BE1000175A3 - Vaccins contre le melanome. - Google Patents

Abstract

Des peptides ou protéines apparentés à un antigène associé au mélanome sont produits en quantités importantes suivant les techniques de l'ADN recombinant et/ou par synthèse chimique. Ces peptides ou protéines peuvent etre utilisés comme immunogènes dans des vaccins propres à induire une réponse immunitaire qui détruit sélectivement les cellules du mélanome chez l'individu vacciné. Si les peptides ou protéines sont exprimés par un virus recombinant, un vaccin de virus inactivé ou vivant peut etre préparé.

Description

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  Vaccins contre le mélanome. 



  1. DOMAINE DE L'INVENTION. 



   La présente invention concerne des compositions de vaccin qui peuvent induire une réponse immunitaire qui détruit sélectivement les cellules du mélanome chez. un individu vaccine. Par consequent, un peptide ou   protéine apparenté S   un antigène associe au mélanome est produit en grandes quantités suivant les techniques de l'ADN recombinant et/ou par des procédés de synthèse chimiques. Le peptide ou protéine de la présente invention peut être utilisé comme immunogène dans une composition de vaccin. Dans certaines formes de réalisation où Le peptide ou protéine apparenté   ä   un antigène associé au mélanome est exprime par un virus recombinant, le virus recombinant lui-même peut être utilisé comme immunogène dans une composition de vaccin.

   L'invention a aussi pour objet des procédés qui comprennent l'utilisation de techniques de l'ADN recombinant ainsi que de moyens de synthèse chimiques permettant de produire en grandes quantités les peptides ou protéines apparentés à   l'antigene associe   au mélanome. 



   L'invention est illustrée à titre d'exemple en prenant comme immunogènes les peptides apparentés au p97, qui est une   sialoglycoproteine   monomere de la surface cellulaire d'un poids moléculaire apparent un 

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 peu inférieur à 97. 000 daltons qui est un composant de la surface des cellules du mélanome. 
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  2. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION. 



    2.   1.   ANTIGENES ASSOCIES   A UNE TUMEUR. 



   Les travaux sur les animaux d'experience, en particulier les rongeurs, ont montré que la plupart des tumeurs induites par les virus oncogènes expriment des antigènes codés par le génome viral et que l'immunisation par ces antigènes peut conduire au rejet d'une agression ultérieure par des cellules tumorales que le même virus induit. Bien qu'une partie importante de ces travaux ait été effectuée avec des souches de virus de laboratoire, conne le SV40, le virus du polynome et les virus de La leucémie de la souris de Friend,   Moloney   ou Rauscher, la transmission horizontale et verticale des virus oncogènes dans la nature a   été   démontrée et en fait un vaccin contre la leucémie et le sarcome du chat induits par virus est actuellement disponible sur le marche. 



   Au contraire,   une'etiologie   virale de la plupart des cancers de   l'être   humain n'a pas encore été démontre. Des exceptions notables sont le virus de 
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 l'hépatite (hépatome), le virus de l'herpès simplex (carcinome du col de l'utérus) et le virus d'EpsteinBarr   (carcinone   du nasopharynx).

   Toutefois, au cours des deux dernières décennies, il a   été   établi que certaines cellules tumorales humaines expriment des antigènes tumoraux,   c'est-a-dire   des antigènes qui distinguent les cellules tumorales des cellules normales correspondantes ; certains patients manifestent des réponses d'immunité humorale ou à médiation cellulaire contre ces antigènes (Hellstrom et al. 1968, Nature,   220 : 1352 ;   Morton et   al.,   1968, Science 162 : 1279-1281; Shiku et al., 1976, J. Exp. Med.   144 :     873-881).   Certaines des cibles de ces réponses immuni- 

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 taires sont des antigens oncofoetaux ou de   differen-   ciation codés par le génome humain (Hellstrom et al.,
1970, Int. J.

   Cancer   6   : 346-351). 



   Jusqu'à récemment, la nature moléculaire des antigènes tumoraux   n'étai t pas   connue et le degré de spécificité tumorale des réactions immunologiques n'était pas élucidé. Les tentatives d'utiliser ces informations pour mettre au point des épreuves   diagno-   stiques du cancer ou des   traitements   du cancer sont restées largement sans succès. Du fait que les   regres-   sions spontanées des tumeurs sont extrêmement rares, on peut en conclure aussi que les réponses immunitaires manifestées in vitro sont inopérantes in vivo; par exemple alors que les anticorps et les lymphocytes collectés chez un patient cancéreux peuvent être efficaces pour tuer les cellules tumorales in vitro, la réponse immunitaire du même patient cancéreux est sans effets in vivo. 



   L'introduction par Kohler et Milstein de la technique des anticorps monoclonaux   (1975, Nature   256 : 495-497) a conduit à des recherches intensifiées sur les antigènes tumoraux humains parce que cette technique apporte   l moyen de définir   ces antigènes tant au niveau moléculaire que pour ce qui est de la spécificité (Hellstrom et Brown, 1979, dans "The Antigens", M. Sela, ed., Academic Press., Vol. V : 1- 66). Au cours des quelques dernières années, un grand nombre d'antigènes associés à des tumeurs ont été décrits, dont la plupart ont été définis par les anticorps monoclonaux de souris (Reisfeld and Sell, eds., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York,   1985,   pp. 1-609). 



  Bien que virtuellement tous les antigènes qui ont été bien caractérisés se soient révélés être des antigènes 

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 oncofoetaux ou de différenciation, et que leur spéci- 
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 ficitd à l'égard des tumeurs soit apparue quantitative   platzt   que qualitative, différents antigènes sont suffisamment spécifiques des cellules néoplasiques plutôt que des cellules normales (en général avec un facteur de 10 à 1. 000 fois) pour atre utilises comme cibles potentielles en vue d'identifier des cellules tumorales et en vue du traitement. Des anticorps monoclonaux humains contre des antigènes tumoraux ont été obtenus aussi (Cote et   al.,   1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 30 : 2026-2030).

   Ceci confirme l'evidence indiquée précédemment que certains patients cancéreux exercent une réaction immunitaire contre leurs tumeurs. 
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  Plus de la moitié des antigènes de la surface cellulaire associes ä des tumeurs identifiés jusqu'ici sont des protéines ou   glycoproteines   codées par le génome humain (plutôt que par des virus endogènes ou exogènes), Les autres étant de   glLycolipides résultant   d'une expression ou regulation anormale des glycolsyltransférases. 



    2. 2. L'ANTIGENE p97   ASSOCIE AU MELANOME. 



   L'antigène p97 est un antigène associé   A   une 
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 tumeur qui a été identifié pour la première fois dans le mélanome humain à l'aide d'anticorps monoclonaux (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 : 4980-4983 ; Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 :   6114-G118     ; Woodbury   et al., 1980, Proc. Natl. 



  Acad. Sci. USA 77 : 2183-2187). L'antigène p97 a été étudié en detail pour ce qui est de son expression dans les tissus normaux et néoplasiques et est présent dans la plupart des mélanomes humains, ainsi que dans certains tissus foetaux, mais n'est retrouvé qu'en traces dans les tissus de l'adulte normal (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127 : 539-546 ; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 : 539-543 ; 

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 Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29 : 511-515). Le p97 a té utilisé comme cible pour l'imagerie diagnostique de mélanomes dans des essais cliniques chez l'être humain (Larson et al., 1983, J. Clin. 



  Invest. 72 : 2101-2114). 



   Le p97 est une   sialog1ycoprotéine   monomère de la surface cellulaire ayant un poids moléculaire apparent (PM) tel que mesuré par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium (SDSPAGE) un peu inférieur   a   97. 000 daltons. Les anticorps monocionaux ont défini trois sites antigéniques majeurs qui sont presents sur un   fragment tryptique stable   de   40.     daltons   (Brown et al., 1981, J. Immunol. 



  127 : 538-546), mais la sequence complete de p97   n'a   pas   été     decrite. Au moins deux   autres   anticjenes asso-     cies   au mélanome humain et caractérisés indépendamment, à savoir gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. 
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 Sei. USA 77 : 6114-6118) et gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer   35 : 73-80)   apparaissent identiques A p97 suivant l'analyse par immunoprécipitation sequence. 



   La séquence des aminoacides N-terminaux du p97 est homologue à la transferrine et, comme la transferrine, p97 fixe le fer (Brown et al., 1982, Nature, London,   296 :   171-173). L'analyse des hybrides cellulaires somatiques et l'hybridation in situ ont montré que le gène du p97, comme les gènes pour la transferrine et le récepteur de la transferrine, est situé sur la région chromosomiale 3q21-3q29 (Plowman et al., 1983, Nature London, 303 : 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756). Ces observations suggèrent que le p97 joue un rôle dans le métabolisme du fer. 

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   2.3. VACCINS CONTRE LE CANCER. 



   Les études chez les animaux d'experience, habituellement la souris, ont montré que l'immunisation au moyen de cellules cancéreuses vivantes ou   tu6es   peut conduire au rejet d'une agression ultérieure de cellules cancéreuses viables. Les tentatives d'immunisation au moyen d'un matériel exempt de cellules ont eu, en   general,   moins de succès, mais quelques succès ont été notes. (Pour un article de revue, voir Hellstrom et Brown, 1979, dans The Antigens, M. Sela ed. Academic Press, Vol. V : 1-66). Dans de nombreux cas, les antigenes cibles responsables des effets protecteurs ont été codes par un virus mais, dans de nombreux cas, la nature de l'antigene qui déclenche une réponse immunitaire protectrice est inconnue. 



   Les études chez l'etre humain sont beaucoup plus difficiles et l'efficacité des vaccins contre le cancer discutée, malgré l'acquisition de certains   succes.   Dans de nombreux cas, les preparations de vaccin ont consisté en cellules tumorales irradiées ou en cellules tumorales tuées par exposition à certains agents chimiques. Du fait que des antigènes associés à une tumeur humaine n'ont pas été disponibles   a   l'état de pureté, il n'existe pas de description de leur utilisation dans des vaccins. 



   Une objection théorique majeure contre l'utilisation proposée des vaccins contre le cancer chez l'être humain est que ce dernier, lorsqu'il est   "vacciné",   par exemple, au moyen de cellules canc6reuses tuées ou de préparations exemptes de cellules, sera exempt de   response   immunitaire, parce que les antigènes tumoraux qui peuvent etre les cibles de la réponse immunitaire sont présents, bien qu'en traces seulement, dans certaines cellules normales et seront donc perçus comme "self" par le système immunitaire.

   La 

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 plupart sinon l'ensemble des antigènes associés   ä   des tumeurs   détectés   dans les tumeurs humaines par les anticorps monoclonaux sont aussi presents dans certains tissus normaux et il n'est guère d'indication que des patients cancéreux leur fassent in vivo une réponse efficace. 11 existe des indices que les cellules suppressives jouent un rôle majeur en régulant à la baisse la réponse immunitaire A l'égard des antigènes tumoraux (Nepom et al., 1983, Experentia, 39 : 235- 242).

   De plus, une réponse de cellule suppressive induite par une série d'antigènes tumoraux peut empecher l'induction d'une réponse efficace de destruction de la tumeur ä   l'egard   d'une autre série d'antigènes tumoraux qui, par eux-mêmes, n'induiraient pas de suppression (Hellstrom et   al.,   1983, dans Biomembranes, A. Nowotny ed., Plenum Press, pp.   365-388).   



  2.4. TECHNIQUES DE L'AND RECOMBINANT ET VIRUS DE LA
VACCINE. 



   L'application des techniques de l'ADN recombinant pour la production de vaccins sous-unitaires afin de proteger contre les infections implique le clonage   moleculaire   et l'expression, dans un vecteur approprié, de l'information génétique codant pour des protéines qui peuvent induire une réponse immunitaire contre la protéine chez   l'animal hole. Recemment   une nouvelle approche qui est potentiellement utile pour la production de vaccins sous-unitaires a été décrite (MacKett et   al.,     1982,   Proc. Natl. Acad. Sei. 



  79 :   7415-7419 : MacKett   et   al.,     1984,   J. Virol. 



  49   : 857-864 ;   Panicali, D. et   Paoletti,   E., 1982, Proc. 
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 sci. Cette Natl. Acad. Sei. 79 : 4927-493t). Cette approche implique d'utiliser le virus de la vaccine comme vecteur pour exprimer des genes étrangers   insérés   dans son génome. Lors de l'introduction dans les animaux hôtes, le virus de la vaccine recombinant exprime le 

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 gène étranger inséré et induit ainsi une réponse 
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 immunitaire de l'hole à ces produits du gene. Comme le virus de la vaccine recombinant vivant peut etre utilise comme vaccin, cette approche combine les avantages des vaccins tant sous-unitaires que vivants. 



   Le virus de la vaccine contient un génome   d'ADN   en double brin linéaire d'environ 187 paires de Kilobases et se réplique dans le cytoplasme des celLules infectées. Ces virus contiennent dans le noyau viral un   Systeme   complet d'enzymes de transcription (comprenant les enzymes de terminaison, de méthylation et de   polyadnylation)   qui sont nécessaires pour   l'infectivite   du virus. Les sequences régulatrices de la transcription du virus de la vaccine (les promoteurs) permettent d'amorcer la transcription par   l'ARN   
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 polymerase de la vaccine, mais non par l'ARN polymerase de la celiule h6te. 



  L'expression de l'ADN étranger dans les virus de la vaccine recombinants nécessite d'épisser les promoteurs de la vaccine à des séquences d'ADN codant pour une protéine du gène étranger. Des plasmides vecteurs, appelés aussi vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes   chimeraux   dans le virus de la vaccine.

   Un type de vecteur d'insertion est composé de : (a) un promoteur du virus de la vaccine comprenant le site d'amorçage de la transcription ? (b) plusieurs sites de clonage par endonucléase de restriction unique se trouvant à l'aval du site d'amorcage de la transcription pour 1'insertion des fragments d'ADN étranger; (c) de l'ADN de virus de la vaccine non essentiel (comme le gène TK) flanquant le promoteur et les sites de clonage qui dirigent l'insertion du   oane   chiméral dans la région non essentielle homologue du génome du virus, et (d) une origine bactérienne de réplication et un marqueur de resistance aux antibio- 

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 tiques pour la réplication et   1a   selection dans   E.   coli. Des exemples de ces vecteurs sont décrits par 
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 MacKett (MacKett et al., 1984, J.

   Virol. 49 : 857-864). 



   Les virus de la vaccine recombinants sont produits par transfection de plasmides d'insertion bactériens recombinants contenant le gène étranger dans des cellules   pralablement   infectées par le virus de ia vaccine. La recombinaison homologue a lieu dans les cellules infectées et conduit a L'insertion du gene étranger dans le génome viral. Les cellules infectées peuvent être triées suivant les techniques immunologiques, l'hybridation sur plaque d'ADN ou par selection génétique des virus recombinants qui peuvent être isoles ultérieurement. Ces recombinants de la vaccine conservent leurs fonctions et leur   infectivite   essentielles et peuvent être construits de   acon   à contenir   et   peu prèa 35 kilobases d'ADN étranger. 



   L'expression du gène étranger peut être détectée par des épreuves enzymatiques ou immunologiques (par exemple immunoprécipitation, radioimmunoessai ou empreinte). Les   glycoprotéines   naturelles de la membrane que produisent les cellules infectées par la vaccine recombinante sont glycosylées et peuvent etre transportées jusqu'à la surface da la cellule. Des niveaux élevés d'expression peuvent être obtenus en utilisant des promoteurs puissants ou en clonant des copies multiples d'un gene unique. 



  3. APERCU DE L'INVENTION. 



   Des compositions de vaccin qui peuvent être utilisées pour induire une réponse immunitaire qui détruit sélectivement les cellules du mélanome chez les individus vaccinés sont décrites. Plus spécifiquement, les compositions de   vaccin'de 1a Drésente   invention comprennent un immunogène qui induit une réponse immunitaire dirigée contre un antigene associé au 

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 mélanome tel que l'antigene p97 associe au mélanome. Conformément à l'invention, un certain nombre de compositions de vaccin sont possibles. Par exemple, l'immunogène d'un "vaccin sous-unitaire" de la présente invention comprend un peptide ou portéine apparenté au p97 qui peut être mis en composition avec un adjuvant approprié.

   Ces peptides ou protéines comprennent des séquences d'aminoacides dérivant de tout ou partie de la séquence d'aminoacides de p97 en substance telle qu'illustrée ä la Fig. 3, en ce compris, mais non limitativement, des sequences d'aminoacides altérées dans lesquelles des résidus d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplaçant des résidus dans la séquence mènent   ci   un changement silencieux et/ou des séquences d'aminoacides modifiées ou traitées, par exemple des sequences d'aminoacides glycosylées, des séquences d'aminoacides phosphoryles, etc. ou des sequences d'aminoacides modifiées chimiquement.

   Ci-   antres,   les peptides ou protéines de la présente invention qui sont apparentes à l'antigène p97 associé au mélanome, qu'ils soient   alternes,   non   altérés,   modifiés ou non modifiés, sont appelés "peptides apparentés au p97". Lorsque le peptide apparenté au p97 est un haptène (c'est-à-dire   antigenique   mais non immunogénique), l'haptène peut etre conjugué avec une molecule vecteur qui confère le caractère immunogène. 



   Les peptides apparentes au p97 de l'invention peuvent etre produits suivant les techniques de   1'ADN   recombinant et/ou des   procédées   de synthèse chimiques. 



  Lorsque les peptides apparentés au p97 sont   synthétisés   chimiquement, ces peptides synthétiques apparentés au p97 peuvent comprendre les séquences d'aminoacides dérivant des regions du p97 dont il est prévu qu'elles sont   antigeniques   (Hopp et Woods, 1981, Proc. Natl. 



  Acad. Sei. USA, 78 : 3824-3828). Lorsque les peptides 

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 apparentés au p97 de la présente invention sont produits suivant les techniques de l'ADN recombinant, une sequence de nucléotides qui code pour tout ou partie du p97 est insérée dans un vecteur d'expression recombinant, tel qu'un virus ou un plasmide qui, dans un höte approprié, peut diriger l'expression d'un peptide apparenté au p97 qui peut être purifié à partir du milieu de culture.

   La séquence de nucléotides insérée est dérivée de tout ou partie de la sequence du p97 en substance teile   qu'illustrée à 1a   Fig. 3, en ce compris, mais non limitativement, les séquences de nucléotides dans lesquelles des codons de nucleotides fonctionnellement équivalents remplaçant des codons dans la séquence mènent   A   un changement silencieux ; en d'autres termes, des codons différents qui codent pour 
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 le meme aminoacide ou son équivalent fonctionnel peuvent être substitués dans la sequence illustrée & la Fig. 3. Lorsqu'un plasmide est utilisme comme vecteur d'expression, la préférence va ä un plasmide qui se prête ä l'expression dans des. cellules eucaryotes, mais un vecteur d'expression procaryote peut être utilisé aussi. 



   Dans une autre forme de réalisation de l'invention ou le vecteur d'expression est un virus recombinant, un vaccin peut être présenté sous la forme d'un vaccin viral, auquel cas   l'immunogène   comprend le virus recombinant qui exprime un peptide apparente au p97. Suivant la nature du virus recombinant utilise comme   ifnmunogène,   un vaccin de virus inactive ou bien un vaccin de virus vivant peut être préparé. L'immunisation appropriée ä l'aide des compositions de vaccin de l'invention peut aboutir ä l'induction d'une réponse immunitaire conduisant   ä   la destruction des cellules du mélanome chez le sujet immunisé. 



   L'invention décrit aussi un   Systeme   dans 

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 lequel une composition de vaccin peut être soumise ä l'épreuve et précise comment l'épreuve devrait etre   effectuée,   Par exemple, les compositions de vaccin peuvent être évaluées pour ce qui est de l'efficacité dans des modèles sur animal, initialement des rongeurs, puis des primates non humains, et finalement chez l'etre humain, de   preference   chez des patients qui sont 
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 en rémission, mais ont une haute probabilité de recurrence due à des micrométastases. 



  4. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES. 



   La Fig.   1   représente une autoradiographie des produits de traduction exempts de cellules du mARN de p97 résolus par SDS-PAGE. A la Fig.   lA,   la piste 1 représente les produits de traduction du mARN enrichi de p97, tandis que   1a piste   2 représente les produits de traduction du mARN non enrichi, les uns et les 
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 autres provenant de 0. 5 UJL de produits de traduction totale de 5ng de mARN. A la Fig. 18, la piste 1 représente les produits de tra (l11ction du mARN enrichi de p97, tandis que la piste 2 représente les produits de traduction du mARN non enrichi, les uns et Les autres provenant de 5   ul   de produits de traduction de 5ng de mARN   immunoprecipites   par du sérum anti-p97. 



   La Fig. 2 est une représentation schématique de la structllre du mARN de p97. L'agencement de la région codante   (à   partir de la séquence de signal jusqu'à la séquence d'ancrage) et la région non codante (3'UT), de même que la structure du domaine duplique du précurseur de p97 (trait vide) sont indiqués. L'emplacement des   differente   sequences de reconnaissance des enzymes de restriction est indiqué au-dessus du mARN. 



  Les positions relatives de quatre clones de cADN sont indiquées au-dessous de la structure de mARN. Le clone de cADN p97-3a2f1 (3a2fl) a été isolé d'une banque de cADN dans laquelle les cADN ont été transcrits sur des 

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 mARN enrichis en p97   oligo (T)-amorces   et ont été clones dans pBR322, tandis que les clones de cADN p97- 2fl (2fl),   p97-ljl     (Ijl)   et p97-10al (10a1) ont   été   isolés par amorgage de la synthèse du cADN au moyen   d'oligonu-   cléotides qui codent pour des s4quences   d'exon de   p97 et par clonage des fragments de cADN résultants dans lambda-gt10.

   La Fig. 2A est une représentation schématique des clones génomiques B15, H17, B6.6 et E7.7 qui ont   eie   clones dans lambda L47.1. 



   La Fig. 3 représente la séquence de nucléotides du cADN précurseur de p97 humain et sa sequence des aminoacides qui en est déduite. Les résidus d'aminoacides N-terminaux déterminés préalablement par séquençage de la protéine étaient identiques à ceux prévus d'après la séquence de nucléotides (résidus d'aminoacides n  21-30). Les sites de glycosylation potentiels aux résidus d'aminoacides 38, 135 et 515 (trait vide) et la région d'ancrage à la membrane a   l'extremiste   C-terminale (trait plein) sont indiques. Un signal de polyadénylation (AATAAA indiqué dans un encadré) a été   détecté   à la position 3847, laquelle se trouve à 50 paires de   bases ä l'amont d'un   tractus 
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 polyadenyle. 



   La Fig. 4 représente une comparaison entre les séquences d'aminoacides prévues du précurseur de p97 et celle de la sérotransferrine humaine (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756 ; Davis et al., 1983, J. Mol. Biol. 181 : 111-121). Les résidus conservés sont encadrés. Les résidus de tyrosine,   d'histj. dine et d'arginine impliques   dans la fixation du fer par la transferrine (Mertz-Boutigue et al., 1984,   Eur. J. Biochem.   145 :   659-676) Bont indiqués   par des astérisques   (*).   



   La Fig. 5 est une représentation schématique d'un modèle bidimensionnel de la structure du p97 base 

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 sur la présence des résidus de cystéine conservés entre les membres de la   superfami11e   de La transferrine. Les trois sites de glycosylation potentiels sont indiques par des astérisques   (*). Le   domaine hydrophobe d'ancrage à la membrane est apparent à   l'extrémité C-   terminale de p97   (COOH).   



   La Fig. 6 est une représentation schématique de la structure   génétique   des clones du cADN de p97 et du fragment de clone génomique lambda E7.7 utilisés pour la construction du vecteur d'expression de p97, outre du vecteur d'expression pSV2p97a. Les abréviations suivantes sont utilisées : E, EcoRI ; P, PvuII; Sal, SalI,   SstI ; ss, BamHi.   



   La Fig. 7 montre les résultats de   l'électro-   phorèse sur gel lors de la caractérisation et de   i'immunopurification   de la protéine p97 recombinante. 



  Un clone CHO transfecté (CH03+) et des cellules de mélanome humain   SK-MEL   28 ont   eie   marqués à la 35S- 
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 cystéine en presence (+TM) ou en l'absence (-TM) de tunicamycine   (TM).   Les cellules ont été déposées sur des plaques de 100 mm2 et admises à atteindre à peu près la confluence. Le milieu a été   évacué   et remplacé par 3   ml   de milieu exempt de cystéine avec ou sans addition de 1 9 par ml de tunicamycine. Après 30 minutes ä 37 C, 250 Ci par ml de L-35S-cystéine (1016 Ci par millimole; New England Nuclear) ont été ajoutées pour une durée   supplementaire   de 6 heures.

   La récolte des cellules, la préparation des produits de lyse des cellules, l'immunoprécipitation et le   SDS-PAGE   ont été menés comme décrit ci-dessus. Les extraits ont été   immunoprécipites   par des anticorps spécifiques de p97 et les protéines ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyamide avec SDS (SDS-PAGE).

   (a) Gel de   polyacryl. am. ide avec   SDS coloré au bleu Coomassie ; piste   1,   marqueurs protéiniques; piste 2, 

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 p37 immunopurifié issu de cellules B16 de souris transfectées; piste 3, cellules SK-MEL 29 +TM; piste 4, cellules SK-MEL   28-TM ;   piste 5, cellules   CH03+     +TM ;   piste 6, cellules   CH03+-TM.   (b) Autoradiogramme du même gel qu'en (a). 



   La Fig. 8 montre les résultats de la radio-   immunoprécipitation   du p97 exprime dans des cellules   transfectees   ou des   cellules tnfectees   par Vp97a-NY. Des cellules BSC ont été infectées pendant une nuit par du virus de la vaccine de type sauvage ou du virus de la vaccine recombinant avec p97. Ces virus ou la lignée cellulaire transfectée CHO-p97. A ont été mis à incuber 
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 avec de la cystéine et de la méthionine marquees au 35S avec ou sans tunicamycine A   2 par rnl (Sigma). Les   cellules ont été lysées six heures plus   tard, preci-     pistées   par l'anticorps monoclonal 96. 5 et séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10%. Le gel a   été   autoradiographie pendant une nuit.

   Le groupe traité A la tunicamycine est situe d droite pour chaque groupe. 



   La Fig. 9 indique les titres en anticorps sériques chez des souris immunisées par des vaccins pour p97.   Tp97   représente cinq souris immunisées au moyen de 5 x l06 cellules   M2svp97a. A irradiées   (cellules tumorales   syngeneriques   transfectées et exprimant le   p97   de surface) dans de l'adjuvant complet de Freund et ayant regu en   rappel le meme nombre   de cellules dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate. p97 représente un groupe de cinq souris immunisées par 100   ujg   de protéine p97 purifiée dans de l'adjuvant complet de Freund et ayant reçu en rappel 50   jig   de protéine aqueuse.

   Vp97 représente un groupe de cinq souris immunisées et ayant reçu en rappel 107 unites formant plage de lyse de Vp97a-NY par scarification ä la queue. 

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   La Fig. 10 indique l'effet thérapeutique de la vaccination, au moyen d'un virus de la vaccine recombinant   pour p97 (Vp97a-. Y),   de souris sous agression tumorale. Les souris ont été agressées au moyen de   135   ou   104   cellules tumorales exprimant le p97 (M2SVp97a. E) 
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 par voie intraveineuse. Deux jours plus tard, les souris ont reçu en inoculation par scarification ä la queue soit Vp97a-NY, soit Vwt-NY. Les inoculations hebdomadaires par scarification ä la queue ont été répétées et la survie des souris a   été   observée. 



  5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION. 



   La présente invention concerne la production de vaccins pour la prévention ou le traitement des mélanomes. Elle est basée sur l'observation que les mélanomes ont des antigènes de la surface cellulaire associes à la tumeur, comme l'antigene p97, qui sont présents en plus grandes quantités dans les cellules du mélanome que dans les tissus normaux. Conformément à la présente invention, les peptides ou protéines apparentés à l'antigene p97 associé au mélanome   (c'est-a-   dire les peptides apparentes au p97) sont produits suivant les techniques de   l'ÄDN recombinant   et/ou des techniques de synthèse chimiques. Les peptides apparentés au p97 de la présente invention comprennent des séquences d'aminoacides dérivant de tout ou partie de la séquence d'aminoacides du p97, en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3.

   Ils comprennent des séquences   d'aminoacides dérivée5   de la Fig. 3 qui ont été alterées par remplacement d'un ou plusieurs résidus   d'ami-   noacides   a   l'intérieur de la séquence par un autre aminoacide de polarité semblable qui agit comme équivalent fonctionnel et conduit ainsi à une alteration silencieuse. Les substituts d'un aminoacide dans la séquence peuvent être choisis parmi d'autres membres de la classe ä laquelle l'aminoacide appartient. Par 

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 exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, La proline, la phénylalanine, le tryptophane et la méthionine.

   Les aminoacides polaires neutres comprennent la   qlycine,   la serine, le thréonine, la 
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 cysteine, la tyrosine, l'asparagine et La glutamine. Les aminoacides à charge positive (basiques) compren- nent l'arginine, la Lysine et l'histidine. Les aminoacides à charge négative (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. De plus, les peptides apparentés au p97 de la présente invention, qu'ils soient ou   1 non altérés   par la substitution de   résidu5   d'aminoacides, peuvent être de surcrolt modifiés ou traites par glycosylation, phosphorylation, etc., ou bien à la suite de modifications chimiques.

   Ces peptides apparentés au p97 peuvent être utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin qui suscitent une réponse immunitaire dirigée contre les cellules du mélanome présentes chez le patient vacciné. 



   Suivant une forme de réalisation de l'invention, les techniques de   L'ADN   recombinant sont appliquées pour insérer des séquences de nucléotides codant pour l'antigene p97 dans des vecteurs d'expression qui dirigeront l'expression des peptides apparentés au p97 dans des   cellules hötes appropriees.   Les séquences de nucléotides codant pour l'antigène p97 comprennent des séquences de nucléotides issues de tout ou partie de la sequence de nuclétoide de p97 en substance telle qu'illustrée à la Fig. 3.

   En raison de la   degene-   rescence du code d'ADN pour les aminoacides   (c'est-a-   dire que la plupart des aminoacides peuvent être codés par plus d'un codon), des codons fonctionnellement équivalents (c'est-à-dire des codons différents qui codent pour le même aminoacide ou son équivalent fonctionnel) peuvent se substituer dans la sequence du 

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 n97 illustrée   à 1a   Fig. 3   A   la condition que la substitution conduise à un changement silencieux.

   Les   systames   vecteur d'expression-cellule hôte qui contiennent une séquence de nucleotides codant pour tout ou partie de p97 peuvent être utilisés pour produire de grandes quantités des peptides apparent6s au p97   ä     l'état   de pureté in vitro, auquel cas les produits du gène peuvent être purifiés au départ des cellules en culture et utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin sous-unitaires. La purification du peptide apparente au p97 peut être effectuée suivant   différents procédés biochimiques, notamment la purifi-   cation   par immunoaffinite ä l'aide d'anticorps mono-   clonaux.

   En outre, la purification du peptide apparenté au p97 peut être facilitée en   modifiant l. es sequences     d'ADN   qui codent pour les peptides apparentés au p97, de façon que les séquences responsables de l'ancrage de la proteine dans la membrane plasmique soient   élime-   nées, mais que les séquences responsables du transport de la protéine jusqu'a la membrane cellulaire ne soient pas éliminées afin qu'une molecule antigénique tronquee soit sécrété dans le milieu de culture par la   cellule hote. Dans   le cas des peptides apparentes au p97 produits par des ceLlules procaryotes, l'absence de modifications appropriées après traduction peut conduire à un produit antigéniquement inactif, qui peut devoir etre activé par des traitements chimiques ou 
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 autres appropriés. 



   Dans certaines formes de réalisation où le vecteur d'expression est un virus, le virus lui-même peut être présenté à   l'etat   de vaccin. Dans de tels cas, des vaccins de virus recombinant inactivé peuvent être pr4parés. Lorsque le vecteur d'expression est un virus recombinant infectieux qui n'induit pas la maladie chez l'hôte, une composition de vaccin de virus 

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 inactivé ou bien une composition de vaccin de virus vivant qui assure une immunité sensible peut être obtenue. Un vecteur d'expression particulièrement utile   A   cet effet est un virus de la vaccine recombinant qui exprime les peptides apparentes au p97 de la présente invention.

   A cette fin, une séquence de nucléotides codant pour tout ou partie de l'antigène p97 peut être insérée dans un virus de la vaccine vecteur qui est capable de diriger l'expression de la sequence dans un hôte approprié. L'invention comprend l'utilisation d'autres virus vecteurs d'expression à l'état de vaccin, plus particulièrement les   adenovirus.   



   Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la séquence d'aminoacides de p97 qui a été déduite peut faire l'objet d'une recherche des séquences ayant des propriétés, en particulier le caractère hydrophile, permettant de prévoir la presence de cette sequence   i   la surface de la molécule de la protéine et son caractère antigénique et/ou immunogénique probable. Ces peptides apparentés au p97 peuvent être synthétisés par voie chimique et utilisés comme immunogènes dans des compositions de vaccin. 



   L'invention a aussi pour objet un procédé pour produire des peptides apparentes au p97 qui peuvent être utilisés   A   des fins autres que la production d'un vaccin. Les peptides apparentés au p97 peuvent être utilises pour immuniser des animaux afin de produire des antisérums ou des anticorps monoclonaux spécifiques contre les cellules de mélanome en cause. 11s peuvent être utilises comme composants dans un test diagnostique ou bien pour la purification par   affinite   d'anticorps A marqueur radioactif unis   ä   un medicament ou unis à une toxine à utiliser pour le traitement du cancer. 



   L'invention est illustrée par des exemples 

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 dans lesquels la construction d'un vaccin & base de p97 contre le mélanome humain est décrite. Toutefois, les procédés et compositions décrits ici ne se limitent pas à La construction de vaccins au moyen de p97, mais sont applicables A d'autres antigènes associés à des tumeurs. 



   L'invention est exposée de la façon suivante, uniquement pour la clarté de la description : (a) la sequence de nucléotides et aminoacides de p97; (b) les peptides apparentes au p97   prepares   par des procédés de synthèse chimiques, (c) les peptides apparentes au p97 produits au moyen de systemes vecteurs d'expressionhôte, (d) caractérisation immunologique des peptides apparentés au p97, et   (e) préparation   de vaccins. 



  5.1. ANALYSE DE LA SEQUENCE DE L'ANTIGENE   p97 ASSOCIEE  
AU MELANOME. 



   La sequence des nucléotides du gene codant pour le p97 et la séquence des aminoacides qui en dérive sont   illustrées à La Fig.   3. Les sequences fonctionnellement équivalentes entrent dans le cadre de la   presente   invention. Elles comprennent non limitativement les séquences de nucléotides comprenant tout ou partie de la séquence de nucléotides illustrée à la Fig. 3 qui sont altérées par la   Substitution   de codons   différentes   qui codent pour un résidu d'aminoacide identique ou fonctionnellement équivalent induisant ainsi un changement silencieux, ainsi que les séquences d'aminoacides comprenant tout ou partie de la sequence d'aminoacides illustrée à la Fig.

   3 qui sont altérées par la substitution de résidus d'aminoacides fonctionnellement équivalents à l'intérieur de la séquence 
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 induisant ainsi un changement silencieux et leurs dérivés qui sont modifiés ou traites, par exemple par glycosylation, phosphorylation, etc. ou à la suite d'autres modifications chimiques. 

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   Les sous-sections   ci-apuras   décrivent lu stratégie qui a   été   appliquée pour déterminer la séquence du p97 telle   qu'illustree A la   Fig. 3, outre 
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 d'autres techniques qui pourraient atre appliquées d la détermination de la sequence du p97 ou d'autres antigênes tumoraux qui pourraient être utiles dans des compositions de vaccin. 



  5.1. 1. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DE L'ANTIGENE 
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 p97 ASSOCIE AU MELANOME. 



  L'activitd et la séquence des aminoacides de l'antigne p97 associe au melanome n'étaient pas connues et, par conséquent, l'identification de l'antigène p97 a été exécutée ä l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. Un certain nombre de techniques peuvent être appliquées pour engendrer des anticorps monoclonaux spécifiques ä   l'egard   du p97. Par exemple, la technique des hybridomes mise au point par Kohler et Milstein (1975, Nature 250 : 495-497) peut être appliquée de la façon suivante : des souris ou des rats sont immunisés avec des cellules de mélanome humain et des lymphocytes recueillis chez Les animaux immunisés sont fusionnés avec des cellules de myélome ; en variante, des lymphocytes provenant de patients porteurs du mélanome peuvent être fusionés avec des cellules du mélanome (Cote et al., 1983, Proc. Natl. 



  Acad. Sei. 80 : 2026 ; Haspel et   al.,   1985, Cancer Res. 



  45 : 3951), ou bien la technique pour produire des anticorps monoclonaux à l'aide du virus   d'Epstein-Barr   (Cole et   al., 1985,   The   EBV-Hydridoma   Technique and its 
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 Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77- 96) peut etre exploitee pour engendrer des anticorps monoclonaux dirigés contre le p97. En tout cas, les hybridomes resultants sont tries en vue de la production d'anticorps qui se fixent sur les cellules du 

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 mélanome, mais ne se fixent pas sur les cellules normales. 



   Les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 décrits ci-dessus peuvent être utilises de nombreuses   facons   pour faciliter l'identification, la caractérisation, le clonage et l'expression de 
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 séquences de nucl. ot. ides qai. permet-tent. La product. i. on, en grandes quantités, de peptides et protéines apparentés à l'antigène p97. Par exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour caractériser plus finement l'antigene p97 oar radiomarquage de toutes les protéines produites par la cellule tumorale, par immunoprécipitation de la protéine tumorale au moyen de l'anticorps monoclonal utilisé pour identifier l'antigene p97, et par fractionnement   électrophoretique   sur gel des protéines immunoprécipitées.

   Les antigènes   proteiniques   s'identifient sous la forme de bandes distinctes sur Le cliché autoradiographique resultant (Brown et al., 1980, J.   apiol.   Chem. 255 : 1980-4993). En outre, les anticorps monoclonaux dirigés contre le p97 peuvent être utilisés pour faciliter le clonage de la façon suivante : (a) pour immunopurifier les poly-   somes   afin d'identifier et d'obtenir des transcrits de mARN présents dans les cellules du mélanome qui codent pour l'antigène   p97 :   (b) Dour identifier des clones dans une banque d'expression de cADN qui expriment des 
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 peptides ou proteines apparentés A L'antigene p97 ;

   (c) pour purifier l'antigene p97 en vue de préparer des anticorps monoclonaux ou antisérums en supplément à utiliser pour les deux applications précédentes ou (d) pour identifier les cellules dans lesquelles le gène pour 1'antigène p97 a été introduit par transfection. 



   Les anticorps monoclonaux peuvent aussi être utilises pour faciliter la   caractgrisation   structurelle 

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 et immunochimique de l'antigone p97 en vue d'identifier des domaines extracellulaires et   antigeniques   de la molécule et pour purifier la molecule en vue de l'ana- lyse de la séquence des aminoacides (Brown et al.,
1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA   78 : 539-) 43 :   Brown et   al.,   1982, Nature, London, 296 : 171-173). 



   Une caractérisation plus poussée de p97 comprend la détermination de la localisation cellulaire et la cartographie des déterminants antigéniques et des domaines fonctionnels. La localisation subcellulaire peut être effectuée par microscopie   d'immunofluo-   rescence et par des expériences de fractionnement cellulaire. Les antigènes tels que le p97 qui sont présents à la surface de la cellule sont   préférés   pour construire un vaccin, bien que les antigens intracellulaires puissent   êt re   utiles aussi.

   Si des anticorps monoclonaux multiples sont disponibles, les   détermi-   nants antigéniques peuvent être cartographies par des experiences de compétition, au cours desquelles chaque anticorps est radiomarqué   et. soumis à   une competition avec chacun des autres anticorps. Les domaines de la molecule peuvent être identifiés par digestion limitée avec des protéases, puis par SDS-PAGE. Conjointement, ces données doivent permettre l'identification des régions de la molecule qui sont les plus   immunogènes.   



  Si les anticorps monoclonaux ont été obtenus par immunisation de cellules intactes, ces régions de la molecule sont alors le plus probablement extracellulaires et utiles pour la construction d'un vaccin. 



   L'analyse de la séquence des aminoacides permet l'identification sans ambiguïté de la protéine et sa comparaison avec d'autres protéines (Brown et al., 1982, Nature, London, 296 :   171-173). Si la   protéine comprend plus de 50 résidus d'aminoacides, il peut être possible de déterminer une partie seulement 

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 de la sequence des aminoacides, le plus souvent   l'extrémité N-terminale.

   L'antigène protéinique pour   l'étude de la séquence des aminoacides peut être purifié hors des produits de lyse cellulaire par chromatographie   d'immunoaffinité   avec l'anticorps monoclonal, puis par SDS-PAGE   preparatie.   La sequence des aminoacides N-terminaux de la protéine purifiée est ensuite déterminée au moyen d'un appareil automatique pour   l'etude   de la sequence des aminoacides, qui est de préférence un appareil ä phase gazeuse pour une sensi-   bilit6 maximale.   



  5.1. 2. IDENTIFICATION, CLONAGE ET SEQUENCAGE OE L'ADN
CODANT POUR L'ANTIGENE p97 ASSOCIE AU MELANOME. 



   Les premières études de clonage se sont concentrées sur des protéines abondantes, comme la 
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 globine et l'ovalbumine, dont les mARN forment souvent 10 A 50% du mARN total. Ces mARN pourraient être purifids jusqu'à omogénéitd par fractionnement suivant dimension et des sondes de cADN pur pourraient etre utilisées pour débrouiller des banques de quelques centaines de clones par hybridation de colonies. Pour des protéines dont les   mARN   forment 1 à 10% du   MARIJ   total, l'hybridation différentielle avec deux sondes de cADN peut être applique, auquel cas l'une des sondes de cADN contient la séquence intéressante et l'autre est un témoin négatif.

   Les ARN messagers codant pour les protéines peu abondantes, comme les antigènes associes aux tumeurs, qui peuvent former à peine   0. 01   du mARN cellulaire, sont beaucoup plus difficiles à cloner parce que des dizaines de milliers de clones doivent être tries et que les sondes de cADN ne donnent alors pas un signal d'hybridation spécifique, Ces deux inconvénients peuvent être atténués par enrichissement du   mARN   pour la sequence intéressante. 



   Plusieurs approches appliquées pour cloner 

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   11 ADN   codant pour   l'antigène p97 associé   au mélanome humain sont décrites ci-après. Les clones résultants ont et analysés en vue d'identifier un ou des clones couvrant la région de codage complète de p97. Les segments insérés de nucléotides pour p97 de ces clones ainsi identifiés peuvent ensuite être   sequences   suivant tout procédé connu. Les différentes approches sont décrites plus en detail ci-après. 



   (a) ISOLEMENT DU mARN PAR IMMUNOPURIFICATION DE
POLYSOMES. 



   Suivant cette technique, des polysomes (qui consistent en mARN, ribosomes et chaines polypeptides naissances) sont purifiés par chromatographie   d'immuno-   affinité avec des anticorps qui reconnaissent les déterminants antigéniques presents sur les chaines naissantes. Dans de nombreux cas, les anticorps monoclonaux obtenus par immunisation de cellules intactes ou d'extraits cellulaires reconnaissent les antigènes dans leur conformation native, mais ils peuvent ne pas convenir pour une   immunopurification   des polysomes parce qu'il y a un risque notable que les déterminants antigdniques reconnus ne soient pas présents dans les chaînes naissantes.

   Comme la traduction commence   a   l'extrémité N-terminale du polypeptide, les   épitoges   proches de   l'extremité C-terminale   sont probablement absents de la majorité des chaines naissantes. Cet inconvénient est évité soit en utilisant des anticorps qui reconnaissent les épitopes N-terminaux, soit en préparant les polysomes à partir de cellules traitées à l'aide d'un inhibiteur de la synthèse des protéines qui bloque la terminaison. 



   Une difficulté plus grave est que les protéines matures different des chaines naissantes à cause de modifications succédant à la traduction. Ce problème est particulièrement aigu pour les protéines 

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 de la surface cellulaire qui sont modifiées plus abondamment par l'Elimination des peptides signaux, par addition de   chalnes laterales d'hydrate   de carbone et par formation de ponts disulfure.

   Si un antiserum 
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 polyclonal est utilise pour l'immunopurification des polysomes, les differences du caractère   antigenique   entre les chalnes naissantes et la protéine mature peuvent être de faible conséquence, parce que pendant l'immunisation, le lapin ou   1 autre animal   est exposé non seulement   a   la protéine native, mais aussi   a   des formes partiellement ou complètement dénaturée, en particulier si de l'adjuvant de Freund a   ete   utilise. Même si ces anticorps ne constituent qu'une fraction mineure de la population des anticorps, il peut y en avoir encore suffisamment en présence pour se fixer sur les chaines naissantes. Toutefois, la préparation d'un antiserum polyclonal contre des protéines de faible abondance peut être extrêmement difficile.

   Bien qu'un anticorps monoclonal puisse être utilisé pour purifier l'antigène en vue   d ' immunisations ultérieures,   chaque gramme de cellules en culture ne produit souvent qu'un microgramme d'antigene. Ceci est suffisant pour immuniser plusieurs souris, mais ä peine suffisant pour un seul lapin. 



   Une autre solution de la difficulté est d'obtenir un anticorps monoclonal qui reconnaît les déterminants antigéniques présents dans les chalnes naissantes en utilisant l'antigene p97 dénaturé comme immunogène servant ä   oreparer   l'anticorps monoclonal. Dans 1'exemple de la   presente   invention, un ensemble d'anticorps monoclonaux reconnaissant trois épitopes 
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 distincts sur le domaine N-terminal d'un poids molécu- laire de 40. 000 daltons de la molécule de p97 étaient disponibles et un pool d'anticorps monoclonaux ayant chacun une spécificité   differente   a été utilisé dans 

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 l'espoir qu'un ou plusieurs d'entre eux se fixeraient sur les chaines naissantes.

   Les anticorps choisis étaient hautement spécifiques de p97 en ce que chacun d'eux donnait l'immunoprécipitation d'une bande unique de p97 à partir d'un produit de lyse de cellules entières radiomarqué et qu'ils avaient des affinités de fixation élevées. Pour le projet de clonage, on a choisi trois anticorps   IgG2a,   un spécifique pour chacun des trois   épitopes.   En   généra1,   les chances de succès peuvent etre augmentées par l'utilisation de plusieurs anticorps à l'égard d'épitopes distincts. 



   Lors de l'utilisation d'anticorps monoclonaux, la question reste de savoir comment on peut prédire si un anticorps monoclonal donné ou une combinaison donnée d'anticorps reconnaltra les chaines naissantes et conviendra donc pour   l'intmunopurification   des polysomes. Une approche est de déterminer si l'anticorps monoclonal donne l'immunoprécipitation de l'antigène qui a été traduit dans le système du produit de lyse des réticulocytes, en se fiant ä la présomption que le produit de traduction in vitro, qui   n'a   pas été traité, ressemblera aux chaines naissantes.

   Une approche différente est de procéder   A   petite échelle   a     l'immuno-   précipitation des polysomes et d'utiliser ensuite la traduction in vitro pour déterminer si l'espèce de mARN intéressante a été enrichie. 



   Lorsqu'une technique d'immunopurification des polysomes est appliquée, il est important de surveiller la purification en mesurant   1'activité   de mARN. Ceci peut être effectué en traduisant le mARN dans un système de produit de lyse des réticulocytes et en analysant les produits de traduction par SDS-PAGE. Bien que   l'antigène associe la tumeur   puisse être un constituant trop mineur des produits de traduction du mARN non enrichi pour être observé parmi les centaines 

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 d'espèces plus abondantes, il devrait être décelable dans les produits de traduction issus des échantillons de mARN enrichi. En variante, le système de traduction par les oocytes de xenopus peut être utilise s'il existe un immunoessai sensible pour détecter l'antigene associé   ci   la tumeur ainsi traduit.

   Pour le p97, un immunoessai   ä   double déterminant hautement sensible (DDIA) qui utilise deux anticorps monoclonaux speci-   fiq'tes   de deux   épitopes   différents du p97 a été utilisé 
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 a cette fin. 



   La protéine A fixée sur Sepharose peut être utilisée pour   l'immunopurification des polysemes.   



  L'adsorbant avec proteine A trouve deux applications dans ce mode opératoire. La première est de purifier les anticorps monoclonaux à partir des liquides d'ascite bruts, de façon à éliminer l'activité de ribonucléase contaminante. L'adsorbant avec protéine A est utilisé ensuite conjointement avec des anticorps purifiés pour l'immunopurification des polysomes portant la chaine naissante spécifique. 



   La traduction du mARN dans un   Systeme   de produit de lyse des réticulocytes permet la   caractéri-   sation biochimique du produit de traduction, de même qu'une évaluation de sa pureté. 



  (b) SONDES D'OLIGONUCLEOTIDES. 



   Un autre procédé qui peut être appliqué conformément   A   l'invention pour cloner le cADN codant pour   l'antigene associe a la tumeur   tel que le p97 est de déterminer une séquence d'aminoacides partielle ou complète de l'antigene et de synthétiser une sonde   d'oligonucleotides basee   sur la séquence de nucléotides déduite de la séquence d'aminoacides.

   L'oligonucléotide peut alors etre utilise comme amorce pour la synthèse du cADN et comme sonde pour vérifier la banque de cADN   r4sultante.   Par conséquent, la protéine p97 associée au 

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 mélanome peut, avec avantage, être purifiée hors des produits de lyse des cellules du mélanome par chromatographie d'affinité ä l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique (Brown et al., 1932, Nature, London, 296 :   171-173). Une séquence   de nucléotides codant pour une partie de la sequence   d'aminoacides determinee   est ensuite synthétisée et peut   µtre   utilisée comme amorce et/ou sonde.

   Les parties de la séquence   d'aminoacides   contenant des résidus d'aminoacides codes par un codon unique ou par deux codons conviennent le mieux   ä   cet effet. Une approche est de synthétiser une séquence plus longue, typiquement de 25 à 60 nucléotides,   ql. Ü   représente la séquence codante la plus probable basée sur les   frÅaquences   habituelles des codons connues chez   l'hêtre   humain. L'utilisation de deux   oliqonucl-eotides   synthétiques basés sur des   parties differentes   de   la   sequence d'aminoacides facilite le débrouillage an permettant d'identifier les signaux d'hybridation positifs faux.

   De plus, l'utilisation de conditions d'hybridation qui reduisent au minimum l'effet de la teneur en G-C sur le point de denaturation des hybrides d'ADN facilite aussi le débrouillage. Lorsqu'un clone de cADN partiel a   été   obtenu suivant ce procédé, il peut être utilisé comme sonde pour aider à obtenir un clone de cADN de longueur complete. 
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  (c) BANQUES D'EXPRESSION DE cADN. 



   Des vecteurs de clonage qui permettent l'expression du segment   inséré   de cADN dans les bactéries ont été développés. Une approche, par conséquent, qu'on peut appliquer pour obtenir des clones de cADN pour des protéines associées ä une tumeur telles que le p97, est de préparer une banque de cADN par transcription reverse du mARN (enrichi ou non enrichi) isole des cellules du mélanome, comme décrit ci-dessus, en utilisant des oligo (T)-nucléotides d'amorçage ou des 

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 oligonucléotides synthétiques d'amorçage décrits cidessus, puis de débrouiller une teile banque à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la proteine p97 associée au mélanome.

   Les clones qui contiennent de l'ADN codant pour les épitopes reconnus par l'anticorps monoclonal dans l'orientation et le cadre de lecture corrects expriment des peptides ou protéines apparentés à la protéine p97 associée au mélanome et peuvent être identifies par transfert des protéines exprimées par les clones sur un filtre de nitrocellulose, puis incubation du filtre avec l'anticorps, suivie du développement avec un reactant anti-immunoglobuline marque. 



   Une difficult possible est que de nombreux anticorps monoclonaux ne soient pas à meme Je reconnattre la protéine exprimée par la bactérie, parce que dans de nombreux cas, seule une partie du cADN est contenue dans le segment inséré et que les bactéries ne traitent pas les protéines de la même   façon qua la font   les cellules eucaryotes.

   Cette difficulté est particulièrement aigue pour les   proteines de La surfaco   cellulaire d'une tumeur qui sont modifiées plus abondamment par élimination des peptides signaux, par addition de   chalnes   latérales d'hydrate de carbone et 
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 par formation de ponts disulfure. 11 peut donc etre   necessaire   d'engendrer des anticorps monoclonaux qui sont connus comme reconnaissant l'antigone dénaturé ou bien de préparer des   antisérums     polyspecifiques   par immunisation   A   l'aide de l'antigène purifie. 



   Lorsqu'un virus recombinant ou plasmide qui 
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 est présumé contenir un segment instr6 de cADN dérivant d'un antigène p97 associé au mélanome est identifie, le segment de cADN peut être utilise   pour debrouiller des   banques supplémentaires aux fins d'identifier soit des clones de longueur complète, soit un groupe de clones 

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 qui couvrent la longuenr complète du cADN qui code pour p97. L'identité du cADN cloné peut être établie par analyse de sequence et par comparaison de la sequence des aminoacides N-terminaux ainsi déduite avec celle déterminée par analyse directe de la séquence d'aminoacides sur la protéine p97. 
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  (d) CLONAGE GENOMIQUE. 



   Le   procédé   ci-après permet de cloner   l'AON   en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre un déterminant antigénique qui est prisent uniquement dans la proteine native et n'est pas présent dans les chaines naissantes, ni dans la proteine exprimée dans les bactéries. A cet effet, de l'ADN dérivé de cellules du mélanome humain est introduit pas   transfection dans   des cellules L de souris.

   Ensuite, les celluLes de souris qui expriment l'antigène p97 associé au mélanome sont   isoldes   soit au moyen du trieur de cellules activées par fluorescence, soit par identification immunologique des colonies qui produisent des peptides apparentés au p97 au moyen d'anticorps monoclonaux   radiomarques   dirigés contre le p97 en vue de déceler les peptides apparentes sur des répliques des colonies   transferees   sur des filtres en toile de polyester. Plusieurs tours successifs de transfection peuvent être nécessaires pour éliminer les séquences   d'ADN   humain non apparentées.

   Une banque   qénomique   est ensuite préparée dans un phage lambda vecteur et ses clones contenant des   sdquences   répétitives humaines qui apparaissent dans les introns de la plupart des genes sont triés. Lorsqu'un clone génomique est identifié, il peut etre utilisé comme sonde d'hybridation pour identifier les clones de cADN contenant l'ADN codant pour le p97. 

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   5.2. SYNTHESE DE FRAGMENTS   ANTIGENIQUES   DE L'ANTIGENE n97 ASSOCIE AU MELANOME ET EVALUATION DU POUVOIR
IMMUNOGENE. 



   Des peptides synthétiques peuvent être utilisés comme immunogènes pour susciter contre la protéine native une réponse immunitaire qui peut assurer un certain degré de protection contre un certain nombre d'agents pathogènes. De telles séquences de peptides sont sélectionnées   d'après La séquence   d'aminoacides connue de   l'antigene protéinique   par identification de séries d'aminoacides qui sont probablement présents la surface de la molécule   protéi-   nique   exposee a. u milieu exterieur.   Ceci est le plus communément   execute   par analyse sur ordinateur de la séquence d'aminoacides en utilisant les paramètres d'hydropathie établis pour les aminoacides.

   Des critères supplémentaires tels que la structure secondaireprévueoulaflexibilitépeuventêtreutilisés aussi. 



   Par consequent, des peptides synthétiques comprenant 5 ä 50 résidus d'aminoacides de la protéine   pur) 7 associée   au mélanome peuvent être soumis ä une preuve du pouvoir immunogène chez des animaux   d'expe-   rience (habituellement la souris ou le lapin). Ces peptides synthétiques comprennent non limitativement tout ou partie de la séquence d'aminoacides sensiblement telle que décrite à la Fig. 3 y compris des séquences altérées dans lesquelles des résidus d'aminoacides fonctionnellement   équivalentes   se substituant a des résidus dans la séquence conduisent à un changement silencieux et/ou des sequences   modifides   ou traitées telles que des séquences glycosylées, des séquences phosphoryles, etc. ou des séquences modifiées par voie chimique.

   Ces peptides apparentes au p97 sont utilises soit isolément, soit   couples avec une proteine   

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 porteuse, comme 1'hémocyanine serrure de patelle   (KLH).   Dans l'un et l'autre cas, L'utilisation d'un adjuvant est   facultattve,   mais préférable. Les animaux immunisés regoivent un rappel et subissent une recherche des anticorps dirigés vers le peptide immunisant. Ceux porteurs d'anticorps contre le peptide subissent une recherche des anticorps qui se fixent sur la protéine p97 native.

   Dans le cas   d'antignes associés à   une tumeur, comme le p97, il est intéressant aussi de rechercher une réponse d'immunité cellulaire, par exemple en recherchant l'hypersensibilité de type différé (DTH), une proliferation stimulée par antigène in vitro, des cellules T cytolytiques ou un rejet de tumeur dans un modèle approprié. Un modele approprie serait une tumeur de souris exprimant l'antigene associé à la tumeur humaine en conséquence d'une transfectionàl'aided'uncADNvecteurd'expression approprié construit. 



   Le but est d'identifier des peptides qui suscitent une vive réponse immunitaire dirigée contre   l'antigène p97 associé   au mélanome. Lorsqu'ils ont été identifies, ces peptides peuvent être produits en grandes quantités suivant des procédés de synthèse chimiques bien connus. En variante, les peptides identifies peuvent être produits en grandes quantités par expression des sequences de nucléotides qui codent pour ces peptides dans des systemes vecteur d'expression-cellule hôte. 



  5.3. PRODUCTION DE PEPTIDES   APPARENTES AU p97   PAR DES
SYSTEMES VECTEUR D'EXPRESSION-HOTE. 



   Des protéines et peptides peuvent être produits en grandes quantités en insérant des séquences de nucleotides codantes dans un vecteur d'expression approprié, qui est ä son tour introduit dans des cellules hôtes appropriées, en ce compris, mais sans 

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 limitation, des   bactériens,   des levures, des cellules d'insectes et des cellules de mammifères. Bien que les hôtes bactériens offrent de nombreux avantages, ils ne traitent pas convenablement de nombreuses protéines eucaryotes et conviennent moins bien que les cellules eucaryotes pour l'expression des protéines associées à la tumeur.

   Toutefois, les protéines recombinantes produites dans les bactéries peuvent être utiles pour induire des réponses de cellules T, du fait que ces réponses nécessitent, croit-on, la dégradation initiale de l'antigène protinique. 



   Afin d'exprimer des peptides apparentés au p97 dans un   Systeme   vecteur-hôte, des séquences de nucleotides codant pour l'antigène p97 associé au mélanome ou une fraction de celui-ci sont insérées dans un vecteur d'expression approprie. De telles séquences de nucleotides comprennent non Limitativement tout ou partie de la séquence   d'ADN   de p97, en substance telle qu'il- 
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 lustrée i la Fig. 3, y compris les séquences altérées dans lesquelles un ou plusieurs codons a l'interieur de la sequence sont remplaces par un codon qui code pour un résidu d'aminoacide identique ou fonctionnellement équivalent, conduisant donc à un changement neutre ou silencieux dans la sequence.

   Le vecteur d'expression contient les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence insérée qui code pour la proteine. Ces   é1éments   varient par leur longueur et leurs spécificités. Suivant le système   hotte-vecteur   qui est utilisé, l'un quelconque parmi de nombreux éléments de transcription et de traduction appropries peut être utilisé. Par exemple, lors du clonage dans des systemes ä cellules de mammifères, des promoteurs isolés du génome de cellules de mammifère (par exemple le promoteur de la métallothionine de souris) ou de virus qui croissent dans ces cellules (par exemple le promoteur 

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 7. 5K du virus de la vaccine) peuvent être utilisés.

   Les promoteurs produits suivant les techniques de l'ADN recombinant ou par synthese peuvent être utilisés aussi pour assurer la transcription des séquences insérées. 



   Des signaux d'initiation spécifiques sont également nécessaires pour une traduction efficace des sequences insérées codant pour la protéine. Ces signaux comprennent le codon d'initiation ATG et les sequences adjacentes. Dans les cas ou le gene ou bien la séquence de cADN est inséré dans un vecteur d'expression approprie, des signaux de contrôle de traduction   supplémen-   taires peuvent être inutiles. Néanmoins, dans les cas   oa   seule une fraction de la sequence codante est insérée, des signaux de contrôle de traduction exogènes, y compris le codon ATG, peuvent devoir être apportes. Le codon   d'initiation doit,   par conséquent, se trouver en phase par rapport au cadre de lecture des séquences codant pour la protdine, afin d'assurer la traduction du segment inséré complet.

   Ces séquences de contrôle de traduction exogènes et codons d'initiation peuvent avoir différentes origines tant naturelles que synthétiques. 



   L'un   quelconque des procedes   connus du specialiste en la matière pour insérer des fragments d'ADN dans un vecteur peut être appliqué pour construire des vecteurs d'expression contenant un gène chiméral consistent en signaux de   controle   de transcription et de traduction appropriés et en les sequences codant pour la proteine. Ces procédés peuvent comprendre ceux appliqués dans les techniques de   l'ADN   recombinant in vitro, les techniques de synthèse et les recombinaisons in vivo (recombinaison génétique). 



   Les vecteurs d'expression comprennent non limitativement les vecteurs suivants et leurs   derives :   le virus de la vaccine, les adénovirus, les virus 

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 d'insectes, les levures vecteurs, les bactériophages vecteurs et les plasmides   d'ADN   vecteurs. Le clonage et l'expression des gènes dans les systèmes bactériens sont bien connus.

   Par exemple, lors du clonage dans un   S. coli,   ses bactériophages ou promoteurs de plasmides, comme le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur   recta,   le promoteur de   l'ARN ribosofnal,   les promoteurs PR et PL du coliphage lambda et d'autres, y compris, 
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 mais non limitativement, iacuv5 < le promoteur hybride jrp-lacuv5 (tac), ompF, bla, Ipp et analogues peuvent être utilisés pour atteindre des valeurs élevées de transcription du segment d'ADN adjacent. Toutefois, en raison des différences opératoires entre les cellules procaryotes et eucaryotes, il peut être   préférable   d'exprimer les peptides apparentés au p97 de la présente invention dans des cellules eucaryotes.

   Les   procédées   les mieux établis pour exprimer les protéines dans les cellules eucaryotes sont (a) l'introduction do gene dans la cellule conjointement avec un gene de résistance   Åa   un médicament, suivie de la sélection par ce médicament, de   preference   en obtenant   l'amplifi-   cation, par exemple avec le système dihydrofolate   reductase-nDethotrexate ; (b)   l'expression du cADN dans un plasmide vecteur, souvent basé sur   p8R322,   en utilisant un promoteur eucaryote puissant ou d'autres séquences régulatrices; (c) l'expression du cADN dans un vecteur viral, souvent issu de SV40, à nouveau en utilisant des promoteurs puissants, en l'occurrence un promoteur de SV40.

   Les plasmides recombinants vecteurs sont souvent utilisés pour produire des lignées cellulaires qui produisent la protéine pendant une longue durée, alors que les SV40 vecteurs sont souvent utilisés pour obtenir l'expression transitoire. Bien que les cellules des mammifères aient le plus souvent été   utilisees contme hole,   les cellules d'insectes et 

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 dans certains cas les cellules de levures peuvent convenir aussi. D'aucunes sont décrites plus en detail   ci-apres.   



   Pour construire un virus de la vaccine recombinant exprimant l'antigène p97 associé au   mälanomg,   la sequence codante de CADN doit être épissée au promoteur 7.5K du virus de la vaccine pour La formation   d'un gêne     chimral.   Ce gêne chim6ral est flanqué par une séquence supplémentaire de virus de la vaccine homologue au gêne viral pour la thymidine-kinase, qui est portée sur l'ADN du plasmide vecteur. La construction du gène chiméral met en jeu l'utilisation de signaux de contrôle tant naturels que synthétiques pour la transcription et la traduction de la séquence de l'antigene associé   a   la tumeur.

   Le gène chiméral est ensuite introduit dans des vecteurs d'expression du virus de la vaccine par la recombinaison in vivo entre la région thymidine-kinase homologue présente tant sur le plasmide vecteur que sur le génome du virus de la vaccine. 



  Ces virus recombinants contenant le gène   chitneral   sont capables de diriger l'expression des peptides apparentés au p97 dans un hôte infecté et oeuvent être utiliséscommecomposantsd'unvaccin. 



   Dans les cas où un   adénovirus   est utilisé comme vecteur d'expression, la séquence d'ADN intéressante est pissée sur un complexe de   controle   de transcription/traduction   d'un adenovirus,   par exemple les séquences de promoteur tardif et tripartites   d'entree.   Ce gene chiméral est ensuite inséré dans le 
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 genome de l'adenovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du genome viral (par exemple la région EI ou E3) conduit à un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer le peptide apparenté au p97 dans les hôtes infectés. Actuellement, il existe deux souches   d'adeno-   

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 virus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire.

   Ce sont des premiers choix   ä   utiliser comme vecteurs pour exprimer 
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 la séquence d'ADN inseree. 



   Un autre   Systeme   d'expression qui pourrait être utilisé pour exprimer les peptides apparentés au   pc) 7   est un   Systeme   avec insecte. Dans un tel système, le virus de la   polyhedrose   nucléaire   d'Autographa   californica (ACNPV) est utilisé comme vecteur pour 
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 t exprimer des genes étrangers. Le virus crott dans les cellules de Spodoptera   frugiperda.   La sequence d'ADN intéressante peut être clonée dans des régions non essentielles (par exemple le gene de la polyhédrine) du 
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 virus qui sont mises sous contrôLe d'un promoteur d'AcNPV (par exemple le promoteur de la polyhedrine).

   L'insertion de la séquence d'ADN avec succès conduit à l'inactivation du gene de la polyhédrine et   A   la production du virus recombinant non occlus (c'est-à- 
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 dire le virus manquant de l'enveloppe protéinique pour laquelle code le gene de polyhédrine). Ces virus racombinants sont ensuite utilises pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le 9cLiper gène inséré est exprime. 



     ! ? n outre,   des souches de cellules hötes peuvent être choisies qui modulent l'expression des séquences insérées, ou bien qui modifient et traitent le gène chiméral produit   d'une façon spécifique   souhaitde. L'expression à partir de certains promoteurs peut   etre   augmentée en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc et cadmium pour les promoteurs de la métallothionéine). Par consequent, l'expression de la protéine produite par génie génétique peut être maîtrisée. Ceci est important si la protéine produite du gène   cloné   est létale pour les cellules hôtes.

   De plus, des modifications (par exemple 

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 glycosylation, phosphorylation,   etc.)   et traitements (par exemple scission) des protéines produites sont importants pour la structure et la fonction de la protéine. Les différentes cellules hôtes ont des caractéristiques et des mécanistes spécifiques pour le traitement succédant   a   la traduction et pour la modification des protéines. Des lignées cellulaires ou systèmes hôtes appropriés peuvent être choisis pour assurer la modification et le traitement corrects de la 
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 proteine étrangère exprimée. 



   Dans la forme de réalisation particulière décrite ici pour p97, on a épissé la séquence de cADN de p97 dans un plasmide d'expression vecteur derive de pssR322 qui contient le promoteur de la métallothionine. La sequence codante entière de p97 comprenant les peptides signaux et l'ancrage à la membrane a été insérée dans le vecteur. 



  5. 3.   1.   IDENTIFICATION DES VECTEURS D'EXPRESSION RECOM-
BINANTS CAPABLES DE REPLIQUER ET DE DIRIGER
L'EXPRESSION DES SEQUENCES   D'ADN DE p97.   



   Les vecteurs d'expression contenant des gênes étrangers insérés peuvent   litre   identifiés par trois approches générales : (a)   l'hybridation ADN-ADU, (b)   la présence ou l'absence de   Eonctions   de gene marqueur, et (c) l'expression des sequences   insérées.   Dans la première approche, la présence d'un gène étranger   inséré   dans un vecteur d'expression peut être détectée par hybridation ADN-ADN au moyen de sondes comprenant des séquences qui sont homologues du gêne étranger   inséré.   Dans la seconde approche,

   le système vecteur recombinant/hôte peut être identifié et sélectionné sur base de la présence ou de l'absence de certaines fonctions de   gene"marqueur"r4sultant   de l'insertion de gènes dans le vecteur (par exemple l'activite thymidine-kinase, la resistance aux antibiotiques, le 

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 phénotype de transformation, etc.). Par exemple, si le gene étranger est inséré ä   l'interieur   de la sequence du gene marqueur du vecteur, Les recombinants contenant l'ADN inséré peuvent être identifiés par   l'absence d   la fonction du gène marqueur. Dans la troisième approche, les vecteurs d'expression recombinants peuvent être identifiés par dosage du produit du gène étranger exprimé par le recombinant.

   Ces dosages peuvent être fondés sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du produit de gène. 



   Par exemple, lors de la construction d'un virus de la vaccine recombinant conformément   â   la présente invention, le gene   chiméral   contenant les séquences codant pour p97 est   inséré   dans le gène de   thymidine-Kinas,   ce qui 1'inactive et   confere au   virus un phénotype TK-. De tels recombinants sont   sélec-   tionnés d'après leur aptitude à croître dans des milieux contenant de la   5-bromo-désoxyuridine   qui est un nucléoside analoque létal pour les cellules TK+, mais non pour les cellules TK". Les recombinants sont en outre identifies par hybridation ADN-ADN au moyen d'une sonde de cADN spécifique pour la protéine asso-   ciee   à la tumeur.

   Le virus recombinant TK-peut etre isolé par purification sur plaque et des stocks en sont   prepares   à partir de cellules infectées cultivdes. Le virus recombinant peut être soumis à une épreuve de son aptitude à induire la synthèse des peptides apparentes au p97. A cet effet, des cellules infectées peuvent être cultivées en présence d'aminoacides radiomarqués, puis les produits de lyse et les fractions   subcellu-   laires des cellules   radiomarqudes   infectées subissent une épreuve d'immunoprécipitation avec des anticorps diriges contre l'antigene p97 associe au mélanome d'origine. Les produits   imununoprecipités   sont résolus par SDS-PAGE.

   Les cellules infectbes peuvent aussi être 

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 testées par immunofluorescence au moyen d'un anticorps monoclonal. 



   Les cellules dans lesquelles un plasmide vecteur a été introduit par transformation peuvent être identifiées aisément par analyse FACS ou bien par des épreuves de fixation de répliques de colonies de cellules sur toile de polyester. La quantit4 de peptide apparenté au p97 en présence peut être déterminée par radio-immunoessai quantitatif et sa Localisation subcellulaire peut être déterminée par fractionnement cellulaire et par microscopie d'immunofluorescence. La structure du peptide apparenté au p97 exprimée peut être   déterminée   par SDS-PAGE et par   squenqage   des aminoacides. 



  5. 3.2. PURIFICATION DU PEPTIDE APPARENTE AU p97 A
PARTIR DES SYSTEMES VECTEUR   D'EXPRESSIONZHOTE.   



   De nombreux antigènes associés   â   une tumeur tels que le p97 sont des   g1ycoprotéines   de la surface cellulaire et contiennent un peptide signal N-terminal et un peptide d'ancrage C-terminal (Davis et   al.,     1995,     J.   Mol. Biol. 181 :   111-121).   Lors de l'expression dans un vecteur approprié. it est à prévoir que la protéine soit transposée   a   la surface de la cellule. Pour faciliter La purification de la protéine, il peut etre préférable d'effacer la sequence d'ADN codant pour la region d'ancrage de la membrane, afin que la protéine mature soit dégagée dans le milieu de culture. 



   Le peptide apparenté au p97 peut être purifié 
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 a partir des cellules hötes par lyse ci l'aide d'un détergent, puis par chromatographie d'affinité   A   l'aide d'anticorps monocionaux. Si une protéine tronquée doit etre purifiée à partir du milieu de culture, il est préférable d'utiliser un milieu exempt de serum et d'appliquer ensuite la chromatographie d'affinité avec des antigènes monoclonaux. 11 est important que l'anti- 

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 gene puisse être élué hors de l'adsorbant portant l'anticorps sans réduction du pouvoir   antigenique   ni d4naturation de l'antigene.

   Ceci peut être obtenu par élévation ou abaissement du pH ou bien par recours   A   un chaotrope. 11 peut être nécessaire de sélectionner un anticorps monoclonal qui libère 1 antigène dans des conditions relativement   modérées.   Cet antigène purifié par affinité peut être purifié davantage par   HPLC.   



  5.4. CARACTERISATION IMMUNOLOGIQUE DES PEPTIDES
APPARENTES AU p97. 



   L'aptitudedel'antigènesynthétiqueou recombinant à susciter une réponse antitumorale peut être évaluée initialement chez les animaux d'expérience. Ceci se réalise par construction d'un système modèle dans lequel la protéine p97 associée au mélanome humain est exprimée dans des cellules de la souche consanquine appropriée de l'espèce expérimentale.

   Les animaux sont ensuite immunisés au moyen du peptide apparente à p97 de la présente invention suivant différents protocoles et sont ensuite soumis à une épreuve de L'acquisition des. anticorps   dirigés   contre l'antigène p97 associé au   mélanome,   de   l'immunitd i   médiation cellulaire teile que l'hypersensibilité de type différé ä   l'egard   de   l'antigene p97   et de leur aptitude à surmonter une agression par des cellules tumorales syngendriques viables exprimant l'antigene p97.

   De plus, des épreuves in vitro de l'immunité cellulaire peuvent être effectuées pour mesurer la prolifération des lymphocytes en réponse au peptide apparenté au p97 et aussi l'aptitude des lymphocytes provenant d'animaux immunises ou de patients humains porteurs du mélanome   A   tuer les cellules tumorales qui expriment   l'antigêne p97. Oe plus,   en immunisant des souris avec du p97 de souris, on est d meme de determiner l'ampleur avec laquelle il est possible d'induire 

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 une réponse immunitaire à l'égard d'un antigène qui est présent en traces dans les tissus normaux. 



   Des primates non humains peuvent être utilisés pour établir la   surjeté   des peptides apparentes au p97 de la présente invention. A cet effet, les animaux peuvent être immunisés suivant des protocoles qui pourraient, du point de vue éthique,   s'appliquer A   un patient cancéreux humain et passent ensuite les épreuves   indiqudes   ci-dessus, sauf que les expériences de transplantation de La tumeur ne sont pas possibles, parce qu'elles n6cessitent d'utiliser des souches consanguines. La   sûreté   de la technique d'immunisation se détermine par observation de l'effet de l'immunisation sur la santé générale des animaux immunisés (variations de poids, fièvre, appétit, comportement, etc.) et par observation des modifications pathologiques lors de l'autopsie. 



   Enfin, le peptide apparente au p97 de la présente invention peut être essaye chez des patients humains cancéreux. Après une phase initiale I d'essai sur des patients cancéreux   avances   visant à établir l'absence de toxicité, des patients cancéreux en état de   remission, mais presentant   une haute probabilité de rechute, pourraient se preter à   l'4preuve.   Leur   response   immunitaire serait évaluée comme décrit ci-dessus à propos des primates non humains, sauf que l'effet du traitement sur l'affection acquise ou sur la fréquence de récurrence serait examiné. Dans le cas de l'antigene p97 du mélanome, les naevi benins (moles) qui expriment 
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 l'antigene seraient. examines aussi. 



  5. 5. PREPARATION D'UN VACCIN. 



  L'objet de la présente forme de réalisation de l'invention est de produire, suivant les techniques de synthèse ou de l'ADN recombinant, un peptide synthétique, une proteine purifiée ou un virus recombinant 

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 pouvant s'utiliser comme immunogène et un vaccin pour 
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 protegeer Les patients cancéreux à risque élevé de   récurrence   de leur affection, pour traiter l'affection   etablie et,   en dernier, pour vacciner   a   titre prophylactique les individus à haut risque.

   En fait, l'antigène p97 associé au mélanome, synthétique ou recombinant, peut être utilisé conjointement avec d'autres immunogènes pour préparer des vaccins polyvalents en vue de la prevention du mélanome et d'autres cancers.   nes exemples da   diverses compositions de vaccin sont 
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 discutés ci-après. 



  5. 5. 1. COMPOSITIONS DE VACCINS VIRALES. 



   Lorsque le peptide apparenté au p97 de la présenteinventionestproduitàl'aided'unvirus recombinant, un vaccin de virus recombinant vivant ou un vaccin de virus recombinant inactivé peut être   prepare.   Le choix dépend de La nature du virus recombinant qui est utilise pour exprimer le peptide apparenté au p97. Lorsque le virus recombinant est infectieux pour   i'höte a immuniser,   mais ne provoque pas la maladie, un vaccin vivant est   préfdrable   parce que la multiplication chez   l'hole   conduit & un stimulus prolonge de nature et d'ampleur semblables ä celles   e   manifestant dans les infections subcliniques et confère donc une immunité sensible et durable.

   Le virus recombinant infectieux, après introduction chez un hôte, peut exprimer le peptide apparenté au p97   A   partir de son gène chiméral et ainsi stimuler une réponse immunitaire. Le virus recombinant vivant lui-même peut etre utilise comme vaccin préventif contre le mélanome. La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces compositions peut mettre en jeu des systemes tant in vitro (par exemple des cellules de culture de tissu) qu'in vivo (par exemple un animal hôte naturel tel que la vache). Les   procédés   classiques pour la 

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 préparation et la mise en composition du vaccin antivariolique peuvent être appliqués ä la mise en composition d'un vaccin de virus recombinant vivant. 



   Des vaccins de virus vivants polyvalents peuvent être prépares à partir d'un   settl   ou de quelques virus recombinants infectieux qui expriment divers antigènes de différentes cellules tumorales ou cancéreuses. Par exemple, un virus vivant (qui peut comprendre environ 35 kilobases d'ADN étranger) peut être construit de manière   a   contenir des séquences codantes pour d'autres epitopes et un tel virus recombinant luimême peut être utilisé comme immunogène dans un vaccin polyvalent. En variante, un mélange du virus de la vaccine et/ou d'autres virus, dont chacun est capable de diriger l'expression d'un gene different codant pour des   épitoges   différents, peut être présent en un vaccin polyvalent. 



   Que le vaccin recombinant soit ou non infectieux pour l'hdte a immuniser, une composition de vaccin inactivé peut être préparé. Les vaccins inactivés sont "morts" dans la sens que leur   infectivité   a été détruite, habituellement par traitement au moyen de formaldehyde. Dans le cas ideal,   l'infectivité   du virus est détruite sans effet sur les protéines de la capside ou enveloppe qui portent le caractère immunogène du virus. Pour préparer des vaccins inactivés, de grandes quantités du virus recombinant doivent être obtenues en culture afin de disposer de la quantité nécessaire des antigènes compétents. Un   melange   de virus inactives qui expriment des épitopes différents peut être utilisé pour la préparation de vaccins"polyvalents".

   Dans certains cas, ceci   peut être préférable à   des compositions de vaccin vivant en raison des difficultés potentielles dues aux interactions mutuelles des virus vivants administres ensemble. Dans l'un et l'autre cas, 

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 le virus recombinant inactivé ou le mélange de ces virus doit être mis en composition avec un adjuvant approprié, afin d'améliorer la réponse immunologique à   l'egard de   leurs antigens. Des adjuvants appropriés comprennent non limitativement des gels minéraux, comme l'hydroxyde d'aluminium ; des substances tensioactives, comme la lysolécithine; les polyols Pluronic, des polyanions : des peptides et des émulsions huileuses. 



   De nombreux procédés peuvent être appliqués pour introduire les compositions de vaccin décrites cidessus et comprennent non limitativement les voies intradermique, intramusculaire,   intraperitoneale,   intraveineuse, sous-cutanée et intranasale. Lorsqu'une composition de vaccin de virus recombinant vivant est utilisée, elle peut   etre   introduite par la voie naturelle d'infection par le virus du type sauvage d'origine qui a été utilisé pour préparer le virus recombinant de la composition de vaccin. 



    5. 5. 2. COMPOSITIONS DE VACCINS SOUS-UNITAIRES.   



   Au lieu des vaccins de virus, le peptide apparenté au p97 peut lui-mem être utilisé comme immunogène dans des compositions de vaccin sousunitaires. Les vaccins sous-unitaires comprennent uniquement la substance immunogène compétente nécessaire pour immuniser un   hole.   Par consequent, le peptide apparenté au p97 peut être purifié   a   partir des recombinants qui expriment le peptide. Ces recombinants comprennent l'une quelconque des cellules en culture infectées par le virus, bactéries transformées ou levures transformes citées précédemment. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, les peptides ou protéines apparentés au p97 peuvent être synthétises chimiquement. 



   Que les peptides apparentés au o97 soient purifies   a.   partir des recombinants ou soient synth6- 

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 tisés chimiquement, le produit final peut être ajusté ä une concentration   appropriée, rois   en composition avec tout adjuvant de vaccin convenable et conditionne en 
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 vue de l'administration. Des adjuvants convenables comprennent non limitativement, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium; des substances tensioactives, comme la lysolécithine; les polyols Pluronic ; des polyanions : des peptides et des émulsions huileuses. Le peptide apparenté au p97 peut aussi être incorporé ä des liposomes ou bien étre conjugué   A   des 
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 pol. ysaccharides et/ou d'autres polymères Åa utiliser t dans une composition de vaccin. 



   Dans les cas où le peptide apparenté au p97 est un haptène,   c'est-à-dire   une molécule qui est   antignique   dans le sens qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps appropriés, mais n'est pas immunogène dans le sens qu'elle ne peut susciter de réponse immunitaire, l'haptène peut être uni par covalence   à une molécule   vecteur ou immunogène et l'haptène-vecteur peut être mis en composition pour servir de vaccin : par exemple une grosse proteine, comme l'albumine du sérum, confère le caractère immunogêne à l'haptène auquel elle est combinée. 



  6. EXEMPLE : L'ANTIGENE p97 ASSOCIE AU MELANOME. 



   Dans l'exemple décrit ci-après, des clones de cADN issus de différentes régions du mARN de p97 sont assemblés et insérés dans un vecteur d'expression qui dirige l'expression d'un peptide apparenté au   p97.   Les peptides apparentés au p97 produits par le vecteur   d'expression-cellule hte   peuvent etre mis en composition en un vaccin. 
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  6. 1. PURIFICATION DU mARN de p97. 



  On prepare des polysomes ä partir de cellules du m4lanome SK-MEL 28 (Carey et al., 1976, Proc. Natl. 



  Acad. Sei. USA 73 : 3270-3282) par precipitation par le 

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 magnesium. A partir de cette préparation, on purifie des polysomes portant des chaînes naissantes de p97 par incubation avec trois anticorps monoclonaux   IgG2a   (96.5,   118. 1,   133.2) spécifiques pour des   epitopes   distincts de p97 (Brown et al., 1980, J. Biol.   Chem.   



  255 : 4980-4983 ; Brown et   al.,   1981, J. Immunol. 



  127 : 539-546 : Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. 



    Set. USA   78 t   53') -543 : Plowman   et al., 1983, Nature, London 303 :   70-72) et ensuite   par chromatograohie d'affinité sur Sepharose avec protéine   A.   On élue le mARN enrichi en p97 au moyen d'EDTA et on le purifie par chromatographie d'affinité sur oligo(T)-cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD). Au cours d'une expérience typique, 150 unités   S260   de   polysemes   donnent 260 ng de   mARN   enrichi en p97, ce qui représente 0, 23% du mARN total. Après traduction dans des oocytes de Xenopus et dosage du p97 comme d6crit (Brown 
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 et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei.

   USA 78 : 539-543 ; Plowman et   al.,   1983, Nature, London 303 : 70-72), le   mARH   enrichi en p97 donne 80 pg de p97 par ng de mARN, alors que le   mARN   non enrichi en p97 ne donne que 0,44 pg de p97 par ng de   mÄRN,   ce qui démontre que   l'activite de mARN   de p97 a été enrichie 180 fois. Le rendement de   l'activiste   de mARN de p97 est de 42%. La 
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 traduction dans le système de produit de lyse de réticulocytes (Pelham et JacKson, 1976, Eur. J. 



  Biochem. 67 : 247-256) montre que le mARN enrichi en p97 code pour un polypeptide majeur qui a un poids   moleculaire   apparent de 84. 000 daltons, comme l'indique l'analyse par SDS-PAGE, qui n'est pas décelable dans les produits de traduction du mARN non enrichi et qui est   immunoprecipite   par 1'antiserum spécifique de p97 
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 (Fig. 1). On en a conclu qu'il est le précurseur non glycosy1é de p97. 

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    6. 2.   PREPARATION ET CONSTRUCTION DE CLONES DE cADN,
Deux techniques décrites ci-après sont appliquées ä la construction de clones de cADN transcrits a 
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 partir des mARN modèles isolés ci-dessus. 



  6. 2. 1. CONSTRUCTION DE CLONES DE cADN AMORCEE PAR 
OLIGO (T). 



   On a utilisé le mARN enrichi en p97   prepare   ci-dessus comme modèle pour la Synthese du CADN amorcée   par oligo (T).   Le cADN a été   cloné   dans pBR322 de la façon suivante : pour la synthèse du premier brin da 
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 cADN, le mARN enrichi en p97, on a mis Åa incuber les quatres dNTPs et l'oligo (T) (Collaborative Research, Walthma, MA) avec de la   transcript. ase reverse (Mole-     cular   Genetic Resources). On a synthétisé le second brin par incubation avec le gros fragment d'ADN poly- 
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 mérase de E. coli (Bethesda Research Labs, Bethesda MD), et on a mis le cADN en double brin   A   digérer avec de la nucléase Sl (don de 0. Durnam, de The Fred Hutchinsen Cancer Research Center, Seattle, WA).

   On a ensuite fixé au cADN une queue dC au moyen de désoxynucléotidyl-transférase terminale (Bethesda Research Labs, Bethesda,   MD),   on a soumis le cADN   a   la maturation avec pBR322   a   queue dG   digéré   par   Pstl (Bethesda   Research Labs, Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et   al.,   1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 : 3727-3732), puis on   l'a utilise   pour transformer E. coli RR1 traité par le   CaCl. On   a fixe l'ADN des colonies des bactéries 
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 transformées sur papier (Taub et Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126 : 222-230) et on l'a débrouillé par hybridation differentielle avec des sondes de cADN synthétisées sur des modèles de mARN non enrichi et enrichi en p97. 



   On a identifié un clone de 243 paires de bases (bp), le p97-3a2fl, qui   s'hybride avec le cADN   enrichi en p97, mais non de façon détectable avec le cADN non 

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 enrichi et aussi le mARN de p97 sélectionné dans des experiences de traduction avec sélection par hybride. 



  Un signal de polyaddnylation (AATAA) et un tractus   poly(A) étaient présents à l'extrémité 3' du cADN (voir   Fig. 2). Le p97-3a2fl   tradult avec trou monocaténaire   s'hybride 100 fois plus fort avec le mARN enrichi en p97 qu'avec le   MARIN   de mélanome non enrichi et de façon non décelable avec le   mARN   de fibroblaste. L'analyse d'empreinte de Morthern avec le cADN cloné comme sonde a identifié un mARN d'environ 4 kilobases   (kb) qui   était present dans les cellules du mélanome SK-MEL 28 et absent des fibroblastes. 



  6.2. 2. CLONAGE GENOMIQUE DE p97 ET UTILISATION DES
OLIGONUCLEOTIDES SYNTHETIQUES POUR AMORCER 
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 LA SYNTHESE DU CAIN. 



   Les tentatives d'obtenir des clones de cADN s'étendant sur plus de 1 kb   A   partir du site de polyaddnylation n'ont pas eu de   succes,   peut-etre ä cause   d'une region   haute teneur en G-C (plus de 80%) avec structure secondaire étendue. On a appliqué le clonage gnomique pour contourner la, difficulté. On a isolé quatre clones génomiques chevauchants hors de banques de lambda   L47.   1 contenant de l'ADN de SK-MEL 28 fractionnd suivant dimensions et enrichi avec un fragment de restriction de p97 sp4cifique. Ces quatre clones génomiques couvrent 28 kb et contiennent toute la régioncodantedep97ycomprislarégionrégulatrice du gene. Les clones génomiques tels qu'agences en succession à partir de   5'jusqu'a 3'sont : lambda 815   lambda H17, lambda B6.6 et lambda E7.7.

   Cette nomenclature consiste en une lettre qui fait   reference     a   l'enzyme de restriction utilisée pour engendrer le fragment et en un nombre qui indique la dimension en kilobases du fragment qui a été clone dans lambda L47. 1. Ainsi, a partir de   l'extrémité 5',   le clone 

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 lambda B15 contient un fragment BamHI p97 de 15   kob ; le   clone lambda H17 contient un fragment   HindIII   p97 de 17   Kb ; 1e   clone lambda   86.   6 contient un fragment BamHI p97 de   eb   et le clone lambda 87. 7 contient un fragment EcoRI p97 de 7,7 Kb (voir Fig. 2A).

   Les fragments de restriction des clones qui s'hybrident avec le mARN de p97 de 4 kb sur des empreintes de 
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 northern ont été sequences et les exons de p97 ont été identifies par une recherche d'homologie assistée par ordinateur entre les sequences codantes prévues et les séquences d'aminoacides de transferrine d'homme et de poule (Yang et   al., 1934,   Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. 



  Acad. Sei. USA 79 : 2504-2508; Jetsch et Chambon, 1982, Eur. J.   Biochert.     122 : 291-295).   



   On a utilise trois oligonucléotides synthétiques dont les séquences sont basées sur les séquences 
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 d'exons gdnomiques de p97 po ur dmorcer 1a synthèse du cADN sur le mARN de SK-MEL 28 et on a clone le cADN resultant dans 1ambda-gtlO de' La façon suivante: on a fixé une queue dG sur le cADN de p97 et on a pissé celui-ci avec un oligonucidotide de pontage (AATTCCCCCCCCCCCC) et   lambda-gtIO   ayant subi La restriction par EcoRI.   L'oligonucleotide   de pontage permet l'insertion et   l'epissage   des séquences de cADN à queue dG dans le site EcoRI de lambda-gtlO. On a enveloppé le phage lambda (Grosveld et al., 1981, Gene 
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 13 : 227-237), et on l'a appliqué sur E. coli c600 ry.

   (-   mK+hfl.   On a   débrouillé   les banques de cADN dans lambda-gt10   d'apres le fragment insere   de p97 par hybridation sur plaque (Benton et Davis, 1977, Science 196 : 180) au moyen de fragments de l'exon génomique comme sondes. Les sondes étaient   radiomarqudes   au 32pTTP (New England Nuclear, 3200 Ci par mmole) par transduction avec trou monocaténaire   jusqu'   une 

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 activité spécifique de 5-10 x 109 coups par minute par microgramme. On a identifié trois clones de cADN chevauchants   (IOal, Ijl, 2fl) couvrant 2. 368 nucléo-   tides du mARB de p97 y compris La région codante complète en utilisant des fragments spécifiques de l'exon de p97 comme sondes (Fig.   2).   



  6.   3. SEQUENCGE DE L'ADN DE p97.   



   On a excis4 les fragments insérés de cADN et on les a subcloné dans le plasmide vecteur pEMBL13+   (Dente   et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 : 1645-1655) dans E. coli en vue de la propagation ultérieure et de la cartographique de restriction. On a   subclan6   aussi le cADN dans le phage M13mp18 vecteur de clonage (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33 : 103-119) et on   l'a s2quencé   par le   procédai   didésoxy de Sanger   (Sanger   et   al.,   1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 : 5463-   5467). On   a séquencé les clones M13 contenant des fragments insérés importants en engendrant des   dele-   tions au moyen d'ADNase   1 (Hong, 1992,   J. Mol. Biol. 



  153 : 539-549) ou d'exonucléase III (Henikoff, 1984, Gene 28 : 351-359), et en utilisant des amorces d'oligonucléotides 21-mères synthétiques. 



   La séquence de cADN de p97 est illustrée ä la Fig. 3. Un cadre de lecture ouvert de 2. 214 nucléotides s'étend du premier ATG, la séquence autour de laquelle se conforme la sequence d'approbation d'initiation déterminée par KozaK (Kozak, 1980 ; Nucleic Acids Res. 



  8 : 127-142), jusqu'à TGA   A   la position   2. 215.   Le clone de cADN le plus près de 5'contient un supplément de 60 nucléotides   ä   l'amont de   l'ATG d'initiatiol1.   La région   3'non   codante de mARS de p97, qui   n'a pas été   obtenue à l'état de clone de cADN, a été identifiée 
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 comme étant un exon gnomique unique contenant 1. 667 nueléotides. Les résidus 20-32 de la sequence d'aminoacides prévue sont identiques   ä   la sequence 

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 d'aminoacides N-terminale connue de p97 (Brown et   al.,   1982, Nature, London   296 : 171-173),   ce qui prouve l'identité du cADN clone.

   De surcrott, le poids moléculaire prévu du précurseur est de 80. 196 daltons, en bon accord avec le poids moleculaire observé   du nroduit de   traduction in vitro. 



  6.4. CONSTRUCTION RUCTION D'UN PLASMIDE D'EXPRESSION RECOM-
BINANT CONTENANT LA SEQUENCE CODANT POUR p97. 



   La grande dimension du gène p97 a nécessité d'assembler les clones de   cAON   qui ont été obtenus par amorçage spécifique du mARN de mélanome au moyen de transcriptase reverse. On a   utilisé les   trois clones de cADN de   lambda-gtlO   (10a1, 1j1 et   ifi,   voir Fig. 2) couvrant la région codante ä partir du peptide signal en passant par la séquence d'ancrage sur la membrane. On a excisé le segment inséré de   p97   du clone lOal par digestion avec EcoRI et on a éliminé la séquence oligo(dG) à l'extrémité 5' du cADN 10a1 par digestion avec de 1'exonucléase III, engendrant le clone lOalb, avec un site HindIII ä 30 bp   ê   l'amont de la méthionine 
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 d'initiation de la préproteine de p97.

   Les segments insérés de p97 des trois clones de cADN lOalb, ljl et 2fl et le clone gnomique E7. 7 ont été épissés ensemble aux sites de restriction Pruil, SstI et EcoRI et insérés dans les sites HindIII-EcoRI du plasmide vecteur pEMBL18+   (Dente   et al., 1983, Nuc. Acid. Res. 11 : 1645-1655) comme illustré à la Fig. 2. La construction finale, p97b, contient le. segment inséré de 4,4 Kb de p97 dans le plasmide vecteur pEMBL18+ qu'on a utilisé pour transformer E. coli HB101. Le segment inséré dans   p97b   contient 30 bp de la région 5' non traduite de wARN de p97, la séquence codante entière et la région 3'non traduite, unies par un site HindIII en   5'et   un site EcoRI en   3'.   



   On a excisé le segment inséré de p97 de 

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 4,4 kilobases hors de p97b au moyen de HindIII et XI et on a garni les extrémités en utilisant le fragment Klenov   d'ADN polymérase   de E. coli. On a inséré le fragment à extrémités non adhesives dans l'unique site SmaI du vecteur d'expression de cADN eucaryote 1995. 12 
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 pUC13, qui est un ddrivd du vecteur mThGH-112 (Palmiter et   al.,   1983, Science 222 :   309-814)   qui a   été   acquis chez le Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle, Washington). Ce vecteur utilise un promoteur de la métallothionéine de souris pour exprimer les gènes étrangers dans les cellules eucaryotes.

   On a identifié le produit construit avec le fragment inséré de p97 dans la bonne orientation par une analyse de restriction et on l'a désigné par pMTp97b. 



   On a transfecté le plasmide recombinant dans des cellules LMTK- et on a sélectionné les cellules transfectées par croissance du milieu HAT. On a multiplié les clones recueillis dans la   holte   transfectée dans des plaques de microtitrage   a   96 cupules et on a dosé le p97 dans le milieu de culture usé et les produits de lyse cellulaire de   ? laques   faites en double suivant une technique immunoradiométrique à deux sites. 



  On a multiplie ces sous-clones qu'on a   reverifies.   On a fait croitre le clone   TKMp97-12 qui exprime   environ 4.   000. 000   de molecules de p97 par cellule, on en a fait l'induction par le cadmium et on l'a utilise comme source du p97 pour l'immunisation. 



  6.5. IMMUNISATION DE LA SOURIS AU MOYEN DES   PEPTIDES  
APPARENTES AU p97. 



   On a multipliA par culture les cellules   Temp97-12,   on a   opéré   l'induction par le cadmium et on les a   lys4es   (14,4 g) par incubation pendant 10 minutes sur de la glace avec 70 ml de   TNEN   (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100   mM,   EDTA 1 mM et NP-40 0, 5%). On a   ultracentrifuge   le produit de lyse à 200. 000 9 pendant 

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 45 minutes   ä     40C   et on a fait passer la moitié du produit de lyse sur une colonne d'immunoaffinité de 1 ml spécifique pour le p97 (fragment Fab de l'anti- 
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 corps 96. 5 couplé à du Sepharose). On a lave aoondam- ment l'imnunoadsorbant d'abord au TNEN et enfin avec du Tris-cl 20 mM de pH 6,8. 



   Pour l'immunisation, on a   melange   0,5 ml de la colonne d'immunoaffinité adsorbé préparé comme décrit   cri-dessus   avec 0,5 ml de Tris-HCl 20 mM de pH 6,8 et on a   émulsionné   avec 1 ml d'adjuvant complet de Freund. On a administré par voie intrapéritonéale   0,   4 ml de   l'emulsion a   chacune de quatre souris BLAB/c. On a donné une injection de rappel trois semaines plus tard aux souris avec un quart de cette quantité d'antigène dans de L'adjuvant incomplet de Freund. On a immunisé les souris témoins avec une colonne   d'immunoaffinité   d'un anticorps non apparenté au p97, mais qui a par ailleurs été traite de façon identique.

   On a saigné une semaine après le rappel quatre des souris immunisées au 
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 p97 et deux souris temoins'On a recherché les anticorps contre p97, par immunpprecipitation, dans les sérums issus de cellules du mélanome SK-MEL radio-iodé, suivie de SDS-PAGE. Les résultats ont montré que les sérums provenant des quatre souris immunisées au p97 font l'immunoprécipitation de   p97,   tandis que les sérums témoins sont négatifs. On a vérifié sur les serums aussi la présence des anticorps diriges contre le p97 par un test ELISA sur des cellules de mélanome SK-MEL 28 fixées par le glutaraldéhyde (20.000 cellules par cupule de   microtitrage).

   On a mis   les cellules fixées   A   incuber avec 0,05 ml de sérum dilué à 1/10,000 pendant une   heure d la temperature   ambiante, on les a lavées, puis on les a mìses à incuber pendant une heure à la température ambiante avec 0,05   ml   d'IgG antisouris de chèvre conjuguée avec de la peroxydase de raifort 

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 (Southern Biotech.). Les densites optiques (lues a 490 nm) des serums provenant des souris immunisées au p97 ont té de 0, 350, 0, 243, 0, 343 et 0, 200, alors que la densité optique des serums des témoins a été de 0, 036 et 0, 057. 



  6. 6. CARACTERISATION DE p97 6. 6. 1. STRUCTURE DE p97 
On a déterminé la structure da p97 d'après la séquence d'aminoacides du précurseur de p97 qui comprend quatre domaines structuraux. Comme le   residu   20 de la séquence du   precurseuc   correspond   ä     l'extrémiste   N-terminale du p97 à maturité, les résidus   d'amino-   acides 1-19 constituent probablement un peptide signal, conclusion qui est confirmée par sa longueur et son caractère hydrophobe. Les aminoacides 20-361 et 362-713 comprennent deux domaines homologues de 342 et 352 aminoacides. Des sites de glycosylation   N-lids   potentiels existent aux positions 38 et 135 dans le Romaine Nterminal et à la position 515 dans le domaine Cterminal.

   Enfin, on est porté   a   croire que les aminoacides 714-738, une region de résidus principalement non chargés et hydrophobes, ancrent le p97   A   la membrane cellulaire (Davis et   al., 1985,   J. Mol. Biol. 



  181 : 111-121) et peuvent   penetreer   jusque dans le cytoplasme. 



   La structure des domaines de p97 est confirmée par les experiences de digestion par les protéases. La digestion de p97 par la trypsine, la papaîne (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127 : 539-546) ou la thrombine donne un fragment   antigenique     glycosyle   d'environ 40. 000 daltons de poids moléculaire. On a purifia ce fragment à partir d'un produit de digestion du p97 par la thrombine qui a été marqué par voie métabolique à 35S-méthionine ou   35S-cystéine   et on   l'a sequence comme   décrit (Brown et   al.,   1982, Nature, London 296 : 171- 

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 173). Des residus de cystéine ont   ete   identifiés aux positions 7 et 17 et des résidus de méthionine aux positions 2 et 10.

   Des résultats identiques ont été obtenus avec le p97 intact et sont en complet accord avec la   séquence   N-terminale de p97 prédite à partir de la sequence de cADN. On a conclu que le fragment d'un poids moléculaire de 40.   000   daltons qui résiste à la protéase correspond au domaine N-terminal de p97. On n'a pas été à même d'isoler le domaine C-terminal de p97, peut-etre en raison de sa sensibilité   a   la protéase. 
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 r,. 6. 2. HOMOLOGIE DU p97 AVEC LA TRANSPERRINE. 



  Une investigation de la banque de séquences d'aminoacides de Protein Identification Resource (Release   5.     0 Dayhotf   et al., 1981, Nature, London 290 : 8) a   montré qua   le p97 est étonnamment homologue aux trois membres de la superfamille des transfer-   rines : la transferrine   du sérum humain, la lactotransferrine humaine et la transferrine de poule (37-39% d'homologie, voir Fig.   4).   Du fait que les transferrines   d'eire   humain et de poule présentent 50% d'homologie l'une avec l'autre, le p97 doit avoir divergé de la transferrine du sérum il y a plus de 300 millions d'années. Le p97 comprend 14 résidus de cystéine situés dans des positions homologues dans chaque domaine.

   La transferrine humaine contient toutes ces cystéines dans des positions homologues dans les deux domaines, tandis qu'il ne manque à la lactotransferrine humaine et ä la transferrine de poule que deux de ces résidus de cystéine (dans leurs domaines C-terminaux). Au contraire du p97, ces protéines contiennent 4 ä 7 résidus de cystéine supplémentaires dans leurs domaines Cterminaux qui n'ont pas de terme correspondant dans le domaine N-terminal. La transferrine humaine contient aussi 2 résidus de cystéine supplémentaires propres & 

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 son domaine N-terminal, Les positions de la plupart des disulfures dans la transferrine de serum humain, la lactotransferrine et la transferrine de poule ont été   déterminées   directement   (McGillivray   et al., 1932, Proc. Natl. Acad. Sei.

   USA 79 : 2504-2508 ; MetzBoutique et   al.,   1984, Eur. J. Biochem. 145 : 659-676 ; 
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 Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel) 39 : 135- 141 ; McGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 



  258: 3543-3S53; Williams et al., 1982, Eur. J. 



  *Biochem. 122 : 297-303 ; Williams, 1974, Biochem. J. 



  141 : 745-752). On peut donc prédire la sequence des 7 ponts disulfure dans chaque domaine de p97 (voir Fig.   5).   



   L'homologie des aminoacides entre les domaines 
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 de p97 (acquise à 46% par insertion de 7 manques de 9 résidus) est plus remarquable que celle observée dans la transferrine humaine   (43t - 16 manques,   45 résidus) ou la transferrine de poule (35%-12 manques, 49   rdsidus).   Etant donné la longue sequence d'homologie entre le p97 et la transferrine et les motifs de pliage apparemment semblables, sur base de la conservation des résidus de cystein, on   est port a   croire que si la structure aux rayons X   Åa   faible résolution actuelle   d   la   trqnsferrine   (Gorinsky et   al.,   1979, Nature, London 281 :

   157-158) pouvait âtre affinée, il serait possible   d'en déduire 1a structure tridimensionnelle   du   p97.   



    6. 6.   3. FONCTION DE   p97.   



   Son appartenance la superfamille des transferrines, son aptitude à fixer le fer (Brown et al., 1982, Nature, London   296 : 171-173)   et sa localisation chromosomique commune avec la transferrine et le récepteur de la transferrine (Plowman et al., 1983, 
 EMI58.3 
 Nature, London, 303 : 70-72 ; Yang et a1., 1984, Proc. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 2752-2756) confirment ensemble un role du p97 dans le transport du fer. La 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 cavité de fixation du fer de la transferrine contient, croit-on, 2 ou 3 tyrosines, 1 ou 2 histidines et une seule arginine fixant le bicarbonate (Metz-Boutigue et   al.. 1984, Bur. J. Biochem.   145 : 659-676). La conservation de ces aminoacides dans le p97 confirme son rôle propos4 dans le mdtabolisme du fer (voir Fig. 4).

   Comme le p97 est une molécule analogue à la transferrine et unie à la membrane et n'a pas d'homologie avec le récepteur de la transferrine (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311 : 675-678), son röle dans le métabolisme cellulaire du fer peut   di ffÅarer da cell1i   assuré par la transferrine circulante du serum et par le récepteur cellulaire pour la transferrine. L'expression du cADN de p97 clone dans des cellules eucaryotes permettra la vérification expérimentale de ses propriétés fonctionnelles. 



    6. 6. 4. CONCLUSION.   



   Sur base de ces données, il est évident qu'on a obtenu des cADN construits pour le p97 associ4 au mélanome et qu'ils peuvent   igtre exprimds   efficacement dans des cellules de mammifères pour produire de grandes quantités de p97   antigéniql1e.   
 EMI59.1 
 



  7. EXPRESSION DU p97 CLONE ET EPREUVE DU VACCIN. 



   Les expériences   détaillées   ici décrivent l'expression de la protdine p97 clonee et son épreuve comme vaccin. L'expression de la protéine p97 dans une forme sécrétée (par le clone cellulaire de souris transfect BIGSVp97a. 14} a permis de purifier en quantités de l'ordre du milligramme la protéine p97 en pleine longueur. La protéine sous forme purifiée a été utilisée pour des épreuves in vitro de l'induction de 
 EMI59.2 
 l'immunité cellulaire et pour des epreuves de son potentiel comme vaccin sous-unitaire. Le produit de gène p97 a été exprimé aussi a la surface cellulaire de cellules du mélanome de la souris en métastase, ce qui 

 <Desc/Clms Page number 60> 

 constitue un modèle pour l'épreuve de l'efficacité des 
 EMI60.1 
 vaccins A empêcher la croissance des tumeurs dans un Systeme syngenerique. 



  Le gène de p97 a et ins6r4 dans un virus recombinant vivant de la vaccine à utiliser comme com- position de vaccin capable d'engendrer une immunité cellulaire efficace. Le virus de la vaccine recombinant, Vp97a-NY, a fait l'objet d'une   évaluation   de son aptitude à induire l'immunité chez la souris, au cours 
 EMI60.2 
 de différents essais visant à démontrer l'immunité humorale et cellulaire. Au moyen du moddie de tumeur syngnerique chez la souris décrit ci-dessus, il a été   démontré   que le vaccin de virus recombinant   Vp97a-NY   exerce un effet protecteur contre une agression par des cellules tumorales.

   Le vaccin a exercé aussi un effet thérapeutique chez la souris cnntre des métastases pulmonaires existantes en croissance, ce qui est une propriété analogue   Åa   l'utilisation envisagée du vaccin pour induire une réponse antitumorale   immunotherapeu-   tique chez des êtres humains porteurs d'un mélanome. 



   En plus des études sur la souris, où il   n'existe que 911 d'homologie   entre le p97 de litre humain et la proteine homologue de la souris (sur les regions examinées jusqu'a present), le vaccin   Vp97a-NY   a   été essayé   aussi sur des primates non humains. I1 existe une homologie beaucouo plus étroite entre le p97 de l'être humain et la forme de la protéine propre au singe (comme   l'a   révélé la   réactivité   croisée au niveau de l'anticorps monoclonal). En raison de la difficulté potentielle de susciter une réponse immunitaire contre une protéine"self", le singe macaque étroitement 
 EMI60.3 
 apparenté a et < & choisi pour éprouver le pouvoir immuno- gène du vaccin Vp97a-NY.

   La vaccin de la vaccine recombinant a té essayé sur des singes et   s'est révélé   induire une immunité humorale dirigée contre la 

 <Desc/Clms Page number 61> 

 
 EMI61.1 
 protéine p97. Jusqu' présent, les singes n'ont mani- feste aucun symptôme notable d'effets secondaires défavorables dus à l'exposition au vaccin, après avoir reçu deux inoculations du virus recombinant vivant de la vaccine sur une période de six semaines. 



  7. 1. EXPRESSION DU PLASMIDS. 



   Le plasmide dont l'expression est contrôlée par sv2, le promoteur précoce de SV-40, a été construit à partir du plasmide de cADN cloné p97a, qui est semblable au plasmide p97b, sauf que la région   3'UT   entière est utilisée (Fig. 6). Tous les clones de cADN ont été initialement isoles de banques de   lambda-tao   au moyen d'éléments de liaison synthétiques EcoRI-dG (9-17) comme décrit précédemment. Les segments insérés ont été excisés par EcoRI et sous-clones dans pEMBL18+ en vue de la propagation et de la caractérisation ultérieures.

   Le clone   lOal   a été sous-cloné dans 
 EMI61.2 
 Ml3mpl8 et une forme réplicative a été mise A digdrer avec BamHI et Sphl, traitée brièvement avec de   l'exonu-   cléase III, rendue non adhesive par la nucléase   SI,   traitée suivant Klenow et   reepissee.   Différentes plaques ont été isolées et séquences, dont l'une avait séparé la queue dG et conservé 33 bp de l'extrémité 5' de la région non traduite de p97 insérée dans Le site Hindlll de M13mP18. Une forme replicative de ce sous- 
 EMI61.3 
 clone (lOala) a ete utilisée pour engendrer le cADM de p97 intact ; par ailleurs, tous les fragments ont été isolés des sous-clones du plasmide.

   Le fragment HindIII-PvuII de 550 bp provenant de lOala et le fragment PvuII-SalI de 735 bp provenant de Ijl ont été isoles sur gel d'agarose avec LMP et   épisses   dans pEMBL18+ aux sites Sall et HindIII, engendrant ainsi p5'p97. Le clone génomique E7. 7 de   pEMBL18+   a été mis à digérer complètement avec EcoRI et digérer partiellement avec SstI, et un fragment de 4,5   kb   a été séparé 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 par fractionnement dans de l'agarose avec LMP à 0,8%. 



  Ce fragment 3'de 4, 5 kb a été épissé avec le fragment SstI de 404 bp provenant de 2fl et le fragment BamHISstI de 535 bp provenant de Ijl dans   pEMBL18+   aux sites de Sall et EcoRI, engendrant ainsi p3'p97. Le fragment HindIII-SalI de 1285 bp de p5'p97 a été   épissé   ensuite dans p3'p97, engendrant ainsi   pp97a. Le   fragment EcoRIHindIII partiel de ce clone a été inséré dans pSV2neo (Southern et al., 1982, J. Mol. App.

   Genet.   1 : 327-   341) aux sites   Hindlfl   et EcoRI, en éliminant la region codant pour la néomycine et les séquences   épies-     surolpolya   de SV40 tout en conservant le promoteur précoce de SV40 et   l'accentuateur de   72 bp, la région 5'UT de p97 de 33 bp, toute la région codant pour p97, la région 3'UT et l'ADN   flanquant 3'sur 1, 4 kb. Le   plasmide resultant a été appelé   pSVp97a.   



   Le plasmide contrôlé par sv2 a été transfecté par précipitation avec du phosphate de calcium dans diverses lignées cellulaires eucaryotes et les cellules l'exprimant ont été clonées et sélectionnées par co- 
 EMI62.1 
 transfection d'un marqueur dominant selectionnable. A cet effet, on a mis en culture des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) dans du milieu Fl de HanK contenant 15% de serum foetal de veau (FCS), de la Lglutamine 4 mM, de la proline 1, 3 mM et des antibiotiques. Les cellules B16 ont   ete   mises en culture dans du milieu RPMI contenant 0,15% de bicarbonate et des cellules 1735 dans du milieu OMEN   (GibcO) 1   tous deux additionnes de 15% de FCS et d'antibiotiques.

   Les cellules ont été transfectées suivant une technique par le phosphate de calcium modifiée (Wigler M. et al., 1978, CeLl 14 : 725-731) au moyen de 20  g par plaque de   l'ADN   de plasmide pSV2p97a et de 0,5  g de pSV2DHFR ou de pSV2neo, respectivement. Tous les plasmides ont   été   linéarisés au site EcoRI. Des transfectants stables 

 <Desc/Clms Page number 63> 

 ont été sélectionnés au moyen d'un milieu exempt   d'hypoxanthine (HAT-)   pour les cellules CHO ou avec 0,   5 ruz   par ml de Généticine (G418, Gibco) pour les cellules   B16   et 1735. Les cellules survivantes ont commencéàformerdescoloniesvisiblesseptjours après la transfection et ont été recouvertes de filtres en   polyester steriles immobilises   par des perles de verre.

   Les filtres sont   festes   en place pendant cinq jours, ce qui a permis aux cellules de croltre dans la matrice du polyester, engendrant ainsi une réplique des colonies sur la plaque. Les filtres ont   ete   recueillis et utilisés pour un essai de fixation sur cellules vivantes avec l'anticorps monoclonal anti-p97 iodé. 10 gdel'anticorpsmonoclonalmarquéontétémisà incuber avec jusqu'à 20 filtres dans 10 ml   d   FCS à 40C pendant une heure. Les filtres ont été laves abondamment dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate   (PBS), sechs   et poses pour exposition sur du film XAR-5 jusqu'au lendemain à -70 C. Les filtres ont ensuite   dud   colores   avec'du bleu de methylene a 7%   pour visualiser les colonies cellulaires.

   Dans toutes les lignees cellulaires utilisées, sauf la lignée de souris B16, les cellules exprimantes contenaient la protéine p97 antigénique ci leur surface. 



   Dans le cas des cellules B16 transfectées, le p97 a été dégagé dans le milieu, ce qui est une observation particulière à ce type de cellule. La sécrétion du p97 a permis de purifier la proteine p97 en longueur complete A partir du milieu des cellules. Le clone   1316SVp97a. 14   a exprimé environ 4M par ml de p97 dans 
 EMI63.1 
 le milieu us6. Le p97 recombinant a été purifié ä partir du milieu usss du clone ss16SVp97a. l4 transfert qui dégage d'abondantes quanti tés d'antigène p97 dans le milieu. Les cellules ont dté maintenues i peu prs a la confluence (109 cellules) dans des flacons roulants 

 <Desc/Clms Page number 64> 

 de 350 cm2 avec un apport ininterrompu de petites quantités de milieu frais.

   Les cellules ont continue   a   dégager de l'antigène sans se détacher pendant plusieurs semaines, ce qui a permis une collecte ininterrompue et la concentration du milieu usé par congélation. La purification du p97 a été effectuée par chromatographie d'immunoaffinité avec du Sepharose uni à des fragments Fab de l'anticorps monoclonal 96. 5. A cet effet, on a fait s'écouler 3 titres de milieu usé sur une serie de trois colonnes de 30 ml. La première contenait 15 ml de Sephadex superfin G-25 (Pharmacia), la seconde contenait 20   ml   de Sepharose 4b (Pharmacia) et la troisième contenait 8 ml de Sepharose activé au bromure de cyanogène (Sigma) conjugué   ä   des fragments Fab d'anticorps monoclonal 96.5 (10 mg de protéine par ml de Sepharose).

   Par après, la colonne   d'affinite:a   été lavée abondamment avec du PSB froid et L'antigene en a été   dlué   avec 30 ml de citrate 0, 1 M de pH 5 et 30 ml de citrate 0, 1 M de pH 4. Ces conditions se sont révélées ne pas altérer l'iminunoréactivitd de   l'anti-   gene tout en assurant une elution complete de l'antigène ä partir de l'anticorps monoclonal 96. 5. Les deux éluats ont   été   neutralisés avec 3, 0 ml et 4,5   ml,   respectivement, de Tris 2 M de pH 8. L'eluat purifié a été concentré dans un appareil Amicon avec un filtre PM10 et lave avec deux volumes de 10 ml de PBS, conduisant   3   un rendement final de 4, 95 mg dans 4, 5   ml,   comme determine par dosage Bradford (Biorad).

   On a fait passer   15 jug   du produit sur SDS-PAGE (Fig. 7) qu'on a visualisé au bleu Coomassie et aussi par coloration à l'argent. Un immunodosage avec déterminant double (DDIA) (Brown et   al.,   1981, Proc. Natl.   Acad. Sci.   



  78 : 539) a apporte une confirmation indépendante de la quantité molaire de la protéine purifi4e. Des préparations t4moins ont   été   exécutées en parallele avec du 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 milieu usé provenant de la lignée cellulaire B16 parentale et n'ont pas révélé de protéine décelable. Au cours d'une preparation ultérieure, on a isole 30 mg de protéine p97 d'une pureté de 95% par purification à partir de 300 mg de fragments Fab d'anticorps monoclonal   96. 5 conjugue a du   Sepharose. La protéine p97 purifiée était immunogène et induisait une intense   r4ponse d'anticorps chez   les souris immunisées par la protdine, comme decrit dans la section 7.3. ci-après. 



  7.2. CONSTRUCTION ET EXPRESSION DU VIRUS RECOMBINANT
DE LA VACCINE POUR p97. 



   La région codante de p97 a   été     insérée   par coupure de p97a au moyen de HindIIt, conversion des extrémités en extrémités non adhésives et épissage dans le vecteur pGS-20 pour insertion dans la vaccine (MacKett et al., 1994, J. Virol. 49 : 857-864) qui avait été ouvert au site Smal. Le vecteur pGS-20 utilise le promoteur   7. 5   K et contient des séquences de flanquement provenant du gène de la thymidine-kinase (TK) de la vaccine. On a engendre un virus recombinant suivant le procédé de MacKett et al., supra, et on a isole le Vp97a-NY qui amène les cellules infectées à exprimer la protéine p97 de la dimension et de la glycosylation convenables   (Fig. 8).

   L'expression en   surface de p97 a été confirmée aussi dans des cellules infectées par le virus de p97 recombinant (tableau   I)   ci-après. 

 <Desc/Clms Page number 66> 

 



   TABLEAU l 
EXPRESSION DE p97 A LA SURFACE DE CELLULES DE SOURIS TRANSFECTEES ET DE CELLULES INFECTEES PAR
LE VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE1. 
 EMI66.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Type <SEP> de <SEP> cellule <SEP> Virus <SEP> utilisé <SEP> Molécules <SEP> de
<tb> pour <SEP> infecter <SEP> p97 <SEP> exprimées
<tb> les <SEP> cellules <SEP> par <SEP> cellule
<tb> M2SVp97a. <SEP> A <SEP> néant <SEP> 3. <SEP> 210. <SEP> 000
<tb> MEsvp97a. <SEP> E/F2 <SEP> néant <SEP> 434. <SEP> 000
<tb> M2 <SEP> parent <SEP> néant <SEP> 2. <SEP> 000
<tb> BSC <SEP> néant <SEP> 5. <SEP> 590
<tb> ase <SEP> vaccine <SEP> Vwt-NY <SEP> 5. <SEP> 220
<tb> BSC'vaccine <SEP> Vp97a-NY <SEP> 1. <SEP> 140. <SEP> 000
<tb> 
 rets cellules ont été traitées brièvement par la trypsine, larvées et introduites par aliquotes dans des tubes contenant   103 jusqu'à 104   ou
105 cellules.

   Des   cellales suppldtives   non expri- mantes ont été introduites dans les tubes conte- nant les cellules les moins nombreuses, de façon qu'un total de 105 cellules soit utilisé par tube.
On a fait incuber 1 x 106 coups par minute d'anti- corps monoclonal 95. 5 iodé (123 ng) dans un volume total de 50  l avec les cellules pendant
60 minutes sur glace. On a lavé les cellules et on les a centrifugées quatre fois dans du PBS   addi-   tionné de 10% de sérum foetal de veau, puis on les remises en suspension et comptées dans un compteur gamma Micromedic 4/600plus. 



  (-)signifieinférieurà. 
 EMI66.2 
 



  7. 3. LE VIRUS RSCOMBIANT DE LA VACCINE POUR p97 EST IMMUNOGENE CHEZ LA SOURIS. 



  L'inoculation de souris au moyen de Vp97a-NY a engendré une puissante réponse   d'immunité   humorale. Les souris ont été immunisées une fois, ont reçu un rappel 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 à quatre semaines et ont été saignées à cinq semaines. 



  Les titres ont   étá   mesurés par ELISA sur des plaques recouvertes d'antigène avec 1a protéine A conjuguée   ä   de la peroxydase raifort comme réactif de détection. 



  Les résultats ont   été   convertis en équivalents d'anticorps monoclonal par comparaison avec une courbe étalon pour ELISA, les liaisons étant établies au moyen de l'anticorps monoclonal 133.2 anti-p97. Les résultats ont   révélé   une forte induction d'anticorps sérique (Fig. 9). L'immunité cellulaire a été détectée par une épreuve de proliferation in vitro avec la protéine p97 purifiée comme antigene stimulant (Tableau II). 

 <Desc/Clms Page number 68> 

 
 EMI68.1 
 



  TABLEAU 11 EPREUVE DE PROLIFERATION DE CELLULES OE LA RATE DE LA SOURIS&commat; Antigene stimulant Indice de Indice de prolifération de prolifération cellules de la rate de cellules   itimunises par   le témoins de recombinant Vp97 la rate 
 EMI68.2 
 
<tb> 
<tb> Con <SEP> A
<tb> (10 <SEP> ug <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 71 <SEP> 50
<tb> Protéine <SEP> p97
<tb> (3 <SEP>  g <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 27 <SEP> 2
<tb> (10 <SEP> ug <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 43 <SEP> 2
<tb> (20 <SEP>  g <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 56 <SEP> 2
<tb> (SO <SEP> ? <SEP> a <SEP> par <SEP> mi) <SEP> 44 <SEP> 3
<tb> Virus <SEP> de <SEP> la
<tb> vaccine <SEP> inactivé
<tb> par <SEP> UV
<tb> (107 <SEP> ufp <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 91 <SEP> 2
<tb> Cellules <SEP> tumorales
<tb> syngénériques
<tb> irradies <SEP> transfect4es <SEP> par <SEP> p97 <SEP> (104)

   <SEP> 86 <SEP> 2
<tb> Cellules <SEP> tumorales
<tb> parentales <SEP> irradiées
<tb> (104) <SEP> 3 <SEP> 1
<tb> 
 1 Les cellules de la rate ont été recueillies sur des souris inoculées par scarification ä la queue avec 107 ufp de virus recombinant Vp97a-NY, ayant reçu un mois plus tard un rappel avec la même dose et tuées une semaine par après. Des celluLes natives de la rate ont été utilisées comme témoins dans l'expérience. On amis 105 cellules en culture par cupule dans des plaques à 96 cupules à 

 <Desc/Clms Page number 69> 

 fond rond dans 0,22 ml de milieu RPMI additionné de 0, 5% de serum de souris normale, de   pdnicil-   line/streptomycine, de glutamine, de bicarbonate et de 2-mercaptoéthanol 2,5 x   10-5   M.

   Les cultures ont été marquées par impulsions pendant six heures au quatrième jour au moyen de 25  Ci par cupule de   thymidine     tritiee (New   England Nuclear), puis ont été   récoltées   dans un collecteur da cellules PHD et comptées au moyen   d'Optifluor   dans un compteur
Beckman LS 3801. Les indices de proliferation ont été calculés en divisant les nombres moyens de coups par minute de cupules prises par quatre stimulées au moyen de chaque antigene par le nombre moyen de coups par minute du témoin (le milieu). 



   Les résultats présentés au tableau II montrent que les lymphocytes T sont proliférants en réponse   a     Ld   protéine antigénique p97. 



   Pour évaluer si les cellules coopérantes sont stimulées aussi par le virus recombinant dans les cellules de la rate provenant, de souris immunisées, on a stimulé les cellules in vitro et on a dose dans les liquides surnageants la production de   l'interleukine-2     (IL-2),   qui est un facteur de lymphocytes T coopérants. Des cellules de la rate ont été mises en culture après prélèvement sur des souris immunisées deux fois préalablement par le virus Vp97a-NY recombinant ou la vaccine d'origine.

   On   a mis d   incuber 105 cellules pendant 48 heures dans 0, 2 ml d'un milieu identique à celui utilisé pour les épreuves de prolifération, dans des plaques à 96 cupules à fond rond, en la présence et en l'absence de   l'antigne stimulant.   Les liquides surnageants ont   été   recueillis, rassembles pour quatre cupules et congelés avant le dosage de   l'IL-2. Le   dosage de   l'IL-2   a utilisé 104 cellules CTLL de la 

 <Desc/Clms Page number 70> 

 lignée des lymphocytes T de souris privées   d'IL-   incubées dans chaque cupule avec des dilutions diverses du liquide surnageant   ä   doser avec du milieu de Click, pris en triple.

   Une courbe d'étalonnage a été établie avec l'IL-2 recombinant acquis chez   Genentech,   CA. Les cellules CTLL ont été marquées par impulsions au moyen de thymidine suivant la technique d'épreuve de prolifération habituelle au cours des six dernières heures d'une incubation de 24 heures, puis ont été récoltées et   comptées comme ddcrit a   propos des épreuves de prolifération. Les résultats rassemblés au tableau III montrent que la production d'IL-2 par les cellules de la rate chez les souris immunisées par le virus de la vaccine p97 recombinant est stimulée in vitro par le   p@7.   



   TABLEAU III
STIMULATION DE LA PRODUCTION D'IL-2 PAR LES
CELLULES DE LA RATE   p97-IMMUNISEES.   
 EMI70.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Immunogène <SEP> pour <SEP> Stimulus <SEP> UnitEs <SEP> d'IL-2
<tb> la <SEP> vaccination <SEP> in <SEP> vitro <SEP> produites
<tb> Vp97a-NY <SEP> protéine <SEP> p97
<tb> (20, <SEP> Mg <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 4, <SEP> 4
<tb> Vp97a-NY <SEP> Milieu <SEP> 0,25
<tb> Vwt-NU <SEP> Protéine <SEP> p97
<tb> (20 <SEP> fI3 <SEP> par <SEP> ml) <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Vwt-NY <SEP> Milieu <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> 
 
De plus, on a mesuré une réponse d'hypersensibilité de type différé par épreuve de gonflement du coussinet plantaire chez des souris inoculées par Vp97a-NY. On a inoculé à cinq souris (souche   C3H/Hen)   par groupe, par scarification à la queue, du virus de la vaccine de souche d'origine ou recombinant.

   Six 

 <Desc/Clms Page number 71> 

 jours plus tard, on a   agresse   la patte arrière de chaque souris par inoculation de 20   PU   de PBS ou de   20    l de cellules dans du PBS (5 x 105 cellules par souris). On a mesuré le coussinet plantaire 24 heures plus tard, en opérant au double insu et en utilisant un micromètre de Fowler. On a soustrait   l'6paisseur   du coussinet plantaire ayant reçu l'injection de PBS de l'épaisseur mesurée à la patte   d'épreuve da   chaque souris et on a calculé les moyennes et les écarts-types pour l'augmentation de gonflement du coussinet plantaire.

   Les résultats rassemblés au tableau IV montrent l'induction d'une réponse d'hypersensibilité de type   différé   spécifique de p97 chez les souris immunisées par le virus recombinant de la vaccine p97. 



   TABLEAU IV
GONFLEMENT DU COUSSINET PLANTAIRE SPECIFIQUE
OE L'ANTIGENE CHEZ LES SOURIS P97-IMMUNISEES. 
 EMI71.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Immunogène <SEP> pour <SEP> Antigène <SEP> agressant <SEP> Gonflement <SEP> du
<tb> la <SEP> vaccination. <SEP> coussinet
<tb> (mm <SEP> x <SEP> 10-2)
<tb> Vp97a-NY <SEP> Cellules <SEP> tumorales <SEP> 40,3 <SEP> (+ <SEP> 6, <SEP> 3)
<tb> syngénériques
<tb> transfectées <SEP> par <SEP> p97
<tb> Vp97a-NY <SEP> Cellules <SEP> tumorales <SEP> 3,0 <SEP> (¯ <SEP> 2, <SEP> 8)
<tb> syngénériques
<tb> parentales
<tb> Vwt-NY <SEP> Cellules <SEP> tumorales <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> (+ <SEP> 2, <SEP> 3)
<tb> syngénériques
<tb> transfectées <SEP> par <SEP> p97
<tb> Vwt-NY <SEP> Cellules <SEP> tumorales <SEP> 5,5 <SEP> (¯ <SEP> 5,0)
<tb> syngnriques
<tb> parentérales
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 72> 

 7.4. PROTECTION ET THERAPIE AU MOYES DE VIRUS DE LA
VACCINE p97 DANS UN MODELE SUR TUMEUR DE SOURIS. 



   Afin   d'évaluer l'dfficacité   de La vaccination, on a vaccine des souris suivant   différentes   protocoles en utilisant le virus de la vaccine recombinant p97 conforme à l'invention et on les a agressées ensuite au moyen de cellules tumorales syngénériques transfectées par p97 (M2SVp97a.   2E).   A cet effet, on a immunisé les souris avec du virus de la vaccine vivant recombinant Vp97a-NY ou avec la souche parentale d'origine (Vwt-NY) par scarification a la queue, ou bien avec   zog   de protéine p97 purifiée ou 5 x 106 cellules tumorales M2- 
 EMI72.1 
 Kl 735 irradiées, par voie intraperitonale < dans de l'adjuvant de Freund complet.

   On a effectue une agression au moyen de cellules tumorales par voie intraveineuse deux semaines après La dernière vaccination en   injectant M2SVp97a. 2E,   qui est un clone de cellules tumorales métastatiques   prepare   à partir de   M2-K1735   (mélanome de souris modèle) par transfection avec La séquence codant pour le p97. humain contenue dans un plasmide d'expression sous contrôle du promoteur précoce de SV40. On a sélectionné une   variété   de clones qui expriment et celui utilisé pour l'agression tumorale, le clone M2SVp97a. 2E, exprime un niveau moyen de p97, environ   400. 000 molécules   par cellule ou l'équivalent de la densité de l'antigène p97 du mélanome humain.

   On a utilisé deux doses d'agression tumorale par voie intraveineuse, 5 x 105 ou 1 x 105 cellules, qu'on a injectées dans la veine de la queue de souris C3H/Hen   syngneriques.   On      sacrifié les souris 16 jours après l'agression tumorale et on a   prdleve   les poumons. Une souris a   été   comptée comme positive s'il y avait des tumeurs visibles à l'oeil nu dans les poumons colorés à l'encre de Chine. Les résultats sont rassem-   bles   au tableau V. 

 <Desc/Clms Page number 73> 

 
 EMI73.1 
 



  TABLEAU V AGRESSION DE SOURIS VACCINEES AU MOYEN DE CELLULES DE MELANOMM SYNGENERIQUES TRANSFECTEES PAR p97. 
 EMI73.2 
 
<tb> 
<tb> 



  Vaccin <SEP> Nombre <SEP> Dose <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> d <SEP> muni- <SEP> cellules <SEP> avec <SEP> métastase
<tb> sations <SEP> d'agression <SEP> pulmonaire
<tb> évidente
<tb> Vp97a-NY <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 1/5
<tb> Vp97a-NY <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 2/4
<tb> Cellules <SEP> de
<tb> mélanome
<tb> syngénériques
<tb> irradiées <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 0/4
<tb> V...

   <SEP> "t <SEP> -NY <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 9/10
<tb> Proteine <SEP> p97 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 3/3
<tb> Vp97a-NY <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 0/1
<tb> Vp97a-NY <SEP> 1 <SEP> 1x <SEP> 105 <SEP> 0/4
<tb> Néant <SEP> 0 <SEP> i-x <SEP> 105 <SEP> 5/6
<tb> 
 
 EMI73.3 
 Les résultats présentés au tableau V demon-   trant   qu'il y a eu un effet protecteur considérable avec deux immunisations par Vp97a,NY, bien qu'aucun effet protecteur n'ait été observé avec le vaccin de protéine p97 purifiée (malgré les titres en anticorps extrêmement   élevés   atteints). L'aptitude du virus recombinant à provoquer l'immunité cellulaire peut être responsable de l'immunité protectrice contre la tumeur. 



   Au cours d'un thérapeutique expérimentale, on a inoculé ä des souris une faible dose de cellules tumorales exprimant p97 et deux jours plus tard, on leur a   inoculé La vaccin   de la vaccine recombinant. On a agressé les souris avec 105 ou 104 cellules tumorales exprimant p97 (M2SVp97a. E) par voie intraveineuse. Deux 

 <Desc/Clms Page number 74> 

 jours plus tard, on a   inocu16   aux souris par scarifi- cation à la queue soit Vp97a-NY, soit Vwt-NY. On a répété les inoculations hebdomadaires par scarification à la queue et on a noté la survie des souris. Les résultats rassemblés à la Fig. 10 indiquent l'effet thérapeutique de la vaccination par le virus de   1a   vaccine p97 recombinant chez des souris porteuses de métastasespulmonaires. 



  7. 5. VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANT p97 COMME 
IMMUNOGèNE CHEZ LE MACAQUE. 



   On a scarifié deux singes Macaca   fasicularis   (macaque) au moyen soit de 2 x 103 unités formant plage de lyse (ufp) de vaccine recombinante   Vp97a-NY,   soit de   la rnême   dose de vaccine de la souche d'origine. Deux semaines plus tard, on a dose les sérums par ELISA pour établir le titre en vaccine et   pro7.   Les résultats rassemblés au tableau VI démontrent que des anticorps tumoraux contre p97 ont été décelables deux semaines après l'inoculation unique par Vp97a-NY. 



   TABLEAU, VI    TITRE EN ANTICORPS DU SERUM CHEZ DES SINGES INOCULES PAR LA VACCINE.   



  Immunogène/semaines Titre contre la Anti-p97   vaccine (dilution (/jLg par ml du serum avec d'equivalents   deux fois le fond d'anticorps continu) monoclonal) 
 EMI74.1 
 
<tb> 
<tb> Vp97a-NY <SEP> ! <SEP> semaine <SEP> 0 <SEP> 1/20 <SEP> 0, <SEP> 54
<tb> Vp97a-NY/semaine <SEP> 2 <SEP> 1/2000 <SEP> 6, <SEP> 54
<tb> Vwt-NY/semaine <SEP> 0 <SEP> 1/20 <SEP> 0,50
<tb> Vwt-NY/semaine <SEP> 2 <SEP> 1/2000 <SEP> 0, <SEP> 34
<tb> 
 8. DEPOT DES MICRO-ORGANISMES. 



   La souche   d'E.   col. i ci-après portant le 

 <Desc/Clms Page number 75> 

 plasmide indiqué a   été     déposée   ä l'ATCC, Rockville, MD, 
 EMI75.1 
 et a reçu le numéro d 'accès suivant 
 EMI75.2 
 
<tb> 
<tb> Souche <SEP> d'E. <SEP> coli <SEP> Plasmide <SEP> Numéro <SEP> d'accès
<tb> E. <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> p97b <SEP> 53. <SEP> 403
<tb> 
 
 EMI75.3 
 Le virus de la vaccine recombinant ci-après a été déposé à l'ATCC, Rockville, MD, et a reçu le numéro d'accès suivant : 
 EMI75.4 
 
<tb> 
<tb> Virus <SEP> Numero <SEP> d'acces
<tb> Vp97a-NY <SEP> VR <SEP> 2159
<tb> 
 Les lignées cellulaires   ci-après port. ant   les 
 EMI75.5 
 plasmides indiqués ont t déposes & l'ATCC, Rockville, mo, et ont reçu leg numéros d'accès suivants :

   
 EMI75.6 
 
<tb> 
<tb> Lignde <SEP> cellulaire <SEP> Plasmide <SEP> Numéro <SEP> d'accès
<tb> TKMp97-12 <SEP> pMTp97b <SEP> CRL <SEP> 8985
<tb> (Cellule <SEP> de <SEP> souris)
<tb> B16SVp97a. <SEP> 14 <SEP> pSVp97a <SEP> CRL <SEP> 9304
<tb> (Cellule <SEP> de <SEP> mélanome
<tb> de <SEP> souris)
<tb> 
 
Le cadre de la présente invention n'est pas à limiter aux micro-organismes et cellules déposés du fait que la forme de réalisation déposée est conçue comme illustration unique d'un aspect de l'invention et que des micro-organismes ou cellules qui sont fonction-   nellement   équivalents entrent dans le cadre de 1'invention. En effet, différentes modifications A l'invention, en plus de celles illustrées et décrites ici, sont évidentes pour le spécialiste   d'après la   description ci-dessus et les dessins annexés.

   Ces 

 <Desc/Clms Page number 76> 

 modifications sont conçues comme tombant dans le cadre des revendications ci-après. 



   11 convient   d'observsr aussi   que toutes les dimensions en paires de bases indiquées pour les nucléotides sont approximatives et sont citées pour les besoins de la description.

Claims (1)

1. EMI77.1

   R Z V Z N 0 1 C A T 1 0 N 3 RSVEMOICATIONS 1.- Peptide ou protéine antigénique sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il est apparenté à l'antigene p97 associé au mélanome.

   2.- Peptide ou protéine suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a une séquence d'amino- acides comprenant la séquence d'aminoacides en substance telle qu'illustre a la Fig. 3, ou une partie antigénique quelconque de celle-ci.

   3.- Peptide ou protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le peptide ou 1 protéine a été purifie a partir d'une cellule cultivée contenant une séquence de nucléotides qui code pour le peptide ou protéine et qui est sous le contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui régule l'expression du gène de façon que le peptide ou protéine soit exprime par la cellule cultivée.

   4.-Peptide ou protéine suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule cultivée comprend un micro-organisme.

   5.-Peptide ou proteine suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme comprend une bacterie. EMI77.2

   6.-Peptide ou proteine suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme comprend une levure.

   7.- Peptide ou protéine suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule cultivée comprend une lignée cellulaire d'animal.

   8.- Peptide ou proteine suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la cellule cultivée comprend une lignée cellulaire d'insecte.

   9.-peptide ou protéine suivant l'une quelconque des revendications l et 2, caractérisé en ce que <Desc/Clms Page number 78> le peptide ou proteine a été synthétisé chimiquement.

   10.-Virus recombinant, caractérisé en ce que son génome comprend une sequence de nucléotides codant pour un peptide ou protéine antigenique apparenté ä l'antigène p97 associé au mélanome, ou une partie antigenique de celui-ci, qui est sous le contröle d'une seconde sequence de nucléotides qui régule l'expression du gene de façon qu'un peptide ou protéine apparenté à l'antigene p97 associé au mélanome soit exprimé dans une cellule infectée par le virus.

   11.-Virus suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la sequence de nucléotides codant pour un peptide ou protéine antigenique apparenté à l'antigene p97 associé au mélanome comprend la sequence de nucléotides en substance telle qu'illustrée à 1a Fig. 3, ou une partie quelconque de celle-ci codant pour un peptide ou une proteine antigenique.

   12.- Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un virus A enveloppe.

   13. - Virus suivant. La revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend un virus de la vaccine.

   14.- Virus suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend le virus Vp97a-NY tel que déposé avec le numero ATCC et d'acces VR 2159, ou bien un mutant, recombinant ou dérivé de ce virus par génie génétique.

   15.- Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un virus nu.

   16.- Virus suivant la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un adenovirus.

   17.- Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il <Desc/Clms Page number 79> comprend un virus de la polyhedrose nucléaire.

   18. - Virus suivant 1a revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend un baculovirus.

   19.- Virus suivant l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il comprend un bactériophage.

   20.-Virus suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend un phage lambda.

   21.-Composition de vaccin sous-unitaire, caractérisée en ce que son immunogène comprend une dose efficace du peptide ou protéine suivant l'une quelconque des revendications l a 9 en melange avec un excipient pharmaceutique.

   22.-Composition de vaccin de virus vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend le virus recombinant suivant l'une quelconque des revendications 10 à 20 dont le virus est infectieux sans provoquer de maladie chez un höte vacciner.

   23.-Composition de vaccin de virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant suivant l'une quelconque des revendications 10 a 20 dans un ét non infectieux en melange avec un excipient pharmaceutique.

   24.-ADN recombiant vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend p97b.

   25.- Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il contient l'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 24.

   26.- Bactérie, caractérisée en ce qu'elle EMI79.1 contient l'AON recombinant vecteur suivant la revendication 24.

   2"7. - Bactérie suivant la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle comprend Escherichia coli tel que déposé avec le numéro ATCC et d'acces attribue 53403, ou bien un mutant, recombinant ou <Desc/Clms Page number 80> dérivé de cette bactérie par génie génétique.

   28.- ADN recombinant vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend pMTp97b.

   29. - Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu'elle contient l'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 28.

   30.- Lignée cellulaire suivant la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle comprend TKMp97-12 telle que déposée avec le numero ATCC et d'accès attribué CRL 8985, ou bien un mutant, recombinant ou derive de cette lignée par génie génétique.

   31.- ADN recombinant vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend pSVp97a.

   32. - Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu'elle contient l'ADN recombinant vecteur suivant la revendication 30.

   33. - Lignée cellulaire suivant la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle comprend B16SVp97a. 14 teile que déposée avec le numéro ATCC et d'acces attribue CRL 9304, ou. bien un mutant, recombinant ou derive de cette lignée par genie génétique.