JPH08500246A

JPH08500246A - 細胞増殖の阻害剤，その調製および用途

Info

Publication number: JPH08500246A
Application number: JP6505616A
Authority: JP
Inventors: アイグウィン、デイビッド; マーシオニ、マーク; エヌマックバーニー、ロバート
Original assignee: ケンブリッジニューロサイエンスインコーポレーテッド
Priority date: 1992-08-10
Filing date: 1993-08-10
Publication date: 1996-01-16
Also published as: AU693767B2; EP0656069A1; US5876973A; AU5002693A; KR950703064A; EP0656069A4; CA2142185A1; WO1994003644A1

Abstract

(57)【要約】細胞（とくにシュワン細胞）増殖の阻害に有益な多数のポリペプチド因子をコードするＤＮＡの特徴づけおよび精製が開示されている。これらの因子は神経腫瘍の治療に有益である。また、細胞増殖を阻害する剤としての用途を有してもよい新規なペプチドをコードするＤＮＡ配列も開示されている。疾患の治療における治療および診断の補助として用いるための既知のおよび新規なポリペプチドの合成、精製ならびに試験の方法も与えられている。また、かかるポリペプチドを抗体プローブの調製に用いるための方法も与えられている。かかるプローブは神経細胞およびグリア細胞に関する疾患において診断の、および治療の用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞増殖の阻害剤、その調製および用途発明の背景本発明は、種々の細胞型に対して抗増殖活性（antiproliferative activity）を有する、細胞増殖の阻害剤である化合物（compound）に関する。多くの脊椎動物の細胞型は増殖を調節する刺激物として拡散しうる（diffusib le）成長因子に応答する。多数のこれら成長因子およびそれらと同族の（cognat e）受容体が精製されており、またそれらをコードする遺伝子がクローン化され特徴付けがなされている（スポーン（Sporn）およびロバーツ（Robarts）編（19 91）ペプチド・グロース・ファクターズ・アンド・ゼア・レセプターズＩ・アンド・II（Peptide Growth Factors and their Receptors I and II）、スプリンガー−ベルラッツ（Springer-Verlaz）、ニューヨーク）。細胞増殖の疾患である多くの癌は、成長因子と受容体の相互作用の性質に影響を与える遺伝子の修飾（genetic modifications）に関係する。このような修飾の結果、受容体をもつ標的細胞における増殖が調節されることなく（unregulated）刺激されうる。加えて、神経系のある種の腫瘍は中枢および末梢神経系の両者からの細胞の増殖の調節に関係する。脊椎動物のグリア細胞は中枢および末梢神経系の特殊化された結合組織を構成する。重要なグリア細胞は、ニューロンへの代謝の支持（support）および特定の末梢ニューロンの軸索のまわりのミエリンの被覆（myelin shea thing）の両者を提供し、それによって個々の神経繊維が形成される、末梢シュワン細胞を含む。シュワン細胞はニューロンを支持し、ニューロン軸索の近傍周辺に同心性の膜の層を形成すること、その層が軸索周辺に発達（develop）するにつれてねじれることによって鞘効果を提供する。これらのミエリン鞘は多くの神経繊維の影響を受けやすいエレメント（susceptible element）である。シュワン細胞への損傷、または成長および発達の不全は、多数の末梢神経系疾患および障害の特徴である重大な脱髄化（demyelination）または神経の変性（degener ation）を伴いうる。神経系の発達において、細胞はその分裂および成長を調節する種々の因子を必要とすることが明らかになってきている。シュワン細胞の増殖および分化のいくつかの調節剤が同定されている。このような因子は末梢神経系の発達および再生（損傷に続いて）の両方において重要な役割を果たす。ブロックス（Brockes）ら（（１９８４）ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J. Neuroscience）４巻、７５〜８３頁）はウシ脳および下垂体組織からの抽出物に存在する、グリア成長因子（Grial Growth Factor）（ＧＧＦ）と名付けたタンパク質成長因子を記述している。この因子は１０％胎児子ウシ血清を含むバックグラウンド培地に抗して、培養されたラットシュワン細胞の分裂を刺激する。ＧＧＦは３１ＫＤの分子量を有し、容易に二量体を形成すると記述されている。ブロックス（（１９８７）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth.Enz.）１４７巻、２１７〜２２５頁）はシュワン細胞をベースにした３１ＫＤＧＧＦのための分析および逆相ＨＰＬＣを用いた精製を記述している。ブロックスらのジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、前出の文献には、見かけ上均質なＧＧＦへの精製法が記載されている。簡単にいえば手短かには、１つの記載された大規模の精製法には、凍結乾燥されたウシ前葉の抽出およびそれによってえられた材料のＣＭセルロースからのＮａＣｌ濃度勾配溶出を用いたクロマトグラフィーが含まれる。そののちウルトロゲル（Ultrogel）カラムを用いてゲル濾過が行なわれ、ついでホスホセルロースカラムからの溶出、さらに最後に小規模のＳＤＳゲル電気泳動が行なわれる。代わりになるべきものとしては、ＣＭ−セルロース材料を直接ホスホセルロースカラムに付し、そのカラムからの画分を集め、さらに予備的な未変性（ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動により精製し、最後にＳＤＳゲル電気泳動を行なった。ブロックス（（１９８０）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol. Chem.）２２５巻、８３７４〜８３７７頁）は、ゲル濾過実験において成長因子活性の主たるピークは５６ＫＤの分子量に移動することが観察され、一方前記の手順の第１段階で活性は分子量３１ＫＤに主に観察された。彼らはこの手順においてＣＭ−セルロースからの濃度勾配溶出の結果としてＧＧＦ二量体が大いに除去されると報告している。ベンベニステ（Benveniste）ら（（１９８５）ピー・エヌ・エー・エス（ＰＮＡＳ）８２巻、３９３０〜３９３４頁）は、Ｔリンパ球由来のグリア成長促進因子を記述している。この因子は還元条件下でＳＤＳゲル上の見かけの分子量における変化を呈する。キムラ（Kimura）ら（（１９９０）ネイチャー（Nature）３４８巻、２５７〜２６０頁）は、坐骨神経鞘腫瘍からえたシュワノーマ由来成長因子（ＳＤＧＦ）と名付けた因子を記述している。著者らは培養されたシュワン細胞内へのトリチウムで標識したＴｄＲの取り込みを、対照的にＧＧＦを含む部分精製した下垂体画分は活性である条件下でＳＤＧＦが刺激しないと述べている。デイビス（Davis）ら（（１９９０）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.Biol.）１１０巻、１３５３〜１３６０頁）は、多数のマイトジェン（ mitogen）の候補のスクリーニングを記述している。選ばれた候補物質はフォルスコリン（forskolin）存在および非存在において、１０％ＦＣＳ（胎児子ウシ血清）存在下でラットシュワン細胞におけるＤＮＡ合成の刺激能について実験されている。調べられた因子の１つ、ＧＧＦ−カルボキシメチルセルロース画分（ＧＧＦ−ＣＭ）はフォルスコリン存在および不存在において、ＦＣＳ存在下で分裂促進能を有した。フォルスコリン存在下で血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）はシュワン細胞に対する有力なマイトジェンであることが観察された。この発見より前には、ＰＤＧＦはシュワン細胞に対して分裂促進能を有すると思われていなかった。ホルムス（Holmes）ら（（１９９２）サイエンス（Science）２５６巻、１２０５頁）およびウェン（Wen）ら（（１９９２）セル（Ｃｅｌｌ）６９巻、５５９頁）は、受容体（ｐ１８５^erbB2）に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列がいくつかのヒト腫瘍に関連することを証明している。ｐ１８５^erbB2タンパク質はチロシンキナーゼ活性をもつ１８５キロダルトンの膜貫通タンパク質（membranespanning protein）である。該タンパク質はｅｒｂＢ２プロト−オンコジンによりコードされる（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびウーリッヒ（Ullrich）（１９８８）アニュル・レビュー・オブ・バイオケミストリ（Ann. Rev. Biochm.）５７巻、４４３頁）。ｅｒｂＢ２遺伝子（ＨＥＲ −２（ヒト細胞中）およびｎｅｕ（ラット細胞中）とも参照される）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する受容体と密接に関連している。最近の証明で、ｐ１８５^erbB2と相互作用する（かつｐ１８５^erbB2のキナーゼを活性化する）タンパク質がｐ１８５^erbB2をもつ細胞において増殖を誘導することが示されている（ホルムスら、（１９９２）サイエンス２５６巻、１２０５頁；ドバシ（Dobashi）ら（１９９１）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl.Acad.Sci.）８８巻、８５８２頁；およびルプ（Lupu）ら（１９９２）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス８９巻、２２８７頁）。ある受容体（たとえばｐ１８５^erbB2受容体）をもつ細胞の増殖を刺激するリガンドが同定されているが、これらの受容体部位で細胞増殖の阻害剤として働く因子を同定および単離する必要がある。このような阻害剤は細胞増殖障害（たとえば、新生物）を治療する目的で用いられうる。発明の要旨大きくは、本発明は神経系の細胞を含む、細胞の増殖阻害の方法を提供する。本発明の抗増殖因子は、タンパク質のＧＧＦ／ｐ１８５^erbB2 ファミリーをコードするＤＮＡの選択的スプライシング（alternative spl icing）産物およびそのフラグメントである。本発明はまた、グリア成長阻害因子をコードするＤＮＡ配列をも提供し、その配列はクローンｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１（ＡＴＣＣ寄託番号７５３４７）に含まれる。このクローンによりコードされるペプチドもまた本発明の一部である。本発明はさらにＥ配列（配列番号１３７および１６３）でコードされるペプチド、およびクローンｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１（ＡＴＣＣ寄託番号７５３４７）上のＥをコードする配列にフランキングする（flanking）脳由来のＤＮＡ配列によりコードされるペプチドの少なくとも一部からなるペプチドを含む。好ましくは、そのＥでコードされたポリペプチド配列はアミノ末端部で４８アミノ酸を欠失し、Ｅによりコードされたポリペプチドにフランキングする２０〜１００または、より好ましくは、２５〜７０のアミノ酸を含む。加うるに、Ｅでコードされたポリペプチドは、そのＥでコードされたセグメントのカルボキシ末端側で３０〜５０、または、より好ましくは、３５〜４５のアミノ酸によってフランキングされていてもよい。Ｅでコードされたポリペプチドにフランキングする配列は、クローンｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１（ＡＴＣＣ寄託番号７５３４７）に存在するＥ配列にフランキングするＤＮＡ配列によってコードされる。とくに、本発明はまた、ａ）式：ＶＹＢＡＺＷＸ（式中、ＶＹＢＡＺＷＸは図３１（配列番号１３６〜１３９、１４１〜１４７、１６０、１６１）に示すポリペプチドセグメントから構成される；式中ＶはＦを含むかまたは存在しない；式中ＹはポリペプチドセグメントＥを含むかまたは存在しない；式中ＺはポリペプチドセグメントＧを含むかまたは存在しない；式中ＷはＣを含むかまたは存在しない；および式中ＸはポリペプチドセグメントＣ／ＤＨＫＬ、Ｃ／ＤＨ、Ｃ／ＤＨＬ、Ｃ／ＤＤ、Ｃ／Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／Ｄ ′ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′ Ｈ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ ＨＫＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｈ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ、Ｃ／ＤＤ ′ Ｈ、Ｃ／ＤＤ′ＨＬ、Ｃ／ＤＤ′ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ Ｈ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＫＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ Ｈ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＬ、Ｈ、ＨＫ、ＨＫＬ、またはＣ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＫＬを含む）により定義されるポリペプチド；ｂ）図３１（配列番号１３６、１３８、１３９）に示すアミノ酸配列を有するＦＢＡポリペプチドセグメントからなるポリペプチド；ｃ）図３１（配列番号１３６、１３８、１４０、１６８）に示すアミノ酸配列を有するＦＢＡ′ポリペプチドセグメントからなるポリペプチド；ｄ）図３１（配列番号１３６〜１３９）に示すアミノ酸配列を有するＦＥＢＡポリペプチドセグメントからなるポリペプチド；もしくはｅ）図３１（配列番号１３６〜１３８、１４０、１６８）に示すポリペプチドセグメントに対応するアミノ酸配列を有するＦＥＢＡ′ポリペプチドセグメントからなるポリペプチド；ｆ）図３１（配列番号１３６、１３８、１４０、１６８）に示すポリペプチドセグメントに対応するアミノ酸配列を有するＥＢＡ′ポリペプチドセグメントからなるポリペプチド；もしくはｇ）Ｅ配列（配列番号１３７および１６３）の一部からなり、Ｆ、Ｂ、Ａ、Ｃ／Ｄ、Ｃ／Ｄ′、Ｄ、Ｄ′、ＨＫまたはＬに含まれずかつクローンｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１、ＡＴＣＣ寄託番号７５３４７に含まれる新しい配列によってフランキングされるポリペプチドと；またはグリア細胞（すなわち、中枢および末梢神経系の星状膠細胞、およびミクログリア細胞ならびに末梢神経系のシュワン細胞）に細胞を接触させることからなるインビトロまたはインビボの細胞増殖を阻害するための方法をも提供する。本発明はまた、神経系の細胞を含む細胞の増殖を阻害する方法をも提供し、細胞をその細胞型のｐ１８５^erbB2受容体に特異的に結合する化合物と接触させることからなる方法による。また含まれるのは、神経疾患または障害の治療または予防において前記ペプチドが投与されるばあいの前記ペプチドのいずれかの投与を含む方法である。さらに本発明に含まれるのは、細胞が哺乳動物内に存在し、該細胞を含む哺乳動物における病態生理学的状態の予防または治療のための哺乳動物への前記ペプチドの投与により細胞の接触が行なわれるばあいの、前記ペプチドのいずれかの投与の方法である。また含まれるのは、前記した方法の用途であって、ここで状態には腫瘍などの細胞増殖の疾患を含み、さらにとりわけ前記状態には神経系の腫瘍により惹き起こされる末梢神経損傷を含む。また本発明の一部は、存在するまたは再生された神経組織の有髄化増大を目的とした阻害因子の投与である。さらに本発明の一部として含まれるのは、細胞が哺乳動物内に存在し、以下の状態を含む状態の予防または治療のためにその哺乳動物に前記ペプチドを投与することにより細胞の接触が行なわれるばあいの、細胞への前記ペプチドのいずれかの投与からなる方法であり、シュワン細胞の腫瘍、たとえば神経繊維腫症；悪性神経鞘腫または神経繊維肉腫；髄膜腫；両側聴神経腫；星状細胞腫；網膜芽腫；神経膠腫；神経芽細胞腫；腺癌；または膠腫、哺乳動物に有効量の前に定義したポリペプチドを投与することからなる方法による。本発明はまた、前掲のポリペプチドから選択されたポリペプチドまたはそのフラグメントで哺乳動物を免疫すること、およびその動物の組織からまたはその組織を用いて作製されたハイブリドーマから抗体を精製することよりなる、ポリペプチドに特異的な抗体の製造法をも含む。さらに本発明は、前記ポリペプチドから選択されたポリペプチドに結合する受容体に結合しうる分子の存在を、サンプル中で、検出する、およびそのサンプルを受容体とともにポリペプチドと接触させ、該サンプル中の受容体結合分子の存在の指標として受容体に対するポリペプチドの結合の阻害を検出するための方法を提供する。本発明はまた、このような競合的阻害剤が受容体機能の拮抗剤かまたは作用剤のいずれであるかを決定するための方法をも提供する。かくして、本発明の方法において有用な因子は、（ａ）神経系の細胞とくにシュワン細胞を含む細胞と接触したばあいに抗増殖活性を有し、それらのアミノ酸配列の中に１またはそれより多くの以下のペプチド配列を含有するベーシックなポリペプチド因子（basic polypeptide fators）：ＦＫＧＤＡＨＴＥＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫＡＧＹＦＡＥＸＡＲＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡＡＫＥＡＬＡＡＬＫＦＶＬＱＡＫＫＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭＥＸＫＦＹＶＰＫＬＥＦＬＸＡＫ；ならびに（ｂ）神経系の細胞とくにシュワン細胞を含む細胞の分化を阻害することができ、それらのアミノ酸配列の中にそれぞれ、１またはそれより多くの以下のペプチド配列を含有するベーシックなポリペプチド因子；ＶＨＱＶＷＡＡＫＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧＬＧＡＷＧＰＡＦＰＶＸＹＷＦＶＶＩＥＧＫＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＱＲＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴＫＶＨＱＶＷＡＡＫＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫＤＬＬＬＸＶである。以下に詳細に記載した低分子量および高分子量ポリペプチド因子に由来した、前記したペプチド配列もまた、まぎれもなく本発明の１つの面である。これらの配列は、治療法として、大きいポリペプチド因子のためのプローブとして、ある範囲の異なる種からこのような因子（もしくは対応する遺伝子配列）を探索し、単離しまたは調製するために、あるいはこのような因子を組換え技術によって調製するために、ならびに探索ツールおよび可能性のある薬剤としてそれ自体有用な抗体（好ましくはモノクローナル）を従来の技術によって作製するうえで、潜在的に有用である。このような抗体は本発明の中に含まれる。本発明はまた、本発明のペプチド配列を用いてえられうる遺伝子配列でコードされる細胞増殖の阻害剤も含む。さらに本発明は、神経系の細胞を含む細胞の抗増殖活性を有し、かつ（ａ）図２８ａ、２８ｂまたは２８ｃ（それぞれ配列番号１３３〜１３５）のいずれかに示されるＤＮＡ配列；（ｂ）図２２（配列番号８９）に示されるＤＮＡ配列；（ｃ）図２８ａ（配列番号１３３）に示される配列のヌクレオチド２８１〜５５７で表わされるＤＮＡ配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかとハイブリダイズしうるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド因子の使用のための方法を含む。本発明はハイブリダイゼーション条件の特定のセットに限定されないが、以下のプロトコルは所望であれば追随されてもよい一般的なガイダンスを与える；たとえば、ニックトランスレーションによってまたはシュワルター（Schowalt er）およびソマ（Sommer）（（１９８９）アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）１７７巻、９０〜９４頁）にしたがうＰＣＲ反応によってＤＮＡプローブは高い特異的活性（およそ１０⁸〜１０⁹ｄｐｍ³²Ｐ／μｇ）まで標識され、さらにＧ１５０セファデックスカラムでの脱塩によって精製されてもよい。プローブは変性され（沸騰水中１０分、ついで氷水中に浸漬）、ついで１μ ｌあたり１０⁶ｄｐｍ³²Ｐで１０％デキストラン硫酸を含有する８０％緩衝液Ｂ（２ｇポリビニルピロリドン、２ｇフィコール−４００、２ｇウシ血清アルブミン、５０μｌ１ＭトリスＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５８ｇＮａＣＩ、１ｇピロリン酸ナトリウム、１０ｇドデシル硫酸ナトリウム、９５０μｌＨ₂Ｏ）のハイブリダイゼーション溶液に添加され、６０℃にて一晩（たとえば１６時間）インキュベートされてもよい。ついでフィルターは６０℃にてまず緩衝液Ｂ中１５分間、つぎに２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中２０分の洗浄を３回、ついで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中２０分間１回洗浄されてもよい。本発明の方法は、グリア成長因子とｐ１８５^erbB2リガンドタンパク質が同じ遺伝子によりコードされるという事実を利用する。種々のメッセンジャ−ＲＮＡスプライシング変異体（およびそれらの結果としてえられるタンパク質）がこの遺伝子に由来し、これらの産物の多くがｐ１８５^erbB2 結合を呈する。この結合の結果、細胞増殖または細胞分裂の休止を惹き起こすかもしれない。その遺伝子産物の少なくとも２つ（ＧＧＦＩおよびＧＧＦII）が、シュワン細胞の分裂促進活性を誘導するのに用いられている。本発明は細胞増殖の阻害剤として、さらにとりわけ、グリア細胞増殖の阻害剤としてＧＧＦ／ｐ１８５^erbB2リガンド遺伝子の知られている産物（前掲の引用文献に記載）のいくつかを使用する。本発明は他の、まだ天然で単離されていないグリア成長因子遺伝子のスプライシング変異体にも関する。図３０にポリメラーゼ連鎖反応実験（逆転写されたＲＮＡについて）およびｃＤＮＡクローンの分析（中に表されたとおり）に由来する、ならびにｐ１８５^erbB2リガンドをコードする配列として報告されているもの（ペレス（Peles）ら（１９９２）セル６９巻、２０５頁およびウェンら（１９９２）セル６９巻、５５９頁）に由来する知られているスプライシングのパターンを示す。本明細書中に開示された付加的なパターンは勿論、これらのパターンは、可能な存在するスプライシング変異体を表わす。かくして本発明の他の面は、シュワン細胞などの神経系の細胞の分裂の阻害を含む、細胞の抗増殖活性を有する一連のヒトおよびウシのポリペプチド因子の使用のための方法である。このようなペプチド配列を図３１〜３４（配列番号１３６〜１３７）にそれぞれ示す。前記した、図３１〜３４、配列番号１３６〜１３７でそれぞれ表わされる、ヒトのペプチド配列は、天然のソース（適切な組織から調製したｃＤＮＡライブラリー）から全長の相補的ＤＮＡ′Ｓ（ｃＤＮＡ′Ｓ）として単離されうるか、または当業者によって個々のエクソン（たとえば独立したエクソンとして派生するもの）を用いたＤＮＡ構築物として集められうる、一連のスプライシング変異体を表わす。他の化合物、とくにペプチドでｐ１８５^erbB2受容体に特異的に結合するものもまた、本発明にしたがってグリア細胞増殖の阻害剤として用いられうる。候補となる化合物は、ｐ１８５^erbB2結合について慣例的にスクリーニングされえ、さらに、それが結合すれば、本明細書に記載の方法を用いて細胞増殖の阻害についてスクリーニングされうる。本発明は述べられた阻害活性における重大な減少を呈さない、前記ポリペプチド因子のいかなる修飾物または等価物の使用も含む。たとえば、阻害活性に実質的に悪影響を及ぼすことなくアミノ酸含量または配列が変えられる修飾物が含まれる。図によって、ＥＰ−Ａ１０９７４８中の天然のタンパク質のムテイン体が開示され、ここでは生物学的活性に必要ではない元来の配列中のシステインのいずれかを中性アミノ酸（neutral amino acid）に置換することにより望ましくないジスルフィド結合の可能性が回避されている。本明細書中に含まれる効果および使用の言及はしたがって、本発明の一部であるとして前述したような修飾されたまたは等価である因子を用いるそのような用途および効果にしたがって解釈されるべきである。本発明において有用なペプチドは、制御配列の制御下にベクター内で作動可能なリーディングフレーム位置における前に定義したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を用いて、該構築物（好ましくは制御配列はたとえばＴｒｐなどの調節しうるプロモーターを含む）による好適な宿主細胞の形質転換ののちその細胞内で配列の発現を可能ならしめるよう組換えによってつくることができる−プロモーターおよび調節配列（あれば）の選択が通常の当該技術を有する者によって選択される問題であることは正しく認識されるであろう。本発明の因子は、許容しうる希釈剤、担体または賦形剤との組み合わせにより、および／または単位投与形態で医薬または獣医薬用途のために製剤化されうる。本発明の因子を用いる際、好適な製剤または組成物を提供するため通例の医薬または獣医薬の手法を使用してもよい。たとえば、本発明の製剤は非経口投与、たとえば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、心室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内、槽内、腹腔内、局所、鼻腔内、アエロゾル、乱切などの非経口投与、および経口、頬、直腸、膣投与にも適用されうる。本発明の製剤は、本発明のＤＮＡを発現する宿主細胞の患者への移植によってまたは本発明の製剤を放出する外科的インプラントの使用によって投与されてもよい。非経口製剤は液体溶液または懸濁液の形態でよく、経口投与のためには製剤は錠剤またはカプセル剤の形態でよく、また鼻腔内製剤のためには粉末、点鼻剤、またはエアロゾルの形態でよい。製剤をつくるための当該技術分野でよく知られた方法は、たとえば「レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（“Remington′s Pharmaceutica l Sciences”）」に見出される。非経口投与用製剤は、たとえば、賦形剤として滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化したナフタレンを含んでよく、生体適合しうる、生体分解しうる（biodegradable）ラクチドポリマー、もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを本発明の因子の放出を制御するために用いてもよい。前記因子のための他の潜在的に有用なデリバリーシステムにはエチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透性ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は、賦形剤としてたとえば、ラクトースを含有してよく、またはたとえばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する水溶液でもよく、または点鼻剤の形態での投与用の、もしくは鼻腔内に適用されるべきゲルとして油性溶液でもよい。非経口投与用製剤にはまた、頬投与用にグリココレート（glycocholate）、直腸投与用にメトキシサリチレート、もしくは腟投与用にクエン酸を含んでもよい。本発明の因子は唯一の活性薬剤として用いられえ、または他の活性成分とともに組合わせて用いられることができる。本発明の製剤中の本因子の濃度は、投与すべき薬量、および投与の経路を含めた数多くの点に依存して変化するであろう。通常は、本発明の因子は非経口投与用に約０．１〜１０％ｗ／ｖの化合物を含有する水性生理的緩衝液の形で提供されてもよい。通常の投与量（dose）は１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、好ましい投与量の範囲は１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与されるべき好ましい投与量は指向される病態生理学的状態の進行の度合および型、患者の全身的な健康、製剤の構成（make up）、および投与の経路に依存する傾向にある。前に示したように、細胞増殖、とくにシュワン細胞（末梢神経系のグリア細胞）および神経系の他の細胞の増殖は、本発明の因子の存在下で阻害される。グリア細胞の種々の腫瘍があり、そのうちもっとも一般的なのはおそらくは神経繊維腫症であり、これはグリア細胞の過成長（overgrowth）によってつくり出されるパッチ状の小さい腫瘍である。また、極めてＧＧＦに似た活性がいくつかのシュワン細胞腫瘍に見出されうることがわかっている（ブロックスら、アニュル・ニューロロジー（Ann. Neurol.）２０巻、３１７頁（１９８６））。それゆえそれらの受容体へのＧＧＦ作用の阻害剤が、グリア腫瘍の治療を提供する。この治療は前に定義した刺激因子の、その受容体への結合を阻害する物質の有効量を投与することを含む。加えて、ＧＧＦ受容体の増幅がヒト腺癌（クラウス（Kr aus）ら、（１９８７）エンボ・ジャーナル（EMBO J.）６巻、６０５頁、スラモン（Slamon）ら、（１９８７）サイエンス２３５巻１７７頁、バーレイ（Varley ）ら（１９８７）オンコジン（Oncogene）１巻、４２３頁、およびバン・デ・ビシュバ（van de Vijver）ら（１９８７）モレキュラー・セル・バイオロジー７巻、２０１９頁）ならびに乳房および卵巣の腫瘍（スラモンら、前出、バーレイら、前出、ベンター（Venter）ら（１９８７）ランセット（Lancet）ｉｉ巻、６７頁、ゾウ（Zhou）ら（１９８７）キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）４７巻、６１２３頁、バーガー（Berger）ら（１９８８）キャンサー・リサーチ４８巻、１２３８頁、ツダ（Tsuda）ら（１９８９）キャンサー・リサーチ４９巻、３１０４頁、スラモンら（１９８９）サイエンス２４４巻、７０７頁）に関連するなら、類似の治療のアプローチが腺癌ならびに乳房および卵巣組織の腫瘍にも採用されてよい。通例、本発明は因子−感受性または因子−応答性細胞型が関係する病態生理学的状態のいずれかの予防または治療における本発明のポリペプチド因子の使用を含む。本発明のポリペプチド因子はまた、標準技術にしたがってモノクローナル抗体などの抗体をつくるための免疫源としても用いられうる。このような抗体は本発明の中に含まれる。これら抗体は治療または診断目的のために用いることができる。したがって、因子の異常なレベルに関連する状態が、このような抗体を用いることで探知されるかもしれない。標準法を用いた単離されたサンプルのアッセイを使用して、イン・ビトロ技術が用いられうる。抗体が、たとえば腫瘍イメージングなどの当該技術分野において使用されている技術を用いて、体外から遠隔操作によってイメージされうる放射活性同位体で標識をつけられるイメージング法もまた使用されうる。前記のようにこのような抗体は治療目的のために用いられてもよい。本発明のポリペプチド因子に対して生じた抗−イディオタイプ抗体、またはそれらの同族の受容体に対して生じたイディオタイプ抗体が、ＧＧＦ／ｅｒｂＢ２リガンドで誘導されるｐ１８５をもつ細胞の増殖の拮抗剤として用いられうる。本発明はまた、イン・ビボまたはイン・ビトロでの細胞増殖の阻害剤としての本発明の因子の通常の使用、およびこのような使用のための方法をも含む。かくして１の実施態様は、有効量の本発明の因子を投与することにより脊椎動物において腫瘍細胞抗増殖効果をつくり出すための方法である。このような方法の例は、神経系腫瘍または他の組織の腫瘍の治療または予防である。本発明のさらなる通例の１つの面は、薬剤に製造における本発明の因子の使用、好ましくは神経疾患または障害の治療への使用である。さらに本発明に含まれるのは、該ポリペプチドの受容体結合特性に対応する、受容体結合特性を有する分子を同定または定量するための競合的アッセイにおける、本発明の因子の用途である。ポリペプチドは放射性同位体で随意に標識されてもよく、これらの標識された産物は受容体結合が存在するかどうか決定するために用いられてもよい。競合的アッセイにより、関連性のある受容体の拮抗剤および作用剤の両者を同定することができる。バイオアッセイにおける既知の作用剤と拮抗剤（受容体結合が示される）間の受容体結合に対するいかなる競合も、拮抗剤濃度の増大にともなう生物学的活性の減少に反映されるであろう。他の面において、本発明はそれぞれの対応する受容体の分離のための、アフィニティー単離プロセス、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにおける因子の用途を提供する。特定のタンパク質に対応する受容体の単離のためのこのようなプロセスは、当該技術分野において知られており、多数の技術が利用でき、本発明の因子に適用されうる。たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−ガンマに関連しては、読者はノビック（Novick）ら（（１９９０）ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromatogr.）５１０巻、３３１〜７頁）を参照され、ゴナドトロピン放出ホルモンに関連してはハズム（Hazum）（（１９９０）ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. Chromatogr.）５１０巻、２３３〜８頁）を参照、Ｇ−ＣＳＦに関連してはフクナガ（Fukunaga）ら、（（１９９０）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６５巻、１３３８６〜１３３９０頁）を参照、ＩＬ−２に関連してはスマ-ト（Smart）ら（（１９９０）ジャーナル・オブ・インベスティゲーティブ・ダーマトロジー（J. Invest. Dermatol.）９４巻。１５８Ｓ〜１６３Ｓ頁）を参照、ならびにヒトＩＦＮ−ガンマに関連してはステファノス（Stefanos）ら（（１９８９）ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（J. Interferon Res.）９巻、７１９〜３０頁）を参照されたい。以下の実施例は発明を限定することは意図せず、発明を説明し有効な調製技術のための特定の指針を提供することを意図する。実施例１〜４は精製およびその結果として可能なＧＧＦをコードするウシのＤＮＡ配列のクローニングを教示する。実施例５および７はＧＧＦをコードするヒトＤＮＡ配列の単離を明示する。実施例８および９はスプライシング変異体の単離を明示する。実施例１０および１１は特異的な抗増殖変異体およびそれらの機能の例を示す。実施例１２および１３は抗増殖分子の産生および試験を明示する。図面の簡単な説明まず図面について説明する。図面図１〜８は後記の実施例１に関連し、以下に簡単に説明する：図１はカルボキシメチルセルロースクロマトグラフィーからの産物についてのプロファイルである；図２はヒドロキシアパタイトＨＰＬＣからの産物についてのプロファイルである；図３はモノＳＦＰＬＣからの産物についてのプロファイルである；図４はゲル濾過ＦＰＬＣからの産物についてのプロファイルである；図５および６は逆相ＨＰＬＣからの２つの部分精製されたポリペプチド産物を示す；ならびに図７および図８は胎児子ウシ血清または胎児子ウシ血漿のバックグラウンドのいずれかを用いた逆相ＨＰＬＣからのＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIについての用量応答曲線を示す；図９〜１２はＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II由来のペプチド（配列番号１〜５３および１６９）（後記の実施例２参照）を示し、図１０および図１２はとくに新規な配列を示す：図１０、パネルＡに、変性オリゴヌクレオチドプローブおよび変性ＰＣＲプライマーを設計するために用いられたＧＧＦ−Ｉぺプチドの配列を列挙する（配列番号２０〜３０）。パネルＡのそれらの配列のうちのいくつかは合成ペプチドを設計するためにも用いられた。パネルＢは変性プローブまたは変性ＰＣＲプライマーの設計のためには短すぎた（６アミノ酸より少ない）新規なペプチド（配列番号３１および５２）を示す；図１２、パネルＡに、変性オリゴヌクレオチドプローブおよび変性ＰＣＲプライマーを設計するために用いられたＧＧＦ−IIペプチドの配列を列挙する（配列番号４５〜５２）。パネルＡのこれらの配列のうちのいくつかも合成ペプチドを設計するために用いられた。パネルＢは変性プローブまたは変性ＰＣＲプライマーの設計のためには短すぎた（６アミノ酸より少ない）新規なペプチド（配列番号５３）を示す；図１３〜２０は後記の実施例３に関連し、本発明に関連する因子の分裂促進活性の種々の観点を示す；図２１〜２８（ａ、ｂおよびｃ）は後記の実施例４に関連し、以下に簡単に説明する：図２１は図１０、パネルＡおよび図１２、パネルＡに列挙した新規なペプチド配列から設計された変性オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５４〜８８）を列挙する；図２２（配列番号８９）は組換えウシゲノムファージＧＧＦ２ＢＧ１からの推定される（putative）一続きのウシＧＧＦ−II遺伝子配列を示し、これは変性オリゴヌクレオチドプローブ６０９および６５０（図２１、それぞれ配列番号６９および７２）の結合部位を含む。示したのは第３リーディングフレーム内のＤＮＡ配列のコーディングストランドおよび推定された（deduced）アミノ酸配列である。ＧＧＦ−２からのぺプチド１２の配列（ボールド（bold）で示す）は、６６アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド７５２７２）の一部である；図２３は変性ＰＣＲプライマー（パネルＡ、配列番号９０〜１０８）および下垂体前葉からのＲＮＡ中に存在するウシＧＧＦ−IIをコードする配列のセグメントを単離するための実験において用いられた独自なＰＣＲプライマー（パネルＢ、配列番号１０９〜１１９）を列挙する；図２４に、図７、パネルＡおよびＢ中のプライマーのリストを用いた下垂体前葉からのＲＮＡについてのＰＣＲ増幅実験でえられた９個の別個の隣接する（co ntiguous）ウシＧＧＦ−IIｃＤＮＡ構造および配列を要約する。図の上に付した線は特徴付けがなされたｃＤＮＡ構造に寄与するエクソン配列の図解を示す；図２５はウシ組換えファージＧＧＦ２ＢＧ１の物理的地図（physical map）である。ウシＤＮＡフラグメントはおおよそ２０ｋｂの長さでウシＧＧＦII遺伝子の２つのエクソン（ボールド）を含む。酵素Ｘｂａｌ、ＳＰｅｌ、Ｎｄｅｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎｌ、およびＳｓｔＩに対する制限部位をこの物理的地図に記している。影を付した部分は配列決定のためにサブクローン化されたフラグメントに対応する；図２６は推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の３つの副遺伝子産物（alternative gene products）の構造を図式的に示す。エクソンはＡからＥまでそれらの発見の順に列挙する。選択的スプライシングパターン１、２および３は、３つのオーバーラップする推定されたタンパク質構造（ＧＧＦ２ＢＰＰ１、２、および３）をつくり、それらを種々の図２８に表わす；図２７では、図１０および図１２に列挙された新規なペプチド配列をもつ、図２８ａ、図２８ｂおよび図２８ｃに示す推定されたタンパク質の配列（配列番号１２０〜１３２）において同定されるＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II配列を比較する。９つの新規なＧＧＦ−IIペプチド配列のうち６つがこれら推定されたタンパク質の配列に対すると考えられる。ＧＧＦ−Ｉ配列と類似の２つのペプチド配列もまた見出された；図２８ａは図２６に示すスプライシングパターン番号１からえられるｃＤＮＡ（配列番号１３３）のコーディングストランドＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を示す。この推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の部分的なｃＤＮＡは、２０６アミノ酸長のタンパク質をコードする。ボールドで示すペプチドは図１０および図１２に示すリストから同定されたものである。潜在的なグリコシル化部位に下線を付す（ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに加えて）；図２８ｂは図２６に示すスプライシングパターン番号２からえられるｃＤＮＡ（配列番号１３４）のコーディングストランドＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を示す。この推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の部分的なｃＤＮＡは、２８１アミノ酸長のタンパク質をコードする。ボールドで示すペプチドは図１０および図１２に示すリストから同定されたものである。潜在的なグリコシル化部位に下線を付す（ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに加えて）；図２８ｃは図２６に示すスプライシングパターン番号３からえられるｃＤＮＡ（配列番号１３５）のコーディングストランドＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を示す。この推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の部分的なｃＤＮＡは、２５７アミノ酸長のタンパク質をコードする。ボールドで示すペプチドは図１０および図１２に示すリストから同定されたものである。潜在的なグリコシル化部位に下線を付す（ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに加えて）；また図２８ａ、図２８ｂおよび図２８ｃに示すＤＮＡ配列はそれ自体本発明のさらなる１つの面である；または本発明はさらに該配列によりコードされるポリペプチドを含む；図２９は後記の実施例７に関連し、サザンブロット上での種々の哺乳動物ＤＮＡへの推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子配列の交差ハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムを示す。フィルターは図に列挙する種からのＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡ（レーンあたり５Ｍｇ）のレーンを含む。図２５中の物理的地図により予想されるようにウシＤＮＡ中の４ｋｂフラグメントを含めて、プローブは各ＤＮＡサンプル中に強い単一バンドを検出する。比較的小さい強度のバンドもまた観察され、これらは関連するＤＮＡ配列を示しうる。他の哺乳動物ＤＮＡサンプルのそれぞれからの強くハイブリダイズするバンドは、おそらくはこれらの種のＧＧＦ−II相同物を示す。後記の実施例１において、他に示さない限りすべての操作は４０℃にて行なわれ、図１〜６に関しては、各段階での活性は以下の修飾を加えてブロックス（メソッズ・イン・エンザイモロジー、前出）の技術を用いて決定した。すなわち、シュワン細胞調製に際し、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＦＣＳおよびＧＧＦに加えて５μＭのフォルスコリンが添加された。アッセイに用いた細胞は、線維芽細胞を含まない１０より少ない継代数のシュワン細胞で、これら細胞はトリプシンを用いてフラスコから剥がし、マイクロウェルあたり３３００細胞で平底の９６穴プレートに撒いた。試験溶液添加ののち最後の２４時間、¹²⁵ＩＩＵｄＲを添加した。各アッセイへのバックグラウンド（刺激されない）取り込みは１００ｃｐｍより少なく、また最高の取り込みはシュワン細胞のバッチ番号および継代数に応じてバックグラウンドを２０〜２００倍超えていた。実施例１で後記するように逆相ＨＰＬＣからのＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II画分のばあい、また各因子に対して２つの用量応答曲線をつくり、ここで各因子に対して曲線のうち１つには正確に前記の方法を用い、また各因子に対するもう一方の曲線をうるためにはアッセイ手順において胎児子ウシ血漿を胎児子ウシ血清の代わりに用いることによりのみ変更した前記の方法を用いた。結果を図７および図８に示す。図３０は代表的なスプライシング変異体の図式的なダイアグラムである。コーディングセグメントはＦ、Ｅ、Ｂ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｃ／Ｄ、Ｃ／Ｄ′、Ｄ、Ｄ′、Ｈ、ＫおよびＬで示される。精製されたタンパク質に由来したペプチド配列の位置を「○」によって示す。図３１（配列番号１３６〜１４７、１６０、１６１および１６８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列のリストである。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ（matches）を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＫはウシの配列のみを示す。ＥおよびＡ′の両方に対するヒトとウシのコーディングセグメントが提供される。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。図３２は、ＢＰＰ５の予測されるＧＧＦ２アミノ酸配列およびヌクレオチド配列である（配列番号１４８）。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。図３３は、ＧＧＦ２ＢＰＰ２の予測されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である（配列番号１４９）。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。図３４は、ＧＧＦ２ＢＰＰ４の予測されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。図３５（配列番号１５１〜１５２）は、２つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧＦ２ｂｐｐ４およびＧＧＦ２ｂｐｐ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）ペプチド配列とのアラインメントを記す。星印は保存されたシステインの位置を示す。図３６は、ＧＧＦの量の増大に応じたＧＧＦ活性（シュワン細胞分裂促進能アッセイ）および約２００ｋＤタンパク質のチロシンリン酸化（抗ホスホチロシンポリクローナル抗体とともに展開されたウェスタンブロットのオートラジオグラム上での２００ｋＤのバンドの強度）のレベルを記す。図３７は、図３１に示す配列に由来するスプライシング変異体のリストである。図３８は、クローンのスケールコーディングセグメント地図である。Ｔ３はクローンからｍＲＮＡをつくるために用いられたバクテリオファージプロモーターのことである。Ｒ＝フランキングするＥｃｏＲＩ制限酵素部位。５′ＵＴは５′ 非翻訳領域のことである。Ｅ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｃ／Ｄ′およびＤはコーディングセグメントのことである。Ｏ＝翻訳開始部位。Λ＝ウシＥセグメントと相同な領域の５′限界（実施例６参照）また３′ＵＴは３′非翻訳領域のことである。図３９は、ＥＧＦＬ１の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５４）。図４０は、ＥＧＦＬ２の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５５）。図４１は、ＥＧＦＬ３の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５６）。図４２は、ＥＧＦＬ４の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５７）。図４３は、ＥＧＦＬ５の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５８）。図４４は、ＥＧＦＬ６の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５９）。図４５は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５の予測されるアミノ酸配列（中部）およびヌクレオチド配列（上部）である（配列番号１６７）。下部（間欠（intermittent）配列）は、ＧＧＦII調製物に由来したペプチド配列を表わす（図１１、１２参照）。詳細な説明本発明は、細胞、とくに神経およびグリアの細胞増殖の阻害剤である新規な因子の用途、ならびにこれらの因子をコードするＤＮＡ配列の使用のための方法に関する。開示されるのは、細胞分裂の阻害剤をコードしうるこれらの因子の数種の遺伝子スプライシング変異体である。ホルムスら（（１９９２）サイエンス２５６巻、１２０５頁）およびウェンら（（１９９２）セル６９巻、５５９頁）はいくつかのヒト腫瘍に関連する受容体（ｐ１８５）に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＧＧＦのＤＮＡ配列と大いに相同性を分担することを明らかにしている。これは、ウシＧＧＦ類とヒトおよびラットｐ１８５^erbB2リガンドが同じ（相同の）遺伝子によってコードされること、ならびにリガンドグループがいずれも同じ受容体（ｐ１８５^erbB2）と相互作用することを示す証拠を提供する。ｐ１８５^erebB2タンパク質は、チロシンキナーゼ活性をもつ１８５キロダルトンの膜貫通タンパク質である。タンパク質はｅｒｂＢ２プロト−オンコジンによりコードされる（ヤーデンおよびウーリッヒ、（１９８８）マニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー５７巻、４４３頁）。ｅｒｂＢ２遺伝子はＨＥＲ −２（ヒト細胞中）およびｎｅｕ（ラット細胞中）とも称され、上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する受容体と密接に関係している。最近の証拠により、ｐ１８５^er ^bB2 と相互作用する（およびｐ１８５^erbB2のキナーゼを活性化する）タンパク質がｐ１８５^erbB2をもつ細胞において増殖を誘導することが示されている（ホルムスら（１９９２）サイエンス２５６巻、１２０５頁；ドバシら（１９９１）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス８８巻、８５８２頁；ルプら（１９９２）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス８９巻、２２８７頁）。この証拠は、ＧＧＦ′Ｓをコードする遺伝子およびｐ１８５^erbB2結合タンパク質が、神経細胞、とくにシュワン細胞、およびヒト腺癌ならびに他の癌を起こす細胞の両方を標的とする、多価発現性（pleiotrophic）効果を有する成長因子のファミリーの産生を請け負うものであるという結論を支持する。さらに、ＧＧＦおよびｐ１８５^erbB2結合タンパク質をコードする遺伝子が、異なる長さでかついくつかの共通ペプチド配列およびいくつかの独自なペプチド配列である一連のタンパク質を生じる、数多くの様々なサイズとなり差が生ずるように（differentially）スプライスされたＲＮＡ転写産物を産生する。これは、差が生ずるようにスプライスされた配列がウシ下垂体前葉ＲＮＡ（ここで提示されたように）、およびヒト乳がん細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）ＲＮＡ（ホルムスら（１９９２）サイエンス２５６巻、１２０５頁）から回収しうるという証拠により支持される。この「１遺伝子：多様産物（“one gene:multiple prod uct”）」の結論に対するさらなる支持は、シュワン細胞に対するマイトジェン（本明細書に開示されるように）およびｐ１８５^rbB2受容体に対するリガンド（以下を参照）の両方として作用するタンパク質の広いサイズ範囲から導き出される。ＧＧＦとｐ１８５^erbB2受容体リガンドをコードする遺伝子が相同であるという事実を支持するさらなる証拠は、ヌクレオチド配列の比較から帰着する。ホルムスら（（１９９２）サイエンス、２５６巻、１２０５〜１２１０頁）は、ｐ１８５^erbB2受容体と特異的に相互作用する４５キロダルトンのヒトタンパク質（ヘレグリン（heregulin））の精製を明らかにしている。これらのヒトＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの予測される配列は、グリア成長因子の配列から予測される配列と密接にマッチする。ペレス（Peles）ら（（１９９２）セル６９巻、２０５頁）およびウェンら（（１９９２）セル６９巻、５５９頁）は、ホルムスらが記載したヘレグリン配列と相同性を分担するｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）と呼ばれるタンパク質をコードする、ラット細胞から単離された相補ＤＮＡを記載している。加えて、そのＮＤＦｃＤＮＡの翻訳産物はｐ１８５^erbB2結合活性を有する。種々の他のグループが、ｅｒｂＢ２結合活性をもつ種々の分子量のタンパク質の精製を報告している。これらのグループは、ルプら（（１９９２）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー８９巻、２２８７頁）、ヤーデンおよびペレス（（１９９１）バイオケミストリー（Biochemistry）３０巻、３５４３頁）、ルプら（（１９９０）サイエンス２４９巻、１５５２頁）、およびドバシら（（１９９１）バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシヨン（Biochem. Biophys. Res.Comm.）１７９頁、１５３６頁）を含む。ｐ１８５^erbB2オンコジーンおよび推論による、その同族リガンドは、数種の型の腫瘍の発達および維持に重大な役割を果たすことが確認されている。ｅｒｂＢ２の増幅および過発現は、数種の組織からのヒト腺癌に伴なわれている（クラウスら（１９８７）エンボ・ジャーナル６巻、６０５頁；スラモンら（１９８７）サイエンス２３５巻、１７７頁；バーレイら（１９８７）オンコジーン１巻、４２３頁；およびバン・デ・ビシュバら（１９８７）モレキュラー・セル・バイオロジー７巻、２０１９頁）。乳房および卵巣の癌との関連もまた報告されている（スラモンら、前出；バーレイら、前出；ベンタら（１９８７）ランセットii 巻、６７頁；ゾウら（１９８７）キャンサー・リサーチ４７巻、６１２３頁；バーガーら（１９８８）キャンサー・リサーチ４８巻、１２３８頁；ツダら（１９８９）キャンサー・リサーチ４９巻、３１０４頁、スラモンら（１９８９）サイエンス２４４巻、７０７頁）。ｅｒｂＢ２遺伝子がシュワン細胞系列（lineage）の細胞の腫瘍形成において役割を果たす証拠もある（ペラントニ（Perantoni）ら（１９８７）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス８４巻、６３１７頁；ニキチン（Nikitin）ら（１９９１）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス８８巻、９９３９頁）。数種の腫瘍型はシュワン細胞の異常増殖の結果であり、これらには神経繊維腫、および悪性神経鞘腫ならびに神経繊維肉腫が含まれる。ｅｒｂＢ２受容体に対するリガンドの候補として、ＧＧＦ類は前記腫瘍の発達において重大な役割を果たしうるであろう。以上概説したように、ＧＧＦ類およびｐ１８５^erbB2リガンドをコードする遺伝子は多種のタンパク質をコードする数多くの変異体転写物を生ずる。これらの変異体タンパク質の数種は、前記腫瘍細胞系上のｐ１８５^erbB2受容体とはもちろんのこと、シュワン細胞（本明細書中に開示）を含む神経細胞上のｐ１８５^er ^bB2 受容体に結合する。これら変異体タンパク質のいくつかは、シュワン細胞においておよび腫瘍細胞系（本明細書中に開示）において細胞増殖を活性化する。他の変異体はおそらく、ｐ１８５^erbB2受容体上の結合部位に対してそれらのリガンドと競合することにより増殖を剌激するリガンドの活性を妨げるかもしれない。チャン（Chan）ら（（１９９１）サイエンス２５４巻、１３８２頁）は、天然に生じている肝細胞成長因子（ＨＧＦ）変異体は、同じ遺伝子によってコードされる全長の分子としてより小さい転写産物に由来することを示した。変異体転写産物によりコードされる切除された（truncated）タンパク質は、ＨＧＦで誘導される分裂促進誘発を特異的に阻害し、ＨＧＦ受容体への結合に対してＨＧＦと競合することが明らかにされた。ＨＧＦ受容体はｃ−ｍｅｔプロト−オンコジーン産物として同定されている。このように、成長因子タンパク質のこれらの変異体バージョンは、細胞増殖の制御において重大な調節の役割を果たすかもしれない。グリアの増殖を阻害するＧＧＦ関連因子は、神経系の腫瘍の治療用の抗増殖化合物として治療上有用であろう。シュワン細胞および乏突起膠細胞（oligodendrocytes）による有髄化は増殖状態により調節されることが示されている（ジェセン（Jessen）ら、１９９１アニュル・エヌワイ・アカド・サイエンス（Ann NY Acad Science）６３３巻、７８〜８９頁）。細胞が増殖サイクルから抜ける（withdraw）際、有髄化プロセスが始まるようである。シュワン細胞および乏突起膠細胞が増殖細胞サイクルを出て休止状態に入ることを誘導する本発明の因子は、脱髄化の疾患または障害をもっている哺乳動物において、存在しているまたは新しく再生される神経組織の有髄化を増大するために投与されてもよい。突然変異誘発の阻害剤を用いて治療されうる疾患および障害の例には、シャロット−マリー−トゥース（Charot-Marie-T ooth）病（とくにＩ型およびIII型）、腓骨筋委縮、デジェリン−ソッタ（Dejerine-Sottos）病（III型遺伝性運動性および知覚性神経病）、多発性硬化症、慢性炎症性脱髄化多発性神経根神経病、慢性肝疾患、ジフテリア性多発性神経炎、ギランバレー症候群、甲状腺機能不全多発性神経病、異染性大脳白質委縮症（metachromatic leukodystrophy）、Ｉ型遺伝性運動性および知覚性神経病、III型遺伝性運動性および知覚性神経病、ならびに脈管炎神経病が含まれる。実施例１Ｉ．因子−ＣＭ画分の調製４，０００の凍結した全ウシ脳下垂体（約１２ｋｇ）を一晩解凍し、簡単に水で洗浄したのちに、等量の０．１５Ｍ硫酸アンモニウムでウェアリングブレンダー（Waring Blender）中バッチ式でホモジナイズした。ホモジネートを１．０ＭＨＣｌでｐＨ４．５とし、４，９００ｇ、８０分間遠心分離した。上清をガラスウールに通過させることにより上清のあらゆる脂肪物質（fatty material）を除去した。上清のｐＨを１．０ＭＮａＯＨを用いて６．５としたのちに、固体の硫酸アンモニウムを加えて３６％飽和溶液をえた。数時間撹拌したのち、懸濁液を４，９００ｇ、８０分間遠心分離し、沈殿物を廃棄した。ガラスウールによるろ過ののち、さらなる固体の硫酸アンモニウムを上清に加え、７５％飽和溶液をえた。この溶液を数時間撹拌したのち、もう一度４，９００ｇ、８０分間遠心分離した。ペレットを約２Ｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０に再度懸濁し、４０Ｌの同一の緩衝液で３回透析した。透析物の導伝率が２０．０μジーメンスより下であることを確認したのち、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ−５２、ワットマン）が充填されたバイオプロセスカラム（Bioprocess column）（１２０×１１３ｍｍ、ファルマシア）に流速２μｌ／分で付した。このカラムを２倍量の０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０で洗浄し、続いて２倍量の５０ｍＭＮａＣｌ、そして最終的に２倍量の０．２ＭＮａＣｌ、両者とも同一の緩衝液中で、洗浄した。最後の工程で１０μＬ（５分）の画分を集めた。画分７３〜１１８の内容物（inclusive）をプールし、１０倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０に対して２回透析し、１００，０００ｇ、６０分間遠心分離することにより不純物を除去した。II．ヒドロキシアパタイトＨＰＬＣヒドロキシアパタイトＨＰＬＣは、これまではグリア成長因子の単離に用いられる技術ではなかったが、本発明ではとくに効果的であることが証明された。前記ＣＭ−セルロースクロマトグラフィーからえられる物質を０．２２μｍのフィルター（ナルゲン（nalgene））に通してろ過し、ガードカラム（１５×２５ｍｍ、バイオラッド）を備えた高性能ヒドロキシアパタイトカラム（５０×５０ｍｍ、バイオラッド）に室温で付し、１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０で平衡化した。以下のプログラム化された線形勾配を用いて、流速２μｌ／分、室温で溶出を行なった：勾配溶出の際に６．０μＬ（３分）の画分を集めた。画分３９〜４５をプールし、１０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０に対して透析した。III．モノＳＦＰＬＣモノＳＦＰＬＣにより、のちのゲルろ過のためにさらなる濃縮物質を調製することができた。のちに、室温で流速１．０μＬ／分、５０ＭＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０に再平衡化される予備のＨＲ１０／１０モノＳ陽イオン交換カラム（１００× １０ｍｍ、ファルマシア）に付す前に、１００，０００ｇ、６０分間の不純物を除去するスピンにより、ヒドロキシアパタイトカラムからプールされた物質中のあらゆる粒子状物質を除去した。これらの条件下、以下のプログラム化された線形勾配を用いて結合されたタンパク質を溶出した：この勾配プログラムを通じて１μＬ（１分）の画分を集めた。画分９９〜１１５の内容物をプールした。IV．ゲルろ過ＦＰＬＣこの工程では、濃縮画分を産生する最終精製の前に、本発明の２つの因子の分離を開始した。この工程の目的のために、製造業者の指示にしたがって予備のスーパーロース（Superose）１２ＦＰＬＣカラム（５１０×２０ｍｍ、ファルマシア）を充填した。このカラムを標準化するために、製造者の指示にしたがって理論段の測定を行ない、９，７００理論段の値をえた。モノＳで溶出された物質のプールを、室温で、２．５μＬアリコート中、５０ＭＭリン酸ナトリウム、０．７５ＮａＣｌｐＨ６．０（あらかじめＣ１８逆相カラム（セップ−パック（Spe-pak）、ミリポア）に通した）におけるこのカラムに、流速１．０μＬ／分で付した。１μＬ（０．５分）画分を各サンプルをカラムに付したのち３５分から集めた。各実験からの画分２７〜４１（ＧＧＦ −II）および４２〜５７（ＧＧＦ−Ｉ）の内容物をプールした。Ｖ．逆相ＨＰＬＣ前記スーパーロース１２の実験からのＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIのプールを３つの等アリコートにそれぞれ分けた。ガードカートリッジ（ＲＰ−８、１５×３．２ｍｍ、アプライドバイオシステムズ）によって保護されたＣ８逆相カラム（アクアポア（Aquapore）ＲＰ−３００７μ Ｃ８２２０×４．６ｍｍ、アプライドバイオシステムズ）に各アリコとートを付し、４℃、０．５μＬ．分で平衡化した。以下のプログラム化された線形勾配を用いてこれらの条件下、タンパク質を溶出した：プログラム化された勾配の開始後１５．２分から、シリコン処理された試験管（マルチルーブチューブズ（Multilube tubes）、バイオクオート（Bioquote ））に２００μＬ（０．４分）画分を集めた。VI．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動この工程において、タンパク質の分子量の標準物質、低範囲、バイオ−ラッドラボラトリーズリミテッド、ワットフォード英国のカタログ番号１６１− ０３０４を用いた。実際に用いたタンパク質およびそれらの分子量の標準物質は前記にあげている。前記逆相ＨＰＬＣの実施からの画分４７〜５３（ＧＧＦ−Ｉ）および画分６１〜６７（ＧＧＦ−II）を各々プールした。プールされた物質の７μＬを、当量の０．０１２５ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、およびＧＧＦ−Ｉ用１０％ β−メルカプトエタノール中で煮沸し、４％スタッキングゲルを有する１１％ポリアクリルアミドリームリゲル（Leammli gel）に付し、５０Ｖの定電圧で、１６時間実施した。そののちにゲルを固定し、銀染色キット（アマシャム（Amersham））を用いて染色した。これらの条件下、分子量マーカーによって定められるものとして、相対分子量３０，０００〜３６，０００ダルトン（ＧＧＦ−Ｉ）および５５，０００〜６３，０００ダルトン（ＧＧＦ−II）の多少拡散したバンドとして因子がそれぞれ確かめられる。ゲル染色の結果から、逆相の実施からプールされた物質には、ＧＧＦ−Ｉ種およびＧＧＦ−II種と同等のレベルで存在する少数のほかのタンパク種があることが明らかである。VII．トリフルオロ酢酸中の安定性トリフルオロ酢酸存在下の本発明の因子について安定性のデータを以下のようにえた：ＧＧＦ−Ｉ逆相ＨＰＬＣからの物質を、０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルの存在下、カラムでの実施が完了した１２時間以内および、そののち４０℃で１０週間インキュベーションしたのちにアッセイした。インキュベーションののちのＧＧＦ −Ｉは、カラムから取出して直接アッセイした物質の活性の少なくとも５０％の活性を有していた。ＧＧＦ−II 逆相ＨＰＬＣからの物質を、０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリルの存在下− ２０℃で貯蔵し、これを解凍したのち４０℃で４日間インキュベーションし、アッセイした。インキュベーションののちの、ＧＧＦ−IIは解凍したこの物質の活性の少なくとも５０％の活性を有していた。前述の研究で用いられたトリフルオロ酢酸の濃度は、逆相クロマトグラフィーで最も一般的に用いられる濃度であることは理解されるであろう。実施例２精製ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIのアミノ酸配列高度に精製されたウシ脳下垂体のＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIを用いて、アミノ酸配列分析の研究が行なわれた。配列を記載するために通常の１文字コードを用いた。１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの５５〜６５ＲＤ領域から溶出された物質（前記に示したマーカーに対して相対的な分子量）について行なわれたＧＧＦ−IIのリシルエンドペプチダーゼ分解とともに、還元され、カルボキシメチル化されたサンプルについて行なわれたリシルエンドペプチダーゼ分解およびプロテアーゼＶ８分解によりペプチドをえた。ＧＧＦ−Ｉについて合計２１のペプチド配列（図９参照）がえられ、そのうちの１２のペプチド配列（図１０参照）は、現在のタンパク質データベースに存在しないので、独自なの配列を表わす。ＧＧＦ−IIについては合計１２のぺプチド配列（図１１参照）がえられ、そのうちの１０のぺプチド配列（図１２参照）は現在のタンパク質データベースに存在しないので、独自な配列を表わす（おそらく重要性のない、少数の残基である多くのタンパク質において同一の配列を示すぺプチドＧＧＦ−II ０６（配列番号３８）は例外である）。これらの新規な配列はおそらく、ＧＧＦIおよびIIの真のアミノ酸配列の一部ときわめて一致するであろう。明らかに高度に関連しているＧＧＦ−I ０７の（配列番号３９）およびＧＧＦ−II １２（配列番号４４）の配列はとくに注目されうる。この類似性は、これらのぺプチドの配列が、ほとんど疑いなく割り当てられた（assigned）ＧＧＦ種のぺプチド配列であり、混入したタンパク質に由来することはほとんどありえないことを示す。さらに、ぺプチドＧＧＦ−II ０２（配列番号３４）では、配列ＸＳＳが、Ｘと記された位置でアスパラギンにＮ結合した炭水化物部分（N linked carbohydr ate moiety）の存在と一致する。一般的には、図９および１１において、Ｘは配列決定のサイクルの中で同じ大きさのシグナルが１より多く存在するので、またはシグナルが存在しないので、単一の位置を確信をもってコールすることができない、配列決定のサイクルを示す未知の残基を示す。星印はコールされた（called）最後のアミノ酸がそのペプチドに存在する最後のアミノ酸に対応するペプチドを示す。残りのペプチドにおいては、コールされた最後のアミノ酸のうしろのシグナルの強度がそのペプチドの末端への配列コーリングを続けるには不充分であった。右側の欄には、ＮＢＲＦおよびＥＭＢＬ配列データベースを分析するために、ＧＣＧパッケージＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラムを用いてコンピュータデータベースを調査した結果を示す。この欄のタンパク質の名前は、その配列の一部の、最大２つのミスマッチを許容するコールされたペプチドのアミノ酸配列との、同一性を示す。疑問符は３つのミスマッチを許容することを示す。用いた略語は以下のとおりである：ＨＭＧ−１高移動度のグループのタンパク質−１ＨＭＧ−２高移動度のグループのタンパク質−２ＬＨ−アルファ黄体形成ホルモンαサブユニットＬＨ−ベータ黄体形成ホルモンβサブユニット実施例３精製ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIの分裂促進活性ＧＧＦＩおよびIIの両者を含有する高度に精製されたサンプルの分裂促進活性を、１つの微小培養物についてＤＮＡ合成、細胞形態、細胞数および細胞抗原の発現を検討できる定量法を用いて、調べた。この技術は、ミュアー（Muir）ら（（１９９０）アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）１８５巻、３７７〜３８２頁）によって以前に報告された方法を修正したものである。おもな修正として、１）コートされていないマイクロタイタープレータの使用、２）ウェルあたりの細胞数、３）１０％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）にかわる５％胎児ウシ血漿（ＦＢＰ）の使用および４）同時に培養物に加えられたマイトジェンおよびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下のインキュベーション時間である。さらに、細胞の損失を避けるために、固定の前に細胞の単層は洗浄せず、アッセイの感受性を高めるために、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体およびペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスイムノグロブリン（ＩｇＧ）抗体のインキュベーション時間を２倍にした。ラット座骨神経のシュワン細胞のために最適化されたアッセイを、細胞培養条件を適切に修正したのち、数種の細胞系にも用いた。Ｉ．分裂促進誘導の試験法１日目に、５％ＦＢＰ／ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）の入ったコートされていない９６ウェルプレートに精製シュワン細胞をまいた（５，０００細胞／ウェル）。２日目に、最終濃度１０ｍｍでのＢｒｄＵと同様にＧＧＦ類またはほかの試験因子を培養物に加えた。４８時間後（４日目）、培地を吸引することによりＢｒｄＵの取り込みを終わらせ、７０％エタノール２００μｌ／ウェルを用いて、２０分間、室温で細胞を固定した。つぎに、水で細胞を洗浄し、２ＮＨＣｌ１００μｌを用いて、１０分間、３７℃でインキュベーションすることによりＤＮＡを変性させた。吸引に引き続き、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ９．０でウェルを満たして残った酸を中和し、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。そののちに、ブロッキング緩衝液（０．１％トリトン×１００および２％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ）５０ μｌを用いて１５分間、３７℃で細胞を処理した。吸引ののち、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（ダコ社（Dako Corp.）、サンタバーバラ（Santa Barb ara）、カリフォルニア州）（５０μｌ／ウェル、１．４ｍｇ／ｍｌブロッキング緩衝液で希釈）を加え、２時間、３７℃でインキュベートした。結合していない抗体は０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで３回洗浄することによって除去して、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ダココーポ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）（５０μｌ／ウェル、２ｍｇ／ｍｌブロックキング緩衝液で希釈）を加え、１時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／トリトンで３回洗浄してＰＢＳで最終的にすすいだのちに、０．０５％可溶性色素原オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０．０２％Ｈ₂Ｏ₂を含有する５０ｍＭリン酸塩／クエン酸塩緩衝液、ｐＨ５．０を１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。室温にて、５〜２０分後、２Ｎ硫酸を４０μｌ／ウェル含むきれいなプレートに、各ウェルから８０μｌをピペッティングすることにより反応を停止した。吸光度は、プレートリーダー（ダイナテックラブズ（Dynatech Lab s）を用いて４９０ｎｍで記録した。細胞の単層を有するアッセイプレートをＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および０．０２％Ｈ₂Ｏ₂を加えて不溶性産物を生じさせることにより、ＢｒｄＵ− ＤＮＡに対して免疫細胞化学的に（immunocytochemically）染色した。１０〜２０分後、水で洗浄することにより、染色反応を停止させ、倒立顕微鏡を用いてＢｒｄＵ−陽性核を観察し、カウントした。適宜、陰性核を０〜００１％トルイジンブルー（Toluidine blue）で対比染色し、前述のようにカウントした。II．分裂促進誘発アッセイに用いられる細胞系スイス３Ｔ３線維芽細胞フローラブズ（Flow Labs）からの細胞を、空気中１０％（ＣＯ₂の加湿された雰囲気下、３７℃で、１０％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中で維持した。２日ごとに細胞の栄養補給をするかまたは細胞の継代培養をした。分裂促進アッセイ用に、完全培地中５，０００細胞／ウェルの密度で細胞をプレートにまき、細胞がコンフルエントでかつ静止状態になるまで１週間インキュベートした。血清を含有する培地を除去し、無血清培地で細胞の単層を２回洗浄した。マイトジェンおよび１０μＭＢｒｄＵで含有する無血清培地１００μｌを各ウェルに加え、４８時間インキュベートした。ＧＧＦ類および血清もしくはＰＤＧＦ（陽性コントロールとして）に対する用量応答を行なった。ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）２１Ｃ１３線維芽細胞ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマルセル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）からの細胞を、空気中５％ＣＯ₂の加湿された雰囲気下、３７℃で、５％トリプトースホスフエートブロス（tryptose phosphate broth）、５％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したグラスゴー修正イーグル培地（ＧＭＥＭ）で維持した。２〜３日ごとに細胞の栄養補給をするか細胞の継代培養をした。分裂促進アッセイ用に、完全培地中、２，０００細胞／ウェルの密度で２４時間プレートでインキュベートした。血清を含む培地を除去し、無血清培地で洗浄したのちに、０．１％ＦＣＳを含有するＧＭＥＭ、またはＧＭＥＭ単独１００μｌで培地交換した。１０μＭＢｒｄＵとともに、ＧＧＦ類およびＦＣＳまたはＢＦＧＦを陽性コントロールとして加え、４８時間インキュベートした。そののち、シュワン細胞に対して記載したように、細胞培養物を処理した。Ｃ６ラット膠腫細胞系継代３９でえられた細胞を、空気中１０％ＣＯ₂の加湿された雰囲気中３７℃ で、５％ＦＣＳ、５％ウマ血清（ＨＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持した。３日ごとに細胞の栄養補給をするかまたは細胞の継代培養をした。分裂促進アッセイ用に完全培地に２，０００細胞／ウェルの密度で細胞をプレートにまき、２４時間インキュベートした。無血清培地で洗浄したのち、ついで培地を０．１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭとＦ１２の１：１培地の混合物で交換した。そののち、ＧＧＦ類、ＦＣＳおよびＡＦＧＦに対する用量応答を行ない、ほかの細胞型に対して以前に記載したように、ＥＬＩＳＡにより細胞を処理した。ＰＣ１２（ラット副腎褐色細胞腫細胞）ＥＣＡＣＣからの細胞を、コラーゲンでコートされたフラスコで、１０％ＨＳ、５％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０で３７０Ｃ、空気中５％ＣＯ₂の加湿された雰囲気中維持した。３日ごとに、培地の８０％のを交換することにより細胞の栄養補給をした。分裂促進アッセイ用に、完全培地にコラーゲンでコートされたプレート（５０μｌ／ウェルコラーゲン、ビトロゲンコラーゲンコープ（Vitrogen Collagen Co rp.）、１：５０に希釈、３０分間、３７℃）に、細胞を３，０００細胞／ウェルの密度でまき、２４時間インキュベートした。そののち、新鮮なＲＰＭＩ単独または１ｍＭインスリンもしくは１％ＦＣＳを含有する新鮮なＲＰＭＩで培地を交換した。陽性コントロールとしてのＦＣＳ／ＨＳ（１：２）およびＧＧＦ類に対する用量応答を前述のように行なった。４８時間後、細胞を固定し、前述のとおりにＥＬＩＳＡを行なった。III．分裂促進誘発アッセイの結果ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II（ＧＧＦ類）の混合物を含有する、スーパーロース１２クロマトグラフィー精製工程で高度に精製されたサンプル（実施例１、セクションＤ参照）を用いて、本実施例に記された実験のすべてを、行なった。まず、ジェイピーブロックス（J. P. Brockes）（（１９８７）メソッズエンザイモル（Methods Enzymol.）１４７巻、２１７頁）に記載されている、分裂している細胞のＤＮＡへの¹²⁵Ｉ−ＵｄＲの取り込みにもとづくシュワン細胞の古典的な分裂促進アッセイとＢｒｄＵの取り込みアッセイでえられた結果を比較した。図１３に、同一の細胞培養条件（５，０００細胞／ウェル、５％ＦＢＰ／ＤＭＥＭ中、ＧＧＦ類の存在下４８時間インキュベートされた）で行なわれた２つのアッセイからえられたデータの比較を示す。明確に示されているように、結果は比較することができ、曲線のグラフの左へ、すなわちＧＧＦ類のより低濃度へのシフトから示唆されるように、ＢｒｄＵ取り込みアッセイはわずかにより感受性があるように考えられる。以下のセクション「方法」に記載したように、免疫応答性のＢｒｄＵ−ＤＮＡを、ＯＰＤペルオキシダーゼ反応の可溶性産物の強度を読むことにより定量したのち、細胞の単層を含むオリジナルのアッセイプレートで、ＢｒｄＵ陽性核を染色する、不溶性ＤＡＢ産物がえられる第２の反応を行なうことが可能である。そののちに、微小培養物を倒立顕微鏡下で調べることができ、細胞形態およびＢｒｄＵ陽性および陰性核の数を観察することが可能である。図１４ａおよび図１４ｂでは、４９０ｎｍにおける吸光度を読むことにより評価されたＢｒｄＵ−ＤＮＡの免疫応答性を、同一培養物でカウントされたウェルあたりのＢｒｄＵ−陽性核の数および全細胞数に対するＢｒｄＵ−陽性核の百分率と比較する。標準偏差は１０％より小であった。２つの評価法はきわめて望ましい相間を示し、最大用量のＧＧＦ類における値の間の相違は、ＢｒｄＵ−陽性として検出された細胞におけるＤＮＡ合成の程度の差によるものであると説明することができる。したがって、¹²⁵Ｉ−ＵｄＲ取り込みアッセイと比較すると、ＢｒｄＵ取り込みアッセイは、シュワン細胞に対するＧＧＦ類の生物学的活性についてのさらなる有用な情報が提供されうる。たとえば、図１５に報告されるデータは、ＧＧＦ類がシュワン細胞に作用してＤＮＡ合成を誘導することができるが、低用量では４８時間後の微小培養物に存在する陰性細胞の数を増加させうることを示す。ＢｒｄＵ取り込みアッセイは、異なる起源の数種の細胞系に用いられた。図１６では、シュワン細胞およびスイス３Ｔ３線維芽細胞のＧＧＦ類に対する分裂促進応答が比較される；３Ｔ３線維芽細胞で弱い応答がえられたにもかかわらず、これらの培養物においてＢｒｄＵ−陽性核がある程度は明らかに検出された。コントロール培養は、数種の用量のＦＣＳまたはヒト組換えＰＤＧＦの存在下で並行して行なわれ、細胞は適切な剌激に応答しうることが示された（データは示さない）。線維芽細胞のＧＧＦ類に対する応答能を、ＢＨＫ２１Ｃ１３細胞系を用いてさらに調べた。腎臓由来のこれらの線維芽細胞は、コンフルエントのときにコンタクトインヒビションを示さないかまたは静止状態に達しない。したがって、実験条件は細胞の生存度からなるのではなく、きわめて低いバックグラウンドの増殖を有するように決められた。図１７および図１８によって示されるように、ＧＧＦ類はＢＨＫ２１Ｃ１３細胞に対する著しい分裂促進活性を有する。図１７は、０．１％ＦＣＳの存在下、ＧＧＦ類によって剌激されたＢＨＫ２１Ｃ１３細胞によるＢｒｄｕのＤＮＡへの取り込みを示す。ＦＣＳに対する好ましい分裂促進応答は、細胞培養条件が限定していなかったことを示す。図１８は、ＧＧＦ類の分裂促進効果がＢｒｄＵ−陽性およびＢｒｄＵ−陰性の細胞数として、およびウェルあたりのカウントされた全細胞数として表現されている。データは重複して実行した２つの実験の代表例である；ウェルあたり少なくとも３領域をカウントした。低容量の増殖効果に加えてシュワン細胞について観察されたように、ＧＧＦ類はまた、応答しない生存細胞数をも増加させる。ＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、培養物に加えられたＧＧＦ類の量の増加と比例する。より高い用量のＧＧＦ類の存在下、４８時間後の全細胞数は少なくとも２倍であり、ＧＧＦ類がＢＨＫ２１Ｃ１３細胞におけるＤＮＡ合成および増殖を誘導することが確かめられる。同一条件下、２％ＦＣＳの存在下で４８時間維持された細胞は、約６倍の増加を示した（データは示さない）。Ｃ６膠腫細胞は、グリア細胞の性質を研究するための有用なモデルを提供している。発現される表現型は細胞継代によると考えられ、細胞は初期段階では星状細胞の表現型、後期段階（継代７０をこえる）は乏突起膠細胞の表現型により近似している。これらの実験で用いられるＣ６細胞は、継代３９〜継代５２であった。Ｃ６細胞は高度に増殖する集団であるため、実験条件はきわめて低いバックグラウンドのＢｒｄＵの取り込みを有するように最適化された。ＦＣＳに対する用量応答により示されたように（図１９）、分裂促進応答に著しく影響を及ぼすことなく細胞の生存度を維持するために、０．１％血清の存在は必要であった。図２０では、ａＦＧＦ（酸性の線維芽細胞成長因子）およびＧＧＦ類に対する分裂促進応答がＦＣＳ（８％）の存在下でえられる最大のＢｒｄＵの取り込みの割合として表現されている。値は、重複して行なわれた２つの実験の平均である。ＧＧＦ類の効果はａＦＧＦの純粋な調製物の効果と比較できた。ａＦＧＦは、Ｃ６細胞に対する特異的な成長因子として記載されており（リムアール（Lim R.）ら、（１９９０）セル・レギュレーション（Cell Regulation）１巻、７４１〜７４６頁）、その理由で陽性コントロールとして用いた。微小培養物における細胞の密度は高いので、ＢｒｄＵ陽性および陰性細胞を直接的にカウントすることは不可能であった。報告されている細胞系とは対照的に、ＰＣ１２が血清（細胞の維持に通常通りに用いられるようなＦＣＳおよびＨＳの混合物）に応答しうる培養条件下で処理されたばあい、ＰＣ１２細胞はＧＧＦ類に対して明白な応答性を示さなかった。それにもかかわらず、ウェルあたりに播かれた細胞数が、ＰＣ１２細胞の挙動に影響を与えると考えられるので、さらなる実験が必要である。実施例４ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIペプチドを含有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離およびクローニングペプチド配列の情報およびライブラリースクリーニングを用いて、ここに概述したようにＧＧＦ−IIヌクレオチド配列の単離およびクロ−ニングを行ない、以下に記述したように行なった。ここに記載する技術にしたがうことによってＧＧＦ−Ｉ配列の単離およびクロ−ニングのための出発点として、図４および図５のペプチドが用いられうることは理解されるであろう。実際に、図２１（配列番号５４〜８８）はこの目的のために可能な変性オリゴヌクレオチドプローブを示し、図２３（配列番号９０〜１１９）は可能なＰＣＲプライマーを列挙している。ＤＮＡ配列およびポリペプチド配列は、ＧＧＦ−IIをもちいるこの手段によりうることができなければならない。また、ＤＮＡ構築物およびそのようなＤＮＡ配列を取り込んでいる発現ベクター、そのような構築物／ベクターを取り込むことによって遺伝的に変えられた宿主細胞、そのような宿主細胞を培養することによりえられうるタンパク質も同様である。本発明はこのような主題を意図する。Ｉ．オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーの設計および合成アミノ酸配列（精製されたＧＧＦタンパク質から生じたペプチドに由来する）をヌクレオチド配列に逆翻訳（backtranslating）することにより、変性ＤＮＡオリゴマープローブを設計した。オリゴマーはＤＮＡ配列をコードする鎖またはコードしない鎖のいずれかを表わす。オリゴマーの設計においてセリン、アルギニンまたはロイシンが含まれるばあいは、あいまいさを避けるために２つの化合物を別々に調製した。たとえば、セリンは５３７と５３８または６０９と６１０におけるように、ＴＣＮかまたはＡＧＹかのいずれかによりコードされた。類似のコドンスプリッティング（SPlittng）がアルギニンまたはロイシン（たとえば５４４、５４５）に対して行なわれた。０．２マイクロモルの規模の合成で操作される、βシアノエチルケミストリー（β cyanoethyl chemistry）を用いて、バイオリサーチ８７５０４ −カラムＤＮＡシンセサイザー（Biosearch 8750 4- column DNA synthesizer）でＤＮＡオリゴマーを合成した。オリゴマーをカラム（５００オングストロームＣｐＧ樹脂）から切り離し、６〜２４時間５５〜６０′℃で濃縮水酸化アンモニウム中で脱保護を行なった。脱保護されたオリゴマーを真空（スピードバック（Speedvac））下で乾燥し、１５％アクリルアミドゲル（２０モノ：１ビス）、７Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ホウ酸塩− ＥＤＴＡ緩衝液により精製した。ＵＶをシャドーイングすることにより、全長のオリゴマーをゲル中で検出し、そのバンドを切り出し、４〜１６時間振とうしながらＤＮＡオリゴマーを１．５μｌｓＨ₂Ｏに溶出した。溶出物を乾燥し、０．１μｌＨ₂Ｏに再溶解し、２６０ｎｍで吸光度測定を行なった。濃度は以下の式にしたがって決定された：（Ａ２６０×単位／μ１）（６０．６／長さ）＝ＸμＭＨ₂Ｏを添加してすべてのオリゴマーを５０μＭの濃度に調節した。前述のように設計された変性ＤＮＡを図２１（配列番号５４〜８８）に示す。以下の修飾をともなうプローブに用いられた手順と本質的に同様の手順によってＰＣＲプライマーを調製した。制限部位を含む１３個のヌクレオチドのリンカーは、ベクターへのクロ−ニングに用いるために変性オリゴマーの５´末端に含有された。ＤＮＡ合成は１，０００オングストロームＣｐＧ樹脂を用いて１マイクロモルの規模で行なわれ、４種すべてのヌクレオチドが変性プローブに正常に取り込まれる位置にイノシン（inosine）を用いた。ＰＣＲプライマーの精製は、ゲル電気泳動精製につづくエタノール沈殿を含んでいた。II．ライブラリーの構築およびスクリーニングウシゲノムＤＮＡライブラリーはストラタジーン（Stratagene）より購入した（カタログ番号：９４５７０１）。ライブラリーは、ベクターラムダダッシュII（lamdaDashII）中にクローン化された、２×１０⁶ １５〜２０ｋｂＳａｕ３Ａｌの部分ウシＤＮＡフラグメントを含有した。ウシ全脳ＣＤＮＡライブラリーはクローンテック（Clonetech）より購入した（カタログ番号：ＢＬ１０１３９）。相補的ＤＮＡライブラリーは、ウシ全脳から、ウシ脳下垂体からおよびウシ脳下垂体後葉から調製されたｍＲＮＡから構築された（インビトロゲン（In Vitrogen）、ストラタジーン）。インビトロゲンは２つのｃＤＮＡライブラリーを調製した。１つのライブラリーはベクターラムダｇ１０に存在し、もう一方はベクタ−ｐｃＤＮＡＩに存在していた（プラスミドライブラリー）。ストラタジーンのライブラリーは、ベクタラムダユニザップ（unizap）において調製された。あわせると、ｃＤＮＡライブラリーは１４００万の主要な組換えファージを含有した。ウシゲノムライブラリーを、プレート（plate）あたり１５０，０００〜２００，０００ファージプラークで２３×２３ｃｍプレート（ヌンク（Nunc））上の大腸菌Ｋ１２宿主株ＬＥ３９２に播いた。各プレートはおよそ１ウシゲノム相当量（equivalent）を示した。一晩３７℃でインキュベーションを行なったのち、プレートを冷蔵し、グルーンシュテタイン（Grunstein）およびホグネス（Hｏｇｎｅｓｓ）の手順（（１９７５）ＰＮＡＳ（米国）７２巻、３９６１頁）に従って複製フィルター（replicate filters）を調製した。各プレートから帯電していないナイロン膜（パールバイオダインエイ（Pall Biodyne A）またはエムエスアイニトロピュア（MSI Nitropure））上へ４種のプラーク隆起（lifts）を調製した。ＵＶ光のもと５分間クロスリンキング（cross-lin king）することによるか、または真空下２時間８０℃で焼くことにより、ＤＮＡを膜に固定した。供給元の説明書にしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブズ（New England Biolabs））を用いてガンマ³²ＰＡＴＰ（ニューイングランドヌクレアー（New England Nuclea r）、６５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。簡単にいえば、５０ｐｍｏｌの変性ＤＮＡオリゴマーを６００μＣｉガンマ³²Ｐ−ＡＴＰおよび５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下３０分間、３７℃でインキュベートした。反応を停止させ、ゲル電気泳動ローディング緩衝液を加えて電気泳動により放射能標識したプローブを精製した。³²Ｐで標識されたプローブをゲルスライスから切り出し、水に溶出した。それとは別に、ショーウォルター（Schowalter）およびソマー（Sommer）のプロトコル（（１９８９）アナル・バイオケム１７７巻、９０〜９４頁）にしたがって、ＰＣＲ増幅を経たのちにα³²Ｐ−ｄＡＴＰまたはα³² ＰｄＣＴＰの取込みによりＤＮＡプローブを標識した。ＰＣＲ反応で標識されたプローブをセファデックス（Sephadex）Ｇ−１５０カラムで脱塩することにより精製した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションをＧＭＣ緩衝液（０．５２ＭＮａＰｉ、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｐｇ／μｌＴＲＮＡ）で行った。洗浄は緩衝液Ａオリゴウォッシュ（oligowash）（１６０μｌ1 ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、２００μｌ２０％ＳＤＳ、８．０μｌ０．５ｍＥＤＴＡ、１００μｌ５ＭＮａＣｌ、３６３２μｌＨ２Ｏ）中で行った。典型的には、１０ウシゲノム相当量の複製コピーを示す２０枚のフィルター（それぞれ４００平方センチメートル）を１００ｐｍｏｌの変性オリゴヌクレオチドプローブ（１２８〜５１２倍変性）をともなう２００μｌハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートした。変性プローブ用に計算された最小の融解温度より低い５℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。最小の融解温度の計算値は、ＡＴ対については２℃、そしてＧＣ対については４℃と考えられる。フィルターをハイブリダイゼーション温度で、４〜５時間、オリゴウォッシュを繰返し変えて洗浄し、最後には、ＤＮＡプローブの長さに依存する温度で３０分間、２回１％ＳＤＳを含む３．２Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。２０量体では、最終の洗浄温度は６０℃であった。フィルターをのせ、ついで強化スクリーン（デュポンクロネックスライトニングプラス（Dupo nt Cronex Lightening Plus））を用いてＸ線フィルム（コダックＸＡＲ５）に暴露した。通常、これらのライブラリースクリーニングにおいて重複するシグナルを検出するには、３〜５日間フィルムを−８０℃で暴露させると充分である。結果の分析につづき、フィルターをはがし、再びプローブ化することができた。１０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８を含有する１％ＳＤＳの溶液において電子レンジ中全出力で１５分間の２回の連続するサイクルによってインキュベートすることによってはがした。フィルターは、はがすおよび種々のプローブを用いて再度プローブ化する少なくとも３〜４のサイクルによってとった。III．組換えファージの単離、成長およびＤＮＡの調製これらの手順は組換えＤＮＡ（マニアティスら、リコンビナントＤＮＡ（Reco mbinant DNA）、２巻、６０〜６２頁、１９８１年）に記載されたように標準プロトコルにしたがった。IV．ＤＮＡ分解およびサザンブロットによる単離されたクローンの分析組換えファージＤＮＡサンプル（２μｇ）は制限エンドヌクレアーゼの供給者（ニューイングランドバイオラブス（New England Biolabs））によって推奨された条件により分解された。３７℃での４時間のインキュベーションにつづいて、反応産物を０．１Ｍの酢酸ナトリウムおよび３倍量のエタノールの存在下で沈殿させた。沈殿したＤＮＡは遠心分離により集め、７５％のエタノールですすぎ、乾燥した。すべての再び懸濁されたサンプルはアガロースゲル（典型的にはＴＡＥ緩衝液中１％、０．０４Ｍのトリス酢酸塩、０．００２ＭＥＤＴＡ）にかけられた。ゲル操作（ｒｕｎ）は４〜２０時間、１ｃｍあたり１Ｖで行なわれた。マーカーはλ Ｈｉｎｄ III ＤＮＡフラグメントおよび／またはφ×１７４Ｈａｅ III ＤＮＡフラグメント（ニューイングランドバイオラブズ）を含んでいた。ゲルは０．５μｇ／μＬのエチジウムブロミドを用いて染色され、写真撮影を行なった。サザンブロッティングのために、ＤＮＡはまず０．１２５ＮのＨＣｌ処理によってゲルでデピュリネート（depurinate）し、０．５ＮのＮａＯＨで変性し、２０×ＳＳＣ（３Ｍの塩化ナトリウム、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）において、荷電されていないナイロン膜に移した。ブロッティングは６時間から２４時間まで行われ、そののち、フィルターを０．５ＭのトリスＨＣ１ｐＨ７．５、０．１５Ｍの塩化ナトリウムで中和し、ついで５０ｍＭのトリスーホウ酸塩ＥＤＴＡで簡単にすすいだ。クロスリンキングのために、フィルターをまず透明なプラスティックラップで包み、そののちＤＮＡ側を５分間紫外線暴露した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、ライブラリースクリーニングのために記載されたように行った（本実施例のセクション２参照）。類似遺伝子が他の種に存在するか否かを決定するためのハイブリダイゼーション分析について、わずかな修飾が行われた。ＤＮＡフィルターは、クローンテック（カタログ番号７７５３〜１）から購入され、系（ lane）あたり様々な種からの、ＥｃｏＲＩで分解されたＤＮＡ５μｇを含む。プローブは前記セクション２に記載されたように、ＰＣＲ増幅反応により標識され、ハイブリダイゼーションは、１０％デキストラン硫酸を含む８０％緩衝液Ｂ（ポリビニルピロリジン２ｇＮフィコール（Ficoll）−４００２ｇ、ウシ血清アルブミン２ｇ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０μｌＮａＣｌ５８ｇ、ピロリン酸ナトリウム１ｇ、硫酸ドデシルナトリウム１ｏｇ、Ｈ₂０９５０μｌ）において行なわれた。プローブは１０分間煮沸し、そののちすみやかに氷水中で冷却することによって変性された。プローブは１μｌあたり１０⁶ｄｐｍ³²ｐでハイブリダイゼーション緩衝液に加えられ、６０℃で一晩インキュベートされた。フィルターは、まず緩衝液Ｂ中で、つづいて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでそののち１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃ で洗浄された。極めて厳格な、実験のために、最後の洗浄が０．１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で行なわれ、温度は６５℃まであげられた。サザンブロットデータは、ゲノムクローンの制限地図を調製するため、およびサブフラグメントがＧＧＦプローブ（サブクロ−ニングのための候補）にハイブリダイズされたことを示すために用いられた。Ｖ．ハイブリダイゼーションプローブに対して相同なＤＮＡの小片のサブクローニングＤＮＡ分解物（たとえば５μｇ）を１％のアガロースゲルにかけ、適当なフラグメントをゲルから切り出し、染色した。ＤＮＡはガラスビーズへの吸着につづいて、供給者（バイオ（Ｂｉｏ）１０１）によって記載されたプロトコルを用いた溶出によって精製された。回収されたＤＮＡフラグメントー（１００〜２００ｎｇ）は、線化され脱リン酸化された（ linearizd dephoshorylated）ベクター、たとえばｐＵＣ１８の誘導体であるｐＴ３Ｔ７（アンビオン（Ambion））に、Ｔ４リガーゼ（ニューイングランドバイオラブズ）を用いて連結された。このベクターは大腸菌βラクタマーゼ遺伝子を担っているので、形質転換体はアンピシリン含有平板培地（ｐｌａｔｅ）上で選択されうる。また前記ベクターは宿主細胞にβ−ガラクトシダーゼ補足性を与え、そのため、非組換え体（ブルー）はイソプロピルチオガラクトシドおよびブルオガル（Bluogal）（ベセスダリサーチラブズ（Bethesda Research Labs ）を用いて検出されうる。連結反応（ligationreactions）の一部は、大腸菌Ｋ１２ＸＬｌブルーコンピテント細胞（ストラタジーンカタログ番号２００２３６）を形質転換するために用いられ、ついで、形質転換体が１μｌあたり５０μｇのアンピシリンを含有するＬＢ平板培地で選択された。白色のコロニーが選択され、プラスミド小調製物（mini preps）がＤＮＡ分解のためにおよびＤＮＡ配列分析のために調製された。選択されたクローンはＧＧＦプローブでハイブリダイズされたそれらの挿入ＤＮＡであるか否かを決定するために再試験された。VI．ＤＮＡ配列決定二本鎖プラスミドＤＮＡの鋳型は標準プロトコルにしたがって５μｌの培養物から単離された二本鎖プラスミドから調製された。配列決定は、取扱いプロトコル（ア・モディフィケーション・オブ・サンガー・エト・アール（a modification of Sanger et al．（１９７７）ＰＮＡＳ、米国、７４巻、５４６３頁）にしたがい、シークエナーゼ２．０およびジデオキシヌクレオチド配列決定キット（ＵＳバイオケミカル（Biochemical））を用いたジデオキシ鎖終止法（dideoxy chain termination method）によった。択一的に、配列決定はサイクル配列決定キット（ニューイングランドバイオラブズ、ベセスダリサーチラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories））を用いたＤＮＡサーマルサイクラー（DNA thermal cycler）（パーキンエルマー（perkin Elmer）、モデル４８００）で行なわれ、５′末端が標識されたプライマーを用いて製造者の指示にしたがって行なわれた。配列プライマーは配列決定キットで供給されたもの、あるいはクローンから決定された配列にしたがって合成されたもののいずれかであった。配列決定反応は、０．４ｍｍ厚の６％ポリアクリルアミドの配列決定ゲルにかけられ、分解された。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露した。典型的には標準配列決定キットが用いられたばあい、３５Ｓが取り込まれ、³²Ｐで末端が標識されたプライマーは、サイクル配列決定反応のために用いられた。配列はゲルの下から上まで（５′から３′へ）ＤＮＡ配列エディターに読み込まれ、データはジェネティックスコンピユータグループ（Genetics C omputer Group）（ＧＣＧ、ウィスコンシン大学（University of Wisconsin））により供給されたプログラムを用いて分析された。VII.ＲＮＡの調製およびＰＣＲの増幅ゲノムＤＮＡにおいて検出されたオープンリーディングフレームは、ＧＧＦペプチドをコードする配列を含み、推定されるＲＮＡのＰＣＲ増幅により延長された。ＲＮＡはグアニジン中性−ＣｓＣｌ塩化物手順（gu anidine neutral-CsCl chloride procedure）（チヤーウイン（Chirgwin）ら、（１９７９）、バイオケミストリー、１８巻、５２９４頁）にしたがって冷凍ウシ組織（ペルフリーズ（Pelfreeze））から調製された。ポリアデニル化されたＲＮＡはオリゴーｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー（アビブ（Aviv）およびレーダー（Leder.）（１９７２）ＰＮＡＳ（米国）、６９巻、１４０８頁）によって選択された。特異的な標的ヌクレオチド配列は、パーキンエルマーＰＣＲ／ＲＮＡキット番号Ｎ８０８−００１７を用いてｃＤＮＡに変換されている、全ＲＮＡまたはポリアデニル化されたＲＮＡのいずれかのサンプルをはじめに用いて増幅された。第１鎖逆転写反応は鋳型ＲＮＡＩμｇと付加された制限酵素認識部位のリンカーとともにオリゴｄＴのプライマーあるいは付加された制限部位を有するクローン化された配列から決定された特異的なアンチセンスプライマーのいずれかを用いた。第２の鎖を産生するため、プライマーは３′レース（RACE）反応（フローマン（Frohman）ら（１９８８）ＰＮＡＳ（米国）、８５巻、８９９８頁）に用いられたような、プラス鎖の特自な配列（plus strand unique sequences）、あるいは第２の標的部位がｄＡＴＰをもちいて第１鎖反応産物をテーリングするターミナルトランスフェラーゼによって加えられたばあいは（たとえば５′レース反応、フローマンら、同書）付加された制限部位を有するオリゴｄＴプライマーのいずれかであった。択一的にアンカーされたＰＣＲ反応におけるように第２の鎖のプライマーが変性され、ゆえに特別なペプチド配列を表している。増幅プロフィールは以下の一般のスキーム、１）９５℃、５分間の浸漬（soak ）ファイル、２）９５℃、１分間のサーマルサイクルファイル、４５℃、５０℃ または５５℃のアニーリング温度まで１分間冷却（ramped down）し、１分間アニーリング温度を維持、１分間にわたって７２℃まで加熱（ramp up）、７２℃ 、１分間延長あるいは１分＋１０秒の自動延長、３）７２℃、５分間延長サイクルおよび４）４０℃、長時間浸漬ファイル、にしたがった。サーマルサイクルファイル（＃２）は通常３０サイクル行なわれた。各増幅反応１００μｌのうち１６μ１を３時間１ｃｍあたり４ボルトでＴＡＥ緩衝液中２％ヌシーブ（Nusieve ）１％アガロースゲル実施において電気泳動により分析された。ゲルが染色され、そののちプライマーに対して内部である標識されたＤＮＡプローブを用いてプローブ化された非荷電ナイロン膜にブロッティングされた。ＤＮＡ増幅産物の特異的なセットはブロッティング実験で同定されることができ、それらの位置は精製および再増幅のためのガイドとして用いることができた。適切であれば、選択されたサンプルのうち適切な残りの部分が予備のゲルにかけられ、ついで、以下の電気泳動の０．５ｍｍ厚の４〜５のスライス（特異的な産物の予測された位置をかっこでくくっている）がゲルからえられた。アガロースはつぶされ、４０℃、２〜１６時間、電気泳動の緩衝液０．５μｌに浸漬された。つぶされたアガロースは、２分間遠心分離され、上清が新しい試験管に移された。再増幅がオリジナル反応におけるように同じセットのプライマーおよび反応プロフィールを用いて溶出された物質の５μｌ（産物のおおむね１％）について行なわれた。再増幅反応が終了したとき、サンプルはクロロホルムで抽出され、新しい試験管に移された。濃縮された制限酵素緩衝液および酵素は、リンカーに存在する制限部位で切裂（cleave）するために反応物（reactions）に加えられた。分解されたＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって精製され、ついでサブクローニングのセクションに記載されているようにベクターにサブクローン化された。ＤＮＡ配列決定は前記のように行われた。 VII．ＤＮＡ配列分析ＤＮＡ配列はフラグメントアッセンブリープログラム（fragment assembly pr ogram）を用いて収集し、アミノ酸配列をＧＣＧプログラムゲルアセンブル、地図および翻訳（ＧelAssemble、 Map and Translate）によって推定した。推定されたタンパク質の配列は、ワードサーチ（WordSearch）を用いたタンパク質配列データベースを調べるための検索（query）配列として用いた。ＶＭＳ５．１で作動するＶＡＸステーション３１００ワークステーションにおいて分析した。データベース調査はＧＣＧバージョン７．０を用いたスイスプロットリリース番号２１（SwissProt release number 21）において行なった。 VII．結果前述のように、ウシＧＧＦ−IIをコードするＤＮＡ配列を同定するため、変性オリゴヌクレオチドプローブがＧＧＦ−IIペプチド配列から設計された。精製されたＧＧＦ−II調製物（図１１および１２参照）をリシルエンドペプチダーゼ分解により産生されたペプチドであるＧＧＦ−II １２（配列番号４４）は、精製されたＧＧＦ−Ｉ調製物から産生されたトリプシン性（triptic）のペプチドであるＧＧＦ−Ｉ０７（配列番号３９）と強いアミノ酸配列の相同性を示した。このようにＧＧＦ−II １２を用いて１０コの変性オリゴヌクレオチドプロープ（図２１のオリゴ６０９、６１０および６４９〜６５６、それぞれ配列番号６９〜７１および７９を参照）を作製した。フィルターの１つの複写のセットをＧＧＦ−II １２の重複する２つの部分をコードするプローブの２つのセット（セット１＝６０９、６１０；セット２＝６４９〜６５６）を用いてプローブされた。ハイブリダイゼーションシグナルが観察されたが、１つのクローンのみが両プローブセットに対してハイブリダイズされた。このクローン（ＧＧＦ２ＢＧ１とする）を精製した。ファージクローンＧＧＦ２ＢＧ１からのＤＮＡのサザンブロット分析により、プローブの両セットがそのウシＤＮＡ配列とハイブリダイズすることが確認され、さらに、両プローブはそのクローン内の同じセットのＤＮＡフラグメントと反応することが示された。それらの実験にもとづいて、オリジナルクローンの４ｋｂのＥｃｏＲＩサブフラグメントが同定され、サブクローン化されて、部分的に配列決定された。図２２はプローブ６０９および６５０のハイブリダイゼーション部位を含んだ初期ＤＮＡ配列リーディングのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列（配列番号８９）を示し、このウシゲノムＤＮＡの一部がペプチド１２（ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭ）をコードすることが確認された。さらに配列分析は、ＧＧＦ−II １２が推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子およびｃＤＮＡを表す重複配列の単離のための開始位置にきた６６アミノ酸オープンリーディングフレーム（以下参照）に存在することを証明した。いくつかのＰＣＲ法が推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子のためのさらなるコーディング配列をうるために用いられた。全ＲＮＡおよびオリゴｄＴ選択（dT-sel ected）（ポリＡ含有）ＲＮＡのサンプルをウシ全下垂体、下垂体前葉、下垂体後葉、および視床下部から調製した。図２３（配列番号１０９〜１１９）に示されたリストからプライマーを用いて片側の（one-sided）ＰＣＲ反応（ＲＡＣＥ）が３′および５′の両方向でのｃＤＮＡ末端を増幅するために用いられ、アンカーされたＰＣＲ反応をさらなるＧＧＦ−IIペプチドを表す変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。図２４にそれらの実験においてえられた隣接するＤＮＡ構造および配列をまとめた。３′レース（RACE）反応から、クローン化および配列決定された３つの代わりに別のスプライシングされたｃＤＮＡ配列が産生された。５′レース反応により少なくとも５２のアミノ酸ためのコーディング配列を含むさらなるエクソンが発見された。その推定されたアミノ酸配列の分析によりペプチドＧＧＦ−II−６およびＧＧＦ−Ｉ−１８（以下参照）と類似の配列が示された。アンカーされたＰＣＲ反応により３００ｂｐの追加のｃＤＮＡセグメント内に含まれるペプチド（ＧＧＦ−II−１、２、３および１０）のコーディング（ｃＤＮＡ）配列が同定された。このセグメント（すなわち、セグメントＥ、図３１参照）の５′末端は、ペプチドＧＧＦ−II−１をコードし、ＰＣＲ反応に用いられる、オリゴヌクレオチドによって定義される。（追加の５′配列データは、実施例６のヒトクローンに記載したように存在する。）このようにこのクローンは存在する全部で９つの新規なＧＧＦ−IIペプチド配列のうち６つをコードするヌクレオチド配列を含む。クローン化された遺伝子は、見出されたような（以下、図２５参照）コーディング配列を位置づけることができる、ＧＧＦ２ＢＧ１の物理的地図を構成することによってまず特徴づけられた。前記したコーディング配列からのＤＮＡプローブは、このファージクローン上のエクソンを含むさらなるＤＮＡフラグメントを同定し、両方向で重複するクローンを同定するために用いられた。推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子は少なくとも５つのコーディングセグメントに分けたが、これまではコーディングセグメントＡおよびＢのみがエクソンとして定義され、配列決定され、マッピングされた。同定された隣接するコーディング配列の要約を図２６に示す。エクソンは発見された順に（アルファベット順に）列記した。イントロン／エクソンの境界から、エクソンＢが、コーディングセグメントＥおよびコーディングセグメントＡを接続するｃＤＮＡに含まれうることは明らかである。すなわち、リーディングフレームを傷つけることなく、エクソンＢをスプライシングされることができないのである。それゆえ、我々は、別の３つのスプライシングパターンが推定されるウシＧＧＦ −IIｃＤＮＡ配列１、２および３を産生しうることを示唆する。これらのコーディング配列、それぞれ、設計されたＧＧＦ２ＢＰＰ１．ＣＤＳ、ＧＧＦ２ＢＰＰ２．ＣＤＳおよびＧＧＦ２ＢＰＰ３．ＣＤＳを、それぞれ図２８ａ（配列番号１３３）、２８ｂ（配列番号１３４）および図２８ｃ（配列番号１３５）に示す。また３つのｃＤＮＡの推定されたアミノ酸配列も図２８ａ、図２８ｂおよび図２８ｃ（それぞれ配列番号１３３〜１３５）に示す。３つの推定された構造は長さ２０６個、２８１個および２５７個のアミノ酸のタンパク質をコードする。推定されたタンパク質配列の最初の１８３残基が３つの遺伝子産物すべてにおいて同一である。１８４位でクローンは大きく異なる。また、ＧＧＦ２ＢＰＰ１におけるグリシンＧＧＴのコドンは、ＧＧＦ２ＢＰＰ２およびＧＧＦ２ＢＰＰ３に対するスプライスドナーとして働き、これら配列は代わりに図３３（配列番号１４９）に示される、それぞれエクソンＣ、Ｃ／Ｄ、Ｃ／Ｄ′およびＤまたはエクソンＣ、Ｃ／ＤおよびＤ上に加える。ＧＧＦ２ＢＰＰ１はコーディングセグメントを越えてつぎの介在する配列（イントロン）へのスプライス接合点を読みとることによって産生される切断された遺伝子産物である。これは図３１（配列番号１４０、１６８）においてコーディングセグメントＡ ′を表している。転写は規定（canonical）のＡＡＴＡＡＡポリアデニル化配列に隣接して終了し、我々はこの切断された遺伝子産物が真実の（bonafide）成熟転写を表すことを示唆する。ほかの２つのより長い遺伝子産物は同じ３′翻訳されていない配列およびポリアデニル化部位を共有する。これら３つのすべての分子は９つの新規なＧＧＦ−IIペプチド配列のうち６つを有し（図１２参照）、もう一つのペプチドはＧＧＦ−Ｉ−１８と相同性が高い（図２７参照）。この所見は、この組換え体分子がウシＧＧＦ−IIの少なくとも一部をコードする可能性が高いことを示している。さらに、３つのペプチドに対する計算された等電点はＧＧＦ−ＩおよびIIの物理的性質と一致している。ＧＧＦ−２の分子サイズは約６０ｋｄであるので、３つのｃＤＮＡのうち最も長いものは、予想されるアミノ酸の数のほぼ１．５倍でタンパク質をコードするであろう。ＢおよびＡのエクソンを包囲するプローブは、ＰＣＲ増幅により標識され、ウシ下垂体後葉から単離されたＲＮＡで作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた。１つのクローン（ＧＧＦ２ＢＰＰ５）は図３０に示すパターンを示し、コーディングセグメントＡおよびＣ間の追加のＤＮＡコーディングセグメント（Ｇ）を含んでいた。全核酸配列は図３２（配列番号１４８）に示す。最も長いオープンリーディングフレームから予測される翻訳産物は２４１個のアミノ酸である。また２つめのｃＤＮＡ（ＧＧＦ２ＢＰＰ４）の一部を、前述したプローブを用いてウシ下垂体後葉ライブラリーから単離した。このクローンは図３０に示すパターンを示した。このクローンは５′末端では不完全であるが、コーディングセグメントＧおよびＤを欠損しているセンスにおけるスプライシング変異体である。またＢＰＰ４はＣ／Ｄ領域を越えてＨ、ＫおよびＬ領域を有する新規な３′末端を表す。ＢＰＰ４の配列は図３４（配列番号１５０）に示す。実施例５様々な種におけるＧＧＦ配列コンピューターデータベース調査では、いかなる予測されるＧＧＦ翻訳産物と既知のタンパク質配列とでは、いかなる有意義な類似性も示さなかった。このことは、ＧＧＦ−IIがタンパク質の新規なファミリーもしくはスーパーファミリーの最初のメンバーであることを示唆している。他の哺乳類のＤＮＡとの極めて厳格なクロスハイブリダイゼーション研究（ＤＮＡブロッティング実験）において、我々は、このウシ組換え体分子からのＤＮＡプローブが、種々の被験サンプルにおいて特異な配列を容易に検出しうることを明確に示した。また相同性の高い配列がヒトゲノムＤＮＡで検出された。オートラジオグラムを図２９に示す。ラットおよびヒトのＤＮＡを含む、系（lane）におけるシグナルはラットおよびヒトの等価のＧＧＦを表し、その配列はホルムズ（Holmes）ら（（１９９２）、サイエンス、２５６巻、１２０５頁）およびウェン（Wen）ら（（１９９２年）、セル、６９巻、５５９頁）によって最近報告された。実施例６ヒトＧＧＦ２をコードするヒトの配列の単離ウシＧＧＦ−IIコーディングセグメントＥに相同な配列を含むいくつかのヒトクローンは、脳幹から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離された（ストラタジーンカタログ＃９３５２０６）。この方法は、ほとんどのＧＧＦ２ペプチド（ＧＧＦ２に特有）とウシＥセグメントを含むクローンからの予測されるペプチド配列との強い結合（link）にもとづいて行なわれた。このライブラリーは、以下にあげたオリゴヌクレオチドプローブ９１４〜９１９を用いて実施例４のセクションIIに記載したようにスクリーニングした。９１４ TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA ９１５ TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT ９１６ ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA ９１７ TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA ９１８ AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA ９１９ ATGARGTGTGGGCGGCGAAA これらのプローブで検出されたクローンは、ハイブリダイゼーションによってさらに分析した。またセグメントＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を標識することによって産生された、コーディングセグメントＡ（図２１参照）に由来するプローブは、プライマリーライブラリーをスクリーニングするために用いた。ＡおよびＥに由来するプローブでハイブリダイズされたいくつかのクローンが選択され、１つの特別なクローン、ＧＧＦ２ＨＢＳ５がさらなる分析のために選択された。このクローンは、コーディングセグメントのパターン（図３１に示されるＥＢＡＣＣ／Ｄ′Ｄ）によって表される。このクローンのＥセグメントは、図３７に示されるＥの切断されたウシバージョンに等価なヒトのセグメントである。ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、記載されたすべての「推定される」ＧＧＦ−II候補のＧＧＦ−IIをコードするのに最も好ましい候補である。コーディング配列セグメントＥの長さは７８６ヌクレオチドに非翻訳配列の２６４塩基を加えたものである。ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされたタンパク質の予測される大きさは約４２３アミノ酸（約４５キロダルトン）であり、ＧＧＦの脱グリコシル化された形態のもの（deglycosylated form）の大きさと類似している（実施例１５参照）。さらに図２７にあげたＧＧＦIIペプチドのうち７つはＥ領域から予測されるタンパク質配列に入る等価な配列を有する。ペプチドII−６およびII−１２はそれぞれコーディングセグメントＢおよびコーディングセグメントＡに入るが除外する。ＧＧＦ２ＨＢＳ５タンパク質をコードするＲＮＡは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５挿入物を含むベクター（ブルースクリプトエスケー（Bluescript S K）［ストラタジーンインク］図４４参照）に内在するバクテリオファージＴ７プロモーターによって行なわれたインビトロ転写系において産生された。このＲＮＡは無細胞（ウサギ網状赤血球）翻訳系で翻訳することができ、そのタンパク質産物の大きさは４５Ｋｄであった。さらに、無細胞産物は、生物学的活性を確認するためにシュワン細胞分裂促進アッセイでアッセイした。コンディションドメディウム（ｃonditioned medium）で処理されたシュワン細胞は、¹²⁵ウリジンの取り込みによって測定された増殖、および１８５キロダルトンの範囲内のタンパク質のチロシンリン酸化の両方が増加を示す。こうして、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされた産物のサイズ、および図１２で示されるウシペプチドと相同性の高いヒトペプチドをコードするＤＮＡ配列の存在から、ＧＧＦ２ＨＢＳ５がウシＧＧＦ２と等価のヒトの配列をコードすることが確かめられる。このクローンで形質転換された細胞から調製された条件培地がシュワン細胞の分裂促進活性を引き出すという事実から、ＧＧＦIIＨＢＳ５遺伝子産物（ＢＰＰ５遺伝子産物とは似ていない）が分泌されることが確かめられる。さらに、ＧＧＦＢＰＰ５遺伝子産物はｐ１８５^erbB2などの受容体チロシンキナーゼまたは密接に関連する受容体を介して、シュワン細胞増殖応答を媒介するようである（実施例１３参照）。実施例７ウシＧＧＦに関連するヒトの配列の単離実施例５の結果から、ＧＧＦに関連するヒトのソース（source）からの配列も、ウシＧＧＦ配列由来のＤＮＡプローブを用いて容易に単離できることが示される。あるいは、ホルムズらによって記載された方法（１９９２年、サイエンス、２５６巻、１２０５頁）が用いられうる。本実施例においては、ｐ１８５^erbB2 受容体と結合してこの受容体を活性化する（およびＧＧＦと関連する）、ヒトのタンパク質（ヘレグリンα）が腫瘍細胞系から精製され、えられた(derived)ペプチド配列は、ヘレグリンをコードするｃＤＮＡをクローンするために利用されたオリゴヌクレオチドプローブを産生するために用いられる。これは、視床下部ｃＤＮＡからＧＧＦ配列をクローニングするために実施例１〜４で用いられたものとよく似た方法である。ヘレグリンタンパク質および相補的ＤＮＡは以下の手順にしたがって単離した。ヘレグリンは、パーセルバイオリチカマイクロキャリヤービーズ（Percell Biolytica microcarrier beads）（ハイクローンラブズ（Hyclone Labs））上で育成されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣ ♯ＨＴＢ２６）によってコンディションされた培地から精製した。培地（１０リットル）は膜（10-kD カットオフ）（ミリポア（Millipore））で濾過することによって２５倍まで濃縮し、遠心分離およびフィルター（０．２２μｍ）で濾過することによって浄化された。濾過物はヘパリンセファロースカラム（ファルマシア（Pharmacia））に付し、タンパク質をリン酸塩緩衝生理食塩水で０．３、０．６および０．９ＭＮａＣｌの段階で溶出した。種々のクロマトグラフィー画分での活性を、ＭＣＦ−７胸部腫瘍細胞（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ２２）においてｐ１８５^erbB2のチロシンリン酸化の増大を定量することにより測定した。ＭＣＦ−７細胞を血清（１０％）を含むＦ１２（５０％）ダルベッコ（Dulbecco ）の最小必須培地（５０％）において２４ウェルのコスター（Costar）プレートにまき（ウェルあたり１０⁵細胞）、２４時間以上接着させた。アッセイに先立って、細胞は、最低１時間、無血清培地へ移した。カラム画分（１０〜１００μ ｌ）を３７℃で３０分間インキュベートした。つぎに、上清を吸引し、ＳＤＳ− ＰＡＧＥサンプル緩衝液（１００μｌ）を添加することにより反応を停止した。サンプルを１００℃で５分間加熱し、部分（１０〜１５μｌ）をトリスーグリシンゲル（４〜２０％）（ノベックス（Novex））に付した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜上でエレクトロブロッティングして、ツイーン２０（Tween-20）（０．０５％）を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST）中でウシ血清アルブミン（５％）でブロックした。ブロットは室温で最低１時間、ホスホチロシン（アップステートバイオテクノロジー（Upstate Biotechnology））に対するモノクローナル抗体（１：１０００に希釈）でプローブした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、室温で最低３０分アルカリホスファターゼ（プロメガ（Promega））に結合（conjugate）したマウスイムノグロブリンＧに対する抗体（１：７５００に希釈）でプローブした。反応性のバンドは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−１−リン酸塩およびニトローブルーテトラゾリウムで視覚化した。イムノブロットはスキャンジェットプラス（Scan Jet Plus）（ヒューレットーパッカード（Hewlett-Pac kard））濃度計を用いてスキャンした。剌激されていないＭＣＦ−７細胞に対するシグナル強度は２０〜３０単位であった。充分に刺激されたｐ１８５^erbB2は１８０〜２００単位のシグナルを生じた。ほとんどの活性を含んだ０．６ＭのＮａＣｌプール（pool）は、エタノール（３０％）を含有する１７ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で平衡化されたポリアスパラギン酸（PolyLC）カラムに付した。平衡緩衝液（equilibration buffer）において０．３Ｍから０．６ＭまでのＮａＣｌの直線勾配を結合タンパク質を溶出するために用いた。さらに活性のピーク（０．４５ＭまでのＮａＣｌにおいて）を、ＴＦＡ（０．１％）およびアセトニトリル（１５％）を含む緩衝液で平衡化されたＣ４逆相カラム（シンクロパック（SynChropak）ＲＰ−４）で分画した。タンパク質を６０分をこえて２５％から４０％までのアセトニトリル勾配でこのカラムから溶出させた。画分（１μｌ）を集めて、活性をアッセイし、トリス−グリシンゲル（４〜２０％、ノベックス（Novex））におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＰＬＣで精製されたＨＲＧ−αは、３７℃で２０時間、ＳＤＳ中リジンＣ（０．１％）、１０ｍＭジチオスレイトール（dithiothreitol）、０．１ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８．０）を用いて溶解し、生じたフラグメントをシンクロム（ Synchrom）Ｃ４カラム（４０００Å、０．２×１０ｃｍ）で分解した。前記カラムは０．１％ＴＦＡで平衡化し、０．１％ＴＦＡ中１−プロパノールの勾配で溶出した（ヘンゼル（Henzel）ら（１９８９）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、２６４巻、１５９０５頁）。クロマトグラフィーの実施からのピークを真空下で乾燥し、配列決定した。ペプチドの１つ（２４％までの１−プロパノールで溶出）は［A］AEKEKTF［C］VNGGEXFMVKDLXNP の配列（配列番号１６２）であった。角カッコ内の残基は不確定で、Ｘはアミノ酸を同定することができないサイクルを表す。最初の収率は８．５ｐｍｏｌで、配列はいかなる既知のタンパク質とも対応しなかった。のちに、残基１、９、１５および２２はシステインとしてｃＤＮＡ配列において同定された。過負荷され、ＰＶＤＦ膜にブロットされた、ゲルからの４５−ｋＤ以下のバンドの直接配列決定では、最初のきわめて低い収率（０．２ｐｍｏｌ）で発達量（adundance）の低い配列 XEXKE［G］［R］ GK ［G］ K ［G］KKKEXGXG 「K］（配列番号１６９）を示した。これは、セリン２がｐｒｏＨＲＧ−αのＮＨ₂末端であることを示唆しているので、ヘレグリンーαのアミノ酸残基２〜２２（図３１）に対応していた。ＮＨ₂末端はブロックされていたにもかかわらず、少量の正常にブロックされたタンパク質が時折翻訳後に修飾されないであろうことが観察された。ＮＨ₂末端の割り当て（assignmen t）は臭化シアンを用いて溶解したのち、タンパク質の質量分析法によって確認した。単離されたタンパク質のＣＯＯＨ末端は明確には同定されていなかったが、タンパク質分解分解物（proteolytic digests）の混合物の配列決定によって、成熟配列が後残基（past residue）２４１を延長するとは思えない。アミノ残基の略号は：Ａ、Ａｌａ；Ｃ、Ｃｙｓ；Ｄ、Ａｓｐ；Ｅ、Ｇｌｕ；Ｆ、Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ；Ｈ、Ｈｉｓ；Ｉ、Ｉｌｅ；Ｋ、Ｌｙｓ；Ｌ、Ｌｅｕ；Ｍ、Ｍｅｔ；Ｎ、Ａｓｎ；Ｐ、Ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｌｎ；Ｒ、Ａｒｇ；Ｓ、Ｓｅｒ；Ｔ、Ｔｈｒ；Ｖ、Ｖａｌ；Ｗ、Ｔｒｐ；およびＹ、Ｔｙｒである。ｃＤＮＡクローンのソースとしてオリゴ（ｄＴ）がプライマーとしてついた（ oligo(dT)-primed）λｇｔ１０（ハーン（Hurn）ら（１９８４）λｇｔ１０およびλｇｔ１１ＤＮＡクローニングテクニックス（λｇｔ１０ａnd λｇｔ１１ DNA Cloning Techiques）：ア・プラクティカル・アプローチ（A Practical A pproach）ｃＤＮＡライブラリーが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から精製されたｍＲＮＡ（チャーウィン（Chirwin）ら（１９７９）バイオケミストリー（Bio chemistry）、１８巻、５２９４頁）を用いて構築された（ガブラー（Gubler）およびホフマン（Hoffman）、１９８３年、ジーン（Gene）、２５巻、２６３頁）。１３のアミノ酸配列 AEKEKTFCVNGGE （配列番号１６４）をコードする以下の８倍の変性アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドは、ヒト・コドン・フリークエンシー・オプテイマ（human codon frequency optima）（ラス（Lathe）（１９８５）ジェイ・モル・バイオル（J.Mol. Biol.）、１８３巻、１頁）にもとづいて設計され、化学的に：５′−CTCGCC（ＧまたはＴ） CC （ＡまたはＧ）TTCAC（ＡまたはＧ）CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC−３′（配列番号１６５）が合成された。プローブ設計のために、システインがアミノ酸配列の未知の残基にわりあてられた。プローブはリン酸化により標識し、ｃＤＮＡライブラリーに対して、厳しくない条件下でハイブリダイズした。ｐｒｏＨＲＧ−αタンパク質はこのライブラリーで同定された。ＨＲＢ−β１ｃＤＮＡは、ｐｒｏＨＲＧの５′ および３′の両末端から誘導された配列を用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡから作製された２つめのオリゴ（ｄＴ）がプライマーとしてついたλｇｔ１０ライブラリーをプローブすることによって同定した。クローン１３（図２Ａ）は５′ＨＲＧ配列を用いてプライマー化された（５′−CCTCGCTCCTTCTTCTTGCCCT TC−３′プライマー；ｐｒｏＨＲＧ−αアンチセンスヌクレオチド３３〜５６）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１λｇｔ１０ライブラリーのスクリーニング産物であった。プローブとしてクローン１３の５末端に対応する配列は、ＭＤＡ −ＭＢ−２３１細胞のｍＲＮＡから誘導された３つめのオリゴ（ｄＴ）がプライマーとしてついたλｇｔ１０ライブラリーにおいて、ｐｒｏＨＲＧβ２およびｐｒｏＨＲＧβ３を同定するために用いられた。４つのＨＲＧのそれぞれをコードする２つのｃＤＮＡクローンが配列決定された（サンガー（Sanger）ら（１９７７）ＰＮＡＳ（米国）、７４巻、５４６３頁）。もう一つのｃＤＮＡによるクローン８４（cDNA designated clone 84）はアミノ酸４２０を介して、ｐｒｏＨＲＧβ２と同一のアミノ酸配列を有している。４２１位の停止コドンのあとに異なる３′−未翻訳配列が続く。実施例８さらなるスプライシング変異体の単離実施例７の方法により、スプライシング多様性の結果としておこる近密に関連した４つの配列（ヘレグリンα、β１、β２、β３）を産生した。ペレス（Pele s）ら（１９９２）セル、６９巻、２０５頁）およびウェン（Wen）ら（１９９２）セル、６９巻、５５９頁）は、ｐ１８５に結合するタンパク質を含む実施例１〜４および７に記載されたものと類似した精製法およびクローニングアプローチを用いて（ラットから）さらなるスプライシング変異体を単離した。ｃＤＮＡクローンは、（形質転換されたラット線維芽細胞系からのｐ１８５^erbB2結合タンパク質を精製して配列決定することににより）以下のようにえられた。ｐ１８５^erbB2結合タンパク質は以下のようにコンディションドメディウムから精製した。５００本のローラー（roller）ボトル（全量１２０リットル）の３つの収穫物からプールされたコンディションドメディウムは、０．２μのフィルターで濾過することにより浄化し、２０ｋｄ分子サイズカットオフの膜を用いてペリコン（Pelicon）限外濾過システムにより３１倍に濃縮した。すべての精製段階は、ファルマシアファストプロテイン（Pharma cia fast protein）液体クロマトグラフィーシステムを用いて行なった。濃縮物は直接ヘパリンーセファロースカラムに付した（１５０μｌ、あらかじめリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）で平衡化された）。カラムは、２８０ｎｍの波長で吸光度が検出されなくなるまで、０．２ＭＮａＣｌを含むＰＢＳで洗浄した。そののち結合タンパク質はＮａＣｌ（０．２Ｍから１．０Ｍまで）の連続勾配（２５０μｌ）で溶出し、５μｌの画分を収集した。サンプル（収集された画分の０．０１μｌ）はキナーゼ刺激活性の定量アッセイのために用いた。３つのカラム実施（全量＝３６０μｌ）からの活性画分をプールして、ＹＭ１０限外濾過膜（アミコン（Amicon）、ダンバース（Danvers）、マサチューセッツ州）を用いて２５μｌにまで濃縮し、硫酸アンモニウムを１．７Ｍの濃度になるまで加えた。遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間）による浄化後、プールされた材料をフェニルースーパーロース（phenyl-Superose）カラム（ＨＲ１０／１０、ファルマシア）に付した。カラムは０．１ＭＮａ₂ＰＯ（ＰＨ７．４）中で４５μｌの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄勾配（１．７Ｍから無塩まで）で展開され、２μｌの画分を収集し、（実施例７に記載のように）キナーゼ剌激についてアッセイされた（サンプルあたり０．００２μｌ）。主な活性ピークをプールし、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に対して透析した。モノ−Ｓ（Mono-S）陽イオン交換カラム（ＨＲ５／５、ファルマシア）は５０ｍＭリン酸ナトリウムを用いてあらかじめ平衡化した。活性材料（タンパク質０．８８４ｍｇ；３５μｌ）をかけたのち、カラムは開始用緩衝液で洗浄し、１μｌ／分の速度でＮａＣｌの勾配で展開した。キナーゼ剌激活性は０．４５〜０．５５Ｍの塩で回収され、各２μｌの４つの画分に渡っていた。これらをプールし、直接Ｃｕ⁺²キレーティングカラム（１．６μｌ、ＨＲ２／５キレーティングスーパーロース（chelating Superose）、ファルマシア）に付した。ほとんどのタンパク質は樹脂に吸収されたが、それらは順次３０．μｌの塩化アンモニウムの直接勾配（０〜１Ｍ）で溶出された。活性は０．０５〜０．２ＭＮＨ₄Ｃｌの範囲で単一のタンパク質のピークに溶出された。種々の精製段階からのサンプルはゲル電気泳動をしたのちＩＣＮからのキット（コスタメサ（Costa Mesa）、カリフォルニア州（CA））を用いて銀染色して分析し、それらのタンパク質の含有量はバイオーラッド（Bio-Rad）（リッチモンド（Richmond）、カリフォルニア州）からのキットを用いて、クマシーブルー染色結合アッセイで決定された。ｐ４４タンパク質（１０μｇ）は、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）２００ｐｌ中で再構築した。溶解は１：１０の酵素−基質比で３７℃ 、１８時間、Ｌ−１−トシル−アミド２−フェニルエチルクロロメチルケトンで処理された（L-1-tosyl−amide 2-ph enylethyl chloromethyl ketone-treated）トリプシン（セルバ（Serva））を用いて行なわれた。えられたペプチド混合物は逆相ＨＰＬＣにより分離し、ビダック（Vydac）Ｃ４マイクロカラム（２．１ｍｍ内径×１５ｃｍ、３００）およびダイオードアレイ（diode-array）検出機およびワークステーションを備えたＨＰ１０９０液体クロマトグラフィーシステムを用いて２１５ｎｍでモニターした。カラムは０．１％のトリフルオロ酢酸（移動相（mobile phase）Ａ）で平衡化され、溶出は７０分を越えて０％〜５５％の移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸中９０％アセトニトリル）の直線勾配で達成した。流速は０．２μｌ／分で、カラム温度は２５℃に調節した。ＨＰＬＣシステムから手動で収集したペプチドピークの１／３アリコートはエドマン（Edman）分解によるＮ末端配列分析によって特徴付けられた。２７．７分後溶出された画分（Ｔ２７．７）は、混合アミノ酸配列を含有し、さらに以下のような還元ののち、再びクロマトグラフィーにかけた。ペプチド画分の７０％アリコートを真空下で乾燥し、０．２Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）１００μｌに再構築した。ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を溶液に加え、そののち、３７℃で３０分間インキュベートした。つぎに、還元されたペプチド混合物は、ビダックカラム（２．１ｍｍ内径×１５ｃｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣにより分離した。溶出条件および流速は前記のものと同一にした。ペプチドのアミノ酸配列分析は、オンライン式のフェニルチオヒダントイン（PTH）アミノ酸分析機およびモデル９０データ分析システム（ヒュンカピラー（Hunkapiller）ら、１９８６年）が備えられたモデル４７７タンパク質シークエンサー（アプライドバイオシステムズインク（Applied Biosystems, Inc.）フォスターシテイ（Foster City）、カリフォルニア州）を用いて行なわれた。タンパク質はポリブレン（polybrene）およびＮａＣｌであらかじめ環化されたトリフルオロ酢酸処理された、ガラスファイバーディスクにかけられた。ＰＴＨ−アミノ酸分析は、デュアルシリンジポンプおよび逆相（Ｃ−１８）の狭い内径のカラム（アプライドバイオシステムズ、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いてマイクロ液体クロマトグラフィーシステム（モデル１２０）により行なわれた。ＲＮＡは標準手順（マニアティス（Maniatis）ら、１９８２年、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning ：A La boratory Manual）によりラット１−ＥＪ細胞から単離し、ポリ（Ａ）⁺がｍＲＮＡセパレーターキット（Separator kit）（クローンテックラブインク（Clo ntech Lab,Inc.）、パロ（Palo）、アルト（Alto）、カリフォルニア州）を用いて選択した。ｃＤＮＡはスーパースクリプトキット（Superscript kit）（ＢＲＬライフテクノロジーズインク（BRL Life Technologies,Inc.）、ベセスダ（Bethesda）、ミシシッピー州（MS））により合成された。カラム分画された二本鎖のｃＤＮＡは、ＳａｌｌおよびＮａｃｌで溶解されたｐＪＴ−２プラスミドベクター、ｐＣＤ−Ｘベクター（オカヤマ（Okayama）およびバーグ（Berg ）（１９８３）モル・セル・バイオル（Mol.Cell Biol.）、３巻、２８０頁）の誘導体に連結させ、エレクトロポレーション（electroporation）によってＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞を形質転換した（ダウアー（Dower）ら、１９８８年、ニュークル・アシッズ・レス（Nucl. Acids Res.）、１６巻、６１２７頁）。約５×１０⁵の主要な形質転換体は、ＮＤＦのＮ末端のタンパク質配列（残基５〜２４）およびＴ４０．４トリプシンのペプチド（残基７〜１２）から誘導された２つのオリグヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングした。それら各配列は以下のとおりである（Ｎはすべて４ｎｔを示す）。（１：配列番号１６７；２：配列番号１６８）合成オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−³²Ｐ］ＡＴＰにより末端を標識し、ニトロセルロースフィルターの複製セットをスクリーニングするために用いた。ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％リン酸ナトリウム、２×デンハート（Denhardt′ｓ）溶液、５０μｇ／ｍｌサーモン精子ＤＮＡ，および２０％ホルムアミド（プローブ１用）もしくは（ホルムアミドを用いないプローブ２用）を含んでいた。フィルターは、０．５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、２ｍＭＥＤＴＡを用いて５０℃で（プローブ１用）、または２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、２ｍＭＥＤＴＡを用いて３７℃（プローブ２用）で洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーにより両プローブを用いてハイブリダイズされた１０クローンをえた。これらのクローンは前記のように再びプレートにまくことおよびプローブハイブリダイゼーションにより精製した。ｃＤＮＡクローンは製造者の指示にしたがってアプライドバイオシステムズ３７３Ａ自動化ＤＮＡシークエンサーおよびアプライドバイオシステムズタクダイデオキシ（Taq DyeDeoxy）（商品名）ターミネーター（Terminator）サイクル配列決定キットを用いて配列決定した。いくつかのばあい、配列は製造者の指示にしたがって、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（アマーシャム（Amersham））およびＵ．Ｓ．バイオケミカルズ（U.S.Biochemicals）からのシークエナーゼ（Sequenas e）（商品名）キットを用いてえられた。ｃＤＮＡクローン４４の両鎖はプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いることによって配列決定した。ほとんどの５′の３５０ｎｔの配列が７つの独立したｃＤＮＡクローンにおいて決定された。えられたクローンは図３０に示すパターン（ＮＤＦ）を証明した。実施例９ほかの可能なスプライシング変異体ウシのｃＤＮＡクローンおよびＰＣＲ産物の推定されたアミノ酸配列の整列（ alignment）および公表されたヒト（図３１）およびラットの配列は、類似性が高いことを示しており、それは、これらの配列が３つの種内の相同遺伝子に由来することを示している。ｃＤＮＡ／ＰＣＲ産物レベルで検出可能な様々な数のメッセンジャーＲＮＡ転写物はおそらく広範な組織特異的スプライシングによるであろう。えられた図３０に示すパターンはほかのスプライシング変異体が存在することを示している。可能なスプライシング変異体のリストを以下に示す。これらの変異体の多くは、別々の組織に由来するｃＤＮＡライブラリーのプロービングに特異的なコーディングセグメントによってえられうる。あるいは、前記変異体は、当業者に知られた切除およびスプライシング技術により、特異的な（ｃＤＮＡクローンから切り出された）ｃＤＮＡクローン、ＰＣＲ産物またはゲノムＤＮＡ領域から集められた。これらの変異体配列は、組換えシステムで発現することができ、組換え産物は、ｐ１８５^erbB2受容体を結合および活性する能力と同様にシュワン細胞分裂促進活性のレベルを決定するために、アッセイすることができる。実施例１０ＧＧＦの機能的要素ＧＧＦ配列のファミリーの推定された構造により、（ＧＧＦ２ＢＰＰ４で示されるような）最も長い形が、細胞外部分が上皮成長因子に類似のドメインを含有している膜貫通タンパク質をコードすることが示される（ペプチド・グロース・ファクターズ・アンド・ゼア・レセプターズＩ（Peptide Growth Factors and Their Receptors Ｉ）６９〜１３３頁、スプリンジャーバーラグ（Springer-V erlag）、ニューヨーク州（NY）１９９１年におけるカーぺンター（Carpenter）およびワール（Wahl）参照）。コーディングセグメントＣおよびＣ／ＤまたはＣ／Ｄ′ペプチド配列におけるシステイン残基の位置は、上皮成長因子（EGF）ペプチド配列中の類似残基に関して保持されている。このことにより、細胞外ドメインが受容体認識および生物学的活性化（actiration）部位として機能することが示唆される。いくつかの変異体はＨ、Ｋ、およびＬコーディングセグメントを欠いており、そのため分泌される、拡散可能な生物学的に活性なタンパク質として発現されうる。ありそうな構造を図３５に示す。このタンパク質の膜結合バージョンは、胚形成の際または神経再生の際にニューロンの表面上に発現されれば（その際ニューロンの表面は増殖中のシュワン細胞の表面と密接に関連する）、シュワン細胞増殖を誘導しうる。分泌される（非膜結合）ＧＧＦ類は、それらの分泌点からいく分離れたシュワン細胞と相互作用することのできる古典的に拡散可能な因子として作用しうる。分泌されるＧＧＦの一例は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によりコードされるタンパク質である（実施例６参照）。ＧＧＦ２ＢＰＰ５によりコードされるＧＧＦなどのほかのＧＧＦ類は、非分泌のようである（実施例６参照）。これらのＧＧＦ類は、組織障害の結果として放出される損傷応答形態のものであるかもしれない。実施例１１抗増殖作用を有するスプライシング変異体ひとつの特定のスプライシング変異体（ＧＧＦ２ＢＰＰ１）が実施例４に記載されている。ＧＧＦ２ＢＰＰ１は、コーディングセグメントＡスプライスジャンクションをへて隣接するゲノム配列へリーディングすることによって産生される、切断された遺伝子産物である。これは図３１のコーディングセグメントＡ′を表す。転写は、特徴的ＡＡＴＡＡＡポリアデニレーション配列の近くで終わる。このスプライシング変異体は、領域Ｆ、Ｅ、ＢおよびＡ′を含有する。ほかの可能なこれの変異体は、領域Ｅ（Ｆ、Ｂ、Ａ′）を欠いていてもよい。実施例１０に記載のように、領域Ｃ、Ｃ／Ｄ、またはＣ／Ｄ′はＥＧＦと相同であり、生物学的活性の原因となる部位であるのに最も適当である。ＧＧＦ２ＢＰＰ１は、受容体活性化能力を失うが、受容体結合活性を維持することができるであろう。そのようなリガンドは、活性ＧＧＦ／ｐ１８５ｅｒｂＢ２リガンド（たとえばＧＧＦ２ＢＰＰ５）とレセプター結合について競合するため、拮抗剤として機能するであろう。領域Ｅを含有するスプライシング変異体などのほかのスプライシング変異体も、前記のように拮抗剤として機能しうる。領域Ｅによりコードされるもののような過剰のドメインの存在により、受容体結合のあとに起こる生物学的活性をそこなう構造上の差異が生じうる。ＧＧＦ２ＢＰＰ２も阻害剤分子となりうる。ＧＧＦ２ＢＰＰ２中の領域Ｃ／Ｄに加えて領域Ｃ／Ｄ′の存在により、生物学的活性を欠いたタンパク質を潜在的に生じうるＥＧＦ関連領域に、配列が加えられる。ＧＧＦ２ＨＢＳ１１はもう１つの潜在的阻害剤分子である。このクローンは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５の単離について実施例６において記載したのと同じ方法およびプローブを用いて、ヒト脳幹ライブラリーから単離した。ＧＧＦ２ＨＢＳ１１クローンは、ほかのいかなる既知の領域にも含まれない新しい配列によってフランキングされる、領域Ｅの一部を含む。領域Ｃ、Ｃ／ＤまたはＣ／Ｄ′が欠失していることから、ＧＧＦ２ＨＢＳ１１も生物学的活性を欠いているであろうことが示唆される。実施例１２組換え細胞からの抗増殖因子の精製抗増殖因子をえて生物学的活性をアッセイするため、タンパク質をクローン化されたＤＮＡを用いて過剰産生することができる。いくつかのアプローチを用いることができる。実施例１１で記載した配列を含有する組換え大腸菌細胞を構築することができる。この目的のためにｐＮＨ８ａ（ストラタジーン、インク（St ratagene,Inc.））などの発現システムを、製造業者の手法にしたがって用いることができる。そうする代わりに、これらの配列を哺乳動物の発現ベクターに挿入し、過剰産生細胞系を構築することもできる。一例として、この目的のためにＧＧＦ２ＢＰＰ１をコードするＤＮＡをＣＯＳ細胞中で発現することができ、またはｐＭＳＸＮＤ発現ベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞中で発現させることができる（リー（Lee）およびナサンス（Nathans）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）２６３巻、３５２１〜３５２７頁（１９８１））。ＧＧＦのＤＮＡ配列を含有するこのベクターは、確立された手順を用いて宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。一時的な発現を調べることが可能であり、（ｐＭＳＸＮＤベクター上に含まれる）ＤＨＦＲ遺伝子を増幅する細胞を選択すべく、Ｇ４１８耐性クローンをメトトレキセートの存在下で増殖させ、その工程において隣接するタンパク質をコードする配列を共増幅（co-amplify）することができる。ＣＨＯ細胞は完全な無タンパク質培地中で維持することができる（ハミルトン（Hamilton）およびハム（ Ham）、イン・ビトロ（In Vitro）１３巻、５３７〜５４７頁（１９７７））ので、所望のタンパク質を培地から精製することができる。過剰産生細胞のコンディションドメディウム中の所望のタンパク質の存在を検出するために、実施例９で作製した抗血清を用いたウエスタン分析を用いることができる。所望のタンパク質は、実施例１で記載したタイプの手法を用いて、大腸菌溶菌液またはＣＨＯ細胞コンディションドメディウムから精製することができる。ウエスタンブロットアッセイを用いて、手順の中の様々なポイントでタンパク質をアッセイすることもできる。実施例１３抗増殖因子の設計およびアッセイ先にならびに図３５および図３９〜４５に示したように、ＧＧＦコーディングセグメントはＥＧＦ様相同性を有する領域を含有する。これらのＥＧＦ様ドメインは、そのようなドメインを含有するＧＧＦリガンドとｅｒｂＢ２受容体との間の結合反応における分裂促進誘発の活性化に必要とされうる。既に開示したように、天然に生じるＧＧＦコーディング配列の産物で分裂促進活性を有するものと抗増殖活性を有するものとの比較によって、このことがさらに支持される。結果として、好ましい抗増殖因子は、これらのＥＧＦ様ドメインを欠いたものである。このようにして設計された抗増殖因子は、Ｃ、Ｃ／ＤまたはＣ／Ｄ′コーディングセグメントのすべてまたは一部を欠いているであろう。この設計戦略を用いた抗増殖活性を有するであろうそのような因子の例を図３７に示し、本発明の開示に記載した。既に記載した基準を用いて実施例１２で作製した組換えタンパク質を、以下に記載するようにアッセイすることができる。ここで記載するシュワン細胞分裂促進アッセイは、完全長クローンの発現産物またはそのあらゆる生物学的に活性な部分をアッセイするのに用いることができる。当業者は、（ヘレグリンを含む）ＧＧＦ遺伝子由来のスプライシング変異体相補的ＤＮＡ類のファミリーのあらゆるメンバーを、このようにして発現し、シュワン細胞の増殖アッセイでアッセイすることができる。ＧＧＦアッセイにおける抗増殖活性は、競合アッセイによって調べることができる（チャン（Chan）ら、サイエンス（Science）２５４巻、１３８３頁（１９９１））。様々な濃度の（ＧＧＦ２ＢＰＰ１のような）組換え抗増殖ＧＧＦ変異体を、ＧＧＦの存在下、シュワン細胞培養物に加えることができる。培養物の分裂促進活性を、ＧＧＦのみで処理されたコントロールと比較することによって、抗増殖活性の程度を測定することができる。これによって、用量依存阻害の測定を行なうことができる。応答の特異性は、さまざまな濃度の抗増殖因子の、他の成長因子の分裂促進活性およびその標的細胞（たとえばＥＧＦ）への効果を調べることにより測定することができる。組換えＧＧＦ変異体の抗増殖活性は、乳癌細胞においても調べることが可能である。ＧＧＦ′ｓ／ｐ１８５erbB2リガンドに応答して増殖するＳＫ−ＢＲ−３のような細胞系は、先でシュワン細胞について述べたのと類似方法でアッセイすることができる。（前記のように）抗増殖活性を示す、Ｉ¹²⁵で標識されたＧＧＦ変異体がｅｒｂＢ２受容体に結合するかどうかを決定するため、クロスリンキング試験を行なうことができる（チャンら、サイエンス２５４巻、１３８３頁（１９９１））。クロスリンクされたタンパク質をｅｒｂＢ２受容体に対する抗体で免疫沈降させることにより結合を証明することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵＣ０７Ｋ 14/52 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 7055−2Ｊ 33/577 Ｂ 7055−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4ＣＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＡ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡＡＤＵ (31)優先権主張番号０７／９８４，０８５ (32)優先日 1992年12月１日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／０１１，３９６ (32)優先日 1993年１月29日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者マーシオニ、マークアメリカ合衆国、02174 マサチューセッツ州、アーリントン、ツインサークルドライブ 24 (72)発明者マックバーニー、ロバートエヌアメリカ合衆国、02166 マサチューセッツ州、ニュートン、レスリーロード 20

Claims

【特許請求の範囲】１．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に１９９２年１１月６日に寄託されたプラスミドｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号７５３４７）によって合成されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。２．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に１９９２年１１月６日に寄託されたｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号７５３４７）によりコードされるポリペプチド。３．Ｅ配列（配列番号１３７および１６３）でコードされるペプチドおよびクローンｐＧＧＦ２ＨＢＳ１１、ＡＴＣＣ寄託番号７５３４７上のＥをコードする配列にフランキングする脳由来のＤＮＡ配列によりコードされるペプチドの少なくとも一部からなるポリペプチド。４．Ｅ配列（配列番号１３７および１６３）によりコードされる前記ペプチドに４８Ｎ末端アミノ酸の欠失があり、前記のＥにフランキングするペプチド配列が前記クローンによってコードされる２０〜１００Ｎ末端アミノ酸および３０〜５０Ｃ末端アミノ酸に含まれる請求項３記載のポリペプチド。５．Ｅ配列（配列番号１３７および１６３）によりコードされる前記ペプチドに４８Ｎ末端アミノ酸の欠失があり、前記Ｅにフランキングするペプチド配列は前記クローンによってコードされる２５〜７０Ｎ末端アミノ酸および３０〜４５Ｃ末端アミノ酸に含まれる請求項３記載のポリペプチド。６．式：ＶＹＢＡＺＷＸ（式中、ＶＹＢＡＺＷＸは図３１（配列番号１３６〜１３９、１４１〜１４７、１６０、１６１、および１６３）に示されたポリペプチドセグメントから構成される；式中、ＶはＦを含むかまたは存在しない；式中、ＹはポリペプチドセグメントＥを含むかまたは存在しない；式中、ＺはポリペプチドセグメントＧを含むかまたは存在しない；式中、ＷはＣを含むかまたは存在しない；および式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／ＤＨＫＬ、Ｃ／ＤＨ、Ｃ／ＤＨＬ、Ｃ／ＤＤ、Ｃ／Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／Ｄ′ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′Ｈ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ ＨＫＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｈ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ、Ｃ／ＤＤ′ Ｈ、Ｃ／ＤＤ′ＨＬ、Ｃ／ＤＤ′ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ Ｈ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＫＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ Ｈ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＬ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ′ Ｄ′ ＨＫＬ、Ｈ、ＨＬ、またはＨＫＬを含む）により定義されるポリペプチドと細胞とそ接触させることからなる、前記細胞の増殖を阻害する方法。７．図３１（配列番号１３６〜１４０、１６３、１６８）に示されたポリペプチドセグメントに対応するアミノ酸配列を有する、ＦＢＡポリペプチドセグメント、ＦＢＡ′ポリペプチドセグメント、ＥＢＡポリペプチドセグメント、ＥＢＡ′ ポリペプチドセグメント、ＦＥＢＡポリペプチドセグメント、またはＦＥＢＡ′ ポリペプチドセグメントからなるポリペプチドと細胞とを接触させることからなる、前記細胞の増殖を阻害する方法。８．請求項１、２、３、４または５記載のポリペプチドと細胞とを接触させることからなる、前記細胞の増殖を阻害する方法。９．細胞のｐ１８５^erbB2受容体と特異的に結合する化合物と細胞とを接触させることからなる、前記細胞の増殖を阻害する方法。 10．前記細胞が神経系の細胞である請求項６、７、８または９記載の方法。 11．前記細胞がグリア細胞である請求項１０記載の方法。 12．前記細胞がシュワン細胞である請求項１１記載の方法。 13．前記細胞が癌細胞である請求項６、７、８または９記載の方法。 14．前記細胞がアデノカルチノーマ細胞である請求項１３記載の方法。 15．前記方法が神経疾患または障害の治療または予防に用いられる請求項６、７、８または９記載の方法。 16．前記細胞が哺乳動物内にあり、該哺乳動物における病態生理学的状態の予防または治療のために該状態に関係する前記細胞を含む該哺乳動物に前記ペプチドを投与することにより前記接触が行なわれる請求項６、７、８または９記載の方法。 17．前記方法が脱髄性疾患または障害の治療または予防に用いられる請求項６、７、８または９記載の方法。 18.前記状態が腫瘍または細胞腫瘍により生じた末梢神経損傷などの細胞増殖の疾患を含む請求項１６記載の方法。 19．前記細胞は哺乳動物内にあり、前記接触がたとえば神経繊維腫症、悪性神経鞘腫または神経繊維肉腫である前記細胞の腫瘍を含む状態の予防または治療のために前記哺乳動物に前記ペプチドを投与することによって行なわれる請求項６、７、８または９記載の方法。 20．前記細胞が哺乳動物内にあり、前記接触が髄膜腫、両側聴神経腫、星状細胞腫、網膜芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、または膠腫を含む状態の予防または治療のために前記哺乳動物に前記ペプチドを投与することにより行なう請求項６、７、８または９記載の方法。 21．ｉ）式：ＶＹＢＡＺＷＸ（式中、ＶＹＢＡＺＷＸは図３１（配列番号１３６〜１３９、１４１、１４６、１４７、１６０、１６１、および１６３）に示されるポリペプチドセグメントから構成される；式中ＶはＦを含むかまたは存在しない；式中ＹはポリペプチドセグメントＥを含むかまたは存在しない；式中ＺはポリペプチドセグメントＧを含むかまたは存在しない；式中ＷはＣを含むかまたは存在しない；式中ＸはポリペプチドセグメントＨ、ＨＫ、またはＨＫＬを含む）により定義されるポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドで哺乳動物を免疫し、ｉｉ）抗体を該哺乳動物の組織から、または該組織を用いて作製されたハイブリドーマから抗体を精製することからなる、前記ポリペプチドに特異的な抗体の製造法。 22．ｉ）式：ＦＢＡ、ＦＢＡ′、ＥＢＡ、ＦＥＢＡ、ＦＥＢＡ′、またはＥＢＡ ′（式中、Ｆ、Ｅ、Ｂ、ＡおよびＡ′セグメントは図３１（配列番号１３６〜１４０、１６３、１６８）に示されるアミノ酸配列により定義される）により定義されるポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドで哺乳動物を免疫し、ｉｉ）抗体を該哺乳動物の組織から、または該組織を用いて作製されたハイブリドーマから精製することからなる、前記ポリペプチドに特異的な抗体の製造法。 23．式：ＶＹＢＡＺＷＸ（式中、ＶＹＢＡＺＷＸは図３１（配列番号１３６〜１３９、１４１、１４６、１４７、１６０、１６１、および１６３）に示されるポリペプチドセグメントから構成される；式中ＶはＦを含むかまたは存在しない；式中ＹはポリペプチドセグメントＥを含むかまたは存在しない；式中ＺはポリペプチドセグメントＧを含むかまたは存在しない；式中ＷはＣを含むかまたは存在しない；式中ＸはポリペプチドセグメントＨ、ＨＫ、またはＨＫＬを含む）により定義されるポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドに結合する受容体に結合しうる分子の存在を、サンプル中で、検出する方法であって、ｉ）前記受容体とともに前記ポリペプチドと前記サンプルを接触させる工程、およびｉｉ）前記サンプル中の受容体結合分子の存在を指標として前記受容体に対する前記ポリペプチドの結合の競合的阻害を検出する工程からなる検出方法。 24．式：ＦＢＡ、ＦＢＡ′、ＥＢＡ、ＦＥＢＡ、ＦＥＢＡ′、またはＥＢＡ′（式中、Ｆ、Ｅ、Ｂ、ＡおよびＡ′セグメントは図３１（配列番号１３６〜１４０、１６３、１６８）に示されるアミノ酸配列により定義される）により定義されるポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドに結合する受容体に結合しうる分子の存在を、サンプル中で、検出する方法であって、ｉ）前記受容体とともに前記ポリペプチドと前記サンプルを接触させる工程、およびｉｉ）前記サンプル中の受容体結合分子の存在を指標として前記受容体に対する前記ポリペプチドの結合の競合的阻害を検出する工程からなる検出方法。