HU218416B - Eljárás melanoma elleni GP75 vakcina előállítására - Google Patents
Eljárás melanoma elleni GP75 vakcina előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU218416B HU218416B HU9203009A HU300992A HU218416B HU 218416 B HU218416 B HU 218416B HU 9203009 A HU9203009 A HU 9203009A HU 300992 A HU300992 A HU 300992A HU 218416 B HU218416 B HU 218416B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- molecule
- cdna
- nucleic acid
- melanoma
- Prior art date
Links
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 63
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 41
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 26
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 24
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 16
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 16
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 16
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 15
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 6
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000608782 Mus musculus Tyrosinase Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 101000641826 Mycobacterium phage L5 Gene 75 protein Proteins 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- -1 phenylthiocarbamoyl amino Chemical class 0.000 description 3
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 208000003367 Hypopigmentation Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003370 dye binding method Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000003425 hypopigmentation Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149506 28 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108700000328 75kDa membrane Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001025146 Bartonella bacilliformis Cell division protein FtsZ Proteins 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710137943 Complement control protein C3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100154912 Mus musculus Tyrp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101000829189 Staphylococcus aureus Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710152003 Suppressor of silencing P0 Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101800003447 VP53 Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020061 kirsch Nutrition 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
- C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
- C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
A találmány szerinti eljárással előállított, izoláltnukleinsavmolekula szekvenciája a gp75 vagy egy fragmenseaminosavszekvenciáját kódolja. A találmány a gp75-öt kódolónukleinsavmolekulával vagy fragmensével komplementer izolált cDNS-molekulája vagy az abból származó aminosavszekvencia előállítására isvonatkozik. A találmány vakcina előállítására is vonatkozik gp75elleni antitestek termelésének stimulálására vagy fokozására avakcinával kezelt alanyban. A találmány szerinti vakcina rákosbetegségek, főleg melanóma kezelésére, megelőzésére és kiújulásánakkésleltetésére alkalmas. ŕ
Description
A humán rákos sejtek immunogén determinánsainak molekuláris azonosítása képezi az alapját a rákra adott immunválasz megértésének. Humán melanómasejteken az antigének két osztálya érdemel különleges figyelmet az immunfelismerés célpontjaként:
1) a csak autológ melanómasejtek által expresszált egyedi antigének [Old, L. J.: Cancer immunology: The search fór specificity. G. H. A. Glowes Memóriái Lecture, Cancer Rés. 41, 361 (1981); Carey T. E., Takahashi T., Resnick L. A., Oettgen H. F. és Old L. J. Cell surface antigens of humán malignant melanóma. I. Mixed hemadsorption assay fór humorai immunity to cultured autologous melanóma cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 3278 (1976); Reál F. X., Mattes M. 1, Houghton A. N., Oettgen H. F., Lloyd K. O. és Old L. J.: Class 1 (unique) antigens of humán melanóma: Identification of a 90,000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibody, J. Exp. Med. 160, 1219 (1984)] és
2) a normálisan melanocita eredetű sejtek által expresszált differenciálódási antigének [Houghton A. N., Taormina M. C., Ikeda H., Watanabe T., Oettgen H.
F. és Old L. J.: Serological survey of normál humans fór natural antibody to cell surface antigens of melanoma, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4260 (1980); Houghton A. N., Eisinger M., Albínó A. P., Caimcross J. G. és Old L. J.: Surface antigens of melanocytes and melanóma: Markers of melanocyte differentiation and melanóma subsets, J. Exp. Med. 156, 1755 (1982); Houghton A. N., Reál F. X., Davis L. J., Cardon-Cardo C. és Old L. J.: Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med. 164, 812 (1987)]. A melanociták differenciálódási antigénjeit a melanociták differenciálódása során expresszált egyéb, jól definiált fenotipikus jellemzőkkel való kapcsolatuk alapján definiálják [Houghton A. N., Eisinger M., Albínó A. P., Caimcross J. G. és Old L. J.: Surface antigens of melanocytes and melanomas: Markers of melanocyte differentiation and melanóma subsets, J. Exp. Med. 156, 1755 (1982); Houghton A. N., Reál F. X., Davis
L. J., Cardon-Cardo C. and Old L. J.: Phenotypic heterogeneity of melanóma: Relation to the differentiation program of melanóma cells, J. Exp. Med. 164, 812 (1987)], a legjellegzetesebb a melaninpigment szintézise a melanoszomákon belül.
Klinikai megfigyelésekből arra következtettek, hogy a normális pigmentsejtek által expresszált antigének elleni immunválasz befolyásolhatja az áttételes melanóma lefolyását. Közelebbről, melanómás betegekben a vitiligo és a hipopigmentáció jó prognózissal jár [Nordlund J. J., Kirkwood J. M., Forget Β. M., Milton
G. , Albert D. M. és Lemer A. B.: Vitiligo in patients with metastatic melanóma: a good prognosis sign, J. Am. Acad. Dermatol. 9, 689 (1983); Bystryn J. C., Rigel D., Friedman R. J. és Kopf A.: Prognostic significance of hypopigmentation in malignant melanóma, Arch. Dermatol 123, 1053 (1987)]. Tekintettel erre, a melanoszomális antigéneket az immunrendszer felismerheti. Ezt a gp75 antigén immunprecipitálásával bizonyították autológ melanómasejtekből, áttételes melanómában szenvedő beteg szérum IgG-antitestjeivel [Mattes J. M., Thomson T. M., Old L. J. és Lloyd K. O.: A pigmentation-associated, differentiation antigens of humán melanóma defined by a precipitating antibody in humán serum, Int. J. Cancer. 32, ΊΠ (1983)]. A gp75 antigén egy melanoszomális polipeptid, amely a pigmentált melanociták és melanómák által legnagyobb mennyiségben szintetizált glikoprotein [Tai T., Eisinger M., Ogata S. és Lloyd K. O.: Glycoproteins as differentiation markers in humán malignant melanóma and melanocytes, Cancer Rés. 43, 2773 (1983)]. Az epidermális melanociták, jóindulatú pigmentált léziók, a primer és áttételes melanómák expresszálnak gp75-öt, de az egyéb sejttípusok nem [Thomson T. M., Reál F. X., Murakami S., Cardon-Cardo C., Old L. J. és Houghton A. N.: Differentiation antigens of melanocytes and melanóma: Analysis of melanosome and cell surface markers of humán pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermatol. 90, 459 (1988)]. A találmány értelmében bebizonyítottuk, hogy a gp75 cDNS közelítőleg 90%-ban azonos egy egérgén nukleotidszekvenciájával és az abból származó aminosavszekvenciával, amely a géntérképen a b (barna) lókuszban helyezkedik el. A barna lókusz az a hely, amely meghatározza a szőrtakaró színét és befolyásolja a szintetizált melanin típusát, amiből arra következtethetünk, hogy a gp75 szabályozhatja vagy befolyásolhatja a szintetizált melanin típusát.
Az a tény, hogy áttételes melanómában szenvedő beteg szérumában az IgG antitestek bizonyíthatóan immunprecipitálják a gp75-öt, bizonyítja, hogy a gp75-tel szembeni immunológiai tolerancia megtörhető. A találmány ennek megfelelően gp75 cDNS-t tartalmazó expressziós vektorokra vonatkozik, amelyeket vakcinaként használhatunk melanóma ellen, mimellett meghatározzuk az izolált és egyéb TA99 monoklonális antitesttel tisztított gp75 polipeptidből származó peptidek aminosavszekvenciáját, és a cDNS-klónokat a fenti peptidszekvenciákon alapuló oligonukleotidokkal való szűrővizsgálattal izoláljuk.
A találmány izolált nukleinsavmolekulára is vonatkozik, amelynek szekvenciája a gp75 aminosavszekvenciáját vagy annak egy ffagmensét kódolja.
A találmány vonatkozik továbbá a gp75 nukleinsavmolekula izolált cDNS-molekulájára is, valamint a gp75 nukleinsavmolekula egy fragmensének 3. ábrán látható nukleotidszekvenciával rendelkező izolált cDNSmolekulájára, valamint az abból származó aminosavszekvenciára is.
A találmány vonatkozik továbbá vakcinákra is, amelyek a vakcinával kezelt alanyban stimulálják vagy fokozzák a gp75 elleni antitestek termelődését.
A találmány tárgya továbbá eljárás gp75 elleni antitestek termelődésének stimulálására vagy fokozására egy alanyban, oly módon, hogy az alanynak egy találmány szerinti vakcinát adagolunk az antitestek termelődésének stimulálására vagy fokozására hatásos dózisban.
A találmány tárgya továbbá eljárás rák kezelésére, megelőzésére vagy kiújulásának késleltetésére oly módon, hogy az alanynak egy találmány szerinti vakcinát
HU 218 416 Β adagolunk a rák kezelésére, megelőzésére vagy kimúlásának késleltetésére hatásos dózisban.
Az ábrákat röviden alább ismertetjük.
1. ábra: A TA99 mAb és AU szérum által felismert proteinek immunprecipitációja és peptidösszetételének analízise
A) Immunprecipitátumok egydimenziós SDS-PAGEanalízise származék-MEL-19 125I-jelzett lizátumaiból TA99 mAb-tel (1. sáv), normális humán szérummal (2. sáv) és 1/75-ből származó AU-szérummal (3. sáv) és 10/76-ból származó AU-szérummal (4. sáv)
B) A pg75-nek vagy az Endo H-val kezelt (részlegesen deglikozilált) gp75-nek megfelelő sávokat az SDS-poliakrilamid-gélből kivágjuk, és a peptidösszetételt S. aureus V8 proteázzal végzett korlátozott emésztéssel analizáljuk SDS-PAGE-módszerrel. -:gp75; +: Endo H-val részlegesen deglikozilált gp75. Az autoradiográfiás exponálás TA99 esetén két nap és általános képletű peptidek esetén 5 nap.
2. ábra: gp75-ből származó három peptid aminosavszekvenciája
Az aláhúzott aminosavmaradékok azok, amelyek különböznek a pMT4 egér cDNS-ből következtetett maradékoktól [Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B. és Muller R.: Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Rés. 14, 2413 (1986)].
3. ábra: gp75 részleges cDNS-szekvenciája
Az ábrán az 5’ -> 3’ részleges cDNS-fragmens látható a 778. nukleotidtól az 1524. nukleotidig.
4. ábra: gp75-öt kódoló teljes hosszúságú cDNS-izolálása
Az ábrán látható egy részletes restrikciós térkép,
2,7 kb gp75 cDNS-inzerttel. Látható a gp75 teljes
2,7 kb hosszúságú cDNS-ének első 18 nukleotidját tartalmazó részleges nukleotidszekvencia is 5’ -> 3’ irányban.
A találmányt közelebbről az alábbiakban ismertetjük.
A találmány izolált nukleinsavmolekulára vonatkozik, amelynek szekvenciája a gp75 aminosavszekvenciáját vagy annak egy ffagmensét kódolja.
A találmány egyik kiviteli alakja szerint a gp75 egy fragmensének aminosavszekvenciája: asn-thr-val-glugly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tyr-asp-pro-ala-val. Egy másik kiviteli alakban az aminosavszekvencia: metphe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu. Egy újabb kiviteli alakban az aminosavszekvencia: asn-pheasp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.
A találmány vonatkozik továbbá a gp75 nukleinsavmolekula valamely izolált cDNS-molekulájára is, valamint a gp75 nukleinsavmolekula egy fragmensének 3. ábrán látható nukleotidszekvenciával rendelkező izolált cDNS-molekulájára, valamint az ebből származó aminosavszekvenciára is.
A gp75 E-1-nek nevezett E. coli DH5a törzset - amely a pcvEx-nek nevezett plazmidvektort és a teljes 2,7 kb hosszúságú gp75 cDNS-inzertet magában foglaló gp75 E-l plazmidot tartalmazza (lásd 4. ábra) az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland, U. S. A) helyeztük letétbe (letéti száma:...), a Budapesti Szerződés előírásainak megfelelően [International Recognition of the Deposit of Microorganisms fór the Purposes of Patent Procedure (Budapest Treaty)].
A teljes 2,7 kb hosszúságú cDNS-t tartalmazó plazmidot a letébe helyezett E. coli gazdatörzsből szakemberek számára jól ismert módszerrel nyerhetjük ki [Maniatis T., Frish E. F. és Sambrook J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1.38-1.39, 1.42-1.343 (1989)]. A plazmidból a 2,7 kb gp75 cDNSizolálását EcoRI restrikciós endonukleázos emésztéssel végezhetjük, szakemberek által ismert módszerek alkalmazásával.
Ezenkívül a találmány expressziós vektorra is vonatkozik, amely egy, a vektor replikációjához elengedhetetlen DNS-szekvenciát tartalmaz a gp75 nukleinsavmolekula vagy ffagmense cDNS-molekulájával kombinálva, gazdaszervezetben való expresszióra adaptálva. Az expressziós vektor egy vacciniavírus vagy előnyösen egy Imclone vektor lehet.
A találmány továbbá vakcinára is vonatkozik, amely a vakcinával kezelt alanyban gp75 elleni antitestek termelésének stimulálására vagy fokozására alkalmas. Ez a vakcina a cDNS-molekulát tartalmazó expressziós vektort, hatékony mennyiségű adjuvánst és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. A kezelendő alany előnyösen ember, és a gp75 előnyösen az adjuvánshoz van kötve. Az adjuváns lehet egy mikrobiális adjuváns, vagy bármely egyéb gyógyászati szer.
A találmány vonatkozik továbbá olyan vakcinára, amely vakcinával kezelt alanyban gp75 elleni antitestek termelését stimulálja vagy fokozza, amely vakcina tartalmazhatja a gp75 nukleinsavmolekula vagy ffagmense cDNS-molekulájából származó aminosavszekvenciát vagy a tisztított gp75 vagy annak egy ffagmense olyan mennyiségét, amely képes az alanyban antitesttermelést stimulálni vagy fokozni, valamint hatékony mennyiségű adjuvánst és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót. A kezelt alany előnyösen ember, és a gp75 az adjuvánshoz kötve van. Az adjuváns mikrobiális adjuváns vagy bármely egyéb gyógyászati szer lehet.
A találmány vonatkozik továbbá egy eljárásra is gp75 elleni antitestek termelésének stimulálására vagy fokozására egy alanyban. Az eljárás értelmében az alanynak egy találmány szerinti vakcinát adagolunk antitestek termelésének stimulálására vagy fokozására hatásos dózisban.
A találmány továbbá egy eljárásra vonatkozik rák kezelésére rákos betegben. Az eljárás értelmében a kezelendő alanynak egy találmány szerinti vakcinát adagolunk rák kezelésére hatásos dózisban.
A találmány továbbá egy eljárásra vonatkozik rák megelőzésére. Az eljárás értelmében a kezelendő alanynak egy találmány szerinti vakcinát adagolunk rák megelőzésére hatásos dózisban.
A találmány továbbá eljárásra vonatkozik rák kiújulásának késleltetésére rákra érzékeny betegben, amely3
HU 218 416 Β nek értelmében a kezelendő alanynak egy találmány szerinti vakcinát adagolunk a rák kiújulásának késleltetésére hatásos dózisban.
A rák kezelésére, megelőzésére és kiújulásának késleltetésére szolgáló eljárások különféle rákok, például melanóma ellen alkalmazhatók. A találmány szerinti vakcinák olyan betegekben használhatók rák, például melanóma megelőzésére, amelyeknél nagy a valószínűsége a primer vagy kiújuló melanómának.
A fenti eljárásokban a gp75 az adjuvánshoz kötve lehet. Ezenkívül a kezelendő alanynak a vakcina adagolását megelőzően ciklofoszfamid hatékony mennyiségét is adagolhatjuk.
A találmányt részletesen az alábbi kísérleti részben ismertetjük. Az itt közöltek a találmány tökéletesebb megértését szolgálják a korlátozás szándéka nélkül.
1. kísérlet
Anyagok és módszerek
Szövettenyészet
Az SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalat 1% nem esszenciális aminosavakat és penicillint, valamint sztreptomicint tartalmazó MEM-tápközegben tenyésztjük azzal az eltéréssel, hogy 10 térfogat% SerumPlus (Hazelton Research Products Inc., Lenexa, KS) helyett magzati borjúszérumot (FCS) alkalmazunk.
rt gp75 izolálása és tisztítása
Az SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalból úgy izoláljuk a posztnukleáris membránfrakciót, hogy a sejteket 20 mmol/liter Tris-HCl (pH 7,5) 5 mmol/liter MgCl2 és 2 mmol/liter PMSF-t tartalmazó pufferben homogenizáljuk, és 10 000 g-vel centrifugáljuk. A membránokat 20 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 3 mol/liter KCl-t és 5 mmol/liter EDTA-tartalmú pufferben szolubilizáljuk és 100 000 g-vel centrifugáljuk. Az oldhatatlan proteinfrakciót 20 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 0,5% nátrium-dezoxikolát-tartalmú pufferben újraszuszpendáljuk. A detergensben oldható proteineket 100 000 g-vel való centrifugálással összegyűjtjük. A felülúszót 20 mmol/liter Tris-HCl-ot (pH 7,5), 0,15 mol/liter nátrium-kloridot és 2 mmol/liter CHAPS-t tartalmazó pufferrel szemben dializáljuk és Mono Q (HR 5/5 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. Piscataway, NJ) oszlopra visszük, amelyet 20 mmol/liter Tris-HCl-ot (pH 7,5), 0,15 mol/liter NaCl-ot és 2 mol/liter 3-[(3-kolamido-propil)-dimetil-ammonio]-l-propánszulfonátot (CHAPS) tartalmazó pufferrel (A puffer) ekvilibráltunk. A kötött proteineket 0-1,0 mol/liter NaCl lineáris gradiensével eluáljuk A pufferben. A frakciók gp75-tartalmát kompetitív gátlási vizsgálattal határozzuk meg. A gp75-öt tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Con A oszloppufferrel szemben [10 mmol/liter Tris-HCl (pH 7,5), amely 1 mmol/liter CaCl2,1 mmol/liter MnCl2-ot és 2 mmol/liter PMSF-t tartalmaz] dializáljuk, és egy Con A-Sepharose oszlopra visszük. A nem kötődő proteineket az oszloppufferrel való mosással távolítjuk el. A Con A-hoz kötött proteineket 0,25 mol/liter a-D-metil-mannopiranozidot tartalmazó Con A oszloppufferrel eluáljuk. A gp75-öt tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 10 mmol/liter Tris-HCl-ot (pH 7,5), 2 mmol/liter CHAPS-t és 2 mmol/liter PMSF-t tartalmazó pufferrel (CB) szemben dializáljuk, és TA99 egér monoklonális antitestet (mAb) [Thomson T. M., Mattes J. M., Roux
L. , Old L. J. és Lloyd K. O.: Pigmentation-associated glycoprotein of humán melanóma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermatol. 85, 169 (1985)] tartalmazó Affi-Gel 10 affinitást oszlopra visszük. A gélt egymás után 6-6 ml CB-pufferrel, 1 mol/liter NaCl-t tartalmazó CB-pufferrel és 2 mmol/liter CHAPS-t tartalmazó CB-pufferrel mossuk. A kötődött gp75-öt 2 mmol/liter CHAPS-t tartalmazó 0,1 mol/liter koncentrációjú glicin-HCl pufferrel (pH 3,1) eluáljuk az oszlopról.
Kompetitív gátlás vizsgálata gp75-re
A tisztítás során a gp75 jelenlétét és mennyiségét a frakciók 300 ng/ml TA99 mAb 1:1 térfogatarányú metanol/aceton elegyben fixált SK-MEL-19 sejtekhez való kötődését gátló képességének mérésével határoztuk meg, enzimes immunvizsgálati módszerrel (ELISA) [Houghton A. N., Brooks H., Cote R. J., Taormina
M. C., Oettgen H., F. és Old L. J.: Detection of cell surface and intracellular antigens by humán monoclonal antibodies: hybrid cells derived ff om lymphocytes of patients with malignant melanóma, J. Exp. Med. 158, 53 (1983)].
Immunprecipitáció, géieiektroforézis és peptidtérképezés
Az SK-MEL-19 Con A-Sepharose-hoz kötött protein frakciójának kloramin T módszerrel való jódozását és az immunprecipitációt TA99 mAb-vel és AU-szérummal Mattes és munkatársai módszere szerint hajtottuk végre [Mattes J. M., Thomson T. M., Old L. J. és Lloyd
K. O.: A pigmentation-associated, differentiation antigén of humán melanóma defined by a precipitating antibody in humán serum, Int. J. Cancer. 32, ΊΪΊ (1983)]. A proteineket SDS-pobakrilamid-gél elektroforézissel (SDS-PAGE) analizáltuk [Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Natúré 227, 680 (1970)]. Az endoglikozidáz H-val (Endo H) végzendő emésztéshez az immunprecipitátumot 0,4%-os SDS-ben szuszpendáltuk, 100 °C-on 5 percen keresztül melegítettük, és 1 milliegység Endo H-val (Genzyme Corporation, Boston, MA) emésztettük 100 mmol/liter koncentrációjú citrátpufferben (pH 5,5) 37 °C-on, 16 órán keresztül. A két-dimenziós elektroforézist amfolinok (pH 5-7) (LKB-Produkter, Bromma, Svédország) hajtottuk végre O’Farrel módszere szerint [O’Farrel P. H.: High resolution two-dimensional elektrophoresis of proteins, J. Bioi. Chem. 250, 4007 (1975)]. Az immunprecipitált gp75 peptidtérképezését Staphylococcus aureus V8 proteázzal (V8 proteáz, Boehringer Mannheim Biochemicals. Indianapolis, IN) hajtottuk végre, SDS-PAGEeljárással, Cleveland és munkatársai módszere szerint [Cleveland D. W., Fischer S. G, Kirschner M. W. és Laemmli U. K.: Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gél electrophoresis, J. Bioi. Chem. 252, 1102 (1977)].
Peptidszekvenálás
A peptid szekvenciájának meghatározását mikrokémiai felszereléssel (Harvard University Microche4
HU 218 416 Β mistry Facility) végeztük. Nitro-cellulózra elektroblottolt 12 pg tisztított gp75-öt V8 proteázzal (1:20 tömeg/tömeg) emésztettük Aebersold módszere szerint [Aebersold R. H., Leavitt J., Saavedra R. A. és Hood L. E.: Internál amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gél electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6970 (1987)], és a kapott peptideket Brownlee RP-300 2,1x100 mm-es C8-oszlopon választottuk szét 38 °C-on. A V8 proteázos emésztési termékből kapott csúcsokat összegyűjtöttük és szárítottuk. A teljes redukciót és alkilezést 50 pl 8 mol/liter karbamid/0,4 mol/liter ammóniumhidrogén-karbonát-puffer (pH 8,0) és 5 pl 100 mmol/liter koncentrációjú ditiotreit hozzáadásával és 50 °C-on, 15 percen keresztüli melegítéssel végeztük. A mintát ezután 5 pl 45 mmol/liter koncentrációjú jód-ecetsavval 15 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, és 140 pl desztillált vízzel hígítottuk. A redukált és alkilezett peptidffakció további emésztését tripszinnel (1:25 tömeg/tömeg) végeztük 1 éjszakán keresztül, 37 °C-on. A szekvenálandó frakciókat közvetlenül felvittük a polibrén előciklizált üvegszálas szűrőkre, és ABI477A proteinszekvenálóban szekvenáltuk. Az aminosavakat ABI 120A online HPLC-vel választottuk szét. Minden egyes peptid esetén legalább 20 ciklust végeztünk. A HPLC ismétlődő hozama rutin laboratóriumi körülmények között 93% volt. Csak a legnagyobb megbízhatósági eredményekkel rendelkező peptidek aminosavszekvenciáját közöljük.
A gp75 cDNS-klónozása és szekvenálása
Az SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalból cDNSkönyvtárat szerkesztettünk. A gp75 cDNS-klón izolálására oligonukleotid próbát alkalmaztunk ismert módszerek szerint [Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med. 169, 2029 (1989)]. Az oligonukleotid próbák szekvenciája a következő:
5’-CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC-3’. A gp75-1-nek nevezett 2,0 kb hosszúságú cDNS-klónt szekvenáltuk (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). A gp75-l nukleotidszekvenciáját az EMBL-adatbankban X51455 számon helyeztük letétbe (lásd 3. ábrát).
Eredmények és kiértékelésük
Mind a TA99 egér mAb, mind az AU melanómás betegből származó szérum immunprecipitál egy 75 kDa tömegű antigént, és a TA99 mAb előtisztítja az AU-szérummal precipitált gp75-antigént [Thomson T. M., Mattes J. M,, Roux L., Old L. J és Lloyd Κ. O.: Pigmentation-associated glycoprotein of humán melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermatol. 85, 169 (1985)]. Mivel a TA99 mAb-t alkalmaztuk az SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalból a gp75 tisztítására, jelentős volt megerősíteni, hogy a TA99 csak az AU-szérum által felismert gp75 antigént detektálja. Előkísérletekben kimutattuk, hogy a TA99 mAb nem reagál humán tirozinázzal, ami egy 75-80 kDa-os glikoprotein, és pigmentált melanocitákban szintén expresszálódik [Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi
S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med. 169, 2029 (1989)]. Azonban ezekkel a kísérletekkel nem tudtuk kizárni annak lehetőségét, hogy a TA99 mAb keresztreakcióba lép az SK-MEL-19 által expresszált egyéb polipeptidekkel.
A TA99 mAb-vel és AU-szérumantitestekkel immunprecipitált proteineket egy- és kétdimenziós SDS-PAGE-módszerrel és S. aureus V8 proteázzal végzett korlátozott proteolízis alkalmazásával peptidtérképezéssel analizáltuk. Azok a proteinek, amelyek mind TA99 mAb-vel, mind AU-szérumantitestekkel precipitálnak, azonos móltömeggel (75 kDa), izoelektromos ponttal (5,5-5,9) és peptidösszetétellel (1. ábra) rendelkeznek, megerősítvén, hogy a TA99 és az AUszérum ugyanazt a gp75 molekulát ismeri fel.
A gp75-antigént az Anyagok és módszerek részben ismertetett módon tisztítottuk. A peptid szekvenálására az affinitási kromatográfiával tisztított gp75-öt alkalmaztuk. A tisztított gp75 V8 proteázzal és tripszinnel való proteolitikus hasításával kapott három belső peptid aminosavszekvenciáját határoztuk meg. A három peptid szekvenciája a 2. ábrán látható. 90%-os azonosságot találtunk a Shibara és munkatársai által izolált pMT4 egér cDNS-klónból következtetett aminosavszekvenciával (a pMT4 247-260-as, 333-349-es és 428-442-es helyzetű aminosavaiban) [Shibahara, S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B. és Muller R.: Cloning and expression of cDNS encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Rés. 14, 2413 (1986)], A gp75 peptidszekvenciáiból származtatott oligonukleotid próbákat alkalmaztuk az SK-MEL-19 humán melanóma-sejtvonalból szerkesztett cDNS-könyvtár szűrővizsgálatára. Az SK-MEL-19 cDNS-könyvtárából két cDNS-klónt (1,8 és 2,0 kb hosszúságú) izoláltunk. A cDNS-klónok (gp75-l és -2) részleges nukleotidszekvenciái - amelyek egyikét a 3. ábrán mutatjuk be - 88,6%-os azonosságot mutattak a pMT4-gyel (a nyitott leolvasási keretben a 649-1437-es helyzetű nukleotidokkal). A gp75-l és -2 származtatott aminosavszekvenciája 93,6%-ban azonos a pMT4 219-467es helyzetű aminosavmaradékok közötti aminosavszekvenciájával. A gp75 cDNS-szekvenciája és a humán tirozináz cDNS-szekvenciája [Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med. 169, 2029 (1989)] között 55,3% az azonosság a tirozináz 618-1344-es helyzetű nukleotidjaiban.
A humán gp75 és az egér pMT4 gén következtetett termék közötti nagyfokú homológia némi fényt vet a gp75 lehetséges szerkezetére és funkciójára. A pMT4 kiónt egér melanocitasejtekből izolálták [Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B. és Muller R.: Cloning and expression of cDNS encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Rés. 14, 2413 (1986)]. Eredetileg azt gondolták, hogy a pMT4 cDNS egértirozinázt kódol, amely az egér c
HU 218 416 Β (albínó) lókuszban foglal helyet. További tanulmányok azonban azt mutatták, hogy a pMT4 különbözik az egértirozináztól [Yamamoto H., Takeuchi S., Kudo T., Makino K., Nakata A., Shinoda T. és Takeuchi T.: Cloning and sequencing of mouse tyrosinase cDNS, Jpn. J. Genetics. 62, 271 (1987); Muller G., Ruppert S., Schimd E. és Schutz G.: Functional analysis of alternatively spliced tyrosinase gene transcripts, EMBO (Eur. Mól. Bioi. Organ. J.) 7, 2723 (1988); Jackson I. J.: A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4392 (1988)]. Hasonlóképpen a gp75 szekvenciája is különbözik a humán tirozináz szekvenciájától, annak ellenére, hogy bizonyos fokú azonosság (43,1%) van a gp75 és a humán tirozináz származtatott aminosavszekvenciája között (a 208-459-es helyzetű aminosavmaradékokban). A gp75 és a pMT4 tennék funkciójára abból a tényből következtettek, hogy a pMT4 a b (barna) lókuszban helyezkedik el egérben [Jackson I. J.: A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4392 (1988)], amely régió a szőrtakaró színét szabályozza [Silvers W. K.: Comparative genetics of coat colour in mammals, In: The Coat Colors in Mice, Springer Verlag, New York, 1. oldal (1979)]. A gp75 és a pMT4 következtetett aminosavszekvenciája közötti homológia lehetővé teszi az egér barna lókusz géntermék humán homológjának formális azonosítását. Melanoszomális lokalizációja és tirozinázhoz való szerkezeti hasonlósága alapján a gp75 molekula valószínűleg a melanin szintézisét szabályozza és meghatározza a szintetizálódott melanin típusát.
Ismert az, hogy a melanoszomális determinánsok és az egyéb intracelluláris antigének nem potenciális célpontok a melanóma immunterápiájára. Napjainkban azonban nyilvánvalóvá vált, hogy az intracelluláris proteineket az antigént termelő sejtek előállíthatják és citotoxikus T-sejteknek peptidként prezentálhatják [Townsend A. R. M. és Bodmer H.: Antigén recognition by eláss I-restricted T lymphocytes, Ann. Rév. Immunoi. 7, 601 (1989)]. Ez a felfedezés elméletileg megnyitja annak lehetőségét, hogy a melanóma elleni T-sejt-válaszok a tumorsejtben expresszálódott molekulák ellen irányulhatnak. Az is előfordulhat, hogy a melanoszomális komponensek - amelyek normális esetben az érés során a melanocitán kívülre transzportálódnak - felhalmozódhatnak a tumorsejtek körüli extracelluláris térben, vagy a helyi szövetelhalás intracelluláris termékek szabaddá válásához és lerakódásához vezethet. A gp75 hozzáférhetőségét alátámasztja az, hogy a radioaktívan jelzett TA99 mAb specifikusan lokalizálja a humán melanóma xenograftokban nu/nu egerekben [Welt S., Mattes J. M., Grando R., Thomson T. M., Leonard R. W., Zanzonico P. B., Bigler R. E., Yeh S., Oettgen H. F. és Old L. J.: Monoclonal antibody to an intracellular antigén images humán melanóma transplants in nu/nu mice, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84, 4200 (1987)] jelezvén az antigén hozzáférhetőségét az antitest számára a tumoros helyeken belül.
Az AU-melanomás betegben az IgG-antitestek felismerték a gp75 determinánsait, amelyek megoszlottak a melanómasejtek és a normál melanociták között [Mattos J. M., Thomson T. M., Old L. J. és Lloyd Κ. O.: A pigmentation-associated, differentiation antigén of humán melanóma defined by a precipitating antibody in humán serum, Int. J. Cancer. 32, 717 (1983)]. A gp75-öt kódoló cDNS-klónok izolálásával lehetőség nyílik a gp75 elleni aktív immunizálás stratégiájának tanulmányozására. A gp75-re adott CTL-válaszok hatékony indukálásának legalább két követelménye van:
1. a gp75-tel szembeni immuntoleranciát meg kell törni, és
2. a gp75 peptideket a melanómasejteken lévő fő hisztokompatibilis antigéneknek kell előállítani és hatékonyan prezentálni.
Az is lehetséges, hogy a melanociták differenciálódási antigénjei hordoznak egyedi determinánsokat. A normális melanociták által expresszált termékeket kódoló gének mutálhatnak vagy átrendeződhetnek a rosszindulatú transzformáció során, a CTL és az antitestek általi felismeréshez új epitopok kialakulása közben. Ebben a tekintetben a legjobban jellemzett egyedi antigén a humán melanómasejtekben egy, a melanotranszferinen lévő determináns, ami egy 95-97 kDa méretű glikoprotein, amely a tenyésztett melanocitákon és melanómasejteken expresszálódik [Reál F. X., Mattes M. J., Houghton A.
N., Oettgen H. F., Lloyd Κ. O. és Old L. J.: Class 1 (unique) antigens of humán melanóma. Identification of a 90,000 dalton cell surface glyeoprotein by autologous antibody, J. Exp., Med. 160, 1219 (1984); Furakawa K. S., Furakawa K., Reál F. X., Old L. J. és Lloyd Κ. O.: A unique antigenic epitope of humán melanóma is carried on the conunon melanóma glyeoprotein gp75/p97, J. Exp. Med. 169, 585 (1989)]. Ezen lehetőséget alátámasztja az, hogy nagy gyakorisággal és a humán melanómasejtek genomjában kiterjedten detektáltak genetikus változásokat [Dracopoli N. C., Houghton A. N. és Old L. J.: Loss of polymorphis restriction ffagments in malignant melanóma: Implications fór tumor heterogeneity, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1470 (1985); Dracopoli N. C., Alhadeff B., Houghton A. N. és Old L. J.: Loss of heterozygosity at autosomal and x-linked loci during tumor progression in a patient with melanóma, Cancer Rés. 47, 3995 (1987)].
2. kísérlet
Anyagok és módszerek
2,7 kb hosszúságú qp75 cDNS-izolálása λ-fágban
Az 1. kísérletben ismertetett 2,0 kb hosszúságú gp75 cDNS-ffagmenst (szekvenciáját a 3. ábra mutatja) alkalmaztuk egy genomiális könyvtár szűrővizsgálatára. Egy genomiális kiónt kaptunk, amely tartalmazta a gp75 gént.
cDNS-könyvtár előállítása és szűrővizsgálata
A cDNS-könyvtárat 3 pg poli(A)-ból és humán melanotikus SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalból [Houghton A. N., Eisinger M., Albínó A. P., Caimcross J. G. és Old L. J.: Surface antigens of melanocytes and melanóma: markers of melanocyte differentiation and melanóma subsets. J. Exp. Med. 156, 1755 (1982)] pre6
HU 218 416 Β páráit szelektált mRNS-ből állítottuk elő [Maniatis T., Frish E. F. és Sambrook J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 545. oldal (1982)]. Szintetizáltuk a teljes hosszúságú cDNS-t, Klenow-enzimmel tompa végűvé tettük és EcoRI linkerekkel farkaztuk (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) [Gubler U. és Hoffman B. J.: A simple and very efficient method of generating cDNA libraries. Gene (Amst.), 25, 262 (1983)]. A cDNS-t ezután méret szerint frakcionáltuk Ultrogel Aca 34-en (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) [Watson C. J. és Jackson J. F.: Constructing and screening cDNA libraries in λ gt 10 and λ gtll. In DNA Cloning: A practical Approach. D. M. Glover, editor. IRL Press Limited, Oxford. 79-100 (1985)]. A 800 bp-nál nagyobb cDNS-molekulákat alkalmaztuk egy 3xl05 rekombinánst tartalmazó könyvtár szerkesztésére gt 10 λ-fág-vektorban [Huynh T. V., Young R. A. és Davis R. W.: An altematíve procedure fór the synthesis of double stranded cDNA fór cloning in phage and plasmid vectors. In DNA Cloning: A practical Approach. Szerk. Glover D. M., IRL Press Limited, Oxford, 49-78. oldal (1985)].
Szűrővizsgálatra a fent kapott genomiális klón 5’terminális kódolórégióján alapuló fragmenset alkalmaztuk. Egy 2,7 kb hosszúságú cDNS-t kaptunk λ-fágban [Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med. 169, 2029 (1989)].
2,7 kb hosszúságú cDNS kinyerése
A 2,7 kb cDNS-gp75 inzertet EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztettük. A DNS-t fenol/kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. A DNS-t TE-ben (pH 7,6) 100 pg/ml koncentrációban újra feloldottuk. A ragadós végek ligálását az alábbiak szerint végeztük. Előállítottuk az alábbi ligációs elegyet.
1. 0,1 pg pcvEx vektor-DNS-t vittünk egy steril mikrocentrifugacsőbe. Hozzáadtunk ekvivoláris menynyiségű 2,7 kb gp75 cDNS-t.
2. H2O-val 7,5 μΐ-re töltöttük és az oldatot 45 °C-on 5 percen keresztül melegítettük, hogy az újraillesztett ragadós végeket felolvasszuk. Az elegyet 0 °Cra hűtöttük.
3. Ezután hozzáadtunk 1 μΐ 10-szeres töménységű bakterofág T4 DNS-ligáz puffért [200 mmol/liter Tris-HCl (pH 7,6), 50 mmol/liter MgCl2, 50 mmol/liter ditiotreitol, 500 pg/ml marhaszérum-albumin (V. frakció, Sigma)], 0,1 Weiss-egység T4 bakteriofág DNS-ligázt és 1 μΐ 5 mmol/liter koncentrációjú ATP-t. A reakcióelegyet 1-4 órán keresztül 16 °C-on inkubáltuk. így kaptuk a 4. ábrán bemutatott gp75 E1 plazmidot, amely a pcvEx plazmidvektort és a
2,7 kb gp75 cDNS-inzertet tartalmazza.
Kompetens E. coli előállítása
Az egyes ligációs elegyekből 1-2 μΐ-t alkalmaztunk az alábbi módszerrel kapott kompetens E. coli transzformálására. Friss, 1 éjszakás lemezről származó tenyészetből egyetlen teleppel beoltunk 5 ml LB-tápközeget. A sejteket rázás közben 5-7 órán keresztül tenyésztjük. 4 ml így kapott tenyészettel inokulálunk egy 4 literes lombikban lévő 1 liter LBtáptalajt. A sejteket O.D.550 = 0,15 sűrűségig növesztjük. A tenyészetet 10 percen keresztül 3 K-val lecentrifugáljuk, és 400 ml 100 mmol/liter koncentrációjú CaCl2oldatban 0 °C-on újraszuszpendáljuk. Ezután 10 percen keresztül 3 K-val újracentrifugáljuk, és 10 ml 100 mmol/liter koncentrációjú CaCl2-ban, 0 °C-on újraszuszpendáljuk. Hozzáadunk 2,5 ml 80%-os glicerint.
DH5a. E. coli transzformálása
100 μΐ kompetens sejthez 1-20 μΐ gp75 E-l plazmidot adunk. Az elegyet 20 percen keresztül jégen tartjuk. Ezután 1 percen keresztül 42 °C-on melegítve hósokknak tesszük ki. Az elegyet újra jégre helyezzük 10 percen keresztül. A sejteket ezután 10 sec-on keresztül mikrocentrifugában centrifugáljuk, és 200 μΐ LBben újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót 45 percen keresztül, 37 °C-on rázatás közben inkubáljuk.
Az így kapott E. colit, amely a gp75 E-l plazmidot tartalmazza, az ATCC-nél letétbe helyeztük.
3. kísérlet
Anyagok és módszerek
Reagensek
Az L-[gyűrű-3,5-3H]tirozint (specifikus aktivitása
46,7 Ci/mmol) az ICN-től (Irvine, CA) szereztük be. A konkanavallin A-Sepharose és a protein A-Sepharose CL 4B a Pharmacia (Piscataway, NJ) terméke. Az Affigel-10 a Bio-Rad (Richmond, CA) terméke. Az összes elektroforetikus vegyszert a BRL (Gaithersburg, MD) gyártja. A dezoxikolsav-nátriumsó, a Nonidet P40, a 3-[(3-kolamido-propil)-dimetil-ammonio]-l-propánszulfonát (CHAPS), a fenil-metánszulfonil-fluorid (PMSF) és az α-D-metil-mannopiranozid, a lúgos foszfatázzal konjugált kecske-antiegér IgG, a lúgos foszfatáz színkifejlesztő reagens és az egyéb reagenstisztaságú vegyszerek a Sigma (St. Louis, MO) terméke. A HPLC-tisztaságú vizet és egyéb reagenstisztaságú szerves oldószert Fisher (Pittsburgh, PA) gyártotta. A TA99 egér mAb-ket (IgC2A) és az F23-at (IgG2a) protein A-Sepharose alkalmazásával tisztítottuk. A TA99 mAb egy anti-gp75 antitest [Thomson T. M., Mattes J. M., Roux L., Old L. J. és Lloyd K. O.: Pigmentationassociated glycoprotein of humán melanóma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, J. invest. Dermat., 85, 169-174 (1985)], és a kontroll antitestként alkalmazott F23 mAb, egy antihumán vastagbél-karcinoma antitest, amely nem reagál humán melanocitasejtekkel.
Szövettenyésztés
Az SK-MEL-19 melanóma-sejtvonalat 10% SerumPlusszal (Hazelton, Lenexa, KS) kiegészített MEM-tápközegben tenyésztettük és passzáltuk, Vijayasaradhi S. és munkatársai módszere szerint [Vijayasaradhi S., Bouchard Β. B. és Houghton A. N.: The melanóma antigén gp75 is the humán homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Exp. Med., 171, 1375-1380(1990)].
A gp75 izolálása és tisztítása
A gp75 tisztítására végzett összes műveletet 0-5 °C-on hajtottuk végre, kivéve, ha azt másként nem
HU 218 416 Β jelezzük. A 150 cm2 felületű lombikokban lévő félig összefüggő SK-MEL-19 melanóma-sejttenyészetet gumivégű bottal lekaparva összegyűjtjük, szövettenyészettápközegbe visszük, és centrifugáljuk, majd a sejteket (60 g üledék) PBS-sel mossuk. A sejteket 300 ml, 20 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 5 mmol/liter MgCl2és 2 mmol/liter PMSF-tartalmú oldatban 10 percen keresztül szuszpendáljuk, és Dounce-homogenizátorban homogenizáljuk. A sejtek lízisét fáziskontraszt-mikroszkóppal követjük. A homogenizátumot 1000 g-vel 10 percen keresztül centrifugáljuk, majd a felülúszót összegyűjtjük és 10 000 g-vel 30 percen keresztül centrifugáljuk. A nyers membránüledéket 50 ml, 20 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 3 mol/liter KC1- és 5 mmol/liter EDTA-tartalmú oldatban szuszpendáljuk, Dounce-homogenizátorban enyhén homogenizáljuk, és 100 000 gvel 90 percen keresztül centrifügáljuk. Az üledéket 30 ml, 20 mmol/liter Tris-HCl (pH 7,5), 0,5% nátriumdezoxikolát-tartalmú oldatban újraszuszpendáljuk és óvatosan homogenizáljuk. A homogenizátumot 100 000 gvel centrifügáljuk és a felülúszót 200-300 térfogatnyi, 20 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 0,15 mol/liter NaClés 2 mmol/liter CHAPS-tartalmú oldattal szemben 24 órán keresztül dializáljuk. A dializátumot 100 000 gvel, 90 percen keresztül centrifugálva derítjük. A fenti lépésből kapott tiszta felülúszót egy 20 mmol/liter Tris/HCl- (pH 7,5), 0,15 mol/liter NaCl és 2 mmol/liter CHAPS-tartalmú oldattal (A puffer) ekvilibrált Mono Q (Pharmacia, HR 5/5) oszlopra visszük, amelyet Superloopon (Pharmacia) keresztül 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopot 10 ml A pufferrel mossuk, a kötődött proteineket 30 ml 0-1,0 mol/liter NaCl lineáris gradiensével eluáljuk A pufferben, és 1 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciók gp75-tartalmát kompetitív gátlást vizsgálattal mutatjuk ki, és a pozitív frakciókat összegyűjtjük és 100 térfogat Con A oszloppufferrel [10 mmol/liter Tris-HCl (pH 7,5), amely 1 mmol/liter CaCl2-ot, 1 mmol/liter MnCl2-ot és 2 mmol/liter PMSF-et tartalmaz] szemben dializáljuk, 18 órán keresztül.
Con A-Sepharose kromatográfia 5 ml Con A-Sepharose-t 50 ml Con A oszloppufferrel mosunk 10 ml-es Econo-oszlopban (Bio-Rad), és a Mono Q ioncserélő kromatográfiás oszlopról kapott összegyűjtött, dializált frakciókat az oszlopra visszük 1,0-1,5 ml/perc átfolyási sebességgel. Az effluenst visszavisszük az oszlopra, és az oszlopot oszloppufferrel mossuk, amíg az effluens abszorpciója 280 nm-en 0,01 alatti. A Con A-hoz kötött proteineket 0,25 mol/liter α-D-metil-mannopiranozidot tartalmazó Con A oszloppufferrel eluáljuk, 1,5-2 ml frakciókat gyűjtünk. A protein hozamát javítja, hogyha az eluálás előtt az oszlopot 25-30 °C-on, 15-20 percen keresztül az eluciós pufferrel inkubáljuk. A gp75-öt tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 10 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 2 mmol/liter CHAPS- és 2 mmol/liter PMSF-tartalmú oldattal szemben dializáljuk, majd TA99 Affi-Gel 10 affinitási oszlopra visszük fel.
TA99 affinitási kromatográfia A TA99 mAb-t BALB/c χ C57BL/6 F, egerek aszciteszéből tisztítottuk ammónium-szulfátos kicsapással, majd protein A-Sepharose-on és Sephadex G-25 oszlopon való kromatografálással. Az Affi-Gel 10-et a kapcsolásra a gyártó előírásai szerint készítettük elő, és hideg kapcsolópufferral (CB), (50 mmol/liter HEPES (pH 7,6), 150 mmol/liter NaCl) mostuk. A kapcsolási reakciót 4 °C-on, 4 órán keresztül végeztük 9 mg tisztított TA99 IgG/2 ml Affi-Gellel, 6 ml kapcsolópuffer össztérfogatban. Az üresen maradt kapcsolóhelyeket azonos térfogatú 0,1 mol/liter koncentrációjú etanol-aminHCl-oldattal (pH 8,0) 1 órán keresztül, 4 °C-on inkubálva blokkoljuk. A gélt ezután egymás után mossuk CB-vel, CB + 1,5 mol/liter NaCI-dal, CB-vel, és végül 10 mmol/liter Tris-HCl- (pH 7,5), 0,15 mol/liter NaCl- és 2 mmol/liter CHAPS-tartalmú pufferrel. A kapcsolás hatékonyságát úgy határoztuk meg, hogy 4 órás kapcsolási reakció előtt és után mértük a TA99 antitest titerét a kapcsolási reakcióelegy tiszta felülúszójában ELISA-módszerrel, SK-MEL-19 melanómasejtekkel szemben az A kapcsolás hatékonysága 60-80%, és közelítőleg 5 mg TA99 IgG kapcsolódott 1 ml Affi-Gel 10-hez. A Con A kromatográfíával kapott proteinoldatot összegyűjtjük és dializáljuk, majd 2 ml mAb TA99-Affi-Gel 10 oszlopra visszük 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel, és az effluenst az oszlopra újra feltöltjük. A gélt ezután egymás után mossuk 6-6 ml CB-vel, CB+1 mol/liter NaCldal, CB-vel és CB+2 mmol/liter CHAPS-vei. A kötődött gp75-öt az oszlopról 2 mmol/liter CHAPS-t tartalmazó 0,1 mol/liter koncentrációjú glicin-HCl oldattal (pH 3,1) eluáljuk.
A gp75 vizsgálata enzimkötött immunszorbenssel Az ELISA-vizsgálathoz tripszinezett sejteket helyeztünk a mikrotitrálólemezek rezervoárjaiba 500-2000 sejt/rezervoár sűrűségben (Microtest Plates 3034, Falcon, Oxnard, CA), és a tenyésztést 48-72 órán keresztül, 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves szövettenyészet-inkubátorban végeztük. A lemezeket CB-vel mostuk, -20 °C-ra hűtött, 1:1 térfogatarányú metanol/aceton eleggyel fixáltuk 10 percen keresztül, majd 0,2% nátrium-azidot tartalmazó hideg PBS-sel háromszor mostuk. A fixált és permeabilizált sejteket tartalmazó sejteket 4 °C-on tároltuk. A TA99 antitesttitert frissen fixált lemezeken határoztuk meg ELISA-módszerrel. (A TA99 mAb titerében nem tapasztaltunk jelentős változást, ha a lemezeket 4 °C-on, 6 hónapon keresztül tároltuk.) Röviden, a sejteket 10 μΐ/rezervoár, 5% gamma-globulinmentes FBS-t (GGFFBS) tartalmazó PBS-sel sorozathígított TA99 mAb-vel inkubáltuk 45 percen keresztül, majd a lemezeket háromszor mostuk 2% GGFFBS-t tartalmazó PBS-sel, lúgos foszfatázzal konjugált kecskeantiegér IgG-t (5% GGFFBS-t tartalmazó PBS-sel 1:200 arányban hígítva) adtunk az egyes rezervoárokba, és 45 percen keresztül inkubáltuk. A lemezeket a fentiek szerint háromszor mostuk, és 18 pl lúgos foszfatáz szubsztrátoldatot [p-fenil-dinátrium-foszfát dietanol-amin-pufferben (pH 9,8), 5 mmol/liter MgCl2] adtunk hozzá. Nedves kamrában 37 °C-on, 15-20 percen keresztüli inkubálás után 405 nm-en mértük az optikai sűrűséget Artek (Chantilly, VA) mikrolemez-leolvasóban (Model 210).
HU 218 416 Β
A qp75 vizsgálata kompetitiv gátlással
A kezdeti lépésekben a gp75 tisztítását a frakciók TA99 mAb SK-MEL-19 sejtekhez való kötődését gátló képességének mérésével követtük, és számszerűleg meghatároztuk a fent ismertetett ELISA-módszerrel. A szubcelluláris frakciókat vagy az oszlopkromatográfiával kapott frakciókat 96 rezervoáros lemezeken sorozathígítottuk. A TA99 antitestet 300 ng/ml végkoncentrációban (éppen az SK-MEL- 19-hez való telítési kötődés alatt) adtuk a rezervoárokba. Az antigén-antitest elegyet szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül inkubáltuk, majd az SK-MEL-19 sejtekhez adtuk a mikrotitrálólemez rezervoáijaiban. Az SK-MEL-19 sejtekhez kötött TA99 mAb mennyiségét ELISA-módszerrel mértük a fent ismertetett módon. A gp75 aktivitásának 1 egységét úgy definiáltuk, mint a protein azon mennyiségét, amely a TA99 mAb (300 ng/ml) SK-MEL-19 sejtekhez való kötődése maximális gátlásának feléhez szükséges.
Gélelektroforézis és elektroblottolás
A proteineket SDS-poliakrilamid-gél elektroforézissel [Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bactriophage T4, Natúré (Lond.), 227, 680-685 (1970)] analizáltuk, és ezüstfestéssel [Oakley, B. R., Kirsch D. R. és Morris N. R: A simplified ultrasensitive silver stain fór detecting proteins in acrylamide gels, Anal. Biochem. 105, 361-363 (1980)] tettük láthatóvá. A proteineket Transphor-készülékben (Hoefer, San Francisco, CA) elektroblottoltuk PVDF (polivinilidén-difluorid) membránra (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) az N-terminálisszekvenálás és az aminosav-összetétel analízise céljából Matsudaira módszere szerint [Matsudaira P.: Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted on to polyvinylidene difluoride membranes, J. Bioi. Chem. 262,10035-10038 (1987)].
Aminosavanalízis
A PVDF-membránra átvitt proteinminta aminosavanalízisét mikrokémiai felszereléssel (Harvard University Microchemistry Facility) végeztük. 0,6 és 0,8 pg proteint 6 n sósavban 24 órán keresztül, 110 °C-on hidrolizáltunk. A szabad aminosavakat fenil-izotiocianáttal derivatizáltuk, és a kapott fenil-tiokarbamoil aminosavakat HPLC-vel analizáltuk Ebért R. F. módszerével [Ebért R. F.: Amino acid analysis by HPLC: optimized conditions fór chromatography of phenylthiocarbamyl derivatives, Anal. Biochem., 154, 431-435 (1986)].
Tirozin-hidroxiláz-aktivitás vizsgálata immunprecipitációval
Detergenssel szolubilizált (1% NP40 PBS-ben) melanóma (SK-MEL-19) sejtextraktumok 100 pg alikvotjait 3-15 pg TA99 mAb-vel (anti-gp75), F23 mAb-vel vagy PBS-sel inkubáltuk 45 pl végterfogatban, 4 °C-on, 90 percen keresztül, folyamatos keverés közben. 6 mg/ml végkoncentrációban hozzáadtuk a protein A-Sepharose CL 4B-t. Az elegyet 2 órán keresztül 4 °C-on inkubáltuk, majd a felülúszót 15 000 fordulat/perccel, 5 percen keresztül, 4 °C-on centrifugálva összegyűjtöttük. Az üledéket 1% NP40-et tartalmazó PBS-sel ötször mostuk, és azonos puffer 50 pl-ében szuszpendáltuk. A tirozin-hidroxiláz-aktivitást a felülúszóban és az üledékben is meghatároztuk. A sejtextraktumokban a protein A-Sepharose hozzáadása előtt jelen lévő összes tirozin-hidroxiláz-aktivitás mintegy 85%-a reprodukálhatóan kinyerhető a PBS-kontroll felülúszóiban. Az antitesttel és a protein A-Sepharosesal inkubált sejtextraktumok felülúszóiban kimutatott enzimaktivitást a PBS-kontrollban kimutatott aktivitás százalékaként adjuk meg.
Tirozin-hidroxiláz-aktivitás meghatározása
A tirozin-hidroxiláz-aktivitást Pomerantz S. H. módszere szerint határozzuk meg [Pomerantz S. H.: L-Tyrosine 3,5-H assay fór tyrosinase development in skin of newbom hamster, Science 164, 838-839 (1969)], Bouchard B. és munkatársai módosításaival [Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med. 169, 2029-2042 (1989)]. Az enzimaktivitás egy egységét azon protein mennyiségeként definiáljuk, amely 1 pmol 3H2O felszabadításához szükséges 3H-tirozinból 1 óra alatt, 37 °C-on.
Protein meghatározása
A proteinkoncentrációt festékkötődési módszerrel határozzuk meg [Bradford M.: A rapid and ultrasensitive method fór the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)], Bio-Rad proteinvizsgálati rendszert alkalmazva. A tisztított gp75 mennyiségét a poliakrilamid-gélben lévő proteinsávok festékintenzitásának mérésével határozzuk meg ezüsttel festett móltömeg-marker proteinek, ismert mennyiségeinek sorozatához viszonyítva (10-100 ng/proteinsáv).
Eredmények és értékelésük
A gp75 antigén forrásaként SK-MEL-19 melanómasejtvonal posztnukleáris membránfrakcióját alkalmaztuk. A membránfrakciót nagy sókoncentrációval (3 mol/liter KC1) kezeltük, és a nagy sókoncentrációban oldhatatlan frakciót szolubilizáltuk a detergens dezoxikolátban. A nukleáris üledék kivételével az összes szubcelluláris frakciót megvizsgáltuk a gp75 jelenléte szempontjából kompetitiv ELISA alkalmazásával, amellyel a TA99 mAb SK-MEL-19 sejtekhez való kötődésének gátlását (gp75 aktivitás) méljük. A gp75-aktivitást csak a dezoxikolátban oldódó membránfrakcióban mutattunk ki, de a nagy sókoncentrációban oldódó frakcióban nem. Ez összhangban van gp75 integrális membránlokalizációjával. A gp75 melanoszomális membránon való lokalizációját úgy mutattuk ki, hogy a melanómasejteket 35Smetioninnal metabolikusan „pulse-chase” jeleztük, majd a melanoszomák feldúsítására szakaszos szacharóz sűrűséggradiens frakcionálási végeztünk, végül elvégeztük az immunprecipitációs analízist. Ezekben a kísérletekben a gp75-öt csak a detergenssel szolubilizált melanoszomákat tartalmazó, pigmentált gradiensfrakciókból lehetett immunprecipitálni.
A gp75 kezdeti dúsítását a dezoxikolátban oldható membránfrakció Mono Q (anioncserélő) oszlopon való frakcionálásával hajtottuk végre. A kötött gp75 0,26-0,5 mol/liter NaCl-koncentrációval széles aktivitáscsúcsként eluálódik, amely töltés-mikrohete9
HU 218 416 Β rogenitást jelez. Ezt a kétdimenziós SDS-PAGE is megerősíti (pl 5,5-5,9). Megfigyeltük, hogy az ikerionos detergens {3-[(3-kolamido-propil)-dimetil-ammonio]-l-propánszulfonát (CHAPS)} jelenléte vagy hiánya az oszlop ekvilibrációs pufferben vagy a mintapufferben nem befolyásolja a gp75 kötődését a Mono Q oszlophoz, de a CHAPS elúciós pufferhez való hozzáadása javítja a gp75-hozamot.
A gp75-aktivitást tartalmazó Mono Q frakciókat összegyűjtöttük, konkanavalin A (Con A) oszloppufferben dializáltuk és Con A-Sepharose oszlopra vittük. A felvitt proteinek mintegy 60%-a kötődik a Con Ahoz. A kötött protein 0,25 mol/liter koncentrációjú aD-metil-mannopiranoziddal való elúciója egy széles fő csúcsot ad, amelyet egy kisebb csúcs követ. A gp75 antigén Con A-oszlophoz való kötődésében heterogenitást tapasztaltunk, amelyet az elúció során több gp75aktivitáscsúcs jelez. Ezt következetesen megfigyeltük több oszlopkromatográfiás futtatásban. Megfigyeltük, hogy a gp75 a melanocitákban és melanómasejtekben két érett formában létezik, amelyek az Asn-kötött, komplex szénhidrátok számában vagy összetételében különböznek egymástól. A Con A-hoz való kötődés heterogenitása azonban nem az Asn-kötött, nagy mannóztartalmú szénhidrátokban lévő kimutatható különbségekből származik. Ezt az eluált csúcsfrakciók radioaktív jódozásával és a gp75 TA99 mAb-vel való immunprecipitálásával, majd a nagy mannóztartalmú szénhidrátláncok endo-P-N-acetil-glukózaminidáz-H-val (Endo H) való emésztésével végzett eltávolításával bizonyítottuk. Az összes vizsgált csúcs gp75-nek két érett formáját tartalmazta, amelyek az Endo H-val való emésztés után SDS-PAGE-lemezen két, 63 és 66 kDa méretű sávot adtak.
A gp75-öt tartalmazó Con A-eluátumokból kapott frakciókat összegyűjtöttük és TA99 mAb affinitási oszlopra vittük. A gp75 teljesen hiányzott az affinitási oszlop effluenséből, amint azt ELISA-módszerrel és az SDS-PAGE ezüstfestésével kimutattuk. Az effluens az oszlopra felvitt összes protein 92%-át tartalmazta. A kötött gp75 elúciójának körülményeit előre meghatároztuk, a TA99 mAb permeabilizált és metanol/aceton eleggyel fixált SK-MEL-19 melanómasejtekhez való kötődésének gátlása alapján ELISA-módszerrel (az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint). A TA99 mAb gp75-höz való kötődése befolyásolható vagy megfordítható 0,1 mol/liter koncentrációjú glicinHC1 pufferrel (pH 3,1). Az oszlop eluálása 0,1 mol/liter koncentrációjú glicin-HCl pufferrel mintegy 0,5 nmol tisztított gp75-öt eredményezett 1,7 mg oszlopra felvitt proteinből, amint azt poliakrilamid-gélben a gp75sáv ezüstfestésének intenzitásából meghatároztuk. A gp75 elúciója a TA99 antitestaffinitási oszlopról a TA99 antitestek (nehéz és könnyű láncok) nyomnyi mennyiségeinek átszűrődésével járt, amely további, 53, 28 és 26 kDa-os kis sávok megjelenését eredményezte az ezüsttel festett gélben. Megerősítettük, hogy ezek a további sávok az oszlophoz kötött TA99 antitestből származtak, és nem az SK-MEL-19 antigénpreparátumból oly módon, hogy
1. az 53, 28 és 26 kDa-os proteineket nyúl-antiegér IgG-antitesttel immunprecipitáltuk, és
2. bizonyítottuk, hogy ezek a sávok nem az SK-MEL-19 lizátum radiojódozott készítményéből származnak.
A gp75 tisztításának összefoglalását az 1. táblázatban ismertetjük.
1. táblázat A gp75 tisztítása
| Proteinfrakció | Összes protein1 (mg) | gp75 aktivitása2 (egység) | Specifikus aktivitás (cgy- ség/mg) |
| Dezoxikoláttal szolubilizált membrán | 236 | 250 | 1,05 |
| Mono Q oszlophoz kötött | 6,27 | 128 | 20,41 |
| Con A-Sepharose-hoz kötött | 1,73 | 118 | 68,20 |
| TA99 affinitási oszlopról eluált | 0,0353 | ND | - |
1. Az összegyűjtött és dializált frakciók proteinartalmát Bradfordfclc festékkötődési módszerrel méljük (1976).
2. 1 egységnyi aktivitást úgy definiáltuk, mint a protein azon mennyiségét, amely a TA99 mAb (300/mg) SK.-MEL-19 sejtek hez való kötődése maximális gátlásának feléhez szükséges.
3. A tisztított gp75 mennyiségét a TA99 affinitási oszlop eluátumában SDS-PAGE-módszerrel határoztuk meg az ezüsttel festett sáv intenzitásának meghatározásával.
ND Nem határoztuk meg.
Az affinitási oszlopon tisztított gp75-öt használtuk az aminosavanalízishez. A gp75 aminosav-összetételét a 2. táblázatban közöljük.
2. táblázat
A gp75 aminosav-összetétele
| Maradékok száma/gp75 molekula (pmol) | |||
| Asx | 63 (970) | Tyr | 13 (205) |
| Glx | 60 (922) | Ser | 47 (730) |
| Gly | 55 (854) | His | 10 (160) |
| Arg | 33 (502) | Thr | 34 (525) |
| Alá | 30 (467) | Pro | 32 (492) |
| Val | 33(515) | Met | 1(11) |
| Ile | 15 (235) | Leu | 41(628) |
| Phe | 26 (397) | Lys | 6(90) |
| Cys | ND | Trp | ND |
Az aminosavanalízist két mintán végeztük, amelyek a
PVDF-membránra átvitt tisztított gp75-ből 600, illetve 800 ng-ot tartalmaztak. A zárójelekben megadott számok a kimutatott egyes aminosavak mennyiségét jelentik pmol-ban.
Asx=aszparaginsav és aszparagin összege,
Glx=glutaminsav és glutamin összege,
ND=nem határoztuk meg.
HU 218 416 Β
A gp75 három belső peptidjének szekvenciáját és a gp75 cDNS részleges szekvenciáját az 1. kísérletben ismertettük. A gp75 aminosav-összetétele hasonló a N. crassa tirozinázéhoz [Lerch K., Longoni C. és Jordi E.: Primary structure of tyrosinase from Neurospora crass, 5 J. Bioi. Chem., 257, 6408-6413 (1982)] és az emlős tirozinázokéhoz, valamint az egér b gén termékéhez [Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nager C., Chaudhuri B. és Muller R.: Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids Rés.,
14, 2413-2427 (1986); Bouchard B., Fuller B„ Vijayasaradhi S. és Houghton A. N.: Induction of pigmentation in mouse fíbroblasts by expression of humán tyrosinase, J. Exp. Med., 169, 2029-2042 (1989);
Cohen T., Muller R. M., Tomita Y. és Shibahara S.: 15 Nucleotide sequence of the cDNA endocing humán tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Rés., 18, 2807 (1970)]. A gp75 N-terminális szekvenciájának Edman-féle lebontási módszerrel való meghatározására végzett kísérletek nem voltak sikeresek egy védett N-terminális jelenléte miatt. A N. crassa tirozináz Nterminális szerinmaradéka szintén védett, ebben az esetben egy acetilcsoporttal [Lerch K., Longoni C. és Jordi E.: Primary structure of tyrosinase from Neurospora crassa, J. Bioi. Chem., 257, 6408-6413 (1982)].
Mind a gp75, mind a tirozináz 75 kDa móltömegű membrán-glikoprotein, ezek a melanoszomákban lokalizálódnak, aminosav-összetételük hasonló, az aminosavszekvencia mintegy 40%-a azonos [lásd 1. kísérletet; Cohen T., Muller R. M., Tomita Y. és Shibahara S.: Nucleotide sequence of the cDNA endocing humán tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Rés., 18, 2807 (1990)], és 2 potenciális Cu2+kötőhellyel rendelkeznek, amely a tirozináz katalitikus aktivitásához szükséges. Néhány kutató szerint az egér gp75 tirozin-hidroxiláz-aktivitással rendelkezik, amely a tirozinázmolekula egyik jellemzője [Hearing 10 V. J., Jimenez M.: Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Rés., 2, 75-85 (1989)].
A tirozin-hidroxiláz-aktivitást TA99 mAb-vel való precipitáció után mértük az SK-MEL-19 melanómasejt-extraktumok immunprecipitátumaiban és felülúszóiban. A TA99 nem csökkentette az enzimaktivitást specifikusan; a tirozin-hidroxiláz-aktivitás 94%-a viszszanyerhető a felülúszóból, a sejtextraktumok kontroliantitestekkel (F23 mAb-vel) vagy TA99 mAb-vel 20 való inkubálását követően (3. táblázat).
Az antitest koncentrációjának 300 pg/ml-es értékig való növelésével sem figyelhető megjelentős csökkenés a tirozin-hidroxiláz-aktivitás visszanyerésében a felülúszóban. Az immunprecipitátumokban nem mu25 tatható ki enzimaktivitás. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy humán melanómasejtekben szinte a teljes tirozin-hidroxiláz-aktivitás olyan molekuládnak tulajdonítható, amely(ek) a gp75-antigéntől eltérőek.
3. táblázat
Tirozin-hidroxiláz-aktivitás TA99 mAb-vel való immunprecipitáció után
| mAb | Antitest koncentrációja (pg/ml) | Felszabadult 3H2O, cpm/pg protein/óra (összes enzimaktivitás, %)' | |
| Felülúszó | Üledék | ||
| A kísérlet: | |||
| puffer 2 | - | 772 (100%) | 170 |
| F233 | 60 | 727 (94%) | 189 |
| TA99 | 60 | 735 (95%) | 140 |
| B kísérlet: | |||
| puffer | - | 550 (100%) | 45 |
| TA99 | 60 | 537 (97%) | 37 |
| 300 | 530 (96%) | 46 |
A zárójelben megadott számok a felülúszóban visszanyert tirozin-hidroxiláz-aktivitás %-át jelentik a kontrollpuffcrhez (= 100%) viszonyítva.
A kontrollcsöveket PBS-sel, majd protein A-Sepharose-zal inkubáltuk az Anyagok és módszerek ismertetésében leírtak szerint.
Az egér F23 mAb (IgG2a) egy anti-vastagbél-karcinoma mAb, amely nem reagál a humán mclanocitasejtckkel.
A tirozin-hidroxiláz-aktivitást a gp75-öt tartalmazó frakciókban is meghatároztuk a tisztítás során. Az összes celluláris tirozin-hidroxiláz-aktivitás együtt tisztítódott a gp75-tel a posztnukleáris membránok detergenssel való szolubilizálása, a Mono Q anioncserélő oszlophoz kötött proteinek gradienselúciója, és a Con A-ffakcionálás során. Ez egybevág a gp75 és a humán tirozináz közötti alapvető homológiával. Azonban a 55 gp75 és a tirozin-hidroxiláz-aktivitás szétválik a
TA99 mAb affinitási oszlopon. Ha az SK-MEL-19 dezoxikoláttal szolubilizált, Con A-tisztított frakcióját a TA99 mAb affinitási oszlopra visszük, a tirozin-hidroxiláz-aktivitásnak >75%-a kinyerhető az effluensben, míg a gp75-aktivitás teljesen kiürül (4. táblázat).
HU 218 416 Β
4. táblázat
Tirozin-hidroxiláz-aktivitás visszanyerése a gp75 tisztítása során
| Frakció | Protein (gg/ml) | Összes tirozin-hidroxilázaktivitás (egység)1 | Specifikus aktivitás (egység/mg) |
| Con A-Sepharose oszlophoz kötött | 160 | 34 | 215,68 |
| TA99 affmitási oszlopon keresztül folyó | 120 | 25 | 210,13 |
1 Az enzimaktivitás 1 egységet a protein azon mennyiségével definiáltuk, amely 1 pmol 3H2O felszabadításához szükséges 3H-tirozinból 1 óra alatt 37 °C-on.
Noha az eluált gp75 nem tartalmazott tirozin-hidroxiláz-aktivitást, lehetséges, hogy az oszlop eluálási körülményei befolyásolják az enzimaktivitást. A fenti eredmények alátámasztják azt a következtetést, hogy a 15 tirozin-hidroxiláz-aktivitás teljes mértékben, ha nem egészében a melanocitás sejtekben egy gp75-től különböző proteinnek tulajdonítható.
A gp75 antigén egy membránhoz kötött glikoprotein, amely pigmentált humán melanocitákban és me- 20 lanómákban expresszálódik, és nem detektálható nempigmentált melanómákban, vagy nem melanocitás sejttípusokban [Thomson T. M., Mattes J. M., Roux L.,
Old L. J és Lloyd K. O.: Pigmentation-associated glycoprotein of humán melanóma and melanocytes: 25 definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermat., 85, 169-174 (1985); Thomson T. M., Reál F.
X., Murakami S., Cordon-Cardo C., Old L. J. és Houghton A. N.: Differentiation antigens of malanocytes and melanóma: analysis of melanosome and cell 30 surface markers of humán pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermat., 90, 459-466 (1988)]. Immun-elektronmikroszkópiás vizsgálatok bizonyítják, hogy a TA99 mAb a melanoszomális membránhoz vagy annak közelében kötődik 35 [Thomson T. M., Reál F. X., Murakami S., CordonCardo C., Old L. J. és Houghton A. N.: Differentiation antigens of malanocytes and melanóma: analysis of melanosome and cell surface markers of humán pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. 40 Dermat., 90, 459-466 (1988)]. A gp75 melanómasejtekben való intracelluláris lokalizációja úgy tűnik, hogy a gp75-öt az immunrendszer számára elérhetetlenné teszi. Azonban gp75 elleni IgG-antitesteket kimutattak melanómás betegekben [Mattes J. M., Thomson T. 45 M., Old L. J. és Lloyd K. O.: A pigmentation-associated, differentiation antigén of humán melanóma defined by a precipitating antibody in humán serum, Int. J. Cancer, 32, 717-721 (1983)]. Ebből a szempontból a TA99 mAb ugyanazt a gp75 antigént ismeri fel, ame- 50 lyet a melanomás beteg IgG-antitestjei precipitálnak [Vijayasaradhi S., Bouchard Β. B. és Houghton A. N.:
The melanóma antigén gp75 is the humán homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Exp. Med., 171, 1375-1380 (1990)]. Radioaktívan jelzett TA99 mAb 55 intravénásán injektálva hatásosan lokalizálódik a melanomás xenograftokban tímuszhiányos egerekben [Welt S., Mattes J. M., Grando R., Thomson T. M., Leonard R. W., Zanzonico P. B., Bigler R. E., Yeh S., Oettgen H. F és Old L. J.: Monoclonal antibody to an intra- 60 cellular antigén images humán melanóma transplants in nu/nu mice, Proc. Nat. Acad. Sci. (Wash.), 84, 4200-4204 (1987)], amiből arra lehet következtemi, hogy a gp75 antigén hozzáférhető az immunrendszer számára.
A tirozináz nevű melanoszomális glikoproteint egy olyan gén kódolja, amely az egér c (albínó) lókuszában helyezkedik el, míg a gp75 a b (barna) lókuszban helyezkedik el. A tirozináznak és a gp75-nek számos közös tulajdonsága van. Hasonló fizikai tulajdonságaikon kívül a gp75- és a tirozináz-aktivitás számos kromatográfiás lépésen keresztüli együtt tisztításából nyilvánvaló, hogy ez a két protein molekuláris azonosságot is mutat (aminosavszinten 43,1%, nukleotidszinten 55,3% a homológia) [Vijayasaradhi S., Bouchard Β. B. és Houghton A. N.: The melanóma antigén gp75 is the humán homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Exp. Med., 171, 1375-1380 (1990); Cohen T., Muller R. M., Tomita Y. és Shibahara S.: Nucleotide sequence of the cDNA endocing humán tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Rés., 18, 2807 (1990)].
Az antitirozináz antitestek keresztreakciót adnak a tirozinázzal, a b (barna) lókuszproteinnel és valószínűleg a rokon proteinek egy családjával [Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nager C., Chaudhuri B. és Muller R.: Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids. Rés., 14, 2413-2427 (1986); Jackson I. J.: A cDNA encoding tyrosinaserelated protein maps to the brown locus in mice, Proc. Nat. Acad. Sci. (Wash.), 85, 4392-4396 (1988); Hearing V. J. és Jimenez M.: Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Rés., 2, 75-85 (1989)]. Ezért jelentős volt annak bizonyítása, hogy a tisztított gp75-antigén nem azonos a tirozinázzal. A gp75 és a tirozin-hidroxiláz-aktivitás együtt tisztítódik, de a tirozináz enzimaktivitás többsége elválasztható a gp75-től a TA99 affmitási kromatográfiás tisztítás során. Az összes celluláris tirozin-hidroxilázaktivitás többsége a TA99 mAb affmitási oszlopon átfolyó effluensben mutatható ki, amiből arra következtethetünk, hogy a tirozin-hidroxiláz-aktivitást a gp75-től eltérő molekula mutatja. Ezzel a megfigyeléssel egybevág az a tény, hogy a TA99 mAb nem immunprecipitálja vagy tünteti el a tirozin-hidroxiláz-aktivitást [4. táblázat; Thomson T. M., Mattes J. M., Roux L., Old L. J. és Lloyd K. O.: Pigmentation-associated glycoprotein of humán melanóma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermat., 85, 169-174 (1985)]. Jimenez M. és munkatársai egér
HU 218 416 Β b lókuszprotein elleni antipeptid antitesteket alkalmazva kimutatták, hogy a b protein hordozza a tirozinázaktivitás 15-30%-át egér melanómasejtekben [Jimenez M., Malvoy L. és Hearing V. J.: Specific Identification of an authentic clone fór mammalian tyrosinase, J. Bioi. Chem., 264, 3397-3403 (1989)]. Saját eredményeink azt mutatják, hogy a gp75 nem tartalmaz tirozin-hidroxiláz-aktivitást. Azon lehetőség azonban nem zárható ki, hogy a gp75 tartalmaz egy nagyon gyenge tirozin-hidroxiláz-aktivitást, amely az enzimaktivitás 5%-át teszi ki pigmentált melanómasejtekben.
Claims (19)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás a gp75-proteint és/vagy annak ffagmensét kódoló nukleinsavmolekula izolálására, azzal jellemezve, hogy feltételezhetően gp75-proteint és/vagy annak ffagmensét kódoló nukleinsavmolekulákat is tartalmazó nukleinsav-molekulaelegyet állítunk elő önmagukban ismert rekombináns és/vagy szintetikus kémiai eljárások alkalmazásával, vagy a kívánt molekulák természetes forrásának felhasználásával, és a gp75-proteint és/vagy annak ffagmensét kódoló nukleinsavmolekulákat azokkal specifikusan hibridizálódó nukleinsavmolekulák alkalmazásával az elegyből önmagukban ismert módszerek alkalmazásával kinyerjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lystyr-asp-pro-ala-val szekvenciát tartalmazó fragmenst kódoló DNS-molekulát izolálunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thrtyr-glu szekvenciát tartalmazó fragmenst kódoló nukleinsavmolekulát izolálunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy asp-phe-asp-ser-thr-leu-ile-ser-pro-asn-ser-valphe-ser szekvenciát tartalmazó fragmenst kódoló nukleinsavmolekulát izolálunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-molekulát izolálunk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a 3. ábrán bemutatott szekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekulának megfelelő cDNS-molekulát izolálunk.
- 7. Eljárás 6. igénypont szerinti eljárással előállított izolált cDNS-molekula által kódolt aminosavszekvenciájú izolált polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy feltételezhetően a kívánt polipeptidet is tartalmazó polipeptidelegyet állítunk elő a cDNS-molekula expresszálása útján vagy önmagukban ismert szintetikus kémiai eljárások alkalmazásával, és az elegyből a kívánt polipeptidet önmagában ismert módszerek alkalmazásával kinyerjük.
- 8. Eljárás 5. és/vagy 6. igénypont szerint előállított DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy replikációhoz szükséges DNS-szekvenciát 6. igénypont szerint előállított cDNSmolekulával és/vagy gazdaszervezetben történő expresszióra alkalmassá tett 5. igénypont szerint előállított cDNS-molekulával kombinálunk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektorként vakciniavírust alkalmazunk.
- 10. Eljárás hatóanyagként 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított terméket tartalmazó, gp75protein elleni ellenanyagok termeltetésére alkalmas vakcinakészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított terméket gyógyászatilag alkalmas hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítve gp75-protein elleni ellenanyagok termeltetésére alkalmas vakcinakészítménnyé alakítunk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emberi felhasználásra alkalmas vakcinakészítményt állítunk elő.
- 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gp75-proteint adjuvánshoz kötve alkalmazzuk.
- 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerint előállított expressziós vektort, és/vagy tisztított gp75-proteint vagy fragmensét, és/vagy 7. igénypont szerint előállított polipeptidet vagy ffagmensét adjuváns hatásos mennyiségével elegyítjük.
- 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákos beteg rák elleni kezelésére alkalmas vakcinakészítményt állítunk elő.
- 15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákos megbetegedés veszélyének kitett páciensben a rák megelőzésére alkalmas vakcinakészítményt állítunk elő.
- 16. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákos betegben a rákos betegség előrehaladásának késleltetésére alkalmas vakcinakészítményt állítunk elő.
- 17. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy melanóma kezelésére alkalmas vakcinakészítményt állítunk elő.
- 18. A 13—16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adjuvánshoz kötött gp75proteint tartalmazó vakcinakészítményt állítunk elő.
- 19. A 13-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ciklofoszfamiddal előkezelt páciensen előnyösen alkalmazható vakcinakészítményt állítunk elő.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49743190A | 1990-03-22 | 1990-03-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT62934A HUT62934A (en) | 1993-06-28 |
| HU218416B true HU218416B (hu) | 2000-08-28 |
Family
ID=23976841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203009A HU218416B (hu) | 1990-03-22 | 1991-03-22 | Eljárás melanoma elleni GP75 vakcina előállítására |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6168946B1 (hu) |
| EP (2) | EP0522078B1 (hu) |
| JP (2) | JP3336006B2 (hu) |
| AT (1) | ATE187493T1 (hu) |
| AU (1) | AU660412B2 (hu) |
| CA (1) | CA2078773C (hu) |
| CZ (1) | CZ290278B6 (hu) |
| DE (1) | DE69131829T2 (hu) |
| DK (1) | DK0522078T3 (hu) |
| ES (1) | ES2141089T3 (hu) |
| FI (1) | FI113786B (hu) |
| GR (1) | GR3032804T3 (hu) |
| HK (1) | HK1014732A1 (hu) |
| HU (1) | HU218416B (hu) |
| IE (2) | IE910820A1 (hu) |
| NO (1) | NO311366B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ237532A (hu) |
| PL (3) | PL168235B1 (hu) |
| PT (1) | PT97103B (hu) |
| SK (1) | SK282873B6 (hu) |
| WO (1) | WO1991014775A1 (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE910820A1 (en) * | 1990-03-22 | 1991-09-25 | Sloan Kettering Inst Cancer | Gp75 as a tumor vaccine for melanoma |
| US7041801B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-05-09 | Vanderbilt University | Antibodies binding to polypeptides encoded by developmentally-regulated endothelial cell locus-1 |
| US7015312B1 (en) | 1996-02-09 | 2006-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antibodies to the protein product encoded by ORF3 of the TRP-1 gene and compositions and kits thereof |
| US6083703A (en) * | 1996-02-09 | 2000-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes |
| US5840839A (en) * | 1996-02-09 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein |
| US7001600B1 (en) | 1996-02-09 | 2006-02-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes |
| WO2001060391A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Regents Of The University Of California | A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase |
| US6613534B2 (en) | 2001-03-20 | 2003-09-02 | Wake Forest University Health Sciences | MAP-2 as a determinant of metastatic potential |
| US20030113919A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-06-19 | Aventis Pasteur, Ltd. | Immunogenic targets for melanoma |
| US20030157720A1 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-21 | Expression Technologies Inc. | Protein standard for estimating size and mass |
| US20090117034A1 (en) | 2007-06-15 | 2009-05-07 | Nanhai Chen | Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors |
| AU2009222998B2 (en) | 2008-03-12 | 2013-05-23 | Imclone Llc | Anti-TYRP1 antibodies |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
| US4808704A (en) * | 1981-09-30 | 1989-02-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human malignant melanoma |
| US4806628A (en) * | 1982-11-30 | 1989-02-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies against melanocytes |
| US4591572A (en) * | 1983-04-01 | 1986-05-27 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Pigmentation associated, differentiation antigen of human melanoma and autologous antibody |
| USH819H (en) * | 1984-04-30 | 1990-09-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Energy | Palladium-109 labeled anti-melanoma monoclonal antibodies |
| US4851510A (en) * | 1984-11-30 | 1989-07-25 | Wadley Technologies, Inc. | Monoclonal antibodies to novel melanoma-associated antigens |
| US4798790A (en) * | 1985-07-18 | 1989-01-17 | Sloan-Kettering Institute | Monoclonal antibody specific for a pigmentation associated antigen |
| US5262177A (en) * | 1986-02-07 | 1993-11-16 | Oncogen | Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen |
| US5141742A (en) * | 1986-02-07 | 1992-08-25 | Oncogen | Vaccines against melanoma |
| US5009995A (en) * | 1986-10-27 | 1991-04-23 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to melanoma cells |
| US5059523A (en) * | 1988-05-02 | 1991-10-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Cell-surface glycoproteins of human sarcomas |
| US5009495A (en) * | 1989-05-26 | 1991-04-23 | Williams Robert D | Hinge for eyeglasses |
| DK0444181T3 (da) | 1989-08-04 | 2002-02-25 | Schering Ag | C-erbB-2 eksternt domæne: gp75 |
| IE910820A1 (en) * | 1990-03-22 | 1991-09-25 | Sloan Kettering Inst Cancer | Gp75 as a tumor vaccine for melanoma |
| US5262117A (en) * | 1990-10-12 | 1993-11-16 | Centro Sviluppo Settori Impiego S.R.L. | Process for preparing thermoinsulating and/or structural formed articles and products so obtained |
| US6180604B1 (en) * | 1996-08-21 | 2001-01-30 | Micrologix Biotech Inc. | Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin |
-
1991
- 1991-03-12 IE IE082091A patent/IE910820A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-12 IE IE20000918A patent/IE20000918A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 CZ CS1991760A patent/CZ290278B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 PT PT97103A patent/PT97103B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-03-21 SK SK760-91A patent/SK282873B6/sk unknown
- 1991-03-21 NZ NZ237532A patent/NZ237532A/xx unknown
- 1991-03-22 PL PL91289550A patent/PL168235B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 HU HU9203009A patent/HU218416B/hu unknown
- 1991-03-22 WO PCT/US1991/001942 patent/WO1991014775A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-03-22 AU AU76906/91A patent/AU660412B2/en not_active Ceased
- 1991-03-22 EP EP91908003A patent/EP0522078B1/en not_active Revoked
- 1991-03-22 ES ES91908003T patent/ES2141089T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-22 DE DE69131829T patent/DE69131829T2/de not_active Revoked
- 1991-03-22 EP EP99109256A patent/EP0965640A1/en not_active Withdrawn
- 1991-03-22 JP JP50783191A patent/JP3336006B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 DK DK91908003T patent/DK0522078T3/da active
- 1991-03-22 AT AT91908003T patent/ATE187493T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 CA CA002078773A patent/CA2078773C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-22 PL PL91307930A patent/PL169168B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-03-22 PL PL91307929A patent/PL169105B1/pl not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-09-21 NO NO19923659A patent/NO311366B1/no unknown
- 1992-09-21 FI FI924222A patent/FI113786B/fi active
-
1995
- 1995-03-24 US US08/409,794 patent/US6168946B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-28 HK HK98116009A patent/HK1014732A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-29 GR GR20000400507T patent/GR3032804T3/el not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-25 JP JP2001391870A patent/JP2002241314A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-25 US US10/877,489 patent/US20050037462A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vijayasaradhi et al. | The melanoma antigen gp75 is the human homologue of the mouse b (brown) locus gene product. | |
| AU775162B2 (en) | Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines | |
| US5141742A (en) | Vaccines against melanoma | |
| LU86765A1 (fr) | Vaccins contre le melanome | |
| AU660412B2 (en) | GP75 as a tumor vaccine for melanoma | |
| CA2182889C (en) | Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor | |
| JP2002519303A (ja) | 脂質動員性を有する糖タンパク質およびその治療的適用 | |
| JPH0751065A (ja) | 糖タンパク質３９遺伝子 | |
| Colombo et al. | cDNA cloning and Escherichia coli expression of UK114 tumor antigen | |
| Amar-Costesec et al. | Identification and characterization of the tumor-specific P1A gene product | |
| BE1000175A3 (fr) | Vaccins contre le melanome. | |
| EP1369478A1 (en) | Novel scavenger receptor class a protein | |
| EP0926157A1 (en) | Protein capable of combining with tbp to form complex, polynucleotide coding for said protein, anti-sense polynucleotide of said polynucleotide, and antibody capable of recognizing said protein | |
| JPH03502446A (ja) | 動物およびヒトのレクチン類の少なくとも一部分の配列を再現するアミノ酸配列，それを得る方法，およびその診断および治療への用途 | |
| Claus et al. | Oncofetal antigen in Xiphophorus detected by monoclonal antibodies directed against melanoma‐associated antigens | |
| Walker | Characterization of adenylate cyclase toxin plus macrophage and thymic peptides by mass spectrometry | |
| Boon et al. | Identification of Point Mutations in Genes Coding for tum-Antigens. A Step Towards the Understanding of Mouse and Human Tumor-Specific Transplantation Antigens? | |
| CA2309336A1 (en) | Neuralized protein, polynucleotide encoding the same, and antibody recognizing the same | |
| CA2506684A1 (en) | Immunogenic epitopes for fibroblast growth factor 5 (fgf-5) presented by hla-a3 and hla-a2 | |
| JPH11222499A (ja) | プロテアソーム抑制蛋白質およびそれをコードするポリヌクレオチド | |
| WO1999037777A2 (en) | Differentiation-associated sequences and methods of use therefor |