ES2652017T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el engaño inmunitario, particularmente útiles en el tratamiento de cáncer - Google Patents

Abstract

Una molécula que comprende: (i) un péptido restringido al MHC humano capaz de provocar una respuesta de memoria cuando está presente en la molécula, (ii) un primer conector peptídico, (iii) una ß-2-microglobulina humana, (iv) un segundo conector peptídico, (v) una cadena de HLA-A2 de una molécula de la clase I del MHC humano, y (vi) un dominio de direccionamiento de anticuerpo específico de tumor, en la que los segmentos (v) y (vi) están unidos entre sí directamente por un enlace peptídico o por un tercer conector peptídico y en la que el extremo carboxilo de cada uno de los segmentos (i) a (v) está unido al extremo amino de los segmentos (ii) a (vi), respectivamente.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones farmaceuticas para el engano inmunitario, particularmente utiles en el tratamiento de cancer

Campo y antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere a un novedoso concepto en inmunoterapia, por el que el engano del sistema inmunitario produce destruccion espedfica y mas eficiente de celulas de interes, celulas cancerosas en particular.

Hay fuerte evidencia de que la progresion tumoral en pacientes con cancer esta controlada por el sistema inmunitario. Esta conclusion se basa en observaciones de que la progresion tumoral esta frecuentemente asociada a la secrecion de factores supresores inmunitarios y/o regulacion por disminucion de las funciones de presentacion del antigeno de la clase I del MHC (1-5). La inferencia es que los tumores deben haber elaborado estrategias para evitar una respuesta inmunitaria aparentemente eficaz. Y, lo que es mas importante, puede detectarse una respuesta inmunitaria espedfica de tumor en individuos (6-8).

La aparente ineficiencia de las respuestas inmunitarias antitumorales que produce el fallo de combatir la enfermedad sienta la base para los actuales conceptos de inmunoterapia. Se sugiere que el refuerzo de la respuesta inmunitaria antitumoral por vacunacion deliberada o por otros enfoques inmunoterapeuticos puede aumentar los posibles beneficios de las terapias basadas en inmunidad (6,9-11).

El brazo efector de los linfocitos T citotoxicos (CTL) CD8 restringidos a la clase I del MHC de la respuesta inmunitaria adaptativa esta mejor equipado para reconocer el tumor como extrano e iniciar la cascada de eventos que producen la destruccion tumoral (12,13). Por tanto, el enfoque mas atractivo en la inmunoterapia del cancer esta centrado en las estrategias de vacunacion disenadas para potenciar el brazo de CTL de la respuesta antitumoral y, por consiguiente, vencer los mecanismos de escape tumoral de CTL (9-11).

Uno de los mecanismos de escape mejor estudiados por los que las celulas tumorales evaden el ataque inmunitario es por la regulacion por disminucion de las moleculas de la clase I del MHC que son los antfgenos reconocidos por CTL (1-5,14).

Mutaciones a lo largo de la via de presentacion de la clase I deben ser la forma mas simple de los tumores para escapar de la eliminacion mediada por CTL, ya que puede lograrse por uno o dos eventos mutacionales (dos mutaciones para inactivar ambos alelos o una mutacion para crear un inhibidor negativo dominante) (1-3).

Se observa frecuentemente la regulacion por disminucion de la expresion de la clase I del MHC en tumores humanos, y es particularmente pronunciada en lesiones metastasicas (3,14-17). Esto es circunstancial, pero sin embargo evidencia convincente de la funcion de CTL en controlar la progresion tumoral en pacientes con cancer. La expresion de la clase I del MHC ha sido principalmente analizada en espedmenes de tumor quirurgicamente extirpados usando metodos inmunohistoqmmicos (14-15). Se ha informado de la reduccion parcial o perdida completa de MHC, que engloba todas las moleculas del MHC o limitada a alelos particulares (14-15). La perdida de MHC puede observarse en algunas, pero no todas, las lesiones del mismo paciente. La regulacion por disminucion de la expresion de la clase I del MHC ha sido atribuida a mutaciones en p2-microglobulina (p2-m), transportador asociado a protemas de presentacion de antfgenos (TAP), o las protemas lMP-2 y LMP-7 del proteosoma (2,18-21). Evidencia adicional que implica la perdida de la expresion de la clase I del MHC como mecanismo para el escape tumoral de la eliminacion mediada por CTL procede de un estudio longitudinal de un paciente con melanoma. Celulas tumorales extirpadas durante la cirugfa inicial presentaron nueve antfgenos diferentes limitados a cuatro alelos de la clase I del HLA separados para clones de CTL establecidos del paciente (1). El paciente siguio sin enfermedad durante 5 anos despues de que se detectara una metastasis. En particular, una lmea celular establecida de la lesion metastasica habfa perdido los cuatro alelos que se habfa mostrado previamente que presentaban antfgenos de melanoma.

Asf, la regulacion por disminucion de la molecula de la clase I del MHC es un problema limitante grave para la inmunoterapia del cancer y la aplicacion de vacunas contra el cancer. Asf, hay una necesidad ampliamente reconocida de, y sena altamente ventajoso tener, un enfoque novedoso de inmunoterapia que careciera de las limitaciones anteriores, concretamente un enfoque de inmunoterapia que fuera independiente del nivel de expresion de las moleculas de la clase I del MHC por celulas cancerosas.

El documento EP 0 352 761 ensena construcciones de antfgeno que resultan de la union de los antfgenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a moleculas de vehmulo espedficas. La union tiene lugar en el extremo N o C por enlace covalente o, en el caso de enlace no covalente, por ejemplo mediante union a avidina- biotina. Las moleculas de vehmulo espedficas se unen selectivamente a celulas diana y son preferentemente anticuerpos monoclonales. Tambien se desvelan procesos de ingeniena genetica para la produccion de tales construcciones. Por consiguiente, se usan construcciones de antfgeno generadas para danar o eliminar celulas diana.

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Sumario de la invencion

El brazo efector de los linfocitos T citotoxicos (CTL) CD8 restringidos a la clase I del MHC de la respuesta inmunitaria adaptativa esta mejor equipado para reconocer celulas tumorales como extranas e iniciar la cascada de eventos que produce la destruccion tumoral. Sin embargo, los tumores han desarrollado estrategias sofisticadas para escapar de los mecanismos efectores inmunitarios, de las que las mejores estudiadas es por la regulacion por disminucion de las moleculas de la clase I del MHC que son los antigenos reconocidos por CTL.

Las moleculas de la invencion se definen en las reivindicaciones.

Para vencer esto y desarrollar nuevos enfoques para inmunoterapia, y aunque se reduzca la presente invencion a la practica, se construyo una molecula recombinante en la que un MHC monocatenario es espedficamente dirigido a celulas tumorales mediante su fusion con fragmentos de anticuerpo recombinante espedficos de cancer o un ligando que se une a receptores expresados por celulas tumorales. Como una molecula a modo de ejemplo, una molecula de HLA-A2 monocatenaria se fusiono geneticamente con los dominios variables de un anticuerpo humanizado espedfico de la subunidad a anti-receptor de IL-2, anti-Tac (aTac). La construccion, llamada B2M- aTac(dsFv), se expreso en E. coli y se produjeron moleculas funcionales por el replegamiento in vitro en presencia de peptidos antigenicos restringidos al HLA-A2. Estudios de citometna de flujo revelaron la capacidad de decorar celulas tumorales humanas HLA-A2-negativo positivas para antigeno, con complejos de HLA-A2 de un modo que fuera completamente dependiente de la especificidad del fragmento de anticuerpo de direccionamiento. Y, lo que es mas importante, el recubrimiento mediado por B2M-aTac(dsFv) de celulas tumorales diana las hizo susceptibles a la lisis mediada por CTL espedfica del peptido gp100 de melanoma restringido al HLA-A2 eficiente y espedfico. Estos resultados demuestran el concepto de que el direccionamiento espedfico de antfgeno de tumor guiado por anticuerpo de complejos de MHC-peptido en celulas tumorales puede hacerlas susceptibles y potenciar la destruccion de CTL. Este novedoso enfoque abre ahora el camino para el desarrollo de nuevas estrategias inmunoterapeuticas basadas en el direccionamiento de anticuerpos de ligandos de MHC relacionados naturales y mecanismos citotoxicos basados en CTL.

Por lo tanto, aunque la presente invencion se reduzca a la practica, se desarrollo una estrategia novedosa para volver a dirigir los complejos de la clase I del MHC-peptido sobre la superficie de celulas tumorales en una forma que fuera independiente del grado de expresion de la clase I del MHC por las celulas tumorales diana. Para este fin, se emplearon dos brazos del sistema inmunitario en fusion. Un brazo, el resto de direccionamiento, comprende fragmentos recombinantes espedficos de tumor de anticuerpos dirigidos a tumor o antfgenos de diferenciacion que se han usado durante muchos anos para dirigir radioisotopos, toxinas o farmacos a celulas cancerosas (22, 23). El segundo brazo efector es una molecula de MHC monocatenario (MHCmc) compuesta de p2-microglobulina humana unida a los tres dominios extracelulares de la cadena pesada de HLA-A2 (24, 25, documento WO 01/72768). Conectando las dos moleculas en un unico gen recombinante y expresando el gen. La nueva molecula se expresa eficientemente en E. coli y se produce, por ejemplo, por replegamiento in vitro en presencia de peptidos restringidos al HLA-A2. Este enfoque, como se muestra en el presente documento, convierte las celulas tumorales diana en susceptibles a la lisis por linfocitos T citotoxicos independientemente de su nivel de expresion de MHC y asf puede emplearse como un nuevo enfoque para potenciar las inmunidad antitumoral mediada por CTL. Este enfoque novedoso conducira al desarrollo de una nueva clase de agentes terapeuticos recombinantes capaces de destruccion y eliminacion selectiva de celulas tumorales que utilizan ligandos de MHC relacionados naturales y mecanismos citotoxicos basados en CTL.

Segun un aspecto, se proporciona una inmuno-molecula que comprende: un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un dominio de direccionamiento que esta unido al dominio efector de la clase I del MHC humano soluble.

Asf, segun otro aspecto, se proporciona una construccion de acidos nucleicos que codifica una inmuno-molecula, comprendiendo la construccion: un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica un dominio de direccionamiento; el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y el dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionen traduccionalmente opcionalmente mediante un conector peptfdico intermedio.

Segun todavfa otro aspecto, se proporciona una construccion de acidos nucleicos que codifica una inmuno- molecula, comprendiendo la construccion: un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica una region variable de una de una cadena ligera o una cadena pesada de un dominio de direccionamiento de anticuerpo; el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y la region variable de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionen traduccionalmente opcionalmente mediante un conector peptfdico intermedio; y un tercer polinucleotido que codifica la otra de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo.

Segun un aspecto adicional, se proporciona un sistema de construccion de acidos nucleicos que comprende: una

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primera construccion de acidos nucleicos que comprende: un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica una region variable de una de una cadena ligera o una cadena pesada de un dominio de direccionamiento de anticuerpo; el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y la region variable de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionen traduccionalmente opcionalmente mediante un conector peptidico intermedio; una segunda construccion de acidos nucleicos que comprende: un tercer polinucleotido que codifica la otra de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo.

Segun un aspecto adicional, se proporciona un metodo de destruccion selectiva de una celula en un paciente, presentando la celula un antfgeno (por ejemplo, un receptor), comprendiendo el metodo administrar al paciente una inmuno-molecula que comprende: un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble complejado con un peptido restringido al MHC; y un dominio de direccionamiento que esta unido al dominio efector de la clase I del MHC humano soluble, siendo el dominio de direccionamiento para unirse selectivamente al antfgeno; por el cual, el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble complejado con el peptido restringido al mHc inicia una respuesta inmunitaria mediada por CTL contra la celula, destruyendo asf selectivamente la celula in vivo.

Segun caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas mas adelante, el dominio de direccionamiento es un dominio de direccionamiento de anticuerpo.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento es un dominio de direccionamiento de ligando.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento de ligando esta seleccionado del grupo que consiste en PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, VEGF y sus derivados, TNF.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones descritas, el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y el dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende una region variable de una cadena ligera de un anticuerpo unida al dominio efector.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones descritas, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y el dominio efector se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende ademas una region variable de una cadena pesada de un anticuerpo unida a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo se une a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo mediante un conector peptfdico.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo se une a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo mediante al menos un enlace S- S.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende una region variable de una cadena pesada de un anticuerpo unida al dominio efector.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y el dominio efector se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende ademas una region variable de una cadena ligera de un anticuerpo unida a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y la region variable de la cadena pesada del anticuerpo se fusionan traduccionalmente,

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opcionalmente con un conector peptidico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todav^a adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo se une a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo mediante un conector peptidico.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo se une a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo mediante al menos un enlace S- S.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo es capaz de unirse a un antfgeno asociado a tumor.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio de direccionamiento de anticuerpo es capaz de unirse a un antfgeno espedfico de tumor.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble comprende una p-2-microglobulina humana funcional y una cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional unidas a el.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional comprende dominios a 1-3.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la p-2-microglobulina humana funcional y la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble comprende ademas un peptido restringido al MHC.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC esta unido a la p-2-microglobulina humana funcional.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC y la p-2-microglobulina humana funcional se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC esta complejado con la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC deriva de un patogeno comun.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC deriva de un patogeno para el que hay una vacunacion activa.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC deriva de un antfgeno asociado a o espedfico de tumor.

Segun caractensticas adicionales descritas mas adelante, cualquiera de las construcciones de acidos nucleicos descritas en el presente documento, que comprende ademas al menos una secuencia reguladora que actua en cis operativamente unida a los polinucleotidos codificantes en ella.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en bacterias.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en levadura.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en celulas de animales.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en celulas vegetales.

Segun todavfa otro aspecto, se proporciona una celula transformada que comprende cualquiera de las construcciones de acidos nucleicos o el sistema de construccion de acidos nucleicos descrito en el presente

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documento.

Segun caractensticas adicionales en realizaciones preferidas descritas mas adelante, la celula es una celula eucariota seleccionada del grupo que consiste en una celula de mairnfero, una celula de insecto, una celula de planta, una celula de levadura y una celula de protozoo.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la celula es una celula bacteriana.

Segun todavfa un aspecto adicional, se proporciona una preparacion aislada de cuerpos de inclusion derivados de bacteria que comprenden mas del 30 por ciento en peso de una inmuno-molecula como se describe en el presente documento.

Segun todavfa un aspecto adicional de la presente divulgacion, se proporciona un metodo de produccion de una inmuno-molecula que comprende: expresar, en bacterias, la inmuno-molecula que comprende: un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble que incluye una p-2-microglobulina humana funcional y una cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional unidas a el; y un dominio de direccionamiento que esta unido al dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y aislar la inmuno-molecula.

Segun caractensticas adicionales en realizaciones preferidas descritas mas adelante, la inmuno-molecula comprende ademas un peptido restringido al MHC unido a la p-2-microglobulina humana funcional, comprendiendo el metodo ademas el replegamiento de la inmuno-molecula para asf generar un complejo de clase I del MHC-peptido restringido al MHC.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el aislamiento de la inmuno- molecula es por cromatograffa de exclusion por tamano.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, un peptido restringido al MHC se co-expresa junto con la inmuno-molecula en las bacterias.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la expresion, en las bacterias, de la inmuno-molecula se efectua de forma que la inmuno-molecula forme cuerpos de inclusion en las bacterias.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC y la inmuno-molecula co-forman cuerpos de inclusion en las bacterias.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el aislamiento de la inmuno- molecula comprende ademas: desnaturalizar los cuerpos de inclusion para liberar moleculas de protemas de los mismos; y renaturalizar las moleculas de protemas.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el renaturalizar las moleculas de protemas se efectua en presencia de un peptido restringido al MHC.

Segun caractensticas todavfa adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el peptido restringido al MHC se co-expresa en las bacterias.

La presente invencion trata satisfactoriamente las limitaciones de las configuraciones presentemente conocidas proporcionando un nuevo medio con el que combatir el cancer.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se describe en el presente documento, a modo de ejemplo solo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia espedfica ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los datos mostrados son a modo de ejemplo y para fines de discusion ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invencion solo, y se presentan en la causa de proporcionar lo que se cree que es la descripcion mas util y facilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invencion. A este respecto, no se hace intento por mostrar detalles estructurales de la invencion en mas detalle que el que es necesario para un entendimiento fundamental de la invencion, haciendo evidente la descripcion, tomada con los dibujos, para aquellos expertos en la materia como las varias formas de la invencion pueden ser integradas en la practica.

En los dibujos:

Las FIG. 1A-F demuestran la union de complejos scHLA-A2 replegados in vitro a CTL. Se hicieron reaccionar clones de CTL espedficos del antfgeno de diferenciacion de melanoma gp100 R6C12 y R1E2 con tetrameros scHLA-A2 purificados replegados in vitro que conteman el epitope G9-209M reconocido por CTL R6C12 y el peptido G9-280V reconocido por CTL R1E2. Se tineron CTL con FITC-anti-CD8 (Figuras 1A y 1D), con

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tetrameros scHLA-A2/G9-209M marcados con PE (Figuras 1B y 1F) y con tetrameros scHLA-A2/G9-280V (Figuras 1C y 1E). Se tineron CTL R6C12 y r1e2 con el tetramero G9-209M y G9-280V espedfico, respectivamente pero no con tetramero de control.

La FIG. 1G es una representacion esquematica de un complejo scHLA-A2 usado en los experimentos descritos en las Figuras 1A-F.

La FIG. 1H demuestra las secuencias de acidos nucleicos (SEQ ID NO:1) y de aminoacidos (SEQ ID NO:2) de scHLA-A2 esquematicamente ilustradas en la Figura 1G.

Las FIG. 2A-D demuestran el diseno, expresion, purificacion y caracterizacion bioqdmica de B2M-aTac(dsFv). Figura 2A - Se genero la construccion B2M-aTac(dsFv) fusionando un MHC monocatenario con un fragmento Fv variable de anticuerpo. En el gen de HLA-A2 monocatenario se fusiono con a-2m humana con los tres dominios extracelulares de HLA-A2 mediante un conector flexible de 15 aminoacidos de longitud [(Gly4-Ser)3, es decir, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:3), codificado por GGCGGAGGAGGGTCCGGTGGCGGAGG TTCAGGAGGCGGTGGATCG (SEQ ID NO:15)]. Se uso el mismo conector peptidico para conectar el gen scHLA con el fragmento Fv de anticuerpo. Se fusiono el dominio variable VL del anticuerpo con el extremo C del gen scHLA-A2 mientras que el dominio variable VH se expreso por separado. Los dos plasmidos se expresaron en cultivos separados y se combinaron los cuerpos de inclusion reducidos solubilizados para formar fragmentos Fv estabilizados por disulfuro (dsFv) en los que los dominios variables Fv estan estabilizados por enlaces disulfuro intercatenarios manipulados entre restos conservados de la region estructural. La Figura 2B muestra el analisis de SDS-PAGE de los cuerpos de inclusion de cultivos bacterianos incluidos para expresar los componentes de B2M-aTac(dsFv); B2M-aTacVL y aTacVH. La Figura 3C muestra el analisis de SDS-PAGE en geles no reductores y reductores de B2M-aTac(dsFv) despues de la purificacion por intercambio ionico en columna de Q-Sepharose. La Figura 4D demuestra la union de B2M-aTac(dsFv)lG9-209M replegado al antfgeno diana, p55. La deteccion de la union fue con el MAb w6/32 espedfico de conformacion.

La FIG. 2E demuestra las secuencias de acidos nucleicos (SEQ ID NO:4, la secuencia conectora se muestra en letras minusculas) y de aminoacidos (SEQ ID NO:5) de B2M-aTacVL esquematicamente ilustrado en la Figura 2A como parte de B2M-aTac(dsFv).

La FIG. 2F demuestra las secuencias de acidos nucleicos (SEQ ID NO:6) y de aminoacidos (SEQ ID NO:7) de aTacVH esquematicamente ilustradas en la Figura 2A como parte de B2M-aTac(dsFv).

Las FIG. 3A-F demuestran la union de B2M-aTac(dsFv) a celulas diana de tumor HLA-A2-negativo. Analisis de citometna de flujo de la union de B2M-aTac(dsFv) a celulas HLA-A2-negativo positivas para antfgeno. La Figura 3A muestra la union del Mab anti-Tac (rojo) a A431; la Figura 3B muestra la union del MAb anti-Tac a celulas A431 transfectadas con Tac (p55) (AtAc4) (rojo); la Figura 3C muestra la union del MAb anti-HLA-A2 BB7.2 a celulas A431 incubadas (rojo) o no (azul) con B2M-aTac(dsFv); la Figura 3D muestra la union del MAb BB7.2 a celulas ATAC4 transfectadas con p55 preincubadas (rojo) o no (azul) con B2M-aTac(dsFv); la Figura 3E muestra la union del MAb anti-Tac (rojo) a celulas HUT102W leucemicas; y la Figura 3F muestra la union del MAb BB7.2 a celulas HUT102W preincubadas (rojo) o no (azul) con B2M-aTac(dsFv). En todos los casos, las celulas de control con anticuerpo secundario se muestran en negro.

Las FIG. 4A-E demuestra la potenciacion de la lisis mediada por CTL de celulas tumorales HLA-A2-negativo por B2M-aTac(dsFv). Se incubaron celulas diana recubiertas o no con los complejos de B2M-aTac(dsFv)-peptido con CTL espedficos del peptido gp100 reactivo con melanoma en un ensayo de liberacion de 35metionina. Figura 4A - Se preincubaron o no celulas A431 y ATAC4 HLA-A2- transfectadas con p55 con complejos B2M- aTac(dsFv)/G9-209M, seguido de incubacion con el CTL espedfico de G9-209M, R6C12. El control son celulas incubadas con medio solo; Figura 4B - se preincubaron celulas A431 y ATAC4 HLA-A2- transfectadas con p55 con complejos B2M-aTac(dsFv)/G9-209M, seguido de incubacion con CTL R6C12. FM3D son celulas de melanoma HLA-A2+, gp100+; Figuras 4C y 4D - se preincubaron celulas ATAC4 transfectadas con p55 con complejos B2M-aTac(dsFv) replegados con los peptidos restringidos al HLA-A2 G9-209M, G9-280V y TAX, seguido de incubacion con el clon de CTL espedfico de G9-209M R6C12 en la Figura 4C o el clon de CTL espedfico de G9-280V R1E2 en la Figura 4D; Figura 4E - se preincubaron celulas leucemicas HUT102W y CRII- 2 HLA-A2- (con) o no (sin) con complejos B2M-aTac(dsFv) que conteman el peptido apropiado, seguido de incubacion con los CTL R6C12 espedficos de G9-209M o CTL R1E2 espedficos de G9-280V como se indica.

La FIG. 5 es un grafico que demuestra los resultados de un ensayo in vivo con B2m-aTac(dsFv). Se mezclaron celulas ATAC4 (1x105) con CTL R6C12 (1x106) (E:T 10:1) en presencia o ausencia de B2M-aTac(dsFv) (20-50 |jg/ml) en 200 jl. La mezcla se inyecto por via subcutanea a ratones sin pelo y se observo la aparicion de tumores. Se usaron celulas ATAC4 solas como control.

La FIG. 6 es una ilustracion esquematica de inmuno-moleculas preferidas segun la presente invencion, en la que las lmeas entre recuadros representan enlace covalente (por ejemplo, fusion traduccional) entre restos en los recuadros.

Descripcion de las realizaciones preferidas

La presente divulgacion es de (i) inmuno-moleculas novedosas; (ii) metodos de preparacion de las mismas; (iii)

construcciones de acidos nucleicos que codifican las mismas; y (iv) metodos de uso de las mismas para la

destruccion selectiva de celulas, celulas cancerosas en particular.

Los principios y operacion de la presente invencion pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y

descripciones adjuntas.

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Por tanto, debe entenderse que la fraseologfa y terminologfa empleadas en el presente documento es con el fin de descripcion y no debe ser considerada como limitante.

La progresion tumoral se asocia frecuentemente a la secrecion de factores inmunosupresores y/o regulacion por disminucion de funciones de presentacion del antigeno de la clase I del MHC (1-5, 14, 15). La inferencia es que los tumores han elaborado estrategias para evitar una respuesta inmunitaria aparentemente eficaz. Un significativo progreso hacia el desarrollo de vacunas que puedan estimular una respuesta inmunitaria contra tumores ha implicado la identificacion de los antigenos de protema asociados a un tipo de tumor dado y se identifico el mapeo de epitopes de antfgenos de tumor para los motivos de union restringidos a la clase I y la clase II del HLA y estan actualmente siendo usados en diversos programas de vacunacion (6, 9, 11-13). Las moleculas de la clase I del MHC que presentan los peptidos apropiados son necesarias para proporcionar las senales espedficas para el reconocimiento y la destruccion por CTL. Sin embargo, el mecanismo principal de escape tumoral es la perdida, regulacion por disminucion o alteracion de los perfiles de HLA que puedan convertir la celula diana en insensible a la lisis de CTL, aunque la celula expresa el antfgeno de tumor apropiado. En tumores humanos, la perdida de HLA puede ser de hasta el 50 %, sugiriendo que una reduccion en los niveles de protema podna ofrecer una ventaja de supervivencia a las celulas tumorales (14, 15).

La presente invencion presenta un nuevo enfoque para evitar este problema. Aunque se reduzca la presente invencion a la practica, se mostro que el direccionamiento espedfico de tumor de los complejos de la clase I del MHC-peptido en celulas tumorales era una estrategia eficaz y eficiente para convertir celulas HLA-A2-negativo susceptibles a la lisis por CTL restringidos al HLA-A2 relevantes. Esta nueva estrategia de redirigir los CTL contra celulas tumorales aprovecha el uso de fragmentos recombinantes de anticuerpo o ligandos que pueden localizarse en celulas malignas que expresan un marcador tumoral (antfgeno, por ejemplo, receptor), normalmente asociado al fenotipo transformado (tal como receptores del factor de crecimiento, antfgenos de diferenciacion), con un grado relativamente alto de especificidad. Los fragmentos de anticuerpo recombinante de direccionamiento tumoral usados, aunque se reduzca la presente invencion a la practica, estan constituidos por los dominios variables Fv que son los modulos funcionales mas pequenos de anticuerpos necesarios para mantener la union al antfgeno. Esto los haces especialmente utiles para aplicaciones clmicas, no solo para generar la molecula descrita en el presente documento, sino tambien para preparar otras protemas de fusion de anticuerpo, tales como inmunotoxinas Fv recombinantes o fusiones de anticuerpo recombinante-citocina (37, 38), debido a que su pequeno tamano mejora la penetracion tumoral.

El fragmento de direccionamiento de anticuerpo o ligando de direccionamiento se fusiona con una molecula de HLA monocatenario que puede plegarse eficientemente y funcionalmente alrededor de un peptidos restringido al HLA-A2. Este enfoque puede ser expandido a otros alelos de HLA importantes y muchos tipos de specificidades tumorales que son dictados por los fragmentos de anticuerpo recombinante, generando asf una nueva familia de agentes inmunoterapeuticos que puede usarse para aumentar y potenciar las actividades antitumorales. Junto con la aplicacion de anticuerpos monoclonales para la terapia del cancer, este enfoque puede considerarse como un enlace entre los anticuerpos antitumorales y la inmunoterapia mediada por celula.

Ya se han usado anticuerpos recombinantes para redirigir linfocitos T usando un enfoque clasico de anticuerpos biespedficos en los que un brazo de anticuerpo se dirige contra un antfgeno espedfico de tumor y el otro brazo contra una molecula asociada a celula efectora tal como CD3 para CTL y CD16 para celulas NK (39).

Tambien se han usado ya ligandos que se unen a celulas tumorales para dirigir una variedad de toxinas a celulas tumorales. Veanse, por ejemplo, las referencias 50-52 con respecto a EGF, TGFa, IL-2 e IL-3.

Una ventaja importante del enfoque de la presente invencion es el uso de una molecula recombinante que puede producirse en una forma homogenea y grandes cantidades. Y, lo que es mas importante, el tamano de la molecula B2M-dsFv de aproximadamente 65 kDa (generada con cualquier fragmento dsFv de anticuerpo) es optimo con respecto a los requisitos necesarios para la buena penetracion tumoral por una parte y semivida relativamente larga y estabilidad en la circulacion por otra (40). Un estudio reciente que describe la generacion de tetrameros de anticuerpo-clase I del MHC fue publicado por que se observo la eficiente destruccion mediada por CTL de celulas diana tumorales usando conjugados de tetramero de Fab-estreptavidina-MHC (41). La limitacion de este enfoque, en comparacion con la fusion de fragmento de anticuerpo recombinante-MHCmc monomerico descrita en el presente documento, es el gran tamano de estas moleculas de aproximadamente 400 kDa y el hecho de que los tetrameros de MHC solubles pueden inducir la activacion de los propios linfocitos T, mientras que la molecula de MHC monomerica no puede inducir la activacion, a menos que esta a una concentracion local relativamente alta (42-44).

El recubrimiento de celulas tumorales que habfan regulado por disminucion su propia expresion de MHC mediante el uso de este enfoque de direccionamiento potencia las celulas para la destruccion mediada por CTL mientras que se usa una diana en las celulas tumorales que esta normalmente implicada en el proceso de transformacion, los ejemplos mas clasicos son los receptores del factor de crecimiento tales como IL-2r como se usa en el presente documento. Este hecho tambien favorece la idea de que usando este enfoque los mutantes de escape que regulan por disminucion el receptor elegido como diana probablemente no tienen una ventaja de crecimiento debido a que el receptor participa directamente en funciones de supervivencia clave de las celulas cancerosas.

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Otra ventaja del enfoque de anticuerpo presentado en el presente documento es el hecho de que estos nuevos agentes pueden disenarse alrededor de la especificidad de peptido deseado, concretamente el replegamiento de la molecula B2M-Fv puede realizarse alrededor de cualquier peptido restringido al MHC apropiado. En los ejemplos presentados en el presente documento, se emplearon CTL espedficos de tumor restringidos al HLA-A2 que reconocen epitopes de linfocitos T derivados del antigeno de diferenciacion de melanoma gp100. Sin embargo, el tipo de CTL reactivos con antigeno que va a ser redirigido para destruir las celulas tumorales puede definirse por otros peptidos antigenicos basandose en el reciente conocimiento de los mecanismos inmunitarios en salud y enfermedad. Por ejemplo, la identificacion de respuestas de CTL espedficos de tumor en pacientes puede sugerir que estos pueden ser eficientes para el direccionamiento. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que estos CTL espedficos de tumor no siempre son optimos, ya que estan frecuentemente presentes solo a frecuencias muy bajas o incluso cuando estan presentes a frecuencias altas pueden no ser funcionales o anergicos (7). Asf, una fuente mas activa y prometedora de CTL puede ser reclutada de linfocitos circulantes dirigidos contra epitopes de linfocitos T comunes y muy inmunogenicos tales como derivados de virus o toxinas bacterianas que tambien pueden provocar una buena respuesta de memoria (45,46). Se ha mostrado que los precursores de CTL dirigidos contra epitopes de gripe, VEB, CMV (peptidos) se mantienen en altas frecuencias en la circulacion de pacientes con cancer, ademas de individuos sanos y estos CTL son normalmente activos y con un fenotipo de memoria (45, 46). Asf, estos CTL senan la fuente de eleccion para ser redirigidos a las celulas tumorales mediante el uso de una molecula B2M-Fv generada cargada con tales epitopes derivados de virus. El agente optimo es una molecula B2M- Fv en la que el peptido antigenico tambien esta ligado covalentemente al complejo mediante el uso de un conector flexible que conecta el peptido con el extremo N de la p-2-microglobulina. Esta construccion garantizara la optima estabilidad para el complejo de MHCmc in vivo debido a que el peptido estabilizante esta conectado covalentemente y no puede abandonar facilmente la ranura de union a MHC-peptido Este tipo de moleculas de peptido-MHC monocatenario se generaron previamente en sistemas murinos y humanos para diversos estudios funcionales y estructurales (47, 48). Una opcion adicional es usar derivados de peptido antigenicos que se modifican en los "restos de anclaje" de forma que aumente su afinidad por la ranura de union a HLA (27).

Tambien hay varias opciones para el tipo de fragmento Fv que va a usarse como el resto de direccionamiento. Ademas del tipo dsFv de fragmento, empleado aunque que se reduzca la presente invencion a la practica, puede usarse un fragmento Fv monocatenario (scFv) en el que los dominios VH y VL de anticuerpo estan conectados mediante un conector peptfdico. En tal caso, la molecula B2M-Fv esta codificada por un plasmido que evita la posible contaminacion con moleculas B2M de un solo dominio.

Otro aspecto importante de la presente invencion que esta soportado por otros es el hecho de que el recubrimiento de complejos de MHC-peptido antigenicos sobre la superficie de celulas tumorales sin anclaje transmembranario es suficiente para inducir su eficiente lisis por CTL espedficos sin el conocimiento de si moleculas accesorias autologas de las celulas tumorales diana estan presentes o no en absoluto y estan desempenando una funcion en tal destruccion mediada por CTL. Esta observacion resulta del hecho de que se forma una alta concentracion local de complejos de MHC-peptido recubiertos que presentan un epitope de linfocito particular T (peptido) sobre las celulas elegidas como diana que supera enormemente la densidad natural de tales complejos presentados sobre la superficie de celulas. En el caso de la subunidad a de IL-2R, estan presentes varios de cientos a miles de sitios por celula en las celulas diana, en comparacion con muy pocos complejos que contienen un peptido particular que se espera este presente sobre las celulas, que puede ser suficiente para la destruccion eficaz y eficiente, incluso sin la participacion de moleculas accesorias. Esto es sin tener en cuenta la regulacion por disminucion de la expresion de la clase I del MHC como mecanismo de escape. Indicacion adicional de esta posibilidad se encuentra mediante los hallazgos de que los tetrameros de MHC pueden inducir la activacion de linfocitos T por sf mismos (44), que incluye la reciente observacion de que la activacion de CTL por tetrameros de MHC sin moleculas accesorias puede demostrarse al nivel de celula individual (Cohen, Denkberg, Reiter; manuscrito presentado).

En conclusion, los resultados presentados en el presente documento proporcionan una clara demostracion de la utilidad del enfoque de la presente invencion para reclutar CTL activos para la destruccion tumoral de celulas mediante anticuerpo espedfico de cancer o direccionamiento guiado por ligando de complejos de MHCmc-peptido. Estos resultados sientan las bases para el desarrollo de una nuevo enfoque inmunoterapeutico basado en respuestas inmunitarias celulares que existen de forma natural que son redirigidas contra las celulas tumorales.

Segun un aspecto, se proporciona una inmuno-molecula que comprende un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un dominio de direccionamiento, ya sea el dominio de direccionamiento de anticuerpo o dominio de direccionamiento de ligando, que esta unido al dominio efector de la clase I del MHC humano soluble. Preferentemente, la inmuno-molecula tiene un peso molecular inferior a 100 kDa. El dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y el dominio de direccionamiento se fusionan preferentemente traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio. Sin embargo, otras formas para unir covalentemente el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y el dominio de direccionamiento se describen en el presente documento mas adelante.

La Figura 6 demuestra varias inmuno-moleculas preferidas de la presente invencion, identificadas como (i) - (xiv). Todas las moleculas comprenden un MHC monocatenario y soluble, que incluye p-2-microglobulina humana funcional unida a la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional, que preferentemente comprende los dominios a 1-3. Preferentemente, la p-2-microglobulina humana funcional y la cadena pesada de la clase I del MHC

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humano funcional se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptidico traduccionalmente fusionado intermedio. Sin embargo, como se detalla adicionalmente mas adelante, la p-2-microglobulina humana funcional y la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional pueden unirse covalentemente entre sf en otras formas.

Como se usa en el presente documento, el termino "funcional", cuando se usa en referencia a la p-2-microglobulina y polipeptidos de cadena pesada de un complejo de la clase I del MHC monocatenario, se refiere a cualquier porcion de cada uno que es capaz de contribuir al ensamblaje de un complejo de la clase I del MHC monocatenario funcional (es decir, capaz de union y presentacion a peptidos antigenicos restringidos al MHC espedficos de CTL cuando se complejan).

Las expresiones "traduccionalmente fusionado" y "en marco" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polipeptidos codificados por polinucleotidos que estan unidos covalentemente para formar un unico marco de lectura abierto continuo que abarca la longitud de las secuencias codificantes de los polinucleotidos unidos. Tales polinucleotidos pueden unirse covalentemente directamente o preferentemente indirectamente mediante un espaciador o region conectora que codifica un peptido conector.

Las moleculas (i) - (vi) y (xiii) comprenden ademas un peptido restringido al MHC covalentemente unido a ellas. El peptido restringido al MHC esta preferentemente unido a la p-2-microglobulina humana funcional. Preferentemente, el peptido restringido al MHC y la p-2-microglobulina humana funcional se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio. Sin embargo, como se detalla ademas mas adelante, el peptido restringido al MHC y la p-2-microglobulina humana funcional pueden unirse covalentemente entre sf de otras formas.

Las moleculas (vii) - (xii) y (xiv) comprenden ademas un peptido restringido al MHC que no esta covalentemente unido a ellas. En ambos casos, sin embargo, el peptido restringido al MHC esta seleccionado para complejarse con la cadena pesada de la clase I del MHC humano funcional tras el replegamiento, como se describe ademas mas adelante.

El peptido restringido al MHC deriva preferentemente de un patogeno comun, tal como gripe, hepatitis, etc. El patogeno del que deriva el peptido restringido al MHC se selecciona segun varios criterios del siguiente modo: (i) preferentemente, una gran porcion de la poblacion se expuso al patogeno o sus antfgenos mediante infeccion de vacunacion; (ii) una vacunacion activa esta disponible para el patogeno, de manera que sea capaz de reforzar la respuesta inmunitaria; y (iii) se retiene tftulo relativamente alto de CTL con memoria a largo plazo para el patogeno en pacientes infectados o vacunados.

Alternativamente, el MHC-peptido deriva de un antfgeno asociado a o espedfico de tumor. Se mostro que los peptidos restringidos al MHC derivados de antfgeno asociado a o espedfico de tumor pueden usarse para provocar una respuesta de CTL eficiente. Para este fin, veanse, por ejemplo, el documento WO 00/06723, que se incorpora en el presente documento por referencia.

El dominio de direccionamiento puede ser un dominio de direccionamiento de anticuerpo (moleculas (i)-(xii)) o un dominio de direccionamiento de ligando (moleculas (xiii) y (xiv)).

Segun una realizacion preferida de la presente invencion, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende una region variable de una cadena ligera de un anticuerpo unido al dominio efector (veanse las moleculas (i) y (vii) de la Figura 6). Preferentemente, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y el dominio efector se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio. Sin embargo, otras formas de enlazar covalentemente la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y el dominio efector se describen a continuacion.

Segun otra realizacion preferida, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende ademas una region variable de una cadena pesada de un anticuerpo unida a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo (veanse las moleculas (iii) - (vi) y (ix) - (xii) de la Figura 6). Preferentemente, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio (veanse las moleculas (vi) y (x) de la Figura 6). Sin embargo, otras formas de enlazar covalentemente la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo se desvelan en el presente documento.

Por ejemplo, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo puede unirse a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo mediante al menos un enlace S-S, generando un resto dsFV (veanse, por ejemplo, las moleculas (v) y (xi) en la Figura 6)).

Segun otra realizacion preferida de la presente invencion, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende una region variable de una cadena pesada de un anticuerpo unido al dominio efector (veanse las moleculas (ii) y (viii) de la Figura 6). Preferentemente, la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y el dominio efector se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio

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(veanse las moleculas (iii) y (ix) de la Figura 6). Sin embargo, otras formas para unir covalentemente la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y el dominio efector se describen mas adelante.

Segun otra realizacion preferida, el dominio de direccionamiento de anticuerpo comprende ademas una region variable de una cadena ligera de un anticuerpo unida a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo (veanse las moleculas (iii), (vi), (ix) y (xii) de la Figura 6). Preferentemente, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y la region variable de la cadena pesada del anticuerpo se fusionan traduccionalmente, opcionalmente con un conector peptfdico traduccionalmente fusionado intermedio (veanse las moleculas (iii) y (ix) de la Figura 6). Sin embargo, otras formas para unir covalentemente la region variable de la cadena ligera del anticuerpo y la region variable de la cadena pesada del anticuerpo se desvelan en el presente documento.

Por ejemplo, la region variable de la cadena ligera del anticuerpo puede unirse a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo mediante al menos un enlace S-S, generando un resto dsFv (veanse, por ejemplo, las moleculas (vi) y (xii) en la Figura 6)).

El dominio de direccionamiento de anticuerpo en la molecula de la invencion esta seleccionado para ser capaz de unirse a un antfgeno asociado a o espedfico de tumor. Se apreciara a este respecto que actualmente hay varios cientos de antfgenos asociados a o espedficos de tumor identificados, asociados a diversos tumores solidos y no solidos, y ademas que los anticuerpos monoclonales se desarrollaron para muchos de ellos. En otras palabras, las secuencias de aminoacidos y de acidos nucleicos de muchos anticuerpos que se unen espedficamente a antfgenos asociados a o espedficos de tumor ya son conocidos o pueden ser facilmente determinados analizando los hibridomas que producen tales anticuerpos.

Las moleculas descritas en la Figura 6 estan compuestas de un unico polipeptido [por ejemplo, moleculas (i)-(iv) y (xiii)], dos polipeptidos [moleculas (v), (vi), (vi)-(x) y (xiv)] o tres polipeptidos [moleculas (xi) y (xii)].

Los terminos peptido y polipeptido se usan en el presente documento indistintamente. Cada uno de los polipeptidos puede sintetizarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica. Por lo tanto, se apreciara que las inmuno- moleculas de la presente invencion o porciones de las mismas pueden prepararse de varias formas, que incluyen smtesis en fase solida de protemas, sin embargo, en la realizacion preferida de la invencion, al menos porciones importantes de las moleculas, por ejemplo, el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble (con o sin el peptido restringido al MHC) y el dominio de direccionamiento de anticuerpo (como un scFV o como un brazo de un dsFv) se generan portraduccion de una construccion o construcciones de acidos nucleicos respectivas.

Asf, se requiere de uno a tres marcos de lectura abiertos para sintetizar las moleculas de la Figura 6 mediante traduccion. Estos marcos de lectura abiertos pueden residir en una unica, dos o tres moleculas de acidos nucleicos. Asf, por ejemplo, una unica construccion de acidos nucleicos puede llevar uno, dos o tres marcos de lectura abiertos. Pueden usarse una a tres secuencias reguladoras que actuan en cis para controlar la expresion del uno a tres marcos de lectura abiertos. Por ejemplo, una unica secuencia reguladora que actua en cis puede controlar la expresion de uno, dos o tres marcos de lectura abiertos, en un modo similar a cistron. Alternativamente, pueden usarse tres secuencias reguladoras que actuan en cis independientes para controlar la expresion de los tres marcos de lectura abiertos. Tambien se preven otras combinaciones.

En casos en los que el peptido restringido al MHC no se una covalentemente a las restantes porciones de la molecula (vease en la Figura 6 moleculas (vii) - (xii)), se prepara preferentemente mediante tecnicas en fase solida, ya que es generalmente un peptido corto de menos de 10 aminoacidos.

Los marcos de lectura abiertos y las secuencias reguladoras que actuan en cis pueden ser llevados por una a tres moleculas de acidos nucleicos. Por ejemplo, cada marco de lectura abierto y su secuencia reguladora que actua en cis son llevados por una molecula de acido nucleico diferente, o todos los marcos de lectura abiertos y sus secuencias reguladoras que actuan en cis asociadas son llevados por una unica molecula de acido nucleico. Tambien se preven otras combinaciones.

La expresion del (de los) polipeptido(s) puede efectuarse por transformacion/transfeccion y/o co-transformacion/co- transfeccion de una unica celula o una pluralidad de celulas con cualquiera de las moleculas de acidos nucleicos, que sirven de vectores de transformacion/transfeccion (por ejemplo, como plasmidos, fagos, fagemidos o virus).

Por lo tanto, segun otro aspecto, se proporciona una construccion de acidos nucleicos que codifica una inmuno- molecula. La construccion segun este aspecto de la invencion comprende un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica un dominio de direccionamiento, ya sea un dominio de direccionamiento de anticuerpo o un dominio de direccionamiento de ligando. El primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen juntos de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y el dominio de direccionamiento se fusionen traduccionalmente, opcionalmente mediante un conector peptfdico intermedio.

Segun todavfa otro aspecto, se proporciona una construccion de acidos nucleicos que codifica una inmuno-

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molecula. La construccion segun este aspecto de la invencion comprende un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica una region variable de una de una cadena ligera o una cadena pesada de un dominio de direccionamiento de anticuerpo. El primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen juntos de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y la region variable de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionen traduccionalmente opcionalmente mediante un conector peptfdico intermedio. La construccion segun este aspecto de la invencion comprende ademas un tercer polinucleotido que codifica la otra de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo. El tercer polinucleotido puede seleccionarse para codificar un polipeptido separado, para permitir la generacion de un dsFV, o para codificar un polipeptido que se fusiona traduccionalmente con el segundo acido nucleico, para permitir la generacion de un scFV.

Segun un aspecto adicional, se proporciona un sistema de construccion de acidos nucleicos. El sistema de construccion comprende una primera construccion de acidos nucleicos que comprende un primer polinucleotido que codifica un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble; y un segundo polinucleotido que codifica una region variable de una de una cadena ligera o una cadena pesada de un dominio de direccionamiento de anticuerpo. El primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan seleccionados y se unen juntos de forma que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble y la region variable de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo se fusionen traduccionalmente opcionalmente mediante un conector peptfdico intermedio. El sistema de construccion comprende ademas una segunda construccion de acidos nucleicos que comprende un tercer polinucleotido que codifica la otra de la una de la cadena ligera y cadena pesada del dominio de direccionamiento de anticuerpo. Estas construcciones pueden ser co-introducidas en la misma celula o en diferentes celulas. En el primer caso, las construcciones que constituyen el sistema de construccion pueden mezclarse juntas, mientras que en el segundo caso, las construcciones que constituyen el sistema de construccion se mantienen sin mezclar en receptores separados.

Cuando y donde se usen, el conector peptido esta seleccionado de una secuencia de aminoacidos que es inherentemente flexible, de forma que los polipeptidos conectados asf se pliegan independientemente y nativamente tras la expresion de los mismos, facilitando asf la formacion de un complejo de la clase I del MHC humano monocatenario (mc) funcional, que se dirige a scFv o ligando y/o complejo de la clase I del MHC humano-antfgeno restringido al MHC.

Cualquiera de las construcciones de acidos nucleicos descritas en el presente documento comprende al menos una secuencia reguladora que actua en cis operativamente unida a los polinucleotidos codificantes en ella. Preferentemente, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en bacterias. Alternativamente, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en levadura. Todavfa alternativamente, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en celulas de animales. Todavfa alternativamente, la secuencia reguladora que actua en cis es funcional en celulas vegetales.

La secuencia reguladora que actua en cis puede incluir una secuencia promotora y secuencias potenciadoras de la transcripcion o traduccion adicionales todas las cuales sirven para facilitar la expresion de los polinucleotidos cuando se introducen en una celula hospedadora. Ejemplos espedficos de promotores se describen en el presente documento mas adelante en el contexto de diversos sistemas de expresion eucariotas y procariotas y en la seccion de ejemplos que sigue.

Se apreciara que una unica secuencia reguladora que actua en cis puede utilizarse en una construccion de acidos nucleicos para dirigir la transcripcion de un unico transcrito que incluye uno o mas marcos de lectura abiertos. En el caso posterior, puede utilizarse un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para permitir la traduccion de la secuencia de acidos nucleicos internamente posicionada.

Segun otro aspecto de la presente invencion, se proporciona una celula transformada que comprende una cualquiera o mas de las construcciones de acidos nucleicos o el sistema de construccion de acidos nucleicos descrito en el presente documento. La celula, segun este aspecto de la invencion, puede ser una celula eucariota seleccionada del grupo que consiste en una celula de mairnfero, una celula de insecto, una celula de planta, una celula de levadura y una celula de protozoo, o puede ser una celula bacteriana.

Siempre que la co-expresion de polipeptidos independientes en una unica celula sea preferida, la construccion o construcciones empleadas deben configurarse de forma que los niveles de expresion de los polipeptidos independientes se optimicen, para obtener proporciones mas altas del producto final.

Preferentemente, un promotor (que es un ejemplo de una secuencia reguladora que actua en cis) utilizado por la(s) construccion (construcciones) de acidos nucleicos de la presente invencion es un promotor constitutivo fuerte tal que se obtienen altos niveles de expresion para los polinucleotidos tras la transformacion en celulas hospedadoras.

Se apreciara que tambien pueden efectuarse altos niveles de expresion transformando la celula hospedadora con un alto numero de copias de la(s) construccion (construcciones) de acidos nucleicos, o utilizando secuencias que

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actuan en cis que estabilizan el transcrito resultante y como tal disminuyen la degradacion o "renovacion" de un transcrito tal.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celula transformada" describe una celula en la que una secuencia de acidos nucleicos exogena se introduce para asf alterar geneticamente establemente o transitoriamente la celula hospedadora. Puede producirse en condiciones naturales o artificiales usando diversos metodos muy conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se describen en detalle en el presente documento mas adelante en el contexto con ejemplos espedficos de celulas hospedadoras.

La celula hospedadora transformada puede ser una celula eucariota, tal como, por ejemplo, una celula de marnffero, una celula de insecto, una celula de planta, una celula de levadura y una celula de protozoo, o alternativamente, la celula puede ser una celula bacteriana.

Cuando se utiliza para la expresion de celulas hospedadoras eucariotas, la(s) construccion (construcciones) de acidos nucleicos segun la presente invencion pueden ser un vector lanzadera, que puede propagarse tanto en E. coli (en la que la construccion comprende un marcador de seleccion apropiado y origen de replicacion) como ser compatible para la expresion en celulas hospedadora eucariotas. La(s) construccion (construcciones) de acidos nucleicos segun la presente invencion pueden ser, por ejemplo, un plasmido, un bacmido, un fagemido, un cosmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.

Segun otra realizacion preferida de la presente invencion, la celula hospedadora es una celula de mairnfero de, por ejemplo, un cultivo de celulas de marnffero. Sistemas de expresion en mamffero adecuados incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que estan disponibles de Invitrogen, pCI que esta disponible de Promega, pBK-RSv y pBK-CMV que estan disponibles de Stratagene, pTRES que esta disponible de Clontech, y sus derivados.

Tambien puede utilizarse cultivos de celulas de insecto para expresar las secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion. Sistemas de expresion en insecto adecuados incluyen, pero no se limitan a, el sistema de expresion en baculovirus y sus derivados que estan comercialmente disponibles de numerosos proveedores tales como Invitrogen (maxBac™), Clontech (BacPak™) o Gibco (Bac-to-Bac™).

La expresion de las secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion tambien puede efectuarse en celulas de planta. Como se usa en el presente documento, la expresion "celula de planta" puede referirse a protoplastos de planta, celulas de un cultivo de tejido de planta, celulas de tejidos derivados de planta o celulas de plantas enteras.

Hay diversos metodos de introduccion de construcciones de acidos nucleicos en celulas vegetales. Tales metodos se basan en tanto la integracion estable de la construccion de acidos nucleicos o una porcion de la misma en el genoma de la celula de planta, como en la expresion transitoria de la construccion de acidos nucleicos, en cuyo caso estas secuencias no son establemente integradas en el genoma de la celula de planta.

Hay dos metodos principales para efectuar la integracion genomica estable de secuencias de acidos nucleicos exogenos tales como aquellos incluidos dentro de la construccion de acidos nucleicos de la presente invencion en genomas de celulas de planta:

(i) Transferencia genica mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

(ii) Captacion directa de ADN: Paszkowski et al., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif.

(1989) p. 52-68; incluyendo metodos para la captacion directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captacion de ADN inducida por choque electrico breve de celulas de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Inyeccion de AdN en celulas o tejidos de planta por bombardeo de partfculas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; por el uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant.

(1990) 79:213-217; o por la incubacion directa de ADN con polen en germinacion, DeWet et al. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; y Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmfdicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genomico de planta. Metodos de inoculacion del tejido de planta vanan dependiendo de la especie de planta y el sistema de administracion de Agrobacterium. Un enfoque ampliamente usado es el procedimiento de disco de hoja, vease, por ejemplo, Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Un enfoque complementario emplea el sistema de administracion de

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Agrobacterium en combinacion con infiltracion a vado. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creacion de plantas dicotiledoneas establemente transformadas.

Hay diversos metodos de transferencia directa de ADN en celulas vegetales. En la electroporacion, se exponen brevemente protoplastos a un campo electrico fuerte. En microinyeccion, el ADN es mecanicamente inyectado directamente en las celulas usando micropipetas muy pequenas. En el bombardeo de micropardculas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio, partfculas de tungsteno o partfculas de oro, y los microproyectiles son ffsicamente acelerados en celulas o tejidos de planta. Tambien puede utilizarse transferencia directa de ADN para transformartransitoriamente celulas de planta.

En cualquier caso, promotores de planta adecuados que pueden ser utilizados para la expresion en celulas de planta de la primera y segunda secuencias de acidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, promotor 35S de CaMV, promotor de ubiquitina, y otros promotores fuertes que pueden expresar las secuencias de acidos nucleicos en una forma constitutiva o espedfica de tejido.

Tambien puede usarse virus de planta como vectores de transformacion. Virus que se ha mostrado que son utiles para la transformacion de hospedadores de celulas de planta incluyen CaV, TMV y BV. La transformacion de plantas usando virus de planta se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.855.237 (BGV), documento EP-A 67.553 (TMV), solicitud publicada japonesa N.° 63-14693 (TMV), documentos EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partfculas de pseudovirus para su uso en expresar ADN foraneo en muchos hospedadores, que incluyen plantas, se describen en el documento WO 87/06261.

La construccion de virus de ARN de planta para la introduccion y expresion de secuencias de acidos nucleicos exogenas no virales en plantas se demuestra por las referencias anteriores, ademas de por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:12941297; y Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Cuando el virus es un virus de ADN, las construcciones pueden prepararse para el propio virus. Alternativamente, el virus puede clonarse primero en un plasmido bacteriano para facilitar la construccion del vector viral deseado con las secuencias de acidos nucleicos descritas anteriormente. El virus puede entonces escindirse del plasmido. Si el virus es un virus de ADN, un origen de replicacion bacteriano puede unirse al ADN viral, que entonces es replicado por las bacterias. La transcripcion y traduccion de este ADN hara que la protema de la cubierta encapside el ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, el virus se clona generalmente como un ADNc y se inserta en un plasmido. El plasmido se usa entonces para hacer todas las construcciones. El virus de ARN se produce entonces por transcripcion de la secuencia del plasmido viral y traduccion de los genes virales para hacer que la(s) protema(s) de la cubierta encapsiden el ARN viral.

La construccion de virus de ARN de planta para la introduccion y expresion en plantas de secuencias de acidos nucleicos exogenas no virales tales como aquellas incluidas en la construccion de la presente invencion se demuestra por las referencias anteriores, ademas de en la patente de EE.UU. N.° 5.316.931.

Tambien pueden utilizarse celulas de levadura como celulas hospedadoras por la presente invencion. Se conocen en la tecnica numerosos ejemplos de vectores de expresion en levadura adecuados para la expresion de las secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion en levadura y estan comercialmente disponibles. Tales vectores normalmente se introducen en una celula hospedadora de levadura mediante metodos qrnmicos o de transformacion por electroporacion muy conocidos en la tecnica. Sistemas comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, los sistemas de expresion pYES™ (Invitrogen) o YEX™ (Clontech).

Se apreciara que cuando se exprese en sistemas de expresion eucariotas tales como aquellos descritos anteriormente, la construccion de acidos nucleicos preferentemente incluye una secuencia codificante de peptido senal de forma que los polipeptidos producidos a partir de la primera y segunda secuencias de acidos nucleicos sean dirigidos mediante la senal de peptido unido en vfas de secrecion. Por ejemplo, en celulas hospedadoras de mairnfero, insecto y de levadura, los polipeptidos expresados pueden secretarse al medio de crecimiento, mientras que en sistemas de expresion en planta los polipeptidos pueden secretarse en el apoplasto, o dirigirse a un organulo subcelular.

Segun una realizacion actualmente mas preferida de la invencion, la celula hospedadora es una celula bacteriana, tal como, por ejemplo, E. coli. Un hospedador bacteriano puede transformarse con la secuencia de acidos nucleicos mediante metodos de transformacion muy conocidos en la tecnica, que incluyen, por ejemplo, transformacion qmmica (por ejemplo, CaCh) o electroporacion.

Se conocen en la tecnica numerosos ejemplos de sistemas de expresion bacterianos que pueden utilizarse para expresar las secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion. Sistemas de expresion bacterianos comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, el sistema de expresion pET™ (Novagen), sistema de expresion pSE™ (Invitrogen) o el sistema de expresion pGEX™ (Amersham).

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Como se describe ademas en la seccion de ejemplos que sigue, la expresion bacteriana es particularmente ventajosa, ya que los polipeptidos expresados forman cuerpos de inclusion sustancialmente puros facilmente susceptibles a la recuperacion y purificacion del polipeptido expresado.

As^ segun otro aspecto mas, se proporciona una preparacion de cuerpos de inclusion derivados de bacteria que estan compuestos por mas del 30 por ciento, preferentemente mas del 50 %, mas preferentemente mas del 75 %, lo mas preferentemente mas del 90 % en peso del polipeptido recombinante o una mezcla de polipeptidos de la presente invencion. El aislamiento de tales cuerpos de inclusion y la purificacion del (de los) polipeptido(s) de los mismos se describe en detalle en la seccion de ejemplos que sigue.

Como se demuestra en la seccion de ejemplos que sigue, la expresion bacteriana del (de los) polipeptido(s) puede proporcionar altas cantidades de inmuno-moleculas puras y funcionales.

Segun un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un metodo de produccion de una inmuno- molecula de la invencion. El metodo segun este aspecto de la presente invencion utiliza cualquiera de la(s) construccion (construcciones) de acidos nucleicos descritas para expresar, en bacterias, un (los) polipeptido(s) descritos en el presente documento.

Tras la expresion, el polipeptido(s) se afsla/n y purifican/n como se describe mas adelante.

Como se describe ademas en la seccion de ejemplos que sigue, el (los) polipeptido(s) expresado(s) forman cuerpos de inclusion sustancialmente puros que son facilmente aislados mediante tecnicas de fraccionamiento muy conocidas en la tecnica y purificados mediante, por ejemplo, etapas de desnaturalizacion-renaturalizacion.

Preferentemente, el (los) polipeptido(s) se renaturalizan y repliegan en presencia de un peptido restringido al MHC, que esta ya sea unido a, coexpresado con o mezclado con otros polipeptidos de la invencion y que es capaz de la union del polipeptido de la clase I del MHC monocatenario. Como se describe ademas en la seccion de ejemplos, esto permite generar un complejo de la clase I del MHC-peptido antigenico sustancialmente puro que puede purificarse ademas por cromatograffa de exclusion por tamano.

Se apreciara que el peptido restringido al MHC usado para el replegamiento puede ser co-expresado junto con (como un peptido independiente) o fusionarse con el polipeptido de la clase I del MHC humano soluble en las bacterias. En un caso tal, el polipeptido expresado y el peptido co-forman cuerpos de inclusion que pueden aislarse y utilizarse para la formacion de complejos de la clase I del MHC-peptido antigenico.

Segun un aspecto adicional, se proporciona un metodo de destruccion selectiva de una celula en un paciente, presentando la celula un antfgeno (por ejemplo, un receptor). El metodo segun este aspecto de la invencion comprende administrar al paciente una inmuno-molecula que comprende: un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble complejado con un peptido restringido al MHC; y un dominio de direccionamiento, ya sea anticuerpo o dominio de direccionamiento de ligando, que esta unido al dominio efector de la clase I del MHC humano soluble. El dominio de direccionamiento sirve para unir selectivamente al antfgeno; por lo que el dominio efector de la clase I del MHC humano soluble complejado con el peptido restringido al MHC inicia una respuesta inmunitaria mediada por CTL contra la celula, destruyendo asf selectivamente la celula in vivo. La celula que va a ser destruida puede ser una celula cancerosa, en cuyo caso, el dominio de direccionamiento se seleccionara para la union a un antfgeno asociado a tumor caracterizado por dicha celula cancerosa.

Las siguientes secciones proporcionan ejemplos espedficos y alternativas para cada uno de los diversos aspectos de la invencion descritos en el presente documento. Estos ejemplos y alternativas no deben ser considerados como limitantes de ningun modo, ya que la invencion puede ponerse en practica en formas similares, aunque algo diferentes. Estos ejemplos, sin embargo, ensenan a los expertos en la materia sobre como poner en practica las diversas alternativas y realizaciones de la invencion.

Anticuerpo:

El termino "anticuerpo" y la expresion "dominio de direccionamiento de anticuerpo", como se usa para describir la presente invencion, incluye moleculas intactas, ademas de fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, Fv y scFv que son capaces de union espedfica de alta afinidad a un antfgeno. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales se definen como sigue: (i) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de union al antfgeno monovalente de una molecula de anticuerpo, puede producirse por digestion del anticuerpo completo con la enzima papama para dar una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada; (ii) Fab', el fragmento de una molecula de anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido de reduccion, para dar una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molecula de anticuerpo; (iii) F(ab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reduccion posterior; F(ab')2 es un dfmero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos por dos enlaces disulfuro; (iv) Fv, definido como un fragmento geneticamente manipulado que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y (c) scFv o "anticuerpo

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monocatenario" ("SCA"), una molecula geneticamente manipulada que contiene la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada, unidas por un conector polipeptidico adecuado como una molecula monocatenaria geneticamente fusionada.

Metodos de preparacion de estos fragmentos son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporado en el presente documento por referencia).

Pueden prepararse fragmentos de anticuerpos segun la presente invencion por hidrolisis proteolftica del anticuerpo o por expresion en E. coli o celulas de mairnfero (por ejemplo, cultivo de celulas de ovario de hamster chino u otros sistemas de expresion en protema) de ADN que codifica el fragmento.

Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos por digestion con pepsina o con papama de anticuerpos completos por metodos convencionales. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpos por escision enzimatica de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S indicado F(ab')2. Este fragmento puede ser ademas escindido usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escision de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, una escision enzimatica usando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos metodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, patentes de EE.Uu. N.° 4.036.945 y 4.331.647, y referencias contenidas en su interior, cuyas patentes se incorporan por este documento por referencia en su totalidad. Vease tambien Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959. Tambien pueden usarse otros metodos de escision de anticuerpos, tales como separacion de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, escision de fragmentos adicional, u otras tecnicas enzimaticas, qmmicas o geneticas, mientras que los fragmentos se unan al antfgeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Fragmentos Fv comprenden una asociacion de cadenas Vh y Vl. Esta asociacion puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972. Alternativamente, las cadenas variables pueden unirse por un enlace disulfuro intermolecular o reticularse por productos qmmicos tales como glutaraldehndo. Preferentemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas Vh y Vl conectadas por un conector peptfdico. Estas protemas de union al antfgeno monocatenarias (sFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios Vh y Vl conectados por un oligonucleotido. El gen estructural se inserta en un vector de expresion, que posteriormente se introduce en una celula hospedadora tal como E. coli. Las celulas hospedadoras recombinantes sintetizan una cadena de polipeptido individual con un peptido conector que une dos dominios V. Metodos de produccion de sFv se describen, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77, 1993; y Ladner et al., patente de EE.UU. N.° 4.946.778, que se incorpora por este documento por referencia en su totalidad.

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un peptido que codifica una unica region determinante de la complementariedad (CDR). Pueden obtenerse peptidos de CDR ("unidades mmimas de reconocimiento") construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interes. Tales genes se preparan, por ejemplo, usando la reaccion en cadena de la polimerasa para sintetizar la region variable de celulas productoras de ARN de anticuerpo. Vease, por ejemplo, Larrick y Fry, Methods, 2: 106-10, 1991.

Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son moleculas quimericas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de union al antfgeno de anticuerpos) que contienen secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en el que los restos que forman una region determinante de la complementariedad (CDR) del receptor estan sustituidos por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, restos de Fv de la region estructural de la inmunoglobulina humana estan sustituidos por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo de receptor ni en las CDR importadas o secuencias de la region estructural. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo optimamente humanizado tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Metodos de humanizacion de anticuerpos no humanos son muy conocidos en la tecnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoacidos no humanos se denominan frecuentemente restos de importacion, que normalmente son tomados de un dominio variable de importacion. La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327

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(1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quimericos (patente de EE.UU. N.° 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR estan sustituidos por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.

Tambien pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica, que incluyen bibliotecas de presentacion en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las tecnicas de Cole et al. y Boerner et al. tambien estan disponibles para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, pueden prepararse humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogenos han sido parcialmente o completamente inactivados. Tras la exposicion, se observa produccion de anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a la observada en seres humanos en todos los respectos, que incluyen reordenacion de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones cientfficas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

Se apreciara que una vez se identifican las CDR de un anticuerpo usando tecnicas convencionales de ingeniena genetica, pueden usarse para concebir polinucleotidos expresables que codifican cualquiera de las formas o fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento.

Ligando

La tabla a continuacion proporciona ejemplos no exhaustivos de receptores selectivamente expresados mediante una variedad de celulas tumorales, sus ligandos e informacion de secuencia referente a los ligandos, informacion de secuencia que puede usarse en la construccion de construcciones e inmuno-moleculas segun la presente invencion:

Receptor

Tumor (Ref) Ligando N.° de acceso de Genebank (secuencia de acidos nucleicos) N.° de acceso de Genebank (secuencia de aminoacidos)

EGFR

Mama, cerebro, pulmon (Niv et al Curr. Pharm. Biotech. 2:19-46, 2002) EGF L17029 AAB32226

PDGFR

Ovario, mama PDGF XO6374 CAA29677

EGFR mutante

Hfgado, cerebro EGF S51343 AAB19486

IL-4R

Renal IL-4 M13982 AAA59149

IL-6R

Mieloma IL-6 M14584 AAA59149

IL-10R

Leucemias IL-10 M57627 AAA63207

EGFR

Mama, ovario, TGFa M31172 AAA61157

VEGFR

Carcinomas de vasos sangumeos VEGF M32977 AAA35789

KDR

Carcinomas de vasos sangumeos VEGF M32977 AAA35789

Una clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano:

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un complejo de antfgenos codificado por un grupo de loci unidos, que se llaman conjuntamente H-2 en el raton y HLA en seres humanos. Las dos clases principales de los antfgenos de MHC, clase I y clase II, comprenden cada una un conjunto de glucoprotemas de la superficie celular que desempenan una funcion en determinar el tipo de tejido y la compatibilidad del trasplante. En reacciones de trasplante, los linfocitos T citotoxicos (CTL) responden principalmente contra glucoprotemas de clase I extranas, mientras que los linfocitos T cooperadores responden principalmente contra glucoprotemas de clase II extranas.

Las moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I se expresan sobre la superficie de casi todas las celulas. Estas moleculas funcionan en la presentacion de peptidos que derivan principalmente de protemas endogenamente sintetizadas para linfocitos T CD8+ mediante una interaccion con el receptor ap de linfocitos T. La molecula de la clase I del MHC es un heterodfmero compuesto de una cadena pesada de 46 kDa que esta no covalentemente asociada a la p-2-microglobulina de 12 kDa de cadena ligera. En seres humanos, hay varios haplotipos de MHC, tales como, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8, sus secuencias pueden encontrarse en la base de datos de Kabbat, en
http://immuno.bme.nwu.edu/, que se incorpora en el presente documento por referencia.

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Peptidos que se unen a moleculas de la clase I del MHC; antigenos restringidos al MHC:

Peptidos restringidos a la clase I del MHC (tambien denominados en el presente documento indistintamente antigenos restringidos al MHC, peptidos restringidos al HLA, antigenos restringidos al HLA) que normalmente tienen 8-10 aminoacidos de longitud, se unen a la ranura de a1-a2 de la cadena pesada mediante dos o tres restos de anclaje que interaccionan con bolsillos de union correspondientes en la molecula de MHC. La cadena de p-2- microglobulina desempena una funcion importante en el transporte intracelular de la clase I del MHC, union a peptido y estabilidad conformacional. Para la mayona de las moleculas de clase I, se requiere la formacion de un heterodfmero que consiste en la cadena pesada de la clase I del MHC, peptido (auto o antigenico) y p-2- microglobulina para la maduracion biosintetica y expresion en la superficie celular.

Estudios de investigacion realizados sobre la union de peptido a moleculas de la clase I del MHC permiten definir motivos de MHC espedficos funcionales en la presentacion de peptidos derivados de antigenos virales, tumorales y auto-antigenos que son posiblemente inmunogenicos y podnan provocar la respuesta espedfica de linfocitos T citotoxicos (CTL).

Como se usa en el presente documento, el termino "peptido" se refiere a peptidos nativos (tanto productos de degradacion como peptidos sinteticamente sintetizados) y ademas a peptidomimeticos, tales como peptoides y semipeptoides que son analogos de peptido, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que convierten los peptidos en mas estables mientras estan en un cuerpo, o mas inmunogenicos. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, ciclacion, modificacion del extremo N, modificacion del extremo C, modificacion del enlace peptidico, que incluyen, pero no se limitan a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificacion de esqueletos y modificacion de restos. Metodos de preparacion de compuestos peptidomimetico son muy conocidos en la tecnica y se especifican en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capftulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora por referencia como si se expusiera completamente en el presente documento. Detalle adicional a este respecto se proporciona en el presente documento.

Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la seccion de reivindicaciones mas adelante, se entiende que el termino "aminoacido" incluye los 20 aminoacidos que existen de forma natural; aquellos aminoacidos frecuentemente modificados post-traduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoacidos poco usuales que incluyen, pero no se limitan a, acido 2- aminoadfpico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Ademas, el termino "aminoacido" incluye tanto D- como L-aminoacidos. Elaboracion adicional de los posibles aminoacidos utiles segun la presente invencion y ejemplos de aminoacidos no naturales utiles en antigenos de peptido reconocibles de HLA-A2 de MHC-I se dan en el presente documento.

Basandose en datos experimentales acumulados, hoy en dfa es posible predecir cuales de los peptidos de una protema se uniran a MHC, clase I. La clase I del MHC de HLA-A2 ha sido hasta la fecha mejor caracterizada que otros haplotipos de HLA, aunque datos predictivos y/o esporadicos estan disponibles para todos los otros haplotipos.

Con respecto a los peptidos de union a HLA-A2, suponer las siguientes posiciones (P1-P9) en un peptido 9-mero:

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Las posiciones P2 y P2 incluyen los restos de anclaje que son los principales restos que participan en la union a moleculas de MHC. Las posiciones de interaccion de los restos de aminoacido P2 y P9 son aminoacido natural no cargado alifatico hidrofilo (siendo ejemplos Ala, Val, Leu, Ile, Gln, Thr, Ser, Cys, preferentemente Val y Leu) o de un aminoacido no cargado alifatico hidrofilo no natural (siendo ejemplos norleucina (Nle), norvalina (Nva), acido a- aminobutirico). Las posiciones P1 y P3 tambien son conocidas por incluir restos de aminoacidos que participan o ayudan en la union a moleculas de MHC, sin embargo, estas posiciones pueden incluir cualquier aminoacido, natural o no natural. Las otras posiciones son interaccionadas por restos de aminoacidos que normalmente no participan en la union, mas bien estos aminoacidos se presentan a las celulas inmunitarias. Mas detalles referentes a la union de peptidos a moleculas de MHC pueden encontrarse en Parker, K.C., Bednarek, M.A., Coligan, J.E., Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J Immunol.152,163-175, 1994, vease la Tabla V, en particular. Por lo tanto, la puntuacion de los peptidos de union a HLA-A2.1 puede realizarse usando el software HLA Peptide Binding Predictions accesible mediante una interfaz de web mundial en
http://www.bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html. Este software se basa en datos acumulados y puntuaciones de cada peptido posible en una protema analizada para la posible union a HLA-A2.1 de MHC segun la contribucion de cada aminoacido en el peptido. Puntuaciones de union teoricas representan la semivida calculada del complejo de HLA-A2.1-peptido.

Los aminoacidos naturales alifaticos hidrofilos en P2 y P9 pueden estar sustituidos por aminoacidos sinteticos, preferentemente Nleu, Nval y/o acido a-aminobutirico. P9 tambien puede estar sustituido por aminoacidos alifaticos

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de formula general -HN(CH2)nCOOH, en la que n = 3-5, ademas de por derivados ramificados de los mismos, tales como, pero no se limitan a,

-NH(CH2)n-COOH

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en la que R es, por ejemplo, metilo, etilo o propilo, localizado en uno cualquiera o mas de los n carbonos.

El resto del extremo amino (posicion P1) puede estar sustituido por acidos carboxflicos alifaticos positivamente cargados, tales como, pero no se limitan a, H2N(CH2)nCOOH, en la que n = 2-4 y H2N-C(NH)-NH(CH2)nCOOH, en la que n = 2-3, ademas de por hidroxilisina, N-metil-lisina u ornitina (Orn). Ademas, el resto del extremo amino puede estar sustituido por restos aromaticos ampliados, tales como, pero no se limitan a, H2N-(C6H6)-CH2-COOh, p- aminofenilalanina, H2N-F(NH)-NH-(C6H6)-CH2-COOH, p-guanidinofenilalanina o piridinoalanina (Pal). Estos ultimos restos pueden formar enlace de hidrogeno con los restos OH- de los restos de tirosina en el bolsillo de union del extremo N de MHC-1, ademas de crear, interacciones aromatico-aromatico simultaneas.

La derivatizacion de restos de aminoacidos en las posiciones P4-P8, deben estos restos tener una cadena lateral, tal como OH, SH o NH2, como Ser, Tyr, Lys, Cys u Orn, puede ser por alquilo, arilo, alcanoflo o aroflo. Ademas, grupos OH en estas posiciones tambien pueden ser derivatizados por fosforilacion y/o glucosilacion. Se ha mostrado que estas derivatizaciones potencian en algunos casos la union al receptor de linfocitos T.

Derivados mas largos en los que el segundo aminoacido del anclaje esta en la posicion P10 pueden incluir en P9 la mayona de los aminoacidos L. En algunos casos tambien son aplicables derivados mas cortos, en los que el acido del extremo C sirve del segundo resto de anclaje.

Derivados de aminoacido dclico pueden interaccionar en la posicion P4-P8, preferentemente posiciones P6 y P7. Puede obtenerse ciclacion mediante formacion de enlaces amida, por ejemplo, incorporando Glu, Asp, Lys, Orn, acido di-aminobutmco (Dab), acido di-aminopropionico (Dap) en diversas posiciones en la cadena (enlaces -CO-NH o -NH-CO). Tambien puede obtenerse ciclacion esqueleto a esqueleto mediante la incorporacion de aminoacidos modificados de formulas H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH o H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2, en las que n = 1-4, y adicionalmente en las que R es cualquier cadena lateral natural o no natural de un aminoacido.

Tambien es posible la ciclacion mediante la formacion de enlaces S-S mediante la incorporacion de dos restos Cys. Puede obtenerse ciclacion de cadena lateral a cadena lateral adicional mediante la formacion de un enlace de interaccion de formula -(-CH2-VS-CH2-C-, en la que n = 1 o 2, que es posible, por ejemplo, mediante la incorporacion de Cys u homoCys y reaccion de su grupo SH libre con, por ejemplo, Lys bromoacetilada, Orn, Dab o Dap.

Enlaces peptfdicos (-CO-NH-) dentro del peptido pueden estar sustituidos por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces ester (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces a-aza (-NH-N(R)-cO-), en las que R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefmicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados de peptido (-N(R)-CH2-CO-), en las que R es la cadena lateral "normal", naturalmente presentada sobre el atomo de carbono.

Estas modificaciones pueden producirse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena de peptido e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo. Preferentemente, pero no en todos los casos necesarios, estas modificaciones deben excluir aminoacidos de anclaje.

Los aminoacidos aromaticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden estar sustituidos por acido no natural sintetico tal como TIC, naftilalanina (Nol), derivados de metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil- Tyr.

Antigenos restringidos al MHC de tumor:

Las referencias citadas en la siguiente tabla proporcionan ejemplos de peptidos restringidos al MHC de tumor de la clase I del MHC humano derivados de antfgenos asociados a tumor (TaA) o marcadores de protema asociados a diversos canceres. Peptidos restringidos al MHC de tumor adicionales derivados de antfgenos asociados a tumor (TAA) pueden encontrarse en
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/_____________________________________

Cancer

TAA/Marcador HLA Referencia

Carcinoma de celulas transitorias

Uroplakina II HLA-A2 WO 00/06723

Carcinoma de celulas transitorias

Uroplakina la HLA-A2 WO 00/06723

Carcinoma de la prostata

Antfgeno espedfico de la prostata HLA-A2 WO 00/06723

Carcinoma de la prostata

Antfgeno de membrana espedfico de prostata HLA-A2 WO 00/06723

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Cancer

TAA/Marcador HLA Referencia

Carcinoma de la prostata

Fosfatasa acida de prostata HLA-A2 WO 00/06723

Cancer de mama

BA-46 HLA-A2 WO 00/06723

Cancer de mama

Muc-1 HLA-A2 WO 00/06723

Melanoma

Gp100 HLA-A2 Referencia 54

Melanoma

MARTI HLA-A2 Referencia 54

Todos los tumores

Telomerasa HLA-A2 Referencia 54

Leucemia

TAX HLA-A2 Referencia 54

Carcinomas

NY-ESO HLA-A2 Referencia 54

Melanoma

MAGE-A1 HLA-A2 Referencia 54

Melanoma

MAGE-A3 HLA-A24 Referencia 54

Carcinomas

HER2 HLA-A2 Referencia 54

Melanoma

Beta-catenina HLA-A24 Referencia 54

Melanoma

Tirosinasa HLA-DRB1 Referencia 54

Leucemia

Bcr-abl HLA-A2 Referencia 54

Cabeza y cuello

Caspasa 8 HLA-B35 Referencia 54

Antigenos restringidos al MHC virales:

Las referencias citadas en la siguiente tabla proporcionan ejemplos de peptidos restringidos al MHC virales de la clase I del MHC humano derivados de antigenos virales.

Enfermedad

Antigeno viral HLA Referencia

SIDA (HTLV-1)

HIV-1 RT 476-484 HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Gripe

G I L G F V F T L (SEQ ID NO:16) HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Enfermedad de CMV

CMV HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Linfoma de Burkitt

TAX HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Hepatitis C

HCV HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Hepatitis B

Protema pre-S de VHB 85-66 S T N R Q S G R Q (SEQ ID NO:17) HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Leucemia HTLV-1

HTLV-1 tax 11-19 HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Hepatitis

Antigeno de superficie del VHB 185-194 HLA-A2
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/

Antigenos restringidos al MHC autoinmunitarios:

El sitio web
http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/ proporciona ejemplos de peptidos restringidos al MHC autoinmunitarios de la clase I del MHC humano derivados de antigenos autoinmunitarios.

Moleculas de la clase I del MHC solubles:

Secuencias que codifican complejos de la clase I y clase II del MHC recombinantes que son solubles y que pueden producirse en grandes cantidades se describen en, por ejemplo, las referencias 23, 24 y 41-53 y ademas en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 09/534.966 y PCT/IL01/00260 (publicada como el documento WO 01/72768), todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Las moleculas de la clase I del MHC solubles estan disponibles o pueden producirse por cualquiera de los haplotipos de MHC, tales como, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8, siguiendo, por ejemplo, las ensenanzas del documento PCT/IL01/00260, ya que sus secuencias son conocidas y pueden encontrarse en la base de datos de kabbat, en
http://immuno.bme.nwa.edu/, el contenido del sitio se incorpora en el presente documento por referencia. Tales moleculas de la clase I del MHC solubles pueden cargarse con antigenos restringidos al MHC adecuados y usarse para la vacunacion de mairnfero no humano que tiene celulas que expresan la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano como se detalla ademas en el presente documento mas adelante.

Conjugados quimicos:

Se conocen en la tecnica muchos metodos para conjugar o fusionar (acoplar) moleculas de diferentes tipos, que incluyen peptidos o polipeptidos. Estos metodos pueden usarse segun la presente invencion para acoplar un dominio efector de la clase I del MHC humano soluble con un dominio de direccionamiento de anticuerpo y opcionalmente con un antigeno restringido al MHC.

Pueden conjugarse o fusionarse dos peptidos aislados usando cualquier metodo de conjugacion conocido para un experto en la materia. Un peptido puede conjugarse con otro usando un ester de N-hidroxisuccinimida de acido 3-(2- piridilditio)propionico (tambien llamado 3-(2piridilditio)propionato de N-succinimidilo) ("SDPD") (Sigma, Cat. N.° P3415), un procedimiento de conjugacion de glutaraldehfdo o un procedimiento de conjugacion de carbodiimida.

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Conjugacion de SPDP:

Puede usarse cualquier metodo de conjugacion de SPDP conocido para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, en una realizacion ilustrativa, se usa una modificacion del metodo de Cumber et al. (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224) como se describe mas adelante.

Se mezcla un peptido (1,7 mg/ml) con un exceso de 10 veces de SPDP (50 mM en etanol) y el anticuerpo se mezcla con un exceso de 25 veces de SPDP en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,10 M a pH 7,2 y cada una de las reacciones se incubaron, por ejemplo, durante 3 horas a temperatura ambiente. Las reacciones se dializan entonces contra PBS.

El peptido se reduce, por ejemplo, con DTT 50 mM durante 1 hora a temperatura ambiente. El peptido reducido se desala por equilibracion en columna G-25 (hasta 5 % de muestra/volumen de columna) con KH2PO4 50 mM a pH 6,5. El peptido reducido se combina con el anticuerpo SPDP en una relacion molar de 1:10 de anticuerpo:peptido y se incuba a 4 °C durante la noche para formar un conjugado de peptido-anticuerpo.

Conjugacion de glutaraldeh^do:

La conjugacion de un peptido con otro peptido puede llevarse a cabo por metodos conocidos para aquellos expertos en la materia usando glutaraldehndo. Por ejemplo, en una realizacion ilustrativa, se usa el metodo de conjugacion por G.T. Hermanson (1996, "Antibody Modification and Conjugation, en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego) descrito mas adelante.

Los peptidos (1,1 mg/ml) se mezclan a un exceso de 10 veces con 0,05 % de glutaraldehndo en fosfato 0,1 M, NaCl 0,15 M a pH 6,8, y se deja que reaccionen durante 2 horas a temperatura ambiente. Puede anadirse lisina 0,01 M para bloquear el exceso de sitios. Despues de la reaccion, el exceso de glutaraldehndo se elimina usando una columna G-25 equilibrada con PBS (10 % v/v de muestra/volumenes de columna)

Conjugacion de carbodiimida:

La conjugacion de un peptido con otro peptido puede llevarse a cabo por metodos conocidos para aquellos expertos en la materia usando un agente deshidratante tal como una carbodiimida. Lo mas preferentemente, la carbodiimida se usa en presencia de 4-dimetilaminopiridina. Como es muy conocido para aquellos expertos en la materia, puede usarse la conjugacion de carbodiimida para formar un enlace covalente entre un grupo carboxilo de peptido y un grupo hidroxilo de un peptido (produciendo la formacion de un ester enlace), o un grupo amino de un peptido (produciendo la formacion de un enlace amida) o un grupo sulfhidrilo de un peptido (produciendo la formacion de un enlace tioester).

Asimismo, puede usarse el acoplamiento de carbodiimida para formar enlaces covalentes analogos entre un grupo de carbono de un peptido y un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del otro peptido. Vease, generalmente, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, pp. 349-50 & 372-74 (3d ed.), 1985. Por medio de ilustracion, y no limitacion, el peptido se conjuga con otro mediante un enlace covalente usando una carbodiimida, tal como diciclohexilcarbodiimida. Veanse generalmente los metodos de conjugacion por B. Neises et al. (1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522; A. Hassner et al. (1978, Tetrahedron Lett. 4475); E.P. Boden et al. (1986, J. Org. Chem. 50:2394) y L.J. Matias (1979, Synthesis 561).

Objetos adicionales, ventajas y caractensticas novedosas de la presente invencion seran evidentes para un experto habitual en la materia tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Ademas, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion como se delinean anteriormente en este documento y como se reivindican en la seccion de reivindicaciones a continuacion encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invencion de una forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y de ADN recombinante. Tales tecnicas son minuciosamente explicadas en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologfas como se exponen en las patentes de EE.UU. N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory

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Handbook", Volumenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edicion; "Current Protocols in Immunology" Volumenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliograffa de patentes y cientifica, veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en el presente documento. Otras referencias generales se proporcionan durante todo este documento. Se cree que los procedimientos en el presente documento son muy conocidos en la tecnica y se proporcionan para conveniencia del lector.

Materiales y metodos experimentales

Peptidos: Se sintetizaron peptidos por qmmica de fluorenilmetoxicarbonilo estandar y se purificaron > 95 % por HPLC de fase inversa. Los peptidos restringidos al HLA-A2 asociados a tumor usados son: G9-209-2M (IMDQVPFSV, SEQ ID NO:8) y G9-280-9V (ILEPGPVTV, SEQ ID NO:9), ambos derivados del antfgeno de diferenciacion de melanoma gp100 y son epitopes inmunodominantes comunes (32-34). Estos peptidos se modifican en las posiciones de anclaje de mHc 2 (en G9-209-2M) y 9 (en G9-280-9V) para mejorar la afinidad de union al HLA-A2 (27). Se uso el peptido derivado de HTLV-1 (LLFGYPVYV, SEQ ID NO:10) como control.

Lmeas celulares: Se mantuvieron celulas A431, ATAC4 (carcinoma epidermoide), HUT102W y CRII-2 (leucemia, ATL) en RPMI + 10 % de FCS. Las celulas ATAC4 son celulas de carcinoma epidermoide A431 humano transfectadas establemente con la subunidad a del receptor de IL-2 (p55, Tac, CD25) (53). Las celulas transfectadas se mantuvieron en medio de crecimiento que contema 500 pg/ml de G418 (Gibco-BRL).

Construcciones de plasmido: Se construyo la molecula MHCmc como se describe previamente uniendo p- microglobulina humana con los tres dominios extracelulares del gen de HLA-A2 (24, 25, documento WO 01/72768). Los genes del dominio variable VL(cys) y VH(cys) del MAb anti-Tac se construyeron previamente para formar la molecula dsFv anti-Tac en la que los dos dominios variables se mantienen juntos y se estabilizan por un enlace disulfuro intercatenario manipulado en restos conservados de la region estructural (29, 30). Para construir la molecula MHCmc-aTacVL, el extremo C de la molecula MHCmc se conecto al extremo N de VL anti-Tac usando un conector flexible de 15 restos de largo (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO:3). Se usaron ADNc amplificados por PCR de ambas moleculas en una reaccion de extension por solapamiento de PCR de dos etapas en la que el extremo 3' de MHCmc se conecto al extremo 5' del gen VL. En la primera etapa, se introdujeron dos tercios de la secuencia conectora y sitios de clonacion en cualquier gen usando los oligonucleotidos: MHCmc-5: 5'GGAAGCGTTGGCGCATATGATCC AGCGTACTCC-3' (SEQ ID NO:11) y MHCmc-3: 5'-

TCCTGAACCTCCGCCACCGGACCCTCCTCCGCCCTCCCATCTCAGGG T-3' (SEQ ID NO:12), que introducen un sitio de restriccion Ndel en el extremo 5' del gen de MHCmc y dos tercios del conector en el extremo 3'. El gen VL anti-Tac se amplifico por PCR con los oligonucleotidos: VL-Tac-5: 5'-

TCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGCAAATTGTTCTCACC-3' (SEQ ID NO:13) y VL-Tac-3: 5'- GCAGTAAGGAA TTCATTAGAGCTCCAGCTTGGT-3' (SEQ ID NO:14) para introducir dos tercios del conector en el extremo 5' del gen VL y un sitio de clonacion EcoRI en el extremo 3'. En una segunda etapa de ensamblaje, los dos productos de PCR se combinaron en una relacion 1:1 (50 ng cada uno) para formar una reaccion de extension por solapamiento de PCR usando los cebadores MHCmc-5 y VL-Tac-3 para el ensamblaje de la construccion MHCmc- aTacVL. El producto de PCR se subclono posteriormente en el vector de expresion basado en pET pULI7 (49) usando los sitios de restriccion Ndel y EcoRI. Se subclono el gen VH anti-Tac para preparar el fragmento dsFv anti- Tac en pULI7 como se describe previamente (29).

Expresion, replegamiento y purificacion de complejos de B2M-aTac(dsFv)-peptido: Los componentes de B2M- aTac(dsFv); MHCmc-aTacVL y aTacVH, se expresaron en celulas BL21 (ADE3) separadas (Novagen, Madison, WI). Tras la induccion con IPTG, se acumularon grandes cantidades de protema recombinante insoluble en cuerpos de inclusion intracelulares. Se aislaron y purificaron cuerpos de inclusion de cada componente a partir de las celulas BL21 inducidas como se ha descrito previamente (29, 49). Brevemente, se realizo la rotura de celulas con 0,2 mg/ml de lisozima, seguido de la adicion de 2,5 % de TRITON X-100 y NaCl 0,5 M. Se recogieron sedimentos de cuerpos de inclusion por centrifugacion (13.000 rpm, 60 minutos a 4 °C) y se lavaron 3 veces con tampon Tris 50 mM, pH 7,4, que contema EDTA 20 mM. Se determino la expresion de cada componente de protema recombinante en cuerpos de inclusion aislados y purificados analizando una muestra en SDS-PAGE como se muestra en la Figura 2B. Los cuerpos de inclusion aislados y purificados se solubilizaron en HCl de guanidina 6 M, pH 7,4, seguido de reduccion con DTE 65 mM. Cuerpos de inclusion solubilizados y reducidos de MHCmc-aTacVL y aTacVH, mezclados en una relacion molar 1:2, se replegaron por una dilucion 1:100 en un sistema de tampon redox-barajado que contema Tris

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0,1 M, arginina 0,5 M, glutation oxidado 0,09 mM, pH 10,0, en presencia de un exceso molar de 5-10 de los peptidos restringidos al HLA-A2. La concentracion de protema final en el replegamiento fue 50 pg/ml. Despues del replegamiento, la protema se dializo contra urea 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,4, seguido de purificacion de complejos de MHCmc-aTac(dsFv)-peptido solubles por cromatograffa de intercambio ionico sobre columna de Q Sepharose (7,5 mm de diametro interno x 60 cm de longitud, Pharmacia) aplicando una gradiente de sal (NaCl) (0-0,4 M). Las fracciones pico que conteman MHCmc-aTac(dsFv) se sometieron entonces a cromatograffa de exclusion por tamano (TSK3000) para mas purificacion e intercambio de tampon a PBS.

ELISA: Se recubrieron inmunoplacas (Falcon) con 10 pg/ml de antfgeno p55 purificado (durante la noche a 4 °C). Las placas se bloquearon con PBS que contema 2 % de leche desnatada y entonces se incubaron con diversas concentraciones de B2M-aTac(dsFv)-peptido (90 minutos a temperatura ambiente). La union se detecto usando el anticuerpo dependiente de conformacion anti-HLA W6/32 (60 minutos, temperatura ambiente, 10 pg/ml). La reaccion se desarrollo usando anti-IgG de raton-peroxidasa. Se uso anticuerpo anti-Tac de conejo como control positivo, seguido de peroxidasa anti-conejo.

Citometna de flujo: Las celulas se incubaron con complejos de B2M-aTac(dsFv)-peptido (60 minutos a 4 °C en 300 pl, 25 pg/ml), se lavaron y se incubaron con el MAb anti-HLA-A2 BB7.2 (60 minutos a 4 °C, pg/ml). La deteccion fue con FITC anti-raton. Se uso anti-Tac humano (10 pg/ml) como control positivo para determinar la expresion del antfgeno p55, seguido de incubacion con anticuerpo marcado con FlTc anti-humano. Las celulas se lavaron posteriormente y se analizaron por citometro de flujo de Beckman FACScaliber.

Clones de CTL y estimulacion: Se proporcionaron clones de CTL espedficos para los peptidos derivados de gp100 de melanoma por los Drs. Steven Rosenberg y Mark Dudley, Rama de Cirugfa, Instituto Nacional del Cancer, NIH. Estos clones de CTL se generaron clonando a partir de cultivos a granel de CMSP de pacientes que recibieron inmunizaciones con peptido (26). Se expandieron clones de CTL por incubacion con celulas FM3D de melanoma irradiadas (como fuente de antfgeno) y las celulas JY transformadas por VEB (linfoblastos B como celulas presentadoras de antfgenos). La mezcla de estimulacion tambien contuvo el anticuerpo OKT3 (30 ng/ml) y 50 Ul/ml de IL-2 e IL-4.

Ensayos de citotoxicidad: Se cultivaron celulas diana en placa de 96 pocillos (2-5x103 celulas por pocillo) en RMPI+10 FCS. Las celulas se lavaron y se incubaron con metionina y medio sin suero durante 4 horas, seguido de incubacion (durante la noche) con 15 pCi/ml de 35S-metionina (nEn). Despues de 3 horas de incubacion con complejos de B2M-aTac(dsFv)-peptido (a 37 °C, 10-20 pg/ml), se anadieron celulas CTL efectoras a la relacion diana:efectoras como se indica y se incubaron durante 8-12 horas a 37 °C. Tras la incubacion, la liberacion de 35S- metionina de celulas diana se midio en una muestra de 50 pl del sobrenadante de cultivo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. El porcentaje de lisis espedfica se calculo del siguiente modo: [(liberacion experimental - liberacion espontanea)/( liberacion maxima - liberacion espontanea)] x100. La liberacion espontanea se midio como 35S-metionina liberada de celulas diana en ausencia de celulas efectoras, y la liberacion maxima se midio como 35S- metionina liberada de celulas diana lisadas por NaOH 0,1 M.

Resultados experimentales

Diseno de B2M-anti-Tac(dsFv): Recientemente, se genero una construccion que codifica un MHC monocatenario (MHCmc) soluble en el que el gen de p-2-microglobulina humana esta unido a los tres dominios extracelulares (a1, a2 y a3) del gen de cadena pesada de HLA-A2 (aa 1-275) mediante un conector flexible de 15 aminoacidos de longitud (24, 25 y documento WO 01/72768, que se incorpora en el presente documento por referencia). Estas moleculas de MHCmc se expresaron en E. coli como cuerpos de inclusion intracelulares y tras el replegamiento in vitro en presencia de peptidos asociados a tumor restringido al HLA-A2 o virales forman complejos de MHCmc- peptido correctamente plegados y funcionales y tetrameros (24, 25, documento WO 01/72768). Estos complejos MHCmc-peptido han sido caracterizados en detalle para sus caractensticas bioqmmicas y bioffsicas, ademas de para su actividad biologica y se encuentra que son funcionales (24, 25, documento WO 01/72768). Y, lo que es mas importante, fueron capaces de unirse a y tenir lmeas de CTL espedficos de tumor y clones. En las Figuras 1A-H se muestran la construccion y reactividad de estos complejos de MHCmc-peptido, en forma de tetrameros de MHCmc, con CTL espedficos para los epitopes del antfgeno de diferenciacion de melanoma gp100 G9-209M y G9-280V (26). Estos peptidos se modifican en las posiciones de anclaje del MHC 2 (en G9-209M) y 9 (en G9-280V) para mejorar la afinidad de union a HLA-A2 (27). Los clones de CTL cD8+ (Figuras 1A y 1D) R6C12 y R1E2 se tineron intensamente (80-95 %) y espedficamente con los tetrameros de MHCmc que contienen G9-209M y G9-280V, respectivamente (Figuras 1b y 1E). Como control de especificidad, CTL R6C12 espedficos de G9-209M y R1E2 espedficos de G9- 280V no se tineron por tetrameros de G9-280V y G9-209M scHLA-A2, respectivamente (Figuras 1C y 1F). Estos CTL tambien reaccionaron con una intensidad similar con los epitopes no modificados no mutados G9-209 y G9-280 (datos no mostrados).

Para generar la molecula de B2M-aTac(dsFv) que dirige la molecula de MHCmc a celulas mediante el uso de un fragmento Fv de anticuerpo, en el extremo C del gen de HLA-A2, se fusiono el dominio variable del gen de cadena ligera (VL) del anti-CD25 humanizado (tambien conocido como Tac, p55, subunidad a de IL-2R) con el anticuerpo monoclonal anti-Tac (28) (Figura 2A). El dominio variable de la cadena pesada (VH) esta codificado por otro plasmido para formar un fragmento de anticuerpo Fv estabilizado por disulfuro (dsFv) en el que los dominios VH y

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VL se mantienen juntos y estabilizados por un enlace disulfuro intercatenario manipulado entre restos estructuralmente conservados de la region estructural de Fv (Figuras 2A, 2E y 2F) (29,30). Las posiciones en las que los restos de cistema estan situados se identificaron por modelado molecular basado en ordenador; como estan situados en la region estructural de cada VH y VL, esta localizacion puede usarse como metodo general para estabilizar todos los Fv sin la necesidad de informacion estructural adicional. Muchos dsFv han sido construidos en los ultimos anos, que han sido caracterizados en detalle y encontrado que son extremadamente estables y con afinidad de union tan buena como otras formas de anticuerpos recombinantes y en muchos casos incluso mejoradas (30, 31).

Construccion, expresion y purificacion de B2M-anti-Tac(dsFv): Para generar la molecula B2M-aTac(dsFv), se construyeron dos plasmidos de expresion basados en el promotor T7 (vease tambien la seccion de Materiales y metodos experimentales anterior en este documento); la molecula de MHCmc fusionada con el dominio VL anti-Tac (B2M-aTacVL) esta codificada por un plasmido y el dominio VH anti-Tac esta codificado por el segundo. En ambos plasmidos, los dominios VL y Vh contienen una cistema que se manipulo en lugar de un resto conservado en la region estructural para formar un fragmento dsFv (30). El plasmido de expresion para B2M-aTacVL se genero por una reaccion de PCR de extension por solapamiento en la que los genes de HLA-A2 y VL se unieron por un conector flexible de 15 aminoacidos de longitud de [(gly4-ser)3, (SEQ ID NO:3)] que es identico al conector usado para conectar la p2-microglobulina y genes de HLA-A2 en la construccion de MHCmc (24, 25, documento WO 01/72768). La construccion del plasmido de expresion para el dominio VH anti-Tac se describio previamente (29). Los dos plasmidos se expresaron por separado en celulas BL21 de E. coli. Tras la induccion con IPTG, se acumularon grandes cantidades de protema recombinante en cuerpos de inclusion intracelulares. El analisis de SDS-PAGE de los cuerpos de inclusion aislados y purificados demostro que las protemas recombinantes con el tamano correcto constituyeron el 80-90 % de la protema de cuerpos de inclusion total (Figura 2B). Los cuerpos de inclusion de cada componente se aislaron por separado, solubilizaron, redujeron y replegaron en un tampon de renaturalizacion que contema aditivos de redox-barajado y de prevencion de la agregacion, en presencia de peptidos restringidos al HLA-A2 de los epitopes de linfocitos T del antfgeno de diferenciacion de melanoma gp100 G9-209M y G9-280V (32-34, 27). Se mezclaron los componentes solubilizados y reducidos, B2M-aTacVL y anti-TacVH en una relacion molar 1:2 en presencia de un exceso molar de 100 veces el peptido restringido al HLA-A2. Se encontro que los complejos de MHCmc-peptido y las protemas de fusion de Fv de anticuerpo previamente generadas usando este protocolo de replegamiento se plegaron correctamente y fueron funcionales (24, 25, 30). Se purificaron moleculas de B2M-aTac(dsFv)/peptido (complejos) de la solucion de replegamiento por cromatograffa de intercambio ionico usando columnas Q-Sepharose. Como se muestra en la Figura 2C, analisis de SDS-PAGE no reductora de fracciones pico eluidas de la columna MonoQ revelaron la presencia de moleculas de B2M-aTac(dsFv) monomericas con el peso molecular correcto de aproximadamente 67 kDa. Estas facciones contuvieron tambien moleculas de un solo dominio de B2M-aTacVL que no estuvieron emparejadas con VH. Estas moleculas de B2M de un solo dominio son diffciles de separar de las moleculas de B2M-dsFv debido a que, como tambien se mostro previamente con otras protemas de fusion de dsFv, el plegamiento de fusiones de VL es muy eficiente y el producto es bastante soluble. Sin embargo, la contaminacion con las moleculas de B2M de un solo dominio no interfirio con los posteriores analisis de la molecula de B2M-aTac(dsFv) soluble. Para confirmar la correcta formacion del fragmento dsFv, se realizo un analisis de SDS-PAGE reductor en el que la molecula de B2M-dsFv se separo en su componentes. Se muestra (Figura 2D) la forma molecular de B2M-aTac(dsFv) despues de la reduccion que contiene B2M-aTacVL y los dominios VH. En cualquier caso, pueden usarse otras tecnicas de separacion por tamano para purificar la molecula B2M-aTac(dsFv) a homogeneidad.

Se probo la capacidad de B2M-aTac(dsFv) para unirse a su antfgeno diana, la subunidad a del receptor de IL-2 (p55), primero por ELISA usando p55 purificado. Para monitorizar la union de B2M-aTac(dsFv) purificado a pocillos recubiertos de p55, se uso el anticuerpo monoclonal w6/32, que reconoce moleculas de HLA solo cuando se pliegan correctamente y contienen peptido. Como se muestra en la Figura 2E, B2M-aTac(dsFv) se une en un modo dependiente de la dosis a p55, que indica que los dos dominios funcionales de la molecula, el dominio efector de MHCmc y el dominio de direccionamiento del anticuerpo dsFv, estan correctamente plegados, indicado por la capacidad del resto dsFv de unirse al antfgeno diana y el reconocimiento de MHCmc por el anticuerpo anti-HLA espedfico de conformacion.

Union de B2M-aTac(dsFv) a celulas diana: Para probar la capacidad de la molecula B2M-aTac(dsFv) de recubrir y dirigirse a complejos de HLA-A2-peptido sobre celulas tumorales, se probo su union a celulas tumorales HLA-A2 negativo por citometna de flujo. Primero, se usaron celulas de carcinoma epidermoide humano A431, que se transfectaron establemente con el gen de p55 (celulas ATAC4) (35) y se probo la tincion de celulas parentales transfectadas frente a no transfectadas. La union de B2M-aTac(dsFv) a las celulas se monitorizo usando un anticuerpo secundario MAb anti-HLA-A2 BB7.2 y marcado con FITC. La expresion del antfgeno diana p55 se detecto por el anticuerpo monoclonal anti-Tac completo del que derivo el fragmento dsFv. Como se muestra en la Figura 3A, celulas A431 no expresan p55, sin embargo, las celulas ATAC4 transfectadas con p55 expresan altos niveles del antfgeno (Figura 3B). Ninguna lmea celular fue HLA-A2 positiva (Figura 3C y 3D). Cuando se prueba la union de B2M-aTac(dsFv) a estas celulas, las Figuras 3C y 3D muestran que celulas ATAC4 dieron una tincion anti-HLA-A2 positiva solo cuando se preincubaron con B2M-aTac(dsFv) (Figura 3D), pero las celulas A431 fueron negativas cuando se preincubaron con B2M-aTac(dsFv).

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A continuacion, se probo la union de B2M-aTac(dsFv) a celulas leucemicas que, como se muestra en la Figura 3E, expresan el antigeno p55 pero carecen de expresion de HLA-A2 (Figura 3F). Como se muestra en la Figura 2F, las celulas HUT102W leucemicas de ATL que expresan p55 dieron una tincion anti-HLA-A2 positiva cuando se preincubaron con B2M-aTac(dsFv). Se observaron resultados similares cuando celulas CRII-2 HLA-A2-negativas p55-positivas de leucemia (ATL) se preincubaron con la molecula B2M-aTac(dsFv) (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que B2M-aTac(dsFv) puede unirse a su antfgeno como se presenta en la forma nativa sobre la superficie de celulas. Y, lo que es mas importante, B2M-aTac(dsFv) podna usarse para recubrir celulas HLA-A2 negativas de un modo que fuera completamente dependiente de la especificidad del tumor que se dirige al fragmento de anticuerpo que las convierte en celulas HLA-A2 positivas.

Induccion de la susceptibilidad mediada por B2M-aTac(dsFv) a la lisis de CTL: Para probar la capacidad de B2M-aTac(dsFv) para potenciar la susceptibilidad de celulas HLA-A2 negativas a celulas diana radiomarcadas de destruccion mediada por CTL, primero se incubaron con B2M-aTac(dsFv) y luego se probaron en un ensayo de liberacion de 35S-metionina en presencia de CTL espedficos del peptido gp100 de melanoma restringido al HLA. Como se muestra en la Figura 4A, B2M-aTac(dsFv) indujo una eficiente lisis mediada por CTL de celulas ATAC4 HLA-A2 negativas p55-positivas mientras que la misma molecula B2M-aTac(dsFv) no tuvo ningun efecto y no indujo la lisis de celulas A431 que no expresan el antigeno. Celulas A431 y ATAC4 solas no presentaron ninguna lisis mediada por CTL (Figura 4A). La incubacion de celulas ATAC4 con MHCmc solo, no fusionado con el resto de direccionamiento de dsFv, o con el anticuerpo anti-Tac, no produjo ninguna potenciacion detectable de la lisis mediada por CTL (datos no mostrados). La capacidad de CTL espedficos de peptidos G9-209M para destruir celulas ATAC4 preincubadas con B2M-aTac(dsFv) (pero no celulas A431) fue tan buena como, y en muchos experimentos mejor que, la eficiencia de estos CTL para lisar celulas FM3D de melanoma que expresan altos niveles de HLA-A2 y el antfgeno de diferenciacion de melanoma gp100 (36) (Figura 4B). Para demostrar la especificidad de la destruccion por CTL mediada por B2M-aTac(dsFv) para el peptido antigenico restringido al HLA- A2 usado en el replegamiento de la molecula de B2M-aTac(dsFv), se usaron dos clones de CTL, espedficos para los epitopes de linfocitos T importantes de gp100 G9-209M y G9-280V. Como se muestra en la Figura 4C, se lisaron celulas ATAC4 HLA-A2-negativas p55-positivas por el clon de CTL espedfico del peptido G9-209M R6C12 solo cuando se preincubaron con B2M-aTac(dsFv) replegado con el peptido G9-209M, pero no con el epitope de G9- 280V derivado del mismo antfgeno de diferenciacion de melanoma ni con B2M-aTac(dsFv) replegado alrededor del epitope TAX de linfocitos T restringido al HLA-A2 de HTLV-1. Similarmente, se destruyeron celulas ATAC4 por el clon de CTL espedfico de G9-280V R1E2 solo cuando se preincubo con B2M-aTac(dsFv) replegado con el epitope de G9-280V, pero no con los peptidos G9-209M o TAX (Figura 4D). A continuacion, se probo la lisis de CTL mediada por B2M-aTac(dsFv) de p55 que expresan celulas leucemicas HLA-A2 negativas HUT102W y CRII-2. Como se muestra en la Figura 4E, HUT102W y CRII-2 no fueron susceptibles a la lisis por los clones de CTL restringidos al HLA-A2 R6C12 y R1E2, espedficos para los peptidos de gp100 G9-209M y G9-280V, respectivamente. Sin embargo, cuando estas celulas diana HLA-A2-negativas p55-positivas se preincubaron con la molecula de B2M- aTac(dsFv) se observo una potenciacion significativa para lisis mediada por CTL que fue espedfica para el peptido gploO presente en el complejo B2M-aTac(dsFv) (Figura 4E). Celulas HUT102W recubiertas con B2M-aTac(dsFv) fueron eficientemente destruidas por los clones de CTL R6C12 y R1E2 espedficos de peptidos G9-209M y G9- 280V, respectivamente, y celulas CRII-2 fueron lisadas por el clon de CTL R1E2. Celulas diana HLA-A2 positivas y negativas no de melanoma de control que no expresan p55 no presentaron ninguna susceptibilidad detectable a la lisis por los clones de CTL espedficos de melanoma tanto recubiertos como no recubiertos con la molecula B2M- aTac(dsFv) (datos no mostrados). Estos resultados demuestran claramente, in vitro, el concepto de que la construccion de B2M-aTac(dsFv) puede usarse eficientemente para el direccionamiento espedfico de antfgeno de tumor guiado por anticuerpo de complejos de MHC-peptido en celulas tumorales para convertirlos en susceptibles a la lisis por CTL relevantes y asf potenciar respuestas inmunitarias antitumorales.

Actividad in vivo de B2M-aTac(dsFv):

Para evaluar inicialmente la actividad in vivo de B2M-aTac(dsFv) en un modelo de tumor humano, se realizo un ensayo no mutado en el que se mezclaron celulas ATAC4 con CTL R6C12 espedficos para el peptido derivado de gp100 G9-209M en presencia o ausencia de la molecula B2M-aTac(dsFv). La mezcla se inyecto por via subcutanea a ratones sin pelo y se siguio la formacion de xenoinjertos humanos en los animales. Como se muestra en la Figura 5, celulas ATAC4 generaron xenoinjertos en ratones sin pelo 10-12 dfas despues de inyeccion subcutanea.

Una mezcla de ATAC4 y CTL R6C12 no presento ningun efecto significativo sobre el crecimiento tumoral. Sin embargo, cuando el receptor de IL-2 que expresa celulas ATAC4 se mezclo con B2M-aTac(dsFv) y CTL R6C12 se observo inhibicion completa del crecimiento tumoral que indica la eficiente destruccion mediada por CTL inducida por B2M-aTac(dsFv) de celulas diana ATAC4 in vivo. Resultados in vitro (Figuras 4A-E) confirmaron que la cantidad de B2M-aTac(dsFv) y la relacion de efectoras con respecto a diana usada para el ensayo in vivo produjo lisis maxima de celulas diana ATAC4 (95-100 % de destruccion). Celulas A431 negativas para el receptor de IL-2 parentales mezcladas con CTL R6C12 en presencia o ausencia de B2M-aTac(dsFv) generaron tumores eficientemente, por lo que no se observo efecto sobre el crecimiento tumoral (no mostrado).

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Referencias citadas

(Referencias adicionales se citan en el texto)

1. Gilboa, E. (1999) How tumors escape immune destruction and what we can do about it. Cancer Immunol Immunother. 48, 343-5

2. Seliger B, Maeurer MJ, Ferrone S (2000) Antigen-processing machinery breakdown and tumor growth. Immunol Today..21,455-64.

3. Garrido F5 Algaira I. (2001) MHC antigens and tumor escape from immune surveillance. Adv Cancer Res.;83:l 1758.

4. Ferrone S, Finerty JF5 Jaffee EM, Nabel GJ.(2000) How much longer will tumour cells fool the immune system? Immunol Today. 21,70-2.

5. Marineola FM, Jaffee EM, Hicklin DJ, Ferrone S. (2000) Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance. Adv Immunol. 74,181-273.

6. Rosenberg, S.A. (2001) Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411,380-4

7. Lee5P.P. et al. (1999) Characterization of circulating T cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients. Nat. Med. 5, 677-685.

8. Mocellin S, Wang E, Marineola FM. (2001) Cytokines and Immune Response in the Tumor Microenvironment. J Immunother. 24, 392- 407.

9. Offringa, R., van der Burg, S.H., Ossendorp, F. Toes, R.E., & Melief, C.J. Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against cancer. (2000)Cwrr Opin Immunol 12, 576-82.

10. Esche, C., Shurin, M.R., Lotze, M.T., (1999) The use of dendritic cells for cancer vaccination. Curr Opin Mol Ther 1,72-81

11. Wang E, Phan GQ, Marineola FM. (2001) T-cell-directed cancer vaccines: the melanoma model. Expert Opin Biol Ther.l, 277-90.

12. Boon, T., & van der Bruggen, P. (1996) Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. JExp Med 183,725-9.

13. Renkvist, N.,Castelli, C., Robbins, PF, & Parmiani, G. (2001) A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 50, 3-15

14. Ferrone S, Marineola FM. (1995) Loss of HLA class I antigens by melanoma cells: molecular mechanisms, functional significance and clinical relevance. Immunol Today. 16,487-94.

15. Hicklin DJ, Marineola FM, Ferrone S. (1999) HLA class I antigen downregulation in human cancers: T-cell immunotherapy revives an old storyMolMed Today 5, 178-86.

16. Mendez R, et al. (2001) Analysis of HLA class I expression in different metastases from two melanoma patients undergoing peptide immunotherapy.r/wwe Antigens. 57, 508-19.

17. Real LM, (2001) et al Multiple mechanisms of immune evasion can coexist in melanoma tumor cell lines derived from the same patient. Cancer Immunol Immunother. 49, 621-8.

18. Restifo NP, Marineola FM, Kawakami Y, Taubenberger J, Yannelli JR, Rosenberg SA. (1996) Loss of functional beta 2- microglobulin in metastatic melanomas from five patients receiving immunotherapy. JNatl Cancer Inst. 88, 100-8.

19. Seliger B, Maeurer MJ, Ferrone S. (1997) TAP off—tumors on. Immunol Today 18, 292-9.

20. Vitale M, et al (1998) HLA class I antigen and transporter associated with antigen processing (TAPI and TAP2) down-regulation in high-grade primary breast carcinoma lesions. Cancer Res. 58,737-42.

21. Johnsen A, France J, Sy MS, Harding CV. (1998) Down- regulation of the transporter for antigen presentation, proteasome subunits, and class I major histocompatibility complex in tumor cell lines. Cancer Res. 58,3660-7.

22. Hudson PJ, Souriau C. (2001) Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy .Expert Opin Biol Ther. 1,845-55.

23. Cheng JD, Rieger PT, von Mehren M, Adams GP, Weiner LM. (2000) Recent advances in immunotherapy and monoclonal antibody treatment of cancer. Semin Oncol Nurs. 16,2-12.

24. DenkbergsG., CohensCJ., SegalsD., Kirkin,A.F. & ReitersY. (2000) Recombinant human single-chain MHC- peptide complexes made from E. coli by in vitro refolding: functional single-chain MHC-peptide complexes and tetramers with tumor associated antigens. Eur. J Immunol. 30, 3522-3532.

25. Denkberg, G., Cohen, C.J., & Reiter, Y. (2001) Critical role for cd8 in binding of mhc tetramers to ter: cd8 antibodies block specific binding of human tumor- specific mhc-peptide tetramers to TCR. J Immunol 167,270-6

26. Dudley5M-E., Ngo,L.T., Westwood5J., Wunderlich,J.R. & Rosenberg5S.A. (2000) T-cell clones from melanoma patients immunized against an anchor- modified gplOO peptide display discordant effector phenotypes. Cancer J 6, 69-77

27. Parkhurst MR, et al (1996) Improved induction of melanoma- reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gplOO modified at HLA-A*0201-binding residues. JImmunol. 157,2539-48.

28. Uchiyama T, Broder S, Waldmann TA. . (1981) A monoclonal antibody (anti-Tac) reactive with activated and functionally mature human T cells.I. Production of anti-Tac monoclonal antibody and distribution of Tac (+) cells JImmunol 126,1393-7.

29. Reiter Y, Kreitman RJ5 Brinkmann U, Pastan I. (1994) Cytotoxic and antitumor activity of a recombinant immunotoxin composed of disulfide-stabilized anti-Tac Fv fragment and truncated Pseudomonas exotoxin. Int J Cancer. 58,142-9.

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20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

30. Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I. (1996) Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. NatBiotechnol 14,1239-45.

31. Reiter Y, Brinkmann U, Jung SH, Lee B, Kasprzyk PG, King CR, Pastan I. (1994) Improved binding and antitumor activity of a recombinant anti-erbB2 immunotoxin by disulfide stabilization of the Fv fragment. JBiol Chem. 269,18327-31.

32. Bakker,A.B. et al. (1994) Melanocyte lineage-specific antigen gplOO is recognized by melanoma- derived tumor- infiltrating lymphocytes. J Exp. Med. 179, 1005-1009.

33. Kawakami5Y. et al. (1995) Recognition of multiple epitopes in the human melanoma antigen gplOO by tumor- infiltrating T lymphocytes associated with in vivo tumor regression. JImmunol. 154, 3961-3968

34. Cox5AJL et al. (1994) Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines. Science 264, 716-719

35. Kreitman RJ5 Bailon P, Chaudhary VK5 FitzGerald DJ5 Pastan I. (1994) Recombinant immunotoxins containing anti-Tac(Fv) and derivatives of Pseudomonas exotoxin produce complete regression in mice of an interleukin-2 receptor-expressing human carcinoma .Blood 83,426-34.

36. KirkinsAJF. et al. (1995) Generation of human-melanoma- specific T lymphocyte clones defining novel cytolytic targets with panels of newly established melanoma cell lines. Cancer Immunol. Immunother. 41, 71-81

37. Pastan, I. (1997) Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta. 1333,Cl-6

38. Lode, H.N., Sc Reisfeld, R.A. (2000) Targeted cytokines for cancer immunotherapy. Immunol Res. 21,279-88

39. Withoff, S., Helfrich, W., de Leij, LF., Molema, G. (2001) Bispecific antibody therapy for the treatment of cancer. Curr Opin Mol Ther. 3, 53-62

40. Jain RK. (1999) Transport of molecules, particles, and cells in solid tmnoxsAnnu Rev BiomedEng. 1,241-63.

41. Robert B, Guillaume P, Luescher I, Romero P5 Mach JP. (2000) Antibody-conjugated MHC class I tetramers can target tumor cells for specific lysis by T Iymphocytes-L1Mr JImmunol. 30,3165-70.

42. Lanzavecchia, A., G. Lezzi, and A. Viola. (1999) From TCR engagement to T cell activation: a kinetic view of T cell behaviour. Cell 96,1-4

43. BromleysSK, et al (2001) The immunological synapse. Ann Rev. Immunol. 19, 375-396.

44. Wang, B., R. Maile, R. Greenwood, E. J. Collins, and J. A. Frelinger. (2000) Naive CD8+ T cells do not require costimulation for proliferation and differentiation into cytotoxic effector cells. J Immunol. 164,1216-1222.

45. Tussey L, Speller S, Gallimore A, Vessey R. (2000) Functionally distinct CD 8+ memory T cell subsets in persistent EBV infection are differentiated by migratory receptor expression.Eur J Immunol. 30,1823-9.

46. Lechner F, Cuero AL, Kantzanou M, Klenerman P. (2001) Studies of human antiviral CD 8+ lymphocytes using class I peptide tetramers .Rev Med Virol. 11,11-22.

47. Mottez, E., P. Langlade-Demoyen, H. Goumier, F. Martinon, J. Maryanski, P. Kourilsky, and J. P. Abastado. (1995) Cells expressing a major histocompatibilitycomplex class I molecule with a single covalently bound peptide are highly immunogenic. J. Exp. Med. 181,493-7

48. White, J., Crawford, F., Fremont, D., Marrack, P., and Kappler, J. (1999) Soluble class I MHC with ^-2 microglobulin covalently linked peptides: specific binding to a T-cell hybridoma. J. Immunol. 162,2671-8

49. Brinkmann U, Pai LH, FitzGerald Dj, Willingham M, Pastan I. (1991) B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice.Proc Natl Acad Sci U S A. 88,8616-20.

50. Kreitman RJ. Chimeric fusion proteins—Pseudomonas exotoxin- based (2001). Curr Opin InvestigDrugs., 2,1282-93.

51. Pastan 11, Kreitman RJ. (1998) Immunotoxins for targeted cancer therapy. Adv Drug Deliv Rev. 31,53-88.

52. Frankel AE, Kreitman RJ, Sausville EA. (2000) Targeted toxins. Clin Cancer Res. 6,326-34.

53. Kreitman RJ, Bailon P, Chaudhary VK, FitzGerald DJ, Pastan I. (1994) Recombinant immunotoxins containing anti-Tac(Fv) and derivatives of Pseudomonas exotoxin produce complete regression in mice of an interleukin-2 receptor-expressing human carcinoma. Blood 83,426-34.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Reiter, Yoram Avital, Lev

<120> METODOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA EL ENGANO INMUNITARIO, PARTICULARMENTE UTILES EN EL TRATAMIENTO DE CANCER

<130> 01/23769 <160> 17

<170> Patentln version 3.1

<210> 1 <211>1170 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

15

<223> Secuencia de acidos nucleicos de la construccion SCHLA-A2 <400> 1

atgatccagc

gtactccaaa gattcaggtt tactcacgtc atccagcaga gaatggaaag 60

tcaaatttcc

tgaattgcta tgtgtctggg tttcatccat ccgacattga agttgactta 120

ctgaagaatg

gagagagaat tgaaaaagtg gagcattcag acttgtcttt cagcaaggac 130

tggtctttct

atctcttgta ttatactgag ttcaccccca ctgaaaaaga tgagtatgcc 24 0

tgccgtgtga

accacgtgac tttgtcacag cccaagatag ttaagtggga tcgagacatg 300

ggtggcggtg

gaagcggcgg tggaggctct ggtggaggtg gcagcggctc tcactccatg 360

aggtatttct

tcacatccgt gtcccggccc ggccgcgggg agccccgctt catcgcagtg 420

ggctacgtgg

acgacacgca gttcgtgcgg ttcgacagcg acgccgcgag ccagaggatg 480

gagccgcggg

cgccgtggat agagcaggag ggtccggagt attgggacgg ggagacacgg 540

aaagtgaagg

cccactcaca gactcaccga gtggacctgg ggaccctgcg cggctactac 600

aaccagagcg

aggccggttc tcacaccgtc cagaggatgt atggctgcga cgtggggtcg 660

gactggcgct

tcctccgcgg gtaccaccag tacgcctacg acggcaagga ttacatcgcc 720

ctgaaagagg

acctgcgctc ttggaccgcg gcggacatgg cagctcagac caccaagcac 780

aagtgggagg

cggcccatgt ggcggagcag ttgagagcct acctggaggg cacgtgcgtg 840

gagtggctcc

gcagatacct ggagaacggg aaggagacgc tgcagcgcac ggacgccccc 900

aaaacgcaca

tgactcacca cgctgtctct gaccatgaag ccaccctgag gtgctgggcc 960

ctgagcttct

accctgcgga gatcacactg acctggcagc gggatgggga ggaccagacc 1020

caggacacgg gctgtggtgg

agctcgtgga tgccttctgg gaccaggcct acaggagcag gcaggggatg agatacacct gaaccttcca gccatgtgca gaagtgggcg gcatgagggt 1080 1140

ttgcccaagc

ccctcaccct gagatgggag 1170

<210>2 <211>389 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de productos de aminoacido de SCHLA-A2 <400> 2

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una molecula que comprende:

   (i) un peptido restringido al MHC humano capaz de provocar una respuesta de memoria cuando esta presente en la molecula, (ii) un primer conector peptfdico, (iii) una p-2-microglobulina humana, (iv) un segundo conector peptfdico, (v) una cadena de HLA-A2 de una molecula de la clase I del MHC humano, y (vi) un dominio de direccionamiento de anticuerpo espedfico de tumor,

   en la que los segmentos (v) y (vi) estan unidos entre sf directamente por un enlace peptidico o por un tercer conector peptfdico y en la que el extremo carboxilo de cada uno de los segmentos (i) a (v) esta unido al extremo amino de los segmentos (ii) a (vi), respectivamente.
2. 2. La molecula de la reivindicacion 1, en la que el dominio de direccionamiento de anticuerpo del segmento (vi) comprende un fragmento de anticuerpo funcional.
3. 3. La molecula de la reivindicacion 2, en la que el fragmento de anticuerpo funcional comprende una asociacion de una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera.
4. 4. La molecula de la reivindicacion 3, en la que la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera estan unidas entre sf por enlaces disulfuro intermoleculares.
5. 5. La molecula de la reivindicacion 3, en la que la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera estan unidas entre sf por un cuarto conector peptfdico.
6. 6. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en la que el segmento (v) se une o bien directamente por un enlace peptfdico o bien por un tercer conector peptfdico a la region variable de la cadena ligera del segmento (vi).
7. 7. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha molecula esta unida a un antfgeno asociado a tumor o espedfico de tumor.
8. 8. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el segmento (i) esta complejado con el segmento (v).
9. 9. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el segmento (i) es un peptido derivado de un antfgeno asociado a tumor o espedfico de tumor.
10. 10. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el peptido restringido al MHC humano del segmento (i) deriva de una protema viral.
11. 11. La molecula de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la protema viral es CMV.

    Tetramero (PE)

    Fig. 1b

    Fig. 1c

    CO

    CO

    R6/C12 Fig. 1a

    ■'T

    Os

    imagen1

    tjttthh—1t1 nun nmim—i mim 10° 101 102 103 10 Altura de FL1

    i 11 mm i 11 mm i urmii'-i imuif 10° 101 102 1 03 1 04

    Altura de FL1

    R1/E2

    Fig Id

    imagen2

    CM

    Oi

    to

    o =

    n iiuiiit i hitijk

    '° 101 102 103 104 Altura de FL1

    <i> o, ~0 °!

    ra ^ j

    3 ■«- “

    o

    O

    Fig. 1e

    imagen3

    . "nrmiif i nnnn i "iiunr t mmif 10° 101 102 103 104 Altura de FL1

    Anti-CD8 (FITC)

    imagen4

    Altura de FL1

    Fig. 1f

    0|-----------------

    imagen5

    Altura de FL1

    imagen6

    Secuencia de acidos nucleicos de ScHLA-A2 (3EQ ID NO: 1)

    ATGATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTC

    CTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTrGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGA

    ATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACrTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTATrATACT

    GAgTTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCACGTGACTTTGTCACAGCCCAAG

    ATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGggtggcggtggaagcggcggtggaggctctggtggaggtggcagc

    GGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATC

    gcagtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggag

    CCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCC

    CACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCT

    CACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAG

    TACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATG

    GCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAG

    GGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACGCC

    CCCAAAACGCAcATGACTCACCACGCTGTCTCTGACCATGAAGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGC

    TTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTC

    GTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAG

    GAGCAGAGATACACCrGCCArGTGCAGCArGAGGGTTTGCCCAAGCCCCrCACCCTGAGATGGGAG

    Secuencia de amincAcidos de ScHLA-A2 <SEQ ID NO: 2)

    MIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYT

    EFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSG3HSMRYFFTSVSRPGRGEPRFT

    AVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGS

    HrVQRMYGCDVGSDWRFLRGYflQYAYDGKDYIALKEDIRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLE

    GTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV

    ETRPAGDGTFQKWAAVWPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE

    Fig. 1h

    imagen7

    HLA-A2

    B2-M

    Direccionamiento

    Efector

    (cualquier especificidad de peptido deseada) (especifico de tumor)

    Fig. 2a

    B2M-VL

    Reducida

    No reducida

    U

    B2M-dsFv

    B2M-VL

    VH

    Fig. 2c

    Fig. 2b

    Fig. 2d

    Q 0,5

    Control

    0,5

    B2M-dsFv (mg/ml)

    Secuencia de acidos nucleicos de B2M-aTacVL (SEQ ID NO: 4)

    ATGATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTC

    CTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGA

    ATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGGAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTATTATACT

    GAgTTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCACGTGACTTTGTCACAGCCCAAG

    ATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGggtggcggtggaagcggcggtggaggctctggtggaggtggcagc

    GGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATC

    GCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAG

    CCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCC

    CACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCT

    CACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAG

    TACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATG

    GCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAG

    GGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACGCC

    CCCAAAACGCAcATGACTCACCACGCTGTCTCTGACCATGAAGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGC

    TICTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGGAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTC

    gtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcggctgtggtggtgccttctggacag

    GAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTTTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGggc

    ggaggagggtccggtggcggaggttcaggaggcggtggatcgCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCA

    ATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTACATG

    CACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGATTTATACCACATCCAACCTGGCTTCT

    ggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggag

    GCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAAAGGAGTACTTACCCACTCACGTTCGGTTgTGGtACC

    AAGCTGGAGCTC

    Secuencia de aminoacidos de B2M-aTacVL (SEQ ID NO: 5}

    MIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYT

    EFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGG3GGGGSGSHSMP-YFFTSVSRPGRGEPR.fi

    avgyvddtqfvrfdsdaasqrmeprapwieqegpeywdgetrkvkahsqthrvdlgtlrgyynqseags htvqrmygcdvgsdwrflrgyhqyaydgkdyialkedlrswtaadmaaqttkhkweaahvaeqlrayle gtcvewlrrylengketlqrtdapkthmthhavsdheatlrcwalsfypaeitltwqrdgedqtqdtel vetrpagdgtfqkwaavwpsgqeqrytchvqheglpkpltlrweggggsggggsggggsqivltqspa IMSAS PGEKVTITCSASS SISYMHWFQQKPGTSPKLWIYTTSNLASGVPARFSGS GSGTSYSLTISRME AEDAATYYCHQRSTY PLTFGCGTKLEL

    Fig. 2e

    Secuencia de Acidos nucleicos de aTacVH (SEQ ID NO: 6)

    CAGGTCCAtCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAG

    gcttctggctacacctttactagctacaggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaa

    TGGATTGGATATATTAATCCTAGCACTGGGTATACTGAATACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACA

    TTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCA

    GTCTATTACTGTGCAAGAGGGGGGGGGGTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCACTCTCACAGTCTCC

    TCA

    Secuencia de aminoacidos de aTacVH (SEQ ID NO: 7)

    qvhlqqsgaelakpgasvkmsckasgytftsyrmhwvkqrpgqglewigyinpstgyteynqkfkdkat

    LTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYYCARGGGVFDYWGQGTTLTVSS

    Fig. 2f

    Eventos mn n Eventos

    imagen8

    □

    O

    imagen9

    imagen10

    4^

    CO

    70 70

    CD 03

    o o

    ro to cn o 5' o

    ■H

    70 70

    m m

    ro to

    imagen11

    imagen12

    Lisis especifica (%)

    to -U 03 co o

    o o o o o o

    imagen13

    Lisis especifica (%)

    imagen14

    Lisis especifica (%)

    imagen15

    03

    imagen16

    imagen17

    Cadena pesada de HLA _

    Cadena pesada de HLA

    restr. a MHC

    Cadena pesada de HLA

    Cadena pesada de HLA

    Ligando

    Dominio de direccionamiento

    Dominio efector

    Cadena pesada de HLA HVL

    6-2 M

    Pep, restr. a MHC

    VH

    (3-2 M- lj Cadena pesada de HLA HVH

    - VL

    Pep. restr. a MHC

    Cadena pesada de HLA _

    VL - VH

    Cadena pesada de HLA

    VL

    Cadena pesada de HLA HVH

    Pep. restr. a MHC — (3-2 M

    (Viii)

    VL

    _ Cadena pesada de HLA HVH

    JlaJ-VL

    _ Cadena pesada de HLA

    ~(3-2M

    Pep. restr. a MHC

    (XI)

    [3-2 M — Cadena Pesada de HLA

    - Ligando

    Pep. restr. a MHC

    Fig. 6