にではないが、sPLA₂の濃度は約１ng/mlから約
１μg/mlである。

【００６８】以下に述べるのは、本発明の実施例であ
る。この実施例は、本発明を説明するためにのみに示さ
れる。特許請求の範囲内での数多くの態様が本発明の開
示内容に照らして当業者にとり明白であるので、これら
の実施例はいかなる意味においても本発明の範囲を制限
することを意図するものではない。当業者は、本願に引
用され、その開示内容が参考として本文中に引用されて
いる参考文献に精通している（あるいは容易に理解しう
る）と推定される。

【００６９】

【実施例】

Ｉ．sPLA₂の精製と配列決定 Ａ．初期精製 ゲル濾過および電気泳動のためのセファデックス(登録
商標) G-75、CM-セファデックス(登録商標) C-50および
タンパク標準品をPharmacia Fine Chemicalsから購入し
た。アクリルアミド、N,N,N',N'-テトラメチルエチレン
ジアミン、ブロモフェノールブルー、クマシーブリリア
ントブルーＲ、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)、脂肪酸
を含有しないウシ血清アルブミン(BSA)、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン、およびローリータンパク検定
キットをSigmaから入手した。銀染色およびバイオ−ラ
ッド(Bio-Rad)タンパク検定キットをBio-Rad Laborator
iesから購入した。

【００７０】１-〔¹⁴C〕オレイン酸（50mCi/mmol）をニ
ューイングランドニュークリア(NewEngland Nuclear)か
ら購入した。2-〔1-¹⁴C〕-パルミトイル-1-パルミトイ
ルホスファチジルコリン（59mCi/mmol）および2-〔1-¹⁴
C〕-リノレオイル(linoleoyl)ホスファチジルエタノー
ルアミンをアバンティ・ポーラー・リピッズ(Avanti Po
lar Lipids)（バーミンガム、アラバマ州 (AL)）から供
給した。分析用の焦点電気泳動のためのアンホリンPAG
プレート、pH3.5〜9.5をLKBブロマ(Bromma)から購入し
た。プレコーティングした薄層クロマトグラフィー(TL
C)用シリカゲル60プレートはBDHから入手した。使用し
たすべての化学物質および試薬は分析用グレードのもの
であった。

【００７１】滑液(SF)を、進行中の古典的なあるいは明
確なリウマチ関節炎(RA)の患者から関節穿刺によって採
取した。この物質を４℃で遠心分離し、細胞と細胞破砕
物とを除去してプールし、使用時まで−70℃でポリプロ
ピレン管中に保存した。

【００７２】精製工程はすべて４℃で実施した。プール
した滑液（510ml）を５mM緩衝液、pH5.0に対して24時間
透析した。生じた沈澱物は0.5Ｍアセテート緩衝液、pH
5.00中に再溶解させ、同じ緩衝液であらかじめ平衡させ
ておいたCMセファデックス(登録商標) C50の200mlカラ
ムに入れた。このカラムを、0.5Ｍアセテート緩衝液、p
H8.5；0.2Ｍ Tris−HCl中0.3Ｍ NaCl、pH5.0；0.2Ｍ Tr
is−HCl中のＭ NaCl、pH8.5；および0.2Ｍ Tris HCl中
３Ｍ NaCl、pH8.5により連続的に溶出した。PLA₂は後者
の緩衝液中に溶出した。PLA₂活性を有する画分をプール
し、次いでこれを0.05Ｍ Tris−HCl、pH8.5に対して透
析して、凍結乾燥した。凍結乾燥した残渣を、0.05Ｍ T
ris−HCl緩衝液、pH8.5中で、続いて2Ｍ NaClで再構成
し、そしてこれを同じ緩衝液であらかじめ平衡させた、
1.6×68cmのセファデックス(登録商標) G75カラムでク
ロマトグラフィーされた。

【００７３】カラムを20ml／時で溶出し、PLA₂活性およ
びタンパク含量の測定のために2.8mlの画分を回収し
た。活性分画をプールし、0.05Ｍ Tris−HCl、pH8.5に
対して透析して、凍結乾燥した。この残渣を、１％ SDS
と10％グリセロールとを含有する0.0625Ｍ Tris−HCl、
pH9.5に溶解し、37℃で１時間インキュベートし、15％
ポリアクリルアミドゲルに作用させた。準備用電気泳動
を30mAで４時間実施した。ゲルを0.5cm細片に切り出し
た。タンパクを破砕して、0.1Ｍ Tris−HCl緩衝液、pH
7.5で溶出した。PLA₂活性を有する画分をプールし、凍
結乾燥した。精製および濃縮の工程を表１にまとめて示
す。

【００７４】

【表１】

【００７５】Nature 227：680〜681（レムリ(Laemmul
i)、1970）に記載されているように、0.1％ SDSの存在
下、15％ポリアクリルアミドゲル中でポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(PAGE)を行なった。オバルブミン、炭酸
脱水素酵素、トリプシン阻害物質、およびラクトアルブ
ミンを分子量マーカーとして使用した。サンプルを、２
％ SDSと10％グリセロールを含有する0.0625Ｍ Tris−H
Cl、pH6.8中、分析用PAGEについては５％ 2-メルカプト
エタノール(2-ME)と共に100℃で６分間、準備用SDS−PA
GEについては2-MEなしで37℃において１時間培養し、次
いでこれらをゲルに作用させた。電気泳動を30mAで４時
間行ない、タンパクのバンドをクマシーブリリアントブ
ルーまたはバイオ−ラッド銀染色によって染色した。ス
ィッツアー(Switzer)ら(1975) Anal Biochim 98：231〜
237。

【００７６】硫酸ドデシルナトリウムおよび2-メルカプ
トエタノールの存在下でポストG-75画分（1.5mcg）のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動は、分子量17Ｋおよび15
Ｋに対応する２つのタンパクのバンドの存在を示してい
た。同じPLA₂調製物について同一の電気泳動像が、ジス
ルフェート結合を減少させることなく、得られた。PLA₂
活性は15Ｋおよび17Ｋの両バンドと関連があった。

【００７７】SDS−PAGEからの溶出液以外の、実施例
Ｉ．Ａ．あるいはIIに記載されているすべてのPLA₂調製
物のタンパク測定は、バイオ−ラッド法によって実施し
た。ブラッドフォード(Bradford)（1976）Anal Biochim
72：248〜254。SDS−PAGEから溶出したタンパクは、ト
リクロロ酢酸沈降反応させた後、ローリーの方法によっ
て測定された。ピーターソン(Peterson)（1977）Anal B
iochim 83：346〜356。両方の方法において、ウシ血清
アルブミンをタンパク標準品として使用した。

【００７８】Ｂ．最終精製 初期精製からの物質を逆相C-4 HPLCカラムに充填し、0.
1％トリフルオロ酢酸の存在下、15〜60％のアセトニト
リル勾配で溶出した。溶出した画分はPLA₂活性について
測定され（以下のＣ参照）そして活性画分をプールし
て、ケイ素化ファルコン(siliconized Falcon) No.2059
チューブ中で一晩凍結乾燥した。ピークＡ、ＢおよびＣ
と称する活性ピークを通常の方法で得、それぞれをさら
に精製した（図２）。ここで、縦軸は光学密度プロフィ
ールを示し、そして横軸は画分を示す。実線は、クロマ
トグラフィーのピークを表し、破線は、アセトニトリル
勾配を表す。中のグラフの縦軸はそのピークに対応する
酵素の加水分解パーセントを示す。凍結乾燥したピーク
物質をPAGE充填緩衝液（2.3％ SDS、50mM Tris、10％グ
リセロール）中に再懸濁し、これを90℃で３分間加熱し
て、12.5％アクリルアミドミニゲルに充填した。次に、
40,000dpmの¹²⁵Ｉ標識したブタのプロ膵臓PLA₂をオート
ラジオグラフ用マーカーとしてサンプル中に含有させ
た。電気泳動後、ゲルを30分間オートラジオグラフにか
け、そしてオートラジオグラムを切断のガイドとして用
いて、ゲルを1.0mm切片に切断した。この切片を破砕
し、10mM N-エチルモルホリノアセテート、pH7.0中で１
〜２日間、この活性を溶出させた。37℃で60分間インキ
ュベートした後、溶出液1.0μlについて測定を実施し、
活性のプロフィールを得た（図２）。ピークＡ、Ｂおよ
びＣのいずれもが、プロ膵臓マーカーの直前の、分子量
15,000に対応する切片から溶出した。活性画分を第四ア
ミンガラスファイバーフィルター上に直接スポットし
て、乾燥させた。同じ緩衝液中でフィルターを各５分間
ずつ４回洗浄し、乾燥した。アプライド・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)気相シークエンサーでエドマ
ン(Edman)分解により配列分析を実施した。sPLA₂Ａ型
（ピークＡ）およびsPLA₂（ピークＢ）のNH₂末端配列を
図１に示す。

【００７９】Ｃ．ホスホリパーゼA₂の測定 最終精製工程のための標準測定条件は、50mM Tris、pH
8.0、150mM NaCl、5.0mM CaCl₂、0.04％デオキシコール
酸ナトリウム(DOC)、および基質としての22nmolの2-ステ
アロイル-2-〔1-¹⁴C〕アラキドニル-L-3-ホスファチジ
ルコリン（PC、アマーシャム(Amersham) No. CFA. 65
5）からなり、37℃で30分間インキュベートした。２％
DOCに、新たに粉末化したPCを溶解させて基質を調製
し、次にこれを測定バッファー中で適当な濃度に溶出し
た。あらかじめ加温しておいた基質を添加して50μlの
反応液で反応を開始させ、10μlの８Ｍ酢酸を加えて反
応を停止させた。反応混合物50μlをワットマン(Watma
n)薄層クロマトグラフィープレートにスポットして乾燥
し、クロロホルム：メタノール：酢酸（90：10：１）を
溶媒として用いて、このプレートをクロマトグラフィー
にかけた。乾燥したプレートを一晩Ｘ線フィルムに曝す
か、あるいはその代わりに生成物(アラキドネート)と基
質(PC)に対応するバンドを削り取り、このバンドをシン
チレーション液中で計数した。

【００８０】II．滑膜PLA₂の特徴 実施例Ｉ．Ａ．で調製した物質を以下に記載されている
ようにさらに特徴づけた。

【００８１】Ａ．pH依存性および基質特異性 ホスホリパーゼ活性を、加圧滅菌した〔¹⁴C〕オレイン
酸で標識した大腸菌K₁₂C₆₀₀株を基質として使用し、フ
ランソン(Franson)ら(1978) J Lipid Res 19：18〜23の
修正方法〔バダス(Vadas)ら(1980) Life Sci 26：1721
〜1729〕によって定量した。測定は、4,120cpm/nmolリ
ン脂質の比活性を有するリン脂質5.6nmolに対応する、
１回の測定あたり2.8×10⁸大腸菌を使用して、基質過剰
で実施した。総容量1.5mlの標準反応混合物は、10mg BS
A、７mM CaCl₂、0.1mM Tris−HCl緩衝液、および
〔¹⁴C〕オレイン酸で標識した大腸菌を含有していた。3
7℃で30分間反応を進行させ、0.45μmのミリポア・フィ
ルターを通して濾過することにより反応を停止させた。
酸素活性を非酵素性加水分解に関して修正した。基質過
剰の条件下で、基質加水分解の速度は、30分までは、基
質濃度が酵素濃度の５倍の範囲内を越えるまで、反応時
間と直線的である。

【００８２】放射性標識した合成基質である、ジパルミ
トイルホスファチジルコリンおよび2-リノレオイル-1-
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンに対す
るホスホリパーゼ活性の測定は、Anal Biochim 114：64
〜70（シャカール(Shakir)、(1981)）に記載されている
ようにして行われた。標準インキュベーション混合物
は、総容量400μl中に750nmolのリン脂質、２mM CaC
l₂、２mMデオキシコール酸ナトリウム(DOC)、0.09％ト
リトンX-100、および0.1mM Tris-HCl緩衝液中の酵素タ
ンパクを含有していた。インキュベーションは、振とう
水浴中37℃で１時間、至適pH（以下参照）において実施
した。n-ヘプタン-イソプロパノール-1N 硫酸（１：
４：0.1、V/V/V）2.0mlを加えて反応を停止させた。遊
離した脂肪酸をシャカール（Shakir,（1981）Anal Bioc
him 114：64〜70）の方法によって抽出した。PLA₂活性
は、遊離した脂肪酸(nmol)／タンパク(mg)／時間(h)で
表わす。

【００８３】精製PLA₂のpH依存性は、シャカール（198
1、Anal Biochim 114：64〜70）の測定法を用いて、pH
５〜10の範囲内でジパルミトイルホスファチジルコリン
および1-パルミトイル-2-リノレオイルホスファチジル
エタノールアミンに対して測定した。使用した緩衝液は
一定のイオン強度を有する緩衝液であった：0.1Ｍ酢酸
ナトリウム−酢酸（pH５〜６）、0.1Ｍ Tris−HCl（pH
７〜８）、および0.1Ｍグリシン−NaOH（pH９〜10）。

【００８４】精製したPLA₂のpH依存性を、２つの合成リ
ン脂質基質であるジパルミトイルホスファチジルコリン
および2-リノレオイル-1-パルミトイルホスファチジル
エタノールアミンを用いてpH５〜10の範囲内において検
討した。ホスファチジルエタノールアミンは広範囲のpH
（６〜10）内で加水分解され、至適PLA₂活性はpH7.5〜
8.0において認められた。ホスファチジルコリンに対す
るPLA₂活性はpH7.0で最大を示し、pH８〜10で活性が急
に低下した。

【００８５】PLA₂の比活性は分析した３つのリン脂質の
いずれもに匹敵するものであった。大腸菌の膜リン脂質
は最も活発に加水分解され、一方ホスファチジルエタノ
ールアミンおよびホスファチジルコリンは、大腸菌リン
脂質の加水分解率に対してそれぞれ41％および27％の割
合で加水分解された。洗浄剤（特に非イオン性トリトン
X-100）は、同様の構造においてリン脂質を可溶化する
不活性基質として作用するので、認識されたホスファチ
ジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンの活
性は直接比較し得るものである。ロバーツ(Roberts)ら
（1978）J BiolChem 253：1252〜1257。

【００８６】

【表２】

【００８７】Ｂ：部位特異性の決定 精製した酵素の部位特異性を、1-パルミトイル-2-〔1-
¹⁴C〕-パルミトイルホスファチジルコリンを基質として
用いて決定した。測定系は、総容量400μl中に２mM CaC
l₂、２mM DOC、0.09％トリトンX-100、および100μlの
酵素調製物とを含有している0.1Ｍ Tris-HCl緩衝液 pH
7.5に分散した放射性ホスファチジルコリン750nmolを含
有していた。反応は37℃で3.5時間行われ、クロロホル
ム-メタノール（２：１、V/V）８mlを加えることによっ
て反応を停止した。脂質をフォルシュ(Folch)ら、(195
7) J Biol Chem 226：497〜509の方法によって抽出し、
これをクロロホルム-メタノール-酢酸-水（65：25：
８：４、V/V/V/V）中でTLCによって分離した。脂質スポ
ットをヨウ素蒸気に曝すことによって可視化した。ヨウ
素を昇華した後、標品PC、リゾ(lyso)PCおよび遊離脂肪
酸標準品に対応するスポットを削り取り、シンチレーシ
ョン液10mlを含有するシンチレーションバイアルに入れ
て、液体シンチレーションスペクトロメーター（ベック
マン(Beckman)LS7500）において放射能を測定した。1-
アシル-2-〔1-¹⁴C〕パルミトイルホスファチジルコリン
を毒物であるPLA₂、粗製の滑液または精製した滑液PLA₂
と共にインキュベートし、反応生成物を薄層クロマトグ
ラフィーによって分析した。

【００８８】98％をこえる総基質がヒガシダイヤガラガ
ラヘビ(Crotalus adamanteus)の毒物から得られたPLA₂
によって加水分解された。生成された総生成物におい
て、97.2％の放射能が遊離脂肪酸に結合しており、この
時放射性産物の2.8％だけがリゾレシチンと共に移動
し、sn-2位でエステル化した脂肪酸の選択開裂と一致し
た。同様に、粗製の滑液および精製したPLA調製物の両
方が放射性標識した基質をsn-2の位置で選択的に加水分
解し、95％を越える¹⁴C-脂肪酸を、および５％未満の2-
〔¹⁴C〕パルミトイルホスファチジルコリンを産生し
た。

【００８９】PLA₁とリゾホスホリパーゼとの結合活性(c
ombined activities)を妨げるために、粗製の滑液およ
び精製した滑液ホスホリパーゼを、1-〔1-¹⁴C〕パルミ
トイルホスファチジルコリンと共に上記のようにインキ
ュベートした。生成物の薄層クロマトグラフィー分析
は、放射性標識の99％がリゾリン脂質基質と結合したま
まであり、放射能の0.05％だけが遊離脂肪酸に結合して
いることを明らかにし、検出しうるリゾホスホリパーゼ
活性が実質上存在しないことを示唆した。これらのデー
タは、滑液ホスホリパーゼに対する完全な2-アシル特異
性と一致する。

【００９０】Ｃ．PLA₂活性におけるSDSの影響 高精製したPLA₂によるホスファチジルコリンの加水分解
率へのSDSの影響を、シャカール(Shakir)の方法（前
出）を用いて検討した。SDSはPLA₂の活性を濃度依存的
に阻害した。PLA₂の阻害は、１mg/mlおよび0.1mg/mlのS
DS濃度において各々初期酵素活性の94％および７％の割
合であった。準備用SDS−PAGEの有用性の評価におい
て、スラブ・ゲル(slab gel)からの酵素の回収率は、一
貫してゲルに作用した酵素全体の95％と100％との間で
あった。しかしながら、高精製したPLA₂を続いて凍結乾
燥すると、その結果、活性の損失（約64％の損失）はか
なりであった。

【００９１】Ｄ．PLA₂の免疫反応性 滑液PLA₂を、放射性免疫検定法によりウサギ抗ヒト膵臓
PLA₂に対する免疫反応性について試験した。スターンビ
ー(Sternby)ら（1984）Biochim Biophys Acta789：164
〜169。8.7から31.0nmol/ml・分の範囲内のPLA₂活性
（大腸菌リン脂質基質を用いて）を有する分画していな
いリウマチ性滑液の10標本を試験した。すべての場合に
おいて、抗ヒト膵臓PLA₂との実質的な交叉感受性はな
く、酵素測定によるPLA₂の定量とRIAによるPLA₂の定量
も相関関係がなかった（ｒ＝0.134）。同様に、この抗
体は精製（ex-セファデックス(登録商標)Ｇ75）した画
分を認識できなかった（表３）。滑液に添加したブタ膵
臓PLA₂についてRIAと酵素の分析物の相関関係は有意で
あった。

【００９２】

【表３】

【００９３】III．滑膜PLA₂配列のクローニング Ａ．ゲノミッククローニング ２つの50-merコドン選択オリゴをRASFピークＡ配列から
設計し、以下のようにしてアンビギュイティーを最小に
した：（a）オリゴをアンビギュイティーの最も少ない
コドングループ上に集め、そして（b）Ｇ：Ｔ結合させ
る。図３に示すように、そのオリゴはアプライド・バイ
オシステムズ（Applied Biosystems)のオリゴヌクレオ
チドシンセサイザーにおいて合成された。

【００９４】オリゴをγ-³²P-ATPおよびポリヌクレオチ
ドキナ−ゼで標識し、これをクローンテック社(Clonete
ch Inc.)（マウンテンビュー、カリフォルニア州（C
A））から入手したEMBL3-ヒト白血球ゲノムライブラリ
ーについてのハイブリダイゼーションプローブとして使
用した。次に10⁶の総プラークを、細菌株NM538を用いて
L-ブロスを含有する20個の150mm寒天プレートにまい
た。プラークをニトロセルロースフィルター上に写し、
真空の炉内で80℃で２時間熱変性させ、そして、プレハ
イブリダイゼーション溶液５Ｘデンハート液、20％ホル
ムアミド、６ＸＳＳＣ、50mM NaPO₄、100μg/mlのサケ
精子剪断DNA）中37℃で２時間プレハイブリダイズし
た。ブレハイブリダイゼーション液＋10％硫酸デキスト
ランおよび２×10⁶cmの標識プローブ中、37℃で一晩ハ
イブリダイゼーションを行った。そのフィルターを１×
0.16Ｍ NaCl、0.016Ｍクエン酸ナトリウム(SSC)、0.1％
硫酸ドデシルナトリウム(SDS)中25℃で２回洗浄し、さ
らに同じ溶液中50℃で１時間の間、フィルターを１回洗
浄して、次いでこれを−70℃で一晩オートラジオグラフ
用フィルムに曝した。その後、同じフィルターを55℃で
再洗浄し、再び曝した。

【００９５】２種類のシグナルが認められ、両方のプロ
ーブとハイブリダイズしたシグナルが７個、2779プロー
ブだけとハイブリダイズしたシグナルが４個であった。
11のシグナルのいずれもが、３回の精製工程を通してプ
ラーク精製された。ファージDNAをクローンから調製
し、その制限酵素消化物をアガロースゲル分離によって
分析すると、明らかなクローンの数は２個に減少した。
以後、これをクローン６およびクローン10とした。オリ
ゴ2779は、55℃で洗浄すると、クローン６およびクロー
ン10と強くハイブリダイズした；オリゴ2780は同じ条件
下でクローン６と弱くハイブリダイズした。

【００９６】２つの独特なクローンからのDNAをエンド
ヌクレアーゼHaeIII、RsaＩ、およびAluＩで消化した。
完全な消化産物をフェノール／クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させた。乾燥したペレットを10mM
Tris、pH8.0、１mM EDTA中に再懸濁し、そして1.0μl
のアリクウォットを、あらかじめSmaＩで消化しておい
たバクテリオファージM13m８に連結した。形質転換した
大腸菌JM101株の細胞を150mmのL-寒天プレートにプレー
トし、37℃で一晩インキュベートした。生じたM13組換
えプラークを取り、そのフィルターを上述のようにハイ
ブリダイズした。ハイブリダイゼーションシグナルに一
致するプラークを取り、これを用いて一本鎖M13DNA鋳型
を作製した。クローンの配列決定はジデオキシ／酵素的
方法を用いて行い、得られた配列を整理して、これをイ
ンテリジェネティックス(Intelligenetics)プログラムS
eqおよびGel（インテリコープ社）(Intellicorp In
c.)、マウンテンビュー、カリフォルニア州(CA)）を用
いてVACS8500コンピューター（ディジタル社）(Digital
Corp.)で解析した。この２つの独特なホスホリパーゼ
クローン６および10のエクソンに関する得られたクロー
ン配列を図４および５に示す。これらの配列は404bp Al
uＩ断片（クローン６）および約460bp AluＩ断片（クロ
ーン10）内に含有されている。クローン６および10をそ
れぞれλSPLA2-6およびλSPLA2-10と名づけた。

【００９７】λsPLA₂-6におけるsPLA₂コード配列は、元
来ヒトＡ型遺伝子Ａ型のエクソン２であると考えられ
た。以下のIII．Ｂ．において同定するcDNA配列を使用
して、ゲノミッククローン中に残っているエクソンを同
定した。遺伝子の5'非コード領域に予想外のイントロン
が存在することを見い出した。このため、元来、エクソ
ン２であると考えられたものは、実際にはエクソン３で
ある。エクソン１をコードする配列を図８〜１０に示
す。1016から1038までの塩基は、cDNAクローンの８から
27の塩基に正確に相当する。厳密な転写開始部位は決定
されなかったがその最も有望な位置は塩基1012あるいは
そのすぐ上流である。潜在的な「TATA」配列がヌクレオ
チド968から974において認められ得、推定上の「CAAT」
配列はヌクレオチド904から909に存在する。

【００９８】Ｂ．cDNAクローニング 60-merオリゴヌクレオチドプローブを、図４および５に
示すλsPLA2-6のヌクレオチド配列と対合し、図１に示
すアミノ酸残基５〜24のコドンに対応するように合成し
た。このオリゴヌクレオチドプローブを使用して、以下
のものを含有する各種の起源からのRNAブロットをスク
リーニングした：細胞株HL60およびU937、ヒト滑膜細
胞、ヒト腹腔炎症浸出液細胞、ヒト膿細胞、ブタ空腸組
織、ブタ膵臓組織、ラット脾臓組織、およびラット肝臓
組織。かなりのレベルのRNAが、ヒト腹腔細胞における
ハイブリダイゼーションにより検出され、ヒト滑膜細胞
ではそれより低いレベルのRNAが検出された。

【００９９】ガプラーとホフマン(Gubler & Hoffman)
（1983）Gene 25：263〜269の方法に従い、腹腔細胞RNA
（prep）からのポリA⁺メッセージからcDNAライブラリー
を構築した。そのライブラリーを60-merプローブでスク
リーニングし、フィルターを1X SSC、0.1％SDS中60℃で
洗浄した後、17の独立(discrete)重複シグナルを得た。
10のクローンからのDNAをPAGEによって分析した。すべ
てのクローンが800〜1,000bpの挿入部を含有していた。
クローン１、４、11および14と称する４つのクローン
を、バクテリオファージM13ヘのサブクローニングのた
めに、およびその後の標準的手法によるDNA配列分析の
ために選択した。これらのクローンのうちの１つである
λsPLA₂cDNA-4が、sPLA₂ Ａ型配列全体をコードするこ
とが決定された。図７を参照されたい。その他のクロー
ンは同じ配列を含有するか、あるいは5'未満で長さがわ
ずかに異なっており、異なる長さのポリAの尾部を有し
ていた。他の点では、このクローンは、277位でＣがＴ
に置換されている以外同一であった。アミノ酸に関する
サイレント変異(silent mutation)はコドンによって規
定される。典型的な翻訳終止配列、AATAAAが塩基116か
ら始まることが認められ得る。λPLA₂cDNA-4によってコ
ードされた成熟ペプチド配列は124のアミノ酸を含有
し、そして13,919ダルトンの計算された分子量を有す
る。

【０１００】IV．組換え滑膜PLA₂ Ａ．細菌宿主 活性な組換えsPLA₂を、デゲウス(de Geus)ら（1987）Nu
cleic Acids Res 15：3743〜3759から適用させた工程を
使用し、β-ガラクトシダーゼ融合タンパクとして、大
腸菌のような細菌中に産生した。この方法は次のように
sPLA₂に適用させた。まず最初にＣ未満でヌクレオチド5
88に挿入したＣからＧへの単一の塩基変化により、TGA
停止コドンの17塩基下流にHindIII部位を創製した。こ
の変化は、標準的な分子生物学的方法を用いて、一本鎖
M13DNAのオリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異によ
り実施した。この変異したクローンDNAをBcIIおよびHin
dIIIで消化すると、成熟タンパクの最初の９個のアミノ
酸残基以外はsPLA₂コード領域全体を含有する、370bp断
片を産生した。これら９個の残基を開裂可能な融合部位
（Trp）およびEcoRI部位と共に、図１１に示す２つのオ
リゴヌクレオチドリンカーによって置き換えた。370bp
BclI-HindIII断片を２つのオリゴヌクレオチドと共に、
あらかじめEcoRIとHindIIIで切断しておいた発現ベクタ
ーpHNF86に連結することにより、発現構築物p86-1Aを得
た。pHNF86ベクターは、pBR322バックボーン；大腸菌ト
リプトファンプロモーター；リボソーム結合部位；６個
のThr残基が続く、大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子の
アミノ末端部分の一部をコードする配列； EcoRIとHind
III部位；および２つの強力な大腸菌転写終止シグナル
から成る。例えば、サング(Sung)ら(1986) Proc Natl A
cad Sci USA 83：561〜565を参照されたい。

【０１０１】sPLA₂構築物を含有する発現ベクターを使
用して、発現のために大腸菌株W3110（ATCC受託番号273
25）を形質転換した。適当な個体群密度の形質転換細胞
の培養を播種した後、培地中に3-B-インドールアクリル
酸を添加して発現を誘導した。誘導培地で９時間増殖さ
せた後、細胞の約90％において封入体が観察された。細
胞分断後、封入体をペレットし、これを50mM β-メルカ
プトエタノールを含有するゲル充填緩衝液中で５分間煮
沸した。非誘導培養および対照培養からの類似の抽出物
のゲルと比較してみると、発現構築物で形質転換した誘
導培養においては顕著に15kdバンドが観察された。この
バンドは精製封入体抽出物から得られるゲル中にかなり
多く、準備用SDS-ポリアクリルアミドゲルから得られる
この融合タンパク質を大規模に分離した。このようにし
て調製した融合タンパクを、抗体産生のためにウサギ、
ラットおよびマウスに注入した。

【０１０２】精製した融合タンパク画分はデ・ハース(D
eHaas)ら(1987)（前出）が述べたようなS-スルホン化方
法により活性化し得る。活性化後、融合タンパクはTrp
残基において開裂され得、成熟ヒトPLA₂を放出する。そ
の代わりに、逆の順序で２つの工程を行なうと、活性タ
ンパクがより大きな収量で得られる。例えば、リシュク
ウェとオッシュ(Lishchwe & Ochs)（1982）Anal Biochi
m 127：453〜457を参照されたい。さらに従来の精製工
程を使用して、β-galリーダー(β-gal leader)からsPL
A₂が分離され得る。

【０１０３】Ｂ．ワクシニアウイルス 組換えsPLA₂ポリペプチドは、ワクシニアウイルス発現
ベクターを使用して、哺乳類細胞においても提供し得
る。このような発現ベクターは当該技術において公知で
ある。例えば、PCT特許公開第WO86/07593号（CBI：PB
8）を参照されたい。

【０１０４】例えば、チャクラバーティ(Chakrabarti)
（1985）Mol Cell Biol 5：3403が述べている、ワクシ
ニア発現ベクターpSC-11を以下の実験計画案(protocol)
に従って使用した。オリゴヌクレオチド部位特異的変異
によって塩基127をＡからＧに変えて、ATG開始コドンか
ら５bp上流にSacＩ部位を作製したこと以外は、上述の
ようにしてsPLA₂コード断片を調製した。従って、コー
ド領域は469bp SacＩ−HindIII断片上に含まれている。
次に、この断片を、あらかじめSmaＩで切断したワクシ
ニアベクターPSC-11に平滑末端連結した。得られたDNA
を回収し、これを用いて標準的手法で培養した哺乳類CV
-1細胞のワクシニア感染単層をトランスフェクションし
た。得られたプラークを数段階の感染を通して精製し
た。

【０１０５】図１２に示すように、細胞および培地の両
方に存在するPLA₂活性を測定することにより、時間経過
と共に培地中にPLA₂のかなりの蓄積が示された。この図
１２において、縦軸に培地当たりのPLA₂活性を示し、横
軸に時間を示す。黒四角は、野生型であり、黒菱形は標
準品であり、そして黒丸は500mM Trisを示す。同じよう
にして調製した培地が大量に得られ、このため、これら
の細胞によって発現される活性を有する組換えPLA₂酵素
が、標準的精製工程によって得られ得る。さらに、これ
らの細胞から精製した感染ウイルスを使用して、活性酵
素を認識する抗体の産生のためにウサギおよびマウスに
接種した。マウスにおいてかなりの力価に到達すると、
酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が同定され得
る。この同定は、上述したPLA₂測定での活性を阻害する
能力に関してハイブリドーマクローンをスクリーニング
することにより行われる。

【０１０６】Ｖ．滑膜PLA2に対する阻害抗体 ヒト滑膜PLA2配列のセグメント：（i）67〜85（GTKFLSY
KFSNSGSRITC）および（ii）109〜132（NKTTYNKKYQYYSNK
HSRGSTPRC）に対応する２つのペプチドを合成し、これ
らとグルタルアルデヒドを有するオバルブミンとを結合
させて、これらを別々にウサギを免疫するために使用し
た。

【０１０７】Elisa測定による測定で１：40,000の力価
を有する両ペプチド複合体に対する抗血清を得た。マッ
キンニー(McKinney)およびパーキンソン(Parkinson)（J
Immun Meth 96：271〜278 (1987)）の方法により抗血
清および対照血清からIgGを精製し、これを10mg/mlの濃
度でin vitro活性測定において使用した。

【０１０８】測定のための滑膜PLA2活性の起源は、ヒト
メタロチオネインプロモーターの転写制御下で滑膜PLA2
配列によりトランスフェクトした細胞からの、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞馴化培地の部分精製した調製物
であった。部分的な精製は、イオン交換クロマトグラフ
ィー（モノＱカラム、50mM Tris−HCl、pH8.0中０〜２
Ｍ NaCl勾配）、透析および凍結乾燥によって達成され
た。

【０１０９】in vitro活性測定は、酵素およびIgGを、
基質を添加する前に、37℃で１時間、測定緩衝液中でプ
レインキュベートするという変形を行ったこと以外は上
述のようにして行なった。

【０１１０】各ペプチドに対する抗体とプレインキュベ
ートすると、対照IgGと比べて約50％の活性阻害を生じ
る。その結果を表４に示す：

【０１１１】

【表４】

【０１１２】本発明は、ある特定の実施態様によって上
記のように例示され得るが、これらの特定実施例は、上
記特許請求の範囲で述べられるような本発明の範囲を制
限することを意図するものではない。

【０１１３】

【発明の効果】本発明により、抗哺乳類滑膜ホスホリパ
ーゼA₂抗体が提供され、さらに炎症性疾患を治療するた
めの抗哺乳類滑膜ホスホリパーゼA₂抗体を含有する治療
用組成物、およびこの抗体を用いる哺乳類滑膜ホスホリ
パーゼA₂の定量方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の滑膜ホスホリパーゼと他のホスホリパ
ーゼとのＮ末端アミノ酸配列の比較を示す図である。

【図２】酵素活性および光学密度プロフィールを表わ
す、部分精製滑膜PLA₂のC₄逆相HPLCプロフィールを示す
グラフである。

【図３】滑膜PLA₂クローンを同定するために使用された
２種の50-merオリゴヌクレオチドプローブのDNA配列を
示す図である。

【図４】２種のヒトPLA₂ゲノミッククローン、λSPLA2-
6およびλSPLA2-10のDNA配列を示す図である。これらは
本文中に述べる２種のPLA₂酵素のエクソンを含む。

【図５】図４の続きである、２種のヒトPLA₂ゲノミック
クローン、λSPLA2-6およびλSPLA2-10のDNA配列を示す
図である。

【図６】図１に示すsPLA₂A型のアミノ酸残基５〜24に一
致するように合成され、クローンλSPLA₂-6のヌクレオ
チド配列に基づく60-merオリゴヌクレオチドプローブを
示す図である。

【図７】λSPLA₂cDNA-4と称するヒトsPLA₂A型のcDNAク
ローン由来の、ヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸
配列を示す図である。

【図８】ヒトsPLA₂A型のゲノミッククローンλSPLA2-6
由来のエクソン１〜５のヌクレオチド配列を示す図であ
る。

【図９】図８の続きである、ヒトsPLA₂A型のゲノミック
クローンλSPLA2-6由来のエクソン１〜５のヌクレオチ
ド配列を示す図である。

【図１０】図９の続きである、ヒトsPLA₂A型のゲノミッ
ククローンλSPLA2-6由来のエクソン１〜５のヌクレオ
チド配列を示す図である。

【図１１】イー．コリにおけるsPLA₂の発現のための組
換え体DNA構築物に有用なオリゴヌクレオチドリンカー
を示す図である。上部の配列はＮ末端接続部分を示し、
株の配列は、Ｃ末端接続部分を示す。

【図１２】ヒトsPLA₂A型遺伝子を含有する組換え体ワク
シニアウイルスによるCV-1細胞の感染中の、血清を含ま
ない培地におけるPLA₂酵素活性の蓄積を示すグラフであ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ジェフェリー ジェイ． セイルヘイマー アメリカ合衆国 カリフォルニア 95035 ミルピタス，エリック サークル 860 (72)発明者 ウォルデマー プルザンスキー カナダ国 オンタリオ エム２エル ２ジ ェイ６ ウィルロウデイル，フィフェシャ ー ロード 42 (72)発明者 ピーター バダス カナダ国 オンタリオ エム４ピー １ケ ー４ トロント，エーピーティー．ナンバ ー．３ グレンローズ アベニュー 52

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳類滑膜ホスホリパ−ゼＡ₂に固有の
   エピトープを認識する抗体を含む組成物。
2. 【請求項２】 炎症性疾患の処置のための治療用組成物
   であって、有効量の抗哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ₂抗
   体を含む、組成物。
3. 【請求項３】 試料中の哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ₂
   （sPLA₂）Ａ型およびＢ型を定量する方法であって、哺
   乳類由来の滑液試料を提供すること、および定量分析に
   おいて該試料中の該哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ₂（sPL
   A₂）Ａ型およびＢ型の量を測定すること、を包含する方
   法。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記定
   量分析は免疫学的検定法である、方法。