DE69131829T2

DE69131829T2 - Gp75 als tumorimpfstoff gegen melanome

Info

Publication number: DE69131829T2
Application number: DE69131829T
Authority: DE
Inventors: Alan Houghton; Setaluri Vijayasaradhi
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2011-03-23
Also published as: PL169168B1; EP0522078A4; PT97103B; JP3336006B2; ATE187493T1; NO923659D0; IE20000918A1; US20050037462A1; DK0522078T3; FI924222A; HK1014732A1; PT97103A; NZ237532A; AU660412B2; PL169105B1; CZ290278B6; HU218416B; EP0965640A1; ES2141089T3; GR3032804T3

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine "continuation-in-part"-Anmeldung des am 22. März 1990 eingereichten US-Patents Serien-Nr. 497,431, dessen Inhalt hiermit durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist.
In der ganzen vorliegenden Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen sind in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben.

Technischer Hintergrund

Die molekulare Bestimmung der immunogenen Determinanten auf menschlichen Krebszellen stellt die Basis zum Verständnis der Immunreaktion auf Krebs dar. Zwei Klassen von Antigenen auf menschlichen Melanomzellen haben als Ziele für die Erkennung durch das Immunsystem besondere Aufmerksamkeit gefunden: 1) einzigartige Antigene, die nur von autologen Melanomzellen exprimiert werden (Old, L. J., Cancer immunology: The search for specificity. G. H. A. Clowes Memorial Lecture, Cancer Res., 41(1981), 361; Carey, T. E., T. Takahashi, L. A. Resnick, H. F. Oettgen und L. J. Old, Cell surface antigens of human malignant melanoma. 1. Mixed hemadsorption assay for humoral immunity to cultured autologous melanoma cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), 3278; Real, F. X., M. J. Mattes, A. N. Houghton, H. F. Oettgen, K. O. Lloyd und L. J. Old, Class 1 (unique) antigens of human melanoma: Identification of a 90,000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibody, 1 Exp. Med, 160 (1984), 1219), und 2) Differenzierungs-Antigene, die normalerweise von Zellen der melanocytischen Abstammungslinie exprimiert werden (Houghton, ·A. N., M. C. Taormina, H. Ikeda, T. Watanabe, H. F. Oettgen und L J. Old, Serological survey of normal humans for natural antibody to cell surface antigens of melanoma, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980), 4260; Houghton, A. N., M. Eisinger, A. P. Albino, J. G. Cairncross und L. J. Old, Surface antigens of melanocytes and melanoma: Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Exp. Med., 156 (1982), 1755; Houghton, A. N., F. X. Real, L. J. Davis, C. Cardon-Cardo und L. J. Old, Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J. Exp. Med., 164 (1987), 812). Differenzierungs-Antigene von Melanocyten sind durch ihre Verwandtschaft zu anderen wohldefinierten phänotypischen Eigenschaften definiert worden, die während der Melanocyten-Differenzierung exprimiert werden (Houghton, A. N., M. Eisinger, A. P. Albino, J. G. Cairncross und L. J. Old, Surface antigens of melanocytes and melanoma: Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, 1 Exp. Med., 156 (1982), 1755; Houghton, A. N., F. X. Real, L. J. Davis, C. Cardon-Cardo und L. J. Old, Phenotypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells; J. Exp. Med., 164 (1987), 812), wobei die kennzeichnendste Eigenschaft die Synthese des Pigments Melanin innerhalb von Melanosomen ist.
Klinische Beobachtungen haben nahegelegt, daß eine gegen die von normalen Pigment-Zellen exprimierten Antigene gerichtete Immunreaktion den Verlauf eines metastatischen Melanoms beeinflussen könnte. Bei Melanom-Patienten sind insbesondere die Weißfleckenkrankheit und eine Hypopigmentierung mit einer guten Prognose in Verbindung gebracht worden (Nordlund, J. J., J. M. Kirkwood, B. M. Forget, G. Milton, D. M. Albert und A. B. Lerner, Vitiligo in patients with metastatic melanoma: a good prognosis sign, J. Am Acad. Dermatol., 9 (1983), 689; Bystryn, J. C., D. Rigel, R. J. Friedman und A. Kopf, Prognostic significance of hypopigmentation in malignant melanoma, Arch. Dermatol., 123 (1987), 1053). Melanosomale Antigene können durch das Immunsystem erkannt werden. Das ist mittels Immunpräzipitation eines gp75- Antigens von autologen Melanomzellen durch Serum-IgG-Antikörper eines Patienten mit metastatischem Melanom gezeigt worden (Mattes, J. NL, T. M. Thomson, L. J. Old und K. O. Lloyd, A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer, 32 (1983), 717). Das gp75-Antigen ist ein melanosomales Polypeptid, das das häufigste, von pigmentierten Melanocyten und Melanomen synthetisierte Glycoprotein ist (Tai, T., NI. Eisinger, S. Ogata und K. O. Lloyd, Glycoproteins as differentiation markers in human malignant melanoma and melanocytes, Cancer Res., 43 (1983), 2773). Epidermale Melanocyten, gutartige pigmentierte Läsionen und primäre und metastatische Melanome exprimieren gp75, während andere Zelltypen dies jedoch nicht tun (Thomson, T. M., F. X. Real, S. Murakami, C. Cardon-Cardo, L. J. Old und A. N. Houghton, Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: Analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermatol., 90 (1988), 459). In der vorliegenden Erfindung wird nachgewiesen, daß die gp75-cDNA mit den von einem im b (brown -Locus kartierten Maus-Gen stammenden Aminosäure- und Nucleotidsequenzen zu etwa 90% identisch ist. Der brown-Locus ist eine Stelle, die die Fellfarbe bestimmt und den Typ des synthetisierten Melanins beeinflußt, was nahelegt, daß gp75 den Typ des synthetisierten Melanins reguliert oder beeinflußt.
Die Tatsache, daß sich gezeigt hat, daß IgG-Antikörper in Seren eines Patienten mit metastatischem Melanom gp75 immunpräzipitieren, zeigt, daß die Immuntoleranz gegenüber gp75 unterbrochen werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt daher gp75-cDNA umfassende Expressionsvektoren zur Verwendung als Impfstoff gegen Melanome bereit, wobei die Aminosäuresequenzen von Peptiden anhand des gp75-Polypeptids bestimmt wurden, das mit Hilfe des monoclonalen Maus-Antikörpers TA99 isoliert und aufgereinigt worden war, und wobei cDNA-Clone mit Hilfe eines Screenings mit auf den Peptidsequenzen basierenden Oligonucleotiden isoliert wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül bereit, dessen Sequenz die gp75-Aminosäuresequenz codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein isoliertes cDNA-Molekül eines gp75- Nucleinsäuremoleküls bereit, das die in Fig. 3 gezeigte Nucleotidsequenz und die davon stammende Aminosäuresequenz umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Impfstoffe zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden, dem der Impfstoff verabreicht wird, bereit.
Die vorliegende Erfindung kann ferner auch zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden von Nutzen sein. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann dem Probanden in einer Dosis verabreicht werden, die eine Stimulation oder Steigerung der Antikörper-Produktion bewirkt.
Die vorliegende Erfindung kann ferner zur Behandlung, Prävention oder Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs Verwendung finden. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann dem Probanden in einer Dosis verabreicht werden, die eine Behandlung, Prävention oder Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs bewirkt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Immunpräzipitation und Analyse der Peptidzusammensetzung von Proteinen, die vom mAb TA99 und AU-Serum erkannt werden. A. Eindimensionale SDS-PAGE von Immunpräzipitaten von ¹²&sup5;I-markierten SK- MEL-19-Lysaten mittels mAb TA99 (Laufspur 1), normalem menschlichem Serum (Laufspur 2) und AU-Seren von 1/75 (Laufspur 3) und von 10/76 (Laufspur 4). B. Banden, die gp75 oder mit Endo H behandeltem gp75 (partiell deglycosyliert) entsprachen, wurden aus dem SDS-Polyacrylamid-Gel ausgeschnitten und die Peptidzusammensetzung wurde mit Hilfe einer begrenzten Spaltung mit der V8-Protease von S. aureus auf einer SDS-PAGE analysiert. "-" - gp75; "+" - mit Endo H partiell deglycosyliertes gp75. Bei TA99 wurde der Film zur Autoradiographie 2 Tage exponiert und bei AU-Peptiden 5 Tage.
Fig. 2: Aminosäuresequenz von drei von gp75 stammenden Peptiden. Bei den unterstrichenen Aminosäureresten handelt es sich um diejenigen, die sich von den anhand der Maus-cDNA pMT4 prognostizierten Resten unterscheiden (Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri und R. Muller, Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res., 14 (1986), 2413).
Fig. 3: Partielle cDNA-Sequenz von gp75. Dargestellt ist das partielle cDNA- Fragment in 5'-3'-Richtung von Nucleotid 778 bis Nucleotid 1524.
Fig. 4: Isolierung einer gp75 codierenden cDNA voller Länge. Dargestellt ist eine partielle Restriktionskarte mit einer gp75-cDNA-Insertion von 2,7 kb. Eine partielle Nucleotidsequenz, die die ersten 18 Nucleotide der 2,7 kb-gp75-cDNA voller Länge enthält, ist in 5'-3'-Richtung dargestellt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, dessen Sequenz die gp75-Aminosäuresequenz codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine gp75-Aminosäuresequenz bereit, die die Aminosäuresequenz asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys- tyr-asp-pro-ala-val und die Aminosäuresequenz met-phe-val-thr-ala-pro-asp- asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein isoliertes cDNA-Molekül eines gp75- Nucleinsäure-Moleküls bereit, das die in Fig. 3 gezeigte Nucleotidsequenz und die davon stammende Aminosäuresequenz umfaßt.
Der als. GP75 E-1 bezeichnete E. coli-Stamm DH5α, der das Plasmid pGP75 E-1 enthält, das einen als pcvEx bezeichneten Plasmidvektor und eine 2,7 kb große gp75-cDNA-Insertion voller Länge umfaßt (vgl. Fig. 4), ist bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA 20852, unter einer entsprechenden ATCC-Eingangsnummer hinterlegt worden. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (Budapester Vertrag).
Das die 2,7 kb-cDNA voller Länge enthaltende Plasmid kann aus den hinterlegten E. coli-Wirtsstämmen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren gewonnen werden (Maniatis, T., E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1.38-1.39, 1.42-1.43 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Die Isolierung der 2,7 kb-gp75-cDNA aus dem Plasmid kann unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease-Spaltung mit EcoRI mittels auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren erfolgen.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die für die Replikation des Vektors essentiell ist, der mit dem zur Expression in einem Wirt angepaßten cDNA-Molekül eines gp75- Nucleinsäure-Moleküls kombiniert worden ist. Der Expressionsvektor kann ein Vaccinia-Virus oder vorzugsweise ein Imclone-Vektor sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Impfstoff zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden, dem der Impfstoff verabreicht wird, bereit, umfassend den das cDNA-Molekül enthaltenden Expressionsvektor, eine wirksame Menge eines Adjuvans und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Bei dem Probanden handelt es sich vorzugsweise um einen Menschen und gp75 ist vorzugsweise an das Adjuvans gebunden. Das Adjuvans kann ein mikrobielles Adjuvans oder ein anderes pharmazeutisches Mittel sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Impfstoff zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden, dem der Impfstoff verabreicht wird, bereit. Der Impfstoff kann ein Polypeptid, das die vom cDNA-Molekül des gp75-Nucleinsäure-Moleküls stammende Aminosäuresequenz aufweist, eine wirksame Menge eines Adjuvans und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Bei dem Probanden handelt es sich vorzugsweise um einen Menschen und gp75 ist vorzugsweise an das Adjuvans gebunden. Das Adjuvans kann ein mikrobielles Adjuvans oder ein anderes pharmazeutisches Mittel sein.
Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff oder das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel kann zur Stimulation oder Steigerung der Produktion von gegen gp75 gerichteten Antikörpern in einem Probanden verwendet werden. Der Impfstoff oder das Arzneimittel kann dem Probanden in einer Dosis verabreicht werden, die eine Stimulation oder Steigerung der Produktion der Antikörper bewirkt.
Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff oder das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel kann bei einem an Krebs leidenden Patienten zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Der Impfstoff oder das Arzneimittel kann dem Patienten in einer Dosis verabreicht werden, die eine Behandlung von Krebs bewirkt.
Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff oder das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel kann zur Vorbeugung gegen Krebs bei einem an Krebs leidenden Patienten verwendet werden. Der Impfstoff oder das Arzneimittel kann dem Patienten in einer Dosis verabreicht werden, die eine Vorbeugung gegen Krebs bewirkt.
Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff oder das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel kann bei einem für Krebs anfälligen Patienten zur Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs verwendet werden. Der Impfstoff oder das Arzneimittel kann dem Patienten in einer Dosis verabreicht werden, die eine Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs bewirkt.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Impfstoffs oder Arzneimittels zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs kann auf ein Carcinom, wie ein Melanom, gerichtet sein. Die Impfstoffe oder Arzneimittel eignen sich bei einem Patienten, der durch ein rezidivierendes oder primäres Melanom stark gefährdet ist, zur Vorbeugung gegen ein Carcinom, wie ein Melanom.
In diesen Impfstoffen oder Arzneimitteln kann gp75 an das Adjuvans gebunden sein. Vor Verabreichung des Impfstoffs kann dem Patienten außerdem eine wirksame Cyclophosphamid-Menge verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird in dem folgenden experimentelle Einzelheiten betreffenden Abschnitt näher erläutert. Dieser Abschnitt soll das Verständnis der Erfindung fördern.

EXPERIMENT 1

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Gewebekultur: Die Melanom-Zellinie SK-MEL-19 wurde in MEM-Medium und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und Penicillin und Streptomycin gezüchtet, wobei allerdings fötales Kälberserum (FCS) gegen 10% (Vol./Vol.) SerumPlus (Hazelton Research Products Inc., Lenexa, KS) ausgetauscht wurde.
Isolierung und Aufreinigung von gp75: Mittels Homogenisierung von Zellen in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM MgCl&sub2; und 2 mM PMSF und Zentrifugation bei 10 000 · g wurde aus der Melanom-Zellinie SK-MEL 19 eine post-nukleare Membranfraktion isoliert. Die Membranen wurden in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 3 M KCl und 5 mM EDTA solubilisiert und bei 100 000 · g zentrifugiert. Eine unlösliche Proteinfraktion wurde in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5% Natriumdesoxycholat resuspendiert. In einem Detergens lösliche Proteine wurden durch Zentrifugation bei 100 000 · g gesammelt. Der Überstand wurde gegen 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl und 2 mM CHAPS dialysiert und auf eine Mono-Q-Säule (HR 5/5, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl und 2 mM (3- [(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) (Puffer A) äquilibriert worden war. Gebundene Proteine wurden mit: einem linearen Gradienten von 0 M-1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Mittels eines kompetitiven Hemmtests wurden die Fraktionen auf gp75 getestet. gp75 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, gegen Con A-Säulenpuffer (1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2; und 2 mM PMSF enthaltendes 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) dialysiert und auf eine Con A-Sepharose-Säule aufgetragen. Ungebundene Proteine wurden mittels Waschen mit Säulenpuffer entfernt. An Con A gebundene Proteine wurden mit 0,25 M α-D-Methylmannopyranosid in Con A-Säulenpuffer eluiert. gp75 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, gegen 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 2 mM CHAPS und 2 mM PMSF (CB) dialysiert und auf eine Affi-Gel 10- Affinitätssäule aufgetragen, die den monoclonalen Maus-Antikörper (mAb) TA99 (Thomson, T. M., J. M. Mattes, L. Roux, L. J. Old und K. O. Lloyd, Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermatol., 85 (1985), 169) enthielt. Das Gel wurde schrittweise mit jeweils 6 ml CB, CB + 1 M NaCl, CB und CB + 2 mM CHAPS gewaschen. Gebundenes gp75 wurde mit 2 mM CHAPS enthaltendem 0,1 M Glycin-HCl, pH-Wert 3,1, eluiert.
Kompetitiver Hemmtest auf gp75: Während der Aufreinigung wurde gp75 kontrolliert und quantitativ bestimmt, indem die Fähigkeit der Fraktionen zur Hemmung der Bindung von 300 ng/ml mAb TA99 an in Methanol : Aceton (1 : 1, Vol./Vol.) fixierte SK-MEL-19-Zellen mittels eines Enzymimmuntests (ELISA) (Houghton, A. N., H. Brooks, R. J. Cote, M. C. Taormina, H. F. Oettgen und L. J. Old, Detection of cell surface and intracellular antigens by human monoclonal antibodies: hybrid cells derived from lymphocytes of patients with malignant melanoma, J Evp. Med., 158 (1983), 53) bestimmt wurde.
Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und Peptidkartierung: Wie beschrieben (Mattes, J. M., T. M. Thomson, L. J. Old und K. O. Lloyd, A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer, 32 (1983), 717) wurde eine an Con A- Sepharose gebundene SK-MEL-19-Proteinfraktion mittels des Chloramin-T- Verfahrens iodiert und mit dem mAb TA99 und AU-Serum immunpräzipitiert. Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert (Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227 (1970), 680). Zur Spaltung mit Endoglycosidase H (Endo H) wurden die Immunpräzipitate in 0,4% SDS suspendiert, 5 min bei 100ºC erhitzt und mit 1 mE Endo H (Genzyme Corporation, Boston, MA) in 100 mM Citratpuffer, pH-Wert 5,5, 16 h bei 37ºC gespalten. Unter Verwendung von Ampholinen, pH-Wert 5-7 (LKB-Produkter, Bromma, Schweden), wurde eine zweidimensionale Elektrophorese nach O'Farrel durchgeführt (O'Farrel, P. H., High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J. Blol. Chem., 250 (1975), 4007). Nach Cleveland et al. (Cleveland, D. W., S. G. Fischer, M. W. Kirschner und U. K. Laemmli, Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecylsulfate and analysis by gel electrophoresis, J. Biol. Chem., 252 (1977), 1102) wurde eine Peptidkartierung von immunpräzipitiertem gp75 mittels begrenzter Proteolyse mit V8-Protease von Staphylococcus aureus (V8-Protease) (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in SDS-PAGE durchgeführt.
Peptidsequenzierung: An der Harvard University, Microchemistry Facility, wurde eine Peptidsequenzierung durchgeführt. Mittels des Elektroblotting- Verfahrens auf Nitrocellulose übertragenes aufgereinigtes gp75 (12 ug) wurde mit V8-Protease (1 : 20, Gew./Gew.) nach Aebersold (Aebersold, R. H., J. Leavitt, R. A. Saavedra und L. E. Hood, Internal. amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 6970) gespalten und die erhaltenen Peptide wurden auf einer Brownlee-RP-300-C8-Säule mit Abmessungen von 2,1 · 100 mm bei 38ºC getrennt. Mehrere Peaks aus der V8- Protease-Spaltung wurden vereinigt und getrocknet. Durch Zugabe von 50 ul 8 M Harnstoff/0,4 M Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer, pH-Wert 8,0, und 5 ul 100 mM Dithiothreit und 15-minütiges Erhitzen bei 50ºC wurde eine vollständige Reduktion und Alkylierung durchgeführt. Danach wurde die Probe mit 5 ul 45 mM Iodessigsäure 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 140 ul destilliertem Wasser verdünnt. Eine weitere Spaltung der reduzierten und alkylierten Peptidfraktion mit Trypsin (1 : 25, Gew./Gew.) wurde die Nacht über bei 37ºC durchgeführt. Fraktionen, die sequenziert werden sollten, wurden direkt auf Glasfaserfilter, die einem Vorbehandlungs-Zyklus mit Polybren unterworfen worden waren, aufgetragen und auf einer ABI-477A- Proteinsequenzier-Vorrichtung sequenziert. Aminosäuren wurden mit einer rechnerunterstützten ABI-120A-HPLC-Vorrichtung getrennt. Für jedes Peptid wurden mindestens 20 Zyklen durchgeführt. Die reproduzierbare HPLC- Ausbeute unter routinemäßigen Laborbedingungen belief sich auf 93%. Es sind nur die Aminosäuresequenzen der Peptide angegeben, bei denen die zuverlässigsten Ergebnisse erhalten wurden.
Clonierung und Sequenzierung einer gp75-cDNA: Aus der Melanom-Zellinie SK- MEL-19 wurde eine cDNA-Genbank konstruiert. Eine Oligonucleotid-Sonde wurde zur Isolierung eines gp75-eDNA-Clons nach früher beschriebenen Verfahren verwendet (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi und A. N. Houghton, Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Fxp. Med., I69 (1989), 2029). Die Oligonucleotidsonde besaß die folgende Sequenz:
5'-CTCGAAGGTGAAGCCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC-3'. Ein als GP75-1 bezeichneter 2,0 kb-cDNA-Clon wurde sequenziert (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Die Nucleotidsequenz von GP75-1 ist bei der EMBL-Datenbank unter der Eingangs-Nr. X51455 hinterlegt worden (vgl. Fig. 3).

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Sowohl der Maus-mAb TA99 als auch Serum des Melanom-Patienten AU immunpräzipitieren ein 75 kDa-Antigen, wobei der mAb TA99 das mit AU-Serum präzipitierte gp75-Antigen vorreinigt (Thomson, T. M., J. M. Mattes, L Roux, L. J. Old und K. O. Lloyd, Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody, 1 Invest. Dermatol., 85 (1985), 169). Da der mAb TA99 zur Aufreinigung von gp75 aus der Melanom-Zellinie SK-MEL-19 verwendet wurde, war es wichtig zu bestätigen, daß der mAb TA99 nur das vom AU-Serum erkannte gp75-Antigen nachwies. Bei früheren Untersuchungen hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß der mAb TA99 nicht mit menschlicher Tyrosinase, einem auch in pigmentierten Melanocyten exprimierten Glycoprotein von 75 kDa-80 kDa (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi und A. N. Houghton, Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med., 169 (1989), 2029), reagierte. Aufgrund dieser Experimente konnten die Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, daß der mAb TA99 mit anderen von SK-MEL-19- Zellen exprimierten Polypeptiden kreuzreagierte.
Mit dem mAb TA99 und dem AU-Serum-Antikörper immunpräzipitierte Proteine wurden mittels ein- und zweidimensionaler SDS-PAGE und mittels Peptidkartierung unter Verwendung einer begrenzten Proteolyse mit der S. aureus-V8-Protease analysiert. Sowohl mit dem mAb TA99 als auch dem AU- Serum-Antikörper präzipitierte Proteine besaßen ein identisches Molekulargewicht (75 kDa), einen identischen isoelektrischen Punkt (5,5-5,9) und eine identische Peptidzusammensetzung (Fig. 1), was bestätigte, daß TA99 und AU-Serum das gleiche gp75-Molekül erkannten.
Das gp75-Antigen wurde, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, aufgereinigt. Zur Peptidsequenzierung wurde affinitätsgereinigtes gp 75 verwendet. Die Aminosäuresequenzen von drei internen Peptiden wurden mittels proteolytischer Spaltung von aufgereinigtem gp75 mit V8-Protease und Trypsin erhalten. Die Sequenzen der drei Peptide sind in Fig. 2 gezeigt. Es bestand eine 90%ige Identität mit den Aminosäuresequenzen, die aus dem von Shibahara et al. isolierten Maus-cDNA-Clon pMT4 abgeleitet worden waren (an den Aminosäurepositionen 247-260, 333-349 und. 428-441 von pMT4) (Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri und R. Muller, Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res., 14 (1986), 2413). Von gp75-Peptidsequenzen wurden Oligonucleotid-Sonden abgeleitet und zum Durchmustern einer aus der menschlichen Melanom- Zellinie SK-MEL-19 konstruierten cDNA-Genbank verwendet. Aus der cDNA- Genbank von SK-MEL-19 wurden zwei cDNA-Clone (1,8 kb und 2,0 kb) isoliert. Partielle Nucleotidsequenzen der cDNA-Clone (GP75-1 und GP75-2), deren eine in Fig. 3 gezeigt ist, zeigten eine 88,6%-ige Identität mit pMT4 (zwischen den Nucleotiden 649-1437 innerhalb des offenen Leserasters). Die abgeleitete Aminosäuresequenz von GP75-1 und GP75-2 zeigte mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von pMT4 zwischen den Aminosäureresten 219-467 eine 93,6%-ige Identität. Zwischen der cDNA-Sequenz von gp75 und der cDNA- Sequenz von menschlicher Tyrosinase (Bouchard, B., B. Fuller, S. Vijayasaradhi und A. N. Houghton, Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med., 169 (1989), 2029), die sich zwischen den Nucleotiden 618-1344 von Tyrosinase befanden, bestand eine 55,3%-ige Identität.
Die enge Homologie zwischen menschlichem gp75 und dem abgeleiteten Produkt des Maus-pMT4-Gens bringt etwas Licht in die mögliche Struktur und Funktion von gp75. Der pMT4-Clon wurde aus melanocytischen Maus-Zellen isoliert (Shibahara, S., Y. Tomita, T. Sakakura, C. Nagar, B. Chaudhuri und R. Muller, Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acids Res., 14 (1986), 2413). Ursprünglich war man davon ausgegangen, daß die pMT4-cDNA die im c-(albino)-Locus der Maus kartierte Maus-Tyrosinase codiert. Weitere Untersuchungen zeigten jedoch, daß sich pMT4 und Maus-Tyrosinase unterscheiden (Yamamoto, H., S. Takeuchi, T. Kudo, K. Makino, A. Nakata, T. Shinoda und T. Takeuchi, Cloning and sequencing of mouse tyrosinase cDNA, Jpn. J. Genetics, 62 (1987), 271; Muller, G., S. Ruppert, E. Schimd und G. Schutz, Functional analysis of alternatively spliced tyrosinase gene transcripts, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J., 7 (1988), 2723; Jackson, I. J., A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 4392). Ebenso unterscheidet sich die gp7S-Sequenz von der Sequenz von menschlicher Tyrosinase, obwohl es zwischen gp75 und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von menschlicher Tyrosinase (zwischen den Aminosäureresten 208-459) eine beschränkte Identität (43,1%) gibt. Die Beobachtung, daß pMT4 in der Maus im b (brown)-Locus kartiert wurde (Jackson, I. J., A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proc. Nat). Acad. Sci. USA, 85 (1988), 4392), einem Bereich, der die Fellfarbe reguliert (Silvers, W. K., Comparative genetics of coat colour in mammals, in: The Coat Colors in Mice, (1979), 1, Springer Verlag, New York), deutet die Funktion von gp75 und des pMT4-Produkts an. Die Homologie zwischen gp75 und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von pMT4 ermöglicht die formale Identifizierung des menschlichen Homologs des Genprodukts des Maus-brown-Locus. Auf der Basis seiner melanosomalen Lokalisation und seiner strukturellen Ähnlichkeit mit Tyrosinase reguliert das gp75-Molekül vielleicht die Melanin-Synthese und bestimmt den Typ des synthetisierten Melanins.
Man hat erkannt, daß melanosomale Determinanten und andere intrazelluläre Antigene keine potentiellen Ziele für die Immuntherapie eines Melanoms sind. Vor kurzem ist jedoch deutlich geworden, daß Antigen-präsentierende Zellen intrazelluläre Proteine prozessieren und diese gegenüber cytotoxischen T- Zellen (CTL) als Peptide präsentieren können (Townsend, A. R. M und H. Bodmer, Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes, Ann. Rev. Immunol., 7 (1989), 601). Diese Beobachtung eröffnet die theoretische Möglichkeit, daß gegen ein Melanom gerichtete T-Zell-Reaktionen gegen innerhalb der Tumorzelle exprimierte Moleküle gerichtet sein könnten. Alternativ könnten sich melanosomale Bestandteile, die während des Reifeprozesses normalerweise aus der Melanocyte transportiert werden, in dem die Tumorzellen umgebenden extrazellulären Raum anreichern oder eine lokale Gewebenekrose könnte zur Freisetzung und Ablagerung intrazellulärer Produkte führen. Die Zugänglichkeit von gp75 wird dadurch untermauert, daß radiomarkierter mAb TA99 in nu/nu-Mäusen spezifisch auf menschliche Melanom-Transplantate beschränkt bleibt (Welt, S., J. M. Mattes, R. Grando, T. M. Thomson, R. W. Leonard, P. B. Zanzonico, R. E. Bigler, S. Yeh, H. F. Oettgen und L J. Old, Monoclonal antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplants in nu/nu mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 4200), was zeigt, daß das Antigen innerhalb von Tumorstellen für einen Antikörper zugänglich ist.
IgG-Antikörper des Melanom-Patienten AU erkannten Determinanten auf gp75, die sowohl bei Melanomzellen als auch bei normalen Melanocyten zu finden waren (Mattes, J. M., T. M. Thomson, L. J. Old und K. O. Lloyd, A pigmentation associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. 1 Cancer, 32 (1983), 717). Durch die Isolierung von gp75 codierenden cDNA-Clonen sollte es möglich sein, Strategien zur aktiven Immunisierung gegen gp75 zu untersuchen. Zur wirksamen Induktion von CTL-Reaktionen gegen gp75 gibt es mindestens zwei Erfordernisse: 1) die Immuntoleranz gegen gp75 muß unterbrochen werden, und 2) gp75-Peptide müssen prozessiert und durch Antigene des Haupt- Histokompatibilitäts-Komplexes auf Melanomzellen wirksam präsentiert werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, daß Differenzierungs-Antigene von Melanocyten einzigartige Determinanten tragen könnten. Gene, die von normalen Melanocyten exprimierte Produkte codieren, könnten während der malignen Transformation mutiert oder umgebaut werden, wodurch neuartige Epitope zur Erkennung durch CTL und Antikörper erzeugt werden. Das in dieser Hinsicht am besten charakterisierte einzigartige Antigen auf menschlichen Melanomzellen ist eine Determinante auf Melanotransferrin, einem 95 kDa-97 kDa-Glycoprotein, das auf gezüchteten Melanocyten und Melanomzellen exprimiert wird (Real, F. X., M. J. Mattes, A. N. Houghton, H. F. Oettgen, K. O. Lloyd und L. J. Old, Class I (unique) antigens of human melanoma. Identification of a 90,000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibody, J. Exp. Med., 160 (1984), 1219; Furakawa, K. S., K. Furakawa, F. X. Real, L J. Old und K. O. Lloyd, A unique antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoprotein gp75/p97, J. Exp. Med., 169 (1989), 585). Diese Möglichkeit wird durch den Nachweis untermauert, daß im ganzen Genom menschlicher Melanomzellen genetische Veränderungen sehr häufig und überall vorkommen (Dracopoli, N. C., A. N. Houghton und L. J. Old, Loss of polymorphic restriction fragments in malignant melanoma: Implications for tumor heterogeneity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 1470; Dracopoli, N. C., B. Alhadeff, A. N. Houghton and L J. Old, Loss of heterozygosity at autosomal and x-linked loci during tumor progression in a patient with melanoma, Cancer Res., 47 (1987), 3995).

EXPERIMENT 2

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Isolierung der 2,7 kb-GP75-cDNA im Phagen λ: Das in Experiment 1 beschriebene GP75-cDNA-Fragment von 2,0 kb (die Sequenz findet sich in Fig. 3) wurde zum Durchmustern einer genomischen Genbank verwendet. Ein genomischer Clon wurde erhalten, der das GP75-Gen enthielt.
Konstruktion und Durchmustern einer cDNA-Genbank: Eine cDNA-Genbank wurde aus 3 u.g Poly(A)&spplus;-selektierter mRNA (Maniatis, T., E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), S. 545, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) konstruiert, die aus der menschlichen melanotischen Melanom-Zellinie SK-MEL-19 isoliert worden war (Houghton, A. N., M. Eisinger, A. P. Albino, J. G. Cairncross und L. J. Old, Surface antigens of melanocytes and melanoma: markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Evp. Med., 156 (1982), 1755). Eine cDNA voller Länge wurde synthetisiert und unter Verwendung von Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen und daran wurden aus Eco RI-Linkern (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) bestehende Schwänze angefügt (Gubler, U. und B. J. Hoffman, A simple and very efficient method of generating cDNA libraries, Gene (Amst.), 25 (1983), 263). Die cDNA wurde dann auf einer Ultrogel-Aca 34- Vorrichtung (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) entsprechend der Größe fraktioniert (Watson, C. J. und J. F. Jackson, Constructing and screening cDNA libraries in λgt 10 and λgt 11, in: DNA Cloning: A Practical Approach (Herausgeber D. M. Glover), (1985), 79-100, IRL Press Limited, Oxford). cDNA- Moleküle, die größer als 800 bp waren, wurden zur Konstruktion einer 3 · 10&sup5; Rekombinanten enthaltenden Genbank im Phagenvektor λgt 10 verwendet (Huynh, T. V., R. A. Young und R. W. Davis, An alternative procedure for the synthesis of double stranded cDNA for cloning in phage and plasmid vectors, in: DNA Cloning: A Practicai Approach (Herausgeber D. M. Glover), (1985), 49-78, IRL Press Limited, Oxford).
Zum Durchmustern wurde ein Fragment verwendet, das auf dem 5'-terminalen codierenden Bereich des vorstehend erhaltenen genomischen Clons basierte. Dabei wurde eine 2,7 kb-eDNA im Phagen X erhalten (Bouchard, B., B. Fuller, 5. Vijayasaradhi und A. N. Houghton, Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Fxp. Med., 169 (1989), 2029).
Gewinnung der 2,7 kb-cDNA: Mit der GP75-cDNA-Insertion von 2,7 kb wurde eine Spaltung mit der Restriktionsendonuclease Eco RI durchgeführt. Die DNA wurde mittels Extraktion mit Phenol/Chloroform und Präzipitation mit Ethanol aufgereinigt. Die DNA wurde erneut in TE (pH 7,5) in einer Konzentration von 100 ug/ml gelöst. Mit Hilfe des folgenden Verfahrens wurden die kohäsiven Termini ligiert. Die folgenden Ligierungsgemische wurden vorbereitet:
1) 0,1 ug DNA des Vektors pcvEx wurden in ein steriles Mikrofugen-Röhrchen überführt. Eine äquimolare Menge der 2,7 kb-GP75-cDNA wurde zugegeben. 2) H&sub2;O wurde bis zu einem Volumen von 7,5 ul zugegeben und die Lösung wurde 5 min auf 45ºC erwärmt, um alle kohäsiven Termini, die sich erneut aneinander gelagert hatten, aufzuschmelzen. Das Gemisch wurde auf 0ºC gekühlt. 3) Danach wurden 1 ul 10 · Puffer für DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 (200 mM Tris-Cl (pH 7,6), 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM Dithiothreit, 5(10 ug/ml Rinder- Serumalbumin (Fraktion V; Sigma)), 0,1 Weiss-Einheiten DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 und 1 ul 5 mM ATP zugegeben. Die Umsetzungsgemische wurden 1-4 Stunden bei 16ºC inkubiert. Es wurde das in Fig. 4 dargestellte Plasmid pGP75 E-1 erhalten, das den Plasmidvektor pcvEx und die GP75-cDNA- Insertion von 2,7 kb enthält.
Erzeugung kompetenter E. coli-Zellen: Von jedem Ligierungs-Umsetzungsgemisch wurden 1 ul-2 ul zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen mit Hilfe des folgenden Verfahrens verwendet. Zuerst wurden 5 ml LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie einer frischen, die Nacht über bebrüteten Platte beimpft. Dann wurden die Zellen 5-7 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung gezüchtet. Danach wurde 1 Liter LB-Medium in einer 4 Liter-Flasche mit 4 ml der vorstehend erhaltenen Kultur beimpft. Die Züchtung erfolgte bis zu einer OD&sub5;&sub5;&sub0; = 0,15. Dann erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 3000 Upm (3 K) und das Pellet wurde in 400 ml 100 mM CaCl&sub2; bei 0ºC resuspendiert. Danach erfolgte erneut eine 10-minütige Zentrifugation bei 3000 Upm (3 K) und das Pellet wurde in 10 ml 100 mM CaCl&sub2; bei 0ºC resuspendiert. 2,5 ml 80%-iges Glycerin wurden zugegeben.
Transformation von E. coli DH5α: Zu 100 ul kompetenten Zellen wurden 1 ul- 20 ul des Plasmids GP75 E-1 gegeben. Dieses Gemisch wurde 20 min auf Eis gehalten. Danach erfolgte ein einminütiger Hitzeschock bei 42ºC. Dann wurde das Gemisch 10 min zurück auf das Eis gegeben. Die Zellen wurden 10 Sekunden in einer Mikrofuge zentrifugiert und in 200 ul LB-Medium resuspendiert. Das Medium wurde 45 min bei 37ºC auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.
Die erhaltenen E. coli-Zellen, die das Plasmid pGP75 E-1 enthielten, wurden bei ATCC hinterlegt.

EXPERIMENT 3

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Reagentien: L-[Ring-3,5-³H]-Tyrosin (spezifische Aktivität 46,7 Cl/mmol) wurde von ICN (Irvine, CA) bezogen. Concanavalin A-Sepharose und Protein A- Sepharose-CL-4B wurden von Pharmacia (Piscataway, NJ) bezogen. Affigel-10 wurde von Bio-Rad (Richmond, CA) bezogen. Alle zur Elektrophorese verwendeten Chemikalien wurden von BRL (Gaithersburg, MD) bezogen. Desoxycholsäure (Natriumsalz), Nonidet P-40, (3-[(3-Cholamidopropyl)- dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und α-D-Methylmannopyranosid, mit alkalischer Phosphatase konjugierter, gegen Maus-IgGs gerichteter Ziegen-IgG, Farbentwicklungsreagens für alkalische Phosphatase und alle anderen analysenreinen Chemikalien wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Wasser zur HPLC-Analyse und andere analysenreinen organischen Lösungsmittel wurden von Fisher (Pittsburgh, PA) bezogen. Die Maus-mAbs TA99 (IgG2A) und F23 (IgG2a) wurden unter Verwendung von Protein A-Sepharose aufgereinigt. Der mAb TA99 ist ein gegen gp75 gerichteter Antikörper (Thomson, T. M., Mattes, J. M., Roux, L., Old L. J. und Lloyd, K. O., Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melariocytes: definition with a mouse monoclona1 antibody, J. Invest. Dermatol., 85 (1985), 169-174) und der als Kontroll-Antikörper verwendete mAb F23 ist ein gegen menschliches Dickdarmcarcinom gerichteter Antikörper, der mit menschlichen melanocytischen Zellen nicht reagiert.
Gewebekultur: Die Melanom-Zellinie SK-MEL-19 wurde in mit 10% Serum Plus (Hazelton, Lenexa, KS) angereichertem MEM-Medium gezüchtet und Passagen unterworfen, wie von Vijayasaradhi, S., Bouchard, B. B. und Houghton, A. N., The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. bp. Med., 171 (1990), 1375-1380, beschrieben.
Isolierung und Aufreinigung von gp75: Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Verfahren zur Aufreinigung von gp75 bei 0ºC-5ºC durchgeführt. Semikonfluente SK-MEL-19-Melanomzellen wurden aus 150 cm²-Flaschen durch Abkratzen mit einem Gummischaber, Sammeln in Gewebekulturmedium und Zentrifugation geerntet und anschließend wurden die Zellen (60 g Pellet) mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 300 ml 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM MgCl&sub2; und 2 mM PMSF 10 min suspendiert und in einem Dounce- Homogenisator homogenisiert. Die Zell-Lyse wurde mit einem Phasenkontrast- Mikroskop kontrolliert. Das Homogenat wurde 10 min bei 1000 · g zentrifugiert, dann wurde der Überstand gesammelt und 30 min bei 10 000 · g zentrifugiert. Das Roh-Membranpellet wurde in 50 ml 20 mM Tris-HCl, ph-Wert 7,5, 3 M KCl und 5 mM EDTA suspendiert, in einem Dounce-Homogenisator vorsichtig homogenisiert und 90 min bei 100 000 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5% Natriumdesoxycholat resuspendiert und vorsichtig homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 100 000 · g zentrifugiert und der Überstand wurde 24 h gegen 200-300 Volumina 20 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,5, 0,15 M NaCl und 2 mM CHAPS dialysiert. Das Dialysat wurde mittels 90- minütiger Zentrifugation bei 100 000 · g geklärt. Der bei diesem Schritt erhaltene klare Überstand wurde auf eine Mono-Q (Pharmacia, HR 5/5)-Säule, die mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl und 2 mM CHAPS (Puffer A) äquilibriert worden war, über eine Superloop-Vorrichtung (Pharmacia) aufgetragen, wobei die Durchflußrate 0,5 ml/min betrug. Die Säule wurde mit 10 ml Puffer A gewaschen, gebundene Proteine wurden mit einem linearen 30 ml-Gradienten von 0 M-1,0 M NaCl in Puffer A eluiert und 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden mittels eines kompetitiven Hemmtests auf gp75 getestet und Fraktionen mit positiven Ergebnissen wurden vereinigt und gegen 100 Volumina Säulenpuffer C, d. h. 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2; und 2 mM PMSF enthaltendes 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 18 h dialysiert.
Con A-Sepharose-Chromatographie: In einer 10 ml Econo-Säule (Bio-Rad) wurde Con A-Sepharose (5 ml) mit 50 ml Con A-Säulenpuffer gewaschen und und die aus der Mono-Q-Ionenaustausch-Chromatographie erhaltenen, vereinigten, dialysierten Fraktionen wurden bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min-1,5 ml/min auf die Säule aufgetragen. Der Ausfluß wurde erneut auf die Säule aufgetragen und die Säule wurde mit dem Säulenpuffer solange gewaschen, bis die Extinktion (280 nm) des Ausflusses unter 0,01 lag. An Con A gebundene Proteine wurden mit 0,25 M α-D-Methylrnannopyranosid in Con A-Säulenpuffer eluiert und Fraktionen von 1,5 ml-2 ml wurden gesammelt. Eine 15- bis 20-minütige Inkubation der Säule mit Elutionspuffer bei 25ºC-30ºC vor der Elution verbesserte die Ausbeute an Protein. gp75 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und gegen 10 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, 2 mM CHAPS und 2 mM PMSF dialysiert und auf eine TA99 enthaltende Affi-Gel-10-Affinitätssäule aufgetragen.
TA99-Affinitätschromatographie: Der mAb TA99 wurde aus Ascites-Flüssigkeit von (BALB/c · C57BL/6)-F&sub1;-Mäusen mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation und anschließender Chromatographie über eine Protein A-Sepharose-Säule und eine Sephadex-G-25-Säule aufgereinigt. Affi-Gel 10 wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers zur Kupplung vorbereitet und mit kaltem Kupplungspuffer (CB), d. h. 50 mM HEPES, pH-Wert 7,6, und 150 mM NaCl, gewaschen. Die Kupplungsumsetzung wurde mit 9 mg aufgereinigtem TA99-IgG pro 2 ml Affi-Gel in einem Gesamtvolumen von 6 ml Kupplungspuffer 4 h bei 4ºC durchgeführt. Nicht-gekuppelte Stellen wurden mittels Inkubation mit 0,1 M Ethanolamin-HCl, pH-Wert 8,0, in gleicher Menge 1 h bei 4ºC blockiert. Danach wurde das Gel schrittweise mit CB, CB + 1,5 M NaCl, CB und schließlich 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl und 2 mM CHAPS gewaschen. Die Kupplungs-Wirksamkeit wurde ermittelt, indem im klaren Überstand der Kupplungsumsetzung der TA99-Antikörper-Titer vor und nach der 4-stündigen Kupplungsumsetzung mittels eines ELISA-Tests gegen SK-MEL-19- Melanomzellen bestimmt wurde. Die Kupplungs-Wirksamkeit betrug 60%-80%, wobei etwa 5 mg TA99-IgG pro ml Affi-Gel 10 gekuppelt wurden. Die bei der Con A-Chromatographie erhaltene, vereinigte, dialysierte Proteinlösung wurde auf eine den mAb TA99 enthaltende 2 ml-Affi-Gel-10-Säule bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0, 5 ml/min aufgetragen und der Ausfluß wurde erneut auf die Säule aufgetragen. Dann wurde das Gel schrittweise mit jeweils 6 ml CB, CB + 1 M NaCl, Cb sowie CB + 2 mM CHAPS gewaschen. Gebundenes gp75 wurde mit 2 mM CHAPS enthaltendem 0,1 M Glycin-HCl, pH-Wert 3,1, von der Säule eluiert.
Enzymverbundener Immunadsorptionstest auf gp75: Zum ELISA-Test wurden mit Trypsin behandelte Zellen in einer Dichte von 500-2000 Zellen/Vertiefung auf mit Mikrovertiefungen versehenen Platten (Microtest-Platten 3034, Falcon, Oxnard, CA) ausplattiert und 48 h-72 h bei 37ºC bei 5% CO&sub2; in einem Gewebekultur-Inkubator mit erhöhtem Feuchtigkeitsgehalt gezüchtet. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, mit abgekühltem (-200 G) Methanol : Aceton (1 : 1, Vol./Vol.) 10 min fixiert und dann dreimal mit 0,2% Natriumazid enthaltender kalter PBS gewaschen. Platten mit den fixierten und permeabilisierten Zellen wurden bei 4ºC aufbewahrt. Der Titer des TA99- Antikörpers wurde auf frisch fixierten Platten mittels des ELISA-Tests bestimmt. (Bei Aufbewahrung der Platten bei 4ºC bis zu 6 Monaten wurde bei dem mAb TA99 keine signifikante Veränderung des Titers beobachtet.) Kurz zusammengefaßt, wurden die Zellen mit 10 ul mAb TA99 pro Vertiefung inkubiert und in 5% gamma-Globulin-freies FBS (GGFFBS) enthaltender PBS in einer Verdünnungsreihe 45 min verdünnt. Danach wurden die Platten dreimal mit 2% GGFFBS enthaltender PBS gewaschen, in jede Vertiefung wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiertes, gegen Maus-Antikörper gerichtetes Ziegen-IgG (in PBS mit 5% GGFFBS 1 : 200 verdünnt) gegeben und es erfolgte eine 45-minütige Inkubation. Die Platten wurden, wie vorstehend beschrieben, dreimal gewaschen und 18 ul Substrat-Lösung für alkalische Phosphatase (p- Phenyldinatriumphosphat in 5 mM MgCl&sub2; enthaltendem Diethanolamin-Puffer, pH 9,8) wurden zugegeben. Nach einer 15- bis 20-minütigen Inkubation bei 37ºC in einer Kammer mit erhöhtem Feuchtigkeitsgehalt wurde die optische Dichte bei 405 nm in einer Mikroplatten-Ablesevorrichtung (Modell 210) von Artek (Chantilly, VA) bestimmt.
Kompetitiver Hemmtest auf gp75: Während der ersten Schritte wurde die Aufreinigung von gp75 kontrolliert und quantitativ bestimmt, indem die Fähigkeit der Fraktionen zur Hemmung der Bindung des mAb TA99 an SK-MEL- 19-Zellen mittels des vorstehend beschriebenen ELISA-Tests bestimmt wurde. Subzelluläre Fraktionen oder Säulenchromatographie-Fraktionen wurden auf Mikrotest-Platten mit 96 Vertiefungen in einer Verdünnungsreihe verdünnt. Der TA99-Antikörper wurde bis zu einer Endkonzentration von 300 ng/ml (gerade unter der Sättigungsbindung an SK-MEL-19) zugegeben. Das Antigen- Antikörper-Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf SK-MEL-19-Zellen auf Mikrovertiefungs-Platten gegeben. Die Menge des an SK-MEL-19-Zellen gebundenen mAb TA99 wurde mittels ELISA bestimmt, wie vorstehend beschrieben. Eine Einheit der gp75-Aktivität wurde als die Protein- Menge definiert, die zur Hälfte der maximalen Hemmung der Bindung des mAb TA99 (300 ng/ml) an SK-MEL-19-Zellen erforderlich war.
Gel-Elektrophorese und Elektroblotting-Verfahren: Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature (Lond.), 227 (1970), 680-685) analysiert und mittels Silberfärbung (Oakley, B. R., Kirsch, D. R. und Morris, N. R., A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in acrylamide gels, Anal. Biochem., 105 (1980), 361-363) sichtbar gemacht. Proteine wurden in einer Transphor-Vorrichtung (Hoefer, San Francisco, CA) mittels des Elektroblotting-Verfahrens auf eine PVDF (Polyvinylidendifluorid)-Membran (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) zur N- terminalen Sequenzierung und Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung übertragen, wie von Matsudaira, P., Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted on to polyvinylidene difluoride membranes, J. Biol. Chem., 262 (1987), 10035-10038, beschrieben.
Aminosäure-Analyse: Die Aminosäure-Analyse einer auf eine PVDF-Membran übertragenen Proteinprobe wurde an der Harvard University Microchemistry Facility durchgeführt. Das Protein (0,6 ug und 0,8 ug) wurde in 6 N HCl 24 h bei 110ºC hydrolysiert. Freie Aminosäuren wurden mit Phenylisothiocyanat in Derivate überführt und die erhaltenen Phenylthiocarbamylaminosäuren wurden mittels HPLC analysiert, wie von Ebert, R. F., Amino acid analysis by HPLC: optimized conditions for chromatography of phenylthiocarbamyl derivatives, Anal. Biochem., 154 (1986), 431-435, beschrieben.
Analyse auf Tyrosinhydroxylase-Aktivität mittels Immunpräzipitation: 100 ug- Aliquots von Melanom (SK-MEL-19)-Zellextrakten, die mittels eines Detergens (1% NP40 in PBS) solubilisiert worden waren, wurden mit 3 ug-15 ug mAb TA99 (gegen gp75 gerichtet), mAb F23 oder PBS in einem Gesamtvolumen von 45 ul 90 min bei 4% unter kontinuierlichem Mischen inkubiert. Protein A- Sepharose CL 4B wurde bis zu einer Endkonzentration von 6 mg/ml zugegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 4ºC wurden die Überstände mittels 5- minütiger Zentrifugation bei 15 000 Upm bei 4ºC gesammelt. Die Pellets wurden 5mal mit 1% NP40 enthaltender PBS gewaschen und in 50 ul des gleichen Puffers suspendiert. Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde in Überständen und Pellets bestimmt. In den Überständen der PBS-Kontrolle wurden etwa 85% der Gesamt-Tyrosinhydroxylase-Aktivität, die in den Zellextrakten vor Zugabe von Protein A-Sepharose vorhanden war, reproduzierbar gewonnen. Die Enzym-Aktivität, die in den Überständen der mit einem Antikörper und Protein A-Sepharose inkubierten Zellextrakten gewonnen wurde, wurde als Prozentsatz der bei der PBS-Kontrolle gewonnenen Aktivität angegeben.
Tyrosinhydroxylase-Test: Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde getestet, wie von Pomerantz, S. H., L-Tyrosine-3,5-H assay for tyrosinase development in skin of newborn hamsters, Science, 164 (1969), 838-839, beschrieben, wobei geringfügige Modifikationen erfolgten (Bouchard, B., Fuller, B., Vijayasaradhi, S. und Houghton, A. N., Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp. Med., 169 (1989), 2029-2042). Eine Einheit der Enzym-Aktivität wurde als die Proteinmenge definiert, die zur Freisetzung von 1 umol ³H&sub2;O aus ³H-Tyrosin in 1 h bei 37ºC erforderlich ist.
Protein-Bestimmung: Die Proteinkonzentration wurde mittels des Farbstoffbindungs-Verfahrens (Bradford, M., A rapid and ultrasensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) unter Verwendung des Protein-Testsystems von Bio-Rad bestimmt. Aufgereinigtes gp75 wurde quantitativ bestimmt, indem die Färbungs-Intensität der Proteinbande auf dem Polyacrylamid-Gel mit einer Reihe bekannter Mengen (10 ng/Proteinbande - 100 ng/Proteinbande) silbergefärbter Molekulargewichts-Markerproteine verglichen wurde.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Als Quelle für das gp75-Antigen wurde die post-nukleare Membranfraktion der Melanom-Zellinie SK-MEL-19 verwendet. Die Membranfraktion wurde mit einer hohen Salzkonzentration (3 M KCl) behandelt und die in hoher Salzkonzentration unlösliche Fraktion wurde dann im Detergens Desoxycholat solubilisiert. Mit Ausnahme des Kernpellets wurden alle subzellulären Fraktionen mittels eines kompetitiven ELISA-Tests, mit dem die Hemmung der Bindung des mAb TA99 an SK-MEL-19-Zellen (gp75-Aktivität) bestimmt wurde, auf das Vorkommen von gp75 getestet, wobei gp75 nur in der in Desoxycholat löslichen Membranfraktion nachgewiesen wurde, nicht jedoch in der in einer hohen Salzkonzentration löslichen Fraktion. Das stimmt damit überein, daß gp75 vollständig in den Membranen lokalisiert ist. Die Lokalisation von gp75 in melanosomalen Membranen wurde mittels einer metabolischen "pulse-chase"- Markierung von Melanomzellen mit ³&sup5;S-Methionin und anschließender Fraktionierung auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten (zur Anreicherung von Melanosomen) und mittels Immunpräzipitations- Analyse gezeigt. Bei diesen Experimenten konnte gp 75 nur aus den Melanosomen enthaltenden, mit einem Detergens solubilisierten, pigmentierten Gradientenfraktionen immunpräzipitiert werden.
Eine erste Anreicherung von gp75 erfolgte mittels Fraktionierung der in Desoxycholat löslichen Membranfraktion auf einer Mono-Q- (Anionenaustausch)-Säule. Gebundenes gp75 eluierte mit 0,26 M-0,5 M NaCl als breiter Aktivitäts-Peak, was auf eine Mikroheterogenität der Ladung hindeutete. Das wurde mittels einer zweidimensionalen SDS-PAGE (Pl 5,5-5,9) bestätigt. Es wurde beobachtet, daß das Vorhandensein oder Fehlen des zwitterionischen Detergens 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1- propansulfonat (CHAPS) im Säulen-Äquilibrierungspuffer und i m Probenpuffer die Bindung von gp75 an die Mono-Q Säule nicht beeinträchtigte, wobei jedoch die Zugabe von CHAPS zum Elutionspuffer die Ausbeute an gp75 verbesserte.
Die gp75-Aktivität enthaltenden Mono-Q-Fraktionen wurden vereinigt, gegen Concanavalin A (Con A)-Säulenpuffer dialysiert und auf eine Con A-Sepharose- Säule aufgetragen. Etwa 60% des aufgetragenen Proteins wurden an Con A gebunden. Die Elution gebundener Proteine mit 0,25 M α-D-Methylmannopyranosid führte zu einem breiten Hauptpeak, dem ein kleiner Peak folgte. Die Bindung des gp75-Antigens an die Con A-Säule verlief heterogen, was sich während der Elution an mehreren gp75-Aktivitäts-Peaks zeigte. Bei mehreren Säulenläufen wurde das durchgängig beobachtet. Es wurde beobachtet, daß es in Melanocyten und Melanomzellen zwei reife gp75-Formen gibt, die sich entweder durch die Anzahl oder die Zusammensetzung von Asn-gebundenen Kohlenhydrat-Komplexen unterscheiden. Die heterogene Bindung an Con A resultierte jedoch nicht aus nachweisbaren Unterschieden der Asngebundenen, einen hohen Mannose-Gehalt aufweisenden Kohlenhydrate auf gp75. Dies wurde mittels Radioiodierung der eluierten Peak-Fraktionen und Immunpräzipitation von gp75 mit mAb TA99 und anschließender Entfernung der einen hohen Mannose-Gehalt aufweisenden Kohlenhydratketten mittels Spaltung mit Endo-β-N-acetylglycosaminidase H (Endo H) gezeigt. Alle getesteten Peaks enthielten 2 reife gp75-Formen, die nach Endo H-Spaltung auf einer SDS-PAGE zwei Banden von 63 kDA und 66 kDa erzeugten.
gp75 enthaltende Fraktionen des Con A-Eluats wurden vereinigt und auf eine den mAb TA99 enthaltende Affinitätssäule aufgetragen. Im Ausfluß der Affinitätssäule war überhaupt kein gp75 vorhanden, wie mittels ELISA und Silberfärbung der SDS-PAGE bestimmt. Der Ausfluß enthielt 92% des gesamten auf die Säule aufgetragenen Proteins. Die Bedingungen zur Elution von gebundenem gp75 wurden auf der Basis der Hemmung der mAb TA99-Bindung an permeabilisierte und mittels Methanol : Aceton fixierte SK-MEL-19- Melanomzellen mit Hilfe des ELISA-Tests (wie in "Materialien und Verfahren" beschrieben) vorher bestimmt. Die Bindung des mAb TA99 an gp75 konnte durch 0,1 M Glycin-HCl-Puffer, pH-Wert 3,1, unterbunden oder aufgehoben werden. Mittels Elution der Säule mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer wurden aus 1,7 mg auf die Säule aufgetragenem Protein etwa 0,5 nmol aufgereinigtes gp75 erhalten, wie anhand der Intensität der silbergefärbten gp75-Bande auf einem Polyacrylamid-Gel bestimmt. Die Elution von gp75 von der den Antikörper TA99 enthaltenden Affinitätssäule führte auch zur Auswaschung von Spurenmengen des Antikörpers TA99 (schwere und leichte Ketten), was sich auf dem silbergefärbten Gel in zusätzlichen, schwach ausgeprägten Banden von 53 kDa, 28 kDa und 26 kDa zeigte. Mittels (1) Immunpräzipitation der 53 kDa-, 28 kDa- und 26 kDa-Proteine mit einem gegen Maus-IgG gerichteten Kaninchen-Antikörper und (2) des Nachweises, daß diese Banden nicht aus einem radioiodierten Präparat des SK-MEL-19-Lysats stammten, wurde bestätigt, daß diese zusätzlichen Banden von dem an die Säule gebundenen Antikörper TA99 stammten und nicht von dem SK-MEL-19-Antigenpräparat. Eine Zusammenfassung der gp75-Aufreinigung ist in Tabelle I gezeigt. TABELLE I - AUFREINIGUNG VON gp75
¹ Die Proteinmenge in vereinigten, dialysierten Fraktionen wurde mittels des Farbstoffbindungs-Verfahrens von Bradford (1976) bestimmt.
² Eine Aktivitäts-Einheit wurde als die Proteinmenge definiert, die zur Hälfte der maximalen Hemmung der Bindung des mAb TA99 (300/mg) an SK-MEL- 19-Zellen erforderlich ist.
³ Die Menge an aufgereinigtem gp75 im Eluat der TA99-Affinitätssäule wurde mittels Beurteilung der Intensität einer silbergefärbten Bande auf SDS- PAGE bestimmt.
ND nicht bestimmt.
Zur Aminosäure-Analyse wurde affinitätsgereinigtes gp75 verwendet. Die Aminosäure-Zusammensetzung von gp75 ist in Tabelle II gezeigt. TABELLE II - AMINOSÄURE ZUSAMMENSETZUNG VON gp75
Die Aminosäure-Analyse wurde an 2 Proben (600 ng und 800 ng) von aufgereinigtem gp75 durchgeführt, das auf eine PVDF-Mernbran übertragen worden war. Die Zahlen in Klammern stellen die pmol-Menge jeder nachgewiesenen Aminosäure dar. Asx = Summe von Asparaginsäure und Asparagin; Glx = Summe von Glutaminsäure und Glutamin. ND = nicht bestimmt.
Die Sequenzen von 3 internen gp75-Peptiden und die partielle Sequenz der gp75-cDNA sind in Experiment 1 gezeigt worden. Die Aminosäure- Zusammensetzung von gp75 war der von N. crassa (Lerch, K., Longoni, C. und Jordi, E., Primary structure of tyrosinase from Neurospora crassa, J. Biol Chem., 257 (1982), 6408-6413) und der von Säuger-Tyrosinasen und. des Produkts des Maus-b-Gens (Shibahara, S., Tomita, Y., Sakakura, T., Nagar, C., Chaudhuri, B und Muller, R., Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids Res., 14 (1986), 2413-2427; Bouchard, B., Fuller, B., Vijayasaradhi, S. und Houghton, A. N., Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, 1 Exp. Med., 169 (1989), 2029-2042; Cohen, T., Muller, R. M., Tomita, Y. und Shibahara, S., Nucleotide sequence of the cDNA encoding human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18 (1990), 2807) ähnlich. Versuche zur Durchführung der N-terminalen Sequenzanalyse von gp75 mit Hilfe des Edman-Abbau-Verfahrens waren aufgrund des Vorhandenseins eines blockierten N-Terminus nicht erfolgreich. Der N-terminaie Serin-Rest der Tyrosinase von N. crassa ist auch blockiert, in diesem Fall durch eine Acetyl- Gruppe (Lerch, K., Longoni, C, und Jordi, E., Primary structure of tyrosinase from Neurospora crassa, 1. Biol. Chem., 257 (1982), 6408-6413).
Sowohl gp75 als auch Tyrosinase sind in Melanosomen lokalisierte Membran- Glycoproteine von 75 kDa, die ähnliche Aminosäure-Zusammensetzungen aufweisen, im Hinblick auf die Aminosäuresequenz zu etwa 40% identisch sind (vgl. Experiment 1; Cohen, T., Muller, R. M., Tomita, Y. und Shibahara, S., Nucleotide sequence of the cDNA encoding human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18 (1990), 2807) und zwei potentielle Kupfer-Bindungsstellen (für die katalytische Tyrosinase-Aktivität erforderlich) besitzen. Einige Forscher haben angenommen, daß Maus-gp75 eine Tyrosinhydroxylase- Aktivität besitzt, d. h. ein Merkmal des Tyrosinase-Moleküls (Hearing, V. J. und Jimenez, M., Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Res., 2 (1989), 75-85).
Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde in den Überständen und Immunpräzipitaten von SK-MEL-19-Melanomzellextrakten nach Präzipitation mit dem mAb TA99 bestimmt. TA99 bewirkte keine spezifische Verminderung der Enzymaktivität. Nach Inkubation von Zellextrakten mit entweder einem Kontroll-Antikörper (mAb F23) oder dem mAb TA99 konnten 94% der Tyrosinhydroxylase-Aktivität im Überstand gewonnen werden (Tabelle III).
Bei erhöhten Antikörper-Konzentrationen bis zu 300 ug/ml wurde nicht festgestellt, daß die im Überstand gewonnene Tyrosinhydroxylase-Aktivität signifikant verringert war. In den Immunpräzipitaten wurde keine Enzymaktivität gewonnen. Diese Ergebnisse zeigen, daß fast die gesamte Tyrosinhydroxylase-Aktivität in menschlichen Melanomzellen von (einem) Molekül(en) stammte, das/die sich vom gp75-Antigen unterscheidet/unterscheiden. TABELLE III - TYROSINHYDROXYLASE-AKTIVITÄT NACH IMMUNPRÄZIPITATION MIT MAb TA99
¹ Die Zahlen in Klammern stellen den Prozentsatz der in Überständen gewonnenen Tyrosinhydroxylase-Aktivität im Vergleich zur Pufferkontrolle (= 100%) dar.
² Kontroll-Röhrchen wurden mit PBS und dann Protein A-Sepharose inkubiert, wie in "Materialien und Verfahren" beschrieben.
³ Der Maus-mAb F23 (IgG2a) ist ein gegen Dickdarmcarcinom gerichteter mAb, der nicht mit menschlichen melanocytischen Zellen reagiert.
Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde auch während der Aufreinigung in gp75 enthaltenden Fraktionen bestimmt. Die gesamte zelluläre Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde während der mittels eines Detergens durchgeführten Solubilisierung der post-nuklearen Membranen, der Gradientenelution der an die Mono-Q Anionenaustauschsäule gebundenen Proteine und der Con A-Fraktionierung zusammen mit gp75 aufgereinigt. Das stimmt mit der erheblichen Homologie zwischen gp75 und menschlicher Tyrosinase überein. Auf der den mAb TA99 enthaltenden Affinitätssäule wurden gp75 und die Tyrosinhydroxylase-Aktivität jedoch getrennt. Bei Auftragung einer mit Desoxycholat solubilisierten, Con A-aufgereinigten SK- MEL-19-Fraktion auf eine den mAb TA99 enthaltende Affinitätssäule wurden ≥ 75% der Tyrosinhydroxylase-Aktivität im Ausfluß gewonnen, während die gp75-Aktivität vollständig fehlte (Tabelle IV). TABELLE IV - GEWINNUNG VON TYROSINHYDROXYLASE-AKTIVITÄT WÄHREND DER AUFREINIGUNG VON gp75
¹ Eine Einheit der Enzymaktivität ist die Proteinmenge, die zur Freisetzung von einem Mikromol ³H&sub2;O von ³H-Tyrosin während 1 h bei 37ºC erforderlich ist.
Obwohl eluiertes gp75 keine Tyrosinhydroxylase-Aktivität enthielt, ist es möglich, daß die Bedingungen zur Säulenelution die Enzymaktivität beseitigten. Diese Ergebnisse unterstützen die Schlußfolgerung, daß sich der größte Teil, wenn nicht die gesamte Tyrosinhydroxylase-Aktivität in melanocytischen Zellen in einem anderen Protein als gp75 befindet.
Das gp75-Antigen ist ein membrangebundenes Glycoprotein, das in pigmentierten menschlichen Melanocyten und Melanomen exprimiert wird und in nicht-pigmentierten Melanomen oder nicht-melanocytischen Zelltypen nicht nachgewiesen wird (Thomson, T. M., Mattes, J. M., Roux, L., Old, L J. und Uoyd, K. O., Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, 1. Invest. Dermat, 85 (1985), 169-174; Thomson, T. M., Real, F. X., Murakami, S., Cordon-Cardo, C., Old, L. J. und Houghton, A. N., Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermat., 90 (1988), 459- 466). Immunelektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, daß der mAb TA99 an die melanosomale Membran oder in der Nähe davon bindet (Thomson, T. M., Real, F. X., Murakami, S., Cordon-Cardo, C., Old, L. J. und Houghton, A. N., Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: analysis of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest. Dermat., 90 (1988), 459-466). Die intrazelluläre Lokalisation von gp75 in den Melanomzellen scheint zu bewirken, daß gp75 für das Immunsystem unzugänglich ist. In einem Melanom-Patienten sind jedoch gegen gp75 gerichtete IgG-Antikörper nachgewiesen worden (Mattes, J. M., Thomson, T. M., Old, L. J. und Lloyd, K. O., A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum, Int. J. Cancer, 32 (1983), 717-721). Was dies anbelangt, so erkennt der mAb TA99 das gleiche gp75-Antigen, das durch IgG-Antikörper des Melanom-Patienten präzipitiert wurde (Vijayasaradhi, S., Bouchard, B. B. und Houghton, A. N., The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Lkp. Med., 171 (1990), 1375-1380). Bei thymuslosen Mäusen blieb intravenös injizierter, radiomarkierter mAb TA99 wirksam auf Melanom-Transplantate beschränkt (Welt, S., Mattes, J. M., Grando, R., Thomson, T. M., Leonard, R. W., Zanzonico, P. B., Bigler, R. E., Yeh, S., Oettgen, H. F. und Old, L. J., Monoclorial antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplants in nu/nu mice, Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash.), 84 (1987), 4200-4204), was nahelegte, daß das gp75- Antigen für das Immunsystem verfügbar ist.
Das melanosomale Glycoprotein Tyrosinase wird von einem Gen codiert, das im Maus-c-(albino)-Locus kartiert wurde, während gp75 im b (brown)-Locus kartiert wurde. Tyrosinase und gp75 besitzen eine Reihe gemeinsamer Eigenschaften. Neben ähnlichen physikalischen Eigenschaften, wie bei der gemeinsamen Aufreinigung von gp75 und der Tyrosinase-Aktivität über mehrere Chromatographie-Schritte deutlich war, besitzen diese beiden Proteine auch molekulare Identität (43,1% auf der Aminosäure-Ebene und 55,3% auf der Nucleotid-Ebene) (Vijayasaradhi, S., Bouchard, B. B. und Houghton, A. N., The melanoma antigen gp75 is the human homologue of mouse b (brown) locus gene, J. Exp. Med., 171 (1990), 1375-1380; Cohen, T., Muller, R. M., Tomita, Y. und Shibahara, S., Nucleotide sequence of the cDNA encoding human tyrosinase-related protein, Nucl. Acids Res., 18 (1990), 2807).
Gegen Tyrosinase gerichtete Antikörper kreuzreagieren mit: Tyrosinase, dem Protein des b (brown)-Locus und möglicherweise einer Familie verwandter Proteine (Shibahara, S., Tomita, Y., Sakakura, T., Nagar, C., Chaudhuri, B. und Muller, R., Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucl. Acids Res., 14 (1986), 2413-2427; Jackson, I. J., A cDNA encoding tyrosinaserelated protein maps to the brown locus in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash.), 85 (1988), 4392-4396; Hearing, V. J. und Jimenez, M., Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level, Pigment Cell Res., 2 (1989), 75-85). Es war daher wichtig zu zeigen, daß sich das aufgereinigte gp75-Antigen von Tyrosinase unterscheidet. gp75 und die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurden. zusammen aufgereinigt, wobei jedoch der größte Teil der Tyrosinase- Enzymaktivität während der Aufreinigung mittels TA99- Affinitätschromatographie von gp75 getrennt werden konnte. Der größte Teil der gesamten zellulären Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde im Durchfluß einer den mAb TA99 enthaltenden Affinitätssäule gewonnen, was nahelegte, daß die Tyrosinhydroxylase-Aktivität von einem Molekül katalysiert wird, das sich von gp75 unterscheidet. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung ist die Tatsache, daß der mAb TA99 die Tyrosinhydroxylase-Aktivität nicht immunpräzipitiert oder vermindert (Tabelle IV; Thomson, T. M., Mattes, J. M., Roux, L., Old, L. J. und Lloyd, K. O., Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: definition with a mouse monoclonal antibody, J. Invest. Dermat., 85 (1985), 169-174). Jimenez, M., Malvoy, L. und Hearing, V. J., Specific identification of an authentic clone for mammalian tyrosinase, J. Biol. Chem., 264 (1989), 3397-3403, haben ant.i-Peptid-Antikörper gegen das Protein des Maus-b-Locus eingesetzt und haben die Vermutung geäußert, daß 15%-30% der Tyrosinase-Aktivität in Maus-Melanomzellen auf das b-Protein zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der Erfinder der vorliegenden Erfindung legen jedoch nahe, daß gp75 keine Tyrosinhydroxylase-Aktivität enthält. Die Möglichkeit, daß gp75 eine sehr schwache Tyrosinhydroxylase-Aktivität besitzt, auf die 5% der Enzymaktivität in pigmentierten Melanomzellen zurückzuführen sind, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.

Claims

1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das die Aminosäuresequenz eines gp75 codiert, das die Aminosäuresequenz asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-pro-thr-gly-lys-tyr-asp- pro-ala-val und met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu umfaßt.

2. Isoliertes cDNA-Molekül des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1.

3. Isoliertes cDNA-Molekül des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 2, das die Sequenz

5'GGA CCA GCT TTT CTC ACA TGG CAC AGG TAC CAC CTC CTG CGT CTG GAG AAA GAC ATG CAG GAA ATG TTG CAA GAG CCT TCT TTC TCC CTT CCT TAC TGG AAT TTT GCA ACG GGG AAA AAT GTC TGT GAT ATC TGC ACG GAT GAC TTG ATG GGA TCC AGA AGC AAC TTT GAT TCC ACT CTA ATA AGC CCA AAC TCT GTC TTT TCT CAA TGG CGA GTG GTC TGT GAC TCT TTG GAA GAT TAT GAT ACC CTG GGA ACA CTT TGT AAC AGC ACC GAG GAT GGG CCA ATT AGG AGA AAT CCA GCT GGA AAT GTG GCC AGA CCA ATG GTG CAA CGT CTT CCT GAA CCA CAG GAT GTC GCT CAG TGC TTG GAA GTT GGT TTA TTT GAC ACG CCT CCT TTT TAT TCC AAC TCT ACA AAC AGT TTC CGA AAC ACA GTG GAA GGT TAC AGT GAC CCC ACG GGA AAG TAT GAC CCT GCT GTT CGA AGT CTT CAC AAT TTG GCT CAT CTA TTC CTG AAT GGA ACA GGG GGA CAA ACC CAT TTG TCT TCC CAA GAT CCT ATT TTT GTC CTC CTG CAC ACC TTC ACA GAT GCA GTC III GAT GAA TGG CTA AGG AGA TAC AAT GCT GAT ATA TCC ACA TTT CCA TTG GAA AAT GCC CCT ATT GGA CAT AAT AGA CAA TAC AAC ATG GTG CCA TTC TGG CCC CCA GTC ACC AAC ACA GAA ATG III GTT ACT GCT CCA GAC AAC CTG GGA TAC ACT TAT GAA3'

umfaßt.

4. Polypeptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, die von dem isolierten cDNA- Molekül nach Anspruch 3 codiert wird.

5. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz, die für die Replikation essentiell ist, und das cDNA-Molekül nach Anspruch 2 oder 3 umfaßt.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Expressionsvektor ein Vacciniavirus ist.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Expressionsvektor ein Imclone- Vektor ist.

8. Vakzin, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 5, eine wirksame Menge eines Adjuvans und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

9. Impfstoff, umfassend ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz nach Anspruch 4 aufweist, eine wirksame Menge eines Adjuvans und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

10. Impfstoff nach Anspruch 8 oder 9, der ein Impfstoff für Menschen ist.

11. Impfstoff nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Polypeptid an das Adjuvans gebunden ist.

12. Verwendung des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 5 bis 7, oder eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz nach Anspruch 4 aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung oder Erhöhung der Produktion von Antikörpern in einem Individuum, die gegen ein gp75 gerichtet sind.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs oder zur Verzögerung des Wiederauftretens von Krebs verwendbar ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Krebs ein Melanom ist.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Polypeptid an das Adjuvans gebunden ist.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Kombination mit Cyclophosphamid, wobei das Cyclophosphamid dem Individuum vor der Verabreichung des Arzneimittels verabreicht werden kann.