JPS62502687A - 消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト消化管の腫瘍細胞における悪性細胞の増殖の有無持に腺癌型細胞 の増殖の有無をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断する°手段に係る。これら手段は、ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ診断方法、及び、これらの方法で使用され得る材料要素、特にプロー ブとして使用され得るＤＮＡ断片又はヒト絨毛に対する抗体好ましくはモノクロ ーナル抗体に係る。

本発明は更に、種々の用途、例えばヒト絨毛を含む細胞抽出物からヒト絨毛を精 製するために使用されたときのこれらモノクローナルの効果に及ぶ。従って本発 明はまた、精製ヒト絨毛自体に係る。

いくつかの高等真核細胞型を同定するため及びこれらの細胞の種々の発生段階、 特に分化段階の追跡研究のために、特異的ラベルとして構造タンパク質の検出を 利用することは既に提案されている。公知のラベルとして例えば、線維タンパク 質例えばビメルチン、ケラチン又は神経線維タンパク質があり、これらは幾つか の細胞型の同定、胚形成時期から細胞分化の最終時期までの細胞の発生の研究及 び環境培地に対する細胞の挙動の研究に使用できる（Ｅ、ＬＡＺＡＲｌ（１９８ ２））。

ケラチンはしばしば上皮細胞と非上皮細胞とを識別し得る特にを効なラベルと考 えられる。しかし乍ら、この種の識別では、該当する上皮細胞の起源を・必ずし も明確に確定することはできないことが判明した。

しかし乍ら、幾つかの細胞型の起源を確実に検出することの必要性は、多くの場 合、例えば腫瘍細胞の増殖を示す生物サンプルを検査する場合に、この増殖の起 源に存在する一次腫瘍細胞を同定するため又は消化領域の癌を起源とする転移の 存在を検出するため又は転移癌に対する化学療法及びその他の療法の効果を確認 するために特に重要視されつつある。勿論、抗癌治療の効果は疾患の一次原因た る腫瘍細胞の正確な同定とのつながりが深い。

これらの観察は、（臨床的に発見される癌のうちの高い割合を占める）消化器官 起源又は腎臓起源の腫瘍細胞の増殖又はこれら細胞から誘導された細胞の増殖の 検出好ましくは早期発見、特にこれら細胞の特宵ラベルの同定のために特に重要 である。

従って本発明は特に、消化器官の粘膜特に腸粘膜中に通常は存在し主な分化型が 吸収細胞又は腸細胞から構成される上皮細胞の幾つかの主要表現型を維持した腫 瘍細胞の検出に重要である。

本発明はまた、これら腫瘍細胞に担持されるか否かにかかわりなく検出され得る 特異的ラベルに係る。

本発明の目的は特に、これらラベルが腫瘍細胞特に該細胞の壊死の場合に該細胞 から離脱し例えば血管系に遊離されたときにもラベルを検出することである。

本発明の範囲内で使用されるラベルは、絨毛の全部又は一部から構成される。絨 毛は、通常は消化粘膜特に腸粘膜の絨毛組織中に存在する分子量約９５，０００ ドルトンのオーダのタンパク質である。絨毛はカルシウムイオンの存在下でアク チンと結合し得る。

絨毛の種類毎にアミノ酸配列は若干異なっているが機能特性は維持されている。

今日まで公知の精製技術ではニワトリ及びブタの絨毛を実質的に純粋な状態まで 精製し得る。

しかし乍らこれらの技術ではヒト絨毛を精製することはで最もよく知られた絨毛 の１つはニワトリの絨毛である。

この絨毛は８５４個のアミノ酸配列から形成されている。トリプシン及びプロテ アーゼＶ−８を使用した調整タンパク質分解によって所定箇所を切断し４４Ｋｄ 、５１Ｋｄ及び１ＱＫｄの断片を得ることができる。絨毛のマツプ内でのこれら 断片の相対位置は、Ｐａｕｌ　ＭＡＤＳＵＤＡＩＲＡ、ＭＲＣ，Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｌＣａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｕ 、に、及びＪｏｈｎ　ＧＬＥＮＮＥＹ等、Ｊ、Ｂ、Ｃ，，１９８１，２５６，８ １５６−８１６１によって以下のごとく確認されている。

１　）−１−１−１−１６９７７９１・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・（８５４カルシウムの存在に　アミノ酸配列 依存するアクチンの　が既知の領域 結合部位 Ｔｉニトリプシン切断 ｖ８ニブロチアーゼＶ８による切断 ニワトリの絨毛のＣ００Ｉ＋末端のアミノ酸配列（７７９−８５４）即ち「ヘッ ド部」（［ペプチドＨＰＪ）は以下の式で示される。

Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−３０ｊＩ Ｇｌｕ−Ａｓｐ、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ −Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−４０４１ｔａ　ｒ／ Ａｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ− Ｌｙｓ−Ａｔ　ａ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ　−Ｇ　１　ｙ　−≦ｏ　４／ Ｍｅｔ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ　−３ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　 −Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｎ　−Ｇ　１　ｎ　−７ｏ　７／ Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ− Ｐｈｅ一般的に絨毛は、特に分化終期に到達した腸細胞の表面で観察される腸内 腟壁の刷毛縁中に存在する。微絨毛は腸細胞の分化終期の集合オルガネラである 。絨毛は特に微絨毛の軸方向微線維束中に局在している。絨毛は、細胞骨格の構 成に寄与している。凍結切片を免疫蛍光で検査すると、絨毛が腸内壁に露出する 円柱を形成する細長い細胞の頂端に存在し、また腎臓の近位尿細管細胞の近傍に も存在することを確認した。いずれの場合も絨毛の存在領域は該当細胞の刷毛縁 と一致する。しかし乍ら、その他の種々の上皮の別の種々の絨毛が極めて組織化 された刷毛縁を持たないときは絨毛は検出されなかった（Ａ、ＢＲＥＴＳＣＨＥ Ｒ等、Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ。

ｒｅｓ、１３５．２１Ｍ１９８１）又はＡ、ＬＩＳＳの著書ＭｅＬＩｌｂｒａｎ ｅ　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（成長及び発生中の膜 ）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）、ｐｐ、８９−１０５に所収のＨ，ＲＥＧＧ ＩＯの論文）。

更に、絨毛が刷毛縁の形成よりかなり早い発生早期の腸細胞中に存在することも 確認された。

本発明は、２つの知見により得られたものである。絨毛は消化管の組織腫瘍形成 中、特に最も頻繁な癌の形態の１つたる結腸の癌、及び幾つかのタイプの腎臓癌 においては実質的に組織的に検出可能な状態で維持されるが、その他の器官（肝 臓、卵巣、肺等）に局在する組織の初期癌化から生じる一次腫瘍細胞中では決し て検出されない。

更に、絨毛は、消化部の腫瘍細胞の全ての発生箇所で腫瘍形成の早期及びより遅 い時期に、該当細胞の分化状態にかかわりなく　ｉｎ　ｖｉｖｏ検出可能である 。

生物サンプル中の最初から消化部で形成された腫瘍細胞　・及び／又は該腫瘍細 胞の誘導体をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出することを主目的とする本発明の診断方法の 特徴は、この生物サンプルを絨毛に対する特異的アフィニティをもつか又はこの タンパク質をコードする遺伝子を認識する試薬と接触させることである。

本発明の診断方法は、消化器官起源の腫瘍細胞又は消化器官もしくは腎臓起源の 一次細胞の影響によって生物体の別の部分に後で形成された腫瘍細胞を内包する 全ての生物サンプル、又は該細胞の壊死の場合に絨毛ラベルを含む種々の腫瘍細 胞の分解産物を内包する全ての生物サンプルに適用し得る。この生物サンプルは 、いかなる形態でもよく例えば、生検により得られた組織もしくは固体腫瘍の断 片、又は悪性細胞もしくは該細胞由来の断片を運ぶ液体生物サンプル例えば全血 もしくは血清である。　、本発明の実施態様によれば、本発明の診断方法で使用 される試薬は、ヒト絨毛特にＣ０ＯＨ末端部のアミノ酸配列をコードする領域を 含む配列をもつＤＮＡから構成される。

本発明の別の実施態様によれば、診断方法で使用される技術は免疫技術であり、 絨毛に特異的アフィニティをもつ試薬は絨毛を認識し得る抗体から構成される。

これら抗体は、公知の任意の方法で抗体自体がラベルされるか、又は、絨毛もし くは絨毛担持細胞に固定された状態のときはラベル免疫グロブリン又はその他の ラベルタンパク質（例えば５ｔａｐｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのプロ ティンＡ）で認識され得る。

特に適当な技術は、後述する試験で使用され前記のごとき結果を示す技術である 。

本発明の目的はまた、腸細胞又は同類細胞の微絨毛の箇所の絨毛を検出するため の新規な特異的手段を提供することである（勿論新規な手段の使用は、本発明の 診断方法に必、ずしも限定されない）。

本発明の１つの特徴によれば、これら手段は、ヒト絨毛の完全ｍＲＮＡに対応す るＤＮＡ又はヒト絨毛のアミノ酸配列をコードする領域を含むヌクレオチド配列 をもつＤＮＡ断片から構成され、絨毛をコードするヌクレオチド配列と特異的に ハイブリダイズし得る。

本発明は特に、ヒト絨毛の完全ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ又はヒト絨毛のｃｏｏ ｎ末端のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むｃＤＮ Ａ断片を前記方法において使用することを目的とする。このヌクレオチド配列と 、コードされたアミノ酸の対応配列とを以下に示す。

（以下余白） ＬＹＳ　ＴＲＰ　ＳＥＲＡＳＮ　ＴＨＲＬＹＳ　ＳＥＲＴＹＲＧＬＵ　ＡＳＰ　 ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＧＬＵＡＡＧ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＡＡＡ 　ＴＣＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＡＧＳＥＲＧＬＹ 　ＡＳＮ　ＳＥＲＡＲＧ　ＡＳＰ　ＴＲＰ　ＳＥＲＧＬＮ　ＩＬＥ　ＴＨＲＡＬ Ａ　ＧＬＵ　ＶＡＬＴＣＴ　ＧＧＣＡＡＣＴＣＴ　ＡＧＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＡＧ ＣＣＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＴＨＲＳＥＲＰＲＯＬＹＳ　 ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＳＥＲＡＳＮ　Ｌ ＥＵＡＣＡ　ＡＧＣＣＣＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＧＡＣＧＴＧ　ＴＴＣＡＡＴ　ＧＣ Ｔ　ＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣ５ＥＲＳＥＲＧＬＹ　ＰＲＯＬＥＵ　ＰＲＯＩＬ Ｅ　ＰＨＥ　ＰＲＯＬＥＵ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＶＡＬＡＧＴ　ＴＣＴ　 ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　 ＣＴＡ　ＧＴＧＡＳＮ　ＬＹＳ　ＰＲＯＶＡＬ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＰＲ ＯＧＬＵ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＰＲＯ５ＥＲＡＡＣＡＡＧ　ＯＣＴ　ＧＴ Ａ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＣＣＧＡＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＣＣＣＡＧ ＣＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＳＥＲ工ＬＥ　ＧＬＵ　 ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＴＨＲＧＬＮ　ＡＬＡＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＡ ＣＣＴＧ　ＴＯＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＣＰＨ Ｅ　ＧＬＹ　ＭＥＴ　ＴＨＲＰＲＯＡＬＡ　ＡＬＡ　Ｐ）（Ｅ　ＳＥＲＡＬＡ　 ＬＥＵ　ＰＲＯＡＲＧ　ＴＲＰＴＩＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣ Ｔ　ＧＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＴＧＧＬＹＳ　Ｇ ＬＮ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　Ｌ ＥＵ　ＰＨＥ　☆ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＣＴＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡ Ａ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＡ　ＴＸＴ　ＴＧＡ　ＧＡＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧ ＧＴＴＧＴＡＭＧＣＡＧＴＡＣＣＣＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣ ＡＴＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＡＧＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧ ＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣ ＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴ ＡＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ 使用されるヌクレオチド配列は、ヒト絨毛をコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを検 出するためのプローブとして使用される。

この種の検出に適したプローブは、放射性元素によってラベルされるか又は被検 ｍＲＮＡもしくはＤＮＡを含む調製物とのハイブリダイズ状態で認識可能な別の 物質によってラベルされるのが有利である。

従来技術によれば、これらプローブと被検細胞を含む生物サンプルとを、プロー ブのヌクレオチド配列と被検サンプルに任意に含まれる相補的配列とが任意にハ イブリダイズできる条件下に接触させるか又は核酸と直接接触させる。

２００塩基対のインサートを含むプローブを使用して検出の再現性を試験した。

本発明の範囲に包含された新規な産生物を構成するこれらヌクレオチドプローブ の別の特徴は、腸細胞及び／又は絨毛発現細胞の各分化状態及び腎臓又は腸起源 の細胞の種々の成熟時期ζこおける絨毛のｍＲＮＡの発現を研究するために使用 されることである。

従って、得られたプローブはヒト遺伝子バンクから単離された絨毛の遺伝子の敵 、組織及び構造を決定し得る。

本発明によれば、ヒト絨毛の末端をコードするヌクレオチド配列の単離は以下の 手順で行なわれるニー公知技術を使用し絨毛を発現する細胞系から完全ｍＲＮＡ （メツセンジャーＲＮＡ）を調製する、 −ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）バンクを構築する、−インサートによってコードさ れたタンパク質を発現し得るベクターにｃＤＮＡを挿入する、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換し、次に細菌中で所望タン パク質を発現させ得る条件を設定する、 一絨毛を認識し得る抗体を用いて絨毛の特異的クローンを含む組換体クローンを 選択する。

ｃＤＮＡバンクの構築段階は、挿入ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を 発現し得るベクターを用いて行なわれる。

特に発現効率が高いので特に有利なりローニングベクターは、ＰＥＸタイプのプ ラスミドから構成される。かかるプラスミドは、５ｔａｎｌｅｙ及びＬｕｚｉｏ によってＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、１９８４．３．１４２９−１４３４に記載さ れている。この文献には、λノ（クテリオファージのプロモータＰＲのコントロ ール下で発現する融合遺伝子ｃｒｏ−１ａｃＺを含むプラスミドが記載されてい る。

この発現は温度によって誘発される。

複数の非反復制限部位を含むポリヌクレオチドが読取りフェーズの各々に挿入さ れ、また転写及び翻訳の終了シグナルも挿入される。非反復制限部位に挿入され たｃＤＮＡは、対応するハイブリッドタンパク質ｃｒｏ−βｇａｌ−ペプチドの 形態で極めて高い効率で発現される。このハイブリッドタンパク質の利点は、難 溶性であり従って細菌中でのタンパク質分解のおそれが少なく特異的抗体によっ て容易に免疫検出されることである。

対応するポリペプチドを細菌中で発現させるべく、遺伝子ｃｒｏ−１ａｃＺに対 して正しい配向でｃＤＮＡを挿入するために、Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、ＵＳＡ、　１９ ８３、晩、３１−３５に記載のＨｅ１ｆ’ｍａｎｎ等の技術に従ってｃＤＮＡの 両端に種々のリンカ−を順次付加するプロトコルを使用する。使用されるリンカ −はＢａｍＨＩ及びＳａｊ　Ｉ切断部位に対応する。

これら組換体プラスミドは、従来技術を用い所望配列によってタンパク質を発現 させる細菌株を形質転換するために使用される。

細菌株としては大腸菌株が好ましく、リプレッサーｃｒ。

の対立遺伝子ｃｌｔｓ８５７を含む大腸菌ｐＯｐ２１３５が特に好ましい。

このようにして細菌株中で高レベルの絨毛を発現する細胞のｍＲＮＡに対応し約 ３０，０００のクローン組換体を含むｃＤＮＡバンクが得られる。

ハイブリッドタンパク質の発現は温度によって誘発され得る。従って遺伝子Ｃｒ Ｏのリプレッサーが失活する温度で処理する。このためには、室温より高温、特 に４０〜４２℃のオーダの温度で菌株を約２時間インキュベートするだけでよい 。

従来技術による細菌の溶解及びタンパク質の再生後に回収されたクローンを免疫 スクリーニングによって選択する。

好ましくは先ず少なくとも１種類の抗絨毛ポリクローナル抗体によってｃＤＮＡ バンクのスクリーニングを行う。１種類以上のポリクローナル抗体と特異的に反 応するクローンをＣＯＯ■末端エピトープに対する少なくとも１種類のモノクロ ーナル抗体を用いて再度スクリーニングする。

完全ブタ絨毛に対する抗ポリクローナル抗体の如き抗絨毛ポリクローナル抗体と 、分子のＣｏｏｌ末端に位置するエピトープを認識し得る１種類以上のモノクロ ーナル抗体とを順次使用すると十分なスクリーニングが行なわれる。

ポリクローナル抗体によるスクリーニング後に、別のポリクローナル抗体特にニ ワトリの絨毛のｃｏｏｎ末端断片に対するポリクローナル抗体を用いた二次スク リーニングを行なうのが有利である。

本発明の目的は特に、完全絨毛に対するポリクローナル抗体とニワトリの絨毛の Ｃ０ＯＨ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体とＣｏｏｌ末端エピトープに 対する２種類のモノクローナル抗体とに特異的に反応することを特徴とするヒト 絨毛に対応するｃＤＮＡを担持するクローンを提供することである。

本発明の目的はまた、ポリＡ配列とポリアデニル化部位とをもつインサートを含 む絨毛に対応するｃＤＮＡを担持するクローンを提供することである。

本発明の別の特徴によれば、絨毛の検出に使用される手段はモノクローナル抗体 から構成される。

本発明のこの特徴は、異なる種に由来する絨毛がモノクローナル抗体に接近し得 る共通エピトープをもち、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生 に適したミエローマ細胞と融合した膵臓細胞をもつ動物の免疫化に使用された特 定の絨毛を特異的に認識するだけでなくヒトを含むその他の種に由来する絨毛を も特異的に認識するという事実に基づく。

従って本発明の好ましいモノクローナル抗体の特徴は、以下の特性をもっことで ある。

一精製ブタ絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、−ニワトリ の絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、−ヒト結腸の腺癌Ｈ Ｔ２９に由来する系の細胞抽出物の絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ ｔｉｎｇ）、−免疫細胞化学的ラットの絨毛（ホルムアルデヒドに固定されたラ ットの腸粘膜の凍結切片（クリオスタット））を認識する。

前記定義に対応するモノクローナル抗体のうちの好ましいモノクローナル抗体は 、ニワトリの絨毛の「ペプチドＨＰＪに含まれるエピトープをも認識する。予め 単離されたペプチドＨＰとペプチドＩＩＰをまだ含む５１Ｋｄのペプチドとの双 方に対して認識が可能である。該抗体はニワトリ絨毛のペプチド４４Ｋｄ又はペ プチド４４Ｋｄのいずれをも認識しない。

本発明の好ましい抗体は、更に、タンパク質ｔｌＰを特にドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）で処理後の再生状態で認識でき、また、絨毛を担持する上皮細胞で 認識し得る。この結果は、ペプチド■Ｐによって担持されるエピトープが細胞培 地中の他のタンパク質によって遮蔽されていないことを示す。

本発明は当然、これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマに係る。こ れらハイブリドーマを産生ずるための有利な技術、特に精製ブタ絨毛に対する免 疫マウスの膵臓細胞と適当なミエローマの細胞との融合によるハイブリドーマ産 生技術については後述する。この方法で得られた好ましいハイブリドーマ（ＢＤ −Ｄ２Ｃ３株）はパリ、パスツール研究所のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｌ１ａｔｉ ｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　ＣｕＨｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｓ（ＣＭＣＭ）に１９８５年４月２９日に受託番号ｎｑ、ｌ−４４０で寄託され た。

本発明の有利な特徴によれば、抗体の形成に使用される一免疫物質は細菌中で多 量に発現し得る。この免疫物質は、ヒト絨毛のＤＮＡ又はその断片に対応する前 記ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドに対応する。

従来技術によって、ペプチドを動物に注射し、抗血清を回収し、次に必要な場合 、例えばアフィニティクロマトグラフィーに、よって抗血清から抗体を回収する 。抗体産生のこの変形例は、上記に定義したｃＤＮＡ断片によってコードされた 領域ＨＰが最も免疫原性で最も絨毛特異的な領域であるときに一層有利である。

絨毛の相補的ＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片のヌクレオチド配列によってコードされ るタンパク質はまた、競合ラジオイムノアッセイ（直接ＥＬＩＳＡ法又は競合Ｅ ＬＩＳＡ法）を行うための抗原ソースを構成する。

しかし乍ら勿論、同じ免疫原性配列を含むその他の全ての免疫物質を使用し得る 。例えば、ペプチドｉｔ　Ｐ自体を使用してもよく、場合によっては免疫特性を 強化するために子牛血清アルブミンのごときキャリヤー分子に予めグラフト重合 されたペプチドＨＰを使用してもよい。

本発明の好ましいモノクローナル抗体を入手できればペプチドＨＰの特性的エピ トープ領域を定義し得ることも当業者に明らかであろう。より正確に同定するた めには、特に、以下の段階を含む方法を使用するとよい。

−ペプチドＨＰ（又は所望エピトープを含むと推定できるペプチドＨＰの部分） をコードするポリヌクレオチド配列を合成する、 一絨毛のＣＯＯ［＋末端をコードするヌクレオチド配列を含む前記に定義した前 記プラスミドを前記配列の外部の制限部位のところで直線化する、 一酵素ＢａＲ３１の如きエキソヌクレアーゼによって直線化プラスミドを調整的 トリミングする、 −ＤＮＡリガーゼによってプラスミドを再環化する、一対応プラスミドによって それ自体形質転換できかつプラスミドに内包されるインサートを発現し得る適当 な微生物を形質転換する、 一部の微生物の発現産物と該当抗体とを再度接触させる。

再環化された最終プラスミドによって形質転換された前記微生物の発現産物中で 前記免疫原性ペプチドの検出が消滅するまで上記処理サイクルを繰り返す。

方法の各サイクルの終期、特に中間再環化プラスミドの認識能力を消滅させる最 終トリミング処理の以前及び以後のプラスミドの末端部分の配列決定のときに、 この最終トリミング処理中に除去されたヌクレオチド配列によってコードされる ペプチドの箇所にエピトープを配置することが可能である。即ち、当業者にとっ て前記抗体を入手することは、該エピトープを含む化学的に定義されたペプチド 配列を入手したことと等価である。

本発明はまた、上記に定義した好ましいモノクローナル抗体と反応でき且つポリ アクリルアミドゲル電気泳動特に５ＤＳ−ＰＡＧＥ試験で実質的に１つのバンド だけを生じる生物学的に実質的に純粋なヒト絨毛に係る。

即ち、ヒト絨毛は、ヒト腸細胞溶解物、特に適当な洗浄剤を含む水溶液で処理し 前記モノクローナル抗体を用いて精製したヒト腸細胞溶解物から抽出され得る。

この種の精製方法では、アフィニティクロマトグラフィー処理に適応するように 好ましくは固体支持体に固定されたモノクローナル抗体を使用するのが有利であ る。例えば、スエーデンのＰＩ（ＲＭＡＣＩＡ　Ａ、Ｇ、によって商標５ＥＰＨ ＡＲＯＳＥとして市販されている三次元網目状構造のアガロースの網にモノクロ ーナル抗体を例えばシアノケンブロマイド法で固定する。

従って本発明は特に、ヒト絨毛を分離するために、該絨毛を含む溶液を前記モノ クローナル抗体を含むアフィニティカラムと接触させてヒト絨毛を選択的に固定 し、次にグリシンベースのＩ））１２〜４の酸性バッファ又はメチルアミンベー スのｐｉ（１１の塩基性バッファによる抗原抗体複合体の溶解によってヒト絨毛 を回収し、次に酢酸アンモニウムバッファに透析する方法に係る。

勿論本発明はまた、ヒト絨毛断片から成るより小さい分子量のポリペプチドに係 る。断片が特異的部位のポリペプチド切断酵素によるヒト絨毛の切断によって得 られることは当業者に明らかであろう。かかるタンパク質として例えば１先ず１ 　トリプシン即ち５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓＶ８のプロテア ーゼ、アルファキモトリプシン、ＢＯＥ［ＩＲ［ＮＧＥＲ社により市販のマウス の顎下線プロテアーゼ、前記ペプチドＧｌｙ　−Ｐｒｏ及びＧｌｙ−Ａｌａ等を 特異的に認識するＶｉｂｒｉｏ　ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉ−ｃｕＳｃｈｅｍｏｖａ ｒ　ｉｏｐｈａｇｕｓのコラゲナーゼがある。

ヒ）・絨毛又はその断片から製造され得る任意に種物異的なハイブリドーマ及び モノクローナル抗体も本発明の一部を構成することが理解されよう。

本発明の別の特徴及び利点は、ヒト絨毛の検出、ハイブリドーマ及びモノクロー ナル抗体の産生及び試験で使用される特定条件の例を示す以下の記載より明らか にされるであろう。

またヒト絨毛のｃＤｌｉＡ部分を担持するクローンの作成方法も記載する。

実施例１：ヒト絨毛の検出 消化部又は腎臓部と生物体のその他の部とに由来する腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の 増殖の種々の時期の絨毛の発現を検査した。ＢＲＯＷＮ及びＦＡＲＱｔｌＨＡＲ ，Ｃｅ１ｌ、姓、２９５（１９８４）に記載の技術で該当組織を採取し凍結し固 定して切片（凍結切片）を調製した。

一２５℃で５ｐ厚の切片を得、ポリリジンで被覆したガラスプレートに載せた。

０．２％のゼラチンを含む生理食塩水リン酸バッファ（ＰＢＳ−ゼラチン）溶液 に浸漬した後に、絨毛を検出すべく　ＰＢＳ−ゼラチン中に１／８００に希釈し た抗絨毛ウサギ抗血清５０試を含む溶液で切片を処理し、湿潤室で室温で２５分 間インキュベートした。

次にＰＢＳ−ゼラチン中で切片を１０分間ずつ３回洗浄した。

ｒａｔｏｒｉｅｓの製品）でラベルしたウサギ抗１ｇＧを添加し、これら抗１ｇ Ｇの存在下に切片を室温で２５分間インキュベートした。次に切片をＰＢＳ−ゼ ラチン中で完全に洗浄し、Ｐｌａｎ　Ｎｅｏ−ｆｌｕａｒオイルに浸漬したレン ズと１組の適当なフィルターとを備えた蛍光顕微鏡（ＺＥＩＳＳ光顕微鏡）で検 査した。

コントロール組織及び他の起源の腫瘍細胞についても同様に処理した。

以下の結果が観察された。

組織が結楊の腺癌に由来するとき、１２のサンプルのうちの１１のサンプルが絨 毛の発現の陽性を示した。他の起源のヒト腫瘍、例えばリンパ腫特に腸間膜結節 リンパ腫及び膵臓、食道等の転移又はそれ以外の原因による他の起源の種々のタ イプの癌腫はタンパク質を発現しなかった。

観察の結果一般的に、処理された腫瘍の一次腸起源と絨。

毛の発現との間に緊密な相関関係があることが判明した。

明らかに別の起源の腫瘍に対して行なった多数の試験では、実質的に全部の場合 にタンパク質の発現が陰性であった。

注目すべきは、腸起源の組織においては、該細胞の増殖程度にかかわりなく絨毛 が常に観察されることである。

前記の試験ではポリクローナル抗体を用いた。ＣＮＣＭに寄託した好ましいモノ クローナル抗体を使用するとより明白な結果が得られた。

これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの単離条件の例を以下に記 載する。また、ＥＬＩＳＡタイプの免疫試験によって絨毛の有無を診断するため の好ましい検出条件の与え方についても以下に記載する。

実施例２：絨毛に対するモノクローナル抗体の調製ルアミドゲル（１０％）電気 泳動後の分子ｍ　９５Ｋｄのタンパク質の均質バンド） １０ｏ＋Ｍイミダゾール ７５ｍＭ　ＨＣ乏 １ｍＭ　ＥＧＴＡ Ｏ，ＩＭ　ＤＴＴ ５０％グリセロール 一プログラム 初日：５０１５０エマルジジン（ＰＢＳ−フロイント完全アジュバント）中の５ ０１！ｇの純粋絨毛のＩＰ（腹腔組織内）注射、１４日：５０Ｉ！ｇの絨毛（Ｐ ＢＳ−フロインド不完全アジュバントエマルジョン中）のブースターＩＰ注射、 ２１日：５０円の絨毛（ＰＢＳ−フロインド不完全アジュバントエマルシロン中 ）のブースターＩＰ注射、 ２８日：　Ｉ’ＢＳに溶解した２０日ｇの絨毛のＩＭ（筋肉内）注射、２９日： 　ＰＢＳに溶解した１０日ｇの絨毛のＩＶ（静脈）注射、３２日：融合。

Ｓｐ２１０−Ａｇ１４系（８Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ耐性）ＤＭＥＭＩＯ％ＦＣ８ 培地中の無菌培養物起源：ブタ絨毛に対する超免疫マウスｏ　Ｂａ１ｂ／Ｃの牌 （ＩＩ　）Ｋａｈｌｅｒ　Ｇ、及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，による細胞融合方法 （所定特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞の連続培養物、Ｎａｔｕｒｅ、　１ ９７５．２５６．４９５）−無血清ＤＭＥＭ培地中の５０％のポリエチレングリ コール溶液（ＰＥＧ１０００−Ｍｅｒｃｋｇ７２９）の存在下に無菌条件下、の 無血清ＤＭＥＭ培地中で融合させる。２種類の親細胞の計数後に、培養中のミエ ローマ細胞の懸濁液を膵臓細胞の懸濁液に１＝５の割合で混合する。

一２分３０秒間接触させる。

一完全ＤＭＥＭ培地で希釈してＰＥＧの作用を停止させる。

−選択ＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地に細胞懸濁液を最終的に希釈（２Ｘ１０’細胞／Ｔ ｄｌ）する。

一１ｍＬ）のウェルを含むＣ０３ＴＡＲ２４皿に分配（Ｃ０３ＴＡＲＴｉ５ｓｕ ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃ１ｕｓｔｅｒ　２４、Ｃａｔ、Ｎｏ、３５２４、Ｃ０３Ｔ ＡＲ２０５Ｇｒｏａｄｗａｙ。

ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳＭａ、　ＵＳＡ）。

ブタ精製絨毛に対する抗体の分泌能力によってクローンを同定する。

この試験では融合後の培養物上清中の抗絨毛モノクローナル抗体を証明し得る。

一抗原の固定：支持体（ＥＬＩＳＡプラーク）に抗原を固定する。

濃度：５０ｍＭ、　ｐＨ８のリン酸カリウムバッファ中に５ｕｇ／−０４℃で１ 晩維持。

一飽和：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０−ＢＳＡで飽和。

−インキュベーション■：非希釈ハイブリドーマ上清と共に４℃で３時間。

一インキュベーション■：βガラクトシダーゼでラベルしたマウス抗１ｇＧと共 に４℃で２時間。

各段階間の洗浄にはいずれも０．１％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いる。

一拳」杢−：０．ＩＭ、　ｐＨ７，０のリン酸バッファ、１０−’Ｍ　Ｍｇ５Ｏ い２×１０−’Ｍ　Ｍｎ５Ｏ，、２ＸＩＯ−”Ｍ脱水トリトリプレックス（Ｔｒ ｉｔｒｉ−ｐｌｅｘ）ｖグネシウム（Ｍｅｒｃｋ８４０９）中のｏ−＝トロ７エ ー１−７Ｌｚ−β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｎｉｌ−２７）久Ｎす：４ １４ｒ＋ｍでのＤｏ（光学密度）読取り。

バックグラウンドノイズのＤＯの１０倍のＤｏを与えるハイブリドーマ上清をも ツクローンを選択した。

（Ｉ［）Ｗｅｓｔｅｒｎ　ＢｌｏｔｔｉｎｇＳ　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、人ｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９１１１．１１２．１９５−２０３ この試験によって、ＥＬＩＳＡ試験の陽性クローンのうちでヒト絨毛とニワトリ 絨毛とを同時に認識し得るブタ抗絨毛モノクローナル抗体を分泌するクローンを 選択し得る。

種々の試験段階 （ａ）ニワトリの腸粘膜の細胞抽出物と絨毛を発現するＨＴ２９系（ヒト結騙の 腺癌）の細胞抽出物とをポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。

（ｂ）ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質をニトロセルローズ紙に 電気転移する。

（Ｃ）細胞タンパク質が転移されたニトロセルローズ紙を、ＥＬＩＳＡで予め選 択したハイブリドーマ上演と共に４℃で１晩インキユベートする。

（ｄ）ペルオキシダーゼでラベルしたマウス抗１ｇＧと共に室温で１時間インキ ュベートする。

（ｅ）基体ニ ー　１０ａ＋ｇの四塩酸ジアミノベンジジン−２０−のｐ）１７．６の０．１Ｍ 　Ｔｒｉｓ）ｌｃｆｉ−０，２−の１％Ｈ２０゜ 各段階間の洗浄にはいずれも新生子ウシ血清−ＰＢＳ−Ｔｒｔ−ｔｏｎ　Ｘ１０ ０を用いる。

（ｆ）陽性反応：抗原−モツクローナル抗体反応が生じると、栗色バンド（分子 ＩＬ９５Ｋｄ）が速やかに出現する。

（Ｄ）選択ハイブリッドのクローニング−限界希釈法： ウェルの底部に結合したマクロファージ（４週齢のＢａ１ｂ／Ｃマウス起源）に （９６ウエルのプラークの）ウェル当たり１つの細胞が分布するように陽性クロ ーンを選択培地に希釈する。

条件調整した選択培地を添加する。

−前記方法によって陽性クローンを選択する。

−必要に応じて再クローニングする。

（Ｅ）腹水の調製 一４〜５日以前にＰＲＩｓＴＡＮＥ（Ａｌｄｒｉｃｈ、　２，６，１０．１４− テトラメチルペンタデカン）を注射しておいたマウスに選択クローンを注射する 。

一マウス当たり１〜２ＸＩＱ＠の細胞を注射する。

−１０〜１５日後に増殖したクローン細胞を含む腹水をマウスから回収する。

腹水の抗絨毛モノクローナル抗体価は１ｍｇ／ｄより高い。

−選択クローンの凍結は１０％ＦＣ８−５％ＤＭＳＯのＤＭＥＭ培地中で行なう 。

一１７６℃の液体窒素中で保存する。

絨毛定量のための直接ＥＬＩＳＡ法 −精製１ｇＧの吸着；一定濃度の腹水ＢＤ−Ｄ−ｅａからＥＬＩＳＡプラークに 吸着させる。

イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ八へ−Ｔｒｉｓアクリル）及びヒドロキシ アパタイトカラムによって抗体を精製した。

所定濃度まで濃縮する。

３７℃で２時間次に４℃で１晩インキユベートする。

０．１％のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。

−プラークの飽和 １’Ｂｓ１０．１％のＴｖｅｅｎ２０１０．４％のＢＳＡの存在下に３０分間イ ン０．４％ＢＳＡの存在下で精製絨毛の濃度範囲は５　ｔｑ　／ｖｄｌから１又 は０．１ｎｉＦ／−に減少する。

４℃で３時間インキュベートする。

０．１％のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。

−精製１ｇＧの添加：βガラクトシダーゼと結合した絨毛に対するウサギモノク ローナル抗体血清から精製されたＩｇＧを添加する。

４℃で２時間インキュベートする。

０．１％のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄する。

−ガラクトシダーゼの検出 ２０ｍ＋ノｐＨ７ノ０．１Ｍノ！Ｊ　：／酸緩衝バッフ７．１０−’ＭノＭｇ５ Ｏ，。

２Ｘ　１０−’ＭのＭｎＳＯ４，２Ｘ　ｔｏ−”ＭのＥＤＴＡ（Ｍｅｒｃｋ８４ ０９）中の４１７ｄの、溶液を用いて２０ｍｇのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシドを添加する。

３７℃でＸ時間インキュベートする。

４１４ｎｍでの光学密度を読取る。

実施例３：ヒト臨床観察 細胞抽出物中の極めて少量（全タンパク質ｌｌｌ１ｙ当たり０．５ｎｙ）の絨毛 を検出し得る感度をもつ後述のＥＬＩＳＡ試験を使用して血清中の絨毛の定量可 能な量を検出するための測定を行なった。即ち、絨毛は、消化管の健常細胞及び 腫瘍細胞によって発現される細胞内タンパク質なので、ある種の病理的及び生理 的状態では絨毛を含む細胞の壊死によって絨毛が血管系に遊離されることが判明 した。

供血集団（ｎ＝　１９０）に関する検査によれば、大多数の血清（ｎ＝　１６８ ）中で絨毛が検出されないことが判明した。しかし乍ら、少数の個体（ｎ＝　１ ５）には検出可能量の絨毛（５〜ｔｏｎｇ／ｍｆｌ）が存在した。この値を病理 徴候でない絨毛のレベルと考えてよい。最後に、幾つかの個体（ｎ＝　７）では 基底値より高いレベルの絨毛（５０〜１００ｎｌＦ／ｍｆりが存在した。所網「 健常」なこれら個体（３，６％）に対しては消化管の付加的臨床検査（ファイバ ースコープ、コロノスコープ）を行なわなかった。

・種々の胃腸病理に関して得られた結果を以下の表にまとめる。

患者の血清中に検出可能量の絨毛が検出される疾患：消化管の悪性病理ニ ー結腸癌 一胃癌 一絨毛腫 −Ｃｒｏｈｎ病 一出血性直腸結腸炎 一十二指腸球潰瘍、胃潰瘍、食道潰瘍 注目すべきは消化器官の多腺腫（ポリープ）は逆にこのタンパク質を血液中に遊 離しないことである。

この検査から更に幾つかの結論が得られる。

１／血液中の絨毛の量と腫瘍の大きさ又はその進行期には相関関係がないと考え てよい。

２Ｘ手術後の追跡のためにこのタンパク質を゛測定すると完全摘除後、には血清 中の率が低下する。これに反して、腫瘍細胞が残存すると（不完全摘除、再発、 転移）絨毛レベルは維持されるか又は増加する。

この研究により、絨毛が健常被検者の血清中では通常検出されないが、悪性病理 （結腸癌又は腎臓癌）に侵された患者又は消化粘膜の炎症性又は壊死性突起を生 じる消化管の良性潰瘍（Ｃｒｏｈｎ病、ＲＣＩｌ病、潰瘍）がみられる患者では 絨毛を定量できることが判明した。

血液中の絨毛の定量はまた、良性疾患（消化管の潰瘍及た。他方、血液中の絨毛 を追跡するためには、本発明の抗体と共に癌の進行監視のために現在使用されて いるＡＣＥ（未分化発癌抗原）の如き別の腫瘍ラベルを使用することも可能であ る。これら現行の腫瘍ラベルは、ｌ／侵された器官に特異的でない、２Ｘ種々の 良性病理中に観察される、という欠点をもつ。

ヒト結腸腺癌由来の細胞系ＨＴ２９からｍＲＮＡを調製する。

ＩＪｌｌｒｉｃｈ等による塩化グアニジウム法、５ｃｉｅｎｃｅ、　１９７７． １９６゜１３１３−１３１９、によってＲＮＡを抽出する。Ａｖｉｖ及び１ｅｄ ｅｒによるオリゴｄＴ−セルロースカラムクロマトグラフィー法、Ｐｒｏｃ。

ポリＡ＋の精製を行なう。

によってｃＤＮＡの第１ストランドと第２ストランドとを調製する。Ｈｅ１ｆａ ＋ａｎｎ等の方法、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８ ３、ＢａｍＨＩを順次付加する。

約３０．Ｇｏｏの組換体クローンを含むｃＤＮ＾パンクを得る。

ベクター プラスミドｐＥＸ１−３（Ｓｔａｎｌｅｙ及びＬｕｚｉｏ、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎ ａｌ。

ターは、その発現がλバクテリオファージのプロモータＰＲのコントロール下に ある融合遺伝子ｅｒｏ−ＬａｃＺを含むプラスミドから誘導される。複数の非反 復制限部位を含むポリヌクレオチドを遺伝子ＬａｃＺの３′末端に挿入した。ま た、転写及び翻訳終了シグナルを３つの読取リフェーズに挿入した。

制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｆｆｉ　Ｉで消化したプラスミドＩＩＩＥＸの各々 にｃＤＮＡを挿入した。従ってこれらは全て遺伝子ＣｒｏＬａｃＺに対して同方 向に配向されている。

形質転換 ０、ＲａｆｂａｕｄによってＮＵｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈに記 載のごとく構築された大腸菌ｐｏｐ２１３５株を細菌株として使用する。

以下の式によって操作し、対立遺伝子Ｃｌ８５７とプロモータＰＲとを含むλフ ァージの２．３ｋｂの■ｌ■断片をポリリンカーのＢａｎＨｒ部位にクローニン グする。

叫■　囮旦、Ｐｇ　Ｂｇｊｌｌ 二のように得られたＥｃｏＲＩ断片を、ｐＯＭ４１のＥｃｏＲＩ部位にクローニ ングし、菌株Ｃ６００の染色体に転移する（Ｇｅｎｅ、里、２３１−２４１）。

る。大腸菌ｐｏｐ２１３５が、配向４匹り困、ＰＨ１旺で得られる。

大腸菌ｐｏｐ２１３５を組換体プラスミドで形質転換するためには、Ｉ’！ａｎ ａｈａｎ等のルビジウムを使用する技術ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．．１９８３．１ ６６．５５７−５８０、を使用する。この−株はｃｒｏのリプレッサーの対立遺 伝子ｃ［ｔｓ８５７を含む。

得られた組換体の数は１０５〜１０’ｎｇのｃＤＮＡのオーダである。

免疫検出によるクローンの選択 得られた組換体クローンをニトロセルロースフィルターに塗抹する。４２℃で２ 時間インキュベーション後にハイブリッドタンパク質の合成が誘発される。ＳＤ Ｓによる細菌の溶解及びメタノールの非存在下でのタンパク質の再生後に免疫ス クリーニングによってクローンを分析する。タンパク質の再生にはＢｕｒｎｅｔ ｔの技術、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９８１．１１２．１９５−２０３、 を用いる。

先ず、完全ブタ絨毛に対するポリクローナル抗体によってバンクをスクリーニン グする。次に、ニワトリの絨毛のＣｏｏｌ末端断片に対するポリ６クローナル抗 体と、分子のＣＯＯ１ｉ末端領域に位置するエピトープを認識する２種類のモノ クローナル抗体（ＢＤＤ、Ｃ，及び１ＩＤ３Ｈｓ）とを使用して二次スクリーニ ングを行なう。

クローンｐＥＸＺ−Ｖ１９は、５１０塩基対のインサートを含む。

コード部分は３３０の塩基対をもつ。この部分に続いて２００塩基対の非コード 領域が存在する。

クローニングされたｃＤＮＡはヒト絨毛のＣ０ＯＨ末端の９５個のアミノ酸をコ ードしており全タンパク質の約１／１０（分子量：国際調査報失 ”””””ｋ　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００１５（！“１“＾　”’　ＰＣＴ／ＦＲ ８６１００１５０ＡＮＮＩｉＪＣＴｏ　ＴＡＧ：　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ 　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴ！０ＮＡＬ　ＡＰＰｔＪＣ ＡτＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣτ／ｒＲ８６１００１５０（ＳＡ　１３０１９）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）腫瘍形質の疑いのある生物サンプル中で、最初に消化部で形成された腫瘍 細胞及び／又は該細胞の誘導体をｉｎｖｉｔｒｏ検出するために、該生物サンプ ルを絨毛に特異的アフィニティをもつ試薬と接触させることを特徴とする診断方 法。
2. （２）絨毛に特異的アフィニティをもつ試薬が抗絨毛抗体から構成され、これら 抗体がヒト絨毛を認識することを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. （３）以下の特性をもっこと、即ち −精製ブタ絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、−ニワトリ の絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、−ヒト結腸の腺癌Ｈ Ｔ２９に由来する系の細胞抽出物の絨毛を認識する（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ ｔｉｎｇ）、−免疫細胞化学的ラットの絨毛（ホルムアルデヒドに固定されたラ ットの腸粘膜の凍結切片（クリオスタット））を認識することを特徴とする絨毛 に対するモノクローナル抗体。
4. （４）Ｃ−末端配列（７７９−８５４）に含まれる抗原部位、即ち式【配列があ ります】 で示されるニワトリの絨毛の「ヘッド部」を認識することができ、前記ヘッド部 が単離されているか又はニワトリの絨毛に含まれた５１Ｋｄのペプチドの内部に 存在するかにかかわりなく該ヘッド部を認識し得ることを特徴とする請求の範囲 ３に記載のモノクローナル抗体。
5. （５）特に１９８５年４月２９日に受託番号Ｎｏ．１−４４０でＣＮＣＭに寄託 された請求の範囲３又は４に記載のモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ。
6. （６）ポリアクリルアミドゲル電気泳動試験で実質的に１っだけの分子量バンド を生じることを特徴とする生物学的に純粋なヒト絨毛。
7. （７）使用試薬がヒト絨毛をコードする遺伝子を認識する試薬であることを特徴 とする請求の範囲１に記載の方法。
8. （８）ヒト絨毛をコードする遺伝子を認識する試薬が、ヒト絨毛特にＣＯＯＨ末 端部のアミノ酸配列をコードする領域を含む配列をもつＤＮＡから構成されるこ とを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。
9. （９）ヒト絨毛の完全ｍＲＮＡに対応するか又はヒト絨毛のアミノ酸配列をコー ドする領域を含むヌクレオチド配列をもつＤＮＡ断片に対応しており、絨毛をコ ードするヌクレオチド配列と特異的にハイプリダイズし得ることを特徴とするＤ ＮＡ。
10. （１０）ヒト絨毛のＣＯＯＨ末端のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の少 なくとも一部を含み、ヌクレオチド鎖と対応アミノ酸の鎖とが夫々以下の配列： 【配列があります】 をもっことを特徴とするｃＤＮＡ断片。
11. （１１）請求の範囲４のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含み、必要な場合 にこの配列が放射性元素でラベルされているか又は検出すべきｍＲＮＡ又はＤＮ Ａを含む調製物とハイプリダイズした状態で認識されるべく別の物質によってラ ベルされていることを特徴とするヒト絨毛をコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの検 出用プローブ。
12. （１２）−公知技術を使用し絨毛を発現する細胞系から完全ｍＲＮＡ（メッセン ジャーＲＮＡ）を調製し、−ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）バンクを構築し、−イン サートによってコードされたタンパク質を発現し得るベクターにｃＤＮＡを挿入 し、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換し、次に細菌中で所望タン パク質を発現させ得る条件を設定し、−絨毛を認識し得る抗体を用いて絨毛の特 異的クローンを含む組換体クローンを選択することを特徴とするヒト絨毛の末端 をコードするヌクレオチド配列の合成方法。
13. （１３）ｃＤＮＡバンクの構築が、挿入ｃＤＮＡによってコードされたタンパク 質を発現し得るクローニングベクター、特にｐＥＸ型プラスミドによって行なわ れることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
14. （１４）ヒト絨毛の末端をコードするヌクレオチド配列を含む組換体ベクターに よって大膓菌、特に大腸菌ｐｏｐ２１３５型の細菌株を形質転換することを特徴 とする請求の範囲１２又は１３に記載の方法。
15. （１５）完全プタ絨毛に対するポリクローナル抗体の如き抗絨毛ポリクローナル 抗体と、分子のＣＯＯＨ末端領域に位置するエピトープを認識する１種頬以上の モノクローナル抗体とを順次用いてｃＤＮＡバンクをスクリーニングし、好まし くはポリクローナル抗体によるスクリーニング後に、別のポリクローナル抗体、 特にニワトリの絨毛のＣＯＯＨ末端断片に対するポリクローナル抗体を用いた第 ２スクリーニングを行なうことを特徴とする請求の範囲１２〜１４のいずれかに 記載の方法。
16. （１６）完全絨毛に対するポリクローナル抗体と、ニワトリの絨毛のＣＯＯＨ末 端ペプチドに対するポリクローナル抗体と、ＣＯＯＨ末端エビトープに対する２ 種頭のモノクローナル抗体とに対して特異的に反応することを特徴とするヒト絨 毛に対応するｃＤＮＡを担持するクローン。