JP2002241314A - メラノーマに対する腫瘍ワクチンとしてのｇｐ７５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】それが投与される被検体において、ｇｐ75に対
する抗体の産生を刺激もしくは増強するワクチンを提供
すること。 【解決手段】投与される被検体におけるｇｐ75に対する
免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンにおいて、両
端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1の約
２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のアミノ
酸配列をコ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌内の
前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴＣ
Ｃに寄託されている）に結合したベクターの複製に必須
のＤＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合した発現ベク
ターと、有効量のアジュバントと、調剤上許容し得る担
体とを含有するワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この出願は、1990年 3月22日に出願された
米国特許出願第497,431 号の一部継続出願であり、その
内容は参照として本出願に組み込まれる。

【０００２】この出願の全体を通して、種々の刊行物が
引用される。これら刊行物の開示は、本発明が関係する
技術の状態をより完全に記述するために、その全体が参
照としてこの出願に組み込まれる。

【０００３】

【発明の背景】ヒト癌細胞についての免疫原性決定因子
の分子的同定は、癌に対する免疫応答を理解するための
基礎を提供する。ヒトメラノーマ細胞に関しては、免疫
認識のためのターゲットとして、下記の二つのクラスの
抗原が注目されている。

【０００４】１）自系メラノーマ細胞によってのみ発現
する独特な抗原（Old,L.J.(1981),Cancer immunology:
The search for Specificity. G.H.A. Clowes Memorial
Lecture, Cancer Res. 41:361 ；Carey,T.E., T.Takah
ashi, L.A.Resnick, H.F.Oettgen, and L.J.Old.(197
6), Cell surface antigens of human malignant melan
oma. I. Mixed hemadsorption assay for humoral immu
nity to cultured autologous melanoma cells, Proc.N
atl.Acad.Sci.USA.73:3278 ；Real,F.X., M.J.Mattes,
A.N.Houghton, H.F.Oettgen, K.O.Lloyd, and L.J.Old.
(1984), Class 1(unique) antigens of human melanom
a: Identification of a 90,000 daltoncell surface g
lycoprotein by autologous antibody, J.Exp.Med 160:
1219)および ２）通常、メラノサイト系統の細胞によって発現する分
化抗原（Houghton,A.N., M.C.Taormina, H.Ikeda, T.Wa
tanabe, H.F.Oettgen, and L.J.Old.(1980), Serologic
al survey of normal humans for natural antibody to
cell surfaceantigens of melanoma, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA. 77:4260 ；Houghton,A.N., M.Eisinger, A.P.
Albino, J.G.Cairncross, and L.J.Old.(1982), Surfac
e antigens of melanocytes and melanoma: Markers of
melanocyte differentiation and melanoma subsets,
J.Exp.Med. 156:1755；Houghton,A.N., F.X.Real, L.J.
Davis, C.Cardon-Cardo, and L.J.Old.(1987), Phenoty
pic heterogeneity of melanoma: Relation to the dif
ferentiation program of melanoma cells, J.Exp.Med.
164:812 ）。メラノサイトの分化抗原は、メラノサイ
トが分化する間に発現する他の十分定義された表現型特
性（その最も特徴的なものはメラノソ−ム内でのメラニ
ン色素の合成である）に対するそれらの関係によって定
義されている（Houghton,A.N., M.Eisinger, A.P.Albin
o, J.G.Cairncross, and L.J.Old.(1982), Surface ant
igens of melanocytes and melanomas: Markers of mel
anocyte differentiation and melanoma subsets, J.Ex
p.Med. 156:1755；Houghton,A.N., F.X.Real, L.J.Davi
s, C.Cardon-Cardo, and L.J.Old.(1987), Phenotypic
hetetogeneity of melanoma: Relation to the differe
ntiation program ofmelanoma cells, J.Exp.Med. 164:
812 ）。

【０００５】臨床観察は、正常色素細胞によって発現す
る抗原に対する免疫応答が転移メラノ−マの進路に影響
を及ぼす可能性を示唆している。特に、メラノ−マを持
つ患者の皮膚発疹およびハイポピグメンテ−ションは良
好な予後と関連付けられている（Nordlund,J.J., J.M.K
irkwood, B.M.Forget, G.Milton, D.M.Albert, and A.
B.Lerner. (1983) Vitiligo in patients with metasta
tic melanoma: a goodprognosis sign, J.Am.Acad.Derm
atol. 9:689 ；Bystryn,J.C., D.Rigel, R.J.Friedman,
and A.Kopf. (1987) Prognostic significance of hyp
opigmentationin malignant melanoma, Arch.Dermatol.
123:1053）。これに関連して、メラノソ−ム抗原は免
疫系によって認識することが可能である。これは、転移
メラノ−マを持つ患者の血清ＩｇＧ抗体による自系メラ
ノ−マ細胞からのｇｐ75抗原の免疫沈降により示されて
いる（Mattes,J.M., T.M.Thomson, L.J.Old, and K.O.L
loyd. (1983) A pigmentation-associated, differenti
ation antigen of human melanoma defined by a preci
pitating antibody in human serum, J.Cancer. 32:71
7）。ｇｐ75抗原はメラノソ−ムのポリペプチドであっ
て、色素が形成されたメラノサイトおよびメラノ−マに
よって合成される最も多量に存在する糖タンパクである
（Tai,T., M.Eisinger, S.Ogata, and K.O.Lloyd. (198
3) Glycoproteins as differentiation markers in hum
an malignant melanoma and melanocytes, Cancer Res.
43:2773）。表皮メラノサイト、良性の色素形成病変、
並びに一次および転移メラノ−マはｇｐ75を発現する
が、他の細胞型は発現しない（Thomson,T.M., F.X.Rea
l, S.Murakami, C.Cardon-Cardo, L.J.Old, and A.N.Ho
ughton. (1988) Differentiation antigens of melanoc
ytes and melanoma: Analysisof melanosome and cell
surface markers of human pigmented cells with mono
clonal antibodies, J.Invest.Dermatol. 90:459）。こ
の発明においては、ｇｐ75ｃＤＮＡが、ｂ（褐色）遺伝
子座をマップするマウス遺伝子に由来するアミノ酸およ
びヌクレオチド配列と、ほぼ90％の同一性を有している
ことが示される。この褐色遺伝子座は、外皮の色を決定
し、合成されるメラニンの型に影響を及ぼす部位であ
り、ｇｐ75が合成されるメラニンの型を調整し、もしく
は影響を及ぼしていることが示唆される。

【０００６】転移メラノ−マを持つ患者の血清中のＩｇ
Ｇ抗体がｇｐ75を免疫沈降させることが見出されている
という事実は、ｇｐ75に対する免疫寛容を破壊すること
が可能であることを示している。したがって、この発明
は、メラノ−マに対するワクチンとして使用される、ｇ
ｐ75ｃＤＮＡを有する発現ベクターを提供する。このベ
クターにより、マウスモノクロ−ナル抗体ＴＡ99により
単離および精製されたｇｐ75ポリペプチドからペプチド
のアミノ酸配列が決定され、かつこのペプチド配列に基
づくオリゴヌクレオチドを用いるスクリ−ニングにより
ｃＤＮＡクロ−ンが単離された。

【０００７】

【発明の概要】この発明は、その配列がｇｐ75もしくは
それらの断片のアミノ酸配列をコ−ドする、単離核酸分
子を提供する。

【０００８】この発明は、さらに、ｇｐ75核酸分子の単
離ｃＤＮＡ分子、並びに図３に示すヌクレオチド配列を
有するｇｐ75核酸分子の断片の単離ｃＤＮＡ分子および
それらから誘導されるアミノ酸配列を提供する。

【０００９】この発明はまた、それが投与される被検体
において、ｇｐ75に対する抗体の産生を刺激または増強
するワクチンを提供する。

【００１０】この発明は、さらに、被検体におけるｇｐ
75に対する抗体の産生を刺激または増強する方法を提供
する。この方法は、抗体産生の刺激もしくは増強のため
に、この発明のワクチンの有効量を被検体に投与するこ
とを含む。

【００１１】この発明は、さらに、癌の再発を治療し、
予防し、または遅らせる方法を提供する。この方法は、
癌の再発の治療、予防または遅延のために、この発明の
ワクチンの有効量を被検体に投与することを含む。

【００１２】

【発明の詳細な記述】この発明は、その配列がｇｐ75ま
たはその断片をコ−ドする単離核酸分子を提供する。

【００１３】この発明は、さらに、その一態様におい
て、ｇｐ75の断片のアミノ酸配列が asn-thr-val-glu-g
ly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tyr-asp-pro-ala-val
であることを提供する。他の態様においては、アミノ酸
配列は、met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-ty
r-thr-tyr-glu である。さらに別の態様においては、ア
ミノ酸配列は、asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro
-asn-ser-val-phe-serである。

【００１４】この発明は、さらに、ｇｐ75核酸分子の単
離ｃＤＮＡ分子並びに図３に示すヌクレオチド配列を有
するｇｐ75核酸分子の断片の単離ｃＤＮＡ分子およびそ
れらに由来するアミノ酸配列を提供する。

【００１５】ＧＰ75Ｅ-1と称するE.coli株ＤＨ 5αが、
ＡＴＣＣ受入番号（Accession No.） とし
て、アメリカン・タイプ・カルチャ−・コレクション、
ロックヴィル、メリ−ランド、U.S.A. 20852に寄託され
ている。このＧＰ75Ｅ-1は、ｐｃｖＥｘと称するプラス
ミドベクターと全長 2.7ｋｂのＧＰ75ｃＤＮＡインサ−
ト（図４参照）とを含むｐＧＰ75Ｅ-1プラスミドを有す
る。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブタペスト条約（ブタペスト条約）の規約に
従ってなされた。

【００１６】全長 2.7ｋｂのｃＤＮＡを含むプラスミド
は、この分野で公知の方法（Maniatis,T., E.F.Frish,
and J.Sambrook, 1989, Molecular Cloning: A Laborat
oryManual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, NY 1.38-1.39,1.42-1.343 ）により、寄託
されたE.coliホスト株から回収することができる。この
プラスミドからの 2.7ｋｂのＧＰ75ｃＤＮＡの単離は、
この分野で公知の方法により、EcoRI を使用する制限エ
ンドヌクレア−ゼ消化を用いて行なうことができる。

【００１７】加えて、この発明は、ホストにおける発現
に適合したｇｐ75核酸分子もしくは断片のｃＤＮＡ分子
と結合したベクターの複製に必須のＤＮＡ配列を有する
発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、ワクチ
ニアウイルス、もしくは、好ましくはイムクロン（Imcl
one ）ベクターであってもよい。

【００１８】この発明はまた、それが投与される被検体
において、ｇｐ75に対する抗体の産生を刺激し、または
増強させるためのワクチンであって、ｃＤＮＡ分子を有
する発現ベクター、有効量のアジュバントおよび調薬上
許容し得る担体を含有するワクチンを提供する。好まし
くは、被検体は人間であり、ｇｐ75はアジュバントに結
合されている。アジュバントは微生物アジュバントであ
っても、または他のいかなる調薬上の試薬であってもよ
い。

【００１９】さらに、この発明は、それが投与される被
検体において、ｇｐ75に対する抗体の産生を刺激し、ま
たは増強させるためのワクチンを提供する。このワクチ
ンは、ｇｐ75ｌ核酸分子もしくは断片のｃＤＮＡ分子に
由来するアミノ酸配列または被検体における抗体産生を
刺激もしくは増強するに有効な量の精製ｇｐ75もしくは
その断片、有効量のアジュバント、および調薬上許容し
得る担体を含有してもよい。被検体は人間であり、ｇｐ
75はアジュバントに結合していることが好ましい。アジ
ュバントは、微生物アジュバントまたは他のいかなる調
薬上の試薬であってもよい。

【００２０】この発明はまた、被検体における、ｇｐ75
に対する抗体の産生を刺激または増強する方法を提供す
る。この方法は、抗体の産生を刺激もしくは増強するに
有効な投与量で、この発明のワクチンを被検体に投与す
ることを含む。

【００２１】この発明はさらに、癌を患う被検体におけ
る癌の治療方法を提供する。この方法は、癌の治療に有
効な投与量でこの発明のワクチンを被検体に投与するこ
とを含む。

【００２２】この発明は、さらに、癌を患う被検体にお
ける癌の予防方法を提供する。この方法は、癌の予防に
有効な投与量でこの発明のワクチンを被検体に投与する
ことを含む。この発明はまた、癌に感受性のある被検体
における癌の再発を遅らせる方法を提供する。この方法
は、癌の再発を遅らせるに有効な投与量でこの発明のワ
クチンを被検体に投与することを含む。

【００２３】癌の再発を治療し、予防し、かつ遅らせる
方法は、メラノ−マのような癌に対するものであっても
よい。このワクチンは、再発の危険が高い患者における
メラノ−マまたは一次メラノ−マのような癌の予防に有
用である。

【００２４】これらの方法において、ｇｐ75はアジュバ
ントに結合していてもよい。加えて、ワクチンを投与す
る前に被検体に有効量のシクロホスファミドを投与する
こともできる。

【００２５】この発明は、以下の実験詳述項において説
明される。これらの項はこの発明の理解を助けるために
示されるものであり、以下の請求の範囲に示されるよう
に、いかなる意味でもこの発明を限定することを意図す
るものではなく、限定すると解釈されるものでもない。

【００２６】

【実施例】実験 １ 材料および方法組織培養 メラノ−マ細胞株 SK-MEL-19を、ウシ胎児血清（FCS ）
が SerumPlus 10％ (v/v)（Hazelton Research Produc
ts Inc., Lenexa, KS ）に置き換えられたことを除い
て、 1％非必須アミノ酸およびペニシリンおよびストレ
プトマイシンを加えた MEMで増殖させた。

【００２７】ｇｐ75の単離および精製 20ｍＭ Tris／HCl 、ｐＨ 7.5、 5ｍＭ MgCl2 、 2ｍ
Ｍ PMSFにおいて細胞をホモジネ−トし、 100,000×ｇ
で遠心分離することにより、メラノ−マ細胞株SK-MEL-1
9から後核膜分画（post-nuclear membrane fraction）
を単離した。この膜を20ｍＭ Tris／HCl 、ｐＨ 7.5、
3Ｍ KCl および 5ｍＭ EDTAにおいて可溶化し、 10
0,000×ｇで遠心分離した。不溶タンパク分画を、20ｍ
Ｍ Tris／HCl ｐＨ 7.5、 0.5％デオキシコ−ル酸ナ
トリウムに再懸濁した。デタ−ジェント可溶タンパク
を、 100,000×ｇで遠心分離することにより集めた。こ
の上清を、20ｍＭ Tris／HCl 、ｐＨ 7.5、0.15Ｍ Na
Clおよび 2ｍＭ CHAPS に対して透析し、20ｍＭ Tris
／HCl 、ｐＨ 7.5、0.15Ｍ NaClおよび 2ｍＭ（3-
［（3-コラミドプロピル）ジメチル- アンモニオ］1-プ
ロパンスルホネ−ト（CHAPS）（緩衝液Ａ）で平衡化し
た Mono Q （HR 5/5、 Pharmacia LKB BiotechnologyIn
c. Piscataway, NJ）カラムにかけた。緩衝液Ａ中の 0-
1.0Ｍ NaCl直線勾配で結合タンパクを溶出させた。分
画は、競合阻害アッセイによりｇｐ75について検定を行
なった。ｇｐ75を含有する分画をプ−ルし、Con A カラ
ム緩衝液（ 1ｍＭ CaCl1 、 1ｍＭ MnCl2 および 2ｍ
Ｍ PMSFを含有する、10ｍＭ Tris／HCl 、ｐＨ 7.5）
に対して透析して Con A- セファロ−スカラムにかけ
た。カラム緩衝液で洗浄することにより、非結合タンパ
クを除去した。Con A に結合したタンパク質は、Con A
カラム緩衝液中の0.25Ｍ α- Ｄ- メチルマンノピラノ
シドを用いて Con Aに結合したタンパク質を溶出させ
た。ｇｐ75を含有する分画をプ−ルして、10ｍＭ Tris
／HCl 、ｐＨ 7.5、 2ｍＭ CHAPS および 2ｍＭ PMSF
（CB）に対して透析し、マウスモノクロ−ナル抗体（ m
Ab）TA99（Thomson,T.M., J.M.Mattes, L.Roux, L.J.Ol
d, and K.O.Lloyd (1985) Pigmentation-associated gl
ycoprotein of human melanoma and melanocytes: Defi
nition with a mouse monoclonal antibody, J.Invest.
Dermatol. 85:169） Affi-Gel 10 アフィニティカラム
にかけた。このゲルを、各々 6ｍｌのCB、CB＋ 1Ｍ Na
Cl、CB、およびCB＋ 2ｍＭ CHAPS で逐次的に洗浄し
た。結合ｇｐ75を 2ｍＭ CHAPS を含有する 0.1Ｍグリ
シン-HCl、ｐＨ 3.1でカラムから溶出させた。

【００２８】ｇｐ75の競合阻害アッセイ 精製の間、 300ｎｇ／ｍｌ mAb TA99 のメタノ−ル：ア
セトン（ 1:1 vol／vol ）に固定された SK-MEL-19細胞
への結合を阻害する分画の能力を酵素免疫検定（ELISA
）によって測定することにより、ｇｐ75をモニタ−
し、定量した（Houghton,A.N., H.Brooks, R.J.Cote,
M.C.Taormina, H.F.Oettgen and L.J.Old. (1983) Dete
ction of cell surface and intracellular antigens b
y human monoclonal antibodies: hybrid cells derive
d from lymphocytes of patients withmalignant melan
oma, J.Exp.Med. 158:53）。

【００２９】免疫沈降、ゲル電気泳動およびペプチドマ
ッピング クロラミンＴ法による SK-MEL-19の Con A -セファロ−
ス結合タンパク分画のヨウ素化、並びに mAb TA99 およ
び AU 血清を用いる免疫沈降を記述の通りに行なった
（Mattes,J.M., T.M.Thomson, L.J.Old, and K.O.Lloy
d. (1983) A pigmentation-associated, differentiati
on antigen of human melanoma defined bya precipita
ting antibody in human serum, Int.J.Cancer. 32:71
7）。タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS-PAGE）により解析した（Laemmli, U.K. (197
0) Cleavage of structural proteins during assembly
of ofthe head of bacteriophage T4, Nature. 227:68
0）。エンドグリコシダ−ゼＨ（エンドＨ）消化のため
に、免疫沈降物を 0.4％ SDSに懸濁させ、 100℃で 5分
間加熱し、 1ｍＵのエンドＨを用いて、 100ｍＭクエン
酸緩衝液、ｐＨ 5.5中において37℃で16時間消化した。
オファ−レルに従い、アンフォリン（ampholines）ｐＨ
5-7（LKB-Produkter, Bromma, Sweden ）を用いる二次
元電気泳動を行なった（O'Farrel,P.H. (1975) High re
solution two-dimensional electrophoresis of protei
ns, J.Biol.Chem. 250:4007 ）。免疫沈降したｇｐ75の
ペプチドマッピングは、Cleveland ら（Cleveland,D.
W., S.G.Fischer, M.W.Kirschner, and U.K.Laemmli.
(1977) Peptide mapping by limited proteolysis in s
odium dodecyl sulfate and analysis by gel electrop
horesis. J.Biol.Chem. 252:1102 ）に従い、SDS-PAGE
において、スタフィロコッカス・オウレウス（Staphylo
coccus aureus）Ｖ8 プロテア−ゼ（Ｖ8 プロテア−
ゼ）（Boehringer MannheimBiochemicals. Indianapoli
s, IN）を用いる制限タンパク分解により行なった。

【００３０】ペプチド配列決定 ペプチド配列決定は、ハ−バ−ド大学マイクロケミスト
リ−施設で行なった。ニトロセルロ−ス上にエレクトロ
ブロットした（electroblotted）精製ｇｐ75（12μｇ）
を、Aebersold （Aebersold,R.H., J.Leavitt, R.A.Saa
vedra, and L.E.Hood. (1987) Internal amino acid se
quence analysis of proteins separated by one- or t
wo- dimensional gel electrophoresis after in situ
protease digestion on nitrocellulose, Proc.Natl.A
cad.Sci.USA. 84:6970）に従い、Ｖ8 プロテア−ゼ（
1:20 W/W ）で消化し、得られたペプチドを Brownlee
ＲＰ-300 2.1 ×100 ｍｍ Ｃ8 カラムで38℃で分離し
た。Ｖ8 プロテア−ゼ消化物からの幾つかのピ−クをプ
−ルし、乾燥した。50μLの 8Ｍ尿素／ 0.4Ｍ重炭酸ア
ンモニウム緩衝液、ｐＨ 8.0、 5μLの 100ｍＭジチオ
トレイト−ルを添加し、50℃で15分間加熱することによ
り、完全還元およびアルキル化を行なった。その後、試
料を45ｍＭヨ−ド酢酸 5ｍLと共に室温で15分間インキ
ュベ−トし、蒸留水 140μLで希釈した。さらに、還元
かつアルキル化されたペプチド分画をトリプシン（1:25
W/W）を用いて37℃で一晩消化した。配列決定しようと
する分画をポリブレン・プレサイクルド（precycled ）
・ガラスファイバ−フィルタ−に直接適用し、ＡＢＩ 4
77Ａプロテイン・シ−ケンサ−で配列決定した。アミノ
酸は、ＡＢＩ 120ＡオンラインＨＰＬＣを用いて分離し
た。各ペプチドについて、最低20サイクル行なった。ル
−チンの実験室条件の下でのＨＰＬＣの反復収率は93％
であった。最も信頼性の高い結果を有するペプチドのア
ミノ酸配列のみを報告する。

【００３１】ｇｐ75ｃＤＮＡのクロ−ニングおよび配列
決定 メラノ−マ細胞株 SK-MEL-19からｃＤＮＡライブラリ−
を構築した。前に記述された方法（Bouchard,B., B.Ful
ler, S.Vijayasaradhi, and A.N.Houghton. (1989) Ind
uction of pigmentation in mouse fibroblasts by exp
ression of human tyrosinase, J.Exp.Med. 169:2029）
に従って、ｇｐ75ｃＤＮＡクロ−ンの単離にオリゴヌク
レオチドプロ−ブを用いた。このオリゴヌクレオチドプ
ロ−ブの配列は、 5' CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC 3' であった。ＧＰ75-1と称する 2.0ｋｂのｃＤＮＡクロ−
ンの配列決定を行なった（Stratagene Cloning System
s, La Jolla, CA）。ＧＰ75-1のヌクレオチド配列は、
受入番号 X 51455として EMBL デ−タバンクに寄託され
ている（図３参照）。

【００３２】結果および考察 マウス mAb TA99 およびメラノ−マ患者 AU からの血清
はいずれも 75 kDa の抗原を免疫沈降させ、かつ mAb T
A99 は AU 血清によって沈殿するｇｐ75抗原を予め一掃
する（preclear）（Thomson,T.M., J.M.Mattes, L.Rou
x, L.J.Old, andK.O.Lloyd (1985) Pigmentation-assoc
iated glycoprotein of human melanomaand melanocyte
s: Definition with a mouse monoclonal antibody, J.
Invest.Dermatol. 85:169）。mAb TA99はメラノ−マ細
胞株 SK-MEL-19からｇｐ75を精製するために用いられた
ので、mAb TA99が AU 血清に認識されるｇｐ75抗原のみ
を検出したことを確かめることが重要である。以前の研
究において、我々は、mAbTA99はヒトチロシナ−ゼ、同
様に色素形成されたメラノサイト中に発現する75-80 kD
a の糖タンパク質と反応しないことを示した（Bouchar
d,B., B.Fuller, S.Vijayasaradhi, and A.N.Houghton.
(1989) Induction of pigmentation in mouse fibrobl
asts by expression of human tyrosinase, J.Exp.Med.
169:2029）。しかしながら、これらの実験からは、mAb
TA99が SK-MEL-19によって発現する他のポリペプチド
と交差反応する可能性を除外することはできなかった。

【００３３】mAb TA99および AU 血清抗体によって免疫
沈降したタンパク質を、一次元および二次元 SDS-PAGE
およびＳ．オウレウスＶ8 プロテア−ゼを用いる制限タ
ンパク分解を利用するペプチドマップにより解析した。
mAb TA99および AU 血清抗体の両者により沈殿したタン
パク質は、同一の分子量（75 kDa）、同一等電点（isoe
lectric point ： 5.5-5.9）、およびペプチド組成（図
１）を有しており、 TA99 および AU 血清は同一のｇｐ
75分子を認識することが確認された。

【００３４】ｇｐ75抗原は、材料および方法に記載され
た通りに精製した。アフィニティ−精製したｇｐ75をペ
プチド配列決定に利用した。Ｖ8 プロテア−ゼおよびト
リプシンを用いる精製ｇｐ75のタンパク分解開裂によ
り、３種の内部ペプチドのアミノ酸配列が得られた。こ
の３種のペプチドの配列を図２に示す。Shibahara らに
よって単離されたマウスｃＤＮＡクロ−ン、ｐＭＴ4 、
から推定されるアミノ酸配列と90％一致した（ｐＭＴ4
のアミノ酸位置 247-260、 333-349、および 428-441）
（Shibahara,S., Y.Tomita, T.Sakakura, C.Nagar, B.C
haudhuri, and R.Muller. (1986) Cloning and express
ion of cDNA encoding mouse tyrosinase,Nucleic Acid
Res. 14:2413）。オリゴヌクレオチドプロ−ブはｇｐ7
5のペプチド配列から誘導され、ヒトメラノ−マ細胞株
SK-MEL-19から構築されたｃＤＮＡライブラリ−のスク
リ−ニングに用いられた。２種のｃＤＮＡクロ−ン（
1.8および 2.0ｋｂ）が、SK-MEL-19 のｃＤＮＡライブ
ラリ−から単離された。ｃＤＮＡクロ−ン（ＧＰ75-1お
よび-2）の部分的なヌクレオチド配列（その１つは図３
に示されている）は、ｐＭＴ4 と（オ−プン・リ−ディ
ング・フレ−ム内のヌクレオチド 649-1437 の間で）8
8.6％の同一性を示した。ＧＰ75-1および-2の推定アミ
ノ酸配列は、ｐＭＴ4 の推定アミン酸配列と、アミノ酸
残基 219-467の間で93.6％の同一性を示した。ｇｐ75の
ｃＤＮＡ配列とヒトチロシナ−ゼとは、チロシナ−ゼの
ヌクレオチド 618-1344 の間で、55.3％の同一性があっ
た（Bouchard,B., B.Fuller, S.Vijayasaradhi, and A.
N.Houghton. (1989) Induction of pigmentation in mo
use fibroblasts by expression of human tyrosinase,
J.Exp.Med. 169:2029）。 ヒトｇｐ75とマウスｐＭＴ
4 遺伝子の推定正生物との緊密な相同製は、ｇｐ75の可
能な構造および機能にいく筋かの光を当てる。ｐＭＴ4
クロ−ンはマウスメラノサイトから単離された（Shibah
ara,S., Y.Tomita, T.Sakakura, C.Nagar, B.Chaudhur
i, and R.Muller. (1986) Cloning and expression of
cDNA encodingmouse tyrosinase, Nucleic Acid Res. 1
4:2413）。元来、ｐＭＴ4 ｃＤＮＡは、マウスｃ（アル
ビノ）遺伝子座にマップされるマウスチロシナ−ゼをコ
−ドすると考えられていた。しかしながら、さらなる研
究は、ｐＭＴ4 がマウスチロシナ−ゼから区別されるこ
とを示した（Yamamoto,H., S.Takeuchi, T.Kudo, K.Mak
ino, A.Nakata, T.Shinoda, and T.Takeuchi. (1987) C
loning and sequencingof mouse tyrosinase cDNA, Jp
n.J.Genetics. 62:271；Muller,G., S.Ruppert,E.Schim
d, and G.Schutz (1988) Functional analysis of alte
rnatively spliced tyrosinase gene3 transcripts, EM
BO (Eur.Mol.Biol.Organ.J.) 7:2723；Jackson,I., (19
88) A cDNA encoding tyrosinase-related protein map
s to thebrown locus in mice, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A. 85:4392）。同様に、ｇｐ75とヒトチロシナ−ゼの推
定アミノ酸配列とは（アミノ酸残基 208-459の間で）制
限された同一性（43.1％）があるにもかかわらず、ｇｐ
75の配列はヒトチロシナ−ゼの配列とは区別される。ｇ
ｐ75およびｐＭＴ4 生成物の機能は、マウスにおいてｐ
ＭＴ4 が、外皮の色を調節する領域（Silvers,W.K., (1
979) Comparative genetics of coat colour in mammal
s, In: The Coat Colors in Mice, SpringerVerlag, Ne
w York. 1）であるｂ（褐色）遺伝子座にマップされる
という発見（Jackson,I.J. (1988) A cDNA encoding ty
rosinase-related protein maps to the brown locus i
n mice Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 85:4392）により示唆
される。ｇｐ75とｐＭＴ4 の推定アミノ酸配列との相同
性は、マウス褐色遺伝子座遺伝子生成物のヒト類似体の
正式な同定を可能にする。メラノソ−ムへの偏在および
チロシナ−ゼとの構造的な類似性に基づくと、ｇｐ75分
子はメラニン合成を調節し、合成されるメラニンの型を
決定している可能性がある。

【００３５】メラノソ−ム決定因子および他の細胞内抗
原が、メラノ−マの免疫治療の潜在的な標的ではないこ
とは認識されている。しかしながら、最近、抗原保有細
胞（antigen-presenting cells）によって細胞内タンパ
ク質が処理され、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対する
ペプチドとして存在し得ることが明らかとなってきた
（Townsend,A.R.M., and H.Bodmer. (1989) Antigen re
cognition by class I-restricted T lymphocytes, An
n.Rev.Immunol. 7:601 ）。この発見は、メラノ−マに
対するＴ細胞応答が腫瘍細胞内で発現する分子に向けら
れ得るという理論的な可能性を開くものである。もしく
は、その代わりに、通常成熟する間にメラノサイトの外
部に移送されるメラノソ−ムの成分が腫瘍細胞周囲の細
胞外空間に集積し、または局在的な組織壊死が細胞内生
成物の放出および堆積を誘導する可能性がある。ｇｐ75
の近付き易さに対する支援においては、nu／nuマウス中
のヒトメラノ−マ異種移植片に放射性標識 TA99 mAb が
特異的に局在し、これは腫瘍部位内における抗体に対す
る抗原の有用性を示している（Welt,S., J.M.Mattes,
R.Grando, T.M.Thomson, R.W.Leonard, P.B.Zanzonico,
R.E.Bigler, S.Yeh, H.F.Oettgen, and L.J.Old. (198
7) Monoclonal antibody to an intracellular antigen
images human melanoma transplants in nu/nu mice,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 84:4200）。

【００３６】メラノ−マ患者ＡＵにおけるＩｇＧ抗体
は、メラノ−マ細胞および正常メラノサイトによって共
有されるｇｐ75上の決定因子を認識した（Mattes,J.M.,
T.M.Thomson, L.J.Old, and K.O.Lloyd. (1983) A pig
mentation-associated, differentiation antigen of h
uman melanoma defined by a precipitating antibodyi
n human serum, Int.J.Cancer. 32:717）。ｇｐ75をコ
−ドするｃＤＮＡの単離に伴い、ｇｐ75に対する能動免
疫の戦略の研究が可能であるべきである。ｇｐ75に対す
るＣＴＬ応答を有効に誘導するためには、少なくとも２
つの要求が存在する：１）ｇｐ75に対する免疫寛容が破
壊され、２）主要組織適合抗原により、メラノ−マ細胞
上でｇｐ75ペプチドが処理されて有効に存在しなければ
ならない。または、その代わりに、メラノサイトの分化
抗原がユニ−ク決定因子を担持することも可能である。
正常メラノサイトによって発現される生成物をコ−ドす
る遺伝子は、悪性変換の間に変異し、もしくは再編成さ
れ、ＣＴＬおよび抗体による認識のための新規エピト−
プを生じることもある。これに関連して、ヒトメラノ−
マ細胞に対する最も特徴付けられたユニ−ク抗原は、培
養メラノサイトおよびメラノ−マ細胞上に発現する 95-
97ｋＤａの糖タンパクである、メラノトランスフェリン
に対する決定因子である（Real,F.X., M.J.Mattes, A.
N.Houghton, H.F.Oettgen, K.O.Lloyd, and L.J.Old.
(1984) Class 1 (unique) antigens of human melanom
a. Identification of a a 90,000 dalton cell surfac
e glycoprotein by autologous antibody, J.Exp.Med.
160:1219 ；Furakawa,K.S., K.Furakawa, F.X.Real, L.
J.Old, and K.O.Lloyd. (1989) A unique antigenic ep
itopeof human melanoma is carried on the common me
lanoma glycoprotein gp75/p97, J.Exp.Med. 169:58
5）。この可能性の支持においては、ヒトメラノ−マ細
胞のゲノムを通して、遺伝的な抗体が高頻度で広く検出
されている（Dracopoli,N.C., A.N.Houghton, and L.J.
Old. (1985) Loss of polymorphic restriction fragme
nts in malignant melanoma: Implicarions for tumor
heterogeneity, Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 82:1470； D
racopoli,N.C., B.Alhadeff, A.N.Houghton,and L.J.Ol
d. (1987) Loss of heterozygosity at autosomal and
x-linked loci during tumor progression in a patien
t with melanoma, Cancer Res. 47:3995 ）。

【００３７】実験 ２ 材料および方法λファ−ジにおける 2.7ｋｂのＧＰ75ｃＤＮＡの単離 実験１において記述した 2.0 kDaの GP75 cDNA（その配
列は図３参照）をゲノムライブラリ−のスクリ−ニング
に用いた。 GP75 遺伝子を有するゲノムクロ−ンを得
た。

【００３８】ｃＤＮＡライブラリ−の構築およびスクリ
−ニング ヒト・メラニン性メラノ−マ細胞株 SK-MEL-19（Hought
on,A.N., M.Eisinger,A.P.Albino, J.G.Cairncross, an
d L.J.Old. 1982. Surface antigens of melanocytes a
nd melanoma: markers of melanocyte differentiation
and melanomasubsets. J.Exp.Med. 156:1755 ）から調
製したポリ（Ａ）＋選択された mRNA（Maniatis,T., E.
F.Frish, and J.Sambrook. 1982. Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NY. 545pp） 3μｇから cDNA
ライブラリ−を構築した。クレノウ酵素を用いて鈍端
（blunt ended ）とし、Eco RIリンカ− （New Englan
d Biolabs,Inc., Beverly,MA ）を繋げた完全な長さの
cDNA を合成した（Gubler,U., and B.J.Hoffman.1983.
A simple and very efficient method of generating c
DNA libraries. Gene (Amst.). 25:263 ）。次いで、こ
の cDNA をウルトロゲル・アカ34（Ultrogel Aca 34 ）
（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ）でサイ
ズ分画した（Watson,C.J., and J.F.Jackson. 1985. Co
nstructing and screening cDNA libraries in λgt 10
and λgt 11. In DNA Cloning: A Practical Approac
h. D.M.Glover, editor. IRL Press Limited, Oxford.
79-100 ）。 cDNA 分子＞ 800bp を、λファ−ジベクタ
ー gt10 における 3×105 組換え体からなるライブラリ
−の構築に用いた（Huynh,T.V., R.A.Young, and R.W.D
avis. 1985. An alternative procedure for the synth
esis of double stranded cDNA for cloning in phage
and plasmid vector. In DNA Cloning: A Practical Ap
proach. D.M.Glover, editor. IRL Press Limited, Oxf
ord. 49-78）。

【００３９】スクリ−ニングには、上で得られたゲノム
クロ−ンの5'末端コ−ディング領域に基づくフラグメン
トを用いた。λファ−ジ中に 2.7 kb の cDNA が得られ
た。（Bouchard,B., B.Fuller, S.Vijayasaradhi, and
A.N.Houghton. (1989) Induction of pigmentation in
mouse fibroblasts by expression of human tyrosinas
e, J.Exp.Med. 169:2029）2.7 kb ｃＤＮＡの回収 2.7 kb cDNA GP75 インサ−トに対する、Eco RIを用い
る制限エンドヌクレア−ゼ消化を行なった。DNA はフェ
ノ−ル・クロロホルムを用いる抽出およびエタノ−ル沈
殿により精製した。この DNAを 100μｇ／ｍLの TE
（ｐＨ 7.6）に再溶解した。以下の方法により、粘着末
端のライゲ−ションを行なった。以下のライゲ−ション
混合物を用意した。１） pcvExベクター DNA 0.1μｇを
無菌マイクロフュ−ジ（microfuge ）管に移した。等モ
ル量の 2.7 kb GP75 cDNA を添加した。２） H2 O を
7.5μLまで加え、この溶液を45℃で 5分間加温して再ア
ニ−ルしている粘着末端を溶融した。この混合物を 0℃
に冷却した。３）その後、10×バクテリオファ−ジ T4
DNA リガ−ゼ緩衝液（ 200ｍＭ Tris Cl（ｐＨ 7.6）、
50ｍＭ MgCl2 、50ｍＭジチオトレイト−ル、 500μｇ
／ｍLウシ結成アルブミン（Fraction V； Sihma）、 0.
1ワイス（Weiss ）単位のバクテリオファ−ジT4 DNA リ
ガ−ゼ、および 5ｍＭ ATP 1 μL）を加えた。この反
応体を、16℃で 1-4時間インキュベ−トした。プラスミ
ドベクター pcvExおよび 2.7 kb GP75cDNA インサ−ト
を有し、図４に示されるプラスミド pGP75 E-1が得られ
た。

【００４０】有用なＥ．ｃｏｌｉの作製 各ライゲ−ション反応体の 1-2μLを、以下の方法によ
る有用 E.coliの形質転換に用いた。まず、新鮮なオ−
バ−ナイト・プレ−トからの単一コロニ−をＬＢ 5ｍL
に接種した。その後、撹拌機中で 5-7時間細胞を増殖さ
せた。次に、 4Lフラスコ内で、ＬＢ 1Lに上記 4ｍLを
接種した。O.D.550 ＝0.15となるまで増殖させた。 3Ｋ
で10分間スピンダウン （spin down ）させ、 0℃で 1
00ｍＭ CaCl2 400ｍLに再懸濁した。その後、 3Ｋで1
0分間再びスピンダウンさせ、 0℃で 100ｍＭ CaCl2 1
0ｍLに再懸濁した。80％グリセロ−ル 2.5ｍLを添加し
た。

【００４１】ＤＨ 5α Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換 GP75 E-1プラスミド 1-20 μLを有用な細胞 100μLに添
加した。これを氷上に20分間保持した。その後、42℃で
1分間熱衝撃を与えた後、氷に10分間戻した。この細胞
をマイクロフュ−ジで10秒間回転させ、ＬＢ 200μLに
再懸濁した。これを撹拌機上において37℃で45分間イン
キュベ−トした。 得られた、pGP75 E-1 プラスミドを
有する E.coliは、ＡＴＣＣに寄託した。

【００４２】実験 ３ 材料および方法試薬 L-［リング-3,5- 3H ］チロシン（比活性46.7Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）をＩＣＮ（Irvine, CA）より入手した。コンカ
ナバリンＡ- セファロ−スおよびプロテインＡ・セファ
ロ−スＣＬ 4Ｂは Pharmacia（Piscataway, NJ）製であ
る。アフィゲル-10 は Bio-Rad（Richmond, CA）製であ
る。全ての電気泳動用化学薬品はＢＲＬ（Gaithersbur
g, CA）製である。デオキシコ−ル酸（ナトリウム
塩）、ノニデット（Nonidet ）Ｐ-40 、（3-［（3-コラ
ミドプロピル）ジメチル- アミノ］ 1-プロパンスルホ
ネ−ト（CHAPS ）、フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド（PMSF）およびα-D- メチルマンノピラノシド、アル
カリホスフェ−ト結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、アルカリホ
スファタ−ゼ発色試薬および他の試薬グレ−ドの化学薬
品はシグマ（St.Louis, MO）製である。ＨＰＬＣグレ−
ドの水および他の試薬グレ−ドの有機溶媒はフィッシャ
−（Fisher）（Pittsburgh, PA）製である。マウスＭＡ
ｂｓ ＴＡ99（ＩｇＧ2A）およびＦ23（ＩｇＧ2a）は、
プロテインＡ・セファロ−スを用いて精製した。ＴＡ99
ＭＡｂは抗ｇｐ75抗体であり（Thomson,T.M., Matte
s,J.M., Roux,L., Old,L.J. and Lloyd,K.O., Pigmenta
tion-associated glycoprotein of human melanoma and
melanocytes: definition with a mouse monoclonal a
ntibody, J.invest.Dermat., 85, 169-174, 1985 ）、
コントロ−ル抗体として用いられるＭＡｂ Ｆ23は、ヒ
トメラノサイト細胞とは反応しない抗ヒト結腸カルシノ
−マ抗体である。

【００４３】組織培養 メラノ−マ細胞株 SK-MEL-19を、Vijayasaradhi,S., Bo
uchard,B.B. and Houghton,A.N., The melanoma antige
n gp75 is the human homologue of mouse b (brown) l
ocus gene, J.exp.Med., 171, 1375-1380 (1990)に記述
されているように、10％セ−ラム・プラス（Serum Plu
s）（Hazelton, Lenexa, KS）を補ったＭＥＭにおいて
増殖および継代した。

【００４４】ｇｐ75の単離および精製 ｇｐ75の精製の全ての手続きは、他に特定されていない
限りは 0-5℃で行なった。半融合 SK-MEL-19メラノ−マ
細胞を、ラバ−ポリスマンで掻き取ることにより 150ｃ
ｍ2 フラスコから収穫し、組織培養培地に集めて遠心分
離した後、細胞（60ｇペレット）をＰＢＳで洗浄した。
この細胞を、 300ｍLの20ｍＭ Tris/HCl 、ｐＨ 7.5、
5ｍＭ MgCl2 、 2ｍＭ PMSF に10分間懸濁させ、ドウ
ンス（Dounce）ホモジナイザ−でホモジナイズした。細
胞溶解を位相差顕微鏡法により監視した。ホモジネ−ト
を 1,000ｇで10分間遠心分離した後、上清を集めて 10,
000 ｇで30分間遠心分離した。粗精製膜ペレットを、50
ｍLの20ｍＭ Tris/HCl、ｐＨ 7.5、 3Ｍ KClおよび 5ｍ
Ｍ EDTA に懸濁し、ドウンス・ホモジナイザ−内で穏や
かにホモジナイズし、 100,000ｇで90分間遠心分離し
た。このペレットを、30ｍLの20ｍＭ Tris/HCl 、ｐＨ
7.5、 0.5％デオキシコ−ル酸ナトリウムに再懸濁し、
穏やかにホモジナイズした。このホモジネ−トを 100,0
00ｇで遠心分離し、上清を 200-300 volの20ｍＭ Tris/
HCl 、ｐＨ 7.5、0.15Ｍ NaCl および 2ｍＭ CHAPSに対
して24時間透析した。透析物を 100,000ｇで90分間遠心
分離することにより清浄にした。この工程から得られた
清澄な上清を、20ｍＭ Tris/HCl 、ｐＨ 7.5、0.15Ｍ N
aCl および 2ｍＭ CHAPS（緩衝液Ａ）で平衡にしたモノ
Ｑ（Mono Q）（Pharmacia, HR 5/5 ）カラムに、ス−パ
−ル−プ（Superloop）（Pharmacia ）を介して流速 0.
5ｍL／分で流した。カラムを緩衝液Ａ10ｍLで洗浄し、
結合タンパク質を緩衝液Ａの 0-1.0Ｍ NaCl 直線勾配30
ｍLで溶出させて、分画 1ｍLを集めた。競合阻害検定に
よりｇｐ75について分画を検定し、陽性分画をプ−ルし
て 1ｍＭ CaCl2 、 1ｍＭ MnCl2 および 2ｍＭ PMSF
を含有するCon A カラム緩衝液、10ｍＭ Tris/HCl 、ｐ
Ｈ 7.5、 100 volに対して18時間透析した。

【００４５】ＣｏｎＡ- セファロ−ス・クロマトグラフ
ィ− 10ｍLエコノカラム（Econo-column）（Bio-Rad ）中に
おいて、Con A-セファロ−ス（ 5ｍL）を Con Aカラム
緩衝液50ｍLで洗浄してプ−ルし、モノＱイオン交換ク
ロマトグラフィからの透析分画を流速 1.0-1.5ｍL／分
でこのカラムにかけた。流出液を再びカラムにかけ、流
出液の吸光度（ 280ｎｍ）が0.01未満になるまでカラム
緩衝液で洗浄した。Con A に結合しているタンパク質
を、Con A カラム緩衝液に溶解した0.25Ｍα-D- メチル
マンノピラノシドで溶出させ、 1.5-2ｍLの分画を集め
た。溶出に先立って 25-30℃で 15-20分間溶出緩衝液を
用いてカラムをインキュベ−トすることにより、タンパ
ク質の収量が改善された。ｇｐ75を含有する分画をプ−
ルし、10ｍＭ Tris/HCl 、ｐＨ 7.5、 2ｍＭ CHAPSおよ
び 2ｍＭ PMSF に対して透析し、ＴＡ99アフィゲル 10
アフィニティカラムにかけた。

【００４６】ＴＡ99アフィニティクロマトグラフィ− 硫酸アンモニウム沈殿、並びにそれに続くプロテインＡ
- セファロ−スおよびセファデックスＧ-25 カラムでの
クロマトグラフィにより、（BALB/C × C57BL/6 ）Ｆ
1 マウスの腹水から TA99 MAb を精製した。製造者用指
導書に従ってカップリング用アフィゲル 10 を調製し、
冷カップリング緩衝液（ＣＢ）、50ｍＭHEPES、ｐＨ 7.
6、 150ｍＭ NaCl で洗浄した。アフィゲル 2ｍL当り 9
ｍｇの精製 TA99 IgG を用いて、カップリング緩衝液の
合計体積 6ｍLで、カップリング反応を 4℃で 4時間行
なった。未結合の部位は、等体積の 0.1Ｍエタノ−ルア
ミン HCl、ｐＨ 8.0を用いて 4℃で 1時間インキュベ−
トすることによりブロックした。その後、ゲルを、CB、
CB＋ 1.5Ｍ NaCl 、CB、および最後に10ｍＭ Tris/HCl
、ｐＨ 7.5、0.15Ｍ NaCl および 2ｍＭ CHAPSで順次
洗浄した。カップリング効率は、カップリング反応の 4
時間前および 4時間後に、カップリング反応の清上清中
の TA99 の SK-MEL-19メラノ−マ細胞に対する抗体力価
を ELISAによって測定することにより決定した。カップ
リング効率は 60-80％であり、アフィゲル 10 1ｍL当
り TA99 IgG 約 5ｍｇが結合した。Con A クロマトグラ
フィからプ−ルされ、透析されたタンパク溶液を、 0.5
ｍL／分の流速で 2ｍL MAb TA99-アフィゲル 10 カラム
にかけ、溶出液を再びカラムにかけた。その後、このゲ
ルを、各々 6ｍLのCB、CB＋ 1Ｍ NaCl 、CB、およびCB
＋ 2ｍＭ CHAPSで順次洗浄した。結合したｇｐ75を、 2
ｍＭ CHAPSを含有する 0.1Ｍグリシン-HClを用いてカラ
ムから溶出させた。

【００４７】ｇｐ75に対する固相酵素免疫測定法 ELISA のために、トリプシン結合細胞（trypsinized ce
lls ）をマイクロウェルプレ−ト（Microtest Plates 3
034, Falcon, Oxnard, CA ）に 500-2000 細胞／ウェル
入れ、加湿組織培養インキュベ−タ−中において、 5％
CO2 中で、37℃で 48-72時間増殖させた。このプレ−ト
を PBSで洗浄し、冷却（ -20℃）メタノ−ル：アセトン
（ 1:1 v/v）で10分間固定した後、 0.2％ナトリウムア
ジドを含有する冷 PBSで３回洗浄した。固定され、かつ
透過性が付与された細胞を有するプレ−トは 4℃で保存
した。ELISA により、新たに固定したプレ−トについて
TA99 抗体の力価を決定した。（ 4℃で 6か月までのプ
レ−トの保存については、MAb TA99を用いる力価には重
大な変化は観察されなかった。）簡潔に言うと、細胞を
ウェル当り10μLの MAb TA99 と共にインキュベ−ト
し、 5％γ- グロブリン非含有 FBS（GGFFBS）を含有す
る PBS中に45分間連続的に希釈した後、 2％ GGFFBS を
含有する PBSでプレ−トを３回洗浄し、（ 5％ GGFFBS
で PBS中に 1：200 に希釈した）アルカリホスファタ−
ゼ結合ヤギ抗マウス IgGを各ウェルに添加して45分間イ
ンキュベ−トした。プレ−トを上と同様に３回洗浄し、
アルカリホスファタ−ゼ基質溶液（ジエタノ−ルアミン
緩衝液、ｐＨ 9.8、 5ｍＭ MgCl2 に溶解したp-フェニ
ルジソディウムホスフェ−ト）18μLを添加した。加湿
チャンバ−内において37℃で 15-20分間インキュベ−ト
した後、ア−テク（Artek ）（Chantilly 、VA）マイク
ロプレ−トリ−ダ−（モデル210）において、 405ｎｍ
で光学密度を測定した。

【００４８】ｇｐ75の競合阻害検定 初期の工程の間、ｇｐ75の精製を監視し、上述のよう
に、分画のSK-MEL-19 細胞への MAb TA99 の結合を阻害
する能力を ELISAによって測定することにより定量し
た。カラムクロマトグラフィ−からの亜細胞分画もしく
は分画を、96ウェルマイクロテストプレ−トにおいて連
続的に希釈した。TA99抗体を最終濃度 300ｎｇ／ｍｌ
（SK-MEL-19 への結合の飽和直前）まで添加した。この
抗原抗体混合物を室温で30分間インキュベ−トした後、
マイクロウェルプレ−ト中の SK-MEL-19細胞に適用し
た。SK-MEL-19 細胞に結合した MAb TA99 の量を、上述
のように ELISAによって測定した。ｇｐ75の活性 1単位
は、SK-MEL-19 細胞に結合する MAbTA99 （ 300ｎｇ／
ｍL）の半最大阻害（half-maximal inhibition ）に必
要なタンパク質の量と定義された。

【００４９】ゲル電気泳動およびエレクトロブロッティ
ング タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（Laemmli,U.K., Cleavage of structural proteins du
ring assembly of the head of bacteriophage T4, Nat
ure (Lond.), 227, 680-685, 1970 ）により解析し、銀
染色（Oakley,B.R., Kirsch,D.R. and Morris,N.R., A
simplified ultrasensitive silver stainfor detectin
g proteins in acrylamide gels, Anal.Biochem., 105,
361-363,1980 ）により可視化した。N-末端配列決定の
ために、トランスフォア（Transphor ）装置（Hoefer,
San Francisco, CA ）内において、ＰＶＤＦ（ポリビニ
リデンジフルオリド）膜（Immobilon, Millipore, Bedf
ord, MA ）上でタンパク質のエレクトロブロッティング
を行ない、Matsudaira,P., Sequence from picomole qu
antities of proteins electroblotted on to polyviny
lidene difluoridemembranes. J.biol.Chem., 262, 100
35-10038, 1987 に記述されているようにアミノ酸組成
を解析した。

【００５０】アミノ酸解析 PVDF 膜に転写されたタンパク試料のアミノ酸解析は、
ハ−バ−ド大学マイクロケミストリ−施設で行なった。
タンパク質（ 0.6μｇおよび 0.8μｇ）を 6ＮHCl中に
おいて 110℃で24時間加水分解した。Ebert,R.F., Amin
o acid analysis by HPLC: optimized conditions for
chromatography of phenylthiocarbamylderivatives, A
nal.Biochem., 154, 431-435, 1986 に記述されている
ように、遊離アミノ酸をフェニルイソチオシアネ−トで
誘導体とし、得られたフェニルチオカルバミルアミノ酸
を HPLC で分析した。

【００５１】チロシンヒドロキシラ−ゼ活性についての
免疫沈降解析 界面活性剤可溶化（PBS 中の 1％ NP 40）メラノ−マ
（SK-MEL-19 ）細胞抽出物 100μｇの一定量を、 3-15
μｇのMAb TA99（抗ｇｐ75）、MAb F23 または PBSと共
に、総容量45μLで、連続的に混合しながら、 4℃で90
分間インキュベ−トした。プロテインＡセファロ−ス C
L 4Bを最終濃度 6ｍｇ／ｍLまで添加した。 4℃で 2時
間インキュベ−トした後、 4℃で 5分間、15,000 rpmで
遠心分離することにより上清を集めた。ペレットを 1％
NP 40を含有する PBSで 5回洗浄し、同じ緩衝液 50 μ
Lに懸濁した。チロシンヒドロキシラ−ゼ活性は、上清
およびペレット中で測定した。プロテインＡセファロ−
スを添加する以前に細胞抽出物中に存在した全チロシン
ヒドロキシラ−ゼ活性約85％は、PBS コントロ−ルの上
清中に再現性よく得られた。抗体およびプロテインＡセ
ファロ−スと共にインキュベ−トした細胞抽出物の上清
において得られた酵素活性を、PBS コントロ−ルにおい
て得られた活性に対する割合で表わす。

【００５２】チロシンヒドロキシラ−ゼ検定 チロシンヒドロキシラ−ゼ活性を、Pomerantz,S.H., L-
Tyrosine-3,5-H assayfor tyrosinase development in
skin of newborn hamsters, Science, 164, 838-839, 1
969に記述されているように、多少の変更（Bouchard,B.
Fuller,B., Vijayasaradhi,S. and Houghton,A.N., In
duction of pigmentation in mouse fibroblasts by ex
pression of human tyrosinase, J.exp.Med., 169, 202
9-2042,1989 ）を加えて検定した。酵素活性 1単位は、
37℃で 1時間に 3Ｈチロシナ−ゼから 1μモルの 3Ｈ2
Ｏを放出させるのに必要なタンパク質の量と定義され
た。

【００５３】タンパク質の決定 バイオラッド・タンパク検定システム（Bio-Rad Protei
n Assay System）を用い、染料結合法（Bradford,M., A
rapid and ultrasensitive method for the quantitat
ion of microgram quantities of protein utilizing t
he principle of protein-dye binding, Anal.Bioche
m., 72, 248-254, 1976 ）によりタンパク質濃度を評価
した。精製ｇｐ75は、一連の既知量（10-100ｎｇ／タン
パク質バンド）の銀染色分子量マ−カ−タンパク質に対
するポリアクリルアミドゲル上のタンパク質バンドの染
色強度の概算により定量した。

【００５４】結果および考察 メラノ−マ細胞株 SK-MEL-19の後核膜分画をｇｐ75抗原
の源として用いた。この膜分画をハイ・ソルト（high s
alt ）で処理した後、ハイ・ソルト不溶分画を界面活性
剤デオキシコ−ル酸塩中で可溶化した。各ペレットを除
く全ての亜細胞分画を、SK-MEL-19 細胞への MAb TA99
結合の阻害（ｇｐ75活性）を測定する競合 ELISAによっ
て、ｇｐ75の存在について検定した。ｇｐ75は、デオキ
シコ−ル酸可溶化膜分画中にのみ検出され、ハイ・ソル
ト可溶分画中には検出されなかった。これは、ｇｐ75の
完全な膜局在と一致する。ｇｐ75のメラノソ−ム膜局在
は、35Ｓ- メチオニンを用いるメラノ−マ細胞の代謝パ
ルス- チェイス標識、続く（メラノソ−ムを強化するた
めの）不連続ショ糖濃度勾配分画および免疫沈降分析に
より示された。これらの実験において、ｇｐ75は、メラ
ノソ−ムを含有する、界面活性剤可溶化し、色素形成し
た勾配分画からのみ免疫沈降が可能であった。

【００５５】ｇｐ75の初期強化は、モノＱ（陰イオン交
換）カラムでのデオキシコ−ル酸塩可溶膜分画の分画に
より行なわれる。結合ｇｐ75は、0.26-0.5Ｍ NaCl で、
電荷微小不均一性（microheterogeneity）を示すブロ−
ドピ−クの活性を有して溶出した。これは、二次元 SDS
-PAGE （ｐＩ 5.5-5.9）により確認された。カラム平衡
緩衝液および試料緩衝液中における両性イオン性界面活
性剤3-［（3-コラミドプロピル）ジメチル- アミノ］ 1
- プロパンスルホネ−ト（CHAPS ）の存在もしくは不存
在は、モノＱカラムへのｇｐ75の結合に影響を及ぼさな
いが、溶出緩衝液への CHAPSの添加はｇｐ75の収率を改
善することが観察された。

【００５６】ｇｐ75活性を有するモノＱ分画をプ−ル
し、コンカナバリンＡ（Con A ）カラム緩衝液中で透析
してCon A-セファロ−スカラムにかけた。のせたタンパ
ク質の約60％が Con Aに結合した。結合タンパク質を0.
25Ｍα-D- メチルマンノピラノシドを用いて溶出させる
ことで、ブロ−ドな主要ピ−クに小ピ−クが続く結果が
得られる。Con A カラムへのｇｐ75の結合に不均一性が
存在し、これは溶出の間のｇｐ75活性の複数のピ−クに
より示される。これは、複数のカラムを可動させる際に
首尾一貫して観察される。メラノサイトおよびメラノ−
マ細胞におけるｇｐ75は、Asn-結合複合炭水化物の数も
しくは塑性のいずれかが異なる２種の成熟携帯で存在す
ることが観察された。しかしながら、Con A への結合に
おける不均一性は、ｇｐ75上のAsn-結合、抗マンノ−ス
炭水化物における検出可能な相違からは起こらない。こ
れは、溶出されたピ−ク分画の放射性ヨウ素か、および
MAbTA99 を用いたｇｐ75の免疫沈降、それに続くエン
ド- β -N-アセチル- グルコサミニダ−ゼＨ（エンド
Ｈ）消化による抗マンノ−ス炭水化物鎖の除去により示
された。試験した全てのピ−クは、エンドＨ消化の後に
SDS-PAGE 上で 63-および 66-kDa のバンドを生じるｇ
ｐ75の２種の成熟形態を有していた。

【００５７】Con A 溶出液からのｇｐ75を含有する分画
をプ−ルし、 MAb TA99 アフィニティカラムにかけた。
ELISA および SDS-PAGE の銀染色によって測定されるよ
うに、アフィニティカラムの流出液中のｇｐ75は完全に
低下した。全タンパク質の92％を含有する流出液をカラ
ムにのせた。結合ｇｐ75の溶出条件は、（「材料および
方法」に記載したように）ELISA による、透過性が付与
され、メタノ−ル：アセトン固定された SK-MEL-19メラ
ノ−マ細胞に対する MAb TA99 結合の阻害に基づいて予
め決定した。ｇｐ75への MAb TA99 の結合は、 0.1Ｍグ
リシン HCl緩衝液、ｐＨ 3.1によって取り消す、すなわ
ち逆転させることができる。 0.1Ｍグリシン HCl緩衝
液、ｐＨ 3.1、を用いるカラムの溶出は、ポリアクリル
アミドゲル上の銀染色ｇｐ75バンドの強度によって決定
されるように、カラムにのせたタンパク質 1.7ｍｇから
精製ｇｐ75約 0.5ナノモルを生じた。 TA99 抗体アフィ
ニティカラムからのｇｐ75の溶出はまた、銀染色ゲル上
に53、28および26 kDaの追加の小バンドとして現われる
痕跡量の TA99 抗体（重鎖および軽鎖）のろ過を生じる
結果となる。これらの追加のバンドは、カラムに結合し
た TA99 抗体に起因し、SK-MEL-19 抗原調製物からでは
ないことが、（１）ウサギ抗マウス IgG抗体との 53-、
28- および 26-kDa タンパク質の免疫沈降、および
（２）これらのバンドが SK-MEL-19溶解物の放射性ヨウ
化調製物からは生じないという実証により確認された。
ｇｐ75の精製の概要を表Ｉに示す。

【００５８】

【表１】 ¹プ−ルされ、透析された分画中のタンパク量は、ブラ
ッドフォ−ド染料結合法（Bradford's dye binding met
hod ）（1976）により測定した。

【００５９】²活性１単位は、MAb TA99（ 300／ｍｇ）
のSK-MEL-19 細胞への結合の半最大阻害に必要なタンパ
ク質量と定義された。 3TA99アフィニティカラム溶出液
中の精製ｇｐ75の量は、SDS-PAGE上の銀染色バンドの強
度の概算により評価した。

【００６０】ＮＤ．検出されず。

【００６１】アフィニティ精製ｇｐ75は、アミノ酸解析
に利用した。ｇｐ75のアミノ酸組成を表IIに示す。

【００６２】

【表２】 アミノ酸解析は、 PVDF 膜に転写された精製ｇｐ75の２
種の試料（ 600および800ｎｇ）について行なった。括
弧内の数字は検出された各アミノ酸のｐｍｏｌである。
Asx＝アスパラギン酸およびアスパラギンの合計； Glx
＝グルタミン酸およびグルタミンの合計。ＮＤ＝検出さ
れず。

【００６３】ｇｐ75の３種の内部ペプチドの配列および
ｇｐ75ｃＤＮＡの部分配列は、実験１において示した。
ｇｐ75のアミノ酸組成は、アカパンカビ（N.crassa）
（Lerch,K., Longoni,C., and Jordi,E., Primary stru
cture of tyrosinase from Neurospora crassa, J.bio
l.Chem., 257, 6408-6413, 1982）および哺乳動物のチ
ロシナ−ゼ、およびマウスｂ遺伝子生成物（Shibahara,
S., Tomita,Y., Sakakura,T., Nager,C., Chaudhuri,
B., and Muller,R., Cloning and expression of cDNA
encoding mouse tyrosinase, Nucl.Acids Res., 14, 24
13-2427, 1986 ；Bouchard,B., Fuller,B., Vijayasara
dhi,S., and Houghton,A.N., Induction of pigmentati
on in mouse fibroblasts by expression of human tyr
osinase, J.exp.Med., 169, 2029-2042, 1989 ；Cohen,
T., Muller,R.M., Tomita,Y., and Shibahara,S., Nucl
eotide sequence of the cDNA encoding human tyrosin
ase-related protein, Nucl.Acid.Res., 18, 2807, 199
0 ）のアミノ酸配列に類似していた。エドマン分解法に
よってｇｐ75のN-末端配列解析を行なおうとする試み
は、ブロックされたN-末端の存在により不成功に終わっ
た。アカパンカビ・チロシナ−ゼのN-末端セリン残基も
また、この場合はアセチル基により、ブロックされてい
る（Lerch,K., Longoni,C., and Jordi,E., Primary st
ructure of tyrosinase from Neurospora crassa, J.bi
ol.Chem., 257, 6408-6413, 1982）。

【００６４】ｇｐ75およびチロシナ−ゼの両者はメラノ
ソ−ムに局在する 75-kDa の膜糖タンパク質であり、類
似のアミノ酸組成、約40％のアミノ酸配列同一性（実験
１参照；Cohen,T., Muller,R.M., Tomita,Y., and Shib
ahara,S., Nucleotide sequence of the cDNA encoding
human tyrosinase-related protein, Nucl.Acid.Res.,
18, 2807, 1990 ）、および（チロシナ−ゼの触媒活性
に必要な）２つの潜在的な協同的結合部位（cooper-bin
ding sites）を有している。幾人かの探索者は、マウス
ｇｐ75が、チロシナ−ゼ分子の特性であるチロシンヒド
ロキシラ−ゼ活性を有することを提唱している（Hearin
g,V.J., Jimenez,M., Analysis of mammalian pigmenta
tion at the molecular level, Pigment.Cell.Res., 2,
75-85,1989）。

【００６５】チロシンヒドロキシラ−ゼ活性は、MAb TA
99を用いる沈殿の後の、SK-MEL-19メラノ−マ細胞抽出
物の上清および免疫沈降物中で測定した。 TA99 による
酵素活性の特別な低下は見られなかった；細胞抽出物を
コントロ−ル抗体（MAb F23）もしくは MAb TA99 のい
ずれかと共にインキュベ−トした後、上清中にチロシン
ヒドロキシラ−ゼ活性の94％を再現することができた
（表III）。

【００６６】抗体濃度を 300μｇ／ｍLまで増加させて
も、上清中におけるチロシンヒドロキシラ−ゼ活性の再
現に有意の減少は観察されなかった。免疫沈降物中で
は、酵素活性は再現されなかった。これらの結果は、ヒ
トメラノ−マ細胞におけるほとんど全てのチロシンヒド
ロキシラ−ゼ活性が、ｇｐ75抗原とは区別される分子に
よるものであると説明されることを示している。

【００６７】

【表３】 ¹括弧内の数値は緩衝液コントロ−ル（=100％）と比較
した、上清中に再現されたチロシンヒドロキシラ−ゼ活
性の割合である。

【００６８】²コントロ−ルチュ−ブは、「材料および
方法」に記載されるように、PBS と共にインキュベ−ト
された後、プロテインＡセファロ−スにかけた。

【００６９】³マウス MAb F23（ IgG2a）は、ヒトメラ
ノサイト細胞と反応しない抗結腸癌 MAbである。

【００７０】チロシンヒドロキシラ−ゼ活性は、精製の
間に、ｇｐ75を含有する分画においても測定した。全細
胞チロシンヒドロキシラ−ゼ活性は、後核膜の界面活性
剤可溶化、モノＱ陰イオン交換カラムに結合したタンパ
ク質の勾配溶出、および ConA分画の間に、ｇｐ75と共
に、共純化（co-purified ）した。これは、ｇｐ75とヒ
トチロシナ−ゼとの実施的な相同性と一致する。しかし
ながら、ｇｐ75とチロシンヒドロキシラ−ゼ活性とは、
MAb TA99アフィニティカラム上で分離する。SK-MEL-19
のデオキシコ−ル酸塩可溶化、Con A 精製分画を MAb T
A99 アフィニティカラムにかけた場合には、溶出液中に
おいて、ｇｐ75活性は完全に低下するのに対して≧75％
のチロシンヒドロキシラ−ゼ活性が再現される（表I
V）。

【００７１】

【表４】 ¹酵素活性１単位は、37℃ 1時間で、 ^３H-チロシンか
ら 1マイクロモルの ^３Ｈ_２ Ｏを放出するのに必要な
タンパクの量である。

【００７２】溶出したｇｐ75はチロシンヒドロキシラ−
ゼ活性を有してはいなかったが、カラム溶出条件が酵素
活性を消失させることは可能である。これらの結果は、
メラノサイト細胞における（全てでないならば）ほとん
どのチロシンヒドロキシラ−ゼ活性がｇｐ75とは区別さ
れるタンパク質に帰するという結論を支持する。

【００７３】ｇｐ75抗原は、色素形成ヒトメラノサイト
およびメラノ−マにおいて発現し、色素非形成メラノ−
マまたはメラノサイト細胞型においては検出されない膜
結合糖タンパク質である（Thomson,T.M., Mattes,J.M.,
Roux,L., Old,L.J. and Lloyd,K.O., Pigmentation-as
sociated glycoprotein of human melanoma and melano
cytes: definition with a mouse monoclonal antibod
y, J.invest.Dermat.,85, 169-174, 1985 ；Thomson,T.
M., Real,F.X., Murakami,S., Cordon-Cardo,C., Old,
L.J. and Houghton,A.N., Differentiation antigens o
f melanocytes and melanoma: analysis of melanosome
and cell surface markers of human pigmented cells
with monoclonal antibodies, J.invest.Dermat., 90,
459-466,1988 ）。免疫電子顕微鏡法研究は、MAb TA99
がメラノソ−ム膜またはその近傍に結合することを明ら
かにしている（Thomson,T.M., Real,F.X., Murakami,
S.,Cordon-Cardo,C., Old,L.J. and Houghton,A.N., Di
fferentiation antigens ofmelanocytes and melanoma:
analysis of melanosome and cell surface markers o
f human pigmented cells with monoclonal antibodie
s, J.invest.Dermat., 90, 459-466, 1988 ）。メラノ
−マ細胞におけるｇｐ75の細胞内局在は、ｇｐ75が免疫
系に接触するのを不可能にしているように見える。しか
しながら、メラノ−マ患者で、ｇｐ75に対するＩｇＧ抗
体が検出されている（Mattes,J.M., Thomson,T.M., Ol
d,L.J. and Lloyd,K.O., A pigmentation-associated,
differentiation antigen of human melanoma defined
by a precipitating antibody inhuman serum, Int.J.C
ancer, 32, 717-721, 1983）。これに関連して、MAb TA
99は、メラノ−マ患者のＩｇＧ抗体によって沈殿した同
様のｇｐ75抗原を認識する（Vijayasaradhi,S., Boucha
rd,B.B. and Houghton,A.N., The melanoma antigen gp
75 is the human homologue of mouse b (brown) locus
gene, J.exp.Med.,171, 1375-1380, 1990 ）。静脈内
注射された放射性標識 MAb TA99 は、無胸腺マウスのメ
ラノ−マ異種移植片に効率よく局在し（Welt,S., Matte
s,J.M., Grando,R., Thomson,T.M., Leonard,R.W., Zan
zonico,P.B., Bigler,R.E., Yeh,S.,Oettgen,H.F. and
Old,L.J., Monoclonal antibody to an intracellular
antigen images human melanoma trasplants in nu/nu
mice, Proc.nat.Acad.Sci.(Wash.), 84, 4200-4204, 19
87 ）、これはｇｐ75抗原が免疫系に用いられ得ること
を示唆している。。

【００７４】メラノソ−ム糖タンパクチロシナ−ゼは、
ｇｐ75がｂ（褐色）遺伝子座であるのに対して、マウス
ｃ（アルビノ）遺伝子座にマップされる遺伝子によって
コ−ドされる。チロシナ−ゼおよびｇｐ75は、多数の共
有タンパク質を有している。類似の物理学的特性に加え
て、複数のクロマトグラフィ工程を介するｇｐ75および
チロシナ−ゼ活性の共純化から明らかなように、これら
２つのタンパク質は分子同一性をも共有する（アミノ酸
レベルで43.1％、およびヌクレオチドレベルで55.3％）
（Vijayasaradhi,S., Bouchard,B.B. and Houghton,A.
N., The melanoma antigen gp75 is the human homolog
ue of mouse b (brown) locus gene, J.exp.Med., 171,
1375-1380, 1990 ；Cohen,T., Muller,R.M., Tomita,
Y. and Shibahara,S., Nucleotide sequence of the cD
NA encoding human tyrosinase-related protein, Nuc
l.Acids Res., 18, 2807, 1990 ）。

【００７５】抗チロシナ−ゼ抗体は、チロシナ−ゼ、ｂ
（褐色）遺伝子座タンパク質および、恐らく、関連タン
パク質の一族と交差反応する（Shibahara,S., Tomita,
Y., Sakakura,T., Nager,C., Chaudhuri,B. and Mulle
r,R., Cloning and expressionof cDNA encoding mouse
tyrosinase, Nucl.Acids Res., 14, 2413-2427, 198
6；Jackson,I.J., A cDNA encoding tyrosinase-relate
d protein maps to the brown locus in mice, Proc.na
t.Acad.Sci.(Wash.), 85, 4392-4396, 1988；Hearing,
V.J., and Jimenez,M., Analysis of mammalian pigmen
tation at the molecular level, Pigment Cell Res.,
2, 75-85, 1989）。したがって、精製ｇｐ75抗体がチロ
シナ−ゼとは区別されることを示すことが重要であっ
た。ｇｐ75およびチロシナ−ゼ酵素活性は共純化した
が、ほとんどのチロシナ−ゼ酵素活性は、TA99 アフィ
ニティクロマトグラフィを用いる精製の間にｇｐ75から
分離することができる。全細胞チロシンヒドロキシラ−
ゼ活性のほとんどは、 MAb TA99 アフィニティカラムの
通過分中に回収され、これは、チロシンヒドロキシラ−
ゼ活性がｇｐ75とは区別される分子によって触媒される
ことを示唆している。 MAb TA99 がチロシンヒドロキシ
ラ−ゼ活性を免疫沈降させない、もしくは枯渇させない
という事実は、この観察と一致する（表IV；Thomson,T.
M., Mattes,J.M., Roux,L., Old,L.J. and Lloyd,K.O.,
Pigmentation-associated glycoprotein of human mel
anoma and melanocytes: definition with a mouse mon
oclonal antibody, J.invest.Dermat., 85, 169-174, 1
985 ）。Jimenez,M., Malvoy,L. and Hearing,V.J., Sp
ecific identification of an authentic clone for ma
mmaliantyrosinase, J.biol.Chem., 264, 3397-3403, 1
989は、マウスｂ遺伝子座タンパク質に対する抗ペプチ
ド抗体を使用し、ｂタンパク質がマウスメラノ−マ細胞
におけるチロシナ−ゼ活性の 15-30％を説明することを
示唆している。我々の結果は、ｇｐ75がチロシンヒドロ
キシナ−ゼ活性を有していないことを示唆している。し
かしながら、ｇｐ75が、色素形成メラノ−マ細胞におけ
る酵素活性の 5％を説明する非常に弱いチロシンヒドロ
キシラ−ゼ活性を有する可能性を除外することはできな
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：ｍＡｂ ＴＡ99およびＡＵ血清により認
識されたタンパク質の免疫沈降およびペプチド組成分
析。 Ａ．ＳＫ−ＭＥＬ−19からの 125Ｉ標識溶解物からのｍ
ＡｂＴＡ99による免疫沈殿物の一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（レ−ン１）、正常ヒト血清（レ−ン２）並びに1／75
（レ−ン３）および10／76（レ−ン４）からのＡＵ血
清。 Ｂ．ｇｐ75もしくはエンドＨで処理した（部分的に脱グ
リコシル化した）ｇｐ75に相当するバンドをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルから切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上において、 S.aureus Ｖ8 プロテア−ゼで制限消化す
ることによりペプチド組成を解析した。−、ｇｐ75；
＋、エンドＨで部分的に脱グリコシル化したｇｐ75。オ
−トラジオグラフ露光は、ＴＡ99に対して２日間および
ＡＵペプチドに対して５日間であった。

【図２】図２：ｇｐ75由来の３種のペプチドのアミノ酸
配列。下線を付したアミノ酸残基は、マウスｃＤＮＡ
ｐＭＴ4 （Shibahara,S., Y.Tomita, T.Sakakura, C.Na
gai, B.Chaudhuri, and R.Muller. (1986) Cloning and
expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nuc
leic Acid Res. 14:2413）から予測される残基と異なる
ものである。ｇｐ75由来の３種のペプチドのアミノ酸配
列。

【図３】図３：ｇｐ75の部分的ｃＤＮＡ配列。ヌクレオ
チド778 からヌクレオチド1524までの5'-3' 部分的ｃＤ
ＮＡ断片が描写される。

【図4】図４：ｇｐ75をコ−ドする完全長のｃＤＮＡの
単離。 2.7ｋｂ ｇｐ75ｃＤＮＡインサ−トを含む部分
的制限地図が示される。ＧＰ75の全 2.7ｋｂ ｃＤＮＡ
の最初の18ヌクレオチドを含む部分的ヌクレオチド配列
が 5'-3'方向に示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 セタルリ・ビジャヤサラデイ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10028、 ニューヨーク、イースト・エイティーファ ースト・ストリート 504 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA36 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 AA13 BA02 BA23 CA62 ZB26 4C085 AA03 BB03 BB11 CC08 CC21 EE06 FF24

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 投与される被検体におけるｇｐ75に対す
   る免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンであって、
   両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1の
   約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のアミ
   ノ酸配列をコ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌内
   の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴ
   ＣＣに寄託されている）に結合したベクターの複製に必
   須のＤＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合した発現ベ
   クターと、有効量のアジュバントと、調剤上許容し得る
   担体とを含有するワクチン。
2. 【請求項２】 投与される被検体におけるｇｐ75に対す
   る免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンであって、
   下記の配列を含むｃＤＮＡ分子に結合したベクターの複
   製に必須のＤＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合した
   発現ベクターと、有効量のアジュバントおよび調剤上許
   容し得る担体を含有するワクチン。 GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA
3. 【請求項３】 投与される被検体におけるｇｐ75に対す
   る免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンであって、
   該被検体における免疫応答を刺激もしくは増強するのに
   有効な量の精製ｇｐ75、または下記からなる群から選択
   される単離された核酸分子によりコードされるポリペプ
   チドと、有効量のアジュバントと、調剤上許容し得る担
   体を含有するワクチン。 ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のア
   ミノ酸配列をコ−ドする単離された核酸分子（大腸菌内
   の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴ
   ＣＣに寄託されている）； ・下記の配列を含む単離された核酸分子； GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分のｇｐ75コード配列を有する単離
   された核酸分子（大腸菌内の前記プラスミドはＡＴＣＣ
   受付番号６８５６５でＡＴＣＣに寄託されている）； ・下記のアミノ酸配列を有するｇｐ75の断片をコ−ドす
   る単離された核酸分子：Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-
   Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val；Met-Phe-V
   al-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Thr-Tyr-Glu；も
   しくはAsn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser
   -Val-Phe-Ser；またはこれらの何れかの組合わせ。
4. 【請求項４】 投与される被検体において、ｇｐ75に対
   する免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンであっ
   て、該被検体における抗体産生を刺激もしくは増強する
   のに有効な量の、両端がEcoRIによって区分されたプラ
   スミドGP75 E-1の約２．７ｋｂの部分によってコード
   されるｇｐ75のアミノ酸配列をコ−ドする単離されたｃ
   ＤＮＡ子（大腸菌内の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番
   号６８５６５でＡＴＣＣに寄託されている）によってコ
   ードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、有効
   量のアジュバントと、調剤上許容し得る担体とを含有す
   るワクチン。
5. 【請求項５】 投与されるヒトにおいて、ｇｐ75に対す
   る免疫応答を刺激もしくは増強するワクチンであって、 （ａ）免疫応答を刺激もしくは増強するのに有効な量
   の、下記の群から選択される抗原成分と、 ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のア
   ミノ酸配列をコ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌
   内の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡ
   ＴＣＣに寄託されている）に結合したベクターの複製に
   必須のＤＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合した発現
   ベクター； ・下記の配列を含むｃＤＮＡ分子に結合したベクターの
   複製に必須のＤＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合し
   た発現ベクター GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のア
   ミノ酸配列をコ−ドする単離された核酸分子（大腸菌内
   の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴ
   ＣＣに寄託されている）によりコードされるポリペプチ
   ド； ・下記の配列を含む単離された核酸分子によりコードさ
   れるポリペプチド GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分のｇｐ75コード配列を有する単離
   された核酸分子（大腸菌内の前記プラスミドはＡＴＣＣ
   受付番号６８５６５でＡＴＣＣに寄託されている）によ
   りコードされるポリペプチド； ・下記のアミノ酸配列を有するｇｐ75の断片をコードす
   る単離された核酸分子によってコードされるポリペプチ
   ド：Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-Asp-Pro-Thr-Gly-Ly
   s-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val；Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp
   -Asn-Leu-Gly-Tyr-Thr-Tyr-Glu；もしくはAsn-Phe-Asp-
   Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser；また
   はこれらの何れかの組合わせ； ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のア
   ミノ酸配列をコ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌
   内の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡ
   ＴＣＣに寄託されている）によってコードされるポリペ
   プチド ・上記の何れかの組み合わせ； （ｂ）有効量のアジュバントと、 （ｃ）調剤上許容し得る担体とを含有するワクチン。
6. 【請求項６】 ｇｐ75に対する免疫応答を刺激もしくは
   増強する薬学的組成物を製造するために、両端がEcoRI
   によって区分されたプラスミドGP75 E-1の約２．７ｋ
   ｂの部分によってコードされるｇｐ75のアミノ酸配列を
   コ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌内の前記プラ
   スミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴＣＣに寄託
   されている）に結合したベクターの複製に必須のＤＮＡ
   配列を含む宿主内での発現に適合した発現ベクターを使
   用する方法であって、免疫応答を刺激または増強するた
   めに有効な量の前記発現ベクター、有効量のアジュバン
   トおよび調剤上許容し得る担体を混合することを具備す
   る方法。
7. 【請求項７】 ｇｐ75に対する免疫応答を刺激もしくは
   増強する薬学的組成物を製造するために、下記の配列を
   含むｃＤＮＡ分子に結合したベクターの複製に必須のＤ
   ＮＡ配列を含む宿主内での発現に適合した発現ベクター
   を使用する方法であって、免疫応答を刺激または増強す
   るために有効な量の前記発現ベクター、有効量のアジュ
   バントおよび調剤上許容し得る担体を混合することを具
   備する方法。 GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA
8. 【請求項８】 ｇｐ75に対する抗体の産生を刺激もしく
   は増強する薬学的組成物を製造するために、ｇｐ75また
   は下記からなる群から選択される単離された核酸分子に
   よりコードされるポリペプチドを使用する方法であっ
   て、 ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分によってコードされるｇｐ75のア
   ミノ酸配列をコ−ドする単離された核酸分子（大腸菌内
   の前記プラスミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴ
   ＣＣに寄託されている）； ・下記の配列を含む単離された核酸分子； GGACCAG CTTTTCTCAC ATGGCACAGG TACCACCTCC TGCGTCTGGA GAAAGACATG CAGGAAATGT TGCAAGAGCC TTCTTTCTCC CTTCCTTACT GGAATTTTGC AACGGGGAAA AATGTCTGTG ATATCTGCAC GGATGACTTG ATGGGATCCA GAAGCAACTT TGATTCCACT CTAATAAGCC CAAACTCTGT CTTTTCTCAA TGGCGAGTGG TCTGTGACTC CTTGGAAGAT TATGATACCC TGGGAACACT TTGTAACAGC ACCGAGGATG GGCCAATTAG GAGAAATCCA GCTGGAAATG TGGCCAGACC AATGGTGCAA CGTCTTCCTG AACCACAGGA TGTCGCTCAG TGCTTGGAAG TTGGTTTATT TGACACGCCT CCTTTTTATT CCAACTCTAC AAACAGTTTC CGAAACACAG TGGAAGGTTA CAGTGACCCC ACGGGAAAGT ATGACCCTGC TGTTCGAAGT CTTCACAATT TGGCTCATCT ATTCCTGAAT GGAACAGGGG GACAAACCCA TTTGTCTCCA AATGATCCTA TTTTTGTCCT CCTGCACACC TTCACAGATG CAGTCTTTGA TGAATGGCTG AGGAGATACA ATGCTGATAT ATCCACATTT CCATTGGAAA ATGCCCCTAT TGGACATAAT AGACAATACA ACATGGTGCC ATTCTGGCCC CCAGTCACCA ACACAGAAAT GTTTGTTACT GCTCCAGACA ACCTGGGATA CACTTATGAA ・両端がEcoRIによって区分されたプラスミドGP75 E-1
   の約２．７ｋｂの部分のｇｐ75コード配列を有する単離
   された核酸分子（大腸菌内の前記プラスミドはＡＴＣＣ
   受付番号６８５６５でＡＴＣＣに寄託されている）； ・下記のアミノ酸配列を有するｇｐ75の断片をコ−ドす
   る単離された核酸分子：Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-
   Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val；Met-Phe-V
   al-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Thr-Tyr-Glu；も
   しくはAsn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser
   -Val-Phe-Ser；またはこれらの何れかの組合わせ；被検
   体における免疫応答を刺激または増強するために有効な
   量の前記ｇｐ75またはポリペプチド、有効量のアジュバ
   ントおよび調剤上許容し得る担体を混合することを具備
   する方法。
9. 【請求項９】 ｇｐ75に対する免疫応答を刺激もしくは
   増強する薬学的組成物を製造するために、両端がEcoRI
   によって区分されたプラスミドGP75 E-1の約２．７ｋ
   ｂの部分によってコードされるｇｐ75のアミノ酸配列を
   コ−ドする単離されたｃＤＮＡ子（大腸菌内の前記プラ
   スミドはＡＴＣＣ受付番号６８５６５でＡＴＣＣに寄託
   されている）によってコードされるアミノ酸配列からな
   るポリペプチドを使用する方法であって、免疫応答を刺
   激または増強するために有効な量の前記ポリペプチド
   と、有効量のアジュバントと、調剤上許容し得る担体と
   を混合することを具備する方法。