JPH04506447A - 滑膜ホスホリパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 滑膜ホスホリパーゼ 関連出願 本出願は、　１９８７年８月２７日付出願の米国特許出願第０８９．８８３号の 一部継続出願である。、１９８８年７月６日付出願の米国特許出願第２１５，４ ２６号の一部継続出願である。そしてこれらの開示内容は参考として本文に示さ れている。

技術分野 本発明は９組換え法によるタンパクの分離、特性付け、および製造に関する。さ らに詳しくは１本発明は滑脱ホスホリパーゼＡ２に間する。

背景 炎症性疾患は、現在衰弱疾患の重要なパーセンテージを占めている。慢性関節リ ウマチ、全身性狼癒、乾唐、そしておそらくアテローム性動脈硬化症のような慢 性症状は、関節。

皮膚および血管における炎症反応から生じる。炎症反応の中心的役割がエイコサ ノイドと呼ばれるリン脂質代謝産物の産生であることは現在明らかになっている 。はとんどの組織において、エイコサノイドの合成は複合脂質中のエステル化貯 蔵物から遊離するアラキドン酸（ＡＡ）の利用率によって制限されることが一般 的に認められている。

ホスホリパーゼＡ２　（ＰＬＡ２　；　ＥＣ３，１，１，４）は１．２−ジアシ ル−５ｎ−グリセロ−ホスホコリンのｓｎ”からの脂肪酸の放出を触媒する。最 もよく特性付けられている種類は、ｌ１ｉｎ乳類の膵臓中でチモーゲンとして分 泌される消化酵素である。各種の哺乳類由来の膵Ｗ＆１ＰＬＡ２酵素に対するア ミノ酸配列とｃＤＮＡがクローン化されている。例えば、　Ｏ’Ｈａｒａら（１ ９７６）　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　９９　ニア３３〜７３９　；　Ｄｕｆｔｏｎら （１９８３）　Ｅｕｒ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３７　：　５３７〜５４４　； Ｇｒａｔａｒｏｌｉら（１９８２）Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１２２　：　 １１１〜１１７を参照のこと。これらの哺乳［ＰＬＡ２酵素はヘビおよびミツハ チの毒物ホスホリパーゼと密接な相同性がある（Ｄｕｆ　ｔｏｎら、前出の文献 ）。特に２重要な活性部位の残基とシスティンの配列は極めてよく保存されてい るようである。ウシ膵臓ＰＬＡ　Ｚおよびいくつかの毒物酵素のｘ′！ｓ結晶構 造解析により、　ＰＬＡ２酵素の構造上作用機構に関する詳細なモデルが解明さ れるに至った。

例えばＲｅｎｅｔｓｅｄｅｒら（１９８５）Ｊ、　Ｂｉｏｌ　ｃｈｅｍ　２６０ 　：　１１６２７〜１１６３４を参照のこと。膵１ｉｉＰＬＡ２および毒物ＰＬ Ａ　２の両者が前炎症性であることが示されている（Ｐｒｕｚａｎｓｋｉら（１ ９８６）Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏ１８６　：　３８０〜３８３）。別 の消化ＰＬＡｔがブタの腸から単離され。

部分的なアミノ酸配列が推定された（Ｖｅｒｇｅｒら（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔ■２１　：　６８８３〜６８８９）。

膵臓ＰＬＡｚの構造は、新規なＰＬＡ　２阻害因子を設計するためのモデルとし て使用されてきた。しかし、このアプローチは。

インビボでの炎症阻害に有効であることが証明された薬剤を設計するには至って いない。

しかし、　ＰＬｌｈが、哺乳類の炎症性疾患において中心的役割を果たすとすれ ば、おそらくほとんどの場合消化形によってではないであろう。むしろ、「細胞 性Ｊ　ＰＬＡ２酵素と称される類似ＰＬＡ２酵素が炎症発現におけるへへ放出の 調節因子である可能性が高いようである。残念ながら、これらの細胞性ＰＬＡ２ 酵素はよく理解されていない。これは、十分な量の細胞性ＰＬＡ　。

酵素を得ることが困難であり、消化形のＰＬＡ２よりも広汎な精製を必要とする という事実に起因する。

細胞形のＰＬＡ　ｚは、以下のものを包含する種々の哺乳類組織や細胞型から分 離されている：脳（Ｇｒａｙと５ｔｒｉｃｋｌａｎｄ、　１９８２゜Ｃａｎ　Ｊ 、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　６０　：　１０８〜１１７）　、肝Ｗ＆（Ｄｅｗｉｎｔｅ ｒら、　１９８２゜Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ　７１２　：　 ３３２〜３４１）、肺（Ｆｒａｎｓｏｎら。

１９８２、　匡■１６０　：　２７５〜２８４　；　Ｇａｒｃｉａら、　１９７ ５．　ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　ＣｏＩＩＩＩＩ＋６４　：　１ ２８〜１３５　；　５ａｈｕとＬｙｎｎ、　１９７７、　Ｂｉｏｃｈｉｍ厖」仇 ■」１垣　剣澱−：３０７〜３１７　）　、腸（Ｖｅｒｇｅｒら、１９８２゜Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２１　：　６８８３〜６８８９）　、牌＠（Ｔａｒａｍ ｏｔｏら、　１９８３゜Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　９３　：　１３５３〜１３６０ ）　、マクロファージ（ＴｒｏｔｔｅｒとＳｍ１ｔｈ　、　１９８６．　Ｎｅｕ ｒｏｃｈｅｍ　Ｒｅｓ　旦：　３４９〜３６１　；　Ｌａｎｎ１とＦｒａｎｓｏ ｎ、　１９８１．　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ　６５８　：　 ５４〜６３　；　ＶａｄａｓとＨａｙ　、　１９８０．　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ ｃｅｓ　２６：　１７２１〜１７２９　；Ｖａｄａｓら。

１９８１、　Ｎａｔｕｒｅ　２９３　：　５８３　；Ｗｉｇｈｔｍａｎら、　１ ９８１．　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｊ２００　：　４４１〜４４４　；　Ｆｒａｎｓｏ ｎ　ら、　１９７３．　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ２９６　： 　３６５〜３７３）　、白血球（ＴｒａｙｎｏｒとＡｕｔｈｉ、　１９８１．　 ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ　６６５　：　５７１〜５７７　；　 Ｆｒａｎｓｏｎら、　１９７７、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｊ１６７　：　８３９〜８ ４１）　、赤血球（Ｋｒａｍｅｒら、　１９７８．　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　 ｈ　ｓ紅１）５０７　：　３８１〜３９４）　、腹水（Ｆｏｒｓ　ｔら、１９８ ６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２５　：　８３８１〜８３８５）　、軟骨細胞（ Ｃｈａｎｇら、　１９８６．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ１１３６　；　１２８３〜１２ ８７）　、および血小板（Ｈａｙａｋａｗａら、　１９８Ｂ、　Ｊ（１９８０） 　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ　６０４　：　１９１〜２４６を 参照のこと。本出願人による１９８６年１２月２４日付出願の米国特許出願第９ ４６．５５７号も参照されたい。

特に興味深いのは、慢性関節リウマチ患者の滑液のような炎症性滲出液からＰＬ Ａ！を分離することである。　５ｔｅｆａｎｓｋｉら。

（１９８６）Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　１００　：　１２９７〜１３０３　；　Ｖ ａｄａｓ　ら（１９８５）ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ　３６　：　５７９〜５８ ７　；　ＶａｄａｓとＰｒｕｚａｎｓｋｉ（１９８４）　Ａｄｖ　Ｉｎｆｌａ＋ ｕ＋ａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ　ヱ：　５１〜５９　；　Ｖａｄａｓら（１９８１）　 Ｎａｔｕｒｅ　２９３　：５８３〜５８５　；　Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ　ら（１９ ８５）Ｊ　Ｒｈｅｕｍｓｔｏｌ　１２　：　２１１〜２１６　；Ｓｉｌｖｅｒｍ ａｎ　ら、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　Ａｓｓ’ｎ　：　５１ｓ ｔ　ＡｎｎｕａｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｍｅｅｔｉｎ　（１９８７年６月９〜 １３日、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ　ら、同上 に れらの様々な細胞性酵素の活性についての報告は、大きさ、至適ｐＨ，基質特異 性、　Ｃａ”要求、形態（可溶性あるいは膜結合性）、および量が異なっている 。これらの単離物についての完全なタンパク配列は公的に報告されていないので （部分配列は、　Ｖｅｒｇｅｒら、　１９８２．前出逼Ｆｒｏｓｔら、　１９８ ６．前出；）Ｉａｙａｋａｗａら、　１９８７．前出；およびＨａｙａｋａＨａ ら、　１９８Ｂ、前出に公表されている）、これらの単離物のいずれかが、同じ 酵素であるかを判断することは困難である。さらに、リン脂質のｓｎ２部位の開 裂は、　ＰＬＡ、とりヅホスホリパーゼとの結合した連続的作用からも生じ得る ので、高度に精製された単離物以外では直接ＰＬＡ　ＩとＰＬＡ２とを完全に識 別することはむずかしい。

しかしながら、上記から明らかなように、これらの酵素の多くは炎症反応に関連 する細胞（すなわち、マクロファージ。

白血球、軟骨細胞、溝膜細胞など）あるいは炎症性滲出液から調製されている。

それにもかかわらず、因果関係に関するデータが欠落しているため、もしその中 にあるとすれば、これらの酵素のうちのいずれが、炎症反応において重要である かを確定することが困難であった。

インビボで慢性関節リウマチの原因となる形態のＰＬｌｈが単離されれば、抗炎 症薬の設計に役立つ重要な手段を提供することになる。消化および毒物ＰＬＡ　 、阻害因子に関する研究に基づいて、炎症性疾患の原因となるＰＬＡ、の形態に は、類似してはいるが、消化あるいは毒物ＰＬＡ２の阻害因子が必ずしもインビ ボで後者の形態を阻害しないような構造上の相違があると考えられる。従って、 特異的阻害因子を効果的に設計するためには、慢性関節リウマチに関わる特異的 ＰＬＡ２を、構造的に特性決定することのできる十分な量で単離することが必要 である。ＰＬＡｚは、一般に１食品加工産業（ＤｕｔｉｌｈとＧｒｏｇｅｒ、　 １９８１゜Ｌと「ハ剋」肛江　井＝４５１〜４５８）および魚の保存においても 有用である。Ｍａｚｅａｕｄと旧１ｉｎｓｋｉ（１９７６）Ｊ　Ｆｉｓｈ　Ｒｅ ｓ　Ｂｏａｒｄｑリー　狼：　１２９７〜１３０２）。

本発明によれば、以下層膜ホスホリパーゼＡ、（溝膜ＰＬＡ　ｚすなわち５ＰＬ Ａｚ　）と称する。新しい族の哺乳類ホスホリパーゼＡ２が哺乳類のゲノム内に コードされており、それらはＤＮＡ配列およびアミノ酸配列がともに、既知のＰ ＬＡ、酵素と実質的に異なることが発見された。５ＰＬＡｚの遺伝子のクローニ ングにより、これらの新しい酵素の構造的特性付けができ、そして精製された相 当量の酵素を製造する方法が提供される。従って本発明は、中でも、抗炎症薬の 設計に役立つ重要な手段を提供するものである。

一実施態様において１本発明は、非相同領域を含む二本鎖ＤＮＡ構築物を含有す る組成物を提供する。該領域は哺乳類滑層ホスホリパーゼＡ２のコード配列を有 し、該組成物は、該非相同領域を含まない構築物を実質的に含有しない。このＤ ＮＡ構築物はレプリコン内に含まれるか、あるいは含まれない。

他の一実施態様において１本発明は９次の工程を包含する。

組換え体哺乳類滑脱ホスホリパーゼＡｔの製造方法を提供する：細胞内で機能し 得るレプリコンを含有する形質転換された細胞群を生産する工程、ここで；該レ プリコンは該細胞内で機能し得るプロモーターの制御下にあるコード配列を含み 、該コード配列は哺乳類滑層ホスホリパーゼＡ２をコードし、該細胞群は実質的 に他の細胞を含まない：哺乳類溝膜ホスホリパーゼを発現する条件下で該細胞群 を増殖させる工程：および該補乳類滑脱ホスホリパーゼＡ２を回収する工程。本 発明の方法は、適当な原核細胞あるいは真核細胞発現系を使用することができる 。

さらに他の実施態様において１本発明は、実質的に夾雑タンパクを含まない哺乳 類溝膜ホスホリパーゼＡ２を含有する組成物を提供する。

さらに他の実施態様において９本発明は抗哺乳類滑脱ホスホリパーゼＡ２抗体、 ならびに抗哺乳類滑脱ホスホリパーゼＡ２抗体を用いて炎症性疾患を治療する方 法を提供する。

置皿■説皿 第１図は２本発明の滑脱ホスホリパーゼと他のホスホリパーゼとのＮ末端アミノ 酸配列の比較を示す。ｈＲＡＳＦ−ピークＡおよびビークＢはヒト滑液から単離 した２種の滑層ＰＬＡ　Ｚである。ＮＰは、同時継続中の米国特許出願第９４６ ．５５７号に記述されている「非膵臓ｊ型のＰＬＡ　、であり、ヒ）（ｈ）、ブ タ（ｐ）およびラント（ｒ）形態を包含している。ｒｈｃｌｎ　ＩＯＪで表わさ れる配列は、クローンλ５ＰＬＡ２−１０　（第４図）から誘導され。

５ＰＬＡｚ　Ｂ型またはＣ型配列、あるいは異なるＰＬＡ２であろう。

いくつかの膵臓ＰＬＡｚも図中に示す：ブタ腸ＰＬＡｚ（ｐ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎ ｅ）。

ウサギ腹水ＰＬＡｚ（ｒａｂ　Ａｓｃｉｔ’ｅｓ）、ラット血小板ＰＬＡ、（ｒ 　ｐｌａｔｅｌｅｔ）　；および２種のヘビ毒物：　Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒ ｏｘ　（Ｃ，ａｔｒｏｘ　）　、およびＡｑｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｐｉｓｃｉｖ ｏｒｕｓ　（紅」ｎ虹に−４９）。

第２図は、酵素活性および光学密度プロフィールを表わす。

部分精製溝膜ＰＬＡ２のＣ４逆相ＨＰＬＣプロフイールである。

第３図は、溝膜ＰＬＡｚクローンを同定するために使用された２種の５０−ｍｅ ｒオリゴヌクレオチドプローブのＤＮＡ配列を示す。

第４図は、２種のヒトＰＬへ２ゲノミッククローン、λ５ＰＬＡ２−６およびλ ５ＰＬＡ２−１０のＤＮＡ配列を示す。これらは本文中に述べる２種のＰＬＡ　 Ｚ酵素のエクソンを含む。

第５図は、第１図に示す５ＰＬＡ２Ａ型のアミノ酸残基５〜２４に一致するよう に合成され、クローンλ５ＰＬＡ２−６のヌクレオチド配列に基づ＜　６０−ｍ ａｒオリゴヌクレオチドプローブを示す。

第６図は、λ５ＰＬＡ２ｃＤＮＡ−４と称するヒト５ＰＬＡｚＡ型のｃＤＮＡク ローン由来の、ヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列を示す。

第７図は、ヒト５ＰＬＡ２Ａ型のゲノミッククローンλ５ＰＬＡ２−６由来のエ クソン１〜５のヌクレオチド配列を示す。

第８図は、イー、コリにおける５ＰＬＡｚの発現のための組換え体ＤＮＡ構築物 に有用なオリゴヌクレオチドリンカーを示す。

第９図は、ヒト５ＰＬＡｚＡ型遺伝子を含有する組換え体ワクシニアウィルスに よるＣＶ−１細胞の感染中の、血清を含まない培地におけるＰＬＡ、酵素活性の 蓄積をグラフで示したものである。

■豊星説皿 本発明の実施には、特に記載がない限り、当業者の範囲内の従来の分子生物学、 微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。そのような技術は文献中に十分 に説明されている。

例えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ｒ分 子クローニング：実験室マニュアルＪ　（１９８２）　ｒＤＮＡＤＮＡセグメン ト的アプローチＪ、ｒ巻と■巻（Ｄ、Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ）編、　１９８５）　 ；「オリゴヌクレオチドの合成Ｊ　（Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔ　編、　１９８４）　 ；　「核酸ハイブリダイゼーションＪ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓとＳ、Ｊ、　Ｈ ｉｇｇｉｎｓ編、　１９８５）　；　ｒ転写と翻訳」（Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｓと Ｓ、Ｊ、　）Ｉｉｇｇｉｎｓｍ。

１９８４）　；　ｒ動物細胞培養Ｊ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ　ｉ、　１９ ８６）　；　’固定化細胞および酵素」（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６　） 　；　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ。

「分子クローニングの実践的手引Ｊ　（１９８４）を参照のこと。

本発明を説明するにあたり１次の語句を以下に述べる定義に従って使用する。

「レプリコン」とは、インビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能する。すなわ ち、自らの制御下で複製を行ない得る遺伝的要素（例えばプラスミド、染色体、 ウィルス）である。

「ベクター」とは、別の１つのＤＮＡセグメントが結合し得。

結合したセグメントの複製を引きおこす、プラスミド、ファージあるいはコスミ ドのようなレプリコンである。

「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、正常な二本鎖らせん状の重合体形態のデオキシリボ ヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）を指す。この 語句は２分子の一次および二次構造のみを指し１分子を特定の三次形態に限定す るものではない。従って、この語句は、特に線形ＤＮＡ分子（例えば制限断片） 、ウィルス、プラスミド、および染色体において認められる二本鎖ＤＮＡを包含 する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を検討するにあたり２本文中では、配列は 、転写されないＤＮＡ鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を持つ鎖）に沿って５ ゛末端から３°末端方向への配列のみを示す常法に従って記述される。

ＤＮＡの「コード配列」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、インビ ボで転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界 は、５“（アミノ）末端の開始コドンと３゛（カルボキシ）末端の翻訳終止コド ンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｒｔｒＲＮＡ由 来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳ｉ）　ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さ らには合成りＮＡ配列をも包含し得るが、これらに限定されるものではない。ポ リアデニル化信号および転写終止配列は１通常コード配列の３°側に位置する。

「プロモーター配列」とは、細胞中でｌ？ＮＡポリメラーゼと結合して、下流（ ３′方向）のコード配列の転写を開始させることのできるＤＮＡ　調節領域であ る。本発明を定義するために。

プロモーター配列は、その３゛末端はコード配列の翻訳開始コドンまでとし、上 流（５′方向）は拡張されて、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写 を開始するために必要な最小数の塩基あるいは要素を含む。プロモーター配列内 には。

転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でのマツピングにより都合よく決定される）、 およびＲＮＡポリメラーゼの結合を支配するタンパク結合領域（コンセンサス配 列）が認められる。真核生物プロモーターは、常にでは、ないがしばしば、ｒ　 ＴＡ７Ａ　ＪボックスおよびｒＣＡＴ　、Ｊボックスを含む。原核生物プロモー ターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイ、ン・ダルガーノ （Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含む。

プロモーター配列を結合しているＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに 転写し５次にコード配列によってコードされたタンパクに翻訳される場合、コー ド配列が細胞中でプロモーター配列の「制御下」にある。

外因性ＤＮＡが細胞壁内に導入された場合、細胞は外因性ＤＮＡによって「形質 転換」される。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込ま れている（共有結合的に結合）場合と組込まれていない場合がある。原核生物お よび酵母においては９例えば、外因性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム成分 上に保持されていると考えられる。真核細胞に関しては、安定して形質転換され る細胞は、外因性ＤＮＡが、染色体内に組込まれて、染色体の複製を通して娘細 胞に遺伝されるものである。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞集団 からなる細胞系統、あるいはクローンを確立する。真核細胞の能力によって証明 される。「クローン」とは、単一細胞あるいは共通の祖先から有糸分裂によって 生じる細胞集団である。「細胞系統」は、何世代にもわたってインビトロで安定 な増殖を続けることができる一次細胞のクローンである。

一定の長さのＤＮＡ配列にわたってヌクレオチドの少なくとも約８５％（約９０ ％以上が好ましく、約９５％以上が最も好ましい）が一致している場合、２つの ＤＮＡ配列は「実質的に相同である」。実質的に相同な配列は１例えばその特定 の系について定められている厳密な条件下で、サザーンハイプリダイゼーション 実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定め ることは当業者の範囲内である。例えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、ＤＮ八 へローニング、１巻と■巻、前出；核酸ハイブリダイゼーション、前出を参照の こと。

ＤＮＡ構築物の「非相同」領域とは、より大きなりＮＡ分子内にあり、天然では その大きな分子と結合した形では見出されない、同定可能なりＮＡ上セグメント ある。従って、非相同領域が哺乳類遺伝子をコードする場合には、その遺伝子に は。

通常、起源生物のゲノムにおいては哺乳類のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡが 隣接している。非相同コード配列のもう１つの例は、コード配列自体が天然には 見出されない構築物である（例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含むｃ ＤＮＡ　。

あるいは天然遺伝子とは異なるコドンを持つ合成配列）。対立遺伝子変異あるい は自然に発生する突然変異は９本文中で定義したようなりＮＡの非相同領域を生 じることはない。

組成物中のタンパクの少なくとも約７５重量％が当該の特定タンパクである場合 、タンパク組成物は「実質的に夾雑タンパクを含まない」。好ましくは、このタ ンパクは９組成物中に少なくとも約９０重量％の当該タンパク、最も好ましくは 少なくとも約９９％の当該タンパクを含有する。実質的に夾雑タンパクを含まな いタンパク組成物は、当該タンパクの活性を有する単−分子量種のみを包含する ことが好ましい。

「溝膜ホスホリパーゼＡ２」（溝膜ＰＬＡ　！すなわち５ＰＬＡｚ）は。

ＰＬＡ２活性を示し、慢性関節リウマチに罹患している（ヒトのような）＠乳類 の滑液中に認められる哺乳類酵素の分類を１旨す。５ＰＬＡ２酵素は、炎症を起 こした溝膜組織によって、あるいはおそらく滑液中の顆粒細胞またはマクロファ ージによって産生される。滑膜ＰＬＡｚ酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＰＡＧＥ）　（１２，５％ポリアクリルアミドゲル、０．１％ＳＯＳ　）に よって測定すると、約１５±３ＫＤの分子量を持つと特徴付けられている。この 酵素族の代表的なものは、　５ＰＬＡｚＡ型。

Ｂ型、およびＣ型である。Ａ型およびＢ型のＮ８２末端アミノ酸配列を第１図に 示す。ヒ）　ｃＤＮＡクローンλＰＬＡｚｃＤＮＡ−４から類推したＡ型の完全 なアミノ酸配列を第６図に示す。Ａ型は。

検査されたすべてのタイプの関節炎由来の滑液中に存在する。

Ｂ型は、あるリウマチサンプルでは全く存在せず、別のサンプルでは総括性の約 ３３％を占めるというように、量的に変動がある。Ｂ型は９代表的には、リウマ チ患者からのサンプルよりも変形性関節症患者からの滑液サンプル中により高レ ベルで発現するが、やはりＡ型が５ＰＬＡ、の大部分を占めている。

Ｂ型はまた。　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓあるいは０．１％デオキシコール酸ナトリウ ムのいずれかの存在下でＡ型に比べ加水分解作用をかなり刺激する；Ａ型は０． ５Ｍ　Ｔｒｉｓによって抑制される。

Ｃ型は、存在する場合でも、Ｂ型よりも２倍から５倍量が少ない。これらの細胞 外酵素は、（ｉ）可溶性で、　（ｉｉ）カルシウム依存性、　（ｉｉｉ）皮内あ るいは関節内注射される場合１組織において前炎症（ｐｒｏｉｎｆ　１ａｓｖ＋ ａｔｏｒｙ）活性を有し、　（ｉｖ）ジパルミトイルホスファチジルコリンの旦 −２−アシルエステル結合に対して絶対的な特異性を示す。この特性は９合成５ ＰＬＡｚ　類似体および組換えｓ　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚ　Ｍ　（１２体をも含む。こ れらの類似体では、アミノ酸配列の何らかの変化、欠失あるいは付加が上記の特 徴的活性に変化を及ぼさない。

第１図において比較した配列は、　５ＰＬＡｚが１４Ｃｙｓ残基の数および位置 に関して他のＰＬＡＺ配列、特にＣ，ａｔｒｏｘ　ＰＬＡ２を例とする　ｒ［型 」酵素に類似することを示している。溝膜ＰＬＡＺも１１位にＣｙｓを持たない 。これは高度に前炎症性のＨ型酵素（例えばクサリヘビ科のヘビの毒物形１１５ および同時継続中の米国特許出願第９４６，５５７号に述べられているＰＬＡ　 ２種）の特徴である。この比較は、　５ＰＬＩｈが、特にカルボキシ末端近くの 可変領域において、他のすべての既知ＰＬＡＮ配列と異なることを示している。

細胞膜を超えた転座に典型的なシグナルを含む２０残基のペプチド前駆体が、成 熟酵素配列の上流に存在しており、おそらく合成中あるいは合成後に開裂すると 考えられる。

５ＰＬＡ２　Ａ型をコードするゲノムＤＮＡのクローン、λ５ＰＬＡ２−６は、 　１９８７年８月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ＴＣＣ）（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

２０８５２）に寄託され、受託番号４０３６１を与えられた。コード配列（第４ 図）はλ５ＰＬＡ２−６から単離され得る４０４ｂｐ　Ａｌｕ　Ｉ断片上にある 。５ＰＬＡ、　Ｂ型あるいはＣ型の少なくとも１つのエクソンからのヒトゲノム 配列を表わし、λ５ＰＬＡ２−１０と呼ばれるもう１つのクローンも、　１９８ ７年８月１４日に受託番号４０３６０としてＡＴＣＣに受託された。このクロー ンにおけるコード配列は。

約４６０ｂｐのＡｌｕ　Ｔ断片上に含まれている。８５４ｂρのＥｃｏＲＩ断片 上にあるすべてのヒト５ＰＬＡ２Ａ型をコードし、λ５ＰＬＡ２　ｃＤＮＡ−４ と称されるｃＤＮＡクローンは、　１９８８年５月２７日に受託番号４０４５６ としてＡＴＣＣに寄託された。５ＰＬＡｚコ一ド配列を含む発現ベクター、　ｐ ８６−１＾（以下に述べる）も、　１９８８年６月２７日に受託番号６７７３５ としてＡＴＣＣに寄託された。これらの寄託物はブタペスト条約により保存され る。λ５ＰＬＡ２−６　、λ５ＰＬＡ２−１０およびλ５ＰＬＡ２ＣＤＮＡ−４ の５ＰＬＡｚコ一ド配列、ならびにｐＨＮＦ３６の発現カセット配列は１本文中 に参考として包含されている。

本文中に開示した配列と委託したクローンの配列との間に何らかの相違がある場 合には、クローンの配列に従う（ｃｏｎ　ｔｒｏ　ｌ　ｌ　ｉ　ｎｇ）。

適当な組織７体液源由来の５ＰＬＡＺを精製することも可能であるが（以下参照 ）３組換え法によって５ＰＬＡ２を産生することが好ましい。５ＰＬＡｚをコー ドするＤＮＡ配列いくつかのアプローチのうちの１つによって単離され得る。こ れらの方法は。

部分的に、適当なオリゴヌクレオチドプローブを使用する核酸ハイブリダイゼー ションによる。そのようなプローブは。

本文中に開示されている５ＰＬＡｚ　ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列に基づいて 合成的に構築され得るか、あるいは、やはり本文中に述べられているゲノム５Ｐ ＬＡｚクローンから単離することができる。

オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーの作製および核酸ハイブ リダイゼーションによるそれらのスクリーニングについての基本的ストラテジー は、当業者にとって公知である。例えば、　ＤＮＡクローニング：１巻（Ｄ、Ｐ 、ＧｌｏｖｅｒＷ、　１９８５）　；核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ、Ｄ、　 ＨａｍｅｓとＳ、Ｊ。

Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｗｉｔ、　１９８５）　；オリゴヌクレオチド合成（Ｍ、Ｊ、 　Ｇａｔｅｍ。

１９８４）　；　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら１分子クローニング：実験室マニュア ル（１９８２）　；　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ　、分子クローニングの実践的手引き （１９８４）を参照のこと。まず、　ＤＮＡライブラリーを作製する。

ライブラリーは、ヒトなどの選択された哺乳類由来のゲノムＤＮＡライブラリー から構成され得る。ヒトゲノムライブラリーは、当該技術分野で周知である。例 えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９７８）Ｃｅｌｌ　１５：６８７〜７０１　； Ｌａｗｎら（１９７８）Ｃｅｌｌ　１５　：　１１５７〜１１７４を参照のこと 。ＤＮＡライブラリーは逆転写によりポリ−＾ＲＮＡ　（ａ＋ＲＮ＾）から調製 されたｃＤＮＡからも構築され得る。例えば、米国特許第４，４４６，３２５号 ；第４．４４０．８５９号；第４．４３３．１４０号；第４．４３１　、７４０ ０号；第４，３７０，４１７号；第４．３６３，８７７号を参照のこと。上記ｍ ＲＮＡは、溝膜組織あるいは滑液から単離した炎症性細胞などの、　５ＰＬＡｚ を発現すると考えられる細胞系統あるいは組織から単離される。ｃＤＮＡライブ ラリー構築のための好ましいｍＲＮＡ源は、滑脱性の関節組織である。ゲノムＤ ＮＡあるいはｃＤＮＡを、ライブラリーの構築に好適なベクターにクローニング する。好ましいベクターは、いずれかのλファージなどのバクテリオファージベ クターである。適当なライブラリ出を参照のこと。

ライブラリーが構築されれば、オリゴヌクレオチドを用いてライブラリーをプロ ーブし５ＰＬＡ２コ一ド配列を有するセグメントを同定することができる。一般 に、プローブは公知の核酸配列に基づくことが好ましい。しかし、核酸配列が未 知である場合には、精製された５ＰＬＡｚから決定されたアミノ酸配列に基づく ことが望ましい。この場合には、アミノ酸配列をコードするコドンに対応するよ うにヌクレオチド配列を選択する。遺伝コードが冗長であるので２通常は、タン パクの特定領域をコードする可能性のあるヌクレオチド配列の全部あるいはその うちの妥当な数をカバーする。いくつかのオリゴヌクレオチドを合成することが 必要となる。したがって。

プローブの基礎とする領域を選択する際に、コドンが高度に変性しているアミノ 酸を、その領域が含まないことが一般的に好ましい。しかしながら、ライブラリ ーを作製した哺乳類においてめったに使用されないコドンを含むプローブは作製 する必要がないと考えられる。

一定条件において、かなり長いプローブおよび／または対応する核酸配列が極め て高度な冗長性を有するアミノ酸配列の領域を含むプローブを作製することが望 ましいことは、当業者に理解されるであろう。完全な遺伝子、あるいは遺伝子の 実質的な部分をカバーするプローブもまた。予想される相同性の度合いに依存す るが、適切である。ＰＬＪｈの性質が種系統を超えて高度に保存されるため、ヒ トのクローンλ５ＰＬＡ２ｃＤＮＡ−４などの１つの種由来の完全な長さの５Ｐ ＬＡ２　ｃＤＮＡプローブは、他の１つの種から作製したライブラリーをスクリ ーニングするために容易に使用できる。その他の場合には、２組のプローブの各 々を遺伝子の異なる領域に同時に使用することが望ましいと考えられる。使用す るプローブの正確な長さは決定的ではないが、一般に、約１４から約２０塩基対 のプローブが通常有効であることは、当該技術分野において認識されている。約 ２５から約６０塩基対という、より長いプローブも使用され得る。

当該技術分野において周知のように、標準的手法を用いて。

オリゴヌクレオチドプローブを放射性ヌクレオチドあるいはビオチンなどのマー カーで標識する。次に標識した一組のプローブをスクリーニングステップにおい て使用する。このステップは、標準的手法に従って、一本鎖のプローブをライブ ラリー由来の単離した５ｓＤＮＡにハイブリダイズすることからなる。厳密なハ イブリダイゼーション条件あるいは寛容なハイブリダイゼーション条件のどちら かが、プローブの長さ。

プローブとライブラリーが同じ種由来のものであるかどうか。

そして種同士が進化的に近いか遠いかといったいくつかの要素に依存して用いら れ得る。これらの要素はこれらに限定されるものではない。相同な配列を単離し 、バックグラウンドのハイブリダイゼーションから検出しうるように、ハイブリ ダイゼーションの条件を最適化することは当業者の範囲内である。基本的に必要 なのは、ハイブリダイゼーション条件が十分に厳密で選択的なハイブリダイゼー ションが生じ得ることである；すなわち１選択的なハイブリダイゼーションとは 。

より低い度合の相同性による非特異的結合あるいはハイブリダイゼーションとは 異なり、最小限の核酸相同性（たとえば。

少なくとも約７５％）によるハイブリダイゼーションである。

一般的には、「核酸ハイブリダイゼーション」前出を参照のこと。陽性ハイブリ ダイゼーションによってスクリーンされたライブラリー由来のクローンが同定さ れれば、制限酵素分析とＤＮＡの配列決定によってクローンをさらに特性付けて ７特定のクローンが５ＰＬＡｚのコード配列を含有することを確認することがで きる。

λ５ＰＬＡｚ４０における５ＰＬＡ２のエクソンのクローンなどの部分ゲノミン ククローンは、いくつかの手法の１つによって完全なりローンに拡張することが できる。「染色体ウオーキング（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗａｌｋｉｎｇ）Ｊ法 を用いてクローンを５゛または３゛方向に拡張し、遺伝子コード領域全体を包含 することを確認することができる。次いで、これらのクローンの制限断片が。

例えば、　５ＰＬＡｚ　ｃＤＮＡで、プローブされ得る。これらのエクソン内に 膵Ｗ４Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚに対する十分な相同性が存在すれば、　５ＰＬＡ２のその 他のエクソンもやはり膵臓５ＰＬＡ２クローンによって同定されうる。非５ＰＬ Ａｚ　ｃＤＮＡプローブを使用する場合には、とくに保存される領域（例えばア ミノ酸残基４４〜５２）に対応するオリゴヌクレオチドでプローブすることが特 に好ましく、それによっておこり得る相違（例えばＡｓｐ、ｇがＬＶＳ　ａ　ｑ へ変化する）が予測できる。

ゲラミッククローン中の他のコード領域は、新しいＭ１３−ジデオキシ配列決定 法を用いて、クローニングしたエクソンの下流のＤＮＡの直接塩基配列決定によ り容易に同定され得る。

次にその配列は、３つの読み取り枠すべてについて検索され。

オープンリーディングフレームが明らかになる。その他のエクソンはイントロン スプライシングシグナルによって両側が限定され、保存されたアミノ酸をコード するはずであるから。

その他のエクソンも明らかになるであろう。

さらに詳しくは、　５ＰＬＡｚ　Ｂ型あるいはＣ型のエクソンの正しい遺伝子コ ード配列がわかれば、以下の手段の１つまたはそれ以上によって酵素のタンパク コード領域全体を得るために使用することができる。まず、エクソン自体だけを 含むＤＮＡを大量に得、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できるよう に、λクローンからエクソンを取り出し、　ｐＢＲ３２２のようなより好ましい ベクターに組み込む。その代わりに。

コード領域の単一領域（例えば、アミノ酸残基６−２５）に対応する６Ｏ−ａｖ ｅｒオリゴヌクレオチドを合成することもできる。

どちらも、腹膜細胞、膿、内皮組織、末梢血白血球、リンパ球、およびマクロフ ァージなどの様々な起源から得たｍＲＮＡのノーザンプロットのためのハイブリ ダイゼーションプローブとして使用できる。さらに１分化Ｕ−９３７および肛６ ０などの各種細胞系統由来のｍＲＮＡも試験することができる。次に、検出しう るレベルの、ハイブリダイズするｍＲＮＡを含む何らかの組織あるいは細胞源を 使用してｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのあと同じプローブ゛でスクリーニ ングして、　５ＰＬＡｚをコードする完全な長さのｃＤＮＡを検出する。実際に 、以下に述べるように、このストラテジーは、クローンλ５ＰＬＡ２　ｃＤＮＡ −４のような５ＰＬＡＺ　Ａ型をコードする完全な長さのｃＤＮＡをクローン化 する。

その代わりとして、　ｌｌＲＮＡのための良好な組織源がない場合には、Ｂ型あ るいはＣ型タンパクから内部配列を得ることが必要になるであろう。これは２例 えば、常法によって（以下に述べる）精製したビークＡ物質を５ｔａｐｈ−ＶＢ でタンパク分解し１次に還元的アルキル化を行い、消化産物をＨＰＬＣによって 分離することにより実施されうる。分離された酵素断片に対応する溶出ピークは 前記のようにして配列決定される。あるいは、　ｃＤＮＡクローンからの推定ア ミノ酸配列を使用してもよい。得られた配列から、オリゴヌクレオチドが設計さ れ得。

その他のエクソンを位置づけるためのハイブリダイゼーシヨンプローブとして使 用するために製造される。最後に、正しい成熟タンパクがコードされるように単 離したエクソンを互いに結合させる。

５ＰＬＡｚ遺伝子の最長の挿入部を含有する哺乳類ゲノミンククローン（部分あ るいは全体）は、ネオマイシンやメタロチオネイン耐性遺伝子などのマーカーを 含むプラスミドＤＮＡとともに、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に コトランスフエクトされ得る。−抗生物質Ｇ４１８およびＣｄ”の存在下で選択 された生存細胞ならびに生存クローンは、抽出したＲＮＡのノーザンプロットに おいて５ＰＬＡｚハイブリダイジング転写物の存在に関して分析される。次いで 、所望の転写物を含有するクローンは、　ｃＤＮＡライブラリー構築のためのｍ ＲＮＡ起源として使用され得る。

溝膜ＰＬＡ　Ｚは、慢性関節リウマチあるいは乾廖に罹患した患者からのヒト滑 液より精製され得る。その精製のプロトコールは、以下に詳細に述べるが、十分 な量の天然５ＰＬＩｈの精製を、正確なアミノ酸配列決定を行うのに十分な純度 で実施することを初めて可能にしたものである。精製した５ＰＬＡ２から導かれ るアミノ酸配列は、天然５ＰＬＡｚの核酸配列の単離において有用なプローブの 設計、あるいは５ＰＬＡｚのアミノ酸配列をコードする合成核酸配列の設計を可 能にする。

（以下余白） 第１図のＮＨ２末端に示されるようなアミノ酸残基の配列を有する合成５ＰＬＡ ｚペプチドに対して、特異的抗血清あるいはモノクローナル抗体（後述）が調製 され得る。特に好ましいのは、１位から２６位にまで伸びるペプチドである。こ れは該タンパクに独特な領域であり、それに対する抗体は１選択された組織、細 胞抽出物、あるいは体液中に存在する５ＰＬＡ、のいずれをも免疫沈降させるた めに使用され得る。次いで、この供給源からの精製３ＰＬＡ２は、配列決定し、 以下に述べるように特異的プローブを設計するための基礎として使用することが できる。既知のＰＬＡｚｌｌからのその他の領域に対する抗体もまた使用され得 る。精製された天然あるいは組換え５ＰＬＡｚ　もまた、抗原として有用である 。

上述したように、　５ＰＬＡｚをコードするＤＮＡ配列はクローニングを行うよ りもむしろ合成により調製され得る。このＤＮＡ配列は、　５ＰＬＡｚアミノ酸 配列についての適切なコドンによって設計され得る。一般に、その配列が発現の ために使用されるのであれば、所望する宿主においては、好適なコドンを選択す る。完全な配列は、標準的方法によって調製され、完全なコード配列中に組み込 まれた重複オリゴヌクレオチドから１２９９；ジェイら（Ｊａｙ　ｅｔ　ａｌ、 ）　（１９８４）　Ｊ　ＢｉｏｌＣｈｅｍ　２５９：６３１１を参照されたい。

合成りＮＡ配列は、　５ＰＬＡｚの類似体あるいは「変異タンパク」を発現する 遺伝子の節倹な構築を可能にする。あるいは、変異タンパクをコードするＤＮＡ は、天然５ＰＬＡＺ遺伝子あるいはｃＤＮＡの部位特異的変異によって調製され 、そして、変異タンパクは従来のポリペプチド合成法を用いて直接調製すること ができる。変異タンパクの構築において特に興味深いのはＡ型における触媒的な （ｃａｔａｌｙｔｉｃ）　Ｈｉｓ４ｓ残基をＧｉｎのような他のアミノ酸に置換 することである。４８位の変異タンパクは。

内因性の炎症性ＰＬＡ　！酵素に結合し、それによって不活性ダイマーを形成す ることにより、　ＰＬＡ、抑制因子として働き得る。

変異のためのその他の潜在的標的にはＮ末端近く（７，１０および１６位）の３ つの塩基生残基が含まれ、それらは膜関連性基質との相互作用に関わると考えら れる。酸性残基（例えばＧｌｕあるいはＡｓｐ　）の置換によって、これらの部 位のいずれか１つまたは全部が変化した変異タンパクは、膜結合性あるいは複合 基質に対する活性が低下し得る。

部位特異的変異は、限られたミスマツチを除いて、変異を起こさせる一本鎖ファ ージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、所望 の変異が達成される。

簡単に述べると１合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してファージ に相補的なストランドの合成を指示し。

生じる２本鎖ＤＮＡをファージを保持する宿主細菌に形質転換する。形質転換細 菌の培養物を寒天培地にプレートし、ファージを有する単一の細胞からプラーク が形成される。

理論的には、新しいプラークの５０％が、変異形態を一本鎖として有するファー ジを含む。５０％は元の配列を有している。

生じたプラークは、正確な対合のハイブリダイゼーションを可能にするが１元の ストランドとのミスマツチのハイブリダイゼーションは妨げられるような温度に おいて、リン酸化された合成プライマーを用いてハイブリダイズさせる。そのあ とプローブとハイブリダイズしたプラークを取り出し、培養し、そしてＤＮＡを 回収する。

５ＰＬＡ　２についてのコード配列が調製され、あるいは単離されると、それは 適当なベクターまたはレプリコンにクローン化され、それによって５ＰＬＡ２コ 一ド配列を持たないベクターを実質的に含まない（例えば、他のライブラリーの クローンを含まない）組成物中に保持され得る。数多くのクローニングベクター が当業者には既知であり、適当なりローニングベクターを選ぶことは選択の問題 である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換し 得る宿主細胞の例は次のものを含む：種々のバクテリオファージスベクター（大 腸菌、　Ｅ、ｃｏｌｉ）　、　ｐＢＲ３２２（大腸菌）　、　ｐＡｃＹｃｔ７７ （大腸菌）　、　ｐＫＴ２３０　（グラム陰性細菌）　、　Ｉ）ＧＶ１１０６　 （グラム陰性細菌）　、　Ｉ）ＬＡＦＲＩ　（グラム陰性細菌）　、　ｐＭＥ２ ９０　（非大腸菌グラム陰性細菌）　、　ｐＨＶ１４　（大腸菌および枯草菌Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）。

ｐＢＤ９　（バチルス属菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、　ｐＩＪ６１　（ストレプトミ セス属５ｔｒｅｐｔｏｓｙｃｅｓ）　、　ｐＵｃ６　（ストレプトミセス属）、 アクチノファージ、φＣ３１（ストレプトミセス属）　、　ＹＩｐ５　（す・ン カロミセス属５ａｃｃｈａｒｏ＊ｙｃｅｓ）、　ＹＣｐ１９　（サツカロミセス 属）、およびウシ乳頭ウィルス（哺乳類細胞）。一般には、　ＤＮＡクローニン グ：１巻および■巻、前出；Ｔ、マニアティスら、前出；Ｂ、パーパル、前出、 を参照されたい。

本発明によれば、　５ＰＬＡｚをコードするＤＮＡ配列を、この発現構築物を含 むベクターによって形質転換された宿主細胞中のＲＮＡに転写するために、＠乳 類ｓ　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚのコード配列は、プロモーター、リポソーム結合部位（細 菌発現のための）および、必要に応じて、オプレータ−（本文中ではまとめて「 調節」要素という）の制御下に置かれる。コード配列はシグナルペプチドあるい はリーダー配列を含む場合と含まない場合とがある。コード配列がシグナルペプ チドを含む場合には。

それは５ＰＬＡｚシグナル配列であり得、あるいはそうではない。

例えば細菌においては、成熟５ＰＬＡ２は、　５ＰＬＡｚシグナルペプチドを含 まないコード配列の発現によるか、あるいは翻訳後のプロセッシングにおいて細 菌宿主により除去されるリーダー配列を含むコード配列の発現によって調製され ることが好ましい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号、　４，４２５， ４３７号；４．３３８，３９７号を参照されたい。

発現ベクターは、　５ＰＬＡ２コ一ド配列が適切な調節配列によってベクター内 に位置づけられるように本発明により構築される。制御配列に関してのコード配 列の位置づけおよび方向性は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写される （すなわち、制御配列の米でＤＮＡ分子に結合するＲＮ＾ポリメラーゼがコード 配列を転写する）ような位置づけおよび方向性である。制御配列は、上述したク ローニングベクターのように。

ベクターへの挿入前にコード配列に連結され得る。あるいは。

コード配列は既に制御配列と適当な制限部位を含む発現ベクターに直接クローン 化され得る。原核生物および酵母における５ＰＬＡ２の発現の場合には、制御配 列は必然的にコード配列と非相同になる。宿主細胞が原核細胞であれば、コード 配列がイントロンを含まないことも必要である（例えばｃＤＮＡ　）。

選択された宿主細胞が哺乳類細胞であれば、制御配列は３ＰＬＡ２コ一ド配列に 相同な場合と非相同な場合があり、コード配列はイントロンを含む゛ゲノムＤＮ ＡあるいはｃＤＮＡのいずれでもよい。酵母においてはゲノムあるいはｃＤＮＡ のいずれかのコード配列が発現され得る。

多くの原核性発現ベクターが当該技術において既知である。

例えば、米国特許第４，４４０．８５９号、　４，４３６，８１５号；　４，４ ３１，７４０号；　４，４３Ｌ７３９号、　４，４２８．９４１号；　４，４２ ５，４３７号、　４，４１８，１４９号；　４．４１１，９９４号、　４，３６ ６．２４６号；　４，３４２，８３２号；さらに英国特許公開ＧＢ２．１２１　 、０５４号、　ＧＢ２．００８．１２３号、　ＧＢ２，００７，６７５号；およ び欧州特許公開第１０３，３９５号を参照されたい。好ましい原核発現系は大腸 菌である。その他の好ましい発現ベクターは、真核発現系において使用するため のものである。例えば、　１９８５年１２月１６日出願の、同一出願人による米 国特許出願第８０９．１６３号を参照されたい。その開示内容をここに参考とし て引用する。好ましい真核性発現系はワタシニアウイルスを用いたもので、これ は当該技術分野では周知である。例えば、マケットら（Ｍａｃｋｅｔｔ　ｅｔ　 ａｌ、）（１９８４）　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　４９：８５７；ｒ　ＤＮＡクローニン グ」■巻、１９１〜２１１頁、前出、　ＰＣＴ特許公開第一０８６１０７５９３ 号を参照されたい。酵母発現ベクターは当該技術において公知である。例えば、 米国特許第４，４４６，２３５号；　４，４４３，５３９号；　４，４３０．４ ２８号を、さらに欧州特許公開第１０３．４０９号、　１００，５６１号：　９ ６，４９１号を参照されたい。もう１つの好ましい発現系は、ベクターｐＨ５１ であり、これはチャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換する。このベクター の使用は、　１９８５年１２月４日出願の、ここにその開示内容が参考として含 まれている。　ＰＣＴ特許公開第一０８７１０２０６２号および同一出願人によ る米国特許出願第８０４　、６９２号に開示されている。

発現系および選択する宿主に依存して、　５ＰＬＡ！タンパクが発現される条件 下で、上述した発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖させること により、　５ＰＬｌｈが生産される。次に、宿主細胞から酵素タンパクを分離し て精製する。

発現系が増殖培地中に酵素を分泌する場合には、細胞を含有しない培地から直接 タンパクを精製することができる。ｓＰＬ／ｈタンパクが分泌されない場合には 、細胞溶解産物から分離する。適切な増殖条件および回収方法の選択は当該技術 の範囲内である。

天然１組換えあるいは合成５ＰＬＩｈペプチド（完全長またはサブユニット）は 、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生産するために使用することがで きる。ポリクローナル抗体が所望である場合には、精製した５ＰＬｌｈペプチド を使用して選択した哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫 し、後日免疫した動物から血清を採取し、既知の工程に従って処理する。５ＰＬ Ａ２に加えて１種々の抗原に対するポリクローナル抗体を含む組成物が、免疫ア フィニティークロマトグラフィーにより、抗５ＰＬＡｚではない抗体を実質的に 含まずに調製され得る。

モノクローナル抗５ＰＬＡ２抗体もまた。開示内容から当業者により容易に生産 され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生ずる一般的方法は 周知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は、融合以外の手法１例えば、腫瘍Ｄ ＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、あるいはエプスタイン−バーウィルスに よるトランスフェクション、によっても創製され得る。例えば１Ｍ、シュライア −ら（Ｍ、５ｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）「ハイプリドーマ技術Ｊ　（１９ ８０）；ノ１マーリングら（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔ　ａｌ−）＋　’モノク ローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ」（１９８１）　；ヶネットら（Ｋｅ ｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、）、　’モノクローナル抗体Ｊ　（１９８９）を参照 されたい。さらに、米国特許第４，３４１．７６１号；　４，３９９，１２１号 、　４，４２７．７８３号、　４，４４４，８８７号；　４．４５１．５７０号 ；　４，４６６．９１７号、　４，４７２，５００号、　４，４９１，６３２号 ；　４，４９３．８９０号もまた参照されたい。

５ＰＬＡｚペプチドに対して産生じたモノクローナル抗体のノぐネルは９種々の 特性（すなわち、アイソタイプ、エピトープ。

親和性など）に関してスクリーニングすることができる。特に興味深いのは５Ｐ ＬＡ、の活性を中和するモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナル は、　ＰＬＡ２活性の測定において容易に同定され得る。親和性の高い抗体は、 天然あるし１は組換え５ＰＬＩｈの免疫アフィニティー精製においても有用であ る。

ヒト肺組織において発現される膵臓ＰＬ／ｈの発見は、膵臓ＰＬＡＺが炎症性疾 患においてこれまで考えられていた以上の役割を果たし得ることを示している。

従って、ここで述べる他のむ鳥かなる形態のＰＬＡｚに対する抗体も（ポリクロ ーナルおよびモノクローナル）、炎症性疾患の治療のために使用され得る。

抗膵臓ＰＬＩｈ抗体が、抗５ＰＬＡ、抗体に関してここで述べたように、産生さ れ得る。疾患が１例えば急性エンドトキシンショックであれば、適切な治療方法 は、従来の静脈内経路により。

有効用量の抗ＰＬＡｚ抗体（例えば抗滑脱ＰＬＡｚ）で患者を処置することであ る。局所的な急性炎症の治療では、抗５ＰＬＡ、抗体による処置を、おそらく筋 肉内注射によって行うことが適切である。慢性関節リウマチ患者の関節のような 局所的慢性炎症は、抗５ＰＬＡ２抗体の非経口的投与によって治療することが特 に好ましい。これらの組成物は、変形性関節症のような他の形態の関節炎を治療 する上でも有用であり得る。エンドトキシンショックはＰＬＡ、レベルの上昇を ひき起こすので、抗ＰＬＡ　ｚ抗体を、グラム陰性病原菌およびそれらの毒素に 対する他の治療法（例えば抗ＬＰＳ療法）と組み合わせて投与することが望まし いと考えられる。ＰＬ／ｈは肺、の界面活性物質の単層を攻撃することも知られ ているので、呼吸器系統の疾病（例えしｆ。

成人呼吸困難症候群）では２代替肺界面活性リン脂質であるジパルミトイルホス ファチジルコリンと組み合わせて、吸入により抗ＰＬＡ　ｚ抗体を投与すること が望ましいと考えられる。

５ＰＬＡｚ変異タンパクのようなＰＬＡｚ拮抗剤もまた。抗体の代わりに使用さ れ得る。

適切な治療方法（すなわち、用量、投与頻度、全身投与を行うか、あるいは局所 を行うか、など）の決定は当該技術の範囲内である。投与にあたっては、薬学的 に許容される非経口賦形剤を配合して、単位用量の注射形態（溶液、懸濁液。

乳剤など）に抗体を処方する。そのような賦形剤は通常、非毒性であり治療効果 を持たない。かがる賦形剤の例には、水。

生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。処理された油 やオレイン酸エチルのような非水性賦形剤もまた使用され得る。好ましい賦形剤 は、生理食塩水中の５％（重量／重量）ヒトアルブミンである。この賦形剤は。

等張性および化学的安定性を高める物質（例えば、緩衝剤および保存剤）のよう な、少量の添加物を含有してもよい。抗体は１代表的には、そのような賦形剤中 に約Ｉｕｇ／ａｄｌがら１゜μｇ／ｄの濃度で処方される。

抗５ＰＬＡｚ抗体は診断の用途においても有用である。例えば。

慢性関節リウマチ患者から分離した滑液は、全部ではないとしても、主としてＡ 視程のＰＬＡ　２を含むことを示す。これに対して、変形性関節症の患者からの サンプルは９代表的には、評価しうる量のＢ型ならびにＡ型を、　５０＠Ｍ　Ｔ ｒｉＳの存在下での活性を基準とすると９通常Ａ型対Ｂ型を２：１の割合で含む 。

そのため１本発明は、ヒト（あるいは他の哺乳類）由来の滑液サンプルを提供し 、そして５ＰＬＡｚのＡ型およびＢ型の量を検定において定量的に測定して比較 する方法、特に診断方法を意図する。例えば、定量的免疫学的検定において角型 あるいはＢ型に特異的な抗５ＰＬＡｚ抗体を使用すれば、２つのタイプの関節炎 を識別することができる。Ａ型あるいはＢ型に特異的な抗体は、従来の免疫学的 検定の様式（例えば、同種あるいは異種の、放射免疫検定法あるいはＥＬＩＳＡ ）に組み入れることができる。各種の様式は等業者に既知である。例えば。

「免疫学的検定：実践的手引きＪ　（Ｄ、Ｗ、チャン（Ｃｈａｎｇ）およびＭ、 Ｔ、パールスタイン（Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎ）編、　１９８７）を参照されたい。

この文献の開示内容は参考としてここに引用される。免疫学的検定以外の定量分 析法も、Ａ型およびＢ型５ＰＬＡｚの相対的レベルを測定するために使用され得 る。

一般に９Ｍｉ換え法による５ＰＬＡｚの生産により、夾雑タンパクを実質的に含 まない酵素組成物が提供され得る。高レベルの純度を得るための能力は＋　Ｉｎ 　ＶＩＶＯの供給源に比べて実質的な量の５ＰＬＡ、を生産することができる組 換え発現系の結果である。従って１組換え培養に従来の手法を適用することによ り、現在非分解性および非毒物性供給源から入手しうる細胞系ＰＬＡ　、組成物 よりも実質的に純度の高い５ＰＬｌｈ組成物が生産され得る。

本発明の精製５ＰＬＡ２組成物はいくつかの面において有用である。まず最初に 、デューティルおよびグレガー（Ｄｕｔｉｌｈ　＆Ｇｒｅｇｅｒ）（１９８１） 　Ｊ　Ｓｃｉ　Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ　３２：　４５１〜４５８が述べているよ うに１食品加工技術において使用され得る。さらに。

５ＰＬＡ２組成物は魚の酸敗の開始を遅らせ企ために使用され得る。例えば、マ ゾードおよびビリンスキー（Ｍａｚｅａｕｄ　＆　Ｂ１１１ｎｓｋｉ）（１９７ ６）　Ｊ　Ｆｉｓｈ　Ｒｅｓ　Ｂｏａｒｄ　Ｃａｎ　３３３　：　１２９７〜１ ３０２を参照されたい。

精製５ＰＬＡ２は、しかし、炎症抑制剤の設計およびスクリーニングにおける手 段として特に有用である。まず９本発明によりミリグラム量の物質が得られ得る 。ミリグラム量は、結晶化することができ、Ｘ線回折およびコンピューター解析 を用いた三次元の研究を可能にする。これは９分子の形に関する波線を可能にし 、それによって５ＰＬＡ２が通常示す酵素活性の抑制因子として使用しうる物質 の適当な形が決定され得る。

アンギオテンシンＩからアンギオテンシン■への転換のための触媒である「転換 酵素」に関しては、既に阻害因子が設計されている。一般に、これらの拮抗物質 は「ジペプチド」であって２それらの転換酵素との相互作用は、転換酵素と特異 的に相互作用する「ジペプチド」の能力を高めるような、ペプチド結合に関与す る「残基」の修飾によって安定化される。

従ってペプチド結合は、特定の選ばれたカルボン酸およびアミン類（必ずしもア ミノ酸とは限らない）に結合する。これらの「ジペプチド」は、所望するターゲ ットである転換酵素の外形と相補するような三次元構造の立体配置を有する。同 様の鍵と鍵穴の空間配置は９本発明の結晶化５ＰＬＡ２の表面外形に相補的に設 計された分子から生じ得る。「表面」が、内側に面七得る湾曲面を含むこと、特 に活性部位を含むことは明らかである。さらに、「相補的」という語句は、「適 合する」空間的立体配座に加えて、タンパクとその表面外形に対合する分子との 間の相互作用が誘引的かつ正であることを意味することが理解され得る。これら の相互作用は、水素結合。

イオン、あるいは疎水的親和性であり得る。

従って１本発明は１組換え５ＰＬＡ２の表面の三次元外形に相補的な三次元外形 により特徴づけられる。　５ＰＬＡ２に対してのペプチド拮抗物質（２〜１５ア ミノ酸）を意図する。この明細書においては、ペプチドという語により、拮抗物 質が、残基数よりも少ない数に対応するカルボン酸アミド結合を含むことを意味 する。カルボン酸およびアミンに関連する物質はα−アミノ酸である必要はない 。

第２に、三次元構造決定の助けを得なくても９本発明の精製５ＰＬＡ２は、評価 を行うための特別なアプローチとしてｉｎ　ｖｉｔｒ。

で５ＰＬＡ２抑制因子をスクリーニングする際の試薬として重要である。現在入 手しうる不純な５ＰＬＡ２調製物は、試験結果への夾雑物の影響のため、まぎら れしいデータを生じる。例えば、それ自体が５ＰＬＡ２にとっての抑制物質、活 性化物質、あるいは基質となる夾雑物は、評価を妨害する。従って、　５ＰＬＡ ２抑制物質についての現在のスクリーニング方法の実質的な改良は、精製された ヒ）　５ＰＬＡ２タンパクを利用し得るか否かに左右される。

ここに記載されている５ＰＬＡ２組成物は制癌剤としても有用であり得る。例え ば、悪性腫瘍内部あるいはその周囲へ５ＰＬＡ２を直接注入し、および必要に応 じて腫瘍切除術と組み合わせて注入を行うことにより、高レベルの、マクロファ ージの強力な化学的誘引物質および活性化物質となる。次にこれらの活性化され たマクロファージは９局所的な腫瘍の抑制あるいは除去を促進し得る。

本発明による５ＰＬＡ２は、さらにワクチン組成物にあけるアジュバントとして 適用される。ワクチンの処方は、当該技術において公知である。通常、ワクチン 処方物は、薬学的に許容される非経口賦形剤中に抗原（類）（例えば１弱毒化ウ ィルス、死滅ウィルス、ウィルスポリペプチドのサブユニット。

死滅菌、細菌性線毛など）を含む。本発明の改良されたワクチン組成物は、　５ ＰＬＡ２アジユバントに加えて、付加的なアジュバントを含み得る。最終的なワ クチン処方物中の５ＰＬＡｚの濃度は、当業者により容易に決定され得る。代表 的には、必ずしも常にではないが、　５ＰＬＡ２の濃度は約１ｎｇ／ｍｅから約 １μｇ　／　ｍｊ２である。

以下に述べるのは９本発明の実施例であるこの実施例は。

本発明を説明するためにのみに示される。特許請求の範囲内での数多くの態様が 本発明の開示内容に照らして当業者にとり明白であるので、これらの実施例はい かなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当 業者は９本願に引用され、その開示内容が参考として本文中に引用されている参 考文献に精通している（あるいは容易に理解しうる）と推定される。

（以下余白） 実施例 ゲル濾過および電気泳動のためのセファデックス■Ｇ−７５゜ＣＭ−セファデッ クス＠　Ｃ−５０およびタンパク標準品をＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓから購入した。アクリルアミド、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　 −テトラメチルエチレンジアミン、ブロモフェノールブルー。

ダマシーブリリアントブルーＲ１硫酸ドデシルナトリウム　（ＳＤＳ）　、脂肪 酸を含有しないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、　ジパルミトイルホスファチ ジルコリン、およびローリ−タンパク検定キットをＳｉｇｍａから入手した。銀 染色およびバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク検定キットをＢｉｏ−Ｒ ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。

１−　［”’Ｃ］オレイン酸（５０ｍＣｉ／ｍｍｏ　１）をニューイングランド ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）から購入した。２− 〔１−”Ｃ〕−バルミトイル−１−バルミトイルホスファチジルコリン（５９ｍ Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｉ）および２−　［１−”Ｃ〕−リルオイル（１ｉｎｏ　Ｉｅｏ ｙ　ｌ）ホスファチジルエタノールアミンをアパンティーポーラー・リピッズ（ Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）　（バーミンガム、アラバマ州（Ａ Ｌ））から供給した。分析用の焦点電気泳動のためのアンホリンＰＡＧプレート 、　ｐＨ３，５〜９．５をＬＫＢブロマ（Ｂｒｏｍｍａ）から購入した。プレコ ーティングした薄層クロマトグラフィー（ＴＬ［：）用シリカゲル６０プレート は８０８から入手した。使用したすべての化学物質および試薬は分析用グレード のものであった。

滑液（ＳＦ）を、進行中の古典的なあるいは明確なリウマチ関節炎（ＲＡ）の患 者から関節穿刺によって採取した。この物質を４℃で遠心分離し、細胞と細胞破 砕物とを除去してプールし。

使用時まで一７０℃でポリプロピレン管中に保存した。

精製工程はすべて４℃で実施した。プールした滑液（５ＬＯ献）を５１緩衝液、 　ｐＨ５，０に対して２４時間透析した。生じた沈澱物は０．５Ｍアセテート緩 衝液、　ｐＨ５，００中に再溶解させ、同じ緩衝液であらかじめ平衡させておい たＣＭセファデックス■Ｃ５０の２００ｒｎ１カラムに入れた。このカラムを、 ０．５Ｍアセテート緩衝液、　ｐＨ８，５；　０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０ ．３Ｍ　ＮａＣｌ、　ｐＨ５，０；０、２ＭＴｒ　１ｓ−ＨＣｌ中のＭ　ＮａＣ １，ｐｔ（８，５；および０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ中３Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ ８，５により連続的に溶出した。ＰＬＡ２は後者の緩衝液中に溶出した。ＰＬＡ ２活性を有する両分をプールし。

次いでこれを０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，５に対して透析して。

凍結乾燥した。凍結乾燥した残渣を、　０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液。

ｐＨ８−５中で、続いて２Ｍ　ＮａＣ１で再構成し、そしてこれを同じ緩衝液で あらかじめ平衡させた。　１．６Ｘ６８ａｎのセファデックス■Ｇ７５カラムで クロマトグラフィーされた。

カラムを２０ｄ／時で溶出し、　ＰＬＡ２活性およびタンパク含量の測定のため に２−８−の両分を回収した。活性分画をプールし、　０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　ｐＨ８，５に対して透析して、凍結乾燥した。この残渣を、１％Ｓ口 Ｓと１０％グリセロールとを含有する０、０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ Ｈ９，５に溶解し、３７℃で１時間インキュベートし９１５％ポリアクリルアミ ドゲルに作用させた。

準備用電気泳動を３０ｍＡで４時間実施した。ゲルを０．５ｃ＋ｎ細片に切り出 した。タンパクを破砕して、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＥ：Ｉ緩衝液、　ｐＨ７， ５で溶出した。ＰＬＡ、活性を有する両分をプールし。

凍結乾燥した。精ｌ！および濃縮の工程を表１にまとめて示す。

表１ 滑液　２１．９３０　１８．７１７　０．８５　１　１００透析　６，５２８　 １３．７０２　２．０９　２．５　７３（Ｊ−セファ１フクス ■Ｃ−５０１６３，３８８５１３，３３６０３，９１８セフ７デフクス ＠Ｇ−７５　１．０　２，０４６　２．０４６．００　２．４０７．１　１１準 備用 ５Ｏ３−ＰＡＧＥ　０．１９５　７５ｇ　３，８８７．１８　４，５７３．２　 ４記載されているように、０．１％ＳＯ３の存在下、１５％ポリアクリルアミド ゲル中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行なった。オバルブミ ン、炭酸脱水素酵素、トリプシン阻害物質、ふよびラクトアルブミンを分子量マ ーカーとして使用した。サンプルを、２％ＳＯ３と１０％グリセロールを含有す る０、０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ、　ｐｉｆ　６．８中９分析用ＰＡＧＥ については５％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と共に１ｏｏｔ”で６分 間、準備用５ＯＳ−ＰＡＧＥについては２−吐なしで３７℃において１時間培養 し。

次いでこれらをゲルに作用させた。電気泳動を３０ｍＡで４時間行ない、タンパ クのバンドをクマシーブリリアントブルーまたはパイオーラッド銀染色によって 染色した。スイッツアー（Ｓｗ　ｉ　ｔｚｅｒら（１９７５）　Ａｎａｌ　Ｂｉ ｏｃｈｉＩｍ９８　：　２３１〜２３７゜硫酸ドデシルナトリウムおよび２−メ ルカプトエタノールの存在下でポストＧ−７５画分（１，５＋＋＋ｃｇ）のポリ アクリルアミドゲル電気泳動は９分子量１７におよび１５Ｋに対応する２つのタ ンパクのバンドの存在を示していた。同じＰＬＡ２調製物につぃ０　て同一の電 気泳動像が、ジスルフエート結合を減少させるこ３　となく、得られた。ＰＬＡ 、活性は１５におよび１７にの両バンドと８　関連かあ・た・ ５ＯＳ−ＰＡＧＥからの溶出液以外の、実施例ＬＡ、あるいはＨｌ　に記載され ているすべてのＰＬＡ２調製物のタンパク測定は、バ嘆　イ”−ラ・ド法によ− て実施した・ブタ・ドアオード（Ｂｒ“６「°・ｄ）（１９７６）　Ａｒ＋ａｌ 　Ｂｉｏｃｈｉｍ　７２：　２４８〜２５４　、５ＯＳ−ＰＡＧＥから溶出した タンパクは、トリクロロ酢酸沈降反応させた後、ローグーの方法によって測定さ れた。ピーダーリン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）　（１９７７）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈ ｉｍ　８３：３４６〜３５６゜両方の方法において、ウシ血清アルブミンをタン パク標準品として使用した。

Ｂ、最終精製 初期精製からの物質を逆相Ｃ−４ＨＰＬＣカラム１ご充填し、０．１以下のＣ参 照）そして活性画分をプールして、ケイ素化ファルコン（ｓｉｌｉｃｏｎｉｚｅ ｄ　Ｆａｌｃｏｎ）Ｎｕ２０５９チューブ中で一晩凍結乾燥した。ピークＡ、Ｂ ＃よびＣと称する活性ピークを通常の方法で得、それぞれをさらに精製したく第 ２図）。凍結乾燥したピーク物質をＰＡＧＥ充填緩衝液（２，３％ＳＯ５，５０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

１０％グリセロール）中に再懸濁し、これを９０℃で３分間加熱して、１２．５ ％アクリルアミドミニゲルに充填した。次に。

４０、０００ｄｐｍの１２５１標識したブタのプロ膵１１ＰＬＡ２をオートラジ オグラフ用マーカーとしてサンプル中に含有させた。電気泳動後、ゲルを３０分 間オートラジオグラフにかけ、そしてオートラジオダラムを切断のガイドとして 用いて、ゲルを１．０−切片に切断した。この切片を破砕し、　１０ｍＭ　Ｎ− エチルモルホリノアセテート、ｐＨ７，０中で１〜２日間、この活性を溶出させ た。３７℃で６０分間インキュベートした後、溶出液１．０μｌについて測定を 実施し、活性のプロフィールを得たく第２図）。ピークＡ、ＢおよびＣのいずれ もが、プロ膵臓マーカーの直前の９分子量１５．０００に対応する切片から溶出 した。活性画分を第四アミンガラスファイバーフィルター上に直接スポットして 、乾燥させた。同じ緩衝液中でフィルターを各５分間ずつ４回洗浄し、乾燥した 。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）気 相シークエンサーでエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解により配列分析を実施した。５ ＰＬＡ２Ａ型（ビークＡ）および５ＰＬＡ−（ビークＢ）のＮＨ２末端配列を第 １図に示す。

最終精製工程のための標準測定条件は、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０゜ １５０ｍＭ　ＮａＣ１、５，０ｍＭ　ＣａＣ］＝、　０．０４％　デオキシコー ル酸ナトリウム（ＤＯＣ）、および基質としての２２ｎｍｏ　ｌの２−ステアロ イル−２−（１〜”　Ｃ〕アラキトニル−Ｌ−３−ホスファチジルコリン（ＰＣ 、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＮＣＬＣＦＡ、　６５５　）からなり、３ ７℃で３０分間インキュベートした。２％ＤＯＣに、新たに粉末化したＰＣを溶 解させて基質を調製し９次にこれを測定バッファー中で適当な濃度に溶出した。

あらかじめ加温しておいた基質を添加して５０μｌの反応液で反応を開始させ、 １０μｌの８Ｍ　酢酸を加えて反応を停止させた。反応混合物５０μｌをワット マン（Ｗｈａｔｍａｎ）薄層クロマトグラフィープレートにスポットして乾燥し 、クロロホルム：メタノール：酢酸（９０：１０：１）を溶媒として用いて、こ のプレートをクロマトグラフィーにかけた。乾燥したプレートを一晩Ｘ線フィル ムに曝すか、あるいはその代わりに生成物（アラキトネート）と基質（ＰＣ）に 対応するバンドを削り取り、このバンドをシンチレーション液中で計数した。

うにさらに特徴づけた。

で標識した大腸菌ＫＩ２ＣｆｉＯＯ株を基質として使用し、フランソン（Ｆｒａ ｎｓｏｎ）ら（１９７８）Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　１９　：　１８〜２３の修 正方法〔バダス（Ｖａｄａｓ）ら（１９８０）　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　２６　：　 １７２１〜１７２９］によって定量した。測定は、　４．１２０ｃＰｍ／ｎｍｏ ｌ　Ｕン脂質の比活性を有するリン脂質５．６％ｍｏ　ｌに対応する。１回の測 定あたり２．８×１０８大腸菌を使用して、基質過剰で実施した。総容量１．５ 献の標準反応混合物は、　ｌｏｎｇ　ＢＳＡ、７ｍＭ　ＣａＣＩｚ、０．１ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、および〔１４Ｃ〕オレイン酸で標識した大腸菌を含 有していた。３７℃で３０分間反応を進行させ、０．４５μｍのミリポア・フィ ルターを通して濾過することにより反応を停止させた。酵素活性を非酵素性加水 分解に関して修正した。基質過剰の条件下で、基質加水分解の速度は、３０分ま では、基質濃度が酵素濃度の５倍の範囲内を越えるまで１反応時間と直線的であ る。

放射性標識した合成基質である。ジパルミトイルホスファチジルコリンおよび２ −リルオイルー１−バルミトイルホスファチジルエタノールアミンに対するホス ホリパーゼ活性の測定は、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｉｍ　１１４　：６４〜７０ 　（シャカール（Ｓｈａｋｉｒ）。

（１９８１））に記載されているようにして行われた。標準インキュベーション 混合物は、総容量４００μ！中に７５０ｎｍｏ　ｌのリン脂質、２ｍＭ　ＣａＣ ｌ２．　２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）　。

０−０９％　トリトンＸ−１００、およびＯ，１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液 中の酵素タンパクを含有していた。インキュベーションは、振とう水浴中３７℃ で１時間、至適ｐＨ（以下参照）において実施０、１　、　Ｖ／Ｖ／Ｖ）　２， ０ｒｎ１．を加えて反応を停止させた。遊離した脂肪酸をシャカール（Ｓｈａｋ ｉｒ、（１９８１）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｉｍ　１１４：６４〜７０）の方法に よって抽出した。ＰＬＡ２活性は、遊離した脂肪酸（ｎｍｏｌ）／タンパク（ｍ ｇ＞／時間（ｈ）で表わす。

ルミトイルホスファチジルコリンおよび１−バルミトイル−２−リルオイルホス ファチジルエタノールアミンに対して測定した。使用した緩衝液は一定のイオン 強度を有する緩衝液であった：０．１Ｍ酢酸ナトリウムー酢酸（ｐＨ５〜６）、 ０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ［：１　（ｐＨ７ｍｇ　）　、および０．１Ｍグリシン− ＮａＯＨ（ｐｔ１９〜１０）。

精製したＰＬＡ２のｐＨ依存性を、２つの合成リン脂質基質であるジパルミトイ ルホスファチジルコリンおよび２−リルオイルー１−バルミトイルホスファチジ ルエタノールアミンを用いてｐＨ５〜１０の範囲内において検討した。ホスファ チジルエタノールアミンは広範囲のρ）Ｉ（６〜１０）内で加水分解され、至適 ＰＬＡ２活性はｐＨ７，５〜８．０において認められた。ホスファチジルコリン に対するＰＬＡ２活性はｐＨ７，０で最大を示し、ｐｆ１８〜１０で活性が急に 低下した。

ＰＬＡ２の比活性は分析した３つのリン脂質のいずれもに匹敵するものであった 。大腸菌の膜リン脂質は最も活発に加水分解され、一方ホスファチジルエタノー ルアミンおよびホスファチジルコリンは、大腸菌リン脂質の加水分解率に対して それぞれ４１％および２７％の割合で加水分解された。洗浄剤（特に非イオン性 トリトンｘ−ｔｏｏ　＞は、同様の構造においてリン脂質を可溶化する不活性基 質として作用するので、認議されたホスファチジルエタノールアミンおよびホス ファチジルコリンの活性は直接此較し得るものである。ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ ｓ）リン脂質基質　（ｒ＋ｍｏｌ／μタンパク・時）大腸菌リン脂質　１２２． ５ ☆大腸菌膜リン脂質の組成：ホスファチジルエタノールアミン４８．６％、ホス ファチジルグリセロール２５．０％、および力Ｊレジオライピン１１．１％；バ ダスとプルリンスキ−（Ｖａｄａｓ　＆　Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ）。

精製した酵素の部位特異性を、■−バルミトイルー２−　（１−１４Ｃｌ　−バ ルミトイルホスファチジルコリンを基質として用いて決定した。測定系は、総容 量４００μβ中に２ｍＭ　ＣａＣ１，、２＋＋Ｍ　ＤＯＣ。

０．０９％トリトンＸ−１００、および１００μ！の酵素調製物とを含有してい るＯ、　ＬＭ　Ｔｒ　１ｓ−Ｈ［：Ｉ緩衝液　ｐｌ−１７，５に分散した放射性 ホスファチジルコリン７５０ｎｍｏｌを含有してＧ）だ。反応Ｏよ３７℃で３． ５時間行われ、クロロホルム−メタノール（２：　ｌ。

Ｖ／Ｖ）８ｍＭを加えることによって反応を停止した。脂質をフォルシュ（Ｆｏ ｌｃｈ）　ら、（１９５７）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２２６　：　４９７〜５ ０９の方法によって抽出し、これをクロロホルム−メタノール−酸−水（　６５ 　：　２５　：　８　：　４，　Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ　）中でＴＬＣニよって分離し た。脂質スポットをヨウ素蒸気に曝すことによって可視イヒした。ヨウ素を昇華 した後，標品ＰＣ，　ＩＪゾ（ｌｙｓｏ）　ＰＣおよび遊離脂肪酸標準品に対応 するスポットを削り取り，シンチレーション液１０ｒｎｌを含有するシンチレー ションノイイアル（こ入れて。

液体シンチレーションスペクトロメーター（へ・ツクマン（Ｂｅｃｋｍａ口）Ｌ Ｓ７５００）において放射能を測定した。１−アシル−２−　［１−Ｉ’Ｃ］バ ルミトイルホスファチジルコリンを毒物であるＰＬＡ．、粗製の滑液または精製 した滑液ＰＬＡ２と共にインキュベートし，反応生成物を薄層クロマトグラフィ ーによって分析した。

９３％をこえる総基質がヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ肪酸に結 合しており，この時放射性産物の２．８％だけがＩＪソルシチンと共に移動し， 　ｓｎ−２位でエステＪし化した脂肪酸の選択開裂と一致した。同様に，粗製の 滑液および精製したＰＬＡ調製物の両方が放射性標識した基質をｓｎ−２の位置 で選択的１こ加水分解し、９５％を越える＋４ｃ−脂肪酸を、および５％未満の ２−　［：”Ｃ］バルミトイルホスファチジルコリンを産生じた。

ＰＬＡ　、とりゾホスホリバーゼとの結合活性（ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｃｔｉ− ｖｉｔｉｅｓ）を妨げるために、粗製の滑液および精製した滑液ホスホリパーゼ を、　１−　〔Ｌ−”Ｃ’　３バルミトイルホスフアチジルコリンと共に上記の ようにインキュベートした。生成物の薄層クロマトグラフィー分析は、放射性標 識の９９％がリゾリン脂質基質と結合したままであり、放射能の０．０５％だけ が遊離脂肪酸に結合していることを明らかにし、検出しつるりゾホスソリパーゼ 活性が実質上存在しないことを示唆した。これらのデータは、滑液ホスホリパー ゼに対する完全な２−アシル特異性き一致する。

Ｃ，ＰＬＡ２活性におけるＳＯＳの影響高精製したＰＬＡ２によるホスファチジ ルコリンの加水分解率へのＳＤＳの影響を、シャカール（Ｓｈａｋｉｒ）の方法 （前出）を用いて検討した。ＳＯ８はＰＬＡ２の活性を濃度依存的に阻害した。

ＰＬＡ２の阻害は、１ｍｇ／ｒｒＬ１および０．１ｍｇ／ｍｆのＳＯ３６度にお いて各々初期酵素活性の９４％および７％の割合であった。準備用５Ｏ３−ＰＡ ＧＥの有用性の評価において、スラブ・ゲル（ｓｌａｂ　ｇｅｌ）からの酵素の 回収率は、−貫してゲルに作用した酵素全体の９５％と１００％との間であった 。しかしながら、高精製したＰＬＡ２を続いて凍結乾燥すると、その結果、活性 の損失（約６４％の損失）はかなりであった。

滑液ＰＬＡ２を、放射性免疫検定法によりウサギ抗ヒト膵１１ＰＬＡ２に対する 免疫反応性について試験した。スターンビー（Ｓｔｅｒｎｂｙ）ら（１９８４） 　Ｂｉｏｃｈｉｎ＋　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　７８９　：　１６４〜１６９ 　。８−７から３１．　Ｏｎｍｏｌ／　ｍｊ２−分の範囲内のＰＬＡ、活性（大 腸菌リン脂質基質を用いて）を有する分画していないリウマチ性滑液の１０標本 を試験した。すべての場合において、抗ヒト膵１ＩｉＰＬＡ２との実質的な交叉 感受性はなく、酵素測定によるＰＬＡ２の定量とＲＩＡによるＰＬＡ２の定量も 相関関係がなかった（ド０．１３４）。

同様に、この抗体は精製（ｅｘ−セファデックス■Ｇ７５）　した両分を認識で きなかったく表■）。滑液に添加したブタ膵臓ＰＬＡ。

についてＲＩＡと酵素の分析物の相関関係は有意であった。

（以下余白） 滑液　１　８．６７　＜０．８ ２　３０、５５　０．８ ３　２３、００　０．８ ４　１８、２３　０．８ ５　１１．６２　＜０．８ ６　１６、３７　０．９ ７　１６、６７　４．３ ８　１８、０８　：ｌ’、　１ ９　３０、７３　２．０ １０　３１、０２　２．３ 滑液十 ０　μｇ　膵ＩＩ　ＰＬＡ２　３８．４８　＜０．８１Ｍｇ膵臓　ＰＬＡ２１１ ９．９３　１３．０１５Ｍｇ膵［Ｉ　ＰＬＡ２８８１．９８　５１０３０μｇ膵 ＩＩ　ＰＬＡ２　１４２２．７２　６４．０滑液ＰＬＡ２ ｅｘ−セフ７デフクス■　Ｇ−７５８１，８２＜０．８（以下余白） ■、滑滑脱ＬＡ２配列のクローニング ２つの５０−ｍｅｒコドン選択オリゴをＲＡＳＦピークＡ配列から設計し、以下 のようにしてアンビギュイティーを最小にした＝（ａ）オリゴをアンビギュイテ ィーの最も少ないコドングループ上に集め、そして（ｂ）Ｇ：Ｔ結合させる。第 ３図に示すように。

そのオリゴはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓ ｔｅｍｓ）のオリゴヌクレオチドシンセサイザーにおいて合成された。

オリゴをγ−”Ｐ−ＡＴＰＪ６よびポリヌクレオチドキナーゼで標識し、これを クローンチック社（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）　（７ウンテンビユー、カ リフォルニア州（ＣＡ））から入手したＥＭＢＬ３−ヒト白血球ゲノムライブラ リーについてのハイダイゼーションプローブとして使用した。次に１０６の総プ ラークを、細菌株ＮＭ５３８を用いてＬ−ブロスを含有する２０個の１５０　ｍ ｍ寒天プレートにまいた。プラークをニトロセルロースフィルター上に写し、真 空の炉内で８０℃で２時間熱変性させ、そして、プレハイブリダイゼーション溶 液５ｘデンハート液、２０％ホルムアミド６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，５ｈＭ　ＮａＰ Ｏ−、１００ｕ　ｇ／ｍｌのサケ精子剪断ＤＮＡ）中３７℃で２時間プレハイブ リダイズした。プレハイブリダイゼーション液＋１０％硫酸デキストランおよび ２Ｘ　ＩＱ’ｃｐｍの標識プローブ中、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを 行った。そのフィルターを１　ｘＯ，１６Ｍ　Ｎａ［”ｌ、　０．０１６Ｍ　ク エン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、　０．１％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＯＳ）中 ２５℃で２回洗浄し、さらに同じ溶液中５０ｔ’で１時間の間、フィルターを１ 回洗浄して９次いでこれを一７０ｔで一晩オートラジオグラフ用フィルムに曝し た。その後、同じフィルターを５５℃で再洗浄し、再び曝した。

２種類のシグナルが認められ９両方のプローブとハイブリダイズしたシグナルが ７個、　２７７９プローブだけとハイブリダイズしたシグナルが４個であった。

１１のシグナルのいずれもが、３回の精製工程を通してプラーク精製された。フ ァージＤＮＡをクローンから調製し、その制限酵素消化物をアガロースゲル分離 によって分析すると、明らかなりローンの数は２個に減少した。以後、これをク ローン６およびクローン１ｏとした。オリゴ２７７９は、５５℃で洗浄すると、 クローン６およびクローン１０と強くハイブリダイズした；オリゴ２７８ｏは同 じ条件下でクローン６と弱くハイブリダイズした。

２つの独特なりローンからのＤＮＡをエンドヌクレアーゼＨａｅｍ、　Ｒｓａ　 Ｉ、およびＡｌｕ　Ｉで消化した。完全な消化産物をフェノール／クロロホルム で抽出して、エタノールで沈澱させた。乾燥したペレットを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 、　ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁し、そして１．０μｌのアリクウォ ットを、あらかじめＳｍａ■で消化しておいたバクテリオファージＭ１３ｍ　ｇ に連結した。

形質転換した大腸菌、ＪＭ１０１株の細胞を１５０　ｍｍのＬ−寒天プレートに プレートし、３７℃で一晩インキユベートした。生じたＭ１３組換えプラークを 取り、そのフィルターを上述のようにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ ョンシグナルに一致するプラークを取り、これを用いて一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ鋳型 を作製した。クローンの配列決定はジデオキシ／酵素的方法を用いて行い、得ら れた配列を整理して、これをインテリジエネティックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ ｅｔｉｃｓ）プログラムＳｅ４およびＧｅ１（インテリコープ社）　（Ｉｎｔｅ ｌｌｉｃｏｒｐ　Ｉｎｃｊ　、　？ランテンビュー。

カリフォルニア州（ＣＡ））を用いてＶＡＣ３８５００コンピューター（ディジ タル社）　（Ｑｉｇｉｔａｌ　Ｃａｒｐ、）で解析した。この２つの独特なホス ホリパーゼクローン６および１０のエクソンに関する得られたクローン配列を図 ４に示す。これらの配列は４０４ｂρＡｌｕｌ断片（クローン６）および約４６ ０　ｂｐ　Ａｌｕ　Ｉ断片（クローン１０）内に含有されている。クローン６お よび１０をそれぞれλ５ＰＬＡ２−６およびλ５ＰＬＡ２−１０と名づけだ。

λ５ＰＬＡ２−６における５ＰＬＡ２コ一ド配列は１元来ヒトＡ型遺伝子Ａ型の エクソン２であると考えられた。以下のＩＩｌ、　Ｂ。

において同定するｃＤＮＡ配列を使用して、ゲノミッククローン′　中に残って いるエクソンを同定した。遺伝子の５゛非コード領域に予想外のイントロンが存 在することを見い出した。このため９元来、エクソン２であると考えられたもの は、実際にはエクソン３である。エクソン１をコードする配列を図７に示す、　 １０１６から１０３８までの塩基は、　ｃＤＮＡクローンの８から２７の塩基に 正確に相当する。厳密な転写開始部位は決定されなかったがその最も有望な位置 は塩基１０１２あるいはそのすぐ上流である。潜在的なｒＴＡＴＡ」配列がヌク レオチド９６８から９７４において認められ得、推定上のｒｃＡＡＴ」配列はヌ クレオチド９０４から９０９に存在する。

Ｂ、ｃＯ〜Ａクローニング ６０−＋ｗｅｒオリゴヌクレオチドプローブを、第４図に示すλ５ＰＬＡ２−６ のヌクレオチド配列上対合し、第１図に示すアミノ酸残基５〜２４のコドンに対 応するように合成した。このオリゴヌクレオチドプローブを使用して、以下のも のを含有する各種の起源からのＲＮＡプロットをスクリーニングした：細胞株Ｈ Ｌ６０およびＵ９３７．　ヒト着膜細胞、ヒト腹腔炎症浸出液細胞、ヒト膿細胞 、ブタ空腸組礁、ブタ膵臓組織、ラット膵臓組織、およびラット肝臓組織。かな りのレベルのＲＮＡが、ヒト腹腔細胞にあけるハイブリダイゼーションにより検 出され、ヒト着膜細胞ではそれより低いレベルのＲＮＡが検出された。

ガプラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ　＆Ｈｏｆｆｍａｎ）　（１９８３）　Ｇｅ ｎｅ　２５：２６３〜２６９の方法に従い、腹腔細胞ＲＮＡ　（ｐｒｅｐ）から のポリＡ＋メツセージからｃＤＮＡライブラリーを構築した。そのライブラリー を６０−ｍａｒプローブでスクリーニングし、フィルターをＩＸ　ＳＳＣ，（Ｌ １％ＳＯ５中６０℃で洗浄した後、１７の独立（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）重複シグナ ルを得た。ｌＯのクローンからのＤＮＡをＰＡＧＥによって分析した。すべての クローンが８００〜ｌ、　０（１０ｂρの挿入部を含有していた。クローン１． 　４．１１およびＩ４と称する４つのクローンを、バクテリオファージＭ１３へ のサブクローニングのために、およびその後の標準的手法によるＤＮＡ配列分析 のために選択した。これらのクローンのうちの１つであるλ５ＰＬＡ２ｃＤＮＡ −４が、　５ＰＬＡ２Ａ型配列全体をコードすることが決定された。第６図を参 照されたい。その他のクローンは同じ配列を含有するか、あるいは５“未満で長 さがわずかに異なっており、異なる長さのポリＡの尾部を有していた。他の点で は。

このクローンは、２７７位でＣがＴに置換されている以外同一であった。アミノ 酸に関するサイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）はコドンによっ て規定される。典型的な翻訳終止配列、　ＡＡＴＡＡＡが塩基１１６から始まる ことが認められ得る。λＰＬＡ２ｃＤＮＡ−４によってコードされた成熟ペプチ ド配列は１２４のアミノ酸を含有し、そして１３．９１９ダルトンの計算された 分子量を有する。

活性な組換え５ＰＬＡ２を、テ；ゲウス（ｄｅ　Ｇｅｕｓ）ら（１９８７）　Ｎ ｕｃ　ｌｅ　ｉｅガラクトシダーゼ融合タンパクとして、大腸菌のような細菌中 に産生じた。この方法は次のように５ＰＬＡ２に適用させた。

まず最初にＣ未満でヌクレオチド５８８に挿入したＣからＧへの単一の塩基変化 により、　ＴＧＡ停止コドンの１７塩基下流に）ｌｉｎｄＩＩＩ部位を創製した 。この変化は、標準的な分子生物学的方法を用いて、−木端Ｍ１３ＤＮＡのオリ ゴヌクレオチド定方向部位特異的変異により実施した。この変異したクローンＤ ＮＡをＢｃｌＩおよび旧ｎｄｌｌＩで消化すると、ｔＬ熟タンパクの最初の９個 のアミノ酸残基以外は５ＰＬＡ２コ一ド領域全体を含有する。　３７０ｂρ断片 を産生じた。これら９個の残基を開裂可能な融合部位（Ｔｒｐ）およびＥｃｏＲ １部位と共に、第８図に示す２つのオリゴヌクレオチドリン力−によって置き換 えた。３７０ｂｐＢｃｌｌ−ＨｉｎｄＤＩ断片を２つのオリゴヌクレオチドと共 に、あらかじめＥｃｏＲＩと旧ｎｄＩ［Ｉで切断してふいた発現ベクターｐＨＮ Ｆ３６に連結することにより。

発現構築物ｐ８６−　ＩＡを得た。ｐＨＮＦ３６ベクターは、　ｐＢＲ３２２バ ックボーン；大腸菌トリプトファンプロモーター；　リポソーム結合部位；６個 のＴｈｒ残基が続（、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ末端部分の一 部をコードする配列；　ＥｃｏＲＩと旧ｎｄ１１１部位：および２つの強力な大 腸菌転写終止シグナル５ＰＬＡ２構築物を含有する発現ベクターを使用して９発 現のために大腸菌株Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ受託番号２７３２５）を形質転換し た。

適当な個体群密度の形質転換細胞の培養を播種した後、培地中に３−８−インド ールアクリル酸を添加して発現を誘導した。

誘導培地で９時間増殖させた後、細胞の約９０％において封入体が観察された。

細胞分断後、封入体をペレットし、これを５０ｍＭβ−メルカプトエタノールを 含有するゲル充填緩衝液中で５分間煮沸した。非誘導培養ふよび対照培養からの 類似の抽出物のゲルと比較してみると１発現構築物で形質転換した誘導培養にお いては顕著に１５ｋｄバンドが観察された。このバンドは精製封入体抽出物から 得られるゲル中にかなり多く。

準備用ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲルから得られるこの融合タンパクを大規模 に分離した。このようにして調製した融合タンパクを、抗体産生のためにウサギ 、ラットおよびマウスに注入した。

精製した融合タンパク画分はデ・ハース（ＤｅＨａａｓ）ら（１９８７）（前出 ）が述べたまうなＳ−スルホン化方法により活性化し得る。活性化後、融合タン パクはＴｒｐ残基において開裂され得。

成熟ヒ）　ＰＬＡ２を放出する。その代わりに、逆の順序で２つの工程を行なう と、活性タンパクがより大きな収量で得られる。

来の精製工程を使用して、β−ｇａｌ　リーダー（β−ｇａｌ　１ｅａｄｅｒ） から５ＰＬＡ２が分離され得る。

Ｂ、ワタシニアウイルス 組換え５ＰＬＡ２ポリペプチドは、ワタシニアウイルス発現ベクターを使用して 、Ｗ乳類細胞においても提供し得る。このような発現ベクターは当該技術におい て公知である。例えば。

ＰＣＴ特許公開第ＷＯ３６／　０７５９３号（ＣＢ［：　ＰＯ２）を参照された い。

例えば、チャクラバーチ４　（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）　（１９８５）Ｍｏｌ 　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ下の実験計画案（ｐｒｏｔｏｃｏ　１）に従って使用した 。オリゴヌクレオチド部位特異的変異によって塩基１２７をＡからＧに変えて。

ＡＴＧ開姶コドンから５ｂρ上流にＳａｃ　１部位を作製したこと以外は、上述 のようにして５ＰＬＡ２コ一ド断片を調製した。従って、コード領域は４６９ｂ ｐ　Ｓａｃ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片上に含まれている。次に、この断片を、 あらかじめＳｍａ　Ｉで切断したワタシニアベクターｐＳＣ−１１に平滑末端連 結した。得られたＤＮＡを回収し、これを用いて標準的手法で培養した哺乳類Ｃ Ｖ−を細胞のワタシニア感染単層をトランスフェクションした。得られたプラー クを数段階の感染を通して精製した。

第９図に示すように、細胞および培地の両方に存在するＰＬＡ２活性を測定する ことにより１時間経過と共に培地中にＰＬＡ２のかなりの蓄積が示された。同じ ようにして調製した培地が大量に得られ、このため、これらの細胞によって発現 される活性を有する組換えＰＬＡ２酵素が、標準的精製工程によって得られ得る 。さらに、これらの細胞から精製した感染ウィルスを使用して、活性酵素を認識 する抗体の産生のためにウサギおよびマウスに接種した。マウスにおいてかなり の力価に到達すると、酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が同定され得る。

この同定は、上述したＰＬＡ２測定での活性を阻害する能力に関してハイブリド ーマクローンをスクリーニングすることにより行われる。

■、滑滑脱ＬＡ２に対する阻害抗体 ヒト着膜ＰＬＡ２配列のセグメント：　（ｉ）　６７〜８５　（ＧＴＫＦＬＳＹ ＫＦＳＮＳＧＳＲＩＴＣ）および（ｉ　ｉ）　１０９〜１３２　（ＮＫＴＴＹＮ ＫＫＹＱＹＹＳＮにＨ３ＲＧＳＴＰＲＣ）に対応する２つのペプチドを合成し、 これらとグルタルアルデヒドを有するオバルブミンとを結合させて、これらを別 々にウサギを免疫するために使用した。

Ｅｌｉｓａ測定による測定で１　：　４０．０００の力価を有する両ペプチド複 合体に対する抗血清を得た。マツキンニー（ＭｃＫｉｎｎｅｙ）およびパーキン ソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）　（Ｊ　Ｉｍｍｕｎ　Ｍｅｔｈ　９６：２７１〜２ ７８、（１９８７）の方法により抗血清および対照血清からＩｇＧを精測定のた めの滑層ＰＬＡ２活性の起源は、ヒトメタロチオネインプロモーターの転写制御 下で滑層ＰＬＡ２配列によりトランスフェクトした細胞からの、チャイニーズハ ムスター卵巣細胞馴化培地の部分精製した調製物であった。部分的な精製は。

イオン交換クロマトグラフィー（モノＱカラム、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 　、　ｐＨ８，０中０〜２　Ｍ　Ｎａ（：］勾配）、透析および凍結乾燥によっ て達成された。

前に、３７℃で１時間、測定緩衝液中でブレインキュベートするという変形を行 ったこと以外は上述のようにして行なった。

各ペプチドに対する抗体とブレインキュベートすると、対照１ｇＧと比べて約５ ０％の活性阻害を生じる。その結果を表■に示す： 表■ モノクローナル抗体によるＰＬＡ２の阻害試料　加水分解％ 対照１ｇＧ　４３％ ｐｅｐＨｇＧ　２５％ ｐｅｐ２１ｇＧ　１７％ 本発明は、ある特定の実施態様によって上記のように例示され得るが、これらの 特定実施例は、添付の請求の範囲で述べられるような本発明の範囲を制限するこ とを意図するものではない。

ＦＩＧ、２ 五　分 ぐ ロロロロロロ０ロロロロロロロロ００ｏロ０ロロ０ロロロロロロ０ロロロロロＬ ）　ＮＩＮのωロ呼ザ！ロロロ１ψψへ〜〜ロロΦザすザロ０口１Ｄψ〜〜ロロ です１ψ−一一一一へＩ′＋Ｉへ一門一一門一でマす！苛曾い一φ１１ψＱ―さ さ一＾の口ψ ムー ｓＰＬ＾２違ｆｔ、ｉＥｌ’Ｊ　（Ｌ７ノン１−５）ＦＩｏ、　７−１ ＦＩＧ、　７−２ ＦＩｏ　７−３ ワクシニア　ＰＬＡ２の藁稽 ＦＩＧ、９ 国際調査報告

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＡ２）のコード配列を有する非相同領 域を含む二本鎖ＤＮＡ構築物を含有し，該非相同領域を含まない構築物を実質的 に含有しない，組成物。
2. ２．請求項１に記載の組成物であって，前記コード配列は，成熟ｓＰＬＡ２　の アミノ酸配列をコードする。
3. ３．請求項１に記載の組成物であって，前記コード配列は，酵素前駆体のアミノ 酸配列をコードする。
4. ４．請求項１に記載の組成物であって，前記哺乳類はヒトである。
5. ５．請求項１に記載の組成物であって，前記ｓＰＬＡ２は可溶性である。
6. ６．請求項１に記載の組成物であって，前記ｓＰＬＡ２は，天然のｓＰＬＡ２配 列におけるＨｉｓ４６に対応するアミノ酸がＨｉｓではない，変異タンパクであ る。
7. ７．請求項６に記載の組成物であって，前記Ｈｉｓ４６に対応するアミノ酸は， ＧＩｕまたはＡＳｐである。
8. ８．請求項１に記載の組成物であって，前記ＤＮＡ構造物は，さらにレプリコン を含む。
9. ９．請求項８に記載の組成物であって，前記レプリコンは細菌プラスミドである 。
10. １０．請求項８に記載の組成物であって，前記レプリコンは酵母プラスミドであ る。
11. １１．請求項８に記載の組成物であって，前記レプリコンはバクテリオファージ である。
12. １２．請求項８に記載の組成物であって，前記レプリコンは染色体である。
13. １３．次の工程を包含する，組換え体哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ ２）の製造方法： 細胞内で機能し得るレプリコンを該細胞内に含む形質転換細胞群を提供する工程 ，ここで該レプリコンは該細胞内で機能し得るプロモーターの制御下にあるコー ド配列を含み，該コード配列は哺乳類ｓＰＬＡ２をコードし，該細胞群は実質的 に他の細胞を含まない； 該哺乳類ｓＰＬＡ２を発現する条件下で該細胞群を増殖させる工程；および 該哺乳類ｓＰＬＡ２を回収する工程。
14. １４．請求項１３に記載の方法であって，該細胞は細菌細胞である。
15. １５．請求項１３に記載の方法であって，該細胞は酵母細胞である。
16. １６．請求項１３に記載の方法であって，該細胞は哺乳類細胞である。
17. １７．請求項１４に記載の方法であって，該レプリコンはプラスミドである。
18. １８．請求項１５に記載の方法であって，該レプリコンはプラスミドである。
19. １９．請求項１６に記載の方法であって，該レプリコンは染色体である。
20. ２０．請求項１３に記載の方法であって，該哺乳類はヒトである。
21. ２１．実質的に夾雑タンパク質を含まない哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２（ｓＰ ＬＡ２）を含有する組成物。
22. ２２．請求項２１の組成物であって，該ｓＰＬＡ２はｓＰＬＡ２Ａ型である。
23. ２３．請求項２１の組成物であって，該ｓＰＬＡ２はｓＰＬち２Ｂ型である。
24. ２４．請求項２１の組成物であって，該ｓＰＬＡ２はｓＰＬＡ２Ｃ型である。
25. ２５．請求項２１の組成物であって，該ｓＰＬＡ２は，天然のｓｐＬＡ２におけ るＨｉｓ４６に対応するアミノ酸がＨｉｓではない，変異タンパクである。
26. ２６．請求項２５の組成物であって，前記Ｈｉｓ４６に対応するアミノ酸はＧＩ ｕまたはＡｓｐである。
27. ２７．哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２に固有のエピトープを認識する抗体を含む 組成物。
28. ２８．炎症性疾患に罹患している哺乳類に，有効量の抗哺乳類滑膜ホスホリパー ゼＡ２抗体組成物を投与すること，を包含する治療方法。
29. ２９．哺乳類由来の滑液試料を提供すること，および定量分析において該試料中 の哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）Ａ型およびＢ型の量を測定する こと，を包含する方法。
30. ３０．請求項２９の方法であって，前記定量分析は免疫学的検定法である。
31. ３１．抗原，薬学的に受容され得る非経口賦形剤，および少なくとも１種のアジ ュバントを含むワクチン組成物において，哺乳類滑膜ホスホリパーゼＡ２（ｓＰ ＬＡ２）をアジュバントとして使用すること。