CH675424A5 - Melanoma-associated antigen peptide(s) - Google Patents

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CH675424A5
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melanoma
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CH471/87A
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Joseph P Brown
Gregory D Plowman
Karl E Hellstrom
Anthony F Purchio
Sridhar Pennathur
Charles D Estin
Timothy M Rose
Ingegerd Hellstrom
Shiu-Lok Hu
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Oncogen
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Description

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CH 675 424 A5
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung ist auf antigenische Peptide oder Proteine gerichtet, welche eine Immun-Antwort induzieren können, die in einem mit solchen Peptiden geimpften Individuum selektiv Melanomzel-len zerstören können. Demzufolge wird ein Peptid oder Protein, welches einem Melanom zugeordneten Antigen verwandt ist, in grossen Quantitäten durch rekombinante DNA-Techniken und/oder durch chemisch synthetische Methoden hergestellt. Das erfindungsgemässe Peptid oder Protein kann als Immunogen in Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. In gewissen Ausführungsformen, worin das Peptid oder Protein, welches einem Melanom zugeordneten Antigen verwandt ist, durch ein rekombinantes Virus exprimiert wird, können die rekombinanten Viren selbst als Immunogene in Impfstoff-Formulierungen eingesetzt werden. Die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken und ebenso chemisch-synthetische Methoden ermöglichen die Herstellung von Peptiden und Proteinen, welche dem Melanom zugeordneten Antigen verwandt sind, in grossen Quantitäten.
Die Erfindung wird beispielsweise unter Verwendung von Immunogenen Peptiden erläutert, die dem p97 verwandt sind, einem monomeren Zelloberflächen-Sialoglycoprotein mit dem scheinbaren Molekulargewicht von etwas weniger als 97 000 Datons, welches eine Zelloberflächen-Komponente von Melanom-Zeilen darstellt.
Die Arbeit mit Versuchstieren, insbesondere mit Nagetieren, hat gezeigt, dass die meisten Tumore, welche durch oncogene Viren erzeugt werden, Antigene exprimieren, die durch das virale Genom codiert werden und dass die Immunisierung mit diesen Antigenen zur Rückweisung einer nachfolgenden Herausforderung von Tumorzellen, die durch das gleiche Virus induziert worden sind, führen kann. Obwohl der Hauptteil dieser Arbeit mit Laboratoriumsstämmen von Viren, wie SV40, das Polyomvirus und die Mäuseleukämie-Viren nach Friend, Moloney oder Rauscher, durchgeführt wurde, ist die horizontale und vertikale Übertragung von oncogenen Viren in der Natur demonstriert worden; tatsächlich ist nun ein kommerzieller Impfstoff gegen virusinduzierte Katzenleukämie und Sarcom erhältlich.
Im Gegensatz dazu, ist eine virale Ursache der meisten humanen Krebsarten nicht nachgewiesen worden. Bemerkenswerte Ausnahmen sind das Hepatitis-Virus (Hepatom), das Herpes-Simplex-Virus (das cervicale Carcinom) und das Epstein-Barr-Virus (das nasopharyngeale Carcinom). Während den letzten zwei Jahrzehnten ist jedoch erkannt worden, dass einige humane Tumorzellen, Tumor-Antigene exprimieren, d.h. Antigene, welche die Tumorzelle von entsprechenden normalen Zellen unterscheiden können; einige Patienten zeigen zellvermittelte oder humorale Immun-Antworten gegen diese Antigene auf (Hellstrom et al., 1968, nature, 220:1352; Morton et al., 1968, Science 162:1279-1281 ; Shiku et al., 1976, J. Exp. Med., 144: 873-881). Einige Ziele dieser Immun-Antworten sind oncofötaie oder Unterschei-dungs-Antigene, die durch humane Genome codiert werden (Hellstrom et al., 1970, Int. J. Cancer, 6: 346-351).
Bis vor kurzem war die molekulare Natur von Tumor-Antigenen unbekannt und der Grad der Tumor-spezifität von immunologischen Reaktionen war unklar. Versuche, diese Information bei der Entwicklung von Krebs-Diagnostiktests oder Krebs-Therapien zu verwenden, haben sich als weitgehend erfolglos erwiesen. Da spontane Tumor-Regressionen extrem selten sind, kann man ebenfalls schliessen, dass die Immun-Antworten, die in vitro demonstriert wurden, in vivo unwirksam sind; beispielsweise können Antikörper und Lymphocyten, die von einem Krebspatienten erhalten werden, wirksam bei der Abtötung von Tumorzellen in vitro verwendet werden, wogegen die Immun-Antwort des gleichen Krebspatienten in vivo keine Wirkung zeigt.
Die Einführung der monoclonalen Antikörper-Technik durch Kohler und Milstein (1975, Nature, 256: 495-497) führte zu intensivierten Forschungsarbeiten an humanen Tumor-Antigenen, da das Mittel zur Verfügung stand, solche Antigene zu definieren, sowohl auf dem molekularen Bereich, wie bezüglich der Spezifität (Hellstrohm und Brown, 1979, In «The Antigens» M. Sela, ed., Academic Press, Vol. V: 1-66). Während einiger vergangener Jahre wurde eine grosse Anzahl von tumorzugeordneten Antigenen beschrieben, wovon die meisten durch monoclonale Antikörper von Mäusen definiert wurden (Reisfeld und Seil, Herausgeber, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cel-lular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, S. 1-609). Obschon im Grunde genommen sämtliche der Antigene, die wohl charakterisiert worden sind, sich als oncofötaie oder Unter-scheidungs-Antigene erwiesen haben und ihre Spezifität gegen Tumore mehr als quantitativ und weniger als qualitativ nachgewiesen wurde, sind einige Antigene genügend spezifisch für neoplastische gegen normale Zellen (im allgemeinen entsprechend einem Faktor von 10 zu 1000 Mal), um sie als potentielle Ziele für die Identifizierung von Tumorzellen und für die Therapie zu verwenden. Es wurden ebenfalls humane, monoclonale Antikörper für Tumor-Antigene erhalten (Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sei. 80: 2026-2030). Dies unterstützt den vorher zitierten Beweis, dass einige Krebspatienten eine Immunreaktion gegen ihre Tumore zeigen.
Mehr als die Hälfte der tumorassoziierten Oberflächen-Zellantigene sind, soweit sie identifiziert sind, Proteine oder Glyco-Proteine, die humane Genome codieren (weniger durch endogene oder exogene Viren), wobei der Rest Glyco-Lipide sind, die von der abnormalen Expression oder der Regulierung von Giycosyl-Transferasen herrühren.
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Das dem Melamon zugeordnete p97-Antiaeri
Das p97-Antigen ist ein tumorzugeordnetes Antigen, welches zuerst bei humanem Melanom unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern identifiziert wurde (Brown et al, 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Dippold et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 77: 6114-6118; Woodbury et al, 1980, Proc. Natr. Acad. Sei. USA 77: 2183-2187). Das p97-Antigen ist bezüglich seiner Expression in normalen und neoplastischen Geweben, extensiv studiert worden und es ist in den meisten Melanomen und in gewissen fötalen Geweben vorhanden, wurde jedoch nur spurenweise in normalem, erwachsenem Gewebe nachgewiesen (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546; Brown et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 539-543; Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer, 29: 511-515). p97 ist als Ziel für die diagnostische Abbildung von Melanomen in humanen, klinischen Versuchen verwendet worden (Larson et al, 1983, J. Clin. Invest. 72:2101-2114).
p97 ist ein monomeres Zelloberflächen-Sialoglyeoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht (MW), wie durch Natrium dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemessen (SDSPAGE) von etwas weniger als 97 000 Dalton. Die monoclonalen Antikörper haben drei antigenische Hauptzentren definiert, welche auf einem stabilen tryptischen Fragment von 40 000 Dalton vorhanden sind (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546); die vollständige Sequenz von p97 ist jedoch nicht beschrieben worden. Mindestens zwei andere unabhängige charakterisierte zu humanem Melanom gehörende Antigene, nämlich gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. nati. Acad. Sei. USA, 77: 6114-6118) und gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer, 35: 73-80) scheinen mit p97 identisch zu sein, wie dies durch sequenale Immuno-präcipitation analysiert wurde.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von p97 ist mit Transferrin homolog, und wie Transferrin, bindet p97 Eisen (Brown et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173). Analysen von somatischen Zellhybriden und die in situ-Hvbridisieruna haben gezeigt, dass das p97-Gen, wie die Gene für Transferrin und den Transferrin-Rezeptor, in der chromosomalen Region 3q21-2q29 vorliegt (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72; Yant et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 81; 2752-2756). Diese Beobachtungen führen zum Schluss, dass p97 eine Rolle im Eisenmetabolismus spielt.
Krebs-Impfstoffe
Studien in Versuchstieren, normalerweise bei Mäusen haben gezeigt, dass die Immunisierung mit lebenden oder toten Krebszellen zur Abwehr einer nachfolgenden Herausforderung durch lebensfähige Krebszellen führen kann. Immunisationsversuche mit zellfreiem Material war im allgemeinen weniger erfolgreich, es wurden jedoch einige Erfolge beschrieben. Für einen Überblick vergleiche Hellstrom und Brown, 1979, in «The Antigens», M. Sela ed. Academic Press, Vol. V: 1-66. In vielen Fällen sind die Ziel-Antigene, die für die protektiven Effekte verantwortlich sind, viral codiert worden, jedoch in vielen anderen Fällen, ist die Natur des Antigens, welches eine protektive Immun-Antwort bewirkt, unbekannt.
Studien beim Menschen sind viel schwieriger, und die Wirksamkeit von Krebs-Impfstoffen ist umstritten, trotz einiger Erfolge, die gemeldet wurden. In einigen Fällen, bestehen die Impfstoff-Zubereitungen aus bestrahlten Tumorzellen oder aus Tumorzellen oder abgetöteten Tumorzellen, welche Chemikalien ausgesetzt worden waren. Da reine, dem menschlichen Tumor zugeordnete Antigene nicht erhältlich sind, existieren keine Berichte über ihre Verwendung in Impfstoffen.
Ein theoretischer Haupteinwand zur vorgeschlagenen Verwendung von Krebs-Impfstoffen bei Menschen, besteht darin, dass Menschen, welche beispielsweise mit abgetöteten Krebszellen oder zellfreien Präparaten «geimpft» sind, immunologisch unreaktiv sind, da die Tumor-Antigene, welche die Ziele der Immun-Antwort sein könnten, in einigen normalen Zellen vorhanden sind, trotzdem nur spurenweise, werden sie vom Immun-System als «selbst» erkannt. Die meisten, wenn nicht alle, dem Tumor zugeordneten Antigene, welche in humanen Tumoren durch monoclonale Antikörper entdeckt werden, sind ebenfalls in einigen normalen Geweben vorhanden und demzufolge besteht wenig Aussicht, dass Krebspatienten darauf in vivo wirksam reagieren. Es ist nachgewiesen, dass die Suppressor-Zellen eine Hauptrolle bei der Hinunterregulierung bei der Immun-Antwort gegen Tumor-Antigene spielen (Nepon et al., 1983, Experientia, 39: 235-242). Des weiteren kann eine Suppressor-Zellantwort, welche durch einen Satz von Tumor-Antigenen eingeleitet wird, die Induktion einer wirksamen tumor-zerstörenden Reaktion auf einen anderen Satz von Tumor-Antigenen einleiten, welche alleine die Subversion nicht induzieren würden (Hellstrom et al., 1983, in «Biomembranes», A. Nowotny ed., Plenum Press, Seiten 365-388).
Rekombinante DNA-Techniken und Impfstoff-Virus
Die Venwendung der rekombinanten DNA-Technologie für die Herstellung von Untereinheits-Impf-stoffen zum Schutz gegen Infektionen umfasst das molekulare Cloning und die Expression in einem zweckmässigen Vektor mit genetischer Information, welche Proteine codiert, die eine Immun-Antwort gegen das Protein im Wirts-Tier auslösen können. Kürzlich ist ein neuer Weg beschrieben worden, welcher potentiell nützlich für die Herstellung von Untereinheits-Impfstoffen ist (Mackett et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sei., 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol., 49: 857-864; Panicali, D. und Paoletti,
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E., 1982, Proc. nati. Acad. Sci., 79: 4927-4931). Dieser Weg umfasst die Verwendung des Vaccinia-Virus als Vektor zur Expression von fremden Genen, die als Insertion in sein Genom eingeführt wurden. Nach seiner Einführung in ein Wirts-Tier exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das insertierte fremde Gen, wobei er eine Immun-Antwort beim Wirt gegen solche Genprodukte auslöst. Da das lebende rekombinante Vaccinia-Virus als Impfstoff verwendet werden kann, kombiniert dieser Weg die Vorteile der Untereinheits-, wie auch der lebenden Impfstoffe.
Das Vaccinia-Virus enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 187 Kilobasen-Paaren und repliziert im Cytoplasma von infiszierten Zellen. Diese Viren enthalten ein vollständiges Transkriptionsenzym-System (einschliesslich Überkappungs-, Methylierungs- und Polyadenylierungsenzy-me) im Viruskern, welche für die Virusinfektiosität nötig sind. Die transkriptionalen Regulationssequenzen des Impfstoff-Virus (Promotoren) ermöglichen die Einleitung der Transkription durch Impfstoff-RNA-Polymerase, jedoch nicht durch Wirtszellen-RNA-Polymerase.
Die Expression der fremden DNA in rekombinanten Vaccinia-Viren erfordert das Binden von Vac-cinia-Promotoren an Protein-codierende DNA-Sequenzen des fremden Gens. Es wurden Plasmid-Vek-toren, die ebenfalls Insertions-Vektoren genannt werden, konstruiert, um im Vaccinia-Virus die Insertion eines chimerischen Genes vorzunehmen. Ein Typ eines Insertions-Vektors ist zusammengesetzt aus:
a) einem Vaccinia-Virus-Promotor, welches das Transkriptions-Einleitungszentrum enthält;
b) einigen einzelnen Restriktions-Endonucleasen clonende Zentren die stromabwärts von der Trans-kriptions-Startstelle für die Insertion von fremden DNA-Fragmenten liegen;
c) nicht-essentielles Vaccinia-Virus DNA (wie das TK-Gen), das den Promotor flankiert und Clonie-rungssteilen, welche die Insertion des chimerischen Gens in die homologe, nicht-essentielle Region des Virus-Genoms steuern; und d) einen bakteriellen Ursprung für die Replikation und einen antibiotischen Resistenz-Marker für die Replikation und Selektion in E. coli.
Beispiele solcher Vektoren wurden beschrieben durch MacKett (Mackett et al., 1984, J. Viral. 49: 857-864).
Die rekombinanten Vaccinia-Viren werden produziert durch Transfektion von rekombinanten bakteriellen Insertions-Plasmiden, die fremde Gene enthalten, in Zellen, die vorher durch Vaccinia-Viren infis-ziert wurden. Die homologe Rekombination findet mit den infiszierten Stellen statt und bewirkt die Insertion des fremden Gens im viralen Genom. Die infiszierten Zellen können unter Verwendung der üblichen immunologischen Techniken, der DNA-Plaque-Hybridisierung oder der genetischen Selektion für rekombinante Viren, die anschliessend isoliert werden können, einem Screening unterworfen werden. Diese Vaccinia-Rekombinanten weisen ihre ursprünglichen Funktionen und Infektivität auf und können so konstruiert werden, dass sie etwa 35 Kilobasen fremde DNA aufnehmen.
Die fremde Gen-Expression kann durch enzymatische oder immunologische Assays nachgewiesen werden (z.B. durch Immunopräcipitation, Radio-Immunoassay oder Immuno-Blotting). Natürlich vorkommende Membran-Glycoproteine, die aus infiszierten Zellen aus rekombinanten Impfstoffen produziert werden, werden glykosiliert und können auf die Zelloberfläche transportiert werden. Der hohe Expressionsgrad kann erhalten werden, indem starke Promotoren verwendet werden oder indem multiple Kopien eines einzelnen Gen geclont werden.
Es werden Impfstoff-Formulierungen beschrieben, die verwendet werden können, um eine Immun-Antwort zu induzieren, die Melanom-Zellen in geimpften Individuen selektiv zerstört. Spezifischer enthalten die erfindungsgemässen Impfstoff-Formulierungen ein Immunogen, welches eine Immun-Antwort gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen induziert, wie das Melanom-assoziierte p97-Antigen. Erfin-dungsgemäss ist eine Anzahl von Impfstoff-Formulierungen möglich. Beispielsweise enthält das Immunogen eines «Untereinheits-Impfstoffes» gemäss der vorliegenden Erfindung ein Peptid oder Protein, welches dem p97 verwandt ist und welches in einem zweckmässigen Adjuvans formuliert werden kann. Solche Peptide oder Proteine enthalten Aminosäuresequenzen, die von der gesamten oder einem Teil der Aminosäuresequenz von p97, wie sie im wesentlichen in Figur 3 dargestellt ist, abgeleitet ist und geänderte Aminosäuresequenzen umfassen, worin funktionelle äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, in einem stillen Wechsel und/oder modifizierte oder entwickelte Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise glycosilierte Aminosäuresequenzen, phosporilierte Aminosäuresequenzen usw. oder chemisch modifizierte Aminosäuresequenzen enthalten. Nachstehend werden die erfindungsgemässen Peptide oder Proteine, welche dem Melanom-assoziierten p97-Antigen verwandt sind, wenn sie geändert, umgeändert, modifiziert oder unmodifiziert sind, als «p97 verwandte Peptide» bezeichnet. Falls das p97 verwandte Peptid ein Hapten ist (beispielsweise antigenisch, jedoch nicht immunogenisch) kann das Haptent mit einem Trägermolekül, welches Immunogenität verleiht, konjugiert sein.
Die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide können unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken und/oder chemisch-synthetischen Methoden hergestellt werden. Wenn p97-verwandte Peptide chemisch synthetisiert werden, können solche synthetischen p97-verwandten Peptide ebenfalls diejenigen Aminosäuresequenzen enthalten, die von den Regionen von p97 abgeleitet sind, von welchen
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angenommen wird, dass sie antigenisch sind (Hopp und Woods, 1981, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 3824-3828). Falls die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, wird eine Insertion einer Nukleotid-Sequenz, die das gesamte oder ein Teil von p97 codiert, in einem rekombinaten Expressions-Vektor vorgenommen, wie in einem Virus oder einem Plasmid, welches in einem zweckmässigen Wirt die Expression eines p97-verwandten Peptides, welches aus dem Kulturmedium gereinigt werden kann, steuern kann. Die eingefügte Nukleotid-Sequenz wird von der gesamten oder von einem Teil der p97-Sequenz abgeleitet, wie sie in Figur 3 dargestellt ist, einschliesslich, jedoch nicht eingeschränkt auf Nukleotid-Sequenzen, worin funktionell äquivalente Nukleotid-Codon durch Codons innerhalb der Sequenz als Resultat eines stillen Wechsels substituiert sind; in anderen Worten, verschiedene Codons, welche die gleiche Aminosäure codieren oder funktionelle Äquivalente davon, können in der Sequenz gemäss Figur 3 substituiert sein. Wenn ein Plasmidexpressions-Vektor verwendet wird, ist ein solcher bevorzugt, welcher für die Expression in eu-karyotischen Zellen zweckmässig ist, es kann jedoch auch ein prokaryotischer Expressions-Vektor verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, in welcher der Expressions-Vektor ein rekombi-nantes Virus ist, kann ein Impfstoff als viraler Impfstoff formuliert werden, in welchem Fall das Immunogen den rekombinanten Virus umfasst, welcher ein p97-verwandtes Peptid exprimiert. Je nach der Natur des rekombinanten Virus, welches als Immunogen eingesetzt wird, kann der Impfstoff entweder als inaktivierter Impfstoff oder als lebender Impfstoff formuliert werden. Eine zweckmässige Immunisierung mit erfindungsgemässen Impfstoff-Formulierungen kann zur Induktion einer Immun-Antwort führen, welcher zur Zerstörung von Melanom-Zellen im immunisierten Subjekt führt.
Die Beschreibung gibt ebenfalls ein System an, worin die Impfstoff-Formulierung geprüft werden kann und gibt an, wie der Test durchgeführt werden sollte. Beispielsweise können Impfstoff-Formulie-rungen aufgrund der Wirksamkeit in Tiermodellen, ursprünglich bei Nagetieren, dann bei nicht-humanen Primaten und schiesslich bei Menschen, vorzugsweise bei Patienten, welche in der Remission sind, wobei jedoch gegen Mikrometastasen eine hohe Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens besteht, getestet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt ein Autoradiogramm des zellfreien Translationsproduktes der p97-mRNA, durchgeführt durch SDS-PAGE.
Figur 1A zeigt in Bahn 1 das Translationsprodukt von p97, das angereichert an mRNA ist, wogegen die Bahn 2 das Translationsprodukt zeigt, das nicht angereichert an mRNA ist, jede ist von insgesamt 0,5 jxl Translationsprodukt von 5 ng mRNA abgeleitet. In
Figur 1B zeigt die Bahn 1 das Translationsprodukt von p97, das an mRNA angereichert ist, wogegen Bahn 2 das Translationsprodukt zeigt, welches nicht mit mRNA angereichert ist, wobei jedes Produkt von 5 jj.I Translationsprodukt von 5 ng mRNA abgeleitet ist, welches mit Anti-p97-Serum immunopräcipi-tiert worden ist.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung der Struktur der p97-mRNA. Es ist die Anordnung der codierenden Region (von der Signalsequenz zur Ankersequenz) und die nicht-codierende Region (3'UT) ebenso wie die Struktur des duplizierten Bereiches des p97-Vorläufers (offener Balken) angegeben. Die Lokalisierung von verschiedenen Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen ist oberhalb der mRNA angegeben. Die relativen Positionen von vier cDNA-Clonen sind unterhalb der mRNA-Struktur angegeben. Das cDNA-Clon p97-3a2fl (3a2f!) wurde aus einer cDNA-Genbank isoliert, worin die cDNAs auf Oligo(T)-vorbereiteten p97-angereicherten mRNAs transkribiert und in pBR344 geclont wurden; wogegen cDNA-Clone p97-2fl (2fl), p97ljl (Ijl) und p97-10al (1 Oal) isoliert wurden, indem die cDNA-Synthese mit Oligonukleoiden, welche die p97-Exonsequenzen codieren, vorbereitet wurde und die resultierenden cDNA-Fragmente in A.-gt10 geclont wurden. Die
Figur 2A ist eine schematische Darstellung der genomischen Clone B15, H17, B6.6 und E7.7, die in >147.1 geclont wurden.
Figur 3 stellt die Nukleotid-Sequenz der humanen p97-Vorläufer cDNA dar und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz. Die N-terminalen Aminosäurereste, die vorher durch eine Proteinsequenz-Analyse bestimmt wurden, waren mit denjenigen, welche aus der Nukleotid-Sequenz vorausgesagt waren, identisch (Aminosäurereste der Nummern 21-30). Es sind die potentiellen Glykosilierungsstellen an den Aminosäureresten 37, 135 und 515 (offener Rahmen) und in der Membran-Ankerregion am C-Terminus (fett unterstrichen) angegeben.
Ein Polyadenylierungs-Signal (AATAAA, angegeben durch den Kasten) wurde an der Stelle 3847 entdeckt, welches 50 Basenpaare stromaufwärts vom polyadenylierten Trakt liegt. •
Figur 4 zeigt einen Vergleich der vorausgesagten Aminosäuresequenzen des p97-Vorläufers und desjenigen von humanem Serotransferrin (Yang et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 81.: 2752-2756; Davis et al., 1985 , J . Mol. Bio!., 181:111-121 ). Die beibehaltenen Reste sind in Kasten. Tyrosin, Histidin- und Arginereste, welche an der Eisenbindung von Transferrin beteiligt sind (Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem., 145:659-676) sind durch Sternchen (*) angegeben.
Figur 5 ist eine diagramm-förmige Darstellung eines zweidimensionalen Modelles der Struktur von p97
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auf Basis der Gegenwart von Cystein-Resten, welche zwischen den Transferrin-Superfamilienmitglie-dern erhalten sind. Die drei potentiellen Glycosilierungstellen werden durch Sternchen (*) angegeben. Der hydrophobe Membran-Ankerbereich ist am C-Terminus von p97 (COOH) ersichtlich.
Figur 6 ist eine schematische Darstellung der genetischen Struktur der p97 cDNA-Clone und des Fragmentes des genetischen Clones A.E7.7, welches für die Konstruktion des p97-Expressions-Vek-tors verwendet wird; und des pSV2p97a-Expressions-Vektors. Es werden die folgenden Abkürzungen gebraucht: E, EcoRI: P, Pvull. Sai, Sa[l; S, Sstl; B, BamHI.
Figur 7 zeigt die Resultate von Gel-Elektrophoresen für die Charakterisierung und Immuno-Reinigung von rekombinanten p97-Proteinen. Ein tranfektiertes CHO-Clon (CH03+) und SK-MEL 28 humane Me-lanomzellen wurden mit 35S-Cystein in Gegenwart (+TM) oder in Abwesenheit (-TM) von Tunicamycin (TM) markiert. Die Zellen wurden in 100 mm2-Platten angesetzt, bis nahezu die Konfluenz erreicht war. Das Medium wurde entfernt und mit 3 ml cysteinfreiem Medium ersetzt, mit oder ohne Zugabe von 1 ng/ml Tunicamycin. Nach 30 Min. bei 37°C wurde 250 p.Ci pro ml L-35S-Cystein (1016 Ci per mMol; New England Nuclear) für weitere 6 Std. zugegeben. Die Ernte der Zellen, die Herstellung von Zell-Lysaten, die Immunopräcipitation und die SDS-PAGE wurden wie oben angegeben durchgeführt. Die Extrakte wurden mit p97-spezifischen Antikörpern einer Immunopräcipitation unterworfen und die Proteine wurden durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (SDS-PAGE).
a) SDS-Polyacrylamldgel, gefärbt mit Coomassie-Blau. Bahn 1, Protein-Markierungsmittel; Bahn 2, immungereinigtes p97, ausgeschieden von transferierten B16-Zellen von Mäusen; Bahn 3, SK-MEL
28-Zellen +TM; Bahn 4, SK-MEL 28-Zellen -TM; Bahn 5, CHOS+-Zellen +TM; Bahn 6, CHOS+-Zei-
len-TM.
b) Autoradiogramm des gleichen Gels wie in a)
Figur 8 zeigt die Resultate von Radio-Immunopräcipitaten von exprimierten p97 in transferierten Zellen oder Vp97a-NY-infiszierten Zellen. BSC-Zellen wurden über Nacht mit einem Wildtyp des Impfstoff-Virus oder mit einem p97-rekombinanten Impfstoff-Virus infisziert. Diese Viren oder transferierten Zellinien CHO-p97.A wurden mit 35S-markiertem Methionin und Cystein mit oder ohne Tunicamycin mit einem Gehalt von 2 jig/ml (Sigma) inkubiert. 6 Std. später wurden die Zellen lysiert, mit dem monoclonalen Antikörper 96,5 präcipitiert und durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamid-Gel ausgetrennt. Das Gel wurde über Nacht einer Autoradiographie unterworfen. Die mit Tunocamycin behandelte Gruppe befindet sich rechts von jeder Gruppe.
Figur 9 stellt die Serumantikörper-Titer von Mäusen dar, welche mit den p97-lmfpstoffen immunisiert wurden. Tp97 repräsentiert 5 Mäuse, die mit 5 x 106 bestrahlten M2svp97a.A-Zellen (transfiszierte syngenetische Tumorzellen, die an der Oberfläche p97 exprimieren) in vollständigen Freund-Adjuvanz, immunisiert wurden und mit der gleichen Anzahl Zellen in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nachbehandelt wurden. p97 ist eine Gruppe von 5 Mäusen, die mit 100 g gereinigtem p97-Protein in vollständigem Freund-Adjuvanz immunisiert wurden und mit 5 ng wässrigem Protein nachbehandelt wurden. Vp97 ist eine Gruppe von 5 Mäusen, die mit 107 plaquen-formenden Einheiten von VP97a-NY durch Schwanz-Skarifikation immunisiert und nachbehandelt wurden.
Figur 10 stellt den therapeutischen Effekt einer Impfung von tumorherausgeforderten Mäusen mit einem rekombinanten p97-Impfstoff-Virus (Vp97a-NY) dar. Die Mäuse wurden mit 105 oder 104 p97-expri-mierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E) intravenös herausgefordert. 2 Tage später wurden die Mäuse durch Schwanz-Skarifikation entweder durch Vp97a-NY oder Vwt-NY inokuliert. Die wöchentlichen Inokulationen durch Schwanz-Skarifikation wurden wiederholt und die Überlebenszahl der Mäuse wurde aufgenommen.
Die erfindungsgemässen antigenischen Peptide oder Proteine sind nützlich für die Herstellung von Impfstoffen für die Prävention und Behandlung von Melanomen. Es wurde festgestellt, dass Melanome tumorassoziierte Zelloberflächen-Antigene besitzen, wie das p97-Antigen, welches in grösserer Anzahl in den Melanom-Zellen vorhanden ist, als dies in normalem Gewebe der Fall ist. Die Peptide oder Proteine, welche mit dem Melanom-assoziierten p97-Antigen verwandt sind (d.h. p97-verwandte Peptide) werden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken oder durch chemisch-synthetische Techniken hergestellt. Die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide umfassen Aminsoäuresequenzen, die als Ganzes oder teilweise von der Aminsoäuresequenz von p97 abgeleitet sind, im wesentlichen wie sie in Figur 3 dargestellt ist. Dabei werden Aminosäuresequenzen umfasst, die von Figur 3 abgeleitet sind, indem einer oder mehrere Aminosäurereste durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität ersetzt ist und funktionell äquivalent reagiert und somit eine stille Änderung bewirkt. Als Ersatz für eine Aminsoäure in der Sequenz kann eine andere Aminosäure der gleichen Klasse verwendet werden. Beispielsweise umfassen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Überdies können die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide, ob sie nun durch Substitution von Aminosäureresten geändert sind oder nicht, weiter durch Glycosi-lierung, Phosphorilierung usw. oder durch chemische Änderungen modifiziert oder entwickelt werden. Diese p97-verwandten Peptide können als Immunogene in Impfstoff-Formulierungen eingesetzt werden,
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welche eine Immun-Antwort hervorrufen, die gegen vorhandene Melanomzellen in geimpften Patienten gerichtet sind.
Vorzugsweise werden rekombinante DNA-Techniken verwendet, um Nukleotid-Sequenzen, welche das p97-Antigen codieren, durch Insertion im Expressions-Vektor einzuführen, welche die Expression der p97-verwandten Peptide in zweckmässigen Wirtzellen bewirken. Die Nukleotid-Sequenzen, die das p97-Antigen codieren, umfassen Nukleotid-Sequenzen, die als Ganzes oder teilweise von der p97-Nukleotid-Sequenz abgeleitet sind, wie sie im-wesentlichen in Figur 3 dargestellt ist. Wegen der Entartung des DNA-Codes für Aminosäuren (d.h. die meisten Aminosäuren können durch mehr als ein Codon codiert werden) können funktionell äquivalente Codons (d.h. verschiedene Codons, welche die gleiche Aminosäure oder ein funktionelles Äquivalent davon codieren) innerhalb der p97-Sequenz, wie sie in Figur 3 dargestellt ist, substituiert werden, unter der Voraussetzung, dass die Substitution zu einem stillen Wechsel führt. Die Expression von Vektor-Wirtzellen-Systemen, die eine Nukleotid-Sequenz enthalten, die alle oder einen Teil von p97 codiert, kann zur Herstellung von grossen Mengen von reinen p97-verwandten Peptiden in vitro verwendet werden, wobei die Genprodukte aus den Zellen in den Kulturen gereinigt werden können und als Immunogene in Untereinheits-Impfstoff-Formulierungen eingesetzt werden können. Die Reinigung des p97-verwandten Peptides kann durchgeführt werden, indem eine Vielzahl von biochemischen Verfahren, einschliesslich der Immunoaffinitäts-Reinigung unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, verwendet werden. Zusätzlich kann die Reinigung des p97-verwandten Peptides erleichtert werden, indem die DNA-Sequenzen, weiche p97-verwandte Peptide codieren, modifiziet werden, damit die für die Verankerung des Proteins in der Plasma-Membrane verantwortlichen Sequenzen entfernt werden, während die Sequenzen, welche für den Transport des Proteins zur Zellmembrane verantwortlich sind, nicht entfernt werden, so dass ein amputiertes antigenisches Molekül in das Kulturmedium durch die Wirtzelle ausgeschieden wird. Im Fall, dass die p97-verwandten Peptide durch prokaryotische Zellen erzeugt werden, kann der Mangel an zweckmässigen posttranslationa-len Änderungen dazu führen, dass ein antigenisch inaktives Produkt erhalten wird, welches mit zweckmässigen Chemikalien oder anderen Behandlungen aktiviert werden muss.
In gewissen Ausführungsformen, worin der Expressions-Vektor ein Virus ist, kann das Virus selbst als Impfstoff formuliert werden. In solchen Fällen können inaktive rekombinante Virus-Vaccinen hergestellt werden. Wenn der Expressions-Vektor ein infektiöses rekombinantes Virus darstellt, welches keine Krankheit im Wirt verursacht, kann entweder ein inaktivierter viraler Impfstoff oder eine lebende Virus-Impfstoffzubereitung, welche zu wesentlicher Immunität führt, formuliert werden. Ein besonders wirksamer Expressions-Wirkstoff für diesen Zweck ist ein rekombinanter Impfstoff-Virus, der die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide exprimiert. Zu diesem Zweck kann eine Nukleotid-Sequenz, die das gesamte oder ein Teil des p97-Antigens codiert, in einen Impfstoff-Virus-Vektor, welcher fähig ist, die Expression der Sequenz in einem zweckmässigen Wirt zu führen, als Insertion eingefügt werden. Die Erfindung umfasst die Verwendung von anderen Virus-Expressions-Vektoren als Impfstoffe, insbesondere Adeno-Viren.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von p97 kann auf Sequenzen mit Eigenschaften geprüft werden, Eigenschaften wie insbesondere die Hydrophilität, welche auf die Gegenwart dieser Sequenz auf der Oberfläche des Protein-Moleküls und auf seine mögliche Antigen- und/oder Immunogen-Potenz hindeuten. Diese p97-verwandten Peptide können chemisch synthetisiert werden und als Immunogene in Impf-stoff-Formulierungen verwendet werden.
Die p97-verwandten Peptide können auch für andere Zwecke als für die Impfstoff-Herstellung verwendet werden. Die p97-verwandten Peptide können ebenfalls dazu eingesetzt werden, um Tiere zu immunisieren, um so Antiseren oder monoclonale Antikörper zu produzieren, welche wegen ihrer Spezifität auf Melanom-Zellen von Interesse sind. Diese können als Komponenten in diagnostischen Tests oder für die Affinitäts-Reinigung von radiomarkierten Wirkstoff-gebundenen oder Toxin-gebundenen Antikörpern in der Krebs-Therapie verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand von Beispielen erläutert; sie beschreiben die Herstellung des auf p97-Impfstoffes, weicher gegen das humane Melanom gerichtet ist. Die beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen sind nicht auf die Konstruktion von Impfstoffen, unter Verwendung von p97, eingeschränkt, sondern können auch auf andere Tumor-assoziierte Antigene angewendet werden. Die Erfindung wird wie folgt dargestellt, einzig zum Zweck der Klarheit der Beschreibung:
a) Das Nukleotid und die Aminsosäuresequenz p97;
b) Peptide mit den antigenischen Eigenschaften von p97, die durch chemisch-synthetische Methoden hergestellt werden;
c) Peptide mit den antigenischen Eigenschaften von p97, die durch Expression von Vektor-Wirtsyste-men hergestellt werden;
d) immunologische Charakterisierung der Peptide mit den antigenischer Eigenschaften p97;
e) Formulierung der Impfstoffe.
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Seauenz-Analvse des Melanom-assoziierten p97-Antiaens
Die Nukleotid-Sequenz des Gens, welches p97 codiert und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Figur 3 dargestellt. Funktionell äquivalente Sequenzen fallen unter die Definition der vorliegenden Erfindung. Diese umfassen die Nukleotid-Sequenzen, welche die gesamte oder Teile der Nukleotid-Sequenz gemäss Figur 3 umfasst, welche durch Substitution geändert sind oder verschiedene Codons aufweisen,-weiche die gleiche oder funktionell äquivalente Aminosäurereste codieren und somit einen stillen Wechsel darstellen, ebenso wie Aminosäuresequenzen, welche die gesamte oder Teile der Sequenz, welche in Figur 3 dargestellt ist, enthalten, welche durch Substitution geändert sind oder funktionell äquivalente Aminosäurereste enthalten und somit einen stillen Wechsel darstellen und Derivate davon, welche modifiziert oder entwickelt, beispielsweise durch Glycosilierung, Phosphorilierung usw. oder durch andere chemische Änderungen.
Die nachstehenden Unterabschnitte beschreiben die Strategie, welche zur Bestimmung der Sequenz von p97, wie sie in Figur 3 dargestellt ist, eingesetzt wurden, ebenso wie andere Techniken, welche ebenfalls zur Bestimmung der Sequenz von p97 oder anderen Tumor-Antigenen, welche für Impfstoff-Formulierungen nützlich sein könnten, eingesetzt werden können.
Identifizierung und Charakterisierung des Melanom-assozierten P97-Antiaens
Die Aktivität und die Aminosäuresequenz des Melanom-assoziierten p97-Antigen war nicht bekannt; als Resultat wurde die Identifikation des p97-Antigens unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die gegen p97 gerichtet sind, durchgeführt. Es kann eine Anzahl von Techniken verwendet werden, um monoclonale Antikörper, die spezifisch auf p97 sind, herzustellen. Beispielsweise kann die Hybridom-Technik, welche durch Kohler und Milstein (1975, Nature, 250: 495-497) entwickelt wurde, wie folgt eingesetzt werden: Mäuse oder Ratten werden mit humanen Melanom-Zellen immunisiert und Lymphocyten, welche von den immunisierten Tieren gewonnen wurden, werden mit Myelom-Zellen fusioniert; alternativ können Lymphocyten von Melanom-Patienten mit Myelom-Zellen fusioniert werden (Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sei, 80: 2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res., 45: 3951) oder es kann die Technik für die Herstellung monoclonalen Antikörpern unter Verwendung des Epstein-Barr-Vi-rus eingesetzt werden (Cole et al, 1985, «The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy», Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96) für die Bildung von monoclonalen Antikörpern, welche gegen p97 gerichtet sind, verwendet werden. In jedem Fall werden die erhaltenen Hybridome einem Screening unterworfen, um Antikörper zu produzieren, welche sich an die Myelom-Zellen binden und nicht an normale Zellen.
Die oben beschriebenen monoclonalen Antikörper, die gegen p97 gerichtet sind, können in vielen Weisen verwendet werden, um die Identifikation, die Charakterisierung, das Clonen und die Expression von nukleotiden Sequenzen zu erleichtern, was die Herstellung von Peptiden und Proteinen, welche die anti-genen Eigenschaften von p97 besitzen, in hohen Mengen erlaubt. Zum Beispiel können die monoclonalen Antikörper zur weiteren Charakterisierung des p97-Antigens verwendet werden, durch Radiomarkierung sämtlicher, durch die Tumorzelle hergestellten Proteine, durch Ausführung einer Immuno-Präci-pitation des Tumorproteins mit dem monoclonalen Antikörper, welcher zur Identifizierung des p97-Antigens verwendet wurde, und Fraktionierung des durch die Immuno-Präcipitation erhaltenen Proteins durch Gel-Elektrophorese. Die Protein-Antigene werden als unterscheidbare Banden auf dem resultierenden Autoradiogramm identifiziert (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem., 255: 4980-4983). Zusätzlich können die gegen p97 gerichteten monoclonalen Antikörper folgendermassen zur Erleichterung des Clo-nens verwendet werden:
a) Immuno-Reinigung von Polysomen zur Identifikation und Gewinnung von mRNA-Transkripten, welche in den Melanom-Zellen, welche das p97-Antigen codieren, vorhanden sind;
b) Identifikation von Clonen in einer cDNA-Expressions-Genbank, welche Peptide oder Proteine ex-primiert, die dem p97-Antigen verwandt sind;
c) Reinigung des p97-Antigens zur Herstellung von zusätzlichen monoclonalen Antikörpern oder An-tiseren für die Verwendung in den vorher genannten zwei Anwendungen; oder d) Identifikation von Zellen, worin das p97-Antigen durch Transfektion eingeführt wurde.
Die monoclonalen Antikörper können ebenfalls für die Erleichterung der strukturellen und immuno-chemischen Charakterisierung des p97-Antigens verwendet werden, um extra-celluiäre und antigenische Bereiche des Moleküles zu identifizieren und zur Reinigung des Moleküls für die Aminosäuresequenz-Analyse (Brown et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sei, USA 78: 539-543; Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173).
Die weitere Charakterisierung von p97 schliesst die Bestimmung der cellulären Lokalisierung und Kartierung der antigenischen Determinanten und der funktionellen Bereiche ein. Die subcelluläre Lokalisierung kann durch Immuno-Fluoreszenz-Mikroskopie und durch Zell-Fraktionierungsversuche bestimmt werden. Antigene, wie p97, welche an der Zelloberfläche vorhanden sind, werden für Impfstoff-Konstruktionen bevorzugt, obschon intracelluläre Antigene ebenfalls nützlich sein können. Wenn multiple
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monoclonale Antikörper erhältlich sind, können die antigenischen Determinanten durch Konkurrenzversuche kartiert werden, worin jeder Antikörper radiomarkiert und in Konkurrenz mit jedem der anderen Antikörper getestet wird. Bereiche des Moleküls können durch beschränkte Verdauung mit Proteasen und anschliessender SDS-PAGE identifiziert werden. Zusammen sollten diese Daten eine Identifikation der Bereiche mit den stärksten immunen Eigenschaften ermöglichen. Sind die monoclonalen Antikörper durch Immunosierung mit intakten Zellen erhalten worden, sind diese Regionen des Moleküls höchstwahrscheinlich extra-cellulär und für die Konstruktion von Impfstoffen nützlich.
Aminosäuresequenz-Analysen erlauben die unzweideutige Identifikation des Proteins und den Vergleich mit anderen Proteinen (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Enthält das Protein mehr als 50 Aminosäurereste, kann es zweckdienlich sein, nur einen Teil der Aminosäuresequenz zu bestimmen, meistens den N-Terminus. Das Protein-Antigen für die Aminosäuresequenierung kann aus Zellly-saten durch Immunoaffinitäts-Chromatographie mit dem monoclonalen Antikörper und anschliessend durch präparative SDS-PAGE gereinigt werden. Die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins wird dann unter Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenators durchgeführt, vorzugsweise eine hoch-empfindliche Gasphasen-Maschine.
Identifikation. Clonen und Seauenieruna von DNA, welche das Melanom-assoziierte p97-Antiaen codiert
Frühe Cionierungstudien konzentrierten sich auf reichlich vorhandene Proteine, wie Globin und Oval-bumin, deren mRNAs häufig 10 bis 50% der gesamten mRNA umfassten. Diese mRNAS konnten durch Grössenfraktionierung zur Homogenität gereinigt werden und die reinen cDNA-Proben wurden zum Screening von Banken von wenigen 100 Clonen durch Kolonien-Hybridisierung verwendet. Für Proteine, deren mRNAs 1 bis 10% der gesamten mRNA umfassten, kann eine differenzierte Hybridisierung mit 2 cDNA-Proben verwendet werden, wobei eine der cDNA-Proben interessierende Sequenzen enthält und die andere eine Negativ-Probe darstellt. Die Messenger-Hybo-Nukleinsäuren, die weniger reichlich vorhandene Proteine codieren, wie Tumor-assoziierte Antigene, welche nur etwa 0,01% der cellulä-ren mRNA umfassen können, sind viel schwieriger zu clonen, da Zehntausende von Clonen einem Screening unterworfen werden müssen und die cDNA-Proben nicht ein spezifisches Hybridisierungssi-gnal geben. Beide Probleme können vermindert werden, indem die mRNA für die interessierende Sequenz angereichert wird.
Verschiedene Verfahren zum Clonen von DNA, welche das mit dem humanen Melanom assoziierten p97-Antigen codieren, sind nachstehend beschrieben. Die resultierenden Clone wurden analysiert, um ein oder mehrere Clone zu identifizieren, welche die gesamte Region von p97 codieren. Die p97 Nukleotid-Insertionen der Clone, welche auf diese Weise identifiziert sind, können dann durch bekannte Methoden sequeniert werden. Die verschiedenen Wege sind im einzelnen nachstehend beschrieben.
a) Isolierung von mRNA durch Polysom-Immun-Reinigung
In dieser Technik werden Polysome (welche aus mRNA, ribosomen und naszierenden Polypeptidketten bestehen) durch Immuno-Affinitäts-Chromatographie mit Antikörpern, welche die in den naszierenden Ketten vorhandenen antigenischen Determinanten erkennen, gereinigt. In vielen Fällen erkennen die, durch Immunisierung mit intakten Zellen oder Zellextrakten erhaltenen Antikörper, die Antigene in ihren nativen Konformationen, sind jedoch nicht mehr zweckmässig für die Polysomen-Immunreinigung, da insofern eine merkliche Änderung besteht, dass die erkennbaren antigenischen Determinanten an den naszierenden Ketten nicht vorhanden sein können. Da die Translation am N-Terminus des Polypeptides beginnt, können Epitope, welche nahe am C-Terminus liegen, in der Mehrheit der naszierenden Zellen abwesend sein. Dieses Problem kann vermieden werden, indem entweder Antikörper verwendet werden, welche N-terminale Epitope erkennen oder durch Herstellung von Polysomen aus Zellen, welche mit einem Protein-Synthese-Hemmer, welcher die Terminierung blockiert, behandelt wurden.
Ein ernsthafteres Problem besteht darin, dass sich reife Proteine von naszierenden Ketten wegen posttranslationalen Änderungen unterscheiden. Dieses Problem ist besonders bei Oberflächenproteinen akut, welche häufiger durch Entfernung von Signalpeptiden, Addition von Kohlehydrat-Seitenketten und Bildung von Disulfidbrücken geändert werden. Wird ein polyclonales Antiserum für die Polysom-Immunreinigung verwendet, können die Unterschiede in der Antigenizität zwischen den naszierenden Ketten und dem reifen Protein nur von kleiner Wirkung sein, da währerd der Immunisierung das Kaninchen oder das andere Tier nicht nur dem nativen Protein exponiert wird, jedoch auch partiell oder vollständig den denaturierten Formen, insbesondere wenn Freund-Adjuvanz vorhanden war. Sogar wenn diese Antikörper nur einen kleinen Bruchteil der Antikörper-Population ausmachen, können sie immer noch in genügender Menge vorhanden sein, um die naszierenden Ketten zu bilden. Unglücklicherweise kann die Herstellung eines polyclonalen Antiserums gegen ein Niedermengen-Protein aussergewöhnlich schwierig sein. Obschon ein monoclonaler Antikörper für die Reinigung des Antigens für weitere Immunisierungen verwendet werden kann, ergibt jedes Gramm" von kultivierten Zellen häufig nur ein Mikrogramm Antigen. Dies ist genügend, um einige Mäuse zu immunisieren, jedoch kaum genügend für ein einziges Kaninchen.
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Eine andere Lösung des Problems besteht darin, dass ein monoclonaler Antikörper hergestellt wird, welcher die in den naszierenden Ketten vorhandenen antigenischen Determinanten erkennt, indem ein denaturiertes p97-Antigen für die Herstellung des monoclonalen Antikörpers verwendet wird. Im Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde eine Platte mit monoclonalen Antikörpern hergestellt, welche drei bestimmte Epitope des N-terminalen, 40 000 Dalton/Molekularbereiches des p97 erkannten, hergestellt, und es wurde ein Pool von monoclonalen Antikörpern verwendet, wobei jeder eine verschiedene Spezifität aufwies, in der Hoffnung, dass einer oder mehrere davon, die naszierenden Ketten binden würden. Die gewählten Antikörper waren hoch-spezifisch gegen p97, wobei jeder mit einer einzelnen Bande von p97 aus einem radiomarkierten Gesamtzellysat ein Immuno-Präcipitat bildete und sie hohe Bildungsaffinitäten aufwiesen. Für das Clonierungsprojekt wurden drei lgG2a Antikörper ausgewählt, wobei einer für jedes der drei Epitope spezifisch war. Im allgemeinen kann die Erfolgschance erhöht werden, indem eine Anzahl Antikörper gegen unterscheidbare Epitope eingesetzt wird.
Bei der Verwendung von monoclonalen Antikörpern bleibt die Frage offen, wie man voraussagen kann, dass ein vorgegebener monoclonaler Antikörper oder eine Kombination von Antikörpern, die naszierenden Ketten erkennen kann und demzufolge für die Verwendung bei der Polysom-Immunreinigung nützlich ist. Ein Weg zur Bestimmung, ob der monoclonale Antikörper Antigen-Immuno-Präcipitate bildet, die im Reticulocyten-Lysatsystem translatiert wurden, beruht auf der Annahme, dass das in vitro-Trans-lationsprodukt, welches nicht reagiert, den naszierenden Ketten gleichen dürfte. Ein alternativer Weg besteht darin, dass die Polysom-Immun-Präcipitation in kleinem Massstab durchgeführt wird und dann die in vitro-Translation zur Bestimmung, ob die interessierende mRNA-Art angereichert worden ist, verwendet wird.
Wenn die Polysom-Immunreinigungstechnik verwendet wird, ist es wichtig, dass die Reinigung durch Messung der mRNA-Aktivität kontrolliert wird. Dies kann durch Translation der mRNA in einem Reticu-locyten-Lysatsystem und durch SDS-PAGE-Analyse der Translationsprodukte durchgeführt werden. Obschon das Tumor-assoziierte Antigen eine zu kleine Komponente der Translationsprodukte der nicht-angereicherten mRNA darstellen könnte, um es aus den Hunderten von reichlicheren Arten zu erkennen, sollte es in den, welche von angereicherten mRNA-Proben abgeleiteten Translationsprodukten erkennbar sein. Alternativ kann das Xenopus Oocyt-Translationssystem verwendet werden, wenn ein empfindlicher Immuno-Assay möglich ist, um das translatierte Tumor-assoziierte Antigen nachzuweisen. Für p97 wurde ein hoch-spezifischer Doppeldeterminanten-Immuno-Assay (DDIA) verwendet, der zwei monoclonale Antikörper, die spezifisch für zwei verschiedene Epitope von p97 sind, verwendet.
Protein A, das an Sepharose gebunden ist, kann für die Polysom-Immunreinigung eingesetzt werden. Das Protein A Adsorbenz hat in diesem Verfahren zwei Anwendungen. In der ersten werden die monoclonalen Antikörper von rohen Ascites-Flüssigkeiten abgetrennt, wobei die kontaminierende Ribo-nuklease-Aktivität entfernt werden. Das Protein A Adsorbenz wird dann in Konjuktion mit den gereinigten Antikörpern zur Immunreinigung von Polysomen, die die spezifischen naszierenden Ketten tragen, verwendet.
Die Translation der mRNA in einem Reticulocyten-Lysatsystem erlaubt die biochemische Charakterisierung des Translationsproduktes ebenso, wie eine Bestimmung seiner Reinheit.
b) Oligonukleotid-Proben
Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren zum Clonen der cDNA, die ein Tumor-assoziiertes Antigen, wie p97, codiert, besteht in der Bestimmung einer partiellen oder vollständigen Aminosäuresequenz des Antigens und in der Synthese einer Oiigonukleotid-Probe auf Basis der Nukleotid-Sequenz, welche aus der Aminosäuresequenz abgeleitet wird. Das Oligonukleotid kann dann als Primer für die cDNA-Synthese und dann als Probe zum Screenen der resultierenden cDNA-Genbank eingesetzt werden. Demzufolge kann das Melanom-assoziierte p97-Protein in üblicher Weise aus Lysaten von Melanomzel-len durch Affinitätschromatographie mit einem spezifischen monoclonalen Antikörper gereinigt werden (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Eine Nukleotid-Sequenz, die einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenz codiert, wird dann synthetisiert und kann als Primer und/oder Probe eingesetzt werden. Teile der Aminosäuresequenz, welche die Aminosäurereste enthalten, welche durch einen einzelnen Codon oder zwei Codone codiert werden, sind für diesen Zweck am geeignetsten. Dazu ist die Synthese einer längeren Sequenz typischerweise mit 25-60 Nukleotiden, welche die wahrscheinlichste Codierungssequenz darstellen, auf Basis von bekannten Codon-Verwendungsfrequenzen beim Menschen. Die Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotiden auf Basis von verschiedenen Teilen der Aminosäuresequenz erleichtert das Screening, indem eine die Identifikation von scheinbar positiven Hybridisierungssignalen erlaubt. Zusätzlich erleichtert die Verwendung von Hybridisierungsbedingun-gen, welche die Wirkung des GC-Gehaltes am Schmelzpunkt des DNA-Hybrides minimalisieren, ebenfalls das Screening. Hat man einmal nach diesem Verfahren ein partielies cDNA-Clon erhalten, kann es als Probe zur Unterstützung bei der Herstellung eines cDNA-Clones von voller Länge verwendet werden.
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c) cDNA-Expressions-Genbanken
Es sind Cionierungs-Vektoren entwickelt worden, welche die Expression der cDNA-lnsertion in Bakterien ermöglichen. Ein Weg dafür, welcher für die Herstellung von cDNA-Clonen für Tumor-assoziierte Proteine, wie für p97, verwendet werden kann, besteht darin, dass eine cDNA-Genbank durch umgekehrte Transkription der mRNA (angereichert oder nicht angereichert), welche wie oben beschrieben aus Melanom-Zellen isoliert wurde, hergestellt wird, indem Oligo(T)-Nukleotid-Primers oder synthetische Oligonukleotid-Primers verwendet werden und eine solche Genbank mit einem monoclonalen Antikörper, welcher gegen das Melanom-assoziierte p97-Protein gerichtet ist, einem Screening unterworfen wird. Clone, welche DNA, die die Epitope, welche durch die monoclonalen Antikörper in der korrekten Orientierung erkannt werden und die Erkennungsfrequenz enthalten, exprimieren Peptide oder Proteine, weiche dem Melanom-assoziierten p97-Protein verwandt sind und können identifiziert werden durch Transferierung der Proteine, die durch die Clone exprimiert werden, auf einen Nitrocellulose-Fil-ter und Inkubierung des Filters mit dem Antikörper, anschliessender Entwicklung mit einem markierten Anti-Immunoglobulin-Reagenz.
Ein mögliches Problem besteht darin, dass viele monoclonale Antikörper das Protein, welches durch das Bakterium exprimiert wird, nicht erkennen können, da in vielen Fällen nur ein Teil der cDNA in der Insertion erhalten ist und da Bakterien Proteine nicht in der gleichen Weise, wie dies bei eukaryotischen Zellen der Fall ist, entwickeln. Dieses Problem ist besonders akut bei Tumorzellen-Oberflächenproteinen, welche stärker durch Entfernung von Signalproteinen, Addition von Kohlehydrat-Seitenketten und Bildung von Disulfid-Brücken abgeändert werden. Es kann demzufolge nötig sein, solche monoclonalen Antikörper zu bilden, die zur Erkennung des denaturierten Antigens fähig sind oder polyspezifische An-tiseren durch Immunisierung mit gereinigtem Antigen herzustellen.
Ist einmal ein rekombinantes Virus oder ein Plasmid, von welchem angenommen wird, dass es eine cDNA-lnsertion, welche von einem Melanom-assoziierten p97-Antigen abgeleitet ist, enthält, identifiziert, kann die cDNA-lnsertion verwendet werden, um zusätzliche Genbanken einem Screening zu untenwerfen, um entweder die Clone in voller Länge oder aber eine Gruppe von Clonen, welche die volle Länge der cDNA, welche p97 codieren, umfassen, zu identifizieren. Die Identität der geclonten cDNA kann durch Sequenz-Analyse und Vergleich der abgeleiteten N-terminalen Aminosäuresequenz mit derjenigen, welche durch direkte Aminosäuresequenz-Analyse am p97-Protein bestimmt worden ist, ermittelt werden.
d) Genomisches Clonen
Das folgende Verfahren erlaubt das Clonen von DNA unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, welcher gegen eine Antigen-Determinante gerichtet ist, welche nur im nativen Protein vorhanden ist und in naszierenden Ketten oder im Protein, welches in Bakterien exprimiert wird, nicht vorhanden ist. Zu diesem Zweck wird eine DNA, welche von der humanen Melanomzelle abgeleitet ist, in Mäu-se-L-Zellen durch Transfektion eingeführt. Dann werden die Mäusezellen, welche das Melanom-assoziierte p97-Antigen exprimieren, isoliert, entweder unter Verwendung der Sortierung von Fluores-zenz-aktivierten Zellen oder durch die immunologische Identifikation von Kolonien, welche p97-ver-wandte Peptide produzieren, unter Verwendung von radiomarkierten monoclonalen Antikörpern, welche gegen p97 gerichtet sind, um verwandte Peptide auf Kopien von Kolonien, welche auf Polyesterstoff-Filter transferiert wurden, nachzuweisen. Verschiedene nachfolgende Runden der Transfektion können erforderlich sein, um nichtverwandte humane DNA-Sequenzen zu entfernen. Es wird dann eine genomische Genbank in einem A.-Phagen-Vektor hergestellt und einem Screening auf Clone unterworfen, welche humane repetitive Sequenzen enthalten, welche in den Interferonen der meisten Gene vorkommen. Ist einmal ein genomisches Clon identifiziert, kann es als Hybridisierungsprobe zur Identifikation von cDNA-Clonen, welche die p97-codierende DNA enthalten, verwendet werden.
Synthese von antiaenischen Fragmenten des Melanom-assoziierten p-97-Antiaens und Bestimmung der Immunooenität
Synthetische Peptide können als Immunogene zum Hervorrufen von Immun-Antworten gegen das native Protein eingesetzt werden und können einen Schutz gegen eine Anzahl von Pathogenen verleihen. Solche Peptid-Sequenzen werden aus bekannten Aminosäuresequenzen des Protein-Antigens ausgewählt, indem Spannen von Aminosäuren identifiziert werden, die wahrscheinlich an der Oberfläche des Protein-Moleküls vorhanden sind und dem externen Medium ausgesetzt sind. Normalenweise wird dies durch Computer-Analysen von Aminosäuresequenzen durchgeführt, wobei die bekannten Hydropatie-Parameter für Aminosäuren verwendet werden. Zusätzliche Kriterien, wie die vorausgesagte Sekundärstruktur oder Flexibilität können ebenfalls verwendet werden.
Demzufolge können 5 bis 50 Aminosäurereste enthaltende Peptide des Melanom-assoziierten p97-Protein auf Immunogenität in Versuchstieren getestet werden (üblicherweise Mäuse oder Kaninchen). Solche synthetischen Peptide umfassen die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 3 dargestellt ist; weiter umfasst werden geänderte Sequenzen, worin funktionell äquivalente Aminosäurere-
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ste innerhalb der Sequenz in solcher Art substituiert sind, dass ein stiller Wechsel erzielt wird und/oder geänderte oder umgesetzte Sequenzen, wie glycosilierte Sequenzen, phosphorilierte Sequenzen usw. oder chemisch modifizierte Sequenzen, wobei jedoch die synthetischen Peptide nicht auf die genannten Möglichkeiten eingeschränkt sind. Diese p97-verwandten Peptide werden entweder allein oder gekuppelt an ein Trägerprotein verwendet, beispielsweise an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH von diodora aspera). In jedem Fall ist die Verwendung eines Adjuvans fakultativ, jedoch bevorzugt. Die immunisierten Tiere werden nachgeimpft und auf Antikörper, welche gegen das immunisierende Peptid gerichtet sind, getestet. Diejenigen mit Antipeptid-Antikörpern werden auf Antikörper getestet, welche das native p97-Protein binden. Im Fall Tumor-assoziierten Antigenen, wie p97, ist es ebenfalls von Interesse auf eine celluläre Immun-Antwort zu testen, z.B. indem nach der verzögerten Hypersen-sitivität (DTH) nach der Antigen-stimulierten Proliferation in vitro, nach cytolytischen T-Zellen oder nach Tumor-Zurückweisung in einem zweckmässigen Modell untersucht wird. Ein zweckmässiges Modell wäre ein Mäusetumor, welcher das humane Tumor-assoziierte Antigen als Resultat einer Transvektion mit einer zweckmässigen cDNA-Expressions-Vektorkonstruktion exprimiert.
Das Ziel besteht in der Identifikation von Peptiden, welche eine starke Immun-Antwort gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen hervorrufen. Einmal identifiziert können diese Peptide in grossen Mengen durch bekannte chemisch-synthetische Methoden hergesteilt werden. Alternativ können die identifizierten Peptide in grossen Mengen durch Expression der Nukleotid-Sequenzen, welche für solche Peptide codiert sind, in Expressions-Vektor-Wirtzellen-Systemen hergestellt werden.
Herstellung von o97-verwandten Peptiden durch Expressions-Vektor-Wirtsysteme
Proteine und Peptide können in grossen Mengen durch Insertion von Nukleotid-codierenden Sequenzen in einem zweckmässigen Expressions-Vektor hergestellt werden, welcher dann in eine zweckmässige Wirtzelle, wie Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugetierzellen, eingeführt wird. Obschon die bakteriellen Wirte viele Vorteile besitzen, können sie viele eukaryotische Proteine nicht zweckmässig entwickeln und sie sind weniger zweckmässig für eukaryotische Zellen für die Expression von Tumor-assoziierten Proteinen. Die in Bakterien produzierten rekombinanten Proteine können jedoch nützlich sein für die Einführung von T-Zellantworten, denn solche Antworten benötigen, wie angenommen wird, den ursprünglichen Abbau des Protein-Antigens.
Um ein p97-verwandtes Peptid in einem Vektor-Wirtsystem zu exprimieren, werden Nukleotid-Sequenzen, welche das Melanom-assoziierte p97-Antigen oder einen Teil davon codieren, in einem geeigneten Expressionsvektor insertiert. Solche Nukleotid-Sequenzen umfassen ohne Einschränkung die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz von p97, entsprechend der Darstellung in Figur 3, einschliesslich geänderter Sequenzen, worin ein oder mehrere Codon innerhalb der Sequenz durch ein Codon ersetzt sind, welche den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest codieren, was zu einer neutralen oder stillen Änderung der Sequenz führt. Der Expressions-Vektor enthält die nötigen Elemente für die Transkription und Translation der in Form einer Insertion eingesetzten Proteincodierenden Sequenz. Diese Elemente variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Je nach dem verwendeten Wirt-Vektorsystem, kann eines oder eine Anzahl von zweckmässigen Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Es können beispielsweise beim Clonen in Säugetierzeil-Systemen Promotoren verwendet werden, welche vom Genom von Säugetierzellen isoliert worden sind (z.B. Mäuse-Metallothionein-Promotor) oder aus Viren, welche in diesen Zellen wachsen (z.B. Impfstoff-Virus 7.5K-Promotor). Promotoren, die durch rekombinante DNA oder synthetische Techniken hergestellt werden, können ebenfalls für die Transkription der Insertionssequenzen verwendet werden.
Spezifische Initiationssignale sind für eine wirkungsvolle Translation von Protein-codierenden Se-quenz-lnsertionen ebenfalls erforderlich. Diese Signale umfassen das ATG-Initialcodon und die angrenzenden Sequenzen. Im Fall, wo entweder das Gen oder die cDNA-Sequenz als Insertion in einen zweckmässigen Expressions-Vektor eingeführt wird, sind möglicherweise keine zusätzlichen Transiations-Kontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch, wo nur ein Teil der codierenden Sequenz eingefügt wird, können exogene Translations-Kontrollsignale, einschliesslich des ATG-Codons vorgesehen werden. Das Initialcodon muss weiter in Phase mit der Erkennungssequenz der Protein-codierenden Sequenzen sein, damit die Translation der gesamten Insertion sichergestellt ist. Diese exogenenTranslations-Kon-trollsequenzen und Initialcodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlich wie auch synthetisch.
Es können sämtliche Verfahren verwendet werden, die den Fachleuten für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor bekannt sind, um Expressions-Vektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen enthalten, welches aus zweckmässigen Transkriptions- und Translations^Kontrollsignalen und aus Protein-codierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren umfassen diejenigen, welche in den in vitro-rekombinanten DNA-Techniken den synthetischen Techniken und den in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombinationen) verwendet werden.
Expressions-Vektoren umfassen ohne eine Einschränkung die folgenden Vektoren und ihre Derivate: Vaccinia-Virus, Adenoviren, Insektenviren, Hefevektoren, Bakteriophagen-Vektoren und Plasmid-DNA-Vektoren. Das Clonen und die Expression von Genen in bakteriellen Systemen ist auf dem Fach-
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mid-Promotoren, wie der iaç-Promotor, der trp-Promotor. der recA-Promotor. der ribosomale RNA-Pro-motor, der Pr- und PL-Promotor des coliphagen X und andere einschliesslich vom lacuv5. trp-lacuv5 (taci-Hvbrid-Promotor, ompF. bla. Ipp und dergleichen verwendet werden, um einen hohen Grad der Transkription der angrenzenden DNA-Segmente zu gewährleisten. Wegen der Entwicklungsunterschiede zwischen den prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, können jedoch vorzugsweise die erfindungsgemässen p97-verwandten Peptide in eukaryotischen Zellen exprimiert werden. Die am besten eingeführten Verfahren zur Expression von Proteinen in eukaryotischen Zellen sind:
a) die Einführung des Gens in die Zelle, zusammen mit einem Drogen-resistenten Gen und anschliessende Selektion mit der Droge, vorzugsweise unter Erzielung einer Verstärkung wie mit dem Dihydrofo-lat-Reduktase-Methotrexat-System;
b) Expression der cDNA in einem Plasmid-Vektor, häufig auf Basis von pBR322, unter Verwendung eines starken eukaryotischen Promotors und anderen Regulations-Sequenzen;
c) Expression von cDNA in einem viralen Vektor, häufig abgeleitet aus SV40, wiederum unter Verwendung von starken Promotoren, in diesem Fall ein SV40-Promotor.
Die rekombinanten Plasmid-Vektoren werden häufig zur Produktion von Zellinien verwendet, welche das Protein während einer langen Zeitperiode produzieren, während die SV40-Vektoren häufig verwendet werden, um eine unbeständige Expression zu erhalten. Trotzdem meistens Säugetierzellen als Wirte eingesetzt werden, können Insektenzellen und in einigen Fällen ebenfalls Hefezellen zweckmässig sein. Solche sind nachstehend im einzelnen beschrieben.
Um einen rekombinanten Impfstoff-Virus zu konstruieren, weicher das Melanom-assoziierte p97-An-tigen exprimiert, kann die cDNA-codierende Sequenz an den 7.5K-Promotor des Vaccinia-Virus gebunden werden, um ein chimäres Gen zu bilden. Dieses Chimäre Gen wird durch zusätzliche Vaccinia-virale Sequenzen, die homolog zum viralen Thymidin-Kinasegen sind, abgebunden, was am Plasmid DNA-Vektor durchgeführt wird. Die Konstruktion des Chimären Gens umfasst die Verwendung von sowohl natürlichen, wie auch synthetischen Kontrollsignalen für die Transkription und Translation der Tumor-assozi-ierten Antigensequenz. Das chimäre Gen wird dann in die Vaccinia-Virus-Expressions-Vektoren eingeführt, durch in vivo-Rekombination zwischen der homologen Thymidin-Kinaseregion, die sowohl im Plasmid-Vektor, wie auch im Vaccinia-Virus-Genom vorhanden ist. Diese rekombinanten Viren, welche das chimäre Gen enthalten, sind fähig, die Expression von p97-verwandten Peptiden in einem infiszierten Wirt durchzuführen und können als Komponenten in Impfstoffen eingesetzt werden.
In Fällen, worin ein Adenovirus als Expressions-Vektor verwendet wird, wird die interessierende DNA-Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translationskontroll-Komplex gebunden, z.B. der späte Promotor und die Tripartit-Leadersequenzen. Das chimäre Gen wird dann als Insertion in das Ade-novirus-Genom durch in vitro oder in vivo-Rekombination eingesetzt. Die Insertion in eine nicht-wesent-liche Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, welcher lebensfähig ist und die p97-verwandten Peptide in infiszierten Wirten exprimieren kann. Gegenwärtig sind zwei Stämme von Adenovirus vorhanden, die Typen 4 und 7 und werden als Impfstoffe für Militärpersonen verwendet. Sie sind die ersten Kandidaten für die Verwendung von Vektoren für Expression von DNA-Sequenz-Insertionen.
Ein alternatives Expressionssystem, welches zur Expression der p97-verwandten Peptide verwendet werden könnte, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird der Autoorapha californica nukleare Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression von fremden Genen verwendet. Der Virus wächst in Spodoptera fruaiperda-Zellen. Die interessierende DNA-Sequenz kann in nicht-wesentlichen Regionen (z.B. dem Polyhedrin-Gen) des Virus geclont werden und unter Kontrolle eines AcNPV-Promo-tors (beispielsweise dem Polyhedrin-Promotor) plaziert werden. Die erfolgreiche Insertion der DNA-Sequenz führt zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion eines nicht-occludierenden rekombinanten Virus (d.h. eines Virus, welchem der Proteinmantel fehlt, welcher durch das Polyhedrin-Gen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von Soodootera fruaioerda-Zellen verwendet, worin die Gen-Insertion exprimiert wird.
Zusätzlich können Wirtzell-Stämme ausgewählt werden, welche die Expression der Sequenz-Insertio-nen modulieren oder modifizieren und die Chimären Gen-Produkte in einer spezifischen gewünschten Weise erzeugen. Die Expression von gewissen Promotoren kann erhöht werden in Gegenwart von gewissen Induktoren, z.B. Zink- und Kadiumionen für Metallothionein-Promotoren. Demnach kann die Expression von genetisch konstruiertem Protein kontrolliert werden. Dies ist wichtig, wenn das Proteinprodukt des geclonten Genes lethai für die Wirtzellen ist. Des weiteren sind Änderungen, z.B. die Glycosi-lierung, die Phosphorilierung, und Reaktionen (z.B. Spaltung von Proteinprodukten) wichtig für die Struktur und Funktion des Proteins. Verschiedene Wirtzellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die Verfahren und Änderungen des Proteins nach der Translation. Zweckmässige Zellinien oder Wirtsysteme können ausgewählt werden, um die korrekten Änderungen und Reaktionen der exprimierten fremden Proteine sicherzustellen.
In der besonderen, hier beschriebenen Ausführungsform für p97 wurde die p97-cDNA-Sequenz in einen Expressions-Plasmid-Vektor eingebaut, welcher von pBR322 abgeleitet war und den Metallo-
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einen Expressions-Plasmid-Vektor eingebaut, welcher von pBR322 abgeleitet war und den Metallo-thionein-Promotor enthielt. Die gesamte codierende Sequenz von p97, einschliesslich dem Signal-Peptid und dem Membrananker wurde in den Vektor als Insertion eingeführt.
Identifikation von rekombinanten Expressions-Vektoren. die die Fähigkeit der Replizieruna und Durchführung der Expression der p97-DNA-Seauenzen aufweisen
Expressions-Vektoren, welche fremde Gen-Insertionen aufweisen, können durch drei allgemeine Verfahren identifiziert werden:
a) Die DNA-DNA-Hybridisierung b) Gegenwart oder Abwesenheit von Markier-Genfunktionen und c) Expression von Sequenz-Insertionen.
Im ersten Weg kann die Gegenwart eines fremden Gens, welches in einen Expressions-Vektor eingeführt wurde, durch die DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, indem Proben verwendet werden, welche Sequenzen enthalten, welche homolog zu fremden Gen-Insertionen sind. Im zweiten Weg kann das rekombinante Vektor/Wirtsystem identifiziert und ausgewählt werden auf Basis der Gegenwart oder Abwesenheit von gewissen «Markierungs»-Genfunktionen, welche durch die Insertion von Genen in den Vektor (z.B. durch Thymidin-Kinase-Aktivität des Systems gegen Antibiotika, Transforma-tions-Phenotypen usw.) bewirkt werden. Wenn das fremde Gen z.B. in die Markiersequenz des Vektors eingesetzt wird, können Rekombinanten, welche die DNA-Insertion enthalten, durch die Abwesenheit der Markier-Genfunktion erkannt werden. Im dritten Weg, können die rekombinanten Expressions-Vektoren identifiziert werden, indem das fremde Gen-Produkt, welches durch den Rekombinanten exprimiert wird, getestet wird. Solche Tests können auf Basis der physikalischen, der immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Gen-Produkts durchgeführt werden. Wenn beispielsweise ein erfindungs-gemässes rekombinantes Vaccinia-Virus konstruiert wird, wird das chimäre Gen, welches die p97-codie-renden Sequenzen enthält, in das Thymidin-Kinase-Gen eingesetzt, was eine Inaktivierung und die Bildung eines TK-Phenotypes auf dem Virus bewirkt. Solche Rekombinanten werden ausgewählt nach ihrer Fähigkeit in Medien zu wachsen, welche 5-Brom-desoxyuridin enthalten, einem Nukleosid-Analogen, das gegen TK+-Zellen, jedoch nicht gegen TK--Zellen toxisch ist. Die Rekombinanten werden des weiteren durch DNA-DNA-Hybridisierung identifiziert, wobei eine cDNA-Probe, welche auf das Tumor-assoziierte Protein empfindlich ist, verwendet wird. Das TK-rekombinante Virus kann durch Plaquen-Reini-gung isoliert werden und Vorräte aus infiszierten kultivierten Zellen hergestellt. Das rekombinante Virus kann auf seine Fähigkeit, die Synthese von p97-verwandten Peptiden zu induzieren, getestet werden. Zu diesem Zweck können infiszierte Zellen in Gegenwart von radiomarkierten Aminosäuren gezüchtet werden; dann werden die Lysate und die subceliulären Fraktionen der infiszierten radiomarkierten Zellen durch Immuno-Präcipitation mit Antikörpern, welche gegen das native Melanom-assoziierte p97-Antigen gerichtet sind, getestet. Die immuno-präcipierten Produkte werden dann durch SDS-PAGE aufgelöst. Die infiszierten Zellen können ebenfalls durch Immunofluoreszenz unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern getestet werden.
Zellen, in welchen ein Plasmid-Vektor durch Transfektion eingeführt worden ist, können leicht durch FACS-Analyse oder durch Bindungsversuche von Kopien von Zellkolonien auf Polyesterstoff identifiziert werden. Die vorhandene Menge von p97-verwandtem Peptid kann durch einen quantitativen Ra-dio-lmmuno-Assay bestimmt werden und seine subcelluläre Lokalisierung kann durch cellulare Fraktionierung und durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie bestimmt werden. Die Struktur des exprimierten p97-verwandten Peptides kann durch SDS-PAGE und durch Aminosäuresequenz-Analyse bestimmt werden.
Reinigung des p97-verwandten Peptides aus Expressions-Vektor-Wirtsvstemen
Viele Tumor-assoziierte Antigene, wie das p97, sind Zelloberflächen-Glycoproteine und umfassen ein N-terminales Signalpeptid und ein C-terminales Ankerpeptid (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol., 181: 111-121). Bei der Expression in einem zweckmässigen Vektor wird erwartet, dass das Protein an die Zelloberfläche transportiert wird. Zur Erleichterung der Reinigung des Proteins kann es bevorzugt sein, die DNA-Sequenz, welche die Membrananker-Region codiert, zu deletieren, damit das reife Protein in das Kulturmedium freigegeben wird.
Die p97-verwandten Peptide können von diesen Wirtzellen durch Detergentienlyse und anschliessend Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gereinigt werden. Wenn ein gestutztes Protein aus dem Kulturmedium gereinigt werden muss, wird vorzugsweise ein serumfreies Medium verwendet, welches dann für die Affinitäts-Chromatographie mit monoclonalen Antikörpern eingesetzt werden kann. Es ist wichtig, dass das Antigen aus dem Antikörper-Adsorbenz elui-ert werden kann, ohne dass die antigene Wirksamkeit reduziert wird oder es denaturiert wird. Dies kann erzielt werden, indem der pH-Wert erhöht oder gesenkt wird oder indem ein Chaotrop verwendet wird. Es kann erforderlich sein, einen monoclonalen Antikörper auszuwählen, welcher das Antigen unter ver-
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hältnismässig milden Bedingungen freisetzt. Das Affinitäts-gereinigte Antigen kann weiter durch HPLC gereinigt werden.
Die immunologische Charakterisierung von p97-verwandten Peptiden
Die Fähigkeit der synthetischen oder rekombinanten Antigene eine Antitumor-Reaktion auszulösen, kann zuerst in Versuchstieren-nachgewiesen werden. Dies wird erzielt, indem ein Modellsystem errichtet wird, worin das humane Melanom-assoziierte p97-Protein in Zellen von Stämmen mit zweckmässigen Erbeigenschaften der experimentellen Art exprimiert wird. Die Tiere werden dann mit dem erfindungsgemässen p97-verwandten Peptid nach verschiedenen Verfahren immunisiert und dann getestet auf die Entwicklung von Antikörpern, die gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen gerichtet sind, auf zellvermittelte Immunität, wie verzögerte Hyperempfindlichkeit gegen das p97-Antigen und gegen ihre Fähigkeit, eine Herausforderung von lebensfähigen, syngenetischen Tumorzellen, welche das p97-Anti-gen exprimieren, zurückzuweisen. Zusätzlich können in vitro-Versuche für celluläre Immunität durchgeführt werden, indem die Proliferation der Lymphocyten als Reaktion auf das p97-verwandte Peptid gemessen wird und die Fähigkeit der Lymphocyten von immunisierten Tieren oder humanen Melanom-Pa-tienten bestimmt wird, Tumorzellen, welche das p97-Antigen exprimieren, abzutöten. Weiter ist man durch Immunisieren von Mäusen mit Mäuse-p97 fähig, das Ausmass zu bestimmen, in welchem es möglich ist, eine Immun-Antwort gegen ein Antigen zu induzieren, welches in normalen Geweben spurenweise vorhanden ist.
Nicht-humane Primaten können für die Sicherheit von p97-verwandten Peptiden der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zu diesem Zweck können die Tiere unter Verwendung von Versuchsbedingungen immunisiert werden, welche ethisch ebenfalls für humane Krebspatienten verantwortbar sind, und dann wie oben beschrieben, getestet werden, mit der Ausnahme, dass die Tumor-Translationsexperi-mente nicht machbar sind, da diese die Verwendung von vererbten Stämmen erfordern. Die Sicherheit des Immunisierungsverfahrens wird durch Beobachtung des Effektes der Immunisierung auf die allgemeine Gesundheit des immunisierten Tieres durchgeführt (Gewichtsveränderungen, Fieber, Appetit, Verhalten usw.) und durch Beobachtung von pathologischen Veränderungen bei der Autopsie.
Schliesslich kann das erfindungsgemässe p97-verwandte Peptid bei humanen Krebspatienten getestet werden. Nach der Einführungsphase, dem Testen von Krebspatienten in fortgeschrittenem Zustand, um den Mangel an Toxizität festzustellen, könnten Krebspatienten mit nachlassenden Krankheitserscheinungen, jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens getestet werden. Ihre Immun-Antwort könne wie oben für die nicht-humanen Primaten beschrieben, durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass die Wirkung der Behandlung am geprüften Leiden oder an der Häufigkeit des Nachlassens der Krankheit getestet wird. Im Fall des Melanom-Antigens p97 benign nevi (moles), welches das Antigen exprimiert, wird ebenfalls geprüft werden.
Formulieruno des Impfstoffes
Durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken wird ein synthetisches Peptid, ein gereinigtes Protein oder ein rekombinantes Virus produziert, welche als Immunogen und als Impfstoff zum Schutz von Krebspatienten mit einem hohen Risiko des Wiederaufflackerns ihres Leidens, eingesetzt werden können, um vorhandene Leiden zu behandeln und schiesslich prophylaktisch Individuen mit hohem Risiko zu impfen. Tatsächlich kann das synthetische oder rekombinante Melanom-assoziierte p97-Antigen in Kombination mit anderen Immunogenen verwendet werden, um multivalente Impfstoffe für die Prävention von Melanomen und anderen Krebsarten herzustellen. Beispiele von verschiedenen Impfstoff-Formulierungen werden nachstehend diskutiert.
Virale Impfstoff-Formulierunoen
Wenn ein erfindungsgemässes p97-verwandtes Peptid durch einen rekombinanten Virus produziert wird, kann er entweder als lebender rekombinanter viraler Impfstoff oder als inaktivierter rekombinan-ter viraler Impfstoff formuliert werden. Die Wahl hängt von der Natur des verwendeten rekombinanten Virus ab, welcher das p97-verwandte Peptid exprimiert. Wenn der rekombinante Virus gegenüber dem zu immunisierenden Wirt infektiös ist, jedoch keine Krankheit auslöst, wird ein lebender Impfstoff bevorzugt, als eine Multiplikation im Wirt zu einem verlängerten Stimulus ähnlicher Art führt und die Grösse mit denjenigen vergleichbar ist, wie er in natürlichen subklinischen Infektionen vorkommt und demzufolge zu einer wesentlichen langdauernden Immunität führt. Die infektiösen rekombinanten Viren können nach ihrer Einführung in einen Wirt das p97-verwandte Peptid von seinem Chimären Gen exprimieren und dabei eine Immun-Antwort stimulieren. Der lebende rekombinante Virus selbst kann als präventive Impfung gegen Melanom eingesetzt werden. Die Produktion eines solchen rekombinanten Virus, welcher in diesen Formulierungen verwendet werden kann, kann sowohl in vitro-Svsteme (z.B. Gewebekulturzel-ien) als auch in vivo-Svsteme (z.B. natürliche Wirttiere, wie Kühe) umfassen. Übliche Methoden für die Herstellung und Formulierung von Pockenimpfungen können für die Formulierung von lebenden rekombinanten Virus-Impfstoffen adaptiert werden.
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Multivalente lebende Virus-Impfstoffe können aus einzelnen oder wenigen infektiösen rekombinanten Viren hergestellt werden, welche eine Anzahl von Antigenen gegen verschiedene Tumor- oder Krebszellen entwickeln, hergestellt werden. Beispielsweise kann ein Vaccinia-Virus (welcher etwa 35 Kilobasen fremder DNA aufnehmen kann) manipuliert werden, dass er Codierungssequenzen für andere Epitope enthält; ein solcher rekombinanter Virus selbst, kann als Immunogen in einer multivaltenen Vaccine verwendet werden. Alternativ kann eine Mischung von Impfstoffen und/oder anderen Wirkstoffen, welche fähig sind, die Expression von direkten Genen, weiche verschiedene Epitope codieren, zu exprimieren, in einem mehrwertigen Imfpstoff formuliert werden.
Unabhängig davon, ob das rekombinante Virus gegenüber dem zu immunisierenden Virus infektiös ist oder nicht, kann eine inaktivierte Impfstoff-Formulierung hergestellt werden. Inaktivierte Wirkstoffe sind «tot» in dem Sinne, dass ihre Infektivität zerstört worden ist, üblicherweise durch Behandlung mit Formaldehyd. Idealerweise wird die Infektivität des Virus ohne Beeinträchtigung des Capsides oder des Hüllproteines, welches die Immunogenität des Virus trägt, zerstört. Um inaktivierte Impfstoffe herzustellen, müssen grosse Mengen des rekombinanten Virus in Kulturen gezüchtet werden, um die nötige Quantität des relevanten Antigens zur Verfügung zu stellen. Eine Mischung von inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, können für die Formulierung von «mehrwertigen» Impfstoffen verwendet werden. In einigen Fällen kann dies gegenüber lebenden Impfstoff-Formulierungen bevorzugt sein, da mögliche Schwierigkeiten wegen gegenseitigen Wechselwirkungen der gemeinsam verabreichten Viren auftreten können. In jedem Fall sollte der inaktivierte rekombinante Virus oder die Mischung von Viren mit einem zweckmässigen Adjuvanz formuliert werden, um die Immun-Antwort zu ihrem Antigen zu erhöhen. Zweckmässige Adjuvantien umfassen ohne Einschränkung, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid; oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronpolyole; Polyanionen; Peptide; und Öl-Emulsionen.
Es können viele Verfahren für die Einführung der oben beschriebenen Impfstoff-Formulierungen verwendet werden; diese umfassen, ohne Einschränkung, den intradermalen, intramuskulären, intraperitonealen, intravenösen, subcutanen und intranasalen Weg. Wenn eine lebende rekombinante Virus-Impfstoff-Formulierung verwendet wird, kann diese über den natürlichen Weg der Infektion mit dem ursprünglichen Wildtyp des Virus erfolgen, welcher für die Herstellung des rekombinanten Virus in der Impfstoff-Formulierung verwendet wurde.
Untereinheits-Impfstoff-Formulierunaen
In einer Alternative zu den viralen Wirkstoffen können die p97-verwandten Peptide selbst als Immunogen in Untereinheits-Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. Untereinheits-Impfstoffe umfassen nur das relevante immunogene Material, welches nötig ist, um den Wirt zu immunisieren. Demzufolge können die p97-verwandten Peptide von den Rekombinanten, welche die Peptide exprimieren, gereinigt werden. Solche Rekombinanten umfassen sämtliche vorher beschriebenen, virus-infiszierten Kulturzellen, bakterielle Transformanten oder Hefe-Transformanten. Die p97-verwandten Peptide oder Proteine können auch chemisch synthetisiert werden. Unabhängig davon, ob die p97-verwandten Peptide aus den Rekombinanten gereinigt wurden oder chemisch synthetisiert wurden, kann das Endprodukt auf die zweckmässige Konzentration eingestellt werden und mit einem zweckmässigen Impfstoff-Adjuvanz formuliert und für den Gebrauch verpackt werden. Zweckmässige Adjuvantien umfassen ohne Einschränkung Mineralgele, z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanionen, Peptide und Öl-Emulsionen. Das p97-verwandte Peptid kann ebenfalls in Liposome einverleibt werden oder mit Polysacchariden konjugiert und/oder Polymeren für die Verwendung in Impfstoff-Formulierungen.
In solchen Fällen, wo das p97-verwandte Peptid ein Hapten ist, d.h. ein Molekül, welches insofern antigenisch ist, als dass es selektiv mit konjugierten Antikörpern reagieren kann, jedoch nicht immunogen ist, so dass es keine Immun-Antwort hervorrufen kann, kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden werden und der Hapten-Träger kann für die Verwendung als Impfstoff formuliert werden; beispielsweise ein grosses Protein, wie ein Protein-Serumalbumin kann dem gekuppelten Hapten Immunogenizität verleihen.
BEISPIEL: Melanom-assoziiertes p97-Antiaen
Im nachstehend beschriebenen Beispiel wurden cDNA-Clone, welche von verschiedenen Gebieten der p97-mRNA abgeleitet waren, zusammengefügt und in einem Expressionsvektor, welcher gegen die Expression eines mit p97-verwandten Peptides gerichtet war, als Insertion eingefügt. Die p97-verwand-ten Peptide, welche durch die Expression der Vektor-Wirtzelle produziert werden, können als Impfstoff formuliert werden.
Reinigung von p97-mRNA
Es wurden Polysome von SK-MEL28-Melanomzellen durch Magnesium-Präcipitation hergestellt (Carey et al., 1976, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 73: 3270-3282). Von dieser Herstellung wurden Polyso-
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me, welche naszierende p97-Ketten aufwiesen, durch Inkubation mit: 3 lgG2a-monoclonalen Antikörpern (96,5, 118,1,133,2), die spezifisch für bestimmte Epitope von p97 sind (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem., 255:4980-4983; Brown et al., 1981, J. Immunol., 127:539-546; Brown et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72) gereinigt, wonach eine Affinitäts-Chromatographie auf Protein A-Sepharose folgte. Die p97-angereicherte mRNA wurde unter Verwendung von EDTA eluiert und durch Affinitäts-Chromatographie auf Oligo(T)Cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) gereinigt. In einem typischen Experiment ergaben 150 E.260 Einheiten von Polysomen 260 ng p97-angereicherte mRNA, was 0,23% der totalen mRNA ausmachte. Bei der Translation in Xenopus in Oocytes und Test auf p97 wie beschrieben (Brown et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, Londen, 303: 70-72), ergab die p97-angereicherte mRNA 80 pg p97 pro ng mRNA, während die p97-nicht-angereicherte mRNA nur 0,44 pg p97 pro ng mRNA ergab, was zeigt, dass die p97-mRNA-Aktivität etwa 180fach angereichert worden ist. Die Ausbeute der p97-mRNA-Aktivität war 42%. Die Translation im Retikulocyten-Lysatsystem (Pelham und Jackson, 1976, Eur. J. Biochem., 67: 247-256) zeigte, daSs die p97-angereicherte mRNA ein Hauptpoly-peptid codierte, welches ein scheinbares Molekulargewicht von 84 000 Dalton aufwies, wie die Analyse durch SDS-PAGE ergab, welches nicht nachweisbar war, in den Translationsprodukten von nicht-ange-reicherten mRNA und im Antiserum, welches für p97 spezifisch war, immunpräcipiert wurde (Figur 1). Es wurde geschlossen, dass dies der nicht-glycosilierte Vorläufer von p97 war.
Herstellung und Konstruktion von cDNA-Clonen
Die zwei nachstehend beschriebenen Techniken wurden zur Konstruktion von cDNA-Clonen aus denen, wie oben beschrieben, isolierten mRNA-Matrizen transkribiert.
Konstruktion von cDNA-Clonen durch Primino mit OliggCn
Die wie oben hergestellte p97-angereicherte mRNA wurde als Matrix (Templat) für die cDNA-Synthe-se unter Verwendung von Oligo(T) als Primer. Die cDNA wurde in pBR322 folgendermassen geclont: für die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurde p97-angereicherte mRNA, die vier dNTPs und Oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) mit Umkehr-Transkriptase (Molecular Genetic Resources) inkubiert. Der zweite Strang wurde durch Inkubation mit dem grossen Fragment von E. coli DNA-Polyme-rase (Bethesda Research Labs., Bethesda MD) synthetisiert und die doppelsträngige cDNA wurde mit SI-Nuklease (erhalten von D. Durnam des «The Fred Hutchinsen Cancer Research Center», Seattie, WA) verdaut. Die cDNA wurde dann mit terminaler Desoxynukleotidil-Transferase (Bethesda Research Labs., Bethesda, MD) mit dC-Schwänzen versehen, mit Pstl-verdauten. mit dG-Schwänzen versehenem pBR322 (Bethesda Research Labs., Bethesda MD) versehen (Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 75: 3727-3731) und zur Transformation von CaCl2- behandelten E. coli-RRI verwendet. Die DNA aus Kolonien von transformierten Bakterien, wurde auf Papier gebunden (Taub und Thompson, 1982, Anal. Biochem., 126: 222-230) und durch differenzielle Hybridisierung mit cDNA-Pro-ben, die auf p97-angereicherten und nicht-angereicherten mRNA-Matrizen synthetisiert wurden, einem Screening unterworfen.
Es wurde ein Clon mit 243 Basenpaaren (bp), p97-3a2fl identifiziert, welches mit p97 angereicherte cDNA, jedoch nicht mit nicht-angereicherten cDNA hybridisierte und ebenfalls p97-mRNA in Hybrid-Auswahl-Translations-Versuchen auswählte. Es war ein Polyadenylierungssignal (AATAA) und ein Po-ly(A)-Trakt am 3'-Ende der cDNA (vgl. Figur 2) vorhanden. p97-3a2fl, welches einer Nick-Translations unterworfen wurde, hybridisierte 100mal stärker mit p97-angereicherter mRNA als mit nicht-angerei-cherter Melanom-mRNA und nicht nachweisbar mit Fibroblasten-mRNA. Die Northern Blot-Analyse mit der geklonten cDNA als Probe identifizierte eine mRNA mit etwa 4 Kilobasen, welche in SK-MEL28-Me-lanomzellen vorhanden war und in Fibroblasten abwesend war.
Genomisches Clonino von d97 und Verwendung von synthetischen Oliaonukleotiden zum Primina der cDNA-Svnthese
Versuche, cDNA-Clone zu erhalten, die sich mehr als 1 kb vom Polyadenyliqrungs-Zentrum ausdehnten, waren nicht erfolgreich, wahrscheinlich wegen eines Gebietes von hohen GC-Gehalt (grösser als 80%) mit einer extensiven Sekundärstruktur. Zur Umgehung dieses Problems wurde das genomische Cloning verwendet. Vier überlappende genomische Clone wurden aus Banken von A.L47.1 isoliert, welche grössenfraktionierte SK-MEL28-DNA enthielten, welche an spezifischem p97-Restriktionsfrag-ment angereichert war. Diese vier genomischen Clone umspannten 28 kb und enthielten die gesamte Codierungsregion von p97, einschliesslich der Regelungsregion des Gens. Die genomischen Clone, sequentiell angeordnet von 5' zu 3' waren: XB15, XH17, XB6.6 und XE7.7. Die Nomenklatur besteht aus einem Buchstaben, welcher sich auf das zur Bildung des Fragmentes verwendete Restriktionsenzym bezieht und die Numerierung gibt die Kilobasengrösse des Fragments an, welches mit AL47.1 geclont wurde. Ausgehend vom 5'-Terminus enthält demzufolge das X-Clon B15 ein 15kb BamHI p97-Fragment; das \-Clon H17 enthält ein 17kb Hindill p97-Fragment; und X-Clon B6.6 enthält ein 6.6kb Barn Hi p97-Frag-
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ment und das X-Clon E7.7 enthält 7.7kb EcoRl p97-Fragment (vgl. Figur 2A). Die Restriktions-Fragmen-te der Clone, welche mit 4kb p97-mRNA auf Northern Blots hybridisierten, wurden sequeniert und die p97-Exons wurden durch eine computer-unterstützte Homologie-Recherche zwischen den vorausgesagten Codierungssequenzen und den Aminosäuresequenzen des humanen und Hühner-Transferrin identifiziert (Yang et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 81; 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 79: 2504-2508; Jetsch und Chambon, 1982, Eur. J. Biochem., 122: 291-295). Es wurden drei synthetische Oligonukleotide, deren Sequenzen auf den p97-genomischen Exon-Sequenzen basierten, zum Primen der cDNA-Synthese auf SK-MEL28-mRNA verwendet und die resultierende cDNA wurde mit einem X-gt10 folgendermassen geclont: die p97cDNA wurde mit einem dG-Schwanz versehen und mit einem Brücken-Oligonukleotid (AATTCCCCCCCCCCCC) und X-gt10 verbunden, welche mit EcoRl einer Restriktion unterworfen waren. Die Brücken-Oligonukleotide erlaubten die Insertion und Ligation der cDNA-Sequenz mit den dG-Schwänzen am EœRI-Zentrum des X-gt10. Der X-Phage wurde gekoppelt (Grosveld et al., 1981, Gene, 13: 227-237), und auf E. coli c600-rK_mK+hfi beschichtet. Die cDNA-Genbank in A.-gt10 wurde auf die p97-lnsertion durch Plaque-Hybridisierung einem Screening unterworfen (Benton und .Davis, 1977, Science, 196:180) mit genomischen Exon-Fragmen-ten als Proben. Die Proben wurden mit 32P-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/mmole) radiomarkiert, durch Nick-Translation auf eine spezifische Aktivität von 5-10 x 108 cpm/ ng. Drei überlappende cDNA-Clone (10 al, 1jl, 2fl), welche 2368 Nukleotide der p97-mRNA umspannten und die gesamte Codierungsregion umfassen, wurden unter Verwendung von p97-Exon-spezifischen Fragmenten als Proben identifiziert (Figur 2).
DNA-Seauenz-Analvse von d97
Es wurden cDNA-lnsertionen herausgeschnitten und in den Plasmid-Vektor pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res., H: 1645-1644) einer Subclonierung unterworfen und nacher in E. coli fortgepflanzt und eine Restriktionskarte erstellt. Die cDNA wurde ebenfalls im M13mp18-Phagen-Clonierungs-Vektor (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene, 33:103-119) einer Subclonierung unterworfen und unter Verwendung der Didesoxy-Methode von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463-5467) sequeniert. Die M13-Clone, welche grosse Insertionen enthielten, wurden durch Bildung von Deletionen unter Verwendung von DNAse l (Hong, 1983, J. Mol. Biol., 158: 539-549) oder Exo-nuklease III (Henikoff, 1984, Gene, 28: 351-359) und durch Verwendung von synthetischen 21-mer-Oli-gonukleotid-Primern sequeniert.
Die p97-cDNA-Sequenz ist in Figur 3 dargestellt. Eine offene Erkennungsfrequenz von 2214 Nukleotiden dehnt sich vom ersten ATG über die Sequenz in der Nähe, welche mit der Anfangssequenz, welche durch Kozak bestimmt wurde, übereinstimmt (Kozak, 1980, Nucleic Acids Res., 8:127-142) bis zur TGA in Stellung 2215. Die meisten 5'-cDNA-Clone enthalten zusätzliche 60 Nukleotide stromaufwärts der An-fangs-ATG. Die 3'-nicht-codierende Region von p97-mRNA, welche nicht als cDNA-Clon erhalten wurde, wurde als einzelnes genomisches Exon identifiziert, welches 1667 Nukleotide enthält. Die Reste 20-32 der vorausgesagten Aminosäuresequenz sind identisch mit der bekannten N-terminalen Aminsosäu-resequenz von p97 (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173), was die Identität mit der geclonten cDNA beweist Weiter beträgt das vorausgesagte Molekulargewicht des Vorläufers 80196 Dalton, was gut mit dem festgestellten Molekulargewicht des in vitro-Translationsproduktes übereinstimmt.
Konstruktion eines rekombinanten Expressions-Plasmides. welches die p97-codierende Sequenz enthält
Die grosse Grösse des p97-Gens erforderte das Zusammenfügen der durch spezifisches Priming der Melanom-mRNA mit Umkehr-Transkriptase erhaltenen cDNA-Clone. Es wurden die drei cDNA-X.-gt10-Clone (1 Oal, Ijl und Ifl; vgl. Figur 2), welche die Codierungsregion vom Signalpeptid bis zur Membran-Ankersequenz codiert, verwendet. Die p97-lnsertion des Clons 10al wurde durch Verdauung mit EcoRl herausgeschnitten und die Oligo(dG)-Sequenz am 5' der cDNA-10al wurde durch Verdauung mit Exo-nuklease III entfernt, wobei das Clon 10alb gebildet wurde, mit einer Hindlll-Stelle. 30 bp stromaufwärts des Anfangs-Methionins des p97-Präproteins. Die p97-lnsertionen der drei cDNA-Clone 10alb, 1jl und 2fi und die genomischen Clone E7.7 wurden miteinander an den Pvull, Sstl und EcoRI-Restriktionsen-zym-Stellen verbunden und an den Stellen Hindlll-EcoRI als Insertion in den Plasmid-Vektor pEMBL18+ eingefügt (Dente et al., 1983, Nuc. Acid Res., H: 1645-1655) wie in Figur 2 dargestellt. Die finale Konstruktion, p97b, umfasst 4.4 kb p97-lnsertion im Plasmid-Vektor pEMBL18+, welcher zur Transformation von E. coli HB101 verwendet wurde. Die Insertion in p97b enthält 30 bp der 5'-untranslatierten Region der p97-mRNA, die gesamte Codierungssequenz und die 3'-untranslatierte Region, welche durch ein 5'HindIIi-Zentrum gebunden ist und die 3'EcoRI-Stelle enthält.
Die 4.4 Kilobasen p97-lnsertion wurde aus p97b mit Hindlll und EcoRl herausgeschnitten und die Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von E. coli-DNA-Polvmerase gefüllt. Das stumpfendige Fragment wurde als Insertion an der einzigen Smal-Stelie des eukaryotischen cDNA-Ex-pressions-Vektors 1995.12 pUCI3, einem Derivat; des Vektors mThGH-112 eingesetzt (Palmiter et al., 1983, Science, 222: 809-814 ), welcher von Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle,
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Washington) zur Verfügung gestellt wurde. Dieser Vektor verwendet den Mäuse-Metallothionein-Pro-motor, um fremde Gene in eukaryotischen Zellen zu exprimieren. Die Konstruktion mit der p97-lnsertion in korrekter Orientierung wurde durch Restriktions-Analyse identifiziert und als pMTp97b bezeichnet.
Das rekombinante Plasmid wurde einer Transfektionin LMTK~-Zellen unterworfen und die Transfek-tanten wurden durch Wachstum in HAT-Medium ausgewählt. Die Clone, welche von der Transfektions-Platte gewonnen wurden, wurden in 96-Loch-Mikrotest-Platten ausgebreitet und mit Kulturmedium versehen und die Zellysate-von Abklatsch-Platten wurden auf p97 durch einen immuno-radiometrischen Zwei-Stellen-Test getestet. Die Subclone wurden ausgebreitet und wieder getestet. Das Clon TKMp97-12, welches etwa 4 000 000 Moleküle p97 pro Zelle exprimiert, wurde gezüchtet, mit Cadmium induziert und als Quelle für p97 für die Immunisierung verwendet.
Die Immunisierung von Mäusen mit p97-verwandten Peptiden
Die TKMp97-12-Zellen wurden gezüchtet, mit Cadmium induziert und (14,4 g) wurden durch Inkubation während 10 Min. auf Eis mit 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40) lysiert. Das Lysat wurde bei 200 000 g während 45 Min. bei 4°C ultrazentrifugiert und die Hälfte des Lysates wurde auf eine 1 ml Immuno-Affinitäts-Säule gegeben, welche auf p97 spezifisch war (Fab-Fragment des Antikörpers 96,5 der an Sepharose gekoppelt war). Das Immuno-Adsorbenz wurde intensiv gewaschen, zuerst mit TNEN und dann schliesslich mit 20 mM Tris-HCI, pH-Wert 6,8.
Für die Immunisierung wurde 0,5 ml der adsorbierten Immuno-Affinitätssäule, die wie oben beschrieben, hergestellt wurden, mit 0,5 ml 20 mM Tris-HCI, pH 6,8, gemischt und mit 1 ml vollständigen Freund-Adjuvanz kultiviert. Vier BALB/c-Mäuse erhielten je intraperitoneal 0,4 ml der Emulsion. 3 Wochen später wurden die Mäuse mit einem Viertel dieser Menge des Antigens in unvollständigem Freund-Adju-vanz nachbehandelt. Die Kontrollmäuse wurden mit einer Immuno-Affinitäts-Säule mit einem Antikörper, welcher p97 nicht verwandt war, immunisiert und wurden im übrigen identisch behandelt. Den vier p97-im-munisierten Mäusen und den beiden Kontrollmäusen wurde 1 Woche nach der Auffrischung der Immunisierung Blut entnommen. Die Seren wurden auf Antikörper gegen p97 durch Immuno-Präcipitation mit ra-dio-iodierten SK-MEL-Melanomzellen getestet und einer SDS-PAGE unterworfen. Die Resultate zeigten, dass die Seren der vier mit p97 immunisierten Mäuse immuno-präcipiertes p97 aufwiesen, während die Kontrollseren negativ waren. Die Seren wurden ebenfalls auf die Gegenwart von Antikörpern, welche gegen p97 gerichtet sind, getestet, wobei ein ELISA-Assay mit Glutaraldehyd-fixierten SK-MEL27-Melanomzellen (20 000 Zellen pro Mikrotest-Loch) verwendet wurde. Die fixierten Zellen wurden mit 0,05 ml Serum, welches 1/10 000 verdünnt war, während 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert, gewaschen und dann während 1 Std. bei Zimmertemperatur mit 0,05 ml Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Geissen-Antismäure IgG (Southern Biotech) inkubiert. Die optischen Dichten (abgelesen bei 490 nm) der Seren der p97-immunisierten Mäuse waren 0,350, 0,243, 0,343, 0,200, während die optischen Dichten der Kontrollseren 0,036 und 0,057 betrugen.
Charakterisierung von o97. Struktur von p97
Die Struktur von p97 wurde aus der Aminosäuresequenz des p97-Vorläufers bestimmt, welcher vier strukturelle Bereiche aufweist. Da der Rest 20 der Vorläufersequenz dem N-Terminus des reifen p97 entspricht, stellen die Aminosäurereste 1-19 möglicherweise ein Signalpeptid dar, eine Annahme, die durch die Länge und die hydrophobe Natur gestützt wird. Die Aminosäuren 20-361 und 362-713 umfassen zwei homologe Bereiche von 342-352 Aminosäuren. Mögliche N-gebundene Glycosilierungsstellen befinden sich an den Stellen 38 und 135 im N-terrr.inaien Bereich und in Stellung 515 im C-terminalen Bereich. Schliesslich nehmen wir an, dass die Aminosäuren 714-718 ein Gebiet von vorwiegend unbelade-nen und hydrophoben Resten, p97 in der Zell-Membrane verankert (Davis et al., 1985, J. Mol biol, 181: 111-121) und sich in das Cytoplasma ausdehnen.
Die Bereichsstruktur von p97 wird durch Protease-Verdauungsversuche gestützt. Die Verdauung von p97 mit Trypsin, Papain (Brown et al., 1981, J. Immunol., 127: 539-546) oder Thrombin ergibt ein glycosyliertes, antigenisches Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 Dalton. Das Fragment wurde dann aus einer Thrombin-Verdauung von p97, welches metabolisch mit 35S-Methionin oder 35S-Cystein markiert war, gereinigt und wie beschrieben sequeniert (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Die Cysteinreste wurden an den Stellen 7 und 17 identifiziert und die Methionin-Reste an den Stellen 2-20. Identische Resultate wurden erhalten mit intakten p97 in vollständiger Übereinstimmung mit der N-terminalen Sequenz von p97, welche aus der cDNA-Sequenz vorausgesagt wurde. Wir schliessen, dass das Proteinase-resistente Fragment mit einem Molekulargewicht von 40 000 Daltons dem N-terminalen Bereich von p97 entspricht. Es war nicht möglich, den C-terminalen Bereich von p97 zu isolieren, wahrscheinlich wegen seiner Protease-Empfindlichkeit.
Homologie von p97 mit Transferrin
Eine Recherche an der Aminosäuresequenz-Bank der Protein Identification Resource (Release 5,0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London, 290: 8) zeigte, dass p97 bestechend homolog mit drei Mitgliedern
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der Transferrin-Superfamilie ist: humanes Serum-Transferrin, humanes Lacto-Transferrin und Hühner-Transferrin (37-39% Homologie, vgl. Figur 3). Da das humane und das Hühner-Transferrin 50% Homologie zeigen, musste p97 etwa vor 3 000 000 Jahren vom Serum-Transferrin abgeleitet worden sein. p97 hat 14 Cysteinreste, welche in jedem Bereich in homologer Stellung vorliegen. Das humane Transferrin enthält alle diese Cysteine in homologen Stellungen in beiden Bereichen, während dem humanen Lacto-Transferrin und dem Hühner-Transferrin nur zwei dieser Cysteinreste (in ihren C-terminaien Bereichen) fehlen. Im Unterschied zu p97 enthalten diese Proteine 4-7 zusätzliche Cysteine in ihren C-termi-nalen Bereichen und weisen kein entsprechendes Mitglied im N-terminalen Bereich auf. Das humane Transferrin enthält in seinem N-terminalen Bereich zwei zustätziiche Cystein-Einheiten. Die Positionen der meisten Disulfide in humanem Transferrin, Lacto-Transferrin und Hühner-Transferrin wurden direkt bestimmt (McGillivray et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sei, USa, 79: 2504-2508; Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem., 145: 659-676; Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel), 39:135-141; MacGilliv-ray et al., 1983, J. Biol. Chem.,258:3453-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem., 122:297-303; Williams, 1974, Biochem J., 141: 745-752). Man kann die Gegenwart von 7 Disulfid-Bindungen in jedem Bereich von p97 voraussagen (vgl. Figur 5).
Die Aminosäure-Homologie zwischen den Bereichen von p97 (46% - erzielt durch Insertion von 7 Schlaufen von 9 Resten) ist bestechender als diejenige, welche in humanem Transferrin (43% - 16 Schlaufen, 45 Reste) oder in Hühner-Transferrin (35%, 12 Schlaufen, 49 Reste) festgestellt werden kann. Unter Voraussetzung der extensiven Sequenz-Homologie zwischen p97 und Transferrin, dem offensichtlich ähnlichen Faltmuster auf Basis der Konservierung von Cysteinen wird angenommen, dass wenn die vorliegende Niederauflösungs-Röntgen-Struktur von Transferrin (Gorinsky et al, 1979, Nature, London, 281: 157-158) verfeinert werden kann, kann es möglich sein, dass die dreidimensionale Struktur von p97 abgeleitet werden kann.
Funktion von d97
Seine Mitgliedschaft in der Transferrin-Superfamilie, seine Fähigkeit Eisen zu binden (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173) und seine gemeinsame chromosomale Lokalisierung mit Transferrin und dem Transferrin-Rezeptor (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sei, USA, §1: 2752-2756) stützen alle die Rolle von p97 beim Eisentransport. Es wird angenommen, dass die Eisenbindungstasche von Transferrin 2-3 Tyrosine, 1-2 Histidine und ein einziges Bicarbonat-bindendes Arginin aufweist (Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem., 145: 659-676). Die Konservierung dieser Aminosäuren in p97 stützt seine Rolle beim Eisenmetabolismus (vgl. Figur 4). Da p97 ein Membran-gebundenes, Transferrin-artiges Molekül darstellt und keine Homologie mit dem Transferrin-Rezeptor aufweist (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311: 675-678) kann sich seine Rolle im cellulären Eisenmetabolismus von demjenigen, welcher durch Zirkulation des Serum-Trans-ferrins und dem cellulären Rezeptor für Transferrin gebildet wird. Die Expression der geclonten p97-cDNA in eukaryotischen Zellen wird experimentelle Tests über die funktionellen Eigenschaften erlauben.
Schluss
Auf Basis dieser Daten ist es klar, dass cDNA-Konstruktionen für das Melanom-assoziierte p97 erhalten worden sind und dass diese effizient in Säugetierzellen exprimiert werden können, um grosse Mengen des antigenischen p97 zu erhalten.
Expression von aeclontem d97 und Impfstoff-Tests
Die hier beschriebenen ausführlichen Experimente beschreiben die Expression des geclonten p97-Proteins und entsprechende Impfstoff-Tests. Die Expression von p97-Protein in einer sekretierten Form (durch das transferierte Mäusezell-Clon B16svp97a.14) erlaubte die Reinigung in Milligramm-Mengen des p97-Proteins in voller Länge. Das gereinigte Protein wurde für in vitro-Tests auf die Induktion von cellulärer Immunität und für die Prüfung seines Potentials als Untereinheits-Impfstoff verwendet. Das p97-Genprodukt wurde ebenfalls an der Zelloberfläche von metastatischen Mäuse-Melanom-zelien exprimiert und stellt ein Modell für den Test der Wirksamkeit von Impfstoffen für die Vorbeugung des Tumorwachstums in einem sygenetischen System dar.
Das p97-Gen wurde in einen lebenbenden rekombinanten Vaccinia-Virus als Insertion eingeführt, für die Verwendung als Impfstoff-Formulierung, welche fähig ist, wirksame celluläre Immunität zu verleihen. Der rekombinante Vaccinia-Virus Vp97a-NY wurde wegen seiner Fähigkeit, Immunität bei Mäusen zu bilden, ausgewählt unter Verwendung einer Vielzahl von Versuchen für die Demonstration von humoraler und cellulärer Immunität. Unter Venwendung des syngenetischen Mäusetumor-Modells, wie es oben beschrieben ist, zeigte der rekombinante Virus-Impfstoff Vp97a-NY die Verleihung eines protektiven Effekts von einer Tumorzellen-Herausforderung. Der Impfstoff zeigte ebenfalls einen therapeutischen Effekt bei Mäusen mit existierenden, wachsenden Lungenmetastasen, einer Eigenschaft, welche analog zur vorgeschlagenen Verwendung des Impfstoffes für die Bildung einer immunotherapeutischen Antitu-mor-Antwort bei humanen Melanom-Patienten mit existierendem Tumor ist.
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mologen Mäuse-Protein besteht (in den bisher getesten Gebieten) wurde der Vp97a-NY-lmpfstoff ebenfalls bei nicht-humanen Primaten getestet. Hier besteht eine viel grössere Homologie zwischen humanem p97 und der Affenform des Proteins (wie sich durch die Kreuz-Reaktivität auf der monoclonalen Antikörperstufe zeigte). Wegen möglicher Schwierigkeiten bei der Bildung einer Immun-Antwort gegen ein «selbst»-Protein, wurde der am nächsten verwandte Macaquenaffe zum Testen der Immunogenizität des Vp97a-NY-lmpfstoffes verwendet. Der rekombinante Vaccinia-Impfstoff wurde in Affen getestet, und es hat sich erwiesen, dass er eine humorale Immunität, welche gegen das Protein .p97 gerichtet war, einleitet. Soweit zeigten die Affen keine merklichen Symptome von schädlichen Nebenwirkungen, die vom Impfstoff herrühren, nachdem sie zwei Inokulationen des lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus während einer Periode von 6 Wochen verabreicht bekamen.
Plasmid-Expression
Das Expressions-Plasmid, welches durch den frühen SV-40-Promotor sv2 angetrieben wird, wurde aus dem cDNA-Plasmid-Clon p97 konstruiert, welches ähnlich dem Plasmid p97b ist, mit der Ausnahme, dass die gesamte 3'UT-Region verwendet wird (Figur 6). Sämtliche cDNA-Clone wurden ursprünglich aus X-gt10-Banken mit synthetischen EcoRI-dG (9-17)-Linken, wie vorher beschrieben, isoliert. Die Insertionen wurden durch EcoRl herausgeschnitten und in pEMBL18+ für die nachfolgende Fortpflanzung und Charakterisierung subgeclont. Das Clon 10al wurde in M13mp18 subgeclont und eine RF-Form wurde mit BamHI und Sphl verdaut, kurz mit Exonuklease III behandelt, mit Sl-Nuklease abgestumpft, mit Klenow behandelt und wieder verbunden. Es wurden verschiedene Plaquen isoliert und sequeniert, wobei in einer davon, der dG-Schwanz entfernt wurde und 33 bp der p97 5'-untranslatierten Region an die Hindlll-Stelle von M13mp18 als Insertion eingefügt wurde. Ein RF dieses Subclons (10ala) wurde für die Bildung der intakten p97-cDNA verwendet; andererseits wurden sämtliche Fragmente aus den Plasmid-Subclonen isoliert. Das 550 bp-Hindlll-Pvull-Fraament aus 10ala und das 735 bp Pvull-Sall-Fraament von 1jl wurde aus LMP-Agarosegelen isoliert und in pEMBL18+ an den Sa[l- und Hindlll-Stellen eingebaut, wobei p5'p97 gebildet wurde. Das genomische Clon E7.7 in pEMBLI 8+ wurde vollständig mit EcoRl verdaut und partiell mit Sstl verdaut und das 4,5 kb-Fragment wurde durch Fraktionierung durch 0,8% LMP-Agarose abgetrennt. Dieses 4,5 kb3'-Fragment wurde mit dem 404 bp Sstl-Fraament von 2fl und dem 535 bp BamHl-Sstl-Fraament von 1 jl gebunden in das pEMBLI8+ an den Stellen Sali und EcoRl. wobei p3'p97 gebildet wurde. Das 1285 bp Hindlll-Sall-Fraament von p5'p97 wurde dann in p3'p97-bilden-des pp97a eingebaut. Das EcoRI-Partial-Hindlll Fragment von diesem Clon wurde als Insertion in pSV2neo (Southern et al., 1982, J. Mol. App. Genet., 1: 327-341) an den Stellen Hindill und EcoRl. die Neomycin-codierende Region und die SV40-spleissende/PolyA-Sequenzen wurden entfernt, wobei der frühe SV40-Promotor und der 72 bp Enhancer, das 33 bp-p975'UTR, die gesamte p37-codierende Region, 3'UTS und die 1,4 kb 3'-flankierende DNA zurückblieben. Das resultierende Plasmid wurde als pSV2p97a bezeichnet.
Das sv2-getriebene Plasmid wurde einer Transfektion durch Kalzium-Phosphat-Fällung in einer Anzahl von eukaryotischen Zellen unterworfen und die exprimierten Zellen wurden geclont und unter Verwendung einer Co-Transfection eines dominanten auswählbaren Markers selektioniert. Zur Durchführung wurden Ovar-Zellen eines chinesischen Hamsters (CHO) in Hank-Fl-Medium, welches 15% fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-Glutamin, 1,3 mM Prolin und Antibiotika enthielt, kultiviert. Die B16-Zeilen wurden in RPMI-Medium, welches 0,15% Bicarbonat und 1735 Zellen in DMEM-Medium (Gibco), je mit 15% FCS versetzt und Antibiotika enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden durch eine modifizierte Kalzium-Phosphat-Technik einer Transfektion unterworfen (Wigler M., et al., 1978, Cell, 14: 725-731), mit 20 (ig pro Platte pSV2p97a-Plasmid-DNA und 0,5 ng entweder pSV2DHFR oder pSV2neo. Alle Plasmide wurden an der EcoRI-Stelle linearisiert. Es wurden stabile Transfektionsmittel ausgewählt, unter Verwendung eines Hypoxanthin-negativen (HAT-)-Medium für CHO-Zellen oder 0,5 g/ml Geneticin (G418, Gibco) für das B16 und 1735 Zellen. Die überlebenden Zellen begannen 7 Tage nach der Transfektion sichtbare Kolonien zu bilden und wurden mit sterilen Polyester-Filtern bedeckt, welche durch Glaskügelchen an der Stelle gehalten wurden. Die Filter blieben während 5 Tagen an der Stelle, wobei die Zellen in der Polyester-Matrix wachsen konnten, wobei eine Kopie der Kolonien auf der Platte gebildet wurde. Die Riter wurden dann entfernt und für einen Bindungsversuch für lebende Zellen mit einem iodierten Anti-p97-monoclonalen Antikörper verwendet. 10 Microgramm markierter monoclonaler Antikörper wurde mit bis zu 20 Filtern in 10 ml FCS bei 4°C während einer Std. inkubiert. Die Filter wurden ausgiebig in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, getrocknet und auf einem XAR-5-Film über Nacht bei -70°C stehengelassen. Die Filter wurden anschliessend mit 7% Methylen-Blau gefärbt, um die Zell-Kolonien sichtbar zu machen. In allen verwendeten Zellinien, mit Ausnahme der B16-Mäuselinie, enthielten die Expressionszellen das antigenische p97-Protein an ihrer Oberfläche.
In den B16-transfektierten Zellen wurde p97 in das Medium freigesetzt, was bei diesem Zelltyp einen einmaligen Fund darstellte. Die Sekretion von p97 ermöglichte die Reinigung des p97-Proteins aus dem Zellmedium in vollständiger Länge. Das Clon B16SVp97a.14 exprimierte etwa 4 ng/ml p97 im verbrauchten Medium. Das rekombinante p97 wurde aus dem verbrauchten Medium des transferierten Clons B16SVp97a.14, welches grosse Mengen von p97-Antigen in das Medium ausschüttete, gereinigt. Die Zellen wurden nahezu in Konfluenz (109 Zellen) in 850 cm2-Rollflaschen gehalten, wobei kontinuierlich
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Zellen wurden nahezu in Konfluenz (109 Zellen) in 850 cm2-Rollflaschen gehalten, wobei kontinuierlich kleine Mengen von frischem Medium zugesetzt wurden. Sie setzten das Ausschütten von Antigen fort, ohne sich abzulösen, während Wochen, was eine kontinuierliche Ernte und Frieren des verbrauchten Mediums erlaubte. Die Reinigung, von p97 wurde durch Immuno-Affinitäts-Chromatographie durchgeführt, wobei Sepharose die an Fab-Fragmente des monoclonalen Antikörpers 96,5 gebunden war, verwendet wurde. Zu diesem Zweck wurden drei Liter des verbrauchten Mediums auf eine Serie von drei 30 ml-Säulen gegeben. Die erste enthielt 15 ml G-25 superfeines Sephadex (Pharmacia), die zweite enthielt 20 ml Sepharose 4b (Pharmacia) und die dritte enthielt 8 ml Cyanogen-Bromid-aktivierte Sepharose (Sigma), die an Fab-Fragmente des monoclonalen Antikörpers 96,5 gebunden war (10 mg Protein/ml Sepharose). Anschliessend wurden die Affinitäts-Säulen extensiv mit kalten PBS gewaschen und das Antigen mit 30 ml 0,1 M-Citrat, pH 5 und 30 ml 0,1 MCitrat, pH 4, eluiert. Es hat sich gezeigt, dass diese Bedingungen die immuno-Reaiktivität des Antigens nicht verändern, während der Durchführung der gesamten Elution des Antigens aus den monoclonalen Antikörpern 96,5. Die zwei Elutionen wurden mit 3,0 ml, bzw. 4,5 ml, 2 M-Tris, pH8, neutralisiert. Das gereinigte Eluat wurde unter Verwendung eines Amicon-Apparates mit einem PM10-Filter konzentriert und mit zwei 10 ml-Volumen PBS gewaschen, wobei eine Endausbeute von 4,95 mg in 4,5 ml erhalten wurden, wie dies durch den Bradford-Assay (Biorad) bestimmt wurde. 15 ng des Produktes wurden auf SDS-PAGE (Figur 7) gegeben und beide mit Coomassie-Blau und Siiberfarbstoff gefärbt. Ein Doppeldeterminanten-lmmuno-Assay (DDIA) (Brown et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sei., 78:539) ergab eine unabhängige Bestätigung der molaren Quantität des gereinigten Proteins. Parallel wurcen Kontrollpräparate in verbrauchtem Medium der B16-Stammzeliinie hergestellt, welche kein nachweisbares Protein enthielten. In einer nachfolgenden Zubereitung wurde 30 mg 95% reines p97-Protein aus 300 mg monoclonalen Antikörper 96,5-Fab-Fragmenten, die mit Sepharose konjugiert waren, gereinigt. Das gereinigte p97-Protein war immunogen und erzeugte eine starke Anti-körper-Reaktion in Mäusen, welche mit dem Protein wie nachstehend beschrieben, immunisiert wurden.
Konstruktion und Expression des rekombinanten p97-Vaccinia-Virus
Es wurde eine Insertion der codierenden Region von p97 vorgenommen, indem p97a mit Hindlll verschnitten wurde, die Enden in stumpfe Enden übergeführt wurden und in den Vaccinia-Insertionsvektor pGS-20 (Mackett et al., 1984, J. Viral. 49: 857-864) eingefügt wurde, welcher an der Smal-Stelle geöffnet war. Der pGS-20-Vektor verwendet den 7,5 K-Promotor und enthält flankierende Sequenzen des Vaccinia-Thymidin-Kinase (TK)-Gens. Ein rekombinanter Virus wurde nach dem Verfahren von Macket et al, suora, gebildet und Vp97a-NY wurde isoliert, welches bewirkt, dass infiszierte Zellen p97-Protein der korrekten Grösse exprimieren und glycosilieren (Figur 8). Die Oberflächen-Expression von p97 wurde ebenfalls in Zellen bestätigt, welche mit dem nachstehenden rekombinanten p97-Virus infisziert wurden (Tabelle I).
Tabelle I
p97-Oberf!ächen-Expression an transferierten Mäusezellen und Zellen, welche mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus1 infisziert wurden
Zelltyp Verwendeter Virus Exprimierte p97-Moleküle/Zelle
Zellinfektion
M2SVp97a.A
keine
3 210 000
M2svp97a.E/F2
keine
434 000
M2-Stamm keine
2 000-
BSC
keine
5590
BSC
Vwt-NY-Vaccinia
5220
BSC
Vp97a-NY-Vaccinia
1 140 000
1 Die Zellen wurden kurz trypsinisiert, gewaschen und in aliquoten Anteilen in Röhrchen gegeben, welche 103 bis 104 oder 105 Zellen enthielten. Nicht-exprimierende Trägerzellen wurden in die Röhrchen mit der niedrigeren Zellzahl gegeben, damit insgesamt 105 Zellen pro Röhrchen vorhanden waren. 1 x 106 cpm jodierter monoclonaler Antikörper 96,5 (123 ng) wurde inkubiert, in einem Gesamtvolumen von 50 jil, mit den Zellen während 60 Min. auf Eis. Die Zellen wurden gewaschen und viermal in PBS +10% fötalem Kälberserum herumgewirbelt und dann resuspendiert und in einem Micromedic 4/600-pIus y-Zähler ge-zählt (-) bedeutet weniger als.
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Das rekombinante p97-Vaccinia-Virus ist in Mäusen immununoaen
Die Inokulation von Mäusen mit Vp97a-NY bildete eine stark humorale Antikörper-Reaktion. Die Mäuse wurden einmal immunisiert und einmal nach 4 Wochen nachbehandelt, und nach 5 Wochen wurde das Blut entnommen. Die Titers wurden ELISA bestimmt, wobei Antigen-beschichtete Platten und ein Protein A, welches mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, als Nachweis-Reagenz eingesetzt wurde. Die Daten wurden in monoclonale Antikörper-Äquivalente umgewandelt, indem mit einer Standard-Kurve für die gebildete ELISA-Bindung unter Verwendung von Antip97-monoclonalen Antikörpern 133.2 verglichen wurde. Die Resultate zeigten eine starke Induktion von Serum-Antikörpern (Figur 9). Unter Verwendung eines in vitro-ProliferationsTests mit gereinigtem p97-Protein als Stimulations-Antigen (Tabelle II) wurde celluläre Immunität nachgewiesen.
Tabelle II
Proliferations-Versuch von Mäusemilz-Zellen1
Stimulierendes Antigen Proliferativer. Index von vp97-re- Proliferativer Index kombinanten Immun-Milzzellen von Kontrollmilzzellen
Con A
(10ng/ml) 71 50
p97-Protein
(3 ng/ml)
27
2
(10|ig/ml)
43
2
(20 ng/ml)
56
2
(50 ng/ml)
44
3
UV-lnaktiviertes Vaccinia-Virus (107 pfu/ml)
91
2
p97-Transfizierte bestrahlte syngenetische
86
2
Tumor-Zellen (104)
Ursprüngliche bestrahlte Tumor-Zellen (104)
3
1
1 Es wurden Milzzellen aus Mäusen isoliert, die durch Schwanz-Skarifikation mit 107 pfu Vp97a-NY-re-kombinantem Virus inokuliert wurden und 1 Monat später mit der gleichen Menge nachbehandelt und eine Woche später getötet wurden. Native Milzzellen wurden zur Kontrolle des Versuches verwendet. 105 Zellen wurden pro Loch in 96-Loch-Rundbodenplatten in 0,22 ml RPMI, welchem 0,5% normales Mäuseserum, Penicillin/Streptomycin, Glutamin, Bicarbonat und 2,5 x 105 M2-Mercaptoethanol zugesetzt wurden, kultiviert. Die Kulturen wurden während 6 Std. am Tag stoss-markiert mit 25 (iCi/Loch zerriebenem Thymidin (New Englang Nuclear), mit einem PHD-Zellemter geerntet und unter Verwendung von Opti-fluor in einem Beckman LS 3801-Zähler gezählt. Die Proliferations-Indices wurden berechnet, indem der Mittelwert der Impulszahl pro Minute der vierfachen Löcher, die mit jedem Antigen stimuliert werden, durch den Mittelwert der Impulszahl pro Minute der Kontrolle dividiert wird (Medium).
Die Resultate, welche in Tabelle II dargestellt sind, zeigen, dass die T-Zellen als Reaktion auf das p97-Protein-Antigen proliferieren.
Zur Vergewisserung, ob Hilfszellen ebenfalls durch die rekombinanten Viren in Milzzellen von immunisierten Mäusen stimuliert werden, wurden die Zellen in vitro stimuliert und die Überstände zur Herstellung von lnterleukin-2 (IL-2), einem Hilfs-T-Zellfaktor getestet. Die Milzzellen wurden von Mäusen kultiviert, welche vorher zweimal mit dem rekombianten Vp97aNY-Vaccinia oder dem ursprünglichen Vaccinia immunisiert wurden. Es wurden 105 Zellen während 48 Std. in 0,2 ml Medium, das identisch war, mit demjenigen, welches für die Proliferationsversuche verwendet wurde, in 96-Loch-Rundbodenplatten in Gegenwart oder Abwesenheit des Stimulations-Antigen inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, von vier Löchern gepoolt und vor dem lL-2-Test gefroren. Der IL-2-Test verwendet 104 vorher an IL-2 verarmte Mäuse-T-Zellinien-CTLL-Zellen, wobei jedes Loch mit verschiedenen Verdünnungen des zu testenden Überstandes mit der dreifachen Menge Click-Medium angesetzt wurde. Es wurde eine Standard-Kurve mit rekombinantem IL-2 aufgenommen, welches von Genentech, CA, erhalten wurde. Die CTLL-Zellen wurden mit Thymidin gemäss den üblichen Proliferationstest-Techniken in den letzten 6 Std. der 24stündigen Inokubation stoss-markiert, dann geerntet und gezählt, wie dies in den Proliferations-test-Verfahren beschrieben ist. Die Resultate, die in Tabelle III dargestellt sind, zeigen, dass die IL-2-Produktion auf Milzzellen von Mäusen, die mit dem rekombinanten p97-Vaccinia-Virus immunisiert worden sind, in vitro durch p97 stimuliert wird.
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Tabelle IH
Stimulierung der IL-2-Produköon durch p97-immune Milzzeilen
impfstoff-lmmunogen
In vitro-Stimulus
Hergestelltes IL-2,
Einheiten
Vp97a-NY
p97-Protein (20 (ig/ml)
4,4
Vp97a-NY
Medium
0,25
Vwt-NY
p97-Protein (20 (ig/ml)
0,25
Vwt-NY
Medium
0,25
Tabelle IV
Zusätzlich wurde eine verzögerte Hypersensitivitäts-Reaktion gemessen, wobei der Fussballen-Schwelltest bei mit Vp97aNY-inokulierten Mäusen verwendet wurde. Fünf Mäuse (C3H/Hen-Stamm) pro Gruppe wurden durch Schwanz-Skarifikation mit einem rekombinanten oder parentalen Vaccinia-Vi-rus-Stamm inokuliert.
6 Tage später wurden die Hinterpfoten jeder Maus durch Inokulation von 20 ixl PBS oder 20 jxl Zellen in PBS (5 x 105 Zellen pro Maus) herausgefordert. Die Fussballen wurden 24 Std. später mit einer Dop-pelblind-Probe gemessen, wobei ein Fowler-Mikrometer eingesetzt wurde. Die Dicke der Fussballen der PBS-injizierten Pfoten wurde der gemessenen Dicke des experimentell behandelten Fussefe jeder Maus abgezogen und bedeutet, dass ebenso die Standard-Abweichungen der Zunahme der Fussballen-Schwellung berechnet wurden. Die Resultate sind in der Tabelle IV dargestellt und zeigen die Induktion einer p97-spezifischen verzögerten Hypersensitivitäts-Antwort bei Mäusen, welche mit dem rekombinanten p97-Vaccinia-Virus immunisiert wurden.
Tabelle IV
Antigen-spezifische Fussballen-Schwellung bei p97-immunen Mäusen
Impfstoff Herausfordemdes Antigen Fussballen-Schwellung
Immunogen (mmx 10~2)
Vp97a-NY
p97-transfizierte syngenetische Tumorzellen
40,3 (+/-6,8)
Vp97a-NY
ursprüngliche syngenetische Tumorzellen
3,0 (+/—2,8)
Vwt-NY
p97-transfizierte syngenetische Tumorzeilen
1,5 (+/— 2,3)
Vwt-NY
ursprüngliche syngenetische Tumorzellen
5,5 (+7-5,0)
Schutz und Theraoie mit D97-Vaccinia-Impfstoff bei einem Mäusetumor-Modell
Um die Impfwirksamkeit festzulegen, wurden Mäuse nach verschiedenen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemässen rekombinanten p97-Vaccinia-Virus geimpft und dann mit einer p97-trans-fizierten syngenetischen Tumorzelle (M2SVp97a.2E) herausgefordert. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit Vp97a-NY rekombinantem lebendem Vaccinia-Virus oder dem ursprünglichen Stamm (Vwt-NY) durch Schwanz-Skarifikation immunisiert; oder mit 100 ng gereinigtem p97-Protein oder mit 5 x 106 bestrahlten M2-K1735 Tumorzellen intraperitoneal in vollständigem Freund-Adjuvanz immunisiert. Eine intravenöse Tumorzeli-Herausforderung wurde 2 Wochen nach der letzten Impfung durch Injektion von M2SVp97a.2E, einem metastatischen Tumorclon, welches aus M2-K1735 (einem Mäusemelanom-Modell) durch Transfektion mit der humanen p97-codierenden Sequenz, welche in einem Expressions-Plasmid enthalten ist, das durch den frühen SV-40-Promotor getrieben wird. Es wurde eine Sorte von Expres-sions-Clonen ausgewählt und diejenige, welche für eine Tumor-Herausforderung verwendet wurde, das Clon M2SVp97a.2E exprimiert eine mittlere Stufe von p97, etwa 400 000 Moleküle pro Zelle oder ein Äquivalent zur humanen Melanom p97-Antigendichte. Zwei Dosen zur intravenösen Tumor-Herausforderung wurden verwendet, 5 x 105 oder 1 x 105 Zellen, welche in die Schwanzvene von syngenetischen C3H/Hen-Mäusen injiziert wurde. Die Mäuse wurden 16 Tage nach der Tumor-Herausforderung geschlachtet und die Lungen wurden entfernt. Eine Maus wurde als positiv bewertet, wenn von blossem Auge Tumore auf der Lunge sichtbar waren, welche mit Tusche gefärbt waren. Die Resultate sind in der Tabelle V dargestellt.
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Tabelle V
Herausforderung von geimpften Mäusen mit syngenetischen p97-transfizierten Melanomzellen Vaccine Anzahl Herausforderung Anzahl Mäuse mit offen-
Immunisierungen Zelldosis sichtlicher Lungen-Meta stase
Vp97a-NY
2
5 x 105
1/5
Vp97a-NY
1
5x10s
2/4
Bestrahlte syngenetische
2
5 x 105
0/4
Melanomzellen
Vwt-NY
2
5x10®
9/10
p97-Protein
2
5 X105
3/3
Vp97a-NY
2
1 x105
0/1
Vp97a-NY
1
1 x105
0/4
unbefangen
0
1 x105
5/6
Die in der Tabelle V präsentierten Resultate zeigen, dass mit zwei Immunisierungen mit Vp97a-NY ein beträchtlicher protektiver Effekt vorhanden ist, obschon mit dem gereinigten p97-Protein-lmpfstoff kein protektiver Effekt festgestellt werden konnte (trotz des extrem hohen hervorgerufenen Antikörper-Titers). Die Fähigkeit des rekombinanten Virus, eine celluläre Immunität hervorzurufen, kann für ihre protektive Tumor-Immunität verantwortlich sein.
In einem Therapie-Experiment wurden Mäuse mit einer niederen Dosis von p97-exprimierenden Tumorzellen inokuliert und 2 Tage später mit dem rekombinanten Vaccinia-Impfstoff inokuliert. Die Mäuse wurden mit 105 oder 10* p97-exprimierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E) intravenös herausgefordert. 2 Tage später wurden die Mäuse durch Schwanz-Skarifikation entweder mit Vp97a-NY oder mit Vwt-NY inokuliert. Die wöchentlichen Inokulationen durch Schwanz-Skarifikation wurden wiederholt und die überlebenden Mäuse aufgezeichnet. Das Resultat ist in Figur 10 dargestellt und zeigt den therapeutischen Effekt der rekombinanten p97-Vaccinia-Virus-lmpfung in Mäusen mit vorhandener Lungen-Metastase.
Der rekombinante p97-Vaccinia-Virus ist bei Macaauenaffen immunogen
Zwei Macaca fasicularis (Macaquen) Affen wurden entweder mit 2 x 108 plaquenbildenden Einheiten (pfu) oder mit Vp97a-NY recombinanter Vaccinia oder mit der gleichen Dosis des ursprünglichen Vacci-nia-Stammes skarifiziert. 2 Wochen später wurden die Seren durch ELISA auf Titer von Vaccinia und p97 getestet. Die Resultate sind in Tabelle VI dargestellt und zeigen, dass die humoralen Antikörper gegen p97 2 Wochen nach einer einzigen Inokulation mit Vp97a-NY nachweisbar waren.
Tabelle VI
Serum-Antikörper-Trter in Vaccinia-inokulierten Affen
Immunogen/Woche Anti-Vaccinia-Titer (Serumver- Arrti-p97-Trter (ng/ml monoclonale dünnung mit dopp. Hintergrund) Antikörper-Äquivalente)
Vp97a-NY/Woche 0
1/20
0,54
Vp97a-NY/Woche 2
1/2000
6,54
Vwt-NY/Woche 0
1/20
0,50
Vwt-NY/Woche 2
1/2000
0,34
Hinterlegung von Mikroorganismen
Der folgende E. coli-Stamm. welcher das angeführte Plasmid trägt, wurde am 27.12.1985 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852-US, hinterlegt und trägt die folgende Hinterlegungsnummer:
E. coli-Stämme
Plasmid
Hinteriegungs-Nr.
E. coli HB101
p97b
53 403
25
5
10
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20
25
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Der folgende rekombinante Vaccinia-Virus wurde beim ATCC, Rockvilie, MD, am 6.1.1987 hinterlegt und erhielt die folgende Hinterlegungsnummer:
Virus
Hinterlegungs-Nr.
Vp97a-NY
VR 2159
Die folgenden Zellinien tragen die aufgelisteten Plasmide und wurden ebenfalls bei der ATCC, Rock-ville, MD, hinterlegt und erhielten folgende Hinterlegungsnummern:
Zell-Linie
Plasmid
Hinterlegungs-Nr.
hinterlegt am
TKMp97-12 (Mäusezellen)
PMTp97b
CRL 8985
27.12.1985
B16SVp97a.14
pSVp97a
CRL 9304
6.1.1987
(Mäusemelanomzellen)
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen und Zellen eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform einzig der Erläuterung eines Aspektes der vorliegenden Erfindung dient und sämtliche Mirkoorganismen oder Zellen, welche funktionell äquivalent sind unter die vorliegende Erfindung fallen. In der Tat sind verschiedene Änderungen der Erfindung möglich, zusätzlich zu denjenigen, welche hier gezeigt und beschrieben sind, was für den Fachmann naheliegend ist. Solche Änderungen gehören ebenfalls zu der Erfindung, welche in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist.
Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass alle Basenpaar-Grössen, welche für die Nukleotide angegeben wurden, approximative Werte darstellen und nur zum Zweck der Beschreibung angegeben wurden.

Claims (11)

Patentansprüche
1. Ein im wesentlichen reines antigenisches Peptid oder Protein mit den antigenen Eigenschaften des dem Melanom p97 zugeordneten Antigens, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäss Rgur 3 oder einen antigenischen Teil davon umfasst.
2. Rekombinantes Virus, dadurch gekennzeichnet, dass sein Genom eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein antigenisches Peptid oder Protein gemäss Anspruch 1 codiert.
3. Rekombinantes Virus gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es das Vaccinia-Virus Vp97a-NY mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. VR 2159 darstellt.
4. Untereinheitsimpfstoff-Formulierung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Immunogen eine wirksame Dosis eines Peptides oder Proteins gemäss Anspruch 1 enthält in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger.
5. Impfstoff-Formulierung mit inaktiviertem Virus, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wirksame Dosis eines rekombinanten Virus gemäss Anspruch 2 oder 3 in nicht-infektiösem Zustand in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger enthält.
6. Impfstoff-Zubereitung mit lebendem Virus, dadurch gekennzeichnet, dass sie das lebende Virus gemäss Anspruch 2 oder 3 in einer unschädlichen Dosis enthält.
7. Rekombinanter DNA-Vektor zur Herstellung eines Peptides oder Proteins gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er p97b, hinterlegt in E. coli unter der ATCC-Nr. 53403, pMTp97b, wobei p97b in E. coli unter der ATCC-Nr. 53403 hinterlegt ist oder pSV2p97a mit der Restriktionskarte gemäss Rg. 6 umfasst.
8. Bacterium Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass es den rekombinanten DNA-Vektor gemäss Anspruch 7, der p97b umfasst, enthält, mit der Hinteriegungsnummer ATCC 53403.
9. Zellinien, dadurch gekennzeichnet, dass sie den rekombinanten DNA-Vektor pMTp97b oder pSV2p97a gemäss Anspruch 7 enthalten.
10. Zellinie gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie TKMp97-12 oder B16SVp97a.14 darstellt und die Hinterlegungsnummer CRL 8985 bzw. CRL 9304 aufweist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Peptides oder Proteins mit den antigenischen Eigenschaften des dem Melanom p97 zugeordneten Antigens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz von p97 gemäss Fig. 3 in einen Vektor insertiert wird und mit diesem Vektor Wirtszellen transformiert werden und das Peptid oder Protein aus den gezüchteten Zeilen gewonnen wird, welche das Peptid oder Protein exprimieren.
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CH471/87A 1986-02-07 1987-02-09 Melanoma-associated antigen peptide(s) CH675424A5 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82731386A 1986-02-07 1986-02-07
US07/007,230 US5262177A (en) 1986-02-07 1987-01-27 Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen

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Publication Number Publication Date
CH675424A5 true CH675424A5 (en) 1990-09-28

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DE19821925A1 (de) * 1998-05-15 1999-11-18 Roehnisch Tim Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Induktion einer tumorspezifischen Immunantwort, sowie Verwendung der Zusammensetzung zur Behandlung von Neoplasien
JP4414023B2 (ja) * 1999-08-05 2010-02-10 オリエンタル酵母工業株式会社 関節炎関連メラノトランスフェリンの測定方法および試薬
JP4708027B2 (ja) * 2002-10-01 2011-06-22 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 抗癌組成物および抗感染疾患組成物ならびにこれらを使用する方法
US8207314B2 (en) * 2003-05-16 2012-06-26 Sanofi Pasteur Limited Tumor antigens for prevention and/or treatment of cancer

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