LU86765A1

LU86765A1 - Vaccins contre le melanome

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Publication number: LU86765A1
Application number: LU86765A
Authority: LU
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1986-02-07
Filing date: 1987-02-06
Publication date: 1987-09-15
Also published as: AT396938B; FR2601370A1; ATA26687A; AU6862087A; AU606046B2; KR870008030A; ZA87880B; IL81481A0; US5262177A; FR2601370B1

Description

Vaccins contre le mélanome.

1. DOMAINE DE L1 INVENTION»

La présente invention concerne des compositions de vaccin qui peuvent induire une réponse immunitaire qui détruit sélectivement les cellules du mélanome chez un individu vacciné. Par conséquent, un peptide ou protéine apparenté à un antigène associé au mélanome est produit en grandes quantités suivant les techniques de l'ADN recombinant et/ou par des procédés de synthèse chimiques. Le peptide ou protéine de la présente invention peut être-utilisé comme immunogène dans une composition de vaccin. Dans certaines formes de réalisation où le peptide ou protéine apparenté à un antigène associé au mélanome est exprimé par un virus recombinant, le virus recombinant lui-même peut être utilisé comme immunogène dans une composition de vaccin. L'invention a aussi pour objet des procédés qui comprennent l'utilisation de techniques de l'ADN recombinant ainsi que de moyens de synthèse chimiques permettant de produire en grandes quantités les peptides ou protéines apparentés à l'antigène associé au mélanome.

L'invention est illustrée à titre d'exemple en prenant comme immunogènes les peptides apparentés au p97, qui est une sialoglycoprotéine monomère de la j surface cellulaire d'un poids moléculaire apparent un /

L

2 peu inférieur à 97.000 daltons qui est un composant de la surface des cellules du mélanome.

2. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION.

2.1. ANTIGENES ASSOCIES A UNE TUMEUR.

Les travaux sur les animaux d'expérience, en particulier les rongeurs, ont montré que la plupart des tumeurs induites par les virus oncogènes expriment des antigènes codés par le génome viral et que l'immunisation par ces antigènes peut conduire au rejet d'une agression ultérieure par des cellules tumorales que le même virus induit. Bien qu'une partie importante de ces travaux ait été effectuée avec des souches de virus de laboratoire, comme le SV40, le virus du polynôme et les virus de la leucémie de la souris de Friend, Moloney ou Rauscher, la transmission horizontale et verticale des virus oncogènes dans la nature a été démontrée et en fait un vaccin contre la leucémie et le sarcome du chat induits par virus est actuellement disponible sur le marché.

Au contraire, une " étiologie virale de la plupart des cancers de l'être humain n'a pas encore été démontrée. Des exceptions notables sont le virus de l'hépatite (hépatome), le virus de l'herpès simplex (carcinome du col de l'utérus) et le virus d'Epstein-Barr (carcinone du nasopharynx). Toutefois, au cours des deux dernières décennies, il a été établi que certaines cellules tumorales humaines expriment des antigènes tumoraux, c'est-à-dire des antigènes qui distinguent les cellules tumorales des cellules normales correspondantes; certains patients manifestent des réponses d'immunité humorale ou à médiation cellu-laire contre ces antigènes (Hellstrom et al. 1968, Nature, 220 : 1352; Morton et al., 1968, Science 162 : 1279-1281; ShiKu et al., 1976, J. Exp. Med. 144: l 873-881). Certaines des cibles de ces réponses immuni- 3 taires sont des antigènes oncofoetaux ou de différenciation codés par le génome humain (Hellstrom et al., * 1970, Int. J. Cancer 6 : 346-351).

Jusqu'à récemment, la nature moléculaire des antigènes tumoraux n'était pas connue et le degré de spécificité tumorale des réactions immunologiques n'était pas élucidé. Les tentatives d'utiliser ces informations pour mettre au point des épreuves diagnostiques du cancer ou des traitements du cancer sont restées largement sans succès. Du fait que les régressions spontanées des tumeurs sont extrêmement rares, on peut en conclure aussi que les réponses immunitaires manifestées in vitro sont inopérantes in vivo ; par exemple alors que les anticorps et les lymphocytes collectés chez un patient cancéreux peuvent être efficaces pour tuer les cellules tumorales iii vitro, la réponse immunitaire du même patient cancéreux est sans effets in vivo.

L'introduction par Köhler et Milstein de la technique des anticorps monoclonaux (1975, Nature 256 : 495-497) a conduit à des recherches intensifiées sur les antigènes tumoraux humains parce que cette technique apporte le moyen de définir ces antigènes tant au niveau moléculaire que pour ce qui est de la spécificité (Hellstrom et Brown, 1979, dans "The Antigens", M. Sela, ed., Academie Press., Vol. V : 1-66). Au cours des quelques dernières années, un grand nombre d'antigènes associés à des tumeurs ont été décrits, dont la plupart ont été définis par les anticorps monoclonaux de souris (Reisfeld and Sell, eds., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Sériés, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New YorK, 1985, pp. 1-609). Bien que virtuellement tous les antigènes qui ont été bien caractérisés se soient révélés être des antigènes /_ i 4 oncofoetaux ou de différenciation, et que leur spécificité à l'égard des tumeurs soit apparue quantitative plutôt que qualitative, différents antigènes sont suffisamment spécifiques des cellules néoplasiques plutôt que des cellules normales (en général avec un facteur de 10 à 1.000 fois) pour être utilisés comme cibles potentielles en vue d'identifier des cellules tumorales et en vue du traitement. Des anticorps monoclonaux humains contre des antigènes tumoraux ont été obtenus aussi (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 30 : 2026-2030). Ceci confirme l'évidence indiquée précédemment que certains patients cancéreux exercent une réaction immunitaire contre leurs tumeurs.

Plus de la moitié des antigènes de la surface cellulaire associés à des tumeurs identifiés jusqu'ici sont des protéines ou glycoprotéines codées par le génome humain (plutôt que par des virus endogènes ou exogènes), les autres étant de glycolipides résultant d'une expression ou régulation anormale des glycolsyl-transférases.

2.2. L'ANTIGENE p97 ASSOCIE AU MELANOME.

L'antigène p97 est un antigène associé â une tumeur qui a été identifié pour la première fois dans le mélanome humain à l'aide d'anticorps monoclonaux (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 : 4980-4983? Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA

77 : 6114-6118? Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 ; 2183-2187). L'antigène p97 a été étudié en détail pour ce qui est de son expression dans les tissus normaux et néoplasiques et est présent dans la plupart des mélanomes humains, ainsi que dans certains tissus foetaux, mais n'est retrouvé qu'en traces dans les tissus de l'adulte normal (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127 : 539-546; Brown et al., 19131 » Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 ; 539-543? 5

Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29 : 511-515).

Le p97 a été utilisé comme cible pour l'imagerie 4 diagnostique de mélanomes dans des essais cliniques chez l'être humain (Larson et al., 1983, J. Clin.

s Invest. 72 ï 2101-2114).

Le p97 est une sialoglycoprotéine monomère de la surface cellulaire ayant un poids moléculaire apparent (PM) tel que mesuré par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) un peu inférieur à 97.000 daltons. Les anticorps monoclonaux ont défini trois sites antigéniques majeurs qui sont présents sur un fragment tryptique stable de 40.000 daltons (Brown et al., 1981, J. ïmmunol. 127 : 538-546), mais la séquence complète de p97 n'a pas été décrite. Au moins deux autres antigènes asso-t ciés au mélanome humain et caractérisés indépendamment, à savoir gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 î 6114-6118) et gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35 : 73-80) apparaissent identiques à p97 suivant l'analyse par immunoprécipitation séquencée.

La séquence des aminoacides N-terminaux du p97 est homologue à la transferrine et, comme la trans-ferrine, p97 fixe le fer (Brown et al., 1982, Nature, London, 296 : 171-173). L'analyse des hybrides cellulaires somatiques et l'hybridation in situ ont montré que le gène du p97, comme les gènes pour la transferrine et le récepteur de la transferrine, est situé sur la région chromosomiale 3q21-3q29 (Plowman et al., 1983, Nature London, 303 : 70-72? Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756). Ces observations suggèrent que le p97 joue un rôle dans le métabolisme du fer.

6 2.3. VACCINS CONTRE LE CANCER.

Les études chez les animaux d'expérience, λ habituellement la souris, ont montré que l'immunisation au moyen de cellules cancéreuses vivantes ou tuées peut = conduire au rejet d'une agression ultérieure de cellules cancéreuses viables. Les tentatives d'immunisation au moyen d'un matériel exempt de cellules ont eu, en général, moins de succès, mais quelques succès ont été notés. (Pour un article de revue, voir Iîellstrom et Brown, 1979, dans The Antigens, M. Sela ed. Academie Press, Vol. V : 1-66). Dans de nombreux cas, les antigènes cibles responsables des effets protecteurs ont été codés par un virus mais, dans de nombreux cas, la nature de l'antigène qui déclenche une réponse immunitaire protectrice est inconnue.

Les études chez l'être humain sont beaucoup plus difficiles et l'efficacité des vaccins contre le cancer discutée, malgré l'acquisition de certains succès. Dans de nombreux cas, les préparations de vaccin ont consisté en cellules tumorales irradiées ou en cellules tumorales tuées par exposition à certains agents chimiques. Du fait que’ des antigènes associés à une tumeur humaine n'ont pas été disponibles à l'état de pureté, il n'existe pas de description de leur utilisation dans des vaccins.

Une objection théorique majeure contre l'utilisation proposée des vaccins contre le cancer chez l'être humain est que ce dernier, lorsqu'il est "vacciné", par exemple, au moyen de cellules cancéreuses tuées ou de préparations exemptes de cellules, sera exempt de réponse immunitaire, parce que les antigènes tumoraux qui peuvent être les cibles de la * réponse immunitaire sont présents, bien qu'en traces seulement, dans certaines cellules normales et seront donc perçus comme "self" par le système immunitaire. La 7 plupart sinon l'ensemble des antigènes associés à des tumeurs détectés dans les tumeurs humaines par les s anticorps monoclonaux sont aussi présents dans certains tissus normaux et il n'est guère d'indication que des patients cancéreux leur fassent in vivo une réponse efficace. Il existe des indices que les cellules suppressives jouent un rôle majeur en régulant à la baisse la réponse immunitaire à l'égard des antigènes tumoraux (Nepom et al., 1983, Experentia, 39 : 235-242). De plus, une réponse de cellule suppressive induite par une série d'antigènes tumoraux peut empêcher l'induction d'une réponse efficace de destruction de la tumeur à l'égard d'une autre série d'antigènes tumoraux qui, par eux-mêmes, n'induiraient pas de suppression (Hellstrom et al., 1983, dans Biomembranes, s A. Nowotny ed., Plenum Press, pp. 365-388).

2.4. TECHNIQUES DE L'ADN RECOMBINANT ET VIRUS DE LA VACCINE.

L'application des techniques de 1'ADN recombinant pour la production de vaccins sous-unitaires afin de protéger contre les infections implique le clonage moléculaire et l'expression, dans un vecteur approprié, de l'information génétique codant pour des protéines qui peuvent induire une réponse immunitaire contre la protéine chez l'animal hôte. Récemment, une nouvelle approche qui est potentiellement utile pour la production de vaccins sous-unitaires a été décrite (MacKett et al., 1982, Proc, Natl. Acad. Sei.

79 : 7415-7419; MacKett et al., 1984, J. Virol. 49 :857-864; Panicali, D. et Paoletti, E., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. 79 :4927-4931). Cette approche implique d'utiliser le virus de la vaccine comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Lors de l'introduction dans les animaux hôtes, le virus de la vaccine recombinant exprime le 8 gène étranger inséré et induit ainsi une réponse immunitaire de l'hôte à ces produits du gène. Comme le * virus de la vaccine recombinant vivant peut être utilisé comme vaccin, cette approche combine les ? avantages des vaccins tant sous-unitaires que vivants.

Le virus de la vaccine contient un génome d'ADN en double brin linéaire d'environ 187 paires de kilobases et se réplique dans le cytoplasme des cellules infectées. Ces virus contiennent dans le noyau viral un système complet d'enzymes de transcription (comprenant les enzymes de terminaison, de méthylation et de polyadénylation) qui sont nécessaires pour l'infectivité du virus. Les séquences régulatrices de la transcription du virus de la vaccine (les promoteurs) permettent d'amorcer la transcription par l'ARN polymérase de la vaccine, mais non par 1'ARN polymérase de la cellule hôte.

L'expression de 1'ADN étranger dans les virus de la vaccine recombinants nécessite d'épisser les promoteurs de la vaccine à des séquences d'ADN codant pour une protéine du gène étranger. Des plasmides vecteurs, appelés aussi vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chiméraux dans le virus de la vaccine. Un type de vecteur d'insertion est composé de : (a) un promoteur du virus de la vaccine comprenant le site d'amorçage de la transcription; (b) plusieurs sites de clonage par endonucléase de restriction unique se trouvant à l'aval du site d'amorçage de la transcription pour l'insertion des fragments d'ADN étranger; (c) de l'ADN de virus de la vaccine non essentiel (comme le gène TK) flanquant le promoteur et les sites de clonage qui dirigent l'insertion du gène chiméral dans la région non essentielle homologue du génome du virus, et (d) une origine bactérienne de '^ réplication et un marqueur de résistance aux antibio- 9 tiques pour la réplication et la sélection dans E. coli. Des exemples de ces vecteurs sont décrits par MacKett (MacKett et al., 1984, J. Virol. 49 : 857-864).

Les virus de la vaccine recombinants sont produits par transfection de plasmides d'insertion bactériens recombinants contenant le gène étranger dans des cellules préalablement infectées par le virus de la vaccine. La recombinaison homologue a lieu dans les cellules infectées et conduit à l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Les cellules infectées peuvent être triées suivant les techniques immunologiques, l'hybridation sur plaque d'ADN ou par sélection génétique des virus recombinants qui peuvent être isolés ultérieurement. Ces recombinants de la vaccine conservent leurs fonctions et leur infectivité essen-tielles et peuvent être construits de façon à contenir à peu près 35 kilobases d'ADN étranger.

L'expression du gène étranger peut être détectée par des épreuves enzymatiques ou immunologiques (par exemple immunoprécipitation, radio-immunoessai ou empreinte). Les glycoprotéines naturelles de la membrane que produisent les cellules infectées par la vaccine recombinante sont glycosylées et peuvent être transportées jusqu'à la surface de la cellule. Des niveaux élevés d'expression peuvent être obtenus en utilisant des promoteurs puissants ou en clonant des copies multiples d'un gène unique.

3. APERCU DE L'INVENTION.

Des compositions de vaccin qui peuvent être utilisées pour induire une réponse immunitaire qui détruit sélectivement les cellules du mélanome chez les individus vaccinés sont décrites. Plus spécifiquement, les compositions de vaccin de la présente invention comprennent un immunogène qui induit une réponse ^ immunitaire dirigée contre un antigène associé au 10 mélanome tel que l'antigène p97 associé au mélanome. Conformément à l'invention, un certain nombre de compositions de vaccin sont possibles. Par exemple, l'immunogène d'un "vaccin sous-unitaire" de la présente invention comprend un peptide ou orotéine apparenté au p97 qui peut etre mis en composition avec un adjuvant approprié. Ces peptides ou protéines comprennent des séquences d'aminoacides dérivant de tout ou partie de la séquence d'aminoacides de p97 en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3, en ce compris, mais non limitativement, des séquences d'aminoacides altérées dans lesquelles des résidus d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplaçant des résidus dans la séquence mènent à un changement silencieux et/ou des séquences d'aminoacides modifiées ou traitées, par exemple des séquences d'aminoacides glycosylées, des séquences d'aminoacides phosphorylées, etc. ou des séquences d'aminoacides modifiées chimiquement. Ci-après, les peptides ou protéines de la présente invention qui sont apparentés à l'antigène p97 associé au mélanome, qu'ils soient altérés, non altérés, modifiés ou non modifiés, sont appelés "peptides apparentés au p97". Lorsque le peptide apparenté au p97 est un haptène (c'est-à-dire antigénique, mais non immunogénique), l'haptène peut être conjugué avec une molécule vecteur qui confère le caractère immunogène.

Les peptides apparentés au p97 de l'invention peuvent être produits suivant les techniques de l'ADN recombinant et/ou des procédés de synthèse chimiques. Lorsque les peptides apparentés au p97 sont synthétisés chimiquement, ces peptides synthétiques apparentés au p97 peuvent comprendre les séquences d'aminoacides dérivant des régions du p97 dont il est prévu qu'elles sont antigéniques (Hopp et Woods, 1981, Proc. Natl.

____Acad. Sei. USA, 78 : 3824—3828) · Lorsque les peptides 11 apparentés au p97 de la présente invention sont produits suivant les techniques de 1'ADN recombinant, une séquence de nucléotides qui code pour tout ou partie du p97 est insérée dans un vecteur d'expression recombinant, tel qu'un virus ou un plasmide qui, dans un hôte approprié, peut diriger l'expression d'un peptide apparenté au p97 qui peut être purifié à partir du milieu de culture. La séquence de nucléotides insérée est dérivée de tout ou partie de la séquence du p97 en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3, en ce compris, mais non limitativement, les séquences de nucléotides dans lesquelles des codons de nucléotides fonctionnellement équivalents remplaçant des codons dans la séquence mènent à un changement silencieux; en d'autres termes, des codons différents qui codent pour le même aminoacide ou son équivalent fonctionnel peuvent être substitués dans la séquence illustrée à la Fig. 3. Lorsqu'un plasmide est utilisé comme vecteur d'expression, la préférence va à un plasmide qui se prête à l'expression dans des, cellules eucaryotes, mais un vecteur d'expression procaryote peut être utilisé aussi.

Dans une autre forme de réalisation de l'invention où le vecteur d'expression est un virus recombinant, un vaccin peut être présenté sous la forme d'un vaccin viral, auquel cas l'immunogène comprend le virus recombinant qui exprime un peptide apparenté au p97. Suivant la nature du virus recombinant utilisé comme immunogène, un vaccin de virus inactivé ou bien un vaccin de virus vivant peut être préparé. L'immunisation appropriée à l'aide des compositions de vaccin de 1'invention peut aboutir à 11 induction d'une réponse immunitaire conduisant à la destruction des cellules du mélanome chez le sujet immunisé.

L'invention décrit aussi un système dans 12 lequel une composition de vaccin peut être soumise à l'épreuve et précise comment l'épreuve devrait être » effectuée. Par exemple, les compositions de vaccin peuvent être évaluées pour ce qui est de l'efficacité dans des modèles sur animal, initialement des rongeurs, puis des primates non humains, et finalement chez l'être humain, de préférence chez des patients qui sont en rémission, mais ont une haute probabilité de récurrence due à des micrométastases.

4. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES.

La Fig. 1 représente une autoradiographie des produits de traduction exempts de cellules du mARN de p97 résolus par SDS-PAGE. A la Fig. IA, la piste 1 représente les produits de traduction du mARN enrichi de p97, tandis que la piste 2 représente les produits de traduction du mARN non enrichi, les uns et les autres provenant de 0,5 jil de produits de traduction totale de 5ng de mARN. A la Fig. IB, la piste 1 représente les produits de traduction du mARN enrichi de p97, tandis que la piste 2 représente les produits de traduction du mARN non enrichi, les uns et les autres provenant de 5 de produits de traduction de 5ng de mARN immunoprécipités par du sérum anti-p97.

La Fig. 2 est une représentation schématique de la structure du mARN de p97. L'agencement de la région codante (à partir de la séquence de signal jusqu'à la séquence d'ancrage) et la région non codante (3'UT), de même que la structure du domaine dupliqué du précurseur de p97 (trait vide) sont indiqués. L'emplacement des différentes séquences de reconnaissance des enzymes de restriction est indiqué au-dessus du mARN. Les positions relatives de quatre clones de cADN sont indiquées au-dessous de la structure de mARN. Le clone de cADN p97-3a2fl (3a2fl) a été isolé d'une banque de cADN dans laquelle les cADN ont été transcrits sur des 13 mARN enrichis en p97 oligo(T)-amorcés et ont été clonés dans pBR322, tandis que les clones de cADN p97- 2fl (2fl), p97-ljl (1j1) et p97-10al (lOal) ont été isolés par amorçage de la synthèse du cADN au moyen d'oligonucléotides qui codent pour des séquences d'exon de p97 et par clonage des fragments de cADN résultants dans lambda-gtlO. La Fig. 2A est une représentation schématique des clones génomiques B15, H17/ B6.6 et E7.7 qui ont été clonés dans lambda L47.1.

La Fig. 3 représente la séquence de nucléotides du cADN précurseur de p97 humain et sa séquence des aminoacides qui en est déduite. Les résidus d'ami-noacides N-terminaux déterminés préalablement par séquençage de la protéine étaient identiques à ceux prévus d'après la séquence de nucléotides (résidus d'aminoacides n° 21-30). Les sites de glycosylation potentiels aux résidus d'aminoacides 33, 135 et 515 (trait vide) et la région d'ancrage à la membrane à l'extrémité C-terminale (trait plein) sont indiqués. Un signal de polyadénylation (AATAAA indiqué dans un encadré) a été détecté à la position 3847, laquelle se trouve à 50 paires de bases à l'amont d'un tractus polyadénylé.

La Fig. 4 représente une comparaison entre les séquences d'aminoacides prévues du précurseur de p97 et celle de la sérotransferrine humaine (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756; Davis et al., 1983, J. Mol. Biol. 181 : 111-121). Les résidus conservés sont encadrés. Les résidus de tyrosine, d'histidine et d'arginine impliqués dans la fixation du fer par la transferrine (Mertz-Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145 : 659-676) sont indiqués par des * astérisques (*).

La Fig. 5 est une représentation schématique ", d'un modèle bidimensionnel de la structure du p97 basé 14 sur la présence des résidus de cystéine conservés entre les membres de la superfamille de la transferrine. Les trois sites de glycosylation potentiels sont indiqués par des astérisques (*). Le domaine hydrophobe d'ancrage à la membrane est apparent à l'extrémité C-terminale de p97 (COOH).

La Fig. 6 est une représentation schématique de la structure génétique des clones du cADN de p97 et du fragment de clone génomique lambda E7.7 utilisés pour la construction du vecteur d'expression de p97, outre du vecteur d'expression pSV2p97a. Les abréviations suivantes sont utilisées : E, EcoRI; P, PvuII;

Sal, Sali, Sstl; ß, BamHI.

La Fig. 7 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel lors de la caractérisation et de 1'immunopurification de la protéine p97 recombinante. Un clone CHO transfecté (CH03+) et des cellules de mélanome humain SK-MEL 28 ont été marqués à la 35g_ cystéine en présence (+TM) ou en l'absence (-TM) de tunicamycine (TM). Les cellules ont été déposées sur des plaques de 100 mm2 et admises à atteindre à peu près la confluence. Le milieu a été évacué et remplacé par 3 ml de milieu exempt de cystéine avec ou sans addition de 1 g par ml de tunicamycine. Après 30 minutes à 37°C, 250 Ci par ml de L-^S-cystéine (1016 Ci par millimole; New England Nuclear) ont été ajoutées pour une durée supplémentaire de 6 heures. La récolte des cellules, la préparation des produits de lyse des cellules, l'immunoprécipitation et le SDS-PAGE ont été menés comme décrit ci-dessus. Les extraits ont été immunoprécipités par des anticorps spécifiques de p97 et les protéines ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyamide avec SDS (SDS-PAGE). (a) . Gel de polyacrylamide avec SDS coloré au bleu ^ Coomassie; piste 1, marqueurs protéiniques; piste 2, Î „ 15 p97 immunopurifié issu de cellules B16 de souris transfectées; piste 3, cellules SK-MEL 23 +TM; piste 4, cellules SK-MEL 28 -TM; piste 5, cellules CH03+ +TM; piste 6, cellules CH03+ -TM. (b) Autoradiogramme du ’ même gel qu'en (a).

La Fig. 8 montre les résultats de la radioimmunoprécipitation du p97 exprimé dans des cellules transfectées ou des cellules infectées par Vp97a-tïY. Des cellules BSC ont été infectées pendant une nuit par du virus de la vaccine deotype sauvage ou du virus de la vaccine recombinant avec p97. Ces virus ou la lignée cellulaire transfectée CHO-p97.A ont été mis à incuber avec de la cystéine et de la méthionine marquées au 35S avec ou sans tunicamycine à 2jyg par ml (Sigma). Les cellules ont été lysées six heures plus tard, précipitées par l’anticorps monoclonal 96.5 et séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10%. Le gel a été autoradiographié pendant une nuit. Le groupe traité à la tunicamycine est situé à droite pour chaque groupe.

La Fig. 9 indique les titres en anticorps sériques chez des souris immunisées par des vaccins pour p97. Tp97 représente cinq souris immunisées au moyen de 5 x 10^ cellules M2svp97a.A irradiées (cellules tumorales syngénériques transfectées et exprimant le p97 de surface) dans de l'adjuvant complet de Freund et ayant reçu en rappel le même nombre de cellules dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate. p97 représente un groupe de cinq souris immunisées par 100 jyg de protéine p97 purifiée dans de l'adjuvant complet de Freund et ayant reçu en rappel 50 Jlg de protéine aqueuse. Vp97 représente un groupe de cinq souris immunisées et ayant reçu en rappel 107 unités formant plage de lyse de Vp97a-NY par l scarification à la queue.

16

La Fig. 10 indique l'effet thérapeutique de la vaccination, au moyen d'un virus de la vaccine recombinant pour p97 (Vp97a-NY), de souris sous agression tumorale. Les souris ont été agressées au moyen de 10^ ou 104 cellules tumorales exprimant le p97 (M2SVp97a.E) par voie intraveineuse. Deux jours plus tard, les souris ont reçu en inoculation par scarification à la queue soit Vp97a-NY, soit VWt-NY. Les inoculations hebdomadaires par scarification à la queue ont été répétées et la survie des souris a été observée.

5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION.

La présente invention concerne la production de vaccins pour la prévention ou le traitement des mélanomes. Elle est basée sur l'observation que les mélanomes ont des antigènes de la surface cellulaire associés à la tumeur, comme l'antigène p97, qui sont présents en plus grandes quantités dans les cellules du mélanome que dans les tissus normaux. Conformément à la presente invention, les peptides ou protéines apparentés à l'antigène p97 associé au mélanome (c'est-à-dire les peptides apparentés au p97) sont produits suivant les techniques de 1'ADN recombinant et/ou des techniques de synthèse chimiques. Les peptides apparentés au p97 de la présente invention comprennent des séquences d’aminoacides dérivant de tout ou partie de la séquence d'aminoacides du p97, en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3. Ils comprennent des séquences d‘aminoacides dérivées de la Fig. 3 qui ont été altérées par remplacement d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides à l'intérieur de la séquence par un autre aminoacide de polarité semblable qui agit comme équivalent fonctionnel et conduit ainsi à une altération silencieuse. Les substituts d'un aminoacide dans la séquence peuvent être choisis parmi d'autres membres de la classe à laquelle 1'aminoacide appartient. Par 17 exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, 1'isoleucine, la j valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane et la méthionine. Les aminoacides polaires neutres comprennent la glycine, la sérine, le thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides à charge positive (basiques) comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les aminoacides à charge négative (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. De plus, les peptides apparentés au p97 de la présente invention, qu'ils soient ou non altérés par la substitution de résidus d'aminoacides, peuvent être de surcroît modifiés ou traités par glycosylation, phosphorylation, etc., ou bien à la suite de modifications chimiques. Ces peptides apparentés au p97 peuvent être utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin qui suscitent une réponse immunitaire dirigée contre les cellules du mélanome présentes chez le patient vacciné.

Suivant une forme de réalisation de 1 'invention, les techniques de l'ADN recombinant sont appliquées pour insérer des séquences de nucléotides codant pour l'antigène p97 dans des vecteurs d'expression qui dirigeront l'expression des peptides apparentés au p97 dans des cellules hôtes appropriées. Les séquences de nucléotides codant pour l'antigène p97 comprennent des séquences de nucléotides issues de tout ou partie de la séquence de nucléotides de p97 en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3. En raison de la dégénérescence du code d'ADN pour les aminoacides (c'est-à-dire que la plupart des aminoacides peuvent être codés par plus d'un codon), des codons fonctionnellement équivalents (c'est-à-dire des codons différents qui codent pour le même aminoacide ou son équivalent l fonctionnel) peuvent se substituer dans la séquence du / 18 π97 illustrée à la Pig. 3 à la condition que la substitution conduise à un changement silencieux. Les systèmes vecteur d'expression-cellule hôte qui contiennent une séquence de nucléotides codant pour tout ou partie de p97 peuvent être utilisés pour produire de grandes quantités des peptides apparentés au p97 à l'état de pureté in vitro, auquel cas les produits du gène peuvent être purifiés au départ des cellules en culture et utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin sous-unitaires. La purification du peptide apparenté au p97 peut être effectuée suivant différents procédés biochimiques, notamment la purification par immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux. En outre, la purification du peptide apparenté au p97 peut être facilitée en modifiant les séquences d'ADN qui codent pour les peptides apparentés au p97, de façon que les séquences responsables de l'ancrage de la protéine dans la membrane plasmique soient éliminées, mais que les séquences responsables du transport de la protéine jusqu'à la membrane cellulaire ne soient pas éliminées, afin qu'une molécule antigénique tronquée soit sécrétée dans le milieu de culture par la cellule hôte. Dans le cas des peptides apparentés au p97 produits par des cellules procaryotes, l'absence de modifications appropriées après traduction peut conduire à un produit antigéniquement inactif, qui peut devoir être activé par des traitements chimiques ou autres appropriés.

Dans certaines formes de réalisation où le vecteur d'expression est un virus, le virus lui-même peut être présenté à l'état de vaccin. Dans de tels cas, des vaccins de virus recombinant inactivé peuvent être préparés. Lorsque le vecteur d'expression est un virus recombinant infectieux qui n'induit pas la ^ maladie chez l'hôte, une composition de vaccin de virus 19 inactivé ou bien une composition de vaccin de virus vivant qui assure une immunité sensible peut être obtenue, Un vecteur d'expression particulièrement utile à cet effet est un virus de la vaccine recombinant qui exprime les peptides apparentés au p97 de la présente invention, h cette fin, une séquence de nucléotides codant pour tout ou partie de l'antigène p97 peut être insérée dans un virus de la vaccine vecteur qui est capable de diriger l'expression de la séquence dans un hôte approprié. L'invention comprend l'utilisation d'autres virus vecteurs d'expression à l'état de vaccin, plus particulièrement les adénovirus.

Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la séquence d1aminoacides de p97 qui a été déduite peut faire l'objet d'une recherche des séquences ayant des propriétés, en particulier le caractère hydrophile, permettant de prévoir la présence de cette séquence à la surface de la molécule de la protéine et son caractère antigénique et/ou immunogénique probable. Ces peptides apparentés au p97 peuvent être synthétisés par voie chimique et utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin.

L'invention a aussi pour objet un procédé pour produire des peptides apparentés au p97 qui peuvent être utilisés à des fins autres que la production d'un vaccin. Les peptides apparentés au p97 peuvent être utilisés pour immuniser des animaux afin de produire des antisérums ou des anticorps monoclonaux spécifiques contre les cellules de mélanome en cause. Ils peuvent être utilisés comme composants dans un test diagnostique ou bien pour la purification par affinité d'anticorps à marqueur radioactif unis à un médicament ou unis à une toxine à utiliser pour le traitement du cancer.

^ L'invention est illustrée par des exemples 20 dans lesquels la construction d'un vaccin à base de p97 contre le mélanome humain est décrite. Toutefois, les procédés et compositions décrits ici ne se limitent pas à la construction de vaccins au moyen de p97, mais sont applicables à d'autres antigènes associés à des tumeurs.

L'invention est exposée de la façon suivante, uniquement pour la clarté de la description : (a) la séquence de nucléotides et aminoacides de p97; (b) les peptides apparentés au p97 préparés par des procédés de synthèse chimiques, (c) les peptides apparentés au p97 produits au moyen de systèmes vecteurs d'expression-hôte, (d) caractérisation immunologique des peptides apparentés au p97, et (e) préparation de vaccins.

5.1. ANALYSE DE LA SEQUENCE DE L'ANTIGENE p97 ASSOCIEE AU MELANOME.

La séquence des nucléotides du gène codant pour le p97 et la séquence des aminoacides qui en dérive sont illustrées à la Fig. 3. Les séquences fonctionnellement équivalentes entrent dans le cadre de la présente invention. Elles comprennent non limitativement les séquences de nucléotides comprenant tout ou partie de la séquence de nucléotides illustrée à la Fig. 3 qui sont altérées par la substitution de codons différents qui codent pour un résidu d'aminoacide identique ou fonctionnellement équivalent induisant ainsi un changement silencieux, ainsi que les séquences d'aminoacides comprenant tout ou partie de la séquence d 'aminoacides illustrée à la Fig. 3 qui sont altérées par la substitution de résidus d'aminoacides fonctionnellement équivalents à l'intérieur de la séquence induisant ainsi un changement silencieux et leurs dérivés qui sont modifiés ou traités, par exemple par glycosylation, phosphorylation, etc. ou à la suite ji d'autres modifications chimiques.

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Les sous-sections ci-après décrivent la stratégie qui a été appliquée pour déterminer la séquence du p97 telle qu'illustrée à la Fig. 3, outre d'autres techniques qui pourraient être appliquées à la détermination de la séquence du p97 ou d'autres antigènes tumoraux qui pourraient être utiles dans des compositions de vaccin.

5·1·1· IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DE L'ANTIGENE P97 ASSOCIE AU MELANOME.

L'activité et la séquence des aminoacides de l'antigene p97 associé au mélanome n'étaient pas connues et, par conséquent, l'identification de l'antigène p97 a été exécutée à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. Un certain nombre de techniques peuvent être appliquées pour engendrer des anticorps monoclonaux spécifiques à l'égard du p97. Par exemple, la technique des hybridomes mise au point par c Köhler et Milstein (1975, Nature 250 : 495-497) peut être appliquée de la façon suivante : des souris ou des rats sont immunisés avec des cellules de mélanome humain et des lymphocytes recueillis chez les animaux immunisés sont fusionnés avec des cellules de myélome; en variante, des lymphocytes provenant de patients porteurs du mélanome peuvent être fusionnés avec des cellules du mélanome (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 80 : 2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45 ; 3951), ou bien la technique pour produire des anticorps monoclonaux à l'aide du virus d’Epstein-Barr (Cole et al., 1985, The EBV-Hydridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) peut être exploitée pour engendrer des anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. En tout cas, les hybridomes résultants sont triés en vue de la produc-' tion d'anticorps qui se fixent sur les cellules du 22 mélanome, mais ne se fixent pas sur les cellules normales.

Les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 décrits ci-dessus peuvent être utilisés de nombreuses façons pour faciliter l'identification, la caractérisation, le clonage et l'expression de séquences de nucléotides qui permettent la production, en grandes quantités, de peptides et protéines apparentés à l'antigène p97. Par exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour caractériser plus finement l'antigène p97 par radiomarquage de toutes les protéines produites par la cellule tumorale, par immunoprécipitation de la protéine tumorale au moyen de l'anticorps monoclonal utilisé pour identifier l'antigène p97, et par fractionnement électrophorétique sur gel des protéines immunoprécipitées. Les antigènes protéiniques s'identifient sous la forme de bandes distinctes sur le cliché autoradiographique résultant (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 : 4980-4983). En outre, les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 peuvent être utilisés pour faciliter le clonage de la façon suivante : (a) pour immunopurifier les poly somes afin d'identifier et d'obtenir des transcrits de mARN présents dans les cellules du mélanome qui codent pour l'antigène p97; (b) pour identifier des clones dans une banque d'expression de cADN qui expriment des peptides ou protéines apparentés à l'antigène p97; (c) pour purifier l'antigêne p97 en vue de préparer des anticorps monoclonaux ou antisérums en supplément à utiliser pour les deux applications précédentes ou (d) pour identifier les cellules dans lesquelles le gène pour l'antigène p97 a été introduit par trans-fection.

Les anticorps monoclonaux peuvent aussi être utilisés pour faciliter la caractérisation structurelle 23 et immunochimique de l'antigène p97 en vue d'identifier des domaines extraceilulaires et antigéniques de la t molécule et pour purifier la molécule en vue de l'analyse de la séquence des aminoacides (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 : 539-543; Brown et al., 1982, Nature, London, 296 : 171-173).

Une caractérisation plus poussée de p97 comprend la détermination de la localisation cellulaire et la cartographie des déterminants antigéniques et des domaines fonctionnels. La localisation subcellulaire peut être effectuée par microscopie d'immunofluorescence et par des expériences de fractionnement cellulaire. Les antigènes tels que le p97 qui sont présents à la surface de la cellule sont préférés pour construire un vaccin, bien que les antigènes intracellulaires puissent être utiles aussi. Si des anticorps monoclonaux multiples sont disponibles, les déterminants antigéniques peuvent être cartographiés par des expériences de compétition, au cours desquelles chaque anticorps est radiomarqué et- soumis à une compétition avec chacun des autres anticorps. Les domaines de la molécule peuvent être identifiés par digestion limitée avec des protéases, puis par SDS-PAGE. Conjointement, ces données doivent permettre l'identification des régions de la molécule qui sont les plus immunogènes. Si les anticorps monoclonaux ont été obtenus par immunisation de cellules intactes, ces régions de la molécule sont alors le plus probablement extracellulaires et utiles pour la construction d'un vaccin.

L'analyse de la séquence des aminoacides permet l'identification sans ambiguïté de la protéine et sa comparaison avec d'autres protéines (Brown et al., 1982, Nature, London, 296 : 171-173). Si la protéine comprend plus de 50 résidus d'aminoacides, il j peut être possible de déterminer une partie seulement 24 de la séquence des aminoacides, le plus souvent l'extrémité N-terminale. L'antigène protéinique pour l'étude de la séquence des aminoacides peut être purifié hors des produits de lyse cellulaire par chromatographie d'immunoaffinité avec l'anticorps monoclonal, puis par SDS-PAGE préparative. La séquence des aminoacides N-terminaux de la protéine purifiée est ensuite déterminée au moyen d'un appareil automatique pour l'étude de la séquence des aminoacides, qui est de préférence un appareil à phase gazeuse pour une sensibilité maximale.

5.1.2. IDENTIFICATION, CLONAGE ET SEQUENÇAGE DE L'ADN CODANT POUR L'ANTIGENE p97 ASSOCIE AU MELANOME.

Les premières études de clonage se sont concentrées sur des protéines abondantes, comme la globine et l'ovalbumine, dont les mARN forment souvent 10 à 50% du mARN total. Ces mARN pourraient être purifiés jusqu'à homogénéité par fractionnement suivant dimension et des sondes de cADN pur pourraient être utilisées pour débrouiller "des banques de quelques centaines de clones par hybridation de colonies. Pour des protéines dont les mARN forment 1 à 10% du mARN total, l'hybridation différentielle avec deux sondes de cADN peut être appliquée, auquel cas l'une des sondes de cADN contient la séquence intéressante et l'autre est un témoin négatif. Les ARN messagers codant pour les protéines peu abondantes, comme les antigènes associés aux tumeurs, qui peuvent former à peine 0,01% du mARN cellulaire, sont beaucoup plus difficiles à cloner parce que des dizaines de milliers de clones doivent être triés et que les sondes de cADN ne donnent alors pas un signal d'hybridation spécifique. Ces deux inconvénients peuvent être atténués par enrichissement du mARN pour la séquence intéressante.

Plusieurs approches appliquées pour cloner f 25 l'ADN codant pour l'antigène p97 associé au mélanome humain sont décrites ci-après. Les clones résultants ont été analysés en vue d'identifier un ou des clones couvrant la région de codage complète de p97. Les segments insérés de nucléotides pour p97 de ces clones ainsi identifiés peuvent ensuite être séquencés suivant tout procédé connu. Les différentes approches sont décrites plus en détail ci-après.

(a) ISOLEMENT Dü mARN PAR IMMUNOPURIPICATION DE POLYSOMES.

Suivant cette technique, des polysomes (qui consistent en mARN, ribosomes et chaînes polypeptides naissantes) sont purifiés par chromatographie d'immuno-affinité avec des anticorps qui reconnaissent les déterminants antigéniques présents sur les chaînes naissantes. Dans de nombreux cas, les anticorps monoclonaux obtenus par immunisation de cellules intactes ou d'extraits cellulaires reconnaissent les antigènes dans leur conformation native, mais ils peuvent ne pas convenir pour une immunopurification des polysomes parce qu'il y a un risque notable que les déterminants antigéniques reconnus ne soient pas présents dans les chaînes naissantes. Comme la traduction commence à l'extrémité N-terminale du polypeptide, les épitopes proches de l'extrémité C-terminale sont probablement absents de la majorité des chaînes naissantes. Cet inconvénient est évité soit en utilisant des anticorps qui reconnaissent les épitopes N-terminaux, soit en préparant les polysomes à partir de cellules traitées à l'aide d'un inhibiteur de la synthèse des protéines qui bloque la terminaison.

Une difficulté plus grave est que les protéines matures diffèrent des chaînes naissantes à cause de modifications succédant à la traduction. Ce problème est particulièrement aigu pour les protéines 26 de la surface cellulaire qui sont modifiées plus abondamment par l'élimination des peptides signaux, par addition de chaînes latérales d'hydrate de carbone et par formation de ponts disulfure. Si un antisérum “ polyclonal est utilisé pour 1'immunopurification des polysomes, les différences du caractère antigénique entre les chaînes naissantes et la protéine mature peuvent être de faible conséquence, parce que pendant l'immunisation, le lapin ou autre animal est exposé non seulement à la protéine native, mais aussi à des formes partiellement ou complètement dénaturée, en particulier si de l'adjuvant de Freund a été utilisé. Même si ces anticorps ne constituent qu'une fraction mineure de la population des anticorps, il peut y en avoir encore suffisamment en présence pour se fixer sur les chaînes naissantes. Toutefois, la préparation d'un antisérum polyclonal contre des protéines de faible abondance peut être extrêmement difficile. Bien qu’un anticorps monoclonal puisse être utilisé pour purifier l'antigène en vue d'immunisations ultérieures, chaque gramme de cellules en culture ne produit souvent qu'un microgramme d'antigène. Ceci est suffisant pour immuniser plusieurs souris, mais à peine suffisant pour un seul lapin.

Une autre solution de la difficulté est d'obtenir un anticorps monoclonal qui reconnaît les déterminants antigéniques présents dans les chaînes naissantes en utilisant l'antigène p97 dénaturé comme immunogène servant à préparer l'anticorps monoclonal. Dans l'exemple de la présente invention, un ensemble d'anticorps monoclonaux reconnaissant trois épitopes distincts sur le domaine N-terminal d'un poids moléculaire de 40.000 daltons de la molécule de p97 étaient disponibles et un pool d'anticorps monoclonaux ayant ^ chacun une spécificité différente a été utilisé dans * -v 27 l'espoir qu'un ou plusieurs d'entre eux se fixeraient sur les chaînes naissantes. Les anticorps choisis * * etaxent hautement spécifiques de p97 en ce que chacun d'eux donnait 1'immunoprécipitation d'une bande unique de p97 à partir d'un produit de lyse de cellules entières radiomarqué et qu'ils avaient des affinités de fixation élevées. Pour le projet de clonage, on a choisi trois anticorps IgG2a, un spécifique pour chacun des trois épitopes. En général, les chances de succès peuvent être augmentées par l’utilisation de plusieurs anticorps à l'égard d'épitopes distincts.

Lors de l'utilisation d'anticorps monoclonaux, la question reste de savoir comment on peut prédire si un anticorps monoclonal donné ou une combinaison donnée d'anticorps reconnaîtra les chaînes naissantes et conviendra donc pour 1'immunopurification des polysomes. Une approche est de déterminer si l'anticorps monoclonal donne l'immunoprécipitation de l'antigène qui a été traduit dans le système du produit de lyse des réticulocytes, en se fiant à la présomption que le produit de traduction in vitro, qui n'a pas été traité, ressemblera aux chaînes naissantes. Une approche différente est de procéder à petite échelle à l'immunoprécipitation des polysomes et d'utiliser ensuite la traduction in vitro pour déterminer si l'espèce de mARN intéressante a été enrichie.

Lorsqu'une technique d'immunopurification des polysomes est appliquée, il est important de surveiller la purification en mesurant l'activité de mARN. Ceci peut être effectué en traduisant le mARN dans un système de produit de lyse des réticulocytes et en analysant les produits de traduction par SDS-PAGE. Bien que l'antigène associé à la tumeur puisse être un constituant trop mineur des produits de traduction du mARN non enrichi pour être observé parmi les centaines 23 d'espèces plus abondantes, il devrait être décelable dans les produits de traduction issus des échantillons de mARN enrichi. En variante, le système de traduction par les oocytes de Xenopus peut être utilisé s'il existe un immunoessai sensible pour détecter l'antigène associé à la tumeur ainsi traduit. Pour le p97, un immunoessai à double déterminant hautement sensible (DDIA) qui utilise deux anticorps monoclonaux spécifiques de deux épitopes différents du p97 a été utilisé à cette fin.

La protéine A fixée sur Sepharose peut être utilisée pour 1'immunopurification des polysomes. L'adsorbant avec protéine A trouve deux applications dans ce mode opératoire. La première est de purifier les anticorps monoclonaux à partir des liquides d'ascite bruts, de façon à éliminer l'activité de ribonucléase contaminante. L'adsorbant avec protéine A est utilisé ensuite conjointement avec des anticorps purifiés pour 1'immunopurification des polysomes portant la chaîne naissante spécifique.

La traduction du mARN dans un système de produit de lyse des réticulocytes permet la caractérisation biochimique du produit de traduction, de même qu'une évaluation de sa pureté.

(b) SONDES D'OLIGONUCLEOTIDES.

Un autre procédé qui peut être appliqué conformément à 1 'invention pour cloner le cADN codant pour l'antigène associé à la tumeur tel que le p97 est de déterminer une séquence d'aminoacides partielle ou complète de l'antigène et de synthétiser une sonde d'oligonucléotides basée sur la séquence de nucléotides déduite de la séquence d'aminoacides. L'oligonucléotide peut alors être utilisé comme amorce pour la synthèse du cADN et comme sonde pour vérifier la banque de cADN j*, résultante. Par conséquent, la protéine p97 associée au 29 mélanome peut, avec avantage, être purifiée hors des produits de lyse des cellules du mélanome par chromatographie d'affinité à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique (Brown et al., 1982, Nature, London, - 296 : 171-173). Une séquence de nucléotides codant pour une partie de la séquence d'aminoacides déterminée est ensuite synthétisée et peut être utilisée comme amorce et/ou sonde. Les parties de la séquence d'aminoacides contenant des résidus d'aminoacides codés par un codon unique ou par deux codons conviennent le mieux à cet effet. Une approche est de synthétiser une séquence plus longue, typiquement de 25 à 60 nucléotides, qui représente la séquence codante la plus probable basée sur les fréquences habituelles des codons connues chez l'être humain. L'utilisation de deux oligonucléotides synthétiques basés sur des parties différentes de la séquence d'aminoacides facilite le débrouillage en permettant d'identifier les signaux d'hybridation positifs faux. De plus, l'utilisation de conditions d'hybridation qui réduisent au minimum l'effet de la teneur en G-C sur le point de dénaturation des hybrides d'ADN facilite aussi le débrouillage. Lorsqu'un clone de cADN partiel a été obtenu suivant ce procédé, il peut être utilisé comme sonde pour aider à obtenir un clone de cADN de longueur complète.

(c) BANQUES D'EXPRESSION DE cADN.

Des vecteurs de clonage qui permettent l'expression du segment inséré de cADN dans les bactéries ont été développés. Une approche, par conséquent, qu'on peut appliquer pour obtenir des clones de cADN pour des protéines associées à une tumeur telles que le p97, est de préparer une banque de cADN par transcription reverse du mARN (enrichi ou non enrichi) isolé des cellules du mélanome, comme décrit ci-dessus, en "H utilisant des oligo(T)-nucléotides d'amorçage ou des 30 oligonucléotides synthétiques d'amorçage décrits ci-dessus, puis de débrouiller une telle banque à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine p97 associée au mélanome. Les clones qui contiennent de : l'ADN codant pour les épitopes reconnus par l'anticorps monoclonal dans l'orientation et le cadre de lecture corrects expriment des peptides ou protéines apparentés à la protéine p97 associée au mélanome et peuvent être identifiés par transfert des protéines exprimées par les clones sur un filtre de nitrocellulose, puis incubation du filtre avec l'anticorps, suivie du développement avec un réactant anti-immunoglobuline marqué.

Une difficulté possible est que de nombreux anticorps monoclonaux ne soient pas à même de reconnaître la protéine exprimée par la bactérie, parce que dans de nombreux cas, seule une partie du cADN est contenue dans le segment inséré et que les bactéries ne traitent pas les protéines de la même façon que le font les cellules eucaryotes. Cette difficulté est particulièrement aiguë pour les protéines de la surface cellulaire d'une tumeur qui sont modifiées plus abondamment par élimination des peptides signaux, par addition de chaînes latérales d'hydrate de carbone et par formation de ponts disulfure. Il peut donc être nécessaire d'engendrer des anticorps monoclonaux qui sont connus comme reconnaissant l'antigène dénaturé ou bien de préparer des antisérums polyspécifiques par immunisation à l'aide de l'antigène purifié.

Lorsqu'un virus recombinant ou plasmide qui est présumé contenir un segment inséré de cADN dérivant d'un antigène p97 associé au mélanome est identifié, le segment de cADN peut être utilisé pour débrouiller des banques supplémentaires aux fins d'identifier soit des "l clones de longueur complète, soit un groupe de clones 31 qui couvrent la longueur complète du cADN qui code pour p97. L'identité du cADN cloné peut être établie par 1 analyse de séquence et par comparaison de la séquence des aminoacides N-terminaux ainsi déduite avec celle : déterminée par analyse directe de la séquence d'amino acides sur la protéine p97.

(d) CLONAGE GENOMIQUE.

Le procédé ci-après permet de cloner l'ADN en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre un déterminant antigénique qui est présent uniquement dans la protéine native et n'est pas présent dans les chaînes naissantes, ni dans la protéine exprimée dans les bactéries. A cet effet, de l'ADN dérivé de cellules du mélanome humain est introduit pas transfection dans des cellules L de souris. Ensuite, les cellules de souris qui expriment l'antigène p97 associé au mélanome sont isolées soit au moyen du trieur de cellules activées par fluorescence, soit par identification immunologique des colonies qui produisent des peptides apparentés au p97 au moyen, d'anticorps monoclonaux radiomarqués dirigés contre le p97 en vue de déceler les peptides apparentés sur des répliques des colonies transférées sur des filtres en toile de polyester. Plusieurs tours successifs de transfection peuvent être nécessaires pour éliminer les séquences d'ADN humain non apparentées. Une banque qénomique est ensuite préparée dans un phage lambda vecteur et ses clones contenant des séquences répétitives humaines qui apparaissent dans les introns de la plupart des gènes sont triés. Lorsqu'un clone génomique est identifié, il peut être utilisé comme sonde d'hybridation pour identifier les clones de cADN contenant l'ADN codant pour le p97.

32 5.2. SYNTHESE DE FRAGMENTS ANTIGENIQUES DE L'ANTIGENE o97 ASSOCIE AU MELANOME ET EVALUATION DU POUVOIR “ IMMUNOGENE.

Des peptides synthétiques peuvent être utilisés comme immunogènes pour susciter contre la protéine native une réponse immunitaire qui peut assurer un certain degré de protection contre un certain nombre d'agents pathogènes. De telles séquences de peptides sont sélectionnées d'après la séquence d'aminoacides connue de l'antigène protéinique par identification de séries d'aminoacides qui sont probablement présents à la surface de la molécule protéinique exposée au milieu extérieur. Ceci est le plus communément exécuté par analyse sur ordinateur de la séquence d'aminoacides en utilisant les paramètres d'hydropathie établis pour les aminoacides. Des critères supplémentaires tels que la structure secon- ,·*· daire prévue ou la flexibilité peuvent être utilisés aussi.

Par conséquent, des peptides synthétiques comprenant 5 à 50 résidus d'aminoacides de la protéine p07 associée au mélanome peuvent être soumis à une épreuve du pouvoir immunogène chez des animaux d'expérience (habituellement la souris ou le lapin). Ces peptides synthétiques comprennent non limitativement tout ou partie de la séquence d'aminoacides sensiblement telle que décrite à la Fig. 3 y compris des séquences altérées dans lesquelles des résidus d*aminoacides fonctionnellement équivalents se substituant à des résidus dans la séquence conduisent à un changement silencieux et/ou des séquences modifiées ou traitées telles que des séquences glycosylées, des séquences phosphorylées, etc. ou des séquences modifiées par voie chimique. Ces peptides apparentés au p97 sont utilisés . soit isolément, soit couplés avec une protéine 33 porteuse, comme 1'hémocyanine serrure de patelle (KLH). Dans l'un et l'autre cas, l'utilisation d'un adjuvant, est facultative, mais préférable. Les animaux immunisés reçoivent un rappel et subissent une recherche des anticorps dirigés vers le peptide immunisant. Ceux porteurs d'anticorps contre le peptide subissent une recherche des anticorps qui se fixent sur la protéine p97 native. Dans le cas d'antigènes associés à une tumeur, comme le p97, il est intéressant aussi de rechercher une réponse d'immunité cellulaire, par exemple en recherchant l'hypersensibilité de type différé (DTH), une prolifération stimulée par antigène in vitro, des cellules T cytolytiques ou un rejet de tumeur dans un modèle approprié. Un modèle approprié serait une tumeur de souris exprimant l'antigène associé à la tumeur humaine en conséquence d'une transfection à l'aide d'un cADN vecteur d'expression approprié construit.

Le but est d'identifier des peptides qui suscitent une vive réponse immunitaire dirigée contre l'antigène p97 associé au mélanome. Lorsqu'ils ont été identifiés, ces peptides peuvent être produits en grandes quantités suivant des procédés de synthèse chimiques bien connus. En variante, les peptides identifiés peuvent être produits en grandes quantités par expression des séquences de nucléotides qui codent pour ces peotides dans des systèmes vecteur d'expression-cellule hôte.

5.3. PRODUCTION DE PEPTIDES APPARENTES AU p97 PAR DES SYSTEMES VECTEUR D'EXPRESSION-HOTE.

Des protéines et peptides peuvent être produits en grandes quantités en insérant des séquences de nucléotides codantes dans un vecteur d'expression approprié, qui est à son tour introduit dans des t· cellules hôtes appropriées, en ce compris, mais sans 34 limitation/ des bactéries, des levures, des cellules d'insectes et des cellules de mammifères. Bien que les hôtes bactériens offrent de nombreux avantages, ils ne traitent pas convenablement de nombreuses protéines eucaryotes et conviennent moins bien que les cellules eucaryotes pour l'expression des protéines associées à la tumeur. Toutefois, les protéines recombinantes produites dans les bactéries peuvent être utiles pour induire des réponses de cellules T, du fait que ces réponses nécessitent, croit-on, la dégradation initiale de l'antigène protéinique.

Afin d'exprimer des peptides apparentés au p97 dans un système vecteur-hôte, des séquences de nucléotides codant pour l'antigène p97 associé au mélanome ou une fraction de celui-ci sont insérées dans un vecteur \, d'expression approprié. De telles séquences de nucléotides comprennent non limitativement tout ou partie de la séquence d'ADN de p97, en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3, y compris les séquences altérées dans lesquelles un ou plusieurs codons à l'intérieur de la séquence sont remplacés par un codon qui code pour un résidu d'aminoacide identique ou fonctionnellement équivalent, conduisant donc à un changement neutre ou silencieux dans la séquence. Le vecteur d'expression contient les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence insérée qui code pour la protéine. Ces éléments varient par leur longueur et leurs spécificités. Suivant le système hôte-vecteur qui est utilisé, l'un quelconque parmi de nombreux éléments de transcription et de traduction appropriés peut être utilisé. Par exemple, lors du clonage dans des systèmes à cellules de mammifères, des promoteurs isolés du génome de cellules de mammifère (par exemple le promoteur de la métallothionine de souris) ou de virus qui ~ croissent dans ces cellules (par exemple le promoteur 35 7.5K du virus de la vaccine) peuvent être utilisés. Les promoteurs produits suivant les techniques de l'ADN recombinant ou par synthèse peuvent être utilisés aussi pour assurer la transcription des séquences insérées.

Des signaux d'initiation spécifiques sont également nécessaires pour une traduction efficace des séquences insérées codant pour la protéine. Ces signaux comprennent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. Dans les cas où le gène ou bien la séquence de cADN est inséré dans un vecteur d'expression approprié, des signaux de contrôle de traduction supplémentaires peuvent être inutiles. Néanmoins, dans les cas où seule une fraction de la séquence codante est insérée, des signaux de contrôle de traduction exogènes, y compris le codon ATG, peuvent devoir être apportés. Le codon d'initiation doit, par conséquent, se trouver en phase par rapport au cadre de lecture des séquences codant pour la protéine, afin d'assurer la traduction du segment inséré complet. Ces séquences de contrôle de traduction exogènes et codons d ' initiation peuvent avoir différentes origines tant naturelles que synthétiques.

L'un quelconque des procédés connus du spécialiste en la matière pour insérer des fragments d'ADN dans un vecteur peut être appliqué pour construire des vecteurs d'expression contenant un gène chiméral consistant en signaux de contrôle de transcription et de traduction appropriés et en les séquences codant pour la protéine. Ces procédés peuvent comprendre ceux appliqués dans les techniques de l'ADN recombinant in vitro, les techniques de synthèse et les recombinaisons in vivo (recombinaison génétique).

Les vecteurs d'expression comprennent non limitativement les vecteurs suivants et leurs dérivés : ^ “ - * “ — “ “ “ “ f 36 d'insectes, les levures vecteurs, les bactériophages vecteurs et les plasmides d'ADN vecteurs. Le clonage et 5 l'expression des gènes dans les systèmes bactériens sont bien connus. Par exemple, lors du clonage dans un E. coli, ses bactériophages ou promoteurs de plasmides, comme le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur recA, le promoteur de 1'ARN ribosomal, les promoteurs Pr et Pl du coliphage lambda et d'autres, y compris, mais non limitativement, lacuv5, le promoteur hybride trp-lacuv5 (tac), ompF, bla, lpp et analogues peuvent être utilisés pour atteindre des valeurs élevées de transcription du segment d'ADN adjacent. Toutefois, en raison des différences opératoires entre les cellules procaryotes et eucaryotes, il peut être préférable d'exprimer les peptides apparentés au p97 de la présente invention dans des cellules eucaryotes. Les procédés les mieux établis pour exprimer les protéines dans les cellules eucaryotes sont (a) l'introduction du gène dans la cellule conjointement avec un gène de résistance à un médicament, s.uivie de la sélection par ce médicament, de préférence en obtenant l'amplification, par exemple avec le système dihydrofolate reductase-méthotrexate; (b) l'expression du cADN dans un plasmide vecteur, souvent basé sur pBR322, en utilisant un promoteur eucaryote puissant ou d'autres séquences régulatrices; (c) l'expression du cADN dans un vecteur viral, souvent issu de SV40, à nouveau en utilisant des promoteurs puissants, en l'occurrence un promoteur de SV40. Les plasmides recombinants vecteurs sont souvent utilisés pour produire des lignées cellulaires qui produisent la protéine pendant une longue durée, alors que les SV40 vecteurs sont souvent utilisés pour obtenir l'expression transitoire. Bien que les cellules des mammifères aient le plus souvent ^ été utilisées contme hôte, les cellules d'insectes et 37 dans certains cas les cellules de levures peuvent convenir aussi. D'aucunes sont décrites plus en détail ci-après.

Pour construire un virus de la vaccine recombinant exprimant l'antigène p97 associé au mélanome, la séquence codante de cADN doit être épissée au promoteur 7.5K du virus de la vaccine pour la formation d'un gêne chiméral. Ce gène chiméral est flanqué par une séquence supplémentaire de virus de la vaccine homologue au gêne viral pour la thymidine-kinase, qui est portée sur l'ADN du plasmide vecteur. La construction du gêne chiméral met en jeu l'utilisation de signaux de contrôle tant naturels que synthétiques pour la transcription et la traduction de la séquence de l'antigène associé à la tumeur. Le gène chiméral est ensuite introduit dans des vecteurs d'expression du virus de la vaccine par la recombinaison in vivo entre la région thymidine-kinase homologue présente tant sur le plasmide vecteur que sur le génome du virus de la vaccine. Ces virus recombinants contenant le gène chiméral sont capables de diriger l'expression des peptides apparentés au p97 dans un hôte infecté et peuvent être utilisés comme composants d'un vaccin.

Dans les cas où un adénovirus est utilisé comme vecteur d'expression, la séquence d'ADN intéressante est épissée sur un complexe de contrôle de transcription/traduction d'un adénovirus, par exemple les séquences de promoteur tardif et tripartites d'entrée. Ce gène chiméral est ensuite inséré dans le génome de 1'adénovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome viral (par exemple la région El ou E3) conduit à un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer le peptide apparenté au p97 dans les hôtes infectés. Actuellement, il existe deux souches d'adéno- 38 virus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire. Ce sont des premiers choix à utiliser comme vecteurs pour exprimer la séquence d'ADN insérée.

Un autre système d'expression qui pourrait être utilisé pour exprimer les peptides apparentés au p97 est un système avec insecte. Dans un tel système, le virus de la polyhédrose nucléaire d'Autographa californica (AcNPV) est utilisé comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus croît dans les cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence d'ADN intéressante peut être clonée dans des régions non essentielles (par exemple le gène de la polyhédrine) du virus qui sont mises sous contrôle d'un promoteur d'AcNPV (par exemple le promoteur de la polyhédrine). L'insertion de la séquence d'ADN avec succès conduit à l'inactivation du gène de la polyhédrine et à la production du virus recombinant non occlus (c'est-à-dire le virus manquant de l'enveloppe protéinique pour laquelle code le gène de -polyhédrine). Ces virus recombinants sont ensuite utilisés pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène inséré est exprimé.

En outre, des souches de cellules hôtes peuvent être choisies qui modulent l'expression des séquences insérées, ou bien qui modifient et traitent le gène chiméral produit d'une façon spécifique souhaitée. L'expression à partir de certains promoteurs peut être augmentée en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc et cadmium pour les promoteurs de la métallothionéine). Par conséquent, l'expression de la protéine produite par génie génétique peut être maîtrisée. Ceci est important si la protéine produite du gène cloné est létale pour les fi cellules hôtes. De plus, des modifications (par exemple 39 glycosylation, phosphorylation, etc.) et traitements (par exemple scission) des protéines produites sont importants pour la structure et la fonction de la protéine. Les différentes cellules hôtes ont des caractéristiques et des mécanismes spécifiques pour le traitement succédant à la traduction et pour la modification des protéines. Des lignées cellulaires ou systèmes hôtes appropriés peuvent être choisis pour assurer la modification et le traitement corrects de la protéine étrangère exprimée.

Dans la forme de réalisation particulière décrite ici pour p97, on a épissé la séquence de cADN de p97 dans un plasmide d'expression vecteur dérivé de pBR322 qui contient le promoteur de la métallo-thionéine. La séquence codante entière de p97 comprenant les peptides signaux et l'ancrage à la membrane a été insérée dans le vecteur.

5.3.1. IDENTIFICATION DES VECTEURS D'EXPRESSION RECOMBINANTS CAPABLES DE REPLIQUER ET DE DIRIGER L'EXPRESSION DES SEQUENCES D'ADN DE p97.

Les vecteurs d'expression contenant des gênes étrangers insérés peuvent être identifiés par trois approches générales : (a) l'hybridation ADN-ADN, (b) la présence ou l'absence de fonctions de gène marqueur, et (c) l'expression des séquences insérées. Dans la première approche, la présence d'un gène étranger inséré dans un vecteur d'expression peut être détectée par hybridation ADN-ADN au moyen de sondes comprenant des séquences qui sont homologues du gêne étranger inséré. Dans la seconde approche, le système vecteur recombinant/hôte peut être identifié et sélectionné sur base de la présence ou de l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur" résultant de l'insertion de gènes dans le vecteur (par exemple l'activité thymidine-kinase, la résistance aux antibiotiques, le 40 phénotype de transformation, etc.)· ?ar exemple, si le gène étranger est inséré à l'intérieur de la séquence du gène marqueur du vecteur, les recombinants contenant 1'ADN inséré peuvent être identifiés par l'absence de la fonction du gène marqueur. Dans la troisième approche, les vecteurs d'expression recombinants peuvent être identifiés par dosage du produit du gène étranger exprimé par le recombinant. Ces dosages peuvent être fondés sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du produit de gène.

Par exemple, lors de la construction d'un virus de la vaccine recombinant conformément à la présente invention, le gène chiméral contenant les séquences codant pour p97 est inséré dans le gène de thymidine-kinase, ce qui l'inactive et confère au virus un phénotype TK". De tels recombinants sont sélectionnés d'après leur aptitude à croître dans des milieux contenant de la 5-bromo-désoxyuridine qui est un nucléoside analooue létal pour les cellules TK+, mais non pour les cellules TK“. Les recombinants sont en outre identifiés par hybridation ADN-ADN au moyen d'une sonde de cADN spécifique pour la protéine associée à la tumeur. Le virus recombinant TK” peut être isolé par purification sur plaque et des stocks en sont préparés à partir de cellules infectées cultivées. Le virus recombinant peut être soumis à une épreuve de son aptitude à induire la synthèse des peptides apparentés au p97. A cet effet, des cellules infectées peuvent être cultivées en présence d'aminoacides radiomarqués, puis les produits de lyse et les fractions subcellulaires des cellules radiomarquées infectées subissent une épreuve d'immunoprécipitation avec des anticorps dirigés contre l'antigène p97 associé au mélanome d'origine. Les produits immunoprécipités sont résolus par SDS—PAGE. Les cellules infectées peuvent aussi être 41 testées par immunofluorescence au moyen d'un anticorps monoclonal.

* Les cellules dans lesquelles un plasmide vecteur a été introduit par transformation peuvent être - identifiées aisément par analyse FACS ou bien par des épreuves de fixation de répliques de colonies de cellules sur toile de polyester. La quantité de peptide apparenté au p97 en présence peut être déterminée par radio-immunoessai quantitatif et sa localisation subcellulaire peut être déterminée par fractionnement cellulaire et par microscopie d'immunofluorescence. La structure du peptide apparenté au p97 exprimée peut être déterminée par SDS-PAGE et par séquençage des aminoacides.

5.3.2. PURIFICATION DU PEPTIDE APPARENTE AU p97 A

PARTIR DES SYSTEMES VECTEUR D'EXPRESSION/HOTE.

De nombreux antigènes associés à une tumeur tels que le p97 sont des glycoprotéines de la surface cellulaire et contiennent un peptide signal N-terminal et un peptide d'ancrage C-terminal (Davis et al., 1935, J. Mol. Biol. 181 s 111-121). Lors de l'expression dans un vecteur approprié, il est à prévoir que la protéine soit transposée à la surface de la cellule. Pour faciliter la purification de la protéine, il peut être préférable d'effacer la séquence d'ADN codant pour la région d'ancrage de la membrane, afin que la protéine mature soit dégagée dans le milieu de culture.

Le peptide apparenté au p97 peut être purifié à partir des cellules hôtes par lyse à l'aide d'un détergent, puis par chromatographie d'affinité à l'aide d'anticorps monoclonaux. Si une protéine tronquée doit être purifiée à partir du milieu de culture, il est préférable d'utiliser un milieu exempt de sérum et d'appliquer ensuite la chromatographie d'affinité avec des antigènes monoclonaux. Il est important que l'anti 42 gène puisse être élué hors de l'adsorbant portant l'anticorps sans réduction du pouvoir antigénique ni dénaturation de l'antigène. Ceci peut être obtenu par élévation ou abaissement du pH ou bien par recours à un chaotrope. Il peut être nécessaire de sélectionner un anticorps monoclonal qui libère l'antigène dans des conditions relativement modérées. Cet antigène purifié par affinité peut être purifié davantage par HPLC.

5.4. CARACTERISATION IMMUNOLOGIQUE DES PEPTIDES APPARENTES AU p97.

L'aptitude de l'antigène synthétique ou recombinant à susciter une réponse antitumorale peut être évaluée initialement chez les animaux d'expérience. Ceci se réalise par construction d'un système modèle dans lequel la protéine p97 associée au mélanome humain est exprimée dans des cellules de la souche consanquine appropriée de l'espèce expérimentale. Les animaux sont ensuite immunisés au moyen du peptide apparenté à p97 de la présente invention suivant différents protocoles et sont ensuite soumis à une épreuve de l'acquisition des anticorps dirigés contre l'antigène p97 associé au mélanome, de l'immunité à médiation cellulaire telle que l'hypersensibilité de type différé à l'égard de l'antigène p97 et de leur aptitude à surmonter une agression par des cellules tumorales syngénériques viables exprimant l'antigène p97. De plus, des épreuves in vitro de l'immunité cellulaire peuvent être effectuées pour mesurer la prolifération des lymphocytes en réponse au peptide apparenté au p97 et aussi l'aptitude des lymphocytes provenant d'animaux immunisés ou de patients humains porteurs du mélanome à tuer les cellules tumorales qui expriment l'antigène p97. De plus, en immunisant des souris avec du p97 de souris, on est à même de déter-miner l'ampleur avec laquelle il est possible d'induire 43 une réponse immunitaire à l'égard d'un antigène qui est présent en traces dans les tissus normaux.

Des primates non humains peuvent être utilisés pour établir la sûreté des peptides apparentés au p97 de la présente invention. A cet effet, les animaux peuvent être immunisés suivant des protocoles qui pourraient, du point de vue éthique, s'appliquer à un patient cancéreux humain et passent ensuite les épreuves indiquées ci-dessus, sauf que les expériences de transplantation de la tumeur ne sont pas possibles, parce qu'elles nécessitent d'utiliser des souches consanguines. La sûreté de la technique d'immunisation se détermine par observation de l'effet de l'immunisation sur la santé générale des animaux immunisés (variations de poids, fièvre, appétit, comportement, etc.) et par observation des modifications pathologiques lors de l'autopsie.

Enfin, le peptide apparenté au p97 de la présente invention peut être essayé chez des patients humains cancéreux. Après une" phase initiale I d'essai sur des patients cancéreux avancés visant à établir l'absence de toxicité, des patients cancéreux en état de rémission, mais présentant une haute probabilité de rechute, pourraient se prêter à l'épreuve. Leur réponse immunitaire serait évaluée comme décrit ci-dessus à propos des primates non humains, sauf que l'effet du traitement sur l'affection acquise ou sur la fréquence de récurrence serait examiné. Dans le cas de l'antigène p97 du mélanome, les naevi bénins (moles) qui expriment l'antigène seraient examinés aussi.

5.5. PREPARATION D'UN VACCIN.

L'objet de la présente forme de réalisation de l'invention est de produire, suivant les techniques de synthèse ou de l'ADN recombinant, un peptide synthé-^ ^^t^ue, une protéine purifiée ou un virus recombinant 44 pouvant s'utiliser comme immunogène et un vaccin pour protéger les patients cancéreux à risque élevé de récurrence de leur affection, pour traiter l'affection établie et, en dernier, pour vacciner à titre prophylactique les individus à haut risque. En fait, l'antigène p97 associé au mélanome, synthétique ou recombinant, peut être utilisé conjointement avec d'autres immunogènes pour préparer des vaccins polyvalents en vue de la prévention du mélanome et d'autres cancers. Des exemples de diverses compositions de vaccin sont discutés ci-après.

5.5.1. COMPOSITIONS DE VACCINS VIRALES.

Lorsque le peptide apparenté au p97 de la présente invention est produit à l'aide d'un virus recombinant, un vaccin de virus recombinant vivant ou un vaccin de virus recombinant inactivé peut être préparé. Le choix dépend de la nature du virus recom- w binant qui est utilisé pour exprimer le peptide apparenté au p97. Lorsque le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser, mais ne provoque pas la maladie, un vaccin vivant est préférable parce que la multiplication chez l'hôte conduit à un stimulus prolongé de nature et d'ampleur semblables à celles se manifestant dans les infections subcliniques et confère donc une immunité sensible et durable. Le virus recombinant infectieux, après introduction chez un hôte, peut exprimer le peptide apparenté au p97 â partir de son gène chiméral et ainsi stimuler une réponse immunitaire. Le virus recombinant vivant lui-même peut être utilisé comme vaccin préventif contre le mélanome. La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces compositions peut mettre en jeu des systèmes tant in vitro (par exemple des cellules de culture de tissu) qu'in vivo (par exemple un animal hôte naturel H tel que la vache). Les procédés classiques pour la 45 préparation et la mise en composition du vaccin antivariolique peuvent être appliqués à la mise en composition d'un vaccin de virus recombinant vivant.

Des vaccins de virus vivants polyvalents peuvent être préparés à partir d'un seul ou de quelques virus recombinants infectieux qui expriment divers antigènes de différentes cellules tumorales ou cancéreuses. Par exemple, un virus vivant {qui peut comprendre environ 35 kilobases d'A.DN étranger) peut être construit de manière à contenir des séquences codantes pour d'autres épitopes et un tel virus recombinant lui-même peut être utilisé comme immunogène dans un vaccin polyvalent. En variante, un mélange du virus de la vaccine et/ou d'autres virus, dont chacun est capable de diriger l'expression d'un gène différent codant pour des épitopes différents, peut être présent en un vaccin polyvalent.

Que le vaccin recombinant soit ou non infectieux pour 1'hôte à immuniser, une composition de vaccin inactivé peut être préparée. Les vaccins inactivés sont "morts" dans le seps que leur infectivité a été détruite, habituellement par traitement au moyen de formaldéhyde. Dans le cas idéal, l'infectivité du virus est détruite sans effet sur les protéines de la capside ou enveloppe qui portent le caractère immunogène du virus. Pour préparer des vaccins inactivés, de grandes quantités du virus recombinant doivent être obtenues en culture afin de disposer de la quantité nécessaire des antigènes compétents. Un mélange de virus inactivés qui expriment des épitopes différents peut être utilisé pour la préparation de vaccins "polyvalents". Dans certains cas, ceci peut être préférable à des compositions de vaccin vivant en raison des difficultés potentielles dues aux interactions mutuelles des virus ______^^vivants administrés ensemble. Dans l'un et l'autre cas, 46 le virus recombinant inactivé ou le mélange de ces virus doit être mis en composition avec un adjuvant * approprié, afin d'améliorer la réponse immunologique à l'égard de leurs antigènes. Des adjuvants appropriés comprennent non limitativement des gels minéraux, comme 1'hydroxyde d'aluminium; des substances tensioactives, comme la lysolécithine; les polyols Pluronic, des polyanions; des peptides et des émulsions huileuses.

De nombreux procédés peuvent être appliqués pour introduire les compositions de vaccin décrites ci-dessus et comprennent non limitativement les voies intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée et intranasale. Lorsqu'une composition de vaccin de virus recombinant vivant est utilisée, elle peut être introduite par la voie naturelle d'infection par le virus du type sauvage d'origine qui a été utilisé pour préparer le virus recombinant de la composition de vaccin.

5.5.2. COMPOSITIONS DE VACCINS SOUS-UNITAIRES.

Au lieu des vaccins de virus, le peptide apparenté au p97 peut lui-même être utilisé comme immunogène dans des compositions de vaccin sous-unitaires. Les vaccins sous-unitaires comprennent uniquement la substance immunogène compétente nécessaire pour immuniser un hôte. Par conséquent, le peptide apparenté au p97 peut être purifié à partir des recombinants qui expriment le peptide. Ces recombinants comprennent l'une quelconque des cellules en culture infectées par le virus, bactéries transformées ou levures transformées citées précédemment. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, les peptides ou protéines apparentés au p97 peuvent être synthétisés chimiquement.

Que les peptides apparentés au o97 soient ^^purifiés à partir des recombinants ou soient synthé- 47 tisés chimiquement, le produit final peut être ajusté à une concentration appropriée, mis en composition avec tout adjuvant de vaccin convenable et conditionné en vue de l'administration. Des adjuvants convenables comprennent non limitativement, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium; des substances tensio-actives, comme la lysolécithine; les polyols Pluronic; des polyanions; des peptides et des émulsions huileuses. Le peptide apparenté au p97 peut aussi être incorporé à des liposomes ou bien être conjugué à des polysaccharides et/ou d'autres polymères à utiliser dans une composition de vaccin.

Dans les cas où le peptide apparenté au p97 est un haptène, c'est-à-dire une molécule qui est antigénique dans le sens qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps appropriés, mais n'est pas immunogène dans le sens qu'elle ne peut susciter de réponse immunitaire, l'haptène peut être uni par covalence à une molécule vecteur ou immunogène et l'haptène-vecteur peut être “ mis en composition pour servir de vaccin; par exemple une grosse protéine, comme l'albumine du sérum, confère le caractère immunogène à l'haptène auquel elle est combinée.

6. EXEMPLE : L'ANTIGENE p97 ASSOCIE AU MELANOME.

Dans l'exemple décrit ci-après, des clones de cADN issus de différentes régions du mARN de p97 sont assemblés et insérés dans un vecteur d'expression qui dirige l'expression d'un peptide apparenté au p97. Les peptides apparentés au p97 produits par le vecteur d'expression-cellule hôte peuvent être mis en composition en un vaccin.

6.1. PURIFICATION DU mARN de p97.

On prépare des polysomes à partir de cellules du mélanome SK-MEL 28 (Carey et al,, 1976, Proc. Natl.

H Acad. Sei. USA 73 : 3270-3282) par précipitation par le 48 magnésium. A partir de cette préparation, on purifie des polysomes portant des chaînes naissantes de p97 par incubation avec trois anticorps monoclonaux IgG2a (96.5, 118.1, 133.2) spécifiques pour des épitopes distincts de p97 (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 : 4980-4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127 : 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 : 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303 : 70—72) et ensuite par chromatographie d'affinité sur Sepharose avec protéine A. On élue le mARN enrichi en p97 au moyen d'EDTA et on le purifie par chromatographie d'affinité sur oligo(T)-cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD). Au cours d'une expérience typique, 150 unités ^260 àe polysomes donnent 260 ng de mARN enrichi en p97, ce qui représente 0,23% du mARN total. Après traduction dans des oocytes de Xenopus et dosage du p97 comme décrit (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 : 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303 : 70-72), le mARN enrichi en p97 donne 80 „pg de p97 par ng de mARN, alors que le mARN non enrichi en pg"’ ne donne que 0,44 pg de p97 par ng de mÀRN, ce qui démontre que l'activité de mARN de p97 a été enrichie 180 fois. Le rendement de l'activité de mARN de p97 est de 42%. La traduction dans le système de produit de lyse de réticulocytes (Pelham et JacKson, 1976, Eur. J. Biochem. 67 : 247-256) montre que le mARN enrichi en p97 code pour un polypeptide majeur qui a un poids moléculaire apparent de 84.000 daltons, comme l'indique l'analyse par SDS-PAGE, qui n'est pas décelable dans les produits de traduction du mARN non enrichi et qui est immunoprécipité par l'antisérum spécifique de p97 (Fig. 1). On en a conclu qu'il est le précurseur non glycosylé de p97.

49 6.2. PREPARATION ET CONSTRUCTION DE CLONES DE cADN.

Deux techniques décrites ci-après sont appliquées à la construction de clones de cADN transcrits à partir des mARN modèles isolés ci-dessus.

6.2.1. CONSTRUCTION DE CLONES DE cADN AMORCEE PAR OLIGO(T).

On a utilisé le mARN enrichi en p97 préparé ci-dessus comme modèle pour la synthèse du cADN amorcée par oligo(T). Le cADN a été cloné dans pBR322 de la façon suivante : pour la synthèse du premier brin de cADN, le mARN enrichi en p97, on a mis à incuber les quatres dNTPs et l'oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) avec de la transcriptase reverse (Mole-cular Genetic Resources). On a synthétisé le second brin par incubation avec le gros fragment d'ADN polymérase de E. coli (Bethesda Research Labs, Bethesda MD), et on a mis le cADN en double brin à digérer avec de la nucléase SI (don de D. Durnam, de The Fred Hutchinsen Cancer Research Center, Seattle, WA). On a ensuite fixé au cADN une queuê dC au moyen de désoxynu-cléotidyl-transférase terminale (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD), on a soumis le cADN à la maturation avec pBR322 à queue dG digéré par PstI (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 : 3727-3732), puis on l'a utilisé pour transformer E. coli RR1 traité par le CaCl2· a fixé l'ADN des colonies des bactéries transformées sur papier (Taub et Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126 : 222-230) et on l'a débrouillé par hybridation différentielle avec des sondes de cADN synthétisées sur des modèles de mARN non enrichi et enrichi en p97.

On a identifié un clone de 243 paires de bases (bp), le p97-3a2f1, qui s'hybride avec le cADN enrichi !P^7, mais non de façon détectable avec le cADN non 50 enrichi et aussi le mARN de p97 sélectionné dans des expériences de traduction avec sélection par hybride. Un signal de polyadénylation (AATAA) et un tractus poly(A) étaient présents à l'extrémité 3' du cADN (voir Pig. 2). Le p97-3a2fl traduit avec trou monocaténaire s'hybride 100 fois plus fort avec le mARN enrichi en p97 qu'avec le mARN de mélanome non enrichi et de façon non décelable avec le mARN de fibroblaste. L'analyse d'empreinte de Northern avec le cADN cloné comme sonde a identifié un mARN d'environ 4 kilobases (kb) qui était présent dans les cellules du mélanome SK-MEL 28 et absent des fibroblastes.

6.2.2. CLONAGE GENOMIQUE DS p97 ET UTILISATION DES OLIGONUCLEOTIDES SYNTHETIQUES POUR AMORCER LA SYNTHESE DU cADN.

Les tentatives d'obtenir des clones de cADN s'étendant sur plus de 1 kb à partir du site de polyadénylation n'ont pas eu de succès, peut-être à cause d'une région à haute teneur en G-C (plus de 80%) avec structure secondaire étendue," On a appliqué le clonage génomique pour contourner la difficulté. On a isolé quatre clones génomiques chevauchants hors de banques de lambda L47.1 contenant de l'ADN de SK-MEL 28 fractionné suivant dimensions et enrichi avec un fragment de restriction de p97 spécifique. Ces quatre clones génomiques couvrent 28 kb et contiennent toute la région codante de p97 y compris la région régulatrice du gène. Les clones génomiques tels qu'agencés en succession â partir de 5' jusqu'à 3' sont : lambda B15, lambda H17, lambda B6.6 et lambda E7.7. Cette nomenclature consiste en une lettre qui fait référence à l'enzyme de restriction utilisée pour engendrer le fragment et en un nombre qui indique la dimension en kilobases du fragment qui a été cloné dans lambda ' ή L47.1. Ainsi, à partir de l'extrémité 5', le clone 51 lambda Bl5 contient un fragment BamHI p97 de 15 Kb; le clone lambda H17 contient un fragment HindlII p97 de 17 kb; le clone lambda B6.6 contient un fragment BamHI p97 de 6,6 kb et le clone lambda E7.7 contient un fragment EcoRI p97 de 7,7 kb (voir Fig. 2A). Les fragments de restriction des clones qui s'hybrident avec le mARN de p97 de 4 kb sur des empreintes de Northern ont été séquencés et les exons de p97 ont été identifiés par une recherche d'homologie assistée par ordinateur entre les séquences codantes prévues et les séquences d'aminoacides de transferrine d'homme et de poule (Yang et al., 1934, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 : 2504-2508; Jetsch et Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122 ; 291-295).

On a utilisé trois oligonucléotides synthétiques dont les séquences sont basées sur les séquences d'exons génomiques de p97 pour amorcer la synthèse du cADN sur le mARN de SK-MEL 28 et on a cloné le cADN résultant dans lambda-gtlO de" la façon suivante : on a fixé une queue dG sur le cADN de p97 et on a épissé celui-ci avec un oligonucléotide de pontage (AATTCCCCCCCGCCGC) et lambda-gtlO ayant subi la restriction par EcoRI. L'oligonucléotide de pontage permet l'insertion et l'épissage des séquences de cADN à queue dG dans le site EcoRI de lambda-gtlO. On a enveloppé le phage lambda (Grosveld et al., 1981, Gene 13 : 227-237), et on l'a appliqué sur E. coli cgQO rK_ mK+hfl. On a débrouillé les banques de cADN dans lambda-gtlO d'après le fragment inséré de p97 par hybridation sur plaque (Benton et Davis, 1977, Science 196 :180) au moyen de fragments de l'exon génomique comme sondes. Les sondes étaient radiomarquées au 32p_ TTP (New England Nuclear, 3200 Ci par mmole) par transduction avec trou monocaténaire jusqu'à une /i 52 activité spécifique de 5-10 x 10¾ coups par minute par microgramme. On a identifié trois clones de cADN " chevauchants (lOal, ljl, 2fl) couvrant 2.368 nucléo tides du mARN de p97 y compris la région codante complète en utilisant des fragments spécifiques de l'exon de p97 comme sondes (Fig. 2).

6.3. SEQUENÇAGE DE L1 ADN DE p97.

On a excisé les fragments insérés de cADN et on les a subcloné dans le plasmide vecteur pEM3L13+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 : 1645-1655) dans E. coli en vue de la propagation ultérieure et de la cartographique de restriction. On a subcloné aussi le cADN dans le phage M13mpl8 vecteur de clonage (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33 : 103-119) et on l'a séquencé par le procédé didésoxy de Sänger (Sänger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 : 5463-5467). On a séquencé les clones M13 contenant des fragments insérés importants en engendrant des délétions au moyen d'ADNase I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 153 : 539-549) ou d'exonucléase III (Henikoff, 1984, Gene 28 : 351-3 59), et en utilisant des amorces d'oligonucléotides 21-mères synthétiques.

La séquence de cADN de p97 est illustrée à la Fig. 3. Un cadre de lecture ouvert de 2.214 nucléotides s'étend du premier ATG, la séquence autour de laquelle se conforme la séquence d'approbation d'initiation déterminée par Kozak (Kozak, 1980? Nucleic Acids Res. 8 : 127-142), jusqu'à TGA à la position 2.215. Le clone de cADN le plus près de 5' contient un supplément de 60 nucléotides à l'amont de l'ATG d'initiation. La région 3' non codante de mARN de p97, qui n'a pas été obtenue à l'état de clone de cADN, a été identifiée comme étant un exon génomique unique contenant 1.667 nucléotides. Les résidus 20-32 de la séquence ^ j d'aminoacides prévue sont identiques à la séquence 53 d'aminoacides N-terminale connue de p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296 : 171-173), ce qui prouve r l’identité du cADN cloné. De surcroît, le poids molécu laire prévu du précurseur est de 80.196 daltons, en bon accord avec le poids moléculaire observé du produit de traduction in vitro.

6.4. CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE D'EXPRESSION RECOMBINANT CONTENANT LA SEQUENCE CODANT POUR p97.

La grande dimension du gène p97 a nécessité d'assembler les clones de cADN qui ont été obtenus par amorçage spécifique du mARN de mélanome au moyen de transcriptase reverse. On a utilisé les trois clones de cADN de lambda-gtlO (10al, ljl et lfl, voir Fig. 2) couvrant la région codante à partir du peptide signal en passant par la séquence d'ancrage sur la membrane. On a excisé le segment inséré de p97 du clone lOal par digestion avec EcoRI et on a éliminé la séquence " oligo(dG) à l'extrémité 5' du cADN lOal par digestion avec de l’exonucléase III, engendrant le clone lOalb, avec un site HindlII à 30 bp à l'amont de la méthionine d'initiation de la préprotéine de p97. Les segments insérés de p97 des trois clones de cADN lOalb, ljl et 2fl et le clone génomique E7.7 ont été épissés ensemble aux sites de restriction PvuII, SstI et EcoRI et insérés dans les sites HindiII-EcoRI du plasmide vecteur pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nue. Acid. Res. 11 î 1645-1655) comme illustré à la Fig. 2. La construction finale, p97b, contient le segment inséré de 4,4 Kb de p97 dans le plasmide vecteur pEMBL18+ qu'on a utilisé pour transformer E. coli HB101. Le segment inséré dans p97b contient 30 bp de la région 5’ non traduite de mARN de p97, la séquence codante entière et la région 3' non traduite, unies par un site HindlII en 5' et un site EcoRI en 3'.

^ On a excisé le segment inséré de p97 de \ 54 4,4 kilobases hors de p97b au moyen de Hindlll et EcoRI et on a garni les extrémités en utilisant le fragment : Klenov d'ADN polymérase de E. coli. On a inséré le fragment à extrémités non adhésives dans 1'unique site Smal du vecteur d'expression de cADN eucaryote 1995.12 pUC13, qui est un dérivé du vecteur mThGH-112 (Palmiter et al., 1933, Science 222 : 809-314) qui a été acquis chez le Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle, Washington). Ce vecteur utilise un promoteur de la métallothionéine de souris pour exprimer les gènes étrangers dans les cellules eucaryotes. On a identifié le produit construit avec le fragment inséré de p97 dans la bonne orientation par une analyse de restriction et on l'a désigné par pMTp97b.

On a transfecté le plasmide recombinant dans des cellules LMTK- et on a sélectionné les cellules transfectées par croissance du milieu HAT. On a multiplié les clones recueillis dans la boîte transfectée dans des plaques de microtitrage à 96 cupules et on a dosé le p97 dans le milieu de culture usé et les produits de lyse cellulaire de plaques faites en double suivant une technique immunoradiométrique à deux sites. On a multiplié ces sous-clones qu'on a revérifiés. On a fait croître le clone TKMp97-12 qui exprime environ 4.000.000 de molécules de p97 par cellule, on en a fait l'induction par le cadmium et on l'a utilisé comme source du p97 pour l'immunisation.

6.5. IMMUNISATION DE LA SOURIS Aü MOYEN DES PEPTIDES APPARENTES AU p97.

On a multiplié par culture les cellules TKMp97-12, on a opéré l'induction par le cadmium et on les a lysées (14,4 g) par incubation pendant 10 minutes sur de la glace avec 70 ml de TNEN (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM et NP-40 0,5%). On a ultracentrifugé le produit de lyse à 200.000 g pendant 55 45 minutes à 4°C et on a fait passer la moitié du produit de lyse sur une colonne d1 immunoaf finité de 1 ml spécifique pour le p97 (fragment Fab de l'anticorps 96.5 couplé à du Sepharose). On a lavé abondam-” ment 1'imnunoadsorbant d'abord au TNEN et enfin avec du

Tris-dCl 20 mM de pH 6,8.

Pour l'immunisation, on a mélangé 0,5 ml de la colonne d'immunoaffinité adsorbé préparé comme décrit ci-dessus avec 0,5 ml de Tris-HCl 20 mM de pH 6,8 et on a émulsionné avec 1 ml d'adjuvant complet de Freund. On a administré par voie intrapéritonéale 0,4 ml de l'émulsion à chacune de quatre souris BLAB/c. On a donné une injection de rappel trois semaines plus tard aux souris avec un quart de cette quantité d'antigêne dans de l'adjuvant incomplet de Freund. On a immunisé les souris témoins avec une colonne d'immunoaffinité d'un anticorps non apparenté au p97, mais qui a par ailleurs été traité de façon identique. On a saigné une semaine après le rappel quatre des souris immunisées au p97 et deux souris témoins. On a recherché les anticorps contre p97, par immunoprécipitation, dans les sérums issus de cellules du mélanome SK-MEL radio-iodé, suivie de SDS-PAGE. Les résultats ont montré que les sérums provenant des quatre souris immunisées au p97 font l'immunoprécipitation de p97, tandis que les sérums témoins sont négatifs. On a vérifié sur les sérums aussi la présence des anticorps dirigés contre le p97 par un test ELISA sur des cellules de mélanome SK-MEL 28 fixées par le glutaraldéhyde (20.000 cellules par cupule de microtitrage). On a mis les cellules fixées à incuber avec 0,05 ml de sérum dilué à 1/10.000 pendant une heure à la température ambiante, on les a lavées, puis on les a mises à incuber pendant une heure à la température ambiante avec 0,05 ml d'IgG antisouris * Λ /' de chèvre conjuguée avec de la peroxydase de raifort

X

56 (Southern Biotech.)· Les densités optiques (lues à 490 nm) des sérums provenant des souris immunisées au p97 ont été de 0,350, 0,243, 0,343 et 0,200, alors que la densité optique des sérums des témoins a été de 0,036 et 0,057.

6.6. CARACTERISATION DJS p97 6.6.1. STRUCTURE DE p97

On a déterminé la structure de p97 d'après la séquence d'aminoacides du précurseur de p97 qui comprend quatre domaines structuraux. Comme le résidu 20 de la séquence du précurseur correspond à l'extrémité N-terminale du p97 a maturité, les résidus d'aminoacides 1-19 constituent probablement un peptide signal, conclusion qui est confirmée par sa longueur et son caractère hydrophobe. Les aminoacides 20-361 et 362-713 , comprennent deux domaines homologues de 342 et 352 ami noacides. Des sites de glycosylation N-liés potentiels existent aux positions 38 et 135 dans le domaine N-terminal et à la position 515 dans le domaine C-terminal. Enfin, on est porté à croire que les aminoacides 714-738, une région de résidus principalement non chargés et hydrophobes, ancrent le p97 à la membrane cellulaire (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181 : 111-121) et peuvent pénétrer jusque dans le cytoplasme.

La structure des domaines de p97 est confirmée par les expériences de digestion par les protéases. La digestion de p97 par la trypsine, la papaïne (Brown et al., 1931, J. Immunol. 127 : 539-546) ou la thrombine donne un fragment antigénique glycosylé d'environ 40.000 daltons de poids moléculaire. On a purifié ce fragment à partir d'un produit de digestion du p97 par la thrombine qui a été marqué par voie métabolique à ^^S-méthionine ou 35g_CyStéine et on l'a séquencé comme »^ décrit (Brown et al., 1982, Nature, London 296 : 171- 57 173). Des résidus de cystéine ont été identifiés aux positions 7 et 17 et des résidus de méthionine aux positions 2 et 10. Des résultats identiques ont été obtenus avec le p97 intact et sont en complet accord avec la seouence N-terminale de p97 prédite à partir de la séquence de cA.DN. On a conclu que le fragment d'un poids moléculaire de 40.000 daltons qui résiste à la protease correspond au domaine N-terminal de p97. On n'a pas été à même d'isoler le domaine C-terminal de p97, peut-être en raison de sa sensibilité à la protéase.

6.6.2. HOMOLOGIE DU p97 AVEC LA TRANSFERRINS.

Une investigation de la banque de séquences d'aminoacides de Protein Identification Resource (Release 5.0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London 290 : 8) a montré que le p97 est étonnamment homologue aux trois membres de la superfamille des transfer- λ rines : la transferrine du sérum humain, la lactotrans-ferrine humaine et la transferrine de poule (37-39¾ d'homologie, voir Fig. 4). Du fait que les transfer-rines d'être humain et de poule présentent 50% d'homologie· l'une avec l'autre, le p97 doit avoir divergé de la transferrine du sérum il y a plus de 300 millions d'années. Le p97 comprend 14 résidus de cystéine situés dans des positions homologues dans chaque domaine. La transferrine humaine contient toutes ces cystéines dans des positions homologues dans les deux domaines, tandis qu'il ne manque à la lactotransferrine humaine et à la transferrine de poule que deux de ces résidus de cystéine (dans leurs domaines C-terminaux). Au contraire du p97, ces protéines contiennent 4 à 7 résidus de cystéine supplémentaires dans leurs domaines C-terminaux qui n'ont pas de terme correspondant dans le domaine N-terminal. La transferrine humaine contient ^ aussi 2 résidus de cystéine supplémentaires propres à 58 son domaine N-terminal. Les positions de la plupart des disulfures dans la transferrine de sérum humain, la lactotransferrine et la transferrine de poule ont été déterminées directement (McGillivray et al., 1932, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 : 2504-2508? Metz-Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145 : 659-676? Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel) 39 : 135-141? McGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem.

258 : 3543-3553? Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem. 122 : 297-303? Williams, 1974, Biochem. J. 141 : 745-752). On peut donc prédire la séquence des 7 ponts disulfure dans chaque domaine de p97 (voir Fig. 5).

L'homologie des aminoacides entre les domaines de p97 (acquise à 46% par insertion de 7 manques de 9 résidus) est plus remarquable que celle observée dans la transferrine humaine (43% - 16 manques, 45 résidus) J ou la transferrine de poule (35% - 12 manques, 49 résidus). Etant donné la longue séquence d'homologie entre le p97 et la transferrine et les motifs de pliage apparemment semblables, sur base de la conservation des résidus de cystéine, on est porté à croire que si la structure aux rayons X à faible résolution actuelle de la transferrine (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281 : 157-158) pouvait être affinée, il serait possible d'en déduire la structure tridimensionnelle du p97.

6.6.3. FONCTION DE p97.

Son appartenance à la superfamille des trans-ferrines, son aptitude à fixer le fer (Brown et al., 1982, Nature, London 296 : 171-173) et sa localisation chromosomique commune avec la transferrine et le récepteur de la transferrine (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303 : 70-72? Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756) confirment ! ensemble un rôle du p97 dans le transport du fer. La 59 cavité de fixation du fer de la transferrine contient, croit-on, 2 ou 3 tyrosines, 1 ou 2 histidines et une seule arginine fixant le bicarbonate (Metz-Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145 ï 659-676). La conservation de ces aminoacides dans le p97 confirme son rôle proposé dans le métabolisme du fer (voir Fig. 4). Comme le p97 est une molécule analogue à la transferrine et unie à la membrane et n'a pas d'homologie avec le récepteur de la transferrine (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311 : 675-678), son rôle dans le métabolisme cellulaire du fer peut différer de celui assuré par la transferrine circulante du sérum et par le récepteur cellulaire pour la transferrine. L'expression du cADN de p97 cloné dans des cellules eucaryotes permettra la vérification expérimentale de ses propriétés fonctionnelles.

6.6.4. CONCLUSION.

Sur base de ces données, il est évident qu'on a obtenu des cADN construits pour le p97 associé au mélanome et qu'ils peuvent être exprimés efficacement dans des cellules de mammifères pour produire de grandes quantités de p97 antigénique.

7. EXPRESSION DU p97 CLONE ET EPREUVE DU VACCIN.

Les expériences détaillées ici décrivent l'expression de la protéine p97 clonée et son épreuve comme vaccin. L'expression de la protéine p97 dans une forme sécrétée (par le clone cellulaire de souris transfecté B16SVp97a.14) a permis de purifier en quantités de l'ordre du milligramme la protéine p97 en pleine longueur. La protéine sous forme purifiée a été utilisée pour des épreuves in vitro de l'induction de 1'immunité cellulaire et pour des épreuves de son potentiel comme vaccin sous-unitaire. Le produit de gène p97 a été exprimé aussi à la surface cellulaire de 'H cellules du mélanome de la souris en métastase, ce qui 60 constitue un modèle pour l'épreuve de l'efficacité des vaccins à empêcher la croissance des tumeurs dans un système syngénérique.

Le gène de p97 a été inséré dans un virus recombinant vivant de la vaccine â utiliser comme composition de vaccin capable d'engendrer une immunité cellulaire efficace. Le virus de la vaccine recombinant, Vp97a-NY, a fait l'objet d'une évaluation de son aptitude à induire l'immunité chez la souris, au cours de différents essais visant à démontrer l'immunité humorale et cellulaire. Au moyen du modèle de tumeur syngénérique chez la souris décrit ci-dessus, il a été démontré que le vaccin de virus recombinant Vp97a-NY exerce un effet protecteur contre une agression par des cellules tumorales. Le vaccin a exercé aussi un effet thérapeutique chez la souris contre des métastases pulmonaires existantes en croissance, ce qui est une J propriété analogue à l'utilisation envisagée du vaccin pour induire une réponse antitumorale immunothérapeu-tique chez des êtres humains porteurs d'un mélanome.

En plus des études sur la souris, où il n'existe que 91% d'homologie entre le p97 de l'être humain et la protéine homologue de la souris (sur les régions examinées jusqu'à présent), le vaccin Vp97a-NY a été essayé aussi sur des primates non humains. Il existe une homologie beaucouo plus étroite entre le p97 de l'être humain et la forme de la protéine propre au singe (comme l'a révélé la réactivité croisée au niveau de l'anticorps monoclonal). En raison de la difficulté potentielle de susciter une réponse immunitaire contre une protéine "self", le singe macaque étroitement apparenté a été choisi pour éprouver le pouvoir immunogène du vaccin Vp97a-NY. Le vaccin de la vaccine recombinant a été essayé sur des singes et s'est révélé induire une immunité humorale dirigée contre la /i 61 protéine p97. Jusqu'à présent, les singes n'ont manifesté aucun symptôme notable d'effets secondaires défavorables dus à l'exposition au vaccin, après avoir reçu deux inoculations du virus recombinant vivant de ^ la vaccine sur une période de six semaines.

7.1. EXPRESSION DU PLASMIDE.

Le plasmide dont l'expression est contrôlée par sv2, le promoteur précoce de SV-40, a été construit à partir du plasmide de cADN cloné p97a, qui est semblable au plasmide p97b, sauf que la région 3'UT entière est utilisée (Fig. 6). Tous les clones de cADN ont été initialement isolés de banques de lambda-gtlO au moyen d'éléments de liaison synthétiques EcoRI-dG (9-17) comme décrit précédemment. Les segments insérés ont été excisés par EcoRI et sous-clonés dans 0EMBLI8+ en vue de la propagation et de la caractérisation ultérieures. Le clone lOal a été sous-cloné dans - M13mpl8 et une forme réplicative a été mise à digérer avec BamHI et SphI, traitée brièvement avec de l'exonucléase III, rendue non adhésive par la nucléase SI, traitée suivant Klenow et reépissée. Différentes plaques ont été isolées et séquencées, dont l'une avait séparé la queue dG et conservé 33 bp de l'extrémité 5' de la région non traduite de p97 insérée dans le site HindlII de M13mpl8. Une forme réplicative de ce sous-clone (lOala) a été utilisée pour engendrer le cADN de p97 intact; par ailleurs, tous les fragments ont été isolés des sous-clones du plasmide. Le fragment HindlII-PvuII de 550 bp provenant de lOala et le fragment PvuII-SalI de 735 bp provenant de ljl ont été isolés sur gel d'agarose avec LMP et épissés dans PEMBL18+ aux sites Sali et HindlII, engendrant ainsi p5'p97. Le clone génomique E7.7 de pEMBL18+ a été mis à digérer complètement avec EcoRI et digérer partiel-lement avec SstI, et un fragment de 4,5 kb a été séparé 62 par fractionnement dans de l'agarose avec LMP à 0,8%. Ce fragment 3' de 4,5 kb a été épissé avec le fragment * Sstl de 404 bp provenant de 2fl et le fragment BamHI-

Sstl de 535 bp provenant de ljl dans pEMBL13+ aux sites de Sali et EcoRI, engendrant ainsi p3'p97. Le fragment HindlII-SalI de 1285 bp de p5'p97 a été épissé ensuite dans p3'p97, engendrant ainsi pp97a. Le fragment EcoRI-HindlII partiel de ce clone a été inséré dans pSV2neo (Southern et al., 1982, J. Mol. App. Genet. 1 : 327-341) aux sites HindlII et EcoRI, en éliminant la région codant pour la néomycine et les séquences épis-sure/polyA de SV40 tout en conservant le promoteur précoce de SV40 et 1 ' accentuateur de 72 bp, la région 5'UT de p97 de 3 3 bp, toute la région codant pour p97, la région 3'UT et 1 'ADN flanquant 3' sur 1,4 kb. Le plasmide résultant a été appelé pSVp97a.

Le plasmide contrôlé par sv2 a été transfecté " par précipitation avec du phosphate de calcium dans diverses lignées cellulaires eucaryotes et les cellules l'exprimant ont été clonées “et sélectionnées par co-transfection d'un marqueur dominant sélectionnable. A cet effet, on a mis en culture des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) dans du milieu Fl de Hank contenant 15% de sérum foetal de veau (FCS), de la L-glutamine 4 mM, de la proline 1,3 mM et des antibiotiques. Les cellules B16 ont été mises en culture dans du milieu RPMI contenant 0,15% de bicarbonate et des cellules 1735 dans du milieu DMEîSf (Gibco), tous deux additionnés de 15% de FCS et d'antibiotiques. Les cellules ont été transfectées suivant une technique par le phosphate de calcium modifiée (Wigler M. et al., 1978, Cell 14 : 725-731) au moyen de 20 ^uug par plaque de l'ADN de plasmide pSV2p97a et de 0,5 de pSV20HFR ou de pSV2neo, respectivement. Tous les plasmides ont “linéarisés au site EcoRI. Des transfectants stables 63 ont été sélectionnés au moyen d'un milieu exempt d'hypoxanthine (HAT-) pour les cellules CHO ou avec par ml de Généticine (G418, Gibco) pour les cellules B16 et 1735. Les cellules survivantes ont commencé à former des colonies visibles sept jours après la transfection et ont été recouvertes de filtres en polyester stériles immobilisés par des perles de verre. Les filtres sont restés en place pendant cinq jours, ce qui a permis aux cellules de croître dans la matrice du polyester, engendrant ainsi une réplique des colonies sur la plaque. Les filtres ont été recueillis et utilisés pour un essai de fixation sur cellules vivantes avec l'anticorps monoclonal anti-p97 iodé. lO^Lug de l'anticorps monoclonal marqué ont été mis à incuber avec jusqu'à 20 filtres dans 10 ml de FCS à 4°C pendant une heure. Les filtres ont été lavés abondamment dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PBS), séchés et posés pour exposition sur du film XAR-5 jusqu'au lendemain à -70°C. Les filtres ont ensuite été colorés avec -du bleu de méthylène à 7% pour visualiser les colonies cellulaires. Dans toutes les lignées cellulaires utilisées, sauf la lignée de souris B16, les cellules exprimantes contenaient la protéine p97 antigénique à leur surface.

Dans le cas des cellules B16 transfectées, le p97 a été dégagé dans le milieu, ce qui est une observation particulière à ce type de cellule. La sécrétion du p97 a permis de purifier la protéine p97 en longueur complète à partir du milieu des cellules. Le clone B16SVp97a,14 a exprimé environ 4 juug par ml de p97 dans le milieu usé. Le p97 recombinant a été purifié à partir du milieu usé du clone B16SVp97a.14 transfecté qui dégage d'abondantes quantités d'antigène p97 dans „ a -*-e milieu. Les cellules ont été maintenues à peu près à I la confluence (10$ cellules) dans des flacons roulants 64 de 350 cm2 avec un apport ininterrompu de petites quantités de milieu frais. Les cellules ont continué à dégager de l'antigène sans se détacher pendant plusieurs semaines, ce qui a permis une collecte «· ininterrompue et la concentration du milieu usé par congélation. La purification du p97 a été effectuée par chromatographie d'immunoaffinité avec du Sepharose uni à des fragments Fab de l'anticorps monoclonal 96.5. A cet effet, on a fait s'écouler 3 litres de milieu usé sur une série de trois colonnes de 30 ml. La première contenait 15 ml de Sephadex superfin G-25 (Pharmacia), la seconde contenait 20 ml de Sepharose 4b (Pharmacia) et la troisième contenait 8 ml de Sepharose activé au bromure de cyanogène (Sigma) conjugué à des fragments Fab d'anticorps monoclonal 96.5 (10 mg de protéine par ml de Sepharose). Par après, la colonne d'affinité a été lavée abondamment avec du PSB froid et 1 ' antigène ύ en a été élué avec 30 ml de citrate 0,1 M de pH 5 et 30 ml de citrate 0,1 M de pH 4. Ces conditions se sont révélées ne pas altérer 11 imîimnorêactivité de l'antigène tout en assurant une élution complète de l’antigène à partir de l'anticorps monoclonal 96.5. Les deux éluats ont été neutralisés avec 3,0 ml et 4,5 ml, respectivement, de Tris 2 M de pH 8. L'éluat purifié a été concentré dans un appareil Amicon avec un filtre PM10 et lavé avec deux volumes de 10 ml de PBS, conduisant à un rendement final de 4,95 mg dans 4,5 ml, comme déterminé par dosage Bradford (Biorad). On a fait passer 15 yug du produit sur SDS-PAGE (Fig. 7) qu'on a visualisé au bleu Coomassie et aussi par coloration à l'argent. Un immunodosage avec déterminant double (DDIA) (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 : 539) a apporté une confirmation indépendante de la quantité molaire de la protéine purifiée. Des prépa-'tâtions témoins ont été exécutées en parallèle avec du / 65 milieu usé provenant de la liqnée cellulaire B16 parentale et n'ont pas révélé de protéine décelable. Au cours d'une préparation ultérieure, on a isolé 30 mg de protéine p97 d'une pureté de 95% par purification à k. partir de 300 mg de fragments Fab d'anticorps mono clonal 95.5 conjugué à du Sepharose. La protéine p97 purifiée était immunogène et induisait une intense réponse d'anticorps chez les souris immunisées par la protéine, comme décrit dans la section 7.3. ci-après. 7.2. CONSTRUCTION ET EXPRESSION DU VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE POUR p97.

La région codante de p97 a été insérée par coupure de p97a au moyen de HindlII, conversion des extrémités en extrémités non adhésives et épissage dans le vecteur pGS-20 pour insertion dans la vaccine (MacKett et al., 1984, J. Virol. 49 : 857-864) qui avait été ouvert au site Smal. Le vecteur pGS-20 - utilise le promoteur 7.5 K et contient des séquences de flanquement provenant du gène de la thymidine-Kinase (TK) de la vaccine. On a engendré un virus recombinant suivant le procédé de MacKett et al., suora, et on a isolé le Vp97a—NY qui amène les cellules infectées à exprimer la protéine p97 de la dimension et de la glycosylation convenables (Fig. 8). L'expression en surface de p97 a ete confirmée aussi dans des cellules infectées par le virus de p97 recombinant (tableau I) ci-après.

66

TABLEAU I

EXPRESSION DE p97 A LA SURFACE DE CELLULES DE SOURIS TRANSFECTEES ET DE CELLULES INFECTEES PAR * LE VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE-1·.

Type de cellule Virus utilisé Molécules de « pour infecter p97 exprimées les cellules par cellule M2SVp97a.A néant 3.210.000 MEsvp97a.E/F2 néant 434.000 M2 parent néant 2.000 BSC néant 5.590 BSC vaccine Vwt-NY 5.220 BSC vaccine Vp97a-NY 1.140.000 1 Les cellules ont été traitées brièvement par la trypsine, lavées et introduites par aliquotes dans des tubes contenant 10^ jusqu'à 10^ ou i· 105 cellules. Des cellules supplétives non expri mantes ont été introduites dans les tubes contenant les cellules les moins nombreuses, de façon qu'un total de 10$ cellules soit utilisé par tube. On a fait incuber 1 x 106 coups par minute d'anticorps monoclonal 95.5 iodé (123 ng) dans un volume total de 50 jxL avec les cellules pendant 60 minutes sur glace. On a lavé les cellules et on les a centrifugées quatre fois dans du PBS additionné de 10% de sérum foetal de veau, puis on les remises en suspension et comptées dans un compteur gamma Micromedic 4/600plus.

(-) signifie inférieur à.

7.3. LE VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE POUR p97 EST IMMUNOGENE CHEZ LA SOURIS.

L'inoculation de souris au moyen de Vp97a-NY a engendré une puissante réponse d'immunité humorale. Les I 7 souris ont été immunisées une fois, ont reçu un rappel

K

67 à quatre semaines et ont été saignées à cinq semaines. Les titres ont été mesurés par ELISA sur des plaques - recouvertes d'antigène avec la protéine A conjuguée à de la peroxydase raifort comme réactif de détection.

- Les résultats ont été convertis en équivalents d'anticorps monoclonal par comparaison avec une courbe étalon pour ELISA, les liaisons étant établies au moyen de l'anticorps monoclonal 133.2 anti-p97. Les résultats ont révélé une forte induction d'anticorps sérique (Fig, 9). L'immunité cellulaire a été détectée par une épreuve de prolifération in vitro avec la protéine p97 purifiée comme antigène stimulant (Tableau II).

\ 68

TABLEAU II

EPREUVE DE PROLIFERATION DE CELLULES DE LA RATE

- ~~~ DE LA SOURIS1 2 3»

Antigène stimulant Indice de Indice de v prolifération de prolifération cellules de la rate de cellules immunisées par le témoins de recombinant Vp97 la rate

Con A

(10 jig par ml) 71 50

Protéine p97 (3 jjß par ml) 27 2 (10 par ntl) 43 2 (20 jjq par ml) 56 2 ( 50 jiq par ml) 44 3

Virus de la vaccine inactivé par UV

(10? ufp par ml) 91 2

Cellules tumorales syngénériques irradiées transfectées par p97 (104) gg 2

Cellules tumorales parentales irradiées (104 5 6) 3 1

Les cellules de la rate ont été recueillies sur 2 des souris inoculées par scarification à la queue 3 avec 107 ufp de virus recombinant Vp97a-NY, ayant 4 reçu un mois plus tard un rappel avec la même dose 5 et tuées une semaine par après. Des cellules : natives de la rate ont été utilisées comme témoins 6 dans l'expérience. On a mis 10^ cellules en 7 - culture par cupule dans des plaques â 96 cupules à 69 fond rond dans 0,22 ml de milieu RPMI additionné de 0,5% de sérum de souris normale, de pénicil-v line/streptomycine, de glutamine, de bicarbonate et de 2-mercaptoéthanol 2,5 x 10”5 M. Les cultures „ ont été marquées par impulsions pendant six heures au quatrième jour au moyen de 25 y^Ci pat cupule de thymidine tritiée (New England Nuclear), puis ont été récoltées dans un collecteur de cellules PHD et comptées au moyen d’Optifluor dans un compteur Beckman LS 3801. Les indices de prolifération ont été calculés en divisant les nombres moyens de coups par minute de cupules prises par quatre stimulées au moyen de chaque antigène par le nombre moyen de coups par minute du témoin (le milieu).

Les résultats présentés au tableau II montrent que les lymphocytes T sont proliférants en réponse à la " protéine antigénique p97.

Pour évaluer si les cellules coopérantes sont stimulées aussi par le virus recombinant dans les cellules de la rate provenant, de souris immunisées, on a stimulé les cellules in vitro et on a dosé dans les liquides surnageants la production de 11interleukine-2 (IL-2), qui est un facteur de lymphocytes T coopérants. Des cellules de la rate ont été mises en culture après prélèvement sur des souris immunisées deux fois préalablement par le virus Vp97a-NY recombinant ou la vaccine d'origine. On a mis à incuber 10^ cellules pendant 48 heures dans 0,2 ml d'un milieu identique à celui utilisé pour les épreuves de prolifération, dans des plaques à 96 cupules à fond rond, en la présence et en l'absence de l'antigène stimulant. Les liquides surnageants ont été recueillis, rassemblés pour quatre cupules et congelés avant le dosage de l'IL-2. Le dosage de l'IL-2 a utilisé 104 cellules CTLL de la 70 lignée des lymphocytes T de souris privées d'IL-2 incubées dans chaque cupule avec des dilutions diverses * du liquide surnageant à doser avec du milieu de Click, pris en triple. Une courbe d'étalonnage a été établie ** avec l'IL-2 recombinant acquis chez Genentech, CA. Les cellules CTLL ont été marquées par impulsions au moyen de thymidine suivant la technique d'épreuve de prolifération habituelle au cours des six dernières heures d'une incubation de 24 heures, puis ont été récoltées et comptées comme décrit à propos des épreuves de prolifération. Les résultats rassemblés au tableau III montrent que la production d'IL-2 par les cellules de la rate chez les souris immunisées par le virus de la vaccine p97 recombinant est stimulée in vitro par le p97.

TABLEAU III

STIMULATION DE LA PRODUCTION D'IL-2 PAR LES CELLULES DE LA RATE p97-IMMUNISEES.

Immunogène pour Stimulus Unités d'IL-2 la vaccination in vitro produites

Vp97a-NY Protéine p97 (20 ytAjg par ml) 4,4

Vp97a-NY Milieu 0,25

Vwt-NU Protéine p97 (20 jiß par ml) 0,25

Vwt-NY Milieu 0,25

De plus, on a mesuré une réponse d'hypersensibilité de type différé par épreuve de gonflement du coussinet plantaire chez des souris inoculées par ; Vp97a-NY. On a inoculé à cinq souris (souche C3H/Hen) par groupe, par scarification à la queue, du virus de la vaccine de souche d’origine ou recombinant. Six 71 jours plus tard, on a agressé la patte arrière de chaque souris par inoculation de 20 jfX de PBS ou de # 20 pX de cellules dans du PBS (5 x 10^ cellules par souris). On a mesuré le coussinet plantaire 24 heures plus tard, en opérant au double insu et en utilisant un micromètre de Fowler. On a soustrait l'épaisseur du coussinet plantaire ayant reçu l'injection de PBS de l'épaisseur mesurée à la patte d'épreuve de chaque souris et on a calculé les moyennes et les écarts-types pour l'augmentation de gonflement du coussinet plantaire. Les résultats rassemblés au tableau XV montrent l'induction d'une réponse d'hypersensibilité de type différé spécifique de p97 chez les souris immunisées par le virus recombinant de la vaccine p97.

TABLEAU IV

GONFLEMENT DU COUSSINET PLANTAIRE SPECIFIQUE DE L'ANTIGENE CHEZ LES SOURIS P97-IMMUNISEES.

y ———— — ............ — " ' - -

Immunogène pour Antigène agressant Gonflement du la vaccination „ coussinet _____(mm x 10"~2 )

Vp97a-NY Cellules tumorales 40,3 (+ 6,3) syngénériques ~ transfectées par p97

Vp97a-NY Cellules tumorales 3,0 (+ 2,8) syngénériques ~ parentales

Vwt-NY Cellules tumorales 1,5 (+ 2,3) syngénériques ~ ' * transfectées par p97

Vwt-NY Cellules tumorales 5,5 (+ 5,0) syngénériques — ' parentérales 72 7.4. PROTECTION BT THERAPIE AU MOYEN DE VIRUS DE LA VACCINE p97 DANS UN MODELE SUR TUMEUR DE SOURIS.

Afin d'évaluer l'efficacité de la vaccination, on a vacciné des souris suivant différents protocoles , en utilisant le virus de la vaccine recombinant p97 conforme à l'invention et on les a aqressées ensuite au moyen de cellules tumorales syngénériques transfectées par p97 (M2SVp97a. 2E). A cet effet, on a immunisé les souris avec du virus de la vaccine vivant recombinant Vp97a-NY ou avec la souche parentale d'origine (Vwt-NY) par scarification à la queue, ou bien avec 100 ^ de protéine p97 purifiée ou 5 x 1θ6 cellules tumorales M2-K1735 irradiées, par voie intrapéritonéale, dans de l'adjuvant de Freund complet. On a effectué une agression au moyen de cellules tumorales par voie intra-1 veineuse deux semaines après la dernière vaccination en injectant M2SVp97a.2E, qui est un clone de cellules y tumorales métastatiques préparé à partir de M2-K1735 (mélanome de souris modèle) par transfection avec la séquence codant pour le p97- humain contenue dans un plasmide d'expression sous contrôle du promoteur précoce de SV40. On a sélectionné une variété de clones qui expriment et celui utilisé pour l'agression tumorale, le clone M2SVp97a.2E, exprime un niveau moyen de p97, environ 400.000 molécules par cellule ou l'équivalent de la densité de l'antigène p97 du mélanome humain. On a utilisé deux doses d'agression tumorale par voie intraveineuse, 5 x 105 ou 1 x 10^ cellules, qu'on a injectées dans la veine de la queue de souris C3H/Hen syngénériques. On a sacrifié les souris 16 jours après l'agression tumorale et on a prélevé les poumons. Une souris a été comptée comme positive s'il y ÿ avait des tumeurs visibles à l'oeil nu dans les poumons colorés à l'encre de Chine. Les résultats sont rassem-'^ blés au tableau V.

73

TABLEAU V

* AGRESSION ÜE SOURIS VACCINEES AU MOYEN DE CELLULES

~ DE MELANOME SYNGENERIQUES TRANSFECTEES PAR p97.

Vaccin Nombre Dose de Nombre de souris d'immuni- cellules avec métastase sations d’agression pulmonaire __ évidente

Vp97a-NY 2 5 x 105 1/5

Vp97a-NY 1 5 x 1θ5 2/4

Cellules de mélanome syngénériques irradiées 2 5 x lflS 0/4

Vwt-NY 2 5 X 105 9/10 - Protéine p97 2 5 x 105 3/3

Vp97a-NY 2 1 x 105 0/1 v

Vp97a-NY 1 1 x 105 0/4 Néant 0 l‘X 105 5/5

Les résultats présentés au tableau V démontrent qu'il y a eu un effet protecteur considérable avec deux immunisations par Vp97a.NY, bien qu'aucun effet protecteur n'ait été observé avec le vaccin de protéine p97 purifiée (malgré les titres en anticorps extrêmement élevés atteints). L'aptitude du virus recombinant à provoquer l'immunité cellulaire peut être responsable de l'immunité protectrice contre la tumeur.

Au cours d'une thérapeutique expérimentale, on a inoculé à des souris une faible dose de cellules tumorales exprimant p97 et deux jours plus tard, on leur a inoculé le vaccin de la vaccine recombinant. On a agresse les souris avec 10^ ou 104 cellules tumorales exprimant p97 (M2SVp97a.E) par voie intraveineuse. Deux 74 jours plus tard, on a inoculé aux souris par scarification à la queue soit Vp97a-NY, soit Vwt-NY. On a ï répété les inoculations hebdomadaires par scarification à la queue et on a noté la survie des souris. Les résultats rassemblés à la Fig. 10 indiquent l'effet thérapeutique de la vaccination par le virus de la vaccine p97 recombinant chez des souris porteuses de métastases pulmonaires.

7.5. VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANT p97 COMME IMMUNOGENE CHEZ LE MACAQUE.

On a scarifié deux singes Macaca fasicularis (macaque) au moyen soit de 2 x 103 unités formant plage de lyse (ufp) de vaccine recombinante Vp97a-NY, soit de la même dose de vaccine de la souche d'origine. Deux semaines plus tard, on a dosé les sérums par ELISA pour - établir le titre en vaccine et p97. Les résultats rassemblés au tableau VI démontrent que des anticorps v tumoraux contre p97 ont été décelables deux semaines après l'inoculation unique par Vp97a-NY.

TABLEAU,VI

TITRE EN ANTICORPS DU SERUM CHEZ DES SINGES INOCULES PAR LA VACCINE.

Immunogène/semaines Titre contre la Anti-p97 vaccine (dilution (ug par ml du sérum avec d'équivalents deux fois le fond d'anticorps continu) monoclonal)

Vp97a-NY/semaine 0 1/20 0,54

Vp97a-NY/semaine 2 1/2000 6,54

Vwt-NY/semaine 0 1/20 0,50

Vwt-NY/semaine 2 1/2000 0,34 8. DEPOT DES MICRO-ORGANISMES.

^ souc^e d'E. coli ci-après portant le 75 plasmide indiqué a été déposée à l'ATCC, RocJcville, MD, et a reçu le numéro d'accès suivant :

Souche d'B. coli Plasmide Numéro d'accès E. coli HB101 p97b 53.403

Le virus de la vaccine recombinant ci-après a été déposé à l'ATCC, RocJcville, MD, et a reçu le numéro d'accès suivant :

Virus Numéro d'accès

Vp97a-NY VR 2159

Les lignées cellulaires ci-après portant les plasmides indiqués ont été déposées à l'ATCC, _ RocJcville, MD, et ont reçu les numéros d'accès suivants :

Lignée cellulaire Plasmide Numéro d'accès TKMp97-12 pMTp97b CRL 8985 (Cellule de souris) B16SVp97a.14 pSVp97a CRL 9304 (Cellule de mélanome de souris)

Le cadre de la présente invention n'est pas à limiter aux micro-organismes et cellules déposés du fait que la forme de réalisation déposée est conçue comme illustration unique d'un aspect de l'invention et que des micro-organismes ou cellules qui sont fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de l'invention. En effet, différentes modifications à l'invention, en plus de celles illustrées et décrites ici, sont évidentes pour le spécialiste d'après la description ci-dessus et les dessins annexés. Ces 76 modifications sont conçues comme tombant dans le cadre des revendications ci-après.

^ Il convient d'observer aussi que toutes les dimensions en paires de bases indiquées pour les - nucléotides sont approximatives et sont citées pour les besoins de la description.

t\

Claims

77
1. Peptide ou protéine antigénique sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il est apparenté à l'antigène p97 associé au mélanome.
2. Peptide ou protéine suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a une séquence d'amino-acides comprenant la séquence d'aminoacides en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3, ou une partie antigénique quelconque de celle-ci.
3. Peptide ou protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le peptide ou protéine a été purifié à partir d ' une cellule cultivée contenant une séquence de nucléotides qui code pour le peptide ou protéine et qui est sous le _ contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui régule l'expression du gène de façon que le peptide ou v protéine soit exprimé par la cellule cultivée.
4. Peptide ou protéine suivant la revendication 3, caractérisé en ce "que la cellule cultivée comprend un micro-organisme.
5. Peptide ou protéine suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme comprend une bactérie.
6. Peptide ou protéine suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme comprend une levure.
7. Peptide ou protéine suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule cultivée comprend une lignée cellulaire d'animal.
3.- Peptide ou protéine suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule cultivée comprend une lignée cellulaire d'insecte.
9.- Peptide ou protéine suivant l'une quel-~ conque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que 78 le peptide ou protéine a été synthétisé chimiquement.
10. Virus recombinant, caractérisé en ce que son génome comprend une séquence de nucléotides codant j pour un peptide ou protéine antigénique apparenté à : l'antigène p97 associé au mélanome, ou une partie antigénique de celui-ci, qui est sous le contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui régule l'expression du gène de façon qu'un peptide ou protéine apparenté à l'antigène p97 associé au mélanome soit exprimé dans une cellule infectée par le virus.
11. Virus suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides codant pour un peptide ou protéine antigénique apparenté à l'antigène p97 associé au mélanome comprend la séquence de nucléotides en substance telle qu'illustrée à la » Pig. 3, ou une partie quelconque de celle-ci codant pour un peptide ou une protéine antigénique.
12. Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un virus à enveloppeI
13. Virus suivant, la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend un virus de la vaccine.
14. Virus suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend le virus Vp97a-NY tel que déposé avec le numéro ATCC et d'accès VR 2139, ou bien un mutant, recombinant ou dérivé de ce virus par génie génétique.
15. Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un virus nu.
16. Virus suivant la revendication 15, *- caractérisé en ce qu'il comprend un adénovirus.
17. Virus suivant l'une quelconque des /revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il 79 comprend un virus de la polyhédrose nucléaire.
18. Virus suivant la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend un toaculovirus.
19. Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un bactériophage.
20. Virus suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend un phage lambda.
21. Composition de vaccin sous-unitaire, caractérisée en ce que son immunogène comprend une dose efficace du peptide ou protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9 en mélange avec un excipient pharmaceutique.
22. Composition de vaccin de virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend le virus recom- » binant suivant l'une quelconque des revendications 10 à 20 dont le virus est infectieux sans provoquer de ,- Λ. maladie chez un hôte à vacciner.
23. Composition de vaccin de virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant suivant l'une quelconque des revendications 10 à 20 dans un état non infectieux en mélange avec un excipient pharmaceutique.
24. ADN recombinant vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend p97b.
25. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il contient l'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 24.
26. Bactérie, caractérisée en ce qu'elle contient l'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 24. 2^.- Bactérie suivant la revendication 26, v caractérisée en ce qu'elle comprend Escherichia coli tel que déposé avec le numéro ATCC et d'accès attribué ^ 53403, ou bien un mutant, recombinant ou 30 dérivé de cette bactérie par génie génétique.
28. ADN recombinant vecteur, caractérisé en ^ ce qu'il comprend pMTp97b.
29. Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu'elle contient 1'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 28.
30. Lignée cellulaire suivant la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle comprend TKMp97-12 telle que déposée avec le numéro ATCC et d'accès attribué CRL 8985, ou bien un mutant, recombinant ou dérivé de cette lignée par génie génétique.
31. ADN recombinant vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend pSVp97a.
32. Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu'elle contient l'ADN recombinant vecteur suivant la - revendication 30.
33. Lignée cellulaire suivant la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle comprend B16SVp97a.l4 telle que déposée avec le numéro ATCC et d'accès attribué CRL 9304, ou bien un mutant, recombinant ou dérivé de cette lignée par génie génétique. 7 "/jlLtUiu \ \ 's.