FI94836C - Menetelmä melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenisen sukulaispeptidin tai -proteiinin valmistamiseksi, sekä siinä käyttökelpoiset yhdistelmävirukset, yhdistelmävektorit ja isäntäsolut - Google Patents

Description

1 94836

Menetelmä melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenisen sukulaispeptidin tai -proteiinin valmistamiseksi, sekä siinä käyttökelpoiset yhdistelmävirukset, yhdistelmävekto-rit ja isäntäsolut 5 1. Keksinnön ala

Keksintö koskee menetelmää sellaisen antigeenisen peptidin tai proteiinin valmistamiseksi, joka on melanoomaan liittyvän p97-antigeenin sukulaispeptidi tai -pro-10 teiini. Keksintö koskee myös menetelmää sellaisen yhdis-telmäviruksen valmistamiseksi, joka ohjaa melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenisen sukulaispeptidin tai -proteiinin ekspressiota yhdistelmäviruksella infektoidus-sa bakteeri- tai eläinsolussa. Lisäksi keksintö koskee em.

15 peptidin tai proteiinin valmistuksessa käyttökelpoisia yhdistelmävektoreita ja isäntäsoluja.

Keksinnön mukaisesti siis melanoomaan liittyvän antigeenin sukulaispeptidiä tai -proteiinia tuotetaan suuria määriä yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Keksinnön mukai-20 sesti saatavaa peptidiä tai proteiinia voidaan käyttää immunogeeninä rokoteformulaatiossa. Tietyissä suoritusmuodoissa, joissa yhdistelmävirus ekspressoi melanoomaan liittyvän antigeenin sukulaispeptidi tai -proteiinia, itse yhdistelmävirusta voidaan käyttää immunogeeninä rokotefor-25 mulaatiossa.

Keksintöä valaistaan esimerkillä, jossa immunogee-neinä käytetään peptidejä, jotka läheisesti liittyvät p97-antigeeniin, monomeeriseen solun pinnan sialoglykoproteii-niin, jonka näennäinen molekyylipaino on hieman alle 97000 30 daltöniä ja joka on melanoomasolujen solupinnan komponent ti.

2. Keksinnön tausta 2.1 Kasvaimeen liittyvät antigeenit

Koe-elämillä, erityisesti jyrsijöillä, tehty työ on 35 osoittanut, että useimmat onkogeenisten virusten aiheutta- 2 94836 mat kasvaimet ekspressoivat virusgenomin koodittamia antigeenejä ja että immunisointi näillä antigeeneillä saattaa johtaa hylkimisreaktioon altistettaessa tämän jälkeen samalla viruksella indusoiduilla kasvainsoluilla. Vaikka 5 suuri osa tästä työstä on tehty laboratorioviruskannoilla, kuten SV40-viruksella, polyooma-viruksella, sekä hiiren Friend-, Moloney- tai Rauscher-leukemiaviruksilla, luonnossa esiintyvien onkogeenisten virusten horisontaalinen ja vertikaalinen siirto on osoitettu; itse asiassa kaupal-io linen rokote viruksen aiheuttamaa kissan leukemiaa ja sar-koomaa vastaan on nyt saatavilla.

Useimpien ihmisen syöpien virusetiologiaa ei kuitenkaan ole osoitettu. Tärkeitä poikkeuksia ovat hepatiittivirus (maksakasvain), herpes simplex -virus (kohdunkau-15 lan syöpä) ja Epstein-Barr -virus (nenä-nielu -syöpä). Kuluneiden kahden vuosikymmenen aikana on kuitenkin osoitettu, että joissakin ihmisen kasvansoluissa esiintyy kas-vainantigeeneja, tämä tarkoittaa antigeenejä, jotka erottavat kasvainsolut normaaleista soluista; joillakin poti-20 lailla esiintyy soluvälitteisiä tai humoraalisia immuunivasteita näitä antigeenejä vastaa (Hellström et. ai., Nature 220 (1968) 1352, Morton et ai., Science 162 (1968) 1279-1281, Shiku et ai., J. Exp. Med. 144 (1976), 873- 881). Jotkut näiden immuunivasteiden kohdeantigeenit ovat 25 ihmisgenomin koodittamia onkofetaali- tai erilaistumisan-tigeeneja (Hellström et ai., Int. J. Cancer 6 (1970) 346-351) .

Viime aikoihin asti kasvainantigeenien molekulaa-rista luonnetta ei ole tunnettu eikä immunologisten reak-30 tioiden kasvainspesifisyyden aste ole ollut selvä. Yrityk-• set käyttää hyväksi näitä tietoja kehitettäessä syövän diagnostisia määritysmenetelmiä tai syövän hoitomenetelmiä ovat suurimmaksi osaksi epäonnistuneet. Koska spontaanit kasvaimen regressiot ovat äärimmäisen harvinaisia, voidaan 35 myös tehdä se johtopäätös, että in vitro osoitetut immuu- 3 94836 nivasteet eivät vaikuttaneet in vivo: esimerkiksi vaikka syöpäpotilaan vasta-aineet ja lymfosyytit saattavat tehokkaasti tappaa kasvainsoluja in vitro, saman syöpäpotilaan immuunivaste ei ole tehokas in vivo.

5 Köhlerin ja Milsteinin (Nature 256 (1975) 495-497) monoklonaalisia vasta-aineita käyttävien menetelmien julkaiseminen johti lisääntyneeseen ihmisen kasvainantigee-nien etsintään, sillä menetelmät antoivat käyttöön keinon määrittää näitä antigeenejä sekä molekulaarisella tasolla 10 että niiden spesifisyyden suhteen (Hellström ja Brown kirjassa "The Antigens" (1979), toim. M. Sela, Academic Press, Voi. V, ss. 166). Useiden viime vuosien aikana on kuvattu suuri joukko kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joista useimmat on määritetty hiiren monoklonaalisia vas-15 ta-aineita käyttäen. Reisfeld ja Sell, toim., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss,

Inc., New York, 1985, ss. 1-609. Vaikka käytännöllisesti katsoen kaikki hyvin karakterisoidut antigeenit ovat 20 osoittautuneet onkofetaali- tai erilaistumisantigeeneiksi ja niiden kasvainspesifisyyden on havaittu olevan pikemminkin kvantitatiivinen kuin kvalitatiivinen, useat antigeenit ovat tarpeeksi spesifisiä kasvainsoluille verrattuna normaaleihin soluihin (yleensä 10-1000-kertaa spesifi-25 sempiä), jotta niitä voidaan käyttää mahdollisina kohdeso-luina identifioitaessa kasvainsoluja sekä hoidossa. On myös onnistuttu saamaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita kasvainantigeeneille (Cote et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. 80 (1983) 2026-2030). Tämä tukee aikaisemmin mainit-30 tua näyttöä siitä, että joillakin syöpäpotilailla syntyy immuunireaktioita kasvaimiaan vastaan.

Yli puolet tähän mennessä identifioiduista kasvaimeen liittyvistä solun pinta-antigeeneista on ihmisgenomin (pikemminkin kuin endogeenisten tai eksogeenisten virus-35 ten) koodittamia proteiineja tai glykoproteiineja jäljelle « 94836 jääneiden ollessa glykolipidejä, jotka syntyvät glyosyyli-transferaasien epänormaalista ekspressiosta tai säätelystä.

2.2 Melanoomaan liittyvä p97-antigeeni 5 p97-antigeeni on kasvaimeen liittyvä antigeeni, joka identifioitiin ihmisen melanoomakasvaimesta vasta monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen (Brown et ai., J.

Biol. Chem. 255 (1980) 4980-4983, Dippold et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 6114-6118, Woodbury et ai., 10 Proc. Natl. Acad. Sei USA 77 (1980) 2183-2187). p97-anti-geenin esiintymistä normaaleissa kudoksissa ja kasvainkudoksissa on tutkittu perusteellisesti ja sitä esiintyykin useimmissa ihmisen melanoomakasvaimissa ja tietyissä sikiöperäisissä kudoksissa, mutta vain hyvin pieniä määriä 15 normaaleissa aikuisen ihmisen kudoksissa (Brown et ai., J. Immunol. 127 (1981) 539-546, Brown et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 78 (1981) 539-543, Garriques et ai., Int.

J. Cancer 29 (1982) 511-515). p97-antigeenia on käytetty kohdeantigeenina melanoomien diagnostisessa kuvantamisessa 20 kliinisissä ihmiskokeissa (Larson et ai., J. Clin. Invest.

72 (1983) 2101-2114).

p97 on monomeerinen solun pinnan sialoglykoproteii-ni, jonka näennäinen molekyylipaino (MP) mitattuna nat-riumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesin 25 (SDS-PAGE) avulla on hieman alle 97 000 daltonia. Monoklo-naalisten vasta-aineiden avulla on määritetty kolme tärkeää antigeenistä kohtaa, jotka ovat läsnä pysyvässä, trypsiinihajotuksella saadussa 40 000 daltonin fragmentissa (Brown et ai., J. Immunol. 127 (1981) 539546); p95:n 30 täydellistä sekvenssiä ei kuitenkaan ole vielä raportoitu. Ainakin kaksi muuta itsenäisesti karakterisoitua ihmisen melanoomaan liittyvää antigeeniä, nimittäin gp95 (Dippold et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 6114-6118) ja gp87 (Khosravi et ai., Int. J. Cancer 35 (1985) 73-80) 35 vaikuttavat identtisiltä p97:n kanssa sekventiaalisen im-munosaostusanalyysin perusteella.

s 94836 p97:n N-terminaalinen aminohappojärjestys on homologinen transferriinin kanssa ja kuten transferriini p97 sitoo rautaa (Brown et ai., Nature (Lontoo) 296 (1982) 171-173). Somaattisten solujen hybridien analyysi ja in 5 situ -hybridisaatio on osoittanut, että p97-geeni transferriini- ja transferriinireseptorigeenin tavoin sijaitsee kromosomaalisella alueella 3q21-3q29 (Plowman et ai., Nature (Lontoo) 303 (1983) 70-72, Yang et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 81 (1984) 2752-2756). Nämä havainnot viit-10 taavat siihen, että p97:llä on osuus rautaaineenvaihdun-nassa.

2.3 Syöpärokotteet

Koe-eläimillä, tavallisesti hiirillä, tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että immunisointi elävillä tai 15 tapetuilla syöpäsoluilla saattaa johtaa hylkimisreaktioon altistettaessa immunisoinnin jälkeen elävillä syöpäsoluilla. Immunisointiyritykset soluja sisältämättömällä materiaalilla eivät yleensä ole onnistuneet yhtä hyvin, vaikka joitakin onnistuneita kokeita on raportoitu. (Yleiskatsaus 20 löytyy julkaisusta Hellström ja Brown, kirjassa The Antigens, toim. M. Sela, Academic Press, Voi. V. (1979)0 ss.

1-66). Monissa tapauksissa suojavaikutuksen aiheuttavat kohdeantigeenit ovat olleet virusten koodittamia, mutta monissa muissa tapauksissa suojaavan immuunivasteen nos-* 25 tattavan antigeenin luonnetta ei tunneta.

Ihmisellä tehtävät tutkimukset ovat paljon vaikeampia ja syöpärokotteiden tehokkuudesta kiistellään huolimatta muutamista onnistumista kuvaavista raporteista. Monissa tapauksissa rokotevalmisteet ovat sisältäneet sätei-30 lytettyjä kasvainsoluja tai kasvainsoluja, jotka on tapettu altistamalla ne tietyille kemiallisilla aineille. Koska puhtaita ihmisen kasvaimeen liittyviä antigeenejä ei ole saatavissa, raportteja niiden käytöstä rokotteissa ei ole.

Tärkeä teoreettinen vastaväite syöpärokotteiden 35 ehdotetulle käytölle ihmisillä on se, että ihmiset, jotka 6 54836 on "rokotettu" esimerkiksi tapetuilla syöpäsoluilla tai soluja sisältämättömillä valmisteilla, eivät kehitä immuunivastetta, koska immuunivasteen kohdeantigeenina mahdollisesti olevia kasvainantigeeneja esiintyy, vaikkakin hy-5 vin pieniä määriä, joissakin normaaleissa soluissa ja siten immuunisysteemi tunnistaa ne "omaksi". Useimpia, ellei kaikkia, monoklonaalisten vasta-aineiden avulla osoitettuja ihmisen kasvaimissa esiintyviä kasvaimeen liittyviä antigeenejä esiintyy myös joissakin normaaleissa kudoksissa 10 ja on vähän todisteita siitä, että syöpäpotilaat vastaavat niihin tehokkaasti in vivo. On näyttöä siitä, että estäjä-soluilla on tärkeä osuus kasvainantigeeneja vastaan kohdistuvan immuunivasteen torjuntasäätelyssä (down-regulating) (Nepom et ai., Experientia 39 (1983) 235-242). Li-15 säksi yhden kasvainantigeenien ryhmän aikaansaama estäjä-soluvaste saattaa estää toista, yksinään suppressiota aiheuttamatonta kasvainantigeenien ryhmää vastaan kohdistuvan tehokkaan kasvainta tuhoavan vasteen indusoitumisen (Hellström et ai. kirjassa Biomembranes, A. Nowotny, toim.

20 Plenum Press. (1983) ss. 365-388).

2.4 Yhdistelmä-DNA-menetelmät ja rokotevirus Yhdistelmä-DNA-menetelmien käyttö tuotettaessa eristetyistä komponenteista valmistettuja rokotteita tulehduksilta suojelemiseksi käsittää isäntäeläimessä kysei-* 25 siä proteiineja vastaan immunovasteen nostattavia proteii neja koodittavan geneettisen tiedon molekulaarisen kloonauksen ja ekspression sopivassa vektorissa. Äskettäin on kuvattu uusi lähestymistapa, jota mahdollisesti voidaan käyttää tuotettaessa erillisistä komponenteista valmistet-30 tuja rokotteita (Mackett et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 79 (1982) 7415-7419, Mackett et ai., J. Virol. 49 (1984) 857-864, Panicali, D. ja Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sei.

79 (1982) 4927-4931). Tässä lähestymistavassa rokotevirusta käytetään vektorina sen genomiin lisättyjen vieraiden 35 geenien ekspressoimiseksi. Kun yhdistelmärokotevirus vie- il ·Μ · iilk hi t St i 7 94836 dään isäntäeläimiin, se ekspressoi lisätyn vieraan geenin ja siten nostattaa isännän immuunivasteen tällaisia geeni-tuotteita vastaan. Koska elävää yhdistelmärokotevirusta voidaan käyttää rokotteena, tässä lähestymistavassa yhdis-5 tyvät sekä erillisistä komponenteista valmistettujen rokotteiden että eläviä viruksia sisältävien rokotteiden edut.

Rokotevirus sisältää lineaarisen, kaksisäikeisen DNA-genomin, jonka pituus on noin 187 kiloemäsparia, ja se 10 replikoituu infektoitujen solujen sytoplasmassa. Nämä virukset sisältävät sen infektiivisyydelle tarpeellisen, täydellisen transkriptionaalisten entsyymien systeemin (mukaanlukien "cap,,-pään muodostavat sekä metyyli- ja po-lyadenyyliryhmiä lisäävät entsyymit) viruksen ytimessä.

15 Rokoteviruksen transkriptionaaliset säätelysekvenssit (promoottorit) sallivat rokoteperäisen RNA-polymeraasin, mutta eivät isäntäsolun RNA-polymeraasin, transkription aloittamisen.

Vieraan DNA:n ekspressointi yhdistelmärokoteviruk-20 sissa edellyttää rokoteperäisten promoottorien liittämistä vieraan geenin proteiinia koodittaviin DNA-sekvensseihin. Plasmidivektoreita, joita kutsutaan myös liitäntävekto-reiksi, on muodostettu kimeeristen geenien lisäämiseksi rokotevirukseen. Eräs liitäntävektorityyppi muodostuu: (a) 25 rokoteviruspromoottorista mukaanlukien transkription aloi tuskohta, (b) useista ainoalaatuisista restriktioendonuk-leaasin kloonauspaikoista, jotka sijaitsevat transkription aloituskohdasta lukien alaspäin, vieraiden DNA-fragment-tien lisäämistä varten, (c) kimeerisen geenin lisäystä 30 virusgenomin homologiselle, ei-välttämättömälle alueelle ohjaavia promoottori- ja kloonauskohtia reunustavasta, ei-välttämättömästä rokotevirus-DNA:sta (kuten TK-geeni), ja (d) bakteeriperäisestä replikaatiomerkistä (marker) ja antibioottiresistenssimerkistä E. colissa tapahtuvaa rep-35 likointia ja valikointia varten. Mackett (Mackett et ai., s 54836 J. Virol. 49 (1984) 857-864) kuvaa esimerkkejä tällaisista vektoreista.

Yhdistelmärokotevirukset tuotetaan transf ektoimalla vieraan geenin sisältävät, bakteeriperäiset yhdistelmälii-5 täntäplasmidit rokoteviruksella aikaisemmin infektoituihin soluihin. Tapahtuu homologinen yhdistyminen infektoituihin soluihin, mikä johtaa vieraan geenin lisäämiseen viruksen genomiin. Infektoituneet solut voidaan seuloa yhdistelmä-virusten suhteen immunologisia menetelmiä, DNA-plakkihyb-10 ridisaatiota tai geneettistä valikointia käyttäen, minkä jälkeen ne voidaan eristää. Nämä rokoterekombinantit säilyttävät välttämättömät funktionsa ja infektiivisyytensä ja ne voidaan muodostaa sellaisiksi että ne sisältävät noin 35 kiloemäsparia vierasta DNA:ta.

15 Vieraan geenin ekspressoituminen voidaan todeta entsymaattisilla tai immunologisilla määritysmenetelmillä (esimerkiksi immunosaostuksella, radioimmunologisella määritysmenetelmällä tai immunoblotting-menetelmällä). Yhdistelmärokotteella infektoiduissa soluissa tuotetut, luon-20 nonmukaiset kalvon glykoproteiinit ovat glykosyloituja ja ne voidaan kuljettaa solun pinnalle. Käyttämällä vahvoja promoottoreita tai kloonaamalla saman geenin useita kopioita voidaan saadaan runsas ekspressoituminen.

3. Keksinnön yhteenveto 25 Tässä julkaisussa kuvataan rokoteformulaatioita, joita voidaan käyttää indusoimaan sellainen immuunivaste, joka valikoivasti tuhoaa melanoomasoluja rokotetuissa yksilöissä. Rokoteformulaatiot sisältävät immunogeenin, joka aiheuttaa immuunivasteen melanoomaan liittyvää antigeeniä, 30 kuten melanoomaan liittyvää p97-antigeenia, vastaan. Useat rokoteformulaatiot ovat mahdollisia. Esimerkiksi "eristetyistä" komponenteista valmistetun rokotteen immunogeeni on p97:n sukulaispeptidi tai -proteiini ja se voidaan formuloida sopivalla adjuvantilla. Tällaiset peptidit tai 35 proteiinit sisältävät aminohapposekvenssejä, jotka ovat 9 94836 peräisin oleellisesti kuviossa 3 kuvatusta p97:n aminohapposekvenssistä kokonaisuudessaan tai osasta sitä. Tästä lähtien tämän keksinnön mukaisesti valmistettaviin pepti-deihin tai proteiineihin, jotka läheisesti liittyvät mela-5 noomaan liittyvään p97-antigeeniin, olivatpa ne muutettuja, muuttamattomia, modifioituja tai modifioimattomia, tullaan viittaamaan "p97:n sukulaispeptideinä". Kun p97:n sukulaispeptidi on hapteeni (tämä tarkoittaa, antigeeninen muttei immunogeeninen), hapteeni voi olla konjugoitu kan-10 tajamolekyyliin, joka tekee sen immunogeeniseksi.

p97:n sukulaispeptidejä voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-menetelmillä ja/tai kemiallisesti syntetisoimalla. Kun p97:n sukulaispeptidit syntetisoidaan kemiallisesti, tällaiset synteettiset p97:n sukulaispeptidit voivat sisältää 15 sellaisia aminohapposekvenssejä, jotka ovat peräisin p97:n otaksuttavasti antigeenisiltä alueilta, (Hopp ja Woods,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 3824-3828). Kun p97:n sukulaispeptidit tuotetaan tämän keksinnön mukaisesti yh-distelmä-DNA-menetelmiä käyttäen, nukleotidisekvenssi, 20 joka koodittaa p97:ää kokonaan tai sen osaa, lisätään yh-distelmäekspressiovektoriin, kuten virukseen tai plasmi-diin, joka sopivassa isännässä voi ohjata p97:n sukulais-peptidin ekspressiota, joka peptidi voidaan puhdistaa vil-jelyväliaineesta. Lisätty nukleotidisekvenssi on peräisin 25 oleellisesti kuviossa 3 kuvatusta koko p97:n sekvenssistä tai sen osasta. Kun käytetään plasmidi-ekspressiovektoria, eukaryoottisoluissa tapahtuvaan ekspressointiin soveltuva vektori on edullinen, mutta myös prokaryoottista ekspres-siovektori voidaan käyttää.

30 Toisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, jossa ekspressiovektori on yhdistelmävirus, rokote voidaan formuloida virusrokotteena, jolloin immunogeeni on yhdistelmävirus, joka ekspressoi p97:n sukulaispeptidiä. Immu-nogeeninä käytetyn yhdistelmäviruksen luonteesta riippuen 35 voidaan formuloida joko inaktivoitu virusrokote tai eläviä ίο 94836 viruksia sisältävä rokote. Asianmukainen immunisointi ro-koteforraulaatioilla saattaa johtaa immuunivasteen indusoi-tumiseen, mikä puolestaan johtaa melanooroasolujen tuhoutumiseen immunisoidussa henkilössä.

5 Tässä julkaisussa kuvataan myös systeemi, jossa ro- koteformulaatio voidaan testata, ja esitetään pääpiirteittäin kuinka testaus tulisi suorittaa. Esimerkiksi rokote-formulaatioiden teho voidaan määrittää eläinmalleissa, aluksi jyrsijöissä, sitten apinoissa ja lopuksi ihmisissä, 10 edullisesti potilaissa, joiden sairaus on remissiovaihees-sa, mutta sairauden uusiutumisen todennäköisyys on suuri mikroetäispesäkkeistä johtuen.

4. Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää SDS-PAGE:n avulla erotettujen, p97-15 mRNA:n soluja sisältämättömien translaatiotuotteiden auto-radiogrammia. Kuviossa IA kaista 1 esittää p97:n rikastetun mRNA:n translaatiotuotteita, kun taas kaista 2 esittää rikastamattoman mRNA:n translaatiotuotteita, jotka molemmat on saatu 0,5 Ml:sta kaikkiaan 5 ng:n mRNA:ta translaa-20 tiotuotteita. Kuviossa IB kaista 1 esittää p97:n rikastetun mRNA:n translaatiotuotteita, kun taas kaista 2 esittää rikastamattoman mRNA:n translaatiotuotteita, jotka molemmat on saatu 5 Ml:sta anti-p97seerumilla immunosaostettuja 5 ng:n mRNA:ta translaatiotuotteita.

25 Kuvio 2 esittää diagrammin muodossa p97-mRNA:n ra kennetta. Koodittavan alueen (signaalisekvenssistä ankku-risekvenssiin) ja koodittamattoman alueen (3'UT) järjestys samoin kuin p97:n esiasteen (avoin pylväs) toistetun alueen rakenne on merkitty. Eri restriktioentsyymien tun-30 nistussekvenssit on merkitty mRNA:n yläpuolelle. Neljän cDNA-kloonin suhteelliset asemat on merkitty mRNA-raken-teen alapuolelle. cDNA-klooni p97-3a2fl (3a2fl) eristettiin cDNA-kirjastoa, jossa cDNA:t oli kopioitu oligo(T)-sekvenssillä aloitetuista p97:n rikastetuista mRNA:ista ja 35 kloonattu pBR322:ssa; kun taas cDNA-kloonit p97-2fl (2fl), U 94836 p97-ljl (ljl) ja p97-10al (lOal) eristettiin aloittamalla cDNA-synteesi oligonukleotideilla, jotka koodattavat p97:n eksonisekvenssejä ja kloonamalla saadut cDNA-fragmentit lambda-gtlO:een. Kuvio 2A esittää diagrammin muodossa ge-5 nomisia klooneja B15, H17, B6.6 ja E7.7, jotka kloonattiin lambda-L47.l:ssä.

Kuvio 3 esittää ihmisen p97:n esiasteen cDNA:n nuk-leotidisekvenssiä ja siitä johdettua aminohapposekvenssiä. Aiemmin proteiinin sekvensoinnin avulla määritetyt N-ter-10 minaaliset aminohappotähteet olivat identtisiä nukleotidi-sekvenssin perusteella ennustettujen tähteiden kanssa (aminohappotähteet nrot 21-30). Mahdolliset glykosylaatio-kohdat aminohappotähteissä 38, 135 ja 515 (avoin pylväs) ja kalvoon kiinnittymisalue C-päässä (täytetty pylväs) on 15 merkitty. Yksi polyadenylaatiosignaali (kehystetty AATAAA) todettiin asemassa 3847, joka sijaitsee 50 emäsparia poly-adenyloidusta alueesta lukien ylöspäin.

Kuvio 4 esittää p97:n esiasteen ennustettujen aminohapposekvenssien ja ihmisen serotransferriinin aminohap-20 posekvenssin (Yang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 2752-2756, Davis et ai., J. Mol. Biol. 181 (1985) 111-121) vertailua. Säilyneet tähteet on kehystetty. Transferriinin raudan sitomiseen sisältyvät tyrosiini-, histidiini- ja arginiinitähteet (Metz-Boutique et ai., 25 Eur. J. Biochem. 145 (1984) 659-676) on merkitty tähdillä (*) ·

Kuvio 5 esittää diagrammin muodossa p97:n rakenteen kaksiuloitteista mallia, joka perustuu transferriinin suurperheen jäsenten kesken säilyneiden kysteiinitähteiden 30 läsnäoloon. Kolme mahdollista glykosylaatiokohtaa on merkitty tähdillä (*). Hydrofobisen kalvoon kiinnittymisalue näkyy p97:n C-päässä (COOH).

Kuvio 6 esittää diagrammin muodossa seuraavia geneettisiä rakenteita: p97:n cDNA-kloonien ja p97:n eks-35 pressiovektorin muodostamisessa käytetyn genomisen kloonin i2 S4836 lambda E7.7. fragmentin rakennetta ja pSV2p97a. ekspres-siovektorin rakennetta. Seuraavia lyhenteitä käytetään: E,

EcoRI: P, PvuII; Sai, Sali: S, SstI: B, BamHI.

Kuvio 7 esittää geelielektroforeesin tulokset yh-5 distelmä-p97-proteiinin karakterisoinnissa ja immunologisessa puhdistuksessa. Transfektoitu CHO-klooni (CH03+) ja ihmisen melanooma SK-MEL 28 -solut leimattiin 35S-kysteii-nillä tunikamysiinin (TM) läsnäollessa (+TM) tai ilman sitä (-TM) . Solut siirrostettiin 10 mm2:n levyille ja nii-10 den annettiin kasvaa lähes yhtenäiseksi solumassaksi. Väliaine poistettiin ja korvattiin 3 ml:11a kysteiiniä sisältämätöntä väliainetta, johon joko oli tai ei ollut lisätty 1 /zg/ml tunikamysiiniä. Kun seosta oli inkuboitu 3 0 minuuttia 37 °C:ssa, siihen lisättiin 250 /uCI/ml L-35S-kys-15 teiiniä (1016 Ci/mmol, New England Nuclear) vielä 6 tunnin ajan. Solujen talteenotto, solulysaattien valmistus, immu-nosaostus ja SDS-PAGE tehtiin kuten yllä on kuvattu. Uutteet saostettiin immunologisesti p97:lle spesifisillä vasta-aineilla ja proteiinit analysoitiin SDS-polyakryyliami-20 digeelielektroforeesia (SDS-PAGE) käyttäen, (a) Coomassie

Blue -värillä värjätty SDS-polyakryyliamidigeeli. Kaista 1, merkkiproteiinit; kaista 2, transfektoiduista hiiren B16-soluista immunosaostettu p97; kaista 3, SK-MEL 28 -solut +TM; kaista 4, SK-MEL 28 - solut -TM; kaista 5, CH03+ 25 -solut +TM, kaista 6, CH03+ -solut -TM. (b) saman geelin kuin kohdassa (a) autoradiogrammi.

Kuvio 8 esittää transfektoiduissa soluissa tai Bp97a-NY:llä infektoiduissa soluissa ekspressoidun p97:n radioimmunosaostusta. BSC-soluja infektoitiin yli yön vil-30 lityyppisellä rokoteviruksella tai p97-yhdistelmärokotevi- ruksella. Näitä viruksia tai transfektoitua solulinjaa CHO-p97. A inkuboitiin 35S:llä leimatun metioniinin ja kys-teiinin kanssa joko 2 μg/ml tunikamysiinin (Sigma) kanssa tai ilman sitä. Solut hajotettiin kuuden tunnin kuluttua, 35 saostettiin monoklonaalisella vastaaineella 96.5 ja ero- i3 94836 tettiin elektroforeettisesti 10 % polyakryyliamidigeelis-sä. Geelin autoradiografia suoritettiin yli yön. Tunikamy-siinillä käsitelty ryhmä on oikeanpuolimmainen jokaisessa ryhmässä.

5 Kuvio 9 kuvaa seerumin vasta-ainetiittereitä hii rissä, jotka oli immunisoitu p97-rokotteilla. Tp97 esittää viiden hiiren ryhmää, joka immunisoitiin 5 x 106 säteily-tetyllä M2svp97a.A-solulla (transfektoidut kasvainsolut, jotka ekspressoivat pinta-p97-antigeeniä) Complete 10 Freund's adjuvant -adjuvantissa, ja jotka saivat booster-annoksena saman määrän soluja fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. p97 on viiden hiiren ryhmä, joka immunisoitiin 100 Mg:11a puhdistettua p97-pro-teiinia Complete Freund's adjuvant -adjuvantissa ja jonka 15 saama booster-annos sisälsi 50 pq proteiinin vesipitoista liuosta. Vp97 on viiden hiiren, ryhmä, joka sekä immunisoitiin 107 plakkia muodostavalla yksiköllä Vp97a-NY:tä että sai samansuuruisen booster-annoksen hännänkatkaisume-netelmää käyttäen.

20 Kuvio 10 kuvaa rokotuksen yhdistelmä-p97-rokotevi- ruksella (Vp97a-NY) hoitovaikutusta kasvaimella altistetuissa hiirissä. Hiiret altistettiin 105 tai 104 p97:ää ekspressoivalla kasvainsolulla (M2SVp97a.E) suonensisäisesti. Kahden päivän kuluttua hiiret rokotettiin hännän-25 katkaisumenetelraällä joko Bp97a-NY:llä tai Vwt-NY:llä. Viikottaiset rokotukset hännänkatkaisu-menetelmällä toistettiin ja hiirien eloonjäänti merkittiin ylös.

5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Keksintö koskee menetelmää sellaisen antigeenisen 30 peptidin tai proteiinin valmistamiseksi, joka on melanoomaan liittyvän p97-antigeenin sukulaispeptidi tai -proteiini ja jolla on kuviossa 3 esitetyn aminohapporyhmien 20-738 muodostama aminohapposekvenssi. Keksinnön mukaiselle mentelmälle on tunnusomaista, että viljellään bakteeri-35 tai eläinsolu, joka sisältää antigeenistä peptidiä tai i4 54336 proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin toisen geenieks-pressiota säätelevän nukleotidisekvenssin kontrollin alaisena siten, että viljelty bakteeri- tai eläinsolu ekspres-soi mainitun peptidin tai proteiinin, ja antigeeninen pep-5 tidi tai proteiini otetaan talteen viljelmästä.

Keksintö liitty melanoomien estämiseen tai hoitoon tarkoitettujen rokotteiden tuottamiseen. Se perustuu havaintoon, että melanoomat sisältävät kasvaimeen liittyviä solun pinta-antigeeneja, kuten p97-antigeeni, joita esiin-10 tyy melanoomasoluissa suurempia määriä kuin normaaleissa kudoksissa. Tämän keksinnön mukaisesti tuotetaan melanoomaan liittyvän p97-antigeenin sukulaispeptidejä tai -proteiineja (tämä tarkoittaa p97:n sukulaispeptidejä) yhdis-telmä-DNA-menetelmiä käyttäen. Tämän keksinnön mukaisesti 15 p97:n sukulaispeptidit sisältävät aminohapposekvenssejä, jotka ovat peräisin joko oleellisesti kuviossa 3 esitetystä kokonaisesta p97:n aminohapposekvenssistä tai osasta sitä. Näihin luetaan kuviossa 3 esitetyistä sekvensseistä johdetut aminohapposekvenssit, jotka on muutettu substi-20 tuoimalla yksi tai useampia sekvenssin aminohappotähteitä toisella polaarisuudeltaan samanlaisella aminohapolla, joka on toiminnallisesti vastaava aminohappo ja johtaa siten ei-vaikuttavaan muutokseen. Sekvenssinsisäisen aminohapon korvaavat aminohapot voidaan valita muista sen ' 25 luokan jäsenistä, johon aminohappo kuuluu. Poolittomia (hydrofobisia) aminohappoja ovat esimerkiksi alaniini, leusiini, isoleusiini, väliini, proliini, fenyylialaniini, tryptofaani ja metioniini. Poolisia, neutraaleja aminohappoja ovat glysiini, seriini, treoniini, kysteiini, tyro-30 siini, asparagiini ja glutamiini. Positiivisesti varattuja (emäksisiä) aminohappoja ovat arginiini, lysiini ja histi-diini. Negatiivisesti varattuja (happamia) aminohappoja ovat asparagiinihappo ja glutamiinihappo. Lisäksi tämän keksinnön mukaisesti saatavat p97:n sukulaispeptidit, oli-35 vatpa ne muutettuja aminohappotähdesubstituutioilla tai i5 S4836 eivät, voidaan edelleen modifioida tai prosessoida glyko-syloimalla, fosforyloimalla jne., tai kemiallisilla modifikaatioilla. Näitä p97:n sukulaispeptidejä voidaan käyttää immunogeeneinä rokoteformulaatioissa, jotka nostatta-5 vat immuunivasteen rokotetussa potilaassa olevia melanoo-masoluja vastaan.

Tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti käytetään yhdistelmä-DNA -menetelmiä p97-antigeeniä koodattavien nukleotidisekvenssien lisäämiseksi ekspressio-10 vektoreihin, jotka ohjaavat p97:n sukulaispeptidien ekspressiota sopivissa isäntäsoluissa. p97-antigeeniä koodit-tavat nukleotidisekvenssit sisältävät nukleotidisekvensse-jä, jotka ovat peräisin kokonaisesta oleellisesti kuviossa 3 esitetystä p97-nukleotidisekvenssistä tai osasta sitä.

15 Aminohappojen DNA-koodin degeneraatiosta johtuen (tämä tarkoittaa, että useimpia aminohappoja voi koodittaa useampi kuin yksi kodoni), toiminnallisesti vastaavat ko-donit (tämä tarkoittaa erilaiset kodonit, jotka kooditta-vat samaa aminohappoa tai sen kanssa toiminnallisesti sa-20 manarvoista aminohappoa) voidaan korvata kuviossa 3 esitetyssä p97:n sekvenssissä sillä ehdolla, että substituutio johtaa ei-vaikuttavaan muutokseen. Ekspressiovektori-isän-täsolusysteemejä, jotka sisältävät kokonaista p97-antigee-nia tai sen osaa koodittavan nukleotidisekvenssin, voidaan 25 käyttää tuotettaessa suuria määriä puhtaita p97:n sukulaispeptidejä in vitro, jolloin geenituotteet voidaan puhdistaa viljelmäsoluista ja niitä voidaan käyttää immunogeeneinä eristetyistä komponenteista valmistetuissa rokoteformulaatioissa. p97:n sukulaispeptidit voidaan puhdis-30 taa käyttämällä lukuisia biokemiallisia menetelmiä mukaanlukien immunoaffiniteettipuhdistus monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen. Lisäksi p97:n sukulaispeptidien puhdistusta voidaan helpottaa modifioimalla DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat p97:n sukulaispeptidejä, siten, että 35 sekvenssit, jotka vastaavat proteiinin kiinnittämisestä i6 94836 plasmamembraaniin, poistetaan poistamatta kuitenkaan niitä sekvenssejä, jotka vastaavat proteiinin kuljetuksesta solukalvolle, jolloin isäntäsolu erittää tylpistetyn antigeenisen molekyylin viljelyväliaineeseen. Siinä tapaukses-5 sa, että p97:n sukuliaspeptidit tuotetaan prokaryoottisis-sa soluissa, sopivien translaationjälkeisten modifikaatioiden puuttuminen saattaa johtaa antigeenisesti inaktiiviseen tuotteeseen, joka on ehkä aktivoitava sopivia kemiallisia tai muita käsittelyjä käyttäen.

10 Tietyissä suoritusmuodoissa, joissa ekspressiovek- tori on virus, itse virus voidaan formuloida rokotteeksi. Tällaisissa tapauksissa voidaan valmistaa inaktivoituja yhdistelmävirusrokotteita. Kun ekspressiovektori muodostuu infektoivasta yhdistelmäviruksesta, joka ei aiheuta sai-15 rautta isännässä, voidaan valmistaa joko inaktivoitu virusrokote tai eläviä viruksia sisältävä rokote, joka antaa oleellisen immuniteetin. Erityisen käyttökelpoinen ekspressiovektori tähän tarkoitukseen on yhdistelmärokotevi-rus, joka ekspressoi p97:n sukulaispeptidejä. Tällöin nuk-20 leotidisekvenssi, joka koodittaa kokonaista p97-antigeeniä tai osaa siitä, voidaan lisätä rokotevirusvektoriin, joka pystyy ohjaamaan sekvenssin ekspressiota sopivassa isännässä. Keksintö sisältää muiden virusekspressiovektoreiden käytön rokotteina, tarkemmin sanottuna adenovirusten käy-: 25 tön rokotteina.

Keksintö koskee siten myös mentelmää yhdistelmävi-ruksen valmistamiseksi, joka virus ohjaa melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenisen sukulaispeptidin tai -proteiinin ekspressiota yhdistelmäviruksella infektoidus-30 sa bakteeri- tai eläinsolussa. Tälle keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (a) bakteeri- tai eläinsolu infektoidaan yhdistelmäviruksella, jonka genomi sisältää melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenistä sukulaispeptidiä tai -proteiinia 35 koodaavaan nukleotidisekvenssin, jolla on kuviossa 3 esi- i7 94836 tetty nukleotidisekvenssi, ja joka on toisen geeniekspres-siota säätelevän nukleotidisekvenssin kontrollin alaisena, ja (b) yhdistelmävirusta tuotetaan saattamalla infektoitu so-5 lu lisääntymään.

Keksinnön mukaisesti saatua p97:n johdettua aminohapposekvenssiä voidaan myös tutkia sellaisten sekvenssien löytämiseksi, joiden ominaisuudet, erityisesti hydrofiili-syys, ennustavat kyseisen sekvenssin läsnäolon proteiini-10 molekyylin pinnalla ja sen mahdollisen antigeenisyyden ja/ tai immunogeenisyyden. Nämä p97:n sukulaispeptidit voivat olla kemiallisesti syntetisoituja ja niitä voidaan käyttää immunogeeneinä rokoteformulaatiossa.

p97:n sukulaispeptidejä voidaan käyttää myös muissa 15 tarkoituksissa kuin rokotetuotannossa. p97:n sukulaispep- tidiä voidaan käyttää eläinten immunisointiin mielenkiinnon kohteena olevia melanoomasoluja vastaan muodostetun spesifisen antiseerumin tai spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi. Näitä voidaan käyttää kompo-20 nenttina diagnostisessa määritysmenetelmässä tai puhdis tettaessa affiniteettikromatografisesti radioaktiivisella isotoopilla merkityllä lääkeaineella tai toksiinilla leimattuja vasta-aineita, joita tullaan käyttämään syövän hoidossa.

: 25 Keksintöä valaistaan esimerkeillä, joissa kuvataan ihmisen melanoomaa vastaan kehitetyn, p97-antigeeniin perustuvan rokotteen muodostaminen. Tässä kuvatut menetelmät ja koostumukset eivät kuitenkaan rajoitu p97:ää käyttävien rokotteiden mudoostamiseen, vaan niitä voidaan soveltaa 30 myös muihin kasvaimeen liittyviin antigeeneihin.

Keksintö esitetään seuraavalla tavalla yksinomaan kuvauksen selventämiseksi: (a) p97:n nukleotidi- ja ami nohapposekvenssi, (b) kemiallisesti syntetisoidut p97:n sukulaispeptidit, (c) ekspressiovektori-isäntä-systeemeis-35 sä tuotetut p97:n sukulaispeptidit, (d) p97:n sukulaispep- ie 94836 tidien immunologinen karakterisointi; ja (e) rokotteiden formulointi.

5.1 Melanoomaan liittyvän p97-antigeenin sekvenssin määritys 5 p97-antigeenia koodittavan geenin nukleotidisek- venssi ja siitä johdettu aminohapposekvenssi on kuvattu kuviossa 3. Toiminnallisesti vastaavat sekvenssit kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Näihin kuuluvat, mutteivät rajoitu niihin, nukleotidisekvenssit, jotka sisältävät kuviossa 10 3 esitetyn nukleotidisekvenssin kokonaan tai osia siitä ja jotka on muunnettu substituoimalla eri kodoneilla, jotka koodattavat samaa tai toiminnallisesti vastaavaa aminohappotähdettä, jolloin syntyy ei-vaikuttava muutos, samoin kuin aminohapposekvenssit, jotka sisältävät kuviossa 3 15 esitetyn aminohapposekvenssin kokonaan tai osia siitä ja jotka on muunnettu substituoimalla toiminnallisesti vastaavilta aminohappotähteiltä sekvenssin sisällä siten, että syntyy ei-vaikuttava muutos, ja niiden esimerkiksi glykosyloimalla, fosforyloimalla jne modifioidut tai pro-20 sessoidut tai muilla kemiallisilla tavoilla modifioidut johdannaiset.

Allaolevat kappaleet kuvaavat strategiaa, jotka käytettiin kuviossa 3 esitetyn p97:n sekvenssin määrityksessä, samoin kuin myös vaihtoehtoisia menetelmiä, joita 25 voitaisiin käyttää p97:n tai muiden rokoteformulaatioissa käyttökelpoisten kasvainantigeenien sekvenssin määrittämisessä.

5.1.1 Melanoomaan liittyvän p97-antigeenin identifiointi ja karakterisointi 30 Melanoomaan liittyvän p97-antigeenin aktiivisuutta ja aminohapposekvenssiä ei tunneta, minkä johdosta p97-an-tigeenin identifiointi suoritettiin käyttämällä p97:ää vastaan mudoostettua monoklonaalista vasta-ainetta. Useita menetelmiä voidaan käyttää p97:lle spesifisten monoklonaa-35 listen vasta-aineiden tuottamisessa. Esimerkiksi Köhlerin i9 94836 ja Milsteinin (Nature 250 (1975) 495-497) kehittämää hyb-ridoomatekniikkaa voidaan käyttää seuraavasti: hiiriä tai rottia immunisoidaan ihmisen melanoomasoluilla ja immunisoiduista eläimistä talteenotetut lymfosyytit fuusioidaan 5 myeloomasolujen kanssa, vaihtoehtoisesti melanoomapotilai-den lymfosyytit voidaan fuusioida myeloomasolujen kanssa (Cote et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 80 (1983) 2026, Has-pel et ai., Cancer Res. 45 (1985) 3951) tai monoklonaalis-ten vasta-aineiden tuottamismenetelmää, jossa käytetään 10 Epstein-Barr -virusta, (Cole et ai., The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, kirjassa Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.

Liss. Inc. (1985) ss. 77-96) voidaan käyttää p97:ää vastaan muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden tuot-15 tamiseksi. Jokaisessa tapauksessa saadut hybridoomat seulotaan sellaisten vasta-aineiden tuottamiseksi, jotka sitoutuvat melanoomasoluihin mutta jotka eivät sitoudu normaaleihin soluihin.

Ylläkuvattuja p97:ää vastaan muodostettuja monoklo-20 naalisia vasta-aineita voidaan käyttää lukuisilla tavoilla helpottamaan niiden nukleotidisekvenssin identifiointia, karakterisointia, kloonausta ja ekspressointia, joiden avulla voidaan tuottaa p97-antigeenin sukulaispeptidejä ja -proteiineja suuria määriä. Monoklonaalisia vasta-aineita « 25 voidaan käyttää esimerkiksi p97-antigeenin karakterisoimi-seksi edelleen leimaamalla radioaktiivisella isotoopilla kaikki kasvainsolun tuottamat proteiinit, saostamalla im-munologisesti kasvainproteiini monoklonaalisella vasta-aineella ja fraktioimalla immunologisesti saostetut proteii-30 nit geelielektroforeesin avulla. Proteiiniantigeenit identifioidaan selvästi erottuvina nauhoina saadussa autora-diogrammissa (Brown et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 4980-3983). Edelleen p97:ää vastaan muodostettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää helpottamaan kloo-35 nausta seuraavalla tavalla: (a) polysomien immunologisessa 20 94836 puhdistuksessa melanoomasolussa olevien, p97-antigeenia koodittavien mRNA-transkriptien identifioimiseksi ja tal-teenottamiseksi, (b) p97-antigeenin sukulaispeptidejä tai -proteiineja ekspressoivien kloonien identifioimiseksi 5 cDNA-kirjastosta, (c) p97-antigeenin puhdistamiseksi, jot ta voitaisiin valmistaa uusia monoklonaalisia vasta-aineita, tai antiseerumia käytettäväksi edeltävissä kahdessa sovellutuksessa, tai (d) sellaisten solujen identifioimiseksi, joihin p97-antigeenin geeni on viety transfektoi-10 maila.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös helpottamaan p97-antigeenin rakenteellista ja immunokemi-allista karakterisointia, kuten molekyylin ekstrasellulaa-risten ja antigeenisten alueiden identifioimiseksi ja mo-15 lekyylin puhdistamiseksi aminohapposekvenssin analysointia varten (Brown et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 539-543, Brown et ai., Nature, Lontoo, 296 (1982) 171- 173) .

Karakterisoitaessa p97:ää edelleen määritetään sen 20 sijainti solussa ja kartoitetaan antigeeniset determinan tit ja funktionaaliset alueet. Solunsisäinen sijainti voidaan määrittää immunofluoresenssimikroskopian avulla ja solun fraktiointikokeilla. Solun pinnalla olevia antigeenejä, kuten p97:ää, pidetään edullisina rokotteen muodos-25 tamisessa, vaikka solunsisäisiä antigeenejä voidaan myös käyttää. Jos saatavilla on useita monoklonaalisia vasta-aineita, antigeeniset determinantit voidaan kartoittaa kompetiitiokokeilla, joissa kukin vasta-aine leimataan radioaktiivisella isotoopilla ja testataan determinantista 30 kilpailun suhteen jokaisen muun vasta-aineen kanssa. Molekyylin alueet voidaan identifioida käyttämällä rajoitettua proteaasihajotusta ja sen jälkeistä SDS-PAGEa. Kaikkien näiden tietojen avulla pitäisi molekyylin immunogeenisim-mät alueet voida identifioida. Jos monoklonaaliset vasta-35 aineet on saatu immunisoimalla ehjillä soluilla, nämä mo- 21 94836 lekyylin alueet ovat mitä todennäköisimmin ekstrasellulaa-risia ja käyttökelpoisia rokotteen muodostamisessa.

Aminohapposekvenssin analysointi sallii proteiinin yksiselitteisen identifioinnin ja proteiinin vertaamisen 5 muihin proteiineihin (Brown et ai., Nature, Lontoo, 296 (1982) 171-173). Jos proteiini sisältää useampia kuin 50 aminohappotähdettä, saattaa olla mahdollista määrittää vain osa aminohapposekvenssistä, useimmiten N-pään aminohapposekvenssi. Aminohapposekvenssointia varten proteiini-10 antigeeni voidaan puhdistaa solulysaateista immunoaffini-teettikromatografisesti monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen, jonka jälkeen ajetaan preparatiivinen SDS-PAGE. Sitten puhdistetun proteiinin N-terminaalinen aminohappo-sekvenssi määritetään automaattista aminohapposekvenaatto-15 ria, edullisesti kaasufaasilaitetta, käyttäen suurimman herkkyyden saamiseksi.

5.1.2 Melanoomaan liittyvää p97-antigeenia koodit-tavan DNA:n identifiointi, kloonaus ja sekvensointi

Ensimmäiset kloonaustutkimukset keskittyivät ylei-20 siin proteiineihin, kuten globiiniin ja ovalbumiiniin, joiden mRNA usein käsitti 10-50 %:a kokonais-mRNA:sta.

Nämä mRNA:t voitiin puhdistaa homogeenisiksi fraktioimalla koon perusteella ja puhtaita cDNA-koettimia käytettiin muutamia satoja klooneja käsittävien kirjastojen seulomi-25 seen pesäkehybridisaatiota käyttäen. Proteiineille, joiden mRNA sisältää 1-10 %:a kokonais-mRNA:sta, voidaan käyttää differentiaalihybridisaatiota kahta cCNA-koetinta käyttäen, jossa menetelmässä toinen cDNA-koetin sisältää mielenkiinnon kohteena olevan sekvenssin ja toinen on nega-30 tiivinen kontrolli. Proteiineja, joita esiintyy pieniä määriä, kuten kasvaimeen liittyviä antigeenejä, kooditta-via lähettiRNA:itä, jotka saattavat muodostaa vain 0,01 % solun mRNA:sta, on paljon vaikeampi kloonata, koska seulottavia klooneja on kymmeniä tuhansia eivätkä cDNA-koet-35 timet anna spesifistä hybridisaatiosignaalia. Molempia 22 9 4 8 3 6 ongelmia voidaan pienentää rikastamalla mielenkiinnon kohteena olevan sekvenssin mRNA.

Alla kuvataan useita ihmisen melanoomaan liittyvää p97-antigeenia koodittavan DNA:n kloonaamiseksi käytettyjä 5 tapoja. Saadut kloonit analysoitiin sellaisen kloonin tai kloonien identifioimiseksi, jotka sisälsivät kokonaisen p97:ää koodittavan alueen. Näin identifioidut kloonien p97-nukleotidi-insertit voidaan sitten sekvensoida millä tahansa alalla tunnetulla tavalla. Alla kuvataan yksityis-10 kohtaisemmin näitä eri lähestymistapoja.

(a) mRNA:n eristäminen polysomin immunologisen puhdistuksen avulla Tässä menetelmässä polysomit (jotka sisältävät mRNA:ta, ribosomeja ja muodostuvia polypeptidiketjuja) 15 puhdistetaan immunoaffiniteettikromatografisesti käyttäen vasta-aineita, jotka tunnistavat muodostuvissa ketjuissa olevia antigeenisiä determinantteja. Monissa tapaukissa ehjillä soluilla tai solu-uutteilla immunisoimalla saadut monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat antigeenit niiden 20 natiiveissa konformaatioissa, mutta saattaa olla, etteivät ne sovellu polysomien immunologiseen puhdistukseen, sillä on hyvin mahdollista, ettei tunnistettuja antigeenisiä determinantteja esiinny muodostuvissa ketjuissa. Koska translaatio alkaa polypeptidin N-päästä, C-päätä lähellä 25 olevat epitoopit todennäköisesti puuttuvat suurimmasta osasta muodostuvia ketjuja. Tämä ongelma vältetään käyttämällä joko N-terminaalisia epitooppeja tunnistavia vasta-aineita tai valmistamalla polysomit soluista, jotka on käsitelty terminaation estävällä proteiinisynteesin inhi-30 biittorilla.

Suuremman ongelman muodostaa se, että kypsät proteiinit eroavat muodostuvista ketjuista translaationjäl-keisten modifikaatioiden takia. Tämä ongelma on erityisen suuri solun pintaproteiineille, jotka modifioituvat täy-35 dellisemmin signaalipeptidien poistamisen, hiilihydraatti- 23 94836 sivuketjujen lisäämisen ja disulfidisiltojen muodostumisen kautta. Jos käytetään polyklonaalista antiseerumia polyso-mien immunologiseen puhdistukseen, antigeenisyyserot muodostuvien ketjujen ja kypsän proteiinin välillä saattavat 5 olla seurauksiltaan vähäisiä, sillä immunisoinnin aikana kani tai muu eläin altistetaan paitsi natiiville proteiinille myös osittain tai täydellisesti denaturoituneille muodoille erityisesti silloin, jos käytetään Freud'in ad-juvanttia. Vaikka nämä vasta-aineet edustavat vain pientä 10 osaa vasta-ainepopulaatiosta, niitä saattaa olla läsnä tarpeeksi muodostuvien ketjujen sitomiseksi. Valitettavasti on erittäin vaikeaa valmistaa polyklonaalinen antiseerumi proteiineille, joita esiintyy pieniä määriä. Vaikka monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää antigeenin 15 puhdistamiseen muita immunisointeja varten, yhdestä grammasta viljeltyjä soluja saadaan usein vain mikrogramma antigeeniä. Tämä määrä riittää immunisoitaessa useita hiiriä, mutta se hädintuskin riittää yhden kanin immunisoimi-seen.

20 Toinen ongelman ratkaisu on tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka tunnistaa muodostuvissa ketjuissa olevia antigeenisiä determinantteja, käyttämällä denaturoitua p97-antigeenia immunogeenina monoklonaalisen vastaaineen valmistamisessa. Tämän keksinnön esimerkissä käytettävissä 25 oli paneeli monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistivat kolme erillistä epitooppia p97-molekyylin N-terminaa-liselta, molekyylipainoltaan 40000 daltonia olevalta alueelta, ja erilaisen spesifisyyden omaavien monoklonaa-listen vasta-aineiden seosta käytettiin siinä toivossa, 30 että yksi tai useampi niistä sitoutuisi muodostuviin ket-juihin. Valitut vasta-aineet olivat erittäin p97-spesifi-siä siten, että niistä jokainen saosti immunologisesti p97:n yhtenä ainoana nauhana radioaktiivisella isotoopilla leimatusta kokonaisten solujen lysaatista, ja niiden si-35 toutumisaffiniteetit olivat suuret. Kloonausprojektiin 24 94836 valittiin kolme IgG2a-vasta-ainetta, joista yksi oli spesifinen kullekin kolmesta epitoopista. Yleisesti onnistumisen mahdollisuutta voidaan lisätä käyttämällä useita vasta-aineita erillisille epitoopeille.

5 Monoklonaalisia vasta-aineita käytettäessä jää jäl jelle kysymys, kuinka voidaan ennustaa, tunnistaako tietty monoklonaalinen vasta-aine tai vasta-aineiden yhdistelmä muodostuvat ketjut ja soveltuuko se siten polysomien immunologiseen puhdistukseen. Yksi tapa määrittää, saostaako 10 monoklonaalinen vasta-aine antigeenin, joka on kopioitu retikulosyyttilysaattisysteemissä, perustuen olettamukseen, että in vitro -translaatiotuote prosessoimattomana muistuttaa muodostuvia ketjuja. Vaihtoehtoinen lähestymistapa on edetä polysomien immunologisessa saostuksessa pie-15 nessä mittakaavassa ja sitten käyttää in vitro -translaatiota sen määrittämiseksi, onko mielenkiinnon kohteena oleva mRNA-laji rikastunut.

Polysomien immunologista puhdistusmenetelmää käytettäessä on tärkeää seurata puhdistusta mRNA-aktiivisuut-20 ta mittaamalla. Tämä voidaan tehdä kopioimalla mRNA reti-kulosyyttilysaattisysteemissä ja analysoimalla translaa-tiotuotteet SDS-PAGE:11a. Vaikka kasvaimeen liittyvä antigeeni saattaa olla liian pieni rikastumattoman mRNA:n translaatiotuotteiden komponentti erotettavaksi sadoista 25 yleisemmistä lajeista, se pitäisi voida todeta rikastetuista mRNA-näytteistä peräisin olevien translaatiotuotteiden joukosta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Xenopus-varhaismunasolusysteemiä, jos käytettävissä on herkkä immunologinen määritysmenetelmä kopioidun kasvaimeen liit-30 tyvän antigeenin toteamiseksi. p97:n kohdalla tähän tarkoitukseen käytettiin erittäin herkkää kaksoisdeterminant-ti-immunoanalyysi (DDIA) -määritysmenetelmää, jossa käytetään hyväksi p97:n kahdelle eri epitoopille spesifistä kahta monoklonaalista vasta-ainetta.

25 9 4 8 3 6

Sepharose-geeliin sidottua proteiini A:ta voidaan käyttää polysomien immunologiseen puhdistukseen. Proteiini A -adsorbentilla on kaksi sovellutusta tässä menetelmässä. Ensimmäinen sovellutus on käyttää sitä monoklonaalisten 5 vasta-aineiden puhdistamiseksi puhdistamattomista askites-nesteistä, jolloin poistetaan kontaminoiva ribonukleaasi-aktiivisuus. Sitten proteiini A -absorbenttia käytettiin puhdistettujen vasta-aineiden kanssa puhdistettaessa immu-nologisesti polysomeja, jotka kantavat spesifisiä muodos-10 tuvia ketjuja.

mRNA:n translaatio retikulosyyttilysaattisysteemis-sä sallii translaatiotuotteen biokemiallisen karakterisoinnin samoin kuin sen puhtauden määrittämisen.

(b) Oligonukleotidikoettimet 15 Toinen menetelmä, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisesti kasvaimeen liittyvää antigeeniä, kuten p97:ää, koodittavan cDNA:n kloonaukseen, on määrittää antigeenin osittainen tai koko aminohapposekvenssi ja syntetisoida aminohapposekvenssistä johdettuun nukleotidisekvenssiin 20 perustuva oligonukleotidikoetin. Sitten oligonukleotidia voidaan käyttää cDNA-synteesin alukkeena ja koettimena saadun cDNA-kirjaston seulomisessa. Niinpä melanoomaan liittyvä p97-proteiini voidaan helposti puhdistaa melanoo-masolujen lysaateista af f initeettikromatograf isesti spesi-' 25 fisiä monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen (Brown et ai.. Nature, Lontoo, 296, (1982) 171-173). Sitten syntetisoidaan osaa määritetystä aminohapposekvenssistä kooditta-va nukleotidisekvenssi, jota voidaan käyttää alukkeena ja/tai koettimena. Tähän tarkoitukseen sopivimpia ovat 30 yhden tai kahden kodonin koodittamia aminohappotähteitä sisältävät aminohapposekvenssin osat. Eräs tapa on syntetisoida pidempi, tyypillisesti 25-60 nukleotidia sisältävä sekvenssi, joka edustaa todennäköisintä koodittavaa sekvenssiä tunnettujen kodonin ihmisissä esiintymistiheyksien 35 perusteella arvioiden. Aminohapposekvenssin eri osiin pe- 26 9 4 8 3 6 rustuvien kahden synteettisen oligonukleotidin käyttö helpottaa seulontaa, sillä sen avulla väärät positiiviset hybridisaatiosignaalit voidaan identifioida. Lisäksi sellaisten hybridisaatio-olosuhteiden käyttö, jotka minimoi-5 vat GC-sisällön vaikutusta DNA-hybridin sulamispisteeseen, helpottaa myös seulontaa. Kun tällä menetelmällä on saatu yksi osittainen cDNA-klooni, sitä voidaan käyttää koettimena auttamaan täysipitkän cDNAkloonin saamista.

(c) cDNA-ekspressiokirjastot 10 On kehitetty kloonausvektoreita, jotka sallivat cDNA-insertin ekspressoimisen bakteereissa. Niinpä eräs lähestymistapa, jota voidaan käyttää kasvaimeen liittyvien proteiinien, kuten p97:n, cDNA-kloonien saamiseksi, on valmistaa cDNA-kirjasto yllä kuvatulla tavalla käänteis-15 kopioimalla melanoomasoluista eristetty mRNA (rikastettuna tai rikastamattomana) yllä kuvattuja oligo(T)-nukleotidi-alukkeita tai synteettisiä oligonukleotidialukkeita käyttäen ja seuloa tällainen kirjasto melanoomaan liittyvää p97-proteiinia vastaan muodostetun monoklonaalisen vasta-20 aineen avulla. Kloonit, jotka sisältävät monoklonaalisen vasta-aineen tunnistamia epitooppeja koodittavaa DNA:ta orientaatioltaan ja lukuvaiheistukseltaan oikeassa muodossa, ekspressoivat melanoomaan liittyvän p97-proteiinin sukulaispeptidejä tai -proteiineja ja ne voidaan identi- t 25 fioida siirtämällä kloonien ekspressoimat proteiinit nit-roselluloosasuodattimelle ja inkuboimalla suodatinta vasta-aineen kanssa, jonka jälkeen suodatin kehitetään leimatun anti-immunoglobuliinireagenssin kanssa.

Eräs mahdollinen ongelma on se, että monet monoklo-30 naaliset vasta-aineet eivät tunnista bakteerien ekspres-soimaa proteiinia, koska monissa tapauksissa insertti sisältää vain osan cDNA:sta eivätkä bakteerit prosessoi proteiineja eukaryoottisten solujen tapaan. Tämä ongelma on erityisen suuri kasvainsolun pintaproteiineilla, jotka on 35 modifioitu huomattavassa määrin signaalipeptidit poista- 27 94836 maila, hiilihydraattisivuketjuja lisäämällä ja disulfidi-siltoja muodostamalla. Siten saattaa olla tarpeellista muodostaa monoklonaalisia vasta-aineita, joiden tiedetään tunnistavan denaturoitunut antigeeni tai valmistaa poly-5 spesifinen antiseerumi puhdistamalla antigeenillä immuni soimalla.

Kun yhdistelmävirus tai -plasmidi, jonka uskotaan sisältävän melanoomaan liittyvästä p97-antigeenista peräisin olevan cDNA-insertin, on identifioitu, cDNA-inserttiä 10 voidaan käyttää muiden kirjastojen seulomiseen joko täysi-pitkien kloonien identifioimiseksi tai muuten sellaisen klooniryhmän identifioimiseksi, joka kattaa p97:ää koodit-tavan cDNA:n täyden pituuden. Kloonattu cDNA voidaan identifioida sekvenssianalyysin avulla ja vertaamalla johdet-15 tua N-terminaalista aminohapposekvenssiä aminohapposek venssiin, joka on määritetty analysoimalla p97-proteiinin aminohapposekvenssi suoraan.

(d) Genomin kloonaus

Seuraava menetelmä sallii DNA:n kloonauksen sel-20 laista monoklonaalista vasta-ainetta käyttäen, joka on muodostettu vain natiivissa proteiinissa esiintyvää antigeenistä determinanttia vastaan, jota determinanttia ei esiinny muodostuvissa ketjuissa eikä bakteereissa ekspres-soidussa proteiinissa. Tällöin ihmisen melanoomasolusta 25 peräisin oleva DNA viedään hiiren L-soluihin transfektion avulla. Tämän jälkeen melanoomaan liittyvää p97-antigeenia ekspressoivat hiiren solut eristetään joko fluoresenssiak-tivoitua solulajittelijaa käyttäen tai identifioimalla im-munologisesti pesäkkeet, jotka tuottava p97:n sukulaispep-30 tidejä, käyttämällä radioaktiivisella isotoopilla leimattuja, p97:ää vastaan muodostettuja monoklonaalisia vasta-aineita sukulaispeptidien toteamiseksi polyesterikangas-suodattimien päälle siirretyistä pesäkkeiden kopioista. Asiaankuulumattomien ihmisen DNA-sekvenssien poistamiseksi 35 saatetaan tarvita useita peräkkäisiä transfektiokierrok- 28 9 4 8 3 6 siä. Sitten genomikirjasto valmistetaan lambdafaagivekto-rissa ja seulotaan sellaisten kloonien suhteen, jotka sisältävät ihmisen toistuvia sekvenssejä, joita esiintyy useimpien geenien introneissa. Kun genominen klooni on 5 identifioitu, sitä voidaan käyttää hybridisaatiokoettimena p97:ää koodittavaa DNA:ta sisältävien cDNA-kloonien iden-tif ioimiseksi.

5.2 Melanoomaan liittyvän p97-antigeenin antigeenisten fragmenttien synteesi ja immunogeenisyyden määritys 10 Synteettisiä peptidejä voidaan käyttää immunogee- neina nostettaessa natiivia proteiinia vastaan immuunivaste, joka jossain määrin voi suojata lukuisia atogeeneja vastaan. Nämä aminohapposekvenssit valitaan proteiinianti-geenin tunnetusta aminohapposekvenssistä identifioimalla 15 ne aminohappojaksot, jotka todennäköisesti esiintyvät pro-teiinimolekyylin pinnalla ulkoiseen väliaineeseen päin kääntyneinä. Tämä suoritetaan tavallisimmin aminohapposekvenssin tietokoneanalyysin avulla käyttäen aminohappojen määritettyjä vesiliuoksessa käyttäytymisen parametreja 20 (hydropathy parameters). Lisäkriteerejä, kuten ennustettua sekundaarista rakennetta tai joustavuutta, voidaan myös käyttää.

Niinpä melanoomaan liittyvän p97-proteiinin 5-50 aminohappotähdettä sisältäviä synteettisiä peptidejä voi-: 25 daan testata niiden immunigeenisyyden koe-eläimissä (ta vallisesti hiirissä tai kaneissa) suhteen. Tällaisia synteettisiä peptidejä ovat, mutteivät rajoitu niihin, oleellisesti kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi kokonaan tai osittain mukaanlukien muunnellut sekvenssit, joissa 30 sekvenssin tähteet on korvattu toiminnallisesti vastaavilla aminohappotähteillä, jolloin syntyy ei-vaikuttava muunnos ja/tai modifioidut tai prosentuoidut sekvenssit, kuten glykosyloidut sekvenssit, fosforyloidut sekvenssit jne. tai kemiallisesti modifioidut sekvenssit. Näitä p97:n su-35 kulaispeptidejä käytetään joko yksin tai kantajaproteii- 29 94836 niin, kuten tulivuorikotilon hemosyaniiniin (KLH), kytkettyinä. Molemmissa tapauksissa adjuvantin käyttö on valinnaista vaikkakin edullista. Immunisoiduille eläimille annetaan booster-annos ja ne testataan immunisointiin käy-5 tettyä peptidiä vastaan muodostuneiden vasta-aineiden suhteen. Eläimet, joilla todetaan anti-peptidi -vastaaineita, testataan natiivia p97-proteiinia sitovien vasta-aineiden suhteen. Kasvaimeen liittyvien antigeenien, kuten p97:n, ollessa kyseessä mielenkiintoista on myös testata soluvä-10 litteinen immuunivaste esimerkiksi etsimällä viivästynyttä yliherkkyyttä (DTH), antigeenin stimuloimaa lisääntymistä in vitro, sytolyyttisiä T-soluja tai kasvaimen hylkimisreaktiota sopivassa mallissa. Sopiva malli voisi olla hiiren kasvain, joka ekspressoi ihmisen kasvaimeen liittyvää anis tigeenia sopivalla cDNA-ekspressiovektorimuodostelmalla suoritetun transfektion seurauksena.

Päämäärä on identifioida peptidit, jotka nostattavat voimakkaan immuunivasteen melanoomaan liittyvää p97-antigeenia vastaan. Kun nämä peptidit on identifioitu, 20 niitä voidaan tuottaa suuria määriä alalla tunnetuilla kemiallisilla synteesimenetelmillä. Vaihtoehtoisesti identifioituja peptidejä voidaan tuottaa suuria määriä eksp-ressoimalla näitä peptidejä koodittavat nukleotidisekvens-sit ekspressiovektori-isäntäsolu -synteeseissä.

25 5.3 p97:n sukulaispeptidien tuottaminen ekspres- siovektori-isäntä-systeemin avulla

Proteiineja ja peptidejä voidaan tuottaa suuria määriä lisäämällä koodattavia nukleotidisekvenssejä sopivaan ekspressiovektoriin, joka puolestaan viedään sopiviin 30 isäntäsoluihin mukaanlukien, mutta ei niihin rajoittuen, bakteerit, hiiva, hyönteisten solut ja imettäväisten solut. Vaikka bakteeri-isännillä on monia etuja, ne eivät prosessoi moniakaan eukaryoottisia proteiineja kunnolla eivätkä ne sovi kasvaimeen liittyvien proteiinien ekspres-35 sointiin yhtä hyvin kuin eukaryoottiset solut. Bakteereis- 30 94836 sa tuotettuja yhdistelmäproteiineja voidaan kuitenkin käyttää T-soluvasteiden indusoimiseen, sillä näiden vasteiden uskotaan vaativan proteiiniantigeenin alkudegradaa-tiota.

5 p97:n sukulaispeptidien ekspressoimiseksi vektori- isäntä -systeemissä melanoomaan liittyvää p97-antigeenia tai sen osaa koodittavat nukleotidisekvenssit lisätään sopivaan ekspressiovektoriin. Näitä nukleotidisekvenssejä ovat, mutteivät rajoitu niihin, oleellisesti kuviossa 3 10 esitetty DNA-sekvenssi kokonaisuudessaan tai osaksi mukaanlukien muunnellut sekvenssit, joissa yksi tai useampia sekvenssinsisäisiä kodoneita korvataan kodonilla, joka koodittaa samaa tai toiminnallisesti vastaavaa aminohappotähdettä, jolloin syntyy neutraali tai ei-vaikuttava muu-15 tos sekvenssiin. Ekspressiovektori sisältää lisätyn proteiinia koodittavan sekvenssin transkriptioon ja translaatioon tarvittavat elementit. Näiden elementtien voimakkuus ja spesifisyydet vaihtelevat. Käytetystä isäntävektori -systeemistä riippuen mitä tahansa lukuisista sopivista 20 transkriptio- ja translaatioelementeistä voidaan käyttää. Esimerkiksi kloonattaessa imettäväissolusysteemeissä voidaan käyttää imettäväissolujen genomista eristettyjä promoottoreja (esim. hiiren metallotioneiinipromoottoria) tai näissä soluissa kasvavista viruksista eristettyjä promoot-• 25 toreja (esim. rokotevirus 7.5K-promoottoria). Yhdistelmä- DNA -menetelmillä tai synteettisillä menetelmillä tuotettuja promoottoreja voidaan myös käyttää lisättyjen sekvenssien transkription aikaansaamiseksi.

Lisättyjen proteiinia koodittavien sekvenssien te-30 hokkaaseen translaatioon tarvitaan myös spesifiset aloi-tussignaalit. Näitä signaaleja ovat ATG-aloituskodoni ja sen vieressä olevat sekvenssit. Silloin kun joko geeni tai cDNA-sekvenssi lisätään sopivaan ekspressiovektoriin, mutta translaation kontrollisignaaleja ei välttämättä tarvi-35 ta. Sellaisissa tapauksissa, joissa vain osa koodittavasta 3i 94836 sekvenssistä lisätään, ulkopuolisia translaation kontrol-lisekvenssejä mukaanlukien ATG-kodoni on kuitenkin ehkä lisättävä. Lisäksi aloituskodonin täytyy olla samassa vaiheessa proteiinia koodittavien sekvenssien lukuvaiheistuk-5 seen nähden koko insertin translaation varmistamiseksi.

Nämä ulkopuoliset translaation kontrollisekvenssit ja aloituskodonit voivat olla peräisin lukuisista sekä luonnollisista että synteettisistä lähteistä.

Mitä tahansa alan asiantuntijoiden tuntemaa mene-10 telmää DNA-fragmenttien lisäämiseksi vektoriin voidaan käyttää muodostettaessa ekspressiovektoreita, jotka sisältävät sopivista transkription ja translaation kontrolli-signaaleista ja proteiinia koodittavista sekvensseistä muodostuvan kimeerisen geenin. Näitä menetelmiä voivat 15 olla in vitro -yhdistelmä-DNA -menetelmät, synteettiset menetelmät ja in vivo -rekombinaatioissa (geneettisessä rekombinaatiossa) käytetyt menetelmät.

Ekspressiovektoreita ovat, mutteivät rajoitu niihin, seuraavat vektorit ja niiden johdannaiset: rokotevi-20 rus, adenovirukset, hyönteisten virukset, hiivavektorit, bakteriofaagivektorit ja plasmidi-DNA-vektorit. Geenien kloonaus ja ekspressointi bakteerisysteemeissä on alalla hyvin tunnettua. Esimerkiksi kloonattaessa Escherichia colissa voidaan käyttää sen bakteriofaagi- tai plasmidi-: 25 promoottoreita, kuten lac-promoottoria, trp-promoottoria, recA-promoottoria, ribosomaalinen RNA -promoottoria, koli-faagi lambdan PR- ja PL-promoottoreita sekä muita promoottoreita mukaanlukien, muttei niihin rajoittuen, lacuv5, trp-lacuv5 ftae) -hybridipromoottori, ompF. bla. Ipp ja 30 vastaavat viereisen DNA-segmentin laaja-asteisen transkription ohjaamiseksi. Prokaryoottisten ja eukaryoottisten solujen välisistä prosessointieroista johtuen saattaa kuitenkin olla edullista ekspressoida p97:n sukulaispeptidit eukaryoottisoluissa. Parhaiten tunnettuja menetelmiä pro-35 teiinien ekspressoimiseksi eukaryoottisoluissa ovat (a) 32 94836 geenin vieminen soluun yhdessä lääkeaineresistenssigeenin kanssa ja tämän jälkeinen valikointi lääkeaineen avulla edullisesti siten, että saadaan aikaan monistuminen kuten dihydrofolaattireduktaasi-metotreksaattisysteemissä, (b) 5 cDNA:n ekspressointi usein pBR332:een perustuvassa plasmi-divektorissa käyttäen vahvaa eukaryoottista promoottoria ja muita säätelysekvenssejä, (c) cDNArn ekspressointi usein SV40:stä peräisin olevassa virusvektorissa taaskin käyttäen vahvoja promoottoreita, tässä tapauksessa SV40-10 promoottoria. Yhdistelraäplasmidivektoreita käytetään usein sellaisten solulinjojen tuottamiseksi, jotka tuottavat proteiinia pitkän aikaa, kun taas SV40-vektoreja käytetään usein lyhytaikaisen ekspression saamiseksi. Vaikka isäntinä on useimmiten käytetty imettäväisten soluja, hyönteis-15 ten solut ja joissakin tapauksissa hiivasolut saattavat myös olla sopivia. Alla on kuvattu joitakin yksityiskohtaisemmin.

Melanoomaan liittyvää p79-antigeenia ekspressoivan yhdistelmärokoteviruksen muodostamiseksi koodittava cDNA-20 sekvenssi voidaan liittää rokoteviruksen 7.5K-promootto-riin, jolloin muodostuu kimeerinen geeni. Tämä kimeerinen geeni reunustetaan toisella rokoteviruksen sekvenssillä, joka on homologinen plasmidin DNA-vektorin kantaman, viruksen tymidiinikinaasigeenin kanssa. Kimeerisen geenin : 25 muodostaminen käsittää sekä luonnollisten että synteettis ten kasvaimeen liittyvän antigeenin sekvenssin transkription ja translaation kontrollisignaalien käytön. Sitten kimeerinen geeni viedään rokoteviruksen ekspressiovekto-reihin sekä plasmidivektorissa että rokoteviruksen geno-30 missä olevan homologisen tymidiinikinaasialueen välisen in vivo -rekombinaation kautta. Nämä kimeerisen geenin sisältävät yhdistelmävirukset pystyvät ohjaamaan p97:n suku-laispeptidien ekspressointia infektoidussa isännässä ja niitä voidaan käyttää rokotteen komponentteina.

33 9 4 8 3 6

Silloin kun käytetään adenovirusta ekspressiovekto-rina, mielenkiinnon kohteena oleva DNA-sekvenssi liitetään adenoviruksen transkription/translaation kontrollikomplek-siin, esimerkiksi myöhäinen promoottorija tripartite lea-5 dersekvenssihin. Sitten tämä kimeerinen geeni lisätään adenoviruksen genomiin in vitro - tai in vivo -rekombinaa-tiota käyttäen. Lisäys viruksen genomin ei-välttämättömälle alueelle (esim. alueelle El tai E3) johtaa yhdistelmä-virukseen, joka on elinkykyinen ja joka pystyy ekspressoi-10 maan p97:n sukulaispeptidin infektoiduissa isännissä. Tällä hetkellä on kaksi adenovirus-kantaa (tyypit 4 ja 7), jotka on hyväksytty ja joita käytetään rokotteina sotilas-henkilökunnalle. Ne ovat ensisijaisia kandidaatteja käytettäväksi vektoreina lisätyn DNA-sekvenssin ekspressoimi-15 seksi.

Vaihtoehtoinen ekspressiosysteemi, jota voitaisiin käyttää p97:n sukulaispeptidien ekspressoimiseksi on hyön-teissysteemi. Eräässä tällaisessa systeemissä Autographa californican mukleaarista polyhedroosivirusta (AnNPV) käy-20 tetään vektorina vieraiden geenien ekspressoimiseksi. Vi rus kasvaa Spodoptera frugiperda -soluissa. Mielenkiinnon kohteena oleva DNA-sekvenssi voidaan kloonata viruksen ei-välttämättömiin alueisiin (esimerkiksi polyhedriinigee-niin) ja sijoittaa AcNPV-promoottorin (esimerkiksi poly-** 25 hedriinipromoottorin) kontrollin alaiseksi. DNA-sekvenssin onnistunut lisäys johtaa polyhedriinigeenin inaktivoitumi-seen ja vapaan yhdistelmäviruksen (tämä tarkoittaa viruksen, jossa ei ole polyhedriinigeenin koodittamaa proteii-nivaippaa) tuottamiseen. Sitten näitä yhdistelmäviruksia 30 käytetään infektoimaan Spodoptera frugiperda -solut, jois sa lisätty geeni ekpressoidaan.

Lisäksi voidaan valita isäntäsolukannat, jotka moduloivat lisättyjen sekvenssien ekspressiota tai modifioivat ja prosessoivat kimeerisen geenin tuotetta halutulla 35 spesifisellä tavalla. Ekpressio tietyistä promoottoreista 34 94836 voi lisääntyä tiettyjen indusoivien aineiden (esimerkiksi sinkki- ja kadmium-ionien metallotioneiinipromoottoreiden ollessa kyseessä) läsnäollessa. Siten geneettisesti aikaansaadun proteiinin ekspressoitumista voidaan kontrol-5 loida. Tämä on tärkeää silloin, jos kloonatun geenin tuote on kuollettava isäntäsoluille. Lisäksi proteiinituotteiden modifikoinnit (esim. glykolysointi, fosforylointi jne.) ja prosessointi (esim. pilkkominen) on tärkeää proteiinin rakenteelle ja funktiolle. Eri isäntäsoluilla on niille 10 luonteenomaiset ja spesifiset mekanismit proteiinien translaatiojälkeiseen prosessointiin ja modifiointiin. Sopivat solulinjat tai isäntäsysteemit voidaan valita eks-pressoidun vieraan proteiinin oikean modifioinnin ja prosessoinnin varmistamiseksi.

15 Tässä p97:lle kuvatussa erityisessä suoritusmuodos sa p97:n DNA-sekvenssi liitettiin metallotioneiinipromoot-torin sisältävään pBR322:sta peräisin olevaan ekspressio-plasmidivektoriin. p97:n koko koodittava sekvenssi mukaanlukien signaalipeptidi ja kalvoon kiinnittymisankkuri li-20 sättiin vektoriin.

5.3.1 Replikoitumaan ja p97:n DNA-sekvenssien eks-pressointia ohjaamaan pystyvien yhdistelmäekspressiovekto-reiden identifiointi

Vieraan geenin inserttejä sisältävät ekspressiovek-• 25 torit voidaan identifioida kolmea yleistä tapaa käyttäen: (a) DNA-DNA -hybridisaatio, (b) merkkigeenitoimintojen esiintyminen tai puuttuminen ja (c) lisättyjen sekvenssien ekpressio. Käytettäessä ensimmäistä tapaa ekspressiovekto-riin lisätyn vieraan geenin läsnäolo voidaan todeta DNA-30 DNA -hybridisaation avulla vieraan geenin insertin kanssa homologisia sekvenssejä sisältäviä koettimia käyttäen. Toisessa lähestymistavassa yhdistelmävektori/isäntä-systeemi voidaan identifioida ja valikoida geenien lisäämisen vektoriin aiheuttamien tiettyjen "merkkigeenin" toiminto-35 jen (esim. tymidiinikinaasiaktiivisuuden, antibioottire- 35 94836 sistenssin, fenotyypin muuttumisen jne.) esiintymisen tai puuttumisen perusteella. Esimerkiksi jos vieras geeni lisätään vektorin merkkigeenisekvenssiin, DNA-insertin sisältävät rekombinantit voidaan identifioida merkkigeenin 5 toiminnan puuttumisen perusteella. Käytettäessä kolmatta tapaa yhdistelmäekspressiovektorit voidaan identifioida määrittämällä rekombinantin ekspressoima vieras geenituo-te. Nämä määritykset voivat perustua geenituotteen fysikaalisiin, immunologisiin tai toiminnallisiin ominaisuuk-10 siin.

Esimerkiksi muodostettaessa tämän keksinnön mukaisesti yhdistelmärokotevirusta p97:ää koodittavat sekvenssit sisältävä kimeerinen geeni lisätään tymidiinikinaasi-geeniin, jolloin inaktivoidaan viruksen TK+-fenotyyppi ja 15 virus varustetaan TK_-fenotyypillä. Nämä rekombinantit valikoidaan sen perustella, pystyvätkö ne kasvamaan TK+-so-luille, muttei TK_-soluille, tappavissa, 5-bromideoksiuri-diini -nukleosidianalogia sisältävissä väliaineissa. Rekombinantit identifioidaan edelleen DNA-DNA -hybridisaa-20 tion avulla käyttäen kasvaimeen liittyvälle proteiinille spesifistä cDNA-koetintä. TK -yhdistelmävirus voidaan eristää plakkipuhdistuksen avulla ja infektoiduista viljellyistä soluista valmistetaan kannat. Yhdistelmävirus voidaan testata sen perusteella, kykeneekö se indusoimaan “ 25 p97:n sukulaispeptidien synteesin. Tällöin infektoituja soluja voidaan kasvattaa radioaktiivisella isotoopilla leimattujen aminohappojen läsnäollessa; sitten infektoitu-jen, radioaktiivisella isotoopilla leimattujen solujen lysaatit ja solunsisäiset fraktiot testataan natiivia me-30 lanoomaan liittyvää p97-antigeenia vastaan muodostetuilla vastaaineilla immunologisesti seostamalla. Immunologisesti saostetut tuotteet erotetaan SDS-PAGE:n avulla. Infektoidut solut voidaan testata myös immunofluoresenssin avulla monoklonaalista vasta-ainetta käyttäen.

36 94836

Solut, joihin plasmidivektori on transfektion avulla viety, voidaan helposti identifioida FACS-analyysin avulla tai solupesäkkeiden kopioiden sitoutumisen polyesterikankaalle määrittämisen avulla. Läsnäolevan p97:n su-5 kulaispeptidin määrä voidaan määrittää kvantitatiivisella radioimmunologisella määritysmenetelmällä ja sen solunsi-säinen sijainti voidaan määrittää solun fraktioinnilla ja immunofluoresenssimikroskopisesti. Ekspressoidun p97:n su-kulaispeptidin rakenne voidaan määrittää SDS-PAGE:n avulla 10 ja analysoimalla aminohapposekvenssi.

5.3.2 p97:n sukulaispeptidin puhdistus ekspressio-vektori-isäntä -systeemeistä

Monet kasvaimeen liittyvät antigeenit, kuten p97, ovat solun pinnan glykoproteiineja ja sisältävät N-termi-15 naalisen signaalipeptidin ja C-terminaalisen ankkuripepti-din (Davis et ai., J. Mol. Biol. 181 (1985) 111-121). Sopivassa vektorissa ekspressoitaessa odotetaan, että proteiini siirretään solun pinnalle. Proteiinin puhdistamisen helpottamiseksi saattaa olla edullista poistaa kalvoon 20 kiinnittymisaluetta koodittava DNA-sekvenssi, jolloin kyp sä proteiini vapautetaan viljelyvällaineeseen.

p97:n sukulaispeptidi voidaan puhdistaa isäntäso-luista hajottamalla solut detergentin avulla ja suorittamalla tämän jälkeen affiniteettikromatografia monoklonaa-• 25 lisiä vasta-aineita käyttäen. Jos viljelyväliaineesta puh distettavana on tylpistetty proteiini, on edullista käyttää seerumia sisältämätöntä väliainetta ja käyttää sitten affiniteettikromatografiaa monoklonaalisten vastaaineiden avulla. On tärkeää, että antigeeni voidaan eluoida vasta-30 aineadsorbentista joko vähentämättä sen antigeenisyyttä tai denaturoimatta sitä. Tämä voidaan saada aikaan nostamalla tai laskemalla pH:ta tai kaotrooppista ainetta käyttämällä. Saattaa olla välttämätöntä valita sellainen mono-klonaalinen vasta-aine, joka vapauttaa antigeenin suhteel-35 lisen lievissä olosuhteissa. Affiniteettisesti puhdistettu antigeeni voidaan puhdistaa edelleen HPLC:n avulla.

37 94836 5.4 p97:n sukulaispeptidien immunologinen karakterisointi

Synteettisen antigeenin tai rekombinanttiantigeenin kyky nostattaa kasvaimenvastainen vaste voidaan arvioida 5 aluksi koe-elämissä. Tämä voidaan tehdä muodostamalla mallisysteemi, jossa ihmisen melanoomaan liittyvä p97-pro-teiini ekspressoidaan koe-eläinlajin sopivan, sisäsiittoisen kannan soluissa. Sitten eläimet immunisoidaan p97:n sukulaispeptidillä eri immunisointiprotokollia käyttäen, 10 jonka jälkeen testataan, onko melanoomaan liittyvää p97-antigeenia vastaan kehittynyt vasta-aineita, onko p97:ää vastaan muodostunut soluvälitteistä immuniteettia, kuten viivästynyttä yliherkkyyttä, ja kykenevätkö ne hylkimään p97antigeenia ekspressoivilla, elävillä, syngeenisillä 15 kasvainsoluilla altistettaessa. Lisäksi sellulaarisen immuniteetin in vitro -määritysmenetelmillä voidaan mitata lymfosyyttien lisääntymistä vasteena p97:n sukulaispepti-dille ja immunisoiduista eläimistä tai melanoomapotilaista saatujen lymfosyyttien kykyä tappaa p97-antigeenia eks-20 pressoivia kasvainsoluja. Edelleen immunisoimalla hiiriä hiiren p97:llä voidaan määrittää, kuinka pitkälle on mahdollista indusoida immuunivaste antigeenille, jota esiintyy pienenpieniä määriä normaaleissa kudoksissa.

Apinoita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti 25 saatujen p97:n sukulaispeptidien turvallisuuden määrittä miseen. Tällöin eläimet voidaan immunisoida käyttäen immu-nisointiprotokolleja, joita voitaisiin eettisesti soveltaa syöpäpotilaisiin, jonka jälkeen ne voidaan testata yllä kuvatulla tavalla paitsi, ettei kasvaimen siirrännäisko-30 keitä voida käyttää, koskapa nämä vaativat sisäsiittoisten kantojen käyttöä. Immunisointimenetelmän turvallisuus määritetään tarkkailemalla immunisoinnin vaikutusta immunisoitujen eläinten yleiseen terveydentilaan (painonmuutokset, kuume, ruokahalu, käyttäytyminen jne.) ja tarkkaile-35 maila patologisia muutoksia ruumiinavauksessa.

38 94836

Lopuksi tämän keksinnön mukaisesti saatu p97:n su-kulaispeptidi voidaan testata syöpäpotilaissa. Kun alkuvaiheen I testaus on suoritettu potilailla, joiden syöpä on edennyt pitkälle, myrkyttömyyden määrittämiseksi, re-5 missiovaiheessa olevia potilaita, joiden kohdalla sairauden uusiutumisen todennäköisyys on suuri, voitaisiin testata. Heidän immuunivasteensa arvioitaisiin apinoille yllä kuvatulla tavalla paitsi, että hoidon vaikutus olemassaolevaan sairauteen tai uusitumisen esiintymistiheyteen 10 tutkitaan. Melanooma-antigeenin p97:n tapauksessa tutkitaan myös antigeeniä ekspressoivat hyvälaatuiset luomet (syntymämerkit).

5.5 Rokotteen muodostaminen

Keksinnön tämän suoritusmuodon tarkoituksena on 15 tuottaa synteettisesti tai yhdistelmä-DNA -menetelmien avulla synteettinen peptidi, puhdistettu proteiini tai yhdistelmävirus, jota voidaan käyttää immunogeeninä ja rokotteena sellaisten syöpäpotilaiden suojaamiseksi, joi-den sairauden uusiutumisen riski on suuri, olemassaolevan 20 sairauden hoitamiseksi ja loppujen lopuksi henkilöiden, joiden riski sairastua on suuri, rokottamiseksi ennaltaehkäisevästi. Itse asiassa synteettistä tai yhdistelmäDNA -menetelmillä valmistettua melanoomaan liittyvää p97-anti-geenia voidaan käyttää yhdessä muiden immunogeenien kanssa * 25 monivaikutteisten rokotteiden valmistamiseksi melanooman ja muiden syöpien ehkäisemiseksi. Alla kuvataan esimerkkejä erilaisista rokoteformulaatioista.

5.1.1 Virusrokoteformulaatiot

Kun tämän keksinnön mukaisesti p97:n sukulaispepti-30 di tuotetaan yhdistelmäviruksen avulla, voidaan formuloida joko eläviä viruksia sisältävä yhdistelmävirusrokote tai inaktivoitu yhdistelmävirusrokote. Valinta riippuu p97:n sukulaispeptidin ekspressoimiseen käytetyn yhdistelmäviruksen luoteesta. Kun yhdistelmävirus on infektiivinen 35 immunisoitavalle isännälle, mutta ei aiheuta sairautta, : aa.i anu mu 39 94836 eläviä viruksia sisältävä rokote on edullinen, sillä monistuminen isännässä johtaa samantyyppiseen ja suuruudeltaan samanlaiseen pidentyneeseen ärsykkeeseen kuin luonnollisissa, oireettomissa infektioissa esiintyvät ärsyk-5 keet ja tuottaa siksi huomattavan pitkäaikaisen immuniteetin. Infektoiva yhdistelmävirus isäntään vietäessä voi ekspressoida p97:n sukulaispeptidin kimeerisestä geenistään ja siten stimuloida immuunivasteen. Elävää yhdistel-mävirusta sellaisenaan voidaan käyttää melanoomaa ehkäise-10 vänä rokotteena. Näissä formulaatioissa käytettävän tällaisen yhdistelmäviruksen tuottaminen saattaa käsittää sekä in vitro (esim. kudosviljelmäsolut) että in vivo (esim. luonnollinen isäntäeläin, kuten lehmät) -systeemit. Tavanomaisia isorokkorokotteen valmistus- ja formulointi-15 menetelmiä voidaan soveltaa eläivä viruksia sisältävän yhdistelmävirusrokotteen formuloimisessa.

Monivaikutteisia, eläviä viruksia sisältäviä virusrokotteita voidaan valmistaa yhdessä tai muutamista infek-toivista yhdistelmäviruksista, jotka ekspressoivat useita 20 eri kasvain- tai syöpäsolujen antigeenejä. Esimerkiksi rokotevirus (joka voi pitää sisällään noin 35 kiloemäspa-ria vierasta DNA:ta) voidaan saada sisältämään muita epi-tooppeja koodittavia sekvenssejä; tällaista yhdistelmävi-rusta sellaisenaan voidaan käyttää immunogeeninä monivai-25 kutteisessa rokotteessa. Vaihtoehtoisesti seos, joka sisältää rokoteviruksia ja/tai muita viruksia, joista jokainen pystyy ohjaamaan eri epitooppeja koodattavan eri geenin ekspressiota, voidaan formuloida monivaikutteiseksi rokotteeksi.

30 Onpa yhdistelmävirus immunisoitavalle isännälle infektiivinen tai ei ole, voidaan valmistaa inaktivoitu rokoteformulaatio. Inaktivoidut rokotteet ovat "kuolleita" siinä mielessä, että niiden infektiivisyys on tuhottu tavallisesti formaldehydikäsittelyllä. Ihannetapauksessa vi-35 ruksen infektiivisyys tuhotaan vaikuttamatta viruksen im- 40 9 4 8 3 6 munogeenisyyttä kantaviin kapseli- tai vaippaproteiinei-hin. Inaktivoitujen rokotteiden valmistamiseksi on kasvatettava suuria määriä yhdistelmävirusta viljelmässä tarvittavan määrän asianmukaista antigeeniä saamiseksi. Seos-5 ta, joka sisältää eri epitooppeja ekspressoivia, inaktivoitu ja viruksia, voidaan käyttää "monivaikutteisten" rokotteiden formuloinnissa. Joissakin tapauksissa tämä saattaa olla edullinen eläviä viruksia sisältäviin rokotefor-mulaatioihin verrattuna yhdessä annosteltujen elävien vi-10 rusten keskinäisestä vuorovaikutuksesta aiheutuvien mahdollisten vaikeuksien johdosta. Kummassakin tapauksessa inaktivoitu yhdistelmävirus tai virusten seos tulisi formuloida sopivan adjuvantin kanssa niiden antigeenejä vastaan muodostuvan immunologisen vasteen lisäämiseksi. Sopi-15 via adjuvantteja ovat, mutteivät rajoitu niihin, mineraa-ligeelit, esim. alumiinihydroksidi, pinta-aktiiviset aineet, kuten lysolesitiini, pluronipolyolit, polyanionit, peptidit ja öljyemulsiot.

Monia menetelmiä voidaan käyttää ylläkuvattujen 20 rokoteformulaatioiden annostelussa. Näitä ovat, mutteivät rajoitu niihin, ihoon, lihakseen, vatsaonteloon, suoneen, ihon alle tai nenään annostelureitit. Kun käytetään eläviä viruksia sisältävää yhdistelmävirusrokoteformulaatiota, se voidaan annostella käyttämällä sen villityyppisen kantavi-11 25 ruksen, jota käytettiin rokoteformulaatiossa olevan yhdis- telmäviruksen valmistamisessa, luonnollista infektioreit-tiä.

5.5.2 Eristetyistä komponenteista valmistetut rokotef ormulaatiot 30 Vaihtoehtona virusrokotteille p97:n sukulaispepti- diä sillaisenaan voidaan käyttää immunogeeninä eristetyistä komponenteista valmistetuissa rokoteformulaatioissa. Eristetyistä komponenteista valmistetut rokotteet sisältävät ainoastaan asiaankuuluvan immunogeenisen materiaalin, 35 joka tarvitaan isännän immunisoimiseksi. Niinpä p97:n su- !l ' IH ?· silli I I T in ! 4i 94836 kulaispeptidi voidaan puhdistaa peptidiä ekspressoivista rekombinanteista. Näitä rekombinantteja ovat mitkä tahansa aikaisemmin kuvatuista viruksella infektoiduista viljellyistä soluista, bakteeritransformanteista tai hiivatrans-5 formanteista.

Ovatpa p97:n sukulaispeptidit rekombinanteista puhdistettuja tai kemiallisesti syntetisoituja, lopputuote voidaan säätää sopivaan pitoisuuteen ja formuloida minkä tahansa sopivan rokoteadjuvantin kanssa ja pakata käyttöä 10 varten. Sopivia adjuvantteja ovat, mutteivät rajoitu niihin, mineraaligeelit, esim. alumiinihydroksidi, pinta-ak-tiiviset aineet, kuten lysolesitiini, pluronipolyolit, polyanionit, peptidit ja öljyelmusiot. p97:n sukulaispep-tidi voidaan myös yhdistää liposomeihin tai konjugoida 15 polysakkarideihin ja/tai muihin polymeereihin rokoteformu- laatiossa käytettäväksi.

Silloin kun p97:n sukulaispeptidi on hapteeni, tämä tarkoittaa molekyyli, joka on antigeeninen siten, että se voi reagoida selektiivisesti yhteenkuuluvien vasta-ainei-20 den kanssa, mutta ei ole immunogeeninen, sillä se ei kykene nostattamaan immuunivastetta, hapteeni voidaan sitoa kovalenttisesti kantajaan tai immunogeeniseen molekyyliin ja ha teeni-kantaja -molekyyli voidaan formuloida käytettäväksi rokotteena; esimerkiksi suuri proteiini, kuten 25 seerumin albumiini -proteiini tekee siihen kytketyn hap- teenin immunogeeniseksi.

6. Esimerkki: Melanoomaan liittyvä p97-antigeeni

Seuraavassa esimerkissä p97:n eri alueilta peräisin olevat cDNA-kloonit liitettiin yhteen ja lisättiin eks-30 pressiovektoriin, joka ohjaa p97:n sukulaispeptidin eks-pressointia. Ekspressiovektori-isäntäsolu -systeemin avulla tuotettuja p97:n sukulaispeptidejä voidaan formuloida rokotteeksi.

42 94836 6.1 p97-mRNA:n puhdistus

Polysomit valmistettiin SK-MEL28-melanoomasoluista (Carey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976) 3270-3281) magnesiumsaostuksella. Tästä valmisteesta muodostu-5 via p97-ketjuja kantavat polysomit puhdistettiin inkuboi-malla niitä kolmen, p97:n erillisille epitoopeille (Brown et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 4980-4983, Brown et al., J. Immunol. 127 (1981) 539-546, Brown et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 78 (1981) 539-543, Plowman et al., Nature, 10 Lontoo, 303, (1983) 70-72) spesifisen IgG2a-monoklonaalisen vasta-aineen (96.5, 118.1, 133.2) kanssa ja ajamalla sen jälkeen affiniteettikromatografia Proteiini A - Sepharose -geeliä käyttäen. p97:n rikastettu mRNA eluoitiin EDTA:lla ja puhdistettiin affiniteettikromatografisesti oligo(T)-15 selluloosaa (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) käyttäen. Tyypillisessä kokeessa 150 E^-yksikköä polysomeja tuotti 260 mg p97:n rikastettua mRNA:ta, jonka osuus kokona ismRNA:sta on 0,23 %. Kun p97:n rikastettu mRNA kopioitiin Xenopus-varhaismunasoluissa ja määritettiin p97:n 20 suhteen kuvatulla tavalla (Brown et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 78 (1981) 539-543, Plowman et al., Nature, Lontoo, 303 (1983) 70-72), se tuotti 80 pg p97:ää ng:aa mRNA-:ta kohti, kun taas p97:n rikastamaton mRNA tuotti vain 0,44 pg p97:ää ng:aa mRNA:ta kohti, mikä osoittaa, että 25 p97:n mRNA-aktiivisuus on rikastettu 180-kertaisesti.

p97:n mRNA-aktiivisuuden saanto oli 42 %. Translaatio re-tikulosyyttilysaattisyteemissä (Pelham & Jackson, Eur. J. Biochem. 67 (1976) 247-256) osoitti, että p97:n rikastettu mRNA kooditti tärkeää polypeptidiä, jonka näennäinen mole-30 kyylipaino on 84 000 daltonia SDS-PAGE:lla analysoituna, jota ei voitu todeta rikastamattoman mRNA:n translaatio-tuotteista ja joka saostui immunologisesti p97:lle spesifisellä antiseerumilla (kuvio 1) . Tehtiin johtopäätös, että tämä oli p97:n glykosyloimaton esiaste.

43 94836 6.2 cDNA-kloonien valmistus ja muodostaminen

Kahta allakuvattua menetelmää käytettiin yllä eristetyistä mRNA-templaateista kopitoitujen cDNA-kloonien muodostamiseksi.

5 6.2.1 Oligo(T)-sekvenssillä aloitettujen cDNA- kloonien muodostaminen

Yllä valmistettua p97:n rikastettua mRNA:ta käyt-tettiin templaattina oligo(T)-sekvenssillä aloitetun cDNA-:n synteesissä. cDNA kloonattiin pBR322:ssa seuraavasti: 10 ensimmäisen cDNA-säikeen syntetisoimiseksi p97:n rikastettua mRNA:ta, neljää dNTPrtä ja oligo(T)-sekvenssiä (Collaborative Research, Walthma, MA) inkuboitiin käänteisko-pioijaentsyymin (Molecular Genetic Resources) kanssa. Toinen säie syntetisoitiin inkuboimalla E. colin DNA-polyme-15 raasin suuren fragmentin (Bethesda Research Labs,

Bethesda, MD) kanssa ja kaksisäikeinen cDNA hajotettiin Sl-nukleaasilla (lahja D. Durnamilta, The Fred Hutchinse Cancer Research Center, Seattle, WA). Sitten cDNArhan lisättiin dC-häntä terminaalista deoksinukleotidyylitransfe-20 raasia (Bethesda Research Labs, Bethesda, MK) käyttäen, liitettiin Pstlrllä hajotettuun, cG-hännällä varustettuun pBR322:een (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 3727 -3731) ja käytettiin transformoimaan CaCl2:lla käsitelty E.

25 coli RR1. Transformoitujen bakteerien pesäkkeistä saatu DNA kiinnitettiin paperiin (Taub & Thompson, Anal. Bio-chem. 126 (1982) 222-230) ja seulottiin differentiaalihyb-ridisaation avulla käyttäen p97:n rikastettu ja rikastama-ton mRNA -templaateista syntetisoituja cDNA-koettimia.

30 Identifioitiin 243 emäsparia (ep) sisältävä klooni, p97-3a2f1, joka hybridisoitui p97:n rikastetun cDNA:n kanssa, mutta ei havaittavassa määrin rikastamattoman cDNA:n kanssa ja joka myös valikoi p97:n mRNA:n hybridi-valikoitu translaatio -kokeissa (hybrid-selected transla-35 tion experiments). Polyadenylaatio-signaali (AATAA) ja 44 94836 poly(A)-alue sijaitsivat cDNA:n 3'-päässä (katso kuvio 2). Nick-transloitu p97-3a2fl hybridisoitui 100-kertaa vahvemmin p97:n rikastettuun mRNA:hän kuin rikastamattomaan melanooma -mRNA: hän, eikä hybridisoitunut havaittavissa mää-5 rin fibroblasti-mRNArn kanssa. Northern blot -analyysi käyttäen kloonattua cDNA:ta koettimena identifioi noin 4 kiloemäksen (ke) mRNA:n, joka esiintyi SK-MEL28 -melanoo-masoluissa, mutta ei esiintynyt fibroblasteissa.

6.2.2 p97:n genomin kloonaus ja synteettisen oligo-10 nukleotidien käyttö cDNA-synteesin aloittamisessa

Yritykset saada cDNA-klooneja, jotka kattoivat yli 1 kettä polyadenylaatiokohdasta lukien, eivät onnistuneet, mikä mahdollisesti johtui alueesta, joka sisälsi runsaasti (yli 80 %) GC-ryhmiä ja jolla oli huomattavan suuri sekun-15 daarinen rakenne. Tämän ongelman kiertämiseksi käytettiin genomin kloonausta. Neljä päällekkäin menevää genomista kloonia eristettiin lambda-L47.1 -kirjastoista ja kloonit sisälsivät koon perusteella fraktioitua SK-MEL28 -DNA:ta, joka oli rikastettu spesifisen p97:n restriktiofragmentin 20 suhteen. Nämä neljä genomista kloonia kattavat 28 ke:tä ja sisältävät p97:ää koodittavan alueen kokonaisuudessaan mukaanlukien geenin säätelyalue. Genomiset kloonit järjestettyinä peräkkäin 5'-päästä 3'-päähän ovat: lambda B15, lambda H17, lambda B6.6 ja lambda E7.7. Nimi muodostuu • 25 kirjaimesta, joka viittaa fragmentin muodostamisessa käy tettyyn restriktioentsyymiin, ja numerosta, joka osoittaa lambda L47.1:een kloonatun fragmentin koon kiloemäksinä.

Siten alkaen 5'-päästä lambda-klooni B15 sisältää 15 ke:n BamHI-p97-fracrmentin. lambda-klooni H17 sisältää 17 ke:n 30 HindiII-p97-fragmentin, lambdaklooni B6.6 sisältää 6.6 ke:n BamHI-p97-fragmentin ja lambda-klooni E7.7 sisältää 7.7 ke:n EcpRI-p97-fragmentin (katso kuva 2A). 4 ke:n p97--mRNA:n kanssa Northern blot -analyysissä hybridisoitunei-den kloonien restriktiofragmentit sekvensoitiin ja p97-ek-35 sonit identifioitiin tietokonetta apuna käyttävän ennus- 45 94836 tettujen koodittavien sekvenssien ja ihmisen ja kananpojan transferriinin aminohapposekvenssin välisen homologian etsinnän avulla (Yang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 2752-2756. McGillivray et ai., Proc. Natl. Acad.

5 Sei. USA 79 (1982) 2504-2508, Jetsch & Chambon, Eur. J.

Biochem. 122 (1982) 291-295).

Kolmea synteettistä oligonukleotidia, joiden sekvenssit perustuivat p97:n genomin eksonisekvensseihin, käytettiin cDNA:n synteesin SK-MEL28 -mRNA:sta aloittami-10 seen ja saatu cDNA kloonattiin lambda-gtlO:een seuraavasti: p97:n cDNA:hän kiinnitettiin dG-häntä ja se liitettiin oligonukleotidisiltaan (AATTCCCCCCCCCCCC) ja lambda-gtlO:-een, joka oli käsitelty restriktioentyymillä EcoRI. Oligo-nukleotidisilta salli dG-hännällä varustetun cDNA-sekvens-15 sin lisäämisen ja liittämisen lambda-gtlO:n EcoRI-kohtaan. Lambda-faagi paketoitiin (Grosveld et ai., Gene 13 (1981) 227-237) ja levitettiin E. coli c^o rK~mK+hf1 -kantaan. Lambda-gtlO:ssä olevat cDNA-kirjastot seulottiin p97-in-sertin suhteen plakkihybridisaation (Benton & Davis, 20 Science 196 (1977) 180) avulla käyttäen genomin eksoni- fragmentteja koettimina. Koettimet oli leimattu radioaktiivisella 32P-TTP:llä (New England Nuclear, 3200 Ci/mmol) nick-translaation avulla siten, että saatiin spesifinen aktiivisuus 5 - 10 x 108 cpm/^g. Kolme toistensa kanssa 25 osittain päällekkäistä cDNA-kloonia (lOal, ljl, 2fl), jotka kattavat p97:n mRNA:n 2 368 nukleotidia mukaanlukien koodittavan alueen kokonaisuudessaan, identifioitiin käyttämällä p97:n eksonispesifisiä fragmentteja koettimina (kuvio 2).

30 6.3 p97:n DNA-sekvenssin analysointi cDNA-insertit katkaistiin ja subkloonattiin plas-midivektoriin pEMBL18+ (Dente et ai., Nucleic Acids Res.

11 (1983) 1645-1655) E. colissa seuraavaa lisääntymistä ja restriktiokartoitusta varten. cDNA subkloonattiin myös 35 M13mpl8-faagin kloonausvektoriin (Yanish-Perrone et ai., « 94836

Gene 33 (1985) 103-119) ja sekvensoitiin Sangerin dideoksi -menetelmää käyttäen (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 74 (1977) 5463-5467). Suuria inserttejä sisältävät M13-kloonit sekvensoitiin muodostamalla deleetioita 5 DNaasi I:tä (Hong, J. Mol. Biol. 185 (1982) 539-549) tai eksonukleaasi Ill:a (Henikoff, Gene 28 (1984) 351-359) käyttäen sekä käyttäen synteettisiä, 21-meerin oligonuk-leotidialukkeita.

p97:n cDNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 3. Avoin, 10 2 214 nukleotidin lukuvaiheistus ulottuu ensimmäisestä ATG-kodonista, jota ympäröivä sekvenssi on yhdenmukainen Kozakin määrittelemän consensus-aloitussekvenssin kanssa (Kozak, Nucleic Acids Res. 8 (1980) 127-142), TGA-kodoniin asemassa 2 215. Eniten 5'-päässä sijaitseva cDNA-klooni 15 sisältää vielä 60 nukleotidia ylöspäin ATG-aloituskodonis-ta lukien. p97:n mRNA:n 3'-pään koodittamaton alue, jota ei saatu cDNA-kloonina, identifioitiin yksinkertaisena genomisena eksonina, joka sisälsi 1667 nukleotidia. Ennustetun aminohapposekvenssin tähteet 20-32 ovat identtisiä 20 p97:n tunnetun N-terminaalisen aminohapposekvenssin (Brown et ai., Nature, Lontoo, 296 (1982) 171-173) kanssa, mikä tunnistaa kloonatun cDNA:n. Lisäksi esiasteen ennustettu molekyylipaino on 80 196 daltonia, mikä on hyvin sopusoinnussa in vitro -translaatiotuotteen havaitun molekyylipai-‘ 25 non kanssa.

6.4 p97:ää koodittavan sekvenssin sisältävän yh-distelmäekspressioplasmidin muodostaminen p97-geenin suuri koko teki välttämättömäksi niiden cDNA-kloonien yhteenliittämisen, jotka saatiin aloittamal-30 la spesifisesti melanooma-mRNA:n transkriptio käänteisko-pioijaentsyymin avulla. Käytettiin kolmea cDNA:n lambda-gtlO -kloonia (lOal, ljl ja lfl; katso kuvio 2), jotka sisälsivät säätelyalueen signaalipeptidistä kalvoon kiinnit-tymissekvenssiin asti. Kloonin lOal p97-insertti katkais-35 tiin hajottamalla se EcoRI:llä ja cDNA-10al:n 5'-päässä ii iu.t uii ilta 47 94836 oleva oligo(dG)-sekvenssi poistettiin hajottamalla ekso-nukleaasi 111:11a, jolloin muodostui klooni lOalb, jossa on Hindlll-kohta 30 ep:tä j>97-preproteiinin aloitusmetio-niinista lukien ylöspäin. Kolmen cDNA-kloonin, lnalb, ljl 5 ja 2fl, p97-insertit ja genominen klooni E7.7 liitettiin yhteen PvuII-. SstI- ja EcoRI-restriktioentsvvmikohdista ja lisättiin plasmidivektorin pEMBL18+ (Dente et ai., Nuc.

Acid Res. 11 (1983) 1645-1655) Hindlll-EcoRI -kohtiin kuviossa 2 esitetyllä tavalla. Lopullinen muodostelma, p97b, 10 sisältää 4.4 ke:n p97-insertin plasmidivektorissa pEMBL18+, jota käytettiin transformoimaan E. coli HB101. Insertti p97b:ssä sisältää 30 ep:n sekvenssin p97-mRNA:n 5'-pään kopioimatonta aluetta, koodittavan sekvenssin kokonaisuudessaan ja 3'-pään kopioimattoman alueen, joita 15 rajoittavat 5'-pään Hindlll-kohta ja 3'pään EcoRI-kohta.

4,4 Kiloemäksen p97-insertti katkaistiin p97b:stä käyttäen HindIII:a ja EcoRI:tä ja päät täytettiin E. colin DNA-polymeraasin K1 enow-fragmenttia käyttäen. Tylppäpäinen fragmentti lisättiin ainoaan Smal-kohtaan eukaryoottisessa 20 cDNA-ekspressiovektorissa 1995.12 pUC13, joka on vektori mThGH-112 (Palmiter et ai., Science 222 (1983) 809-14) johdannainen ja joka saatiin tri Richard Palmiterilta (University of Washington, Seattle, Washington). Tämä plasmidi käyttää hiiren metallotioneiinipromoottoria vie-25 raiden geenien ekspressoimiseksi eukaryoottisoluissa. Muo dostelma p97-insertin kanssa oikeassa orientaatiossa identifioitiin restriktioanalyysin avulla ja nimettiin pMTp97b:ksi.

Yhdistelmäplasmidi transfektoitiin LMTK -soluihin 30 ja transfektantit valikoitiin HAT-väliaineassa kasvun perusteella. Transfektoidulta mailalta poimittujen kloonien annettiin lisääntyä 96-kuoppaisissä mikrotiitterilevyissä ja käytetty viljelyväliaine sekä replica plate -menetelmällä saatujen pesäkkeiden solulysaatit määritettiin p97:n 35 suhteen kaksipaikkaisella immunoradiometrisellä määritys- 48 9 4 8 3 6 menetelmällä. Alakloonien annettiin lisääntyä ja testattiin uudelleen. Kloonia TKMp97-12, joka ekspressoi noin 4 000 000 p97-molekyyliä solua kohti, kasvatettiin, indusoitiin kadmiumilla ja käytettiin immunisointiin käytetyn 5 p97:n lähteenä.

6.5 Hiiren immunisointi p97:n sukulaispeptideillä TKMp97-12-soluja kasvatettiin, indusoitiin kadmiumilla ja (14,4 g) hajotettiin inkuboimalla 10 minuutin ajan jäiden päällä 70 ml:n TNEN-puskuria (20 mmol/1 Tris-10 HC1, pH 8,0, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 % NP-40) kanssa. Lysaatti ultrasentrifugoitiin 20 0000 x g:n voimalla 45 minuutin ajan 4 °C:ssa ja toisen puolen lysaati-sta annettiin kulkea p97:lle spesifiseen, 1 ml:n immunoaf-finiteettipylvääseen (vasta-aineen 96,5 Fab-fragmentti 15 kytketty Sepharose-geeliin). Immunoadsorbentti pestiin pe rusteellisesti ensin TNEN-puskurilla ja lopuksi 20 mmol/1 Tris-HCl-puskurilla, pH 6,8.

Immunisointia varten 0,5 ml ylläkuvatulla tavalla valmistettua immunoaff initeettipylväsmateriaalia sekoitet-20 tiin 0,5 ml:n 20 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 6,8, kanssa ja emulgoitiin 1 ml:n Complete Freund's adjuvant -adju-vanttia kanssa. Jokainen neljästä BALB/c-hiirestä sai 0,4 ml emulsiota vatsaonteloon. Kolmen viikon kuluttua hiiret saivat booster-annoksen, jonka suuruus oli neljäsosa tästä 25 antigeenimäärästä Incomplete Freund's adjuvant -adjuvan- tissa. Kontrollihiiret immunisoitiin immunoaffiniteetti-pylväsmateriaalilla, joka sisälsi p97:ään liittymättömän vasta-aineen ja joka oli muuten käsitelty identtisellä tavalla. Neljän p97:llä immunisoidun hiiren ja kahden kon-30 trollihiiren veri otettiin talteen viikon kuluttua boos-ter-annoksesta. Seerumit testattiin p97:ää vastaan muodostuneiden vasta-aineiden suhteen seostamalla immunologises-ti radioaktiivisella jodilla leimatuista SK-MEL -melanoo-masoluista ja ajamalla sen jälkeen SDS-PAGE. Tulokset 35 osoittivat, että neljän p97:llä immunisoidun hiiren seeru- 49 9 4 8 3 6 mit saostivat immunologisesti p97:n, kun taas kontrolli-seerumit olivat negatiivisia. Seerumit testattiin p97:ää vastaan muodostuneiden vastaaineiden suhteen myös käyttämällä glutaraldehydillä kiinnitettyjä SK-MEL28 -melanooma-5 soluja (20 000 solua mikrotestikuoppaa kohti) käyttävää ELISA-määritysmenetelmää. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin 0,05 ml:n 1/10 000 laimennettua seerumia kanssa yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin ja inkuboitiin tämän jälkeen yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa 0,05 ml:n 10 piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua vuohen anti-hiiri-

IgG:tä (Southern Biotech) kanssa. p97:llä immunisoitujen hiirien seerumien absorbanssit (aallonpituudella 490 nm luettuina) olivat 0,350, 0,243, 0,343 ja 0#200, kun taas kontrollien seerumien absorbanssit olivat 0,036 ja 0,057.

15 6.6 p97:n karakterisointi 6.6.1 p97:n rakenne 97:n rakenne määritettiin neljä rakenteellista luetta sisältävän p97-esiasteen aminohapposekvenssistä.

Koska esiastesekvenssin tähde 20 vastaa kypsän p97:n N-20 päätä, aminohappotähteet 1-19 todennäköisesti muodostavat signaalipeptidin, johtopäätös, jota tukevat peptidin pituus ja hydrofobinen luonne. Aminohapot 20-361 ja 362-713 muodostavat kaksi 342 ja 352 aminohapon homologista aluetta. Mahdolliset N-sidokseen liittyvät glykosylaatiokohdat 25 sijaitsevat asemissa 38 ja 135 N-terminaalisella alueella ja asemassa 515 C-terminaalisella alueella. Lopuksi uskotaan, että aminohapot 714-738, pääasiallisesti varauksettomia tai hydrofobisia tähteitä sisältävä alue, kiinnittää p97:n solukalvoon (Davis et ai., J. Moll. Biol. 181 (1985) 30 111-121) ja saattaa ulottua sytoplasmaan.

p97:n aluerakennetta tukevat hajotuskokeet proteaa-silla. p97:n hajotus trypsiinillä, papaiinilla (Brown et ai., J. Immunol. 127 (1981) 539-546) tai trombiinilla tuotti glykosyloidun, antigeenisen fragmentin, jonka mole-35 kyylipaino on noin 40 000 daltonia. Fragmentti puhdistet- so 94836 tiin p97:n trombiinilla hajotetusta seoksesta, joka p97 oli leimattu metabolisesti 35S-metioniinilla tai 3Skysteii-nillä, ja sekvensointiin kuvatulla tavalla (Brown et ai., Nature, Lontoo, 296 (1982) 171-713). Kysteiinitähteet 5 identifioitiin asemissa 7 ja 17 ja metioniinitähteet asemissa 2 ja 20. Identtiset tulokset saatiin koskemattomalla p97:llä ja saadut tulokset ovat täydellisesti sopusoinnussa cDNA-sekvenssistä ennustetun p97:n N-terminaalisen sekvenssin kanssa. Tehdään johtopäätös, että molekyylipainol-10 taan 40 000 daltonia oleva, proteaasiresistentti fragmentti vastaa p97:n N-terminaalista aluetta. Emme ole pystyneet eristämään p97:n C-terminaalista aluetta, mahdollisesti siksi, että se on herkkä proteaasille.

6.6.2 p97:n homologia transferriinin kanssa 15 Protein Identification Resource -laitoksen (Release 5.0; Dayhoff et ai., Nature, Lontoo, 290 (1981) 8) amino-happosekvenssikirjaston haku osoitti, että p97 on huomiotaherättävän homologinen kolmen transferriinisuurperheen jäsenen kanssa, nimittäin ihmisen seerumin transferriinin, 20 ihmisen laktotransferriinin ja kananpojan transferriinin kanssa (37 - 39 %:n homologia, katso kuvio 4). Koska ihmisen ja kananpojan transferriini ovat 50 %:sti homologisia toistensa kanssa, p97:n on täytynyt erota ihmisen seerumin transferriinistä yli 300 miljoonaa vuotta sitten. p97:ssä 25 on 14 kysteiinitähdettä, jotka sijaitsevat homologisilla asemissa jokaisella alueella. Ihmisen transferriini sisältää kaikki nämä kysteiinit homologisissa asemissa molemmilla alueilla, kun taas ihmisen laktotransferriinistä ja kananpojan transferriinistä puuttuu vain kaksi näistä kys-30 teiinitähteistä (niiden C-terminaaliselta alueilta). Toisin kuin p97 nämä proteiinit sisältävät C-terminaalisilla alueillaan lisäksi 4-7 kysteiiniä, joilla ei ole vastaavaa jäsentä N-terminaalisella alueella. Ihmisen transferriini sisältää myös 2 ylimääräistä sen N-terminaaliselle alueel-35 le ainoalaatuista kysteiiniä. Asemat, joissa useimmat di- 5i 94836 sulfidit esiintyvät ihmisen seerumin transferriinissä, laktotransferriinissä ja kananpojan transferriinissä on määritetty suoraan (McGillivray et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 79 (1981) 2504-2508, MetzBoutique et ai., Eur. J.

5 Biochem. 145 (1984) 659-676, Mazurier et ai., Experientia (Basel) 39 (1983) 135-141, MacGillivray et ai., J. Biol.

Chem. 258 (1983) 3543-3553, Williams et ai., Eur. J. Biochem. 122 (1982) 297-303, Williams et ai., Biochem. J. 141 (1974) 745-752). Siten p97:n jokaisella alueella voidaan 10 ennustaa olevan 7 disulfidisidosta (katso kuvio 5).

Aminohappohomologia p97:n alueiden välillä (46 % -saatu lisäämällä 9 tähteen 7 aukkoa) on silmäänpistävämpi kuin ihmisen transferriinissä (43 % 16 aukkoa, 45 tähdettä) tai kananpojan transferriinissä (35 % 12 aukkoa, 49 15 tähdettä) havaittu aminohappohomologia. Laajan p97:n ja transferriinin välisen sekvenssihomologian ja kysteiinien säilyttämiseen perustuvaan, näennäisesti samanlaisten yh-teenpuristumismallien perusteella uskomme, että jos transferriinin tämänhetkinen erottuvuudeltaan huono X-sädera-20 kenne (Gorinsky et ai., Nature, Lontoo, 282 (1979) 157- 158) voidaan tehdä hienommaksi, saattaa olla mahdollista päätellä p97:n kolmiulotteinen rakenne.

6.6.3 p97:n funktio p97:n kuuluminen transferriinisuurperheeseen, sen 25 kyky sitoa rautaa (Brown et ai., Nature, Lontoo, 296 (1982) 171-173) ja sen yhteinen kromosomaalinen sijainti transferriinin ja transferriinireseptorin kanssa (Plowman et ai., Nature, Lontoo, 303 (1983) 70-72, Yang et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 2752-2756) tukevat 30 kaikki sen roolia raudan kuljetuksessa. Transferriinin rautaa sitovan taskun on ajateltu sisältävän 2-3 tyrosii-nia, 1-2 histidiinia ja yhden bikarbonaattia sitovan argi-niinin (Metz-Boutique et ai., Eur. J. Biochem. 145 (1984) 659-676). Näiden aminohappojen säilyminen p97:ssä tukee 35 sen ehdotettua roolia rauta-aineenvaihdunnassa (katso ku- 52 94836 vio 4). Koska p97 on kalvoon sidottu, transferriininkal-täinen molekyyli eikä se ole homologinen transferriinire-septorin kanssa (Schneider et ai., Nature, Lontoo, 311 (1984) 675-678), sen rooli solun rauta-aineenvaihdunnassa 5 saattaa erota kiertävän seerumin transferriinin ja solun trasferriinireseptorin roolista. Kloonatun p97:n cDNA:n ekspressointi eukaryottisoluissa sallii sen funktionaalisten ominaisuuksien testaamisen.

6.6.4 Johtopäätös 10 Näiden tietojen perusteella on selvää, että mela noomaan liittyvän p97:n cDNA-muodostelmat on onnistettu saamaan ja että niitä voidaan tehokkaasti ekspressoida imettäväissoluissa antigeenisen p97:n tuottamiseksi suuria määriä.

15 7. Kloonatun p97:n ekspressointi ja rokotteen tes taus Nämä yksityiskohtaiset kokeet kuvaavat kloonatun p97-proteiinin ekspressointia ja sen rokotetestausta. p97-proteiinin ekspressointi eritettävässä muodossa (transfek-20 toidun hiiren solukloonin B16svp97a.l4 avulla) mahdollisti täyspitkän p97-proteiinin puhdistamisen milligrammamääris-sä. Puhdistetussa muodossa olevaa proteiinia käytettiin sellulaarisen immuniteetin indusoinnin in vitro -testaukseen ja testattaessa sen mahdollisuuksia eristetyistä kom-25 ponenteista valmistettuna rokotteena. p97-geenin tuote ekspressoitiin myös etäispesäkkeitä lähettävien hiiren melanoomasolujen solupinnalla, jolloin käyttöön saatiin malli rokotteiden tehokkuuden testaamiseksi kasvaimen kasvun estämiseksi syngeenisessä systeemissä.

30 p97-geeni lisättiin elävään rokoteyhdistelmäviruk- seen käytettäväksi rokoteformulaationa, joka pystyy muodostamaan tehokkaan sellulaarisen immuniteetin. Yhdistel-märokoteviruksen Vp97a-NY kyky muodostaa immuniteetti hiirissä arvioitiin käyttämällä useita määritysmenetelmiä 35 humoraalisen ja sellulaarisen immuniteetin osoittamiseksi.

53 94836 Käyttämällä ylläkuvattua syngeenistä hiiren kasvainmallia, Vp97a-NY-yhdistelmävirusrokotteen osoitettiin antavan suo-jaavan vaikutuksen kasvainsolualtistuksessa. Rokotteella oli myös hoitovaikutus hiirissä, joilla oli kasvavia keuh-5 koetäispesäkkeitä, ominaisuus, joka on analoginen rokotteen ehdotetun käytön kanssa muodostamaan immunoterapeut-tista kasvaimenvastaista vastetta melanoomapotilaissa, joilla jo on kasvaimia.

Hiiritutkimusten lisäksi, kun on vain 91 %:n homo-10 logia ihmisen p97:n ja hiiren homologisen proteiinin välillä (tähän mennessä tutkittujen alueiden kohdalla), Vp97a-NY-rokote on testattu myös apinoissa. Ihmisen p97:n ja proteiinin apinassa esiintyvän muodon välillä on paljon läheisempi homologia (pääteltynä ristireaktiivisuudesta 15 monoklonaalisten vasta-aineiden tasolla). Sen johdosta, että mahdollisesti on vaikeaa kehittää immuunivaste "omaa" proteiinia vastaan, läheistä sukua olevaa Macaque-apinaa käytettiin Vp97a-NY-rokotteen immunigeenisyyden testauksessa. Yhdistelmärokotevirus testattiin apinoissa ja sen 20 osoitettiin indusoivan humoraalista immuniteettiä p97-pro-teiinia vastaan. Tähän mennessä apinat eivät ole osoittaneet havaittavia oireita vahingollisista sivuvaikutuksista rokotteelle altistettaessa saatuaan kaksi rokotusta eläviä viruksia sisältävällä yhdistelmärokoteviruksella kuuden 25 viikon aikana.

7.1 Plasmidin ekspressio SV-40:n varhaisen promoottorin sv2 ohjaama ekspres-sioplasmidi muodostettiin cDNA-plasmidikloonista p97a, joka on samanlainen kuin plasmidi p97b paitsi, että koko 30 3'UT-alue on käytössä (kuvio 6). Kaikki cDNA-kloonit eristettiin alunperin lambda-gtlO -kirjastoista synteettisten EcoRI-dG (9-17) -kytkijöiden avulla aikaisemmin kuvatulla tavalla. Insertit katkaistiin EcoRI:llä ja subkloonattiin pEMBL18+ -plasmidiin myöhempää lisääntymistä ja karakter-35 sointia varten. Klooni lOal subkloonattiin M13mpl8:aan ja 54 94836 RF-muoto hajotettiin BamHI:llä ja Sghrllä, käsiteltiin lyhyesti eksonukleaasi III:11a, tehtiin tylppäpäiseksi Sl-nukleaasilla, käsiteltiin K1enow-fragmentilla ja liitettiin uudelleen. Useita plakkeja eristettiin ja sekven-5 soitiin, joista plakeista yksi oli poistanut dG-hännän ja säilyttänyt 33 ep sisältävän p97:n 5'-pään ei luettavan alueen, joka on lisätty M13mpl8:n HindiII-kohtaan. Tämän alakloonin (lOala) RF:ää käytettiin ehjän p97:n cDNA:n muodostamiseen; muuten kaikki fragmentit eristettiin plas-10 midialaklooneista. 10ala:n 550 ep:n HindiII-PvuII-frag mentti ja ljl:n 735 ep:n PvuII-Sali-fragmentti eristettiin LMP-agaroosigeeleistä ja liitettiin pEMBL18+ -plasmidiin Sali- ja HindiII-kohtiin, jolloin saatiin p5'p97.

pEMBL18+-plasmidin genominen klooni E7.7 hajotettiin täy-15 dellisesti EcoRI:llä ja hajotettiin osittain SstI:llä ja 4,5 ke:n fragmentti eristettiin fraktioimalla 0,8 % LMP-agaroosin avulla. Tämä 4,5 ke:n suuruinen 3'-fragmentti liitettiin 2fl:n 404 ep:n SstI-fragmenttiin ja ljl:n 535 ep:n BamHI-SstI-fragmenttiin pEMBL18+-plamidiin Sali- ja 20 EcoRI-koht iin, jolloin saatiin p3'p97. Sitten p5'p97:n 1285 ep:n suuruinen Hindlll-Sali-fragmentti liitettiin p3'p97:ään, jolloin saatiin pp97a. Tämän kloonin EcoRI-osittainen Hindlll-fragmentti lisättiin pSV2neo-plasmidiin (Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet. 1 (1982) 327-341) ' 25 Hindlll- ja EcoRI-kohtiin. jolloin neomysiiniä koodittava alue ja SV40-splice/polyA-sekvenssit eliminoituvat, samalla kun SV40:n varhainen promoottori ja 72 ep:n suuruinen tehostin, 33 ep:n suuruinen p97-5'UTR, p97:ää koodittava alue kokonaan, 3'UTR ja 1,4 ke:n suuruinen 3'-päätä reu-30 nustava DNA jäävät jäljelle. Saatu plasmidi nimettiin pSVp97a:ksi.

Sv2:n ohjaama plasmidi transfektoitiin kalsiumfos-faattisaostusmenetelmällä lukuisiin eukaryoottisolulinjoi-hin ja ekspressoivat solut kloonattiin ja valikoitiin 35 kanssatransfektoimalla dominoiva, valikoitava merkki. Tä- il < iti 4 liiti l i i Hl 55 94836 män suorittamiseksi kiinalaisen hamsterin (CHO) munasarja-soluja viljeltiin Hank's F1 -väliaineessa, joka sisälsi 5 % vasikan sikiön seerumia (FCS), 4 mmol/1 L-glutamiinia, 1,3 mmol/1 proliinia ja antibiootteja. B16-soluja viljel-5 tiin RPMI-väliaineessa, joka sisälsi 0,15 % bikarbonaat-tia, ja 1735-soluja DMEM-väliaineessa (Gibco), jotka molemmat täydennettiin 15 %:lla FCS:ää ja antibiooteilla.

Solut transfektoitiin käyttäen modifioitua kalsiumfosfaat-timenetelmää (Wigler, M. et. ai., Cell 14 (1978) 725-731) 10 sekä käyttäen 20 Mg:aa joko pSV2DHFR- tai pSV2neo-plasmi-dia, vastaavasti, levyä kohti. Kaikki plasmidit lineari-soitiin EcoRI-kohdassa. Pysyvät transfektantit valikoitiin käyttäen hypoksantiinia sisältämätöntä (HAT-) väliainetta CHOsoluille tai 0,5 μq/ml Genetisiiniä (G418, Gibco) B16-15 ja 1735-soluille. Eloonjääneet solut alkoivat muodostaa näkyviä pesäkkeitä 7 päivän kuluttua transfektiosta ja ne laitettiin lasihelmien avulla kiinnitetyille steriileille polyesterisuodattimille. Suodattimia pidettiin paikoillaan viisi päivää, jolloin solut saivat kasvaa polyesterimat-20 riisiin ja jolloin muodostui levyllä olevien pesäkkeiden kopio. Sitten suodattimet poistettiin ja niitä käytettiin elävän solun sitomismääritysmenetelmässä (live cell binding assay) jodilla leimattua, p97:ää vastaan muodostettua monoklonaalista vasta-ainetta käyttäen. Kymmentä milli-25 grammaa leimattua monoklonaalista vasta-ainetta inkuboi-tiin enintään 20 suodattimen kanssa 10 ml:ssa FCS:ää 4 ° C:ssa tunnin ajan. Suodattimet pestiin perusteellisesti fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), kuivattiin ja altistettiin XAR-5-filmille yli yön 30 -70 °C:ssa. Tämän jälkeen suodattimet värjättiin 7 % mety- leenisinisellä solupesäkkeiden visualisoimiseksi. Kaikissa käytetyissä solulinjoissa paitsi hiiren B16-solulinjassa ekspressoivat solut sisälsivät antigeenistä p97-proteiinia solupinnoillaan.

56 94836 B16:lla transfektoiduissa soluissa p97 vapautui väliaineeseen, mikä oli tälle solutyypille ominainen havainto. p97:n eritys mahdollisti täysipitkän p97-proteii-nin puhdistamisen solujen väliaineesta. Klooni B16SVp97a.

5 14 ekpressoi noin 4 μ9/ιη1 p97:ää käytettyyn väliaineeseen.

Yhdistelmä-p97:ää puhdistettiin suuria määriä p97-antigee-nia väliaineeseen tuottavasta transfektoidun B16SVp97a.14-kloonin käytetystä väliaineesta. Soluja ylläpidettiin lähes yhtenäisessä pitoisuudessa (near confluency, 109 solua) 10 850 cm2:n pyörivissä pulloissa lisäämällä jatkuvasti pieniä määriä tuoretta väliainetta. Ne jatkoivat antigeenin tuottamista ehymättä viikkoja, jolloin käytettyä väliainetta voitiin ottaa talteen jatkuvasti ja jäädyttää. p97:n puhdistus suoritetiin immunoaffiniteettikromatografisesti 15 Sepharose-geeliin kiinnitettyjä monoklonaalisen vasta-aineen 96.5 Fab-fragmentteja käyttäen. Tällöin kolme litraa käytettyä väliainetta ajettiin kolmen sarjaan kytketyn 30 ml:n pylvään läpi. Ensimmäinen sisälsi 15 ml Sephadex-G25 (superfine-laatu, Pharmacia) -geeliä, toinen sisälsi 20 ml 20 Sepharose 4b -geeliä (Pharmacia) ja kolmas sisälsi 8 ml syanogeenibromidilla aktivoitua Sepharose-geeliä (Sigma), johon oli konjugoitu monoklonaalisen vasta-aineen 96.5 Fabfragmentteja (10 mg proteiinia/ml Sepharosea). Tämän jälkeen affiniteettipylväs pestiin perusteellisesti kyl-25 mällä PBS:llä ja antigeeni eluoitiin 30 ml:11a 0,1 mol/1 sitraattia, pH 5, ja 30 m:lla 0,1 mol/1 sitraattia, pH 4. Näiden olosuhteiden ei havaittu muuttavan antigeenin immu-noreaktiivisuutta, mutta antigeenin eluoituminen monoklo-naalisesta vasta-aineesta 96.5 oli täydellinen. Kaksi 30 eluaattia neutraloitiin 3,0 ml:11a ja 4,5 ml:11a, vastaavasti, 2 mol/1 Trissä, pH 8. Puhdistettu eluaatti konsentroitiin Amicon-laitetta ja PM10-suodatinta käyttäen ja pestiin kahdella 10 ml:n tilavuudella PBS:ää, jolloin lopullinen saanto oli 4,95 mg 4,5 ml:ssa Bradfordin määri-35 tysmenetelmällä (Biorad) määritettynä. 15 μg:sta tuotetta 57 94836 ajettiin SDS-PAGE (kuvio 7) ja grammi värjättiin sekä Coo-massie Blue -väriaineella että hopeavärjäyksellä. Kaksois-determinantti-immunoanalyysi (DDIA) -määritys (Brown et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 539) vahvisti riip-5 pumattomasti puhdistetun proteiinin molaarisen määrän. Kontrollivalmisteet ajettiin samanaikaisesti B16-kantaso-lulinjan käytetystä väliaineesta, eikä siinä havaittu proteiinia. Myöhemmässä valmistusvaiheessa 30 mg 95 %:sti puhdasta p97-proteiinia saatiin puhdistetuksi käyttäen 300 10 mg monoklonaalisen vasta-aineen 96.5 Fab-fragmentteja, jotka oli konjugoitu Sepharoseen. Puhdistettu p97-proteii-ni oli immunogeeninen ja aiheutti voimakkaan vasta-aine-vasteen hiirissä, jotka oli immunisoitu alla olevassa kohdassa 7.3 kuvatulla proteiinilla.

15 7.2 Yhdistelmä-p79-rokoteviruksen muodostaminen ja ekspressointi p97:ää koodittava alue lisättiin katkaisemalla p97a Hindlll:11a. tylpistämällä päät ja liittämällä se rokote-insertiovektoriin pGS-20 (Mackett et ai., J. Virol. 49 20 (1984) 857-864), joka oli aukaistu Smal-kohdasta♦ PGS-20- vektori käyttää 7.5 K -promoottoria ja sisältää reunustavat rokotteen tymidiinikinaasi (TK) -geenin sekvenssit. Yhdistelmävirus muodostettiin yllä mainituilla Mackett et al.:n menetelmällä ja Vp97a-NY, joka saa infektoidut solut 25 ekspressoimaan oikeankokoista ja glykosyloinniltaan oikeaa p97-proteiinia (kuvio 8), eristettiin. p97:n ekspressoitu-minen solun pinnalla vahvistettiin myös soluissa, jotka oli infektoitu yhdistelmä-p97-viruksella (taulukko I) alla.

58 94836

Taulukko I

p97:n ekspressiointi transfektoitulen hiiren solujen sekä yhdistelmärokoteviruksella infektoitujen 5 solujen1 pinnalla

Ekspressoidut

Solujen infektointiin p97-molekyylit Solutyyppi__käytetty virus__solua kohti_ M2SVp97a.A Ei virusta 3 210 000 10 M2svp97a.E/F2 Ei virusta 434 000 M2-kantasolu Ei virusta 2 000- BSC Ei virusta 5 590 BSC Vwt-NY-rokotevirus 5 220 BSC Vp97a-NY-rokotevirus 1 140 000 15 'Solut käsiteltiin lyhyesti trypsiinillä, pestiin ja jaettiin putkiin, jotka sisälsivät 103:sta 104-10s:een solua. Ekspressoimattomia kantajasoluja lisättiin putkiin, jotka sisälsivät pienemmät määrät soluja siten, että solujen 20 kokonaismäärä putkea kohti oli 105 solua. 1 x 106 cmp:ää jodilla leimattua monoklonaalista vasta-ainetta 96.5 (123 ng) inkuboitiin kokonaistilavuudessa 50 μΐ solujen kanssa 60 minuutin ajan jäiden päällä. Solut pestiin ja sentrifu-goitiin 4 kertaa liuoksessa, joka sisälsi PBS:ää ja 10 % ' 25 vasikan sikiön seerumia, jonka jälkeen solut suspendoitiin uudelleen ja laskettiin Micromedic 4/600plus -gammalaski-jassa.

7.3 Yhdistelmä-p97-rokotevirus on immunogeeninen hiirissä 30 Hiirien rokotus Vp97a-NY:llä tuotti voimakkaan hu- moraalisen vasta-ainevasteen. Hiiret immunisoitiin kerran, saivat booster-annoksen neljän viikon kuluttua ja niiden veri otettiin talteen viiden viikon kuluttua. Tiitterit määritettiin ELISA:11a käyttäen antigeenillä päällystet-35 tyjä levyjä ja toteamisreagenssina piparjuuriperoksidaa- 59 94836 silla konjugoitua Proteiinia Aita. Tulostiedot muutettiin vastaamaan monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuutta vertaamalla niitä ELISA-sitoutumisen vakiokäyrään, joka oli saatu käyttämällä p97:ää vastaan muodostettua monoklonaa-5 lista vasta-ainetta 133.2. Tulokset osoittivat, että seerumin vasta-aineet indusoituivat voimakkaasti (kuvio 9) . Sellulaarinen immuniteetti todettiin käyttämällä in vitro -lisääntymismääritystä, jossa käytettiin puhdistettua p97-proteiinia stimuloivana antigeeninä (taulukko II).

10

Taulukko II

Hiiren pernasolujen1 2 3 proliferaatiomääritys vp97-rekombinant- 15 ti-immuunien per- Kontrolliper- nasolujen proli- nasolujen pro-

Stimuloiva feratiivinen in- 1iteratiivinen antigeeni__deksi__indeksi_

Con A (io Mg/ml) 71 50 p97-proteiini 20 (3 Mg/ml) 27 2 (10 Mg/ml) 43 2 (20 Mg/ml) 56 2 (50 Mg/ml) 44 3 UV-inaktivoitu 25 rokotevirus (10 pfu/ml) 91 2 p97:llä transfek-toidut säteilyte-tyt, syngeeniset kasvainsolut (104) 86 2 30 .

Säteilytetyt kan- takasvainsolut (104) 3 1 35

Pernasolut eristettiin hiiristä, jotka oli rokotettu hän- 2 nänkatkaisumenetelmäl]ä 107 pfu:ta Vp97a-NY -yhdistelmävi- 3 ruksia käyttäen, jotka saivat samansuuruisen booster-an- 60 94836 noksen kuukauden kuluttua ja jotka tapettiin viikkoa myöhemmin. Natiiveja pernasoluja käytettiin kontrollisoluina tässä kokeessa. 105 solua kuoppaa kohti viljeltiin 96-kuop-paisilla, pyöreäpohjaisilla levyillä 0,22 ml:ssa RPMI-vä-liainetta, jota oli täydennetty 0,5 %:lla normaalia hiiren 5 seerumia, penisilliinillä/streptomysiinillä, glutamiinil-la, bikarbonaatilla ja 2,5 x 105 mol/1 2-merkaptoetanolilia. Viljelmät pulssileimattiin radioaktiivisiksi kuuden tunnin ajan neljänä päivänä aktiivisuudella 25 μΟΙ/^ορρβ tritioitua tymidiiniä (New England Nuclear), otettiin tallo teen PHD-solunkerääjällä ja laskettiin Optifluor'ia käyttäen Beckman LS 3801 -laskijalla. Proliferatiiviset indeksit laskettiin jakamalla jokaisella antigeenillä stimuloitujen neljän rinnakkaiskuopan cmp-lukemien keskiarvot kontrollin (väliaine) cpm-lukemin keskiarvolla.

15 Taulukossa II esitetyt tulokset osoittavat, että T-solut lisääntyvät vasteena p97-proteiiniantigeenille.

Jotta saataisiin selville, stimuloiko immunisoitujen hiirien pernasoluissa oleva yhdistelmävirus myös aut-tajasoluja, solut stimuloitiin in vitro ja supernatanteis-20 ta määritettiin interleukiini-2 (IL-2), auttaja-T-solu -tekijä. Pernasoluja, jotka oli saatu aikaisemmin kahdesti yhdistelmä-Vp97a-NY -rokotteella tai kantarokotteella immunisoiduista hiiristä, viljeltiin. 105 solua inkuboitiin 48 tunnin ajan 0,2 ml:ssa proliferaatiomäärityksissä käy-25 tettyä väliainetta 96-kuoppaisillä, pyöreäpohjaisilla levyillä stimuloivan antigeenin kanssa tai ilman sitä. Su-pernatantit otettiin talteen, neljän kuopan supernatantit yhdistettiin ja jäädytettiin ennen IL-2-määritystä, IL-2-määrityksessä käytettiin 104 aikaisemmin IL-2:ta sisältä-30 mättömiä hiiren T-solulinjan CTLL soluja, joita inkuboitiin jokaisessa kuopassa Click's Medium -väliaineella laimennettujen määritysmenetelmän supernatanttien eri laimennosten kanssa triplikaatteina. Vakiokäyrä muodostettiin käyttämällä Genentech-yhtiöstä, CA, saatua yhdistelmä-IL- ei 94836 2:ta. CTLL-solut leimattiin radioaktiivisella tymidiinillä tavallisen proliferaatiomääritysmenetelmän mukaisesti 24 tunnin inkubointiajän kuuden viimeisen tunnin aikana, jonka jälkeen ne otettiin talteen ja laskettiin, kuten proli-5 feraatiomääritysmenetelmissä on kuvattu. Taulukossa III esitetyt tulokset osoittavat, että p97 stimuloi in vitro yhdistelmä-p97:llä immunisoitujen hiirien pernasolujen IL-2-tuotanto.

Taulukko III

10 p97:lle immuunien pernasolujen aiheuttama IL-2-tuotannon stimuloituminen

Rokotukseen käy- Yksikköä tuotet- tetty immunogeeni In vitro -ärsyke tua IL-2:ta_ 15 Vp97a-NY p97-proteiini 4,4 (20 μ9/πι1)

Vp97a-Ny Väliaine 0,25

Vwt-NY p97-proteiini 0,25 * (20 μq/ml)

Vwt-NY Väliaine 0,25 20 Edelleen mitattiin viivästyneen yliherkkyyden vaste käyttäen jalan polkuanturan turpoamismenetelmää (foot-pad swelling assay) Vp97a-NY:llä rokotetuilla hiirillä. Viiden hiiren (C3H/Hen-kanta) ryhmä rokotettiin hännänkatkaisu-menetelmää ja yhdistelmä- tai kantarokotevirusta käyttäen.

25 Kuuden päivän kuluttua jokaisen hiiren takakäpälät altistettiin rokottamalla niihin 20 μΐ PBSrää tai 20 μΐ soluja PBS:ssä (5 x 105 solua hiirtä kohti). Jalan polkuanturat mitattiin 24 tunnin kuluttua kaksoissokkomenetelmällä Fow-ler-mikrometriä käyttäen. PBS:llä injektoidun jalan polku- 30 anturan paksuus vähennettiin koejalasta mitatusta paksuudesta jokaisella hiirellä ja jalan polkuanturan turpoamisen lisääntymisen keksiarvot samoin kuin standardipoikkea-mat laskettiin. Taulukossa IV esitetyt tulokset osoittavat p97-spesifisen viivästyneen yliherkkyyden vasteen indusoi- 62 94836 tuneen yhdistelmä-p97-rokoteviruksella immunisoiduissa hiirissä.

Taulukko IV

5 Antigeenispesifinen jalan polkuanturan turpoaminen p97:llä immunisoiduissa hiirissä

Rokotuksessa Jalan polkuantu- käytetty Altistukseen käy- ran turpoaminen immunogeeni tetty antigeeni__(mm x 10'2)_ 10 Vp97a-NY p97:llä transfek- 40,3 (± 6,8) toidut syngeeniset kasvainsolut

Vp97a-NY syngeeniset kanta- 3,0 (± 2,8) kasvainsolut

Vwt-NY p97:llä transfek- 1,5 (± 2,3) toidut sygeeniset 15 kasvainsolut

Vwt-NY syngeeniset kanta- 5,5 (± 5,0) kasvainsolut 7.4 Suojaus ja hoito p97-rokoteviruksella jyrsijöi-20 den kasvainmallissa

Rokotuksen tehokkuuden määrittämiseksi hiiret rokotettiin eri rokotusprotokollia ja keksinnön mukaisesti valmsitettua yhdistelmä-p97-rokotevirusta käyttäen, jonka jälkeen ne altistettiin p97:llä transfektoidulla syngeeni-, 25 sellä kasvainsolulla (M2SVp97a.2E). Tällöin hiiret immuni soitiin elävällä Vp97a-NY -yhdistelmärokoteviruksella tai kantaviruksella (Vwt-NY) hännänkatkaisumenetelmää käyttäen tai 100 Mg:11a puhdistettua p97-proteiinia tai 5 x 106 sä-teilytetyillä M2-K1735 -kasvainsoluilla Complete Freund's 30 adjuvant -adjuvantilla vatsaonteloon annettuna. Suonensisäinen kasvainsolualtistus tehtiin kaksi viikkoa sen jälkeen, kun hiiret olivat saaneet viimeisen injektion M2SVp97a.2E:tä, etäispesäkkeitä muodostavaa kasvainkloo-nia, joka valmistettiin M2-K1735:stä (hiiren melanoomamal-35 li) transfektoimalla kasvainsolut SV40:n varhaisen promoottorin ohjaaman ekspressioplasmidin sisältämällä ihmi- 63 94836 sen p97:ää koodittavalla sekvenssillä. Useita ekspressoi-via klooneja valikoitiin ja kasvainaltistuksessa käytetty klooni M2SVp97a.2E ekspressoi keskisuuren määrän p97:ää, noin 400 000 molekyyliä solua kohti eli yhtä paljon kuin 5 ihmisen melanooman p97-antigeeniä ekspressoidaan. Käytettiin kahta suonensisäistä kasvainaltistusta 5 x 105 tai 1 x 105 solulla, jotka injektoitiin syngeenisten C3H/Hen-hii-rien hännän suoneen. Hiiret tapettiin 16 päivän kuluttua kasvainaltistuksesta ja keuhkot poistettiin. Hiiri arvioi-10 tiin positiiviseksi, jos India ink -väriaineella värjätyissä keuhkoissa esiintyi paljaalla silmällä erottuvia kasvaimia. Tulokset on esitetty taulukossa V.

Taulukko V 15

Rokotettujen hiirien altistus syngeenisillä, p97:llä transfektoiduilla melanoomasoluilla

Selviä keuhko-Altistuk- etäisipesäk-

Immuni- sessa käy- keitä saaneiden sointien tetty solu- hiirien luku- rokote__lukumäärä annos__määrä_

Vp97a-NY 2 5 X 105 1/5

Vp87a-NY 1 5 X 105 2/4 Säteilytetyt 2 5 x 105 0/4 25 syngeeniset melanooma-solut

Vwt-NY 2 5 X 10s 9/10 p97-proteii- 2 5 x 105 3/3 ni 3° Vp97a-NY 1 x 10s 0/1

Vp97a-NY 1 1 x 10s 0/4 Käsittelemä- 0 1 x 105 5/6 tön 35 Taulukossa V esitetyt tulokset osoittavat, että kahdella Vp97a.NY-immunisaatiolla oli huomattava suojaava 64 94836 vaikutus, vaikkakaan puhdistettua p97:ää sisältävällä rokotteella ei havaittu suojaavaa vaikutusta (erittäin korkeista vasta-ainetiittereistä huolimatta). Yhdistelmävi-ruksen suojaava kasvainimmuniteetti saattaa johtua sen kyvystä nostaa sellulaarista immuniteettiä.

5 Hoitokokeessa hiiret rokotettiin matalalla annok sella p97:ää ekspressoivia kasvainsoluja, jonka jälkeen ne kahden päivän kuluttua rokotettiin yhdistelmävirusrokot-teella. Hiiret altistettiin 105 tai 104 p97:ää ekspressoi-valla kasvainsolulla (M2SVp97a.E) suoneen annettuna. Kaksi 10 päivää myöhemmin hiiret rokotettiin hännän katkaisumene-telmää käyttäen joko Vp97a-NY:llä tai Vwt-NY:llä. Viikottaisia rokotuksia hännänkatkaisumenetelmää käyttäen toistettiin ja hiiren eloonjääminen pantiin muistiin. Kuviossa 10 esitetyt tulokset osoittavat yhdistelmä-p97-rokotevi-15 ruksella rokotuksella olevan terapeuttinen vaikutus hiiriin, joilla on keuhkoetäispesäkkeitä.

7.5 Yhdistelmä-p97-rokotevirus on immunogeeninen Macaque-apinoissa

Kahta Macaca Fasicularis (macaque) -apinaa naarmu-20 tettiin joko 2 x 108 plakkia muodostavalla yksiköllä (pfu) Vp97a-NY -yhdistelmärokotetta tai samalla annoksella kan-tarokotetta. Kahden viikon kuluttua seerumien rokote- ja p97-tiitterit testattiin ELISA:11a. Taulukossa VI esitetyt tulokset osoittavat, että p97:ää vastaan muodostuneita 25 humoraalisia vasta-aineita voitiin todeta kahden viikon kuluttua yhden ainoan Vp97a-NY-rokotuksen jälkeen.

65 94836

Taulukko VI

Seerumin vasta-ainetiitterit rokotteella injektoiduissa hiirissä 5 Anti-p97-tiitte-

Anti-rokotetiit- ri (/xg/ml mono-teri (seerumi- klonaalisen vas-Immunogeeni/ laimennos kahdes- ta-aineen ekvi- viikko__ti O-seerumilla) valenttia_

Vp97a-NY/viikko 0 1/20 0,54 10 Vp97a-NY/viikko 2 1/2000 6,54

Vwt-NY/viikko 0 1/20 0,50

Vwt-NY/viikko 2 1/2000 0,34 8. Mikro-organismien talletus 15 Seuraava E. coli -kanta, joka kantaa mainittua plasmidia, on talletettu ATCC-talletuslaitokseen, Rockville, MD, ja sille on annettu seuraava talletusnumero: E. coli -kannat_Plasmidi_Talletusnumero E. coli HB101 p97b 53 403 20 Seuraava yhdistelmärokotevirus on talletettu ATCC- talletuslaitokseen, Rockville, MD, ja sille on annettu seuraava talletusnumero:

Virus_Talletusnumero

Vp97a-NY VR 2159 25 Seuraavat solulinjat, jotka kantavat mainittuja plasmideja, on talletettu ATCC-talletuslaitokseen, Rockville, MD, ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot:

Solulinia Plasmidi_Talletusnumero TKMp97-12 PMTp97b CRL 8985 30 (hiiren solu) P16SVp97a.14 pSVp97a CRL 9304 (hiiren melanoomasolu)

Talletettujen mikro-organismien ja solujen ei ole tarkoitettu rajoittavan tämän keksinnön piiriä, sillä tal-35 letettu suoritusmuoto on tarkoitettu vain yhden keksinnön 66 94836 puolen valaisemiseksi ja mitkä tahansa mikroorganismit tai solut, jotka ovat toiminnallisesti vastaavia, kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Itse asiassa tässä esitettyjen ja kuvattujen modifikaatioiden lisäksi monet keksinnön modi-5 fikaatiot selviävät alan asiantuntijoille edellä olevasta kuvauksesta ja mukana olevista kuvista. Näiden modifikaatioiden on tarkoitettu kuuluvan liitteenä olevien vaatimusten piiriin.

Pidetään myös ymmärrettynä, että kaikki nukleoti-10 dien exnäsparien koot ovat suummittaisia ja niitä on käytetty kuvaustarkoituksessa.

il . uu.t miu lii*·

Claims (21)

67 94836 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä sellaisen antigeenisen peptidin tai proteiinin valmistamiseksi, joka on melanoomaan liittyvän 5 p97-antigeenin sukulaispeptidi tai -proteiini ja jolla on kuviossa 3 esitetyn aminohapporyhmien 20-738 muodostama aminohapposekvenssi, tunnettu siitä, että viljellään bakteeri- tai eläinsolu, joka sisältää antigeenistä peptidiä tai proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin 10 toisen geeniekspressiota säätelevän nukleotidisekvenssin kontrollin alaisena siten, että viljelty bakteeri- tai eläinsolu ekspressoi mainitun peptidin tai proteiinin, ja antigeeninen peptidi tai proteiini otetaan talteen viljelmästä .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelty solu on bakteeri.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. coli, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla 20 53403.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelty solu on eläinsolu-linja.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että eläinsolulinja on hiirisolu-linja TKMp97-12, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla CRL 8985.

6. Menetelmä yhdistelmäviruksen valmistamiseksi, joka virus ohjaa melanoomaan liittyvän p97-antigeenin an- 30 tigeenisen sukulaispeptidin tai -proteiinin ekspressiota yhdistelmäviruksella infektoidussa bakteeri- tai eläinso-lussa, tunnettu siitä, että (a) bakteeri- tai eläinsolu infektoidaan yhdistelmäviruksella, jonka genomi sisältää melanoomaan liittyvän p97- 35 antigeenin antigeenistä sukulaispeptidiä tai -proteiinia ββ 94836 koodaavaan nukleotidisekvenssin, jolla on kuviossa 3 esitetty nukleotidisekvenssi, ja joka on toisen geeniekspres-siota säätelevän nukleotidisekvenssin kontrollin alaisena, ja 5 (b) yhdistelmävirusta tuotetaan saattamalla infektoitu so lu lisääntymään.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on vaipallinen virus.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että virus on vaccinia-virus.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on paljas virus.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on adenovirus.

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on bakulovirus.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on nukleaarinen poly-hedroosivirus.

13. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus on bakteriofaagi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteriofaagi on lambda-faa-gi.

15. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu sii tä, että se sisältää p97b:n, jolla on kuviossa 2 esitetty rakenne.

16. Escherichia coli, joka on talletettu talletus-laitokseen ATCC talletusnumerolla 53403.

17. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu sii tä, että se sisältää pMTp97b:n, joka on sisällytetty talletettuun solulinjaan CRL 8985.

18. Solulinja TKMp97-i2, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla CRL 8985. 69 94836

19. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se sisältää pSVp97a:n, jolla on kuviossa 6 esitetty rakenne.

20. Solulinja B16SVp97a.14, joka on talletettu tal-5 letuslaitokseen ATCC talletusnumerolla CRL 9304.

21. Virus Vp97a-NY, joka on talletettu talletus-laitokseen ATCC talletusnumerolla VR 2159. 70 94836