NL8700285A

NL8700285A - Vaccinpreparaten.

Info

Publication number: NL8700285A
Application number: NL8700285A
Authority: NL
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1986-02-07
Filing date: 1987-02-06
Publication date: 1987-09-01
Also published as: FI870501A; IE59597B1; SE8700466D0; HUT43107A; HU209144B; DK63287A; FI94836B; IE870319L; JP2664673B2; IT8719291A0; NZ219192A; DK63287D0; GR870195B; FI94836C; NO178931C; JPH09135692A; PT84255B; SE506024C2; BE1000175A3; DE3703702C2

Description

VO 9013 -1-- # <£

Vaccinpreparaten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op vaccinpreparaten die een immuunrespons kunnen induceren waardoor melanomacellen in een gevaccineerd individu selectief worden vernietigd. Aldus wordt een pep-5 tide of proteïne samenhangend met een melanoma-gebonden antigeen in grote hoeveelheden via recombinant DNA-technieken en/of door cehmische-synthetische methoden geprodμceerd. Het peptide of proteïne van de onderhavige uitvinding kan als een immunogeen in een vaccinpreparaat worden toegepast. In bepaalde uitvoeringsvormen waarbij het peptide of IQ. proteïne in samenhang met een melanoma-verbonden antigeen tot uitdrukking wordt gebracht door een recombinantvirus, kan het recombinant-virus zelf als een immunogeen in een vaccinpreparaat worden toegepast.

De uitvinding voorziet tevens in werkwijzen waarin het gebruik in recombinant DNA-technieken alsmede chemische synthesemethoden 15 zijn omvat waardoor de produktie van peptiden of proteïnen die samenhangen met het melanoma-verbonden antigeen in grote hoeveelheden mogelijk is.

De uitvinding wordt bij wijze van voorbeeld geïllustreerd door toepassing als immunogenen van peptiden samenhangend met p97, een mono-20 meer celoppervlak sialoglycoproteïne met een schijnbaar molecuulgewicht van iets minder dan 97.000 dalton dat een celoppervlakcomponent van melanomacellen is.

2. Achtergrond van de uitvinding.

2.1. Tumor-verbonden antigenen.

25 Door werk net experimentele dieren, in het bijzonder knaagdieren, is aangetoond dat de meeste door oncogene virussen geïnduceerde tumoren antigenen gecodeerd door het virale genoom tot ejqoressie brengen en dat immunisatie met deze antigenen tot afstoting van een latere besmetting van door hetzelfde virus geïnduceerde tumorcellen kan leiden. Hoewel 30 veel van dit werk met laboratoriumstammen van virussen, zoals SV40, polyoma virus en Friend, Moloney of Rauscher murine leukemie virussen is verricht, zijn horizontale en verticale transmissie van oncogene virussen in de natuur gedemonstreerd. Er is nu inderdaad een commercieel vaccin tegen virus-geïnduceerde feline leukemie en sarcoma be-35 schikbaar.

In tegenstelling daarmede is geen virale etiologie van de meeste humane kankersoorten gedemonstreerd. Opvallende uitzonderingen zijn het 8700285 -2-.

** t hepatitusvirus (hepatoma), herpes simplex virus (cerviaal carcinoom), en Epstein Barr virus (nasofaryngeale carcinoom). Gedurende de laatste twee decennia is er echter vastgesteld dat sommige humane tumorcellen tumor-antigenen tot expressie brengen, dat wil zeggen antigenen die de tumor-5 cellen onderscheiden van hun normale cellulaire tegenhangers. Sommige patiënten vertonen een via de cel overgebrachte of humorale immuunrespons tegen dergelijke antigenen (Hellstrom et al., 1968, Nature, 220:1352; Morton et al., 1968 Science 162: 1279-1281; Shiku et al., 1976, J. Exp. Med. 144: 873-881). Sommige van de doelen van deze immuunrespons zijn 10 oncofoetale of differentiatie antigenen die door het humane genoom zijn gecodeerd. (Hellstrom et al., 1979, Int. J. Cancer 6: 356-351).

Tot voor zeer kort was de moleculaire aard van de tumorantigenen onbekend en was de graad van tumorspecificiteit van de immunologische reacties onduidelijk. Pogingen om deze informatie te benutten voor het 15 ontwikkelen van diagnostische kankerbepalingen of kankertherapieën zijn grotendeels zonder succes geweest. Aangezien spontane tumorregressies uitzonderlijk zeldzaam zijn, kan men tevens concluderen dat de immuun-responsies die in vitro zijn gedemonstreerd in vivo niet effectief waren; hoewel bijvoorbeeld antilichamen en lymfocyten afkomstig van een kanker-20 patiënt effectief kunnen zijn wat betreft het doen doden van tumorcellen in vitro heeft de immuunrespons van dezelfde kankerpatiënt geen effect in vivo.

De invoering door Kohier en Milstein van de monoklonale anti-lichaamtechniek (1975, Nature 256:495-497) heeft tot een intensief onder-25. zoek naar humane tumorantigenen geleid, aangezien dit het middel leverde om dergelijke antigenen te karakteriseren zowel op het moleculaire niveau als wat de specificiteit betreft (Hellstrom en Brown, 1979, In "The Antigens", M. Sela, uitg. Academie Press, Vol. V:l-66). Gedurende de laatste verschillende jaren is een groot aantal met tumor samenhan-30 gende antigenen beschreven, waarvan de meeste zijn vastgelegd door muize-monoklonale antilichamen, Reisfeld en Sell, uitg. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Viology,

New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, biz. 1 - 609. Hoewel vrijwel alle antigenen die doed zijn gekenmerkt oncofoetale of 35 differentiatie-antigenen blijken te zijn, en hun specificteit voor tumoren kwantitatief in plaats van kwalitatief is gebleken, zijn sommige antigenen voldoende specifiek ten opzichte van neoplastische versus 8700285 i £ -3- - normale cellen (in het algemeen overeenkomende met een factor van 10 tot 1000 maal) dat zij als potentiële doelen voor het identificeren van tumorcellen voor therapie kunnen worden gebruikt. Humane monoklonale antilichamen ten opzichte van tumorantigenen zijn reeds verkregen 5 (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030). Dit ondersteunt de reeds eerder genoemde bewijzen dat sommige kankerpatiënten een immuunreactie ten opzichte van hm tumoren ontwikkelen.

Meer dan de helft van de tumor-verbonden celoppervlak antigenen die tot dusver zijn geïdentificeerd zijn proteïnen of glycoprotelnen ^0 die door het humane genoom zijn gecodeerd (in plaats van door endogene of exogene virussen), waarbij de rest glycolipiden zijn, afkomstig uit de abnormale expressie of regulatie van glycosyltransferases.

2.2. Met melanoma samenhangend p97 antigeen.

Het p97 antigeen is een met tumor-samenhangend antigeen dat eerst 15 in humaan melanoma werd geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118; Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2183-2187). Het p97 antigeen is intensief bestudeerd wat betreft zijn expressie in normale neoplastische 20 weefsels en het is in de meeste humane melanoma en in bepaalde foetale weefsels aanwezig, maar wordt slechts in sporenhoeveelheden in normale volwassenweefsels aangetroffen (Brown êt al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543;

Carrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511-515). p97 is als een doel 25 voor het diagnostisch afbeelden van melanoma's in humaan klinische onderzoeken gebruikt (Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 2101-2114).

p97 is een monomeer celoppervlak sialoglycoproteïne, met een schijnbaar molecuulgewicht (MW)als gemeten door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelektroforese(SDS-PAGE) van iets minder dan 97.000 dal-3Q ton. Monoklonale antilichamen hebben drie vastgelegde hoofdantigene plaatsen die aan een stabiel 40.000 dalton tryptisch fragment aanwezig zijn (Brown et al., 1981, J. Immunol, 127: 539-546); de volledige volgorde van p97 is echter nog niet gerapporteerd. Ten minste twee andere onafhankelijk gekarakteriseerde met humane melanoma samenhangende antigenen,gp95 35 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118) en gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35:73-80) blijken identiek te zijn aan p97 na analyse volgens sequentiële immunoprecipitatie.

870 028.5 -4- - > t

De N-eindstandige aminozuurvolgorde van p97 is homoloog aan trans-ferrine en evenals transferrine bindt p97 ijzer (Brown et al., 1982,Nature Londen, 296: 171-173). Door analyse van somatische celhybriden en in situ hybridisatie is aangetoond dat het p97 gen,evenals de genen voor trans-5 ferrine en transferrinereceptor, zich bevindt in het chromosomale gebied 3q21 - 3q29 (Plowman et al., 1983, Nature, Londen 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756). Door deze waarnemingen wordt gesuggereerd dat p97 een rol speelt in het ij zermetabolis-me.

10 2.3. Kankervaccins.

Studies bij experimentele dieren, gewoonlijk muizen, hebben aangetoond dat de immunisatie met levende of dode kankercellen tot afstoting van een volgende besmetting met levende kankercellen kan leiden.Pogingen tot immuniseren met celvrij materiaal zijn in het algemeen succesvol ge-15 weest, maar er zijn toch sommige successen vermeld. [Voor een overzicht zie Hellstrom en Brown (1979) in The Antigens, M. Sela uitgever, Academie Press band V: 1 - 66). In vele gevallen blijken de doelantigenen die verantwoordelijk zijn voor de beschermende effecten viraal te zijn gecodeerd maar in vele gevallen is de aard van het antigeen dat een be-20 schermende immuunrespons oproept onbekend.

Studies bij mensen zijn veel moeilijker en de effectiviteit van de kankervaccins staat ter discussie, ondanks dat sommige successen zijn vermeld. In vele gevallen bestonden de vaccinpreparaten uit bestraalde tumorcellen of tumorcellen gedood door conatact met bepaalde chemische 25 middelen. Omdat zuivere met humane tumor-samenhangende antigenen niet beschikbaar waren, zijn er geen rapporten betreffende hun gebruik in vaccins.

Een belangrijk theoretisch bezwaar ten opzichte van het voorgestelde gebruik van kankervaccins bij mensen is dat mensen die zijn 30 "gevaccineerd", bijvoorbeeld met gedode kankercellen of celvrije preparaten, immunologisch niet zullen reageren omdat de tumorantigenen, die de doelen van de’ immuunreactie zijn, hoewel slechts in sporenhoeveelheden, in sommige normale cellen aanwezig zijn en aldus door het immuunsysteem zullen worden ondervonden als "zichzelf", De meeste, zo 35 niet alle met tumor-samenhangende antigenen die in humane tumoren door monoklonale antilichamen zijn gedetecteerd zijn tevens in sommige normale weefsels aanwezig, en er is weinig bewijs dat kankerpatiënten 8700285 -5-.

* c hierop in vivo effectief reageren.. Er is bewijsmateriaal dat suppressor-cellen een belangrijke rol spelen bij het onderdrukkend reguleren van de immuunrespons op tumorantigenen (Nepom et al., 1983,.Experientia, 39: 235-242). Verder kan een suppressorcelrespons die door één stel tumor-5 antigenen wordt geïnduceerd inductie van een effectieve tumor-vemieti-gende respons van een ander stel tumorantigenen, die zelf geen suppressie zouden induceren, beletten. (Hellstrom et al., 1983, in Biomembranes, A. Nowotny uitg., Plenum Press, blz. 365-388).

2.4. Recombinant DNA technieken en vaccinia virus.

10 Het gebruik van recombinant DNA-technologie voor de produktie van subeenheid vaccins ter bescherming tegen infecties betreft het moleculaire doneren en tot expressie brengen in een geschikte vector van genetische informatie die codeert voor proteïnen die een immuunrespons tegen het proteïne in het gastheerdier kunnen oproepen. Onlangs is een nieuwe 15 benadering beschreven die potentieel bruikbaar is voor de produktie van subeenheid vaccins (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 7415-7419? Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; D. Panicali en E. Paoletti, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931). Deze benadering betreft de toepassing van vacciniavirus als een vector voor het tot 20 expressie brengen van vreemde genen die in zijn genoom zijn ingébracht.

Bij invoering in gastheerdieren, brengt het recombinant vacciniavirus het ingebrachte vreemde gen tot espressie en roept daardoor een gastheer immuunrespons ten opzichte van dergelijke genprodukten op. Aangezien levend recomninant vacciniavirus bruikbaar is als een vaccin 25 combineert deze benadering de voordelen van zowel subeenheid als levende vaccins.

Vacciniavirus bevat een lineaire dubbelstrengig DNA-genoom met bij benadering 187 kilobase paren en replicaten binnen het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Deze virussen bevatten een compleet trans-30 criptie enzymsysteem (met inbegrip van afsluitende, methylerende en poly-adenylerende enzymen) binnen de viruskem die noodzakelijk zijn voor virusinfectiviteit. Vacciniavirus transcriptie-regulerende volgordes (promotors) geven de mogelijkheid tot het inleiden van transcriptie door vaccinia RNA-polymerase maar niet door gastheercel RNA-polymerase.

35 De expressie van vreemd DNA in recombinant vacciniavirussen ver eist de ligatie van vacciniapromotors aan protelne-coderende DNA-volg-ordes van het vreemde gen. Plasmidevectors, ook insertievectors ge- 8700285 -6- .

* £ noemd, zijn opgebouwd om chimere genen in vacciniavirus in te brengen. Eén type van insertievector is samengesteld uit: (a) een vacciniaviruspromotor met inbegrip van de transcriptie inlei-dingsplaats; 5 (b) verschillende unieke restrictie endonuclease klonerende plaatsen die stroomafwaarts van de transcriptiestartplaats voor insertie van vreemde DNA-fragmenten zijn geplaatst; (c) niet-essentiële vacciniavirus DNA (zoals het TK-gen)dat de promotor en kloneringsplaatsen flankeert die de insertie van het chimere gen 10· in het homolege niet-essentiële gebied van het virusgenoom dirigeren; en (d) een bacteriële oorsprong van replicatie en een antibiotische resistentie merkstof voor replicatie en selectie in _E. coli.

Voorbeelden van dergelijke vectoren worden beschreven door Mackett 15 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864).

Recombinant vacciniavirussen worden geproduceerd door transfectie van recombinante bacteriële insertieplasmiden die het vreemde gen bevatten in cellen die van de toren zijn geïnfecteerd met vacciniavirus. Homologe recombinatie vindt met de geïnfecteerde cellen plaats en resul-20 teert in de insertie van vreemd gen in het virale genoom. De geïnfecteerde cellen kunnen worden uitgeselecteerd met immunogische technieken, DNA-plaque hybridisatie of genetische selectie op recombinantvirussen die vervolgens kunnen worden geïsoleerd. Deze vaccinia-recombinanten behouden hun essentiële functies en infectiviteit en kunnen worden op-25 gebouwd om bij benadering 35 kilobasen vreemd DNA te herbergen.

Vreemde genexpressie kan men detecteren door enzymatische of immunologische analyse (bijvoorbeeld immunoprecipitatie, radio-immuno-ana-lyse of "immunoblotting"). In de natuur voorkomende membraanglycoprote-inen die uit recombinant vaccinia-geïnfecteerde cellen zijn geproduceerd 30 zijn geglycosyleerd en kunnen naar het celoppervlak worden getransporteerd. Men kan hoge expressie niveaus bereiken door sterke promotors te gebruiken of door veelvoudige kopieën van een enkel gen te kloneren.

3. Samenvatting van de uitvinding.

Er worden vaccinpreparaten beschreven die bruikbaar zijn voor 35 het induceren van een immuunrespons waardoor op selectieve wijze melano-macellen in het gevaccineerde individu worden vernietigd. Meer in het bijzonder omvatten de vaccinpreparaten van de onderhavige uitvinding een 8700285 -7- - immunogeen dat een immuunrespons gericht tegen een melanoma-geassocieerd antigeen, zoals het melanoma-geassocieerde p97 antigeen induceert. Volgens de uitvinding zijn een aantal vacc inpreparaten mogelijk. Het im-munogeen van een "subeenheidvaccin" van de onderhavige uitvinding omvat 5 bijvoorbeeld een peptide of proteïne samenhangend met p97, dat met een geschikt adjuvans kan worden samengesteld. Dergelijke peptiden of proteïnen omvatten aminazuurvoIgordes die uit de gehele of een deel van de aminozuurvolgorde van p97 zijn afgeleid, in hoofdzaak als geschetst in figuur 3, met inbegrip van maar niet beperkt tot gewijzigde aminozuur-10 volgordes waarin functioneel equivalente aminozuurresten in de plaats komen van resten binnen de volgorde die resulteren in een stille verandering, en/of gemodificeerde of verwerkte aminozuurvolgordes,zoals bijvoorbeeld geglycosyleerde aminozuurvolgordes, gefosforyleerde aminozuurvolgordes of chemisch gemodificeerde aminozuurvolgordes. Hierna zullen de 15 peptiden of proteïnen van de onderhavige uitvinding die samenhangen met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen hetzij gewijzigd, ongewijzigd, gemodificeerd of ongemodificeerd worden aangeduid als "met p97 samenhangende peptiden". Wanneer het met p97 samenhangende peptide een hapteen is {dat wil zeggen antigenisch maar niet immunogenisch) kan het hapteen 20 worden geconjugeerd met een dragermolecuul dat immunogeniciteit verleent.

De met p97 samenhangende peptiden van de uitvinding kunnen met recombinant DNA-technieken en/of chemische synthetische methoden worden geproduceerd. Wanneer per p97 samenhangende peptiden chemisch worden gesynthetiseerd kunnen dergelijke synthetische met p97 samenhangende 25 peptiden die aminozuurvolgordes omvatten die zijn afgeleid uit gebieden van p97 waarvan verwacht wordt dat zij antigenisch zijn (Hopp en Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828). Wanneer de met p97 samenhangende peptiden van de onderhavige uitvinding worden geproduceerd met behulp van recombinant DNA-technieken, wordt een nucleotidevolgorde 30 die codeert.voor het geheel of een deel van p97 ingebracht in een recombinant expressievector. zoals een virus of een plasmide, die in een geschikte gastheer de expressie van een met p97 samenhangend peptide kan dirigeren, dat uit het kweekmedium kan worden gezuiverd. De ingebrachte nucleotidevolgorde is afgeleid van het geheel of delen van de p97 volg-35 orde nagenoeg zoals geschetst in figuur 3 met inbegrip van maar niet beperkt tot nucleotidevolgordes waarin functioneel equivalente nucleotide-codons in de plaats komen van codons binnen de volgorde die resulteert 3700285 '* ΐ -8-.

in een stille verandering; met andere woorden verschillende codons die coderen voor hetzelfde aminozuur of het functionele equivalent daarvan kunnen worden gesubstitueerd binnen de volgorde geschetst in figuur 3. Wanneer een plasmide expressievector wordt toegepast heeft er één die 5 geschikt is voor expressie in eukaryotische cellen de voorkeur, maar een prokaryotische expressievector is tevens bruikbaar.

In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding waarin de expressievector een recombinant virus is, kan een vaccin worden samengesteld als een viraal vaccin, in welk geval het immunogeen het recombinant 10'· virus omvat dat een met p97 samenhangend peptide tot uitdrukking brengt. Afhankelijk van de aard van het recombinant virus toegepast als het immunogeen, kan hetzij een geïnactiveerd virusvaccin, of een levend virus-vaccin worden samengesteld. Een geschikte immunisatie met de vaccin-preparaten van de onderhavige uitvinding kan resulteren in de oproeping 15 van een immuunrespons, die leidt tot de vernietiging van melanomacellen in het geïmmuniseerde subject.

De uitvinding beschrijft tevens een systeem waarin het vaccin-preparaat kan worden onderzocht en schetst hoe de proef dient te worden uitgevoerd. De vaccinpreparaten kunnen bijvoorbeeld op hun effect worden 20 geëvalueerd in diermodellen, in het begin knaagdieren, dan in niet-humane primaten en tenslotte bij mensen, bij voorkeur bij patiënten die in remissie zijn maar met een hoge waarschijnlijkheid van recurrentie door micrometastase.

4. Korte samenvatting van de figuren.

25 Figuur 1 stelt een autoradiogram van de celvrije translatiepro dukten van p97 mRNA gescheiden door SDS-PAGE voor. In figuur IA betekent rij 1 de translatieprodukten van p97 verrijkt mRNA terwijl rij 2 de translatieprodukten van niet-verrijkt mRNA voorstelt, elk afgeleid uit 0,5 microliter van totale translatieprodukten van 5 ng mRNA. In figuur 30 1b betekent rij 1 de translatieprodukten van p97 verrijkt mRNA terwijl rij 2 de translatieprodukten van niet-verrijkt mRNA voorstelt, elk afgeleid uit 5 microliter translatieprodukten van 5 ng mRNA immuno-geprecipiteerd met anti-p97 serum.

Figuur 2 is een schematische voorstelling van een structuur van 35 p97 mRNA. De rangschikking van het coderingsgebied (uit de signaalvolg-orde naar de ankervolgorde) en het niet-coderende gebied (3'ÜT) alsmede de gedupliceerde domeinstructuur van de p97 voorloper (open staaf) is 8700285 * *.

-9-- aangegeven. De locaties van de verschillende restrictie-enzymherken-ningsvolgordes zijn boven het mRNA aangegeven. De relatieve plaatsen van vier cDNA klonen zijn beneden de mKNA structuur aangegeven. Het cDNA kloon p97-3a2fl (3a2fl) werd geïsoleerd uit een cDNA-bank waarin 5 de cDNA's waren overgeschreven op oligo(T)gestarte p97-verrijkte mRNA's en gekloneerd in pBR322; terwijl daarentegen cDNA klonen p97-2fl (2fl), p97-lj1 (Ijl) en p97-10al (lOal) werden geïsoleerd door de cDNA synthese te starten met oligonucleotiden die coderen voor p97 exonvolgordes en de verkregen CDNA fragmenten in lambda-gtlO te kloneren. Figuur 2A is een 10 schematische voorstelling van genoomklonen B 15, H 17, B 6.6 en B 7:7, die in lambda L 47.1 werden gekloneerd.

Figuur 3 geeft een voorstelling van de nucleotidevolgorde van humaan p97 voorloper cDNA en zijn daaruit afgeleide aminozuurvolgorde.

De N-eindsrandige aminozuurresten die eerder zijn bepaald door proteïne 15 volgordebepaling waren identiek aan die voorspeld uit de nucleotidevolgorde (aminozuurrest nrs. 21 - 30). De potentiële glycosyleringsplaatsen bij aminozuurresten 38, 135 en 515 (open staaf) en het membraan anker-gebied bij de C-eindplaats (vaste staaf) zijn aangegeven. Een polyadeny-leringssignaal (AATAAA aangegeven in een hokje) werd op plaats 3847 ge-20 detecteerd, hetgeen 50 baseparen stroomopwaarts van een polygeadenyleerd stuk is.

Figuur 4 geeft een voorstelling van eèn vergelijking van de voorspelde aminozuurvolgordes van de p97 voorloper en die van humaan sero-transferrine (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. OSA 81: 2752-25 2756; Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121). Geconserveerde resten zijn in hokjes aangegeven. Tyrosine, histidine en arginineresten die betrokken zijn in de ijzerbinding van transferrine (Mertz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) worden door sterretjes (X) aangegeven.

30 Figuur 5 is een schematische voorstelling van een twee-dimensio- naal model van de structuur van p97 gebaseerd op de aanwezigheid van cysteïneresten die zijn geconserveerd tussen de transferrine super-familieleden. De drie potentiële glycosyleringsplaatsen zijn aangegeven door sterretjes (x). Het hydrofobe membraan verankeringsdomein ziet men 35 bij de C-eindplaats van p97 (COOH).

Figuur 6 is een schematische voorstelling van de genetische structuur van de p97 cDNA klonen en het fragment van genoom kloon lambda E7.7 6700285 * -10- toegepast voor de opbouw van de p97 expressie vector; al sinede de pSV2p97a

expressievector. Er werden de volgende afkortingen gebruikt: E, EcoRI

P, PvuII; Sal, Sail; S, SstI; 6, BamHI.

Fifuur 7 toont de resultaten van gelelektroforese bij de karak- 5 terisering en immunozuivering van recombinant p97 proteïne. Een door transfectie verkregen CHO kloon (CH03+) en SK-MEL 28 humane melanoma- 35 cellen werden gekenmerkt met S-cysteïne in aanwezigheid (+TM) of afwezigheid (-TM) van tunicamycine (TM) . Cellen werden geënt op 100 mm2 platen en men liet deze bijna samenvloeien. Het medium werd verwijderd 1.0) en vervangen door 3 ml cysteine-vrij medium met of zonder toevoeging van 1 yg/ml tunicamycine. Na 30 minuten bij 37°C, werd 250 yCi per ml 35 L- S-cysteïne (1016 Ci per mmol; New England Nuclear) gedurende een verdere 6 uur toegevoegd. Het winnen van de cellen, het prepareren van -cellysaten, immunoprecipitatie en SDS-PAGE waren als boven beschreven.

15 Extracten werden met p97-specifieke antilichamen aan immunopresipitatie onderworpen en proteïnen werden geanalyseerd door SDS-polyacrylamidegel-elektroforese (SDS-PAGE).

(a) Coomassie blauw gekleurd SDS-polyacrylamidegel. Rij 1, proteïne merkstoffen; rij 2 immunogezuiverd p97 afgeschud van door transfec- 20 tie verkregen muize B16-cellen; rij 3, SK-MEL 28 cellen +TM; rij 4, SK-MEL 28 cellen -TM; rij 5, CHO3+ cellen +TM; rij 6, CJO3+ cellen -TM; (b) Autoradiogram van dezelfde· gel als in (a).

Figuur 8 toont de resultaten van een radio-immunoprecipitatie van 25 tot expressie gebracht p97 in door transfectie verkregen cellen of

Vp97a-NY geïnfecteerde cellen. BSC-cellen werden overnacht geïnfecteerd met wild type vacciniavirus of p97 recombinant vacciniavirus. Deze virussen of de door transfectie verkregen cellijn CHO-p97.A werden met 35 S-gemerkt metyonine en cysteine met of zonder tunicamycine bij 2 yg/ml 30 (Sigma) geïncubeerd. De cellen werden 6 uur later gelyseerd, neergeslagen met monoklonaal antilichaam 96,5 en door elektroforese over een 10 %'s polyacrylamidegel gescheiden. De gel werd overnacht aan auto-radiografie onderworpen. De tunicamycine-behandelde groep bevindt zich rechts van elke groep.

35- Figuur 9 schetst de serum antilichaamtiters in muizen geïmmuni- 6 seerd met p97 vaccins. Tp97 stelt vijf muizen geïmmuniseerd met 5 x 10 bestraalde M2svp97a.A cellen (door transfectie verkregen syngene tumor- 8700285 *· -11- cellen die oppervlak p97 tot expressie brengen) in compleet Freund's • adjuvans voor en gestimuleerd met hetzelfde aantal cellen in fosfaat- gebufferde pekel. p97 is een groep van vijf muizen geïmmuniseerd met 100 ug gezuiverd p97 proteïne in compleet Freund’s adjuvans en gestimu- 5 leerd met 50 ug waterig proteïne. Vp97 is een groep van vijf muizen ge- 7 immuniseerd en gestimuleerd met 10 plaque-vormende eenheden van Vp97a-NY door staartscarificatie.

Figuur 10 schetst het therapeutische effect van vaccinatie van met tumor besmette muizen met een recombinant p97 vacciniavirus 10 (Vp97a-NY). Muizen werden intraveneus besmet met 10^ of 104 p97 tot expressie brengende tumorcellen (M2SVp97.E). Twee dagen later werden muizen door staartscarificatie geïnoculeerd hetzij met Vp97a-NY of Vwt-NY. Wekelijkse inoculaties door staartscarificaties werd herhaald en de overleving van de muizen opgeschreven.

15 5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding is gericht op de produktie van vaccins voor de preventie of behandeling van melanoma. Deze is gebaseerd op de waarneming dat melanoma's met tumor-geassocieerde celoppervlak antigenen bezitten/ zoals het p97 antigeen, die in grotere hoeveelheden in de mel-20 anomacellen dan in normale weefsels aanwezig zijn. Volgens de onderhavige uitvinding worden peptiden of proteïnen samenhangend met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen (dat wil zeggen met p97 samenhangende peptiden) geproduceerd met behulp van recombinant DNA technieken en/of chemische synthetische technieken. De met p97 samenhangende peptiden van 25 de onderhavige uitvinding omvatten aminozuurvolgordes afgeleid uit het geheel van of delen van de arainozuurvolgorde van p97 nagenoeg als geschetst in figuur 3. Deze omvatten aminozuurvolgordes afgeleid uit figuur 3y die zijn gewijzigd door één of meer aminozuurresten binnen de volgorde te vervangen door een ander aminozuur met een soortgelijke 30 polariteit, dat werkt als een functioneel equivalent hetgeen aldus resulteert in een stille verandering. Substituten voor een aminozuur binnen de volgorde kunnen uit andere leden van de klasse waartoe de aminozuren behoren worden gekozen. De niet-polaire (hydrofobe) aminozuren omvatten bijvoorbeeld alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, fenyl-35 alanine, tryptofaan en methionine. De polaire neutrale aminozuren omvatten glycine, serine, threonine, cysteine,.thyrosine, asparagine en glutamine. Positief geladen (basische) aminozuren omvatten arginine, 8700285 -12- lysine en hystidine. De negatief geladen (zure) aminozuren omvatten asparaginezuur en glutaminezuur. Bovendien kunnen de met p97 samen- , hangende peptiden van de onderhavige uitvinding al of niet gewijzigd door substitutie van de aminozuurresten verder worden gemodificeerd 5 of verwerkt door glucosylering, fosforylering enz. of door chemische modificatie. Deze met p97 samenhangende peptiden zijn bruikbaar als im-munogenen in vaccinpreparaten die een immunorespons gericht tegen in de gevaccineerde patiënt aanwezige melanomacellen oproepen.

Volgens een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding worden 10 recombinant DNA-technieken toegepast voor het inbrengen van nucleotide-volgordes die coderen, voor het p97 antigeen in expressievectoren die de expressie van de met p97 samenhangende peptiden in geschikte gastheercellen zullen dirigeren. De nucleotidevolgordes die coderen voor het p97 antigeen omvatten nucleotidevolgordes afgeleid van het geheel of delen 15 van de p97 nucleotidevolgorde nagenoeg als geschetst in figuur 3. Vanwege de degeneratie van de DNA-code voor aminozuren (dat wil zeggen de meeste aminozuren kunnen door meer dan één codon worden gecodeerd) kunnen functioneel equivalente codons (dat wil zeggen verschillende codons die voor hetzelfde aminozuur of zijn functionele equivalent coderen) 20 binnen de p97 volgorde geschetst in figuur 3 worden gesubstitueerd, onder voorwaarde dat de substitutie in een stille verandering resulteert.

De expressievector-gastheercelsystemen die een nucleotidevolgorde, die codeert voor het geheel of een deel van p97 omvat, is bruikbaar voor het produceren van grote hoeveelheden zuivere p97 samenhangende pepti-25 den in vitro, in welk geval de genprodukten uit de cellen in de kweek kunnen worden gezuiverd en toegepast als immunogenen in subeenheid vaccinpreparaten. De zuivering van het met p97 samenhangende peptide kan men uitvoeren met verschillende biochemische methoden, zoals immuno-affiniteitszuivering met monoklonale antilichamen. Tevens kan de zuive-30 ring van de met p97 samenhangende peptiden worden vergemakkelijkt door de DNA-volgordes, die coderen voor de met p97 samenhangende peptiden zodanig te modificeren dat de volgordes die verantwoordelijk zijn voor het verankeren van de proteïne in het plasmamembraan worden verwijderd maar toch de volgordes die verantwoordelijk zijn voor het transport van 35 het proteïne in het celmembraan niet worden verwijderd, zodat een afgeknot antigeenmolecuul door de gastheercel in het kweekmedium wordt afgegeven. In het geval van met p97 samenhangende peptiden geproduceerd door 8700235 i *- -13- prokaryotische cellen kan het tekort aan geschikte posttranslationele modificaties resulteren in een antigenisch inactief produkt, dat men zal moeten activeren door geschikte chemische of andere behandelingen.

In bepaalde uitvoeringsvormen waarbij de expressievector een 5 virus is kan het virus zelf als een vaccin worden samengesteld. In sommige gevallen kunnen geïnactiveerde recombinant virusvaccins worden bereikt. Wanneer de expressievector een infectieus recombinant virus is dat geen ziekte in de gastheer veroorzaakt kan hetzij een geïnactiveerd viraal vaccin- of een levend virusvaccinpreparaat dat voor een aanzien-10 lijke immuniteit zorgt worden samengesteld. Een bijzondere bruikbare expressievector voor dit doel is een recombinant vacciniavirus welke de met p97 samenhangende peptiden van de onderhavige uitvinding tot expressie brengt. Voor dit doel kan een nucleotidevolgorde die codeert voor het geheel of een deel van het p97 antigeen worden ingebracht 15 in een vacciniavirusvector die in staat is de expressie van de volgorde in een ceschikte gastheer te dirigeren. De uitvinding omvat de toepassing van andere virusexpressievectoren als vaccins, meer in het bijzonder adenovirussen.

In een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding kan 20 de gededuceerde aminozuurvolgorde van p97 worden onderzocht op volgordes met eigenschappen, in het bijzonder hydrofiliciteit, die voorspellend zijn voor de aanwezigheid van die volgorde bij het oppervlak van het proteïnemolecuul of van zijn waarschijnlijke antigeniciteit en/of immunogeniciteit. Deze met p97 samenhangende peptiden kunnen chemisch 25 worden bereid en toegepast als immunogenen in vaccinpreparaten.

De uitvinding voorziet tevens in een werkwijze voor het produceren van met p97 samenhangende peptiden die bruikbaar zijn voor doeleinden anders dan vaccinproduktie. Het met p97 samenhangende peptide is bruikbaar voor het immuniseren van dieren ter produktie van antisera 30 of monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor de melanomacellen van belang. Zij zijn bruikbaar als een component in een diagnostische analyse, of voor de affiniteits2uivering van radio-actief gemerkte met geneesmiddel gekoppelde of met toxine gekoppelde antilichamen die gebruikt worden voor de kankertherapie.

35 De uitvinding wordt gedemonstreerd door middel van voorbeelden waarin de opbouw van een op p97-gebaseerd vaccin tegen humaan melanoma wordt beschreven. De werkwijzen en de preparaten die hierin worden be- 8700285 f -14- schreven zijn echter niet beperkt tot de opbouw van vaccins met p97, maar zijn tevens bruikbaar voor andere met tumor-geassocieerde antigenen.

De uitvinding wordt terwille van een duidelijke beschrijving als volgt toegelicht: 5 (a) de nucleotide en aminozuurvolgorde van p97; (b) met p97 samenhangende peptiden bereid door chemische synthese-methoden; (c) met p97 samenhangende peptiden geproduceerd door expressievector-gastheersystemen; 10 (d) immunologische karakterisering van de met p97 samenhangende pep tiden ; en (e) samenstelling van vaccins.

5.1. Volgorde-analyse van het met melanoma-geassocieerd p97antigeen. De nucleotidevolgorde van het gen dat codeert voor p97 en zijn 15 afgeleide aminozuurvolgorde worden in figuur 3 geschetst. Functionele equivalente volgorden vallen binnen het kader van de onderhavige uitvinding. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot nucleotidevolgordes die bestaan uit alle of delen van de nucleotidevolgorde geschetst in figuur 3, die zijn gewijzigd door substitutie van verschillende codons die co-20 deren voor hetzelfde of het functioneel equivalent aminozuurresidu waardoor aldus een stilzwijgende verandering wordt geproduceerd alsmede aminozuurvolgordes die het gehele of delen van de aminozuurvolgorde ge-schets in figuur 3 omvatten, die zijn gewijzigd door de substitutie binnen de volgorde van functionele equivalente aminozuurresten, waardoor 25 aldus een stille verandering wordt geproduceerd en derivaten daarvan, die gemodificeerd of verwerkt zijn, bijvoorbeeld door glycosylering, fosforylering enz. of door andere chemische modificaties.

De subafdelingen hieronder beschrijven de strategie die werd toegepast voor het bepalen van de volgorde van p97 als geschets in fi-30 guur 3 alsmede andere technieken die bruikbaar zijn voor het bepalen van de volgorde van p97 of andere tumorantigenen die bruikbaar zijn in vaccin samen stellingen.

5.1.1. Identificatie en karakterisering van het met melanoma-geas- _socieerde p97 antigeen.___ 33 De activiteit en aminozuurvolgorde van het melanoma-geassocieerde p97 antigeen was niet bekend. Aldus werd identificatie van het p97 antigeen tot stand gebracht met behulp van monoklonale antilichamen gericht 8700285 5 * -15— tegen p97. Een aantal technieken is bruikbaar voor het vormen van mono-klonale antilichamen die specifiek zijn voor p97. Bijvoorbeeld kan de hybridomatechniek ontwikkeld door Kohier en Milstein (1975 , Nature 250: 495-497) als volgt worden toegepast: muizen of ratten worden ge-5 immuniseerd met humane melanomacellen en lymfocyten verzameld uit de geïmmuniseerde dieren worden met myelomacellen gefuseerd; naar keuze kunnen lymfocyten uit melanomapatiëntên worden gefuseerd met myelomacellen (Cote et al,, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45:951) of de techniek voor het produceren van mono-10 klonale antilichamen onder toepassing van Epstein-Barr virus (Cole et al., 1985, The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., biz. 77-96) is bruikbaar voor het vormen van monoklonale antilichaam gericht tegen p97. Steeds worden de verkregen hybridoma's uitgeselec-15 teerd voor de produktie van antilichamen die binden aan de melanomacellen maar niet binden aan normale cellen.

De monoklonale antilichamen die gericht zijn tegen p97 als boven beschreven zijn in een aantal methoden bruikbaar voor het vergemakkelijken van de identificatie, karakterisering, klonering en expressie 20 van nucleotidevolgordes, waardoor de produktie van peptiden en proteïnen, die samenhangen met het p97 antigeen,in grote hoeveelheden mogelijk is.

De monoklonale antilichamen kunnen bijvoorbeeld worden gebruik: voor het verder karakteriseren van het p97 antigeen door radio-actief merken van alle door de tumorcel gemaakte proteïnen, door immunoprecipitatie van 25 het turaorproteïne met het monoklonale antilichaam dat is gebruikt voor het identificeren van het p97 antigeen, en het fractioneren van de immuno-geprecipiteerde proteïnen door gelektroforese. Proteïne-antigenen worden geïdentificeerd als onderscheiden banden op het resulterende autoradiogram (Brown et al., 1980, J.Biol. Chem. 255: 4980-4983).

30 Tevens kunnen de tegen p97 gerichte monoklonale antilichamen worden gebruikt voor het vergemakkelijken van de klonering en wel als volgt: (a) voor het immuno-zuiveren van polysomen teneinde mRNA transcripten aanwezig in de melanomacellen die coderen voor het p97 antigeen te identificeren en te verkrijgen; 35 (b) voor het identificeren van klonen in een cDNA expressiebank die peptiden of proteïnen samenhangend met het p97 antigeen tot expressie brengen; 8700285 * g -16-:

Cc) voor het zuiveren van het p97 antigeen teneinde extra monoklonale antilichamen en antisera te bereiden- ten gebruike in de voorafgaande twee toepassingen of (d) voor het identificeren van cellen waarin het gen voor het p97 anti-5 geen door transfectie is geïntroduceerd.

De monoklonale antilichamen zijn tevens bruikbaar voor het vergemakkelijken van de structurele en immunogenische karakterisering van het p97 antigeen, met het doel van identificatie van extracellulaire en antigene domeinen van het molecuul en voor het zuiveren van het mole-10 cuul voor de aminozuurvolgorde-analyse (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Brown et al., 1982, Nature, Londen, 296: 171-173).

Een verdere karakterisering van p97 omvat de bepaling van cellulaire localisatie en het in kaart bregen van antigene determinanten en 15 functionele termijnen. Subcellulaire localisatie kan men tot stand brengen door immunofluorescentie microscopie en door cellulaire fractio-neringsexperimenten. Antigenen zoals p97, die op het celoppervlak aanwezig zijn, hebben de voorkeur voor de opbouw van het vaccin, hoewel intracellulaire antigenen ook bruikbaar zijn. Indien veelvoudige mono-20 klonale antilichamen beschikbaar zijn kunnen antigene determinanten in kaart worden gebracht door concurrentieproeven, waarbij elk antilichaam radio-actief wordt gemerkt en onderzocht op concurrentie met elk van de andere antilichamen. Domeinen van het molecuul zijn identificeerbaar door een beperkte afbraak met proteases gevolgd door SDS-PAGE. Tezamen 25 kan men met deze gegevens gebieden van het molecuul identificeren die het meest immunogeen zijn. Indien de monoklonale antilichamen zouden zijn verkregen door immunisatie met intacte cellen, dan zijn deze gebieden van het molecuul waarschijnlijk extracellulair en bruikbaar voor vaccinopbouw.

30 De aminozuurvolgorde-analyse geeft een ondubbelzinnige identifi catie van het proteïne en zijn verglijking met andere proteïnen is mogelijk (Brown et al., 1982, Nature, Londen, 296: 171-173). Indien het proteïne meer dan 50 aminozuurresten omvat kan het haalbaar zijn slechts een deel van de aminozuurvolgorde te bepalen, dikwijls het N-uiteinde.

35 Proteïne-antigeen voor de volgordebepaling van aminozuren kan worden gezuiverd uit cellysaten door immuno-affiniteitschromatografie met het monoklonale antilichaam. gevolgd door preparatieve SDS-PAGE. De N-eind- 8700285 -17- 1 * standige aminozuurvolgorde van het gezuiverde proteïne wordt dan vastgesteld door gebruik van een automatisch aminozuurvolgordebepalings-toestel, bij voorkeur een gasfasemachine voor de grootste gevoeligheid.

5.1.2. Identificatie, klonering en volgordebepaling van DNA dat 5 _codeert voor het melanoma geassocieerd p97 antigeen.

Eerdere kloneringsstudies hebben zich in hoofdzaak gericht op veel voorkomende proteïnen, zoals globine en ovalbumine, waarvan de mRNA's dikwijls 10 tot 50 % van het totale mRNA omvatten. Deze mRNA's kan men tot homogene toestand zuiveren door afmetingsfactionering en 10 zuivere cDNA sondes werden toegepast voor het uitselecteren van banken van enige honderden klonen door kdoniehybridisering.Voor proteïnen, waarvan de mRNA's 1 - 10 % van het totale mRNA bevatten, kan differentiële hybridisatie met twee cDNA sondes worden gebruikt, waarbij één van de cDNA sondes de volgorde van belang bevat en de ander een negatieve controle is.

15 Boodschapper RNA's die coderen voor proteïnen die weinig voorkomen, zoals tumor-geassocieerde antigenen, die bijvoorbeeld slechts 0,01 % van het cellulaire mRNA kunnen omvatten, zijn moeilijker te kloneren, omdat tienduizenden klonen moeten worden uitgeselecteerd en cDNA sondes geen specifiek hybridisatiesignaal zullen geven. Beide problemen kunnen wor-20 den verlicht door het mRNA met de volgorde van belang te verrijken.

Verschillende benaderingen, toegepast voor het kloneren van DNA dat codeert voor met humaan melanoma geassocieerd p97 antigeen, zijn hieronder beschreven. De resulterende klonen werden geanalyseerd teneinde een kloon of klonen te identificeren die het gehele coderingsgebied van 25 p97 omspanden. Van de p97 nucleotide inserties van de aldus geïdentifi ceerde klonen kunnen daarna volgens elke bekende methode de volgordes worden bepaald. De verschillende benaderingen worden in meer bijzonderheden hieronder beschreven.

(a) Isolering van mRNA door polysoom immunozuivering.

30 In deze techniek worden polysomen (die uit mRNA, ribosomen en ont staande polypeptide ketens bestaan) gezuiverd door immuno-affiniteits-chromatografie met antilichamen die antigene determinanten, die op de ontstaande ketens aanwezig zijn, herkennen. In vele gevallen herkennen monoklonale antilichamen, verkregen door immunisatie met intacte cellen 55 of celextracten de antigenen in hun natieve conformaties, maar zij behoeven niet geschikt te zijn voor polysoom immunozuivering, aangezien er een significante kans is dat de herkende antigenische determinanten v» ” - - Λ Λ .· .. * > * f -18- niet in de ontstaande ketens aanwesig zijn. Aangezien de translatie begint bij: het N-eindstuk van het polypeptide, zijn epitopen die dicht bij het C-eindstuk liggen waarschijnlijk in de veelvoud van de ontstaande ketens afwezig. Dit probleem wordt hetzij vermeden door gebruik 5 te maken van antilichamen die N-eindstandige epitopen herkennen of door polysomen te bereiden uit cellen die zijn behandeld met een proteïne-syntheseremstof, die terminatie blokkeert.

Een ernstiger probleem is dat rijpe proteïnen van de ontstaande ketens verschillen in verband met post-translatie modificaties. Dit 10 probleem is bijzonder scherp voor celoppervlakteproteïnen die veel intensiever worden gemodificeerd door verwijdering van de signaalpeptiden, additie van koolhydraatzijketens en vorming van disulfidebruggen. Indien een polyklonaal antiserum voor polysoom immunozuivering wordt gebruikt, zullen de verschillen in antigeniciteit tussen onstaande ketens en het 15 rijpe proteïne van weinig effect zijn aangezien gedurende de immunisatie het konijn of een ander dier niet alleen wordt blootgesteld aan het na-tieve proteïne maar ook te dele of geheel aan gedenatureerde vormen, in het bijzonder indien Freund's adjuvans wordt gebruikt. Zelfs indien deze antilichamen slechts een ondergeschikte fractie van de antilichaampopula-20 tie voorstellen kunnen er nog steeds voldoende aanwezig zijn om aan de ontstaande ketens te binden. Helaas kan de bereiding van een polyklonaal antiserum ten opzichte van een proteïne met gering voorkomen bijzonder moeilijk zijn. Hoewel een monoklonaal antilichaam bruikbaar is voor het zuiveren van het antigeen voor verdere immunisatie, levert elke gram ge-25 kweekte, cellen dikwijls slechts een microgram antigeen. Dit is voldoende voor het. immuniseren van verschillende muizen maar nauwelijk voldoende voor eert enkel konijn.

Een andere oplossing voor het probleem is een monoklonaal antilichaam te verkrijgen dat antigene determinanten die in ontstaande 30 ketens aanwezig zijn herkent door toepassing van gedenatureerd p97 antigeen als het immunogeen toegepast ter bereiding van het monoklonale antilichaam. In het voorbeeld van de onderhavige uitvinding was een groep monoklonale antilichamen aanwezig, die drie onderscheiden epitopen op het N-eindstandige 40.000 dalton molecuulgewichtsdomein van het p97 35 molecuul herkenden, waarbij een verzameling van monoklonale antilichamen elk met een verschillende specificteit is gebruikt in de hoop dat één of meer daarvan zou binden aan ontstaande ketens. De gekozen antilichamen 8700285 -¾ < -19- waren sterk specifiek voor p97, doordat elk daarvan door immunoprecipi-tatie een enkele band van p97 uit een radio-actief gemerkt geheel cel-lysaat gaf, terwijl zij hoge bindingsaffiniteiten hadden. Voor het klo-neringsproject zijn drie IgG2a antilichamen gekozen, één specifiek voor 5 elk van de drie epitopen. In het algemeen kan de kans op succes worden verhoogd door gebruik te maken van een aantal antilichamen ten opzichte van onderscheiden epitopen.

Bij gebruik van monoklonale antilichamen blijft de vraag bestaan hoe men kan voorspellen of een gegeven monoklonaal antilichaam 10 of een combinatie van antilichamen al of niet de ontstaande ketens zal herkennen en aldus geschikt is ten gebruike in polysoom immunozuivering.

In één benadering bepaalt men of het monoklonale antilichaam door immuno-precipitatie antgeen geeft, dat is vertaald in het reticulocyt lysaatsy-steem, berustend op de aanname dat het in vitro translatieprodukt, dat 15 niet is verwerkt, op de ontstaande ketens zal gelijken. Een andere benadering is te werk gegaan met de polysoom immunoprecipitatie op kleine schaal en daarna in vitro translatie te gebruiken ter bepaling of al of niet de mRNA soort van belang is verrijkt.

Wanneer de polysoom immunozuiveringstechniek wordt toegepast is 20 het belangrijk de zuivering te bewaken door de mRNA activiteit te meten.

Mën kan dit doen door het mRNA in een reticulocyt lysaatsysteem te vertalen en de translatieprodukten door SDS-PAGE te analyseren. Hoewel het tumor-geassocieerde antigeen een te geringe component van de translatieprodukten van niet verrijkt mRNA kan zijn om dit onder de honderden meer 25 overvloedige soorten waar te nemen, zal het toch detecteerbaar zijn in de translatieprodukten afgeleid van de verrijkte mRNA-monsters. Naar keuze kan het Xenopus oocyttranslatiesysteem worden gebruikt indien een gevoelige immuunanalyse beschikbaar is voor de detectie van het getrans-lateerde tumor-geassocieerde antigeen. Voor p97 werd voor dit doel een 30 zeer gevoelige dubbele determinant immuno-analyse (DDIA) waarbij gebruik wordt gemaakt van twee monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor twee verschillende epitopen van p97 toegepast.

Proteïne A gebonden aan sefarose is bruikbaar voor de polysoom-immunozuivering. Het proteïne A adsorbens heeft in deze procedure twee 35 toepassingen. De eerste is de zuivering van de monoklonale antilichamen uit de ruwe ascites vloeistoffen, waardoor verontreinigende ribonuclease activiteit wordt verwijderd. Het proteïne A adsorbens wordt daarna §700285 ** £' -20- tezamen met de gezuiverde antilichamen gebruikt voor de immunozuivêring van polysomen die de specifieke ontstaande keten dragen.

Translatie van het mENA in een reticulocyt lysaatsysteem maakt de biochemische karakterisering van het translatieprodukt alsmede een bepaling van de zuiverheid daarvan mogelijk.

5 (b) Oligonucleotide sondes.

Een andere methode die volgens deze uitvinding voor het kloneren van het cDNA dat codeert voor een tumor-geassocieerd antigeen zoals p97 bruikbaar is, is de bepaling van een gedeeltelijke of volledige aminozuur-volgorde van het antigeen en de synthese van een oligonucleotide sonde 10 ("probe") gebaseerd op de nucleotidevolgorde afgeleid uit de aminozuur-volgorde. Het oligonucleotide is dan bruikbaar als een starter voor cDNA synthese en als een sonde voor het uitselecteren van de resulterende cDNA bank. Aldus kan het melanoma-geassocieerde p97 proteïne geschikt uit lysaten van melanomacellen worden gezuiverd door affiniteitschroma-15 tografie met een specifiek monoklonaal antilichaam (Brown et al., 1982, Nature, Londen, 296: 171-173). Een nucleotidevolgorde die codeert voor een deel van de bepaalde aminozuurvolgorde wordt daarna gesynthetiseerd en is bruikbaar als een starter en/of sonde. Delen van de aminozuurvolgorde die aminozuurresten bevatten die worden gecodeerd door een enkel 20 codon of twee codons zijn het best voor dit doel geschikt. Eén benadering bestaat eruit een langere volgorde, typerend 25 - 80 nucleotiden te synthetiseren, die de meest waarschijnlijke coderingsvolgorde, gebaseerd op de bekende codongebruikfrequenties in mensen, voorstelt. De toepassing van twee synthetische oligonucleotiden, gebaseerd op ver-25 schillende delen van de aminozuurvolgorde vergemakkelijkt het uitsorteren doordat men voorbijgaande positieve hybrisatiesignalen kan identificeren. Naar keuze vergemakkelijkt tevens de toepassing van hybridisatie-omstandigheden die het effect van het GC-gehalte op het smeltpunt van DNA-hybriden minimaal maakt tevens het uitselecteren. Wanneer eenmaal 30 door deze methode een gedeeltelijke cDNA-kloon is verkregen is deze bruikbaar als een sonde om een cDNA-kloon met volledige lengte te verkrijgen.

(c) cDNA expressiebanken.

Er zijn klonerende vectoren ontwikkeld waarmee de expressie van 35 de cDNA insertie in bacteriën mogelijk is. Eén benadering die derhalve voor het verkrijgen van cDNA-klonen voor tumor-geassocieerde proteïnen zoals p97 bruikbaar is betreft het samenstellen van een cDNA-bank door 8700285 -ï % -21- omgekeerde transcriptie van mRNA (verrijkt of niet verrijkt) geïsoleerd uit melanomacellen als boven beschreven, onder gebruik van oligo(T)-nucleotide starters of de synthetische oligonucleotide sondes als boven beschreven en het uitselecteren van een dergelijke bank met een mono-5 klonaal antilichaam dat tegen het melanoma-geassocieerde p97 proteïne is gericht. Klonen die DNA dat codeert voor de epitopen herkent door het monoklonale antilichaam in de correcte oriëntatie en afleeskader bevatten zullen peptiden of proteïnen tot expressie brengen die samen-hangen met het melnoma-geassocieerde p97 proteïne en zij kunnen door het overbrengen van de proteïnen tot expressie gebracht door de klonen naar een nitrocellulosefilter en incubering van het filter met het antilichaam gevolgd door ontwikkeling met een gemerkt anti-immunoglobu-line reagens worden geïdentificeerd.

Een eventueel probleem is dat vele monoklonale antilichamen niet 15 iji staat zijn het proteïne dat door de bacteriën tot- expressie wordt gebracht te' herkennen, omdat in vele gevallen slechts een deel van het cDNA in de insertie aanwezig zal zijn en bacteriën, proteïnen niet op de wijze, zoals eukaryotische cellen dat doen, verwerken. Dit probleem is bijzonder scherp voor tumorceloppervlakprotelnen, die meer intensief 20 worden gemodificeerd door verwijdering van de signaalpeptiden, additie van koolhydraatzijketens en de vorming van disulfidebruggen. Het is derhalve soms noodzakelijk monoklonale antilichamen te vormen waarvan bekend is dat deze het gedenatureerde antigeen herkennen of polyspecifieke antisera te bereiden door immunisatie met gezuiverd antigeen.

25 Wanneer eenmaal een recombinant virus of plasmide, waarvan men aanneemt dat het een cDNA insertie afgeleid uit een melanoma-geassocieerd p97 antigeen bevat, is geïdentificeerd, kan de cDNA insertie worden gebruikt om extra banken uit te selecteren teneinde hetzij klonen met volledige lengte of anderszins een groep van klonen, die de volledige leng-30 te van het cDNA dat codeert voor p97 omspannen, te identificeren. De identiteit van het gekloneerde cDNA kan worden vastgesteld door volgorde-analyse en vergelijking van de afgeleide N-terminale aminozuurvolgorde met die bepaald door directe aminozuurvolgorde-analyse van het p97 proteïne.

(d) Genoomklonering.

35 De volgende methode maakt de klonering van DNA mogelijk met be hulp van een monoklonaal antilichaam dat gericht is tegen een antigene determinant, die alleen in het natieve proteïne aanwezig is en die niet 8700285 ^ έ -22- aanwezig is in de ontstaande ketens of in proteïne tot expressie gebracht in bacteriën. Voor dit doel wordt DNA afgeleid van de humane melanomacel in muize L-cellen door transfectie geïntroduceerd. Vervolgens worden muizecellen, die melanoma-geassocieerd p97 antigeen tot expressie 5 brengen, geïsoleerd hetzij met behulp van de fluorescentie-geactiveerde celsorteerinrichting of door de immunologische identificatie van kolonies die de met p97 samenhangende peptiden produceren onder toepassing van radio-actief gemerkte monoklonale antilichamen die tegen p97 zijn gericht voor de detectie van samenhangende peptiden op replica's van 1.0; kolonies overgebracht op polyesterdoekfliters. Verschillende aansluitende ronden van transfectie kunnen nodig zijn om niet samenhangende humane DNA volgordes te verwijderen. Een genoombank wordt daarna in een lambda-faagvector tot stand gebracht en uitgesorteerd op klonen die zich herhalende humane volgordes bevatten die in de intronen van de meeste 15 genen voorkomen. Wanneer eenmaal een genoomkloon is geïdentificeerd is deze bruikbaar als een hybridysatiesonde voor het identificeren van cDNA codering voor p97 bevatten.

5.2._Synthese van antigene fragmenten van het melanoma-geassocieerde _p97 antigeen en evaluatie van immunogeniciteit._ 20 Synthetische peptiden zijn bruikbaar als immunogenen voor het op roepen van een immuunrespons tegen het natieve proteïne dat een graad van bescherming tegen een aantal pathogenen kan leveren. Dergelijke pep-tidevolgordes worden uit de bekende aminozuurvolgorde van het proteïne antigeen uitgekozen door stukken van aminozuren te identificeren die 25 waarschijnlijk op het oppervlak van het proteïnemolecuul, in contact met het uitwendige medium, aanwezig zullen zijn. Dit wordt gewoonlijk tot stand gebracht door computeranalyse van de aminozuurvolgorde met behulp van vastgestelde hydropathie-parameters voor de aminozuren. Extra criteria zoals de voorspelde secundaire structuur of flexibiliteit zijn te-30 vens bruikbaar.

Aldus kunnen synthetische peptiden die 5-50 aminozuurresten van de met melanoma-geassocieerde p97 proteïnen bevatten op immunogeniciteit in experimentele dieren worden getest (gewoonlijk muizen of konijnen) . Dergelijke synthetische peptiden omvatten maar zijn niet beperkt 35 tot het geheel of een deel van de aminozuurvolgorde, nagenoeg als geschetst in figuur 3, met inbegrip van gewijzigde volgordes waarin functioneel equivalente aminozuurresten in de plaats komen van resten binnen 870 0 28 3 -23- de volgorde, hetgeen resulteert in een stille verandering en/of gemodificeerde of verwerkte volgordes, zoals geglycosyleerde volgordes, gefos-foryleerde volgordes etc., of chemisch gemodificeerde volgordes. Deze met p97 samenhangende peptiden worden hetzij alleen of gekoppeld met 5 een dragerprotelne, zoals keyhole limpet hemocyane (KLH) gekoppeld. In beide gevallen is het gebruik van een adjuvans facultatief, hoewel het de voorkeur heeft. De geïmmuniseerde dieren worden gestimuleerd en onderzocht op antilichamen gericht tegen het immuniserende peptide. Die met anti-peptide antilichamen worden onderzocht op antilichamen die binden 10 aan het natieve p97 proteïne. In het geval van tumor-geassocieerde anti-genen, zoals p97 is het tevens van belang een cellulaire immuunreactie te testen, bijvoorbeeld door te kijken naar vertraagd-type hypergevoeligheid (DTH), naar een antigeen gestimuleerde proliferatie in vitro, naar cytolytische T-cellen of tumorafstoting in een geschikt model. Een ge-15 schikt model zou een muizetumor zijn die het humane tumor-geassocieerde antigeen tot expressie zou brengen als gevolg van transfectie met een geschikte cDNA expressievectoropbouw.

Het doel is de identificatie van peptiden die een krachtige im-muunrespons gericht tegen het melanoma-geassocieerde p97 antigeen op-20 roepen. Wanneer eenmaal geïdentificeerd kunnen deze peptiden in grote hoeveelheden door chemische synthetische methoden, zoals in de techniek bekend, worden geproduceerd. Naar keuze kunnen de geïdentificeerde peptiden in grote hoeveelheden worden geproduceerd door de nucleotide volgordes die coderen voor dergelijke peptiden in expressievector-gastheer 25 celsystemen tot expressie te brengen.

5.3. Produktie van p97 samenhangende peptiden door expressie _vector-gastheersystemen._ ._-

Proteïnen en peptiden kunnen in grote hoeveelheden worden geproduceerd door nucleotiden coderende volgordes in een geschikte expres-30 sievector in te brengen, die op zijn beurt in geschikte gastheercellen wordt ingevoerd met inbegrip van maar niet beperkt tot bacteriën, gisten, insektencellen en zoogdiercellen. Hoewel bacteriële gastheren vele voordelen hebben, bezitten zij niet vele geschikte eukaryotische proteïnen en zijn zij minder geschikt dan eukaryotische cellen voor de expressie 35 van tumor-geassocieerde proteïnen. Recombinant proteïnen gevormd in bacteriën kunnen echter bruikbaar zijn voor de inductie van T-celrela-ties, aangezien dergelijke reacties naar wordt aangenomen vereist zijn 8700285 * t: -24- voor de beginnende afbraak van het proteïne antigeen.

Teneinde de met p97 samenhangende peptiden in een vector-gast-heersysteem tot expressie te brengen, worden nucleotidevolgordes die coderen voor het met melanoma-geassocieerde p97 antigeen of een deel 5 daarvan, in een geschikte expressievector ingebracht. Dergelijke nucleotidevolgordes omvatten maar zijn niet beperkt tot het geheel of een deel van de DNA-volgorde van p97, nagenoeg als geschetst in figuur 3, met inbegrip van gewijzigde volgordes waarin één of meer codons binnen de volgorde zijn vervangen door een codon die dezelfde of een functioneel 10 equivalente aminozuurrest codeert, hetgeen aldus resulteert in een neutrale of stille wijziging in de volgorde. De expressievector bevat de noodzakelijke elementen voor de transcriptie en de translatie van de ingebrachte proteïne-coderende volgorde. Deze elementen variëren wat hm sterkte en specificiteiten betreft. Afhankelijk van het toegepaste gast-15 heer- vectorsysteem kan elk van een aantal geschikte transcriptie- en translatie-elementen worden toegepast. Wanneer bijvoorbeeld wordt gekloneerd in zoogdiercelsystemen kunnen promotors, die uit het genoom van zoogdiercellen zijn geïsoleerd (bijvoorbeeld muizemetallothioninepromo-tor) of uit virussen die in deze cellen groeien (bijvoorbeeld vaccinia-20 virus 7,5K promotor) worden gebruikt. Promotors die door recombinant DNA of synthetische technieken zijn geproduceerd zijn tevens bruikbaar om transcriptie van de ingebrachte volgorde te leveren.

Tevens zijn specifieke initiëringssignalen vereist voor een efficiënte translatie van ingebrachte proteïnecoderingsvolgordes. Deze sig-25 nalen omvatten het ATG-initiatiecodon en de aangrenzende volgordes. In gevallen dat hetzij het gen of de cDNA-volgorde in een geschikte expressievector is ingebracht, behoeven geen extra translatieregelsignalen te worden gebruikt. In die gevallen dat slechts een deel van de coderende volgorde is ingebracht kan het echter nodig zijn exogene translatie-30 regelsignalen met inbegrip van het ATG-codon te voorzien. Het initiatie-codon moet verder ten opzichte van het afleeskader van de proteïnecoderingsvolgordes in fase zijn om translatie van de gehele insertie te verzekeren. Deze exogene translatiecontrolevolgordes en initiatiecodons kunnen uit diverse bronnen afkomstig zijn, zowel natuurlijke als syntheti-35 sche.

Elk van de methoden die aan de vakman bekend zijn voor de insertie van DNA-f ragmen ten in een vector zijn bruikbaar voor het opbouwen van 8700285

V

-25- expressievectoren die een chimeer gen, bestaande uit geschikte transcriptie- en translatiecontrolesignalen en de proteïne coderingvolgordes, bevatten. Deze methoden kunnen die toegepast bij in vitro recombinant DNA-1echnieken, synthetische technieken en in vivo recombinaties (gene-5 tische recombinatie) omvatten.

Expressievectoren omvatten maar zijn niet beperkt tot de volgende vectoren en derivaten: vacciniavirus, adenovirussen, insektenvirussen, gistvectoren, bacteriofaagvectoren en plasmide DND-vectoren. De klonering en de expressie van genen in bacteriële systemen is in de techniek 10 wel bekend. Wanneer bijvoorbeeld in een E. coli wordt gekloneerd kunnen zijn bacterifagen of plasmidepromotors, zoals de lac-promotor, de trp- promotor, recA-promotor, ribosomaal RNA-promotor, de P - en P -promotors

R L

van colifaag lambda en andere, met inbegrip van maar niet beperkt tot lacuv5,trp-lacuv5 (tac) hybridepromotor, ompF, bla, Ipp en dergelijke 15 worden gebruikt om hoge niveaus van transcriptie van aangrenzend DNA-seg-ment te dirigeren. Vanwege de verwerkingsverschillen tussen prokaryoti-sche en eukaryotische cellen heeft het meestal de voorkeur de met p97 samenhangende peptiden van de onderhavige uitvinding in eukaryotische cellen tot expressie te brengen. De best ingevoerde methoden voor het 20 tot expressie brengen van proteïnen in eukaryotische cellen zijn (a) invoering van het gen in de cel tezamen met een geneesmiddelresistent gen gevolgd door selectie met geneesmiddel, bij voorkeur onder verkrijging van versterking zoals met het dihydrofolaat reductase-methotrexaatsysteem; 25 (b) expressie van cDNA in een plasmidevector, dikwijls gebaseerd op pBR322, onder toepassing van een sterke eukaryotische promotor en andere regulatoire volgordes; (c) expressie van cDNA in een virale vector, dikwijls afgeleid uit SV4Q, opnieuw onder toepassing van sterke promotors, in dit geval een 30 SV40 promotor.

Recombinant plasmidevectoren worden dikwijls toegepast voor de produktie van cellijnen die het proteïne gedurende een laag tijdsverloop produceren, terwijl daarentegen SV40 vectoren dikwijls worden gebruikt om tijdelijke expressie te verkrijgen. Hoewel zoogdiercellen het meest 35 worden toegepast als gastheren, zijn tevens insektencellen en in sommige gevallen gistcellen bruikbaar. Sommige worden in meer bijzonderheden hieronder beschreven.

8700285 -26-

Teneinde een recombinant vacciniavirus, dat het melanoma-gesso-cieerde p97 antigeen tot expressie brengt, op te bouwen kan de cDNA-co-deringsvolgorde worden geligeerd aan de 7,5K promotor van vacciniavirus ter vorming van een chimeer gen. Dit chimere gen wordt geflankeerd door 5 extra vaccinia virale volgorde die homoloog is aan het virale thymidine' kinase gen, dat op de plasmide DNA-vector wordt gedragen. De opbouw van het chimere gen betreft de toepassing van zowel natuurlijke als synthetische regelsignalen voor transcriptie en translatie van de tumor-geas-socieerde antigeenvolgorde. Het chimere gen wordt dan in vacciniavirus 10 expressievectoren ingebracht via in vivo recombinatie tussen het homologe thymidine kinase gebied dat zowel op de plasmideveetor als het vacciniavirus genoom aanwezig is. Deze recombinant virussen die het chimere gen bevatten zijn in staat de expressie met de p97 samenhangende peptiden in een geïnfecteerde gastheer te dirigeren en zijn bruikbaar als compo-15 nenten van een vaccin.

In gevallen dat een adenovirus als een expressievector wordt toegepast wordt de DNA-volgorde van belang aan een adenovirustranscriptie/ translatie regelcomplex geligeerd, bijvoorbeeld de late promotor en de tripartiet eerste volgordes. Dit chimere gen wordt daarna in het adeno-20 virusgenoom door in vitro of in vivo recombinatie ingebracht. Insertie in een niet-essentieel gebied van het virale genoom (bijvoorbeeld gebied El of E3) resulteert in een recombinatievirus dat levend is en in staat tot expressie van het met p97 samenhangende peptide in geïnfecteerde gastheren. Momenteel bestaan er twee stammen van adenovirus (types 4 en 25 7) die als vaccin voor militair personeel zijn goedgekeurd en gebruikt.

Zij zijn de hoofdcandidaten ten gebruike als vectoren voor het tot expressie brengen van de ingebrachte DNA-volgorde.

Een ander.expressiesysteem dat bruikbaar is voor het tot expressie brengen van de met p97 samenhangende peptiden is een insektensysteem.

30 In één zo'n systeem wordt Autographa californica nucleair polyhedrose virus(AcNPV) als een vector toegepast om vreemde genen tot expressie te brengen. Dit virus groeit in Spodoptera frugiperda cellen. De DNA-volg-ordes van belang kunnen in niet-essentiële gebieden (bijvoorbeeld het meerhoekige gen) van het virus worden gekloneerd en onder controle ge-35 bracht van een AcNPV promotor (bijvoorbeeld de veelhoekige promotor).

Een succesvolle insertie van de DNA-volgorde resulteert in de inactive-ring van het veelhoekige gen en de produktie van niet-opgesloten recombinant 8700235 -27-.

ΐ» V

virus (dat wil zeggen virus dat de protelnemantel die wordt gecodeerd door het veelhoekige gen mist). Deze recombinant virussen worden toegepast voor het infecteren van Spodoptera frugiperda cellen waarin het ingebrachte gen tot expressie wordt gebracht.

5 Tevens kunnen gastheercelstammen worden gekozen die de expres sie van de ingebrachte volgordes moduleren en het chimere genprodukt in een specifieke gewenste wijze modificeren of verwerken. De expressie van bepaalde promotors kan worden verhoogd in aanwezigheid van bepaalde inducenten (bijvoorbeeld zink, cadmiumionen voor metallothioneïne pro-10 motors). Derhalve kan de expressie van het genetisch gemanipuleerde proteïne worden bestuurd. Dit is belangrijk indien het proteïneprodukt van het gekloneerde gen letaal is ten opzichte van de gastheercellen.

Verder zijn modificaties (bijvoorbeeld glycosylering, fosforylering enz.) en verwerking (bijvoorbeeld splijting)van protelneprodukten belangrijk 15 voor de structuur en de functie van het proteïne. Verschillende gastheercellen hebben een karakteristiek en specifiek mechanisme voor de post-translatieverwerking en modificatie van proteïnen. Geschikte cellijnen of gastheersystemen kunnen worden om de correcte modificatie en verwerking van het uitgedrukte vreemde proteïne te garanderen.

20 In de bepaalde uitvoeringsvorm als hierin beschreven voor p97 is de p97 cDNA-volgorde geligeerd in een expressie plasmidevector afgeleid van pBR322,die de metallothioneïne promotor bevat.De gehele coderings-volgorde van p97 met inbegrip van het signaalpeptide en het membraan-anker werd in de vector ingebracht.

25 5.3.1. Identificatie van recombinant expressievectoren in staat tot replicatie en dirigering van de expressie van de p97 DNA-_volgordes.___

Expressievectoren die vreemde geninserties bevatten kunnen volgens drie algemene benaderingen worden geïdentificeerd: 30 (a) DNA-DNA-hybridisatie; (b) aanwezigheid of afwezigheid van merkgenfuncties; en (c) de expressie van ingebrachte volgordes.

In de eerste benadering kan de aanwezigheid van een vreemd gen, dat in de expressievector is ingebracht, worden gedetecteerd door DNA-DNA-hybri-35 disatie met behulp van sondes die volgordes bevatten die homoloog zijn ten opzichte van de vreemde geninsertie. In de tweede benadering kan het recombinantvector/gastheersysteem worden geïdentificeerd en geselecteerd 8700235 V.

-28- gebaseerd op de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde "merk" genfuncties veroorzaakt door de insertie van genen in de vector (bijvoorbeeld thymidine kinase activiteit, resistentie ten opzichte van antibiotica, transformatie fenotype enz.). Indien het vreemde gen bijvoor-5 beeld binnen de merkgenvolgorde van de vector is ingebracht, kunnen recombinanten die de DNA-insertie bevatten worden geïdentificeerd door de afwezigheid van de merkgenfunctie. In de derde benadering kunnen recombinant expressievectoren worden geïdentificeerd door analyse van het vreemde genprodukt tot expressie gebracht door de recombinant. Derge-^0 lijke analyses kunnen zijn gebaseerd op de fysische, immunologische of functionele eigenschappen van het genprodukt.

Wanneer bijvoorbeeld het recombinant vacciniavirus volgens de onderhavige uitvinding wordt opgebouwd, wordt het chimere gen, dat de p97 coderingsvolgordes bevat,in het thymidinekinasegen ingebracht, waar-*5 door op het virus een TIC fenotype wordt geïnactiveerd en aangebracht. Dergelijke recombinanten worden gekozen om hun vermogen te groeien in media die 5-broom-deoxyuridine een nucleoside analoog, dat letaal is voor TK+cellen maar niet voor TK cellen, bevat. De recombinanten worden verder geïdentificeerd door DNA-DNA-hybridisatie,onder toepassing van ^0 de cDNA sonde die specifiek is voor het tumor-geassocieerde proteïne.

TK recombinantvirus kan door plaque-zuivering worden geïsoleerd en uit-gangscultures worden uit geïnfecteerde gekweekte cellen bereid. Het recombinantvirus kan men onderzoeken op zijn vermogen synthese van de met p97 samenhangende‘peptiden te induceren. Voor dit doel kunnen geïnfec-25 teerde cellen worden gekweekt in aanwezigheid van radio-actief gemerkt aminozuur. Daarna worden lysaten en subcellulaire fracties van de geïnfecteerde radio-actief gemerkte cellen getest door immunoprecipitatie met antilichamen, die gericht zijn tegen het natieve met melanoma-geas-socieerde p97 antigeen. De immuno-geprecipiteerde produkten worden ge-30 scheiden door SDS-PAGE. De geïnfecteerde cellen kunnen tevens worden getest door immunofluorescentie met behulp van monoklonaal amtilichaam.

Cellen waarin een plasmidevector door transfectie is ingevoerd kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door FACS-analyse of door bin-dingsbepalingen van replica's van celkolonies op polyesterdoek. De hoe-35 veelheid met p97 samenhangend peptide dat aanwezig is kan men bepalen door een kwantitatieve radio-immuno analyse, en de subcellulaire locali-satie kan worden vastgesteld door cellulaire fractionering en door 8700285 -t -29-

Imraunofluorescentie microscopie. De structuur van het met p97 samenhangende peptide dat tot expressie is gebracht kan worden vastgesteld door SDS-PAGË en door aminozuurvolgorde-analyse.

5.3.2. Zuivering van het met p97 samenhangende peptide uit expres-_ ievector-gastheersystemen.

Z> - - - - ----- -

Vele met tumor-geassocieerde antigenen, zoals p97 zijn celopper-vlak glycoproteinen en bevatten N-eindstandige signaalpeptiden en een C-eindstandig ankerpeptide (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111— 112). Wanneer tot expressie gebracht in een geschikte vector wordt verier wacht dat het proteïne naar het celoppervlak zal zijn verplaatst. Om zuivering van het proteïne te vergemakkelijken heeft het de voorkeur de DNA-volgorde die codeert voor het membraan-ankergebied weg te laten, zodat het rijpe proteïne-medium wordt af gegeven.

Het met p97 samenhangende peptide kan uit de gastheercellen wor-15 den gezuiverd door detergent lysis gevolgd door affiniteitschromatogra-fie met behulp van monoklonale antilichamen. Indien een afgeknot proteïne uit het kweekmedium moet worden gezuiverd heeft het de voorkeur serumvrij medium te gebruiken en daarna affiniteitschromatografie toe te passen met monoklonale antilichamen. Het is belangrijk dat het anti-20 geen uit het antilichaam adsorbens kan worden geëlueerd zonder hetzij vermindering van zijn antigeniciteit of het te denatureren. Men kan dit bereiken door de pH te verhogen of te verlagen of door een chaotroop te gebruiken. Het kan nodig zijn een monoklonaal antilichaam te kiezen dat het antigeen onder betrekkelijk milde omstandigheden zal afgeven.

25 Het affiniteitsgezuiverde antigeen kan verder via HPLC worden gezuiverd.

5.4._Immunologische karakterisering van met p97 samenhangende _peptiden._' _

Het vermogen van het synthetische of recombinant antigeen een 30 antitumorreactie op te roepen kan eerst bij experimentele dieren worden geëvalueerd. Dit is bereikt door een modelsysteem op te bouwen waarin het met humane melanoma-geassocieerde p97 proteïne in cellen van de geschikte inwendig gekweekte stam van de experimentele proef worden uitgedrukt. Dieren worden dan immuun gemaakt met het p97 samenhangende pep-35 tide van de onderhavige uitvinding volgens verschillende protocollen, gevolgd door testen op de ontwikkeling van antilichamen gericht tegen de melanoma-geassocieerde p97 antigenen op de via de cel lopende 8700285 -* k -30- immuniteit zoals een verttraagd type hypergevoeligheid ten opzichte van het p97 antigeen, en op hun vermogen een infectie van levende, syngene tumorcellen die het p97 antigeen tot expressie brengen te weerstaan. Bovendien kunnen in vitro analyses van cellulaire immuniteit worden uit-5 gevoerd voor het meten van de proliferatie van lymfocyten in reactie op het met p97 samenhangend peptide en het vermogen van lymfocyten van geïmmuniseerde dieren of humane melanoma-patiënten om tumorcellen die het p97 antigeen tot expressie brengen te doden. Bovendien is men door het immuniseren van muizen met muize p97 in staat de mate vast te stel-10 len waarmee het mogelijk is een immuunrespons ten opzichte van een antigeen, dat in sporenhoeveelheden in humane weefsels aanwezig is, te induceren.

Niet-humane primaten zijn bruikbaar voor het vaststellen van de veiligheid van de met p97 samenhangende peptiden van de onderhavige uit-15 vinding. Voor dit doel kunnen de dieren worden geïmmuniseerd met behulp van een protocol dat ethisch kan worden toegepast op humane kankerpatiënten en daarna als bovenbeschreven onderzocht, met uitzondering dat de tumortransplantatieproeven niet haalbaar zullen zijn, aangezien deze het gebruik van inwendig gekweekte stammen vereist. De veiligheid van 20 de immunisatieprocedure wordt bepaald door te zoeken naar het effect van immunisatie op de algemene gezondheid van de geïmmuniseerde dieren (gewicht sveranderingen, koorts, eetlust, gedrag enz.) en te zoeken naar pathologische wijzigingen bij autopsie.

Tenslotte kan het met p97 samenhangende peptide van de onder-25 havige uitvinding worden onderzocht -in humane kankerpatiënten. Na begin-fase-I-onderzoek bij patiënten met voortgeschreden kanker, zouden voor het vaststellen van gebrek aan giftigheid kankerpatiënten in remissie maar met een hoge waarschijnlijkheid van terugkeer kunnen worden onderzocht. Hun immuunrespons zou als bovenbeschreven voor niet-humane pri-30 maten kunnen worden geëvalueerd, met uitzondering dat het effect van de behandeling ten aanzien van een bepaalde ziekte of ten aanzien van de recurrerende frequentie zou worden onderzocht. Bij gevallen van het melanoma antigeen p97 zullen tevens goedaardige moedervlekken, 'die het antigeen tot expressie brengt, worden onderzocht.

35 5.5. Samenstelling van een vaccin.

Het doel van deze uitvoeringsvom van de uitvinding is door synthetische of recombinant DNA technieken een synthetisch peptide, een 8700235 -31-= X * gezuiverd proteïne of een recombinant virus te produceren die bruikbaar kunnen zijn als een immunogeen alsmede een vaccin ter bescherming van kankerpatiënten tegen hoge risico's van terugkeer van de ziekte ter behandeling van reeds aanwezige ziekte en uiteindelijk voor het preven-5 tief vaccineren van individuen met een hoge risicofactor. In feite kan het met synthetisch of recombinant melanoma-geassocieerd p97 anti-geen in combinatie met andere immunogenen worden toegepast ter bereiding van multivalente vaccins voor de preventie van melanoma en andere kankersoorten. Voorbeelden van verschillende vaccinpreparaten worden 10 hierna besproken.

5.5.1. Virale vaccinpreparaten.

Wanneer het met p97 samenhangende peptide van de onderhavige uitvinding wordt geproduceerd door een recombinant virus, kan een levend recombinant viraal vaccin of geïnactiveerd recombinantviraalvaccin wor-15 den samengesteld. De keuze hangt af van de aard van het recombinant- virus dat wordt toegepast om het met p97 samenhangend peptide tot expressie te brengen. Wanneer het recombinant virus infectieus is voor de gastheer die moet worden geïmmuniseerd maar geen ziekte veroorzaakt, heeft een levend vaccin de voorkeur omdat de vermenigvuldiging in de gastheer 20 tot een langdurige stimulans van soortgelijke aard en grootte leidt ten opzichte van die welke plaatsvindt bij natuurlijke subklinische infecties, waardoor derhalve een aanzienlijk lange immuniteit wordt verleend.

De infectieuze recombinant virus kan invoering in de gastheer het met p97 samenhangende peptide uit zijn chimere gen tot expressie brengen en 25 daardoor een immuunrespons stimuleren. Het levende recombinant virus kan op zichzelf worden gebruikt als een preventief vaccin tegen melanoma.

De produktie van dergelijk recombinant virus ten gebruike in deze preparaten kan zowel in vitro (bijvoorbeeld weefselkweekcellen) als in vivo (bijvoorbeeld natuurlijke gastheren zoals koeien) systemen omvatten. Ge-30 bruikelijke methoden voor de bereiding en de samenstelling van koepok-vaccin kan worden aangepast voor het samenstellen van het levende recombinant virus vaccin.

Multivalente levende virusvaccins kunnen uit een enkele of enige infectieuze recombinantvirussen worden bereid die een veelvoud van anti-35 genen van verschillende tumor- of kankercellen tot expressie brengen. Bijvoorbeeld kan een vacciniavirus (dat bij benadering 35 kilobasis vreemd DNA kan herbergen) worden gemanipuleerd om coderende volgordes 8700285 * V.

-32- voor andere epitopen te bevatten; zoals een recombinant virus zelf kan worden toegepast als het immunogeen in een multivalent vaccin. Naar keuze kan een mengsel van vaccinia en/of andere virussen, die elk in staat zijn de expressie van een ander gen, dat codeert voor verschillen-5 de epitopen, te dirigeren in een multivalent vaccin worden samengesteld.

Of het recombinant virus al of niet infectieus voor de te immuniseren gastheer is, men kan altijd een geïnactiveerd vaccinpreparaat maken. Geïnactiveerde vaccins zijn "dood" in de betekenis dat hun besmettelijkheid is vernietigd gewoonlijk door behandeling met formaldehyde. 10 In het ideale geval wordt de besmettelijkheid van het virus vernietigd zonder dat het capside of de mantelproteïnen die de immunigeniciteit van het virus dragen worden aangetast.Teneinde geïnactiveerde vaccins te bereiden moeten grote hoeveelheden van het recombinantvirus in de kweek worden gegroeid teneinde de noodzakelijke hoeveelheid relevante anti-15 genen te leveren. Een mengsel van geïnactiveerde virussen, die verschillende epitopen tot expressie brengen, is bruikbaar voor het samenstellen van "multivalente" vaccins. In sommige gevallen heeft dit voorkeur boven levende vaccinpreparaten vanwege de potentiële moeilijkheden door onderlinge storingen van levende virussen die tezamen worden toegediend. In 20 elk van de gevallen dient het geïnactiveerde recombinantvirus of mengsel van virussen te worden samengesteld met een geschikt adjuvans teneinde de immunologische respons op hun antigenen te versterken. Geschikte ad-juvantia omvatten, maar zijn niet beperkt tot, minerale gels bijvoorbeeld aluminiumhydroxyde, oppervlakte-actieve stoffen zoals lysolecitine; 25 pluronische polyolen; polyanionen; peptiden en olie-emulsies.

Er zijn vele methoden bruikbaar voor het invoeren van de bovenbeschreven vaccinpreparaten; deze omvatten maar zijn niet beperkt tot intradermale, intramusculaire,intraperitoneale, intraveneuze,subcutane en intranasale routes. Wanneer een levend recombinant virusvaccin 30 preparaat wordt gebruikt kan dit via de natuurlijke infectieroute van het hoofd wild-type virus, dat was gebruikt voor het maken van het recombinant virus in het vaccinpreparaat, worden ingevoerd.

5.5.2. Subeenheid vaccinpreparaten.

In een alternatief voor virale vaccins kan het met p97 samen-35 hangend peptide zelf als een immunogeen in subeenheid vaccin preparaten worden gebruikt. De subeenheid vaccins omvatten alleen het relevante immunogene materiaal dat noodzakelijk is voor het immuniseren van een 8700285 -* ? -33- gastheer. Aldus kan het met p97 samenhangende peptide worden gezuiverd uit recombinanten die het peptide tot expressie brengen. Dergelijke recombinanten omvatten elk van de reeds eerder beschreven virus-gelnfec-teerde gekweekte cellen, bacteriële transformanten of gisttransforman-5 ten. m een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding kunnen de met p97 samenhangende peptiden of proteïnen chemisch worden gesynthetiseerd..

Of de met p97 samenhangende peptiden al of niet uit recombinanten worden gezuiverd of chemisch gesynthetiseerd, het eindprodukt moet aan 10 een geschikte concentratie worden aangepast en samengesteld met een geschikt vaccinadjuvans en voor gebruik verpakt. Geschikte adjuvantia omvatten maar zijn niet beperkt tot minerale zuren, zoals bijvoorbeeld aluminiumhydroxyde; oppervlakte-actieve stoffen zoals lysolecitine; pluronische polyolen; polyanionen; peptiden en olie-emulsies. Het met 15 p97 samenhangende peptide kan tevens worden opgenomen in liposomen of geconjugeerd met polysacchariden en/of andere polymeren ten gebruike in vaccinpreparaten.

In gevallen waarbij het met p97 samenhangende peptide en hapteen is, dat wil zeggen een molecuul dat antigeen is doordat het selectief 20 kan reageren met samenhangende antilichamen, maar niet immunogeen is doordat het geen immunrespons kan oproepen, kan het hapteen covalent worden gebonden aan een drager of immunogeen molecuul en kan de hapteen-drager worden samengesteld ten gebruike als een vaccin; bijvoorbeeld zal een groot proteïne zoals proteïne serumalbumine immunogeniciteit 25 aan het daaraan gekoppelde hapteen verlenen.

6. Voorbeeld? Melanoma-geassocieerd p97 antigeen.

In het hieronder beschreven voorbeeld werden cDNA klonen afgeleid uit verschillende gebieden van p97 mRNA aan elkaar gevoegd en ingébracht in een expressievector die de expressie van een met p97 samen-30 hangende peptide dirigeert. De met p97 samenhangende peptiden geproduceerd door de expressievector-gastheercel kunnen tot een vaccin worden samengesteld.

6.1. Zuivering van p97 mRNA.

Er werden polysomen bereid uit SX-MEL28 melanomacellen (Carey et 35 al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3270-3282) door magnesium-precipitatie. Uit dit preparaat werden polysomen die p97 groeiende ketens bevatten gezuiverd door incubatie met 3 IgG2a monoklonale anti- 8700285 -* % -34- lichamen (96,5, 118,1, 133,2) specifiek voor onderscheiden epitopen van P97 (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, Londen 303: 70-72) 5 gevolgd door affiniteitschromatografie over proteïne A Sefarose. Het p97-verrijkte mRNA werd geëlueerd onder toepassing van EDTA en gezuiverd door affiniteitschromatografie over oligo-(T)-cellulose (Bethesda Research Labs. Bethesda MD). in een typerende proef leverden 150 eenheden polysomen 260 ng p97-verrijkt mRNA, dat 0,23 % van het totale 10 mRNA voorstelt. Wanneer vertaald in Xenopus oocyten en geanalyseerd op p97 als beschreven in (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, Londen 303: 70-72) leverde p97-verrijkt mRNA 80 pg p97 per ng mRNA terwijl daarentegen p97-niet verrijkt mRNA slechts 0,44 pg p97 per ng mRNA leverde, hetgeen aan-15 toont dat de p97 mRNA-aetiviteit 180-voudig was verrijkt. De opbrengst van p97 mRNA-activiteit was 42 %. Vertaling in het reticulocyt lysaat-systeem (Pelham & Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67: 247-256) toonde aan dat met p97-verrijkt mRNA codeerde voor een hoofdpolypeptide met een schijnbaar molecuulgewicht van 84.000 dalton, zoals geanalyseerd 20 door SDS-PAGE, hetgeen niet detecteerbaar was in de translatieproduk-ten van niet-verrijkt mRNA en was onderworpen aan iramunoprecipitatie door antiserum specifiek voor p97 (figuur 1). Hieruit werd geconcludeerd dat het de ongeglycosyleerde voorloper van p97 was.

6.2. Bereiding en opbouw van cDNA klonen.

25 Er werden twee technieken als hieronder beschreven toegepast voor het opbouwen van cDNA klonen overgeschreven uit de mRNA matrijzen als boven geïsoleerd.

6.2.1. Opbouw van cDNA klonen gevormd door oligo(T).

Het p97-verrijkt mRNA als boven bereid werd toegepast als ma-30 trijs voor oligo(T)-gevormde cDNA synthese. Het cDNA werd als volgt in pBR322 gekloneerd: voor eerste streng cDNA synthese werden p97-verrijkt mRNA, de vier dNTP's en oligo(T) (Collaborative Research Walthma, MA) geïncubeerd met reverse transcriptase (Molecular Genetic Resources).

De tweede streng werd gesynthetiseerd door incubatie met het grote frag-35 ment van EL Coli DNA polymerase (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) en het dubbelstrengs cDNA werd afgebroken met SI nuclease (geschenk van D. Durnam van The Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle WA).

8700285 -35-.

het cDNA werd daarna met het dC-uiteinde bevestigd met terminaal de-oxynucleotidyltransferase (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD), gelast met PstI-ontsloten, dG-uiteinde bevestigd pBR322 (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.

5 USA 75: 3727-3731) en toegepast voor het transformeren van CaCl -behan- L·* delde E. coli RR1. DNA uit kolonies van getransformeerde bacteriën werd gebonden aan papier (Taub & Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126: 222-230) en uitgesorteerd door differentiële hybridisatie met cDNA sondes gesynthetiseerd aan p97-verrijkte en niet-verrijkte mRNA matrijzen.

10 Een 243-basepaar(bp)Klocn,p97-3a2fl, werd geïdentificeerd,, dat tot p97-verrijkte cDNA maar niet detecteerbaar tot niet-verrijkt cDNA werd gehybridiseerd en tevens tot geselecteerd p97 mRNA in hybride-geselec-teerde translatieproeven. Een polyadenyleringssigtiaal (AATAA) en een poly(A) stuk waren bij het 3'-uiteinde van het cDNA aanwezig (zie figuur 15 2).Nick-getranslateerd p97-3a2f1 werd 100-voudig sterker gehybridiseerd met p97-verrijkt mRNA dan met niet-verrijkt melanoma mRNA en niet detecteerbaar met fibroblast. mRNA. Door Northern membraananalyse (,rblotting") met het gekloneerde cDNA als een sonde werd een mRNA met bij benadering 4 kilobasen (kb) geïdentifceerd, dat in SK-MEL 28 melanomacellen aan-20 wezig was en uit fibrolasten afwezig was.

6.2.2. Genoom-klonering van p97 en de toepassing van synthetische _oligonucleotiden voor het starten van cDNA synthese._

Pogingen om cDNA-klonen te verkrijgen die zich langer uitstrekten dan 1 kb vanaf de polyadenyleringplaats waren niet succesvol, waarschijn-25 lijk te wijten aan een gebied met hoog GC-gehalte (groter dan 80 %) met een intensieve secundaire structuur. Genoom-klonering werd toegepast om dit probleem te ontgaan. Er werden vier overlappende genoomklonen uit banken van lambda L47.1, die op grootte gefractioneerd SK-MEL 28 DNA verrijkt aan een specifiek p97 restrictiefragment bevatten, geïsoleerd.

30 Deze vier genoomklonen overspannen 28 kb en bevatten het gehele code- ringsgebied van p97 met inbegrip van het regulerende gebied van hét gen. De genoomklonen achtereenvolgens gerangschikt van 5' tot 3' zijn: lambda B15, lambda H17, lambda B6.6 en lambda E7.7. De nomenclatuur bestaat uit een letter die verwijst naar het restrictie-enzym toegepast voor het 35 vormen van het fragment terwijl het cijfer de kilobasegrootte van het fragment aangeeft dat werd gekoneerd in lambda L47.1 Aldus uitgaande van het 5'-uiteinde bevat lambdakloon B15 een 15kb BamHI p97 fragment; 870 0 2 8 5

-* -V

-36- lambdakloon Hl7 een 17kb HindiII p97 fragment;lambdakloon B6.6 een 6.6 kb BamHl p97 fragment; en lambdakloon E7.7 een 7.7. kb EcoRI p97 fragment (zie figuur 2A). Restrictiefragmenten van de klonen die werden gehybri-diseerd tot het 4 kb p97 mRNA op Northern membranen ("blots") werden op 5 volgorde onderzocht en p97 exons werden geïdentificeerd door een met een computer gestuurde homologenonderzoek tussen de voorspelde coderende volgorde en de aminozuurvolgorde van humane en kippetransferrine (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81; 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508; Jetsch & Chambon, 10 1982, Eur. J. Biochem. 122: 291-295).

Drie synthetische oligonucleotiden, waarvan de volgordes waren gebaseerd op p97 genoom exonvolgordes werden toegepast voor het vormen van cDNA synthese aan SK-MEL 28 mRNA en het resulterende cDNA werd gekloneerd tot lambda-gtlO en wel als volgt: het p97 cDNA werd van een 15 dG-staart voorzien en geligeerd met een overbruggend oligonucleotide (AATTCCCCCCCCCCCC) en lamda-glO, dat was doorgeknipt met EcoRI. Het overbruggende oligonucleotide gaf de mogelijkheid tot insertie en ligatie van de dG-staart bezittende cDNA volgorde in de EcoRI plaats van lambda gtlO. De lambdafaag werd verpakt (Grosveld et al., 1981, Gene 13: 227- 20 237) en op platen aangebracht op E. coli e,nrtrK mK+hfl. De cDNA-banken — - 600 in lambda-glO werden uitgeselecteerd op de p97-insertie door plaque hybridisatie (Benton & Davis, 1977, Science 196:180) met genoom exonfrag- 23 menten als sondes. De sondes waren radio-actief gemerkt met p-TTP (New

England Nuclear, 3200 Ci/mmol) door nick-translatie tot een specifieke 0 25 activiteit van 5 - 10 x 10 cpm/microg. Drie overlappende cDNA-klonen (lOal, Ijl, 2fl) die 2.368 nucleotiden van het p97 mRNA overspanden, met inbegrip van het gehele coderingsgebied, werden geïdentificeerd door toepassing van p97 exon specifieke fragmenten als sondes (figuur 2).

6.3 DNA-volgorde analyse van p97.

30 cDNA inserties werden uitgesneden en gesubkloneerd in plasmide- vector EMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1645-1655) in E.coli voor aansluitende voortplanting en restrictiebepaling. cDNA werd tevens gesubkloneerd in Ml3mpl8 faag-kloneringsvector (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33: 103-119) en de volgorde onderzocht met 35 behulp van de dideoxy-methode van Sanger (Sanger et al., 1977, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). M13 klonen die grote inserties bevatten werden op volgorde onderzocht door deleties te vormen met DNAse I

8700285 * * -37- (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158: 539-549) of exonuclease III (Henikoff, 1984, Gene 28: 351 -359) en door toepassing van synthetisch 21-mer oligonucleotide patronen.

De p97 cDNA volgorde wordt in figuur 3 weergegeven. Een open 5 afleeskader van 2.214 nucleotiden strekt zich uit van het eerste ATG, waaromheen de volgorde overeenkomt met de gemeenschappelijke initiatie-volgorde bepaald door Kozak (Kozak, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 127-142), tot aan het TGA bij plaats 2.215. Het meeste van het 5'-cDNA kloon bevat extra 60 nucleotiden stroomopwaarts van het initiërende ATG. Het 3' 10 niet-coderende gebied van p97 mKNA, dat niet als een cDNA-kloon was verkregen, werd geïdentificeerd als enkel genoom exon met 1.667 nucleotiden. Resten 20 - 32 van de voorspelde aminozuurvolgorde zijn identiek aan de bekende N-terminale aminozuurvolgorde van p97 (Brown et al, 1982, Nature, Londen,296: 171-173), hetgeen de identiteit van het gekloneerde cDNA be-15 wijst. Verder is het voorspelde molecuulgewicht van de voorloper 80.196 dalton, in goede overeenstemming met het waargenomen molecuulgewicht van het in vitro translatieprodukt.

6.4. Opbouw van een recombinant expressieplasmide dat de p97 code-_rende volgorde bevat._._

De grote afmeting van het p97 gen maakt het nodig de cDNA klonen, 20 die waren verkregen door specifieke starting van melanoma mRNA met revers transcriptase aan elkaar te voegen. Men gebruikte de drie cDNA lambda gtlO klonen (lOal, Ijl en lf4; zie figuur 2)die het coderingsgebied vanaf het signaal peptide via de membraanverankeringsvolgorde omvatten. De p97 insertie van kloon lOal werd uitgesneden door afbraak met EcoRI 25 en de oligo(dG) volgorde bij het 5'-uiteinde van het cDNA lOal werd verwijderd door afbraak met exonuclease III, waardoor kloon lOalb werd gevormd, met een HindllI plaats 30 bp stroomopwaarts van het initiërende methionine van het p97 preproteïne. De p97-inserties van de drie cDNA klonen lOalb, Ijl en 2fl en genoomkloon E7.7 werden aan elkaar gebonden 30 bij PvuII, SstI en EcoRI restrictie enzymplaatsen en ingebracht in de Hindlll-EcoRl plaatsen van de plasmidevector pEMBL 18+ (Dente et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11: 1645-1655) zoals blijkt uit figuur 2. De eind-constructie, p97b bevat de 4,4 kb p97 insertie in plasmidevector pEMBL 18+· die werd toegepast voor het transformeren van _E. coli HB101. De insertie 35 in p97b bevat 30 bp van het 51 -niet-getranslateerde gebied van p97 mRNA, de gehele coderingsvolgorde, en het 3'-niet-getranslateerde gebied, begrensd door een 5'BindIII plaats en een 3'EcoRI plaats.

8700285 * v -38-

De 4.4. kilobase p97 insertie werd uitgesneden uit p97b met HindiII en EcoRI waarna de uiteinden werden opgevuld door toepassing van het Klenow-fragment van IC. Coli DNA polymerase. Het fragment met een stomp ("blunt") uiteinde werd ingebracht in de unieke Smal plaats in 5 de eukaryotische cDNA expressievector 1995. 12pUCl3, een derivaat van vector mThGH-112, (Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-14), dat was verkregen van Dr. Richard Palmiter (Universiteit van Washington, Seattle, Washington). Deze vector gebruikt de muizemetallothioneïne promotor voor het tot expressie brengen van vreemde genen in eukaryotische cellen. De 10 constructie met de p97 insertie in de correcte oriëntatie werd geidenti- . ficeerd door restrictie-analyse en aangeduid als pMTp97b.

Het recombinantplasmide werd in LMTK cellen overgebracht en de transfectanten werden uitgekozen door kweken in HAT-medium. Klonen die uit de overgebrachte schaal waren uitgepikt werden in microproefplaten 15 met 96 cupjes geëxpandeerd en verbruikt kweekmedium en cellysaten uit replicaplaten werden geanalyseerd op p97 door een 2-plaats immunoradio-metrische analyse. Subklonen werden geëxpandeerd en opnieuw onderzocht. Kloon TKMp97-12 die bij benadering 4.000.000 moleculen van p97 per cel tot expressie brengt werd opgekweekt, geïnduceerd met cadmium en toege-20 past als een bron van p97 voor immunisatie.

6.5. Immunisatie van muizen met p97 samenhangende peptiden.

De TKMp97-12 cellen werden gekweekt, geïnduceerd met cadmium en (14,4 g) werd gelyseerd door incubatie gedurende 10 minuten op ijs met 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl ,1 mM EDTA, 0,5 % NP-40) . 25 Het lysaat werd bij 200.000 g gedurende 45 minuten bij 4°C aan ultra-centrifuge onderworpen en de helft van het lysaat werd over een 1 ml immuno-affiniteitskolom gepasseerd specifiek voor p97 (Fab-fragment van antilichaam 96,5 gekoppeld aan sefarose). Het immuno-adsorbens werd intensief gewassen, eerst met TNEN en tenslotte met 20 mM tris-HCl, pH 30 6,8.

Voor de immunisatie werd 0,5 ml van de geadsorbeerde immuno-affiniteitskolom als boven geprepareerd,gemengd met 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 en geëmulgeerd met 1 ml complete Freund's adjuvans. Vier BALB/c muizen ontvingen elk intraperitoneaal 0,4 ml van de emulsie.

35 Drie weken later werden de muizen gestimuleerd met een kwart van deze hoeveelheid antigeen in incompleet Freund's adjuvans. Controlemuizen werden geïmmuniseerd met een immuno-affiniteitskolom van een antilichaam 8700285 -39-.

dat niet verwant was aan p97, maar dat anderszins identiek was behandeld. Van vier van de p97 geïmmuniseerde muizen en twee controlemuizen werd een week na de stimulering bloed afgetapt. De sera werden onderzocht op antilichamen tegen p97 door immunoprecipitatie uit radio-actief gejodeer-5 de SK-MEL melomacellen gevolgd door SDS-PAGË. De resultaten toonden aan dat sera uit de vier p97-gelmmuniseerde muizen immunoprecipitatie van p97 gaven, terwijl de controlesera negatief waren. De sera werden tevens getest op de aanwezigheid van antilichamen gericht tegen p97 met behulp van een ELISA analyse op glutaaraldehyde-gefixeerde SK-MEL 28 melanoma-10 cellen (20.000 cellen per microtestcupje). De gefixeerde cellen werden met 0,05 ml serum 1/10.000 verdund gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, gewassen en daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur ge-incubeerd met 0,05 ml mierikswortelperoxydase-geconjugeerd geite-anti-muis-IgG (Southern Biotech). De optische dichtheden (afgelezen bij 490 15 nm)van sera uit de p97 geïmmuniseerde muizen waren 0,350, 0,243, 0,343, 0,200 terwijl daarentegen de optische dichtheid van sera uit de controles 0,036 en 0,057 was.

6.6. Karakterisering van p97.

6.6.1. Structuur van p97.

20 De structuur van p97 werd bepaald uit de amino zuur volgorde van de p97 voorloper die vier structurele domeinen omvat. Aangezien rest 20 van de voorlopervolgorde overeenkomt met de N-eindplaats van rij p97 vormen de zuurresten 1-19 waarschijnlijk een signaalpeptide, een conclusie die wordt ondersteund door zijn lengtë en hydrofobe aard. Amino-25 zuren 20-361 en 362-713 omvatten twee homologe domeinen van 342 en 352 aminozuren. Potentiële N-gekoppelde glycosyleringsplaatsen treden op bij plaatsen 38 en 135 in het N-eindstandige domein en plaats 515 in het C-eindstandige domein. Tenslotte wordt aangenomen dat aminozuren 714-738, een gebied van overwegend niet geladen en hydrofobe resten, p97 in de 30 celmembraan verankeren (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121), dat zich kan uitstrekken in het cytoplasma.

De domeinstructuur van p97 wordt ondersteund door protease afbraak-proeven. Afbraak van p97 met trypsine, papaxne (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546) of trombine produceerde een geglycolyseerd, anti-35 genisch fragment van bij benadering 40.000 dalton wat molecuulgewicht betreft. Het fragment werd gezuiverd uit een trombine afbraakstuk van p97 35 59 dat metabolisch was gemerkt met S-methionine of S-cysteïne en waar- 8700285

* V

-40- van de volgorde werd bepaald als beschreven in (Brown et al., 1982, Nature, Londen 296: 171-173). Cystelneresten werden geïdentificeerd bij plaatsen 7 en 17 en methionineresten bij plaatsen 2 en 20. Identieke resultaten werden verkregen met intact p97, die volledig in overeenstem-5 ming zijn met de N-terminale volgorde van p97 voorspeld uit de cDNA-volgorde. Geconcludeerd wordt dat het 40.000 dalton molecuulgewicht protease-resistente fragment overeenkomt met het N-terminale domein van p97. Men is niet in staat het C-terminale domein van p97 te isoleren, waarschijnlijk omdat dit protease-gevoelig is.

10 6.6.2. Homologie van p97 met transferrine·.

Een onderzoek van de aminozuurvolgordebank van het Protein Identification Resource (Release 5.0; Dayhoff et al., 1981, Nature, Londen 290:8) toonde aan dat p97 opvallend homoloog is aan drie leden van de transferrine superfamilie:humaan serumtransferrine, humaan lactotrans-15 ferrine en kippetransferrine ( 37 % - 39 % homologie, zie figuur 4). Aangezien humaan en kippetransferrine 50 % homologie met elkaar vertonen, moet p97 uit serumtransferrine meer dan 300 miljoen jaar geleden zijn gedivergeerd. p97 heeft 14 cystelneresten geplaatst in homologe posities in elk domein. Humaan transferrine bevat al deze cysteïnen 20 in homologe plaatsen in beide domeinen, terwijl humaan lactotransferrine en kippetransferrine slechts twee van deze cystelneresten missen (in hun C-eindstandige domeinen). Anders dan p97 bevatten deze proteïnen 4-7 extra systelnen in hun C-eindstandige domeinen die geen overeenkomstig stuk in het N-eindstandige domein hebben. Humaan transferrine bevat 25 tevens 2 extra cysteïnen die uniek zijn voor zijn N-eindstandige domein. De posities van de meeste van de disulfiden in humaan serumtransferrine, lactotransferrine en kippetransferrine zijn direct bepaald (McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508); Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem 45:659-676; Mazurier et al., 1983, Expe-30 rientia (Basel) 39: 135-141; MacGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 3543-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem. 122: 297-303; Williams, 1974, Biochem J. 141: 745-752). Men kan aldus de aanwezigheid van 17 sulfidebindingen in elk domein van p97 voorspellen (zie figuur 5) .

De aminozuurhomologie tussen domeinen van p97 (46 % bereikt door 35 insertie van 7 hiaten van 9 resten) is veel opvallender dan welke men ziet in humaan transferrine (43 % - 16 hiaten, 45 resten) of kippetransferrine (55 % - 12 hiaten, 49 resten). Gelet op de uitgebreide volgorde- 8700285 -41- homologie tussen p97 en transferrine en de schijnbaar gelijke vouwpa-tronen, gebaseerd op het behoud van cysteïnen, wordt aangenomen dat indien de huidige lage-resolutie-röntgenstructuur van transferrine (Gorin-sky et al., 1979, Nature, Londen, 281: 157-158} kan worden verfijnd het 5 mogelijk zal zijn de driedimensionale structuur van p97 af te leiden.

6.6.3. Functie van p97.

Doordat p97 behoort tot de transferrine superfamilie, vormen zijn vermogen ijzer te binden (Brown et al., 1982, Nature, Londen 296: 171-173) en zijn gemeenschappelijke chromosale plaatsing met transferrine 10 en transferrinereceptor(PLowman et al., 1983, Nature, Londen, 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756) aanwijzingen dat het een rol speelt bij ijzeEtransport. De ijzerbindingsholte van transferrine bevat naar men aanneemt 2-3 tyrosines, 1-2 histidines en een enkel bicarbonaat-bindend arginine (Metz-Boutique et al.,1984, 15 Eur. J. Biochem. 145: 659-676). Het behoud van deze aminozuren in p97 ondersteunt zijn voorgestelde rol in ijzermetabolisme (zie figuur 4). Aangezien p97 een membraan gebonden transferrine-achtig molecuul is en geen homologie heeft met de transferrinereceptor (Schneider et al., 1984, Nature, Londen, 311: 675-678), kan zijn rol in cellulair ijzermetabolis-20 me verschillen van dat geleverd door circulerend serumtransferrine en de cellulaire receptor voor transferrine. De expressie van het gekloneerde p97 cDNA in eukaryotische cellen geeft de mogelijkheid zijn functionele eigenschappen experimenteel te toetsen.

6.6.4. Conclusie.

25 Gebaseerd op deze gegevens ie het duidelijk dat cDNA constructies voor het melanoma-geassocieerde p97 zijn verkregen en dat deze efficiënt in zoogdiercellen tot expressie kunnen worden gebracht voor de produktie van grote hoeveelheden antigenisch p97.

7. Expressie van gekloneerd p97 en vaccinonderzoek.

30 De hierin geïllustreerde experimenten beschrijven de expressie van het gekloneerde p97 proteïne en het onderzoek van zijn vaccin. De expressie van p97 proteïne in een uitgescheiden vorm (door de door transfectie verkregen muizecel kloon Bl6svp97a.l4) maakt zuivering van milligram hoeveelheden van het p97 proteïne met volledige lengte moge-35 lijk. Het proteïne in gezuiverde vorm werd door in vitro onderzoek van de inductie van cellulaire immuniteit toegepast alsmede voor het onderzoeken van zijn potentieel als subeenheid vaccin. Het p97 genprodukt 8700285 * V- -42- werd tevens tot expressie gebracht op het geloppervlak van metastatische murine melanomacellen,hetgeen een model opleverde voor het onderzoeken van het effect van vaccins ter voorkoming van tumorgroei in een syngeen systeem.

5 Het p97 gen werd in een levend recombinant vacciniavirus in gébracht ten gebruike als een vaccinpreparaat in staat tot het genereren van een effectieve cellulaire immuniteit. Het recombinant vaccina-virus Vp97a-NY werd geëvalueerd op zijn vermogen immuniteit in muizen te genereren, onder toepassing van diverse bepalingen ter demonstratie IQ; van de humorale en cellulaire immuniteit. Onder toepassing van het syn-gene murine tumormodel als supra beschreven, werd gedemonstreerd, dat het Vp97a-NY recombinant virusvaccin een beschermend effect tegen tumor-celbemsetting leverde. Het vaccin leverde tevens een therapeutisch effect bij muizen met bestaande groeiende longmetastasen, een eigenschap die 15 analoog is aan het voorgestelde gebruik van het vaccin voor het genereren van een immunotherapeutisch anti-tumorrespons in humane melanoma-patiënten met bestaande tumor.

Naast de muizestudies, waar er slechts 91% homologie tussen humaan p97 en homoloog muize-proteïne is (in de tot dusver onderzochte 20 gebieden) is het Vp97a-NY vaccin tevens bij niet-humane primaten onderzocht. Er is een veel nauwere homologie tussen humaan p97 en de aapvorm van het proteïne (zoals blijkt uit de kruis-reactiviteit op het mono-klonale antilichaamniveau). Vanwege de potentiële moeilijkheid een im-muunrespons tegen een "eigen" proteïne te genereren werd de nauw verwan-25 te makaakaap toegepast voor het onderzoeken van de immunogeniciteit van het Vp97a-NY vaccin. Het recombinant vacciniavaccin’werd onderzocht bij apen en bleek een humorale immuniteit gericht tegen p97 proteïne te induceren. Tot dusver hebben de apen geen waarneembare symptomen van schadelijke neveneffecten door blootstelling aan het vaccin vertoond, 30 nadat zij twee inoculaties van het. levende recombinant vacciniavirus gedurende een periode van 6 weken hebben ontvangen.

7.1. Plasmide expressie.

Het expressie plasmide bestuurd door de SV-40 vroege promotor sv2 werd opgebouwd uit de cDNAplasmidekloon p97a, die gelijk is aan 35 plasmidekloon p97b, met uitzondering dat het gehele 3'UT gebied wordt benut (figuur 6). Alle cDNA-klonen waren oorspronkelijk geïsoleerd uit lambda gtlO banken met synthetische EcoRI-dG (9-17) koppelaars als eer- 870 0 285 .

-43-.- der beschreven. Inserties werden uitgesneden door EcoRI en gesubkloneerd in pEMBL18+ voor aansluitende voortplanting en karakterisering. Kloon lOal werd gecubkloneerd in M13mpl8 en er werd een RF-vorm met BamHI en Sphl afgebroken, kort behandeld met exonuclease III, behandeld 5 ("blunted”)met SI nuclease, behandeld met Klenow en opnieuw verbonden. Verschillende plaques werden geïsoleerd en ervan de volgorde bepaald, waarbij van één de dG-staart was verwijderd en 33 bp van het p97 5' on-getranslateerde gebied ingebracht in de HindiII plaats van M13mpl8 was behouden. Een RF van deze subkloon (lOala) werd toegepast voor het gene-10 reren van het intacte p97 cDNA; anderszins werden alle fragmenten uit de plasmide subklonen geïsoleerd. Het 550 bp HindlII-PvuII fragment uit lOala en het 735 bp PvuII-Sall fragment uit Ijl werden geïsoleerd uit LMP agarosegels en geligeerd in pEMBL18+ bij Sail en HindlII-plaatsen, waarbij p5'p97 werd gevormd. E7.7 genoom kloon in pEMBL18+ werd totaal 15 afgebroken met EcoRI en gedeeltelijk met Sstl, waarbij het 4,5 kb fragment werd afgescheiden door fractionering via 0,8 % LMP agarose. Dit

4,5 kb 3'-fragment.werd geligeerd met het 404 bp Sstl fragment van 2fl en het 535 bp BamHl-Sstl fragment van Ijl in pEMBL18+ bij de Sail en EcoRI-plaatsen, waarbij p3'p97 werd gevormd. Het 1285 bp HindlII-SalI

20 fragment van p5’p97 werd daarna geligeerd in p3’p97, hetgeen bp97a vormde. Het EcoRI-gedeeltelijke HindlII fragment uit deze kloon werd ingébracht in pSV2neo (Southern et al., 1982, J. Mol. App. Genet. 1.· 337-341) bij de HindlII- en EcoRI-plaatsen, waarbij het neomycine coderende gebied en SV40 "splice"/polyA volgordes werden geëlimineerd terwijl de 25 SV40 vroege promotor en 72 bp inducent, 33 bp p97 5’UTR, het gehele p97 coderende gebied, 3' UTK en 1,4 kb 3' flankerend DNA werden behouden. Het resulterende plasmide wordt pSVp97a genoemd.

Het sv2 gestuurde plasmide werd door transfectie door calcium-fosfaat overgebracht in een veelvoud van eukaryotische cellijnen en 30 expressiecellen werden gekloneerd en gekozen door toepassing van co-transfectie van een dominante selecteerbare merkstof. On dit tot stand te brengen werden Chinese hamstereierstok (CHO) cel!en gekweekt in Hank's Fl medium dat 15 % foetaal kalfserum (FCS), 4mM L-glutamine, 1,3 mM proline en antibiotica bevatte. De B16 cellen werden gekweekt 35 in RPMI medium dat 0,15 % bicarbonaat en 1735 cellen in DMEM medium (Gibco) bevatte, beide aangevuld met 15 % FCS en antibiotica. De cellen werden door transfectie overgebracht volgens een gemodificeerde calcium- 8700285 * -44-- fosfaatttechniek (M. Wigler et al., 1978, Cell 14; 725-731) met 20 yg per plaat van pSV2p97a plasmide DNA en 0,5 yg van hetzij pSV2DHVR of pSV2neo. Alle plasmiden werden gelineariseerd bij de EcoRI-plaats. Stabiele transfectanten werdén uitgekozen met behulp van hypoxanthine 5 negatief (HAT-)medium voor CHO cellen of 0,5 yg/ml Geneticine (g418, Gibco) voor de B16 en 1735 cellen. Overlevende cellen begonnen 7 dagen na de transfectie zichtbare kolonies te vormen en werden bedekt met steriele polyesterfilters die door klaskralen op hun plaats werden gehouden. De filters bleven gedurende vijf dagen op hun plaats, zodat de ' 10 cellen in de polyestermatrix konden doorgroeien, waarbij op de plaat een replica van de kolonies werd gevormd. De filters werden daarna verwijderd en toegepast voor een levende celbindingsbepaling met een gejodeerd anti-p97 monoklonaal antilichaam. Er werden 10 mg van gemerkt monoklonaal antilichaam geïncubeerd met tot 20 filters in 10 ml FCS gedurende 15 1 uur bij 4°C. De filters werden intensief in fosfaat-gebufferde pekel (PBS) gewassen, gedroogd en overnacht bij -70°C aan XAR-5 film blootgesteld. De filters werden vervolgens gekleurd met 7 % methyleenblauw om de celkolonies zichtbaar te maken. In alle toegepaste cellijnen met uitzondering van de B16-muizelijn bevatten de expressiecellen antigenisch 20 p97 proteïne op hun celoppervlakken.

In de B16 door transfectie overgebrachte cellen werd p97 in het medium afgegeven, een unieke vonds voor dit celtype. De afscheiding van p97 maakte de zuivering van een p97 proteïne met volledige lengte uit het medium van de cellen mogelijk. Kloon Bl6SVp97a.l4 bracht bij bena-25- dering 4 yg/ml p97 in verbruikt medium tot expressie. Recombinant p97 werd uit verbruikt medium van door transfectie verkregen kloon B16SVp97a. 14 gezuiverd, waarbij grote hoeveelheden van p97 antigeen in dit medium 9 werden afgegeven. De cellen werden op bijna samenvloeiendheid (10 cellen) in 850 cm* rolflessen gehandhaafd door continu kleine hoeveelheden 30 vers medium toe te voegen. Zij bleven gedurende een week antigeen af-geven zonder los te raken, waardoor een voortdurende winning en bevriezing van verbruikt medium mogelijk was. De zuivering van p97 werd tot stand gebracht door immuno-affiniteitschromatografie, onder toepassing van cefarose gekoppeld aan Fab-fragmenten van monoklonaal antilichaam 35 96.5. Voor dit doel werden drie liter verbruikt medium over een reeks van drie 30 ml kolommen gestuurd. De eerste bevatte 15 ml G-25 superfijn Sephadex (Pharmacia), en de tweede bevatte 20 ml Sepharose 4B(Pharmacia) 8700285 -45-:

A

en de derde bevatte 8 ml cyanogeenbromide-geactiveerd Sepharose (Sigma) geconjugeerd met Fab-fragmenten van monoklonaal antilichaam 96.5 (10 mg proteïne/ml Sepharose). Vervolgens werd de affiniteitskalom intensief met koud PBS gewassen en het antigeen geêlueerd met 30 ml 0/1 M citraat, 5 pH 5 en 30 ml 0,1 M citraat, pH 4. Aangetoond werd dat deze omstandigheden de immunoreactiviteit van het antigeen niet wijzigden,terwijl een volledige elutie van het antigeen uit monoklonaal antilichaam 96.5 werd bereikt. De twee eluties werden geneutraliseerd met respectievelijk 3,0 ml en 4,5 ml van 2 M tris, pH 8. Het gezuiverde eluaat werd geconcen- 10. treerd met een Amicon-apparaat met een PM10 filter en met twee 10 ml volumes PBS gewassen, waarbij een eindopbrengst van 4,95 mg in 4,5 ml, als vastgesteld door een Bradford-bepaling (Biorad) achterbleef. Vijftien ]ig van het produkt werd onderworpen aan SDS-PAGE (figuur 7) en zichtbaar gemaakt zowel door Coomassie blauw als zilverkleuring. Een dubbele 15 determinant immunobepaling (DDIA) (Brown et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:539) leverde een onafhankelijke bevestiging van de molaire hoeveelheid gezuiverde proteïne. Er werden parallele bereidingen uitgevoerd met verbruikt medium uit de hoofd-Bl6-cellijn, waarbij geen detecteerbaar proteïne werd aangetoond. In een volgende bereiding werd 30 mg van 95 %'s 20 zuiver p97 proteïne gezuiverd uit 300 mg monoklonaal antilichaam en 96,5 Fab-fragmenten geconjugeerd aan Sepharose. Het gezuiverde p97 proteïne was immunogeen en produceerde een sterke antilichaamreactie in muizen geïmmuniseerd met het proteïne als beschreven in hoofdstuk 7.3. infra.

7.2. Opbouw en expressie van recombinant p97 vacciniavirus.

25 Het coderende gebied van p97 werd ingebracht door p97a door te snijden met HindlII, de einden in kleverige einden om te zetten en deze te ligeren in de vaccina-insertievector pGS-20 (Mackettet al,, 1984, J. Virol. 49: 857-864) die bij Smal-plaats was geopend. De PGS-20 vector gebruikte de 7,5 K-promotor en bevatte flankerende volgordes uit het 30 vaccinia thymidinekinase (TK)gen. Er werd een recombinsntenvirus gevormd door de methode van Mackett et al., supra en Vp97a-NY werd geïsoleerd dat geïnfecteerde cellen er toe bracht p97 proteïne met een correcte grootte alsmede glycosylering (figuur 8) tot expressie te brengen. Opper-vlakexpressie van p97 werd tevens bevestigd in cellen geïnfecteerd met 35 het recombinant p97 virus (tabel A) die nu volgt: 8700285 * *.

-46-.

TABEL A,

Oppervlak p98 expressie van door transfectie verkregen muizecellen en _cellen geïnfecteerd met recombinant vacciniavirus D_ 5 Celtype Virus gebruikt om Moleculen van p97 per cel cel te infecteren tot expressie gebracht M2SVp97a.A geen 3.210.000 M2svp97a.E/F2 geen 434.000

Uitgangs-M2 geen 2.000 10 BSC geen 5.590 BSC Vwt-NY vaccinia 5.220 BSC Vp97a-NY vaccinia 1.140.000 1) Cellen werden kort getrypsiniseerd, gewassen en a.ls aliquots gebracht 3 45 15 in buizen die 10 tot 10 of 10 cellen bevatten. Niet-expressie gevende dragercellen werden toegevoegd aan buizen met kleinere celaantallen 5 6 zodat in totaal 10 cellen per buis werden gebruikt. 1 x 10 cpm gejo- deerd monoklonaal antilichaam 36,5 (123 ng) werd geïncubeerd, in een totaalvolume van 50 yl, waarbij de cellen gedurende 60 minuten op ijs 20 waren. De cellen werden gewassen en 4 maal gecentrifugeerd in PBS + foetaal kalfserum, daarna opnieuw gesuspendeerd en geteld in een

Micromedic 4/600plus gammateller (-) betekent minder dan.

7,3. Recombinant p97 vacciniavirus is immunogeen in muizen.

25 Inoculatie van muizen met Vp97a-NY vormde een sterk humorale anti- lichaamrespons. De muizen vierden éénmaal geïmmuniseerd, éénmaal in vier weken gestimuleerd, waarna na vijf weken bloed werd afgetapt. De titers werden bepaald door ELISA, onder toepassing van antigeen-beklede platen en een proteïne A geconjugeerd aan mierikswortelperoxydase als detectie-30 reagens. De gegevens werden omgezet in monoklonale antilichaamequivalenten door vergelijking met een standaardkromme van ELISA-binding gevormd onder toepassing van anti-p97 monoklonaal antilichaam 133.2. De resultaten toonden een sterke inductie van serum antilichaam (figuur 9). De cellulaire immuniteit werd gedetecteerd onder toepassing van een in 35 vitro proliferatiebepaling met gezuiverd p97 proteïne als het stimulerende antigeen (tabel B).

8790285 1) 4 * -47- TABEL B.

Proliferatiebepaling van murine meetcellen

Stimulerend Proliferatie-index van vp97 Proliferatie-index 5 antigeen recombinant immune miltcellen van controle milt- cellen

Con A

(10 ug/ml) 71 50 p97 proteïne 10 ( 3 ug/ml) 27 2 (10 ug/ml) 43 2 (20 ug/ml) 56 2 (50 ug(ml) 44 3 UV-gelnactiveerd vacciniavirus 15 (107pfu/ml) 91 2 P97-bestraalde syngene tumorcellen (10 ) 86 2 parentaal bestraalde 20 tumorcellen(10 ) 3 1 1) Miltcellen werden geïsoleerd uit muizen geinoculeerd door staartscarifi- 7 fatie met 10 pfu Vp97a-NY recombinantenvirus, een maand gestimuleerd met dezelfde dosis en nog een week later gedood. Natieve miltcellen werden in deze proef als controles toegepast.

25 10^ cellen werden per cupje gekweekt in een rondbodem plaat met 96 cupjes in 0,22 ml RPMI gesuppleerd met 0,5 % normaal muizeserum, peni-

S

cilline/streptomycine, glutamine, bicarbonaat en 2,5 x 10 M 2-mercap-toëthanol. De kweken werden pulse-gemerkt gedurende 6 uur op dag 4, met 25 uCi/cupje getritieerd thymidine (New England Nuclear), gewon-30 nen met een PHD cel winapparaat en geteld met Optifluor in een Beekman LS 3801 teller. Proliferatie-indices werden berekend door cpm gemiddelden van vier cupjes gestimuleerd met elk antigeen te delen door het cpm-gemiddelde van de controle (media).

De resultaten in tabel B tonen aan dat T-cellen prolifereren in 35 reactie op het p97 proteïne antigeen.

Teneinde vast te stellen of helpercellen tevens door het recombinantenvirus in miltcellen uit geïmmuniseerde muizen werden gestimuleerd, werden de cellen in vitro gestimuleerd en de vloeistoflagen onderzocht 8700285 -48- op produktie van interleukine-2 (IL-2), een helper T-celfactor. Miltcellen werden gekweekt uit muizen die tweemaal tevoren waren geïmmuniseerd 5 met recombinant Vp 97a-NY vaccinia of parentaal vaccinia. 10 cellen werden gedurende 48 uur in 0,2 ml van een medium, identiek aan dat 5 toegepast voor de proliferatiebepalingen, geïncubeerd in rondbodem platen met 96 cupjes, in aanwezigheid of afwezigheid van het stimulerende antigeen. De vloeibare lagen werden verzameld, samengevoegd uit 4 cupjes en voorafgaande aan de IL-2 bepaling bevroren. In de IL-2 bepa- 4 ling werden 10 eerdere IL-2 muize T-cellijn CTLL cellen in elk cupje 10' met variërende verdunningen van analysevloeistoflaag met Click's Medium in triplicaat geïncubeerd. Er werd een standaardkromme geconstrueerd met recombinant IL-2 verkregen van Genentech, CA. CTLL .cellen werden pulse-gemerkt met thymidine volgens de gebruikelijke poliferatiebepa-lingstechniek in de laatste 6 uur van 24 uur incubatie, daarna geonnen 15 en geteld als beschreven voor de proliferatiebepalingsmethoden. De resultaten die in tabel C worden gegeven tonen aan dat IL-2 produktie uit miltcellen van muizen geïmmuniseerd met recombinant p97 vacciniavirus in vitro wordt gestimuleerd door p97.

20 TABEL C.

Stimulering van IL-2produktie door p!97 immuun miltcellen.

Vaccinatie In vitro stimulans Eenheden immunogeen geproduceerd IL-2 25 Vp97a-NY p97 proteïne 4,4 (20 yg/ml)

Vp97a-NY Medium 0,25

Vwt-NY p97 proteïne (20 yg/ml) 0,25

Vwt-NY Medium 0,25 30 Bovendien werd een vertraagd type hypergevoeligheidsreactie ge meten met de pootzoolkussen-zwelbepaling in Vp97a-NY geinoculeerde muizen Vijf muizen (C3H/Hen stam) per groep werden geïnoculeerd door staart-scarificatie met recombinant of parentaal stamvacciniavirus. Zes dagen later werden de achterpoten van elke muis besmet door inoculatie van 35 20 ylPBSof 20 μΐ cellen in PBS (5 x 10~* cellen per muis). De zoolkus- sens werden 24 uur later in een dubbel blinde proef gemeten met behulp 8700280 -49-.

* "* van een Fowler micrometer. De zoolkussendikte van het met PBS-gexnjec-teerde zoolkussen werd afgetrokken van de gemeten dikte van de experimentele poot van elke muis, en het gemiddelde alsmede standaarddeviaties van de incrementele zoolkussenzwelling werden berekend. De resultaten 5 in tabel D weergegeven tonen de inductie van een p97-specifiek vertraagd type hypergevoeligheidsreactie bij muizen geïmmuniseerd met recombinant p97 vacciniavirus.

TABEL D.

10 Antigeen-specifieke zoolkussenzwelling in p97 immune muizen.

Vaccinatie Besmettend antigeen Pootkussenzwelling immunogeen , „-2% (mm x 10 )

Vp97a-NY p97-door transfectie 40,3 (+/- 6,8) 15 verkregen syngene tumorcellen

Vp97a-NY parentale syngene 3,0 (+/ 2,8) tumorcellen

Vwt-NY p97-door transfectie 1,5 (+/- 2,3) verkregen syngene 20 tumorcellen

Vwt-NY parentale syngene 5,5 (+/- 5,0) tumorcellen 7.4. Bescherming en therapie met p97 vacciniavirus in een murien _tumormodel.____________ 25 Teneinde het vaccinatierendement te bepalen werden de muizen volgens verschillende protocollen gevaccineerd onder toepassing van het recombinant p97 vacciniavirus van de uitvinding en daarna besmet met een p97-overgebrachte syngene tumorcel (M2SVp97a.2E) Voor dit doel werden de muizen geïmmuniseerd met Vp97a-NY recombinant levend vaccinia- 30 virus of de parentale stam (Vwt-NY) door staartscarificatie;of met 100 6 ug gezuiverd p97 proteïne of 5 x 10 bestraalde M2-K1735 tumorcellen intraperitoneaal in compleet Freund's adjuvans. Twee weken na de laatste vaccinatie werd een intraveneuze tumorcel-besmetting gegeven door injectie van M2SVp97a2E, een metastatische tumorkloon verkregen uit M2-K1735 35 (een murien melanomamodel) door transfectie met de humane p97 coderende volgorde aanwezig in een expressieplasmide gestuurd door de SV40 vroege promotor. Er werden diverse expressieklonen gekozen en de één töegepast 8700285 * > -50- voor tumorbesmetting,kloon M2SVp97a.2E, brengt een mediumniveau van p97 tot expressie, ongeveer 400.000 moleculen per cel of equivalent aan humane melanoma p97 antigeen dichtheid. Er werden twee doseringen van in- 5 5 traveneuze tumorbesmetting toegepast, 5 x 10 of 1 x 10 cellen die in 5 de staartader van syngene C3H/Hen muizen werden geïnjecteerd. De muizen werden 16 dagen na de tumorbesmetting geofferd en de longen verwijderd. Een muis werd als positief geteld indien er met het blote oog tumors op longen gekleurd met Indiase inkt aanwezig waren. De resultaten worden in tabel E getoond.

10 TABEL E.

Besmetting van gevaccineerde muizen met syngene p97 overgebrachte _me lanomac e Hen._

Vaccin Aantal Besmettings- Aantal muizen met dui- immunisaties celdosis delijke longmetastase 15 Vp97a-NY 2 5 x 105 1/5 " 1 " 2/4 bestraalde syngene melanomacellen 2 " 0/4

Vwt-NY 2 " 9/10 20 p97 proteïne 2 " 3/3

Vp97a-NY 2 1 x 105 0/1 " 1 " 0/4

Natief 0 " 5/6

De resultaten in tabel E aangegeven demonstreren dat er een aan-25 zienlijk beschermend effect met twee immunisaties van Vp97a-NY werd verkregen hoewel er geen beschermend effect zichtbaar was met het gezuiverde p97 proteïnevaccin (ongeacht de extreem hoge opgeroepen anti-lichaamtiters). Het vermogen van het recombinantenvirus cellulaire immuniteit op te roepen kan verantwoordelijk zijn voor zijn beschermende 30 tumorimmuniteit.

In een therapie-experiment werden muizen geïnoculeerd met een lage dosis van p97- tot expressie brengende tumorcellen en daarna twee dagen later geïnoculeerd met het recombinant vacciniavaccin. Muizen 5 4 werden intraveneus besnet met 10 of 10 p97- tot expressie brengende 35 tumorcellen (M2-SVp97a.E).Twee dagen later werden de mirizen geïnoculeerd door staartscarificatie hetzij met Vp97a-NY. Wekelijkse inocula- 8700285 — * -51- ties door staartscarificatie werden herhaald en het aantal overlevende muizen opgeschreven. De resultaten die in figuur 10 zijn aangegeven wijzen op het therapeutische effect van de recombinant p97 vacciniavirus-vaccinatie bij muizen met bestaande longmetastase.

5 7.5. Recombinant p97 vacciniavirus is immunogeen in makaakapen.

Twee Macaca fasicularis (makaak) apen werden ingesneden met g " hetzij 2 x 10 plaque-vormende eenheden (pfu) van een Vp97a-NY recombinant vaccinia of dezelfde dosis van parentaal stamvaccinia. Twee weken later werden de sera door ELISA onderzocht op titers voor vaccinia en 10 p97. De resultaten aangegeven in tabel F demonstreren dat humorale anti- lichamen tegen p97 twee weken na de enkele inoculatie met Vp97a-NY detecteerbaar waren.

TABEL F.

15 Serum antjlichaam titers in vaccinia geïnoculeerde apen.

Immunogeen/week Anti-vacciniatiter Anti-p97 titer (pg/ml (serumverdunning monoklonaal antilichaanx mronSyeemaal achter- equivalenten)

Vp97a-NY/week 0 1/20 0,54 20 Vp97a-NY/week 2 1/2000 6,54

Vwt-NY/week 0 1/20 0,50

Vwt-NY/week 2 1/2000 0,34 8. Depot van micro-organismen.

25 De volgende E. colistam die het vermelde plasmide draagt is bij ATCC Rockville, MD gedeponeerd, waaraan het volgende toegangsnummer is toegekendi E. coli Stammen Plasmide Toegangsnummer E. coli HB101 p97b 53.403 30 Het volgende recombinant vacciniavirus is gedeponeerd bij ATCC,

Rockville, MD waaraan het volgende toegangsnummer is toegekend:

Virus Toegangsnummer

Vp97a-NY VR 2159

De volgende cellijnen die de vermelde plasmiden dragen zijn ge-35 deponeerd bij ATCC, Rockville, MD, waaraan de volgende toegangsnummers zijn toegekend: 8700285 ·* ' » -52-

Cellijn Plasmide Toegangsnummer ΊΚΜρ97-12 (muizecel) PMTp97b CRL 8985

Bl6SVp97a.14 (muize-melanomacel) pSVp97a CRL 9304 5 De onderhavige uitvinding mag niet worden beperkt door de micro- organismen en de cellen die zijn gedeponeerd aangezien de gedeponeerde uitvoeringsvorm slechts als enkele illustratie van één aspect van de uitvinding is bedoeld en alle micro-organismen of cellen die functioneel equivalent zijn binnen het kader van deze uitvinding vallen.

10 Het zal tevens duidelijk zijn dat alle fasepaarafmetingen die voor de nucleotide zijn gegeven benaderde waarden zijn en slechts ter-wille van de beschrijving worden toegepast.

8700285

Claims

1. Nagenoeg zuiver antigeen peptide of proteïne samenhangend met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen.

2. Peptide of proteïne volgens conclusie 1, met.het kenmerk, dat dit een aminozuurvolgorde heeft die de aminozuurvolgorde nagenoeg als 5 geschetst in figuur 3 of een antigenisch deel daarvan omvat. 3« Peptide of proteïne volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het peptide of proteïne is gezuiverd uit een gekweekte cel die een nucleotidevolgorde bevat die codeert voor het peptide of proteïne, dat onder controle staat van een tweede nucleotidevolgorde, die de gen-10 expressie reguleert en wel zodanig dat het peptide of proteïne door de gekweekte cellen tot expressie wordt gebracht.

4. Peptide of proteïne volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de gekweekte cel een micro-organisme omvat.

5. Peptide of proteïne volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat 15 het micro-organisme een bacterie omvat.

6. Peptide of proteïne volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het micro-organisme gist omvat.

7. Peptide of proteïne volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de gekweekte cel een dierlijke cellijn omvat.

8. Peptide of proteïne volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de gekweekte cel een insecten cellijn omvat.

9. Peptide of proteïne volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het peptide of proteïne chemisch is gesynthetiseerd.

10. Recombinant virus, waarvan het genoom een nucleotidevolgorde 25 omvat ‘die codeert voor een antigenisch peptide of proteïne die samenhangen met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen of een antigenisch deel daarvan, dat onder controle staat van een tweede nucleotidevolgorde die de genexpressie reguleert en wel zodanig dat het peptide of proteïne samenhangend met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen in 30 een gastheer geïnfecteerd met het virus tot expressie wordt gebracht.

11. Recombinant virus volgens.conclusie 10, met het kenmerk, dat de nucleotidevolgorde die codeert voor een antigenisch peptide of proteïne dat samenhangt met het melanoma-geassocieerde p97 antigeen de 87ÜQ283 -54- nucleotidevolgorde nagenoeg als geschetst in figuur 3 of een deel daarvan dat codeert voor een antigenisch peptide of proteïne omvat.

12. Virus volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk, dat dit een ommanteld virus bevat.

13. Virus volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat dit een vacci nia virus omvat.

14. Virus volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk, dat dit een virus zonder enige omhulling omvat.

15. Virus volgens conclusie 14, omvattende een adenovirus.

16. Virus volgens conclusie 10 of 11, omvattende een nucleair poly- hedrosisvirus.

17. Virus volgens conclusie 16, omvattende een baculovirus.

18. Virus volgens conclusie 10 of 11, omvattende een bacteriofaag.

19. Virus volgens conclusie 18, omvattende een lambdafaag. 15 20.· Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 1 of 2, gemengd met een farmaceutische drager omvat.

21. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 3, gemengd met een 20 farmaceutische drager omvat.

22. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 4, gemengd met een farmaceutische drager omvat.

23. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve 25 dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 5, gemengd met een farmaceutische drager omvat.

24. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne van conclusie 6, gemengd met een farmaceutische drager omvat.

25. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 7, gemengd met een farmaceutische drager omvat.

26. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 8, gemengd met 35 een farmaceutische drager omvat.

27. Subeenheid vaccinpreparaat waarin het immunogeen een effectieve dosis van het peptide of proteïne volgens conclusie 9, gemengd met een 8700285 Γ > ' -55- farmaceutische drager omvat.

28. Levend virusvaccinpreparaat omvattende het recombinant virus van conclusie 10 of 11, waarin het virus infectieus is zonder ziekte in een te vaccineren gastheer te veroorzaken..

29. Levend virusvaccinpreparaat volgens conclusie 28, waarin het recombinant virus een ommantelde virus omvat.

30. Levend virusvaccinpreparaat volgens conclusie 29, waarin het ommantelde virus een vacciniavirus omvat.

31. Levend virusvaccinpreparaat volgens conclusie 28, waarin het 10 recombinant virus een virus zonder enige omhulling omvat.

32. Levend virusvaccinpreparaat volgens conclusie 31, waarin het niet-omhulde virus een adenovirus omvat.

33. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 10 of 11 in een niet-in- 15 fectieuze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

34. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 12 in een niet-infecti-euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

35. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve 20 dosis van het recombinant virus van conclusie 13 in een niet-infecti- euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

36. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 10 in een niet-infecti-euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

37. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 15 in een niet-infecti-euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

38. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 16 in een niet-infecti- 30 euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

39. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve dosis van het recombinant virus van conclusie 17 in een niet-infecti-euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager.

40. Geïnactiveerd virusvaccinpreparaat omvattende een effectieve 35 dosis van het recombinant virus van conclusie 18 in een niet-infecti- euze toestand, gemengd met een farmaceutische drager. 8700285 * - * -56-

41. Recombinant DNA-vector omvattende p97b.

42. Unicellulair organisme dat de recombinant DNA-vector van conclusie 41 omvat.

43. Bacterie dat de recombinant DNA-vector van conclusie 41 bevat.

44. Bacterie volgens conclusie 43 omvattende Escherichia coli als gedeponeerd'bij het ATCC waaraan het toegangsnummer 53403 is toegekend, of een mutant, een recombinant of een genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.

45. Recombinante DNA-vector die pMT97b omvat.

46. Cellijn bevattende de recombinant DNA-vector van conclusie 45.

47. Cellijn volgens conclusie 45 omvattende TKMp97-12, zoals gedeponeerd bij het ATCC waaraan het toegangsnummer CRL 8985 is toegekend of een mutant, een recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.

48. Recombinante DNA-vector die pSVp97a omvat.

49. Cellijn die de recombinant DNA-vector van conclusie 48 bevat.

50. Cellijn volgens conclusie 49 omvattende B16SVp97a.l4 als gedeponeerd bij het ATCC en met het toegekende toegangsnummer CRL 9304 of een mutant, recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan.

51. Virus volgens conclusie 13 omvattende virus Vp97a-NY als gede poneerd bij het ATCC en met het toegekende toegangsnummer VR 2159 of een mutant, recombinant of genetisch gemanipuleerd derivaat daarvan. 8700205