JPH08280390A - 黒色腫関連抗原をコードする組換え体ｄｎａベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 黒色腫関連抗原をコードする組換え体ＤＮＡ
ベクターを提供すること。 【解決手段】 ＡＴＣＣに寄託され、受託番号５３４０
３号を指定された大腸菌(Escherichia coli)に含まれる
プラスミドｐ９７ｂからなる組換え体ＤＮＡベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

(1)発明の分野 本発明は予防接種した個体中に黒色腫細胞を選択的に破
壊する免疫応答を生ずることができるワクチン配合物を
指向する。従って、黒色腫関連抗原に関連するペプチド
またはタンパク質は組換えＤＮＡ技術および（または）
化学合成法により多量に製造される。本発明のペプチド
またはタンパク質はワクチン配合物中の免疫原として使
用できる。一定態様において、黒色腫関連抗原に関連す
るペプチドまたはタンパク質は組換え体ウイルスにより
発現され、組換え体ウイルス自体はワクチン配合物中に
免疫原として使用できる。本発明はまた、黒色腫関連抗
原に関連するペプチドまたはタンパク質を多量に生成で
きる組換え体ＤＮＡ技術並びに化学合成法の使用を含む
方法を備えている。本発明はｐ９７に関連する免疫原ペ
プチドとして、黒色腫細胞の細胞表面成分である９7,０
００ドルトンより多少低い見掛け分子量を有する単量体
黒色腫細胞表面シアロ糖タンパク質を使用する例により
例示される。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】

（2)発明の背景 （2.1)腫瘍関連抗原 実験動物、特に齧歯動物、を用いた研究は腫瘍ウイルス
により誘発された腫瘍の大部分がウイルスのゲノムによ
りコードされた抗原を発現すること、およびこれらの抗
原による免疫処置が同様のウイルスにより誘発された腫
瘍細胞のその後の攻撃の拒絶を生ずることができること
を示した。この研究の多くがウイルスの研究室株、例え
ばＳＶ４０、ポリオーマウイルス、およびフレンド、モ
ロニーまたはラウシャーマウス白血病ウイルスでなされ
たけれども、事実上腫瘍ウイルスの水平および垂直伝播
が示され、事実ウイルス誘発ネコ白血病および肉腫に対
する市販ワクチンが現在入手できる。

【０００３】対照的に、大部分のヒト癌腫のウイルス病
因は実証されなかった。顕著な例外は肝炎ウイルス（肝
癌）、ヘルペス単純ウイルス（頸部癌）、およびエプス
イタインバーウイルス（鼻咽頭癌）である。しかし、過
去２０年の間に若干のヒト腫瘍細胞が腫瘍抗原、すなわ
ち腫瘍細胞をその正常細胞等価物と識別する抗原、を発
現することが証明され、若干の患者はこれらの抗原に対
して細胞媒介または体液免疫応答を備える〔ヘルストロ
ム (Hellstrom)ほか、１９６８、ネーチャ（Nature) 、
２２０：１３５２；モートン (Morton) ほか、１９６
８、サイエンス (Science)、１６２；１２７９〜１２８
１；シク (Shiku)ほか、１９７６、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・バイオロジー (J. Exp. Med.) １
４４：８７３〜８８１〕。これらの免疫応答の標的の若
干はヒトゲノムによりコードされたオンコフェタル (on
cofetal)または分化抗原である〔ヘルストロム (Hellst
rom)ほか、１９７０、インタナショナル・ジャーナル・
オブ・カンサー (Int. J. Cancer) 、６：３４６〜３５
１〕。最近まで、腫瘍抗原の分子性質が未知であり、免
疫反応の腫瘍特異性の程度は明らかでなかった。癌診断
検定または癌療法の開発におけるこの情報を利用する試
みは大部分は不成功であった。自然腫瘍退行が非常に稀
であるので、試験管内で示された免疫応答が生体内で有
効でなかったこともまた結論でき、例えば癌患者から得
られた抗体およびリンパ球が試験管内で腫瘍細胞の殺害
に有効であることができるけれども、同じ癌患者の免疫
応答は生体内で効果を有さない。

【０００４】コーラーほか (Kohler and Milstein)によ
る単クローン性抗体技術の導入（１９７5 、Nature、２
５６：４９５〜４９７）は、それが上記抗原を分子レベ
ルおよび特異性に関してともに規定する方法を与えるの
でヒト腫瘍抗原に対する研究を強化した〔ヘルストロム
ほか (Hellstro and Brown) 、１９７９、「抗原 (The
Antigens) 」、セラ (M. Sela) 編、アカデミック・プ
レス (Academic Press) 、Vol.Ｖ：１〜６６〕。過去数
年にわたり、多数の腫瘍関連抗原が記載され、その大部
分はマウス単クローン性抗体により規定された、レイス
フェルドほか (Reisfeld and Sell)編、単クローン性抗
体および癌療法(Monoclonal Antibodiesand Cancer The
rapy)、分子および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンポ
ジウム (UCLA Symposium on Molecular and Cellular B
iology) 、ニュー・シリーズ・Vol.２７、アラン・アー
ル・リス社 (Alan R. Liss, Inc., New York) 、１９８
５、ｐｐ１〜６０９。十分確認された抗原の事実上すべ
てがオンコフェタルまたは分化抗原であると証明され、
腫瘍に対するそれらの特異性が定性的よりもむしろ定量
的であると認められたけれども、若干の抗原は正常細胞
に比較して腫瘍細胞に対し、腫瘍細胞の同定および治療
に対する可能な標的として使用されるのに十分な（一般
に１０〜1,０００倍の力価に相当する）特異性である。
腫瘍抗原に対するヒト単クローン性抗体もまた得られた
〔コート(Coto)ほか、１９８３、プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl. Acad. Sci.）８０：２０２６〜２０３
０〕。これは若干の癌患者が彼らの腫瘍に対する免疫応
答を備えていることの前記証拠を支持する。同定された
限り腫瘍関連細胞表面抗原の半数以上がヒトゲノムによ
り（内因性または外因性ウイルスによるよりも）コード
されたタンパク質または糖タンパク質であり、残りはグ
リコシルトランスフェラーゼの異常発現または調節から
生ずる糖脂質である。

【０００５】(2.2) 黒色腫関連ｐ９７抗原 ｐ９７抗原は単クローン性抗体の使用によりヒト黒色腫
中に最初に同定された腫瘍関連抗原である〔ブラウン
(Brown)ほか、１９８０、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー (J. Biol. Chem.) 、２５５：４
９８０〜４９８３；ジポルド (Dippold)ほか、１９８
０、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、７７：６１１４〜
６１１８；ウッドバーグ (Woodburg) ほか、１９８０、
Proc. Natl.Acad. Sci., USA 、７７：２１８３〜２１
８７〕。ｐ９７抗原は正常および腫瘍の組織中のその発
現に関して広く研究され、大部分のヒト黒色腫中および
一定胎児組織中に存在するが、しかし正常成人組織中に
単に痕跡量認められる。〔ブラウン (Brown)ほか、１９
８１、ジャーナル・オブ・イムノロジー (J. Immunol.)
１２７：５３９〜：５３９〜５４６；ブラウン (Brown)
ほか、１９８１、Proc.Natl. Acad. Sci., USA 、７
８：５３９〜５４３；ガリーグス (Garrigues)ほか、１
９８２、Int. J. Cancer、２９：５１１〜５１５〕・ｐ
９７はヒト臨床試験における腫瘍の診断像出に対する標
的として使用された〔ラーソン (Larson) ほか、１９８
３、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション (J. Clin. Invest.) ７２：２１０１〜２１１
４〕。

【０００６】ｐ９７は単量体細胞表面シアロ糖タンパク
質であり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定して９
7,０００ドルトンより多少低い見掛け分子量（ＭＷ）を
有する。単クローン性抗体は安定な４0,０００ドルトン
のトリプシン消化フラグメント上に存在する３つの主要
抗原部位を規定した〔ブラウン (Brown)）ほか、１９８
１、J. Immunol. ，１２７：５３９〜５４６〕；しか
し、ｐ９７の完全な配列は報告されなかった。少くとも
２つの他の別個に確認されたヒト黒色腫関連抗原ｇｐ９
５〔ジポルド (Dippold)ほか、１９８０、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 、７７：６１１４〜６１１８〕および
ｇｐ８７〔コースラビ (Khosravi) ほか、１９８５、In
t. J. Cancer、３５：７３〜８０〕が逐次免疫沈降によ
り分析するとｐ９７に一致すると思われる。ｐ９７のＮ
末端アミノ酸配列はトランスフェリンに相同であり、ト
ランスフェリンのようにｐ９７は鉄を結合する〔ブラウ
ン (Brown)ほか、１９８２、Nature、London, ２９６：
１７１〜１７３〕。体細胞ハイブリッドの分析およびイ
ン・シトウ (in situ)ハイブリッド形成法はｐ９７遺伝
子が、トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体
に対する遺伝子のように染色体領域３ｑ２１〜３ｑ２９
上に配置されることを示した〔プロウマン (Plowman)ほ
か、１９８３、Nature、London、３０３：７０〜７２；
ヤング (Yang) ほか、１９８４、Proc. Natl.Acad. Sc
i., USA 、８１：２７５２〜２７５６〕。これらの観察
はｐ９７が鉄代謝において役割を果たすことを示唆す
る。

【０００７】(2.3) 癌ワクチン 実験動物、通常マウス、における研究は生または死癌細
胞による免疫処置が生育可能な癌細胞の後の攻撃の拒絶
を生ずることができることを示した。細胞を含まない物
質による免疫の試みは一般に成功することが少なかった
が、しかし若干の成功が報告された〔総説に対しヘルス
トロムほか（Hellstrom and Brown)、１９７９、抗原
(The Antigens) 、Vol.Ｖ：1 〜６６参照〕。多くの場
合に、防御効果に関与する標的抗原がウイルスにコード
されたが、しかし他の多くの場合に防御免疫応答を誘出
する抗原の性質は知られていない。ヒトにける研究は一
層困難であり、若干の成功報告にもかかわらず癌ワクチ
ンの有効性が論争されている。多くの場合に、ワクチン
調製物は照射腫瘍細胞または一定化学薬品にさらすこと
により殺した腫瘍細胞から構成された。純粋なヒト腫瘍
関連抗原を入手できなかったので、ワクチンにおけるそ
の使用の報告はない。

【０００８】ヒトにおける癌ワクチンの提案された使用
に対する主理論的難点は、例えば死癌細胞または細胞を
含まない調製物により「予防接種」されるヒトが、免疫
応答の標的であることができる腫瘍抗原が若干の正常細
胞中に単に微量とはいえ存在することができ、従って免
疫系により「自己」として認識されるので、免疫学的に
感受性が鈍いことである。すべてでなくても、単クロー
ン性抗体によりヒト腫瘍中に検出される大部分の腫瘍関
連抗原はまた若干の正常組織中に存在し、癌患者が生体
内でそれらに有効に応答する証拠がほとんどない。サプ
レッサー細胞が腫瘍抗原に対する免疫応答のダウンレギ
ュレーションに主要役割を果たす証拠がある〔ネポム
(Nepom)ほか、１９８３、エクスペリメンティア (Exper
imentia)，３９：２３５〜２４２〕。さらに１組の腫瘍
抗原により誘発されたサプレッサー細胞応答が、他の組
のそれ自体サプレッションを誘発しない腫瘍抗原に対す
る有効な腫瘍破壊応答の誘発を妨げることができる〔ヘ
ルストロムほか (Hellstrom)ほか、１９８３、バイオメ
ンブランス (Biomembanes)、ノボトリー (A. Nowotry)
編、プリナム・プレス (Plenum Press) 、pp３６５〜３
８８〕。

【０００９】 （2.4)組換えＤＮＡ技術およびワクシニアウイルス 感染を防御するサブユニットワクチンの製造に対する組
換えＤＮＡ技術の使用は受容者動物中のタンパク質に対
する免疫応答を誘出できるタンパク質をコードする遺伝
情報の適当なベクター中の分子クローニングおよび発現
を含む。最近、サブユニットワクチンの製造に潜在的に
有用である新規な方法が記載された〔マケット (Macket
te) ほか、１９８２、Proc. Natl. Acad. Sci., ７９：
７４１５〜７４１９；マケット（Mackette）ほか、１９
８４、ジャーナル・オブ・ビロロジー (J. Virol.) ４
９：８５７〜８６４；パニカリほか (Panicali, D. and
Paoletti, E.)、１９８２、Proc. Natl. Acad. Sci.,
７９：４９２７〜４９３１〕。この方法にはゲノムに挿
入された外来遺伝子の発現にベクターとしてワクシニア
ウイルスの使用が含まれる。受容者動物に導入されると
組換え体ワクシニアウイルスが挿入された外来遺伝子を
発現し、それによりそのような遺伝子生成物に対する受
容者免疫応答を誘出する。生組換え体ワクシニアウイル
スがワクチンとして使用できるので、この方法はサブユ
ニットおよび生ワクチンの両方の利点を組合わせる。

【００１０】ワクシニアウイルスは約１８７キロベース
の線状二重鎖ＤＮＡゲノムを含み、感染細胞の細胞質内
に複製する。これらのウイルスは完全転写酵素系（キャ
ッピング、メチル化およびポリアデニル化酵素を含む）
をウイルス感染力に必要なウイルスコア内に含有する。
ワクシニアウイルス転写調節配列（プロモーター）はワ
クシニアＲＮＡポリメラーゼによるが、しかし受容者細
胞ＲＮＡポリメラーゼによらない転写の開始に備える。
組換え体ワクシニアウイルス中の外来ＤＮＡの発現は外
来遺伝子のタンパク質コーディングＤＮＡ配列に対する
ワクシニアプロモーターの連結を要する。プラスミドベ
クターはまた挿入ベクターと称され、ワクシニアウイル
スへのキメラ遺伝子の挿入のために構築される。挿入ベ
クターの１型は（ａ）転写開始部位を含むワクシニアウ
イルスプロモーター；（ｂ）外来ＤＮＡフラグメントを
挿入する転写開始部位から下流に位置する若干の特有の
制限エンドヌクレアーゼクローニング部位；（ｃ）プロ
モーターをフランキングしウイルスゲノムの相同非必須
領域中へキメラ遺伝子を挿入させる部位をクローニング
する非必須ワクシニアウイルスＤＮＡ（例えばＴＫ遺伝
子）；および（ｄ）大腸菌（Ｅ．coli) 中の複製および
選択のための細菌由来の複製および抗生物質耐性標識か
らなる。そのようなベクターの例はマケットにより記載
されている〔マケット (Mackette) ほか、J.Virol.,４
９：８５７〜８６４〕。

【００１１】組換え体ワクシニアウイルスは外来遺伝子
を含む組換え体細菌挿入プラスミドを、ワクシニアウイ
ルスで予め感染した細胞中へトランスフェクションする
ことにより生成される。相同組換え体は感染細胞で生
じ、ウイルスゲノム中への外来遺伝子の挿入を生ずる。
感染細胞は免疫技術、ＤＮＡプラークハイブリッド形成
または後に分離できる組換え体ウイルスに対する遺伝子
選択を用いてスクリーンすることができる。これらのワ
クシニア組換え体はその必須機能および感染力を保持
し、外来ＤＮＡの約３５キロベースを収容するように構
築することができる。外来遺伝子発現は酵素または免疫
検定（例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、または
イムノブロッティング）により検出できる。組換え体ワ
クシニア感染細胞から生じた天然存在膜糖タンパク質は
グリコシル化され、細胞表面に移動させることができ
る。高い発現レベルは強プロモーターの使用により、ま
たは単一遺伝子の多重コピーのクローニングにより得る
ことができる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】

（3)発明の概要 予防接種した個体中で黒色腫細胞を選択的に破壊する免
疫応答の誘発に使用できるワクチン配合物が記載され
る。より詳しくは、本発明のワクチン配合物は黒色腫関
連抗原例えば黒色腫関連ｐ９７抗原を指向する免疫応答
を誘発する免疫源を含む。本発明によれば、多くのワク
チン配合物が可能である。例えば、本発明の「サブユニ
ットワクチン」の免疫原はｐ９７に関連するペプチドま
たはタンパク質を含み、適当なアジュバントと配合する
ことができる。そのようなペプチドまたはタンパク質は
実質的に第４図及び第５図に示されるようにｐ９７のア
ミノ酸配列のすべてまたは一部から誘導され、機能的に
等しいアミノ酸配列がサイレント変化中に生ずる配列内
残基の置換された改変アミノ酸配列、および（または）
修飾またはプロセッシングされたアミノ酸配列例えばグ
リコシル化アミノ酸配列、ホスホリル化アミノ酸配列な
ど、あるいは化学修飾アミノ酸配列を含むアミノ酸配列
を含む。以下、改変、非改変、修飾または非修飾のいず
れであっても、黒色腫関連ｐ９７抗原に関連する本発明
のペプチドまたはタンパク質が「ｐ９７関連ペプチド」
として示される。ｐ９７関連ペプチドがハプテンである
（すなわち、抗原性であるがしかし免疫原でない）場合
に、ハプテンは免疫原性を与える担体分子に接合させる
ことができる。

【００１３】本発明のｐ９７関連ペプチドは組換えＤＮ
Ａ技術および（または）化学合成法を用いて製造するこ
とができる。ｐ９７関連ペプチドが化学的に合成される
と、そのような合成ｐ９７関連ペプチドは抗原性である
と予期されるｐ９７の領域から誘導されるアミノ酸配列
を含むことができる〔ホップほか (Hoop and Woods)、
１９８１、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、７８：３８
２４〜３８２８〕。本発明のｐ９７関連ペプチドが組換
えＤＮＡ技術の使用により生成される場合に、ｐ９７の
全部または一部をコードするヌクレオチド配列は、適当
な宿主中で培養基から生成できるｐ９７関連ペプチドの
発現を指向することができる組換え体発現ベクター例え
ばウイルスまたはプラスミド中へ挿入される。挿入され
るヌクレオチド配列は実質的に第４図及び第５図に示さ
れるｐ９７配列の全部または一部から誘導され、機能的
に等しいヌクレオチドコドンがサイレント変化中に生ず
る配列内のコドン、換言すれば同一アミノ酸をコードす
る異なるコドン、を置換するか、またはその機能等価物
を第４図及び第５図に示される配列内で置換できるヌク
レオチド配列を含むが、しかしそれに限定されない。プ
ラスミド発現ベクターを用いるとき直核細胞中の発現に
適するものが好ましいが、しかし原核発現ベクターもま
た使用できる。

【００１４】発現ベクターが組換え体ウイルスである発
明の他の態様において、ワクチンはウイルスワクチンと
して配合することができ、その場合に免疫原はｐ９７関
連ペプチドを発現する組換え体ウイルスを含む。免疫原
として用いる組換え体ウイルスの性質により、不活性化
ウイルスワクチンまたは生ウイルスワクチンを配合する
ことができる。本発明のワクチン配合物による適当な免
疫処置は、免疫処置被験体中で黒色腫細胞の破壊を生ず
る免疫応答の誘発を生ずることができる。本発明はまた
ワクチン配合物を試験できるシステムを記載し、試験を
行う方法を略示する。例えば、ワクチン配合物を動物モ
デル中で、初めに齧歯動物、次いで非ヒト霊長類中、最
後にヒト中、好ましくは寛解にあるがしかしミクロ転移
に基く再発の高い可能性を有する受容者中で効力につい
て評価できる。 （4)図面の簡単な説明 第１図はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割したｐ９７ mＲＮ
Ａの細胞を含まない翻訳生成物のオートラジオグラフを
示す。第１図Ａ中、レーン１はｐ９７濃縮 mＲＮＡの翻
訳生成物を表わし、レーン２は非濃縮 mＲＮＡの翻訳生
成物を表わし、それぞれ５ｎg mＲＮＡの全翻訳生成物
0.５μl から得られた。第１図Ｂ中、レーン１はｐ９７
濃縮 mＲＮＡの翻訳生成物を表わし、レーン２は非濃縮
mＲＮＡの翻訳生成物を表わし、それぞれ抗ｐ９７血清
で免疫沈降した５ｎg mＲＮＡの翻訳生成物５μl から
得られた。第２図はｐ９７ mＲＮＡの構造の線図であ
る。コーディング領域（シグナル配列からアンカー配列
までおよび非コーディング領域（３′ＵＴ）並びにｐ９
７前駆物質の重複ドメイン構造（空バー）の配列が示さ
れる。種々の制限酵素認識配列の位置は mＲＮＡの上に
示される。４つのｃＤＮＡクローンの相対位置は mＲＮ
Ａ構造の下に示される。ｃＤＮＡクローンｐ９７−３ａ
２ｆ１（３ａ２ｆ１）はｃＤＮＡがオリゴ（Ｔ）プライ
ムｐ９７濃縮 mＲＮＡ上に転写され、ｐＢＲ３２２中で
クローンされたｃＤＮＡライブラリーから分離され；ｃ
ＤＮＡクローンｐ９７−２ｆ１（２ｆ１）、ｐ９−１ｊ
１（１ｊ１）およびｐ９７−１０ａ１（１０ａｌ）はｃ
ＤＮＡ合成を、ｐ９７エキソン配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドでプライムし、生じたｃＤＮＡフラグメン
トをλｇｔ１０中へクローンすることにより分離した。
第３図はλＬ４7.１中でクローンしたゲノムクローンＢ
１５、Ｈ１７、Ｂ．6.６およびＥ7.７の線図である。

【００１５】第４図及び第５図はヒトｐ９７前駆物質ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列およびその演繹アミノ酸配列
を表わす。タンパク質配列により予め決定したＮ末端ア
ミノ酸残基はヌクレオチド配列（アミノ酸残基数２１〜
３０）から予期したものに一致した。アミノ酸残基３
８、１３５および５１５における可能なグリコシル化部
位（空バー）並びにＣ末端における膜アンカー領域（実
バー）が示される。１つのポリアデニル化シグナル（囲
中に示されるＡＡＴＴＡＡＡ）が位置３８４７に検出さ
れ、それはポリアデニル化トラクトの上流５０塩基対で
ある。第６図はｐ９７前駆物質の予期アミノ酸配列およ
びヒトセロトランスフェリンのそれ〔ヤング (Yang) ほ
か、１９８４、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、８１：
２７５２〜２７５６；デービス (Davis)ほか、１９８
５、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J. Mol. Biol.)１８１：１１１〜１２１〕の比較を示
す。保存された残基は囲に入れた。トランスフェリン
〔メーツ・ボーティグ（Mertz-Boutigue) ほか、１８９
４、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー ( Eur. J. Biochem.)１４５：６５９〜６７６〕の
鉄結合中に包含されるチロシン、ヒスチジンおよびアル
ギニン残基は星標（＊）により示される。

【００１６】第７図はトランスフェリンの上科成員間に
保持されたシステイン残基の存在に基くｐ９７の構造の
二次元モデルの線図である。３つの可能なグリコシル化
部位が星標（＊）により示される。疎水性アンカードメ
インがｐ９７のＣ末端（ＣＯＯＨ）に明らかである。第
８図はｐ９７ｃＤＮＡクローンおよびｐ９７発現ベクタ
ーの構築に用いるゲノムクローンλＥ7.７のフラグメン
ト；並びにｐＳＶ２ｐ９７ａ発現ベクターの遺伝子構造
の線図である。次の略号：Ｅ，ＥcoＲＩ；Ｐ，Ｐvu II
；Ｓal，ＳalＩ；Ｓ，Ｓ st Ｉ；Ｂ，ＢamＨＩ，が使
用されている。

【００１７】第９図は組換え体ｐ９７タンパク質の確認
および免疫精製におけるゲル電気泳動の結果を示す。ト
ランスフェクションしたＣＨＯクローン（ＣＨＯ３＋）
およびＳＫ−ＭＥＬ２８ヒト黒色腫細胞はツニカマイシ
ン (tunicamycin)（ＴＭ）の存在（＋ＴＭ）および不在
（−ＴＭ）下に³⁵Ｓシステインで標識した。細胞は１０
０mm² 平板中へ接種して集密近くへ到達させた。培地を
除き、ツニカマイシン１μｇ／ｍl を添加または添加し
ないシステイン不含培地３ｍl で置換した。３７℃で３
０分後に、２５０μＣi 毎ｍl のＬｒ³⁵Ｓシステイン
〔１０１６Ｃi 毎ミリモル：ニュー・イングランド・ニ
ュークリア (New Ingland Nuclear)製〕をその後６時間
加えた。細胞の回収、細胞溶解物の調製、免疫沈降およ
びＳＤＳ−ＰＡＧＥは前記のとおりであった。抽出物を
ｐ９７特異性抗体で免疫沈降し、タンパク質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動( ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)
により分析した。（ａ）クーマシーブルー染色ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル。レーン１、タンパク質マーカ
ー；レーン２、トランスフェクトマウスＢ１６細胞から
分離した免疫精製 p９７；レーン３；ＳＫ−ＭＥＬ２８
細胞＋ＴＭ；レーン４、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞−ＴＭ；
レーン５、ＣＨＯ３＋細胞＋ＴＭ；レーン６、ＣＨＯ３
＋細胞−ＴＭ。（ｂ）、（ａ）と同一のゲルのオートラ
ジオグラム。

【００１８】第１０図はトランスフェクト細胞またはＶ
ｐ９７ａ−ＮＹ感染細胞中の発現ｐ９７の放射免疫沈降
の結果を示す。ＢＳＣ細胞は野生型ワクシニアウイルス
またはｐ９７組換え体ワクシニアウイルスで一夜感染さ
せた。これらのウイルスまたはトランスフェクト細胞系
ＣＨＯ−ｐ９７．Ａはツニカマイシン〔シグマ (Sigm
a)〕２μｇ／ｍl ともにまたはなしで³⁵Ｓ標識メチオニ
ンおよびシステインとともにインキュベートした。６時
間後に細胞を溶解し、単クローン性抗体９6.５で沈殿さ
せ、１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により
分離した。ゲルを一夜オートラジオグラフにかけた。ツ
ニカマイシン処理群は各群について右側である。第１１
図はｐ９７ワクチンで免疫処置したマウス中の血清抗体
価を示す。Ｔｐ９７は完全フロイントアジュバンド中の
５×１０⁶ 照射Ｍ２ sv ｐ９７ａ. Ａ細胞（トランスフ
ェクションし、表面ｐ９７を発現する同系腫瘍細胞）で
免疫処置し、リン酸塩緩衝食塩水中の同数の細胞で追加
刺激した５マウスを示す。ｐ９７は完全フロイントアジ
ュバンド中の１００μｇの精製ｐ９７タンパク質で免疫
処置し、５０μｇの水性タンパク質で追加刺激した５マ
ウスの群である。Ｖｐ９７は尾部乱切によりＶｐ９７ａ
−ＮＹ１０⁷ プラーク形成単位で免疫処置し追加刺激し
た５マウスの群である。第１２図は組換え体ｐ９７ワク
シニアウイルス（Ｖｐ９７ａ−ＮＹ）による腫瘍攻撃マ
ウスの予防接種の治療効果を示す。マウスは１０⁵ また
は１０⁴ のｐ９７発現腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ．
Ｅ）で静脈内攻撃した。２日後、マウスに尾部乱切によ
りＶｐ９７ａ−ＮＹまたはＶwt−ＮＹを接種した。毎週
尾部乱切による接種を繰返し、マウスの生存を記録し
た。

【００１９】

【発明の実施の態様】

（5)発明の詳細な説明 本発明は黒色腫の予防または治療用のワクチンの製造を
指向する。それは黒色腫が正常組織中よりも黒色腫細胞
中に多量に存在する腫瘍関連表面抗原例えばｐ９７抗原
を有する観察に基く。本発明によれば、黒色腫関連ｐ９
７抗原に関連するペプチドまたはタンパク質（すなわ
ち、ｐ９７関連ペプチド）が組換えＤＮＡ技術および
（または）化学合成技術を用いて製造される。本発明の
ｐ９７関連ペプチドは実質的に第４図及び第５図に示さ
れるｐ９７のアミノ酸配列の全部または一部から誘導さ
れたアミノ酸配列を含む。これらはサイレント変化中に
そのように生ずる機能等価物として作用する同様の極性
の他のアミノ酸による配列内の１つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基の置換により変更された第４図及び第５図か
ら誘導されたアミノ酸配列を含む。配列内のアミノ酸の
置換はアミノ酸が属する種類の他のものから選ぶことが
できる。例えば無極性（疎水性）アミノ酸にはアラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含ま
れる。極性の中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレ
オニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグ
ルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）アミノ酸にはア
ルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷
（酸性）アミノ酸にはアスパラギンおよびグルタミン酸
が含まれる。さらに、本発明のｐ９７関連ペプチドはア
ミノ酸残基の置換により変化していてもいなくても、グ
ルコシル化、ホスホリル化などにより、または化学修飾
によりさらに修飾またはプロセッシングすることができ
る。これらのｐ９７関連ペプチドは免疫原として、予防
接種した患者中に存在する黒色腫細胞を指向する免疫応
答を誘出するワクチン配合物に使用することができる。

【００２０】本発明の１態様によれば、組換えＤＮＡ技
術は適当な宿主細胞中のｐ９７関連ペプチドの発現を指
向する発現ベクター中へｐ９７抗原をコードするヌクレ
オチド配列を挿入するために用いられる。ｐ９７抗原を
コードするヌクレオチド配列は実質的に第４図及び第５
図に示されるｐ９７ヌクレオチド配列の全部または一部
から誘導されるヌクレオチド配列を含む。アミノ酸に対
するＤＮＡコードの縮重（すなわち、大部分のアミノ酸
を１つ以上のコドンによりコードできる）のために、機
能等価コドン（すなわち、同じアミノ酸または機能等価
物をコードする異なるコドン）を、置換がサイレント変
化を生すれば第４図及び第５図に示されるｐ９７配列内
で置換することができる。ｐ９７の全部または一部をコ
ードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター宿主細胞
系を用いて試験管内で多量の純ｐ９７関連ペプチドを生
成させることができ、その場合に遺伝子生成物を培養中
の細胞から精製し、免疫原としてサブユニットワクチン
配合物中に使用することができる。ｐ９７関連ペプチド
の精製は単クローン性抗体を用いるイムノアフィニティ
ー精製を含め、種々の生化学方法を用いて行なうことが
できる。さらに、ｐ９７関連ペプチドの精製は、血漿膜
中のタンパク質の固定に関与する配列を除去するがなお
細胞膜へのタンパク質の輸送に関与する配列が除去され
ず截形抗原分子が宿主細胞により培養基中へ分泌される
ようにｐ９７関連ペプチドをコードするＤＮＡ配列を修
飾することにより促進することができる。原核細胞によ
り生成されたｐ９７関連ペプチドの場合には、適当な翻
訳後の修飾の欠如が抗原的に不活性な生成物を生するこ
とができ、それは適当な化学的または他の処理により活
性化するべきであるかもしれない。

【００２１】発現ベクターがウイルスである一定の態様
において、ウイルス自体をワクチンとして配合すること
ができる。その場合に不活性化組換え体ウイルスワクチ
ンを調製することができる。発現ベクターが受容者に疾
患を生じない感染性組換え体ウイルスである場合に、実
質的な免疫性を与える不活性化ウイルスワクチンまたは
生ウイルスワクチン調製物を配合することができる。こ
の目的に殊に有用な発現ベクターは本発明のｐ９７関連
ペプチドを発現する組換え体ワクシニアウイルスであ
る。このため、ｐ９７抗原の全部または一部をコードす
るヌクレオチド配列を、適切な宿主中で配列の発現を指
向できるワクシニアウイルスベクター中へ挿入すること
ができる。本発明には他のウイルス発現ベクター、殊に
ワクシニアウイルスをワクチンとして使用することが含
まれる。本発明の他の態様において、ｐ９７の演繹アミ
ノ酸配列はタンパク質分子の表面における配列並びにそ
の可能な抗原性および（または）免疫原性の存在を予期
する性質、殊に親水性、を有する配列について試験する
ことができる。これらのｐ９７関連ペプチドは化学的に
合成し、ワクチン配合物中に免疫原として使用すること
ができる。

【００２２】本発明はまた、ワクチン製造以外の目的に
使用できるｐ９７関連ペプチドの製造方法を提供する。
ｐ９７関連ペプチドは動物の免疫処理に使用し、問題の
黒色腫細胞に特異性の抗血清または単クローン性抗体を
生成させることができる。これらは診断検定における成
分として、あるいは癌療法に使用する放射性標識薬物結
合またはトキシン結合抗体のアフィニティー精製に使用
することができる。本発明はヒト黒色腫に対するｐ９７
基ワクチン構築を記載する例によって示される。しか
し、ここに記載される方法および組成物はｐ９７を用い
るワクチンの構成に限定されないで他の腫瘍関連抗原に
適用できる。本発明は単に説明を明確にするために次の
とおり：（ａ）ｐ９７のヌクレオチドおよびアミノ酸配
列；（ｂ）化学合成法により製造されるｐ９７関連ペプ
チド；（ｃ）発現ベクター宿主系により製造されるｐ９
７関連ペプチド；（ｄ）ｐ９７関連ペプチドの免疫確
認；および（ｅ）ワクチンの配合が与えられる。

【００２３】（5.1 ）黒色腫関連ｐ９７抗原の配列分析 ｐ９７をコードする遺伝子のヌクレオチド配列およびそ
の誘導アミノ酸配列が第４図及び第５図に示される。機
能的に等しい配列は本発明の範囲内にある。これらには
同様または機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異
なるコドンの置換により改変され、従ってサイレント変
化を生ずる第４図及び第５図に示されるヌクレオチド配
列のすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列、並びに
配列内の機能的に等しいアミノ酸残基の置換により改変
され、従ってサイレント変化を生ずる第４図及び第５図
に示されるアミノ酸配列のすべてまたはは一部を含むア
ミノ酸配列、並びにそれらの例えばグリコシル化、ホス
ホリル化などにより、または他の化学修飾により修飾ま
たはプロセッシングされた誘導体が含まれるが、しかし
それらに限定されない。 以下のサブセクションには第
４図及び第５図に示されるｐ９７の配列の決定に用いた
方策並びにｐ９７の配列またはワクチン配合物に有用な
他の腫瘍抗原の決定に使用できる代替技術が記載され
る。

【００２４】 （5.1.1 ）黒色腫関連ｐ９７抗原の同定および確認 黒色腫関連ｐ９７抗原の活性およびアミノ酸配列は知ら
れていなかった；そのためｐ９７抗原の同定は、ｐ９７
を指向する単クローン性抗体を用いて行なった。多くの
技術をｐ９７に特異性の単クローン性抗体の発生に用い
ることができる。例えば、コーラーほか (Kohler and M
ilstein)（１９７５、Nature、２５０：４９５〜４９
７）により開発されたハイブリドーマ技術を次のように
用いることができ；マウスまたはラットをヒト黒色腫細
胞で免疫処置し、免疫処置動物から採取したリンパ球を
骨髄腫細胞と融合させ；あるいは、黒色腫患者からのリ
ンパ球を骨髄腫細胞と融合させることができる〔コート
(Cote) ほか、１９８３、Proc. Natl. Acad. Sci., ８
０：２０２６；ハスペル (Haspel) ほか、１９８５、カ
ンサー・リサーチ (Cancer Res.)４５：３９５１〕、あ
るいはエプスタイン・バー (Epstein-Barr) ウイルスを
用いる単クローン性抗体の製造技術〔コール (Cole) ほ
か、１９８５、ＥＢＶハイブリドーマ技術およびそのヒ
ト肺癌への適用、「単クローン性抗体および癌療法（Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy) 」、アラン
・アール・リス社 (Alan R. Liss, Inc.) 、pp７７〜９
６〕を用いてｐ９７を指向する単クローン性抗体を発生
させることができる。どの場合にも、生じたハイブリド
ーマは黒色腫細胞に結合するが、しかし正常細胞に結合
しない抗体の生成についてスクリーンされる。

【００２５】上記ｐ９７を指向する単クローン性抗体を
多くの方法に用いてｐ９７抗原に関連するペプチドおよ
びタンパク質の多量の生成に備えるヌクレオチド配列の
同定、確認、クローニングおよび発現を促進することが
できる。例えば、単クローン性抗体を用いて腫瘍細胞に
より作られた全タンパク質の放射性標識化、ｐ９７抗原
の同定に用いる単クローン性抗体による腫瘍タンパク質
の免疫沈降、および電気泳動による免疫沈降タンパク質
の分画によりさらにｐ９７抗原を確認することができ
る。タンパク質抗原は、生ずるオートラジオグラフ上の
明瞭なバンドとして同定される〔ブラウン (Brown)ほ
か、１９８０、J. Biol. Chem.）２５５：４９８０〜４
９８３〕。さらに、ｐ９７を指向する単クローン性抗体
を次のようにクローニングの促進に用いることができ
る：（ａ）ｐ９７抗原をコードする黒色腫細胞中に存在
する mＲＮＡ転写を同定して入手するためのポリソーム
の免疫精製；（ｂ）ｐ９７抗原に関連するペプチドまた
はタンパク質を発現するｃＤＮＡ発現ライブラリー中の
クローンの同定；（ｃ）前の２つの適用に用いる他の単
クローン性抗体または抗血清を調製するためのｐ９７抗
原の精製：または（ｄ）ｐ９７抗原に対する遺伝子を感
染により導入した細胞の同定。単クローン性抗体はまた
ｐ９７抗原の構造および免疫化学的確認の促進に使用
し、分子の細胞外および抗原ドメインを同定し、またア
ミノ酸配列分析のための分子を精製することができる
〔ブラウン (Brown)ほか、１９８１、Proc. Natl.Acad.
Soc., USA 、７８：５３９〜５４３；ブラウン (Brow
n)ほか、１９８２、Nature、London、２９６：１７１〜
１７３〕。

【００２６】ｐ９７の一層の確認には細胞の局在の決定
並びに抗原決定基および機能性ドメインのマッピングが
含まれる。サブセルの局在は免疫蛍光顕微鏡法により、
および細胞分画再試験により決定することができる。細
胞表面上に存在する抗原例えばｐ９７ばワクチン構成に
好ましいけれども、細胞内抗原もまた有用であることが
できる。多重単クローン性抗体を入手できれば、抗原決
定基は競合試験によりマッピングすることができ、各抗
体を放射性標識し、他の抗体それぞれとの競合について
試験する。分子のドメインはプロテアーゼによる制限消
化、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定することができ
る。これらのデータとともに最も免疫原性である分子の
領域の同定を可能になろう。単クローン性抗体がインタ
クト細胞で免疫処置することにより得られれば、分子の
これらの領域が最も分子外であり、ワクチン構成に有用
であるようである。アミノ酸配列分析はタンパク質の疑
問の余地のない同定および他のタンパク質との比較を可
能にする〔ブラウン (Brown)ほか、１９８２、Nature、
London、２９６：１７１〜１７３〕。タンパク質が５０
以上のアミノ酸残基を含むならば、それはアミノ酸配列
の一部、最もしばしばＮ末端のみを決定することを可能
にすることができる。アミノ酸配列に対するタンパク質
抗原は細胞溶解物から単クローン性抗体によるイムノア
フィニティークロマトグラフィー、次いで調製用ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより精製することができる。精製したタン
パク質のＮ末端アミノ酸配列は次いで自動アミノ酸配列
決定装置、好ましくは最大感度気相装置の使用により決
定される。

【００２７】（5.1.2 ）黒色腫関連ｐ９７抗原をコード
するＤＮＡの同定、クローニングおよび配列決定 初期クローニング研究は豊富なタンパク質例えば mＲＮ
Ａがしばしば全 mＲＮＡの１０〜５０％を構成するグロ
ビンおよびオボアルブミンに集中した。これらの mＲＮ
Ａはサイズ分画により相同性に対して精製し、純ｃＤＮ
Ａプローブを用いてコロニーハイブリッド法により数百
クローンのライブラリーをスクリーンできた。 mＲＮＡ
が全 mＲＮＡの１〜１０％を構成するタンパク質にはｃ
ＤＮＡプローブの１つが問題の配列を含み、他が負の制
御である２つのｃＤＮＡプローブを用いることができ
る。低数度タンパク質、例えば腫瘍関連抗原、をコード
し、細胞 mＲＮＡの0.０１％程度を構成することができ
るメッセンジャーＲＮＡは、数十万のクローンをスクリ
ーンしなければならず、ｃＤＮＡプローブが特異性ハイ
ブリッド形成シグナルを与えないのでクローニングが一
層困難である。両問題は問題の配列に対する mＲＮＡを
濃縮することにより緩和することができる。ヒト黒色腫
ｐ９７抗原をコードするＤＮＡのクローニングに用いた
若干の方法が次に記載される。生じたクローンはｐ９７
の全コーディング領域をスパンするクローンまたはクロ
ーン類を同定するために分析した。そのように同定され
たクローンのｐ９７ヌクレオチド挿入物を次に任意の公
知方法により配列決定することができる。次に種々の方
法がより詳細に記載される。

【００２８】 （ａ）ポリソーム免疫精製による mＲＮＡの分離 この方法において、ポリソーム（ mＲＮＡ、リポソーム
および新生ポリペプチド鎖）を新生鎖上に存在する抗原
決定基を認識する抗体を用いるイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーによって精製する。多くの場合にイン
タクト細胞または細胞抽出物による免疫処置により得ら
れた単クローン性抗体はその天然配座中の抗原を認識す
るが、しかし認識される抗原決定基が新生鎖中に存在で
きない有意な機会があるのでそれらがポリソーム免疫精
製に適切であることができない。翻訳はポリペプチドの
Ｎ末端で開始されるので、Ｃ末端に隣接するエピトープ
は新生鎖の大部分に存在しないようである。この問題は
Ｎ末端エピトープを認識する抗体の使用により、または
終結をブロックするタンパク質合成インヒビターで処理
した細胞からポリソームを調製することにより回避され
る。より重大な問題は成熟タンパク質が翻訳後修飾のた
めに新生鎖と異なることである。この問題は細胞表面タ
ンパク質に対して一層重大であり、それはシグナルペプ
チドの除去、炭水化物側鎖の付加およびジスルフィド架
橋の形成により一層広範に修飾される。多クローン性抗
血清をポリソーム免疫精製に使用すれば、新生鎖と成熟
タンパク質との間の抗原性の差異は、免疫処置中にウサ
ギまたは他の動物が天然タンパク質だけでなく、殊にフ
ロイント (Freund's) アジュバントが使用されれば一部
または完全変性形態もまたさらされるので全く重要でな
いことができる。これらの抗体が抗体集団の小部分のみ
に相当するとしても、それらはなお新生鎖に結合するほ
ど十分に存在することができる。残念ながら低数度タン
パク質に対する多クローン性抗血清の調製は非常に困難
である。単クローン性抗体はさらに免疫処置のための抗
原の精製に使用できるけれども、培養細胞各グラムがし
ばしばマイクログラムの抗体を生ずるのみである。これ
はマウスの若干の免疫に十分であるが１匹のウサギにや
っと十分である。

【００２９】問題に対する他の解法は新生鎖中に存在す
る抗原決定基を認識する単クローン性抗体を単クローン
性抗体の調製に使用する免疫原として変性ｐ９７抗原の
使用により得ることである。本発明の実施例において、
ｐ９７のＮ末端４0,０００ドルトン分子量ドメイン上の
３つの異なるエピトープを認識する単クローン性抗体の
パネルを利用でき、その１つまたはそれ以上が新生鎖に
結合することを望んで各異なる特異性を有する単クロー
ン性抗体のプールを用いた。選んだ抗体は、それぞれが
放射性標識した全細胞溶解物からｐ９７の単一バンドを
免疫沈降し、それらが高い結合アフィニティーを有した
点でｐ９７に非常に特異性であった。クローニング計画
のために、３エピトープのそれぞれに特異性である３つ
のＩｇＧ２ａ抗体を選択した。一般に成功の機会は、異
なるエピトープに対する多くの抗体の使用により高める
ことができる。単クローン性抗体を用いるとき、所与単
クローン性抗体または抗体の組合せが新生鎖を認識し、
従ってポリソーム免疫精製における使用に適するかどう
か予期できる理由には疑問が残る。１つの方法は試験管
内翻訳生成物がプロセッシングされないで、新生鎖に類
似するとの仮定に頼り、単クローン性抗体が網赤血球溶
解物系中で翻訳された抗原を免疫沈降するか否かを決定
することである。他の方法は小規模でポリソーム免疫沈
降を行ない、次いで試験管内翻訳を用いて問題のmＲＮ
Ａ種が濃縮されたかどうかを測定することである。

【００３０】ポリソーム免疫精製技術を用いるときに m
ＲＮＡ活性の測定により精製をモニターすることが重要
である。これは mＲＮＡを網赤血球溶解物系中で翻訳
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより翻訳生成物を分析すること
により行なうことができる。腫瘍関連抗原は少なすぎて
非濃縮 mＲＮＡの翻訳生成物の成分を何百もの一層豊富
な種の間に認めないことができるけれども、それは濃縮
mＲＮＡ試料から誘導された翻訳生成物中で検出できる
であろう。あるいは鋭敏な免疫検定が翻訳された腫瘍関
連抗原の検出に使用できれば、クセノプス（Xenopus)卵
胞子翻訳系を用いることができる。ｐ９７に対しては、
ｐ９７の２つの異なるエピトープに特異性の２つの単ク
ローン性抗体を用いる高感受性二決定基免疫検定（ＤＤ
ＩＡ）をこの目的に使用した。セファロース（Sepharos
e)に結合したタンパク質Ａはポリソーム免疫検定に使用
できる。タンパク質Ａ吸着剤はこの手順において２つの
適用を有する。初めに粗腹水液から単クローン性抗体を
精製し、それにより汚染リボヌクレアーゼ活性を除去す
ることである。次にタンパク質Ａ吸着剤を精製抗体とと
もに用いて特定新生鎖をもつポリソームを免疫精製す
る。網赤血球溶解物系中の mＲＮＡの翻訳は翻訳生成物
の生化学的確認並びにその純度の評価を可能にする。

【００３１】（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブ 本発明により腫瘍関連抗原例えばｐ９７をコードするｃ
ＤＮＡのクローニングに使用できる他の方法は抗原の部
分または完全アミノ酸配列を決定することおよびアミノ
酸配列から演繹されるヌクレオチド配列に基くオリゴヌ
クレオチドプローブを合成することである。次いでオリ
ゴヌクレオチドをｃＤＮＡ合成用プライマーとしておよ
び生ずるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに対す
るプローブとして使用できる。従って、黒色腫関連ｐ９
７タンパク質は黒色腫瘍細胞の溶解物から特定単クロー
ン性抗体によるアフィニティークロマトグラフィーによ
り便宜に精製することができる〔ブラウン (Brown)ほ
か、１９８２、Nature、London、２９６：１７１〜１７
３〕。次いで決定したアミノ酸配列の一部をコードする
ヌクレオチド配列を合成し、それをプライマーおよび
（または）プローブとして使用できる。単一コドンまた
は２コドンによりコードされたアミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列の部分はこの目的に最も適する。１つの方法は
ヒト中の公知コドン利用頻度を基にした最も確率性のコ
ーディング配列を表わす長配列、典型的には２５〜６０
ヌクレオチドを合成することである。アミノ酸配列の異
なる部分に基く２合成オリゴヌクレオチドの使用は疑似
陽性ハイブリッド形成シグナルの同定を可能にすること
によりスクリーニングを促進する。さらに、ＤＮＡハイ
ブリッドの融点に対するＧＣ含量の効果を最小化するハ
イブリッド形成条件の使用もまたスクリーニングを促進
する。部分ｃＤＮＡクローンがこの方法により得られれ
ば、それをプローブとして全長ｃＤＮＡクローンを得る
補助に使用できる。

【００３２】（ｃ）ｃＤＮＡ発現ライブラリー 細菌中のｃＤＮＡ挿入物の発現に備えるクローニングベ
クターが開発された。従って、腫瘍関連タンパク質例え
ばｐ９７に対するｃＤＮＡクローンの取得に使用できる
１つの方法は前記オリゴ（Ｔ）−ヌクレオチドプライマ
ーまたは合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて前
記のように黒色腫細胞から分離された mＲＮＡ（濃縮ま
たは非濃縮）を逆転写することによりｃＤＮＡライブラ
リーを調製することおよび黒色腫関連ｐ９７タンパク質
を指向する単クローン性抗体でそのようなライブラリー
をスクリーンすることである。正しい配向において単ク
ローン性抗体により認識されたエピトープをコードし、
枠を読取るＤＮＡを含むクローンは黒色腫関連ｐ９７タ
ンパク質に関連するペプチドまたはタンパク質を発現
し、クローンにより発現されたタンパク質をニトロセル
ロースフィルターに移し、フィルターを抗体とともにイ
ンキュベートし、次に標識した抗免疫グロブリン試薬で
展開することにより同定することができる。潜在的問題
は、多くの場合にｃＤＮＡの一部のみが挿入物中に含ま
れ、細菌が真核細胞がなすようにタンパク質をプロセッ
シングしないので、細菌により発現されたタンパク質を
認識しないことである。この問題は、シグナルペプチド
の除去、炭水化物側鎖の付加およびジスルフィド架橋の
形成により一層広範に修飾される修飾細胞表面タンパク
質に殊に鋭敏である。従って、変性抗原を認識すること
が知られた単クローン性抗体を発生させ、また精製抗原
による免疫処置により多特異性抗血清を調製することを
必要とすることができる。黒色腫関連ｐ９７抗原から誘
導されたｃＤＮＡ挿入物を含むと思われる組換え体ウイ
ルスまたはプラスミドが同定された後、ｃＤＮＡ挿入物
を、ｐ９７をコーポするｃＤＮＡの全長をスパンするフ
ルレングスクローンまたはクローン群を同定するために
追加のライブラリーのスクリーニングに使用できる。ク
ローン化ｃＤＮＡの本性は配列分析およびｐ９７タンパ
ク質の直接アミノ酸配列分析により決定された演繹Ｎ末
端アミノ酸配列の比較により決定することができる。

【００３３】（ｄ）ゲノムのクローニング 次の方法は、天然タンパク質中にのみ存在し、新生鎖ま
たは細菌中に発現されたタンパク質中に存在しない抗原
決定基を指向する単クローン性抗体を用いるＤＮＡのク
ローニングを可能にする。この目的にはヒト黒色腫細胞
から誘導されたＤＮＡをマウスＬ細胞中にトランスフェ
クションにより導入する。次に黒色腫関連ｐ９７抗原を
発現するマウス細胞を、蛍光活性化細胞選別器の使用に
より、またはｐ９７を指向する放射性標識単クローン性
抗体を用いてポリエステル布フィルターに移したコロニ
ーのレプリカ上の関連ペプチドを検出するｐ９７関連ペ
プチドを生ずるコロニーの免疫同定により分離する。ト
ランスフェクションの数連続回が非関連ヒトＤＮＡ配列
の除去に必要とすることができる。次いでゲノムライブ
ラリーをλファージベクター中に調製し、大部分の遺伝
子のイントロン中に生ずるヒト反復配列ヲ含むクローン
をスクリーンする。ゲノムクローンが同定された後、そ
れをハイブリッド形成プローブとして使用しｐ９７をコ
ードするＤＮＡを含むｃＤＮＡを同定することができ
る。

【００３４】（5.2 ）黒色腫関連ｐ９７抗原の抗原性フ
ラグメントの合成および免疫原性の評価 合成ペプチドは免疫原として多くの病原体に対しある程
度の防御を与えることができる天然タンパク質に対する
免疫応答の誘出に使用できる。そのようなペプチド配列
はタンパク質抗原の既知アミノ酸配列から、外部媒質に
さらされたタンパク質分子の表面上に存在すると思われ
るアミノ酸の伸縮を同定することにより選択される。こ
れはアミノ酸に対して確立された水治法パラメーターを
使用するアミノ酸配列のコンピューター分析により最も
普通に決定される。他の基準、例えば予期二次構造また
は可動性もまた用いることができる。

【００３５】従って、黒色腫関連ｐ９７タンパク質の５
〜５０アミノ酸残基を含む合成ペプチドを実験動物（通
常マウスまたはウサギ）中の免疫原性について試験する
ことができる。そのような合成ペプチドは機能的に等し
いアミノ酸残基がサイレント変化で生ずる配列内の残基
を置換した改変配列および（または）修飾またはプロセ
ッシングした配列例えばグリコシル化配列、ホスホリル
化配列などあるいは化学修飾配列を含め実質的に第４図
及び第５図に示されるアミノ酸配列のすべてまたは一部
を含むが、しかしそれに限定されない。これらのｐ９７
配列ペプチドは単独で、または担体タンパク質例えばキ
ーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）と対に
して使用される。どの場合も、アジュバントの使用は適
宜であるけれども、好ましい。免疫処置動物を追加免疫
処置し、免疫処置ペプチドを指向する抗体について試験
する。抗ペプチド抗体を有するものを天然ｐ９７タンパ
ク質を結合する抗体について試験する。腫瘍関連抗原例
えばｐ９７の場合に、細胞の免疫応答について、例えば
遅延型過敏症（ＤＴＨ）を調べることにより、試験管内
の抗原刺激増殖について、細胞溶解性Ｔ細胞について、
または適当なモデル中の腫瘍拒絶について試験すること
もまた関心深い。適当なモデルは、適当なｃＤＮＡ発現
ベクターによるトランスフェクションの結果としてヒト
腫瘍関連抗原を発現するマウス腫瘍である。目標は黒色
腫関連ｐ９７抗原を指向する激しい免疫応答を誘出する
ペプチドを同定することである。同定後、これらのペプ
チドを既知化学合成法により多量に生成させることがで
きる。あるいは同定したペプチドを、発現ベクター宿主
細胞系中でそのようなペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を発現させることにより多量に生成させることが
できる。

【００３６】（5.３）発現ベクター宿主系によるｐ９７
関連ペプチドの生成 ヌクレオチドコーディング配列を適当な発現ベクター中
へ挿入することによりタンパク質およびペプチドを多量
に生成させることができ、それは次に細菌、酵母、昆虫
細胞および哺乳動物細胞を含みそれらに限定されない適
当な宿主細胞中へ導入される。細菌宿主は多くの利点を
有するけれども、それらは適切に多くの真核タンパク質
を有さず、またそれらは腫瘍関連タンパク質の発現に対
し真核細胞より多少適切でない。しかし、細菌中に生じ
た組換え生成物は、応答がタンパク質抗原の初期分解を
必要とすると思われるのでＴ細胞応答の導入に有用であ
ることができる。ｐ９７関連ペプチドをベクター宿主系
中に発現させるために、黒色腫関連ｐ９７抗原またはそ
のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は適当に発
現ベクター中へ導入される。そのようなヌクレオチド配
列は、配列内の１つまたはより多くのコドンが同一また
は機能的に等しいアミノ酸残基をコードし、従って配列
中に中性またはサイレント変化を生ずるコドンにより置
換された改変配列を含めて実質上第４図及び第５図に示
されるｐ９７のＤＮＡ配列のすべてまたは一部を含む
が、しかしそれらに限定されない。発現ベクターは挿入
されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に
必要な要素を含む。これらの要素はそれらの強さおよび
特異性で異なる。用いる宿主ベクター系により、多くの
適当は転写および翻訳要素の任意の１つを用いることが
できる。例えば哺乳動物細胞系中でクローニングすると
きに哺乳動物細胞のゲノム（例えばマウスメタロチオネ
インプロモーター）から、またはこれらの細胞中で成長
するウイルス（例えばワクシニアウイルス7.５Ｋプロモ
ーター）から分離したプロモーターを用いることもでき
る。組換えＤＮＡまたは合成法により生成されるプロモ
ーターもまた使用して挿入配列の転写に備えることがで
きる。

【００３７】特定開始シグナルもまた挿入タンパク質コ
ーディング配列の有効翻訳に必要である。これらのシグ
ナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。遺伝子
またはｃＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中へ挿入する
場合に追加の翻訳制御シグナルを何ら必要としないこと
ができる。しかし、コーディング配列の一部のみを挿入
する場合にＡＴＧコドンを含む外因性翻訳制御シグナル
を与えるべきであることができる。開始コドンはさらに
タンパク質コーディング配列の読取り枠に関する相中に
あり全挿入物の翻訳を保証しなければならない。これら
の外因翻訳制御配列および開始コドンは天然および合成
両方の種々の由来であることができる。ベクター中への
ＤＮＡフラグメントの挿入に対して当業者に知られた任
意の方法を用いて適当な転写および翻訳制御シグナルお
よびタンパク質コーディング配列からなるキメラ遺伝子
を含む発現ベクターを構築することができる。これらの
方法は試験管内組換えＤＮＡ技術、合成技術および生体
内組換え（遺伝子組換え）を含むことができる。

【００３８】発現ベクターは次のベクター：ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、昆虫ウイルス、酵母ベクタ
ー、バクテリオファージおよびプラスミドＤＮＡベクタ
ー、並びにそれらの誘導体を含むが、しかしそれらに限
定されない。細菌系中の遺伝子のクローニングおよび発
現はよく知られている。例えば大腸菌中でクローンする
ときに、そのバクテリオファージまたはプラスミドプロ
モーター例えば lacプロモーター、trp プロモーター、
rec Ａプロモーター、リポソームＲＮＡプロモーター、
大腸菌ファージλのＰ_R およびＰ_L プロモーターおよび
他の lacＵＶ５、trp − lacＵＶ５（tac)ハイブリッド
プロモーター、omp Ｆ，bla, lppなどを含み、しかしそ
れらに限定されないものを用いて隣接ＤＮＡセグメント
の高レベルの転写を指向することができる。しかし、原
核細胞と真核細胞との間のプロセッシング差異のため
に、本発明のｐ９７関連ペプチドを真核細胞中に発現さ
せることが好ましいことができる。真核細胞中にタンパ
ク質を発現させる最もよく確立された方法は、（ａ）遺
伝子を薬物耐性遺伝子とともに細胞中へ導入し、次い
で、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼ−メトトレキ
セート系によるように増幅を得る薬物による選択；
（ｂ）プラスミドベクター中のしばしばｐＢＲ３２２に
基く強真核プロモーターおよび他の調節配列を用いるｃ
ＤＮＡの発現：（ｃ）しばしばＳＶ４０から誘導される
ウイルスベクター中で、また強プロモーター、この場Ｓ
Ｖ４０プロモーター、を用いるｃＤＮＡの発現、であ
る。組換え体プラスミドベクターは、しばしば長時間タ
ンパク質を生ずる細胞系統の生成に使用され、ＳＶ４０
ベクターはしばしば過渡発現を得るために使用される。
哺乳動物細胞が最もしばしば宿主として使用されたけれ
ども、昆虫細胞および若干の場合に酵母細胞もまた適当
であることができる。若干は次により詳細に説明され
る。

【００３９】黒色腫関連ｐ９７抗原を発現する組換え体
ワクシニアウイルスを構築するために、ｃＤＮＡコーデ
ィング配列をワクシニアウイルスの7.５Ｋプロモーター
に連結してキメラ遺伝子を形成することができる。この
キメラ遺伝子は、プラスミドＤＮＡベクター上に支持さ
れるウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に相同の追加のワ
クシニアウイルス配列によりフランキングされる。キメ
ラ遺伝子の構築は腫瘍関連抗原配列の転写および翻訳の
ための天然および合成シグナル両方の使用を含む。次い
でキメラ遺伝子は、プラスミドベクターおよびワクシニ
アウイルスゲノムの両方上に存在する相同チミジンキナ
ーゼ領域間の生体内組換えによりワクシニアウイルス発
現ベクター中へ導入される。キメラ遺伝子を含むこれら
の組換え体ウイルスは感染宿主中のｐ９７関連ペプチド
の発現を指向することができ、ワクチンの成分として使
用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用す
る場合に、問題のＤＮＡ配列をアデノウイルス転写／翻
訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節リ
ーダー配列に連結させる。このキメラ遺伝子は次に試験
管内または生体内組換えによりアデノウイルスゲノム中
へ挿入される。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば
領域Ｅ１またはＥ３）中への挿入は、生育し、感染宿主
中にｐ９７関連ペプチドを発現できる組換えウイルスを
生ずる。現在、承認され、軍人にワクチンとして使用さ
れる２種のアデノウイルス（４型および７型）がある。
それらは挿入ＤＮＡ配列の発現にベクターとして使用さ
れる主候補である。

【００４０】ｐ９７関連ペプチドの発現に使用できた他
の発現系は昆虫系である。そのような系の１つにおい
て、オートグラファ・カリフォルニカ (Autographa cal
ifornica) 核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）がベクタ
ーとして外来遺伝子の発現に使用される。ウイルスはス
ポドプテラ・フルジペルダ (Spodopetera frugiperda)
細胞中で成長する。問題のＤＮＡ配列はウイルスの非必
須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中へクローンする
ことができ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘド
リンプロモーター）の制御下に置かれる。ＤＮＡ配列の
良好な挿入はポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉
鎖組換え体ウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子を
コードするタンパク質コートのないウイルス）の生成を
生ずる。これらの組換え体ウイルスは次いで、挿入遺伝
子を発現するスポドプテラ・フルジベルダ (Spodopeter
a frugiperda) 細胞の感染に使用される。

【００４１】さらに挿入配列の発現の調節、または所望
特定形態にキメラ遺伝子生成物を修飾またはプロセッシ
ングする宿主細胞株を選択することができる。一定プロ
モーターからの発現は一定誘導物質（例えばメタロチオ
ネインプロモーターに対し亜鉛およびカドミウム）の存
在下に高めることができる。従って、遺伝子的に作られ
るタンパク質の発現を調節することができる。これは、
クローン化遺伝子のタンパク質生成物が宿主細胞に対し
致死性であれば重要である。さらに、タンパク質生成物
の修飾（例えばグリコシル化、ホスホリル化など）およ
びプロセッシング（例えば開裂）はタンパク質の構造お
よび機能に対し重要である。異なる宿主細胞はタンパク
質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特有かつ特異的
機構を有する。適当な細胞系または宿主系を選択して発
現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシ
ングを保証することができる。ｐ９７ｃＤＮＡを、メタ
ロチオネインプロモーターを含むｐＢＲ３２２から誘導
された発現プラスミドベクターに連結した。シグナルペ
プチドおよび膜アンカーを含むｐ９７の全コーディング
配列がベクター中へ挿入された。

【００４２】（5.3.1 ）ｐ９７ｃＤＮＡ配列の複製およ
び発現指向可能な組換え体発現ベクターの同定 外来遺伝子挿入物を含む発現ベクターを３つの一般方
法;（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド法、（ｂ）標識
遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入配列の
発現、により同定できる。第１の方法において、発現ベ
クター中へ導入された外来遺伝子の存在を外来遺伝子挿
入物に相同である配列を含むプローブを用いてＤＮＡ−
ＤＮＡハイブリッド法により検出できる。第２の方法に
おいて、組換え体ベクター／宿主系をベクター中の遺伝
子の挿入により生じた一定「標識」遺伝子機能（例えば
チミジンキナーゼ活性、抗体耐性、形質転換表現型な
ど）の存在または不在に基いて同定し、選択することが
できる。例えば、外来遺伝子がベクターの標識遺伝子配
列内に挿入されれば、ＤＮＡ挿入物を含む組換え体を標
識遺伝子機能がないことにより同定できる。第３の方法
において、組換え体発現ベクターは組換え体により発現
される外来遺伝子生成物の検定により同定することがで
きる。そのような検定は遺伝子生成物の物理的、免疫学
的または機能的性質に基くことができる。

【００４３】例えば、組換え体ワクシニアウイルスを本
発明により構築するとき、ｐ９７コーディング配列を含
むキメラ遺伝子をチミジンキナーゼ遺伝子中へ挿入し、
それによりＴＫ^- 表現型を不活性化しウイルス上に与え
る。そのような組換え体は、ＴＫ⁺ 細胞に対し致死性で
あるがＴＫ^- 細胞に対しそうでないヌクレオシドアナロ
グを５−ブロモ−デオキシウリジンを含む培地中で成長
する能力により選択される。組換え体はさらに腫瘍関連
タンパク質に特異性のｃＤＮＡプローブを用いるＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリッド法により同定される。ＴＫ^- 組換
え体ウイルスはプラーク精製により分離することがで
き、ストックが感染した培養細胞から調製される。組換
え体ウイルスはそのｐ９７関連ペプチドの合成を誘発す
る能力について試験することができる。この目的は、感
染細胞を放射性標識アミノ酸の存在下に成長させ、次い
で溶解し、感染放射性標識細胞のサブセル画分を、天然
黒色腫関連ｐ９７抗原を指向する抗体による免疫沈降に
より試験する。免疫沈降生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分割される。感染細胞はまた単クローン性抗体を用い
る免疫蛍光法により試験することができる。プラスミド
ベクターをトランスフェクションにより導入した細胞は
ＦＡＣＳ分析により、またはポリエステル布上の細胞コ
ロニーのレプリカの結合検定により容易に同定すること
ができる。存在するｐ９７関連ペプチドの量は定量ラジ
オイムノアッセイにより決定でき、そのサブセルの局在
は細胞分画によりおよび免疫蛍光顕微鏡法により決定す
ることができる。発現されたｐ９７関連ペプチドの構造
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、およびアミノ酸配列分析に
より決定できる。

【００４４】（5.3.2 ）発現ベクター宿主系からのｐ９
７関連ペプチドの精製 多くの腫瘍関連抗原例えばｐ９７は細胞表面糖タンパク
質であり、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端アンカ
ーペプチドを含む〔デービス (Devis)ほか、１９８５、
J. Mol. Biol.,１８１：１１１〜１２１〕。適当なベク
ター中に発現されるとき、タンパク質は細胞表面にトラ
ンスロケーションされることが予期される。タンパク質
の精製を促進するために、膜アンカー領域をコードする
ＤＮＡ配列を欠失させ、成熟タンパク質を培養基中へ放
出させることが好ましいであろう。ｐ９７関連ペプチド
は宿主細胞から界面活性剤溶菌し、次に単クローン性抗
体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精
製することができる。截形タンパク質を培養基から精製
すべきであれば、血清を含まない培地を用い、次いで単
クローン性抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることが好ましい。抗原がその抗体性を低下し
またはそれを変化させることなく抗体吸着剤から溶離で
きることが重要である。これは pＨの上下により、また
はカオトロープの使用により達成することができる。比
較的温和な条件下に抗原を放出する単クローン性抗体を
選択することが必要であろう。アフィニティー精製した
抗原はＨＰＬＣによりさらに精製することができる。

【００４５】（5.4 ）ｐ９７関連ペプチドの免疫学的確
認 合成または組換え体抗原の抗腫瘍応答を誘出する能力は
初めに実験動物中で評価することができる。これはヒト
黒色腫関連ｐ９７タンパク質を、適当な近交系の実験動
物種の細胞中に発現させるモデル系を構成することによ
り行なわれる。次いで動物を本発明のｐ９７関連ペプチ
ドで種々のプロトコルにより免疫処置し、次に黒色腫関
連ｐ９７抗原を指向する抗体の発生について、ｐ９７抗
原に対する細胞媒介免疫例えば遅延型過敏症について、
およびｐ９７抗原を発現する生育性同系腫瘍細胞の攻撃
を拒絶する能力について試験する。さらに、細胞免疫の
試験管内検定を行なってｐ９７関連ペプチドに応答した
リンパ球の増殖および免疫処置動物またはヒト黒色腫患
者のリンパ球のｐ９７抗原を発現する腫瘍細胞を殺す能
力を測定することができる。さらに、マウスをマウスｐ
９７で免疫処置することにより正常組織中に痕跡量で存
在する抗原に対する免疫応答を誘発できる程度を決定す
ることができる。

【００４６】非ヒト霊長類を用いて本発明のｐ９７関連
ペプチドの安全性を決定することができる。この目的の
ために動物をヒト癌患者に倫理的に適用できるプロトコ
ルを用いて免疫処置し、次いで前記のように試験するこ
とができるが、しかし腫瘍移植実験は、近交系の使用を
必要とするので容易ではない。免疫処置手順の安全性は
免疫処置動物の一般的健康（体重変化、熱、食欲、行動
など）に及ぼす免疫処置の影響および剖験で病理学的変
化を調べることにより決定される。最後に本発明のｐ９
７関連ペプチドをヒト癌患者において試験することがで
きる。進行癌患者において初期相Ｉ試験し、毒性のない
ことを決定した後、寛解中の、しかし高い再発可能性の
ある癌患者に試験することができる。それらの免疫応答
は、決定された患者または再発頻度に対する治療効果が
試験されることを除いて非ヒト霊長類に対して記載した
ように評価されよう。黒色腫抗原ｐ９７の場合に抗原を
発現する良性母斑（奇胎）もまた試験される。

【００４７】（5.5 ）ワクチンの配合 発明のこの態様の目的は、合成または組換えＤＮＡ技術
により、免疫原およびワクチンとして疾患再発のおそれ
の高い癌患者の保護に、確定疾患の治療に、および結局
は高危険個体の予防的な接種に使用できる合成ペプチ
ド、精製タンパク質または組換え体ウイルスを製造する
ことである。実際に、合成および組換え体黒色腫関連ｐ
９７抗原は他の免疫原と組合せて使用して黒色腫および
他の癌の予防に対する多価ワクチンを製造することがで
きる。種々のワクチン配合物の例は次に論議さえる。

【００４８】（5.5.1 ）ウイルスワクチン配合物 本発明のｐ９７関連ペプチドが組換え体ウイルスにより
生成されると、生組換え体ウイルスワクチンまたは不活
性組換え体ウイルスワクチンを配合することができる。
その選択はｐ９７関連ペプチドの発現に用いた組換え体
ウイルスの性質による。組換え体ウイルスが免疫処置さ
れる受容者に対し感染性であるが、しかし疾患を生じな
い場合に、生ワクチンを受容者中の増殖が同種かつ天然
の潜伏性感染を生ずる大きさの長期刺激を生じ、従って
実質的に長期継続免疫を与えるので好ましい。感染性組
換え体ウイルスは受容者中へ導入された後、そのキメラ
遺伝子からｐ９７関連ペプチドを発現し、それにより免
疫応答を刺激することができる。生組換え体ウイルスそ
のものを黒色腫に対する予防ワクチンとして使用するこ
とができる。これらの配合物中に用いるそのような組換
え体ウイルスの製造には試験管内（例えば組織培養細
胞）および生体内（例えば天然宿主動物例えばウシ）系
の両方が含まれることができる。痘瘡ワクチンの調製お
よび配合に対する普通の方法が生組換え体ウイルスワク
チンの配合に適用することができる。

【００４９】多価生ウイルスワクチンは種々の腫瘍また
は癌細胞の種々の抗原を発現する単一または数感染性組
換え体ウイルスから製造することができる。例えば、ワ
クシニアウイルス（外来ＤＮＡ約３５キロベースを収容
することができる）を組立て、他のエピトープに対する
コーディング配合を含ませることができ；そのような組
換え体ウイルス自体を多価ワクチン中の免疫原として使
用することができる。あるいは、それぞれ異なるエピト
ープをコードする種々の遺伝子の発現を指向できるワク
シニアの混合物および（または）他のウイルスを多価ワ
クチンに配合することができる。

【００５０】組換え体ウイルスが免疫処置される受容者
に対し感染性であってもなくても、不活性化ワクチン配
合物を製造することができる。不活性化ワクチンは、そ
れらの感染性が通常ホルムアルデヒド処理により破壊さ
れている意味で「死」である。理想的には、ウイルスの
感染性がウイルスの免疫原を支持するキャプシドまたは
エンベロープタンパク質に影響を及ぼさないで破壊され
る。不活性化ワクチンを製造するため、必要量の関連抗
原を与えるために多量の組換え体ウイルスを培養中に成
長させねばならない。異なるエピトープを発現する不活
性化ウイルスの混合物を「多価」ワクチンの配合に用い
ることができる。若干の場合には、これは一緒に投与さ
れる生ウイルスの相互干渉による潜在的困難のために生
ワクチン配合物に好ましいかもしれない。どの場合に
も、不活性化組換え体ウイルスまたはウイルスの混合物
は、それらの抗原に対する免疫応答を高めるために適当
なアジュバントと配合すべきである。適当なアジュバン
トには鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム；界面活性物
質例えばリソレシチン、プルロニックポリオール；ポリ
アニオン；ペプチドおよび油乳濁液が含まれるが、しか
しそれらに限定されない。多くの方法を用いて前記ワク
チン配合物を導入することができ；これらには皮内、筋
肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻腔内経路が含まれ
るが、しかしそれらに限定されない。生組換え体ウイル
スワクチン配合物を用いるとき、それを、組換え体ウイ
ルスをワクチン配合物になすのに用いた親野生型ウイル
スの自然感染経路により導入することができる。

【００５１】（5.5.2 ）サブユニットワクチン配合物 ウイルスワクチンの代りに、ｐ９７関連ペプチド自体を
免疫原としてサブユニットワクチン配合物中に用いるこ
とができる。サブユニットワクチンは単に受容者の免疫
処置に必要な関連免疫原物質を含む。従って、ペプチド
を発現する組換え体からｐ９７関連ペプチドを精製する
ことができる。そのような組換え体には前記ウイルス感
染培養細胞、細菌形質転換体、または酵母形質転換体の
いずれも含まれる。本発明の他の態様において、ｐ９７
関連ペプチドまたはタンパク質を化学的に合成すること
ができる。ｐ９７関連ペプチドが組換え体から精製され
てもまたは化合物に合成されても、最終生成物を適当な
濃度に調製し、適当なワクチンアジュバントと配合し、
使用のためパッケージすることができる。適当なアジュ
バントには：鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム；界面
活性剤物質例えばリソレシチン；ブルロニックポリオー
ル；ポリアニオン；ペプチド；および油乳濁液が含まれ
るが、しかしそれらに限定されない。ｐ９７関連ペプチ
ドはまたリポソーム中へ混合し、あるいは多糖および
（または）ワクチン配合物中に使用する他の重合体中へ
混合することができる。ｐ９７関連ペプチドがハプテ
ン、すなわち同族抗体と選択的に反応できる点で抗原性
であるが、しかし免疫応答を誘出できない点で免疫原で
ない分子、である場合に、ハプテンを担体または免疫原
分子に共有結合させることができ、ハプテン−担体をワ
クチンとして用いるために配合することができ、例えば
大タンパク質例えばタンパク質血清アルブミンはそれに
結合したハプテンに免疫原性を与える。

【００５２】（６）実施例：黒色腫関連ｐ９７抗原 下記実施例において、ｐ９７ mＲＮＡの種々の領域から
誘導したｃＤＮＡクローンを接合し、ｐ９７に関連する
ペプチドを発現させる発現ベクター中へ挿入した。発現
ベクター宿主細胞により生成されたｐ９７関連ペプチド
をワクチンに配合することができる。

【００５３】（6.1 ）ｐ９７ mＲＮＡの精製 ポリソームをＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫細胞〔カーレー
(Carey)ほか、１９７６、Proc. Natl. Acad. Sci., USA
、７３：３２７０〜３２８２〕からマグネシウム沈降
により調製した。この調製物からｐ９７新生鎖をもつポ
リソームを、ｐ９７の異なるエピトープに特異性の３つ
のＩｇＧ２ａ単クローン性抗体（９6.５、１１8.１、１
３3.２）〔ブラウン (Brown)ほか、１９８０、J. Biol.
Chem., ２５５：４９８０〜４９８３；ブラウン (Brow
n)ほか、１９８１、J. Immunol.,１２７：５３９〜５４
６：ブラウン (Brown)ほか、１９８１、Proc. Natl. Ac
ad.Sci., USA 、７８；５３９〜５４３；プローマン (P
lowman)ほか、１９８３、Nature、London、３０３：７
０〜７２〕とのインキュベーション、次いでプロテイン
Ａセファロース上のアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。ｐ９７濃縮 mＲＮＡをＥＤＴＡを用い
て溶離し、オリゴ（Ｔ）−セルロース〔ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ (Bethesda Research Labs., Bet
hesda, MD)製〕上のアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。典型的な試験において、１５０Ｅ₂₆₀
単位のポリソームがｐ９７濃縮 mＲＮＡ２６０ngを生
じ、それは全 mＲＮＡの0.２３％に相当する。クセノプ
ス卵母細胞中で翻訳し、記載されたようにｐ９７につい
て検定〔ブラウン (Brown)ほか、１９８１、Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA 、７８：５３９〜５４３；プロー
マン (Plowman)ほか、１９８３、Nature、London、３０
３：７０〜７２〕するとｐ９７濃縮 mＲＮＡが８００ｐ
g のｐ９７毎 mＲＮＡ ng を生じたが、ｐ９７非濃縮 m
ＲＮＡは0.４４ｐg のｐ９７毎 mＲＮＡｎg を生じ、ｐ
９７ mＲＮＡ活性が１８０倍高められたことを示した。
ｐ９７ mＲＮＡ活性の収率は４２％であった。網赤血球
溶解物系〔ペルハムほか (Pelham & Jackson) 、１９７
６、Eur. J. Biochem., ６７：２４７〜２５６〕中の翻
訳はｐ９７濃縮 mＲＮＡがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
して８4,０００ドルトンの見掛け分子量を有する主ポリ
ペプチドをコードしたことを示し、それは非濃縮 mＲＮ
Ａの翻訳生成物中に検出できず、ｐ９７に特異性の抗血
清により免疫沈降させた（第１図）。これはｐ９７の非
グリコシル化前駆物質であると結論された。

【００５４】（6.2 ）ｃＤＮＡクローンの調製および構
築 下記２法を用いて、分離した mＲＮ鋳型から転写される
ｃＤＮＡクローンを構築した。 （6.2.1 ）オリゴ（Ｔ）によりプライムされたｃＤＮＡ
クローンの構築 上に調製されたｐ９７濃縮 mＲＮＡをオリゴ（Ｔ）プラ
イムｃＤＮＡ合成に対する鋳型として用いた。ｃＤＮＡ
は次のようにｐＢＲ３２２中でクローンした：第１鎖ｃ
ＤＮＡ合成のためにｐ９７濃縮 mＲＮＡ、４つのｄＮＴ
Ｐおよびオリゴ（Ｔ）〔コラボラティブ・リサーチ (Co
llaborative Research, Walthma, MA)製〕を逆転写酵素
〔モレキュラー・ジェネティック・リゾーセス（Molecu
lar Genetic Resources)製〕とともにインキュベートし
た。第２鎖は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ〔ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ (Bethesda Research Labs, Be
thesda, MD) 製〕の大フラグメントとのインキュベーシ
ョンにより合成し、二重鎖ｃＤＮＡをＳＩヌクレアーゼ
〔ザ・フィード・ハッチンセン・カンサー・リサーチ・
センター（The Feed Hatchinsen Cancer Research Cent
er, Seattle, WA)のダーナム (D. Durnam)寄贈〕で消化
した。次いでｃＤＮＡを末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ (BethesdaResearch Labs, Bethesda, MD) 製〕でｄ
Ｃテーリングし、ＰstＩ消化ｄＧテールｐＢＲ３２２
〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ (Bethesda Res
earch Labs, Bethesda, MD) 製〕とともにアニーアリン
グし〔ビラ−コマロフ (Villa-Komaroff) ほか、１９７
８ Proc. Natl. Acad. Sci., USA、７５：３２７２〜３
７３１〕、CaCl₂ 処理大腸菌ＲＲ１の形質転換に用い
た。形質転換細菌のコロニーからのＤＮＡを紙に結合さ
せ〔タウブ・アンド・トンプソン (Taub & Thompson)，
１９８２、アナリティカル・バイオケミストリー（Ana
l. Biochem.),１２６：２２２〜２３０〕、ｐ９７濃縮
および非濃縮 mＲＮＡ鋳型上に合成したｃＤＮＡプロー
ブによる差次ハイブリッド法によりスクリーンした。

【００５５】２４３塩基対（ｂp ）クローン、ｐ９７−
３ａ２ｆ１、が同定され、それはｐ９７濃縮ｃＤＮＡに
ハイブリッド形成したが、非濃縮ｃＤＮＡに対し検定可
能にハイブリッド形成せず、またハイブリッド選択翻訳
試験においてｐ９７ mＲＮＡを選択した。ポリアデニル
化シグナル（ＡＡＴＡＡ）およびポリ（Ａ）トラクトは
ｃＤＮＡの３′に存在した（第２図参照）。ニックトラ
ンスレートしたｐ９７−３ａ２ｆ１は非濃縮黒色腫 mＲ
ＮＡより１００倍も強くｐ９７濃縮 mＲＮＡにハイブリ
ッド形成し、繊維芽細胞 mＲＮＡに対し検出可能に形成
しなかった。プローブとしてクローン化ｃＤＮＡによる
ノザンブロット分析は約４キロベース（ｋb ）の mＲＮ
Ａを同定し、それはＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫中に存在し
たが、繊維芽細胞に存在しなかった。

【００５６】（6.2.2 ）ｐ９７のゲノムクローニングお
よびｃＤＮＡ合成のプライムに対する合成オリゴヌクレ
オチドの使用 ポリアデニル化部位から１ｋb 以上延びるｃＤＮＡクロ
ーンを得る試みは、おそらく長い二次構造を有する高Ｇ
Ｃ含量（８０％以上）の領域のために不成功であった。
ゲノムクローニングを用いてこの問題を回避した。４重
複ゲノムクローンを、特定ｐ９７制限フラグメントを濃
縮したサイズ分画ＳＫ−ＭＥＬ２８ＤＮＡを含むλＬ４
7.１のライブラリーから分離した。この４ゲノムクロー
ンは２８ｋb をスパンし、遺伝子の調節領域を含めてｐ
９７の全コーディング領域を含む。５′から３′まで逐
次配列したゲノムクローンは：λＢ１５、λＨ１７、λ
Ｂ6.６およびλＥ7.７、である。命名法はフラグメント
の発生に用いた制限酵素を示す文字およびλＬ４7.１中
へクローンしたフラグメントのキロベース大きさを示す
数字からなる。従って、５′末端から出発してλクロー
ンＢ１５は１５ｋbＢamＨＩｐ９７フラグメントを含
み、λクローンＨ１７は１７ｋb Ｈind III ｐ９７フラ
グメントを含み、λクローンＢ6.６は6.６ｋb ＢamＨＩ
ｐ９７フラグメントを含み；λクローンＥ7.７は7.７ｋ
b ＥcoＲＩｐ９７フラグメントを含む（第３図参照）。
ノザンブロットで４ｋb ｐ９７ mＲＮＡに対しハイブリ
ッド形成したクローンの制限フラグメントが配列され、
ｐ９７エキソンを予期コーディング配列とヒトおよびニ
ワトリトランスフェリンのアミン酸配列との間のコンピ
ュータ補助相同調査により同定した〔ヤング (Yang) ほ
か、１９８４、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、８１：
２７５２〜２７５６；マギリブレイ(McGillivary)ほ
か、１９８２、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、７９：
２５０４〜２５０８；ジェッシュ・アンド・チャンボン
(Jetsch & Chambon）、１９８２、Eup. J.Biochem.,１
２２：２９１〜２９５〕。

【００５７】３合成オリゴヌクレオチド、ｐ９７ゲノム
エキソン配列を基にした配列、をＳＫ−ＭＥＬ２８ mＲ
ＮＡ上のｃＤＮＡ合成プライムに用い、生じたｃＤＮＡ
を次のようにλ−ｇt １０中へクローンさせた：ｐ９７
ｃＤＮＡをｄＧテーリングし、架橋剤オリゴヌクレオチ
ド（ＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ）およびＥcoＲ
Ｉで制限したλ−ｇt １０で連結した。架橋剤オリゴヌ
クレオチドはλ−ｇt１０のＥcoＲＩ部位中へのｄＧテ
ールｃＤＮＡ配列の挿入および連結を可能にした。λフ
ァージをパッケージし〔グロスベルド (Grosveld) ほ
か、１９８１，ジーン (Gene) １３：２２７〜２３
７〕、大腸菌ｃ₆₀₀ rK^- mK⁺ hfl 上で平板培養した。λ
−ｇt １０中のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブ
リッド法〔ベントン・アンド・デービス (Benton & Dev
is）１９７７、Science 、１９６：１８０〕によりゲノ
ムエキソンフラグメントをプローブとしてｐ９７挿入物
についてスクリーンした。プローブは³²Ｐ−ＴＴＰ〔ニ
ュー・イングランド・ニュークリア (New England Nucl
ear)製、３２００ｃｉ／ミリモル〕でニックトランスレ
ーションにより５〜１０×１０⁸ ｃｐｍ／μｇの比活性
に放射性標識した。ｐ９７mＲＮＡの2,３６８ヌクレオ
チドをスパンし、全コーディング領域を含む３重複ｃＤ
ＮＡクローン（１０ａ１、｜ｊ｜、２ｆ１）を、プロー
ブとしてｐ９７エキソン特異性フラグメントを使用する
ことにより同定した（第２図）。

【００５８】（6.３）ｐ９７のＤＮＡ配列分析 ｃＤＮＡ挿入物を切り出し、次の増殖および制限マッピ
ングのために大腸菌中のプラスミドベクターｐＥＭＢＬ
１８＋〔デント (Dente)ほか、１９８３、ニュークリッ
ク・アシッド・リサーチ (Nucleic Acids Res.) ，１
１：１６４５〜１６５５〕中へサブクローンした。ｃＤ
ＮＡはまたＭ１３ mｐ１８ファージクローニングベクタ
ー〔ヤニッシュ−ペロン (Yanish-Perrone) ほか、１９
８５、Gene、３３：１０３〜１１９〕中へサブクローン
し、サンガー (Sanger) のジデオキシ法〔サンガー (Sa
nger) ほか、１９７７、Proc. Natl. Acad. Sci., USA
、７４：５４６３〜５４６７〕を用いて配列した。大
挿入物を含むＭ１３クローンをＤＮＡ se Ｉ（ホング
(Hong）、１９８２、J. Mol. Biol.,１５８：５３９〜
５４９〕またはエキソヌクレアーゼIII 〔ヘニコフ (He
nikoff）、１９８７、Gene、２８：３５１〜３５９〕を
用いる欠失発生により、および合成２１mer オリゴヌク
レオチドプライマーの使用により配列した。

【００５９】ｐ９７ｃＤＮＡ配列は第４図及び第５図に
示される。2,２１４ヌクレオチドの読取り枠は第１ＡＴ
Ｇから伸び、その付近の配列は位置2,２１５におけるＴ
ＧＡに対してコザクにより決定された開始配列に一致す
る〔コザク (Kozak)１９８０、Nucleic Acid Res. 、
８：１２７〜１４２〕。大部分の５′ｃＤＮＡクローン
は開始ＡＴＧの上流にさらに６０ヌクレオチドを含む。
ｐ９７ mＲＮＡの３′非コーディング領域はｃＤＮＡク
ローンとして得られず、1,６６７ヌクレオチドを含む単
ゲノムエキソンと同定された。予期アミノ酸配列の残基
２０〜３２はｐ９７の既知Ｎ末端アミノ酸配列に一致し
〔ブラウン (Brown)ほか、１９８２、Nature、London、
２９６：１７１〜１７３〕、クローン化ｃＤＮＡの本性
を与える。さらに、前駆物質の予期分子量は８0,１９６
ドルトンであり、試験管内翻訳生成物の観測分子量とよ
く一致する。

【００６０】（6.４）ｐ９７コーディング配列を含む組
換え体発現プラスミドの構築 大サイズのｐ９７遺伝子は逆転写酵素による黒色腫 mＲ
ＮＡの特異的プライミングにより得られたｃＤＮＡクロ
ーンとの接合を必要とした。シグナルペプチドから膜ア
ンカー配列までのコーディング領域を含む３つのｃＤＮ
Ａλｇt １０（１０ａ１、｜ｊ｜および｜ｆ｜；第２図
参照）を用いた。クローン１０ａ１のｐ９７挿入物はＥ
coＲＩで消化することにより切り出し、ｃＤＮＡ１０ａ
１の５′端におけるオリゴ（ｄＧ）配列はエキソヌクレ
アーゼIII による消化により除去し、ｐ９７プレプロテ
インの開始メチオニから３０ｂp 上流にＨind III 部位
を有するクローン１０ａ１ｂを生成させた。３ｃＤＮＡ
クローン１０ａ１ｂ、｜ｊ｜および２ｆ１のｐ９７挿入
物およびゲノムクローンＥ7.７をＰvu II 、ＳstＩおよ
びＥcoＲＩ制限酵素部位で接合し、第２図に示すように
プラスミドベクターｐＥＭＢＬ１８＋〔デント (Dente)
ほか、１９８３、Nuc. Acid Res., １１：１６４５〜１
６５５〕のＨind III −ＥcoＲＩ部位に接入した。最終
構築物ｐ９７ｂはプラスミッドベクターｐＥＭＢＬ１８
＋中に4.４ｋb のｐ９７挿入物を含み、それを大腸菌Ｈ
Ｂ１０１の形質転換に用いた。ｐ９７ｂ中の挿入物は、
５′Ｈind III 部位および３′ＥcoＲＩ部位により結合
された３０ｂp のｐ９７ mＲＮＡの５′非翻訳領域、全
コーディング配列および３′非翻訳領域を含む。

【００６１】4.４キロベースのｐ９７挿入物をｐ９７ｂ
からＨind III およびＥcoＲＩで切り出し、端を大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて充
たした。プラント末端フラグメントを、ドクター・リチ
ャード・パルミター (Dr. Richard Palmiter, Universi
ty of Washington, Seattle, Washington)から入手した
真核ｃＤＮＡ発現ベクター１９９5.１２ｐＵＣ１３、ベ
クターｍＴｈＧＨ−１１２の誘導体（パルミター（Palm
iter）ほか、１９８３、Science 、２２２：８０９〜１
４〕中の特有ＳmaＩ部位中へ挿入した。このベクターは
真核細胞中に外来遺伝子を発現するためにマウスメタロ
チオネインプロモーターを用いる。正しい配向における
ｐ９７挿入物を有する構築物は制限分析により固定し、
ｐＭＴｐ９７ｂと称した。組換え体プラスミドはＬＭＴ
Ｋ^- 細胞中へ形質転換し、トランスフェクション体をＨ
ＡＴ培地中の成長により選定した。トランスフェクショ
ン皿からとったクローンを９６ウエルマイクロテストプ
レート中に広げ、スペント培養基およびレプリカ平板か
らの細胞溶解物を２座イミノラジオメトリー検定により
検定した。サブクローンを広げ再試験した。毎細胞約4,
００0,０００分子のｐ９７を発現するクローンＴＫＭｐ
９７−１２を成長させ、カドミウムで誘発させ、免疫処
置に対するｐ９７源として用いた。

【００６２】 （6.５）ｐ９７関連ペプチドによるマウスの免疫処置 ＴＫＭｐ９７−１２細胞を成長させ、カドミウムで誘発
させ、（１4.４ｇ）を氷上で１０分間７０ｍl ＴＮＥＮ
（２０ mＭトリス (Tris) −ＨCl、 pＨ8.０、１００ m
Ｍ− NaCl 、１ mＭ−ＥＤＴＡ、0.５％ＮＰ−４０〕と
ともにインキュベートすることにより溶解させた。溶解
物を２０0,０００Ｘｇで４５分間、４℃で超遠心し、溶
解物の半分をｐ９７に特異性の１ｍl イムノアフィニテ
ィーカラム（セファロースに結合した抗体９6.５のＦab
フラグメント）に通した。免疫吸着剤を広範囲に、初め
にＴＨＥＮ、最後に２０ mＭトリス−ＨＣl 、 pＨ6.8
で洗浄した。

【００６３】上記のように調製した吸着イムノアフィニ
ティーカラム0.５ｍl を２０ mＭトリスＨＣl 、 pＨ6.
８、0.５ｍl と混合し、完全フロイントアジュバント１
ｍlで乳化させた。４ＢＡＬＢ／ｃマウスそれぞれに乳
濁液0.５ｍl を腹腔内に与えた。３週後にマウスにこの
量の１／４の、不完全フロイントアジュバント中の抗原
で追加抗原刺激した。対照マウスはｐ９７に関連せず、
それ以外は同様に処理した抗体のイムノアフィニティカ
ラムで免疫処置した。ｐ９７免疫処置マウス４匹および
対照マウス２匹を追加免疫刺激１週後に採血した。血清
を放射性ヨウ素化ＳＫ−ＭＥＬ黒色腫細胞からの免疫沈
降、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥによりｐ９７に対する抗体に
ついて試験した。結果は４匹のｐ９７免疫処置マウスか
らの血清はｐ９７を免疫沈降したが、対照血清は陰性で
あったことを示した。血清はまた、グルタルアルデヒド
固定化ＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫細胞（２0,０００細胞毎
マイクロテストウエル）上のＥＬＩＳＡ検定を用いてｐ
９７を指向する抗体の存在について試験した。固定した
細胞は１／１0,０００希釈血清0.０５ｍl とともに室温
で１時間インキュベートし、洗浄し、次いでホースラデ
ッシュ (horseradish)ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウ
スＩｇＧ〔サザン・バイオテク (Southern Biotech)
製〕0.０５ｍl とともに室温で１時間インキュベートし
た。ｐ９７免疫処置マウスからの血清の光学濃度（４９
０ nｍにおける読み）は0.３５０、0.２４３、0.３４
３、0.２００であったが、対照からの血清の光学密度は
0.０３６および0.０５７であった。

【００６４】（6.6 ）ｐ９７の確認 （6.6.1 ）ｐ９７の構造 ｐ９７の構造を４構造ドメインを含むｐ９７前駆物質の
アミノ酸配列から決定した。前駆物質配列の残基２０が
成熟ｐ９７のＮ末端に相当するので、アミノ酸残基１〜
１９はおそらくシグナルペプチドを構成し、その結論は
その長さおよび疎水性により支持される。アミノ酸２０
〜３６１および３６２〜７１３は２つの３４２および３
５２アミノ酸の相同ドメインを含む。可能なＮ連結グリ
コシル化部位はＮ末端ドメイン中の位置３８および１３
５並びにＣ末端ドメイン中の位置５１５に生ずる。最後
にアミノ酸７１４〜７３８は主に未変化で疎水性の残基
の領域、細胞膜中のアンカーｐ９７であり〔デービス
(Devis)ほか、１９８５、J.Mol. Biol.,１８１：１１１
〜１２１）、細胞質中へ伸びることができると思われ
る。ｐ９７のドメイン構造はプロテアーゼ消化試験によ
り支持される。ｐ９７のトリプシン、パパインによる
〔ブラウン (Brown)ほか、J. Immunol.)１２７：５３９
〜５４６〕またはトロンビンによる消化は分子量約４0,
０００ドルトンのグリコシル化抗原フラグメントを生じ
た。フラグメントは³⁵Ｓ−メチオニンまたは³⁵Ｓ−シス
テインで代謝的に標識したｐ９７のトロンビン消化から
精製し、上記のように配列決定された〔ブラウン (Brow
n)、ほか、１９８２、Nature、London、２９６：１７１
〜１７４〕。システイン残基は位置７および１７に、メ
チオニン残基は位置２および２０に同定された。同様の
結果はインタクトｐ９７で得られ、ｃＤＮＡ配列から予
期されるｐ９７のＮ末端配列と完全に一致する。４0,０
００ドルトン分子量のプロテアーゼ耐性フラグメントが
ｐ９７のＮ末端ドメインに相当すると結論される。ｐ９
７のＣ末端ドメインは、おそらくそれがプロテアーゼ感
受性であるので分離できなかった。

【００６５】 （6.6.2 ）ｐ９７とトランスフェリンとの相同性 プロテイン・アイデンティフィケーション・リゾ (Prot
ein Identification Resource)〔レリース5.０：ディホ
フ (Dayhoff)ほか、１９８１、Nature、London、２９
０：８〕のアミノ酸配列ライブラリーの調査はｐ９７が
トランスフェリンの上科３成員：ヒト血清トランスフェ
リン、ヒトラクトトランスフェリンおよびニワトリトラ
ンスフェリンに強く相同性である（３７〜３９％相同、
第６図参照）。ヒトおよびニワトリトランスフェラーゼ
は互いに５０％相同を示すので、ｐ９７は３億年以上前
に血清トランスフェリンから分岐したにちがいない。ｐ
９７は各ドメイン中の相同位置に位置する１４システイ
ン残基を有する。ヒトトランスフェリンはこれらのシス
テインのすべてを両ドメイン中の相同位置に含み、ヒト
ラクトトランスフェリンおよびニワトリトランスフェリ
ンはこれらのシステイン残基の単に２つを欠く（それら
のＣ末端ドメイン中）。ｐ９７と異なり、これらのタン
パク質がそれらのＣ末端ドメイン中に４〜７追加システ
インを含み、それはＮ末端中に相当するものを有しな
い。ヒトトランスフェリンはまたそのＮ末端ドメインに
特有の２つのエキストラシステインを含む。ヒト血清ト
ランスフェリン、ラクトトランスフェリンおよびニワト
リトランスフェリン中のジスルフィドの大部分の位置は
直接決定された「マギリブレイ (McGillivray)ほか、１
９８２、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 、７９：２５０
４〜２５０８：メッツ・ブティーグ（Metz-Boutigue)ほ
か、１９８４、Eup. J.Biochem.,１４５：６５９〜６７
６；マズリール (Mazurier) ほか、１９８３、エクスペ
リエンティア (Experientia) (Basel)３９：１３５〜１
４１：マギリブレイ (McGillivray)ほか、１９８３、J.
Biol. Chem.,２５８：３５４３〜３５５３；ウイリアム
ズ (Williams）ほか、１９８２、Eup. J.Biochem.,１２
２：２９７〜３０３；ウイリアムズ (Williams）ほか、
１９７４、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.)、１４１；７４５〜７５２〕。従ってｐ９７の各ド
メイン中の７ジスフィド結合の存在を予期することがで
きる（第７図参照）。

【００６６】ｐ９７のドメイン間のアミノ酸の相同性
（４６％−９残基の７gap の挿入により達成された) は
ヒトトランスフェリン（４６％−１６gap 、４５残基）
またはニワトリトランスフェリン（３５％−１２gap 、
４９残基）中にみられたより一層顕著である。ｐ９７と
トランスフェリンとの間の広範な配列相同性およびシス
テインの保存に基く明らかに類似の折りたたみパターン
が与えられたので、トランスフェリンのこの低分解Ｘ線
構造〔ゴリンスキー (Gorinsky) ほか、１９７９、Natu
re、London，２８１：１５７〜１５８〕を精密にできれ
ば、ｐ９７の三次元構造を演繹することが可能であろ
う。

【００６７】（6.6.3 ）ｐ９７の機能 トランスフェリン上科中のその帰属関係、その鉄を結合
する能力〔ブラウン (Brown)、１９８２、Nature、Lond
on、２９６：１７１〜１７３〕、並びにトランスフェリ
ンおよびトランスフェリン受容体によるその普通の染色
体局在〔プロウマン (Plowman)ほか、１９８３、Natur
e、London、３０３：７０〜７２；ヤング(Yang) ほか、
１９８４、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,８１：２７５
２〜２７５６〕はすべて鉄輸送におけるｐ９７の役割を
支持する。トランスフェリンの鉄結合ポケットは２−３
チロシン、１−２ヒスチジンおよび単バイカーボネート
結合アルギニンを含むと思われる〔メッツーブティーグ
（Metz-Boutigue)ほか、１９８４、Eup. J.Biochem.)、
１４５：６５９〜６７６〕。ｐ９７中のこれらのアミノ
酸の保存は鉄代謝中の提案役割を支持する（第６図参
照）。ｐ９７は結合トランスフェリン様分子を結合した
膜であり、トランスフェリン受容体との相同性を有しな
い〔シュナイダー（Schneider)ほか、１９８４、Natur
e、London、３１１：６７５〜６７８〕ので、細胞の鉄
代謝におけるその役割は血清トランスフェリンの循環お
よびトランスフェリンに対する細胞の受容体により与え
られるものとは異なるであろう。真核細胞中のクローン
ｐ９７ｃＤＮＡの発現はその機能特性の実験試験を可能
にする。

【００６８】（6.6.4 ）結論 これらのデータに基き、黒色腫関連ｐ９７に対するｃＤ
ＮＡ構築物が得られたこと、およびこれらを哺乳動物細
胞中に有効に発現させ多量の抗原性ｐ９７を生成できる
ことが明らかである。

【００６９】 （７）クローン化ｐ９７の発現およびワクチン試験 ここに詳記する試験は、クローン化ｐ９７タンパク質の
発現およびそのワクチン試験の説明である。分泌された
形態（トランスフェクトマウス細胞クローンＢ１６ｓv
ｐ９７ａ. １４による）におけるｐ９７タンパク質の発
現はフルレングスｐ９７タンパク質のミリグラム量の精
製を可能にした。精製形態におけるタンパク質を細胞性
免疫のインビトロ誘発試験およびサブユニットワクチン
としてのその可能性の試験に用いた。ｐ９７遺伝子生成
物はまた転移マウス黒色腫細胞の細胞表面上に発現さ
せ、同系系中の腫瘍成長の予防におけるワクチンの有効
性を試験するモデルを与えた。有効細胞性免疫を発生で
きるワクチン配合物として使用するためにｐ９７遺伝子
を生ワクシニア組換え体ウイルス中へ挿入した。組換え
体ワクシニアウイルス、Ｖｐ９７ａ−ＮＹ、を体液性お
よび細胞性免疫を示す種々の検定を用いてそのマウス中
に免疫性を生ずる能力について評価した。上記同系マウ
ス腫瘍モデルを用いてＶｐ９７ａ−ＮＹ組換え体ウイル
スワクチンは腫瘍細胞攻撃からの防御効果を与えること
が示された。ワクチンはまた成長肺転移が存在するマウ
ス中に治療効果を与え、その性質は腫瘍が存在するヒト
黒色腫患者中の免疫治療抗腫瘍応答を生成させるワクチ
ンの提案された使用に類似する。

【００７０】ヒトｐ９７とマウス相同性タンパク質との
間に（試験した領域にわたる）僅か９１％の相同性があ
るマウスの研究に加えて、Ｖｐ９７ａ−ＮＹワクチンは
また非ヒト霊長類で試験した。ヒトｐ９７とサル型のタ
ンパク質との間には（単クローン性抗体レベルで交差反
応により示されるように）非常に密接な相同性がある。
「自己」タンパク質に対する免疫応答の発生の潜在的な
困難のために、非常に関連するマカク(Macaque) サルを
用いてＶｐ９７ａ−ＮＹワクチンの免疫原性を試験し
た。組換え体ワクシニアワクチンをサルで試験し、ｐ９
７タンパク質を指向する体液性免疫を誘発することが示
された。従って、生組換え体ワクチンウイルス２接種を
受入れた後６週間の期間にわたり、ずっとサルがワクチ
ンに対する暴露から有害な副作用の顕著な症候を示さな
かった。

【００７１】（7.1 ）プラスミドの発現 ＳＶ４０初期プロモーターＳＶ２により駆動された発現
プラスミドは、全３′ＵＴ領域が用いられることを除い
てプラスミドｐ９７ｂに類似するｃＤＮＡプラスミドク
ローンｐ９７ａから構築された（第８図）。すべてのｃ
ＤＮＡクローンは、前記のように初めに合成ＥcoＲＩ−
ｄＧで（９〜１７）リンカーを有するλｇt １０ライブ
ラリーから分離された。挿入体はＥcoＲＩにより切出さ
れ、次の増殖および確認のためにｐＥＭＢＬ１８＋中へ
サブクローンした。クローン１０ａ１はＭ１３ｍｐ１８
中へサブクローンし、ＲＦ形態をＢamＨＩおよびＳphＩ
で消化し、短時間エキソヌクレアーゼIII で処理し、Ｓ
１ヌクレアーゼでプラントし、クレノウで処理し、再び
連結した。若干のプラークを分離して配列決定すると、
その１つはｄＧ尾部が除去され、Ｍ１３ mｐ１８のＨin
d III 部位中へ挿入された３３ｂp のｐ９7 ５′非翻訳
領域を保持した。このサブクローンのＲＦ（１０ａｌ
ａ）はインタクトｐ９７ｃＤＮＡの発生に用い、そうで
なければ全フラグメントをプラスミドサブクローンから
分離した。１０ａｌａからの５５０ｂpＨind III −Ｐv
u II フラグメントおよび１Ｊ１からの７３５ｂp Ｐvu
II −ＳalＩフラグメントをＬＭＰアガロースゲルから
分離し、ｐＥＭＢＬ１８＋中へＳalＩおよびＨind III
部位で連結し、ｐ５′ｐ９７を生成させた。ｐＥＭＢＬ
１８＋中のＥ7.７ゲノムクローンをＥcoＲＩで完全に消
化し、ＳstＩで部分消化し、4.５ｋb フラグメントを0.
８％ＬＭＰアガロースによる分画により分離した。この
4.５ｋb ３′フラグメントは２ｆ１からの４０４ｂp Ｓ
stＩフラグメントおよび１ｊ１からの５３５ｂp ＢamＨ
Ｉ−ＳstＩフラグメントでｐＥＭＢＬ１８＋中へＳalＩ
およびＥcoＲＩ部位で連結してｐ３′ｐ９７を生成させ
た。次いでｐ５′ｐ９７の１２８５ｂp Ｈind III −Ｓ
alＩフラグメントをｐ３′ｐ９７中へ連結させ、ｐｐ９
７ａを生成させた。このクローンからのＥcoＲＩ−部分
ＨindIII フラグメントをｐＳＶ２neo 〔サザン (South
ern) ほか、１９８２、ジェー・モル・アプ・ジネト
(J. Mol. App. Genet.), １：３２７〜３４１〕中へＨi
nd III およびＥcoＲＩ部位で挿入し、ネオマイシンコ
ーディング領域およびＳＶ４０スプライス／ポリＡ配列
を排除するがＳＶ４０初期プロモーターおよび７２ｂp
エンハンサー、３３ｂp ｐ９7 ５′ＵＴＲ、全ｐ９７コ
ーディング領域、３′ＵＴＲおよび1.４ｋb ３′フラン
キングＤＮＡを保持した。生じたプラスミドをｐＳＶｐ
９７ａと称した。

【００７２】ｓｖ２駆動プラスミドはリン酸カルシウム
沈降により種々の真核細胞系中へトランスフェクション
し、発現細胞を優性選択性マーカーの同時トランスフェ
クションを用いてクローンし、選択した。これを行なう
ためにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、
１５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、４ mＭ−Ｌグルタミ
ン、1.３ mＭプロリンおよび抗生物質を含むハンクスＦ
１培地中で培養した。Ｂ１６細胞は、0.１５％重炭酸塩
およびＤＭＥＭ培地〔ギブコ (Gibco)〕中の１７３５細
胞を含み１５％ＦＣＳおよび抗生物質の両方を補足した
ＰＰＭＩ培地中で培養した。細胞は変形リン酸カルシウ
ム法〔ウィグラー (Wigler, M.) ほか、１９７８、セル
(Cell) 、１４：７２５〜７３１〕により、ｐＳＶ２ｐ
９７ａプラスミドＤＮＡ２０μｇ毎プレートおよびｐＳ
Ｖ２ＤＨＦＲまたはｐＳＶ２neo それぞれ0.５μｇでト
ランスフェクションした。プラスミドはすべてＥcoＲＩ
で線状化された。安定なトランスフェクション体をヒポ
キサンチン陰性（ＨＡＴ−）培地を用いてＣＨＯ細胞に
ついて、または0.５μｇ／ｍl ゲネチシン (Geneticin)
〔Ｇ４１８，ギブコ (Gibco)を用いてＢ１６および１７
３５細胞について選択した。生存細胞はトランスフェク
ション７日後に可視コロニーの形成が開始され、ガラス
ビーズにより適所に保持された無菌ポリエステルフィル
ターで覆った。フィルターを５日間適所に保持して細胞
をポリエステルマトリックス中へ成長させ、プレート上
にコロニーのレプリカを生成させた。次いでフィルター
をとり出し、ヨウ素化抗ｐ９７単クローン性抗体による
生細胞結合検定に用いた。標識した単クローン性抗体１
０ミクログラムを２０フィルターまでとともにＦＣＳ１
０ｍl 中で４℃で１時間インキュベートした。フィルタ
ーをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で広く洗浄し、乾
燥し、−７０℃で一夜ＸＡＲ−5 フィルムに暴露した。
次にフィルターを７％メチレンブルーで染色して細胞コ
ロニーを可視化した。Ｂ１６マウス系の除いて、用いた
全細胞系において発現細胞はその細胞表面上に抗原性ｐ
９７タンパク質を含有した。

【００７３】Ｂ１６トランスフェクト細胞において、ｐ
９７が培地中へ遊離され、この所見はこの細胞型に特有
である。ｐ９７の分泌は細胞の培地からフルレングスｐ
９７タンパク質の精製を可能にした。クローンＢ１６Ｓ
Ｖｐ９７ａ．１４はスペント培地中にｐ９７約４μｇ／
ｍl を発現した。組換え体ｐ９７は、培地中ヘ多量のｐ
９７抗原を分離するトランスフェクトクローンＢ１６Ｓ
Ｖｐ９７ａ．１４のスペント培地から精製された。小量
の新培地を連続的に加えることにより８５０cm ³ ローラ
ーボトル中に細胞を集密近くに（１０⁹ 細胞）に維持し
た。細胞は何週も分離することなく抗原を分離し続け、
スペント培地の連続的な回収および凍結を可能にした。
ｐ９７の精製はイムノアフィニティクロマトグラフィー
により、単クローン性抗体９6.５のＦabフラグメントに
結合したセファロースを用いて行なった。このためスペ
ント培地３リットルを一連の３つの３０ｍl カラム上で
行なった。第１カラムはＧ−２５超微粒セファデックス
〔ファルマシア (Pharmacia)製〕１５ｍl を含み、第２
カラムはセファロース４ｂ〔ファルマシア (Pharmacia)
製〕２０ｍl を含み、第３カラムは単クローン性抗体９
6.５のＦabフラグメント（１０mgタンパク質／セファロ
ースｍl ）に接合した臭化アミン活性化セファロース
〔シグマ (Sigma)製〕を含有した。次いでアフィニティ
ーカラムを冷ＰＢＳで広範に洗浄し、抗原を0.１Ｍクエ
ン酸塩、 pＨ５、３０ｍl および0.１Ｍクエン酸塩、 p
Ｈ４、３０ｍl で溶離させた。これらの条件は抗原の免
疫反応性を変えず、単クローン性抗原９6.５からの抗原
の完全溶離が達成されたことを示した。２溶離をそれぞ
れ3.０ｍl および4.５ｍl の２Ｍトリス、 pＨ８で中和
した。精製溶離液はアミコン (Amicon) 装置を用いてＰ
Ｍフィルターで濃縮し、ＰＢＳ１０ｍl ２容で洗浄し、
ブラドフォルド (Bradford) 検定〔バイオラド (Biora
d) 〕により測定して4.５ｍl 中に4.９５mgの最終収量
が残された。生成物１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験
し（第９図）、クーマシーブルーおよび銀の両染色によ
り可視化した。二重決定基免疫検定（ＤＤＩＡ）〔ブラ
ウン (Brown)ほか、１９８１、Proc. Natl. Acad. Sc
i., ７８：５３９〕はモル量の精製タンパク質の独立確
認を与えた。対照調製物を親Ｂ１６細胞系からのスペン
ト培地で平行して行ない、検出可能なタンパク質が示さ
れなかった。その後の調製において、９５％純ｐ９７タ
ンパク質３０mgをセファロースに接合した単クローン性
抗体９6.５Ｆabフラグメント３００mgから精製した。精
製ｐ９７タンパク質は免疫原性であり、セクション（7.
３）に記載されるように、タンパク質で免疫処置したマ
ウスに強い抗体応答を生じた。

【００７４】（7.2 ）組換え体ｐ９７ワクシニアウイル
スの構築および発現 ｐ９７のコーディング領域をｐ９７ａをＨind III で切
り、端部をブラント端に転化し、ＳmaＩ部位で開いたワ
クシニア挿入ベクターｐＧＳ−２０〔マケット（Macket
te）ほか、１９８４、Ｊ．Virol.４９：８５７〜８６
４〕中へ連結した。ＰＧＳ−２０ベクターは7.５Ｋプロ
モーターを利用し、ワクシニアチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子からのフランキング配列を含む。組換え体ウ
イルスはマケット（Mackette）ほかの前掲の方法により
生成させて、感染細胞に正しい大きさおよびグリコシル
化のｐ９７タンパク質の発現を生ずるＶｐ９７ａ−ＮＹ
を分離した（第１０図）。ｐ９７の表面発現はまた下記
組換え体ｐ９７ウイルスで感染した細胞中に確認された
（第Ｉ表）。

【００７５】

【表１】 表 Ｉ トランスフェクトマウス細胞および組換え体ワクシニア ウイルスで感染した細胞の表面ｐ９７発現¹⁾ 細胞感染に 発現ｐ９７ 細胞型 用いたウイルス 分子数毎細胞 M2SVp97a.A な し 3,210,000 M2SVp97a.E/F2 な し 434,000 Ｍ２親 な し 2,000 ＢＳＣ な し 5,590 ＢＳＣ Vwt-NYワクシニア 5,220 ＢＳＣ Vp97a-NYワクシニア 1,140,000 ────────────────────────── 1)細胞は短時間トリプシン処理し、洗浄し、管中へ分取し１０³ 、１０⁴ までま たは１０⁵ 細胞を入れた。非発現担体細胞は、合計１０⁵ 細胞が毎管に使用さ れるように低細胞数を管に加えた。１×１０⁶ cpm のヨウ素化単クローン性抗 体９6.５（１２３ nｇ）を全量５０μl 中で細胞とともに氷上で６０分間イン キュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清中で４回回転し 、次いで再懸濁し、マイクロメディック (Micromedic) ４／６００プラスガン マカウンター中で計数した。（−）は（未満）を示す。 ───────────────────────────────────

【００７６】（7.3 ）組換え体ｐ９７ワクシニアウイル
スはマウス中で免疫原性である Ｖｐ９７ａ−ＮＹによるマウスの接種は強体液性抗体応
答を生じた。マウスは１回免疫処置し、４週に１回追加
刺激し、次いで５週に採血した。力価はＥＬＩＳＡによ
り抗原被覆プレート、および検出試薬としてホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼに接合したプロテインＡを用
いて検定した。データは抗ｐ９７単クローン性抗体１３
3.２を用いて生じたＥＬＩＳＡ結合に対する標準曲線と
比較することにより単クローン性抗体当量に転換した。
結果は血清抗体の強い誘発を示した（第１１図）。細胞
免疫性はインビトロ増殖検定を用い、刺激抗原として精
製ｐ９７タンパク質で検出した（表II）。

【００７７】

【表２】 表 II マウス脾臓細胞の増殖検定 ¹⁾ Vp97組換え体 免疫性脾臓細胞の 対照脾臓細胞の 刺激抗原 増殖指数 増殖指数 Con A （10μg/ｍl) ７１ ５０ ｐ９７タンパク質 （３μg/ｍl) ２７ ２ （10μg/ｍl) ４３ ２ （20μg/ｍl) ５６ ２ （50μg/ｍl) ４４ ３ UV不活性検出ワクシニア ９１ ２ ウイルス(10⁷ pfu/ml) ｐ97トランスフェクト照射 ８６ ２ 同系腫瘍細胞(10⁴) 親照射腫瘍細胞(10⁴) ３ １ ─────────────────────────────── 1)脾臓細胞は、尾部乱切により１０⁷ pfu Ｖｐ９７ａ−ＮＹ組換え体ウイルスを 接種し、同用量で１月後追加刺激し、その１週後に殺したマウスから分離した 。無経験脾細胞をこの実験に対照として用いた。１０⁵ 細胞を0.５％正常マウ ス血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、重炭酸塩および2.５ ×１０⁵ Ｍ２−メルカプトエタノールを補足した0.２２ｍl ＲＰＭＩ中で９６ ウェル丸底プレート中の毎ウェルに培養させた。培養は第４日に２５μＣi ／ ウェルのトリチウム化チミジン（ニュー・イングランド・ニュークリア（New England Nuclear)製〕で６時間パルス標識し、ＰＨＤ細胞ハーベスターで回収 し、ベックマン（Backman)ＬＳ３８０１カウンター中でオプティフルオル (Op tifluor)を用いて計数した。増殖指数は各抗原で刺激した４重ウェルのcpm 平 均値を対照（培地）の平均cpm 平均値で除することにより算出した。 ─────────────────────────────────── 表IIに示される結果はＴ細胞がｐ９７タンパク質抗原に
応答して増殖していることを示す。

【００７８】ヘルパー細胞もまた免疫処置マウスからの
脾臓細胞中の組換え体ウイルスにより刺激されたかどう
かを確認するために、細胞をインビトロで刺激し、上澄
みをインターロイキン２（ＩＬ−２）、ヘルパーＴ細胞
因子、の生成について検定した。脾臓細胞は、予め組換
え体Ｖｐ９７ａ−ＮＹワクシニアまたは親ワクシニアで
２回免疫処置したマウスから培養した。１０⁵ 細胞を、
増殖検定に用いたものに等しい培地0.２ｍl 中で、９５
ウェル丸底プレート中、刺激抗原の存在または不在下に
４８時間インキュベートした。上澄みを採集し、４ウェ
ルからプールし、ＩＬ−２検定前に凍結した。ＩＬ−２
検定は、クリック (Click)培地で検定上澄みの希釈度を
変えて３重に各ウェル中でインキュベートした予めＩＬ
−２飢餓したマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ細胞１０⁴ を用い
た。標準曲線はゲネンテク (Genentech, CA)から入手し
た組換え体ＩＬ−２で構成した。ＣＴＬＬ細胞は２４時
間インキュベーションの最後の６時間に通常の増殖検定
技術によりチミジンでパルス標識し、次いで回収し、増
殖検定法に記載したように計数した。表III に示される
結果は組換え体ｐ９７ワクシニアウイルスで免疫処置し
たマウスの脾臓細胞からのＩＬ−２生成がｐ９７により
インビトロ刺激されることを示す。

【００７９】

【表３】 表 III ｐ９７免疫性脾臓細胞によるＩＬ−２生成の刺激 予防接種免疫原 インビトロ刺激 生成単位ＩＬ−２ Ｖｐ９７ａ−ＮＹ ｐ９７タンパク質 4.４ （２０μg/ｍl ) Ｖｐ９７ａ−ＮＹ 培 地 0.２５ Ｖwt−ＮＹ ｐ９７タンパク質 0.２５ （２０μg/ｍl ) Ｖwt−ＮＹ 培 地 0.２５ ──────────────────────────────

【００８０】さらに、遅延型過敏症応答をＶｐ９７ａ−
ＮＹ接種マウス中の足蹠膨潤検定を用いて測定した。毎
群５マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈen系) を尾部乱切により組換え
体または親株ワクシニアウイルスで接種した。６日後、
各マウスの後足を２０μl のＰＢＳまたは２０μl のＰ
ＢＳ中の細胞（５×１０⁵ 細胞毎マウス）の接種により
攻撃させた。足蹠は２４時間後に二重盲検方式でフォウ
ラー (Fowler) マイクロメーターを用いて測定した。Ｐ
ＢＳ注入足蹠の足蹠厚さを、各マウスから試験足の測定
厚さから差引き、増分足蹠膨潤の平均、並びに標準偏差
を計算した。表IVに示した結果は組換え体ｐ９７ワクシ
ニアウイルスで免疫処置したマウス中のｐ９７特異的遅
延型過敏症応答の誘発を示す。

【００８１】

【表４】 表 IV ｐ９７免疫性マウスにおける抗原特異性足蹠膨潤 予防接種免疫原 攻撃抗原 足蹠膨潤（mm×10^-2） Ｖp97a−NY ｐ９７トランスフェクト ４0.３ 同系腫瘍細胞 （＋／−6.８） Ｖp97a−NY 親同系腫瘍細胞 3.０ （＋／−2.８） Ｖwt−NY ｐ９７トランスフェクト 1.５ 同系腫瘍細胞 （＋／−2.３） Ｖwt−NY 親同系腫瘍細胞 5.５ （＋／−5.０） ──────────────────────────────

【００８２】（7.4)マウス腫瘍モデル中のｐ９７ワクシ
ニアウイルスによる防御および治療 予防接種の有効性を評価するために、マウスを種々のプ
ロトコルで本発明の組換え体ｐ９７ワクシニアウイルス
を用いて予防接種し、次いでｐ９７トランスフェクト同
系腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ．２Ｅ）で攻撃した。こ
のため、マウスをＶｐ９７ａ−ＮＹ組換え体生ワクシニ
アウイルスまたは親株（Ｖwt−ＮＹ）で尾部乱切によ
り；あるいは１００μｇ精製ｐ９７タンパク質または５
×１０⁶ 照射Ｍ２−Ｋ１７３５腫瘍細胞で腹腔内で完全
フロイントアジュバント中で免疫処置した。静脈内腫瘍
細胞攻撃は最後の予防接種の２週後にＭ２ＳＶｐ９７
ａ．２Ｅ、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動された
表現プラスミド中に含まれたヒトｐ９７コーディング配
列でトランスフェクトすることによりＭ２−Ｋ１７３５
（マウス黒色腫モデル）から調製した転移腫瘍クローン
の注入により与えた。種々の発現クローンを選択し、腫
瘍攻撃に用いたもの、クローンＭ２ＳＶｐ９７ａ．２
Ｅ、は培地水準、約４０0,０００分子毎細胞またはヒト
黒色腫ｐ９７抗原密度に等しいｐ９７を発現する。静脈
内腫瘍攻撃の２用量５×１０⁵ または１×１０⁵ 細胞を
用いて、それを同系Ｃ３Ｈ／Ｈenマウスの尾静脈中へ注
入した。マウスは腫瘍攻撃１６日後に殺し、肺をとり出
した。墨汁で染色した肺上に肉眼可視腫瘍が存在すれば
陽性と記録した。結果は表Ｖに示される。

【００８３】

【表５】 表 Ｖ 予防接種マウスの同系ｐ９７トランスフェクト 黒色腫細胞による攻撃 明らかな肺転移を ワクチン 免疫処置の数 攻撃細胞用量 有するマウスの数 Ｖp97a−NY ２ ５×１０⁵ １／５ 〃 １ 〃 ２／４ 照射同系 ２ 〃 ０／４ 黒色腫細胞 Ｖwt−NY ２ 〃 ９／10 p97 タンパク質 ２ 〃 ３／３ Ｖp97a−NY ２ １×１０⁵ ０／１ 〃 １ 〃 ０／４ 無 経 験 ０ 〃 ５／６ ──────────────────────────────── 表Ｖに示される結果はＶｐ９７ａ．ＮＹの２免疫処置で
顕著な防御効果があったが、しかし精製ｐ９７タンパク
質ワクチンで（非常に高い抗体価を誘出したにもかかわ
らず）防御効果が認められなかったことを示す。組換え
体ウイルスの細胞性免疫を誘発する能力はその防御腫瘍
免疫性に関与することができる。

【００８４】治療試験において、マウスにｐ９７発現腫
瘍細胞低用量で、次いで２日後組換え体ワクシニアワク
チンで接種した。マウスは、１０⁵ または１０⁴ のｐ９
７発現腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ．Ｅ）で静脈内攻撃
した。２日後にマウスに尾部乱切によりＶｐ９７ａ−Ｎ
ＹまたはＶwt−ＮＹを接種した。毎週尾部乱切により接
種を繰返し、マウスの生存を記録した。結果は第１２図
に示され、肺転移が存在するマウス中の組換え体ワクシ
ニアウイルス予防接種の治療効果を示す。

【００８５】（7.5)組換え体ｐ９７ワクシニアウイルス
はマカクサル中で免疫原性である ２マカカ・ファシクラリス (Macaca fasicularis) （マ
カク）サルをＶｐ９７ａ−ＮＹ組換え体ワクシニア２×
１０⁸ プラーク形成単位 (pfu)または同用量の親株ワク
シニアで乱切した。２週後に血清をＥＬＩＳＡによりワ
クシニアおよびｐ９７に対する力価について試験した。
表VIに示される結果はｐ９７に対する体液性抗体がＶｐ
９７−ＮＹの１回接種の２週後に検出可能であったこと
を示す。

【００８６】

【表６】 表 VI ワクシニア接種サル中の血清抗体価 抗ワクシニア価 抗ｐ９７価 （２倍バックグランド) （μg/ｍl 単クロー) 免疫原／週 （ による血清希釈） ( ン性抗体当量 ) Ｖp97a-NY ／週０ １／20 0.54 Ｖp97a-NY ／週２ １／2000 6.54 Ｖwt-NY ／週０ １／20 0.50 Ｖwt-NY ／週２ １／2000 0.34 ─────────────────────────────

【００８７】（８）微生物の寄託 示したプラスミドを選ぶ次の大腸菌（Ｅ．coli) 株はエ
ー・ティー・シー・シー（ＡＴＣＣ，Rockville, MD.)
に寄託され、次の寄託番号を指定された：大腸菌株 プラスミド 寄託番号 E. coli HB101 ｐ９７ｂ 53,403 次の組換え体ワクシニアウイルスはエー・ティー・シー
・シー（ＡＴＣＣ，Rockville, MD.) に寄託され、次の
寄託番号を指定された：ウイルス 寄託番号 Ｖp97a-NY VR2159 示したプラスミドを運ぶ次の細胞系がエー・ティー・シ
ー・シー（ＡＴＣＣ，Rockville, MD.)に寄託され、次
の寄託番号を指定された：細胞系 プラスミド 寄託番号 TKMp97-12 PMTp97b CRL8985 (マウス細胞) B16SVp97a.14 pSVp97a CRL9304 (マウス黒色腫細胞)

【００８８】寄託した態様は本発明の１観点の単なる例
示として意図されているので本発明は寄託した微生物お
よび細胞により範囲を限定されるべきでなく、機能的に
等しい微生物または細胞はいずれも本発明の範囲内にあ
る。事実、ここに示され、記載されたものに加えて本発
明の種々の変形は、前記記載および図面から当業者に明
らかになろう。そのような変形は特許請求の範囲内に属
するものである。ヌクレオチドに対して示した塩基対の
大きさはすべて近似値であり、説明のために用いられて
いることもまた理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割したｐ９
７ mＲＮＡの細胞を含まない翻訳生成物のオートラジオ
グラフを示し、第１図Ａは mＲＮＡ全翻訳生成物、第１
図Ｂは抗ｐ９７血清で免疫沈降した mＲＮＡ翻訳生成物
に関し、レーン１はｐ９７濃縮 mＲＮＡの翻訳生成物
を、レーン２は非濃縮 mＲＮＡの翻訳生成物を表す。

【図２】第２図はｐ９７ mＲＮＡの構造の線図を示す。

【図３】第３図はλＬ４7.１中でクローンしたゲノムク
ローンＢ１５、Ｈ１７、Ｂ6.６およびＥ7.７の線図を示
す。

【図４】第４図及び第５図はヒトｐ９７前駆物質ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列およびその演繹アミノ酸配列を表
わす図である。

【図５】第４図及び第５図はヒトｐ９７前駆物質ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列およびその演繹アミノ酸配列を表
わす図である。

【図６】第６図はｐ９７前駆物質の予期アミノ酸配列お
よびヒトセロトランスフェリンのそれの比較を示す図で
ある。

【図７】第７図はトランスフェリンの上科成員間に保持
されたシステイン残基の存在に基くｐ９７の構造の二次
元モデルの線図である。

【図８】第８図はｐ９７ｃＤＮＡクローンおよびｐ９７
発現ベクターの構築に用いるゲノムクローンλＥ7.７の
フラグメント；並びにｐＳＶ２ｐ９７ａ発現ベクターの
遺伝子構造の線図であり、

【図９】第９図は組換え体ｐ９７タンパク質の確認およ
び免疫精製における電気泳動の結果を示す図であり、Ａ
はクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル、Ｂはオートラジオグラムである。

【図１０】第１０図はトランスフェクト細胞またはＶｐ
９７ａ−ＮＹ感染細胞中の発現ｐ９７の放射免疫沈降の
結果を示す図である。

【図１１】第１１図はｐ９７ワクチンで免疫処置したマ
ウス中の血清抗体価を示すグラフである。

【図１２】第１２図は組換え体ｐ９７ワクシニアウイル
ス（Ｖｐ９７ａ−ＮＹ）による腫瘍攻撃マウスの予防接
種の治療効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 グレゴリー ディ プローマン アメリカ合衆国 ワシントン州 98101 シアトル ユニオン 313−1000 (72)発明者 ティモシー エム ローズ アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノース イースト フィフティ ナインス 326 (72)発明者 カルル イー ヘルストロム アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノース イースト サーバー ドライヴ 3925 (72)発明者 インゲガルド ヘルストロム アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノース イースト サーバー ドライヴ 3925 (72)発明者 アンソニー エフ パーチオ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イレブンス アベニュー イー スト 2011 (72)発明者 シウ ロク フー アメリカ合衆国 ワシントン州 98052 レッドモンド ワンハンドレッドアンドセ ブンティーフィフス ノース イースト 14128 (72)発明者 スリドハル ペンナテュール アメリカ合衆国 ワシントン州 98199 シアトル トゥエンティファースト ウエ スト 3400

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＴＣＣに寄託され、受託番号５３４０
   ３号を指定された大腸菌(Escherichia coli)に含まれる
   プラスミドｐ９７ｂからなる組換え体ＤＮＡベクター。
2. 【請求項２】 ＡＴＣＣに寄託され、受託番号５３４０
   ３号を指定された大腸菌(Escherichia coli)に含まれる
   プラスミドｐ９７ｂからなる組換え体ＤＮＡベクターを
   含む細菌。
3. 【請求項３】 ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＣＲＬ89
   85を指定されたＴＫＭｐ９７−１２に含まれるプラスミ
   ドｐＭＴｐ９７ｂからなる組換え体ＤＮＡベクター。
4. 【請求項４】 ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＣＲＬ89
   85を指定されたＴＫＭｐ９７−１２に含まれるプラスミ
   ドｐＭＴｐ９７ｂからなる組換え体ＤＮＡベクターを含
   む哺乳動物細胞系。
5. 【請求項５】 ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＣＲＬ93
   04を指定されたＢ１６ＳＶｐ９７ａ．１４に含まれるプ
   ラスミドｐＳＶｐ９７ａからなる組換え体ＤＮＡベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＣＲＬ93
   04を指定されたＢ１６ＳＶｐ９７ａ．１４に含まれるプ
   ラスミドｐＳＶｐ９７ａからなる組換え体ＤＮＡベクタ
   ーを含む哺乳動物細胞系。