CN104884474A - 包含i类mhc的二硫键连接多价多功能蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本文报道二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于它包含两个或多个抗原呈递结构域、精确地一个抗体Fc区和至少一个抗原结合部位，其中抗原呈递结构域按N端至C端方向包含(i)β2-微球蛋白和(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，或(i)T细胞应答引出肽、(ii)β2-微球蛋白和(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其中抗原结合部位结合癌细胞表面抗原或病毒感染细胞表面抗原，且其中抗原呈递结构域具有至少两个形成链内/结构域间二硫键的非天然存在的半胱氨酸残基。

Description

包含I类MHC的二硫键连接多价多功能蛋白质
本文报道包含抗体片段和一个、两个或多个二硫键连接I类MHC成分的二硫键连接多价多功能蛋白质，及其在通过靶向吸引循环病毒特异性细胞毒性T细胞来去除癌细胞或病毒感染的细胞中的用途。
背景技术
I类MHC蛋白由α-链(α-1至3和跨膜结构域)和β2-微球蛋白组成。它是多基因的(单倍体基因组中有I类MHC蛋白的3个基因座)，产生6种不同的I类MHC蛋白α-链(在人类中是2个HLA-A、2个HLA-B、2个HLA-C)。MHC还是多态的。人HLA-A等位基因A*0201流行于约30％至50％的白种人人群中(参见例如Player等,J.Immunother.EmphasisTumor Immunol.19(1996)357-363)。
人巨细胞病毒huCMV(＝人疱疹病毒5，HHV-5)是最大的人病毒之一。它的基因组包含约230,000bp线性双链DNA，并编码超过160种蛋白质(参见例如Davison,A.J.等,J.Gen.Virol.84(2003)17-28)。
CMV已进化成为人基因组的极端寄生物，它是有效的免疫原，引发来自免疫系统的所有分支的强烈免疫应答。此病毒似乎是已知对人免疫系统免疫显性最强的抗原之一，刺激空前量级的CD8+-T细胞应答。
CMV“潜伏状态”依赖于CMV病毒的慢性免疫抑制而不是病毒转录模式的改变(参见例如Moss&Khan,Human Immunology 65(2004)456-464)。
CD8+-T细胞免疫应答并非均等地针对所有CMV蛋白质而是集中。CMV蛋白质pp65和IE-1是主要靶标参见(例如McLaughlin-Taylor,E.等,J.Med.Virol.43(1994)103-110；Moss&Khan,Human Immunology65(2004)456-464)。
CMV特异性T细胞的频率非常高，单种肽的频率在总CD8+-T细胞所有组成成分(repertoire)的至多1％至2％的量级(参见例如Moss&Khan,Human Immunology supra；Wills,M.R.等,J.Virol.70(1996)7569-7579)。
CMV特异性CD8+-T细胞应答随年龄显著增加，单种HLA肽四聚体常在总CD8+-T细胞库的超过10％中染色(参见例如Khan,N.等,J.Immunol.169(2002)1984-1992)。
健康老年供体中的总CD8+-T细胞应答可构成CD8+-T细胞库的约50％。
大量CD8+-T细胞扩增(expansion)常在克隆上非常受限，据估计，CMV是随着衰老在外周血中观察到的克隆CD8+-T细胞扩增中的至少30％的原因。与CMV血清阴性群组相比，60岁以上的CMV血清阳性供体中的总CD8+-T细胞计数高两倍(参见例如Looney,R.J.等,Clin.Immunol.90(1999)213-219)。
Mottez等(Eur.J.Immunol.21(1991)467-471)；Godeau等(J.Biol.Chem.267(1992)24223-24229)和Mage等(Proc.Natl.Acad.Sci.89(1992)10658-10662)报道了可溶性HLA和β-2-微球蛋白的融合。Mottez等(J.Exp.Med.181(1995)493-502)报道了病毒衍生肽与可溶性HLA和β-2-微球蛋白的融合。Dal Porto等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6671-6675)报道了免疫球蛋白重链与可溶性HLA和共表达的β-2-微球蛋白的融合。Robert等(Eur.J.Immun.30(2000)3165-3170)描述了具有与Fab化学偶联的链霉抗生物素蛋白的生物素化肽-可溶性HLA和β-2-微球蛋白的四聚体多功能蛋白质。Robert等(Cancer Immunity 1(2001)2)报道了具有病毒衍生肽与可溶性HLA和β-2-微球蛋白的融合的化学偶联Fab。Greten等(J.Immunol.Methods 271(2002)125-135)报道了具有可溶性HLA和β-2-微球蛋白的病毒衍生肽与鼠单克隆抗体重链的融合。Lev等(J.Immunol.169(2002)2988-2996；Proc.Natl.Acad.Sci.101(2004)9051-9056)和Novak等(Int.J.Cancer 120(2006)329-336)报道了不含肽的scFv融合的大肠杆菌(E.coli)表达、体外重折叠和肽加载。Mous等(Leukemia 20(2006)1096-1102)报道了加载肽并与融合链霉抗生物素蛋白的Fab或scFv抗体偶联的生物素化可溶性MHC的用途。
WO 2005/099361中报道了具有修饰的β-2-微球蛋白的I类MHC-肽-抗体缀合物。WO 2005/099361中报道的示例性缀合物通过体外缀合MHC-多功能蛋白质(HLA)的α链或通过在同一细胞中从分开的基因共表达而获得。
US 2004/0091488中报道了具有特异性载体分子的主要组织相容性多功能蛋白质I类抗原的抗原性构建体。这些所报道的融合多肽缺乏铰链区。
WO 99/13095中报道了加载多价嵌合肽的MHC/IG分子在检测、激活或抑制抗原特异性T细胞依赖性免疫应答中的用途。WO 02/102299中报道了用于免疫耗竭，尤其是用于治疗癌症的方法和药物组合物。Oelke,M.等(Nat.Med.9(2003)619-624)报道了通过HLA-Ig包被的人工抗原呈递细胞离体诱导和抗原特异性细胞毒性T细胞扩增。WO 2012/175508中报道了用包含I类MHC的复合物通过循环病毒特异性细胞毒性T细胞来去除靶细胞。Robert,B.等(Eur.J.Immunol.30(2000)3165-3170)报道了抗体缀合的I类MHC四聚体可以靶向肿瘤细胞进行T淋巴细胞的特异性裂解。
发明概述
本文报道二硫键连接的多价多功能蛋白质，其包含一个、两个或多个、在一个实施方案中为一个、在另一实施方案中为两个或四个抗原呈递结构域作为第一部分，一个抗体Fc区作为第二部分，及至少一个源自抗体且特异性结合靶抗原的抗原结合部位作为第三部分。
可用本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质将个体现有病毒特异性循环细胞毒性T细胞(记忆T细胞和/或效应T细胞)引导至表达靶抗原的细胞，二硫键连接多价多功能蛋白质的抗体衍生部分特异性结合该靶抗原。然后通过用I类MHC复合物包敷这些细胞，模拟与I类MHC蛋白多功能蛋白质连接的病毒衍生肽的急性病毒感染，吸引细胞毒性细胞，导致靶细胞的去除。
本文报道的一方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个、两个或两个以上抗原呈递结构域；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位；
其中抗原呈递结构域相互独立地按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出(eliciting)肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中一个或多个抗原结合部位结合癌细胞表面抗原或病毒感染细胞表面抗原；且
其中抗原呈递结构域具有至少两个形成链内/结构域间二硫键的非天然存在的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域中的一个非天然存在的半胱氨酸残基在T细胞应答引出肽之间的接头中，一个非天然存在的半胱氨酸残基在I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3之一中。在一个实施方案中，抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键(11位对应于接头的2位；227位对应于SEQ IDNO:72或SEQ ID NO:140的84位)。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域中的一个非天然存在的半胱氨酸残基在T细胞应答引出肽之间的接头中，一个非天然存在的半胱氨酸残基在I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3之一中。在一个实施方案中，抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键(11位对应于接头的2位；108位对应于SEQ IDNO:71的84位)。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域中的一个非天然存在的半胱氨酸残基在T细胞应答引出肽之间的接头中，一个非天然存在的半胱氨酸残基在β2-微球蛋白中。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域中的一个非天然存在的半胱氨酸残基在T细胞应答引出肽之间的接头中，一个非天然存在的半胱氨酸残基在β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外域α1之间的接头中。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含第一和第二条二硫键连接的Fc区多肽，由此抗原结合部位或抗原结合部位之一包含第一Fc区多肽和含有第二Fc区多肽的第二抗原结合部位(如果存在)。
在一个实施方案中，抗原结合部位包含：i)一对(关联)抗体重链和抗体轻链，由此单条链可以是野生型链或经修饰的链(取代、突变或结构域交换)；或ii)按N端至C端方向包含scFv抗体片段和抗体Fc区多肽的scFv融合多肽；或iii)按N端至C端方向包含scFab和抗体Fc区多肽的scFab融合多肽。
在一个实施方案中，抗原结合部位相互独立地包含：i)一对(关联)抗体重链和抗体轻链，由此单条链可以是野生型链或经修饰的链(取代、突变或结构域交换)；或ii)按N端至C端方向包含scFv抗体片段和抗体Fc区多肽的scFv融合多肽；或iii)按N端至C端方向包含scFab和抗体Fc区多肽的scFab融合多肽。
在一个实施方案中，i)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链N端或轻链N端连接(如果存在一个抗原呈递结构域)，或ii)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链N端或每个轻链N端连接(如果存在两个抗原呈递结构域)，或iii)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链C端或轻链C端连接(如果存在一个抗原呈递结构域)，或vi)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链C端或每个轻链C端连接(如果存在两个抗原呈递结构域)，或v)抗原呈递结构域与scFv融合多肽的N端或C端连接(如果存在一个抗原呈递结构域)，或vi)一个抗原呈递结构域与每个scFv融合多肽的每个N端或C端连接(如果存在两个抗原呈递结构域)，或vii)抗原呈递结构域与scFab融合多肽的N端或C端连接(如果存在一个抗原呈递结构域)，或viii)一个抗原呈递结构域与每个scFab融合多肽的每个N端或C端连接(如果存在两个抗原呈递结构域)，或ix)抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接(如果存在一个抗原呈递结构域)，或x)一个抗原呈递结构域与第一Fc区多肽的N端或C端连接，一个抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接(如果存在两个个抗原呈递结构域)。
在一个实施方案中，细胞表面抗原是癌细胞表面抗原。在一个实施方案中，癌细胞表面抗原是黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质是共价二硫键连接多价多功能蛋白质。
在一个实施方案中，T细胞应答引出肽是病毒衍生肽。在一个实施方案中，T细胞应答引出肽是CD8+-T细胞应答引出肽。
在一个实施方案中，病毒选自人巨细胞病毒、腺相关病毒、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、人疱疹病毒4型(EB病毒)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒35型、人乳头瘤病毒39型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒51型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒56型、人乳头瘤病毒58型、人乳头瘤病毒59型、人乳头瘤病毒68型、人乳头瘤病毒73型、人乳头瘤病毒82型、人T淋巴细胞病毒I型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、痘苗病毒、登革病毒。
在一个实施方案中，病毒衍生肽选自肽
NLVPMVATV(SEQ ID NO：01)，VTEHDTLLY(SEQ ID NO：02)，NTDFRVLEL(SEQ ID NO：03)，CVETMCNEY(SEQ ID NO：04)，VLEETSVML(SEQ ID NO：05)，NLVPMVATV(SEQ ID NO：06)，RIFAELEGV(SEQ ID NO：07)，IIYTRNHEV(SEQ ID NO：08)，VLAELVKQI(SEQ IDNO：09)，AVGGAVASV(SEQ ID NO：10)，TVRSHCVSK(SEQ ID NO：11)，IMREFNSYK(SEQ ID NO：12)，GPISHGHVLK(SEQ ID NO：13)，ATVQGQNLK(SEQ ID NO：14)，VYALPLKML(SEQ ID NO：15)，AYAQKIFKIL(SEQ ID NO：16)，QYDPVAALF(SEQ ID NO：17)，YVKVYLESF(SEQ ID NO：18)，DIYRIFAEL(SEQ ID NO：19)，VFETSGGLVV(SEQ ID NO：20)，KARDHLAVL(SEQ ID NO：21)，QARLTVSGL(SEQ ID NO：22)，KARAKKDEL(SEQ ID NO：23)，QIKVRVDMV(SEQ ID NO：24)，RRRHRQDAL(SEQ ID NO：25)，ARVYEIKCR(SEQ ID NO：26)，KMQVIGDQY(SEQ ID NO：27)，NVRRSWEEL(SEQ ID NO：28)，CPSQEPMSIYVY(SEQ ID NO：29)，KPGKISHIMLDVA(SEQ ID NO：30)，ELRRKMMYM(SEQ ID NO：31)，IPSINVHHY(SEQ ID NO：32)，FEQPTETPP(SEQ ID NO：33)，YAYIYTTYL(SEQ ID NO：34)，QEFFWDANDIY(SEQ IDNO：35)，YEQHKITSY(SEQ ID NO：36)，QEPMSIYVY(SEQ ID NO：37)，SEHPTFTSQY(SEQ ID NO：38)，QAIRETVEL(SEQ ID NO：39)，TRATKMQVI(SEQ ID NO：40)，DALPGPCI(SEQ ID NO：41)，CEDVPSGKL(SEQ ID NO：42)，HERNGFTVL(SEQ ID NO：43)，PTFTSQYRIQGKL(SEQ ID NO：44)，QMWQARLTV(SEQ ID NO：45)，HELLVLVKKAQL(SEQ ID NO：46)，orDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：47)，SLYNTVATL(SEQ ID NO：48)，GLCTLVAML(SEQ ID NO：49)，GILGFVFTL(SEQ ID NO：50)，STNRQSGRQ(SEQ ID NO：51)，LLFGYPVYV(SEQ ID NO：52)，FAEGFVRAL(SEQ IDNO：53)，LIVIGILIL(SEQ ID NO：54)，or ILHTPGCV(SEQ ID NO：55)，WYAQIQPHW(SEQ ID NO：56)，AFSGVSWTM(SEQ ID NO：57)，ILIGVVITW(SEQ ID NO：58)，MMIPTVVAF(SEQ ID NO：59)，PFPQSNAPI(SEQ ID NO：60)，LLLTLLATV(SEQ ID NO：61)，IVLEHGSCV(SEQ IDNO：62)，LLFKTENGV(SEQ ID NO：63)，PLNEAIMAV(SEQ ID NO：64)，NLVRLQSGV(SEQ ID NO：65)，LVISGLFPV(SEQ ID NO：66)，LLLVAHYAI(SEQ ID NO：67)，LALLAAFKV(SEQ ID NO：68)，VILAGPMPV(SEQ IDNO：69)，HVLGRLITV(SEQ ID NO：70)；或其包含1至3个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
在一个实施方案中，病毒衍生肽是人巨细胞病毒衍生肽。在一个实施方案中，病毒衍生肽具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一个实施方案中，病毒衍生肽具有选自SEQ ID NO:01至SEQ IDNO:47的氨基酸序列。
在一个实施方案中，病毒衍生肽具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
在一个实施方案中，相对频率为1％或更高的I类MHC分子具有10％或更高的相对频率。
在一个实施方案中，相对频率为1％或更高的I类MHC分子是HLA-A*0201、或HLA-A*1101、或HLA-A*2402、或HLA-A*340101、或HLA-C*0304、或HLA-C*0401、或HLA-C*0702。
在一个实施方案中，依据要对其施用二硫键连接多价多功能蛋白质的个体的区域选择相对频率为1％或更高的I类MHC分子如下：
-对于欧洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701和HLA-C*0702；
-对于澳洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-B*5601、HLA-B*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403和HLA-C*1502；
-对于北美血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401和HLA-C*0702；和
-对于东南亚血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702和HLA-C*0801。
在一个实施方案中，依据要对其施用二硫键连接多价多功能蛋白质的个体的区域选择相对频率为1％或更高的I类MHC分子如下：
-对于欧洲血统个体，I类MHC分子是HLA-A*0201；
-对于澳洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*2402、HLA-B*1301、HLA-C*0102和HLA-C*0401；
-对于北美血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*2402和HLA-C*0304；和
-对于东南亚血统个体，I类MHC分子是HLA-A*2402。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含T细胞应答引出肽、β2-微球蛋白及相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含T细胞应答引出肽、相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3及β2-微球蛋白，其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含T细胞应答引出肽、β2-微球蛋白及相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含T细胞应答引出肽、相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3及β2-微球蛋白，其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，相对频率低于1％的I类MHC分子选自HLA-B*4201、HLA-B*5901、HLA-B*6701和HLA-B*7802。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域包含：
(i)病毒衍生肽；
(ii)β2-微球蛋白；
(iii)可溶性HLA-A等位基因A*0201；和
(iv)至少11位和227位的半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域包含：
(i)病毒衍生肽；
(ii)可溶性HLA-A等位基因A*0201；
(iii)β2-微球蛋白；和
(iv)至少11位和108位的半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白是人β2-微球蛋白。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白是野生型人β2-微球蛋白。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白是人β2-微球蛋白，且相对频率为10％或更高的I类MHC分子是人HLA-A*0201。
在一个实施方案中，I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3由SEQ IDNO:140的氨基酸序列组成，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含β2-微球蛋白及具有低于1％的相对出现频率的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含具有低于1％的相对出现频率的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3及β2-微球蛋白，其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，病毒衍生肽经第一接头肽与β2-微球蛋白融合。
在一个实施方案中，病毒衍生肽与β2-微球蛋白的N端融合。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白经第二接头肽与I类MHC分子的胞外域α1融合。
在一个实施方案中，I类MHC分子的胞外域α3经第三接头肽与二硫键连接的多肽链之一融合。
在一个实施方案中，第一、第二和第三接头肽相同或不同。
在一个实施方案中，第一接头肽、第二接头肽和第三接头肽相互独立地选自氨基酸序列GS(SEQ ID NO:73)、GGS(SEQ ID NO:74)、GSG(SEQ ID NO:136)、GGGS(SEQ ID NO:75)、GGGSGGGS(SEQ ID NO:76)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:77)、GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:78)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:79)、GGGGS(SEQ ID NO:80)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:81)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:82)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:83)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)、和GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:139)。
在所有方面的一个实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。
在所有方面的一个实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在所有方面的一个实施方案中，第三接头肽包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(iv)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)至少11位和227位的半胱氨酸残基，及11位和227位的半胱氨酸残基之间的二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(iv)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(v)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)至少11位和108位的半胱氨酸残基，及11位和108位的半胱氨酸残基之间的二硫键。
在一个实施方案中：
-第一接头肽具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；和/或
-第二接头肽具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和/或
-第三接头肽具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质的特征在于，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)β2-微球蛋白，其具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(iv)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)至少11位和227位的半胱氨酸残基，及11位和227位的半胱氨酸残基之间的二硫键。
在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质的特征在于，抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(iv)β2-微球蛋白，其具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(v)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)至少11位和108位的半胱氨酸残基，及11位和108位的半胱氨酸残基之间的二硫键。
在一个实施方案中，抗体Fc区选自IgG种类或IgE种类的人抗体的抗体Fc区。
在一个实施方案中，抗体Fc区选自IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4亚类的人抗体的抗体Fc区。
在一个实施方案中，抗体Fc区属于IgG1或IgG2亚类的人抗体，且在E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330和/或P331(按照Kabat的EU指数编号)中包含至少一个突变。
在一个实施方案中，抗体Fc区属于具有突变L234A和L235A、和/或突变D265A和N297A、和/或包含PVA236突变、和/或包含突变P329G的IgG1亚类或人IgG2亚类的人抗体。
在一个实施方案中，抗体Fc区属于具有突变L234A和L235A和/或P329G的IgG1亚类的人抗体。
在一个实施方案中，抗体Fc区属于具有突变S228P和/或L235E的IgG4亚类的人抗体。
在一个实施方案中，第一和第二抗体Fc区多肽相互独立地选自SEQID NO:87至101。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的Fc区多肽。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的Fc区多肽。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的Fc区多肽。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其相互独立地按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位或227位具有半胱氨酸残基，且11位和108位或227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其包含含有选自SEQ ID NO:104至106的氨基酸序列的抗体轻链可变结构域和含有SEQ ID NO:108至110的抗体重链可变结构域，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一条SEQ ID NO:117的多肽链；
-一条SEQ ID NO:118的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一条SEQ ID NO:137的多肽链；
-一条SEQ ID NO:118的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一条SEQ ID NO:117的多肽链；
-一条SEQ ID NO:118的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一条SEQ ID NO:137的多肽链；
-一条SEQ ID NO:118的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两条SEQ ID NO:117的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两条SEQ ID NO:137的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两条SEQ ID NO:117的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的一个方面是二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两条SEQ ID NO:137的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含：抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3；抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含：抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3；抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变结构域，及与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含SEQ ID NO:114的抗体重链可变结构域和SEQ ID NO:113的抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含SEQ ID NO:114和SEQ IDNO:113。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含与SEQ ID NO:116的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变结构域，及与SEQ ID NO:115的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含SEQ ID NO:116的抗体重链可变结构域和SEQ ID NO:115的抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，MCSP结合部位包含SEQ ID NO:116和SEQ IDNO:115。
在一方面，本发明提供二硫键连接的多价多功能蛋白质，其包含分离的结合MCSP的抗体的结合特异性(即HVR或可变结构域)。具体而言，包含在本文提供的二硫键连接多价多功能蛋白质中的抗-MCSP抗体结合特异性(即HVR或可变结构域)结合人MCSP的近膜表位。如Staub,E.等(FEBS Lett.527(2002)114-118)中所讨论，MCSP的近膜表位由多个新的重复结构域(称为CSPG重复结构域)组成。
本文报道的一个方面是编码本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质的核酸。
在一个实施方案中，核酸包含2至4个含有编码具有不同氨基酸序列的多肽的结构基因的表达盒。
本文报道的一个方面是包含本文报道的核酸的宿主细胞。
本文报道的一个方面是产生本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质的方法，其包括培养本文报道的宿主细胞，使得产生二硫键连接的多价多功能蛋白质。
在一个实施方案中，从细胞或培养基回收二硫键连接的多价多功能蛋白质，从而产生二硫键连接的多价多功能蛋白质。
本文报道的一个方面是包含本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质和可选的可药用载体的药物制剂。
在一个实施方案中，药物制剂进一步包含附加治疗剂。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用作药物。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于治疗癌症。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于治疗病毒感染。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于消除(去除)癌细胞。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于消除(去除)病毒感染的细胞。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。
在一个实施方案中，药物用于治疗病毒感染。
在一个实施方案中，药物用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
在一个实施方案中，药物用于消除(去除)癌细胞。
在一个实施方案中，药物用于消除(去除)病毒感染的细胞。
本文报道的一个方面是治疗患有癌症的个体的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。
在一个实施方案中，该方法进一步包括对个体施用附加治疗剂。
本文报道的一个方面是治疗患有病毒感染的个体的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。
在一个实施方案中，该方法进一步包括对个体施用附加治疗剂。
本文报道的一个方面是将个体病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至个体中的靶标的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质来将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
本文报道的一个方面是去除个体中的癌细胞的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质来去除/分解癌细胞。
本文报道的一个方面是去除个体中的病毒感染细胞的方法，其包括对个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质来去除/分解病毒感染的细胞。
本文报道的一个方面是用于在真核细胞中重组产生二硫键连接多价多功能蛋白质的方法，该二硫键连接多价多功能蛋白质包含i)β2-微球蛋白与I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3的融合多肽，ii)一对各包含抗体铰链区的二硫键连接多肽链，及iii)至少一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域，该方法包括步骤i)培养包含一个或多个编码二硫键连接多价多功能蛋白质的核酸的真核细胞，及ii)从细胞或培养基回收二硫键连接多价多功能蛋白质，其中二硫键连接多价多功能蛋白质包含β2-微球蛋白与I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3的一个、两个或多个二硫键连接融合多肽，其中二硫键在残基11和227之间。
在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质包含一个MHC衍生多肽或一个含有MHC衍生分子的融合多肽。
在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质包含两个MHC衍生多肽或两个含有MHC衍生分子的融合多肽。
在一个实施方案中，以培养基中1mg/L或更高的浓度获得二硫键连接多价多功能蛋白质。在一个实施方案中，以培养基中4mg/L或更高的浓度获得二硫键连接多价多功能蛋白质。
在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人胚肾细胞、或中国仓鼠卵巢细胞、或幼仓鼠肾细胞、或小鼠骨髓瘤细胞。
以下实施方案可与本文报道的任意方面组合。本文报道的任意实施方案也可以与本文报道的任意其他实施方案或实施方案的组合相组合。
发明详述
附图简述
图1本文报道的示例性二硫键连接二价二硫键连接多价多功能蛋白质的注释方案；HLA-Fc区融合多肽N端至C端顺序：1-2-3-4-5-6-(3-6二硫键)-7-8-9-12-13-14(具有II)；HLA-重链融合多肽N端至C端顺序：1-2-3-4-5-6-(3-6二硫键)-7-8-9-10-11-12-13-14(具有I)；轻链：a-b。
图2包含在本文报道的多功能蛋白质中的示例性多肽：融合多肽在N端与抗体轻链或与包含抗体重链铰链区的多肽融合。
图3用对应的表达质粒转染的HEK293细胞的细胞培养物上清的SDS聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹。用过氧化物酶缀合的多克隆兔抗-人κ-轻链抗体和与辣根过氧化物酶缀合的多克隆兔抗-人IgG抗体进行染色。
泳道：1：双臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc；2：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+IgG-Fc；3：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc；4：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-重链+IgG-重链+IgG-轻链；5：双臂β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-轻链+IgG-重链；6：双臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-轻链+IgG-重链；7：双臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-重链+IgG-轻链；8：双臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv；9：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+单臂IgG(重链和轻链)；10：分子量标记；11：参考标准IgG1抗体。
图4测定用特异性肽体外刺激之前和之后来自不同供体的CMV特异性溶细胞性T细胞的数目的流式细胞术分析：4个人供体衍生的外周血淋巴细胞(PBL)的分析；FITC标记缀合的抗-CD8抗体染色(BD,目录号345772)与Pro5五聚体APC(ProImmune,目录号F008-4A-E)染色的TCR组合，识别加载CMV衍生肽(NLVPMVATV,SEQ ID NO:01)的I类MHC(HLA-A*0201)；圆形：CMV特异性CD8+-T细胞；A：供体1；B供体3。
图5A：考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶：泳道1：分子量标准，泳道2：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+单臂IgG(重链和轻链)，非还原条件；泳道3：单臂肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-IgG-Fc+单臂IgG多功能蛋白质(重链和轻链)，还原条件。
B：大小排阻层析层析图；1：高分子量形式(面积0.7％)；2：单体多功能蛋白质(面积99.3％)。
C：示意分子。
图6A：a)蛋白A HPLC和SEC后的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶；非还原条件；泳道1：分子量标准，泳道2：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+IgG-Fc，泳道3：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+单臂IgG(重链和轻链)。
b)：蛋白A HPLC和SEC后的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶；还原条件；泳道1：分子量标准，泳道2：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+IgG-Fc，泳道3：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+单臂IgG(重链和轻链)。
B：a)肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+IgG-Fc的大小排阻层析层析图；1：高分子量形式(面积1.9％)；2：单体多功能蛋白质(面积98.1％)。
b)肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+单臂IgG(重链和轻链)的大小排阻层析层析图；1：高分子量形式(面积2.1％)；2：单体多功能蛋白质(面积97.9％)。
C：示意分子2：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+IgG-Fc，3：肽-β2-微球蛋白-HLA-A0201-HC+LC+单臂IgG。
图7不同MHC-I多功能蛋白质在MCSP+靶细胞(Colo38)上的结合：用Accutase(PAA,目录号L11-007)孵育Colo38细胞5分钟，以获得单细胞悬液。用100μl含1μg/ml MHC-I多功能蛋白质的PBS/2％FCS在4℃孵育2x105细胞/管45分钟。孵育后，用1ml冷PBS/2％FCS洗涤细胞，并以910转/分钟离心7分钟。将细胞重悬在100μl含二抗(山羊抗-人IgG1抗体PE缀合物,Jackson,目录号109-116-088)(2μg/ml)的PBS/2％FCS中，并在4℃再孵育45分钟。用1ml PBS％2％FCS洗涤细胞两次，并用BD Canto II流式细胞仪测量。
图8细胞毒性测定：本文报道的抗原结合多功能蛋白质引发H460M2肿瘤细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。a)(6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:1.5；b)(6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.75；c)(6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.5；左侧条：本文报道的多功能蛋白质；右侧条：无岩藻糖基化MAB IGF-1R。
图9细胞毒性测定：本文报道的抗原结合多功能蛋白质引发I243T3肿瘤细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。a)(9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:1.5；b)(9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.75；c)(9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.5；左侧条：本文报道的多功能蛋白质；中央条：MAB IGF-1R-afu；右侧条：抗-洋地黄毒苷抗体。
图10抗-IGF-1R抗体和本文报道的多功能蛋白质与肺腺癌细胞系H460M2的结合的FACS分析；a)仅二抗(山羊抗-人IgG(H+L)(JacksonLaboratories,目录号109-116-088))；b)本文报道的多功能蛋白质，其中融合多肽与仅包含一对可变结构域的抗-IGF-1R抗体的重链N端融合；c)抗-IGF-1R抗体。
图11本文报道的不同多功能蛋白质的体外功效和特异性(细胞毒性测定)；a)包含单价抗-IGF1R抗体和CMV衍生肽的多功能蛋白质；b)包含单价抗-IGF1R抗体和EBV衍生肽的多功能蛋白质(对照)；c)包含二价抗-IGF1R抗体和CMV衍生肽的多功能蛋白质；d)抗-IGF-1R抗体(对照)；e)抗-洋地黄毒苷抗体(对照)。
图12在不同的靶细胞(T)/效应细胞(E)比下测定的本文报道的多功能蛋白质的体外功效和特异性(EC50值)，其中融合多肽与完整的抗-IGF-1R抗体的重链N端融合。
图13按1:1.5的靶细胞/效应细胞比与a)包含单价抗-IGF1R抗体和含有CMV衍生肽的融合多肽的多功能蛋白质及b)抗-IGF-1R抗体孵育6小时后靶细胞的裂解。
图14用MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质孵育的Colo38细胞的归一化细胞指数的过程；1μg/ml多功能蛋白质浓度(MHCI-0008(1)、MHCI-0010(2)、MHCI-0030(3)、MHCI-0031(4))，效应细胞与靶细胞的比为10:1；来自供体3的PBMC(200.000细胞，供体3为CMV阳性但为EBV阴性)和黑素瘤肿瘤细胞系Colo38(20.000细胞)，按照96孔，数据为三个重复。
图15A：用MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质孵育的Colo38细胞的归一化细胞指数的过程；1μg/ml多功能蛋白质浓度(MHCI-0008(1)、MHCI-0010(2)、仅PBMC(3))，效应细胞与靶细胞的比为10:1；来自供体3的PBMC(200.000细胞，供体3为CMV阳性但为EBV阴性)和黑素瘤肿瘤细胞系Colo38(20.000细胞)，按照96孔，数据为三个重复。
B：用MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质孵育的WM266细胞的归一化细胞指数的过程；1μg/ml多功能蛋白质浓度(MHCI-0008(1)、MHCI-0010(2)、MHCI-0030(3)、MHCI-0031(4)、靶细胞单独(5)、靶细胞+T-细胞(6))，效应细胞与靶细胞的比为10:1；来自供体3的PBMC(200.000细胞，供体3为CMV阳性但为EBV阴性)和黑素瘤肿瘤细胞系MW266(20.000细胞)，按照96孔，数据为三个重复。
图16在未刺激的PBMC存在下用多功能蛋白质孵育42小时后，多功能蛋白质MHCI-0008(单价，加载CMV肽，1)、MHCI-0010(单价，加载EBV肽的对照，2)、MHC-0026(二价，加载CMV肽，非结合对照，3)、MHCI-0030(单价，加载CMV肽，活性，4)和MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性，5)的靶细胞裂解。
图17在未刺激的PBMC存在下用多功能蛋白质孵育48小时后，多功能蛋白质MHCI-0008(单价，加载CMV肽，1)、MHCI-0010(单价，加载EBV肽的对照，2)、MHC-0026(二价，加载CMV肽，非结合对照，3)、MHCI-0030(单价，加载CMV肽，活性，4)和MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性，5)的LDH释放。
图18A：在经刺激的PBMC存在下用多功能蛋白质孵育10小时后，浓度为1μg/ml的多功能蛋白质MHCI-0008(单价，加载CMV肽，1)、MHCI-0010(单价，加载EBV肽的对照，2)、MHC-0026(二价，加载CMV肽，非结合对照，3)、MHCI-0030(单价，加载CMV肽，活性，4)和MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性，5)的Colo38细胞裂解。
B：在经刺激的PBMC存在下用多功能蛋白质孵育10小时后，浓度为1μg/ml的多功能蛋白质MHCI-0008(单价，加载CMV肽，1)、MHCI-0010(单价，加载EBV肽的对照，2)、MHC-0026(二价，加载CMV肽，非结合对照，3)、MHCI-0030(单价，加载CMV肽，活性，4)和MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性，5)的WM266细胞裂解。
图19非二硫键稳定的多功能蛋白质(A)和二硫键稳定的多功能蛋白质(B)在蛋白A亲和层析之后、制备型大小排阻层析之前的分析型大小排阻层析。
图20浓度为1μg/ml的多功能能蛋白质MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性，非二硫键连接，1)和MHCI-0054(二价，加载CMV肽，活性，MHCI-0031的二硫键连接形式，2)在经刺激的PBMC存在下的Colo38细胞裂解。
图21野生型全长IgG(三角形)、本文报道的示例性二硫键连接多价多功能蛋白质(菱形)、无二硫键稳定化的多价多功能蛋白质(星号)的热稳定定性。
序列简述
SEQ ID NO:01至47  人巨细胞病毒衍生肽。
SEQ ID NO:48      人免疫缺陷病毒衍生肽。
SEQ ID NO:49      人疱疹病毒4型衍生肽。
SEQ ID NO:50      甲型流感病毒衍生肽。
SEQ ID NO:51      乙型肝炎病毒衍生肽。
SEQ ID NO:52      人T淋巴细胞病毒1型衍生肽。
SEQ ID NO:53      V-jun肉瘤病毒17型癌基因同源物(JUN)衍生肽。
SEQ ID NO:54      人腺病毒3型衍生肽。
SEQ ID NO:55      丙型肝炎病毒衍生肽。
SEQ ID NO:56至70  登革病毒衍生肽。
SEQ ID NO:71      人β2-微球蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO:72      人HLA-A*0201α1-α3链氨基酸序列。
SEQ ID NO:73-84   接头肽氨基酸序列。
SEQ ID NO:85      人IgG1CH2结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:86      人IgG1CH2结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:87      人IgG1Fc区氨基酸序列。
SEQ ID NO:88      人IgG1Fc区L234A、L235A突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:89      人IgG1Fc区T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:90      人IgG1Fc区T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:91      人IgG1Fc区L234A、L235A、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:92      人IgG1Fc区L234A、L235A、T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:93      人IgG1Fc区P329G突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:94      人IgG1Fc区L234A、L235A、P329G突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:95      人IgG1Fc区P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:96      人IgG1Fc区P329G、T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:97      人IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:98      人IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:99      人IgG4Fc区氨基酸序列。
SEQ ID NO:100     人IgG4Fc区S228P、L235E突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:101     人IgG4Fc区S228P、L235E、P329G突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:102     人IgG4Fc区S228P、L235E、P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:103     人IgG4Fc区S228P、L235E、P329G、T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:104     HVR-L1
SEQ ID NO:105     HVR-L2
SEQ ID NO:106     HVR-L3
SEQ ID NO:107     HVR-L1
SEQ ID NO:108     HVR-H1
SEQ ID NO:109     HVR-H2
SEQ ID NO:110      HVR-H3
SEQ ID NO:111      HVR-H1
SEQ ID NO:112      HVR-H2
SEQ ID NO:113      VL
SEQ ID NO:114      VH
SEQ ID NO:115      VL
SEQ ID NO:116      VH
SEQ ID NO:117      MHC-I-VH(MCSP)-IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:118      VH(MCSP)-IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366W突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:119      VL(MCSP)-CL氨基酸序列。
SEQ ID NO:120      人源化抗-IGF-1R单克隆轻链抗体氨基酸序列(κ)。
SEQ ID NO:121      人源化抗-IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体)。
SEQ ID NO:122      人源化抗-IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体和杵变体)。
SEQ ID NO:123      人源化抗-IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体和臼变体)。
SEQ ID NO:124      人IgG1Fc区变体铰链区及L234A、L235A突变体和杵变体。
SEQ ID NO:125      人源化抗-IGF-1R单克隆抗体的二硫键稳定的单链Fv。
SEQ ID NO:126      鼠抗-MCSP单克隆轻链抗体氨基酸序列(κ)。
SEQ ID NO:127      人源化抗-MCSP单克隆轻链抗体氨基酸序列(κ)。
SEQ ID NO:128      鼠抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体)。
SEQ ID NO:129      人源化抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体)。
SEQ ID NO:130      鼠抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体和杵变体)。
SEQ ID NO:131      人源化抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体和杵变体)。
SEQ ID NO:132      鼠抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234A、L235A突变体和臼变体)。
SEQ ID NO:133      人源化抗-MCSP单克隆重链抗体氨基酸序列(IgG1L234AL235A突变体和臼变体)。
SEQ ID NO:134      鼠抗-MCSP单克隆抗体的二硫键稳定的单链Fv。
SEQ ID NO:135      人源化抗-MCSP单克隆抗体的二硫键稳定的单链Fv。
SEQ ID NO:136      接头肽13。
SEQ ID NO:137      二硫键稳定的MHC-I-VH(MCSP)-IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:138      人MCSP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:139      二硫键连接多功能蛋白质的接头。
SEQ ID NO:140      用于二硫键连接多功能蛋白质的经修饰的人HLA-A*0201α1-α3链氨基酸序列。
SEQ ID NO:141      VH(MCSP)-IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:142      VH(MCSP)-IgG1Fc区L234A、L235A、P329G、T366W突变体氨基酸序列。
I.定义
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中所述的那些。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
本申请内所用的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸的组，其可以由核酸直接编码或以前体的形式编码。单个氨基酸由由三个核苷酸组成的核酸(所谓的密码子或碱基三联体)编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。这称为“遗传密码的简并性”。本申请内所用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、丙氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
术语“抗-靶标抗体”和“结合靶标的抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合靶标，使得该抗体可用作诊断和/或治疗剂靶向该靶标。在某些实施方案中，结合靶标的抗体具有≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外的包含完整抗体的部分的分子，其结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单结构域抗体；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“抗原结合部位”指可特异性结合靶标蛋白质部分。示例性抗原结合部位是肽、抗体片段、结构域抗体、或单链抗体(例如骆驼或鲨鱼抗体)的可变结构域。抗原结合部位可以是天然存在的抗原结合部位或改造的抗原结合部位。示例性改造的抗原结合部位是DARPIN、结构域交换的抗体或结构域交换的抗体片段和双可变结构域抗体。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“相对频率为…的I类MHC分子”指该I类MHC分子在特定人群中或在全人类内具有给定相对频率的出现频率。即相对频率为10％或更高的I类MHC可见于特定群体的所有人类的10％或更多中，例如欧洲血统的所有人类的27.2％中。
多功能蛋白质与其缀合配偶体的“缀合”可通过不同方法进行，如化学结合，或经特异性结合对或经遗传融合而结合。术语“缀合配偶体”指例如多肽、可检测标记、特异性结合对的成员。在一个实施方案中，通过经由二硫键连接多价多功能蛋白质的部分的氨基酸序列的N端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同溶素的ε-氨基、羧基、巯基、羟基、和/或酚官能团，和/或二硫键连接多价多功能蛋白质的糖类结构的糖醇基团的化学偶联来进行二硫键连接多价多功能蛋白质与其缀合配偶体的缀合。在一个实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质经特异性结合对与其缀合配偶体缀合。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如氨甲喋呤、阿霉素、长春花生物碱(长春花新碱(vincristine)、长春灭瘟碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及多种抗肿瘤剂或抗癌剂。
色原(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR活性基团或金属粒子、半抗原(例如洋地黄毒苷)是“可检测标记”的实例。可检测标记还可以是光活化交联基团，例如叠氮基或azirine基团。可通过电化学发光检测的金属螯合物也是适宜的信号发射基团，特别感兴趣的是钌螯合物，例如钌(双吡啶基)3 2+螯合物。适宜的钌标记基团描述于例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中。对于直接检测，标记基团可以选自任意已知的可检测标记基团，如染料，发光标记基团，如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其他实例是发光金属络合物，如钌或铕络合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定，例如A-0 061 888)的酶，及放射性同位素。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区且随抗体种类而不同的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞激活。
活性剂(例如药物制剂)的“有效量”指对在必要的剂量和时期下达到希望的治疗或预防结果有效的量。
本文所用的术语“表达”指发生在细胞内的转录和/或翻译和分泌过程。目的核酸序列在细胞中的转录水平可根据存在于细胞中的相应mRNA的量来测定。例如，可通过RT-PCR或通过Northern杂交来定量从目的序列转录的mRNA(参见Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989))。核酸所编码的多肽可通过多种方法来定量，例如，通过ELISA，通过测定多肽的生物学活性，或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫测定(参见Sambrook等,(1989),上文)。
“表达盒”指包含用于在细胞中表达至少所包含的核酸的必要调节元件(如启动子和多腺苷酸化位点)的构建体。
术语“表达机器”指细胞的酶、辅因子等的总和，其涉及以核酸或基因的转录步骤(即，也称为“基因表达机器”)开始至核酸所编码的多肽的翻译前后修饰的步骤。表达机器例如包含DNA转录为前mRNA、前mRNA剪接为成熟mRNA、mRNA翻译为多肽和多肽翻译后修饰的步骤。
“表达质粒”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒包含含有复制起点的例如用于大肠杆菌的原核质粒繁殖单位，选择标记，真核选择标记，及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，该表达盒各含有启动子、结构基因和转录终止子(包括多腺苷酸化信号)。通常将基因表达放置在启动子的控制下，这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。
术语“Fc区”指免疫球蛋白重链的C端区域。Fc区是包含两条二硫键连接的抗体重链多肽的二聚体分子。Fc区可通过完整(全长)抗体的木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或胰蛋白酶消化产生，或可重组产生。
可从全长抗体或免疫球蛋白获得的Fc区至少包含全长重链的残基226(Cys)至C端，因此包含部分铰链区和两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域及IgE和IgM类抗体情况下的附加/额外的CH4结构域。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非文中另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat,E.A.等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication91-3242中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
包含两条相同或不相同的抗体重链Fc区多肽的二聚体Fc区的形成由所包含的CH3结构域的非共价二聚化(所涉及的氨基酸残基参见例如Dall'Acqua,Biochem.37(1998)9266-9273)介导。通过在铰链区中形成二硫键共价稳定Fc区(参见例如Huber等,Nature 264(1976)415-420；Thies等,J.Mol.Biol.293(1999)67-79)。
从US 5,648,260和US 5,624,821已知，Fc区中限定的氨基酸残基的修饰导致表型效应。
在一个实施方案中，本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质可包含人Fc区或源自人来源的Fc区作为抗体重链铰链区多肽。在另一实施方案中，Fc区是IgG4亚类人抗体的Fc区或IgG1、IgG2或IgG3亚类人抗体的Fc区，其以这样的方式修饰，使得检测不到Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合和/或C1q结合。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区且尤其来自人IgG4亚类，或来自人IgG1亚类的突变Fc区。在一个实施方案中，Fc区来自具有突变L234A和L235A和P329G的人IgG1亚类。虽然IgG4显示减少的Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。但是，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖类丧失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和/或His435是这样的残基，如果改变它们，则也提供减少的Fcγ受体结合(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；EP 0307434)。在一个实施方案中，本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质是关于在L234、L235、P329和/或D265中具有突变和/或包含PVA236突变的IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的Fcγ受体结合。在一个实施方案中，该突变是S228P、L234A、L235A、L235E、PVA236(PVA236表示用PVA替换IgG1的从氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母代码给出)或IgG4的EFLG)和/或P329G。在一个实施方案中，该突变是IgG4的S228P和P329G及IgG1的L234A、L235A和P329G。抗体Fc区直接涉及ADCC(依赖抗体的细胞毒性)和CDC(依赖补体的细胞毒性)。不结合Fcγ受体和/或补体因子C1q的二硫键连接多价多功能蛋白质不引出依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。
IgG1同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：87).
具有突变L234A、L235A的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：88).
具有T366S、L368A和Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：89).
具有T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：90).
具有L234A、L235A和T366S、L368A和Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：91).
具有L234A、L235A和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：92).
具有P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：93).
具有L234A、L235A和P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：94).
具有P239G和T366S、L368A和Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：95).
具有P329G和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：96).
具有L234A、L235A、P329G和T366S、L368A和Y407V突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：97).
具有L234A、L235A、P329G和T366W突变的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：98).
IgG4同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：99).
具有S228P和L235E突变的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：100).
具有S228P、L235E和P329G突变的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：101).
具有S228P、L235E、P329G和T366S、L368A和Y407V突变的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：102).
具有S228P、L235E、P329G和T366W突变的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：103).
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
术语“细胞”包括用于繁殖质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞二者。在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自包括CHO细胞(例如CHO K1、CHO DG44)、BHK细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、细胞和COS细胞的哺乳动物细胞。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。
“个体(individual)”或“对象(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该个体或对象是人。
“分离的”二硫键连接多价多功能蛋白质是已从其天然环境的成分分开的二硫键连接多价多功能蛋白质。在一些实施方案中，将二硫键连接多价多功能蛋白质纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的纯度大于95％或99％。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
除非另有说明，本文所用的术语“MCSP”指来自任意脊椎动物来源(包括哺乳动物，如灵长类(例如人类)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任意天然MCSP(黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖)。该术语涵盖“全长”、未加工的MCSP，以及产生自细胞中的加工的任意形式的MCSP。该术语还涵盖天然存在的MCSP变体，例如剪接变体或等位基因变体。MCSP也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、硫酸软骨素蛋白聚糖NG2、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)和黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖。示例性人MCSP的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中显示。还参见Pluschke,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)9710-9715；Staub,E.等,FEBS Lett.527(2002)114-118；及GenBank检索号：NP_001888。
术语“一个抗原呈递结构域”指精确地一个(即单个)所定义的抗原呈递结构域，并排除其他(即第二)所定义的抗原呈递结构域的存在。术语“一个”指“精确地一个”或“单个”。
术语“两个抗原呈递结构域”指精确地两个所定义的抗原呈递结构域的存在，并排除仅单个(即一个)抗原呈递结构域的存在。
“有效连接的”指两种或多种成分的并列，其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，但并非必然，“有效连接的”DNA序列是相邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区(如分泌前导序列和多肽)时是相邻和符合(可读)框的。但是，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它并非必然与该编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则该增强子与该编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游，且距启动子相当的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游端，使得转录通过该编码序列进入该聚腺苷酸化序列，则它与该编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3’端)，使得翻译通过该编码序列行进至该终止密码子并在此处终止，则它与该外显子核酸序列有效连接。通过本领域已知重组方法来实现连接，例如，使用PCR方法和/或通过在方便的限制位点处连接。如果不存在方便的限制位点，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或有关这类治疗性产品的用途的警告。
术语“肽接头”指天然和/或合成来源的氨基酸序列。它们由线性氨基酸链组成，其中20种天然存在的氨基酸时单体构件。肽接头具有1至50个氨基酸的长度，在一个实施方案中，长度在1至28个氨基酸之间，在另一实施方案中，长度在2至25个氨基酸之间。肽接头可以包含天然存在的多肽的一个或多个重复氨基酸序列。通过允许多肽正确折叠和正确呈递，接头具有确保相互缀合的多肽可发挥其生物学活性的功能。在一个实施方案中，肽接头富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以至多5个氨基酸的小重复单位排列，如GS(SEQ ID NO:73)、GGS(SEQ IDNO:74)、GGGS(SEQ ID NO:75)和GGGGS(SEQ ID NO:80)。这种小重复单位可以重复1至5次。在多聚体单位的氨基端和/或羧基端，可以加入至多6个附加的任意天然存在的氨基酸。其他合成肽接头由单种氨基酸组成，其重复10至20次，且可在氨基端和/或羧基端包含至多6个附加的任意天然存在的氨基酸。所有肽接头均可由核酸分子编码，因此可以重组表达。由于接头本身是肽，通过接头连接的多肽通过两个氨基酸之间形成的肽键与接头连接。
术语“药物制剂”指这样的制备物，其处于这样的形式，使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效，且不包含对将要施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的附加成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分外的成分，其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
“多肽”是天然产生或合成产生的由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。小于约25个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两条或多条多肽组成或包含一条超过100个氨基酸残基的多肽的分子可以称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸成分，如糖类基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由在其中表达多肽的细胞加入，且可以随细胞类型而不同。本文根据其氨基酸主链结构或编码氨基酸主链结构的核酸定义多肽。诸如糖类基团的添加通常不指定，但可以存在。
“结构基因”指无信号序列的基因区域，即编码区。
术语“T细胞应答引出肽”指呈递在I类MHC多功能蛋白质的肽结合沟中并由循环记忆T细胞或效应T细胞识别的肽。肽的识别导致免疫应答，引起呈递这种肽-I类MHC多功能蛋白质的细胞的去除。
本文所用的“处理”(及其语法变形)指改变所处理的个体的自然过程的尝试中的临床干预，且可以为了预防而进行或在临床病理的过程中进行。希望得到的处理作用包括但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任意直接或间接的病理结果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态及消退或改善的预后。在一些实施方案中，用本发明的抗体来延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
A.示例性二硫键连接多价多功能蛋白质
本文报道抗原结合二硫键连接多价多功能蛋白质，其包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分作为第一部分，与I类MHC蛋白复合物连接的病毒衍生肽作为第二部分。
可用本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质将个体现有病毒特异性循环细胞毒性T细胞(记忆T细胞和/或效应T细胞)引导至表达靶抗原的细胞，二硫键连接多价多功能蛋白质的抗体衍生部分特异性结合该靶抗原，通过用I类MHC多功能复合物包敷这些细胞，模拟急性病毒感染。
在一方面，本发明部分基于这样的发现，包含与I类MHC蛋白连接的病毒衍生肽作为第一部分和抗体衍生的二硫键连接分子作为第二部分的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质可用于将个体现有的病毒特异性细胞毒性T细胞引导至表达靶抗原的细胞，模拟急性病毒感染，从而可以起始表达靶抗原的细胞的消除(去除)。
已发现，与包含非二硫键连接的I类MHC的多功能蛋白质(其中可呈递与抗体铰链区组合的至多单个I类MHC单位以允许重组产生)不同，在包含二硫键连接的I类MHC的多功能蛋白质中，可呈递一个、两个或多个二硫键连接的I类MHC单位而不妨碍在多价多功能蛋白质中与抗体铰链区组合重组产生。
通过使用包含一个(即单个)抗原呈递结构域的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质，包含两个或多个抗原呈递结构域的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质的一些作用方式不再可能，如交联T细胞受体。此外，包含一个抗原呈递结构域的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质可以以高产率产生，且具有改善的热稳定性。另外，不受限于此理论，包含一个抗原呈递结构域的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质就T细胞激活而言更特异(见实施例15)。
在某些实施方案中，提供包含一个、两个或多个抗原呈递结构域的二硫键连接多价多功能蛋白质，该抗原呈递结构域各包含(i)病毒衍生肽、(ii)可溶性HLA-A等位基因A*0201和(iii)β-2微球蛋白，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在某些实施方案中，提供包含一个、两个或多个抗原呈递结构域的二硫键连接多价多功能蛋白质，该抗原呈递结构域各包含(i)病毒衍生肽、(ii)可溶性HLA-A等位基因A*0201和(iii)β-2微球蛋白，其中抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于例如诊断或治疗多种疾病，如癌症或病毒感染。
在一方面，本发明提供结合(i)细胞表面抗原和(ii)细胞毒性T细胞的多功能蛋白质。
本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质利用天然存在的高效抗病毒免疫应答来消除/去除/分解靶细胞，例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。通过使用个体自身非常有效的循环T细胞来达到细胞消除，该循环T细胞的激活无需任何共刺激。此外，此作用机制需要少量治疗性分子在细胞表面上(参见例如Mottez等,J.Exp.Med.181(1995)493-502)。
治疗期间，二硫键连接多价多功能蛋白质可以引发个体的类似于免疫的抗病毒免疫应答。因此，多重处理/应用可增强治疗的功效。因此，可以用免疫作为预处理来增强功效。
也可以使用在群体内的频率非常低(如在一个实施方案中低于1％)的同种异型。这种同种异型的使用可以使免疫步骤变得不必要，因为个体的免疫系统将把该同种异型识别为外来物，并将起始免疫应答。
靶向抗原结合部位需具有高细胞或抗原特异性，以限制毒性和副作用。
因此，通过使用本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质：
(i)只有高度特异的T细胞群体被激活(对展示在二硫键连接多价多功能蛋白质的MHC-I蛋白复合物中的单种病毒衍生肽特异的CD8阳性效应/记忆细胞)，所有其他CD3+细胞均未受影响(CD4+T细胞：TH1、TH2、TH17、调节T细胞)；
(ii)模拟个体免疫系统的天然应答(病毒感染细胞的正常去除)；和
(iii)对二硫键连接多价多功能蛋白质的应用/处理的应答在开始时将低，但可在处理期间加强(特异性T细胞将激活并在数目上扩大)，随之可减少最初输注反应和最初细胞因子释放。
在一个实施方案中，该方法包括通过应用所选择的病毒衍生肽，例如人巨细胞病毒(huCMV)衍生肽来刺激CD8阳性细胞毒性T细胞的步骤。在一个优选实施方案中，该肽具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
已显示，激活的CMV肽特异性T细胞在体外介导有效的肿瘤细胞去除(体外加载CMV衍生肽的肿瘤细胞)。
病毒感染的细胞在其细胞表面呈递病毒衍生肽与I类MHC蛋白的复合物。这些复合物由去除/耗竭呈递病毒衍生肽的细胞的特异性CD8+T细胞识别。溶细胞性(细胞毒性)CD8+-T细胞(CTL)通过其特异性T细胞受体识别I类MHC蛋白中的肽。CTL引发病毒感染细胞的去除而无需共刺激信号。
可以使用可用包含在本文报道的融合多肽中的CMV衍生肽预刺激的效应细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)或FACS分选的CD8+-T细胞。
必须识别待治疗的个体的HLA同种异型。
根据NCBI，频率为10％或更高的HLA同种异型按下表中所示分布。
表
因此，本文报道的一个方面是抗原结合二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个、两个或多个抗原呈递结构域；
-一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位；
其中抗原呈递结构域相互独立地按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原结合部位结合癌细胞表面抗原；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，按N端至C端方向包含β2-微球蛋白及相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3的抗原呈递结构域进一步在其N端包含与MHC-肽结合沟结合的肽，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。在一个实施方案中，该肽是T细胞应答引出肽。
在一个实施方案中，T细胞应答引出肽是病毒衍生肽。在一个实施方案中，病毒选自腺病毒、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、人疱疹病毒4型(EB病毒)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒35型、人乳头瘤病毒39型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒51型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒56型、人乳头瘤病毒58型、人乳头瘤病毒59型、人乳头瘤病毒68型、人乳头瘤病毒73型、人乳头瘤病毒82型、人T淋巴细胞病毒I型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒或痘苗病毒。
在一个实施方案中，病毒衍生肽选自NLVPMVATV(SEQ ID NO:01)、SLYNTVATL(SEQ ID NO:48)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:49)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:50)、STNRQSGRQ(SEQ ID NO:51)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO:52)、FAEGFVRAL(SEQ ID NO:53)、LIVIGILIL(SEQ ID NO:54)或ILHTPGCV(SEQ ID NO:55)。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白是人β2-微球蛋白。在一个实施方案中，β2-微球蛋白由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，相对频率为1％或更高的I类MHC分子是人HLA-A*0201。在一个实施方案中，I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3由SEQ ID NO:140的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，病毒衍生肽经第一接头肽与β2-微球蛋白融合。
在一个实施方案中，β2-微球蛋白经第二接头肽与I类MHC分子的胞外域α1融合。
在一个实施方案中，I类MHC分子的胞外域α3经第三接头肽与多肽(二硫键连接或非二硫键连接)融合。
在一个实施方案中，第一、第二和第三接头肽相同或不同。
在一个实施方案中，第一接头肽、第二接头肽和第三接头肽相互独立地选自氨基酸序列GS(SEQ ID NO:73)、GGS(SEQ ID NO:74)、GGGS(SEQ ID NO:75)、GGGSGGGS(SEQ ID NO:76)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:77)、GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:78)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:79)、GGGGS(SEQ ID NO:80)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:81)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:82)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:83)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)和GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:139)。
在一个实施方案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三接头肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体Fc区选自IgG种类或IgE种类的人抗体的抗体Fc区。
在一个实施方案中，抗体Fc区选自IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4亚类的人抗体的抗体Fc区。
在一个实施方案中，第一条二硫键连接多肽和第二条二硫键连接多肽包含人来源的CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人来源的CH2结构域和CH3属于IgG或IgE种类的人抗体。在一个实施方案中，CH2结构域和CH3结构域属于IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4亚类的人抗体。在一个实施方案中，CH2结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一个实施方案中，CH2结构域属于IgG1或IgG2亚类的人抗体，且包含E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330和/或P331(按kabat的EU指数编号)的至少一个突变。在一个实施方案中，CH2结构域属于具有突变L234A和L235A、和/或突变D265A和N297A、和/或包含PVA236突变、和/或包含突变P329G的IgG1亚类或人IgG2亚类的人抗体。在一个实施方案中，CH2结构域属于具有突变L234A和L235A和/或P329G的IgG1亚类的人抗体。在一个实施方案中，CH2结构域属于具有突变S228P和/或L235E的IgG4亚类的人抗体。
在一个实施方案中，第一条二硫键连接多肽包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，而第二条二硫键连接多肽包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一和第二条二硫键连接多肽包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一条二硫键连接多肽或第二条二硫键连接多肽由SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，第一条二硫键连接多肽包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接多肽包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
在一个实施方案中，二硫键连接多肽通过两个、或三个、或四个二硫键连接。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域的特征在于它按N端至C端方向包含：
(i)具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(iv)具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(vi)具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)11位和227位的半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个实施方案中，抗原呈递结构域的特征在于它按N端至C端方向包含：
(i)具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(iv)具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(vi)具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第三接头肽；和
(vii)11位和108位的半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
从图10可见，多功能蛋白质保持与之组合的抗原结合部位的结合特性(图10b)和c))。
图11和13中显示多功能蛋白质的体外功效和特异性。
在CMV特异性CD8+T细胞的存在下进行了细胞毒性测定。可以看到，包含CMV衍生的病毒肽的多功能蛋白质诱导靶细胞的裂解/去除/分解/消除(单价抗体参见图11a)，二价抗体参见图11b))。还可以看到，靶细胞的裂解高度特异，因为用包含EBV衍生的病毒肽的多功能蛋白质(图11b)和对照抗体(图11d)孵育未导致广泛的细胞裂解(自发裂解约为3.5％)。
图13中显示IGF-1R阳性肺腺癌细胞系H460M2的裂解。
包含CMV衍生肽和二价抗体的多功能蛋白质的EC50值约为10ng/ml，对应于约50pM。所测定的EC50值独立于靶细胞/效应细胞比(参见图12；1:3至1:1的靶细胞/效应细胞比对应于1:0.44至1:0.14的有效比(76％的效应细胞为CD8阳性，19％为CMV特异性))。
1.亲和力
在某些实施方案中，本文提供的二硫键连接多价多功能蛋白质包含衍生自抗体的抗原结合部位，例如一对抗体可变结构域或单结构域抗体。在某些实施方案中，抗原结合部位对其抗原具有≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，用表面等离振子共振测定测量Kd。
例如，这可以用按～10个响应单位(RU)固定抗原的CM5芯片在25℃用或仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)进行。简言之，按厂家的说明用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。用10mM醋酸钠pH 4.8稀释抗原至5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注射，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射抗原后，注射1M乙醇胺，以封闭未反应基团。对于动力学测量，在25℃按约25μl/分钟的流速注射Fab在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合传感图和解离传感图来用简单的1:1Langmuir结合模型(评价软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen,Y.等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。
2.表达
不同的非二硫键连接二价多功能蛋白质(不同接头，HLA和β2-微球蛋白的不同组合)在HEK293和CHO细胞中的表达导致非二硫键连接二价多功能蛋白质(如果全都可检测到)累积在内质网内，即如果全都可检测到，则非二硫键连接二价多功能蛋白质的分离和分泌强烈受损。
在预期多功能蛋白质包含下表中所列多肽之一时，检测不到非二硫键连接多功能蛋白质分泌至培养基中。
表
信号肽 CMV衍生肽 β2-微球蛋白 α1-α2-α3-链 IgG-Fc区 scFv
信号肽 CMV衍生肽 β2-微球蛋白 α1-α2-α3-链 抗体重链
表
已发现，不可能在真核细胞中表达，尤其是分泌包含两个由与I类MHC蛋白复合物连接的病毒衍生肽形成的非二硫键连接抗原呈递结构域及抗体的至少一个可变结构域和一个恒定结构域的多功能蛋白质。
另外，已发现，不可能在真核细胞中表达，尤其是分泌包含两个由与I类MHC蛋白多功能蛋白质连接的病毒衍生肽形成的非二硫键连接抗原呈递结构域、至少一个可变结构域和抗体铰链区的多功能蛋白质。
但已发现，可能在真核细胞中表达，尤其是分泌包含一个或两个由与I类MHC蛋白复合物连接的病毒衍生肽形成的二硫键连接抗原呈递结构域及抗体的至少一个可变结构域和一个恒定结构域的多功能蛋白质。此外，与非二硫键连接的复合物相比，表达产率提高。
因此，在本文报道的多功能蛋白质中，可以存在一个、两个或多个包含与I类MHC蛋白连接的病毒衍生肽的二硫键连接抗原呈递结构域和一个抗体恒定结构域，仍允许用真核细胞重组产生和分泌二硫键连接多价多功能蛋白质。
因此，可以在真核细胞中重组产生并从真核细胞分泌包含一个、两个或多个由与I类MHC蛋白连接的病毒衍生肽形成的二硫键连接抗原呈递结构域、抗体重链铰链区及一个或多个抗体可变结构域和一个抗体恒定结构域的多功能蛋白质。
因此，可以在真核细胞中重组产生并从真核细胞分泌包含抗体重链铰链区、至少一对抗体可变结构域、可选的抗体恒定结构域及一个、两个或多个由与I类MHC蛋白连接的病毒衍生肽形成的二硫键连接抗原呈递结构域的多功能蛋白质。
测试了多种组合。可以通过例如N端融合免疫球蛋白衍生的信号肽来达到多功能蛋白质的分泌性表达，其中病毒衍生肽在N端与I类MHC分子融合。I类MHC分子重链(缺乏跨膜结构域和胞质结构域的α1-α2-α3)和轻链(β2-微球蛋白)可改变顺序。不同抗原呈递结构域在N端与含有抗体轻链或抗体重链铰链区的多肽融合。图2中显示示例性组合。
如从下表可见，在抗原呈递结构域是二硫键连接抗原呈递结构域时，包含一个、两个或多个含有MHC-I蛋白复合物的抗原呈递结构域的多功能蛋白质可在可变抗体结构域和抗体铰链区衍生多肽的存在下表达。另外，可获得的产率提高。
表
在一些实施方案中，本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质包含不同的多肽对。为了使多肽正确配对，可以使用杵入臼技术或交叉mAb技术，以减少未正确结合的多功能蛋白质的量。
杵修饰指抗体CH3结构域中的突变T366W(按Kabat的EU指数编号)。
臼修饰指抗体CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V(按Kabat的EU指数编号)。
除杵和臼修饰外，可以存在一个CH3结构域中的突变S354C和另一CH3结构域中的突变Y349C。
交叉mAb技术报道于例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080254、WO 2009/080253、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中。
3.变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的二硫键连接多价多功能蛋白质的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善二硫键连接多价多功能蛋白质的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽链的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备二硫键连接多价多功能蛋白质的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的氨基酸序列缺失残基，和/或在二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的氨基酸序列内插入残基，和/或取代二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供在一条或多条多肽链中具有一个或多个氨基酸取代的二硫键连接多价多功能蛋白质变体。示例性的改变在下表中“示例性取代”的表头下提供，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。保守取代在下表中“优选的取代”的表头下显示。可在目的二硫键连接多价多功能蛋白质中引入氨基酸取代，并针对希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表
氨基酸可按共同的侧链性质分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括含有具有N端蛋氨酰残基的多肽的二硫键连接多价多功能蛋白质。其他插入变体包括二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽链的N或C端与酶的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，可以改变本文提供的二硫键连接多价多功能蛋白质的一条或多条多肽来提高或降低该一条或多条多肽的糖基化程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对多肽进行糖基化位点的加入或缺失。
二硫键连接多价多功能蛋白质包含抗体Fc区，可以改变附着于其上的糖类。哺乳动物细胞产生的天然Fc区通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297(参见例如Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的变体。
在一个实施方案中，提供具有(直接或间接)附着于Fc区的缺乏岩藻糖的糖类结构的二硫键连接多价多功能蛋白质变体。例如，这种Fc区中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过例如WO 2008/077546中所述的MALDI-TOF质谱法测量的附着于Asn 297的所有糖结构的总和(例如二硫键连接多价多功能蛋白质，杂合和高甘露糖结构)，通过计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(参见例如US 2003/0157108；US2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖(例如其中附着于Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分)的包含Fc区变体的二硫键连接多价多功能蛋白质。这类变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878、US 6,602,684和US 2005/0123546中。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的Fc区变体。这类Fc区变体可以具有改善的CDC功能。对应的抗体变体描述于例如WO1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以向本文提供的二硫键连接多价多功能蛋白质的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的Fc区变体，这使得它成为其中二硫键连接多价多功能蛋白质的体内半衰期重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所希望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性的降低/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保二硫键连接多价多功能蛋白质缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063和Hellstrom,I.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以利用非放射性测定法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定来确认抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro,H.等,J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有减少的效应子功能的Fc区包括具有Fc区残基234、235、238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些(参见例如US 6,737,056)。这类Fc区突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc区突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc区突变体(US 7,332,581)。
已描述了某些具有改善或减少的与FcR的结合的Fc区变体(参见例如US 6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，二硫键连接多价多功能蛋白质变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述，在Fc区中进行改变，该改变导致改变(即改善或减少)的C1q结合和/或依赖补体的细胞毒性(ADCC)。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等,J.Immunol.24(1994)2429-2434))的结合的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc区变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
B.重组方法和组合物
本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质可以用例如US 4,816,567中所述的方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的核酸。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质的方法，其中该方法包括在适于表达多肽并形成二硫键连接多价多功能蛋白质的条件下培养上文提供的含有编码二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收二硫键连接多价多功能蛋白质。
对于二硫键连接多价多功能蛋白质的重组产生，分离例如上文所述的编码二硫键连接多价多功能蛋白质的多肽的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆载体或表达载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生二硫键连接多价多功能蛋白质。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离二硫键连接多价多功能蛋白质，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码多肽的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适合用于表达糖基化二硫键连接多价多功能蛋白质的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如US 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.GenVirol.36(1977)59-74中的HEK 293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
C.药物制剂
通过将具有希望的纯度的这种二硫键连接多价多功能蛋白质与一种或多种可选的可药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编辑)(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的二硫键连接多价多功能蛋白质的药物制剂。可药用载体一般在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(,Baxter International,Inc.)。包括rhuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于US 2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与诸如软骨素酶的一种或多种附加的糖胺聚糖酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括描述于US 6,171,586和WO 2006/044908中的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸缓冲液。
本文的制剂还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性成分，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编辑)(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品，例如膜或微囊的形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地例如通过滤过无菌滤膜来达到。
D.治疗方法和组合物
本文提供的任意二硫键连接多价多功能蛋白质都可用于治疗方法。
在一方面，提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用作药物。
在其他方面，提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于治疗癌症。
在某些实施方案中，提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于治疗方法。
在某些实施方案中，本发明提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于治疗患有癌症或病毒感染的个体的方法，该方法包括对该个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的例如下文所述的至少一种附加治疗剂。
在其他实施方案中，本发明提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于去除癌细胞或病毒感染的细胞。在某些实施方案中，本发明提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于去除个体中的癌细胞或病毒感染的细胞的方法，该方法包括对该个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质，以去除癌细胞。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症或病毒感染。在另一实施方案中，该药物用于治疗癌症或病毒感染的方法，该方法包括对患有癌症或病毒感染的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。在另一实施方案中，该药物用于去除癌细胞或病毒感染的细胞。在另一实施方案中，该药物用于去除个体中的癌细胞或病毒感染的细胞的方法，该方法包括对该个体施用有效量的药物，以去除癌细胞或病毒感染的细胞。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供用于治疗癌症或病毒感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患有这种癌症或病毒感染的个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种附加治疗剂。以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供用于去除个体中的癌细胞或病毒感染的细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质，以去除癌细胞或病毒感染的细胞。在一个实施方案中，“个体”是人。
在另一方面，本发明提供包含本文报道的任意二硫键连接多价多功能蛋白质的药物制剂，例如用于任意以上治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任意二硫键连接多价多功能蛋白质和可药用载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文报道的任意二硫键连接多价多功能蛋白质和至少一种附加治疗剂。
本发明的二硫键连接多价多功能蛋白质可以单独或与其他药物组合用于治疗。例如，本发明的二硫键连接多价多功能蛋白质可以与至少一种附加治疗剂共同施用。
上文指出的这类联合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的多功能蛋白质的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前发生、与施用附加治疗剂和/或佐剂同时发生、和/或在施用附加治疗剂和/或佐剂之后发生。本发明的多功能蛋白质还可以与放射治疗组合使用。
可以通过任意适宜的手段来施用本发明的二硫键连接多价多功能蛋白质(和任意附加治疗剂)，其包括胃肠外、肺内和鼻内，如果希望进行局部处理，则可以病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的，可以通过任意适宜的途径来给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射。本文考虑多种给药方案，包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用本发明的二硫键连接多价多功能蛋白质。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病的病因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。无需但可选地用目前用来预防或治疗所讨论的障碍的一种或多种药物配制二硫键连接多价多功能蛋白质。这类其他药物的有效量取决于存在于制剂中的二硫键连接多价多功能蛋白质的量、障碍或处理的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量，并用本文所述的给药途径施用，或者本文所述剂量的1％至99％，或以任意剂量，并通过经验/临床上确定为适当的任意途径施用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的二硫键连接多价多功能蛋白质(在单独使用或与一种或多种其他附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、二硫键连接多价多功能蛋白质的类型、疾病的严重度和过程、为了预防性还是治疗性目的而施用二硫键连接多价多功能蛋白质、之前的治疗、患者的临床病史和对二硫键连接多价多功能蛋白质的应答及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适宜地对患者施用二硫键连接多价多功能蛋白质。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的二硫键连接多价多功能蛋白质可以是例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的起始候选剂量。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗通常将持续直至出现希望的疾病症状抑制。二硫键连接多价多功能蛋白质的一个示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。这类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的抗体)。可以施用起始的较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
应理解，可以用本发明的免疫缀合物取代或添加至本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质来进行以上制剂或治疗方法中的任一个。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质用于在患者中治疗癌症或病毒感染的方法，其中将在用包含在二硫键连接多价多功能蛋白质中的病毒衍生肽免疫患者之前、与之同时或之后施用二硫键连接多价多功能蛋白质。
本文报道的一个方面是本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质的用途，用于制备用于与针对包含在二硫键连接多价多功能蛋白质中的病毒衍生肽的免疫组合治疗癌症或病毒感染的药物。
在第一步中，首先对待治疗的个体施用包含在二硫键连接多价多功能蛋白质中的病毒衍生肽。在随后某个时间跨度，即4天至28天之间，对该个体施用本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质。
通过病毒衍生肽(在第一步中单独，在第二步中在本文报道的二硫键连接多价多功能蛋白质中)的此连续和分开的应用，可能增加病毒衍生肽特异性T细胞的数目，从而提高治疗的功效。
III.制成品
在本发明的另一方面，提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的材料的制成品。制成品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳本身或与另一组合物组合时对治疗、预防和/或诊断病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的多功能蛋白质。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制成品可以包含：(a)组合物包含在其中的第一容器，其中该组合物包含本发明的多功能蛋白质；和(b)组合物包含在其中的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制成品可以进一步包含指示该组合物可以用来治疗特定病症的包装说明书。备选地，或此外，制成品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。制成品可以进一步包含商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
应理解，以上制成品中的任一种可以包含本发明的免疫缀合物取代或添加至本文报道的多功能蛋白质。
IV.具体实施方案
1.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个或多个抗原呈递结构域；
-一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位；
其中各抗原呈递结构域相互独立地按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中该一个或多个抗原结合部位结合癌细胞表面抗原或病毒感染细胞表面抗原；且
其中一个或多个抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
2.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域；
-一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位；
其中抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中该一个或多个抗原结合部位结合癌细胞表面抗原或病毒感染细胞表面抗原；且
其中该抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
3.1至2项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含第一和第二条二硫键连接Fc区多肽，由此抗原结合部位或抗原结合部位之一包含第一Fc区多肽和含有第二Fc区多肽的第二抗原结合部位(如果存在)。
4.1至3项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗原结合部位相互独立地包含：i)一对抗体重链和抗体轻链；或ii)按N端至C端方向包含scFv抗体片段和抗体Fc区多肽的scFv融合多肽；或iii)按N端至C端方向包含scFab和抗体Fc区多肽的scFab融合多肽。
5.1至4项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于：i)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链N端或轻链N端连接，或ii)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链N端或每个轻链N端连接，或iii)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链C端或轻链C端连接，或vi)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链C端或每个轻链C端连接，或v)抗原呈递结构域与scFv融合多肽的N端或C端连接，或vi)一个抗原呈递结构域与每个scFv融合多肽的每个N端或C端连接，或vii)抗原呈递结构域与scFab融合多肽的N端或C端连接，或viii)一个抗原呈递结构域与每个scFab融合多肽的每个N端或C端连接，或ix)抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接，或x)一个抗原呈递结构域与第一Fc区多肽的N端或C端连接，一个抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接。
6.1至5项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于癌细胞表面抗原是黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
7.1至6项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于T细胞应答引出肽是病毒衍生肽。
8.1至7项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于T细胞应答引出肽是CD8+-T细胞应答引出肽。
9.7至8项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于病毒衍生肽是人巨细胞病毒衍生肽。
10.1至9项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于病毒衍生肽具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
11.1至10项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于病毒衍生肽具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
12.1至11项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于相对频率为1％或更高的I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-C*0304、HLA-C*0401和HLA-C*0702。
13.1至12项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于依据要对其施用多功能蛋白质的个体的区域选择相对频率为1％或更高的I类MHC分子如下：
-对于欧洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701和HLA-C*0702；
-对于澳洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-B*5601、HLA-B*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403和HLA-C*1502；
-对于北美血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401和HLA-C*0702；和
-对于东南亚血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702和HLA-C*0801。
14.1至13项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于依据要对其施用多功能蛋白质的个体的区域选择相对频率为1％或更高的I类MHC分子如下：
-对于欧洲血统个体，I类MHC分子是HLA-A*0201；
-对于澳洲血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*2402、HLA-B*1301、HLA-C*0102和HLA-C*0401；
-对于北美血统个体，I类MHC分子选自HLA-A*2402和HLA-C*0304；和
-对于东南亚血统个体，I类MHC分子是HLA-A*2402。
15.1至14项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于相对频率低于1％的I类MHC分子选自HLA-B*4201、HLA-B*5901、HLA-B*6701和HLA-B*7802。
16.1至15项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于β2-微球蛋白是人β2-微球蛋白，且相对频率为1％或更高的I类MHC分子是人HLA-A*0201。
17.1至16项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗原呈递结构域包含：
(i)病毒衍生肽；
(ii)β2-微球蛋白；
(iii)可溶性HLA-A等位基因A*0201；和
(iv)至少11位和227位的半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少11位和108位的半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
或
(i)病毒衍生肽；
(ii)可溶性HLA-A等位基因A*0201；
(iii)β2-微球蛋白；和
(iv)至少11位和227位的半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少11位和108位的半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
18.1至17项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于β2-微球蛋白由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
19.1至18项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3由SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:140的氨基酸序列组成，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
20.1至19项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(iv)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；且
(vii)抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
21.1至20项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于多功能蛋白质的特征在于抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)β2-微球蛋白，其具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(iv)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，其具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列，或是其包含1至10个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；且
(vii)抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
22.21项的多功能蛋白质，其特征在于：
-第一接头肽具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列；和/或
-第二接头肽具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和/或
-第三接头肽具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
23.1至22项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区选自IgG种类或IgE种类的人抗体的抗体Fc区。
24.1至23项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区选自IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4亚类的人抗体的抗体Fc区。
25.1至24项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区属于IgG1或IgG2亚类的人抗体，且在E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330和/或P331(按照Kabat的EU指数编号)中包含至少一个突变。
26.1至25项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区属于具有突变L234A和L235A、和/或突变D265A和N297A、和/或包含PVA236突变、和/或包含突变P329G的IgG1亚类或人IgG2亚类的人抗体。
27.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区属于具有突变L234A和L235A和/或P329G的IgG1亚类的人抗体。
28.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区属于具有突变S228P和/或L235E的IgG4亚类的人抗体。
29.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于第一和第二抗体Fc区多肽相互独立地选自SEQ ID NO:87至103。
30.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的Fc区多肽。
31.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的Fc区多肽。
32.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含两条具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的Fc区多肽。
33.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
34.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
35.1至26项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于抗体Fc区包含具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第一Fc区多肽和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的第二Fc区多肽。
36.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
37.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
38.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
39.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
40.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
41.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其包含含有SEQ ID NO:104至106的抗体轻链可变结构域和含有SEQ ID NO:108至110的抗体重链可变结构域，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
42.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链。
43.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链。
44.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一。
45.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
46.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
47.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
48.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
49.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一条SEQ ID NO:117或137的多肽链；
-一条SEQ ID NO:118的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
50.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-两条SEQ ID NO:117或137的多肽链；
-两条各为SEQ ID NO:119的多肽链；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
51.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
52.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
53.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位。
54.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
55.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位。
56.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其包含含有SEQ ID NO:104至106的抗体轻链可变结构域和含有SEQ ID NO:108至110的抗体重链可变结构域，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
57.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链。
58.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链。
59.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一。
60.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-一个或多个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽之一；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
61.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:104至106的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:108至110的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与可变结构域之一的N端连接。
62.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
63.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个抗原呈递结构域，其按N端至C端方向包含：
(i)SEQ ID NO:01的T细胞应答引出肽；
(ii)SEQ ID NO:71的β2-微球蛋白；和
(iii)SEQ ID NO:72的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键；
-精确地一个抗体Fc区，其包含两条二硫键连接Fc区多肽，其中第一条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列，而第二条二硫键连接Fc区多肽具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列；和
-两个抗原结合部位，其特异性结合黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，其各包含具有包含SEQ ID NO:105至107的可变结构域的抗体轻链和具有包含SEQ ID NO:110至112的可变结构域的抗体重链，由此抗体重链的Fc区是二硫键连接Fc区多肽；
其中抗原呈递结构域与重链可变结构域之一的N端连接。
64.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3。
65.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
66.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含：抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3；抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
67.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3。
68.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
69.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含：抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的HVR-H3；抗体轻链可变结构域，该抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
70.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变结构域，及与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变结构域。
71.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含SEQ ID NO:114的抗体重链可变结构域和SEQ ID NO:113的抗体轻链可变结构域。
72.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:113。
73.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含与SEQ ID NO:116的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变结构域，及与SEQ ID NO:115的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变结构域。
74.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含SEQ ID NO:116的抗体重链可变结构域和SEQ ID NO:115的抗体轻链可变结构域。
75.1至63项中任一项的多功能蛋白质，其特征在于MCSP结合部位包含SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:115。
76.核酸，其编码1至75项中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质。
77.宿主细胞，其包含76项的核酸。
78.药物制剂，其包含1至75项中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质和可选的可药用载体。
79.1至75项中任一项的多功能蛋白质，其用作药物。
80.1至75项中任一项的多功能蛋白质，其用于治疗癌症或病毒感染。
81.1至75项中任一项的多功能蛋白质，其用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
82.1至75项中任一项的多功能蛋白质，其用于去除癌细胞或病毒感染的细胞。
83.用于重组产生1项的二硫键连接多价多功能蛋白质的方法，其包括以下步骤：
-培养包含76项的核酸的真核细胞；和
-从细胞或培养基回收二硫键连接多价多功能蛋白质；
其中二硫键连接多价多功能蛋白质包含精确地两个或多个含有β2-微球蛋白及I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3的抗原呈递结构域，其中抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键，或至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
84.1至75项中任一项的多功能蛋白质的用途，用于制备药物。
85.84项的用途，其中药物用于治疗癌症或病毒感染。
86.84项的用途，其中药物用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
87.84项的用途，其中药物用于去除癌细胞或病毒感染的细胞。
88.将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标的方法，其包括对该个体施用有效量的1至75项中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，以将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
89.去除个体中的癌细胞或病毒感染的细胞的方法，其包括对该个体施用有效量的1至75项中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，以去除癌细胞或病毒感染的细胞。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容以其整体明确引入作为参考。
V.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1
用于分离和刺激来自人供体的CMV特异性CD8阳性T细胞的方法
PBL的分离
通过Ficoll梯度离心从人供体血液(Greiner bio-one,目录号227290)分离PBL。将PBL培养在补充了5％人血清(Sigma,目录号H2520)、2mML-谷氨酰胺(PAN Biotech,目录号P04-80100)、100μg/ml青霉素/链霉素(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,目录号14001100)的RPMI中。
PBL的刺激
在细胞培养条件(37℃、5％CO2、80％湿度)下在补充了50μg/ml CMVpp65衍生肽(SEQ ID NO:01)的细胞培养基中培养细胞(2x 107细胞/ml)2小时。然后用培养基20倍稀释细胞悬液，按2x 105细胞/96孔的接种密度在平底96孔板中进一步培养。4至5天后，加入20U/ml IL-2(Roche,目录号11011456001)、25ng/ml IL-7(Peprotech,目录号200-01)和25ng/mlIL-15(Peprotech,目录号200-15)，再培养细胞7至8天。T细胞的刺激在显微镜下作为细胞团可见。
PBL的再刺激
将T细胞与刺激细胞共培养，该刺激细胞是同一供体的肽脉冲处理的自体原代PBL(新鲜制备或衍生自冻存物)。用上述肽脉冲处理刺激细胞。肽孵育2小时后，照射(4000rad；STS GmbH OB29Nr.9510-5)PBL，并在不含肽的培养基中洗两次。在96孔板圆底板中进行再刺激。每个96孔使用8x 104至1x 105个刺激细胞。用培养基洗涤来自原代培养物的细胞两次，重悬在200μl培养基中，并将80μl转移至每个刺激细胞孔中。3天后，加入20U/ml IL-2、25ng/ml IL-7和25ng/ml IL-15。细胞确实增殖，每2至3天用新鲜培养基在新孔中扩大细胞。
T细胞的分析
对细胞进行CD8表达(BD,目录号345772)和CMV特异性T细胞受体(ProImmune,目录号F008-4A-E)染色，并在FACS中分析。
细胞培养基
RPMI1640(PAN Biotech,目录号P04-17500)、5％人血清(HS；Sigma目录号H2520)、2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech,目录号P04-80100)、100μg/ml青霉素/链霉素(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,目录号14001100)。
结果
进行了4个人供体衍生的外周血淋巴细胞(PBL)的FACS分析。用FITC-缀合的抗-CD8抗体(BD,目录号345772)与APC-缀合的Pro5五聚体(ProImmune,目录号F008-4A-E)组合标记细胞，以染色携带识别加载了CMV衍生肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO:01))的I类MHC(HLA-A*0201)的T细胞受体(TCR)的T细胞。结果参见图4。在第0天，供体1和4携带低数目的CMV特异性CD8T细胞(分别为0.08％和0.1％)。供体2和3在其外周血中携带较高数目的CMV特异性CD8T细胞(分别为0.25％和3.12％)。用CMV衍生肽脉冲处理的自体细胞刺激14天后，仅供体2和3显示CMV特异性CD8T细胞的显著增加(分别为6.2％和71.2％)，而供体1和4未显示显著增加的CMV特异性CD8T细胞数(分别为0.01％和0.05％)。用CMV衍生肽脉冲处理的自体细胞第二次刺激14天后，供体2和3显示CMV特异性CD8T细胞进一步增加(分别为15.1％和96.6％)。
实施例2
细胞毒性测定
急性淋巴母细胞白血病细胞MN60携带A*0201HLA-A等位基因。在细胞培养条件(37℃、5％CO2、80％湿度)下用50μg/ml CMV pp65肽(SEQID NO:01)孵育MN60细胞(1x 106细胞/ml)。孵育导致HLA-A*0201肽结合沟中的肽交换。离心肽交换的MN60细胞，用PBS(PanBiotech,目录号P04-36500)稀释至1x 106细胞/ml的密度，并用1μM细胞示踪剂羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,Invitrogen,目录号34554)室温(RT)染色15分钟。然后用PBS洗涤细胞一次，并用AIM-V培养基(Gibco,目录号0870112DK)稀释至1x 105细胞/ml。对于测定，将MN60细胞(靶细胞)与CMV特异性人供体3衍生CD8+T细胞(效应细胞，参见实施例1)在细胞培养条件下在96孔圆底板中共培养4小时。效应细胞/靶细胞比为4:1。用1μl/100μl二碘化丙啶(PI,Sigma,目录号P-4864)染色死细胞，并进行FACS分析。
结果
进行流式细胞术分析来通过加载CMV肽的MN60肿瘤细胞的裂解分析经刺激的CTL的溶胞能力：
进行了未加载CMV衍生肽的MN60细胞的共培养。MN60细胞为FITC阳性。效应细胞为FITC阴性。死细胞为PI阳性，活细胞为PI阴性。在它们未加载CMV衍生肽时，超过85％的MN60细胞是活细胞(Q2和Q4)。
进行了加载CMV衍生肽的MN60细胞的共培养。超过80％的MN60细胞是死细胞(Q2和Q4)，而活效应细胞和死效应细胞的比在FACS分析之间未显著改变，指示加载CMV肽的靶细胞的特异性裂解。
进行流式细胞术分析来通过加载CMV肽的MN60肿瘤细胞的裂解分析经刺激的CTL依赖于效应细胞/靶细胞比的溶胞能力：
按上文所述进行细胞毒性测定。应用了从每个靶细胞0.5个细胞应细胞至每个靶细胞4个效应细胞的范围内的不同效应细胞/靶细胞比。孵育时间为4小时。未加载CMV衍生肽的MN60细胞未显示死细胞数随效应细胞/靶细胞比提高而增加，即随比值从0.5:1至4:1而在8％至13％的范围内。
几乎20％的加载CMV衍生肽的MN60细胞在0.5:1的低效应细胞/靶细胞比下在4小时内就已经被杀死。死细胞数随效应细胞/靶细胞比提高而大幅增加，在每个靶细胞4个效应细胞的比下达到至多83％。
实施例3
DNA制备、转染、表达、纯化和分析
DNA制备
收集250ml过夜细菌LB培养物，并按厂家的流程(High speed Maxikit,Qiagen,目录号12663)提取质粒DNA。将得到的质粒DNA稀释在1mlTE缓冲液中，并通过分光光度计测量(Epoch,BioTek)来测定DNA浓度。
最终的表达载体包含以下元件：
-核酸内切限制位点HindIII、NheI；
-CMV启动子；
-5’UTR 1(衍生自人CMV)；
-内含子A；
-5’UTR 2；
-氨苄青霉素抗性基因；
-BGH poly A位点(牛生长激素多腺苷酸化信号)；
-pUC Ori。
包含CMV衍生肽和IGF1R结合特异性(抗-IGF1R抗体)的多功能蛋白质的元件的氨基酸序列：
CMV pp65肽：SEQ ID NO:01
NLVPMVATV
接头1：SEQ ID NO:82
GGGGSGGGGSGGGGS
β2-微球蛋白：SEQ ID NO:71
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
接头2：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201α1-α3：SEQ ID NO:72
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
接头3：SEQ ID NO:73
GS
接头4：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
接头13：SEQ ID NO:136
GSG
Ig轻链：SEQ ID NO:120
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGQGTKVESKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重链(IgG1-L234A，L235A突变体)：SEQ ID NO:121
QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：SEQ ID NO:122
QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：SEQ ID NO:123
QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链Fc区(IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体)：SEQ ID NO:124
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFv：SEQ ID NO:125
QVELVESGGGVVQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAIIWFDGSSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGCGTKVESK
包含CMV衍生肽和MCSP结合特异性(抗-MCSP抗体)的多功能蛋白质的元件的氨基酸序列：
CMV pp65肽：SEQ ID NO:01
NLVPMVATV
接头1：SEQ ID NO:82
GGGGSGGGGSGGGGS
β2-微球蛋白SEQ ID NO:71
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
接头2：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201α1-α3:SEQ ID NO:72
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
接头3：SEQ ID NO:73
GS
接头4：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
接头13：SEQ ID NO:136
GSG
Ig轻链：MHCI-0008
SEQ ID NO:126
DIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig轻链：MHCI-0030和MHCI-0031
SEQ ID NO:127
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重链(IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0008：
SEQ ID NO:128
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Ig重链(IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0030和MHCI-0031
SEQ ID NO:129
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0008
SEQ ID NO:130
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0030和MHCI-0031
SEQ ID NO:131
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0008
SEQ ID NO:132
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体)：
MHCI-0030和MHCI-0031
SEQ ID NO:133
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链Fc区(IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体)：
SEQ ID NO:124
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFv:MHCI-0008
SEQ ID NO:134
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIK
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SEQ ID NO:135
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIK
转染
转染前一天将HEK 293细胞稀释至8x 105细胞/ml。按厂家的流程转染约1至1.6x 106细胞/ml。对于30ml最终转染体积，用I低血清培养基(Gibco,目录号31985070)将30μg DNA稀释至1ml终体积。用培养基将每1μg DNA 2μl的293fectinTM试剂(Invitrogen,目录号12347019)同等地稀释至1ml终体积，并孵育5分钟。孵育后，将稀释的DNA加至稀释的293fectinTM试剂，轻轻混合，再孵育20-30分钟，然后逐滴吸至28ml HEK 292细胞，以获得30ml终体积。在细胞培养条件(37℃、8％CO2、80％湿度)下在按125转/分钟转动的定轨摇床上孵育细胞，并在72小时后收获。收获物1000转/分钟离心10分钟，3000转/分钟离心10分钟，并滤过22μm无菌滤器(Millipore,目录号SCGPU05RE)。
Western印迹
用Pall Nanosep Omega-Membrane 30KD Centrifugal Devices(Pall,目录号OD030C33)将500μl细胞培养物上清浓缩至50μl体积。用4x XT样品缓冲液(Bio Rad,目录号161-0791)和20x XT还原剂(BioRad,目录号161-0792)将17.5μl各浓缩物稀释至25μl终体积，96℃加热8分钟，并加到4-12％Criterion XT Precast Gel(目录号345-0124)上。用Trans-Blot SDsemi-dry Transfer Cell(BioRad)按20V在Trans-blot Pure硝酸纤维素膜(0.45μm)(BioRad,目录号162-0117)上进行印迹30分钟。用1x Western封闭试剂(Roche,目录号11921681001)在室温下进行膜封闭1小时。用过氧化物酶缀合的多克隆兔抗-人κ-轻链(DAKO,目录号P0129,1:3000稀释)和多克隆兔抗-人IgG抗体HRP缀合物(DAKO,目录号P0214,1:5000稀释)在室温下进行染色1小时。用LUMI-Imager F1(Roche)进行发光检测。
纯化
通过离心从培养基去除细胞。通过蛋白A亲和层析(上的MabSelect-Sepharose)从上清纯化多功能蛋白质。用Amicon离心管将洗脱的多功能蛋白质浓缩至3mg/ml的蛋白质浓度。在大小排阻层析(HPLCTSKgel GFC300Sys89)上分析整分试样。进行Superdex 200上的制备型SEC来去除聚集体，并将融合蛋白质缓冲在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中。用Amicon离心管将洗脱的多功能蛋白质浓缩至1mg/ml的蛋白质浓度，并进行除菌过滤(0.2μm孔径)。
分析
用UV分光光度计通过OD280分析多功能蛋白质样品来测定溶液中的蛋白质浓度。此测定所需的消光系数按Pace(Pace等,Protein Science 4(1995)2411-2423)从氨基酸序列计算。用含0.25M KCl的0.2M磷酸钾缓冲液pH 7.0作为流动相在TSK-Gel300SWXL或Superdex 200柱上进行大小排阻层析(SE-HPLC)，以测定样品中单体、聚集和降解种类的含量。进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(还原型和非还原型)来就产品相关降解产物和不相关杂质分析多功能蛋白质制备物的纯度。用还原(TCEP)和去糖基化(N-糖苷酶F)的样品进行电喷雾离子化质谱(ESI-MS)，以确认每条链的正确质量/同一性，并检测化学修饰。进行去糖基化样品的ESI-MS，以分析完全组装的蛋白质的性质和质量，并检测潜在的产品相关副产物。
SDS-PAG和考马斯蓝染色方法
设备：Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell
凝胶：4-20％Tris-甘氨酸凝胶,Invitrogen EC6025BOX
缓冲液：Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液(10x),Invitrogen LC2675-5
样品缓冲液：Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2x),Invitrogen LC2676
还原缓冲液：NuPAGE样品还原剂(10x),Invitrogen NP0004
分子量标记：Mark 12,MW标准,Invitrogen LC5677
蛋白质样品制备
用缓冲液将样品调整至1mg/ml的蛋白质浓度。对于样品还原，进行了以下流程：
-还原缓冲液：4ml样品缓冲液(2x)和1ml还原缓冲液(10x)
-用还原缓冲液1:1稀释样品
-70℃孵育5分钟。
凝胶电泳按125V进行90分钟。用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen,目录号LC6065)染色凝胶。
结果
表
图5和6中显示所选择的具有对应于前表的编号1、2A和3A的结构的多功能蛋白质的考马斯蓝染色SDS凝胶和对应的SEC层析图。可以看到，可获得所定义的多功能蛋白质。
实施例4
MHC-I-抗-IGF-1R多功能蛋白质与人IGF-1R阳性细胞系的结合
在AIM-V培养基(Gibco,目录号0870112DK)中将H460M2细胞稀释至8x 105细胞/ml。用10μg本文报道的MHC-I-抗-IGF-1R多功能蛋白质在4℃或37℃染色500μl细胞悬液1小时。然后用冰冷的AIM-V培养基洗涤细胞一次，并用二抗(其是缀合至P-PE的山羊F(ab‘)2抗-人IgG(H+L)抗体(Dianova,目录号109-116-088,1:50稀释))在4℃染色30分钟。然后用冰冷的AIM-V培养基洗涤细胞一次，用活细胞门控通过FACS Canto II(BD Bioscience)测量荧光。用双特异性抗体作为同种型对照，抗IGF-1R抗体(参见例如WO 2004/087756和WO 2007/115814)作为阳性对照。
结果
考虑到PE-荧光测量(X-轴)的迁移，与对照抗体相比，MHC-I-抗-IGF-1R多功能蛋白质在结合H460M2靶细胞上未显示可见的差异。在4℃还是37℃完成与MHC-I-抗-IGF-1R多功能蛋白质的孵育也无差异。与同种型对照和与荧光标记二抗单独孵育都未显示PE荧光测量的任何迁移。虽然融合了I类MHC分子，但本文的MHC-I-抗-IGF-1R多功能蛋白质的抗体可变结构域仍结合H460M2靶细胞。
实施例5
表达抗原的细胞的体外去除
将I24靶细胞(1x105细胞/ml)接种在WillCo玻璃底平皿(FA.WillCoWells BV,REF GWST-3522)上的细胞培养基(补充了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA和10％(v/w)FCS的RPMI 1640)中24至48小时。用每个平皿50μg/ml聚-L-赖氨酸盐酸盐(Sigma Aldrich,目录号P2658)预包被WillCo玻璃底平皿30分钟。包被后，用无菌组织培养级水彻底漂洗平皿，并干燥2小时。
培养后，去除细胞培养基，以3mM K+Krebs Ringer HEPES缓冲液pH 7.3(补充0.5mM DL-二硫苏糖醇、1mM抗坏血酸和4mM谷胱甘肽)中5μg/ml的终浓度加入IGF-1R结合多功能蛋白质，该IGF-1R结合多功能蛋白质包含一条[CMV-pp65-肽]-[接头1]-[β2-微球蛋白]-[接头2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[接头3]-[具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体]融合多肽，一条IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体二硫键连接多肽，及一条Ig轻链，其中该多功能蛋白质特异性结合本文报道的人IGF-1R(参见例如实施例3)。
以1:10的靶细胞/效应细胞比加入T细胞。用Zeiss Axiovert 135显微镜进行4小时成像。
结果
IGF-1R结合多功能蛋白质介导表达人IGF-1R的I243T3细胞(大的贴壁生长细胞)的裂解。裂解由人CMV特异性T细胞(小的圆形细胞或变形迁移细胞)介导。用浓度为5μg/ml的多功能蛋白质和人CMV特异性T细胞(用HLA-A0201+/CMV肽脉冲处理的APC预激活)孵育I24细胞。在第56分钟和76分钟注意I24细胞与T细胞的相互作用，随后在125分钟后注意I24细胞的崩解。
进行了对照，对照显示，在缺乏本文报道的抗原结合多功能蛋白质的情况下，缺乏通过人CMV特异性T细胞(小的圆形细胞或变形迁移细胞)对I243T3细胞(大的贴壁生长细胞，白色箭头)的裂解。用特异性细胞毒性T细胞(用HLA-A0201+/CMV肽脉冲处理的APC预处理)孵育I24细胞。各图下方显示时间推移。
实施例6
细胞毒性测定
将细胞培养基(50μl)吸入Xcelligence 96孔E-板(Roche,目录号05232368001)的各孔来进行背景测量。
将I24细胞在细胞培养基(RPMI 1640、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA、10％(v/w)FCS)中稀释至1x106细胞/ml，并将50μl(2x104细胞/孔)吸入Xcelligence 96孔板的各孔中至100μl终体积，并培养24小时(37℃、8％CO2、80％湿度)。24小时后，去除培养基，用200μl AIM-V(无血清培养基(Invitrogen)T细胞培养基(目录号)：12055-083)培养基洗涤细胞。以AIM-V培养基中1μg/ml的终浓度将IGF-1R结合多功能蛋白质加至经洗涤的靶细胞，该IGF-1R结合多功能蛋白质包含一条[CMV-pp65-肽]-[接头1]-[β2-微球蛋白]-[接头2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[接头3]-[具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体]融合多肽，一条IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体二硫键连接多肽，及一条Ig轻链，其中该多功能蛋白质特异性结合人IGF-1R。以相当比例将效应细胞加入AIM-V培养基至150μl终体积。抗人IGF-1R的去岩藻糖基化IgG1单克隆抗体(去岩藻糖基化的抗-IGF-1R抗体)和非结合人抗-洋地黄毒苷抗体(抗-洋地黄毒苷抗体)分别作为同种型对照和特异性抗体对照。用Xcelligence系统(Roche)分别进行6至9小时测量。
结果
IGF-1R结合多功能蛋白质引发H460M2肿瘤细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。
用1μg/ml的多功能蛋白质和各比例(1:1.5至1:0.5)的特异性T细胞孵育肿瘤细胞4小时，该多功能蛋白质包含一条[CMV-pp65-肽]-[接头1]-[β2-微球蛋白]-[接头2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[接头3]-[具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体]融合多肽，一条IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体二硫键连接多肽，及一条Ig轻链，其中该多功能蛋白质特异性结合人IGF-1R(参见图8)。各柱(bar)上方表示裂解的百分比。抗人IGF-1R的去岩藻糖基化IgG1单克隆抗体(MAB IGF-1R-afu)未引发显著的肿瘤细胞裂解。
本文报道的多功能蛋白质引发I243T3靶细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。
用1μg/ml的抗原结合多功能蛋白质和各比例(1:1.5至1:0.5)的特异性T细胞孵育靶细胞4小时，该抗原结合多功能蛋白质包含一条[CMV-pp65-肽]-[接头1]-[β2-微球蛋白]-[接头2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[接头3]-[具有臼变异的IgG1-L234A、L235A突变体]融合多肽，一条IgG1-L234A、L235A突变体Fc区杵变体二硫键连接多肽，及一条Ig轻链，其中该多功能蛋白质特异性结合人IGF-1R(参见图9)。各柱上方表示裂解的百分比。抗人IGF-1R的去岩藻糖基化IgG1单克隆抗体(去岩藻糖基化的抗-IGF-1R抗体)和非结合人抗-洋地黄毒苷抗体(抗-洋地黄毒苷抗体)未引发显著的靶细胞裂解。
实施例7
体外功效
用1μg/ml的包含hCMV衍生肽和抗-IGF-1R抗体的多功能蛋白质及低效应细胞/靶细胞比(每个肿瘤细胞1.5至0.5个特异性T细胞)的人CMV特异性CD8阳性T细胞孵育IGF-1R阳性肺腺癌细胞系H460M2。对照抗体是糖基化改造的抗-IGF-1R抗体。孵育时间为6小时。用多功能蛋白质孵育导致H460M2肿瘤细胞的有效去除。
实施例8
不同MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质与MCSP阳性靶细胞的结合
用Accutase(PAA,目录号L11-007)孵育Colo38细胞5分钟，以获得单细胞悬液。用100μl PBS/2％FCS中的1μg/ml MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质构建体在4℃下孵育2x105细胞/管45分钟。孵育后，用1ml冷PBS/2％FCS洗涤细胞，并以910转/分钟离心7分钟。将细胞重悬在100μl含2μg/ml二抗(山羊抗-人IgG1抗体-PE缀合物,Jackson Lab.,目录号109-116-088)的PBS/2％FCS中，并在4℃再孵育45分钟。用1mlPBS％2％FCS洗涤细胞两次，并用BD Canto II流式细胞仪测量。结果显示在图7中。
实施例9
MCSP阳性细胞与MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质的孵育
用Accutase(PAA,目录号L11-007)孵育Colo38或WM266-4细胞5分钟，以获得单细胞悬液。在Eplates96(Roche,目录号05232368001)中在100μl各自的细胞培养基(Colo38细胞系：补充2mM谷氨酰胺、10％FCS的RPMI1640；WM-266-4细胞系：补充2mM谷氨酰胺、10％FKS、2mM丙酮酸钠、2mM NEAA的RPMI1640)中孵育每孔2x104个细胞的Colo38细胞系或1x104个细胞的WM266-4细胞系24小时，每15分钟用ACEA技术(Xcelligence RTCA)测量贴壁(电阻)。24小时(未受干扰的生长期)后，用200μl AIMV-培养基(Gibco,目录号0870112DK)洗涤细胞。向细胞加入1μg/ml终浓度的MHC-I-抗-MCSP多功能蛋白质，连同不同比例的经刺激的T细胞或PBMC，至在AIMV-培养基中的终体积为150μl。再继续孵育4至48小时，同时每5分钟进行ACEA测量。读数基于电阻测量，从Eplate底部脱附时检测裂解或崩解的细胞。已在加入多功能蛋白质后的第一测量点将细胞指数归一化至1。图14中显示1μg/ml多功能蛋白质浓度(MHCI-0008(1)、MHCI-0010(2)、MHCI-0030(3)、MHCI-0031(4))、10:1的效应细胞/靶细胞比、来自供体3的PBMC(200.000细胞，供体3为CMV阳性但为EBV阴性)和黑素瘤肿瘤细胞系Colo38(20.000细胞)及按96孔进行实验的结果，数据有三个重复。图15A(Colo38)和15B(WM266)中显示1μg/ml多功能蛋白质浓度(MHCI-0008(1)、MHCI-0010(2)、仅PBMC(3))、10:1的效应细胞/靶细胞比、来自供体3的PBMC(200.000细胞，供体3为CMV阳性但为EBV阴性)和黑素瘤肿瘤细胞系Colo38(20.000细胞)及按96孔进行实验的结果，数据有三个重复。
实施例10
细胞毒性测定
将细胞培养基(50μl)吸入Xcelligence 96孔E-板(Roche,目录号05232368001)的各孔来进行背景测量。
将Colo38细胞在细胞培养基(补充2mM L-谷氨酰胺、10％FCS的RPMI 1640)中稀释至1x106细胞/ml，并将50μl(2x104细胞/孔)吸入Xcelligence 96孔板的各孔中至100μl终体积，并培养24小时(37℃、8％CO2、80％湿度)。24小时后，去除培养基，用200μl AIM-V(无血清培养基(Invitrogen)T细胞培养基(目录号)：12055-083)培养基洗涤细胞。以AIM-V培养基中1μg/ml的终浓度将MCSP结合多功能蛋白质MHCI-0008(单价，加载CMV肽)、MHCI-0010(单价，加载EBV肽的对照)、MHC-0026(二价，加载CMV肽，非结合对照)、MHCI-0030(单价，加载CMV肽，活性)和MHCI-0031(二价，加载CMV肽，活性)单独加至经洗涤的靶细胞。以10:1(E:T)的相当比例将效应细胞加入AIM-V培养基至150μl终体积。加入后用Xcelligence系统(Roche)进行42小时测量。
图16中显示针对与20.000个贴壁Colo38细胞共培养(96孔板，一式三份)的从供体3现分离的200.000个PBMC(效应细胞)获得的结果(用多功能蛋白质孵育42小时后的细胞裂解)。25％的PBMC为CD8阳性T细胞，其中转而有3％为CMV-pp65-肽特异性，导致每20.000个Colo38靶细胞(真实E:T(效应细胞/靶细胞比)＝1:13)中有约1.500个CMV-pp65-肽特异性CD8+T细胞。
结果
MCSP结合多功能蛋白质引发Colo38肿瘤细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。
实施例11
LDH释放测定
910转/分钟离心ACEA板7分钟。将50μl ACEA上清转入另一96孔平底板(Costar)。按厂家的说明稀释LDH试剂(细胞毒性检测试剂盒,Roche,目录号11644793001)1和2，将50μl溶液加至上清。5至25分钟的孵育期后在Tecan Reader Sunrise(Tecan)中检测吸光度。通过向靶细胞加入1％Triton X-100(Sigma,目录号T-8787)后离心来检测总裂解。
图17中显示针对与20.000个贴壁Colo38细胞共培养(96孔板，一式三份)的从供体3现分离的200.000个PBMC(效应细胞)获得的结果(用多功能蛋白质孵育48小时后的LDH释放)。将从供体3现分离的200.000个PBMC与20.000个贴壁Colo38细胞共培养(96孔板，一式三份)。25％的PBMC为CD8阳性T细胞，其中转而有3％为CMV-pp65-肽特异性，导致每20.000个Colo38靶细胞(E:T(效应细胞/靶细胞比)＝1:13)中有约1.500个CMV-pp65-肽特异性CD8+T细胞。
结果
MCSP结合多功能蛋白质引发Colo38肿瘤细胞通过人CMV特异性T细胞裂解。
实施例12
细胞毒性测定
通过Ficoll离心从全血获得PBMC。在T细胞培养基(补充10％HS、2mM谷氨酰胺的RPMI 1640)中稀释1x107PBMC/ml，并通过向悬液加入50μg/ml CMV pp65肽来达到HLA-A0201分子上的肽交换。孵育2-3小时后，将PBMC 1:10稀释，并在96孔圆底板中接种200μl。在第3天，加入20U/ml IL-2、25ng/ml IL-7和IL-15。14天后，进行再刺激。
在96孔板中洗涤经刺激的T细胞两次，稀释在200μl T细胞培养基中，从其转移80μl至新的96孔圆底板中。
按照上述流程刺激PBMC。肽交换后用4000Gray照射经刺激的PBMC，用T细胞培养基洗涤两次，将1x105个PBMC吸至该80μl T细胞。在第3天，加入20U/ml IL-2、25ng/ml IL-7和IL-15。在第11天用经再刺激的T细胞进行Xcelligence细胞毒性测定。
63％的效应细胞为CMV-pp65-肽特异性CD8+T细胞。
靶细胞/效应细胞比为1:3.5。加入各多功能蛋白质后10小时测定细胞裂解。加入多功能融合蛋白质至1μg/ml的终浓度。
Colo38细胞的结果显示在图18A中，WM266细胞的结果显示在图18B中。
实施例13
二硫键稳定的多功能蛋白质
引入本文报道的多功能蛋白质中的抗原呈递结构域的11位和227位之间的二硫键。
二硫键稳定抗原呈递结构域的氨基酸序列是：
NLVPMVATVGCGGSGGGGCGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWGSGQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：137).
在无二硫键稳定化的情况下，可在蛋白A亲和纯化后从11培养上清获得6.4mg多功能蛋白质。大小排阻层析分开聚集体后的最终产率为2.2mg。
在有二硫键稳定化的情况下，可在蛋白A亲和纯化后从11培养上清获得17.8mg多功能蛋白质。由于所引入的二硫键提高了热稳定性，聚集体的量较低，由于聚集体的量较低，大小排阻层析后的最终产率为11.4mg。
图19中显示蛋白A亲和层析之后但在通过制备型大小排阻层析去除聚集体之前的分析型大小排阻层析。
二硫键连接多功能蛋白质显示与非二硫键连接多功能蛋白质相同的功能性(见图20)。
通过Ficoll离心从全血获得PBMC。在T细胞培养基(补充10％HS、2mM谷氨酰胺的RPMI 1640)中稀释1x107PBMC/ml，并通过向悬液加入50μg/ml CMV pp65肽来达到HLA-A0201分子上的肽交换。孵育2-3小时后，将PBMC 1∶10稀释，并在96孔圆底板中接种200μl。在第3天，加入20U/ml IL-2、25ng/ml IL-7和IL-15。初次刺激后11天取得细胞；45％的细胞为CMV特异性。图20中显示靶细胞/效应细胞比为1:3的结果。
二硫键连接多功能蛋白质显示提高的热稳定性(图21)。
实施例14
DNA制备、转染、表达、纯化和分析
DNA制备
收集250 ml过夜细菌LB培养物，并按厂家的流程(High speed Maxikit,Qiagen,目录号12663)提取质粒DNA。将得到的质粒DNA稀释在1mlTE缓冲液中，并通过分光光度计测量(Epoch,BioTek)来测定DNA浓度。
最终的表达载体包含以下元件：
-核酸内切限制位点HindIII、NheI；
-CMV启动子；
-5’UTR 1(衍生自人CMV)；
-内含子A；
-5’UTR 2；
-氨苄青霉素抗性基因；
-BGH poly A位点(牛生长激素多腺苷酸化信号)；
-pUC Ori。
包含CMV衍生肽和MCSP结合特异性(抗-MCSP抗体)的示例性多价二硫键连接多功能蛋白质的元件的氨基酸序列：
CMV pp65肽：SEQ ID NO:01
NLVPMVATV
接头1：SEQ ID NO:139
GCGGSGGGGSGGGGS
β2-微球蛋白：SEQ ID NO:71
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
接头2：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201α1-α3:SEQ ID NO:140
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
接头13：SEQ ID NO:136
GSG
Ig轻链：SEQ ID NO:127
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:141
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼变异的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:142
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链Fc区(IgG1-L234A、L235A、P329G突变体Fc区杵变体)：
SEQ ID NO:98
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
包含CMV衍生肽和MCSP结合特异性(抗-MCSP抗体)的示例性二价二硫键连接多功能蛋白质的元件的氨基酸序列：
CMV pp65肽：SEQ ID NO:01
NLVPMVATV
接头1：SEQ ID NO:139
GCGGSGGGGSGGGGS
β2-微球蛋白：SEQ ID NO:71
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
接头2：SEQ ID NO:83
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201α1-α3:SEQ ID NO:140
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
接头13：SEQ ID NO:136
GSG
Ig轻链：SEQ ID NO:127
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:142
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼突变的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:141
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
包含CMV衍生肽和MCSP结合特异性(抗-MCSP抗体)的另一示例性二价二硫键连接多功能蛋白质的元件的氨基酸序列：
CMV pp65肽：SEQ ID NO:01
NLVPMVATV
接头1：SEQ ID NO:139
GCGGSGGGGSGGGGS
HLA-A*0201 α1-α3:SEQ ID NO:140
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
接头2：SEQ ID NO:77
GGGGSGGGGSGGGGS
β2-微球蛋白：SEQ ID NO:71
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
接头13：SEQ ID NO:81
GGGGSGGGGS
Ig轻链：SEQ ID NO:127
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ig重链(具有杵变异的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:142
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ig重链(具有臼突变的IgG1-L234A、L235A、P329G突变体)：
SEQ ID NO:141
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
转染
转染前一天将HEK 293细胞稀释至8x 105细胞/ml。按厂家的流程转染约1至1.6x 106细胞/ml。对于30ml最终转染体积，用I低血清培养基(Gibco,目录号31985070)将30μg DNA稀释至1ml终体积。用培养基将每1μg DNA 2μl的293fectinTM试剂(Invitrogen,目录号12347019)同等地稀释至1ml终体积，并孵育5分钟。孵育后，将稀释的DNA加至稀释的293fectinTM试剂，轻轻混合，再孵育20-30分钟，然后逐滴吸至28ml HEK 292细胞，以获得30ml终体积。在细胞培养条件(37℃、8％CO2、80％湿度)下在按125转/分钟转动的定轨摇床上孵育细胞，并在72小时后收获。收获物1000转/分钟离心10分钟，3000转/分钟离心10分钟，并滤过22μm无菌滤器(Millipore,目录号SCGPU05RE)。
Western印迹
用Pall Nanosep Omega-Membrane 30KD Centrifugal Devices(Pall,目录号OD030C33)将500μl细胞培养物上清浓缩至50μl体积。用4x XT样品缓冲液(Bio Rad,目录号161-0791)和20x XT还原剂(BioRad,目录号161-0792)将17.5μl各浓缩物稀释至25μl终体积，96℃加热8分钟，并加到4-12％Criterion XT Precast Gel(目录号345-0124)上。用Trans-Blot SDsemi-dry Transfer Cell(BioRad)按20V在Trans-blot Pure硝酸纤维素膜(0.45μm)(BioRad,目录号162-0117)上进行印迹30分钟。用1x Western封闭试剂(Roche,目录号11921681001)在室温下进行膜封闭1小时。用过氧化物酶缀合的多克隆兔抗-人κ-轻链(DAKO,目录号P0129,1:3000稀释)和多克隆兔抗-人IgG抗体HRP缀合物(DAKO,目录号P0214,1:5000稀释)在室温下进行染色1小时。用LUMI-Imager F1(Roche)进行发光检测。
纯化
通过离心从培养基去除细胞。通过蛋白A亲和层析(上的MabSelect-Sepharose)从上清纯化多功能蛋白质。用Amicon离心管将洗脱的多功能蛋白质浓缩至3mg/ml的蛋白质浓度。在大小排阻层析(HPLCTSKgel GFC300Sys89)上分析整分试样。进行Superdex 200上的制备型SEC来去除聚集体，并将融合蛋白质缓冲在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中。用Amicon离心管将洗脱的多功能蛋白质浓缩至1mg/ml的蛋白质浓度，并进行除菌过滤(0.2μm孔径)。
分析
用UV分光光度计通过OD280分析多功能蛋白质样品来测定溶液中的蛋白质浓度。此测定所需的消光系数按Pace(Pace等,Protein Science 4(1995)2411-2423)从氨基酸序列计算。用含0.25M KCl的0.2M磷酸钾缓冲液pH 7.0作为流动相在TSK-Gel300SWXL或Superdex 200柱上进行大小排阻层析(SE-HPLC)，以测定样品中单体、聚集和降解种类的含量。进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(还原型和非还原型)来就产品相关降解产物和不相关杂质分析多功能蛋白质制备物的纯度。用还原(TCEP)和去糖基化(N-糖苷酶F)的样品进行电喷雾离子化质谱(ESI-MS)，以确认每条链的正确质量/同一性，并检测化学修饰。进行去糖基化样品的ESI-MS，以分析完全组装的蛋白质的性质和质量，并检测潜在的产品相关副产物。
SDS-PAG和考马斯蓝染色方法
设备：Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell
凝胶：4-20％Tris-甘氨酸凝胶,Invitrogen EC6025BOX
缓冲液：Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液(10x),Invitrogen LC2675-5
样品缓冲液：Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2x),Invitrogen LC2676
还原缓冲液：NuPAGE样品还原剂(10x),Invitrogen NP0004
分子量标记：Mark 12,MW标准,Invitrogen LC5677
蛋白质样品制备
用缓冲液将样品调整至1mg/ml的蛋白质浓度。对于样品还原，进行了以下流程：
-还原缓冲液：4ml样品缓冲液(2x)和1ml还原缓冲液(10x)
-用还原缓冲液1:1稀释样品
-70℃孵育5分钟。
凝胶电泳按125V进行90分钟。用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen,目录号LC6065)染色凝胶。
结果
表
可以看到，可获得所定义的多功能蛋白质。
实施例15
包含一个抗原呈递结构域的复合物与包含两个抗原呈递结构域的复合物相比的T细胞激活
用150μl AIM-V培养基体积中终浓度为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml的MHCI-0054[具有单臂二硫键稳定CMV-MHCI的二价抗-MCSP结合剂]或MHCI-0065[具有双臂二硫键稳定CMV-MHCI的二价抗-MCSP结合剂]构建体刺激AIM-V培养基(Gibco)中的每孔20,000个PBMC 16小时。混合4个孔的PBMC，并用以下在冰上染色45分钟，然后用PBS/2％FCS洗涤两次(500x g,10分钟)：
1)PE-Cy7标记的抗-CD8抗体(BD#557746)(5μl/100μl PBS/2％FCS)，或
2)FITC标记的抗-CD4抗体(BD#555346)(20μl/100μl PBS/2％FCS)，或
3)Dextramer CMV APC(Immudex#WB2132)(10μl/100μl PBS/2％FCS)，或
4)PE标记的抗-CD25抗体(BioLegend#302606)(5μl/100μl PBS/2％FCS)，或
5)PerCP/Cy5.5标记的抗-CD69抗体(BioLegend#310925)(5μl/100μlPBS/2％FCS)
为测定T细胞激活，使用了以下读数：
1)所有CMV特异性(NLVPMVATV pp65)CD8+细胞的CD25+细胞的频率；
2)CMV特异性(NLVPMVATV pp65)CD8+细胞的CD69+细胞的频率；和
3)CD8+细胞上的HLA A*0201I类MHC复合物中CMV的NLVPMVATV pp65肽(NLVPMVATV pp65)的关联TCR的下调。
结果：
1)pp65-CMV-HLAA*0201特异性CD8T细胞上的CD25上调：
构建体 应用的剂量 效应
MHCI-0054 100ng/ml 0.9％CD25+
MHCI-0054 1μg/ml 0.7％CD25+
MHCI-0054 10μg/ml 0.9％CD25+
MHCI-0054 100μg/ml 13.8％CD25+
MHCI-0065 100ng/ml 0.6％CD25+
MHCI-0065 1μg/ml 0.6％CD25+
MHCI-0065 10μg/ml 3.9％CD25+
MHCI-0065 100μg/ml 26.6％CD25+
因此，与MHCI-0054相比，用10μg/ml和100μg/ml MHCI-0065可观察到CD25表达上调(分别为4.4倍和1.9倍)。
2)pp65-CMV-HLAA*0201特异性CD8T细胞上的CD69上调：
构建体 应用的剂量 效应
MHCI-0054 100ng/ml 0.6％CD69+
MHCI-0054 1μg/ml 0.9％CD69+
MHCI-0054 10μg/ml 2.3％CD69+
MHCI-0054 100μg/ml 36.8％CD69+
MHCI-0065 100ng/ml 1.3％CD69+
MHCI-0065 1μg/ml 2.3％CD69+
MHCI-0065 10μg/ml 20.6％CD69+
MHCI-0065 100μg/ml 67.1％CD69+
因此，与MHCI-0054相比，用10μg/ml和100μg/ml MHCI-0065可观察到CD69表达上调(分别为9.0倍和1.8倍)。
3)pp65-CMV-HLAA*0201特异性CD8T细胞上的TCR下调：
构建体 应用的剂量 效应
MHCI-0054 100ng/ml 设为0％下调
MHCI-0054 1μg/ml 0％下调
MHCI-0054 10μg/ml 4.9％下调
MHCI-0054 100μg/ml 43.9％下调
MHCI-0065 100ng/ml 0％下调
MHCI-0065 1μg/ml 5.3％下调
MHCI-0065 10μg/ml 31.5％下调
MHCI-0065 100μg/ml 76.9％下调
因此，与MHCI-0054相比，用10μg/ml和100μg/ml MHCI-0065可观察到TCR表达下调(分别为6.5倍和1.8倍)。
因此，与仅携带单个MHC复合物的二价异二聚体抗体融合物相比，携带两个MHC复合物的二价同二聚体抗体融合物对CMV特异性CD8T细胞的激活更强。

Claims (17)

1.二硫键连接的多价多功能蛋白质，其特征在于它包含：
-一个或两个抗原呈递结构域；
-一个抗体Fc区；和
-一个或多个抗原结合部位；
其中抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)β2-微球蛋白；和
(ii)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)相对频率低于1％的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(ii)β2-微球蛋白；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)β2-微球蛋白；和
(iii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
或
(i)T细胞应答引出肽；
(ii)相对频率为1％或更高的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；和
(iii)β2-微球蛋白；
其中抗原结合部位结合癌细胞表面抗原；且
其中抗原呈递结构域具有至少两个形成链内/结构域间二硫键的非天然存在的半胱氨酸残基。
2.权利要求1的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于抗原呈递结构域中的一个非天然存在的半胱氨酸残基在T细胞应答引出肽之间的接头中，一个非天然存在的半胱氨酸残基在I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3之一中。
3.权利要求1或2中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于：
所述抗原呈递结构域至少在11位和227位具有半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键；或
所述抗原呈递结构域至少在11位和108位具有半胱氨酸残基，且11位和108位的半胱氨酸残基形成二硫键。
4.权利要求1至3中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述抗体Fc区包含第一和第二条二硫键连接Fc区多肽，由此抗原结合部位或抗原结合部位之一包含第一Fc区多肽和含有第二Fc区多肽的第二抗原结合部位(如果存在)。
5.权利要求1至4中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述抗原结合部位包含：i)一对抗体重链和抗体轻链；或ii)按N端至C端方向包含scFv抗体片段和抗体Fc区多肽的scFv融合多肽；或iii)按N端至C端方向包含scFab和抗体Fc区多肽的scFab融合多肽；
或
所述抗原结合部位相互独立地包含：i)一对(关联)抗体重链和抗体轻链，由此单条链可以是野生型链或经修饰的链(取代、突变或结构域交换)；或ii)按N端至C端方向包含scFv抗体片段和抗体Fc区多肽的scFv融合多肽；或iii)按N端至C端方向包含scFab和抗体Fc区多肽的scFab融合多肽。
6.权利要求1至5中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于：i)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链N端或轻链N端连接，或ii)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链N端或每个轻链N端连接，或iii)抗原呈递结构域与抗原结合部位的重链C端或轻链C端连接，或vi)一个抗原呈递结构域与每个抗原结合部位的每个重链C端或每个轻链C端连接，或v)抗原呈递结构域与scFv融合多肽的N端或C端连接，或vi)一个抗原呈递结构域与每个scFv融合多肽的每个N端或C端连接，或vii)抗原呈递结构域与scFab融合多肽的N端或C端连接，或viii)一个抗原呈递结构域与每个scFab融合多肽的每个N端或C端连接，或ix)抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接，或x)一个抗原呈递结构域与第一Fc区多肽的N端或C端连接，一个抗原呈递结构域与第二Fc区多肽的N端或C端连接。
7.权利要求1至6中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述T细胞应答引出肽是人巨细胞病毒衍生肽。
8.权利要求1至7中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述病毒衍生肽具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列。
9.权利要求1至8中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述相对频率为1％或更高的I类MHC分子选自HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-C*0304、HLA-C*0401和HLA-C*0702。
10.权利要求1至9中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述相对频率低于1％的I类MHC分子选自HLA-B*4201、HLA-B*5901、HLA-B*6701和HLA-B*7802。
11.权利要求1至10中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述抗原呈递结构域包含：
(i)病毒衍生肽；
(ii)β2-微球蛋白；
(iii)可溶性HLA-A等位基因A*0201；和
(iv)至少11位和227位的半胱氨酸残基，且11位和227位的半胱氨酸残基形成二硫键。
12.权利要求1至11中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其特征在于所述抗原呈递结构域按N端至C端方向包含：
(i)具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:70的氨基酸序列的病毒衍生肽；
(ii)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83、84和139的氨基酸序列的第一接头肽；
(iii)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的β2-微球蛋白；
(iv)具有选自SEQ ID NO:77、78、79、82、83和84的氨基酸序列的第二接头肽；
(v)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3；
(vi)具有选自SEQ ID NO:73、77、78、79、82、83、84和136的氨基酸序列的第三接头肽；且
(vii)至少11位和227位的半胱氨酸残基，及11位和227位的半胱氨酸残基之间的二硫键。
13.药物制剂，其包含权利要求1至12中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质和可选的可药用载体。
14.权利要求1至12中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其用作药物。
15.权利要求1至12中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其用于治疗癌症。
16.权利要求1至12中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶标。
17.权利要求1至12中任一项的二硫键连接多价多功能蛋白质，其用于去除癌细胞或病毒感染的细胞。
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