SE506024C2 - Melanomassocierat P97 antigen och immunogen komposition - Google Patents

Description

506 024 Friend-, Moloney- eller Rauscher-murinleukemivirus, har hori- sontell och vertikal transmission av onkogeniska virus i na- turen påvisats; i själva verket finns nu tillgängligt ett kommersiellt vaccin mot virusinducerad kattleukemi och sar- kom.

I motsats härtill har en viral etiologi av de flesta human- cancerformerna ej påvisats. Anmärkningsvärda undantag är he- patitvirus (hepatom), herpes-simplex-virus (cervikalkarcinom) och Epstein-Barr-virus (nasofaryngialt karcinom). Under de sista två årtiondena har det emellertid fastslagits att vissa humantumörceller expressionsdefinierar tumörantigener, d.v.s. antigener som skiljer tumörcellerna från deras normala cellu- lära motsvarigheter; vissa patienter utvecklar cellmedierade eller humorala immunsvar mot dessa antigener (Hellstrom et al. 1968, Nature, 220:1352; Morton et al., 1968, Science 162: 1279-1281; Shiku et al., 1976, J.Exp.Med. 144: 873-881). Vissa av målobjekten för dessa immunsvar är onkofetala antigener eller differentieringsantigener kodade av humangenomen (Hell- strom et al., 1970, Int. J. Cancer 6: 346-351).

Till nyligen har den molekylära naturen hos tumörantigenerna varit okänd och graden av tumörspecificitet hos de immunolo- giska reaktionerna har varit oklar. Försök att utnyttja denna information vid utvecklandet av cancerdiagnostiska analysme- toder eller cancerterapi har i stor utströckning icke varit framgångsrika. Eftersom spontana tumörregressioner är ytterst sällsynta kan man även draga den slutsatsen att de immunsvar som påvisas in vitro är ineffektiva in ning; så exempelvis kan antikroppar och lymfocyter, erhållna från en cancerpatient, vara effektiva när det gäller att döda tumörceller in niiin medan immunsvaret hos samma cancerpatient ej har någon effekt in vivo.

Införandet av Kohler och Milstein av tekniken med monoklonala antikroppar (1975, Nature 256: 495-497) ledde till ett inten- sivt sökande efter humantumörantigener eftersom nämnda teknik tillhandahöll medel att definiera dylika antigener, både på 506 024 den molekylära nivån och med avseende på specificitet (Hell- strom och Brown, 1979, "The Antigens", M. Sela, ed., Aca- demic Press, Vol. V:1-66). Under de sista åren har ett stort antal tumörassocierade antigener beskrivits, av vilka de fles- ta har definierats av monoklonala musantikroppar; Reisfeld och Sell, red., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, sid. 1-609. Ehuru praktiskt taget samtliga de antigener som har karakteriserats väl har visat sig vara onkofetala antigener eller differentieringsan- tigener och deras specificitet med avseende på tumörer har vi- sat sig vara kvantitativ snarare än kvalitativ, är flera an- tigener tillräckligt specifika med avseende på neoplastiska i motsats till normala celler (i allmänhet motsvarande en fak- tor av 10-1000 gånger) för att kunna användas som potentiala målobjekt för att identifiera tumörceller och för terapi. Mo- noklonala humanantikroppar mot tumörantigener har även erhål- lits (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030).

Detta stöder det tidigare anförda belägget att vissa cancer- patienter utvecklar en immunreaktion mot sina tumörer.

Mer än hälften av de tumörassocierade cellyteantigener som hit- tills har identifierats är proteiner eller glykoproteiner koda- de av humangenomen (snarare än av endogena eller exogena virus), varvid återstoden utgörs av glykolipider, som härrör från onor- mal expression eller reglering av glyosyltransferaser. 2.2. MELANOMASSOCIERAT p97-ANTIGEN p97-antigenet är ett tumörassocierat antigen som först identi- fierades i humanmelanom under användning av monoklonala anti- kroppar (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980-4983; Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6114-6118; Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2183-2187). p97-antigenet har studerats ingående med avseende på dess ex- pression i normala och neoplastiska vävnader och är närvarande i de flesta humanmelanom och i vissa fetala vävnader men har endast återfunnits i spårmängder i normal vuxenvävnad (Brown 506 024 et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:539-543; Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29:511-515). p97 har använts som mâlob- jekt för diagnostisering av melanom vid kliniska prövningar på människa (Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:2101- -2114). p97 är ett monomert cellyte-sialoglykoprotein med en skenbar molekylvikt (MV), uppmätt genom natriumdodecylsulfat-poly- akrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE), av något mindre än 97000 dalton. Monoklonala antikroppar har definierat tre an- tigeniska huvudcentra, som är närvarande på ett stabilit tryp- tiskt fragment om 40 000 dalton (Brown et al., 1981, J. Immu- nol. 127:539-546); den fullständiga sekvensen för p97 har emellertid ej rapporterats. Minst två andra oberoende karak- teriserade humanmelanomassocierade antigener, gp95 (Dipold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6114-6118) och gp87 (Knos- ravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35:73-80), synes vara iden- tiska med p97 vid analys med sekventiell immunoprecipitation.

Den N-terminala aminosyrasekvensen hos p97 är homolog med transferrin och i likhet med transferrin binder p97 järn (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Analys av somatiska cellhybrider och hybridisering in situ har visat att p97-genen, i likhet med generna för transferrin och trans- ferrinreceptor, är lokaliserad på den kromosomala regionen 3q21-3q29 (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303:70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2752-2756).

Dessa observationer visar att p97 spelar en roll vid järnmeta- bolismen. 2.3. CANCERVACCINER Undersökningar på försöksdjur, vanligen möss, har visat att immunisering med levande eller avdödade cancerceller kan leda till bortstötning av en efterföljande infektion av levande cancerceller. Försök att immunisera med cellfritt material har i allmänhet varit mindre framgångsrika men viss framgång har 506 024 rapporterats. (För en sammanfattning se Hellstrom och Brown, 1975 i Egg Antigens, M. Sela ed. Academic Press, Vol. V:1-66). I många fall har de målantigener som ansvarar för skyddseffekter- na kodats viralt men i många andra fall är naturen hos det an- tigen som framkallar ett immunskyddssvar okänd.

Undersökningar på människa är mycket svårare att utföra och effektiviteten av cancervacciner har diskuterats, trots vissa rapporter om framgång. I många fall har vaccinpreparaten be- stått av bestrålade tumörceller eller tumörceller dödade ge- nom exponering för vissa kemiska medel. Eftersom rena human- tumörassocierade antigener ej har funnits tillgängliga finns det icke nâgra rapporter om deras användning i vacciner.

En teoretisk huvudinvändning mot den föreslagna användningen av cancervacciner på människa är att människor, som exempelvis "vaccineras" med avdödade cancerceller eller cellfria preparat, blir immunologiskt icke-responsiva eftersom de tumörantigener som kan utgöra målobjekt för immunsvaret är närvarande, ehuru endast i spårmängder, i vissa normala celler och således av immunsystemet uppfattas som "egna". De flesta, om ej alla, tu- mörassocierade antigener som påvisas i humantumörer med mono- klonala antikroppar är även närvarande i vissa normala vävna- der och det finns ringa belägg för att cancerpatienter svarar på dessa effektivt in vivg. Det finns belägg för att supressor- celler spelar en betydande roll vid nedregleringen av immun- svaret mot tumörantigener (Nepom et al., 1983, Experientia, 39:235-242). Vidare kan ett suppressorcellsvar som induceras av en uppsättning av tumörantigener förhindra inducering av ett effektivt tumördestruktivt svar mot en annan uppsättning av tumörantigener, vilka i sig ej skulle inducera suppression (Hellstrom et al., 1983, Biomembranes, A. Nowotny ed., Plenum Press, pp. 365-388). 2.4. REKOMBINERANDE DNA-TEKNIK OCH VACCINIAVIRUS Användningen av rekombinerande DNA-teknik för framställning av "subunit"-vacciner för skydd mot infektioner innefattar mole- 506 024 kylär kloning och expression i en lämplig vektor av genetisk information, som kodar för proteiner, vilka kan framkalla ett immunsvar mot proteinet i värddjuret. Nyligen har en metod be- skrivits, som är potentiellt användbar vid framställning av "subunit"-vacciner (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad.

Sci. 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857- -864; Panicali D. och Paoletti E., 1982, Proc. Natl. Acad.

Sci. 79: 4927-4931). Denna metod innefattar användningen av vacciniavirus som en vektor för att expressionsdefiniera främmande gener införda i dess genom. Vid införande i värd- djuren expressionsdefinierar det rekombinerande vacciniaviru- set den införda främmande genen och framkallar därigenom ett värdimmunsvar mot dylika genprodukter. Eftersom levande re- kombinerande vacciniavirus kan användas som vaccin kombinerar denna metod fördelarna med både "subunit"-vacciner och levan- de vacciner.

Vacciniavirus innehåller en linjär dubbelsträngad DNA-genom om ca. 187 kilobaspar och replikeras inom de infekterade cel- lernas cytoplasma. Dessa virus innehållerett.fullständigt transkriptionellt enzymsystem (innefattande blockerings-, me- tylerings- och polyadeneleringsenzymer) inom den viruskärna som är nödvändig för virusinfektivitet. Vacciniavirus-trans- kriptionella kontrollsekvenser (promotorer) medger initiering av transkription av vaccinia-RNA-polymeras men ej av värd- cell-RNA-polymeras.

Expression av främmande DNA i rekombinerande vacciniavirus kräver legering av vacciniapromotorer till de proteinkodande DNA-sekvenserna hos den främmande genen. Plasmidvektorer, även benämnda införingsvektorer, har konstruerats för att införa chimeriska gener i vacciniavirus. En typ av införingsvektor består av: (a) en vacciniaviruspromotor innefattande det trans- kriptionella initieringsstället; (b) flera unika restriktions- endonukleas-kloningsställen lokaliserade nedströms om det transkriptionella startstället för införande av främmande DNA- -fragment; (c) icke-essentiell vacciniavirus-DNA (såsom TK-ge- nen), som flankerar promotor- och kloningsställena, som styr 7 i 506 024 införandet av den chimeriska genen i den homologa icke-essen- tiella regionen av virusgenomen; och (dl en bakteriell repli- kationskälla och antibiotikaresistensmarkör för replikation och selektion i §. ggli. Exempel på dylika vektorer beskrives av Mackett (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864).

Rekombinerande vacciniavirus framställes genom transfektion av rekombinerande bakteriella införingsplasmider, som innehål- ler den främmande gelen, i celler som tidigare har infekte- rats med vacciniavirus. Homolog rekombination äger rum med de infekterade cellerna och resulterar i införandet av främ- mande gen i den virala genomen. De infekterade cellerna kan “screenas" under användning av immunologisk teknik, DNA-plack- hybridisering eller genetisk selektion för rekombinerande vi- rus, som därefter kan isoleras. Dessa vacciniarekombinanter bibehåller sina växentliga funktioner och infektivitet och kan konstrueras till att upptaga ca. 35 kilobaser av främman- de DNA.

Främmande genexpression kan påvisas genom enzymatiska eller immunologiska analysmetoder (exempelvis immunoprecipitation, radioimmunoanalys eller immunoblotting). Naturligt förekom- mande membranglykoproteiner, som produceras från rekombine- rande vacciniainfekterade celler, är glykosylerade och kan transporteras till cellytan. Höga expressionsnivâer kan upp- nås genom användning av starka promotorer eller genom kloning av multipelkopior av en enda gen. 3. SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Vaccinberedningar beskrives, vilka kan användas för att indu- cera ett immunsvar, som selektivt förstör melanomceller hos vaccinerade individer. Närmare bestämt innefattar vaccinbe- redningarna enligt föreliggande uppfinning en immunogen, som inducerar ett immunsvar riktat mot ett melanomassocierat an- tigen såsom det melanomassocierade p97-antigenet. Enligt upp- finningen är ett antal vaccinberedningar möjliga. Så exempel- vis innefattar immunogenen hos ett "subunit"-vaccin enligt 506 024 föreliggande uppfinning en peptid eller protein relaterat till p97, som kan beredas med en lämplig adjuvans. Dylika peptider eller proteiner innefattar aminosyrasekvenser härrörande från hela eller en del av aminosyrasekvensen hos p97, i huvudsak såsom visas i Fig. 3, som innefattar men ej begränsas till ändrade aminosyrasekvenser, där funktionellt ekvivalenta amino- syrarester ersätter rester inom sekvensen, vilket resulterar i en tyst förändring och/eller modifierade eller bearbetade ami- nosyrasekvenser, exempelvis glykosylerade aminosyrasekvenser, fosforylerade aminosyrasekvenser etc., eller kemiskt modifie- rade aminosyrasekvenser. I det följande kommer peptiderna el- ler proteinerna enligt föreliggande uppfinning, vilka är rela- terade till det melanomassocierade p97-antigenet att betecknas som p97-relaterade peptider" oavsett om de är förändrade, oför- ändrade, modifierade elller omodifierade. När den p97-relate- rade peptiden är en hapten (d.v.s. antigenisk men ej immuno- genisk) kan haptenen konjugeras till en bärarmolekyl, som förlänar immunogenicitet.

De p97-relaterade peptiderna enligt uppfinningen kan framstäl- las under användning av rekombinerande DNA-teknik och/eller kemiska syntesmetoder. När p97-relaterade paptider kemiskt syntetiseras kan dylika syntetiska p97-relaterade peptider in- nefatta sådana aminosyrasekvenser som härrör från regioner av p97 som förväntas vara antigeniska (Hopp och Woods, 1981, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828). När de p97-relaterade peptiderna enligt föreliggande uppfinning framställes under användning av rekombinerande DNA-teknik införes en nukleotid- sekvens, som kodar hela eller en del av p97, i en rekombine- rande expressionsvektor,.såsom ett virus eller en plasmid, som i ett lämpligt värddjur kan styra expressionen av en p97- -relaterad peptid, vilken kan renas från odlingsmediet. Den nukleotidsekvens som införes härrör från hela eller delar av p97-sekvensen, i huvudsak såsom anges i Fig. 3, som innefattar men ej är begränsad till nukleotidsekvenser, där funktionellt ekvivalenta nukleotidkodoner ersätter kodoner inom sekvensen, vilket resulterar i en tyst förändring; med andra ord olika kodoner, som kodar samma aminosyra eller dess funktionella 9 506 024 ekvivalent, kan ersätta varandra inom den i Pig. 3 visade sek- vensen. När en plasmidexpressionsvektor användes föredrages en sådan som är lämplig för expression i eukaryotiska celler, men en prokaryotisk expressionsvektor kan även användas.

Enligt en annan utföringsform av uppfinningen, där expres- sionsvektorn är ett rekombinerande virus, kan ett vaccin be- redas som ett viralt vaccin, i vilket fall immunogenen inne- fattar det rekombinerande virus som expressionsdefinierar en p97-relaterad peptid. Beroende på beskaffenheten av det re- kombinerande virus som användes som immunogen kan antingen ett inaktiverat virusvaccin eller ett levande virusvaccin be- redas. Lämplig immunisering med vaccinberedningarna enligt föreliggande uppfinning kan resultera i inducering av ett immunsvar, som leder till förstöring av melanomceller hos den immuniserade individen.

Uppfinningen beskriver även ett system, i vilket vaccinbered- ningen kan testas, och skisserar hur testet bör utföras. Så exempelvis kan vaccinberedningar utvärderas med avseende på effektiviteten i djurmodeller, initiellt gnagare, därefter hos icke-humana primater och slutligen på människa, företrädesvis patienter som är i remission men där återfall är högst troligt till följd av mikrometastaser. 4. KORT BESKRIVNING AV FIGURERNA Pig. 1 representerar ett autoradiografi av de cellfria trans- lationsprodukterna av p97-mRNA separerade med SDS-PAGE. I fig. 1A, representerar spår 1 translationsprodukterna av p97- -anrikad mRNA, medan spår 2 representerar translationsproduk-' terna av icke-anrikad mRNA, varvid vart och ett av spåren här- rör från 0,5 pl totala translationsprodukter av Sng mRNA. I fig. 1B representerar spår 1 translationsprodukterna av p97- -anrikad mRNA, medan spår 2 representerar translationsproduk- terna av icke-anrikad mRNA, varvid vart och ett av spåren här- rör från 5 Pl translationsprodukter av 5ng mRNA, som har immu- noprecipiterats med anti-p97-serum. 506 024 Fig. 2 är en schematisk representation av strukturen hos p97- -mRNA. Arrangemanget av kodningsregionen (från signalsekven- sen till ankarsekvensen) och icke-kodningsregionen (3'UT) liksom den duplicerade områdesstrukturen hos p97-förstadie- elementet (ofylld stapel) anges. Lokaliseringen av olika restriktionsenzym-igenkänningssekvenser anger ovan mRNA. De relativa positionerna av fyra cDNA-kloner anges under mRNA- -strukturen. cDNA-klonen p97-3a2fl (3a2fl) isolerades från ett CDNA-bibliotek, där CDNA transkriberades på oligo(T)-prepa- rerad p97-anrikad mRNA och klonades i pBR322, medan cDNA- -kloner p97-2fl (2fl), p97-ljl (ljl) och p97-10al (10al) iso- lerades genom preparerande cDNA-syntes med oligonukleotider, som kodar p97-exonsekvenserna och kloning av de resulterande cDNA-fragmenten i lambda-gt10. Fig. 2A är en schematisk repre- sentation av genomiska kloner B15, H17, B6.6 och E7.7, vilka klonades i lambda L47.1.

Fig. 3 representerar nukleotidsekvensen hos human p97-första- die-cDNA och dess deducerade aminosyrasekvens. De N-terminala aminosyrarester som bestämdes tidigare medelst proteinsekven- tiering var identiska med de som predicerades från nukleotid- sekvensen (aminosyrarest-tal 21-30). De potentiella glyko- syleringsställena vid aminosyraresterna 38, 135 och 515 (ofylld stapel) och membranankarregionen vid C-änden (fylld stapel) anges. En polyadenyleringssignal (AATAAA angiven i en ruta) upptäcktes i position 3847, som är 50 baspar uppströms om ett polyadenylerat område.

Fig. 4 representerar en jämförelse mellan de prediserade ami- nosyrasekvenserna hos p97-förstadieelementet och hos human- serotransferrin (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 81: 2752-2756; Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121). Bevarade rester är angivna inom rutor. Tyrosin-, histidin- och argininrester involverade i järnbindning av transferrin (Metz-Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) anges med asterisk (*).

Fig. 5 är en schematisk representation av en tvådimensionell M 506 024 modell av strukturen hos p97 baserat på närvaron av cystein- rester bevarade mellan transferrinmedlemmarna inom överfa- miljen. De tre potentiella glykosyleringsställena anges med asterisk (*). Det hydrofoba membranankarområdet framträder vid C-änden av p97 (COOH).

Fig. 6 är en schematisk representation av den Qenetiska struk- turen hos: p97-cDNA-klonerna och fragment av den genomiska klonen lambda E7.7, som användes för konstruktion av p97-ex- pressionsvektorn; och pSV2p97a-expressionsvektorn. Följande förkortningar användes: E, §§gRI; P, gvull; Sal, ëalï; S, sig; B, än.

Pig. 7 visar resultaten av gelelektrofores vid karakterise- ring och immunorening av rekombinerande c97-protein. En transfekterad CHO-klon (CH03+) och humanmelanomceller SK-MEL 28 märktes med 35 (-TM) av tunikamycin (TM). Celler ympades i 100 m S-cystein i närvaro (+TM) eller frånvaro 2 plattor och fick nå nära konfluens. Mediet avlägsnades och ersattes med 3 ml cysteinfritt medium med eller utan tillsats av 1 pg/ml tunikamycin. Efter 30 minuter vid 37°C tillsattes 250 pCi per ml L-358-cystein (1016 Ci per mol; New England Nuclear) under ytterligare 6 timmar. Skördning av cellerna, preparation av cellysat, immunoprecipitation och SDS-PAGE utfördes enligt ovan. Extrakten immunoprecipiterades med p97-specifika antikroppar och proteiner analyserades medelst SDS-polyakrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE). (a), Coomassie- -blått-färgad SDS1blyakrylamidgel.Spår 1, proteinmarkörer; spår 2, immunorenat p97 från transfekterade B16-musceller; spår 3, SK-MEL 28-celler +TM; spår 4, SK-MEL 28-celler -TM; spår 5, CHO3+-celler +TM; spår 6, CH03+-celler -TM. (b) Auto- radiogram av samma gel som i (a).

Fig. 8 visar resultaten av radioimmunoprecipitation av ex- pressionsdefinierat p97 i transfekterade celler eller Vp97a-NY- -infekterade celler. BSC-celler infekterades över natten med vacciniavirus av vildtyp eller p97-rekombinerande vaccinia- virus. Dessa virus eller den transfekterade cellinjen CHO- 506 024 12 -p7.A inkuberades med 35 S-märkt metionin och cystein med eller utan tunikamycin vid 2 pg/ml (Sigma). Cellerna lysera- des 6 timmar senare, precipiterades med monoklonal antikropp 96,5 och separerades genom elektrofores på en 10%-ig poly- akrylamidgel. Gelen autoradiograferades under natten. Den tu- nikamycinbehandlade gruppen är till höger för varje grupp.

Fig. 9 visar serumantikropptitern hos möss immuniserade med p97-vacciner. Tp97 representerar fem möss immuniserade med x 106 bestålade M2svp97a.A-celler (syngeneiska tumörcel- ler transfekterade och expressionsyta p97) i Freunds hel- adjuvans och som hade erhållit boosterdos med samma antal celler i fosfatbuffrad saltlösning. p97 är en grupp om fem möss immuniserade med 100 Pg renat p97-protein i Freunds hel- adjuvans och som hade erhållit en booster-dos med 50 Pg vat- tenhaltigt protein. Vp97 är en grupp om fem möss immuniserade 7 och boosterdosbehandlade med 10 plackbildande enheter av Vp97a-NY genom svansskarifikation.

Fig. 10 visar den terapeutiska effekten av vaccinering av tu- mörinfekterade möss med ett rekombinerande p97-vacciniavirus (Vp97a-NY). Möss infekterades med 105 eller 104 p97-expres- sionsdefinierande tumörceller (M2SVp97a.E) intravenöst. Två dagar senare ympades mössen genom svansskarifikation anting- en med Vp97a-NY eller Vwt-NY. Ympningar veckovis genom svans- skarifikation upprepades och överlevnaden hos mössen registre- rades.

. DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser framställning av vacciner för prevention eller behandling av melanom. Den baserar sig på upptäckten att melanom har tumörassocierade cellyteantigener, såsom p97-antigenet, som är närvarande i större mängder i me- lanomcellerna än i normal vävnad. Enligt föreliggande uppfin- ning framställes peptider eller proteiner relaterade till det melanomassocierade p97-antigenet (d.v.s. p97-relaterade peptider) under användning av rekombinerande DNA-teknik och/ 13 505 024 eller kemisk syntesteknik. De p97-relaterade peptiderna en- ligt föreliggande uppfinning innefattar aminosyrasekvenser härrörande från hela eller delar av aminosyrasekvensen hos p97, i huvudsak såsom visas i Fig. 3. Dessa innefattar amino- syrasekvenser härrörande från Fig. 3, vilka har ändrats ge- nom ersättning av en eller flera aminosyrarester inom sek- vensen med en annan aminosyra med liknande polaritet, vilken tjänar som funktionell ekvivalent och således resulterar i en tyst förändring. Substitut för en aminosyra inom sekvensen kan väljas från andra medlemmar från den klass till vilken aminosyran hör. Så exempelvis innefattar de icke-polära (hyd- rofoba) aminosyrorna alanin, leucin, isoleucin, valin, pro- lin, fenylalanin, tryptofan och metionin. De polära neutrala aminosyrorna innefattar glycin, serin, trionin, cystein, ty- rosin, asparagin och glutamin. De positivt laddade (basiska) aminosyrorna innefattar arginin, lysin och histidin. De nega- tivt laddade (sura) aminosyrorna innefattar asparaginsyra och glutaminsyra. Vidare kan de p97-relaterade peptiderna enligt föreliggande uppfinning, vare sig de är förändrade genom substitution av aminosyraresterna eller ej, ytterligare modifieras eller behandlas genom glykosylering, fosforyle- ring etc. eller genom kemiska modifikationer. Dessa p97-re- laterade peptider kan användas som immunogener i vaccinbered- ningar, som framkallar ett immunsvar riktat mot melanomcel- ler närvarande hos den vaccinerade patienten.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning användes rekombinerande DNA-teknik för införande av nukleotidsekven- ser, som kodar p97-antigenet i expressionsvektorer, vilka styr expressionen av de p97-relaterade peptiderna i lämpliga värd- celler. De nukleotidsekvenser som kodar p97-antigenet inne- in fattar nukleotidsekvenser härrörande från hela eller delar av p97-nukleotidsekvensen, i huvudsak som den visas i Fig. 3.

Till följd av degenerering av DNA-koden för aminosyror (d.v.s. de flesta aminosyrorna kan kodas av mer än en kodon) kan funktionellt ekvivalenta kodoner (d.v.s. olika kodoner som kodar samma aminosyra eller dess funktionella ekvivalent) er- sätta varandra inom den i Pig. 3 visade p97-sekvensen under ' förutsättning att substitutionen resulterar i en tyst föränd- 506 024 14 ring. Expressionsvektor-värdcellsystemen, som innehåller en nukleotidsekvens, vilken kodar hela eller del av p97, kan användas för framställning av stora mängder rena p97-relate- rade peptider in vitro, i vilket fall genprodukterna kan re- nas från cellerna i odling och användas som immunogener i "subunit“-vaccinberedningar. Rening av den p97-relaterade pep- tiden kan åstadkommas under användning av en mångfald bioke- miska metoder innefattande immunoaffinitetsrening under an- vändning av monoklonala antikroppar. Vidare kan rening av den p97-relaterade peptiden underlättas genom modifiering av de DNA-sekvenser som kodar för de p97-relaterade peptiderna, så att de sekvenser som är ansvariga för förankring av proteinet i plasmamembranet avlägsnas men de sekvenser som är ansvari- ga för trasport av proteinet till cellmembranet ej avlägsnas, så att en trunkerad antigenisk molekyl utsöndras i odlings- mediet av värdcellen. När det gäller p97-relaterade peptider framställda av prokariotiska celler, kan frånvaron av lämpliga posttranslationella modifikationer resultera i en antigeniskt inaktiv produkt, som eventuellt måste aktiveras genom lämpli- ga kemiska eller övriga behandlingar.

Vid vissa utföringsformer, när expressionsvektorn är ett virus, kan viruset självt beredas som ett vaccin. I dylika fall kan inaktiverade rekombinerande virusvacciner framställas. När ex- pressionsvektorn är ett infektiöst rekombinerande virus, som ej orsakar sjukdom hos värddjuret, kan man bereda antingen ett inaktiverat viralt vaccin eller ett levande virusvaccin, som tillhandahåller väsentlig immunitet. En speciellt använd- bar expressionsvektor för detta ändamål är ett rekombinerande vacciniavirus, som expressionsdefinierar de p97-relaterade peptiderna enligt föreliggande uppfinning. För detta ändamål kan en nukleotidsekvens, som kodar för allt eller delar av p97-antigenet, införas i en vacciniavirusvektor, som har för- måga att styra expressionen av sekvensen i ett lämpligt värd- djur. Uppfinningen innefattar användning av andra virusexpres- sionsvektorer som vacciner, isynnerhet adenovirus.

Enligt en annan utföringsform av föreliggande uppfinning kan den deducerade aminosyrasekvensen hos p97 undersökas med av- 506 024 seende på sekvenser med egenskaper, speciellt hydrofilitet, som är prediktiva vad gäller närvaron av denna sekvens på ytan av proteinmolekylen och dess troliga antigenicitet och/ eller immunogenicitet. Dessa p97-relaterade peptider kan syn- tetiseras kemiskt och användas som immunogener i vaccinbered- ningar.

Uppfinningen tillhandahåller även ett förfarande för fram- ställning av p97-relaterade peptider, som kan användas för andra syften än vaccinproduktion. Den p97-relaterade peptiden kan användas för att immunisera djur för framställning av an- tisera eller monoklonala antikroppar, som är specifika för melanomcellerna av intresse. Dessa kan användas som en kompo- nent vid en diagnostisk analys eller för affinitetsrening av radioaktivt märkta läkemedelslänkade eller toxinlänkade anti- kroppar för användning för cancerterapi.

Uppfinningen âskådliggöres medelst utföringsexempel, där vi beskriver konstruktionen av ett p97-baserat vaccin mot human- melanom. De häri beskrivna metoderna och beredningarna är emel- lertid icke begränsade till konstruktionen av vacciner under användning av p97 utan kan även tillämpas på andra tumörasso- cierade antigener.

Uppfinningen presenteras som följer, enbart i syfte att ge be- skrivningen klarhet; (a) nukleotid- och aminosyrasekvensen hos p97; (b) p97-relaterade peptider framställda medelst ke- miska syntesmetoder; (c) p97-relaterade peptider framställda medelst expressionsvektor-värddjur-system; (d) immunologisk karakterisering av de p97-relaterade peptiderna; och (e) be- redningwav vacciner. .1. SEKVENSANALYS AV DET MELANOMASSOCIERADE p97-ANTIGENET Nukleotidsekvensen hos den gen som kodar för p97 och den där- av härrörande aminosyrasekvensen visas i Fig. 3. Funktionellt ekvivalenta sekvenser faller inom ramen för föreliggande upp- finning. Dessa innefattar men är ej begränsade till nukleo- 'tidsekvenser, som innefattar hela eller delar av den i Fig. 3 506 024 16 visade nekleotidsekvensen, vilka är ändrade genom substitu- tion av olika kodoner, som kodar för samma eller en funktio- nellt ekvivalent aminosyrarest och således ger en tyst för- ändring, liksom aminosyrasekvenser, som innefattar hela eller delar av den i Fig. 3 visade aminosyrasekvensen, vilka är änd- rade genom substitution av funktionellt ekvivalenta aminosyra- rester inom sekvensen och således ger en tyst förändring, och derivat därav, vilka är modifierade eller behandlade exempel- vis genom glykosylering, fosforylering etc. eller genom andra kemiska modifikationer.

Avnitten nedan beskriver den strategi som användes för att be- stämma sekvensen hos p97, såsom den visas i Fig. 3, liksom al- ternativ teknik, som skulle kunna användas för bestämning av sekvensen hos p97 eller andra tumörantigener, som skulle kun- na vara användbara i vaccinberedningar. .1.1 IDENTIFIERING OCH KARAKTBRISERING AV DET MELANOMASSOCIE- RADE p97-ANTIGENET Aktiviteten och aminosyrasekvensen hos det melanomassocierade p97-antigenet var ej kända; som en följd härav utfördes iden- tifiering av p97-antigenet under användning av monoklonala an- tikroppar riktade mot p97. Ett antal tekniker kan användas för att generera monoklonala antikroppar, som är specifika för p97. Så exempelvis kan den hybridomteknik som utvecklades av Kohler och Milstein (1975, Nature 250: 495-497) användas som följer: möss eller råttor immuniseras med humanmelanomceller och lymfocyter tillvaratagna från de immuniserade djuren un- derkastas fusion med myelomceller; alternativt kan lymfocyter från melanompatienter underkastas fusion med myelomceller (Cote, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45:3951) eller också kan tekniken för fram- ställning av monoklonala antikroppar under användning av Ep- stein-Barr-virus (Cole et al., 1985, The EBV-Hybridoma Tech- nique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., sid. 77-96) 506 024 17 användas för att generera monoklonala antikroppar riktade mot p97. Under alla omständigheter "screenas" de erhållna hybri- domen för framställning av antikroppar, som binder till mela- nomcellerna men ej binder till normala celler.

De monoklonala antikroppar som har beskrivits ovan är rikta- de mot p97 kan användas på ett antal sätt för att underlätta identifiering, karakterisering, kloning och expression av nukleotidsekvenser, som medger produktion i stora mängder av peptider och proteiner relaterade till p97-antigenet. Så ex- empelvis kan de monoklonala antikropparna användas för att ytterligare karakterisera p97-antigenet genom radioaktiv märkning av alla de proteiner som framställes av tumörcellen, immunoprecipitation av tumörproteinet med den monoklonala an- tikropp som användes för identifiering av p97-antigenet och fraktionering av de immunoprecipiterade proteinerna genom gel- elektrofores. Proteinantigener identifieras som distinkta band på det erhållna autoradiogrammet (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980-4983). Vidare kan de monoklonala an- tikroppar som är riktade mot p97 användas för att underlätta kloning såsom följer: (a) för att immunorena polysomer i syf- te att identifiera och erhålla mRNA-transkriptat närvarande i den melanomcell som kodar för p97-antigenet; (b) för att identifiera kloner i ett cDNA-expressionsbibliotek, som ex- pressionsdefinierar peptider eller proteiner relaterade till p97-antigenet; (c) för att rena p97-antigenet i syfte att framställa ytterligare monoklonala antikroppar eller anti- sera för användning vid de föregående två tillämpningarna; el- ler (e) för att identifiera celler i vilka genen för p97-an- tigenet har införts genom transfektion.

De monoklonala antikropparna kan även användas för att under- lätta strukturell och immunokemisk karakterisering av p97-an- tigenet för att identifiera extracellulära och antigeniska om- råden av molekylen och för att rena molekylen för aminosyra- sekvensanalys (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Brown et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173). 506 024 18 Ytterligare karakterisering av p97 innefattar bestämning av cellulär lokalisering av och kartläggning av antigeniska de- terminanter och funktionella domäner. Subcellulär lokalise- ring kan bestämmas genom immunofluorescensmikroskopi och ge- nom cellulära fraktioneringsförsök. Antigener såsom p97, vil- ka är närvarande på cellytan föredrages för vaccinberedning, ehuru intracellulära antigener även kan vara användbara. Om multipla monoklonala antikroppar är tillgängliga kan antige- niska determinanter kartläggas genom konkurrensförsök, där varje antikropp märks radioaktivt och testas med avseende på konkurrens med var och en av de andra antikropparna. Domäner av molekylen kan identifieras genom limiterad digerering med proteaser följt av SDA-PAGE. Tillsammans bör dessa data med- ge identifiering av regioner av molekylen som är mest immuno- gena. Om de monoklonala antikropparna erhölls genom immuni- sering med intakta celler är dessa regioner av molekylen troligast extracellulära och användbara för vaccinberedning.

Aminosyrasekvensanalys medger otvetydig identifiering av pro- teinet och en jämförelse därav med andra proteiner (Brown et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173). Om proteinet innefattar mer än 50 aminosyrarester kan det vara lämpligt att bestämma endast en del av aminosyrasekvensen, oftast N- -änden. Proteinantigen för aminosyrasekvensbestämning kan re- nas från cellysat genom immunoaffinitetskromatografi med en monoklonal antikropp, följt av preparativ SDS-PAGE. Den N-ter- minala aminosyrasekvensen hos det renade proteinet bestämmes därefter genom användning av en automatiserad aminosyrasek- vensbestämningsmaskin, företrädesvis en gasfasmaskin för största känslighet. .1.2. IDENTIFIERING, KLONING OCH SEKVENSBESTÄMNING AV DNA SOM KODAR FÖR DET MELANOMASSOCIERADE4p97-ANTIGENET Tidiga kloningsstudier koncentrerades på rikligt förekommande proteiner, såsom globin och ovalbumin, vars mRNAs ofta utgjor- de 10-50 % av total mRNA. Dessa mRNAs kunde renas vad gäller homogenitet genom storleksfraktionering och rena cDNA-prover 1, 506 024 användes för "screening" av bibliotek av några hundra kloner genom kolonihybridisering. För proteiner) vars mRNAs utgör 1-10 % av total mRNA, kan differentiell hybridisering med 2cDNA-prover användas, där ett av cDNA-proverna innehåller sekvensen av intresse och den andra är ett negativt kontroll- prov. Budbärare-RNAs, som kodar för mindre förekommande pro- teiner, såsom tumörassocierade antigener, vilka kan utgöra så litet som 0,01 % av cellulär mRNA, är mycket svårare att klona eftersom tiotusentals kloner måste "screenas" och cDNA- prover ej kommer att ge en specifik hybridiseringssignal. Bå- da problemen kan elimineras genom anrikning av mRNA för sek- vensen av intresse.

Flera metoder för kloning av DNA som kodar för det humanmela- nomassocierade p97-antigenet beskrives nedan. De erhållna klo- nerna analyserades i syfte att identifiera en klon eller klo- ner som omfattade hela kodningsregionen hos p97. p97-nukleo- tidinläggen hos de på så sätt identifierade klonerna kan där- efter sekvensbestämmas medelst vilken som helst inom tekniken känd metod. De olika metoderna beskrives närmare i detalj ne- dan. (a) ISOLERING AV mRNA GENOM POLYSOMIMMUNORENING Vid denna teknik renas polysomer (som består av mRNA, ribo- somer och polypeptidkedjor i begynnelsestadiet) renas genom immunoaffinitetskromatografi med antikroppar, som känner igen antigeniska determinanter, vilka är närvarande på de nyprodu- cerade kedjorna. I många fall igenkänner monoklonala antikrop- par, som har erhållits genom immunisering med intakta celler eller cellextrakt, antigenerna i deras nativa konformationer men de är eventuellt ej lämpliga för polysomimmunorening efter- som det föreligger en signifikant chans till att de igenkända antigeniska determinanterna ej är närvarande i kedjor i begyn- nelsestatiet. Eftersom translationen startar vid polypeptidens N-ände, är det troligt att epitoper nära C-änden saknas i hu- vuddelen av kedjorna i begynnelsestadiet. Detta problem und- 506 024 vikes antingen genom att man använder antikroppar, som känner igen N-terminala epitoper, eller genom framställning av poly- somer från celler behandlade med en proteinsyntesinhibitor, som blockerar terminering.

Ett allvarligare problem är att mogna proteiner skiljer sig från kedjor i begynnelsestadiet på grund av posttranslatio- nella modifikationer. Detta problem är speciellt akut för cell- yteproteiner, som modifieras mera intensivt genom avlägsnan- de av signalpeptiderna, tillsats av kolhydratsidokedjor och bildning av disulfidbryggor. Om ett polyklonalt antiserum an- vändes för polysomimmunorening har skillnanderna i antigeni- citet mellan kedjor i begynnelsestadiet och det mogna protei- net eventuellt ringa betydelse eftersom under immuniseringen kaninen eller något annat djur exponeras ej endast för det na- tiva proteinet utan även för helt eller delvis denaturerade former, speciellt om Freunds adjuvans har använts. Även om dessa antikroppar endast representerar en mindre del av anti- kroppspopulationen kan det fortfarande finnas tillräckligt många för att binda kedjorna i begynnelsestadiet. Olyckligtvis kan framställning av ett polyklonalt antiserum mot ringa före- kommande proteiner vara ytterst svår att genomföra. Ehuru en monoklonal antikropp kan användas för att rena antigenet för ytterligare immuniseringar ger varje gram av odlade celler of- ta utbyten av endast 1 pg antigen. Detta är tillräckligt för att immunisera flera möss men knappast tillräckligt för en en- da kanin.

En annan lösning på problemet är att erhålla en monoklonal an- tikropp, som känner igen antigeniska determinanter, vilka är närvarande i kedjor i begynnelsestadiet, genom användning av denaturerat p97-antigen som den immunogen som användes för framställning av den monoklonala antikroppen. I exemplet en- ligt föreliggande uppfinning var en panel av monoklonala anti- kroppar, som igenkände tre distinkta epitoper på p97-moleky- lens N-terminala domän med en molekylvikt av 40 000, tillgäng- lig och vi använde en pool av monoklonala antikroppar, var och en med olika specificitet i förhoppning om att en eller flera 506 024 21 av dem skulle binda till kedjor i begynnelsestadiet. De valda antikropparna var synnerligen specifika med avseende på p97 genom att var och en av dem immunoprecipiterade ett enda band av p97 från ett radioaktivt märkt helcellysat och de hade hö- ga bindningsaffiniteter. För kloningsprojektet valde vi tre IgG2a-antikroppar, var och en specifik med avseende på de tre epitoperna. I allmänhet ökar chansen till framgång genom an- vändning av ett antal antikroppar mot distinkta epitoper.

Vid användning av monoklonala antikroppar uppkommer frågan hu- ruvida man kan förutsäga om en given monoklonal antikropp el- ler kombination av antikroppar kommer att känna igen kedjorna i begynnelsestadiet och således vara lämpliga för användning vid polysomimmunorening. En metod är att fastställa huruvida den monoklonala antikroppen immunoprecipiterar antigen, som har translaterats i retikulocytlysatsystemet, varvid man ba- serar sig på den uppfattningen att translationsprodukten in vitro, som ej behandlas, kommer att likna kedjorna i begynnel- sestadiet. En alternativ metod är att utföra polysomimmuno- precipitationen i liten skala och därefter använda translation in vitro för att bestämma huruvida mRNA-elementen av intresse har anrikats. När polysomimmunoreningstekniken användes är det viktigt att övervaka reningen genom uppmätning av mRNA-aktivi- teten. Detta kan ske genom translation av mRNA i ett retikulo- cytlysatsystem och analys av translationsprodukterna medelst SDS-PAGE. Ehuru det tumörassocierade antigenet kan vara en alltför ringa komponent i translationsprodukterna av icke-an- rikad mRNA för att kunna påvisas bland hundratalet mera rik- ligt förekommande element, bör det vara påvisbart i de trans- lationsprodukter som härrör från de anrikade mRNA-proverna.

Alternativt kan Xenopus-oocyttranslationssystemet användas,1 om en känslig immunanalysmetod finns tillgänglig för att på- visa det translaterade tumörassocierade antigenet. För p97 an- vändes för detta ändamål en högkänslig immunoanalysmetod med dubbla determinanter (DDIA), som utnyttjar tvâ monoklonala an- tikroppar, vilka är specifika för tvâ olika epitoper på p97.

Protein A, som är bundet till Sepharose, kan användas för poly- 506 024 22 somimmunorening. Protein A-adsorbenten har två användningar vid detta förfarande. Den första är att rena de monoklonala antikropparna från råa askitesvätskor och därigenom avlägsna kontaminerande ribonukleasaktivitet. Protein A-adsorbenten användes därefter tillsammans med de renade antikropparna för att immunorena polysomer, som uppbär de specifika kedjorna i begynnelsestadiet.

Translation av mRNA i ett retikulocytlysatsystem medger bio- kemisk karakterisering av translationsprodukten liksom en bedömning av dess renhet. (b) OLIGONUKLEOTIDPROVER En annan metod, som kan användas i enlighet med uppfinningen för att klona den cDNA som kodar för ett tumörassocierat anti- gen, såsom p97, är att bestämma en partiell eller fullständig aminosyrasekvens hos antigenet och att syntetisera ett oligo- nukleotidprov baserat på den nukleotidsekvens som kan deduce- ras från aminosyrasekvensen. Oligonukleotiden kan därefter användas somçueparatorför cDNA-syntes och som ett prov för att "screena" det erhållna cDNA-biblioteket. Följaktligen kan det melanomassocierade p97-proteinet lämpligen renas från ly- sat av melanomceller genom affinitetskromatografi med en spe- cifik monoklonal antikropp (Brown et al., 1982, Nature, Lon- don, 296: 171-173). En nukleotidsekvens, som kodar för en del av den bestämda aminosyrasekvensen, syntetiseras därefter, vilken kan användas som preparator och/eller prov. Delar av den aminosyrasekvens som innehåller aminosyrarester, kodade av en enda kodon eller två kodoner, är mest lämpliga för det- ta ändamål. En metod är att syntetisera en längre sekvens, typiskt 25-60 nukleotider, vilka representerar den mest troli- ga kodningssekvensen baserat på de kända kodonanvändningssek- venserna hos människa. Användningen av tvâ syntetiska oligo- nukleotider baserade på olika delar av aminosyrasekvensen un- derlättar “screeningen“ genom att denna användning medger identifiering av falska positiva hybridiseringssignaler. Alter- 23 506 024 nativt underlättar även användningen av hybridiseringsbeting- elser, som till ett minimum nedbringar effekten av GC-halten på smältpunkten hos DNA-hybrider, "screeningen". Då man en gång har erhållit en partiell cDNA-klon medelst denna metod kan den användas som ett prov för att erhålla en klon med fullängds-cDNA.

(C) CDNA-EXPRESSIONSBIBLIOTEK Kloningsvektorer har framställts, vilka möjliggör expression av cDNA-inlägget ibakterier.En metod, som därför kan använ- das för erhållande av cDNA-kloner för tumörassocierade protei- ner, såsom p97, är att preparera cDNA-bibliotek genom omvänd transkribering av mRNA (anrikad eller icke-anrikad), som har isolerats från melanomceller såsom beskrivits ovan, under an- vändning av oligo(T)-nukleotidpreparatorer eller de syntetis- ka oligonukleotidpreparatorer som har beskrivits ovan och att "screena" ett dylikt bibliotek med en monoklonal antikropp riktad mot det melanomassocierade p97-proteinet. Kloner, som innehåller DNA, som kodar för de epitoper som igenkännes av den monoklonala antikroppen i korrekt orientering och läsram, expressionsdefinierar peptider eller proteiner relaterade till det melanomassocierade p97-proteinet och kan identifie- ras genom transferering av de proteiner som expressionsdefi- nieras av klonerna till ett nitrocellulosafilter och inkube- ring av filtret med antikroppen, följt av framkallning med ett märkt antiimmunoglobulinreagens.

Ett potentiellt problem är att många monoklonala antikroppar misslyckas med att känna igen det protein som expressionsde- finieras av bakterien eftersom i många fall endast en del avz' cDNA ingår i inlägget och bakterien ej bearbetar proteinet på samma sätt som eukariotiska celler gör. Detta problem är spe- ciellt akut när det gäller tumörcellyteproteiner, vilka modi- fieras mera intensivt genom avlägsnande av signalpeptiderna, addition av kolhydratsidokedjor och bildning av disulfidbryg- gor. Det kan därför vara nödvändigt att generera monoklonala 506 024 24 antikroppar, som är kända för att känna igen det denaturera- de antigenet, eller att framställa polyspecifika antisera ge- nom immunisering med renat antigen.

Då en gång ett rekombinerande virus eller plasmid, som anta- ges innehålla ett cDNA-inlägg härrörande från ett melanom- associerat p97-antigen, har identifierats kan cDNA-inlägget användas för att “screena" ytterligare bibliotek i syfte att identifiera antingen fullängdskloner eller i övrigt en grupp av kloner, som omspänner den fulla längden av den cDNA som kodar för p97. Identiteten hos den den klonade cDNA kan fastställas genom sekvensanalys och jämförelse av den deduce- rade N-terminala aminosyrasekvensen med den som bestämmes ge- nom direkt aminosyrasekvensanalys av p97-proteinet. (d) GENOMISK KLONING Följande metod medger kloning av DNA under användning av en monoklonal antikropp riktad mot en antigenisk determinant, som är närvarande endast i det nativa proteinet och ej är när- varande i kedjor i begynnelsestadiet eller i protein som ex- pressionsdefinieras i bakterier. För detta ändamål införes DNA, som härrör från humanmelanomcellen, i mus-L-celler ge- nom transfektion. Därefter isoleras musceller, som expressions- definierar melanomassocierat p97-antigen, antingen genom an- vändning av den fluorescensaktiverade cellsorteraren eller genom immunologisk identifiering av kolonier, som producerar p97-relaterade peptider, under användning av radioaktivt märk- ta monoklonala antikroppar riktade mot p97 för att påvisa re- laterade peptider på replikat av kolonier, som har överförts till polyestertygfilter. Flera efterföljande transfektions- omgångar kan krävas för att avlägsna icke-relaterade humana DNA-sekvenser. Ett genomiskt bibliotek framställes därefter i en lambda-fagvektor och "screenas" med avseende på kloner, som innehåller återkommande humansekvenser, vilka förekommer i in- tronerna hos de flesta gener. Då en gång en genomisk klon har identifierats kan den användas som hybridiseringsprov för att 506 024 identifiera cDNA-kloner innehållande den DNA som kodar för p97. .2. SYNTES AV ANTIGENISKA FRAGMENT AV DET MELANOMASSOCIERADE p97-ANTIGENET OCH UTVÄRDERING AV IMMUNOGENICITET Syntetiska peptider kan användas som immunogener för att fram- kalla ett immunsvar mot det nativa protein som kan tillhanda- hålla en viss grad av skydd mot ett antal patogener. Dylika peptidsekvenser väljes från den kända aminosyrasekvensen hos proteinantigenet genom identifiering av områden av aminosyror som troligtvis är närvarande på ytan av proteinmolekylen och är exponerade för det yttre mediet. Detta uppnås vanligast genom datoranalys av aminosyrasekvensen under användning av vedertagna hydropatiparametrar för aminosyrorna. Ytterligare kriterier, såsom den prediserade sekundära strukturen eller flexibiliteten, kan även användas.

Följaktligen kan syntetiska peptider, som innefattar 5-50 aminosyrarester av det melanomassocierade p97-proteinet, tes- tas med avseende på immunogenicitet i försöksdjur (vanligt- vis möss eller kaniner). Dylika syntetiska peptider innefattar, men är icke begränsade till hela eller del av aminosyrasekven- sen som den i huvudsak visas i Fig. 3 innefattande ändrade sekvenser, där funktionellt ekvivalenta aminosyrarester har ersatt rester inom sekvensen resulterande i en tyst föränd- ring och/eller modifierade eller behandlade sekvenser, såsom glykosylerade sekvenser, fosforylerade sekvenser etc., eller kemiskt modifierade sekvenser. Dessa p97-relaterade peptider användes antingen separat eller kopplade till ett bärarpro- tein såsom nyckelhålskålsnäckehemocyanin (KLH). I endera fal-t let är användningen av ett adjuvans valfri men föredragen.

De immuniserade djuren erhåller booster-doser och testas med avseende på antikroppar riktade mot den immuniserande peptiden.

De med anti-peptidantikroppar testas med avseende på antikrop- par, som binder det nativa p97-proteinet. När det gäller tu- mörassocierade antigener, såsom p97, är det även av intresse att testa med avseende på ett cellulärt immunsvar, exempelvis 506 024 26 genom att söka efter hyperkänslighet av fördröjd typ (DTH), en antigenstimulerad proliferation in vitrg, cytolytiska T-celler eller tumörrejektion i en lämplig modell. En lämp- lig modell skulle vara en mustumör, som expressionsdefinie- rar det humantumörassocierade antigenet som en följd av trans- fektion med en lämplig cDNA-expressionsvektorkonstruktion.

Målet är att identifiera peptider, som framkallar ett kraf- tigt immunsvar riktat mot det melanomassocierade p97-antige- net. Då dessa peptider har identifierats kan de framställas i stora mängder genom kemiska syntesmetoder, som är kända inom tekniken. Alternativt kan de identifierade peptiderna fram- ställas i stora mängder genom expressionsdefiniering av de nukleotidsekvenser som kodar för dylika peptider i expres- sionsvektor-värdcell-system. .3. FRAMSTÄLLNING AV P97-RELATERADE PEPTIDER MED EXPRESSIONS- VEKTOR-VÄRD-SYSTEM Proteiner och peptider kan framställas i stora mängder genom införande av nukleotidkodande sekvenser i en lämplig expres- sionsvektor, som i sin tur införes i lämpliga värdceller, vil- ka innefattar, men ej är begränsade till bakterie-, jäst-, insekts- och däggdjursceller. Ehuru bakteriella värdar har många fördelar bearbetar de icke många eukariotiska proteiner på rätt sätt och de är mindre lämpliga än eukariotiska celler för expression av tumörassocierade proteiner. Rekombinerande proteiner, som framställes i bakterier, kan emellertid vara användbara för induktion av T-cellsvar, eftersom dylika svar antages kräva en initiell nedbrytning av proteinantigenet.

I syfte att expressionsdefiniera p97-relaterade peptider i ett vektor-värd-system införes nukleotidsekvenser, som kodar för det melanomassocierade p97-antigenet eller en del därav, i en lämplig expressionsvektor. Dylika nukleotidsekvenser innefat- tar, men är ej begränsade till hela eller del av DNA-sekven- sen av p97, i huvudsak såsom den visas i Fig. 3 innefattande 2, 506 024 ändrade sekvenser, där en eller flera kodoner inom sekvensen har ersatts med en kodon, som kodar för samma eller en funk- tionellt ekvivalent aminosyrarest, vilket således resulterar i en neutral eller tyst förändring i sekvensen. Expressions- vektorn innehåller de nödvändiga elementen för transkriptio- nen och translationen av den införda proteinkodande sekvensen.

Dessa element varierar i styrka och specificitet. Beroende på det använda värd-vektor-systemet kan vilket som helst av ett antal lämpliga transkriptions- och translationselement använ- das. Så exempelvis kan man vid kloning i däggdjurscellsystem använda promotorer, som har isolerats från genomen i dägg- djursceller (exempelvis musmetallotionein-promotor) eller från virus, som växer i dessa celler (exempelvis vaccinia- virus 7,5K-promotor). Promotorer, framställda genom rekombi- nerande DNA-teknik eller syntetisk teknik, kan även användas för att tillhandahålla transkription av de införda sekvenserna.

Specifika initieringssignaler kräves även för effektiv trans- lation av de införda proteinkodande sekvenserna. Dessa sig- naler innefattar ATG-initieringskodonen och närliggande sek- venser. I de fall då antingen genen eller cDNA-sekvensen in- föres i en lämplig expressionsvektor, kräves eventuellt icke några ytterligare translationskontrollsignaler. I de fall då endast en del av den kodande sekvensen införes måste eventu- ellt exogena translationskontrollsignaler, innefattande ATG- -kodonen, tillhandahållas. Initieringskodonen måste vidare vara i fas med avseende på läsramen av de proteinkodande sekvenserna för att tillförsäkra translation av hela inläg- get. Dessa exogena translationskontrollsekvenser och initie- ringskodoner kan ha olika ursprung och vara både naturliga och och syntetiska.

Vilken som helst av de metoder som är kända för fackmannen för införande av DNA-fragment i en vektor kan användas för konstruktion av expressionsvektorer, som innehåller chimerisk gen bestående av lämpliga transkriptions- och translations- kontrollsignaler och de proteinkodande sekvenserna. Dessa meto- 506 024 28 der kan innefatta sådana som användes vid rekombinerande DNA- -teknik in vitro, syntesteknik och rekombinationer in vivo (genetisk rekombination).

Expressionsvektorer innefattar, men är ej begränsade till följande vektorer och deras derivat: vacciniavirus, adeno- virus, insektsvirus, jästvektorer, bakteriofagvektorer och plasmid-DNA-vektorer. Kloning och expression av gener i bak- teriesystem är väl kända inom tekniken. Så exempelvis kan man vid kloning i en E. coli använda dess bakteriofager eller plas- midpromotorer, såsom lag-promotorn, trp-promotor, re5A-pro- motor, ribosomal-RNA-promotor, PR- och PL-promotorerna av ko- lifag-lambda och andra innefattande men ej begränsade till l§guv5, trp-lacuv5 (Egg)-hybridpromotor, QEBF, bla, lpp och liknande för framkallande av höga nivåer av transkription av närliggande DNA-segment. Till följd av processkillnaderna mellan prokariotiska och eukariotiska celler kan det emeller- tid vara föredraget att expressionsdefiniera de p97-relaterade peptiderna enligt föreliggande uppfinning i eukariotiska cel- ler. De mest vedertagna metoderna för expressionsdefiniering av proteiner i eukariotiska celler är (a) införande av genen i cellen tillsammans med en läkemedelsresistent gen, följt av selektion med läkemedel, företrädesvis erhållande förstärkning såsom med dihydrofolatreduktas-metotrexat-systemet; (b) ex- pression av cDNA i en plasmidvektor, ofta baserad på pBR322, under användning av en stark eukariotisk promotor och andra kontrollsekvenser; (c) expression av cDNA i en viral vektor, ofta härrörande från SV40, ånyo under användning av starka promotorer, i detta fall en SV40-promotor. Rekombinerande plasmidvektorer användes ofta för att framställa cellinjer, som producerar proteinet under lång tidsperiod, medan SV40-vek- torer ofta användes för att erhålla transient expression. Ehu- ru däggdjursceller oftast har använts som värdceller kan även insektsceller och i vissa fall jästceller vara lämpliga. Vis- sa beskrives närmare i detalj nedan.

I syfte att konstruera ett rekombinerande vacciniavirus, som expressionsdefinierar det melanomassocierade p97-antigenet, 29 506 024 kan den cDNA-kodande sekvensen ligeras till 7,5K-promotorn av vacciniaviruset för bildning av chimerisk gen. Denna chi- meriska gen flankeras av ytterligare vacciniavirussekvenser, som är homologa med den virala tymidinkinasgenen, som bäres av plasmid-DNA-vektorn. Konstruktionen av den chimeriska ge- nen innefattar användningen av både naturliga och syntetiska kontrollsignaler för transkription och translation av den tu- mörassocierade antigensekvensen. Denna chimeriska gen införes därefter i vacciniavirusexpressionsvektorer genom rekombina- tion in ning mellan den homologa tymidinkinasregion som är närvarande på både plasmidvektorn och vacciniavirusgenomen.

Dessa rekombinerande virus, som innehåller den chimeriska ge- nen, kan styra expressionen av p97-relaterade peptider i ett infekterat värddjur och kan användas som komponent av ett vac- cin.

I de fall då ett adenovirus användes som expressionsvektor ligeras DNA-sekvensen av intresse till ett adenovirus-tran- skription/translation-kontrollkomplex, exempelvis de tidiga- re promotor- och tripartitledarsekvenserna. Denna chimeriska gen införes därefter i adenovirusgenomen genom rekombination in vitro eller in ning. Införande i en icke-essentiell region av den virala genomen (exempelvis region E1 eller E3) resul- terar i ett rekombinerande virus, som är levande och kan ex- pressionsdefiniera den p97-relaterade peptiden i infekterade värddjur. Förnnärvarande är två stammar av adenovirus (typer- na 4 och 7) godkända och användes som vacciner för militärper- sonal. De är huvudkandidater för användning som vektorer för att expressionsdefiniera den införda DNA-sekvensen.

Ett alternativt expressionssystem, som skulle kunna användashf för expressionsdefiniering av de p97-relaterade peptiderna, är ett insektssystem. I ett sådant system användes nukleärt nnnn- grapha californica polyhedrosvirus (AcNPV) som vektor för ex- pressionsdefiniering av främmande gener. Viruset växer i cel- ler av Spodoptera frugiperda. DNA-sekvensen av intresse kan klonas till icke-essentiella regioner (exempelvis polyhedrin- genen) av viruset och placeras under kontroll av en AcNPV- -promotor (exempelvis polyhedrinpromotorn). Framgângsrikt in- 506 024 förande av DNA-sekvensen resulterar i inaktivering av poly- hedringenen och produktion av icke-ockluderat rekombinerande virus (d.v.s. virus som saknar det proteinhaltiga skikt, som kodas av polyhedringenen). Dessa rekombinerande virus använ- des därefter för att infektera celler av Spodoptera frugiperda, i vilka den införda genen expressionsdefinieras.

Vidare kan värdcellstammar väljas, vilka modulerar expressio- nen av de införda sekvenserna eller modifierar och bearbetar den chimeriska genprodukten på ett specifikt önskat sätt. Ex- pression från vissa promotorer kan förhöjas i närvaro av vis- sa induktorer (exempelvis zink- och kadmiumjoner för metallo- tioneinpromotorer). Därför kan expressionen av det genetiskt konstruerade proteinet kontrolleras. Detta är viktigt om pro- teinprodukten av den klonade genen är letal för värdcellerna.

Vidare är modifikationer (exempelvis glykosylering, fosforyle- ring etc.) och bearbetning (exempelvis spjälkning) av prote- inprodukter viktiga för proteinets struktur och funktion. Oli- ka värdceller har karakteristiska och specifika mekanismer för posttranslationell bearbetning och modifikation av protei- ner. Lämpliga cellinjer eller värdsystem kan väljas för att tillförsäkra korrekt modifikation och bearbetning av det ex- pressionsdefinierade främmande proteinet.

Vid den speciella utföringsform som beskrives häri för p97 ligerade vi p97-cDNA-sekvensen i en expressionsplasmidvektor härrörande från pBR322, som innehåller metallotioneinpromotorn.

Hela kodningssekvensen av p97 innefattande signalpeptiden och membranankaret infördes i vektorn. .3.1. IDENTIFIERING AV REKOMBINERANDE EXPRESSIONSVEKTORER MED> FÖRMÅGA ATT REPLIKERA OCH STYRA EXPRESSIONEN AV p97-DNA- SEKVENSERNA Expressionsvektorer innehållande främmande geninlägg kan iden- tifieras genom tre allmänna metoder: (a) DNA-DNA-hybridise- ring, (b) närvaro eller frånvaro av markörenfunktioner och (c) expression av införda sekvenser. Enligt den första meto- den kan närvaron av en främmande gen, som införes i en expres- 506 024 31 sionsvektor, påvisas genom DNA-DNA-hybridisering under använd- ning av prover innefattande sekvenser, som är homologa till det främmande geninlägget. Enligt den andra metoden kan det rekombinerande vektor/värd-systemet identifieras och selekte- ras baserat på närvaron eller frånvaron av vissa "markör"-gen- funktioner åstadkomna genom införande av gener i vektorn (ex- empelvis tymidinkinasaktivitet, resistens mot antibiotika, transformationsfenotyp etc.). Om den främmande genen införes inom markörgensekvensen hos vektorn kan exempelvis rekombinat, som innehåller DNA-inlägget, identifieras genom frånvaro av markörgenfunktionen. Enligt den tredje metoden kan rekombine- rande expressionsvektorer identifieras genom analys av den främmande genprodukt som expressionsdefinieras av rekombina- tet. Dylika analyser kan basera sig på fysikaliska, immunolo- giska eller funktionella egenskaper hos genprodukten.

Vid konstruktion av ett rekombinerande vacciniavirus enligt föreliggande uppfinning införes exempelvis den chimeriska gen som innehåller de p97-kodande sekvenserna i tymidinkinasgenen och därigenom inaktiverar viruset och förlänar detta en TK-- -fenotyp. Dylika rekombinat utväljes med ledning av deras för- måga att växa i medier innehållande 5-brom-deoxiuridin, en nukleosidanalog som är letal för TK*-celler men ej för TK-- -celler. Rekombinaten identifieras vidare genom DNA-DNA-hybri- disering under användning av ett cDNA-prov, som är specifikt för det tumörassocierade proteinet. TK--rekombinatviruset kan isoleras genom plackrening och förråd framställes från infekte- rade odlade celler. Det rekombinerande viruset kan testas med avseende på sin förmåga att inducera syntes av de p97-relatera- de peptiderna. För detta ändamål kan infekterade celler få växa i närvaro av radioaktivt märkta aminosyror; därefter tes- tas lysat och subcellulära fraktioner av de infekterade radio- aktivt märkta cellerna genom immunoprecipitation med antikrop- par riktade mot det nativa melanomassocierade p97-antigenet.

De immunoprecipiterade produkterna separeras med SDS-PAGE.

Infekterade celler kan även testas genom immunofluorescens under användning av monoklonal antikropp.

Celler, i vilka en plasmidvektor har införts genom transfek- 506 024 32 »tion. kan lätt identifieras genom FACS-analys eller genom bindningsanalyser av replikat av cellkolonier på polyestertyg.

Den mängd p97-relaterad peptid som är närvarande kan bestäm- mas genom kvantitativ radioimmunoanalys och dess subcellulära lokalisering kan bestämmas genom cellulär fraktionering och , genom immunofluorescensmikroskopi. Strukturen hos den expres- sionsdefinierade p97-relaterade peptiden kan bestämmas medelst SDS-PAGE och medelst aminosyrasekvensanalys. .3.2. RENING AV DEN p97-RELATERADE PEPTIDEN FRÅN EXPRESSIONS- VEKTOR-VÄRD-SYSTEM Många tumörassocierade antigener, såsom p97, är cellyteglyko- proteiner och innehåller en N-terminal signalpeptid och en C- -terminalankarpeptid (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121). Vid expression i en lämplig vektor förväntas att proteinet translokeras till cellytan. För att underlätta re- ning av proteinet kan det vara föredraget att deletera den DNA-sekvens som kodar för membranankarregionen, så att det mogna proteinet frigöres i odlingsmediet.

Den p97-relaterade peptiden kan renas från värdcellerna genom detergentlys följt av affinitetskromatografi under användning av monoklonala antikroppar. Om ett trunkerat protein skall re- nas från odlingsmediet är det föredraget att använda serum- fritt medium och därefter använda affinitetskromatografi med monoklonala antikroppar. Det är viktigt att antigenet kan elu- eras från antikroppsadsorbenten utan att man reduceras dess antigenicitet eller denaturerar det. Detta kan uppnås genom att man höjer eller sänker pH-värdet eller genom användning av en chaotrop. Det kan vara nödvändigt att välja en monoklo-V nal antikropp, som frigör antigenet under relativt milda be- tingelser. Det affinitetsrenade antigenet kan renas ytterli- gare medelst HPLC. .4. IMMUNOLOGISK KARAKTERISERING AV p97-RELATERADE PEPTIDER Det syntetiska eller rekombinerande antigenets förmåga att 33 506 U24 framkalla ett antitumörsvar kan utvärderas initiellt på för- söksdjur. Detta uppnås genom att man konstruerar ett modell- system, där det humanmelanomassocierade p97-proteinet expres- sionsdefinieras i celler av den lämpliga inavelstammen ifråga av försöksarten. Djuren immuniseras därefter med den p97-rela- terade peptiden enligt föreliggande uppfinning enligt olika protokoll och testas därefter med avseende på utvecklandet av antikroppar riktade mot det melanomassocierade p97-antigenet, med avseende på cellmedierad immunitet, såsom överkänslighet av fördröjd typ mot p97-antigenet och med avseende på deras förmåga att avvisa en infektion av levande syngeneiska tumör- celler, som expressionsdefinierar p97-antigenet. Vidare kan analyser in vitro av cellulär immunitet utföras för att mäta proliferationen av lymfocyter i svaret på den p97-relaterade peptiden och förmågan hos lymfocyter från immuniserade djur eller humanmelanompatienter att döda tumörceller, som expres- sionsdefinierar p97-antigenet. Genom immunisering av möss med mus-p97 kan man vidare bestämma den utsträckning i vilken det är möjligt att inducera ett immunsvar mot ett antigen, som är närvarande i spârmängder i normala vävnader.

Icke-humanprimater kan användas för att fastställa säkerheten hos de p97-relaterade peptiderna enligt föreliggande uppfin- ning. För detta ändamål kan djuren immuniseras under använd- ning av protokoll, som etiskt skulle kunna tillämpas på human- cancerpatienter, och testas därefter såsom beskrivits ovan, med undantag av att tumörtransplantationsförsöken ej är möjli- ga eftersom dessa kräver användning av inavelstammar. Säker- heten hos immuniseringsförfarandet bestämmes genom att man tittar på effekten av immuniseringen på de immuniserade dju- rens allmänna hälsotillstånd (viktändringar, feber, aptit, be- teende etc.) och tittar pâ patologiska förändringar vid au- topsi.

Slutligen kan den p97-relaterade peptiden enligt föreliggande uppfinning testas på humancancerpatienter. Efter den initiella testfasen I hos patienter med framskriden cancer för att fast- ställa frånvaron av toxicitet skulle cancerpatienter i remis- sion men med hög sannolikhet till återfall kunna testas. Deras 506 024 34 immunsvar skulle kunna utvärderas såsom beskrivits ovan för icke-humanprimater, med undantag av att effekten av behand- lingen på en fastställd sjukdom eller på återfallsfrekvensen undersökes. När det gäller melanomantigenet p97 undersökes även benigna nevi (moles), som expressionsdefinierar antige- flet . .5. BEREDNING AV ETT VACCIN Syftet med denna utföringsform enligt uppfinningen är att me- delst syntesteknik eller rekombinerande DNA-teknik framställa en syntetisk peptid, ett renat protein eller ett rekombineran- de virus, som kan användas som immunogen, och ett vaccin för att skydda cancerpatienter med hög benägenhet för âterfall'av sjukdomen, att behandla en fastställd sjukdom och slutligen att vaccinera högriskindivider profylaktiskt. I själva verket kan det syntetiska eller rekombinerande melanomassocierade p97- -antigenet användas i kombination med andra immunogener för framställning av multivalenta vacciner för prevention av me- lanom och andra cancerformer. Exempel på olika vaccinberedning- ar diskuteras nedan. .5.1.VIRALAVACCINBEREDNINGAR När den p97-relaterade peptiden enligt föreliggande uppfin- ning produceras av ett rekombinerande virus, kan antingen ett levande rekombinerande viralt vaccin eller ett inaktiverat re- kombinerande viralt vaccin beredas. Valet beror på naturen hos det rekombinerande virus som användes för att expressions- definiera den p97-relaterade peptiden. När det rekombinerande viruset är infektiöst mot det för immunisering avsedda värd- djuret men ej orsakar sjukdom, föredrages ett levande vaccin, eftersom förökning i värddjuret leder till en förlängd stimu- lering av en typ och storleksordning som liknar den som upp- träder vid naturliga subkliniska infektioner och därför för- länar väsentlig långvarig immunitet. Det infektiösa rekombi- nerande viruset kan vid införande i ett värddjur expressions- definiera den p97-relaterade peptiden från sin chimeriska gen och därigenom stimulera ett immunsvar. Det levande rekombine- 505.024 rande viruset kan som sådant användas som preventivvaccin mot melanom. Produktion av dylik rekombinerande virus för an- vändning i dessa beredningar kan innefatta system både in vitrg (exempelvis vävnadskulturceller) och in vivg (exempel- vis naturliga värddjur såsom kor). Konventionella metoder för framställning och beredning av smittkoppsvaccin kan an- vändas för beredning av levande rekombinerande virusvaccin.

Multivalenta levande virusvacciner kan framställas från ett enda eller ett fåtal infektiösa rekombinerande virus, som expressionsdefinierar en mångfald antigener från olika tumör- eller cancerceller. Så exempelvis kan ett vacciniavirus (som kan upptaga ca. 35 kilobaser av främmande DNA) framställas att innehålla kodande sekvenser för andra epitoper; ett dy- likt rekombinerande virus kan som sådant användas som immuno- gen i ett multivalent vaccin. Alternativt kan en blandning av vaccinia och/eller andra virus, vart och ett med förmåga att styra expressionen av en främmande gen, som kodar för oli- ka epitoper, beredas till ett multivalent vaccin.

Vare sig det rekombinerande viruset är infektiöst mot det för immunisering avsedda värddjuret eller ej kan en inaktiverad vaccinberedning beredas. Inaktiverade vacciner är "döda" i den meningen att deras infektivitet har förstörts, vanligen genom behandling med formaldehyd. Idealiskt förstöres virusets infektivitet utan att påverka de kapsel- eller höljesprotei- ner som uppbär virusets immunogenicitet. I syfte att fram- ställa inaktiverade vacciner måste stora mängder av det re- kombinerande viruset tillåtas växa i odling i syfte att till- handahålla den erforderliga mängden v relevanta antigener. En blandning av inaktiverade virus, som expressionsdefinierar :I olika epitoper, kan användas för beredning av “multivalenta" vacciner. I vissa fall kan detta vara att föredraga framför levande vaccinberedningar på grundav potentiella svårigheter med ömsesidig växelverkan hos levande virus som administreras tillsammans. I endera fallet bör det inaktiverade rekombine- rade viruset eller blandningen av virus beredas med en lämp- 506 024 36 lig adjuvans i syfte att förstärka det immunologiska svaret mot deras antigener. Lämpliga adjuvantia innefattar, men är ej begränsade till mineralgeler, exempelvis aluminiumhydr- oxid; ytaktiva substanser såsom lysolecitin; pluronic-poly- oler; polyanjoner; peptider; och oljeemulsioner.

Många metoder kan användas för att administrera ovan beskriv- na vaccinberedningar; dessa innefattar, men är ej begränsa- de till intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan och intranasal administrering. När en levande rekom- binerande virusvaccinberedning användes kan den administreras via den naturliga infektionsvägen för det modervirus av vild- typ som användes för att framställa det rekombinerande viru- set i vaccinberedningen. .5.2. SUBENHETVACCINBEREDNINGAR I ett alternativ till virala vacciner kan den p97-relaterade peptiden som sådan användas som immunogen i subenhetsvaccin- beredningar. Subenhetsvacciner innefattar uteslutande det relevanta immunogeniska material som är nödvändigt för att immunisera ett värddjur. Följaktligen kan den p97-relatera- de peptiden renas från rekombinat som expressionsdefinierar peptiden. Dylika rekombinat innefattar vilken som helst av de tidigare beskrivna virusinfekterade odlade cellerna, bak- terietransformat eller jästtransformat. Enligt en annan ut- föringsform av föreliggande uppfinning kan de p97-relaterade peptiderna eller proteinerna syntetiseras kemiskt.

Om dep97-relaterade pepbiderna renas från rekombinat eller syntetiseras kemiskt kan slutprodukten inställas på lämplig koncentration och beredas med vilket som helst lämpligt vaccin- adjuvans och förpackas för användning. Lämpliga adjuvantia innefattar, men är ej begränsade till: mineralgeler, exempel- vis aluminiumhydroxid; ytaktiva substanser såsom lysolecitin; pluronic-polyoler; polyanjoner; peptider; och oljeemulsioner.

Den p97-relaterade peptiden kan även införlivas med liposomer 37 sne 024 eller konjugeras till polysackarider och/eller andra polymerer för användning i en vaccinberedning.

I de fall då den p97-relaterade peptiden är en hapten, d.v.s. en molekyl som är antigenisk genom att den kan reagera selek- tivt med besläktade antikroppar men ej är immunogenisk genom att den ej kan framkalla immunsvar, kan haptenen bindas kova- lent till en bärare eller immunogenisk molekyl och hapten-bä- raren kan beredas för användning som ett vaccin; så exempel- vis förlänar ett stort protein, såsom serumalbuminprotein, immunogenicitet till den därtill kopplade haptenen. 6. EXEMPEL: MELANOMASSOCIERAD p97-ANTIGEN I nedan beskrivna exempel sammanfogades cDNA-kloner härröran- de från olika regioner av p97-mRNA och infördes i en expres- sionsvektor, som styr expressionen av en peptid relaterad till p97. De p97-relaterade peptider som produceras av ex- pressionsvektor-värdcellen kan beredas till ett vaccin. 6.1. RENING AV p97-mRNA Polysomer framställdes från SK-MEL28-melanomceller (Carey et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3270-3282) genom magnesiumutfällning. Från detta preparat renades polysombäran- de nascerande p97-kedjor genom inkubering med monoklonala an- tikroppar 3IgG2a (96,5, 118,1, 133,2) specifika för distinkta epitoper av p97 (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980- -4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70-72), följt av affinitets-2 ' kromatografering på protein A-sepharose. Den p97-anrikade mRNA eluerades under användning av EDTA och renades genom af- finitetskromatografering på oligo(T)-cellulosa (Bethesda RE- search Labs, Bethesda MD). Vid ett typiskt försök gav 150 E26O- -enheter av polysomer 260 ng p97-anrikad mRNA, som repre- senterar 0,23 % av total mRNA. Vid translation i Xenopus oo- cytes och analys med avseende på p97 såsom har beskrivits 506 024 38 tidigare (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70-72) gav p97-anrikad mRNA 80 pg p97 per ng mRNA, medan p97-icke- -anrikad mRNA endast gav 0,44 pg p97 per ng mRNA, vilket vi- sade att p97-mRNA-aktiviteten hade anrikats 180-faldigt. Ut- bytet av p97-mRNA-aktivitet var 42 %. Translation i retikulo- cytlysatsystemet (Pelham & Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67: 247-256) visade att p97-anrikad mRNA kodade för en huvud- polypeptid med en skenbar molekylvikt av 84 000 dalton vid ana- lys medelst SDS-PAGE, vilken polypeptid ej kunde påvisas i translationsprodukterna av icke-anrikad mRNA och immunopreci- piterades av antiserum, som var specifikt för p97 (Fig. 1).

Vi har därav dragit den slutsatsen att detta var den oglyko- sylerade förstadieföreningen till p97. 6.2. FRAMSTÄLLNING OCH KONSTRUKTION AV CDNA-KLONER Två tekniker, som beskrives nedan, användes för att konstruera CDNA-kloner transkriberade från de ovan isolerade mRNA-mallar- ha. 6.2.1. KONSTRUKTION AV CDNA-KLONER PREPARERADE MED OLIGO(T) Ovan framställda p97-anrikade mRNA användes som mall för oli- go(T)-preparerad cDNA-syntes. cDNA klonades i pBR322 som föl- jer: för förstasträng - cDNA-syntes inkuberades p97-anrikad mRNA, de fyra dNTP och oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) med omvänd transkriptas (Molecular Genetic Re- sources). Den andra strängen syntetiserades genom inkubering med det stora fragmentet av §. coli-DNA-polymeras (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) och den dubbelsträngade cDNA di- gererades med S1-nukleas (gåva från D. Durnam vid The Fred Hutchinsen Cancer Research Center, Seattle, WA). cDNA dC- -ändbehandlades med terminal deoxinukleotidyltransferas (Bet- hesda Research Labs, Bethesda, MD), sammanfogad med §§tI-di- gererad, dG-ändbehandlad pBR322 (Bethesda Research Labs, Bet- hesda, MD) (Villa Komaraff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75:3727-3731) och som användes för att transformera CaCl2- behandlad §.coli-BR1. DNA från kolonier av transformerade bakte- ” 506 024 rier bands till papper (Taub & Thompson, 1982, Anal. Bio- chem. 126: 222-230) och "screenades" genom differentiell hyb- ridisering med cDNA-prover syntetiserade på p97-anrikade och -icke-anrikade mRNA-mallar.

En klon hybridiserade till p97-anrikad cDNA men ej i påvisbar mängd till icke-anrikad cDNA och utvalde även p97-mRNA vid hybrid- selekterade translationsförsök. En polyadenyleringssignal (AATAA) och ett poly(A)-område var närvarande vid 3'-änden av cDNA (se Fig. 2). Nicktranslaterad p97-3a2fl hybridise- rade 100-faldigt mera kraftigt till p97-anrikad mRNA än till icke-anrikad melanom-mRNA och ej i påvisbar grad till fibroblast -mRNA. "Northern" blottanalys med den klonade cDNA som prov identifierade en mRNA om approximativt 4 kilobaser (kb), som var närvarande i SK-MEL 28-melanomceller och frånvarande i fibroblaster. 6.2.2. GENOMISK KLONING AV P97 OCH ANVÄNDNINGEN AV SYNTETISKA OLIGONUKLEOTIDER FÖR PREPRARATOR-CDNA-SYNTES Försök att erhålla cDNA-kloner, som sträckte sig mer än 1 kb från polyadenyleringsstället, var icke framgångsrika, möjli- gen till följd av en region med hög GC-halt (mer än 80 %) med omfattande sekundär struktur. Geonomisk kloning användes för att kringgå detta problem. Fyra överlappande genomiska klo- ner isolerades från bibliotek av lambda L47.1-haltig stor- leksfraktionerad SK-MEL 28-DNA, som hade anrikats med avse- ende på ett specifikt p97-restriktionsfragment. Dessa fyra genomiska kloner omfattar 28kb och innehåller hela kodnings- regionen av p97 innefattande genens kontrollregion. De geno- ' miska klonerna arrangerade i följd från 5' till 3' är: lamb- da B15, lambda H17, lambda B6.6 och lambda E7.7. Nomenklatu- ren består av en bokstav, som hänför sig till det restrik- tionsenzym som användes för att alstra fragmentet, och siff- ran anger fragmentets-storlek i kilobas, vilket fragment klo- nades i lambda L47.1. Utgående från 5'-änden innehåller såle- des lambda-klonen B15 ett 15kb ggmfll p97-fragment; lambda- 506 024 40 -klonen H17 innehåller ett 17kb gigdllï p97-fragment: lambda- -klonen B6.6 innehåller ett 6.6kb §amHI p97-fragment; och lambda-klonen E7.7 innehåller ett 7.7kb EEQRI p97-fragment (se Pig. 2A). Restriktionsfragment av de kloner som hybri- diserade till 4 kb p97 mRNA på “Northern blots" sekvensbe- stämdes och p97-exonerna identifierades genom en datorunder- stödd homologisökning mellan de predicerade kodningssekvenser- na och aminosyrasekvensen hos human- och kycklingstransferrin (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508; Jetsch & Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122: 291-295).

Tre syntetiska oligonukleotider, vars sekvenser baserade sig på genomiska p97-exonsekvenser, användes för att preparera cDNA-syntes på SK-MEL 28 mRNA och den erhållna cDNA klonades i lambda-gt10 som följer: p97-cDNA dG-ändbehandlades och li- gerades med en bryggbildaroligonukleotid (AATTCCCCCCCCCCCC) och lambda-gt10, som hade underkastats restriktion med ÉSQRI.

Bryggbildaroligonukleotiden medgav införande och ligering av den dG-ändbehandlade cDNA-sekvensen i ÉEQRI-stället hos lamb- da gt10. Lambdafagen förpackades (Grosveld et al., 1981, Gene 13:22?-237) och utströks på E. coli c600 rK_ mK+hfl. cDNA-biblioteken i lambda-gt10 "screenades" med avseende på p97-inlägget genom plackhybridisering (Benton & Davis, 1977, Science 196:180) med genomiska exonfragment som prover. Pro- verna märktes radioaktivt med 32P_TTP (New England Nuclear' 3200 Ci/mmole) genom nick-translation till en specifik akti- vitet av 5-10 X 108 cmp/pg. Tre överlappande cDNA-kloner (10a1, 1j1, 2f1) omspännande 2368 nukleotider i p97-mRNA in- nefattande hela kodningsregionen identifierades genom använd- ning av p97-exonspecifika fragment som prover (Pig. 2). 6.3. DNA-SEKVENSANALYS AV p97 CDNA-inlägg utskars och subklonades i plasmidvektor pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:1645-1655) i §. coli för efterföljande propagering och restriktionskartläggning. 41 506 o24 cDNA subklonades även i M13mp18 fagkloningsvektor (Yanish-Perrone -Perrone et al., 1985, Gene 33:103-119) och sekvensbestämdes under användning av dideoximetoden enligt Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467). M13- -kloner innehållande stora inlägg sekvensbestämdes genom alst- ring av deletioner under användning av DNAse I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158:539-545) eller exonukleas III (Henikoff, 1984, Gene 28:351-359) och genom användning av syntetiska 21- -mer-oligonukleotid-preparatorer. p97-cDNA-sekvensen visas i Pig. 3. En öppen läsram om 2,214 nukleotider sträcker sig från den första ATG, runt vilken sek- vensen överensstämmer med den konsensusinitieringssekvens som har bestämts av Kozak (Kozak, 1980. Nucleic Acids Res. 8:127- -142), till TGA i position 2,215. Den mesta 5'-cDNA-klonen innehåller ytterligare 60 nukleotider uppströms om den ini- tierande ATG. Den 3'-icke-kodande regionen av p97-mRNA, som ej_erhölls som en cDNA-klon, identifierades som en enda ge- nomisk exon innehållande 1667 nukleotider. Resterna 20-32 i den prediserade aminosyrasekvensen är identiska med den kända N-terminala aminosyrasekvensen i p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171-173, vilket belägger identiteten hos den klonade cDNA. Vidare är den prediserade molekylvikten hos förstadieföreningen 80,196 dalton, i god överensstämmelse med den observerade molekylvikten för translationsprodukten in vitro. 6 . 4 . KONSTRUKTION AV EN REKOMBINERANDE EXPRESSIONSPLASMID INNE- HÅLLANDE p97-KODNINGSSEKVENSEN Den stora storleken hos p97-genen nödvändiggjorde sammanfog- ning av de cDNA-kloner som erhölls genom specifik prepare- ring av melanom-mRNA med omvänt transkriptas. Man använde de tre cDNA-lambda-gt10-kloner (10a1, 1j1 och 1f1; se Fig. 2), som omfattade kodningsregionen från signalpeptiden via mem- branankarsekvensen. p97-inlägget i klonen 10a1 utskars genom digerering med §§gRI och oligo(dG)-sekvensen vid 5'-änden av 506 024 42 cDNA 10a1 avlägsnades genom digerering med exonukleas III, vilket alstrade klonen 10a1b med ett gindlïl-ställe 30 bp upp- ströms om den initierande metioninen i p97-förproteinet. p97- -inlägget i de tre cDNA-klonerna 10a1b, 1j1 och 2f1 och den ge- onomiska klonen E7.7 ligerades samman vid gyglï-, §§tI- och §g9RI-restriktionsenzymställena och infördes i gindllï- -§g9RI-ställena i plasmidvektorn pEMBL18+ (Dente, et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11:1645-1655) såsom visas i Fig. 2. Den slutliga konstruktionen, p97b, innehåller p97-inlägget om 4,4 kb i plasmidvektorn pEMBL18+, som användes för att trans- formera §. ggli-HB101. Inlägget i p97b innehåller 30 bp av den 5'-icketranslaterade regionen av p97-mRNA, hela kodnings- sekvensen och den 3'-icketranslaterade regionen, bunden av ett '-gindlïï-ställe och ett 3'-EEQRI-ställe. p97-inlägget om 4,4 kilobas utskars från p97b med §iEdIIII och EEQRI och ändarna fylldes i under användning av Klenow-fragmentet av §.g9li-DNA- -polymeras. Det trubbändiga fragmentet infördes i det unika §m51-stället i den eukariotiska cDNA-expressionsvektorn 1995.12 pUC13, ett derivat av vektorn mThGH-112, (Palmiter et al., 1983, Science 222:809-14), som erhölls från Dr. Richard Pal- miter (University of Washington, Seattle, Washington). Denna vektor använder musmetallotioneinpromotorn för att expressions- definiera främmande gener i eukariotiska celler. Konstruktio- nen med p97-inlägget i rätt orientering identifierades genom restriktionsanalys och betecknades pMTp97b.

Den rekombinerande plasmiden transfekterades i LMTK_-celler och transfektaten utvaldes genom tillväxt i HAT-medium. Klo- ner, som uttogs från den transfekterade skålen, expanderades i mikrotestplattor med 96 fack och förbrukat odlingsmedium och cellysat från replikatplattor analyserades med avseende på p97 medelst en tvåställig immunoradiometrisk analys. Sub- kloner expanderades och omtestades. Klon TKMp97-12, som ex- pressionsdefinierar ca. 4 miljoner molekyler av p97 per cell, fick växa upp, inducerades med kadmium och användes som källa till p97 för immunisering. 6.5. IMMUNISERING AV MÖSS MED p97-RELATERADE PEPTIDER TKMp97-12-cellerna fick växa till sig, inducerades med kadmium 506 024 43 och-(14,4 g) lyserades genom inkubering under 10 minuter på is med 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40). Lysatet ultracentrifugerades vid 200 000 x g under 45 minuter vid 4°C och hälften av lysatet fick pas- sera en 1 ml immunoaffinitetskolonn, som var specifik för p97 (Fab-fragment av antikropp 96,5 kopplad till Sepharose). Immu- noadsorbenten tvättades omsorgsfullt, först med TNEN och slut- ligen med 20 mM Tris-HCI, pH 6,8.

För immuniseringen blandades 0,5 ml av den adsorberade immuno- affinitetskolonnen, som hade preparerats såsom beskrivits ovan, med 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 6,8, och emulgerades med 1 ml fullständigt Freunds adjuvans. Fyra BALB/c-möss erhöll varde- ra 0,4 ml av emulsionen intraperitonealt. Tre veckor senare fick mössen en boosterdos om en fjärdedel av denna mängd av antigen i ofullständigt Freunds adjuvans. Kontrollmöss immuni- serades med en immunoaffinitetskolonn av en antikropp, som icke var relaterad till p97 men som i övrigt hade behandlats på samma sätt. Fyra av de p97-immuniserade mössen och tvâ kon- trollmöss tappades på blod 1 vecka efter tillförande av boos- terdosen. Sera testades med avseende på antikroppar mot p97 genom immunoprecipitation från radioaktivt joderade SK-MEL- -melomceller följt av SDS-PAGE. Resultaten visade att sera från de fyra p97-immuniserade mössen immunoprecipiterade p97, medan kontrollsera var negativa. Sera testades även med av- seende på närvaron av antikroppar riktade mot p97 under an- vändning av en ELISA-analys på glutaraldehydfixerade SK-MEL28- -melanomceller (20 000 celler per mikrotestfack). De fixerade cellerna inkuberades med 0,05 ml serum spätt 1A0000under 1 timme vid rumstemperatur, tvättades och inkuberades därefter under 1 timme vid rumstemperatur med 0,05 ml pepparrots-per-' oxidaskonjugerat get-anti-mus-IgG (Southern Biotech). De op- tiska densiteterna (avlästa vid 490 nm) hos sera från de p97- -immuniserade mössen var 0,350, 0,243, 0,343 och 0,200 medan den optiska densiteten hos sera från kontrollmössen var 0,036 och 0,057. 506 024 44 6.6. KARAKTERISERING AV p97 6.6.1. STRUKTUREN HOS P97 Strukturen hos p97 bestämdes utgående från aminosyrasekvensen _hos p97-förstadieelementet, som innefattar fyra strukturomrâ- den. Eftersom resten 20 i förstadiesekvensen motsvarar N-än- den hos mogen p97, utgör troligen aminosyraresterna 1-19 en signalpeptid, en slutsats som underbyggs av dess längd och hydrofoba natur. Aminosyrorna 20-361 och 362-713 innefattar två homologa domäner om 342 och 352 aminosyror. Potentiella N-länkade glykosyleringsställen uppträder i positionerna 38 och 135 i den N-terminala domänen och position 515 i den C- -terminala domänen. Slutligen antager vi att aminosyrorna 714- -738, en region om i huvudsak oladdade och hydrofoba rester, ankare p97 i cellmembranet (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181:111-121) och kan sträcka sig in i cytoplasman.

Domänstrukturen hos p97 underbyggs av proteasdigereringsförsök.

Digerering av p97 med trypsin, papain (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) och trombin gav ett glykosylerat an- tigeniskt fragment med molekylvikten av approximativt 40 000 dalton. Fragmentet renades från en trombindigerering av p97, 3sS_cys_ som hade märkts metaboliskt med S-metionin eller tein och sekvensbestämts såsom beskrivits tidigare (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171-173). Cysteinrester identi- fierades i positionerna 7 och 17 och metioninrester i posi- tionerna 2 och 20. Identiska resultat erhölls med intakt p97 och är i fullständig överensstämmelse med den N-terminala sekvensen av p97 som kan prediseras från cDNA-sekvensen. Vi drager den slutsatsen att det proteasresistenta fragmentet med en molekylvikt av 40 000 dalton motsvarar den N-terminala do- mänen av p97. Vi har icke kunnat isolera den C-terminala do- mänen av p97, förmodligen på grund av att den är proteaskäns- lig. 6.6.2. HOMOLOGI HOSép97 MED TRANSFERRIN En sökning i aminosyrasekvensbiblioteket hos Protein Identifi- 506 024 45 g cation Resource (Release 5.0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London 290:8) visade att p97 i slående grad är homolog med tre medlemmar tillhörande transferrin-överfamiljen: human- serumtransferrin, humanlaktotransferrin och kycklingtrans- ferrin (37-39 % homologi, se Fig. 4). Eftersom human- och kycklingtransferrin visar 50 % homologi med varandra måste p97 ha divergerat från serumtransferrin för mer än 300 mil- joner år sedan. p97 har fjorton systeinrester lokaliserade i homologa positioner i varje domän. Humantransferrin innehål- ler samtliga dessa cysteiner i homologa positioner i båda do- mänerna, medan humanlaktotransferrin och kycklingtransferrin endast saknar två av dessa cysteinrester (i sina C-terminala domäner). I motsats till p97 innehåller dessa proteiner 4-7 ytterligare cysteiner i sina C-terminala domäner, som ioke har något motsvarande element i den N-terminala domänen. Hu- mantransferrin innehåller även två extra cysteiner, som är unika för dess N-terminala domän. Positionerna av de flesta av disulfiderna i humanserumtransferrin, laktotränsferrin och kycklingtransferrin har bestämts direkt (McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. SCi» USA 79:2504-2508; Metz- -Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145:659-676; Mazu- rier et al., 1983, Experientia (Basel) 39:135-141); MacGilli- vray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:3543-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem. 122:297-303; Williams, 1974, Biochem J. 141:745-752). Man kan således predisera närvaron av sju disulfidbindningar i varje domän av p97 (se Fig. 5).

Aminosyrahomologin mellan domänerna i p97 (46 % - uppnås ge- nom införande av 7 gap av 9 rester) är mera slående än den som kan ses i humantransferrin (43 % - 16 gap, 45 rester) eller kycklingtransferrin (35 % - 12 gap, 49 rester). Med hän- syn till den omfattande sekvenshomologin mellan p97 och trans- ferrin och de uppenbarligen likartade vikningsmönstren, ba- serade på konservation av cysteiner, antager vi att det kan vara möjligt att härleda den tredimensionella strukturen hos p97 om den nuvarande lågupplösningsröntgenstrukturen hos transferrin (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281:157-158) 506 024 46 kan förfinas. 6.6.3. FUNKTION HOS E97 p97-peptidens medlemskap i transferrin-överfamiljen, dess för- måga att binda järn (Brown et al., 1982, Nature, London 296: 171-173) och dess gemensamma kromosomala lokalisering med transferrin och transferrinreceptorn (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303:70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 81:2752-2756) är fakta som samtliga underbyg- ger p97-peptidens roll vid järntransport. Den järnbindande fickan i transferrin antages innehålla 2-3 tyrosiner, 1-2 histidiner och en enda bikarbonatbindande arginin (Metz- -Boutigue et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145:659-676). Kon- servation av dessa aminosyror i p97 underbygger dess antagna roll i järnmetabolism (se Pig. 4). Eftersom p97 är en membran- bunden transferrinliknande molekyl och icke har någon homolo- gi med transferrinreceptorn (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311:675-678) kan dess roll i cellulär järnmetabolism skilja sig från den som tillhandahållas av cirkulerande serum- transferrin och den cellulära receptorn för transferrin. Ex- pression av den klonade p97-cDNA i eukariotiska celler medger experimentell provning av dess funktionella egenskaper. 6.6.4 SLUTSATS Baserat på dessa data är det klart att CDNA-konstruktioner för melanomassocierad p97 har erhållits och att dessa kan expres- sionsdefinieras effektivt i däggdjursceller för att producera stora mängder av antigenisk p97. 7. EXPRESSION AV KLONAD p97 OCH VACCINTESTNING De försök som beskrives i detalj nedan avser expression av det klonade p97-proteinet och dess vaccinprovning. Expressicn av p97-protein i en utsöndrad form (frân den transfekterade muscellklonen B16svp97a.14) möjliggjorde rening av milligram- kvantiteter av p97-fullänksproteinet. Proteinet i renad form 506 024 47 användes för provning in vitro av induktionen av cellulär immunitet för provning av dess potential som ett subenhets- vaccin. p97-genprodukten expressionsdefinierades även på cellytan av metastatiska murinmelanomceller, vilket tillhan- dahöll en modell för provning av effektiviteten hos vaccin när det gäller att förhindra tumörtillväxt i ett syngeneiskt system. p97-genen infördes i ett levande rekombinerande vacciniavirus för användning som vaccinberedning med förmåga att generera effektiv cellulär immunitet. Det rekombinerande vacciniavi- ruset, Vp97a-NY, utvärderades med avseende på dess förmåga att generera immunitet hos möss, under användning av en mång- fald analysmetoder för påvisande av humoral och cellulär'im- munitet. Under användning av ovan beskrivna syngeneiska murin- tumörmodell visades det rekombinerande Vp97a-NY-virusvacci- net tillhandahålla en skyddseffekt mot tumörcellsinfektion.

Vaccinet tillhandahöll även en terapeutisk effekt hos möss med existerande växande lungmetastaser, en egenskap som är analog med den föreslagna användningen av vaccinet för att alstra ett immunoterapeutiskt antitumörsvar hos humanmelanom- patienter med existerande tumör.

Förutom musundersökningarna, där det föreligger endast 91 % homologi mellan human p97 och det mushomologa proteinet (över hittills undersökta regioner), har även Vp97a-NY-vaccinet tes- tats på icke-humanprimater. Det föreligger en mycket närmare homologi mellan human p97 och apformen av proteinet (såsom avslöjas av korsreaktiviteten på monoklonalantikroppsnivå).

På grund av den potentiella svårigheteni.attframkalla ett im- munsvar mot ett "eget"-protein användes den närbesläktade än Macaque-apan för att testa immunogeniciteten hos Vp97a-NY-vac- cinet. Det rekombinerande vacciniavaccinet testades på apor och visade sig inducera humoral immunitet riktad mot p97- -proteinet. Hittills har aporna icke uppvisat några pâvisbara symptom på skadliga biverkningar från exponering av vaccinet efter att ha erhållit tvâ inympningar av det levande rekombi- nerande vacciniaviruset under en tidsrymd av 6 veckor. 506 024 48 7.1. PLASMIDEXPRESSION Den expressionsplasmid som styrs av SV-40, tidigare promotor sv2, konstruerades från cDNA-plasmidklonen p97a, som liknar plasmiden p97b med undantag av att hela 3'UT-regionen utnytt- jas (Fig. 6). Samtliga cDNA-kloner isolerades ursprungligen från lambda-gt10-bibliotek med syntetiska EEQRI-dG (9-17)- -länkare såsom har beskrivits tidigare. Inlägg utskars med §g9RI och subklonades i pEMBL18+ för efterföljande propage- ring och karakterisering. Klonen 10a1 subklonades i M13mp18 och kortvarigt med exonukleas III, trubbändbehandlades med S- -nukleas, behandlades med Klenow och återligerades. Flera plack isolerades och sekvensbestämdes, varav ett hade avlägs- nat dG-änden och bibehöll 33 bp av den p97-5'-icketranslate- rade region som hade införts i gindtlï-stället av M13mp18. En RF av denna subklon (10a1a) användes för att alstra intakt p97-cDNA; i övrigt isolerades samtliga fragment från plas- midsubklonerna. Det 550 bp stora §indIII-EXEII-fragmentet från 10a1a och det 735 bp stora 21311-§3lI-fragmentet från 1j1 isolerades från LMP-agarosgeler och ligerades i pEMBL18+ vid §alI- och gindïll-ställena under alstring av p5'p97. Den genomiska E7.7-klonen i pEMBL18+ digererades till fullstän- dighet med §gQRI och digererades partiellt med §§tI och 4.5 kb-fragmentet separerades genom fraktionering genom 0,8 LMP- -agaros. Detta 4,5 kb-3'-fragment ligerades med 404bp §§tI- -fragmentet från 2f1 och 535bp-§amHI-§§tI-fragmentet från 1j1 i pEMBL18+ vid §alI- och EEQRI-ställena under alstring av p3'p97. 1285bp-§indIII-§alI-fragmentet av p5'p97 ligerades därefter i p3'p97 under alstring av pp97a. Det §g9RI-parti- ella gindlïl-fragmentet från denna klon infördes i pSV2neo (Southern, et al., 1982, J. Mol. App. Genet. 1:32?-341) vid §indIII och §g9RI-ställena under eliminering av den kodande neomycinregionen och SV40-splitsning/polyA-sekvenser men un- der bibehållande av den tidiga SV40-promotorn och 72bp för- stärkare, 33cbp p97 5'UTR, hela den kodande p97-regionen, 3'UTR och 1,4 kp 3'-flankerande DNA. Den resulterande plas- miden benämndes pSVp97a. 49 50,6, 024 Den sv2-styrda plasmiden transfekterades genom kalciumfosfat- precipitation i en mångfald eukariotiska cellinjer och ex- pressionsdefinierande celler klonades och selekterades under användning av co-transfektion av en dominerande selekterbar markör. För åstadkommande av detta odlades ovarieceller från kinesisk hamster (CHO) i Hanks F1-medium innehållande 15 % kalvfosterserum (FCS), 4mM L-glutamin, 1,3 mM-prolin och an- tibiotika. B16-celler odlades i RPMI-medium innehållande 0,15 % bikarbonat och 1735 celler i DMEM-medium (Gibco), bå- da kompletterade med 15 % FCS och antibiotika. Cellerna trans- fekterades med en modifierad kalciumfosfatteknik (Wigler M., et al., 1978, Cell 14:725-731) med 20 pg per platta av pSV2p97a-plasmid DNA och 0,5 pg av antingen pSV2DHFR eller pSV2neo. Alla plasmider lineariserades vid §§gRI-stället. Sta- bila transfektat selekterades under användning av hypoxantin- negativt (HAT)-medium för CHO-celler eller 0,5 pg/ml Geneti- cin (G418, Gibco) för B16- och 1735-cellerna. överlevande celler började bilda synliga kolonier 7 dagar efter transfek- tion och överskiktades med sterila polyesterfilter, som hölls på plats med glaspärlor. Filtren fick vara på plats under 5 dagar, vilket fick cellerna att växa upp i polyestermatrisen och alstra ett replikat av kolonierna på plattan. Filtren avlägsnades därefter och användes för en bindningsanalys av levande celler med joderad anti-p97-monoklonal antikropp. 10 pg av den märkta monoklonala antikroppen inkuberades med upp till 20 filter i 10 ml FCS vid 4°C under en timme. Filtren tvättades grundligt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), torka- des och exponerades för XAR-5-film över natten vid -70°C.

Filtren färgades därefter med 7 % metylenblått för visualise- ring av cellkolonierna. I samtliga cellinjer som användes, med undantag av B16-muslinjen, innehöll de expressionsdefini-v erande cellernaantigenisktF97-protein på sina cellytor.

I de B16-transfekterade cellerna frigjordes p97 i mediet, en upptäckt som är unik för denna celltyp. Utsöndringen av p97 möjliggjorde rening av-p97-fullängdsprotein från cellernas medium. Klonen B16SVp97a.14 expressionsdefinierade ca. 4 pg/ ml p97 i förbrukat medium. Rekombinerande p97 renades från 506 024 50 förbrukat medium av den transfekterade klonen B16SVp97a.14, som utsöndrade stora mängder p97-antigen i mediet. Cellerna hölls vid nära konfluens (109celler) i 850 cmz skakflaskor genom kontinuerlig tillsats av små mängder färskt medium.

De fortsatte att utsöndra antigen under veckor utan att iso- leras, vilket möjliggjorde kontinuerlig skördning och nedfrys- ning av förbrukat medium. Reningen av p97 utfördes medelst immunoaffinitetskromatografi under användning av Sepharose länkad till Fab-fragment av den monoklonala antikroppen 96.5.

För detta ändamål kördes 3 liter förbrukat medium under en se- rie av tre 30-ml-kolonner. Den första innehöll 15 ml superfin G25 Sephadex (Pharmacia), den andra innehöll 20 ml Sepharose 4b (Pharmacia) och den tredje innehöll 8 ml cyanogenbromid- aktiverad Sepharose (Sigma) konjugerad till Fab-fragment av den monoklonala antikroppen 96.5 (10 mg protein/ml av Sepha- rose). Därefter tvättades affinitetskolonnen grundligt med kall PBS och antigenet eluerades med 30 ml 0,1 M citrat, pH , och 30 ml 0,1 M citrat, pH 4. Dessa betingelser visade sig ej ändra antigenetsimmunoreaktivitet under det att de åstad- kom fullständig eluering av antigenet från den monoklonala antikroppen 96.5. De två eluaten neutraliserades med 3,0 ml respektive 4,5 ml 2 M Tris, pH 8. Det renade eluatet koncen- trerades under användning av en Amicon-apparat med ett PM10- -filter och tvättades med 2 x 10 ml PBS, vilket gav ett slut- ligt utbyte av 4,95 mg i 4,5 ml vid bestämning medelst Brad- ford-analys (Biorad). 15 pg av produkten kördes på SDS-PAGE (Fig. 7) och visualiserades både med Coomassie-blått och silverfärgning. En dubbeldeterminantimmunoanalys (DDIA) (Brown, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:539) tillhan- dahöll en oberoende bekräftelse av den molära kvantiteten av renat protein. Kontrollpreparationer utfördes parallellt med förbrukat medium från B16-modercellinjen och visade icke på något påvisbart protein. Vid en efterföljande preparation renades 30 mg 96% rent p97-protein från 300 mg Fab-fragment av den monoklonala antikroppen 96.5 konjugerade till Sepharose.

Det renade p97-proteinet var immunogent och gav ett kraftigt antikroppssvar hos möss, som hade immuniserats med proteinet 506 024 51 såsom beskrives i avdelning 7.3 nedan. 7.2. KONSTRUKTION OCH EXPRESSION AV REKOMBINERANDE P97- VACCINIAVIRUS Den kodande regionen av p97 infördes genom att man utskar p97a med §1§åIII'konverterade ändarna till trubbiga ändar och ligerade i vacciniainföringsvektorn pGS-20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:85?-864), som hade öppnats vid §maI-stäl- let.PG920-vektorn utnyttjar 7,5 K promotorn och innehåller flankerande sekvenser från vacciniatymidinkinas (TK)-genen. Ett rekombinerande virus alstrades medelst den metod som har be- skrivits av Mackett et al., ovan och Vp97a-NY isolerades, vil- ket fick infekterade celler att expressionsdefiniera p97-pro- tein av korrekt storlek och glykosylering ( Fig. 8). Ytexpres- sion av p97 bekräftades även i celler, som hade infekterats med det rekombinerade p97-viruset (tabell I) nedan.

TABELL I p97-YTEXPRESSION AV TRANSFEKTERADE MUSCELLER OCH CELLER INFEK- TERADE MED REKOMBINERANDE VACCINIAVIRUS1 Molekyler p97 expres- sionsdefinierade per Virus som har använts för att infektera cel- Celltyp len cell M2SVp97a.A Inget 3 210 000 M2svp97a.E/F2 Inget 434 000 M2 (modercell) Inget 2 000 BSC Inget 5 590 BSC Vwt-NY-vaccinia 5 220 BSC Vp97a-NY-vaccinia 1 140 000 1Celler trypsinerades kortvarigt, tvättades och alikvotöver- 3 till m4 eller 1o5 Icke-expressionsdefinierande bärarceller sattes till rören med lägre celltal så att totalt 105 1 x 106 cpm av joderad monoklonal antikropp 96,5 (123 ng) inkuberades, i en total volym av 50 pl, med Cellefflä Unfiêr 60 minuter på is. Cellerna tvättades och centrifugerades fyra fördes till rör innehållande 10 celler. celler användes per rör. 506 024 52 gånger i PBS + 10 % kalvfosterserum, återsuspenderades där- efter och räknades i en Micromedic 4/600 plus gammaräknare. (-) anger mindre än. 7.3. REKOMBINERANDE p97-VACCINIAVIRUS ÄR IMMUNOGENT HOS MÖSS Ympning av möss med Vp97a-NY alstrade ett kraftigt humoralt antikroppssvar. Möss immuniserades en gång, erhöll en boos- terdos en gång efter fyra veckor och tappades därefter på blod efter fem veckor. Titrarna fastställdes medelst ELISA-analys under användning av antigenbelagda plattor och ett protein A konjugerat till pepparrotsperoxidas som detektionsreagens.

Data omvandlades till monoklonalantikroppekvivalenter genom jämförelse med en standardkurva för ELISA-bindning, som er-' hölls under användning av anti-p97-monoklonal antikropp 133.2.

Resultaten visade en kraftig induktion av serumantikropp (Fig. 9). Cellulär immunitet pâvisades under användning av en pro- liferatnmsanalysin vitrg med renat p97-protein som stimule- rande antigen (tabell II).

TABELL II PROLIFERATIONSANALYS AV MURINA MJÄLTCELLER1 Proliferationsindex Proliferations- Stimulerande för vp97-rekombine- index för mjält- antigen rande inmuna mjältzceller kontrollceller Con A (10 pg/ml) 71 50 p97 protein (3 pg/ml) 27 2 (10 pg/ml) 43 2 (20 pg/ml) 56 2 (50 mikrogr/ml) 44 3 UV-inaktiverat vacciniavirus (10 pfu/ml) 91 2 p97-transfekterade bestrålade syngeneiska tumörceller (104) 86 2 Bestrâlade modertumörceller (194) 3 1 1Mjältceller isolerades från möss, som hade ympats genom svans- 7 skarifikation med 10 pfu VP97a-NY-rekombinerande virus, er- hållit en boosterdos av samma storlek en månad senare och 53 506 024 som avlivades en vecka därefter. Naiva mjältceller användes som kontrollprov i detta försök. 105 celler odlades per fack 1 rundbottnade plattor med 96 fack i 0,22 ml RPMI, komplet- terat med 0,5 % normalt musserum, penicillin/streptomycin, glutamin, bikarbonat och 2,5 x 105 M 2-merkaptoetanol. Od- lingarna pulsmärktes under 6 timmar på dag 4 med 25 pCi/fack tritierat tymidin (New England Nuclear), skördades med en PHD-cellskördeapparat och pulsbestämdes under användning av Optifluor i en Beckman LS 3801-räknare. Proliferationsindex beräknades genom att man dividerade cpm-medelvärdena för kvadrupelfack,Stimulêrädenæd varje antigen, med cpm-medel- värdet för kontrollprovet (medium).

De resultat som visas i tabell II visar att T-celler prolife- rerar som svar på p97-proteinantigenet.

I syfte att fastställa huruvida hjälparceller även stimulera- des av det rekombinerande viruset i mjältceller från immuni- serade möss,stimulerade cellerna inygggg och de överliggan- de vätskorna analyserades med avseende pa produktion av inter- leukin-2-IL-2), en T-hjälparcellfaktor. Mjältceller odlades från möss, som hade immuniserats tvâ gånger tidigare med re- kombinerande VP97a-NY-vaccinia eller modervaccinia. 105 ler inkuberades under 48 timmar i 0,2 ml av ett medium, som var identiskt med det som användes för proliferationsanalyser- na, i rundbottnade plattor med 96 fack och i närvaro eller frånvaro av det stimulerande antigenet. överliggande vätskor tillvaratogs, poolades från 4 fack och frystes före IL-2- 4 tidigare IL-2-svälta celler från mus-T-cellinjen CTLL inkuberad i varje fack med cel- -analys. IL-2-analysen utnyttjade 10 varierande spädningar av överliggande analysvätskor med Clicks medium, i triplikat. En standardkurva uppritades med rekombinerande IL-2 erhållet från Genentech, CA. CTLL-celler pulsmärktes med tymidin enligt den sedvanliga proliferations- analystekniken under de sista sex timmarna av den 24 timmar långa inkuberingen, skördades därefter och pulsbestämdes såsom beskrivits för proliferationsanalysmetoderna. De i tabell III visade resultaten visar att IL-2-produktion från mjältceller 506 024 54 från möss, som har immuniserats med rekombinerande p97-vacci- niavirus, stimuleras in vitro av p97.

TABELL III STIMULATION AV IL-2-PRODUKTION MED P97-IMMUNA MJÄLTCELLER Vaccinations- Stimulus Producerade immunogen in vitro IL-2-enheter Vp97a-NY p97 protein 4,4 (20 pg/ml) Vp97a-NY Medium 0,25 Vwt-NY p97 protein 0,25 (20 pg/ml) Vwt-NY Medium 0,25 Dessutom uppmättes ett överkänslighetssvar av fördröjd typ under användning av trampdynesvällningsanalys på Vp97a-NY- -ympade möss. 5 möss (stammenC3K/Henlper grupp ympades genom svansskarifikation med rekombinerande vacciniavirus eller modervacciniavirus. 6 dagar senare infekterades baktassarna hos varje mus genom ympning av 20 pl PBS eller 20 pl celler i PBS (5 x 105 celler per mus). Trampdynorna uppmättes 24 tim- mar senare medelst en dubbelblindmetod under användning av en Fowler-mikrometer. Tjockleken hos den PBS-injicerade tramp- dynan subtraherades från den uppmätta tjockleken hos försöks- tassen hos varje mus och medelvärden liksom standardavvikel- ser för tillskottet av trampdynesvällning beräknades. De re- sultat som anges i tabell IV visar induktionen av ett p97- -specifikt överkänslighetssvar av fördröjd typ hos möss immu- niserade med rekombinerande p97-vacciniavirus. 55 'l 506 024 TABELL Iv _ _ Anricßuspncirix TRAMPDYNESVÄLLNING nos p97-IMMUNA möss Vaccinations- Infekterande Trampdynesvällning immunogen antigen (mm x 10'2) Vp97a-NY p97-transfekterade syn- 40,3 (+/- 6,8) geneiska tumörceller Vp97a-NY syngeneiska modertu- 3,0 (+/- 2,8) mörceller Vwt-NY p97-transfekterade syn- 1,5 (+/- 2,3) geneiska tumörceller Vwt-NY syngeneiska modertu- 5,5 (+/- 5,0) mörceller 7.4. SKYDD OCH TERAPI MED p97-VACCINIAVIRUS I EN MURIN TUMÖR- MODELL I syfte att utvärdera vaccinationseffektiviteten vaccinerades möss med olika protokoll under användning av det rekombine- rande p97-vacciniaviruset enligt uppfinningen och infektera- des därefter med en p97-transfekterad syngeneisk tumörcell (M2SVp97a.2E). För detta ändamål immuniserades möss med re- kombinerande levande Vp97a-NY-vacciniavirus eller moderstam- men (Vwt-NY) genom svansskarifikation eller med 100 pg renat p97-protein eller s x 106 bestraiade M2-x173s-tumörcelier intraperitonealt i Freunds heladjuvans. En intravenös tumör- cellinfektion âstadkoms två veckor efter den sista vaccina- tionen genom injektion av M2SVp97a.2E, en metastatisk tumör- klon framställd från M2-K1735 (en murinmelanommodell) genom transfektion med den humana p97-kodningssekvens som ingick i en expressionsplasmid styrd av den tidiga SV40-promotorn. En mångfald expressionsdefinierande kloner utvaldes och den som ' användes för tumörinfektion, klonen M2SVp97a.2E, expressions- definierar en mediumnivâ av p97, ca. 400 000 molekyler per cell eller ekvivalent med humanmelanom-p97-antigendensiteten.

Två doser av intravenös tumörinfektion användes, 5 x 10 eller 1 x 105 C3H/Hen-möss. Mössen avlivades 16 dagar efter tumörinfektio- celler, som injicerades i svansvenen hos syngeneiska nen och lungorna avlägsnades. En mus bedömdes som positiv om den uppvisade tumörer synliga för blotta ögat i lungor, som hade färgats med tusch. Resultaten visas i tabell V. 506 024 56 TABELL V INFEKTION AV VACCINERADE MÖSS MED SYNGENElSKA p97-TRANSFEKTERADE MELANOMCELLER Antal immuni- Infekterande Antal möss med Vaccin seringar celldos uppenbar lung- metastas vp97a-NY 2 s x 105 1/5 II 1 Il ~ Bestrålade syn- 2 " 0/4 geneiska melanom- celler Vwt-NY 2 " 9/10 p97-protein 2 " 3/3 vpswa-NY 2 1 x 105 o/1 II 1 II Naivt 0 " 5/6 De resultat som anges i tabell V visar att det förelåg en avsevärd skyddseffekt med två immuniseringar av Vp97a.NY ehu- ru någon skyddseffekt ej kunde konstateras med det renade p97- -proteinvaccinet (trots den framkallade extremt höga anti- kroppstitern). Förmågan hos det rekombinerande viruset att framkalla cellulär immunitet kan vara ansvarig för dess pro- tektiva tumörimmunitet.

Vid ett terapiförsök ympades möss med en låg dos av p97-ex- pressionsdefinierande tumörceller och ympades därefter två dagar senare med det rekombinerande vacciniavaccinet. Möss eller 104p97-expressionsdefinierande infekterades med 10 tumörceller (M2SVp97a.E) intravenöst. Två dagar senare ympa- des möss genom svansskarifikation antingen med Vp97a-NY eller Vwt-NY. Ympningar veckovis genom svansskarifikation upprepa- des och överlevande möss registrerades. De resultat som åter- ges i Fig. 10 visar den terapeutiska effekten hos vaccination med rekombinerande p97-vacciniavirus på möss med existerande lungmetastaser. 57 5o§jo24 7.5. REKOMBINERANDE p97-VACCINIAVIRUS ÄR IMMUNOGENT I MAKAKAPOR Två Macaca fasicularis (makak)-apor underkastades skarifika- tion med antingen 2 x 108 plackbildande enheter (pfu) av rekombinerande Vp97a-NY-vaccinia eller samma dos vaccinia av moderstammen. Två veckor senaretestädessera medelst ELISA- -analys med avseende på titrarna mot vaccinia och p97. De resultat som anges i tabell VI visar att humorala antikroppar mot p97 kunde påvisas tvâ veckor efter den enda ympningen med VP97a-NY.

TABELL VI SERUMANTIKROPPSTITER HOS VACCINIAYMPADE APOR Immunogen/ Antivacciniatiter Anti-p97-titer vecka (serumspädning med (Eg/ml monoklonala dubbel bakgrund) a tikr.ekvivalenter) Vp97a-NY/vecka O 1/20 0,54 Vp97a-NY/vecka 2 1/2000 6,54 Vwt-NY/vecka 0 1/20 0,50 Vwt-NY/vecka 2 1/2000 0,34 8. DEPOSITION AV MIKROORGANISMER Följande §.coli-stam uppbärande den angivna plasmiden har de- ponerats på ATCC, Rockville, MD och har tilldelats följande depositionsnummer: E. coli-stam Plasmid Depositionsnummer E. coli HB101 p97b 53,403 o Följande rekombinerande vacciniavirus har deponerats hos ATCC, Rockville, MD och har tilldelats följande depositions- nummer: Virus Depositionsnummer Vp97a-NY VR 2159 Följande cellinjer uppbärande de angivna plasmiderna har depo- 506 024 58 nerats som ATCC, Rockville, MD och har tilldelats följande de- positionsnummer: Cellinje Plasmid Depositionsnummer TKMp97-12 PMTp97b CRL 8985 (muscell) B16SVp97a.14 pSVp97a CRL 9304 (musmelanomcell) Föreliggande uppfinning är inte begränsad till omfånget av de deponerade mikroorganismerna av cellerna eftersom den de- ponerade utföringsformen är avsedd att endast åskådliggöra en aspekt av uppfinningen och varje mikroorganism eller cell som är funktionellt ekvivalenta faller inom ramen för denna uppfinning. Olika modifikationer av uppfinningen, förutom de som har visats och beskrivits häri, är uppenbara för fackman- nen med ledning av föregående beskrivning och bifogade rit- ningar. Dylika modifikationer är avsedda att falla inom ramen för de bifogade patentkraven.

Det torde även inses att samtliga basparstorlekar, som anges för nukleotider, är approximativa och anges i beskrivande syf- te.

Claims (16)

10 15 20 25 30 35 506 024 59 P A T E N T K R A V

1. Ett i huvudsak rent icke-denaturerat p97-proteinantigen, kännetecknat därav, att det har en aminosyrasekvens väsent- ligen såsom återgivet i Fig 3A och 3B, från aminosyrarest nummer 21 till 738, lektivt förstör melanomceller när det införs i en lämplig och kan framkalla ett immunsvar som se- värd.

2. Ett i huvudsak rent, icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att det har renats från en med genteknik odlad cell innehållande nukleotidsek- vensen enligt Fig 3A och 3B från nukleotid nummer 60 till 2214, med styrning av en andra nukleotidsekvens som styr gen- expression så att p97-proteinantigenet uttryckes av den med genteknik odlade cellen.

3. Ett i huvudsak rent, enligt patentkrav 2, kännatacknat därav, att den med gentek- icke-denaturerat 097-proteinantigen nik odlade cellen är en mikroorganism.

4. Ett i huvudsak rent, icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 3, kännetecknat därav, att mikroorganismen är en bakterie.

5. Ett i huvudsak rent, icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 3, kännatecknat därav, att mikroorganismen är en jäst.

6. Ett i huvudsak rent,'icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 2, kännetecknat därav, att den med gentek- nik odlade cellen är en djurcell.

7. Ett i huvudsak rent, icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 2, kännetecknat därav, att den med gentek- nik odlade cellen är en insektscell. 10 15 20 25 30 35 vfattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, 506 024 60

8. Ett i huvudsak rent, icke-denaturerat p97-proteinantigen enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att det har synteti- serats kemiskt.

9. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 1 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

10. fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 2 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

11. att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, Immunogen komposition, kännetecknat därav, icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 3 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

12. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 4 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

13. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 5 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

14. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 6 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

15. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 7 i blandning icke-denatu- G1 506 024 med en farmaceutiskt acceptabel bärare.

16. Immunogen komposition, kännetecknat därav, att den inne- fattar en immunogen dos av det i huvudsak rena, icke-denatu- rerade p97-proteinantigenet enligt patentkrav 8 i blandning med en farmaceutiskt acceptabel bärare.