CZ200479A3 - Způsoby a farmaceutické prostředky pro oklamání imunitního systému, použitelné zejména při léčbě nádorových onemocnění - Google Patents
Způsoby a farmaceutické prostředky pro oklamání imunitního systému, použitelné zejména při léčbě nádorových onemocnění Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200479A3 CZ200479A3 CZ200479A CZ200479A CZ200479A3 CZ 200479 A3 CZ200479 A3 CZ 200479A3 CZ 200479 A CZ200479 A CZ 200479A CZ 200479 A CZ200479 A CZ 200479A CZ 200479 A3 CZ200479 A3 CZ 200479A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- variable region
- mhc
- heavy chain
- targeting domain
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 123
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 86
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 132
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 89
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 266
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 179
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 131
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 131
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 130
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 83
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 80
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 77
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 77
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 69
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 53
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 31
- 102000047279 human B2M Human genes 0.000 claims description 29
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 28
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 28
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 claims description 27
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 24
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 15
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 15
- -1 IL-β Proteins 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 claims description 7
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 92
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 56
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 52
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 44
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 44
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 13
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 11
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 9
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 4
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 3
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 108010077158 leucinyl-arginyl-tryptophan Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobutanoic acid Natural products CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- FOWHQTWRLFTELJ-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N FOWHQTWRLFTELJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N Arg-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N Arg-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N Asp-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- ZOMMHASZJQRLFS-IHRRRGAJSA-N Cys-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CS)N ZOMMHASZJQRLFS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKRUHITYRFNUKW-WDSKDSINSA-N Glu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O CKRUHITYRFNUKW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010026122 HLA-A*33 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010029526 HLA-A28 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010018475 HLA-A31 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010028938 HLA-B45 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010037618 HLA-C*08 antigen Proteins 0.000 description 2
- AKEDPWJFQULLPE-IUCAKERBSA-N His-Glu-Gly Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AKEDPWJFQULLPE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N Leu-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N Leu-Thr-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N 0.000 description 2
- NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N Lys-Asp-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WAIHHELKYSFIQN-XUXIUFHCSA-N Lys-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WAIHHELKYSFIQN-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N Lys-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ZKBKUWQVDWWSRI-BZSNNMDCSA-N Ser-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKBKUWQVDWWSRI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- YTCNLMSUXPCFBW-SXNHZJKMSA-N Trp-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YTCNLMSUXPCFBW-SXNHZJKMSA-N 0.000 description 2
- KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N Tyr-Ala-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N 0.000 description 2
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000010013 cytotoxic mechanism Effects 0.000 description 2
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 108010003486 leucyl-leucyl-phenylalanyl-glycyl-tyrosyl-prolyl-valyl-tyrosyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N methyl acetate Chemical compound COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- MJIDYLIDXWGFRN-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-[2-(diaminomethylidene)hydrazinyl]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NC(=N)NN[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MJIDYLIDXWGFRN-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical compound CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSFQIJDACSFIOH-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminopropanoic acid Chemical compound CC(N)(N)C(O)=O YSFQIJDACSFIOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTLUPDHBKBULE-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QWTLUPDHBKBULE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CBCCCLMNOBLBSC-XVYDVKMFSA-N Ala-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CBCCCLMNOBLBSC-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N Arg-Ala-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- KGSJCPBERYUXCN-BPNCWPANSA-N Arg-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KGSJCPBERYUXCN-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- YUIGJDNAGKJLDO-JYJNAYRXSA-N Arg-Arg-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YUIGJDNAGKJLDO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- VIINVRPKMUZYOI-DCAQKATOSA-N Arg-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIINVRPKMUZYOI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GITAWLWBTMJPKH-AVGNSLFASA-N Arg-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N GITAWLWBTMJPKH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YLVGUOGAFAJMKP-JYJNAYRXSA-N Arg-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N YLVGUOGAFAJMKP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FBXMCPLCVYUWBO-BPUTZDHNSA-N Arg-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FBXMCPLCVYUWBO-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- WCZXPVPHUMYLMS-VEVYYDQMSA-N Arg-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WCZXPVPHUMYLMS-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UYXXMIZGHYKYAT-NHCYSSNCSA-N Asn-His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UYXXMIZGHYKYAT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N Asp-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- YODBPLSWNJMZOJ-BPUTZDHNSA-N Asp-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YODBPLSWNJMZOJ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N Cys-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CMYVIUWVYHOLRD-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CMYVIUWVYHOLRD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VIOQRFNAZDMVLO-NRPADANISA-N Cys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIOQRFNAZDMVLO-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 206010012239 Delusion Diseases 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- VTTSANCGJWLPNC-ZPFDUUQYSA-N Glu-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VTTSANCGJWLPNC-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N Glu-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N Glu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- HAGKYCXGTRUUFI-RYUDHWBXSA-N Glu-Tyr-Gly Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O HAGKYCXGTRUUFI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- QLNKFGTZOBVMCS-JBACZVJFSA-N Glu-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O QLNKFGTZOBVMCS-JBACZVJFSA-N 0.000 description 1
- YPHPEHMXOYTEQG-LAEOZQHASA-N Glu-Val-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YPHPEHMXOYTEQG-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GZBZACMXFIPIDX-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(=O)O GZBZACMXFIPIDX-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XXGQRGQPGFYECI-WDSKDSINSA-N Gly-Cys-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O XXGQRGQPGFYECI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)CN)O KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010004141 HLA-B35 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N His-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BFOGZWSSGMLYKV-DCAQKATOSA-N His-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N BFOGZWSSGMLYKV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N His-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101000799972 Homo sapiens Alpha-2-macroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000734222 Homo sapiens RING finger protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- WUKLZPHVWAMZQV-UKJIMTQDSA-N Ile-Glu-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N WUKLZPHVWAMZQV-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N Ile-Met-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- NGKPIPCGMLWHBX-WZLNRYEVSA-N Ile-Tyr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N NGKPIPCGMLWHBX-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- UYODHPPSCXBNCS-XUXIUFHCSA-N Ile-Val-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C UYODHPPSCXBNCS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 108700042652 LMP-2 Proteins 0.000 description 1
- 108700026569 LMP7 Proteins 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CNNQBZRGQATKNY-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CNNQBZRGQATKNY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N Leu-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N Leu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- YIRIDPUGZKHMHT-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YIRIDPUGZKHMHT-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- BTSXLXFPMZXVPR-DLOVCJGASA-N Lys-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N BTSXLXFPMZXVPR-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N Lys-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N Lys-Leu-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N Lys-Thr-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- XGZDDOKIHSYHTO-SZMVWBNQSA-N Lys-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 XGZDDOKIHSYHTO-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- NYTDJEZBAAFLLG-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O NYTDJEZBAAFLLG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N Met-Gly-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WRXOPYNEKGZWAZ-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WRXOPYNEKGZWAZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KZKVVWBOGDKHKE-QTKMDUPCSA-N Met-Thr-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 KZKVVWBOGDKHKE-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- PQNASZJZHFPQLE-UHFFFAOYSA-N N(6)-methyllysine Chemical compound CNCCCCC(N)C(O)=O PQNASZJZHFPQLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 206010034016 Paronychia Diseases 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- GNUCSNWOCQFMMC-UFYCRDLUSA-N Phe-Arg-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNUCSNWOCQFMMC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N Phe-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- MGLBSROLWAWCKN-FCLVOEFKSA-N Phe-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MGLBSROLWAWCKN-FCLVOEFKSA-N 0.000 description 1
- GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N Phe-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 101710124413 Portal protein Proteins 0.000 description 1
- VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N Pro-Lys-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N Pro-Val-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 101710137389 Probable tail terminator protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 1
- 102100033605 RING finger protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150109894 TGFA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- LMMDEZPNUTZJAY-GCJQMDKQSA-N Thr-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LMMDEZPNUTZJAY-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N Thr-Glu-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N Thr-Glu-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N Thr-Pro-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- DIHPMRTXPYMDJZ-KAOXEZKKSA-N Thr-Tyr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O DIHPMRTXPYMDJZ-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N Trp-Arg-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- GBEAUNVBIMLWIB-IHPCNDPISA-N Trp-Ser-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GBEAUNVBIMLWIB-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- YCQXZDHDSUHUSG-FJHTZYQYSA-N Trp-Thr-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 YCQXZDHDSUHUSG-FJHTZYQYSA-N 0.000 description 1
- XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013532 Uroplakin II Human genes 0.000 description 1
- 108010065940 Uroplakin II Proteins 0.000 description 1
- 102000018070 Uroplakin Ia Human genes 0.000 description 1
- 108010066197 Uroplakin Ia Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- IVXJODPZRWHCCR-JYJNAYRXSA-N Val-Arg-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N IVXJODPZRWHCCR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 150000007933 aliphatic carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000009880 aromatic-aromatic interaction Effects 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 108010025198 decaglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 description 1
- 231100000868 delusion Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081985 glycyl-cystinyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011293 immunotherapeutic strategy Methods 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108010072637 phenylalanyl-arginyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108010002730 protein S precursor Proteins 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Předkládaný vynález se týká nového konceptu imunoterapíe, při které vede oklamání imunitního systému ke specifické a nejúčinnější destrukci vybraných buněk, zejména nádorových buněk.
Dosavadní stav techniky
Existují významné důkazy o tom, že progrese nádorů upacientů s nádorovým onemocněním je kontrolována imunitním systémem. Tento závěr je založen na pozorováních, že progrese nádoru je často spojena se sekrecí imunosupresivních faktorů a/nebo snížením prezentačních funkcí MHC antigenů třídy I (15). Důsledkem je to, že u nádorů musí vzniknout strategie pro překonání účinných mechanismů imunitního systému. Důležité je to, že u jedinců může být detekována imunitní reakce specifická pro nádory (6-8).
Zjevná neúčinnost protinádorové imunitní reakce, která vede k selhání kontroly onemocnění, vedla ke vzniku současného konceptu imunoterapíe. Předpokládá se, že posílení protinádorové imunitní reakce vakcinaci nebo jinými imunoterapeutickými postupy může zvýšit přínos imunoterapíe (6,9-11).
Rameno CD8 cytotoxických T-lymfocytů (CTL) restrihovaných MHC antigeny třídy I adaptivní imunitní reakce je nejlépe vybaveno pro rozpoznávání nádorů jako cizorodé tkáně a iniciuje kaskádu dějů vedoucích k destrukci nádoru (12,13).
Proto je nejatraktivnější přístup v protinádorové imunoterapii zaměřen na vakcinační strategie určené pro posílení CTL ramena protinádorové reakce a pro překonání mechanismů, kterými nádor uniká z dohledu CTL (9-11).
Jedním z nejlépe studovaných mechanismů, kterými nádorové buňky unikají imunitnímu systému, je snížení počtu MHC molekul třídy I, které jsou antigeny rozpoznávanými CTL (1-5,14).
Mutace v prezentační dráze antigenů třídy I by mohly být nejjednodušším způsobem, kterým mohou nádory unikat eliminaci zprostředkované CTL, protože k nim stačí jedna nebo dvě mutace (dvě mutace inaktivují obě alely nebo jedna mutace vytváří dominantně negativní inhibitor) (1-3) .
Snížení exprese MHC antigenů třídy I je často pozorováno u lidských nádorů a toto snížení je zejména výrazné u metastatických lézí (3,14-17). Toto je nepřímý, ale přesto přesvědčivý důkaz úlohy CTL v kontrole progrese tumoru u pacientů s nádorovým onemocněním. Exprese MHC antigenů třídy I byla analyzována zejména v chirurgicky odstraněných nádorech, za použití ímunohistochemických metod (14-15). Byla popsána částečná redukce nebo úplná ztráta MHC, buď pro všechny molekuly, nebo pouze pro určité alely (14—15). Ztráta MHC může být pozorována u některých, ale ne u všech lézí od stejného pacienta. Snížení exprese MHC antigenů třídy I se přisoudilo mutaci p2-mikroglobulinu (p2-m), transportéru asociovaným s proteiny pro prezentaci antigenu (TAP), nebo proteosomovými LMP-2 a LMP-7 proteiny (2,18-2 1). Další důkazy ukazující na ztrátu MHC antigenů třídy I jako mechanismus úniku nádoru z eliminace zprostředkované CTL pocházejí z dlouhé studie pacientů s melanomem. Nádorové buňky odstraněné během primárního chirurgického výkonu prezentovaly devět různých • · · · · · • · · · · · · ··· * 9 449 4 9 · · · · · » · »44 · · · · · ·· · ti 4 4 9 4 4 4 4 4 β 44 ··· *····· ·· * antigenu restrihovaných na čtyři samostatné HLA alely třídy CTL klonům získaným od pacienta (1). Pacient zůstal bez známek onemocnění po dobu 5 let, kdy byly zjištěny metastasy. U buněčné linie získané z metastatické léze byla pozorována ztráta všech čtyř alel, které předtím prezentovaly melanomové antigeny.
Proto je snížení exprese MHC molekul třídy I závažným limitujícím problémem pro protinádorovou imunoterapii a aplikaci protinádorových vakcín. Existuje proto potřeba nového postupu pro imunoterapii, který by neměl výše uvedená omezení, konkrétně potřeba imunoterapie, která je nezávislá na úrovni exprese MHC antigenu třídy I na nádorových buňkách.
Podstata vynálezu
Rameno CD8 cytotoxických T-lymfocytů (CTL) restrihovaných na MHC antigeny třídy I adaptivní imunitní reakce je nejlépe vybaveno pro rozpoznávání nádorů jako cizorodé tkáně a iniciuje kaskádu dějů vedoucích k destrukci nádoru. U nádorů jsou však vyvinuty složité strategie pro únik před efektorovými mechanismy imunitního systému, z nichž nejlépe prostudovaným mechanismem je snížení exprese MHC antigenu třídy I, které jsou antigeny rozpoznávanými CTL.
Pro překonání tohoto mechanismu a vývoj nových přístupu pro imunoterapii, a pro praktické provedení vynálezu, se připravila rekombinantní molekula, ve které je jednořetězcový MHC antigen specificky namířen na nádorové buňky prostřednictvím jeho fúze na rekombinantní protilátkové fragmenty specifické pro nádor nebo na ligand, který se váže na receptory exprimované na nádorových buňkách. Příkladem molekuly podle předkládaného vynálezu je jednořetězcová HLA-A2 ·· ···· ·· · * · · · • · · · · · *» · · · « ···· * · · · ··· • γ ··« β · ♦ 4 · · · · , « · · · · « ·· ··· ·· ···· ·* · molekula, která byla geneticky fúzována na variabilní domény humanizované protilátky proti a podjednotce IL-2 receptoru, anti-Tac (aTac) . Konstrukt, označený jako B2M-aTac (dsFv) ,. se exprimoval v E. coli a funkční molekuly se produkovaly in vitro skládáním za přítomnosti HLA-A2-restrihovaných antigenních peptidu. Pokusy s průtokovou cytometrií ukázaly schopnost navázání HLA-A2-peptidových komplexů na antigenpozitivní, HLA-A2-negativní lidské nádorové buňky způsobem, který bl zcela závislý na specificitš fragmentu protilátky. Nejdůležitější je to, že potažení nádorových buněk B2MaTac(dsFv) činidlo tyto buňky citlivými na účinnou a specifickou HLA-A2-restrihovanou lýzu zprostředkovanou CTL lymfocyty specifickou pro melanomový gplOO peptid. Tyto výsledky ukazují, že koncept toho, že protilátkou vedené antigen-specifické namíření MHC-peptidových komplexů na nádorové buňky může tyto buňky činit citlivými na jejich zabíjení CTL lymfocyty. Tento nový přístup ukazuje nové cesty pro vývoj nových imunoterapeutických strategií založených na zaměření přirozených příbuzných MHC ligandů a cytotoxických mechanismů na bázi CTL protilátkou.
Proto se v předkládaném vynálezu vyvinula nová strategie pro opětovné vnesení komplexů MHC antigen třídy I-peptid na povrch nádorových buněk způsobem, který je nezávislý na expresi antigenů MHC třídy I cílovými nádorovými buňkami. Pro tento účel jsou v jednom provedení předkládaného vynálezu použita ve fúzi dvě ramena imunitního systému. Jedno rameno, zaměřovači skupina, zahrnuje tumor-specifické rekombinantní fragmenty protilátek namířených proti nádoru nebo diferenciačním antigenům, které se po mnoho let používají pro cílené zaměření radioisotopů, toxinů nebo léčiv na nádorové buňky (22, 23). Druhým efektorovým ramenem, je jednořetězcová MHC molekula (scMHC) složená z lidského p2-mikroglobulínu β
• ·· navázaného na tři extracelulární domény těžkého řetězce HLA-A2 (24,25, WO 01/72768). Použije se spojení těchto dvou molekul do jednoho rekombinantního genu a exprese tohoto genu. Nová molekula je účinně exprimována v E. coli a je produkována, například, in vitro skládáním za přítomnosti HLA-A2restrihovaných peptidů. Tento přístup činí - jak je zde ukázáno - nádorové buňky citlivými na lýzu cytotoxickými Tlymfocyty bez ohledu na jejich expresi MHC antigenů třídy I a proto může být použit jako nový postup pro potenciaci protinádorové imunity zprostředkované CTL. Tento nový postup vede k vývoji nové třídy rekombinantních terapeutických činidel schopných selektivně usmrcovat a eliminovat nádorové buňky za použití přirozených příbuzných MHC ligandů a cytotoxických mechanismů na bázi CTL.
V jednom aspektu předkládaného vynálezu je poskytnuta imunomolekula skládající se z: rozpustné efektorové domény lidské MHC molekuly třídy I; a zaměřovači domény navázané na rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I.
V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu, kde uvedený konstrukt se skládá z: prvního polynukleotidu kódujícího rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a druhého polynukleotidu kódujícího zaměřovači doménu; první polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a protilátková zaměřovači doména jsou translačně fúzované pomocí spojovacího peptidu umístěného mezi nimi.
V dalším aspektu předkládaného vynálezu je poskytnut konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu, který se skládá z: prvního polynukleotidu kódujícího rozpustnou ·· ···· ·· *» ·· · • · ···· · · · • · « · «· » · · · · • ··« · · · · · · · · • ♦ · · · · · * •«· ·· ···· *· · efektorovou doménu MHC antigenů třídy I; a druhého polynukleotidu kódujícího variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény; první polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že rozpustná efektorové doména MHC antigenů třídy I a variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény jsou translačně fúzované pomocí spojovacího peptidu umístěného mezi nimi; a třetího polynukleotidu kódujícího druhý z lehkého řetězce a těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény.
V dalším aspektu předkládaného vynálezu je poskytnut systém konstruktů nukleové kyseliny obsahující: první konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje: první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu lidského MHC antigenů třídy I; a druhý polynukleotid kódující variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény; první polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak,, že rozpustná efektorové doména MHC antigenů třídy I a variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény jsou translačně fúzované pomocí spojovacího peptidu umístěného mezd nimi; druhý konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje: třetí polynukleotid kódující druhý z lehkého řetězce a těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro selektivní usmrcování buněk u pacienta, kde tyto buňky presentují antigen (např. receptor), kde v uvedeném způsobu je pacientovi podána imunomolekula, která obsahuje: rozpustnou efektorovou doménu lidského MHC antigenů třídy I v komplexu s MHC-restrihovaným peptidem; a zaměřovači doménu navázanou na rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenů třídy I, kde • · · a » · · • · · · · a * » · a · · · « · · t • · ·· «· · zaměřovači doména je určena pro selektivní navázání na antigen; kdy rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I v komplexu s MHC-restrihovaným peptidem iniciuje imunitní reakci proti buňkám zprostředkovanou CTL, která způsobí selektivní zabíjení buněk in vivo.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je zaměřovači doménou protilátková zaměřovači doména.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je zaměřovači doménou ligandová zaměřovači doména.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je ligandová zaměřovači doména vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF,
KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-β, VEGF a jeho derivátů, TNF.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou rozpustná efektorová doména lidské MHC molekuly třídy I a protilátková zaměřovači doména translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi doménami.
V dalším provedení předkládaného vynálezu protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na efektorovou doménu.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou variabilní region lehkého řetězce protilátky a efektorová doména translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi doménami.
V dalším provedení předkládaného vynálezu protilátková zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region lehkého ·· ·· ·· ·· ·* * · · · · · · « · · · · · 0 » « 0 · · · « • · • · ·« 9
«.· řetězce protilátky.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou variabilní region těžkého řetězce protilátky a variabilní region lehkého řetězce protilátky translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi regiony.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region lehkého řetězce protilátky prostřednictvím spojovacího peptidu.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region lehkého řetězce protilátky prostřednictvím alespoň jedné vazby S-S.
V dalším provedení předkládaného vynálezu protilátkové zaměřovači doména obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na efektorovou doménu.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou variabilní region těžkého řetězce protilátky a efektorové doména translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi regiony.
V dalším provedení předkládaného vynálezu protilátkové zaměřovači doména dále Obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region těžkého řetězce protilátky.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou variabilní region lehkého řetězce protilátky a variabilní region těžkého tt ···· · * * Λ · » * * · * «··« · · » ··»·· · « ♦ ··»· • · « · « · ♦ »· ·»··♦ Λ «·<»«· · * « y «·<*«« ·»··»· «· » řetězce protilátky translačně fúzované, volitelně s translačnš fúzovaným spojovacím peptidem mezi regiony.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region těžkého řetězce protilátky prostřednictvím spojovacího peptidu.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region těžkého řetězce protilátky prostřednictvím alespoň jedné vazby S-S.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je protilátková zaměřovači doména schopná vazby na antigen asociovaný s nádorem.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je protilátková zaměřovači doména schopná vazby na antigen specifický pro nádor.
V dalším provedení předkládaného vynálezu rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a na něj navázaný funkční těžký řetězec lidského MHC antigenu třídy I.
V dalším provedení předkládaného vynálezu funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I obsahuje domény a 1-3.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi regiony.
• · ♦··« ·· • · * · · • » A · · < · « » ♦ · · ♦ • · ♦ · » · » · · « ·« »···» • · * · · · «»
V dalším provedení předkládaného vynálezu rozpustná efektorové doména MHC antigenu třídy I dále obsahuje MHCrestrihovaný peptid.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid navázaný na funkční lidský β-2 mikroglobulin.
V dalším provedení předkládaného vynálezu jsou MHCrestrihovaný peptid a funkční lidský β-2 mikroglobulin translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid v komplexu s funkčním těžkým řetězcem lidského MHC antigenu třídy I.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid odvozen z běžného patogenů.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid odvozen z patogenů, pro který existuje aktivní vakcína.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid odvozen od antigenu asociovaného s nádorem nebo specifického pro nádor.
Podle dalšího provedení vynálezu jakýkoliv popsaný konstrukt nukleové kyseliny dále obsahuje alespoň jednu cispůsobící regulační sekvenci operativně navázanou na kódující polynukleotidy.
•» · · · * «« 1» * · · ·»· · 0 * · · ·· • ♦ «· · * « * · · · · » * «·« · « · 0 · 0 0 ·
*... .. .... ·. «
V dalším provedení předkládaného vynálezu je cis působící regulační sekvence funkční v bakteriích.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je cis působící regulační sekvence funkční v kvasinkách.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je cis působící regulační sekvence funkční v živočišných buňkách.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je cis působící regulační sekvence funkční v rostlinných buňkách.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje transformovanou buňku obsahující jakýkoliv konstrukt nukleové kyseliny nebo systém konstruktů nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu.
Ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu je buňkou eukaryotická buňka vybraná ze skupiny zahrnující savčí buňky, hmyzí buňky, rostlinné buňky, kvasinky a protozoární buňky.
V dalším provedení předkládaného vynálezu je buňkou bakteriální buňka.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje izolovaný přípravek bakteriálních inkluzních tělísek obsahující více než 30% hmotnostních imunomolekuly podle předkládaného vynálezu.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro produkci imunomolekuly, který zahrnuje: exprimování, v bakteriích, imunomolekuly, která se skládá z: rozpustné efektorové domény MHC antigenu třídy I, která obsahuje funkční • ·
Φ Λ
9· ·
Φ · · · • · · · · · « » « «· · lidský β-2 mikroglobulin a funkční těžký řetězec lidského MHC antigenu třídy I navázaný na sebe; a zaměřovači doménu navázanou na rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a izolování imunomolekuly.
V dalších výhodných provedeních imunomolekula dále obsahuje MHC-restrihovaný peptid navázaný na funkční lidský β-2 mikroglobulin, a způsob dále zahrnuje znovusložení imunomolekuly za zisku komplexu MHC antigen třídy I-MHCrestrihovaný peptid.
V dalších výhodných provedeních je izolování imunomolekuly provedeno chromatografií s vylučováním podle velikosti.
V dalších výhodných provedeních je MHC-restrihovaný peptid exprimován současně s imunomolekulou v bakteriích.
V dalších výhodných provedeních je exprimování imunomolekuly v bakteriích provedeno tak, že imunomolekula tvoří v bakteriích inkluzní tělíska.
V dalším provedení předkládaného vynálezu tvoří MHCrestrihovaný peptid a imunomolekula současně inkluzní tělíska v bakteriích. „
V dalším výhodném provedení izolování imunomolekuly dále zahrnuje: denaturování inkluzních tělísek tak, že se z nich uvolňují proteinové molekuly; a renaturování proteinových molekul.
V dalším výhodném provedení je renaturování proteinové molekuly provedeno za přítomnosti MHC-restrihovaného peptidu.
• · * · · · ♦ · ♦ « to « · » toto · • · · * to • K «»«» 4»
V dalším provedení předkládaného vynálezu je MHCrestrihovaný peptid současně exprimován v bakterii.
Předkládaný vynález úspěšně řeší nevýhody současných postupů a poskytuje nový způsob pro léčbu nádorových onemocnění.
Popis obrázků na připojených výkresech
Vynález bude nyní popsán pomocí příkladů, s odkazy na připojené výkresy. Konkrétní odkazy na výkresy jsou míněny jako příklady a slouží pouze pro znázornění výhodných provedení vynálezu a jsou uvedeny v případě, kdy se předpokládá, že jsou nej vhodnější pro pochopení a popis principů vynálezu. Z tohoto hlediska není žádná snaha uvádět více podrobností vynálezu než je nutné pro jeho základní pochopení, popis doprovázející nákresy je pro pracovníky v oboru dostatečný pro použití několika provedení vynálezu v praxi.
Obr. 1A-F demonstrují vazbu in vitro znovusložených scHLA-A2 komplexů na CTL. Klony R6C12 a R1E2 specifické pro. melanomový diferenciační antigen gp 100 reagovaly s in vitro znovu složenými přečištěnými scHLA-A2 tetramery obsahujícími G9-209M epitop rozpoznávaný R6C12 CTL a G9-280V peptid rozpoznávaný R1E2 CTL. CTL se barvily FITCanti-CD8 (Obr. IA a ID), s PE-značenými scHLA-A21G9-209M tetramery (Obr. IB a IF) a s scHLA-A2/&9-280V tetramery (Obr. 1C a IE). R6C12 a R1E2 CTL se barvily specificky (39-209M a G9-280V tetramer, v příslušném pořadí), ale s kontrolním tetramerem.
Obr. 1G je schématické znázornění scHLA-A2 komplexu • · • » ♦ · · · • · · < · · · · · 9 · ♦ * * * « · · • * · · * » ·· · » použitého v pokusech uvedených na obr. Obr. 1A-F.
Obr. 1H uvádí sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:1) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:2) scHLA-A2 schematicky uvedené na obr. 1G.
Obr. 2A-D ukazují návrh, expresi, přečištění a biochemickou charakterizaci B2M-aTac(dsFv). Obr. 2A - B2MaTac(dsFv) konstrukt se připravil fúzováním jednořetězcové MHC molekuly na protilátkový variabilní Fv fragment. V jednořetězcovém HLA-A2 genu byl lidský a-2m fúzován na tři extracelulámí domény HLA-A2 prostřednictvím flexibilní 15aminokyselinové spojovací sekvence [ (Gly4-Ser)3, tj. GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:3), kódovaný
GGCGGAGGAGGGTCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCG (SEQ ID N0:15)]. Stejný spojovací peptid se použil pro spojení scHLA genu a protilátkového Fv fragmentu. VL variabilní doména protilátky se fúzovala na C-konec scHLA-A2 genu, zatímco VH variabilní doména se exprimovala samostatně. Dva plasmidy se exprimovaly v separátních kulturách a solubilizovaná, redukovaná inkluzní tělíska se smísila za vzniku disulfidovou vazbou stabilizovaných Fv fragmentů (dsFv), ve kterých jsou Fv variabilní domény stabilizované meziřetězcovými disulfidovými vazbami vloženými mezi konzervované zbytky pracovního rámce. Obr. 2B ukazuje SDS-PAGE analýzu inklúzních tělísek z bakteriálních kultur indukovaných k expresi složek B2MaTac(dsFv); B2M-aTacVL a aTacVH. Obr. 3C ukazuje SDS-PAGE analýzy na neredukčních a redukčních gelech B2M-aTac(dsFv) po iontoměničovém přečištění na Q-Sepharosové koloně. Obr. 4D ukazuje vazbu znovu složeného B2M-aTac(dsFv)/G9-209M cílový antigen, p55. Detekce vazby se provedla konformačněspecifickou MAb w6/32.
• · • » « * «* • · · • ♦ · · · • · · • · · • · · • · · · • » ···♦
Obr. 2E ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:4, sekvence spojovací skupiny je uvedena malými písmeny) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:5) B2M-aTacVL schematicky znázorněnou na Obr. 2A jako součást B2M-aTac(dsFv).
Obr. 2F ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:6) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:7) aTacVH schematicky znázorněnou na Obr. 2A jako součást B2M-aTac(dsFv).
Obr. 3A-F ukazují vazbu B2M-aTac(dsFv) na HLA-A2negativní nádorové buňky. Provedla se analýza vazby B2MaTac(dsFv) na antigen-pozitivní HLA-A2-negativní buňky pomocí průtokové cytometrie. ,Obr. 3A ukazuje vazbu anti-Tac Mab (červeně) na A431; Obr. 3B ukazuje vazbu anti-Tac MAb na Tac (p55)-transfektované A431 (ATAC4) buňky (červeně); Obr. 3C ukazuje vazbu anti-HLA-A2 Mab BB7.2 na A43 1 buňky inkubované (červeně) nebo neinkubované (modře) s B2M-aTac(dsFv); Obr. 3D ukazuje vazbu MAb BB7.2 na p55-transfektované ATAC4 buňky preinkubované (červeně) nebo nepreinkubované (modře) s B2MaTac(dsFv); Obr. 3E ukazuje vazbu anti-Tac MAb (červeně) na leukemické HUT102W buňky; a Obr. 3F ukazuje vazbu MAb BB7.2 na HUT102W buňky preinkubované (červeně) nebo nepreinkubované (modře) s B2M-aTac(dsFv). Ve všech případech jsou kontrolní buňky se sekundární protilátkou uvedeny černě.
Obr. 4A-E ukazují potenciaci CTL-zprostředkované lýzy HLA A2-negativních nádorových buněk B2M-aTac(dsFv). Cílové buňky potažené nebo nepotažené B2M-aTac(dsFv)-peptidovými komplexy se inkubovaly s CTL specifickými pro gplOO melanomový peptid v testu uvolňování 35methioninu. 0br.4A - A431 a p55transfektované ATAC4 LILA-A2 buňky se preinkubovaly nebo nepreinkubovaly s B2M-aTac(dsFv)/G9-209M komplexy a potom se provedla inkubace s G9-209M-specifickými CTL, R6C12.
• · ··♦· * · ♦· ♦ ·· · * · ♦ · • ♦ »· · ·· · · • * » · · · · · « « · * » 9 ·
...........
Kontrolami byly buňky inkubované s mediem samotným; Obr. 4B A431 a p55-transfektované ATAC4 HLA-A2 buňky se preinkubovaly s B2M-aTac(dsFv)/G9-209M komplexy a potom se provedla inkubace s R6C12 CTL. FM3D jsou HLA-A2+, gpl00+ melanomové buňky; Obr.
4C a 4D - p55-transfektované ATAC4 buňky se preinkubovaly s B2M-aTac(dsFv) komplexy znovu složenými s HLA-A2restrihovanými peptidy G9-209M, G9-280V, a TAX, a potom se provedla inkubace s G9-209M-specifickým CTL klonem R6C12 na Obr. 4C nebo s G9-280V-specifickým CTL klonem R1E2 na Obr. 4D; Obr. 4E - HUT102W a CRII-2 HLA-A2 leukemické buňky se preinkubovaly (w) nebo nepreinkubovaly (w/o) s B2M-aTac(dsFv) komplexy obsahujícími vhodný peptid a potom se provedla inkubace s G9-209M-specifickými R6C12 CTL nebo G9-280Vspecifickými R1E2 CTL, jak je popsáno.
Obr. 5 je graf ukazující výsledky in vivo win testu s B2m-aTac(dsFv). ATAC4 buňky (lxlO5) se smísily s R6C12 CTL (lxlO6) (E:T 10:1) za přítomnosti nebo absence B2M-aTac(dsFv) (20-50 gg/ml) v 200 μΐ. Směs se podkožně injikovala holým myším a sledoval se vývoj nádorů. ATAC4 buňky se použily jako kontrola.
Obr. 6 je schématické znázornění výhodných imunomolekul podle předkládaného vynálezu, kde čáry mezi rámečky představují kovalentní vazbu (například translační fúzi) mezi skupinami v rámečcích.
Podrobný popis výhodných provedení
Předkládaný vynález poskytuje (i) nové imunomolekuly;
(ii) způsoby přípravy nových imunomolekul; (iii) konstrukty nukleové kyseliny kódující nové imunomolekuly; a (iv) způsoby použití nových imunomolekul pro selektivní zabíjení buněk, ·· ··♦· 99 *· ·· * • β 9 9 9 9 9 9 9 ♦ 999 9 9 * * 9 · 9
9 · 9 9 9 9 9 · ♦«·♦ «9 «·» ·· *··· 99 9 zejména nádorových buněk.
Principy a provedení předkládaného vynálezu budou lépe pochopitelné s odkazem na připojené výkresy a doprovodný popis.
Před popisem alespoň jednoho provedení předkládaného vynálezu je třeba si uvědomit, že vynález není omezen na detaily uvedené dále v následujícím popisu či příkladech provedení vynálezu. Existují různá další provedení, která mohou být prováděna jinými způsoby. Také je třeba si uvědomit, že použitá fraseologie a terminologie je určena pro popis a nijak neomezuje předkládaný vynález.
Progrese nádorů je často spojena se sekrecí imunosupresivních faktorů a/nebo se snížením prezentačních funkcí MHC antigenů třídy I (1-5, 14, 15). Důsledkem je to, že se u nádorů vyvinuly různé strategie pro obejití účinné imunitní reakce. Na významném rozvoji vakcín, které mohou stimulovat imunitní reakci proti nádorům, se podílela identifikace proteinových antigenů asociovaných s daným nádorem a epitopové mapování nádorových antigenů na HLA třídy I a třídy II restrihované vazebné motivy a tyto se v současnosti používají v různých vakcinačních programech (6, 9, 11-13). MHC antigeny třídy I presentující vhodné peptidy jsou nutné pro dodání specifických signálů pro rozpoznání a usmrcení CTL. Nicméně, základním mechanismem úniku nádoru je ztráta, snížení exprese nebo alterace HLA profilů, což může činit buňky nereaktivními na CTL lýzu, i tehdy, když buňky exprimuji vhodný nádorový antigen. V lidských nádorech může být ztráta HLA až 50%, což naznačuje, že redukce koncentrace proteinů může poskytovat nádorovým buňkám výhodu v přežívání (14,15).
• · φ φ·· • φ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ φ φφφφ φ φ · · φφφ φ ♦ φφφ φ φ φφ φφφφ • · φφφφ φφφ φφ φφφ φφ ···» φφ ·
Předkládaný vynález nabízí nový přístup pro překonání tohoto problému. Bylo zjištěno, že tumor-specifické cílené dodání komplexů MHC antigen třídy I-peptid na nádorové buňky je efektivní a účinnou strategií pro učinění HLA-A2negativních buněk citlivými na lýzu relevantními HLA-A2restrihovanými CTL. Tato nová strategie pro nasměrování CTL proti nádorovým buňkám má výhodu v tom, že využívá rekombinantní protilátkové fragmenty nebo ligandy, které mohou být lokalizovány na maligních buňkách, které exprimují nádorový markér (antigen, např. receptor), obvykle asociovaný s transformovaným fenotypem (jako jsou receptory pro růstové faktory, diferenciační antigeny), s relativně vysokým stupněm specificity. Rekombinantní protilátkové fragmenty cílené na nádorové buňky jsou tvořeny Fv variabilními doménami, které jsou nejmenšími funkčními moduly protilátek nutnými k zachování vazby na antigen. Toto je zejména výhodné pro klinické aplikace, nejen pro generování molekul popsaných v předkládaném vynálezu, ale také pro přípravu jiných protilátkových fúzních proteinů, jako jsou rekombinantní Fv imunotoxiny nebo rekombinantní fúze protilátka-cytokin (37,
38), jelikož jejich malá velikost zlepšuje penetraci do nádoru.
Protilátkový zaměřovači fragment nebo zaměřovači ligand je fúzován na jednořetězcovou HLA molekulu, která může být účinně a funkčně složena okolo HLA-A2-restrihovaného peptidu. Tento postup může být rozšířen na další hlavní HLA alely a mnoho typů nádorových specificit, které jsou určeny rekombinantními protilátkovými fragmenty, čímž se získá nová rodina imunoterapeutických prostředků, které mohou být použity pro zesílení a potenciaci protinádorových aktivit. Společně s použitím monoklonálních protilátek pro protinádorovou • 9 9 9 9 · < 9 9 9 • · ·«· · · · 9 9 9 9 • 9 999 9 9 ·9 9 999 * • 9 9 999 999
..............
terapii může být tento postup považován za spojení mezi protinádorovými protilátkami a buněčnou imunoterapií.
Rekombinantní již byly použity pro nasměrování Tlymfocytů, za použití klasického přístupu bispecifických protilátek, ve kterých je jedno rameno protilátky namířeno proti antigenu specifickému pro nádor a druhé rameno protilátky je namířeno na molekulu asociovanou s efektorovou buňkou, jako je CD3 pro CTL a CD16 pro NK buňky (39).
Ligandy, které se váží na nádorové buňky, byly již též použity pro cílenou aplikaci různých toxinů na nádorové buňky.
Viz, například, odkazy 50-52 pro EGF, TGFa, IL-2 a IL-3.
Hlavní výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je použití rekombinantní molekuly, která může být produkována v homogenní formě ve velkých množstvích. Významné je to, že velikost B2M-dsFv molekuly je přibližně 65 kDa (při tvorbě s jakýmkoliv protilátkovým dsFv fragmentem) a tato velikost je optimální z hlediska požadavků na dobrou penetraci do nádoru na jedné straně a relativně dlouhým poločasem a stabilitou v cirkulaci na straně druhé (40). Nedávno byla publikována práce popisující přípravu tetramerů protilátka-MHC antigen třídy I, ve které bylo pozorováno účinné CTL-zprostředkované zabíjení cílových nádorových buněk při použití Fabstreptavidin-MHC tetramerových konjugátů (41). Limitací tohoto způsobu, ve srovnání s rekombinantními fúzními molekulami protilátkový fragment-monomerní scMHC podle předkládaného vynálezu, je velká velikost těchto molekul, která je okolo 400 kDa, a skutečnost, že rozpustné MHC tetramery mohou indukovat aktivaci T-lymfocytů sami o sobě, zatímco monomerní MHC molekula nemůže indukovat aktivaci, pokud není přítomna v relativně vysokých lokálních koncentracích (42-44).
Potažení nádorové buňky, která má sníženou vlastní expresi MHC pomocí tohoto zaměřovacího postupu potencuje zabíjení buněk CTL za použití cíle na nádorové buňce, který se obvykle podílí na procesu transformace, a nejklasičtějšími příklady takových cílů jsou receptory pro růstové faktory, jako je IL-2R, který je zde použit. Tato skutečnost také posiluje představu, že při použití tohoto postupu není pravděpodobné, že uniknou mutanty, u kterých není snížení exprese cílového receptoru a růstová výhoda, protože se receptor přímo podílí na klíčových mechanismech přežívání nádorové buňky.
Další výhodou protilátkového přístupu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že s danou peptidovou skupinou určující specificitu mohou být spojena další činidla, konkrétně, skládání B2M-Fv molekuly může být provedeno okolo jakéhokoliv vhodného MHC-restrihovaného peptidu. V uvedených příkladech HLA-A2-restrihované tumor-specifické CTL rozpoznávají T-lymfocytární epitopy odvozené od melanomového diferenciačního antigenů gplOO. Nicméně, nasměrování antigenreaktivních CTL může být provedeno tak, aby zabíjeli jiné nádorové buňky, za použití jiných antigenních peptidů, které se určí podle nových znalostí v oblasti imunologických mechanismů ve zdraví a nemoci. Například, identifikace tumorspecif ické CTL reakce u pacientů naznačuje, že u takových pacientů mohou existovat vhodné cílové antigeny. Nicméně, nedávné práce prokázaly, že tyto tumor-specifické CTL nejsou optimální, protože jsou často přítomné ve velmi nízkých frekvencích nebo, jsou-li přítomné ve vysokých frekvencích, tak jsou nefunkční nebo anergní (7). Tak mohou být aktivnější a slibnější zdroje CTL získány z cirkulujících lymfocytů namířených proti velmi imunogenním T-lymfocytárním epitopům,
jako jsou epitopy odvozené od virů nebo bakteriálních toxinů, které mohou také vyvolat dobrou paměťovou odpověď (45,46).
Bylo zjištěno, že CTL prekursory namířené proti chřipkovým, EBV, CMV epitopům (peptídům) jsou zachovávány ve vysokých frekvencích v cirkulaci u pacientů s nádorovým onemocněním, stejně jako u zdravých jedinců, a tyto CTL jsou obvykle aktivní a s paměťovým fenotypem (45, 46). Proto mohou být tyto CTL zdrojem, který může být nasměrován na nádorové buňky pomocí použití B2M-Fv molekuly opatřené takovými virovými epitopy. Optimálním činidlem je B2M-Fv molekula, ve které je antigenní peptid také kovalentně navázaný na komplex pomocí použití flexibilní spojovací skupiny napojující peptid na Nkonec β-2 mikroglobulinu. Tento konstrukt zajišťuje optimální stabilitu scMHC komplexu in vivo, protože stabilizační peptid je navázaný kovalentně a nemůže snadno opustit MHC peptidvazebnou rýhu. Tento typ jednořetězcové peptid-MHC molekuly byl dříve generován v myších a lidských systémech pro různé funkční a strukturální pokusy (47, 48). Další možností je použití derivátů antigenního peptidů, které jsou modifikovány v kotevních zbytcích způsobem, který zvyšuje jejich vazebnou afinitu k HLA vazebné drážce (27).
Existuje několik možných Fv fragmentů, které mohou být použity jako zaměřovači skupina. Kromě dsFv typu fragmentu použitému v provedení předkládaného vynálezu může být použit jednořetězcový Fv fragment (scFv), ve kterém jsou protilátkové VH a VL domény spojeny pomocí spojovacího peptidů. V takovém případě je B2M-Fv molekula kódovaná jedním plasmidem, což eliminuje možnou kontaminaci jedinou doménou B2M molekuly.
Dalším významným aspektem předkládaného vynálezu, který je podporován jinými aspekty, je skutečnost, že potažení komplexů antigenní MHC-peptid na povrch nádorové buňky bez • ft ftft ftft ft « · ft «ftftft ftftft • · ftftft ft· · ftftftft » · ftftft · · ftft ftft··· ftft ft··· ftftft • ft ftftft ·· ftftftft ftft · • ft ftftftft transmembránového zakotvení je dostatečné pro indukování jejich lýzy specifickými CTL bez znalostí, zda jsou vůbec přítomny pomocné molekuly cílové nádorové buňky a zda mají nějakou úlohu v CTL zabíjení. Toto pozorování vychází ze skutečnosti, že vysoké lokální koncentrace potažených komplexů MHC-peptid majících jeden konkrétní T-lymfocytární epitop (peptid) se vytvářejí na cílových buňkách, kde tyto koncentrace značně převyšují přirozené koncentrace takových komplexů na povrchu buněk. V případě IL-2R a podjednotky je na cílové buňce přítomno několik stovek až tisíc míst na buňku, na rozdíl od velmi malého počtu komplexů na normálních buňkách, což může být dostatečné pro účinné zabíjení buněk bez podílu pomocných molekul. V této teorii se nebere v úvahu snížení exprese MHC antigenu třídy I jako možného mechanismu úniku buněk. Dalším důkazem svědčícím pro tuto možnost je zjištění, že MHC tetramery mohou indukovat aktivaci Tlymfocytů sami o sobě (44), včetně nedávného pozorování, že aktivace CTL MHC tetramery bez potřeby pomocných molekul může být dokázána na jednotlivých buňkách (Cohen, Denkberg, Reiter; postoupeno k tisku).
Závěrem, výsledky uvedené v předkládaném vynálezu poskytují jasný důkaz použitelnosti způsobů podle předkládaného vynálezu pro zapojení aktivních CTL do zabíjení nádorových buněk prostřednictvím zacílení komplexů scMHCpeptid na nádor pomocí protilátek nebo ligandů specifických pro nádor. Tyto výsledky ukazují cestu pro vývoj nového imunoterapeutického přístupu na bázi přirozené buněčné imunitní reakce, která je přesměrována na nádorové buňky.
V jednom aspektu předkládaného vynálezu je poskytnuta imunomolekula, která obsahuje rozpustnou efektorovou doménu lidské MHC molekuly třídy I; a zaměřovači doménu, buď
0 ·· 0 0 ·· 0 · ♦· 0 • 00 0000 000
0 000 0 0 0 «000
0 000 0 0 00 0000
0 000 000
000 ·0 ··»» 0« · 23 protilátkovou zaměřovači doménu nebo ligandovou zaměřovači doménu, která je navázaná na rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I. Výhodně má imunomolekula molekulovou hmotnost menší než 100 kDa. Rozpustná efektorové doména lidské MHC molekuly třídy I a zaměřovači doména jsou výhodně translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi doménami. Další způsoby pro kovalentní navázání rozpustné efektorové domény MHC antigenu třídy I a zaměřovači domény jsou popsány dále.
Obr. 6 ukazuje několik výhodných imunomolekul podle předkládaného vynálezu, označených jako (i) — (xiv). Všechny molekuly obsahují jednořetězcový a rozpustný MHC, který zahrnuje funkční lidský β-2 mikroglobulin navázaný na funkční lidské těžké řetězce MHC antigenů třídy I, které výhodně obsahují domény a 1-3. Výhodně jsou funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční lidské těžké řetězce MHC antigenů třídy I translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi doménami. Nicméně, jak je popsáno dále, funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční lidské těžké řetězce MHC antigenů třídy I mohou být na sebe navázané jiným způsobem.
Termín funkční, jak je zde použit pro β-2 mikroglobulin a těžké řetězce jednořetězcových MHC antigenů třídy I označuje to, že jakákoliv část těchto molekul je schopna přispět k sestavení funkčního jednořetězcového komplexu MHC antigenu třídy I (tj. je schopná vázat se na a prezentovat CTL specifické MHC-restrihované antigenní peptidy, když je v komplexu s takovými peptidy).
Výrazy translačně fúzované a v rámci jsou zaměnitelné a označují polypeptidy kódované polynukleotidy, které jsou
0000 00 0* 00 *
000 0*00 000
0 *** * 0 0 * 0 0 0
0000 «000 000
4* 0*00 *00 • 0 000 00 040* 00 0 kovalentně vázané a tvoří jediný kontinuální otevřený čtecí rámec v celé délce kódujících sekvencí navázaných polynukleotidů. Takové polynukleotidy mohou být kovalentně navázané přímo nebo výhodně nepřímo pomocí spojovacího nebo oddělovacího regionu kódujícího spojovací peptid.
Molekuly (i) — (ví) a (xiii) dále obsahují na sebe kovalentně navázaný MHC-restrihovaný peptid. MHC-restrihovaný peptid je výhodně navázaný na funkční lidský β-2 mikroglobulin. Výhodně jsou MHC-restrihovaný peptid a funkční lidský β-2 mikroglobulin translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou. Nicméně, jako je popsáno dále, MHC-restrihovaný peptid a funkční lidský β-2 mikroglobulin mohou být na sebe kovalentně navázané i jinými způsoby.
Molekuly (vii) — (xii) a (xiv) dále obsahují MHCrestrihovaný peptid, který není na tyto molekuly kovalentně navázaný. V obou případech je však MHC-restrihovaný peptid vybraný tak, aby tvořil komplex s těžkými řetězci funkčních lidských MHC antigenu třídy I po složení, jak je popsáno dále.
MHC-restrihovaný peptid je výhodně odvozen od běžného patogenu, jako je virus chřipky, hepatitidy atd. Patogen, ze kterého je MHC-restrihovaný peptid odvozen, je vybrán podle následujících kriterií: (i) výhodně je velká část populace vystavena patogenu nebo jeho antigenům cestou infekce nebo vakcinace; (ii) pro patogen je k dispozici aktivní vakcinace, aby bylo možné posílit imunitní reakci; a (iii) relativně vysoké titry CTL s dlouhou pamětí se zachovávají u infikovaných nebo vakcinovaných jedinců.
Alternativně je MHC peptid odvozen od antigenu ·· ···· ·· ·<· ·· · ··· ···· · ·· • · ··· · · · · · · · • · · · · · ···· ···· • · · · · · · Λ · __ ·· ··· *· ···· ·· « 25 asociovaného s nádorem nebo od antigenu specifického pro nádor. Bylo zjištěno, že MHC-restrihované peptidy odvozené od antigenů asociovaných nebo specifických pro nádor mohou být použity pro vyvolání účinné CTL reakce. Viz například WO 00/06723, která je zde uvedena jako odkaz.
Zaměřovači doménou může být protilátková zaměřovači doména (molekuly (i)-(xii)) nebo ligandová zaměřovači doména (molekuly (xiii) a (xiv)).
V jednom výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na efektorovou doménu (viz molekuly (i) a (vii) na Obr. 6). Výhodně jsou variabilní region lehkého řetězce protilátky a efektorová doména translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou. Nicméně, dále jsou popsány další způsoby pro kovalentní navázání variabilního regionu lehkého řetězce protilátky a efektorové domény.
Podle jiného výhodného provedení protilátková zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region lehkého řetězce protilátky (viz molekuly (iii) — (vi) a (ix) — (xii) na Obr.
6). Výhodně jsou variabilní region těžkého řetězce protilátky a variabilní region lehkého řetězce protilátky translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou (viz molekuly (vi) a (x) na Obr. 6). Nicméně, dále jsou popsány další způsoby pro kovalentní navázání variabilního regionu těžkého řetězce protilátky a variabilního regionu lehkého řetězce protilátky.
Například, variabilní region těžkého řetězce protilátky • φ
Φ Φ φφφφ φφ · · φφφ φφφ φ φφφφ · ·
I φ φ φ Φ Φ · • φ φ φ φ φ ••ΦΦΦ φφφφφ φφφφφ
může být navázaný na variabilní region lehkého řetězce protilátky pomocí alespoň jedné S-S vazby, čímž vznikne dsFV skupina (viz například molekuly (v) a (xi) na Obr. 6)).
V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na efektorovou doménu (viz molekuly (ii) a (viii) na Obr. 6). Výhodně jsou variabilní region těžkého řetězce protilátky a efektorová doména translačně fúzované, volitelně s translačnš fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou (viz molekuly (iii) a (ix) na Obr. 6). Nicméně, dále jsou popsány další způsoby pro kovalentní navázání variabilního regionu těžkého řetězce protilátky a efektorové domény.
V jiném provedení předkládaného vynálezu protilátková zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region těžkého řetězce protilátky (viz molekuly (iii), (vi), (ix) a (xii) na Obr. 6). Výhodně jsou variabilní region lehkého řetězce protilátky a variabilní region těžkého řetězce protilátky translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou (viz molekuly (iii) a (ix) na Obr. 6). Nicméně, dále jsou popsány další způsoby pro kovalentní navázání variabilního regionu lehkého řetězce protilátky a variabilního regionu těžkého řetězce protilátky.
Například může být variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na variabilní region těžkého řetězce protilátky pomocí alespoň jedné S-S vazby, za vzniku dsFV skupiny (viz, například, molekuly (vi) a (xii) na Obr. 6) ).
Protilátková zaměřovači doména v molekulách podle
• · · · · · · • · · · · · · • · <r · · · · « · · · · · * ··* • · · · * ί ······ ·· · předkládaného vynálezu je vybrána tak, aby byla schopná vazby na antigen asociovaný s nádorem nebo antigen specifický pro nádor. Je třeba.si uvědomit, že v současnosti jsou známy stovky antigenu asociovaných s nádorem nebo antigenu specifických pro nádory, které jsou asociované s různými solidními i non-solidními nádory, a dále také to, že byly vyvinuty monoklonální protilátky k mnohým z těchto antigenů.
Jinými slovy, aminokyselinové sekvence a sekvence nukleové kyseliny protilátek, které se specificky váží na antigen asociovaný s nádorem nebo antigen specifický pro nádor jsou již známé nebo mohou být snadno určeny analyzováním hybridomů produkujících takové protilátky.
Molekuly popsané na obr. 6 se skládají z jednoho polypeptidů [např., molekuly (i)-(iv) a (xiii)], dvou polypeptidů [molekuly (v), (vi), (vi)-(x) a (xiv)) nebo tří polypeptidů [molekuly (xi) a (xii)].
Termíny peptid a polypeptid jsou v předkládaném vynálezu zaměnitelné. Každý z polypeptidů může být syntetizován za použití jakékoliv metody známé v oboru. Proto je jasné, že imunomolekuly podle předkládaného vynálezu nebo jejich části mohou být připraveny různými způsoby, včetně proteinové syntézy na pevné fázi, avšak ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu jsou alespoň hlavní součásti molekuly, např. rozpustná efektorové doména lidského MHC antigenu třídy I (s nebo bez MHC-restrihovaného peptidu) a protilátkové zaměřovači doména (jako je scFV nebo rameno dsFv) připraveny translací příslušných konstruktů nukleové kyseliny nebo konstruktů.
Pro syntézu molekuly z Obr. 6 pomocí translace jsou nutné jeden až tři otevřené čtecí rámce. Tyto otevřené čtecí rámce • ·
• · • · mohou být umístěny na jedné, dvou nebo třech molekulách nukleové kyseliny. Jeden konstrukt nukleové kyseliny může nést jeden, dva nebo všechny tři otevřené čtecí rámce. Jedna až tři cis působící regulační sekvence mohou být použity pro řízení exprese jednoho až tří otevřených čtecích rámců. Například, jediná cis působící regulační sekvence může řídit expresi jednoho, dvou nebo tří otevřených čtecích rámců, podobně jako cistron. V alternativním provedení mohou být tři nezávislé cis působící regulační sekvence použity pro řízení exprese tří otevřených čtecích rámců. Jiné kombinace jsou také možné.
V případech, kdy MHC-restrihovaný peptid není kovalentně navázaný na zbývající části molekuly (viz na Obr. 6 molekuly (vii). - (xii)), tak je výhodně připraven technikami syntézy na pevné fázi, a obvykle se jedná o krátký peptid délky menší než 10 aminokyselin.
Otevřené čtecí rámce a cis působící regulační sekvence mohou být neseny jednou až třemi molekulami nukleové kyseliny. Například, každý otevřený čtecí rámec a cis působící regulační sekvence jsou neseny jinou molekula nukleové kyseliny, nebo jsou všechny otevřené čtecí rámce a jejich cis působící regulační sekvence neseny jedinou molekulou nukleové kyseliny. Jiné kombinace jsou také možné.
Exprese polypeptidů může být provedena transformací/transfekcí a/nebo ko-transformací/ko-transfekcí jediné buňky nebo většího počtu buněk jakoukoliv molekulou nukleové kyseliny, která působí jako transformační/transfekční vektor (např., jako plasmid, fág, fagemid nebo virus).
Proto v dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu. Konstrukt • · · · • ·
♦ podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu obsahuje první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu lidského MHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující zaměřovači doménu, buď protilátkovou zaměřovači doménu nebo ligandovou zaměřovači doménu. První polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a zaměřovači doména jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidů mezi sebou.
V ještě dalším aspektu předkládaného vynálezu je poskytnut konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu. Konstrukt podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu obsahuje první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu lidského MHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény. První polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a variabilní region lehkého řetězce a těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény, jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidů mezi sebou. Konstrukt podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu dále obsahuje třetí polynukleotid kódující druhý z lehkého řetězce a těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény. Třetí polynukleotid může být vybrán tak, aby kódoval separátní polypeptid, což umožní tvorbu dsFV, nebo aby kódoval polypeptid, který je translačně fúzovaný na druhou molekula nukleové kyseliny, což umožní tvorbu scFV.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje systém konstruktů nukleové kyseliny. Systém konstruktů obsahuje první konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje první • · · « · · • ••44 • · · · · · · • · ·
ΟΛ * · * ·· *·· polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény. První polynukleotid a druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu mezi sebou. Systém konstruktů dále obsahuje druhý konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje třetí polynukleotid kódující druhý z lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény. Tyto konstrukty mohou být současně vloženy do stejné buňky nebo mohou být vloženy do různých buněk.
V prvním případě mohou být konstrukty tvořící systém konstruktů smíseny dohromady, zatímco ve druhém případě musí být konstrukty uchovávány v separovaných kontainerech.
Kdykoliv a kdekoliv je použit, je spojovací peptid vybrán z jakékoliv aminokyselinové sekvence, která je sama o sobě flexibilní, takže se polypeptidy. navázané na tento peptid skládají po expresi přirozeným způsobem, což usnadňuje tvorbu funkčních komplexů jednořetězcových (sc) lidských MHC antigenů třídy I, zaměřovačích scFv nebo ligandu a/nebo lidských MHC MHC třídy I restrihovaných antigenů.
Jakýkoliv konstrukt nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahuje alespoň jednu cis působící regulační sekvenci operativně navázanou na kódující polynukleotidy. Výhodně je cis působící regulační sekvence funkční v bakteriích. Alternativně je cis působící regulační sekvence funkční v kvasinkách. Ještě alternativně je cis působící regulační sekvence funkční v živočišných buňkách. Ještě alternativně je cis působící regulační sekvence funkční • · · to • 4 to · · ·» v rostlinných buňkách.
Cis působící regulační sekvence může obsahovat promotor sekvence a další sekvence zesilující translaci nebo transkripci, které slouží pro usnadnění exprese polynukleotidů po jejich vložení do hostitelských buněk. Specifické příklady promotorů jsou popsány dále v příkladech provedení vynálezu v souvislosti s různými eukaryotickými a prokaryotickými expresními systémy.
Výhodné je to, že jediná cis působící regulační sekvence může být použita v konstruktu nukleové kyseliny pro řízení transkripce jediného transkriptu, který obsahuje jeden nebo více otevřených čtecích rámců. V tomto případě může být vnitřní vstupní ribozomové místo (IRES) použito tak, aby umožnilo translaci vnitřně umístěné molekuly nukleové kyseliny.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje transformovanou buňku, která obsahuje jakýkoliv z popsaných konstruktů nukleové kyseliny nebo systému konstruktů nukleové kyseliny. Buňkou může být podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu eukaryotická buňka vybraná ze skupiny zahrnují savčí buňky, hmyzí buňky, rostlinné buňky, kvasinky a protozoární buňky, nebo se může jednat o bakteriální buňku.
Při současné expresi nezávislých polypeptidů v jediné vybrané buňce musí být konstrukt nebo konstrukty konfigurovány tak, že je optimalizována úroveň exprese nezávislých polypeptidů, aby bylo dosaženo co nejvyšších poměrů finálních produktů.
Výhodně je promotorem (který je příkladem cis působící • · • · * ♦ ·
4 4 99 · * • · · 4 4 · • »' · « 4
4· «.44 44 regulační sekvence) použitým v konstruktu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu silný konstitutivní promotor, takže je po transformaci hostitelských buněk dosaženo vysoké úrovně exprese polynukleotidů.
Je třeba si uvědomit, že vysoká úroveň exprese může být také dosažena transformováním hostitelských buněk vysokým počtem kopií konstruktu nukleové kyseliny, nebo použitím cis působících sekvencí, které stabilizují výsledný transkript a také snížením degradace nebo obratu takového transkriptu.
Výraz transformovaná buňka označuje buňku, do které byla vložena exogenní molekula nukleové kyseliny která stabilně nebo dočasně geneticky mění hostitelskou buňku. Může se vyskytovat za použití přirozených nebo artificiálních podmínek za použití různých metod známých v oboru, které jsou podrobněji popsány dále v příkladech provedení předkládaného vynálezu.
Transformovanými hostitelskými buňkami mohou být eukaryotické buňky, jako jsou například savčí buňky, hmyzí buňky, rostlinné buňky, kvasinky a protozoární buňky, nebo se může jednat o bakteriální buňky.
Při použití exprese v eukaryotických hostitelských buňkách může být konstruktem nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu přenosový vektor, který se může propagovat jak v E. coli (když konstrukt obsahuje vhodný selektovatelný markér a sekvenci rozpoznávající počátek replikace), tak je kompatibilní pro expresi v eukaryotických hostitelských buňkách. Konstrukt nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být, například, plasmid, bacmid, fagemid, kosmid, fág, virus nebo artificiální chromosom.
♦ »00 • · 0 0 0 « 00 0··0·
0 0» ··
0 0 0*
Podle jiného výhodného provedení předkládaného vynálezu jsou hostitelskými buňkami savčí buňky, například kultura savčích buněk. Mezi vhodné savčí expresní systémy patří, například, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, které jsou dostupné od Invitrogen, pCI, který je dostupný od Promega, pBK-RSV a pBK-CMV, které jsou dostupné od Stratagene, pTRES, který je dostupný od Clontech, a jejich deriváty.
Kultury hmyzích buněk mohou být také použity pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Mezi vhodné hmyzí expresní systémy patří například bakulovirové expresní systémy a jejich deriváty, které jsou dostupné od mnoha dodavatelů, jako je Invitrogen (maxBac™) , Clontech (BacPak™) , nebo Gibco (Bac-to-Bac™) .
Exprese molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být také provedena v rostlinných buňkách. Termín „rostlinné buňky, jak je zde použit, označuje rostlinné protoplasty, buňky rostlinných tkáňových kultur nebo buňky celých rostlin.
Existuje mnoho metod pro vnesení konstruktu nukleové kyseliny do rostlinných buněk. Takové metody spočívají buď ve stabilní integraci konstruktu nukleové kyseliny nebo její části do genomu rostlinných buněk, nebo v dočasné expresi konstruktu nukleové kyseliny, kde v tomto případě nejsou sekvence stabilně integrovány do genomu rostlinných buněk.
Existují dvě základní metody pro dosažení stabilní genomové integrace exogenní molekuly nukleové kyseliny, jako jsou molekuly obsažené v konstruktu nukleové kyseliny podle
V Φ <« ···» • · ·· · » · φ φ * V φ ♦ · ·· * φ · φ φ • φφφφ φ φ * «* φ předkládaného vynálezu v genomu rostlinných buněk:
(i) Agrobacterium-zprostředkovaný přenos genů: Klee et al. . (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers v Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K. , Academie Publishers, San Diego, Calif. (1989) str. 2-25; Gatenby, v Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) str. 93-112.
(ii) přímé vychytávání DNA: Paszkowski et al., v Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academie Publishers. San Diego, Calif. (1989) str. 52-68; včetně metod pro přímé vychytávání DNA do protoplastů,
Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074; vychytávání DNA indukované krátkých elektrickým šokem rostlinných buněk: Zhang et al., Plant Cells Rep. (1988) 7:379-384; Fromm et al. Nátuře (1986) 319:791-793; injekce DNA do rostlinných buněk nebo tkání pomocí ostřelování částicemi, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant.
(1990) 79:206-209; použití mikropipetových systémů: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; nebo přímé inkubace DNA s germinativním pylem, DeWet et al. v
Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) str. 197-209; a Ohia, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
Agrobacteriový systém zahrnuje použití plasmidových vektorů, které obsahují definované DNA segmenty, které se integrují do rostlinné genomové DNA. Způsoby naočkování φ» · • φφφ • Φ φφφφ « · « «» * ·« ··«· »· • · · * « φ · · · · ’ • · · · · ~,c · < ♦ * ' ·· ··· ·’ rostlinné tkáně závisejí na druhu rostliny a na
Agrobacteriovém přenosovém systému. Významně rozšířeným postupem je metoda listových disků, viz například, Horsch et al. v Plant Molecular Biology Manual AS, Kluwer Academie Publishers, Dordrecht (1988) str. 1-9. Další přístupy zahrnují použití Agrobacteriových přepravních systémů s vakuovou infiltrací. Agrobacteriový systém je zejména vhodný pro přípravu stabilně transformovaných dvouděložných rostlin.
Existují různé metody pro přímý přenos DNA do rostlinných buněk. Při elektroporaci jsou protoplasty krátce vystaveny působení silného elektrického pole. Při mikroinjekci je DNA mechanicky injikována přímo do buněk za použití velmi malých mikropipet. Při ostřelování částicemi je DNA absorbována na mikroprojektily, jako jsou krystaly síranu hořečnatého, wolframové částice nebo částice zlata a mikroprojektily jsou fyzikálně akcelerovány do buněk nebo rostlinných tkání. Přímý přenos DNA může být také použit pro dočasné transformování rostlinných buněk.
Mezi vhodné rostlinné promotory, které mohou být použity pro expresi první a druhé molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách patří, například, CaMV 35S promotor, ubiquitinový promotor, a jiné silné promotory, které mohou exprimovat molekulu nukleové kyseliny konstitutivním nebo tkáňově-specifickým způsobem.
Rostlinné viry mohou být také použity jako transformační vektory. Mezi viry, o kterých se prokázalo, že mohou být použitelné pro transformaci rostlinných buněk patří, například, CaY, TMV a BV. Transformace rostlin za použití různých virů je popsána v U.S. Pat. č. 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), Japonské patentové přihlášce č. 63-14693 (TMV),
0 · · * «
• 0 00·· *· et al., Cold • 0 0 « · 0 · · » · · · » » · · · ·
ΕΡΑ 194,809 (BY), ΕΡΑ 278,667 (BY); a v Gluzman, Y. Communications in Molecular Biology: Viral Vectors,
Spring Harbor Laboratory, New York, str. 172-189 (1988). Pseudovirové částice použitelné pro expresi cizorodé DNA v mnoha hostitelích, včetně rostlin, je popsána ve WO 87/06261.
Konstrukce rostlinných RNA virů pro vložení a expresi non-virové exogenní molekuly nukleové kyseliny v rostlinách je popsána ve výše uvedených odkazech, stejně jako v Dawson, W.
O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al., EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al., Science (1986) 231:12941297; a Takamatsu et al., FEBS Letters (1990) 269:73-76.
Když je virem DNA virus, tak může být konstrukce provedena virem samotným. Alternativně může být virus nejprve klonován do bakteriálního plasmidu pro usnadnění konstrukce požadovaného virového vektoru se sekvencí nukleové kyseliny popsanou výše. Virus může být potom excidován z plasmidu.
Pokud je virem DNA virus, tak může být na virovou DNA navázána sekvence rozpoznávající počátek replikace a DNA může být potom replikována v bakteriích. Transkripce a translace této DNA produkuje obalový protein, který enkapsiduje virovou DNA.
Když je virem RNA virus, tak je virus obvykle klonován jako cDNA a je insertován do plasmidu. Plasmid je potom použit pro přípravu všech konstruktů. RNA virus se potom produkuje transkribováním virové sekvence plasmidu a translací virových genů, které produkují obalový protein, který enkapsiduje virovou DNA.
Konstrukce rostlinných RNA virů pro vložení a expresi non-virové exogenní molekuly nukleové kyseliny v rostlinách je • · a » ♦ * • · ♦ » · » » popsána ve výše uvedených odkazech, stejně jako v U.S. Pat. č. 5,316,931.
Kvasinky mohou být také použity jako hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu. V oboru je známo mnoho příkladů kvasinkových expresních vektorů vhodných pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve kvasinkách a tyto vektory jsou komerčně dostupné. Takové vektory jsou obvykle vkládány do kvasinkových hostitelských buněk chemicky nebo elektroporací, které jsou známé v oboru. Mezi dostupné systémy patří, například, pYES™ (Invitrogen) nebo YEX™ (Clontech) expresní systémy.
Je třeba si uvědomit, že při expresi v eukaryotických expresních systémech, jako jsou systémy popsané výše, konstrukt nukleové kyseliny výhodně obsahuje sekvenci kódující signální peptid, takže polypeptidy produkované z první a druhé molekuly nukleové kyseliny jsou směrovány prostřednictvím navázaného signálního peptidu do sekrečních drah. Například, v savčích, hmyzích buňkách a kvasinkách mohou být exprimované polypeptidy secernovány do kultivačního media, zatímco v rostlinných expresních systémech mohou být polypeptidy secernovány do apoplastu nebo směrovány do subcelulárních organel.
Podle v současnosti nejvýhodnějšího provedení předkládaného vynálezu je hostitelskou buňkou bakteriální buňka, jako je - například - E. coli. Bakteriální hostitelská buňka může být transformována molekulou nukleové kyseliny za použití transformačních metod známých v oboru, včetně například - chemické transformace (např., CaCl2) nebo elektroporace.
·· «♦·» ·♦ » ··· · · · ♦ · · · ftftftft· * · · · · · « « · · · · * · · · · ft · ftft·· ·· ·» ··» ·· ···· »·
V oboru jsou známé mnohé bakteriální expresní systémy, které mohou být použity pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Mezi komerčně dostupné bakteriální expresní systémy patří, například, pET™ expresní systém (Novagen), pSE™ expresní systém. (Invitrogen) nebo pGEX™ expresní systém (Amersham).
Jak je dále popsáno v příkladech provedení vynálezu, je bakteriální exprese zejména výhodná, protože exprimované polypeptidy tvoří v podstatě čistá inkluzní tělíska vhodná pro odběr a přečištění exprimovaného polypeptidů.
V jednom aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje způsob pro přípravu bakteriálních inkluzních tělísek, které jsou složeny z více než 30%, výhodně více než 50%, ještě výhodněji z více než 75%, nejvýhodněji z více než 90% hmotnostních z rekombinantního polypeptidů nebo směsi polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Izolace takových inkluzních tělísek a přečištění polypeptidů z inkluzních tělísek je podrobně popsáno v příkladech provedení vynálezu.
Jak je prokázáno v následujících příkladech provedení vynálezu může bakteriální exprese polypeptidů poskytnout vysoké kvantity čisté a funkční imunomolekuly.
V dalším aspektu předkládaného vynálezu vynález poskytuje způsob pro přípravu imunomolekuly podle předkládaného vynálezu. Způsob podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu využívá jakýkoliv popsaný konstrukt nukleové kyseliny pro expresi polypeptidů podle předkládaného vynálezu v bakteriích.
Po expresi jsou polypeptidy izolovány a přečištěny způsobem popsaným dále.
« I »1» • φ φ Φ • * φ · » • · φ · • φ φ φ • φ ♦ « φ φ · φφφ φ φ φφφφ
Jak je dále prokázáno v následujících příkladech provedení vynálezu, tvoří exprimované polypeptidy v podstatě čistá inkluzní tělíska, která jsou snadno izolována za použití frakcionačních technik dobře známých v oboru a která jsou přečištěna například za použití kroků denaturace*renaturace.
Výhodně jsou polypeptidy podle předkládaného vynálezu renaturovány a znovu složeny za přítomnosti MHC-restrihovaného peptidu, který je buď navázaný na, exprimovaný současně s nebo ve směsi s jinými polypeptidy podle předkládaného vynálezu a který je schopen vazby na jednořetězcový polypeptid MHC antigenu třídy I. Jak je prokázáno v následujících příkladech provedení vynálezu, umožňuje tento způsob přípravu v podstatě čistých komplexů MHC molekula třídy I-antigenní peptid, které mohou být dále přečištěny za použití chromatografie s vylučováním podle velikosti.
Je třeba si uvědomit, že MHC-restrihovaný peptid použitý pro opětovné skládání může být exprimován současně s antigenem (jako nezávislý peptid) nebo může být fúzovaný na rozpustný lidský polypeptid MHC třídy I v bakteriích. V takovém případě tvoří exprimovaný polypeptid a peptid současně inkluzní tělíska, která mohou být izolována a použita pro přípravu komplexů MHC antigen třídy I-antigenní peptid.
Podle dalšího aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro selektivní zabíjení buněk u pacienta, kde tyto buňky prezentují antigen (např. receptor). Způsob podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje podání imunomolekuly pacientovi, kde tato molekula obsahuje:
rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I v komplexu s MHC-restrihovaným peptidem; a zaměřovači doménu, buď • ftft· ft* « » ♦ • · · • ftftft· protilátkovou, nebo ligandovou zaměřovači doménu, která je navázaná na rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenů třídy I. Zaměřovači doména slouží pro selektivní navázání na antigen; rozpustná efektorové doména MHC antigenů třídy I v komplexu s MHC restrihovaným peptidem iniciuje CTLzprostředkovanou imunitní reakci proti buňce, čímž se dosáhne selektivního usmrcení buňky in vivo. Buňkou, která má být usmrcena, může být nádorová buňka, a v takovém případě je zaměřovači doména vybrána tak, aby se vázala na antigen asociovaný s nádorem charakteristický pro uvedenou nádorovou buňku.
Následující příklady provedení vynálezu uvádějí specifické příklady a alternativy pro různé popsané aspekty předkládaného vynálezu. Tyto příklady a alternativy nijak neomezují předkládaný vynález, který může být prováděn i jinými způsoby. Tyto příklady jsou však návodem pro odborníky v oboru, jak provádět různé alternativy a provedení předkládaného vynálezu.
Protilátky:
Termín protilátky a výraz protilátkové zaměřovači doména, jak jsou použity v popisu předkládaného vynálezu, označují intaktní molekuly, stejně jako jejich funkční fragmenty, jako je Fab, F(ab')2, Fv a scFv, které jsou schopné specifické, vysoce afinitní vazby na antigen. Tyto funkční protilátkové fragmenty jsou definovány následovně: (i) Fab, fragment, který obsahuje monovalentní vazebný fragment pro antigen protilátkové molekuly, který může být produkován trávením celé protilátky enzymem papainem za zisku intaktního lehkého řetězce a části jednoho těžkého řetězce; (ii) Fab', fragment protilátkové molekuly, který může být získán zpracováním celé protilátky pepsinem a potom redukcí, za zisku ·· ·· · . , ♦ 4 · ♦ 4 · 4
4 4 4 4 4 * · · 4 4 4 ·» 44·· ·»♦· 4·4·
4ΐ *«.**.. ♦ · ···» *« * intaktního lehkého řetězce a části těžkého řetězce; na molekulu protilátky se získají dva Fab' fragmenty; (iii)
F(ab')2/ fragment protilátky, který může být získán trávením celé protilátky enzymem pepsinem bez následné redukce; F(ab')2 je dimer dvou Fab' fragmentů, které jsou drženy pohromadě dvěmi disulfidovými vazbami; (iv) Fv, definovaný jako geneticky upravený fragment obsahující variabilní region lehkého řetězce a variabilní region těžkého řetězce exprimované jako dva řetězce; a (c) scFv nebo jednořetězcová protilátka (SCA), geneticky upravená molekula obsahující variabilní region lehkého řetězce a variabilní region těžkého řetězce, navázané na vhodný polyspojovací peptid ve formě geneticky fúzované jednořetězcové molekuly.
Způsoby přípravy takových fragmentů jsou známé v oboru.
(Viz například, Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, zde uvedeno jako odkaz).
Protilátkové fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny proteolytickou hydrolýzou protilátky nebo expresí DNA kódující fragment v E. coli nebo savčí buňce (např. kultuře ovariálních buněk čínského křečka nebo v jiných systémech pro expresi proteinů).
Protilátkové fragmenty mohou být získány pepsinovým nebo papainovým trávením celých protilátek za použití běžných metod. Například, protilátkové fragmenty mohou být produkovány enzymatickým štěpením protilátek pepsinem z zisku 5S fragmentu označovaného jako F(ab')2. Tento fragment může být dále štěpen za použití činidla redukujícího thiol a - volitelně blokováním skupiny pro sulfhydrylové skupiny vzniklé v důsledku štěpení disulfidových vazeb, za vzniku 3.5S Fab' φφ φ • φ φφ φφφφ φφ φφφ ♦ · • φφφφ · ·
• * •
• φ φφφ φφφ φ φφφ φ φφφ φφφ φφ φ monovalentních fragmentů. Alternativně, enzymatické štěpení za použití pepsinu produkuje dva monovalentní Fab' fragmenty a Fc fragment přímo. Tyto metody jsou popsány, například, v Goldenberg, U.S. Pat. č. 4,036,945 a 4,331,647, a citovaných odkazech, kde tyto patenty jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti. Viz též Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959. Další metody pro štěpení protilátek, jako je separace těžkých řetězců za vzniku monovalentních fragmentů lehkéhotěžkého řetězce, další štěpení fragmentů nebo jiné enzymatické, chemické nebo genetické techniky mohou být také použity, pokud se fragmenty váží na antigen, který je rozpoznávaný intaktní protilátkou.
Fv fragmenty obsahují asociované VH a VL řetězce. Tato asociace může být nekovalentní, jak je popsáno v Inbar et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972. Alternativně mohou být variabilní řetězce vázané intermolekulovými disulfidovými vazbami nebo zkříženě navázané pomocí chemických činidel, jako je glutaraldehyd. Výhodně Fv fragmenty obsahují VH a VL řetězce spojené spojovacím peptidem. Tyto jednořetězcové proteiny vážící antigen (sFv) se připraví pomocí konstrukce strukturálního genu obsahujícího DNA sekvence kódující VH a VL domény spojené oligonukleotidem. Strukturální gen je insertován do expresního vektoru, který je potom vložen do hostitelských buněk, jako je E. coli. Rekombinantní hostitelské buňky syntetizují jednořetězcový polypeptid se spojovacím peptidem přemosťujícím dvě V domény. Způsoby pro produkci sFvs jsou popsány, například, v Whitlow and Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77,
1993; a Ladner et al., U.S. Pat. č. 4,946,778, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.
• 99 ·
9
9 • 9 ··* * · · 9 9 «9 9*99 · 9 9 9 9999
9999 «99 ··· 99 9999 99 ·
Jinou formou protilátkového fragmentu je peptid kódující jediný komplementaritu-určujicí region (CDR). CDR peptidy (minimální rozpoznávací jednotky) mohou být získány konstrukcí genů kódujících CDR vybrané protilátky. Takové geny se připraví, například, za použití polymerasové řetězcové reakce pro syntetizování variabilního regionu z RNA buňky produkující protilátku. Viz, například, Larrick and Fry, Methods, 2:106-10, 1991.
Humanizované formy non-lidských (např. myších) protilátek jsou chimérické molekuly imunoglobulinů, imunoglobulinových řetězců nebo jejich fragmentů (jako je Fv, Fab, Fab', F(ab')2, nebo jiné antigen-vazebné subsekvence protilátek), které obsahují minimální sekvence z non-lidského imunoglobulinu. Humanizované protilátky zahrnují lidské imunoglobuliny (akceptorové protilátky), ve kterých jsou zbytky tvořící region určující komplementaritu (CDR) nahrazeny zbytky z CDR non-lidského druhu (donorové protilátky), jako je myš, králík, krysa, majícími požadovanou specificitu, afinitu a kapacitu.
V některých případech jsou zbytky Fv pracovního rámce lidského imunoglobulinu nahrazeny příslušnými non-lidskými zbytky. Humanizované protilátky mohou také obsahovat zbytky, které se nevyskytují v akceptorové protilátce ani v importovaném CDR nebo sekvenci pracovního rámce. Obecně, humanizované protilátky obsahují v podstatě všechny nebo alespoň jednu, typicky dvě, variabilní domény, ve kterých v podstatě všechny CDR regiony odpovídají regionům non-lidského imunoglobulinu a všechny nebo v podstatě všechny FR regiony jsou regiony lidské imunoglobulinové konvenční sekvence.
Humanizované protilátky optimálně také obsahují alespoň část imunoglobulinového konstantního regionu (Fc), typicky regionu lidského imunoglobulinu [Jones et al., Nátuře,
··«· ·» ·· ·· · • »··« · · · ··· · · · · · · · • · · · · · · · ··«· • · · · 9 9 9
999 ·· 9999 9 9 ·
321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nátuře, 332:323-329 (1988); a Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Způsoby pro humanizaci non-lidských protilátek jsou dobře známy v oboru. Obecně, humanizované protilátky obsahují jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložených do sebe ze zdroje, který je jiný než lidský. Tyto non-lidské aminokyselinové zbytky jsou často označovány jako importované zbytky, které typicky pocházejí z importované variabilní domény. Humanizace může být provedena způsobem podle Winter a spol. [Jones et al., Nátuře, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nátuře 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituováním CDR nebo CDR sekvencí od hlodavců za příslušné sekvence lidských protilátek. Proto jsou takové humanizované protilátky chimérickými protilátkami (U.S. Pat. č. 4,816,567), ve kterých je významně menší část než intaktní lidská variabilní doména nahrazena příslušnou sekvencí z non-lidského druhu. V praxi jsou humanizované protilátky typicky lidské protilátky, ve kterých jsou některé CDR zbytky a někdy některé FR zbytky nahrazeny zbytky z analogických míst hlodavčích protilátek.
Lidské protilátky mohou být také produkovány za použití různých technik známých v oboru, včetně fágových zobrazovacích knihoven [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Techniky podle Cole et al. a Boerner et al. Jsou také vhodné pro přípravu lidských monoklonálních protilátek (Cole et al.,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str.
(1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Obdobně může být humanizace provedena vložením lidského imunoglobulinového lokusu do transgenního zvířete, např. myši, ve kterém byly endogenní imunoglobulinové geny částečně nebo ·· ··« · • · • toto· • · ·· ···<
toto * • toto • · · to • · ··>* • •to zcela inaktivovány. Po infekci se pozoruje produkce lidských protilátek, která je podobná produkci u člověka ve všech aspektech, včetně přeskupování genů, sestavování a protilátkového repertoáru. Tento přístup je popsán, například, v U.S. Pat. č. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, a v následujících publikacích: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nátuře 368: 856-859 (1994); Morrison, Nátuře 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nátuře Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nátuře Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Imunol. 13 65-93 (1995).
Je třeba si uvědomit, že když jsou CDR protilátky identifikovány, mohou být běžné techniky genového inženýrství použity pro navržení exprimovatelných polynukleotidů kódujících jakékoliv formy nebo fragmenty protilátek, které zde byly popsány.
Ligand
Následující tabulka poskytuje příklady receptorů selektivně exprimovaných na různých nádorových buňkách, jejich ligandy a informace o sekvenci ligandů, kde tato informace o sekvenci může být použita pro konstrukci konstruktů a imunomolekul podle předkládaného vynálezu:
| Receptor | Nádor | Ligand | | Genebank přírůstk.č. i (sekvence nukl. kyseliny) | ; Genebank přírůstk.č. (aminokyselinová sekvence) |
| EGFR | prs, plíce, mozek (Niv et al Curr. | EGF | L17029 | AAB32226 |
| Pharm. Biotech. 2:19- | ||||
| 46,2002) |
·· ·»<· • 9 9 9 4
449
| PDGFR | 'vajecník, prs | PDGF | XO6374 | CAA29677 |
| Mutant EGFR | Játra,mozek | EGF | S51343 | AAB19486 |
| IL-4R | ledvina | IL-4 | M13982 | AAA59149 |
| BL-6R | myelom | IL-6 | M14584 | AAA59149 |
| IL-1GR | leukemie | IL-10 | M57627 | AAA63207 |
| EGFR | prs, vajecník, | TGFa | M31172 | AAA61157 |
| VEGFR | í ' ' . . cévy ; | VEGF | M32977 | AAA35789 |
| KDR | cévy | VEGF | M32977 | AAA35789 |
Lidský hlavní histokompatibilní komplex (MHC) třídy I:
Hlavní histokompatibilní komplex (MHC) je komplexem antigenu kódovaných skupinou vázanou v lokusech, které jsou dohromady označovány jako H-2 u myší a HLA u člověka. Existují dvě hlavní třídy MHC antigenu, třída I a třída II, která se každá skládá ze sady buněčných povrchových glykoproteinů, které mají úlohu v určování typu tkáně a transplantační kompatibility. V transplantačních reakcích reagují cytotoxické T-lymfocyty (CTL) zejména proti glykoproteinům třídy I, zatímco pomocné T-lymfocyty odpovídají zejména na cizorodé glykoproteiny třídy II.
Molekuly hlavního histokompatibilního komplexu třídy I jsou exprimovány na povrchu téměř všech buněk. Tyto molekuly působí při prezentování peptidů odvozených zejména od endogenně syntetizovaných proteinů CD8+ T-lymfocytům prostřednictvím interakcí s αβ T-lymfocytárním receptorem. Molekula MHC třídy I je heterodimer složený z 46-kDa těžkého řetězce, který je nekovalentně asociován s 12-kDa lehkým
9999
9
9 9 · · 4 · · · · • 9 999 · 9 · 9 9 9 9 • · 999 9 9 «9 9999 99 9999 999 ·· ··· *· ···· ·· ’ řetězcem β-2 mikroglobulinu. U člověka existuje několik MHC haplotypů, jako je, například, HLA-A2, HLA-Al, HLA-A3, HLAA24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 a HLA-Cw8, jejichž sekvence je uvedena v kabbat databázi, na http://imuno.bme.nwu.edu/., která je zde uvedena jako odkaz.
Peptidy, které se váží na MHC molekuly třídy I; MHCrestrihované antigeny:
MHC třídy I-restrihované peptidy (též označovány jako MHC-restrihované antigeny, HLA-restrihované peptidy, HLArestrihované antigeny), které mají obvykle délku 8-10aminokyselin, se váží na těžké řetězce al-a2 drážky prostřednictvím dvou nebo tří kotevních zbytků, které interagují s příslušnými vazebnými kapsami v MHC molekule, β-2 mikroglobulinový řetězec hraje významnou úlohu v intracelulárním transportu MHC třídy I, vazbě peptidu a v konformační stabilitě. Pro většinu molekul třídy I je pro biosyntetickouo maturaci a povrchovou expresi nutná tvorba heterodimeru skládajícího se z těžkého řetězce MHC třídy I, peptidu (vlastního nebo antigenního) a β-2 mikroglobulinu.
Pokusy týkající se vazby peptidu na MHC molekuly třídy I umožňují definování specifických MHC motivů funkčních při zobrazování peptidů odvozených od virových, nádorových a vlastních antigenů, které jsou potenciálně imunogenní a mohou vyvolat specifické reakce cytotoxických T lymfocytů (CTL).
Termín peptid, jak je zde použit, označuje přirozené peptidy (degradační produkty nebo syntetické peptidy) a také peptidomimetika, jako jsou peptoidy a semipeptoidy, které jsou peptidovými analogy, které mohou mít, například, modifikace, díky kterým jsou stabilnější v těle nebo více imunogenní. Mezi »· * ·* «·· ·♦ ·· ··· » · · · · · » · »·» · · · · « · · • · ... · · * » ···» , „ ······ ··» ·· ··♦ ♦· ···· ·· · takové modifikace patří, například, cyklizace, modifikace N konce, modifikace C-konce, modifikace peptidové vazby, včetně, například, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=CNH, CHCH nebo CF=CH, modifikace skeletu a modifikace zbytků. Způsoby přípravy peptidomimetických sloučenin jsou dobře známé v oboru a jsou popsány v Quantitative Drug Design, C.A.
Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), kde tato publikace je zde ve své úplnosti uvedena jako odkaz.
Další podrobnosti týkající se tohoto tématu jsou uvedeny dále.
Termín aminokyselina, jak je zde použit, označuje 20 přirozených aminokyselin; aminokyseliny často post-translačně modifikované in vivo, včetně například hydroxyprolinu, fosfoserinu a fosfothreoninu; a další neobvyklé aminokyseliny, včetně například kyseliny 2-aminoadipové, hydroxylysinu, isodesmosinu, nor-valinu, nor-leucinu a ornithinu. Dále termín aminokyselina označuje D- a L-aminokyseliny. Další výčet možných aminokyselin použitelných ve způsobech podle předkládaného vynálezu v peptidových antigenech rozpoznatelných HLA A2 MHC I jsou uvedeny dále.
Na základě narůstajících experimentálních dat je nyní možné určit, které peptidy proteinu se budou vázat na MHC třídy I. HLA A2 MHC třídy I byly dosud charakterizovány lépe než jiné HLA haplotypy, ačkoliv prediktivní a/nebo sporadická data jsou dostupná pro všechny další haplotypy.
Pro peptidy vážící se na HLA-A2 se předpokládají následující pozice (P1-P9) v 9-merovém peptidů:
P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9
P2 a P2 pozice obsahují kotevní zbytky, které jsou
9 9
9 ·» 9999
hlavními zbytky podílejícími se na vazbě na MHC molekuly. Aminokyseliny umístěné v pozici P2 a P9 jsou hydrofilni alifatické nenabité aminokyseliny (např. Ala, Val, Leu, Ile, Gin, Thr, Ser, Cys, výhodně Val a Leu) nebo syntetické hydrofilni alifatické nenabité aminokyseliny (např. norleucin (Nle), norvalin (Nva), kyselina α-aminomáselná). Pozice Pl a P3 také obsahují aminokyselinové zbytky, které se podílejí na nebo asistují ve vazbě na MHC molekuly, nicméně, tyto pozice mohou obsahovat jakékoliv aminokyseliny, přirozené nebo syntetické. Další pozice jsou obsazeny aminokyselinovými zbytky, které se obvykle nepodílejí na vazbě, ale jsou prezentovány buňkám imunitního systému. Další podrobnosti týkající se vazby peptidů na MHC molekuly jsou uvedeny v Parker, K.C., Bednarek, M.A., Coligan, J.E., Scheme for ranking potential HILA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide sidechains. J Immunol.152, 163-175, 1994., zejména viz tabulka V. Proto může být skórování peptidů vážících se na HLA-A2.1 provedeno za použití HLA Peptide Binding Predictions softwaru, který lze získat z internetové sítě na htt(p: //www .bimas . dort. nih.gov/molbio/hla_bind/index.html.
Tento software je založen na souhrnných datech všech možných peptidů v analyzovaném proteinu na možnou vazbu na MHC HLAA2.1 podle příspěvku každé aminokyseliny v peptidů. Teoretické vazebné skoré představuje vypočtený poločas komplexu HLA-A2.1peptid.
Hydrofilni alifatické přirozené aminokyseliny v P2 a P9 mohou být nahrazeny syntetickými aminokyselinami, výhodně Nleu, Nval a/nebo kyselinou α-aminomáselnou. P9 může být také substituovaný alifatickou aminokyselinou obecného vzorce -HN(CH2)nCOOH, kde n = 3-5, stejně jako rozvětvenými deriváty, jako je ·· ···· • · • ··· ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · · · ·· ···· ···· ···· • · ···· ··· ·· ··· ·· ···· ·· ·
-NH (CH2)n-COOH
R kde R je, například, methyl, ethyl nebo propyl, lokalizovaný v jakémkoliv jednom nebo více n uhlíkách.
Amino-koncové zbytky (pozice Pl) mohou být substituované pozitivně nabitými alifatickými karboxylovými kyselinami, jako je, například, H2N (CH2) nCOOH, kde n = 2-4 a H2N-C (NH) NH(CH2)nCOOH, kde n=2-3, stejně jako hydroxylysinem, N-methyllysinem nebo ornithinem (Orn). Dále, amino-koncové zbytky mohou být substituované velkými aromatickými zbytky, jako je, například, H2N-(CeH6)-CH2-COOH, p-aminofenylalanin, H2N-F(NH)NH-(CeHg) -CH2-COOH, guanidinofenylalanin nebo pyridinoalanin (Pal). Tyto poslední uvedené zbytky mohou tvořit vodíkovou vazbu s OH-skupinami tyrosinu na MHC-I N-koncové vazebné kapse, stejně jako mohou - zároveň - tvořit aromatickéaromatické interakce.
Derivatizace aminokyselinových zbytků v pozicích P4-P8, když mají tyto zbytky vedlejší řetězce, jako je OH, SH nebo NH2, například u Ser, Tyr, Lys, Cys nebo Orn, může být provedena za použití alkylových, arylových, alkanoylových nebo aroylových skupin. OH skupiny v těchto pozicích mohou být také derivatizovány fosforylací a/nebo glykosylací. Bylo zjištěno, že tyto derivatizace v některých případech zvyšují vazbu na Tlymfocytární receptor.
Delší deriváty, ve kterých je druhá kotevní aminokyselina v pozici P10, mohou obsahovat v P9 většinu L aminokyselin.
V některých případech jsou použitelné také kratší deriváty, ve kterých C-koncová kyselina slouží jako druhý kotevní zbytek.
• · · · · · • · · • · · · · • · · · · ····< • · · · · · ·· 9999 9 9 ·
Cyklické aminokyselinové deriváty mohou také obsazovat pozice P4-P8, výhodně pozice P6 a P7. Cyklizace může být provedena, například, tvorbou amidové vazby, např. inkorporováním Glu, Asp, Lys, Orn, kyseliny di-aminomáselné (Dab), kyseliny di-aminopropionové (Dap), do různých pozic v řetězci (-CO-NH nebo -NH-CO vazby). Cyklizace skelet-skelet může být provedena také pomocí inkorporování modifikovaných aminokyselin vzorce H-N ( (CH2) n~COOH) -C (R) H-COOH nebo H-N((CH2)n COOH)-C(R)H-NH2, kde n=l-4, a dále kde R je jakýkoliv přirozený nebo syntetický vedlejší řetězec aminokyseliny.
Cyklizace cestou tvorby S-S vazeb prostřednictvím inkorporace dvou Cys zbytků je také možná. Další cyklizace prostřednictvím vedlejších řetězců mohou být provedeny pomocí tvorby interakční vazby vzorce -(-CH2-) n -S-CH2-C-, kde η = 1 nebo 2, která je možná, například, pomocí inkorporace Cys nebo homoCys a reakce jejich volné SH skupiny s, např.
bromoacetylovaným Lys, Orn, Dab nebo Dap.
Peptidové vazby (-CO-NH-) v peptidu mohou být substituované N-methylovanými vazbami (-N(CH3)-CO-) , esterovými vazbami (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), ketomethylenovými vazbami (CO-CI2-) , α-aza vazbami (-NH-N(R)-CO-), kde R je jakýkoliv alkyl, např., methyl, karba vazbami (-CH2-NH-), hydroxyethylenovými vazbami (-CH(OH)-CH2-) , thioamidovými vazbami (-CS-NH-), olefinovými dvojnými vazbami (-CH=CH), retroamidovými vazbami (-NH-CO-), peptidovými deriváty (-N(R)CH2-CO-), kde R je normální vedlejší řetězec, přirozeně se vyskytující na atomu uhlíku.
Takové modifikace se mohou vyskytovat v jakékoliv vazbě peptidového řetězce a i několikrát (2-3) najednou. Výhodně, ale ne nutně ve všech případech, tyto modifikace vylučují • · • · · • ·· · · kotevní aminokyseliny.
Přirozené aromatické aminokyseliny, Trp, Tyr a Phe, mohou být substituované za syntetické kyseliny, jako je TIC, naftylelanin (Nol), deriváty Phe s methylovaným kruhem, halogenované deriváty Phe nebo o-methyl-Tyr.
Nádorové MHC-restrihované antigeny:
Odkazy citované v následující tabulce uvádějí příklady lidských MHC molekul třídy I, nádorových MHC-restrihovaných peptidů odvozených z antigenů asociovaných s nádorem (TAA) nebo proteinových markérů asociovaných s různými nádory. Další MHC-restrihované peptidy získané z antigenů asociovaných s nádorem (TAA) jsou uvedeny na http://www.brníheidelberg.com/syfpeithi/
| Nádor | TAA/Marker | HLA | Odkaz |
| Karcinom z přechodných buněk | Uroplakin II | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom z přechodných buněk | Uroplakin Ia | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom prostaty | jprostatický specifický i antigen | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom prostaty | prostatický specifický membránový antigen | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom prostaty | prostátická kyselá fosfatasa | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom prsu | BA-46 | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Karcinom prsu | Muc-1 | HLA-A2 | WO 00/06723 |
| Melanom | GplOO | HLA-A2 | Reference 54 |
| Melanom | MARTI | HLA-A2 | Reference 54 |
| Všechny nádory | telomerasa | HLA-A2 | Reference 54 |
| Leukemie | TAX | HLA-A2 | Reference 54 |
| Karcinomy | NY-ESO | HLA-A2 | Reference 54 |
| Melanom | MAGE-A1 | HLA-A2 | Reference 54 |
| Melanom | MAGE-A3 | HLA-A24 | Reference 54 |
| Karcinomy | HER2 | HLA-A2 | Reference 54 |
| Melanom | β-katenin- | HLA-A24 | Reference 54 |
| Melanom | ‘ tyrosinasa | HLA-DRB1 | Reference 54 |
| Leukemie | Bcr-abl | HLA-A2 | Reference 54 |
| Hlava a krk | caspasa-8 | HLA-B35 | Reference 54 |
Virové MHC-restrihované antigeny:
Odkazy citované v následující tabulce uvádějí příklady lidských MHC antigenu třídy I, virových MHC-restrihovaných peptidů získaných z virových antigenu.
| Onemocnění | Virový antigen | HLA | : Odkaz |
| AIDS (HTLV-1) | HTV-1 RT 476-484 | HLA-A2 | http://www.bmi- heidelberg.com/syfjpeith i/ |
| Chřipka | GILGFVFTL (SEQ ID NO: 16) | HLA-A2 | http://www.bmi- heidelberg.com/syfpeith i/ |
| CMV disease | CMV | HLA-A2 | http://www.bmi- heidelberg.com/syfjpeith i/ |
| Burkitův lymfom ’ | TAX | HLA-A2 | http://www.bmi- heidelberg.com/syfpeith i/ |
| Hepatitida C | HCV | HLA-A2 | httn://www.bmi- heidelberg.com/syfpeith i/ |
| Hepatitida B | HBV pre-S protein 85-66 STNRQSG RQ (SEQ ID NO: 1*7) | HLA-A2 | http://www.bmi- heidelberg.com/syfpeith i/ |
• · • ·
| HTLV-1 . , leukemie | HTLV-1 tax 11-19 | HLA-A2 | http://www.bnii- heidelberg.com/syipeith i/ |
| Hepatitida | HBV povrchový; 185-194 antigen - - - ..... ' · | HLA-A2 | http://www.bmi- heideíberg.com/syfpeiíh i/ |
Autoimunitní MHC-restrihované antigeny
Webová stránka http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/ poskytuje příklady lidských MHC antigenu třídy I, autoimunních MHC-restrihovaných peptidů odvozených z autoimunních antígenů.
Rozpustné MHC antigeny třídy I:
Sekvence kódující rekombinantní komplexy MHC třídy I a třídy II, které jsou rozpustné a které mohou být produkovány ve velkých kvantitách, jsou popsány, například, v odkazech 23, 24 a 41-53 a dále v U.S. Patentové přihlášce č. 09/534,966 a PCT/IL01/00260 (publikované WO 01/72768), které jsou zde uvedeny jako odkazy. Rozpustné MHC antigeny třídy I jsou dostupné nebo mohou být produkovány pro jakékoliv MHC haplotypy, jako je, například, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLAA24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 a HLA-Cw8, podle, například, PCT/IL01/00260, protože jejich sekvence jsou známé a mohou být zjištěny v kabátově databázi, na http://imuno.bme.nwn.edu/, kde obsah této stránky je zde uveden jako odkaz. Takové rozpustné MHC molekuly třídy I mohou být navázány na vhodné MHC-restrihované antigeny a mohou být použity pro vakcinací savců jiných než člověk, kteří nesou buňky exprimující lidský hlavní histokompatibilní komplex (MHC) třídy I, jak je popsáno dále.
• · ·· · ·
Chemické konjugáty:
V oboru je známo mnoho metod pro konjugování nebo fúzování molekul různých typů, včetně peptidů nebo polypeptidů. Tyto metody mohou být v předkládaném vynálezu použity pro konjugování rozpustné lidské efektorové domény třídy I s protilátkovou zaměřovači doménou a volitelně s MHCrestrihovaným antigenem.
Dva izolované peptidy mohou být konjugovány nebo fúzovány za použití jakékoliv metody známé odborníkům v oboru. Jeden peptid může být konjugovaný na druhý za použití Nhydroxysukcinimid-esteru kyseliny 3—(2— pyridyldithio)propionové (též označované jako N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionát) (SDPD) (Sigma, kat. č. P3415), a glutaraldehydového konjugačního procesu nebo a karbodiimidového konjugačního procesu.
SPDP konjugace:
Může být použita jakákoliv SPDP konjugační metoda známá odborníkům v oboru. Například, v jednom ilustrativním provedení je použita metoda popsaná v Cumber et al. (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224).
Peptid (1,7 mg/ml) se smísí s 10-násobným nadbytkem SPDP (50 mM v ethanolu) a protilátka se smísí s 25-násobným nadbytkem SPDP ve 20 mM fosforečnanu sodném, 0,10 M NaCI, pH 7,2 a každá reakční směs se inkubuje například po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. Reakční směsi se potom dialyzují proti PBS.
Peptid se redukuje, např. 50 mM DTT po dobu 1 hodiny při
• ft ···· • · » ftftftft • ft ·· · · teplotě místnosti. Redukovaný peptid se odsolí uvedením do rovnováhy na G-25 koloně (do 5% vzorku/objem kolony) s 50 mM KH2PO4 pH 6,5. Redukovaný peptid se smísí s SPDP-protilátkou v molárním poměru 1:10 protilátka:peptid a inkubuje se při 4 °C přes noc za vzniku konjugátu peptid-protilátka.
Glutaraldehydová konjugace:
Konjugace peptidu s jiným peptidem může být provedena za použití metod známých odborníkům v oboru za použití glutaraldehydu. Například v jednom provedení je použito metody popsané v G.T. Hermanson (1996, Antibody Modification and Conjugation, v Bioconjugate Techniques, Academie Press, San Diego).
Peptidy (1,1 mg/ml) se smísí v 10-násobném nadbytku s 0,05% glutaraldehydem v 0,1 M fosfátu, 0,15 M NaCI pH 6,8, a směs reaguje po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Pro blokování nadbytečných míst se může přidat 0.01 M lysin. Po reakci se nadbytek glutaraldehydu odstraní za použití G-25 kolony uvedené do rovnováhy pomocí PBS (10% obj./obj.
vzorku/objemu kolony).
Karbodiimidová konjugace:
Konjugace peptidu s jiným peptidem může být provedena za použití metod známých odborníkům v oboru za použití dehydratačního činidla, jako je karbodiimid. Nejvýhodněji je karbodiimid použit za přítomnosti 4-dimethylaminopyridinu. Jak je odborníkům v oboru dobře známo, může být karbodiimidová konjugace použita pro vytvoření kovalentní vazby mezi karboxylovou skupinou peptidu a hydroxylovou skupinou peptidu (za vzniku esterové vazby), nebo amino skupinou jednoho • ·
··· · φ · · · φ · • · · · ···· φφφφ • · · · · · · ··· · · ···· ·· φ peptidu (za vzniku amidové vazby) nebo sulfhydrylovou skupinou peptidu (za vzniku thioesterové vazby).
Obdobně může být karbodiimidová konjugace použita pro vytvoření analogických kovalentních vazeb mezi uhlíkem jednoho peptidu a hydroxylovou, amino nebo sulfhydrylovou skupinou jiného peptidu. Viz, obecně, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, str. 349-50 & 372-74 (3.vydání), 1985. Například může být peptid konjugován na jiný peptid prostřednictvím kovalentní vazby za použití karbodiimidu, jako je dicyklohexylkarbodiimid. Obecně jsou metody konjugace popsány v B. Neises et al. (1978, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 17:522; A. Hassner et al. (1978, Tetrahedron Lett. 4475); E.P. Boden et al. (1986, J. Org. Chem. 50:2394) a L.J. Mathias (1979, Synthesis 561).
Další předměty, výhody a nové rysy předkládaného vynálezu budou odborníkům v oboru jasné z následujících příkladů provedení vynálezu, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Dále, každé z různých provedení a aspektů předkládaného vynálezu, jak byly uvedeny výše a jak jsou uvedeny v patentových nárocích, se opírá o experimentální důkazy uvedené v příkladech provedení vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak neomezují jeho rozsah.
Použitá nomenklatura a laboratorní postupy zahrnují molekulární, biochemické, mikrobiologické a rekombinantní DNA techniky. Takové techniky jsou důkladně pospané v literatuře. Viz například Molecular Cloning:
«· ···· ., (1989); Current . I-III, Ausubel, R. Μ.,
A laboratory Manual Sambrook et al Protocols in Molecular Biology Vol ed. (1994); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodách uvedených v U.S. Pat. č. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 a 5,272,057; Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique, Fresbney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 3.vydání; Current Protocols in Imunology Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), Basic and Clinical Imunology (8.vydání), Appieton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Imunology, W. H. Freeman and Co., New York (1980); dostupné imunotesty jsou popsány v patentové a vědecké literatuře, viz, například, U.S. Pat. č. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 a 5,281,521; Oligonucleotide Synthesis Gait, M. J., ed. (4984); Nucleic Acids Hybridization Haxnes, B. D., and Higgins S. I., eds. (1985); Transcription and Translation Hames, B. D., a Higgins S. J., eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, R. I., ed.
(1986) ; Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A Practical Guide to Molecular Cloning Perbal, B., (1984) a
Methods in Enzymology Vol. 1-317, Academie Press; „PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Academie Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory ···· • »
.......
Course Manual CSHL Press (1996); kde všechny tyto publikace jsou zde uvedeny v plném znění jako odkazy. Další odkazy jsou uvedeny na jiných místech této přihlášky. Předpokládá se, že popsané postupy jsou známé v oboru a jsou uvedeny pro snadnější pochopení. Všechny informace jsou zde obsaženy jako odkazy.
Materiály a pokusné metody
Peptidy: Peptidy se syntetizovaly za použití fluorenylinethoxykarbonylových činidel přečištěných na >95% HPLC s reverzní fází. Použitými HLA-A2-restrihovanými peptidy asociovanými s nádory byly: G9-209-2M (IMDQVPFSV, SEQ ID NO:8) a G9-280-9V (YLEPGPVTV, SEQ ID NO:9), oba z melanomového diferenciačního antigenů gplOO a oba jsou imunodominantními epitopy (32-34). Tyto peptidy jsou modifikované v MHC vazebných pozicích 2 (v G9-209-2M) a 9 (v G9-280-9V) pro zlepšení jejich vazebné afinity k HLA-A2 (27). Peptid odvozený z HTLV-1 (LLFGYPVYV, SEQ 10) NO:10) se použil jako kontrola.
Buněčné linie: A431, ATAC4 (epidermoidní karcinom), HUT102W a CRII-2 (leukemie, ATL) buňky se uchovávaly v RPMI ± 10% FCS. ATAC4 buňky jsou lidské A£31 buňky epidermoidního karcinomu stabilně transfektované α-podjednotkou IL-2 receptorů (p55, Tac, CD25) (53). Transfektované buňky se uchovávaly v kultivačním mediu obsahujícím 500 pg/ml G418 (Gibco-BRL).
Plasmidové konstrukty: scMHC molekula se konstruovala způsobem popsaným dříve navázáním lidského 32-mikroglobulinu na tři extracelulární domény HLA-A2 genu (24, 25, WO 01/72768). Geny VL(cys) a VH(cys) variabilní domény anti-Tac MAb se konstruovaly způsobem popsaným dříve za vzniku anti-Tac dsFv molekuly, ve které dvě variabilní domény drží pohromadě a jsou
4444 » 4 4 ·· ·4 ·· · • · 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4 •4 4 · 4« 44444 · · 4 4 4
4444 44 4 stabilizovány meziřetězcovou disulfidovou vazbou vloženou do konzervovaných zbytků pracovního rámce (29, 30). Při konstrukci scMHC-aTacVL molekuly se C-konec scMHC molekuly napojil na N-konec anti-Tac VL za použití flexibilní spojovací skupiny délky 15 zbytků (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO:3). PCR amplifikované cDNA obou molekul se použily ve dvoustupňové PCR přesahové extenzní reakci, ve které se 3'-konec scMHC navázal na 5'-konec VL genu. V prvním kroku se dvě třetiny spojovací sekvence a klonovací místa vnesly do jednoho z genů za použití oligonukleotidů: scMHC-5:
5'GGAAGCGTTGGCGCATATGATCCAGCGTACTCC-3' (SEQ ID NO:11) a scMHC3: 5'-TCCTGAACCTCCGCCACCGGACCCTCCTCCGCCCTCCCATCTCAGGGT-3' (SEQ ID N0:12), které vkládají Ndel restrikční místo na 5'-konec scMHC genu a dvě třetiny spojovací sekvence na 3'-konec. AntiTac VL gen se PCR amplifioval s oligonukleotidy: VL-Tac-5: 5'TCCGOTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGCAAATTGTTCTCACC-3' (SEQ ID NO:13) a VL-Tac-3: 5'-GCAGTAAGGAATTCAITTAGAGCTCCAGCTTGGT-3' (SEQ ID NO:14) pro vložení dvou třetin spojovací sekvence na 5'-konec VL genu a EcoRI klonovacího místa na 3'-konec. Ve druhém kroku se dva PCR produkty kombinovaly v poměru 1:1 (po 50 ng) za vzniku PCR přesahové extenzní reakce za použití primerů scMHC-5 a VL-Tac-3 pro sestavení scMHC-aTacVL konstruktu. PCR produkt se potom subklonoval do pET-expresního vektoru pULI? (49) za použití Ndel a EcoRI restrikčních míst. Anti-Tac VH gen pro vytvoření anti-Tac dsFv fragmentu se subklonoval do pULI7, jak bylo popsáno výše (29).
Exprese, složení a přečištění B2M-aTac(dsFv)-peptidových komplexů: Složky B2M-aTac(dsFv); scMHC-aTacVL a aTac VH, se exprimovaly v samostatných BL21 (λϋΕ3) buňkách (Novagen, Madison, WI). Po indukci IPTG se velká množství nerozpustného rekombinantního proteinu akumulovala v intracelulárních inkluzních tělískách. Inkluzní tělíska každé složky se
9
9999 99 99
9 9 9 9 9 9
9 999 9 9 · 9 9 9 9 l 9 9 9 9 9 9999 9999
9 9 9 9 9 9 9 · 61 ..............
izolovala a přečistila se z indukovaných BL21 buněk způsobem popsaným dříve (29,49). Stručně, rozrušení buněk se provedlo s 0,2 mg/ml lysozymu a potom 2,5 % TRITON X-100 a 0,5 M NaCI. Pelety inklúzních tělísek se odebraly pomocí odstředění (13,000 RPM, 60 minut při 4 °C) a promyly se 3-krát 50 mM Tris pufrem, pH 7,4, obsahujícím 20 mM EDTA. Exprese každé složky rekombinantního proteinu v izolovaných a přečištěných inklúzních tělískách se určila analyzováním vzorku SDS-PAGE, jak je uvedeno na obr. 2B. Izolovaná a přečištěná inkluzní tělíska se solubilizovala v 6 M guanidin-HCl, pH 7,4, a potom se provedla redukce 65 mM DTE. Solubilizovaná a redukovaná inkluzní tělíska scMHC-aTacVL a aTacVH, smísená v molárním poměru 1:2, se znova skládala naředěním 1:100 do „redoxshuffling pufrovacího systému skládajícího se z 0,1 M Tris, 0,5 M argininu, 0,09 mM oxidovaného glutathionu, pH 10,0, za přítomnosti 5-10-násobného molárního nadbytku HLA-A2restrihovaných peptidů. Konečná koncentrace proteinu po znovusložení byla 50 μg/ml. Po složení se protein dialyzoval proti 100 mM močoviny, 20 mM Tris, pH 7,4, a potom se provedlo přečištění rozpustných komplexů scMHC-aTac(dsFv)-peptid za použití iontoměničové chromatografie na Q Sepharosové koloně (7,5 mm vnitřní průměr x 60 cm délka, Pharmacia), za použití gradientu solí (NaCI) (0-0,4 M). Frakce z píku obsahujícího scMHC-aTac(dsFv) se potom zpracovaly chromatografií s vylučováním podle velikosti (TSK3000) pro další přečištění a výměnu pufru na PBS.
ELISA : Imunoplotny (Falcon) se potáhly 10 μρ/ml přečištěného p55 antigenu (přes noc při 4 °C) . Plotny se blokovaly pomocí PBS obsahujícího 2% odstředěné mléko a potom se inkubovaly s různými koncentracemi B2M-aTac(dsFv)-peptid (90 minut při teplotě místnosti. Vazba se detekovala za použití anti-HLA protilátky závislé na konformaci W6/32 (60 ·· ···· • · • · · • ·♦·* • ·
Reakce se vyvíjela za
Králičí anti-Tac • ··· · • · · ♦ ·· ···« minut, teplota místnosti, 10 pg/ml) použití anti-myšího IgG-peroxidasy.
protilátka se použila jako pozitivní kontrola a potom se přidala anti-králičí peroxidasa.
Průtoková cytometrie: Buňky se inkubovaly s komplexy B2MaTac(dsFv)-peptid (60 minut při 4 °C ve 300 μΐ, 25 pg/ml), promyly se a inkubovaly se s anti-HLA-A2 MAb BB7.2 (60 minut při 4 °C, pg/ml). Detekce se provedla s anti-myší FITC. Lidská anti Tac (10 pg/ml) se použila jako pozitivní kontrola pro stanovení exprese p55 antigenu a potom se provedla inkubace s anti-lidskou FITC značenou protilátkou. Buňky se potom promyly a analyzovaly se za použití Beckman FACScaliber průtokového cytometru.
CTL klony a stimulace: CTL klony specifické pro peptidy odvozené od melanomového gplOO peptidu se získaly od Drs. Steven Rosenberg a Mark Dudley, Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH. Tyto CTL klony se získaly z kultur PBMC od pacientů imunizovaných peptidem (26). CTL klony se expandovaly inkubací s ozářenými melanomovými FM3D buňkami (jako zdroji antigenu) a s EBV-transformovanými JY buňkami (Blymfoblasty jako antigen-presentující buňky). Stimulační směs obsahovala také OKT3 protilátky (30 ng/ml) a 50 IU/ml IL-2 a IL-4.
Testy cytotoxicity: Cílové buňky se kultivovaly v 96jamkové plotně (2-5xl03 buněk na jamku) v RPMI+10 FCS. Buňky se promyly a inkubovaly se s methioninem a bezsérovým mediem po dobu 4 hodin a potom se provedla inkubace (přes noc) s 15 μΰί/ιηΐ 35S-methioninu (NEN) . Po 3 hodinové inkubaci s komplexy B2M-aTac(dsFv)-peptid (při 37 °C, 10-20 pg/ml) se přidaly efektorové CTL buňky v uvedeném poměru cílových/efektorových ·· · · · · ·· φφ • · · ···· ··· *···· ·· · φφφ • · ···· ····· • · φφφφ «·
·.·.» ...... ·· buněk a provedla se inkubace po dobu 8-12 hodin při 37 °C. Po inkubaci se měřilo uvolňování 35S-methioninu z cílových buněk v 50 μΐ vzorku supernatantu kultury. Všechny testy se provedly trojmo. Procento specifické lýzy se vypočetlo následujícím způsobem: [(pokusné uvolnění — spontánní uvolnění)/(maximální uvolnění — spontánní uvolnění)]xlOO. Spontánní uvolnění se měřilo jako uvolnění 35S-methioninu z cílových buněk za nepřítomnosti efektorových buněk a maximální uvolnění se měřilo jako uvolnění 35S-methioninu z cílových buněk lyžovaných 0,1 M NaOH.
Výsledky pokusů
Návrh B2M-antiTac(dsFv): Nedávno se připravil konstrukt kódující rozpustný jednořetězcový MHC (scMHC), ve kterém je gen pro lidský P2-mikroglobulin navázaný na tři extracelulární domény (al, a2 a a3) genu pro těžký řetězec HLA-A2 (aa 1-275) přes 15-aminokyselin dlouhý spojovací peptid (24, 25 a WO 01/72768, které jsou zde uvedeny jako odkazy). Tyto scMHC molekuly se exprimovaly v E. coli jako intracelulární inkluzní tělíska a po in vitro znovusložení za přítomnosti HLA-A2restrihovaných peptidů asociovaných s nádory nebo viry vytvářely správně složené a funkční komplexy a tetramery scMHC-peptid (24, 25, WO 01/72768). Tyto komplexy scMHC-peptid byly podrobně charakterizovány na biochemické a biofyzikální charakteristiky, stejně jako na biologickou aktivitu, a bylo zjištěno, že jsou funkční (24, 25, WO 01/72768).
Nejdůležitější je to, že jsou schopny vázat se na nádorově specifické CTL linie a klony. Na obr. 1A-H je popsána konstrukce a reaktivita těchto komplexů scMHC-peptid, ve formě scMHC tetramerů, s CTL specifickými pro epitopy melanomového diferenciačního antigenů gplOO G9-209M a G9-280V (26). Tyto peptidy jsou modifikovány na MHC kotvících pozicích 2 (v G9• · · · · · · · · · aa · aaa aa·· ··· aaa·· aa a aaaa a a aaa a a «a · · a a a a a a · a a·»
....... ···· ·· ·
209M) a 9 (v G9-280V) pro zlepšení jejich vazebné afinity k HLA-A2 (27). CD8+ CTL klony (Obr. IA a ID) R6C12 a R1E2 se barvily intenzivně (80-95%) a specificky s scMHC tetramery obsahujícími G9-209M a G9-280V, v příslušném pořadí (Obr. IB a IE). Jako kontrola specificity se G9-209M-specifické R6C12 a G9-280V-specifické R1E2 CTL nebarvily G9-280V a G9-209M scHLAA2 tetramery, v příslušném pořadí (Obr. IC a 1F). Tyto CTL také reagovaly s podobnou intenzitou s přirozenými nemodifikovanými epitopy G9-209 a G9-280 (data nejsou uvedena).
Pro přípravu B2M-aTac(dsFv) molekuly, která cílí scMHC molekulu na buňky prostřednictvím protilátkového Fv fragmentu se C-konec HLA-A2 genu fúzoval s genem lehkého řetězce variabilní domény (VL) humanizované anti CD25 (též známé jako Tac, p55, IL-2R a podjednotka) monoklonální protilátky antiTac (28) (Obr. 2A). Variabilní doména těžkého řetězce (VH) je kódovaná jiným plasmidem za vzniku disulfidovou vazboustabilizovaného Fv protilátkového fragmentu (dsFv), ve kterém drží VH a VL domény pohromadě a jsou stabilizované meziřetězcovou disulfidovou vazbou zapracovanou mezi strukturálně konzervované zbytky pracovního rámce Fv (Obr. 2A,
2E a 2F) (29,30). Pozice, do kterých jsou umístěné cysteinové zbytky, byly identifikovány počítačovým molekulárním modelováním; protože jsou umístěny v pracovním regionu VH a VL, mohou být tyto pozice použity jako obecná místa pro stabilizování všech Fv bez potřeby dalších informací o struktuře. V posledních několika letech bylo konstruováno mnoho dsFv, které byly důkladně charakterizovány a bylo zjištěno, že jsou extrémně stabilní a s vazebnou afinitou stejně dobrou jako jiné formy rekombinantních protilátek a v mnoha případech s vazebnou afinitou ještě lepší (30, 31).
• · · 0 · · · • · · * · · · • · · · · · · • 0 0 · · · · · · ® • · · ·
« · · ··
Konstrukce, exprese a přečištění B2M-antiTac(dsFv): Pro přípravu B2M-aTac(dsFv) molekuly se připravily dva expresní plasmidy na bázi T7 promotoru (viz též oddíl materiály a metody); scMHC molekula fúzovaná na anti-Tac VL doménu (B2MaTacVL) je kódovaná jedním plasmidem a anti-Tac VH doména je kódovaná druhým. V obou plasmidech VL a VH domény obsahují cystein, který byl vložen místo konzervovaného zbytku pracovního rámce za vzniku dsFv fragmentu (30). Expresní plasmid pro B2M-aTacVL byl připraven překrývající se extenzní PCR reakcí, ve které byly HLA-A2 a VL geny navázané flexibilním spojovacím peptidem délky 15-aminokyselin [(gly4ser)3, (SEQ ID NQ:3)], který je identický jako spojovací peptid použitý pro navázání p2-mikroglobulinu a HLA-A2 genů v scMHC konstruktu (24, 25, WO 01/72768). Konstrukce expresního plasmidu pro anti-Tac VH doménu byla popsána dříve (29) . Dva plasmidy se exprimovaly samostatně E. coli BL21 buňkách. Po indukci IPTG se velká množství rekombinantního proteinu akumulovala v intracelulárních inkluzních tělískách. SDS-PAGE analýza izolovaných a přečištěných inkluzních tělísek prokázala, že rekombinantní proteiny správné velikosti tvoří 80-90 % celkového proteinu inkluzních tělísek (Obr. 2B). Inkluzní tělíska každé složky se separovala samostatně, solubilizovala se, redukovala se a znovu se složila v renaturačním pufru, který obsahoval „redox-shuffling a přísady bránící agregaci, za přítomnosti HLA-A2-restrihovaných peptidů získaných z T-lymfocytárních epitopů G9-209M a G9-280V melanomového diferenciačního antigenu gplOO (32-34, 27). Solubilizované a redukované složky, B2M-aTacVL a anti-TacVH, se smísily v molárním poměru 1:2 za přítomnosti 100-násobného nadbytku HLA-A2 restrihovaných peptidů. Bylo zjištěno, že scMHC-peptidové komplexy a protilátkové Fv-fúzní proteiny generované dříve za použití tohoto protokolu pro opětovné složení jsou složené správně a že jsou funkční (24, 25, 30).
9· 9 9 99
999 9999 999
9999 9 9 < 9 999 :· 9 9 · 9 9 99 99999
9 9 9 9 *99 (rf) 99 9 99 «* 9 9 99 9 9 9
B2M-aTac(dsFv)/peptidové molekuly (komplexy) se přečistily z roztoku pro skládání pomocí iontoměničové chromatografie za použití Q-Sepharosové kolony. Jak je uvedeno na obr. 2C, ukázala neredukční SDS-PAGE analýza frakcí eluovaných z MonoQ kolony přítomnost monomerních B2M-aTac(dsFv) molekul se správnou molekulovou hmotností přibližně 67 kDa. Tyto frakce obsahovaly také B2M-aTacVL jednodoménové molekuly, které nebyly spárované s VH. Tyto jednodoménové B2M molekuly jsou obtížně separovatelné od B2M-dsFv molekul proto, že - jak bylo dříve prokázáno pro jiné dsFv-fúzní proteiny - skládání VLfúzí je velmi účinné a produkt je dosti rozpustný. Nicméně, kontaminace jednodoménovou B2M molekulou neinterferuje s následnou analýzou rozpustné B2M-aTac(dsFv) molekuly. Pro potvrzení správné formy dsFv fragmentu se provedla redukční SDS-PAGE analýza, ve které byla B2M-dsFv molekula separována od svých složek. Na obr. 2D je uvedena molekulová forma B2MMaTac(dsFv) po redukci obsahující B2M-aTacVL a VH doménu.
V každém případě musí být jiné techniky separování podle velikosti použity pro přečištění B2M-aTac(dsFv) molekuly tak, aby bylo dosaženo homogenity.
Schopnost vazby B2M-aTac(dsFv) na cílový antigen, apodjednotku IL-2 receptoru (p55), se testovala nejprve ELISA za použití přečištěného p55. Pro sledování vazby přečištěné B2M-aTac(dsFv) na jamky potažené p55 se použila monoklonální protilátka w6/32, která rozpoznává HLA molekuly pouze tehdy, když jsou správně složené a obsahují peptid. Jak je uvedeno na obr. 2E, B2M-aTac(dsFv) se váže v závislosti na dávce na p55, což naznačuje, že dvě funkční domény molekuly, scMHC efektorová doména a protilátkové dsFv zaměřovači doména, jsou složeny správně, což ukazuje na schopnost vazby dsFv skupiny na cílový antigen a na rozpoznávání scMHC konformačněspecifickou anti-HLA protilátkou.
• · ♦ · ···· · · · · • ftft · · · · ft · · ft ft··· · s · · ftftft · ftftft ft ft ftft ftft··· • ft ft ftftft ftftft ft· ftftft ft> ftftftft ftft ft
Vazba B2M-aTac(dsFv) na cílové buňky: Pro testování schopnosti B2M-aTac(dsFv) molekuly potahovat a cílit HLA-A2peptidové komplexy na nádorové buňky se pomocí průtokové cytometrie testovala vazba této molekuly na HLA-A2 negativní nádorové buňky. Za prvé, použily se A431 lidské buňky epidermoidního karcinomu, které se stabilně transfektovaly p55 genem (ATAC4 buňky) (35) a testovalo se barvení transfektovaných versus non-transfektovaných buněk. Vazba B2MaTac(dsFv) na buňky se sledovala za použití anti-HLA-A2 MAb BB7.2 a FITC-značené sekundární protilátky. Exprese p55 cílového antigenů se detekovala úplnou anti-Tac monoklonální protilátkou, ze které byl dsFv fragment odvozen. Jak je uvedeno na obr. 3A, A431 buňky neexprimují p55, zatímco p55transfektované ATAC4 buňky exprimují vysoké hladiny antigenů (Obr. 3B). Ani jedna buněčná linie nebyla HLA-A2 pozitivní (Obr. 3C a 3D). Při testování vazby B2M-aTac(dsFv) na tyto buňky (Obr. 3C a 3D) se zjistilo, že ATAC4 buňky mají pozitivní anti-HLA-A2 barvení pouze tehdy, když jsou preinkubované s B2M-aTac(dsFv) (Obr. 3D), zatímco A431 buňky jsou negativní i tehdy, když jsou preinkubované s B2MaTac(dsFv).
Potom se testovala vazba B2M-aTac(dsFv) na leukemické buňky, které - jak je uvedeno na obr. 3E - exprimují p55 antigen, ale postrádají HLA-A2 expresi (Obr. 3F). Jak je uvedeno na Obr. 2F, ATL leukemické HUT102W buňky exprimující p55 mají pozitivní anti-HLA-A2 barvení, když jsou preinkubované s B2M-aTac(dsFv). Podobné výsledky byly pozorovány tehdy, když byly leukemické (ATL) p55-pozitivní, HLA-A2-negativní CRII-2 buňky preinkubované s B2M-aTac(dsFv) molekulou (data nejsou uvedena). Tyto výsledky ukazují, že B2M-aTac(dsFv) se může vázat na antigen, jak je zobrazován ve c · ©· ···· «· ti • ♦ · · · · 9 ··# » » · · · · · · · · · · • · · » · · < · · · ···« ······»·· ·· ·· “ ·*” ·· · své nativní formě na povrchu buněk. Nejvýznamnější je to, že B2M-aTac(dsFv) může být použit pro potažení HLA-A2 negativních buněk způsobem, který je zcela závislí na specificitě tumorzaměřovacího protilátkového fragmentu, což z těchto buněk činí HLA-A2 pozitivní buňky.
Indukce B2M-aTac(dsFv)-zprostředkované citlivosti na CTL lýzu:
Pro testování schopnosti B2M-aTac(dsFv) potencovat citlivost HLAA-A2 negativních buněk na usmrcování CTL buňkami se radioaktivně značené cílové buňky nejprve inkubovaly s B2MaTac(dsFv) a potom se testovaly v testu uvolňování 35Smethioninu za přítomnosti CTL specifických pro HLA-A2restrihovaný melanomový gplOO-peptid. Jak je uvedeno na obr. 4A, B2M-aTac(dsFv) indukuje účinnou CTL-zprostředkovanou lýzu p55-pozitivních HLA-A2 negativních ATAC4 buněk, zatímco stejná B2M-aTac(dsFv) molekula nemá žádný efekt a neindukuje lýzu A431 buněk, které neexprimují antigen. A431 a ATAC4 buňky samotné nevykazují žádnou CTL-zprostředkovanou lýzu (obr. 4A) . Inkubace ATAC4 buněk s scMHC samotným, nefúzovaným na dsFv zaměřovači skupinu, nebo s anti-Tac protilátkovou, nevedla k žádné detekovatelné potenciací CTL-zprostředkované lýzy (data nejsou uvedena). Kapacita CTL specifických pro G9-209Mpeptid v usmrcování ATAC4 buněk preinkubovaných s B2MaTac(dsFv) (ale ne A431 buněk) byla stejně dobrá - a v mnoha pokusech lepší - než schopnost těchto CTL lyžovat melanoové FM3D buňky, které exprimuji vysoké hladiny HLA-A2 a gplOO melanomového diferenciačního antigenů (36) (Obr. 4B). Pro demonstrování specificity B2M-aTac(dsFv)-zprostředkovaného CTL zabíjení pro HLA-A2-restrihovaný antigenní peptid použitý při skládání B2M-aTac(dsFv) molekuly se použily dva CTL klony specifické pro gplOO hlavní T-lymfocytární epitopy (39-209M a ·· • · ··
G9-280V. Jak je uvedeno na obr. 4C, p55-pozitivní, HLA-A2negativní ATAC4 buňky byly lyžovány G9-209M-peptid-specifickým CTL klonem R6C12 pouze tehdy, když byly preinkubované s B2MaTac(dsFv) znovu složeným s G9-209M peptidem, ale ne s G9-280V epitopem odvozeným ze stejného melanomového diferenciačního antigenu, ani s B2M-aTac(dsFv) znovu složeným s HTLV-1 HLA-A2restrihovaným T-lymfocytárním epitopem TAX. Obdobně, ATAC4 buňky byly usmrcovány G9-280V-specifickým CTL klonem R1E2 pouze tehdy, když byly preinkubované s B2M-aTac(dsFv) znovu složeným s G9-280V epitopem, ale ne s G9-209M nebo TAX peptidy (Obr. 4D) . Potom se testovala B2M-aTac(dsFv)-zprostředkovaný CTL lýza HLA-A2 negativních leukemických buněk HUT102W a CRII2 exprimujících p55. Jak je uvedeno na obr. 4E, HUT102W a CRII-2 nebyly citlivé na lýzu HLA-A2-restrihovanými CTL klony R6C12 a RIE2, specifickými pro G9-209M a G9-280V gplOO peptidy, v příslušném pořadí. Nicméně, když byly tyto p55pozitivní, HLA-A2- negativní cílové buňky preinkubované s B2MaTac(dsFv) molekulou, byla pozorována významná potenciace CTLlýzy, která byla specifická pro gplO peptidy přítomné v B2MaTac(dsFv) komplexu (Obr. 4E). HUT102W buňky potažené B2MaTac(dsFv) byly účinně usmrcovány G9-209M a G9-280V peptidspecifickými R6C12 a R1E2 CTL klony, v příslušném pořadí, a CRII-2 buňky byly lyžovány R1E2 CTL klonem. Kontrolní nonmelanomové HLA-A2 pozitivní a negativní cílové buňky, které neexprimují p55, nevykazovaly žádnou citlivost.k lýze pro melanom-specifickými CTL klony, ať byly či nebyly potaženy B2M-aTac(dsFv) molekulou (data nejsou uvedena). Tyto výsledky jasně ukazují, in vitro, že představa, že B2M-aTac(dsFv) konstrukt může být použit pro protilátkou-řízené, na nádorový antigen cílené zaměření MHC-peptidových komplexů na nádorové buňky, které by je učinilo citlivými na lýzu relevantními CTL, vede k potenciaci protinádorových imunitních reakcí.
• · ·* ·· 9t ·» 4
4 9 9 4 9 4 » ·· • ···· · · * 4 9 9 9
9 4 4 9 9 9 9 9 9 444
9 4 4 9 9 4 9 4 “ ’·’
In vivo aktivita B2M-aTac(dsFv):
Pro prvotní hodnocení in vivo aktivity B2M-aTac(dsFv) v lidském nádorovém modelu se provedl test „win-typ, ve kterém byly ATAC4 buňky smíseny s R6C12 CTL specifickými pro peptid odvozený od G9-209M gplOO za přítomnosti nebo absence B2M-aTac(dsFv) molekuly. Směs se podkožně injikovala holým myším a sledovala se tvorba lidských xenotransplantátů na zvířecím modelu. Jak je uvedeno na obr. 5, ATAC4 buňky tvořily xenotransplantáty u holých myší za 10-12 dnů po injekci.
Směs ATAC4 a R6C12 CTL neměla žádný významný vliv na růst nádoru. Nicméně, když se ATAC4 buňky exprimující IL2 receptor smísily s B2M-aTac(dsFv) a R6C12 CTL, byla pozorována kompletní inhibice růstu nádoru, což ukazuje na účinnou B2MaTac(dsFv)-indukované, CTL zprostředkované zabíjení ATAC4 cílových buněk in vivo. Výsledky získané in vitro (Obr. 4A-E) potvrdily, že množství B2M-aTac(dsFv) a poměr efektorových a cílových buněk použité pro in vivo test vedly k maximální lýze ATAC4 cílových buněk (95-100% usmrcení). Původní IL-2 receptor negativní A431 buňky smísené s R6C12 CTL za přítomnosti nebo absence B2M-aTac(dsFv) tvořily nádory a nebyl pozorován žádný efekt na růst nádorů.
Je třeba si uvědomit, že některé rysy předkládaného vynálezu, které jsou popsány v samostatných provedeních, mohou být také popsány v souvislosti s jednotlivými provedeními, mohou být také uvedeny jako samostatná provedení. Naopak, různá provedení, která jsou lepší pochopení popsána samostatně, mohou být také poskytnuta v jakékoliv vhodné kombinaci.
Ačkoliv byl předkládaný vynález popsán na specifických • ··· · · • ♦ · » φ φ · φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φφφ « φ φφφ φ φ φφ φφφφφ φφφφφ «·φ·φφ «φ · provedeních, je jasné, že existují mnohé alternativy, modifikace a variace. Předkládaný vynález zahrnuje všechny takové alternativy, modifikace a variace, a tyto spadají do rozsahu připojených patentových nároků. Všechny zmíněné publikace, patenty a patentové přihlášky jsou uvedeny ve své úplnosti jako odkazy. Dále, uvedené odkazy neznamenají, že by předměty předkládaného vynálezu byly v oboru dostupné již dříve.
• *
9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 9 9 999
9 9 9 9 * Λ 9 · ·*«*
999 99
Citované odkazy (další odkazy citované v textu)
1. Gilboa, E. (1999) How tumors escape immune destruction and what we can do about it. Cancer Immunol Immunother. 48, 343-5
2. Seliger B, Maeurer MJ, Ferrone S (2000) Antigenprocessing machinery breakdown and tumor growth. Immunol Today. 21,455-64.
3. Garrido F, Algarra I. (2001) MFIC antigens and tumor escape from immune surveillance. Adv Cancer Res.;83:1 17-58.
4. Ferrone 5, Finerty IF, Jaffee EM, Nabel GJ. (2000) How much longer will tumour cells fool the immune systém? Immunol Today. 21,70-2.
5. Marincola FM, Jaffee EM, Hicklin DJ, Ferrone 5. (2000)
Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance. Adv Immunol. 74,181-273.
6. Rosenberg, S.A. (2001) Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nátuře 411,380-4
7. Lee, P.P. et al. (1999) Characterization of circulating T-cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients. Nat. Med. 5,677-685.
8. Mocellin S, Wang E, Marincola FM. (2001) Cytokines and Immune Response in the Tumor Microenvironment. J. Immunother.
24, 392-407.
9. Offringa, R., van der Burg, S.H., Ossendorp, F. Toes, R.E., & Melief, C.J. Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against cancer. (2000) Curr Opin Immunol 12,576-82.
10. Esche, C., Shurin, M.R., Lotze, M.T., (1999) The use of dendritic cells for cancer vaccination. Curr Opin Mol Ther • · * » • · · · · · · » ♦ · · ··«· · · « · ♦ · · · · * · 9 · · • » » * · 9 9 · » · · · · 9
I, 72-81
11. Wang Ε, Phan GQ, Marincola FM. (2001) T-celldirected cancer vaccines: the melanoma model. Expert Opín Biol Ther.l, 277-90.
12. Boon, T., & van der Bruggen, P. (1996) Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J. Exp Med 183,725-9.
13. Renkvíst, N.,Castelli, C., Robbins, PF, & Parmiani,
G. (2001) A listing of human tumor antigens recognized by Tcells. Cancer Immunol Immunother 50, 3-15
14. Ferrone S, Marincola FM. (1995) Loss of HLA class I antigens by melanoma cells: molecular mechanisms, functional significance and clinical relevance. Immunol Today. 16,487-94.
15. Hicklin DI, Marincola FM, Ferrone S. (1999) HLA class I antigen downregulation in human cancers: T-cell immunotherapy revives an old story. Mol Med Today 5, 178-86.
16. Mendez R, et al. (2001) Analysis of HLA class I expression in different metastases from two melanoma patients undergoing peptide immunotherapy.Tissue Antigens. 57, 508-19.
17. Reál LM, (2001) et al., Multiple mechanisms of immune evasion can coexist in melanoma tumor cell lineš derived from the same patient. Cancer Immunol Immunother. 49, 621-8.
18. Restifo NP, Marincola FM, Kawakami Y, Taubenberger
J, Yannelli JR. Rosenberg SA. (1996) Loss of functional beta 2-microglobulin in metastatic melanomas from five patients receiving immunotherapy. J Nati Cancer Inst. 88, 100-8.
19. Seliger B, Maeurer MI, Ferrone S. (1997) TAP off— tumors on. Immunol Today 18, 292-9.
20. Vitale M, et al., (1998) HLA class I antigen and transportér associated with antigen processing (TAP1 a TAP2) down-regulation in high-grade primary breast carcinoma lesions. Cancer Res. 58,737-42.
21. Iohnsen A, France I, Sy MS, Harding CV. (1998) Downregulation of the transportér for antigen presentation, ·· φ··· φ· « · φφφ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φφφ» « • «I φ φ φφφ φφφφφ φφ φφφ φ · φφφ proteasome subunits, and class I major histocompatibility complex in tumor cell lineš. Cancer Res. 58,3660-7.
22. Hudson PJ, Souriau C. (2001) Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy.Expert Opin Biol Ther.1,84555.
23. Cheng JD, Rieger PT, von Mehren M, Adams GP, Weiner LM. (2000) Recent advances in immunotherapy and monoclonal antibody treatment of cancer. Semin Oncol Nurs. 16,2-12.
Denkberg, G., Cohen,C.J., Segal,D., Kirkin,A.F. &
Reiter,Y. (2000) Recombinant human single-chain MHC-peptide complexes made from E. coli by in vitro refolding: functional single-chain MHC-peptide complexes and tetramers with tumor associated antigens. Eur. J Immunol. 30, 3522-3532.
25. Denkberg, G., Cohen, C.J., & Reiter, Y. (2001) Critical role for cd8 in binding of mhc tetramers to tcr: cd8 antibodies block specific binding of human tumor-specific mhcpeptide tetramers to TCR. J Immunol. 167,270-6
26. Dudley,M.E., Ngo,L.T., Westwood,J., Wunderlich,J.R. & Rosenberg, S.A. (2000) T-cell dones from melanoma patients immunized against an anchor-modified gplOO peptide display discordant effector phenotypes. Cancer J. 6,69-77
27. Parkhurst MR, et a! (1996) Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gplOO modified at HLA-A*0201-binding residues. J. Immunol. 157,2539-48.
28. Uchiyama T, Broder S, Waldmann TA.. (1981) A monoclonal antibodies (anti-Tac) reactive with activated and functionally mature human T-cells.I. Production of anti-Tac monoclonal antibodies and distribution of Tac (+)cells. J Immunol. 126,1393-7.
29. Reiter Y, Kreitman Rl, Brinkmann U, Pastan I. (1994) Cytotoxic and antitumor activity of a recombinant immunotoxin composed of disulfide-stabilized anti-Tac Fv fragment and • · • · · · ·· · · » · ♦ • · ♦ 9 · · ♦ · β • · ·* 4 · · « · « · • 4·· · 9 «Ο 9 |*«| • · « · # V · · • · · · · · « « » « · · truncated Pseudomonas exotoxin. Int J Cancer. 58,142-9.
30. Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I. (1996)
Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nat Biotechnol. 14,1239-45.
31. Reiter Y, Brinkmann U, Jung SH, Lee B, Kasrzyk PG, King CR, Pastan I. (1994) Improved binding and antitumor activity of a recombinant anti-erbB2 immunotoxin by disulfide stabilization of the Fv fragment. J Biol Chem. 269,18327-31.
32. Bakker, A.B. et al. (1994) Melanocyte lineagespecific antigen gplOO is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med. 179, 1005-1009.
33. Kawakanii,Y. et al. (1995) Recognition of multiple epitopes in the human melanoma antigen gplOO by tumorinfiltrating T lymphocytes associated with in vivo tumor regression. J Immnunol. 154, 3961-3968
34. Cox, A.L. et al. (1994) Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T-cells lineš. Science 264, 716-719
35. Kreitman RI, Bailon P. Chaudhary VK, FitzGerald DI,
Pastan I. (1994) Recombinant immunotoxins containing antiTac(Fv) and derivatives of Pseudomonas exotoxin produce complete regression in mice of an interleukin-2 receptorexpressing human carcinoma. Blood 83,426-34.
36. Kirkin, A.F. et al. (1995) Generation of humanmelanoma-specific T lymphocyte dones defining novel cytolytic targets with panels of newly established melanoma cell lineš.
Cancer Immunol. Imunother. 41, 71-81
37. Pastan, I. (1997) Targeted therapy of cancer with recombinant imunotoxins. Biochim Biophys Acta. 1333,Cl-6
38. Lodě, H.N., & Reisfeld, R.A. (2000) Targeted cytokines for cancer immunotherapy. Immunol Res. 21,279-88
39. Withoff, S., Helfrich, W., de Leij, LF., Molema, G.
9·· ·« · · ·· 9 • · · ·9*· «9«
9999 9 9 · 9 999 9 9 999 9 · 99 9999·
·..*..»· I (2001) Bispecific antibody therapy for the treatment of cancer. Curr Opin Mol Ther. 3:53-62
40. Jain RK. (1999) Transport of molecules, particles, and cells in solid turaors. Annu Rev Biomed Eng. 1,241-63.
41. Robert B, Guillaume P, Luescher I, Romero P, Mach JP. (2000) Antibody-conjugated MHC class I tetramers can target tumor cells for specific lysis by T lymphocytes. Eur J Immunol. 30,3165-70.
42. Lanzavecchia, A., G. Lezzi, and A. Viola. (1999)
From TCR engagement to T-cells activation: a kinetic view of T-cells behaviour. Cell 96, 14
43. Bromley,SK, et al. (2001) The immunological synapse.
Ann Rev. Immunol. 19, 375-396.
44. Wang, B., R. Maile, R. Greenwood, Ε. I. Collins, and I. A. Frelinger. (2000) Naivě CD8+ T-cells do not require costimulation for proliferation and differentiation into cytotoxic effector cells. J Immunol. 164,1216-1222.
45. Tussey L, Speller S. Gallimore A, Vessey R. (2000) Functionally distinct CD8 + memory T cells subsets in persistent EBV infection are differentiated by migratory receptor expression. Eur J Imunol. 30,1823-9.
46. Lechner F, Cuero AL, Kantzanou M, Klenernian P. (2001) Studies of human antiviral CD8+ lymphocytes using class I peptide tetramers. Rev Med Virol. 11,11-22.
47. Mottez, Ε., P. Langlade-Demoyen, H. Goumier, F.
Martinon, I. Matyanski, P. Kourilsky, and I. P. Abastado.
(1995) Cells expressing a major histocompatibility complex class I molecule with a single kovalentně bound peptide are highly immunogenic. J. Exp. Med. 181,493-7
48. White, I., Crawford, F., Fremont, D., Marrack, P., and Kappler, I. (1999) Soluble class I MHC with β-2 microglobulin covalently linked peptides: specific binding to a T-cell hybridoma. J. Immunol.. 162,2671-8 ·· 9 9 99 »9 44 44 4 ♦ 9 9 » * 9 4
4 4 44 4 9 9 9 999 « * · 9 9 9 9 · 9 »9999
9999 «99 *· ’·’ ·* *··’ *· ·
49. Brinkmann U, Pai LH, FitzGerald DJ, Willingham M,
Pastan I. (1991) B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice.
Proč Nati Acad Sci USA. 88,8616-20.
50. Kreitman RI. Chimeric fusion proteins—Pseudomonas exotoxin based (2001). Curr Opin Investig Drugs., 2,1282-93.
51. Pastan I I, Kreitman RJ. (1998) Immunotoxins for targeted cancer therapy. Adv Drug Deliv Rev. 31,53-88.
52. Frankel AE, Kreitman RI, Sausville EA. (2000) Targeted toxíns. Clin Cancer Res. 6,326-34.
53. Kreitman RI, Bailon P. Chaudhary VK, FitzGerald DI,
Pastan I. (1994) Recombinant immunotoxins containing antiTac(7Fv) and derivatives of Pseudomonas exotoxin produce complete regression in mice of an interleukin-2 receptorexpressing human carcinoma. Blood 83,426-34.
• · • *
Seznam sekvencí ·· ··♦· ·· ·· • · · · ♦· · • «· · · « * * * · * · » · » « * · » · · • · «·* ·· ··.· • « «·»· <11O> Reiter , Yoram
Lev _ PIONS FOR IMMONE DECBPTION, PARTICDIAR1Y nádorových onemocnění <130> 01/237é9 <160> 17 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> schla—A2 konstrukt nukleové kyseliny .· <400> i
| atgatccagc gtactccaaa gattcaggtt tactcacgtc | atccagcaga gaatggaaag | 60 |
| tcaaatttcc tgaattgcta tgtgtctggg tttcatccat | ccgacattga agttgactta | 120 |
| ctgaagaatg gagagagaat tgaaaaagtg gagcattcag acttgtcttt cagcaaggac | ISO | |
| tggtctttct atctcttgta ttatactgag ttcaccccca | ctgaaaaaga tgagtatgcc | ^40 |
| tgccgtgtga accačgtgac tttgtcacag cccaagatag | ttaagtggga tcgagacatg | 300 |
| ggtggcggtg gaagcggcgg tggaggctct ggtggagtftg | gcagcggctc tcactccatg | 360 |
| aggtatttct tcacatccgt gtcccggccc ggccgcgggg | agccccgctt catcgcagtg | 420 |
| ggctacgtgg acgacacgca gttcgtgcgg ttcgacagcg | acgccgcgag ccagaggatg | 480 |
| gagccgcggg cgccgtggat agagcaggag ggtccggagt | attgggacgg ggagacacgg | 540 |
| aaagtgaagg cccactcaca gactcaccga gtggacctgg ggaccctgcg cggctactac | 600 | |
| aaccagagcg aggccggttc tcacaccgtc cagaggatgt | atggctgcga cgtggggtcg | 660 |
| gactggcgct tcctccgcgg gtaccaccag tacgqctacg | acggcaagga ttacatcgcc | 720 |
| ctgaaagagg acctgcgctc ttggaccgcg gcggacatgg | cagctcagac caccaagcac | 780 |
| aagtgggagg cggcccatgt ggcggagcag ttgagagcct | acctggaggg cacgtgcgtg | 840 |
| gagtggctcc gcagatacct ggagaacggg aaggagacgc | tgcagcgcac ggacgccccc | SOO |
| aaaacgcaca tgactcacca cgctgtctct gaccatgaag | ccaccctgag gtgctgggcc | 960 |
| ctgagcttct accctgcgga gatcacactg acctggcagc | gggatgggga ggaccagacc | 1020 |
| caggacacgg agctcgtgga gaccaggcct gcaggggatg gaaccttcca gaagtgggcg | 1080 |
99
9
9999 gctgtggtgg tgccttctgg acaggagcag agatacacct gccatgtgca gcatgagggt 1140 ttgcccaagc ccctcaccct gagatgggag 1170 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> Artificiální sekvence: <220>
<223> schla-a2 aminokyselinová sekvence <400> 2
| Met Ile Gin Arg Thr | Pro Lys Ile Gin Val Tyr Ser Arg His Pro Ala | ||
| 1 | 5 | 10 | 15 |
| Glu | Asn Gly Lys Ser 20 | Asn Phe Leu Asn Cys 25 | Tyr Val Ser Gly Phe His 30 |
| Pro | Ser Asp Ile Glu 35 | Val Asp Leu Leu Lys 40 | Asn Gly Glu Arg Ile Glu 45 |
| Lys | Val Glu His Ser 50 | Asp Leu Ser Phe ser 55 | Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 60 |
| Leu €5 | Leu Tyr Tyr Thr | Glu Phe Thr Pro Thr 70 | Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 75 80 |
| Cys | Arg Val Asn His 85 | Val Thr Leu Ser Gin 90 | Pro Lys Ile Val Lys Trp 95 |
| Asp | Arg Asp Met Gly 100 | Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 105 110 | |
| Gly | Gly Ser Gly Ser 115 | His Ser Met Arg Tyr 120 | Phe Phe Thr Ser Val Ser 125 |
| Arg | Pro Gly Arg Gly 130 | Glu Pro Arg Phe Ile 135 | Ala Val Gly Tyr Val Asp 140 |
| Asp 145 | Thr Gin Phe Val | Arg Phe Asp Ser Asp 150 | Ala Ala Ser Gin Arg Met 155 160 |
| Glu | Pro Arg Ala Pro 165 | Trp Ile Glu Gin Glu 170 | Gly Pro Glu Tyr Trp Asp 175 |
| Gly | Glu Thr Arg Lys 180 | Val Lys Ala His Ser 185 | Gin Thr His Arg Val Asp 190 |
| Leu | Gly Thr Leu Arg | Gly Tyr Tyr Asn Gin | Ser Glu Ala Gly Ser His |
195 200 205
Thr Val Gin Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
0000
0 0
0 0« · 0 0 0 0 0000 • 0 0« · ·
215
220
210
| Leu 225 | Arg | Gly | Tyr | His | Gin 230 | Tyr | Ala | Tyr | Asp | Gly 235 | Lys | Asp | Tyr | Ile | Ala 240 |
| Leu | Lys | Glu | Asp | Leu | Arg | Ser | Trp | Thr | Ala | Ala | Asp | Met | Ala | Ala | Glu |
245
250
255
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gin Leu Arg 260 . 265 270
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu 275 280 285
| Asn | Gly 290 | Lys | Glu | Thr | Leu | Gin 295 | Arg | Thr | Asp | Ala | Pro 300 | Lys | Thr | His | Met | |
| Thr | His | His | Ala | Val | Ser | Asp | Bis | Glu | Ala | Thr | Leu | Arg | Trp | Ala | Leu | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| Ser Phe | Tyr | Pro | Ala | Glu | Ile | Thr | Leu | Thr | Trp | Gin | Arg Asp Gly Glu | |||||
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| Asp | Gin | Thr | Gin | Asp | Thr | Glu | Leu | Val | Glu | Thr | Arg | Pro | Ala | Gly Asp | ||
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| Gly | Thr | Phe | Gin | Lys | Trp | Ala | Ala | Val | Val | Val | Pro | Ser | Gly | Gin Glu | ||
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| Gin | Arg | Tyr | Thr | Cys | His | Val | Gin | His | Glu | Gly | Leu | Pro | Lys | Pro | Leu | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| Thr | Leu | Arg | Trp | Glu |
385 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artifíciální sekvence <22 0>
<223> <
<400> 3 'jednořetězcový' konstrukt, aminokyselinová spojovací sekvence
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
| <210> | 4 |
| <211> | 1530 |
| <212> | DNA |
| <213> | Artifíciální sekvence. |
• · · · ··♦· <220>
<223> B2M-aTacVL construct nucleic acid sequence <400> 4
| atgatccagc | gtactccaaa gattcaggtt tactcacgtc atccagcaga gaatggaaag | 60 |
| tcaaatttcc | tgaattgcta tgtgtctggg tttcatccat ccgacattga agttgactta | 120 |
| ctgaagaatg | gagagagaat tgaaaaagtg gagcattcag acttgtcttt cagcaaggac | 180 |
| tggtctttct | atctcttgta ttatactgag ttcaccccca ctgaaaaaga tgagtatgcc | 240 |
| tgccgtgtga | accacgtgac tttgtcacag cccaagatag ttaagtggga tcgagacatg | 300 |
| ggtggcggtg | gaagcggcgg tggaggctct ggtggaggtg gcagcggctc tcactccatg | 360 |
| aggtatttct | tcacatccgt gtcccggccc ggccgcgggg agccccgctt catcgcagtg | 420 |
| ggctacgtgg | acgacacgca gttcgtgcgg ttcgacagcg acgccgcgag ccagaggatg | 480 |
| gagccgcggg | cgccgtggat agagcaggag ggtccggagt attgggacgg ggagacacgg | 540 |
| aaagtgaagg | cccactcaca gactcaccga gtggacctgg ggaccctgcg cggctactac | 600 |
| aaccágagcg | aggccggttc tcacaccgtc cagaggatgt atggctgcga cgtggggtcg | 660 |
| gactggcgct | tcctccgcgg gtaccaccag tacgcctacg acggcaagga ttacatcgcc | 720 |
| ctgaaagagg | acctgcgctc ttggaccgcg gcggacatgg cagctcagac caccaagcac | 780 |
| aagtgggagg | cggcccatgt ggcggagcag ttgagagcct acctggaggg cacgtgcgtg | 840 |
| gagtggctcc | gcagatacct ggagaacggg aaggagacgc tgcagcgcac ggacgccccc | 900 |
| aaaacgcaca | tgactcacca c^etgtctct gaccatgaag ccaccctgag' gtgctgggcc | 960 |
| ctgagcttct | aCcctgcgga gatcacactg acctggcagc gggatgggga ggaccagacc | 1020 |
| caggacacgg | agctcgtgga gaccaggcct gcaggggatg gaaccttcca gaagtgggcg | 1080 |
| gctgtggtgg | tgccttctgg acaggagcag agatacacct gccatgtgca gcatgagggt | 1140 |
| ttgcccaagc | ccctcaccct gagatgggag ggcggaggag ggtecggtgg cggaggttca | 1200 |
| ggaggcggtg | gatcgcaaat tgttctcacc cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca | 1260 |
| ggggagaagg | tcaccataac ctgcagtgcc agctcaagta taagttacat gcactggttc | 1320 |
| cagcagaagc | caggcacttc .tcccaaactc tggatttata ccacatccaa cctggcttct | 1380 |
| ggagtccctg | ctcgcttcag tggcagtgga tctgggacct cttactctct cacaatcagc | 1440 |
| cgaatggagg | ctgaagatgc tgccacttat tactgccatc aaaggagtac ttacccactc | 1500 |
| acgttcggtt | gtggtaccaa gctggagctc | 1530 |
<210> 5 <211> 510 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>
<223> B2M-aTacVL konstrukt, aminokyselinová sekvence <400> 5 ·· ftftftft ftft ftft ftftft • ftft ftftftft ftftft • ftftftft ftft · ftftftft • ft ftftftft ftftftft ftftftft • ft ftftftft ftftft • ft ftftft ftft ftftftft ftft ·
Met Ile Gin Arg Thr Pro Lys Ile Gin Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His 20 25 30
Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn- Gly Glu Arg Ile Glu 35 40 45
Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 - 60
Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 80
Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gin Pro Lys Ile val Lys Trp 85 90 95
Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser 115 120 125
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp 130 135 - 140
Asp Thr Gin Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gin Arg Met 145 150 155 160
| Glu | Pro | Arg | Ala | Pro 165 | Trp | Ile | Glu | Gin | Glu 170 | Gly | Pro | Glu | Tyr | Trp 175 | Asp |
| Gly | Glu | Thr | Arg 180 | Lys | Val | Lys | Ala | His 185 | Ser | Gin | Thr | His | Arg 190 | Val | Asp |
| Leu | Gly | Thr 195 | Leu | Arg | Gly Tyr | Tyr 200 | Asn | Gin | Ser | Glu | Ala 205 | Gly | Ser | His | |
| Thr | Val 210 | Gin | Arg | Met | Tyr | Gly Cys 215 | Asp | Val | Gly | Ser 220 | Asp | Trp | Arg | Phe | |
| Leu 225 | Arg | Gly | Tyr | His | Gin 230 | Tyr | Ala | Tyr | Asp Gly 235 | Lys | Asp | Tyr | Ile | Ala 240 | |
| Leu | Lys | Glu | Asp | Leu 245 | Arg | Ser | Trp | Thr | Ala 250 | Ala | Asp | Met | Ala | Ala 255 | Gin |
| Thr | Thr | Lys | His 260 | Lys | Trp | Glu | Ala | Ali 265 | His | Val | Ala | Glu | Gin 270 | Leu | Arg |
| Ala | Tyr | Leu 275 | Glu | Gly | Thr | Cys | Val 280 | Glu | Trp | Leu | Arg Arg 285 | Tyr | Leu | Glu |
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gin Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met 290 295 300 • ft ftftft • ftftftft
| Thr 305 | His His Ala | Val | Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala | ||
| 310 | 315 | 320 | |||
| Leu | Ser Phe Tyr | Pro | Ala | Glu Ile Thr Leu Thr | Trp Gin Arg Asp Gly |
| 325 | 330 | 335 | |||
| Glu | Asp Gin Thr | Gin | Asp | Thr Glu Leu Val Glu | Thr Arg Pro Ala Gly |
| 340 | 345 | 350 | |||
| Asp | Gly Thr Phe | Gin | Lys | Trp Ala Ala Val Val | Val Pro Ser Gly Gin |
| 355 | 360 | 365 | |||
| Glu | Gin Arg Tyr | Thr | Cys | His Val Gin His Glu | Gly Leu Pro Lys Pro |
| 370 | 375 | 380 | |||
| Leu | Thr Leu Arg | Trp | Glu | Gly Gly Gly Gly Ser | Gly Gly Gly Gly Ser |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||
| Gly Gly Gly Gly | Ser | Gin | Ile Val Leu Thr Gin | Ser Pro Ala Ile Met | |
| 405 | 410 | 415 | |||
| Ser | Ala Ser Pro | Gly | Glu | Lys Val Thr Ile Thr | Cys Ser Ala Ser Ser |
| 420 | 425 | 430 | |||
| Ser | Ile Ser Tyr | Met | His | Trp Phe Gin Gin Lys | Pro Gly Thr Ser Pro |
| 435 | 440 - | 445 | |||
| Lys | Leu Trp Ile | Tyr | Thr | Thr Ser Asn Leu Ala | Ser Gly Val Pro Ala |
| 450 | 455 | 460 | |||
| Arg | Phe Ser Gly | Ser | Gly | Ser Gly Thr Ser Tyr | Ser Leu Thr Ile Ser |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||
| Arg | Met Glu Ala | Glu | Asp | Ala Ala Thr Tyr Tyr | Cys His Gin Arg Ser |
| 485 | 490 | 495 | |||
| Thr | Tyr Pro Leu | Thr | Phe | Gly Cys Gly Thr Lys | Leu Glu Leu |
| 500 | 505 | 510 |
| <210> | 6 |
| <211> | 348 |
| <212> | DNA |
| <213> | ÍArtifíciální sekvence |
<220>
<223> aTacVH sekvence, část B2M-aTac(dsFv) sekvence >
<400> 6 caggtccatc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctacagga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatat attaatccta gcactgggta tactgaatac
180 • · ···· ··«* ··«<
·· ·«*· ··· ·· ··· ·· ··»« ·· « ·· ··♦« aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atttgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggggg 300 ggggtctttg actactgggg ccaaggaacc actctcacag tctcctca 348 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <2i3> jArtificiální sekvence <220>
<223> aTacra aminokyselinová sekvence - část B2M-aTac(dsFv) kódovaného proteinu <400> 7
| Gin | Val | His | Leu | Gin | Gin | Ser | Gly | Ala | Glu | Leu | Ala | Lys | Pro | Gly | Ala |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser Val | Lys | Met | Ser | Cys | Lys | Ala | Ser | Gly Tyr | Thr | Phe | Thr | Ser | Tyr | ||
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Met | His | Trp | val | Lys | Gin | Arg | Pro | Gly | Gin | Gly | Leu | Glu | Trp | Ile |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gly | Tyr | Ile | Asn | Pro | Sex | Thr | Gly Tyr | Thr | Glu | Tyr | Asn | Gin | Lys | Phe | |
| 50 | 55 | - | 60 | ||||||||||||
| Lys | Asp | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Ala | Asp | Lys | Ser | Ser | Ser | Thr | Ala | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Met | Gin | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Phe | Glu | Asp | Ser | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ala | Arg | Gly | Gly | Gly | Val | Phe | Asp | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Leu |
| 100 | 105 | 110 |
Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220>
<223>
HLA-A2-restrihovaný syntetický peptid odvozený od melanomového diferenciačního antigenu gplOO <400> 8
Ile Met Asp Gin Val Pro Phe Ser Val 1 5 ♦ * »»·· ·> 99 • 44 4 4 4 9
9449 · · 4 • · · · · « · • · 4 4 4 4 »· ·*· ♦· ··*« « · · • · · «
4 · ···· • 9 4
4 .s 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificiální sekvence.
<220>
<223> HLA-A2-restrihovaný syntetický peptid odvozený od melanomového diferenciačního antigenu gplOO <4OO> 9
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Val
5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificiální sekvence,, <220>
<223> Syntetický peptid odvozený z HTLV-1 viru <400> 10
Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr val
5 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> : Artificiální sekvence:
<220>
<223> Jednořetězcový DNA oligonukleotid:
<400> 11 ggaagcgttg gcgcatatga tccagcgtac tec 33
| <210> | 12 |
| <211> | 48 |
| <212> | DNA |
| <213> | Artificiální sekvence. |
<223> Jednořetězcový DNA oligonukleotid <220>
·· ΦΦΦΦ ΦΦ ·· «φ 9
ΦΦΦ · · · · ΦΦΦ • Φ ΦΦΦ · · · ΦΦΦΦ
Φ Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ··«···«·· • Φ ·*· ΦΦ *ΦΦΦ ·· Φ <400> 12 tcctgaacct ccgccaccgg accctcctcc gccctcccat ctcagggt 48 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> ; Artificiální sekvence;
<220>
<223> Jednořetězcový DNA oligonukleotid t <400> 13 tccggtggcg gaggttcagg aggcggtgga tcgeaaattg ttctcacc 48 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> ! Jednořetězcový DNA oligonukleotid <400> 14 gcagtaagga attcattaga gctccagctt ggt 33 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificiální sekvence:
<220>
<223> Oligonukleotid kódující jednořetězcovou spojovací sekvenci <400> 15 ggcggaggag ggtccggtgg cggaggttca ggaggcggtg gatcg 45 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> ;Artificiální sekvence:
<220>
<223> MHC restrihovaný peptid odvozený od chřipkového viru <400> 16
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
4444 • · · • 4 444 • · ·
4 · • 4 444
44
4 4 4
4 4 • 44 ·
4 4
4444 «
4 4
4 4 4
4 4 4444
4 4
4· 4 • xO> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificiální sekvence:
<220>
<223> MHC restrihovaný peptid odvozený od viru hepatitidy B <400> 17
Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin
5 • · • · ·
• · · · · • · · · · · · irt 'i-fn
Claims (122)
- Patentové nároky1. Imunomolekula vyznačující se tím, že obsahuj e:rozpustnou lidskou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a zaměřovači doménu navázanou na uvedenou rozpustnou lidskou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I.
- 2. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená zaměřovači doména je.protilátková zaměřovači doména.
- 3. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je ligandová zaměřovači doména.
- 4. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená ligandová zaměřovači doména je vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL6, VEGF a jeho derivátů a TNF.
- 5. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména lidského MHC antigenu třídy I a uvedená protilátková zaměřovači doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 6. Imunomolekula podle nároku 2vyznačující se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.• ·89 .............
- 7. Imunomolekula podle nároku Svyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorová doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 8. Imunomolekula podle nároku 6vyznačující se t i m., že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky.
- 9. Imunomolekula podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 10. Imunomolekula podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím spojovacího peptidů.
- 11. Imunomolekula podle nároku 8vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím alespoň jedné S-S vazby.
- 12. Imunomolekula podle nároku 2vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména obsahuje • ···· · · · · ··· •0 0000 0000 0·0 • 0 «·00 · 0 090 ..............variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.
- 13. Imunomolekula podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorová doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 14. Imunomolekula podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky.
- 15. Imunomolekula podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 16. Imunomolekula podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím spojovacího peptidu.
- 17. Imunomolekula podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím alespoň jedné S-S vazby.• · · · · · • · · · • · · · · · • · · · ·
- 18. . Imunomolekula podle nároku 2vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména je schopna vazby na antigen asociovaný s nádorem.
- 19. Imunomolekula podle nároku 2vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména je schopná vazby na antigen specifický pro nádor.
- 20. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená rozpustná efektorové doména lidského MHC antigenu třídy I obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a na něj navázaný funkční lidské těžký řetězec MHC antigenu třídyI.
- 21. Imunomolekula podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený funkční těžký řetězec MHC antigenu třídy I obsahuje domény a 1-3.
- 22. Imunomolekula podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin a uvedený funkční těžký řetězec MHC antigenu třídy I jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 23. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se t i m, že uvedená rozpustná efektorové doména MHC antigenu třídy I dále obsahuje MHC-restrihovaný peptid.
- 24. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid je navázaný na uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin.• · · ·91 9999 • · · • · · · · • · · • · · · ·
- 25. Imunomolekula podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid a uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 26. Imunomolekula podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid je v komplexu s uvedeným funkčním těžkým řetězcem MHC antigenu třídy I.
- 27. Imunomolekula podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z běžného patogenu.
- 28. Imunomolekula podle nároku 23 vyznačuj ící se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z patogenu, pro který existuje aktivní vakcinace.
- 29. Imunomolekula podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z antigenu asociovaného s nádorem nebo antigenu specifického pro nádor.
- 30. Konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu vyznačující se tím, že obsahuje:první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující zaměřovači doménu; kde uvedený první polynukleotid a uvedený druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a uvedená protilátková zaměřovači doména jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu mezi sebou.
- 31. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 • · ·93 .............vyznačující se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je protilátkové zaměřovači doména.
- 32. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 vyznačující se tím, že uvedenou zaměřovači doménu je ligandová zaměřovači doména.
- 33. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 vyznačující se tím, že uvedená ligandová zaměřovači doména je vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, VEGF a jeho deriváty a TNF.
- 34. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky.
- 35. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 34 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu, na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky.
- 36. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména obsahuje variabilní region těžkého řetězce.
- 37. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 36 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky translačně fúzovaný, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu, na uvedený variabilní ·· ···· • · • · region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky.
- 38. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména je schopna vazby na antigen asociovaný s nádorem.
- 39. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména je schopna vazby na antigen specifický pro nádor.
- 40. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 vyznačující se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční těžký řetězec lidského MHC antigenu třídy I translačně fúzované na seve navzájem, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu.
- 41. Imunomolekula podle nároku 40vyznačující se tím, že uvedený funkční těžký řetězec lidské MHC molekuly třídy I obsahuje domény a 1-3.
- 42. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 vyznačující se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I dále obsahuje a MHCrestrihovaný peptid translačně fúzovaný, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu, na uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin.
- 43. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 42 vyznačující se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z běžného patogenu.«· <999 999 9 9 · ♦ • 99·· 9 · • 9 9 9··9 9 φ 9 999 99« 9999 99 99 9 9 9 99 9 9 9 99 99 9999 • 9 · 9 «99« 99 9
- 44. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 42 vyznačující se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z patogenu, pro který existuje aktivní vakcinace.
- 45. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 42 vyznačující se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z antigenů asociovaného s nádorem nebo antigenů specifického pro nádor.
- 46. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30 vyznačující se tím, že dále obsahuje cis působící regulační sekvence operativně navázané na uvedený první a druhý polynukleotid.
- 47. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 46 vyznačující se tím, že uvedená cis působící regulační sekvence je funkční v bakterii.
- 48. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 46 vyznačující se tím, že uvedená cis působící regulační sekvence je funkční v kvasinkách.
- 49. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 46 vyznačující se tím, že uvedená cis působící regulační sekvence je funkční v živočišných buňkách.
- 50. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 46 vyznačující se tím, že uvedená cis působící regulační sekvence je funkční v rostlinných buňkách.
- 51. Transformovaná buňka vyznačující se tím, že ·· ·· ···· • · · • · · · » • · · · obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 30.
- 52. Transformovaná buňka podle nároku 51 vyznačující se tím, že jde o eukaryotickou buňku vybranou ze skupiny zahrnující savčí buňky, hmyzí buňky, rostlinné buňky, kvasinky a protozoa.
- 53. Transformovaná buňka podle nároku 51 vyznačuj ící se tím, buňkou je bakteriální buňka.
- 54. Konstrukt nukleové kyseliny kódující imunomolekulu vyznačující se tím, že obsahuje:první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény; kde uvedený první polynukleotid a uvedený druhý polynukleotid jsou vybrány a spojeny tak, že uvedená rozpustná efektorová doména lidské MHC molekuly třídy I a uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce nebo těžkého řetězce uvedené protilátková zaměřovači domény jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidů mezi sebou;třetí polynukleotid kódující druhý z uvedeného lehkého řetězce a těžkého řetězce uvedené protilátkové zaměřovači domény.
- 55. Systém konstruktů nukleové kyseliny vyznačuj ící se t i m, že obsahuje:první konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje: první polynukleotid kódující rozpustnou efektorovou doménuMHC antigenu třídy I; a druhý polynukleotid kódující variabilní region lehkého řetězce nebo těžkého řetězce protilátkové zaměřovači domény;······ ·· ·· *»· ,,. «··· ··· • , ,, · ··· ϊ . ...........·· . . . · · · ♦97 ...........kde uvedený první polynukleotid a uvedený druhý polynukleotid jsou vybrány a navázány tak, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce nebo těžkého řetězce uvedené protilátkové zaměřovači domény jsou translačně fúzované, volitelně prostřednictvím spojovacího peptidu mezi sebou;druhý konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje: třetí polynukleotid kódující uvedený druhý z uvedeného lehkého řetězce nebo těžkého řetězce uvedené protilátkové zaměřovači domény.
- 56. Izolovaný přípravek bakteriálních inkluzních tělísek v y značující se tím, že obsahuje více než 30 procent hmotnostních imunomolekuly, kde imunomolekula obsahuje:rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a zaměřovači doménu navázanou na uvedenou rozpustnou efektorovou doménu lidského MHC antigenu třídy I.
- 57. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je protilátková zaměřovači doména.
- 58. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je ligandová zaměřovači doména.
- 59. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedená ligandová zaměřovači doména je vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4,IL-6, VEGF a jeho deriváty a TNF.
- 60. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC0 0 0 0 • « * » • 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·00 ♦♦· antigenu třídy I a uvedená protilátkové zaměřovači doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 61. Izolovaný přípravek podle nároku 57 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.
- 62. Izolovaný přípravek podle nároku 61 vyznačuj ící se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorová doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 63. Izolovaný přípravek podle nároku 61 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého'řetězce uvedené protilátky.
- 64. Izolovaný přípravek podle nároku 63 vyznačuj ící setím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 65. Izolovaný přípravek podle nároku 63 vyznačuj ící se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky není kovalentně navázaný na jiné polypeptidy v uvedených inkluzních tělískách.• · • · ··«· ·· • · · · · · • · · · · · · · • · · · · » · • · · » · ·99 ...........
- 66. Izolovaný přípravek podle nároku 57 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.
- 67. Izolovaný přípravek podle nároku 66 vyznaču jící se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorová doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 68. Izolovaný přípravek podle nároku 66 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky.
- 69. Izolovaný přípravek podle nároku 66 vyznačuj ící se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 70. Izolovaný přípravek podle nároku 68 vyznačuj ící se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky není kovalentně navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky.
- 71. Izolovaný přípravek podle nároku 57 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména je schopna vazby na antigen asociovaný s nádorem.100 • · · · · * • · · • · · · · « · ·9 9 99 9 9 9 9 • ·
- 72. Izolovaný přípravek podle nároku 57 vyznačuj ící se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména je schopna vazby na antigen specifický pro nádor.
- 73. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I navázaný na β-2 mikroglobulin.
- 74. Izolovaný přípravek podle nároku 73 vyznačuj ící setím, že uvedený funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I obsahuje domény a 1-3.
- 75. Izolovaný přípravek podle nároku 73 vyznačuj ící setím, že uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin a uvedený funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 76. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedená rozpustná lidská efektorová doména MHC antigenu třídy I dále obsahuje MHC-restrihovaný peptid.
- 77. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid je navázaný na uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin.
- 78. Izolovaný přípravek podle nároku 77 vyznačuj ící se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid a uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi • · · · • · « » • · · · · · · • ···· · · · • · · · · · * ft · · ♦ · ·1Q1 ·· ··· ·» ···· sebou.
- 79. Izolovaný přípravek podle nároku 56 vyznačuj ící setím, že uvedený MHC restrihovaný peptid není kovalentně navázaný na uvedený funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I.
- 80. Izolovaný přípravek podle nároku 76 vyznačuj ící se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z běžného patogenů.
- 81. Izolovaný přípravek podle nároku 76vyznačuj ící se tím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z patogenů, pro který existuje aktivní vakcinace.
- 82. Izolovaný přípravek podle nároku 76vyznačuj ící setím, že uvedený MHC restrihovaný peptid pochází z antigenu asociovaného s nádorem nebo antigenu specifického pro nádor.
- 83. Způsob přípravy imunomolekuly vyznačující se tím, že zahrnuje:expresi imunomolekuly v bakterii, kde uvedená imunomolekula obsahuj e:rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I, která obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I navázaný na sebe; a zaměřovači doménu navázanou na uvedenou rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I; a izolování imunomolekuly.• · · · * · · ♦· · • · · • · ·
- 84. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím,102 ·· 0 0 0» ·· • 00 · · • 0 0 0 0 · · • 0 0 0 0 00 0 0 0 · « · 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 • 00 00000 0 0 00 0 0 0 0 0 0 že uvedenou zaměřovači doménou je protilátkové zaměřovači doména.
- 85. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je ligandová zaměřovači doména.
- 86. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že uvedená ligandová zaměřovači doména je vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, VEGF a jeho deriváty a TNF.
- 87. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že imunomolekula dále obsahuje MHC-restrihovaný peptid navázaný na uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin, kde způsob dále zahrnuje opětovné složení uvedené imunomolekuly za vzniku komplexu MHC antigen třídy I-MHC restrihovaný peptid.
- 88. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že izolování imunomolekuly je provedené chromatografii s vylučováním podle velikosti.
- 89. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že MHC-restrihovaný peptid je exprimován současně s uvedenou imunomolekulou v uvedené bakterii.
- 90. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že exprese imunomolekuly v uvedené bakteria je provedena tak, že imunomolekula tvoří inkluzní tělíska v uvedené bakterii.
- 91. Způsob podle nároku 89 vyznačující se tim, že uvedený MHC-restrihovaný peptid a imunomolekula tvoří současně inkluzní tělíska v uvedené bakterii. .«9 9103
- 92. Způsob podle nároku 90 vyznačující se tím, že uvedený krok izolování uvedené imunomolekuly dále obsahuje:denaturování uvedených inkluzních tělísek tak, že se z nich uvolní proteinové molekuly; a renaturování uvedených proteinových molekul.
- 93. Způsob podle nároku 92 vyznačující se tím, že renaturování uvedených proteinových molekul je provedeno za přítomnosti MHC-restrihovaných peptidů.
- 94. Způsob podle nároku 93 vyznačující se tím, že uvedené MHC-restrihované peptidy jsou současně exprimovány v uvedené bakterii.
- 95. Způsob pro selektivní usmrcení buněk u pacienta, kde buňky prezentují antigen, vyznačující se tím, že pacientovi je podána imunomolekula, která obsahuje:rozpustnou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I v komplexu s MHC restrihovaným peptidem; a zaměřovači doménu navázanou na uvedenou rozpustnou lidskou efektorovou doménu MHC antigenu třídy I, kde uvedená zaměřovači doména je určena pro selektivní vazbu na uvedený antigen;kde uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I v komplexu s uvedeným MHC-restrihovaným peptidem iniciuje CTL zprostředkovanou imunitní reakci proti uvedené buňce, čímž dojde k selektivnímu usmrcení buňky in vivo.
- 96. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedenou zaměřovači doménou je protilátková zaměřovači doména.
- 97. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, • · · · · · • · · · • · ··· · • · · · · · · • · · · · ·· · ·· · · ···· • ·104 • ·· · • · že uvedenou zaměřovači doménou je ligandová zaměřovači doména.
- 98. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedená ligandová zaměřovači doména je vybrána ze skupiny zahrnující PDGF, EGF, KGF, TGFa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-β, VEGF a jeho deriváty a TNF.
- 99. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedeným antigenem je receptor.
- 100. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedená rozpustná efektorová doména MHC antigenu třídy I a uvedená protilátková zaměřovači doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 101. Způsob podle nároku 96 vyznačující se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.
- 102. Způsob podle nároku 101 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorová doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 103. Způsob podle nároku 101 vyznačující se tím, že uvedená protilátková zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky.·· ·· ·♦ · • · · « · · · • · » · · · · ·· · · » · ····· • ♦ · · · ♦ • · «··· 9105
- 104. Způsob podle nároku 103 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 105. Způsob podle nároku 103 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím spojovacího peptidu.
- 106. Způsob podle nároku 103 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím alespoň jedné S-S vazby.
- 107. Způsob podle nároku 96 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména obsahuje variabilní region těžkého řetězce protilátky navázaný na uvedenou efektorovou doménu.
- 108. Způsob podle nároku 107 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného·těžkého řetězce uvedené protilátky a uvedená efektorové doména jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 109. Způsob podle nároku 107 vyznačující se tím, že uvedená protilátkové zaměřovači doména dále obsahuje variabilní region lehkého řetězce protilátky navázaný106 • · · · 9 • · · · 9 • »9 9 · · 99 9 9 · • •Φ» *»· 9 na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky.
- 110. Způsob podle nároku 107 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky a uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 111. Způsob podle nároku 109 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím spojovacího peptidu.
- 112. Způsob podle nároku 109 vyznačující se tím, že uvedený variabilní region uvedeného lehkého řetězce uvedené protilátky je navázaný na uvedený variabilní region uvedeného těžkého řetězce uvedené protilátky prostřednictvím alespoň jedné S-S vazby.
- 113. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedenou buňkou je nádorová buňka a uvedeným antigenem je antigen asociovaný s nádorem.
- 114. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedenou buňkou je nádorová buňka a.uvedeným antigenem je antigen specifický pro nádor.
- 115. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedená rozpustná lidská efektorová doména MHC antigenů třídy I obsahuje funkční lidský β-2 mikroglobulin a funkční107 • · · · • · ·· · • t · • · 9 lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I navázané na sebe.
- 116. Způsob podle nároku 115 vyznačující se tím, že uvedený funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I obsahuje domény a 1-3.
- 117. Způsob podle nároku 115 vyznačující se tím, že uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin a uvedený funkční lidský těžký řetězec MHC antigenu třídy I jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 118. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid je navázaný na uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin.
- 119. Způsob podle nároku 118 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid a uvedený funkční lidský β-2 mikroglobulin jsou translačně fúzované, volitelně s translačně fúzovaným spojovacím peptidem mezi sebou.
- 120. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z běžného patogenu, kde způsob volitelně dále zahrnuje vakcinaci pacienta proti uvedenému běžnému patogenu.
- 121. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z běžného patogenu, pro který existuje aktivní vakcinace.
- 122. Způsob podle nároku 95 vyznačující se tím, že uvedený MHC-restrihovaný peptid pochází z antigenu asociovaného s nádorem nebo antigenu specifického pro nádor,
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29891501P | 2001-06-19 | 2001-06-19 | |
| US10/108,511 US20030017134A1 (en) | 2001-06-19 | 2002-03-29 | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ200479A3 true CZ200479A3 (cs) | 2004-11-10 |
Family
ID=26805971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ200479A CZ200479A3 (cs) | 2001-06-19 | 2002-06-18 | Způsoby a farmaceutické prostředky pro oklamání imunitního systému, použitelné zejména při léčbě nádorových onemocnění |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030017134A1 (cs) |
| EP (1) | EP1409547B1 (cs) |
| JP (1) | JP5148804B2 (cs) |
| CA (1) | CA2451353C (cs) |
| CZ (1) | CZ200479A3 (cs) |
| DK (1) | DK1409547T3 (cs) |
| ES (1) | ES2652017T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0400231A3 (cs) |
| NZ (2) | NZ581793A (cs) |
| PL (1) | PL373302A1 (cs) |
| WO (1) | WO2002102299A2 (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2328356A1 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-22 | Itty Atcravi | Recreational vehicles |
| US7645743B2 (en) * | 1999-12-22 | 2010-01-12 | Altermune, Llc | Chemically programmable immunity |
| WO2001072768A2 (en) * | 2000-03-27 | 2001-10-04 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Single chain class i major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same |
| US20040191260A1 (en) | 2003-03-26 | 2004-09-30 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof |
| US8022190B2 (en) * | 2001-06-19 | 2011-09-20 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using |
| GB2408507B (en) * | 2003-10-06 | 2005-12-14 | Proimmune Ltd | Chimeric MHC protein and oligomer thereof for specific targeting |
| KR20100092031A (ko) | 2004-06-17 | 2010-08-19 | 맨카인드 코포레이션 | 에피토프 유사체 |
| US7511119B2 (en) | 2005-06-17 | 2009-03-31 | Mannkind Corporation | PRAME peptide analogues |
| US8846393B2 (en) | 2005-11-29 | 2014-09-30 | Gamida-Cell Ltd. | Methods of improving stem cell homing and engraftment |
| EA200870555A1 (ru) * | 2006-05-19 | 2009-04-28 | Тева Фармасьютикал Индастриз, Лтд. | Слитые белки, их применение и способы их получения |
| CA2760774A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Altermune Technologies, Llc | Chemically programmable immunity |
| GB0908613D0 (en) * | 2009-05-20 | 2009-06-24 | Immunocore Ltd | T Cell Reseptors |
| US20130011394A1 (en) | 2011-06-22 | 2013-01-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Complexes comprising mhc class i fusion polypeptides and antigen-specific antibodies and methods of use |
| EP2814951B1 (en) | 2012-02-13 | 2019-04-03 | Gamida-Cell Ltd. | Culturing of mesenchymal stem cells |
| US9175266B2 (en) | 2012-07-23 | 2015-11-03 | Gamida Cell Ltd. | Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity |
| US9567569B2 (en) | 2012-07-23 | 2017-02-14 | Gamida Cell Ltd. | Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells |
| CA2887486A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Roche Glycart Ag | Removal of cancer cells by circulating virus-specific cytotoxic t-cells using cancer cell targeted mhc class i comprising multi-function proteins |
| BR112015013557B1 (pt) | 2012-12-11 | 2021-12-14 | Albert Einstein College Of Medicine | Sistema, método, método para determinar o efeito de um resíduo de aminoácido predeterminado de uma primeira proteína sobre a ligação da primeira proteína a uma segunda proteína e polipeptídeo pd-l1 mutante |
| JP6475167B2 (ja) * | 2012-12-21 | 2019-02-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ジスルフィド結合した多価ｍｈｃクラスｉを含む多機能タンパク質 |
| ES2820729T3 (es) * | 2013-02-15 | 2021-04-22 | Univ Johns Hopkins | Redirectores de células T específicas de antígenos |
| CA2936352A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Cellular platform for rapid and comprehensive t-cell immunomonitoring |
| IL262606B2 (en) | 2016-05-18 | 2023-04-01 | Albert Einstein College Medicine Inc | pd-l1 variant polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of using them |
| KR20190019068A (ko) | 2016-05-18 | 2019-02-26 | 큐 바이오파마, 인크. | T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 |
| EP3464380A1 (en) | 2016-06-02 | 2019-04-10 | Immunocore Limited | Dosing regimen for gp100-specific tcr - anti-cd3 scfv fusion protein |
| DK3558339T3 (da) | 2016-12-22 | 2024-02-26 | Cue Biopharma Inc | T-celle-modulerende multimere polypeptider og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| WO2018129474A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| US20200010528A1 (en) | 2017-03-15 | 2020-01-09 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
| CN111328288A (zh) * | 2017-08-18 | 2020-06-23 | 磨石肿瘤生物技术公司 | 靶向共同抗原的抗原结合蛋白 |
| EP3737689A4 (en) | 2018-01-09 | 2021-12-01 | Cue Biopharma, Inc. | MULTIMERIC T CELL-MODULATING POLYPEPTIDES AND METHOD OF USING THEREOF |
| WO2019162937A1 (en) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | Technion Research & Development Foundation Limited | Immunotherapeutic composition for the treatment of cancer |
| CA3169949A1 (en) | 2020-05-12 | 2021-11-18 | Cue Biopharma, Inc. | Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof |
| WO2023126544A1 (en) * | 2022-01-03 | 2023-07-06 | Aarhus Universitet | Proteinaceous compound for generating specific cytotoxic t-cell effect |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5194425A (en) * | 1988-06-23 | 1993-03-16 | Anergen, Inc. | Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| US5260422A (en) * | 1988-06-23 | 1993-11-09 | Anergen, Inc. | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| US5468481A (en) * | 1988-06-23 | 1995-11-21 | Amergen, Inc. | MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| DE3825615A1 (de) * | 1988-07-28 | 1990-02-01 | Behringwerke Ag | Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung |
| US5976551A (en) * | 1991-11-15 | 1999-11-02 | Institut Pasteur And Institut Nationale De La Sante Et De La Recherche Medicale | Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and method of using the determinant |
| US5837477A (en) * | 1993-01-15 | 1998-11-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | T cell receptor ligands and methods of using same |
| US5820866A (en) * | 1994-03-04 | 1998-10-13 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Product and process for T cell regulation |
| US5635363A (en) * | 1995-02-28 | 1997-06-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells |
| WO1997024446A2 (en) * | 1995-12-29 | 1997-07-10 | Chiron Corporation | Gene delivery vehicle-targeting ligands |
| US5869270A (en) * | 1996-01-31 | 1999-02-09 | Sunol Molecular Corporation | Single chain MHC complexes and uses thereof |
| NZ331688A (en) * | 1996-03-28 | 2000-02-28 | Univ Johns Hopkins | Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins |
| US6140113A (en) * | 1996-03-28 | 2000-10-31 | The Johns Hopkins University | Polynucleotides encoding molecular complexes which modify immune responses |
| US6211342B1 (en) * | 1996-07-18 | 2001-04-03 | Children's Hospital Medical Center | Multivalent MHC complex peptide fusion protein complex for stimulating specific T cell function |
| US6232445B1 (en) * | 1997-10-29 | 2001-05-15 | Sunol Molecular Corporation | Soluble MHC complexes and methods of use thereof |
| US6235445B1 (en) * | 1998-04-15 | 2001-05-22 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Thermal transfer sheet |
| GB2339782A (en) * | 1998-06-05 | 2000-02-09 | Philip Michael Savage | Chimeric protein complexes comprising HLA class I antigens |
| WO2001072768A2 (en) * | 2000-03-27 | 2001-10-04 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Single chain class i major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same |
| AU5532601A (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Univ Rochester | Targeted vaccine delivery systems |
| WO2001090198A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Ludwig Institute For Cancer Research | Multicomponent conjugates which bind to target molecules and stimulate cell lysis |
| GB0026812D0 (en) * | 2000-11-02 | 2000-12-20 | Isis Innovation | Cancer therapy |
-
2002
- 2002-03-29 US US10/108,511 patent/US20030017134A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-18 EP EP02733206.3A patent/EP1409547B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-18 NZ NZ581793A patent/NZ581793A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-18 WO PCT/IL2002/000478 patent/WO2002102299A2/en active Application Filing
- 2002-06-18 PL PL02373302A patent/PL373302A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-06-18 CA CA2451353A patent/CA2451353C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-18 CZ CZ200479A patent/CZ200479A3/cs unknown
- 2002-06-18 NZ NZ530656A patent/NZ530656A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-18 DK DK02733206.3T patent/DK1409547T3/en active
- 2002-06-18 ES ES02733206.3T patent/ES2652017T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-18 HU HU0400231A patent/HUP0400231A3/hu unknown
- 2002-06-18 JP JP2003504888A patent/JP5148804B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002102299A2 (en) | 2002-12-27 |
| WO2002102299A3 (en) | 2003-11-27 |
| CA2451353A1 (en) | 2002-12-27 |
| NZ530656A (en) | 2007-05-31 |
| CA2451353C (en) | 2012-01-17 |
| JP2005506058A (ja) | 2005-03-03 |
| DK1409547T3 (en) | 2018-01-08 |
| EP1409547A2 (en) | 2004-04-21 |
| US20030017134A1 (en) | 2003-01-23 |
| HUP0400231A2 (hu) | 2005-05-30 |
| PL373302A1 (en) | 2005-08-22 |
| EP1409547B1 (en) | 2017-09-20 |
| JP5148804B2 (ja) | 2013-02-20 |
| EP1409547A4 (en) | 2007-05-02 |
| HUP0400231A3 (en) | 2010-11-29 |
| NZ581793A (en) | 2010-07-30 |
| ES2652017T3 (es) | 2018-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK1409547T3 (en) | METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR IMMUNE MANIPULATION, PARTICULARLY USEFUL FOR CANCER TREATMENT | |
| JP4272535B2 (ja) | Ｔ細胞受容体様特異性を有し、さらに高親和性の抗体ならびに癌、ウイルス感染、および自己免疫疾患の検出および治療でのその使用 | |
| US11242405B2 (en) | Monoclonal antigen-binding proteins to intracellular oncogene products | |
| JP6514774B2 (ja) | 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用 | |
| AU2008234530B2 (en) | Antibodies, methods and kits for diagnosing and treating melanoma | |
| US8449889B2 (en) | Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using | |
| Lev et al. | Recruitment of CTL activity by tumor-specific antibody-mediated targeting of single-chain class I MHC-peptide complexes | |
| CN110799211A (zh) | 特异性识别丛蛋白-信号素-整合素结构域的抗ron单克隆抗体的药物呈递作用及其在肿瘤治疗中的应用 | |
| AU2008243241B2 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer | |
| ZA200309308B (en) | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer | |
| AU2002304279A1 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer | |
| Antibody-Mediated | Recruitment of CTL Activity by |