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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Aminosäuresequenz des Membranproteins
Occludin in einer undurchlässigen
Verbindung (tight junction) (hiernach als "TJ" bezeichnet)
eines Menschen und eine DNA, die die Aminosäuresequenz kodiert.
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STAND DER
TECHNIK
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In
vielzelligen Tieren ist die Information im Hinblick auf eine zelluläre Adhäsion zwischen
benachbarten Zellen stark mit der Regulation und dem Erhalt vitaler
Phänomene,
wie z.B. einer zellulären
Proliferation und Differenzierung, Entzündungen und Krebsmetastasen,
verbunden. Interzelluläre
Adhäsionsmoleküle, die
an der Adhäsion
der Zellen teilnehmen, ordnen sich häufig an den Oberflächen dieser
Zellen zusammen an, um einen spezifisch differenzierten Membranbereich
für die
Adhäsion
zu bilden. Insbesondere ist es für
die interzellulären
Adhäsionsmoleküle, wie
z.B. die Cadherine bekannt, dass sie fest an das Cytoskelett an
der Cytoplasmadomäne
der Epithelzellen gebunden sind. Solche Membranregionen werden als
interzellulärer
Adhäsionsapparat
bezeichnet und werden grob in die folgenden vier Strukturen klassifiziert:
gap junction (GJ), adherens junction (AJ), Desmosom und Tight junction
(TJ).
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Diese
Adhäsionsapparate
wurden erstmalig unter einem Elektronenmikroskop identifiziert und
als Ergebnis einer Untersuchung und Forschung der konstituierenden
Proteine wurde die Wichtigkeit ihrer physiologischen und pathologischen
Signifikanz zum Fokus eines erhöhten
Interesses. Die Proteine, die als sogenannte Adhäsionsmoleküle bezeichnet werden, existieren
spezifisch in diesem Adhäsionsapparat
und die Adhäsionsmoleküle von AJ
sind Cadherine und verschiedene Arten von Cadherinen, wie z.B. N-Cadherin
und P-Cadherin, wurden bis jetzt identifiziert [Takeichi, M. et
al., "Science", Bd. 251, S. 1451–1455 (1991)].
Als Adhäsionsmoleküle des Desmosoms
sind Desmoglein und Desmocollin bekannt und gemäß kürzlichen Studien wurde klargestellt,
dass ihre Strukturen ähnlich
den Cadherinen sind [Buxton, R. S. et al., "J. Cell Biol.", Bd. 121, S. 481–484 (1993)]. Die Adhäsionsmoleküle von GJ
werden Connexin genannt und es ist bekannt, dass Connexin Transmembrandomänen an vier
unterschiedlichen Stellen aufweist und sowohl am N-terminalen als auch
am C-terminalen Ende auf der Cytoplasmaseite der Membran vorsteht.
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Die
TJ ist ein interzellulärer
Adhäsionsapparat,
der für
Epithel- und Endothelzellen besonders ist, wo die Zellmembranen
von benachbarten Zellen als vollständig dicht abgedichtet gesehen
werden. Die TJ umgibt individuelle Zellen und wirkt als Barriere
um die Permeation wasserlöslicher
Moleküle
zwischen dem Lumen und Grundmembranseiten der Zellschicht zu blockieren
oder zu regulieren. Es wurde auch beschrieben, dass sie als Zaun
wirken, der die Zellmembran in apikale und basolaterale Seiten teilt,
um die polare Verteilung solcher Membranproteine wie Ionenkanäle und Pumpen,
wie auch Lipiden auf der Zellmembrane, zu erhalten [Schneeberger,
E. E. et al., "Am.
J. Physiol.", Bd.
262, S. L647–L661
(1992)]. Aufgrund dieser Funktionen der TJ werden Milieus, bestehend
aus unterschiedlichen Fluidzusammensetzungen auf gegenüberliegenden
Seiten einer Zellschicht gebildet, so dass die Polarität der Zellschicht
erhalten wird; daher kann die TJ als fundamentale Struktur von vitaler
Wichtigkeit für
vielzellige Organismen angesehen werden.
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Eine
Analyse der Molekularstruktur der TJ ist jedoch im Vergleich mit
anderen Adhäsionsapparaten wenig
fortgeschritten. Tatsächlich
hat es einen ernsthaften Nachteil im Hinblick auf die Verfolgung
einer molekularbiologischen Forschung für TJ bedeutet, dass das TJ-Adhäsionsmolekül selbst
noch nicht identifiziert wurde.
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Die
vorliegenden Erfinder haben ein Verfahren zur Isolierung von AJ
aus Rattenleber etabliert und haben viele Proteine, wie z.B. Radixin
und ZO-1 aus diesem isolierten AJ identifiziert [Tsukita, Sh. Et
al., "Curr. Opin.
Cell Biol.", Bd.
4, S. 834–839
(1992)]. Von Forschungen an ZO-1 und histologischen Feststellungen
für AJ
und TJ kann geschlossen werden, dass die Proteine in AJ ebenfalls
ein Protein von TJ enthalten. Im Hinblick hierauf haben die vorliegenden
Erfinder AJ aus Hühnerleber
isoliert, einen monoklonalen Antikörper gegen AJ als Antigen hergestellt
und eine Strukturanalyse des TJ-bildenden Proteins unter Verwendung
des Antikörpers,
der spezifisch mit TJ reagiert, durchgeführt. Im Ergebnis waren die
vorliegenden Erfinder bei der Strukturanalyse eines neuen konstituierenden
Proteins erfolgreich, das anderen Proteinen nicht ähnelt und
haben das Protein als Occludin bezeichnet [Furuse, M. et al., "J. Cell Biol.", Bd. 123, S. 1777–1788 (1993)].
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Dieses
Hühneroccludin
ist ein 56Kda-Protein, gebildet aus 504 Aminosäuren, und dadurch gekennzeichnet,
dass es insbesondere Transmembrandomänen an vier Stellen in der
Hälfte
vom N-terminalen Ende aufweist, wobei sowohl N- als auch C-terminale
Enden ins Cytoplasma zeigen und zwei extrazelluläre Schlaufen aufweist.
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Aus
folgenden Studien wurde geschlossen, dass Occludin ein wichtiger
Faktor bei der Analyse der physiologischen Funktion von TJ auf dem
zellulären
Niveau wie auch auf dem Gesamtkörperniveau
wäre und dies
hat erhebliche Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen.
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Weitere
Studien sind nichtsdestotrotz nicht fortgeschritten, da das Protein
seinen Ursprung in einer Hühnerart
hat, die sich von Menschen deutlich unterscheidet. So wurde eine
Strukturanalyse von Occludin vom menschlichen Ursprung zum Zweck
der Erhellung seiner physiologischen Funktion und einer medizinischen
Analyse von TJ erwartet. Es gibt bis jetzt noch nicht Berichte über einen
Erfolg bei der Erhellung des menschlichen Occludins trotz weltweitem
Wettbewerb in der Forschung zu diesem Zweck auf diesem Gebiet.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen
von menschlichen, Hund- und Mausoccludinen und die diese kodierenden
DNAs bereitzustellen.
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In
ihrem Bericht über
das Gen für
das menschliche neuronale Apopotose-inhibitorische Protein (NAIP) dokumentierten
Roy et al., das Auftreten eines DNA-Fragments, das eine Basensequenz
besaß,
die zum C-terminalen Bereich von Hühneroccludin analog war und
zwar bei NAIP-Gendeletionsmutanten [Roy N., et al., "Cell", Bd. 80, S. 167–178 (1995)].
Um sicherzustellen, ob diese Sequenz tatsächlich einen Teil eines menschlichen
Analogs von Occludin kodierte oder nicht, selektierten die gegenwärtigen Erfinder
Primer aus der Basensequenz, analog zu derjenigen von Hühneroccludin
und führten
ein ausführliches
Screening mit einer cDNA-Bibliothek von dem menschlichen Epithelzellstamm
T84 als Matrize für
die PCR durch. Die gegenwärtigen
Erfinder waren so erfolgreich bei der Analyse der Gesamtstruktur
von menschlichem Occludin. Weiterhin haben die Erfinder Analysen
von Maus- und Hundoccludinen vervollständigt, Anti-Occludin-monoklonale Antikörper hergestellt
und mit histologischer Anfärbung
verifiziert, dass die Occludine Transmembran-artige TJ-Proteine
waren.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist mit Aminosäuresequenzen von menschlichem,
Hund- und Mausoccludin, DNAs, die sie kodieren, Anti-Occludin-monoklonalen
Antikörpern
und einem genetischen Analyseverfahren unter Verwendung derselben
beschäftigt.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung die folgenden Aspekte:
- (1) DNA zum Codieren eines menschlichen Occludinproteins
mit einer Aminosäuresequenz
wie in SEQ ID NO: 1 beschrieben.
- (2) DNA zum Codieren eines menschlichen Occludins wie in SEQ
ID NO: 4 beschrieben.
- (3) DNA, beschrieben in SEQ ID NO: 5, zum Codieren eines Hundoccludins
mit einer Aminosäuresequenz wie
beschrieben in SEQ ID NO: 2.
- (4) DNA, beschrieben in SEQ ID NO: 6, zum Codieren eines Mausoccludins
mit einer Aminosäuresequenz wie
beschrieben in SEQ ID NO: 3.
- (5) Menschliches, Hund- und Mausoccludin mit den in SEQ ID NO:
1, 2 bzw. 3 beschriebenen Aminosäuresequenzen.
- (6) Occludinvariante mit einer Aminosäuresequenz, worin ein oder
mehrere Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
von jedem Occludin zugefügt,
deletiert oder substituiert sind, und eine DNA zur Codierung der Variante.
- (7) Vektor, der irgendeine der DNAs zur Codierung eines menschlichen,
Hund- oder Mausoccludins oder zur Codierung ihrer Varianten umfasst.
- (8) Transformante, die den Vektor enthält.
- (9) Herstellungsverfahren für
ein Occludinprotein, das die Schritte der Kultivierung der Transformante
und die Sammlung eines exprimierten Produkts umfasst.
- (10) DNA-Sonde, umfassend den Erhalt der gesamten oder eines
Teils der Basensequenz wie definiert in SEQ ID NO: 4, 5 oder 6.
- (11) DNA-Primer, umfassend den Erhalt eines Teils der Basensequenz
wie definiert in SEQ ID NO: 4, 5 oder 6.
- (12) Polyklonaler Antikörper
oder monoklonaler Antikörper,
der spezifisch an ein menschliches, Hund- oder Mausoccludinprotein
bindet.
- (13) Assayverfahren und Assayreagens für Occludin in einer biologischen
Probe, wobei ein Anti-Occludin-Antikörper verwendet wird.
- (14) Analyseverfahren eines Occludingens in einer biologischen
Probe, wobei der DNA-Primer oder die DNA-Sonde verwendet wird.
- (15) Screeningverfahren eines Arzneimittels, das die Expression
von Occludin beeinflußt,
wobei Occludinexprimierende Zellen und ein Analyt koexistieren dürfen und
eine Expressionsmenge eines Occludingens der Zellen dann durch Verwendung
eines DNA-Primers oder eine DNA-Sonde bestimmt wird.
- (16) Antisense-DNA, abgeleitet von einer menschlichen Occludin-DNA.
- (17) Labortier, dessen Occludin-DNA eine Knock-out-DNA ist.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Durch
den Erfolg der vorliegenden Erfinder bei der Identifizierung von
Occludinanalogen bei Menschen wird es nun möglich, die Konstitution und
Funktion von TJ auf dem molekularen Niveau strukturell und funktionell
zu testen. Die Barriere- und Zaunfunktionen von TJ und die damit
verwandten regulatorischen Mechanismen können durch Experimente analysiert
werden, die die Kontrolle der Expression des Gens für Occludin
oder die Inhibition der Occludinfunktion mit entweder einer Antisinnsonde
oder einem Antikörper
unter Verwendung verschiedener Arten von kultivierten menschlichen,
Maus- und Hund-(MDCK)-Zellen involvieren. Beispielsweise ist es
nun möglich
zu bestimmen, ob die Überexpression
von Occludin-cDNA zu einem Anstieg der Zahl von TJ-Strängen führt oder
auch nicht, die in gefriergekühlten
aufgebrochenen Replikas beobachtet werden und nebenbei zu einer
Erhöhung
der Barrierefunktion führt.
Weiterhin hat es die vorliegende Erfindung ermöglicht, ein einfaches Screeningverfahren
für Arzneimittel
zu etablieren, die die TJ-Funktion beeinflussen. Beispielsweise
können
Arzneimittel, die die TJ-Funktion beeinflussen, unter Verwendung
verschiedener Arten von Zellen, die Occludin exprimieren, einem
Screening unterworfen werden, indem man die Zelle mit einem Testartikel
reagieren lässt
und darauffolgend die Menge des zellulären Occludingens oder der Occludinproteinexpression
misst. Die Genanalyse kann unter Verwendung einer DNA-Sonde oder
eines Primers oder anderer Mittel durchgeführt werden. Sie kann durch
bekannte Verfahren durchgeführt
werden, beispielsweise das Northern-Blot-Verfahren oder das Southern-Blot-Verfahren,
wobei RNA oder DNA auf übliche
Weise aus einer Testprobe extrahiert werden und, falls nötig, vorbehandelt
werden, dann auf einer Membran oder einem Gel elektrophoretisch
behandelt und mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert werden
und indem eine Polymerasekettenraktion (PCR)-Technik durchgeführt wird,
wobei die Ziel-DNA unter Verwendung von Primern mit ungefähr 20 Basen,
korrespondierend zu der relevanten Stelle und einer genomischen
DNA oder cDNA als Matrize amplifiziert wird. Das Occludinprotein
kann beispielsweise durch Verwendung eines Antikörpers quantifiziert werden.
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Weiterhin
wurde es auch möglich
sicherzustellen, wie die TJ-Bildung
an der Morphogenese verschiedener Organe beteiligt ist und ob ein
funktionelles Versagen der TJ eine Beziehung zu verschiedenen pathologischen
Zuständen
hat, wie z.B. Entzündungen
und einer Tumormetastase, indem verschiedene Arten von mutierten
Mäusen
und Occludingen-Knock-out-Mäusen
hergestellt werden. Die Möglichkeit
der Kontrolle der TJ-Funktion,
insbesondere der Barrierefunktion ist ebenfalls in Verbindung mit
einer Arzneimittelpermeabilität von
Interesse. So wäre
es möglich
die Blut-Hirn-Schranke über
eine Hoch- oder
Herabregulation der Occludinsynthese in Epithelzellen des Gehirns
zu kontrollieren. Die Kontrolle der TJ-Funktion in enterischen Epithelzellen
ist notwendig, um eine Arzneimittelabsorption aus dem Verdauungstrakt
zu regulieren. Es wird so möglich
die Arzneimittelabsorption, insbesondere die Verteilung im Gehirngewebe
zu kontrollieren, indem eine effektive Substanz verabreicht wird,
die durch Screening aus Arzneimitteln gewonnen wurde, die die TJ-Funktion beeinflussen.
So sollte die vorliegende Erfindung zur Erhellung der physiologischen
Mechanismen, insbesondere der Blut-Hirn-Schranke wie auch für die Analyse,
Diagnose und Behandlung von Erkrankungszuständen gut geeignet sein.
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Die
durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte DNA kann bei der
Analyse von Genen für
Occludinproteine und der Genexpression davon unter Verwendung von
einem Teil davon als Primer oder Sonde verwendet werden. Die Bezeichnung "ein Teil" bedeutet hier, dass
das als Primer oder Sonde zu verwendende Oligonucleotid mindestens
eine relevante Sequenz mit 10 Basen oder vorzugsweise mindestens
eine 15-Basensequenz
umfasst oder noch bevorzugter ein korrespondierendes Polynucleotid,
umfassend eine Sequenz mit ungefähr
20- bis 30-Basen, basierend auf der DNA-Sequenz der vorliegenden
Erfindung. Als Sonde kann ein höher
makromolekulares Molekül
oder sogar die Gesamt-DNA verwendet werden.
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Es
gibt ein Verfahren unter Verwendung von Anti-Sinn-DNA oder Anti-Sinn-RNA
als Mittel zur Kontrolle der Funktion von Occludin. Das Verfahren
soll den Fluss der Genexpression blockieren, indem in das Ablesen
der genetischen Information auf irgendeiner Stufe der Genexpression,
wie z.B. der DNA-Replikation,
Transkription und Translation eingegriffen wird und das Antisinn-Verfahren
verwendet eine Nucleinsäure
oder ihr Analog für
die Blockierung (Wickstrome, E. Hrsg., Prospects for Antisense Nucleic
Acid Therapy of Cancer and AIDS. Wiley-Liss, New York, 1991). Die
Erhellung der Occludin-DNA gemäß der vorliegenden
Erfindung hat es ermöglicht,
das Mittel zur Inhibition von Occludinfunktionen durch das Antisinn-Verfahren
bereitgestellt werden. Die Länge
des DNA-Oligomers hat einen Einfluss auf die Doppelstrang-Bildungsfähigkeit,
Membranpermeabilität
und Basensequenzspezifität;
und mindestens 6 oder vorzugsweise mindestens 10-mer, üblicherweise
15 bis 30-mer können
verwendet werden. Geeignete Sequenzen können auf der Basis der DNA-Sequenz der
vorliegenden Erfindung gewählt
und durch Experimente verifiziert werden. Üblicherweise wird das Oligomer
chemisch an seiner Phosphatgruppe, dem Zuckerbestand und den 3'- und 5'-Schwänzen modifiziert,
um seine Stabilität
zu erhöhen
(Cook, P.D., Anticancer Drig. Des., 5, 585, 1991). Repräsentative
Analoge sind Oligophosphorthioate, worin eines der Sauerstoffatome
der Internucleosidphosphodiestergruppe durch ein Schwefelatom ersetzt
wird und Oligomethylsulfonat, wobei der Sauerstoff durch eine Methylgruppe
ersetzt ist; alle solche Analoge sind gegen Nucleasen bemerkenswert
stabil. Nebenbei gesagt werden auch solche Oligomere, die mit Acridin
oder Polylysin gebunden sind und diejenigen, die N-Methylthymidylat
enthalten, um die Stabilität
des Hybriddoppelstrangs zu erhöhen,
ebenfalls verwendet. Diese Oligomere können durch bekannte chemische
Syntheseverfahren synthetisiert werden. Eine von der RNA der vorliegenden
Erfindung abgeleitete Anti-Sinn-RNA kann ebenfalls verwendet werden.
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Das
Occludinprotein der vorliegenden Erfindung kann für die Herstellung
eines Antikörpers
unter Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils davon als Epitop
und zur Verwendung des so hergestellten Antikörpers und diagnostisches Reagens
verwendet werden. Die Bezeichnung Epitop bezeichnet eine Antigen-Determinante
des Polypeptids; ein Epitop besteht in der Regel aus mindestens
6 Aminosäuren
und es ist bekannt, dass ein Polypeptid, bestehend aus 6 Aminosäuren sich
mit einem Antikörper
kombiniert (JP-A-60-500684). Das antigene Peptid des Zielproteins
bezeichnet ein Polypeptid, umfassend eine Reihe von mindestens 6
Aminosäuren,
vorzugsweise eine Reihe von mindestens 8 Aminosäuren, noch bevorzugter eine
Reihe von mindestens 15 Aminosäuren
oder weiter bevorzugt eine Reihe von mindestens 20 Aminosäuren, basierend
auf der Aminosäuresequenz
der vorliegenden Erfindung. Durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes
Occludin ist ein Protein, das wie aus seiner Aminosäuresequenz
in Analogie zu Hühneroccludin
geschlossen, Transmembrandomänen
an vier Stellen in einer Hälfte
des N-terminalen Bereichs besitzt, wobei das N- und das C-terminale
Ende dem Cytoplasma gegenüber
liegen und zwei extrazelluläre
Schlaufen aufweist. In dem Fall von menschlichem Occludin, dessen
Aminosäuren
89–135
und 196–243-Bereiche
vermutlich extrazellulär
exponiert sind, können
verschiedene Antikörper
durch Selektion von antigenen Stellen hergestellt werden, die für diese
Zwecke geeignet sind und als Mittel verwendet werden, um die TJ-Funktion aufzuhellen
und als Mittel um durch den Antikörper die TJ-Funktion zu supprimieren.
Es ist auch möglich
die Teilpeptide als Mittel für
ein Screening auf Verbindungen zu verwenden, die zu einer Bindung
an diese Peptide in der Lage sind.
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Proteine
mit einer Aminosäuresequenz
des Occludins der vorliegenden Erfindung, denen ein oder eine Vielzahl
von Aminosäuren
zugefügt
wurden oder von denen eine oder eine Vielzahl von Aminosäuren entfernt
oder subsituiert wurden, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung
umfasst.
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(1) HERSTELLUNG EINER
cDNA-BIBLIOTHEK UND STRUKTURANALYSE VON OCCLUDIN
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Die
Herstellung von RNA kann unter Verwendung menschlicher oder tierischer
Zellen (Zellstämme)
als Rohmaterial durchgeführt
werden, beispielsweise durch Extraktion mit einer Mischlösung aus
Guanidinthiocyanat, einem Tensid, einem Chelatbildner und einem
Reduktionsmittel, gefolgt von einer Phenolextraktion, Fraktionierung
in organischen Lösungsmitteln
(Chamezynski et al., Anal. Biochem., 162, 156, 1987) und darauffolgend
Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsverfahren.
Unter Verwendung der so erhaltenen RNA als Matrize wird eine doppelsträngige DNA
auf übliche
Weise, wie z.B. durch das cDNA-Syntheseverfahren (Gubler, U. et al.,
Gene, 25, 263, 1983) unter Verwendung von Zufallsprimern, reverser
Transkriptase, DNA-Polymerase, usw. hergestellt. Eine DNA-Bibliothek
kann durch Insertion der erhaltenen doppelsträngigen DNA in einen Bacteriophagen, λ zap oder λ gt11 auf übliche Weise
hergestellt werden. Es können
auch kommerzielle cDNA-Bibliotheken verwendet werden.
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Gemäß dem Bericht
von Roy et al. ist es möglich
ein DNA-Fragment
zu erhalten, von dem angenommen wird, dass es von Occludin-DNA-Ursprung
ist, in dem auf geeignete Weise ein Primerbereich gewählt wird,
basierend auf der Basensequenz, die zum C-Terminus des Hühneroccludins
analog ist und zwar durch Amplifikation der DNA durch die PCR-Technik
und durch Subklonieren. Ein darauffolgendes Screening der cDNA-Bibliothek mit diesem
DNA-Fragment als Sonde und eine Analyse der Basensequenz des isolierten
Klons kann zu einer Gesamtlängen-cDNA
für Occludin
führen.
Die Struktur der Basensequenz wird durch das Maxam-Gilbert-Verfahren
bestimmt (Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 560, 1977) oder durch das Dideoxynucleotidketten-Terminationsverfahren
(Sanger, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). Die Aminosäuresequenz
wird so auf der Basis der Basensequenz abgeleitet. Diese Genmanipulationen
können
durch bekannte übliche
Verfahren durchgeführt
werden, beispielsweise gemäß denjenigen, die
in Molecular Cloning; A Laboratory Manual, T. Maniatis et al. Hrsg.
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben werden.
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(2) HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
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Um
den monoklonalen Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung herzustellen, wird menschliches, Hund- oder Mausoccludin
als Antigen verwendet, der Komplex mit einem Trägerprotein wird, falls nötig, hergestellt
und geeignete Tiere werden durch Inokulation mit dem Antigen immunisiert.
Antikörper-bildende
Zellen, die aus der Milz oder Lymphknoten der obigen immunisierten
Tiere erhalten werden, werden mit Myelomzellen fusionier, wodurch
Hybridome, die einen für
Occludin stark spezifischen Antikörper erzeugen, selektiert werden,
um den monoklonalen Antikörper
herzustellen. Das Herstellungsverfahren kann gemäß bekannten vorherigen Verfahren
durchgeführt
werden.
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Als
Immunogen können
alle solche Produkte, wie gereinigte natürliche Produkte und Produkte,
die durch genetische Rekombinationsverfahren oder chemisches Synthese
hergestellt wurden, verwendet werden. Für eine Herstellung von Occludin
für das
rekombinante DNA-Verfahren kann die cDNA, die das Occludin kodiert,
mit dem Promotor stromabwärts
eines Vektors religiert werden, der für die Expression von Occludin geeignet
ist und zwar durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von
Restriktionsenzymen und DNA-Ligase, um einen rekombinanten Expressionsvektor
zu erhalten. Dieser Vektor ist nicht begrenzt, sofern er in einem
Wirt repliziert und amplifiziert werden kann. Im Hinblick auf den
Promotor und Terminator gibt es auch keine bestimmte Begrenzung,
solange sie mit dem für
die Expression der Basensequenz, die Occludin kodiert, verwendeten
Wirt übereinstimmen;
und geeignete Kombinationen, die für den Wirt geeignet sind, können ebenfalls
praktisch sein. Der so erhaltene rekombinante Expressionsvektor
wird in den Wirt durch das kompetente Zellverfahren eingeführt (J.
Mol. Biol., 53, 154, 1970) oder auch das Calciumphosphatverfahren
(Science, 221, 551, 1983) um einen Transformanten herzustellen.
Organismen wie Escherichia coli und Tiere werden als Wirt verwendet
und der erhaltene Transformant wird in einem für den Wirt geeigneten Medium
kultiviert. Die Kulturinkubation wird üblicherweise bei einer Temperatur
zwischen 20 und 45°C
und einem pH zwischen 5 und 8 mit Belüftung und/oder Rühren je
nach Bedarf durchgeführt.
Die Isolierung und Reinigung von Occludin aus den kultivierten Mikroorganismen
oder Zellen kann durch eine geeignete Kombination bekannter Verfahren
der Isolation und Reinigung durchgeführt werden. Diese bekannten
Verfahren beinhalten ein Aussalzen, ein organisches Lösungsmittelverfahren,
eine Dialyse, eine Gelfiltration, eine Elektrophorese, eine Ionenaustauschchromatographie,
eine Affinitätschromatographie
und eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie.
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Das
Immunogen, Occludin, sollte vorzugsweise seine gesamte Struktur
beibehalten, kann jedoch in Form eines Fragments oder eines Peptids
mit einer Teilstruktur vorliegen; diese kann in geeigneter Weise
aus der gesamten Aminosäuresequenz
des Occludins gewählt
werden. Für
die Herstellung des Fragments oder Peptids können ein Verfahren, wie eine
chemische Synthese, das oben erwähnte
Genrekombinationsverfahren oder ein Abbau eines natürlich auftretenden
Artikels verwendet werden.
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Verschiedene
Kondensationsmittel können
für die
Herstellung des Immunogen-Trägerprotein-Komplexes
verwendet werden; Reagenzien, wie Glutaraldehyd, Carbodiimid und
Maleimidaktivierter Ester, können verwendet
werden.
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Das
Trägerprotein
kann eines von denjenigen sein, die üblicherweise verwendet werden,
wie z.B. Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Hämocyanin und üblicherweise
wird das Verfahren, bei dem eine 1- bis 5-fache Menge eines Trägerproteins
an ein Antigen gekoppelt wird, verwendet.
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Für die Immunisierung
verwendete Tiere beinhalten die Maus, die Ratte, das Kaninchen und
Meerschweinchen und die Inokulation wird durch subkutane, intramuskuläre oder
intraperitoneale Injektion bewirkt. Die Verabreichung des Immunogens
kann in Form einer Mischung mit komplettem Freund-Adjuvant oder inkomplettem
Adjuvant durchgeführt
werden und wird üblicherweise
alle 2 bis 5 Wochen durchgeführt.
Antikörper-erzeugende
Zellen, die aus der Milz oder Lymphknoten der immunisierten Tiere
erhalten wurden, werden mit Myelomzellen fusioniert und als Hybridome
isoliert. Die verwendeten Myelomzellen sind diejenigen der Maus,
Ratte oder von menschlichem Ursprung, und sind vorzugsweise allogen
zu den Antigen-erzeugenden Zellen, die verwendet werden, können jedoch
in einigen Fällen
xenogen sein.
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Die
Manipulation der Zellfusion kann beispielsweise gemäß dem Verfahren
von Milstein und Köhler (Nature,
256, 495, 1975) durchgeführt
werden. Verwendete Fusogene beinhalten Mittel, wie Polyethylenglycol und
das Sendai-Virus und die Zellfusion kann durch Inkubation der Antikörper-erzeugenden
Zellen mit Myelomzellen in einem geeigneten Populationsverhältnis von
1:1 bis 10:1 bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C, vorzugsweise
zwischen 30 und 37°C
für ungefähr 1 bis
10 Minuten unter Verwendung von Polyethylenglycol (mittleres Molekulargewicht:
1.000 bis 4.000) in der Regel mit einer Konzentration von ungefähr 20 bis 50%
durchgeführt
werden.
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Verschiedene
immunochemische Verfahren können
für das
Screening von Hybridomen verwendet werden, die einen Anti-Occludin-Antikörper erzeugen.
Die Verfahren beinhalten den Enzym-gebundenen Immunosorbens Assay
(ELISA) unter Verwendung von mit Occludin beschichteten Mikrotiterplatten,
einen Enzymimmunoassay (EIA) unter Verwendung von Mikrotiterplatten,
die mit einem Anti-Immunoglobulinantikörper beschichtet
sind und Western-Blot-Verfahren,
worin Proben, die Occludin enthalten, mit der darauffolgenden Verwendung
von Nitrozellulose-Transfermembranen
elektrophoretisch behandelt werden.
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Klone
werden von diesen Vertiefungen weiter beispielsweise durch limitierende
Verdünnung
erhalten. Das Screening und Züchten
der Hybridome wird in einem Kulturmedium für tierische Zellen (z.B. RPMI
1640), enthaltend 10 bis 20% fötales
Rinderserum, in der Regel mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und
Thymidin) versetzt, durchgeführt.
Der so erhaltene Klon wird intraperitoneal in BALB/c-Mäuse transplantiert,
die vorher mit Bristan behandelt wurden und Ascites, enthaltend
eine hohe Konzentration eines monoklonalen Antikörpers wird 10 bis 14 Tage später gesammelt,
so dass der Ascites als Quelle für
die Reinigung des Antikörpers verwendet
werden kann. Weiterhin werden die klonierten Hybridomzellen so kultiviert,
dass die kultivierten Zellen als Quelle für die Reinigung des Antikörpers verwendet
werden können.
Bekannte Verfahren für
die Reinigung des Immunoglobulins können für die Gewinnung des monoklonalen
Antikörpers
verwendet werden; die Gewinnung kann beispielsweise einfach durch
Mittel, wie eine Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung,
Ethanolfraktionierung, Verwendung von Antionenaustauschern und eine
Affinitätschromatographie erreicht
werden.
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Bei
immunologischen Verfahren unter Verwendung des Anti-Occludin-monoklonalen
Antikörpers,
der gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde, wird es möglich, eine qualitative und
quantitative Bestimmung von Occludin in biologischen Proben durchzuführen. Als
immunologische Verfahren können
konventionelle Verfahren, wie ein immunohistologisches Färben, ein
Enzymimmunassay, ein Agglutinierungstest, ein kompetitiver Assay
und ein Sandwich-Verfahren für
Proben von biologischen Proben verwendet werden, die auf geeignete
Weise verarbeitet wurden, je nach Bedarf, z.B. durch Isolation der
Zellen und Extraktion. Die immunohistologische Färbung kann beispielsweise durch
das direkte Verfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers oder
das indirekte Verfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers gerichtet
gegen den Antikörper,
der an das Zielantigen gebunden ist, durchgeführt werden. Alle solchen bekannten
Markierungssubstanzen, wie fluoreszierende Mittel, radioaktive Substanzen,
Enzyme, Metalle und Farbstoffe können
als Markierungsmittel verwendet werden.
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Der
monoklonale Antikörper
der vorliegenden Erfindung kann in Form eines Fab' oder Fab-Fragments nach
Entfernung des Fc' oder
Fc-Bereiches verwendet werden oder in Form eines Polymers von einem
der Fragmente.
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Weiterhin
kann er sich auch in Form eines chimären Antikörpers, eines humanisierten
Antikörpers
oder eines menschlichen Antikörpers
befinden.
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BEISPIEL
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Die
vorliegende Erfindung wird nun im Detail mit spezifischen Ausführungsformen
durch die folgenden Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung
soll natürlich
nicht auf die folgenden Beispiele begrenzt sein.
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BEISPIEL 1 STRUKTURANALYSE
VON MENSCHLICHEM OCCLUDIN
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Basierend
auf einer Basensequenz eines Teils des menschlichen NAIP-defizienten
Gens, analog zum C-Terminus von Hühneroccludin, wurde eine PCR
unter Verwendung der Oligonucleotide der SEQ ID NO: 7 und 8 als
Primer durchgeführt.
Eine λgt11-cDNA-Bibliothek
wurde durch Reinigung von Poly(A)+RNA aus einer Quelle, bestehend
aus einem menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamm T84 und
unter Verwendung des TimeSaver-cDNA-Synthese-Kits (Handelsname;
Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) und dem GIGAPACK II Packaging
Extract (Stratagene Inc.) durchgeführt. Die PCR wurde mit dieser
Bibliothek als Matrize und mit diesen beiden Primern durchgeführt und
ergab ein cDNA-Fragment
mit 363 Basenpaaren.
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Dieses
DNA-Fragment wurde unter Verwendung des DIG Labeling Kits (Handelsname;
Boehringer Mannheim) DIG-markiert und die Bibliothek wurde damit,
verwendet als Sonde, einem Screening unterworfen. Im Ergebnis wurden
drei cDNA-Klone isoliert, ihre Insertionsstellen wurden geschnitten
und sie wurden in pBluescript SK(–) subkloniert. Von diesen
nahm man an, dass die beiden Klone phOc6 und phOc16 einen gesamten
ORF enthielten und diese beiden klonierten Stränge wurden im Hinblick auf
ihre Basensequenzen analysiert, wobei die Ergebnisse demonstrierten,
dass die Basensequenzen die gesamte Struktur von menschlichem Occludin
kodierten. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung eines 7-deaza
Sequenase Version Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Handelsname;
Applied Biosystems) bestimmt. Die Basensequenz ist in SEQ ID NO:
4 dargestellt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 1.
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Die
Struktur von Hund- und Mausoccludin wurde auf dieselbe Weise wie
oben beschrieben bestimmt, wobei λgt11-
bzw. λ10-cDNA-Bibliotheken,
hergestellt aus Hundenieren (MDCK)-Zellen und Mauslungenzellen verwendet
wurden. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz von Hundeoccludin
sind in Sequenz Nrn. 5 und 2 und die Basensequenz und Aminosäuresequenz
von Mausoccludin in Sequenz Nrn. 6 und 3 dargestellt. Escherichia
coli JM 109, das die menschliche Occludin-cDNA enthielt, wurde am
15. März
1996 hinterlegt (Hinterlegungsnr. FERM BP-5477) beim National Institute
of Bioscience and Human Technology, Ministery of International Trade
and Industry, Japan (Adresse: 1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
305 Japan).
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BEISPIEL 2 HERSTELLUNG
EINES ANTI-HUMANEN OCCLUDIN- MONOKLONALEN
ANTIKÖRPERS
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Das
cDNA-Fragment, das die Cytoplasmaregion der C-terminalen Seite von
menschlichem Occludin kodierte, wurde durch Schneiden des pBluescript
SK(–)-Vektors,
enthaltend Sequenz Nr. 4 wie beschrieben in Beispiel 1, mit den
Restriktionsenzymen Ssp I und EcoR I (die beide Produkte von Takara
Shuzo Co., Ltd. sind) erhalten. Dieses Fragment wurde in den pGEX-3X-Vektor
eingeführt
und Escherichia coli, das mit diesem Vektor transformiert war, wurde
kultiviert, um ein GST-Fusionsprotein herzustellen. Ratten wurden
mit diesem Fusionsprotein als Antigen immunisiert, so dass ein monoklonaler
Antikörper
hergestellt wurde.
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Die
Rattenimmunisierung wurde durch Injektion des Antigens in Dosen
von 300 μg/Injektion
in die hintere Pfote, zunächst
als Emulsion mit komplettem Freund-Adjuvans und dem Antigen allein
zweimal danach (an den Tagen 3 und 7 nach der ersten Injektion)
durchgeführt.
Am auf die letzte Injektion folgenden Tag wurden inguinale Lymphknoten
aus den immunisierten Tieren ausgeschnitten und für eine Zellfusion
verwendet.
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Die
Rattenlymphocyten und Mausmyelom-P3-Zellen wurden in einem Verhältnis von
2,5:1 kombiniert und die Mischung wurde in RPMI-Medium inkubiert,
enthaltend 1 g Polyethylenglycol (mittleres Molekulargewicht 4.000),
darin gelöst
und zwar für
2 Minuten gemäß dem modifizierten
Verfahren von Köhler
et al., um eine Fusion der Zellen zu ermöglichen. Die fusionierten Zellen
wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit HAT-Medium, enthaltend
10% HCF (Bokusui-Braun) für
9 Tage ausgesät,
gefolgt von einer Inkubation in HT-Medium und darauffolgend in Kolben
mit RPMI-Medium. Hybridome wurden durch einen Assay der Überstände von
Vertiefungen, die ein zelluläres
Wachstum im Hinblick auf Antititer unter Verwendung des Immunoblot-Verfahrens
und fluoreszierendem Antikörperfärben bei
Kulturen vom menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamm T84 und
durch limitierende Verdünnung
aus den richtigen Vertiefungen kloniert. Die Hybridomzellen wurden
bei berechneter Konzentration von 7 Zellen/Vertiefung in Mikrotiterplatten
ausgesät
und durch ein Immunoblot-Verfahren einem Screening unterworfen,
um klonale Hybridomzellstämme
zu verifizieren und zu isolieren. Die Antikörper wurden aus den Kulturüberständen des
Hybridoms gereinigt.
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BEISPIEL 3 ZELLFÄRBUNG
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Menschliche
Verdauungstrakt-Epithelzellen wurden in 3% Formalin in phosphatgepufferter
Salzlösung (PBS)
bei Raumtemperatur 15 Minuten fixiert und weiter mit 0,2% Triton
X-100 in PBS bei Raumtemperatur 15 Minuten behandelt. Nach einem
Blockieren der Zellen mit 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) wurde
die Testsubstanz zugefügt
und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem darauffolgenden
Waschen wurde FITC-markierter Anti-Ratten-Immunoglobulinantikörper zugefügt und 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einem Abwaschen
von nicht umgesetzten Antikörper
und einer Überprüfung mit
einem Fluoreszenzmikroskop.
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Ergebnisse
der Doppelimmunfluoreszenzfärbung
mit monoklonalen Antikörper
zu dem TJ-verwandten Protein ZO-1 und dem antimenschlichen Occludin-monoklonalen
Antikörper
der vorliegenden Erfindung sind in der Figur dargestellt.
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Da
insgesamt dasselbe Färbemuster
wie das von ZO-1 (wie in der Literatur berichtet) beobachtet wurde,
wurde bewiesen, dass das menschliche Protein der vorliegenden Erfindung
ein menschliches Homolog des TJ-Adhäsionsmoleküls Occludin ist.
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BEISPIEL 4 EXPRESSION
VON OCCLUDIN IN ZEREBROVASKULÄREN
ZELLEN
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Da
man annimmt, dass zerebrale vaskuläre Endothelzellen, die die
Blut-Hirn-Schranke bilden, eine sehr hoch elektroresistente TJ aufweisen,
anders als periphere vaskuläre
Endothelzellen untersuchte ich die Verteilung und Expression von
Occludin in kultivierten Schweingehirnvaskulären Endothelzellen (PBEC),
die die hoch elektroresistenten TJ besaßen und kultivierte Schweineaorta-Endothelzellen (PAEC).
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Als
Schweineoccludin-cDNA-Fragment wurde eine 363 Basenfragment durch
Amplifikation mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung des 1359–1391 Sinnstrangs
(Sequenz Nr. 7) und 1692–1721
Anti-Sinnstrangs (Sequenz Nr. 8) der menschlichen Occludin-DNA-Sequenz
(Sequenz Nr. 4) als Primer. Die Aminosäuresequenz, basierend auf einer
Analyse der kodierenden Basensequenz des Fragments zeigte einen
hohen Homologiegrad zu den Aminosäuresequenzen der menschlichen,
Maus- und Hundeoccludine und verifizierte so, dass das Fragment
eine cDNA für
Schweineoccludin war. 32P-markiertes Fragment
wurde als Sonde verwendet.
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Um
eine mRNA von den kultivierten Zellen herzustellen, wurde eine Agarosegel-elektrophoretisch
behandelte Probe auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und
mit der cDNA-Sonde unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert,
wobei ein RNA-Isolationskit (Stratagene) verwendet wurde. Im Ergebnis
wurde gezeigt, dass die Occludin-mRNA eine starke Bande bei ungefähr 2,4 kb
in PBEC aufwies, während
bei PAEC nur eine sehr schwache Band an dieser Position bemerkt
wurde.
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Die
Expression von Occludin in diesen Zellen wurde unter Verwendung
eines Anti-Mausoccludin-Antikörpers
als monoklonaler Antikörper,
der spezifisch Säugeroccludine
erkennt und eines Antikörpers
gegen des TJ-verwandte Protein ZO-1 verglichen.
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Ein
Anti-Mausoccludin-Rattenantikörper
wurde unter Verwendung von Mausoccludin:Gluthation-S-Transferase
fusioniertes Protein als Antigen hergestellt und ein FITC-markierter
Anti-Ratten-IgG-Schafantikörper wurde
für den
Nachweis des Antikörpers
verwendet. Wenn gleiche Proteinmengen der Extrakte von aufgebrochenen
kultivierten Zellen durch Immunoblot nach einer eindimensionalen
Gelelektrophorese analysiert wurden, wurde eine starke Occludinbande
bei ungefähr
58KD in PBEC nachgewiesen, während
eine deutlich schwächere
Bande bei dieser Position bei den PAEC bemerkt wurde. Andererseits
gab es keine deutliche Differenz der Expression von ZO-1 zwischen
den beiden Zellarten. Bei einer Immunanfärbung zeigten die PBEC eine
deutliche Occludinexpression mit derselben kontinuierlichen interzellulären Lokalisierung
wie ZO-1, wie in der Immunoblot-Studie beobachtet. Bei PAEC wurde
demgegenüber
Occludin kaum nachgewiesen und ZO-1 zeigte eine diskontinuierliche
interzelluläre
Lokalisierung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die relativ ausgeprägte Expression
von Occludin bei PBEC für
die Bildung der hoch elektroresistenten TJ nötig ist und bringen Beweise
dar, dass Occludin das konstituierende Protein von TJ ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 sind
Fotografien, die Zeichnungen ersetzen, die die Morphologie von Organismen
darstellen. Foto A ist eine mit einem anti-menschlichen Occludin-Ratten-monoklonalen
Antikörper
gefärbte
immunofluoreszierende Mikrofotografie des kultivierten menschlichen
Verdauungstrakt-Epithelzellstamms T84. Foto B ist eine mit einem
Maus-monoklonalen Antikörper gegen
das TJ-Auskleidungsprotein ZO-1 gefärbte Immunfluoreszenz-Mikrofotografie
des kultivierten menschlichen Verdauungstrakt-Epithelzellstamms
T84. Dieselben Stellen von T84 wurden fotografiert.
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