JP3262787B2

JP3262787B2 - 豚コレラウイルスワクチン

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Publication number: JP3262787B2
Application number: JP06953790A
Authority: JP
Inventors: グレーゴル・マイアース; テイルマン・リユーメナプフ; ハインツ‐ユルゲン・テイール
Original assignee: アクゾ・エヌ・ヴエー
Priority date: 1989-03-19
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 2002-03-04
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: CN1047531A; EP0713915A1; DE69034218T2; DE69012386D1; DE69012386T3; AU5145190A; AU632545B2; ES2091083T3; DK0389034T3; HUT56286A; KR0179993B1; ES2063897T3; CA2012414C; DK1087014T3; ES2063897T5; CA2012414A1; DK0614979T3; EP0614979A1; KR900014587A; NZ232947A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は核酸配列、このような核酸配列を含む組換体
核酸分子、このような組換体核酸分子を含む組換体発現
系、豚コレラウイルスの形質を表すポリペプチド、この
ようなポリペプチド又は組換体発現系を含むワクチン、
及びこのようなワクチンの製造方法に係る。

古くからの疾病である豚コレラ（HC）は世界中の多く
の国で経済上、重大な豚疾患である。自然条件下で豚は
HCに感染することが知られている唯一の動物である。豚
コレラは毛細血管の壁に変性を生じ、ひいては内部器官
の出血及び壊死を招く伝染性の高い疾患である。まず最
初に、豚コレラは発熱、食欲不振、嘔吐及び下痢の症状
が現れ、その後、雌豚の不妊症、流産及び出産低下によ
り特徴付けられる慢性過程の疾患が生じ得る。しかしな
がら、初期症状が現れてから２週間以内にほぼ全部の豚
は死亡する。

発現因子である豚コレラウイルス（HCV）は、畜牛の
ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）及び羊国境病ウイ
ルス（BDV）に構造的及び血清学的に関係することが明
らかにされている。これらのウイルスはトガウイルス科
のペスチウイルス属に分類される。ペスチウイルスの遺
伝物質の本質はRNA、即ち顕著なポリアデニル化を欠失
した＋鎖RNAであることが古くから知られている。HCVは
３〜５個の構造タンパク質を含むと考えられ、そのうち
２個はグリコシル化されている可能性がある。非構造ウ
イルス性タンパク質の数は未知である。

HC感染を予防するために種々の修飾HCVワクチン（弱
毒化又は殺したウイルスを含む）が開発され、現在使用
されている。しかしながら、該修飾ウイルスワクチンで
使用すべきHCV材料を得るために組織培養細胞を感染す
ると、ウイルス収率が低く、ビリオンを精製するのは困
難である。修飾生ウイルスワクチンは、まだ病原性であ
って接種動物又は子孫に疾患を生じさせ得る部分的に弱
毒化した病原性HCVを動物に接種する危険、及びワクチ
ン中の他のウイルスによる汚染の危険を常に伴う。更
に、弱毒化ウイルスは毒性状態に戻ることがある。

不活化ワクチンを使用しても幾つかの欠点があり、例
えばウイルスを部分的にしか不活化できないという危
険、低レベルの免疫しか達せられず、更に免疫感作が必
要であるという問題、及び不活化処理により抗原決定基
が変化するので不活化ウイルスの免疫原性をかなり低下
させるという問題などがある。

更に、修飾HCVワクチンの使用は根治プログラムには
適していない。

今まで我々の知る処では、HCVとBVDV感染を区別する
ことが可能な豚の診断試験は存在していない。豚のBVDV
感染はHCV感染よりも重度が低く、従って、BVDVに感染
した豚は根治する必要がないので、このことは重要であ
る。

病原体に対する免疫応答を惹起することが可能な必須
の関連HCV免疫原物質のみを含有するワクチンは、修飾
ワクチンの上記欠点を示さない。

本発明によると、豚コレラウイルスに特異的なポリペ
プチドをコードする核酸配列が知見された。該核酸配列
又は該ポリペプチドのフラグメントも本発明の範囲に含
まれる。核酸配列及びポリペプチドの両方又はそれらの
フラグメントは、HCV感染に対して動物を免疫感作する
ために必須の関連免疫原物質のみを含有するワクチンの
製造に使用することができる。「核酸配列」なる用語は
リボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を意味す
る。

本発明の核酸配列を第２図に示す。当業者に周知のよ
うに、遺伝暗号の縮重はコドン中の塩基の置換を可能に
し、その結果、同一アミノ酸をコードする別のコドンが
存在することになり、例えばアミノ酸グルタミン酸のコ
ドンはGAT及びGAAの両方である。従って、第２図に示す
アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するために
は、第２図に示す核酸配列と異なるこのような別のコド
ン組成を有する核酸配列を使用できることが明らかであ
る。

緊縮条件下で第２図に示す核酸配列にハイブリダイズ
する核酸配列も本発明の範囲に含まれる。これらの核酸
配列は第２図に示す核酸配列に関連するが、ヌクレオチ
ド置換、突然変異、挿入、欠質等を含んでもよく、第２
図に示すポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドを
コードする。換言するなら関連するポリペプチドのアミ
ノ酸配列は第２図に示すアミノ酸配列と同一ではない
が、HCVに特徴的な対応する免疫特性を示す。

このような関連核酸配列によりコードされるポリペプ
チドも本発明の範囲に含まれる。

第２図に示す核酸配列はHCVのゲノムRNAから誘導され
るcDNA配列である。この連続配列は12284ヌクレオチド
長であり、364〜366位のATGコドンから始まって12058〜
12060位の翻訳終止コドンとしてのTGAコドンで終わる１
つの長いオープンリーディングフレーム（ORF）を含
む。このORFは435kDaのタンパク質をコードすることが
可能な3898個のコドンから構成される。

in vivoでは、感染細胞におけるHCVの複製中に、この
タンパク質はポリタンパク質前駆物質分子として合成さ
れる。この前駆分子は、その後（酵素的）切断を受けて
複数のフラグメントポリペプチドとなるものである。こ
れらのフラグメントは翻訳後修飾が行われる場合はその
後に、ウイルスの構造及び非構造タンパク質を形成す
る。好適な核酸配列の１例は、HCVに対する免疫化特性
もしくはHCVに特異的な免疫特性を有するようなフラグ
メントの遺伝情報を含むか、又はHCVの形質を表す免疫
特性もしくは免疫学的形質を維持する、このようなフラ
グメントの一部の遺伝情報を含む。

HCに対する読物の免疫感作又はHCの診断に使用可能
な、第２図のポリペプチドのフラグメントポリペプチド
及びその部分も本発明の一部を形成する。フラグメント
コーディング領域は約１〜249、263〜487、488〜688又
は689〜1067のアミノ酸位置内に配置される。１〜249領
域は本質的にコアタンパク質を表し、263〜487、488〜6
88及び689〜1067領域は本質的に夫々33kD、44/48kD及び
55kDの糖タンパク質を表す。上記コーディング領域の１
以上の遺伝情報を含む核酸配列又はその部分も本発明の
範囲に含まれる。

HCV感染に対するワクチンに取り込むべき好適領域はH
CVの55kDタンパク質に対応する領域、又は免疫活性を維
持する該領域の一部である。

更に、本発明によると、少なくとも該55kDタンパク質
のコーディング配列を含む核酸配列又はその一部を有利
に適用することができる。

更に、HCV感染に対する豚の免疫感作に使用され得るH
CV55kDタンパク質の好適部分は、ウイルス中和活性を有
する抗55kDタンパク質モノクローナル抗体でHCV欠失突
然変異体を分析することにより決定される。エピトープ
を含むこのような部分は約812〜859のアミノ酸配列に相
当し、約2799〜2938のヌクレオチド配列によりコードさ
れる。少なくとも該アミノ酸配列を含むポリペプチド又
は少なくとも該ヌクレオチド配列を含む核酸配列も本発
明の一部を形成する。

豚のHCV感染の診断に使用することができ且つBVDVか
らHCVを区別するために適用することが可能な本発明の
核酸配列は、55kDタンパク質をコードする遺伝子から誘
導され得る。

好ましくは、このような核酸配列はヌクレオチド配列
2587〜2619又は2842〜2880から誘導され、これらの配列
はいずれも55kDタンパク質をコードする遺伝子の一部で
ある。診断の目的に好適なオリゴヌクレオチドは5'−CC
T ACT AAC CAC GTT AAG TGC TGT GAC TTT AAA−3'又は
5'−TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG GCT CAC TGC TGT GC
A CTC−3'である。

更に、少なくとも該オリゴヌクレオチドのサブ配列を
含み且つHCVとBVDVを区別するために使用することが可
能な核酸配列も本発明の一部を形成する。

本発明はアッセイ（分析・検定）で使用されるテスト
キットにも係り、このテストキットは本発明の核酸配列
を含む。

好ましくは、テストキットは上記オリゴヌクレオチド
又は少なくともそのサブ配列を含む核酸配列を含む。

同一の免疫特性を維持するならば、第２図に示すポリ
ペプチド又はそのフラグメントに変異や修飾があっても
よく、例えば別の種又は他の誘導体間におけるような通
常の変異が許容される。これらの変異は配列全体におけ
る１以上のアミノ酸の相異又は該ポリペプチド中のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加により示され得
る。

更に、DNA組換技術を使用して例えば基本DNAの特定部
位の突然変異誘発により、１又は複数のアミノ酸置換、
欠失、付加又は位置交換（replacement）により種々に
修飾された第２図に示すポリペプチド又はそのフラグメ
ントの種々の誘導体を製造することができる。第２図に
示すポリペプチド又はそのフラグメントの本質的形質活
性が本質的に変わらない限り、そのポリペプチド又はそ
のフラグメントの誘導体をもたらすこのようなあらゆる
修飾も本発明の範囲に含まれる。

ペレット化したビリオンから単離したRNAを取り出
し、cDNAの合成に使用した。このcDNAをファージλgt11
にクローニングし、夫々のライブラリーを増幅し、ヤギ
抗HCV抗血清でスクリーニングした。２つの陽性クロー
ンを同定することができ、これらのクローンは0.8kb及
び1.8kbの寸法のインサートを有することが判明した。
0.8kbλgt11インサートを部分的に配列決定（第３図）
した処、HCVゲノム（第２図）上の約1.2〜2.0kbの間に
位置することが判明した。

感染動物のHCVの診断のために使用することができ、
驚くべきことにHCVをBVDVから区別するために適用する
ことが可能な本発明の核酸配列は、第２図に示すヌクレ
オチド配列5551〜5793により表される。

更に、少なくとも該ヌクレオチド配列のサブ配列を含
み且つHCVとBVDVとを区別するために使用することが可
能な核酸配列も本発明の一部を形成する。

本発明は更に、アッセイで使用されるテストキットに
も係り、該テストキットは本発明の核酸配列を含む。

好ましくはテストキットは第２図に示すヌクレオチド
配列5551〜5793により表される核酸配列、又は少なくと
も上記配列のサブ配列を含む核酸配列を含む。

ペレット化したビリオンから単離したRNAを取り出
し、cDNAの合成に使用した。このcDNAをファージλgt11
にクローニングし、夫々のライブラリーを増幅し、ヤギ
抗HCV抗血清でスクリーニングした。２つの陽性クロー
ンを同定することができ、これらのクローンは0.8kb及
び1.8kbの寸法のインサートを有することが判明した。
0.8kbのλgt11インサートを部分的に配列決定（第３
図）した処、HCVゲノム（第２図）上の約1.2及び2.0kb
の間に位置することが判明した。

本発明の核酸配列を、プラスミドDNA、バクテリオフ
ァージDNA又はウイルスDNAのような種々のベクター核酸
分子に連結し、組換体核酸分子を形成することができ
る。ベクター核酸分子は好ましくは、転写及び翻訳を開
始、調節及び終止するためのDNA配列を含む。このよう
な組換体核酸分子を含む宿主細胞を含む組換体発現罫を
使用して、本発明の核酸配列に、該核酸配列によりコー
ドされるポリペプチドを発現させることができる。上記
組換体発現系の宿主は例えば細菌（例えば大腸菌、枯草
菌及びPseudomonas）、ウイルス（例えばワクシニア及
び鶏痘ウイルス）のような原核起源でもよいし、又は例
えば酵母やより高等な真核細胞（例えば昆虫、植物又は
動物細胞）のような真核起源でもよい。

HCに対する動物の免疫感作は例えば、本発明のポリペ
プチドを所謂「サブユニット」ワクチンとして動物に投
与することにより実施され得る。本発明のサブユニット
ワクチンは、場合によって医薬上許容可能なキャリヤー
の存在下で一般に純粋形態のポリペプチドを含む。

小さいフラグメントはその免疫原性を高めるためにキ
ャリヤー分子と結合すると好ましい。このために適当な
キャリヤーは高分子であり、例えば天然ポリマー（キー
ホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、毒素のよ
うなタンパク質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリア
ラニン）のような合成ポリマー、又はサポニンのような
両親媒性化合物のミセルである。あるいは、これらのフ
ラグメントはそのポリマー、好ましくは線状ポリマーと
して提供され得る。このようなサブユニットワクチンで
使用されるポリペプチドは、例えば豚コレラウイルスか
らの該ポリペプチドの単離、組換DNA技術又は化学的合
成により、当業者に既知の方法により製造することがで
きる。

必要に応じてワクチンで使用される本発明のポリペプ
チドは、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル
化又はホスホリル化によりin vitro又はin vivoで修飾
することができる。

サブユニットワクチンの代わりに「ベクター」ワクチ
ンを使用してもよい。本発明の核酸配列を組換技術によ
り別の微生物（例えばウイルス又は細菌）の遺伝物質に
取り込ませ、微生物が本発明のポリペプチドを発現でき
るようにする。この組換発現系を免疫感作すべき動物に
投与すると、該系はその後、接種動物中で複製し、ポリ
ペプチドを発現し、その結果、動物の免疫系を刺激す
る。ワクチンベクターの適当な例は発疹ウイルス（例え
ばワクシニア、牛痘、ウサギ痘）、鳥類発疹ウイルス
（例えば鶏痘ウイルス）、偽狂犬病ウイルス、アデノウ
イルス、インフルエンザウイルス、バクテリオファージ
又は細菌（例えば大腸菌及びサルモネラ菌）である。

本発明の核酸発列がその核酸配列に挿入されている組
立体発現系は例えば細胞培養で増殖させることができ、
必要に応じて感染細胞から回収し、場合によって凍結乾
燥形態のワクチンに形成することができる。該遺伝操作
微生物は該微生物が感染した生きている動物から回収す
ることもできる。上記組換体発現系は本発明のポリペプ
チドを発現する細胞培養で増殖させ、その後、ポリペプ
チドを培地から単離してもよい。

本発明のポリペプチド又は組換体発現系を含むワクチ
ンは、このようなワクチンに関して当業者に周知の手順
により製造することができる。本発明のワクチンは特
に、完全な宿主、宿主抽出物、部分的もしくは完全に精
製したポリペプチド又は部分的もしくは完全に精製した
上記のような組換体発現系から構成され得る。

本発明のワクチンは従来の能動免疫方式で投与するこ
とができ、即ち、投与配合に適合可能な方法で治療上有
効且つ免疫原性となるような量を１回又は繰り返し投与
する。ワクチンの投与は例えば皮内、皮下、筋肉内、静
脈内又は鼻腔内の経路で実施され得る。腸管外投与の場
合、ワクチンは更に、適当なキャリヤー、例えば水、食
塩水又は緩衝溶液（アジュバント、安定剤、可溶剤、乳
化剤等を含むか含まない）を含有し得る。

ワクチンは更に、多価ワクチンを製造するために、パ
ルボウイルス、偽狂犬病ウイルス、豚インフルエンザウ
イルス、TGEウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Bordete
lla、Pasteurella、Erysipelas等の抗原のように他の疾
患に関連する免疫原又はこれらの免疫原をコードする核
酸配列を含有し得る。

本発明のポリペプチドは、動物におけるHCV抗原又は
抗体の存在を検出するための診断法で使用することもで
きる。更に、本発明の核酸配列は上記診断法で使用され
るポリペプチドを製造するため、又はサンプル中のHCV
核酸の存在の検出のためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用することができる。

実施例１ cDNAクローンの免疫学的同定細胞の感染及びウイルスの回収。PK15及び38A₁D細胞
を10％FCSを含有するDMEM中で増殖させ、５×10⁷/mの
細胞濃度で20〜30mの容量中のHCV株Alfortにより、懸
濁液中、37℃で90分間0.01〜0.001のm.o.i.（蛍光抗体
アッセイより決定）で感染させた。その後、PK15細胞を
組織培養プレート（直径150mm）に播種し、一方、懸濁
細胞38A₁Dは弱く撹拌しながら瓶（スイス、Tecnomara
社）中でインキュベートした。cDNA合成のために、組織
培養物上清を感染から48時間後に回収し、12000gで清澄
化し、その後、ウイルスをTFA20ローター（イタリー、C
ontron社）で54000gで12時間かけてペレット化した。

マギ抗HCV血清の作成。標準細胞培養技術により子ヤ
ギの皮膚生検からフィブロブラスト細胞系を作成した。
細胞をまず10％FCSを含むＦ−10培地で増殖させ、その
後、10％FCSを含むDMEM中で増殖させた。ヤギフィブロ
ブラストにHCVを感染させた。感染後（p.i.）の最初の2
6時間、細胞を８時間毎にPBSで３回洗い、その後、10％
プレ免疫ヤギ血清（PGS）を含むDMEM中でインキュベー
トした。感染から48時間後、組織培養物上清を回収し、
ストックウイルスとして使用した。免疫感作前に、30個
の組織培養皿（直径150mm）におけるヤギ細胞を10％PGS
を含む培地で３継代維持し、その後、ストックウイルス
に感染させた。感染から48時間後、ヤギをＸ線で不活化
したペレット化ウイルス及び感染細胞で免疫感作した。
これらの免疫材料はいずれもフロイントアジュバント
（基本免疫（basisimmunization）では完全アジュバン
ト、ブースター注射では不完全アジュバント）中で乳化
し、皮下注射した。変性分子を認識する抗体を得るため
に、抗原調製物を注射前５分間0.2％SDS、3mM DTT中で9
5℃でインキュベートした。

RNA作成、cDNA合成及びクローニング。Chirgwin他（1
979）により記載のグアニジンチオシアネート法を使用
することにより、ビリオンからのRNAを単離した。ペレ
ット化ビリオンからのRNA（５μｇ全RNA、約0.5μgHCV
RNA）及び水20μ中の0.1μｇのランダムヘキサヌクレ
オチドプライマー（スウェーデン、Pharmacia社）を10
分間で65℃に加熱し、氷冷し、最終容量32μ中の第１
鎖緩衝液（50mM Tris−HCl pH8.3;30mM KCl;8mM MgCl₂;
1mM DTT、dATP,dCTP,dGTP,dTTP各1mM及び500単位/mの
RNAガード［スウェーデン、Pharmacia社］）に調整し
た。35単位のAMV逆転写酵素（米国、Life Sciences社）
を加えた。43℃で１時間後、反応混合物を第２鎖合成混
合物（スウェーデン、Pharmacia社のcDNA合成キット）
の１つのバイアルに加えた。第２鎖合成、ブラント（bl
unt）末端の作成並びにEcoR Iアダプター連結及びホス
ホリル化を製造業者により推奨されているように実施し
た。

cDNAを調製的アガロースゲル電気泳動でサイズにより
分画した。0.5kbよりも小さいDNA分子を含むゲル部分を
廃棄した。ゲルを15分間逆に流すことにより残りのDNA
を濃縮し、凍結及び解凍の３サイクル後にアガロースか
らフェノール抽出した。

エタノールで共沈させたcDNA及びλgt11 DNA（米国、
Promega社のEcoR I消化した脱ホスホリル化アーム１μ
ｇ）を合計容量10μのリガーゼ緩衝液（30mM Tris−H
Cl pH7.4;10mM MgCl₂;10mM DTT;1mM ATP）中の３単位の
T4 DNAリガーゼ（スウェーデン、Pharmacia社）により
連結した。製造業者により推奨されているように、市販
抽出物（米国、Promega社、Packagene）でin vitroパッ
ケージングし、大腸菌K12細胞（Y1090株）を得られたフ
ァージに感染させた。文献（Davis他、1986）に記載さ
れているようにライブラリーを１回増幅した。

λgt11ライブラリーのスクリーニング。米国Promega
社から購入したProtoblot系（Huynh他、1985）及び10^-3
の血清希釈液を使用して文献（Young及びDavis、1983）
に記載されているように第１次のスクリーニングを行っ
た。バックグラウンド減少のために、ヤギ抗HCV血清を
0.8mg/mの大腸菌（Y1090株）で処理した（Huynh他、1
985）。夫々0.8kb及び1.8kbのインサートを有する２つ
の陽性クローンを同定することができた。

ニックトランスレーション及びノーザンハイブリダイ
ゼーション。ニックトランスレーション（西ドイツ、Am
ersham Buchler社のニックトランスレーションキット）
により［α³²P］dCTP（西ドイツ、Amersham Buchler
社、3000Ci/mMole）で標識した50ngの0.8kb HCV核酸配
列を68℃で12〜14時間、ハイブリダイゼーション混合物
（５×SSC;1×Denhardt's;20mMリン酸ナトリウムpH6.8;
0.1％SDS及び100μg/mの酵母tRNA［西ドイツ、Boehri
nger−Mannheim社］）濃度5ng/mでノーザンフィルタ
ーにハイブリダイズした。次に文献（Keil他、1984）に
記載されているように膜を洗い、Agfa Curix MR800増感
スクリーンを使用して時間を変えながら−70℃でKodak
X−Omat ARフィルムに暴露した。

0.8kb核酸配列は無傷のHCV RNAのみならずその分解物
にもハイブリダイズした。0.8kb核酸配列は1.8kb核酸配
列にハイブリダイズせず、従って、これらの２つの核酸
配列はゲノムRNAの同一領域に配置されないHCVゲノムの
フラグメントに対応すると考えられる。

ヌクレオチド配列決定。標準手順（Maniatis他、198
2）に従ってHCV特異的ファージDNAインサートをプラス
ミドpEMBL18＋にサブクローニングした。組換体pEMBLプ
ラスミドの一重鎖DNAを文献（Dente他、1985）に記載さ
れているように作成した。製造業者（スウェーデン、Ph
armacia社）により推奨されているようにジデオキシ配
列決定反応（Sanger他、1977）を実施した。

実施例２ HCVのゲノムの分子クローニング及びヌクレオチド配列 RNA作成、cDNA合金及びクローニング。上記と同様
に、RNA作成、cDNA合成、寸法選択及び共沈したcDNAと
λgt10 DNA（米国、Promega社のEcoR Iで消化した脱ホ
スホリル化アーム１μｇ）との連結を行った。製造業者
により推奨されているように、Packagene（米国、Prome
ga社）を使用してファージDNAをin vitroパッケージン
グすると共に、大腸菌株C 600 HFL上のファージを滴定
した。ライブラリーを１回増幅し（Davis他、1986）
し、ニトロセルロース膜（西ドイツ、Amersham Buchler
社）（Benton及びDavis、1977）に移したレプリカをノ
ーザンハイブリダイゼーションについて上述したように
オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。（Benton及
びDavis、1977）により記載されているようにニックト
ランスレーション（西ドイツ、Amersham Buchler社、ニ
ックトランスレーションキット）により［α³²P］dCTP
で標識したcDNAフラグメントでスクリーニングした。陽
性クローンをプラーク精製し、インサートをpEMBLプラ
スミド（Maniatis他、1982;Dente他、1985;Davis他、19
86）にサブクローニングした。

アミノ酸配列Cys Gly Asp Asp Gly PheをコードするR
NA配列に相補的な17塩基の³²P5'末端標識オリゴヌクレ
オチドを使用してλgt10 cDNAライブラリーをスクリー
ニングした。HCVの約12kbのゲノムRNAにハイブリダイズ
したこのオリゴヌクレオチドは、同様にHCV RNAにハイ
ブリダイズした0.75kbのインサートを有するクローンを
特に認識した。HCVゲノムのフラグメントを表すこの0.7
5kb核酸配列を0.8kbλgt11核酸配列インサートと共に使
用して更にライブラリースクリーニングした処、第１図
に示す相対位置及び制限部位地図を有する１組のオーバ
ーラップするHCV核酸配列が確認された。HCVゲノムのこ
れらの核酸配列フラグメントは次の核酸位置： 4.0kbフラグメント: 27〜 4027 4.5kbフラグメント: 54〜 4494 0.8kgフラグメント:1140〜 2002 4.2kbフラグメント:3246〜 7252 5.5kgフラグメント:6656〜11819 及びほぼ次の核酸位置： 3.0kbフラグメント : 8920〜11920 1.9kbフラグメント :10384〜12284 0.75kbフラグメント:10913〜11663 に配置される。

ヌクレオチド配列決定。完全なヌクレオチド配列決定
のために、エキソヌクレアーゼIII及びヌクレアーゼS1
（西ドイツ、Boehringer Mannheim社から入手した酵
素）を使用してpEMBL18＋又は19＋プラスミド（Henniko
ff、1987）にサブクローニングしたHCV誘導cDNAインサ
ートの欠失ライブラリーを作成した。T7ポリメラーゼ配
列決定キット（スウェーデン、Pharmacia社）を使用し
て、一重鎖（Dente他、1985）又は二重鎖DNA鋳型のジデ
オキシ配列決定（Sanger他、1977）を行った。

cDNAフラグメントから第２図に示すように12284ヌク
レオチド長の連続配列を決定することができた。この配
列は364位〜366位のATGコドンから開始して12058〜1206
0位の翻訳終止コドンとしてのTGAで終止する１つの長い
オープンリーディングフレーム（ORF）を含む。このORF
は第２図に示すアミノ酸配列を有する435kDaタンパク質
をコードすることが可能な3898個のコドンから構成され
る。ウイルス集団に異種性が存在する場合に生じるヌク
レオチド配列の差異の結果として３つのヌクレオチド交
換が検出され、そのうちの２つは予想アミノ酸配列の変
化（第２図）を生じた。

結論すると、上記手順によりほとんど完全なHCVゲノ
ムのクローニングと配列決定とがなされた。

抗HCV血清で同定した免疫HCVポリペプチドをコードす
る0.8kbλgt11核酸配列を部分的に配列決定（第３図）
した処、この配列はHCV RNA上の1.2〜2.0kbの範囲に位
置することが判明した。

実施例３ HCVの融合タンパク質の分子クローニング及び発現 HCVゲノムの２つの領域から誘導されたcDNAフラグメ
ント、即ちアミノ酸262〜546（第２図）をコードする実
施例１の0.8kbλgt11インサート及びアミノ酸747〜1071
（第２図）をコードする核酸配列はpEx系（Strebel,K
他、1986）における融合タンパク質として発現させた。

細菌抽出物をSDS−PAGEにより分離し、標準手順に従
って染色し、その後、ウエスタンブロットで実施例１の
ヤギ抗HCV血清との反応性を試験した。

HCV特異性融合タンパク質SDS−PAGEにより部分的に精
製し、ニトロセルロースに移し、ヤギ抗HCV血清と共に
インキュベートした。溶離後に該融合タンパク質に対す
る特異抗体を得た。

上記融合タンパク質に特異的な抗体を放射線免疫沈降
アッセイで使用した。

結果 pEx系で発現された両方の融合タンパク質はヤギ抗HCV
血清との反応後にHCVに特異的であることが明らかに確
認された。

両方の融合タンパク質に対して作成した単一特異性抗
血清はHCV糖タンパク質を沈降させた。

262〜546位の融合タンパク質に特異的な抗体は44/48k
D及び33kDタンパク質を沈降させ、747〜1071位の融合タ
ンパク質に特異的な抗体はウイルス感染細胞からの55kD
タンパク質を沈降させた。

実施例４分子クローニング及びワクシニアウイルスによる構造タ
ンパク質の発現 Hinf I制限部位（ヌクレオチド372）から始まり人工E
coR I部位（ヌクレオチド4000）で終わる第１図に示す
4.0kbクローンのフラグメント（pHCK11）を作成した（M
aniatis他、1982）。

5'末端に、BamH I適合性の突出部、翻訳開始コドンと
して元のATG（364〜366）及び3'末端に、Hinf I適合性
の突出末端を含むオリゴヌクレオチドアダプターを合成
した。

構築物の3'末端において、EcoR I突出末端をヤエナリ
ヌクレアーゼで欠失させ、ブラント末端Stu I/EcoR Iア
ダプター残基に連結することにより翻訳終止コドンを導
入した（Maniatis他、1982）。

上記HCV配列をワクシニアウイルスに挿入する前に、
異種遺伝子を組換体ベクターにクローニングした。この
ために、4.9kbチミジンキナーゼ配列の内側でP7.5Kプロ
モーターの下流にクローニング部位を含むpGS62プラス
ミド（Cranage,M.P.他、1986）を使用した。クローニン
グ部位は３つの固有の制限部位、BamH I、Sma I及びEco
R Iを含む。上記HCV配列（372〜4000）をアダプターと
共にBamH I/EcoR Iで消化したpGS62に連結することによ
り、組換体ベクターpGS62−3.8を作成した。

プラスミドを基に15個の欠失突然変異体から成る組を
作成した。続いてエキソヌクレアーゼIII（Hennikof
他、1987）で処理することにより、3'末端からHCV cDNA
を短縮した。全欠失は約100bpの除去によりHCV55kDタン
パク質をコードする領域の内側に位置し、ヌクレオチド
2589で終結する突然変異体15では55kDタンパク質のほと
んどが失なわれている。Exo IIIで短縮したcDNAクロー
ンをpGS62に連結し、pGS62−3.8Exo1〜15を得た（第４
図）。

CVI細胞を0.1のMOIでワクシニア（Copenhagen株、突
然変異体TS7）に感染させた。感染から３時間後、pGS62
−3.8DNA及びワクシニアWR DNAをCa₃（PO₄）_２沈降法に
よりトランスフェクトし、２日間インキュベートした。
ウイルス子孫を回収し、ブロム−デオキシ−ウリジン
（100μg/m）の存在下で143tk−細胞上のtk−表現型
を選択した。この選択は少なくとも２回実施し、その
後、プラーク精製を更に２サイクル行った。

ワクシニア−HCV組換体の特徴付け CVI細胞を２〜10のMOIでワクシニア−HCV組換体に感
染させ、８〜16時間インキュベートした。細胞の固定
後、HCV55kDタンパク質に特異的なモノクローナル抗体
又は多価抗HCV血清のいずれかを使用して間接免疫蛍光
を実施した。いずれの場合も細胞質蛍光を確認すること
ができた。

ワクシニア組換体で感染した細胞の放射線免疫沈降及
びウエスタンブロット分析後、４つのHCV特異的タンパ
ク質が検出された。［³H］グルコサミンで標識すること
により、これらのタンパク質のうち３種はグリコシル化
されていることが判明した。これらのタンパク質の見掛
けの分子量はHCV特異性血清を有するHCV感染細胞に見出
されたもの、即ち20kD（コア）,44/48kD、33kD及び55kD
と同一であった。

ワクシニアウイルスによる発現により産生されるタン
パク質はHCV感染細胞と同一の見掛けの分子量を有する
ので、タンパク質分解処理及び修飾は信頼できると思わ
れる。

マウスにおける抗HCV中和抗体の誘導４群のマウス（３匹／群）に a.ワクシニアWR野生型（５×10⁶pfu/個体）（WR） b.ワクシニア3.8組換体（５×10⁷pfu/個体）（VAC3.8） c.ワクシニア3.8Exo4（55kD欠失）（５×10⁷pfu/個体）
（VAC.3.8Exo4） d.ワクシニア3.8Exo5（５×10⁷pfu/個体）（VAC3.8Exo
5） e.ワクシニア3.8Exo15（55kD）（５×10⁷pfu/個体）（V
AC3.8Exo15）の精製ウイルスを腹腔内注射により１回感染させた。

３週間後にマウスを瀉血した。連続希釈後にPK［15］
細胞上のHCV（Alfort）でウイルス中和アッセイで血清
の反応性を検査した（Ｒmenapf,T.他、1989）。

中和力価 a.WR ＜1:2 b.VAC3.8 1:96 c.VAC3.8Exo4 1:96 d.VAC3.8Exo5 ＜1:2 e.VAC3.8Exo15 ＜1.2 以上の結果から、全構造タンパク質の遺伝情報を含む
核酸配列を含むワクシニアウイルス（VAC3.8）はマウス
にウイルス中和抗体を誘導できるが、不完全な構築物VA
C3.8Exo5〜15及びWRはそうでないと結論することができ
る。

全欠失はHCV55kDタンパク質（55kDタンパク質の大部
分はヌクレオチド2589で終結する突然変異15では失われ
ている）をコードする領域内に位置し、他の構造タンパ
ク質は依然として組換体ワクシニアウイルスにより発現
されているので、55kDタンパク質がHCV中和抗体の誘導
に関与することは明らかである。

実施例５ VAC3.8によるブタの免疫感作３匹の子ブタ（体重約20kg）のうちの１匹（No.28）
を野生型ワクシニアウイルス（WR株）に感染させ、他の
２匹（No.27,27）を（夫々静脈内及び皮内で）組換体VA
C3.8に感染させた。感染にあたっては１×10⁸pfuのワク
シニアウイルスを各動物に適用した。

感染後６日目に乱切の側の紅斑と発熱（41℃）とが観
察され、ワクシニア感染過程の臨床兆候が現れた。

ワクシニア及び豚コレラウイルスに対する力価感染から３週間後に、ワクシニア（CVI細胞上のWR）
及びHCV（PK15細胞上のAlfort）に対する夫々の血清の
反応性を検査した。

血清の連続希釈後に、cpeの完全な不在（ワクシニ
ア）又は免疫蛍光中の特異的信号（HCV）を検査するこ
とにより中和を調べた（Ｒmenapf,T.他、1989）。

ワクシニアに対する中和力価ブタ28（WR） 1:8 ブタ26（VAC3.8） 1:16 ブタ27（VAC3.8） 1:16 HCVに対する中和力価ブタ28（WR）＜1:2 ブタ26（VAC3.8） 1:32 ブタ27（VAC3.8） 1:16 HCVによる攻撃ワクシニアによる免疫感作から４週間後、ブタの各々
を５×10⁷TCID₅₀HCV Alfortで感染させることにより攻
撃した。感染の天然経路に従ってウイルスを鼻腔に適用
した。この量のウイルスはブタの強制致死量であると実
験的に決定されている。

感作後５日目にブタ28は41.5℃の発熱を示し、この熱
は12日目まで続いた。急性豚コレラの典型的臨床兆候が
現れた日にその瀕死の動物を殺した。

VAC3.8で免疫感作した両方のブタ（26,27）はHCVで攻
撃後、14日間以上病気の兆候を示さなかった。

実施例６ 55kDタンパク質発現ベクターの構築クローンpHCK11を標準方法に従って制限酵素Sac I及
びHpa Iで消化した。

HCV55kDタンパク質の大部分を含むヌクレオチド2672
（AGCTC）と3971（GTT）との間に位置する得られた1.3k
bフラグメントを単離し、偽狂犬病ウイルス（PRV）gX遺
伝子にクローニングした（Maniatis他、1982）。

要約すると、クローニングしたgX配列をSac I及びApa
Iで消化した。Apa I5'突出末端をクレノウフラグメン
トで充填することによりブラントにした。連結後、推定
されるgXリーダーペプチドコーディング配列は挿入した
HCV55kD配列のすぐ上流に位置した。

突出部をクレノウフラグメントで充填後にBgl II（Bg
l II部位:3936〜3941）で消化、再連結することによりH
CV配列の下流の翻訳終止コドンを導入した。この構築物
をPRVgXプロモーター（クローン16/4−1.3）の下流に配
置した。クローン16/4−1.3をDEAEデキストラン法（Man
iatis他、1989）によりMDBK細胞にトランスフェクトし
た。16時間後、細胞をPRV（m.o.i.＝１）に感染させ
た。感染から４時間後、細胞を冷温（−20℃）のメタノ
ール／アセトンの混合物で固定した。モノクローナル抗
体（MAB）抗HCV55kDタンパクで間接免疫蛍光の結果、細
胞の５〜10％に特異的信号が現れた。トランスフェクシ
ョンなしのPRV感染細胞及びクローン16/4−1.3しかトラ
ンスフェクトしなかった細胞はこのアッセイで何ら信号
を示さなかった。

参考資料 BENTON,W.,and DAVIS,R.（1977）.Screening λgt reco
mbinant clones by hybridization to single plaques
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d.Sci.U.S.A.80,1194−1198.

【図面の簡単な説明】

第１図はHCVから誘導される種々のcDNAクローンの物理
的地図及びRNAゲノム（上段）に対するそれらの位置を
示す。抗体プローブ（0.8kbクローン）又は縮重オリゴ
ヌクレオチドプローブ（0.75kbクローン）のいずれかで
スクリーニング後に単離された２つのHCV誘導cDNAクロ
ーンを２段目に示す。更にその下に、ヌクレオチド配列
決定に選択したcDNAフラグメントを示す。数字はいずれ
もDNAフラグメントの寸法（kb）を表す。尚、制限部位
はＢ＝Bgl II、Ｅ＝EcoR I、Ｈ＝Hind III、Ｋ＝Kpn
I、Ｓ＝Sal I、Sm＝Sma Iを表す。第２図はHCVの核酸配列及び長いオープンリーディング
フレームの推定アミノ酸配列を示す。異なるcDNAクロー
ン間のヌクレオチド交換と、それに伴うアミノ酸配列の
変化を示す。スクリーニングに使用されるオリゴヌクレ
オチドに対応する配列の部分を下線で示す。第３図はλgt11クローンの0.8kb HCVインサートの一部
のcDNA配列及び推定アミノ酸（１文字コードで表す）を
示す。第４図はpGS62ベクターにクローニングされたHCV DNAの
長さを示す。エキソヌクレアーゼIIIで処理されること
により、cDnAクローンpHCK11から誘導される15個１組の
欠失突然変異体を作成し、pGS62ベクターにクローニン
グし、pGS62−3.8Exo1〜15を得た。3'末端ヌクレオチド
を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｇ０１Ｎ 33/569 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1:91） 5/00 Ｂ (72)発明者テイルマン・リユーメナプフドイツ連邦共和国、7400・テユービンゲン、リグスターベーク・３ (72)発明者ハインツ‐ユルゲン・テイールドイツ連邦共和国、7400・テユービンゲン、イム・シエーンブリツク・67 (56)参考文献Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 70，（２月，1989）ｐ．253−266 ＶｉｒｕｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．11 （1988）ｐ．281−291 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 A61K 39/00 - 39/44 G01N 33/50 - 33/98 A61P 31/00 - 31/22 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ｉ）配列番号１に示すHCVポリタンパク質
をコードするブタコレラウィルスゲノムの断片であっ
て、配列番号１のアミノ酸１−249、263−487、488−68
8又は689−1067位のいずれかのアミノ酸配列を含むブタ
コレラウィルスポリペプチドをコードすることを特徴と
する前記断片、配列1: 又は、 ii）１または２以上の塩基の欠失、置換又は付加により
得られる前記断片の誘導体であるブタコレラウィルスゲ
ノムの断片であって、コードされるポリペプチドが前記
ｉ）の断片がコードするポリペプチドと同等の免疫学的
性質を有するHCVポリペプチドであることを特徴とする
断片を含むDNA。
【請求項２】請求項１に記載される配列１の1150−1824
位又は2428−3564位のいずれかのヌクレオチド配列ある
いは該ヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリダイズ
するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１
に記載のDNA。
【請求項３】ベクター核酸分子および請求項１あるいは
２に記載のDNA配列を含む組換核酸分子。
【請求項４】請求項３に記載の組換核酸分子を含む、豚
コレラウイルスのポリペプチドを産生し得る宿主細胞。
【請求項５】細菌であることを特徴とする請求項４に記
載の宿主細胞。
【請求項６】請求項３に記載の組換核酸分子を含む組換
ウイルス。
【請求項７】豚コレラウイルスポリペプチドを産生する
方法であって、該ポリペプチドが豚コレラウイルス前駆
体ポリタンパク質の部分に対応し、請求項４又は５に記
載の宿主細胞あるいは請求項６に記載の組換ウイルス
を、ポリペプチドが発現するような培養条件下で増殖さ
せ、その後ポリペプチドを培養から単離することを特徴
とする前記方法。
【請求項８】動物を豚コレラウイルス感染から防御する
ためのワクチンであり、豚コレラウイルス前駆体ポリタ
ンパク質の部分に対応し、請求項１に記載される配列１
に示すアミノ酸配列の689−1067位の範囲内に位置する
アミノ酸配列を含む豚コレラウイルスポリペプチドを含
むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項９】動物を豚コレラウイルス感染から防御する
ためのワクチンであり、請求項４乃至５に記載の宿主細
胞あるいは請求項８に記載のHCVポリペプチドを発現す
る請求項６に記載の組換ウイルスを含むことを特徴とす
る前記ワクチン。
【請求項１０】豚コレラウイルスワクチンを調製する方
法であって、請求項８に記載のポリペプチドから免疫活
性を有する医薬製剤を形成することを特徴とする前記方
法。
【請求項１１】豚コレラワクチンを調製する方法であっ
て、請求項４乃至５に記載の宿主細胞あるいは請求項８
に記載のHCVポリペプチドを発現している請求項６に記
載の組換ウイルスを培養中に増殖させ、その後、宿主細
胞あるいは組換ウイルスを回収し、免疫活性を有する医
薬製剤を形成することを特徴とする前記方法。
【請求項１２】非ヒト動物内のHCV抗原あるいは抗体を
検出するための診断方法であって、請求項４又は５に記
載の宿主細胞によって発現されるポリペプチド、あるい
は請求項６に記載の組換ウイルスを使用することを特徴
とする前記診断方法。