MX2015007239A - Proteinas multifuncion que comprenden complejo mayor de histocompatibilidad (cmh) de clase i multivalente unido mediante disulfuro. - Google Patents

Proteinas multifuncion que comprenden complejo mayor de histocompatibilidad (cmh) de clase i multivalente unido mediante disulfuro.

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Abstract

En el presente documento se informa de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende dos o más dominios presentadores de antígeno, exactamente una región Fc de anticuerpo y por lo menos un sitio de unión a antígeno, en la que el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) una microglobulina ß2, e (ii) los dominios extracelulares a1, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) un péptido inductor de respuesta de células T, (ii) una microglobulina ß2, e (iii) los dominios extracelulares a1, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior, en la que el sitio de unión a antígeno se une a un antígeno de superficie de una célula de cáncer o a un antígeno de superficie de una célula infectada por virus y en la que el dominio presentador de antígeno presenta por lo menos dos residuos de cisteína no naturales que forman un enlace disulfuro intracadena/interdominio.

Description

PROTEINAS MULTIFUNCION QUE COMPRENDEN COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH) DE CLASE I MULTIVALENTE UNIDO MEDIANTE DISULFURO Campo de la Invención En el presente documento se informa de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende un fragmento de anticuerpo y uno, dos o más componentes CMH de clase I unidos mediante disulfuro y de su utilización para la eliminación de celulas de cáncer o infectadas por virus mediante la atracción dirigida de células T citotóxicas circulantes específicas de virus.
Antecedentes de la Invención La proteína del CMH de clase I consiste de una cadena a (a-1 a 3 y un dominio transmembranal) y microglobulina b2. Es poligénica (3 loci génicos para la proteína del CMH de clase I en el genoma haploide), dando lugar a seis cadenas a de proteína del CMH de clase I (en el ser humano, dos HLA-A, dos HLA-B y dos HLA-C). La CMH es además polimórfica. El alelo de HLA-A humano A*0201 presenta una prevalencia aproximada de 30% a 50% en la población caucásica (ver, por ejemplo, Player, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363).
El citomegalovirus humano, CMVhu (=virus herpes humano 5, VHH-5) es uno de los virus humanos de mayor tamaño. Su Ref.256424 genoma comprende aproximadamente 230,000 pb de ADN lineal de doble cadena y codifica más de 160 proteínas (ver, por ejemplo, Davison, A.J., et al, J. Gen. Virol.84 (2003) 17-28).
El CMV ha evolucionado para convertirse en un parásito exclusivo del genoma humano y es un potente inmunógeno e induce respuestas inmunológicas fuertes en todos los brazos del sistema inmunológico. Este virus aparentemente es de los antígenos más inmunodominantes conocidos para el sistema inmunológico humano y estimula respuestas de células T CD8+ de una magnitud sin precedentes.
La "latencia" del CMV depende de la supresión inmunológica crónica de los virus CMV y no de un cambio en el patrón de transcripción vírica (ver, por ejemplo, Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464).
Las respuestas inmunológicas de células T CD8+ no se dirigen uniformemente contra todas las proteínas del CMV sino que son dirigidas. Las proteínas del CMV pp65 e IE-1 son las dianas predominantes (ver, por ejemplo, McLaughlin-Taylor, E., et al, J. Med. Virol. 43 (1994) 103-110; Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464).
La frecuencia de las células T específicas del CMV es muy elevada, con frecuencias de los péptidos individuales del orden de hasta 1% a 2% del repertorio total de células T CD8+ (ver, por ejemplo, Moss & Khan, Human Immunology supra; Wills, M.R., et al, J. Virol.70 (1996) 7569-7579).
La respuesta de células T CD8+ específicas del CMV se incrementa marcadamente con la edad y los tetrámeros individuales de péptido HLA frecuentemente tiñen más de 10% del grupo total de células T CD8+ (ver, por ejemplo, Khan, N., et al, J. Immunol.169 (2002) 1984-1992).
La respuesta de las células T CD8+ totales en donantes de edad avanzada sanos podría constituir aproximadamente 50% del repertorio de células T CD8+.
Las enormes expansiones de células T CD8+ con frecuencia son muy restringidas clonalmente, y se estima que el CMV es la causa de por lo menos 30% de las expansiones clónales de células T CD8+ que se observan en la sangre periférica con el envejecimiento. El recuento de células T CD8+ totales es dos veces más alto en donantes seropositivos para CMV de más de 60 años de edad que en una cohorte seronegativa para CMV (ver, por ejemplo, Looncy, R.J., et al, Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219).
Se informa de una fusión de HLA soluble y microglobulina b2 en Mottez et al. (Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471); Godeau et al. (J. Biol. Chem.267 (1992) 24223- 24229) and Mage et al. (Proc. Nati. Acad. Sci.89 (1992) 10658-10662). Se informa de una fusión de péptido de origen vírico y HLA soluble y microglobulina b2 en Mottez et al . (J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502). Se informa de una fusión de cadena pesada de inmunoglobulina con HLA soluble y microglobulina b2 coexpresada en Dal Porto et al . (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675). Se describe una proteína multifunción tetramérica de péptido HLA soluble biotinilado y microglobulina b2 con estreptavidina acoplada químicamente a un Fab en Robert et al . (Eur. J. Immun.30 (2000) 3165-3170). Se informa de una fusión de Fac acoplado químicamente con péptido de origen vírico y HLA soluble y microglobulina b2 en Robert et al . (Cáncer Immunity 1 (2001) 2). Se informa de una fusión de un péptido de origen vírico con HLA soluble y microglobulina b2 con una cadena pesada de anticuerpo monoclonal murino en Greten et al . (J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135). Se informa de la expresión en E. coli de fusiones de scFv sin péptido, repliegue in vitro y carga de péptido en Lev et al . (J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996; Proc. Nati. Acad. Sci.101 (2004) 9051-9056), y Novak et al. (Int. J. Cáncer 120 (2006) 329-336). La utilización de CMH soluble biotinilado cargado con péptidos y acoplado con anticuerpos Fab o scFv fusionados con estreptavidina se informa en Mous et al. (Leukemia 20 (2006) 1096-1102).
En el documento WO 2005/099361 se informa de conjugados de péptido del CMH de clase I-anticuerpo con microglobulina beta-2 modificada. Los conjugados ejemplares tales como los informados en WO 2005/099361 se obtienen mediante la conjugación in vitro de la cadena alfa de la proteína multifunción de CMH (HLA) o mediante la coexpresión a partir de genes separados en la misma célula.
En el documento US 2004/0091488 se informa de constructos antigénicos de antígenos de clase I de la proteína multifunción de histocompatibilidad mayor con moléculas portadoras específicas. Estos polipéptidos de fusión informados no presentan región bisagra.
En el documento WO 99/13095 se da a conocer la utilización de moléculas quiméricas CMH/IG multivalentes cargadas de péptidos para la detección, activación o supresión de respuestas inmunológicas dependientes de células T específicas de antígeno. En el documento WO 02/102299 se informa de métodos y composiciones farmacéuticas para la reducción inmunológica, que resultan particularmente útiles en el tratamiento del cáncer. Oelke M. et al. (Nat. Med.9 (2003) 619-624) informan de la inducción y expansión in vivo de células T citotóxicas específicas de antígeno por células presentadoras de antígenos artificiales recubiertas con HLA-Ig. En el documento WO 2012/175508 se informa de la eliminación de células diana por células T citotóxicas circulantes específicas de virus utilizando complejos que comprenden CMH de clase I. Robert B. et al . (Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3165-3170) informan de que los tetrámeros de CMH de clase I conjugados con anticuerpos pueden presentar como diana células tumorales para la lisis específica por linfocitos T.
Sumario de la Invención En el presente documento se informa de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende uno, dos o más, en una modalidad uno, en otra modalidad dos o cuatro, dominios presentadores de antígeno como primera parte, una región Fe de anticuerpo como segunda parte y por lo menos un sitio de unión a antígeno que se deriva de un anticuerpo y que se une específicamente a un antígeno diana como tercera parte.
Con la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento, pueden dirigirse células T citotóxicas circulantes específicas de virus (células T de memoria y/o células T efectoras) de un individuo a células que expresan el antígeno diana, al que se une específicamente la parte derivada de anticuerpo de la proteína multifunción unida mediante disulfuro. A continuación, mediante el recubrimiento de estas células con un complejo de CMH de clase I, se imita una infección vírica aguda por el péptido de origen vírico unido a la proteína multifunción del CMH de clase I y resultan atraídas células citotóxicas, resultando en la eliminación de la célula diana.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno, dos o más dominios presentadores de antígeno, - exactamente una región Fe de anticuerpo, y - uno o más sitios de unión a antígeno, en la que los dominios presentadores de antígeno comprenden, independientemente, en dirección N-terminal a C-terminal, ya sea (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una » molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el sitio o sitios de unión a antígenos se unen a un antígeno de superficie de una célula de cáncer o a un antígeno de superficie de una célula infectada por virus, Y en los que el dominio presentador de antígeno presenta como mínimo dos residuos de cisteína no naturales que forman un enlace disulfuro intracadena/interdominio.
En una modalidad, un residuo de cisteína no natural en el dominio presentador de antígeno se encuentra en el conector entre el péptido inductor de respuesta de células T y se encuentra un residuo de cisteína no natural en uno de los dominios extracelulares al, a2 y a3 de la molécula de CMH de clase I. En una modalidad, el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro (la posición 11 corresponde a la posición 2 del conector; la posición 227 corresponde a la posición 84 de SEC ID NO: 72 ó SEC ID NO: 140).
En una modalidad, un residuo de cisteína no natural en el dominio presentador de antígeno se encuentra en el conector entre el péptido inductor de respuesta de células T y se encuentra un residuo de cisteína no natural en uno de los dominios extracelulares al, a2 y a3 de la molécula de CMH de clase I. En una modalidad, el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro (la posición 11 corresponde a la posición 2 del conector; la posición 108 corresponde a la posición 84 de SEC ID NO: 71).
En una modalidad, un residuo de cisteína no natural en el dominio presentador de antígeno se encuentra en el conector entre el péptido inductor de respuesta de células T y se encuentra un residuo de cisteína no natural en la microglobulina b2.
En una modalidad, un residuo de cisteína no natural en el dominio presentador de antígeno se encuentra en el conector entre el péptido inductor de respuesta de células T y se encuentra un residuo de cisteína no natural en el conector entre la microglobulina b2 y el dominio extracelular al de una molécula de CMH de clase I.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende un primer y un segundo polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuro, en la que el sitio de unión a antígeno o uno de los sitios de unión a antígeno comprende el primer polipéptido de región Fe y el segundo sitio de unión a antígeno, en caso de encontrarse presente, comprende el segundo polipéptido de región Fe.
En una modalidad, el sitio de unión a antígeno comprende: i) una pareja (afín) de cadena pesada de anticuerpo y cadena ligera de anticuerpo, en la que las cadenas individuales pueden ser cadenas de tipo salvaje o cadenas modificadas (sustituidas, mutadas o de dominio intercambiado), o ii) un polipéptido de fusión de scFv que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un fragmento de anticuerpo scFv y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o iii) un polipéptido de fusión scFab que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un scFab y un polipéptido de región Fe de anticuerpo.
En una modalidad, los sitios de unión a antígeno comprenden, independientemente, i) una pareja (afín) de cadena pesada de anticuerpo y cadena ligera de anticuerpo, en la que las cadenas individuales pueden ser cadenas de tipo salvaje o cadenas modificadas (sustituidas, mutadas o de dominio intercambiado), o ii) un polipéptido de fusión de scFv que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un fragmento de anticuerpo scFv y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o iii) un polipéptido de fusión scFab que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un scFab y un polipéptido de región Fe de anticuerpo.
En una modalidad, i) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de la cadena pesada o al extremo N-terminal de la cadena ligera de un sitio de unión a antígeno (en caso de encontrarse presente un dominio presentador de antígeno), o ii) un dominio presentador de antígeno se une a cada extremo N-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno (en caso de encontrarse presentes dos dominios presentadores de antígeno), o iii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo C-terminal de la cadena pesada o al extremo C-terminal de la cadena ligera del sitio de unión a antígeno (en caso de encontrarse presente un dominio presentador de antígeno), o vi) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo C-terminal de la cadena pesada o a cada extremo C-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno (en caso de encontrarse presentes dos dominios presentadores de antígeno), o v) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión de scFv (en caso de encontrarse presente un dominio presentador de antígeno), o vi) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal o C-terminal de cada polipéptido de fusión de scFv (en caso de encontrarse presentes dos dominios presentadores de antígeno), o vii) se encuentra unido un dominio presentador de antígeno al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión de scFab (en caso de encontrarse presente un dominio presentador de antígeno), o viii) se encuentra unido un dominio presentador de antígeno a cada extremo N-terminal o C-terminal de cada polipéptido de fusión de scFab (en caso de encontrarse presentes dos dominios presentadores de antígeno), o ix) se encuentra unido un dominio presentador de antígeno al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de región Fe (en caso de encontrarse presente un dominio presentador de antígeno), o x) se encuentra unido un dominio presentador de antígeno al extremo N-terminal o C-terminal del primer polipéptido de región Fe y un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de región Fe (en caso de encontrarse presentes dos dominios presentadores de antígeno).
En una modalidad, el antígeno de superficie celular es un antígeno de superficie de una célula de cáncer. En una modalidad, el antígeno de superficie de células de cáncer es el proteoglicano condroitín-sulfato asociado al melanoma (PCSM).
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro covalente.
En una modalidad, el péptido inductor de respuesta de células T es un péptido derivado de virus. En una modalidad, el péptido inductor de respuesta de células T es un péptido inductor de respuesta de células T CD8+.
En una modalidad, el virus se selecciona de entre citomegalovirus humano, adenovirus, herpesvirus 1 humano, herpesvirus 2 humano, herpesvirus 4 humano (virus de Epstein-Barr), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano de tipo 16, virus del papiloma humano de tipo 18, virus del papiloma humano de tipo 31, virus del papiloma humano de tipo 33, virus del papiloma humano de tipo 35, virus del papiloma humano de tipo 39, virus del papiloma humano de tipo 45, virus del papiloma humano de tipo 51, virus del papiloma humano de tipo 52, virus del papiloma humano de tipo 56, virus del papiloma humano de tipo 58, virus del papiloma humano de tipo 59, virus del papiloma humano de tipo 68, virus del papiloma humano de tipo 73, virus del papiloma humano de tipo 82, virus linfotrópico de células T de tipo I, virus de influenza A humano, virus de influenza B humano, virus Vaccinia y virus Dengue.
En una modalidad, el péptido de origen vírico se selecciona de entre los péptidos NLVPMVATV (SEC ID NO: 01), VTEHDTLLY (SEC ID NO: 02), NTDFRVLEL (SEC ID NO: 03), CVETMCNEY (SEC ID NO: 04), VLEETSVML (SEC ID NO: 05), NLVPMVATV (SEC ID NO: 06), RIFAELEGV (SEC ID NO: 07), IIYTRNHEV (SEC ID NO: 08), VLAELVKQI (SEC ID NO: 09), AVGGAVASV (SEC ID NO: 10), TVRSHCVSK (SEC ID NO: 11), IMREFNSYK (SEC ID NO: 12), GPISHGHVLK (SEC ID NO: 13), ATVQGQNLK (SEC ID NO: 14), VYALPLKML (SEC ID NO: 15), AYAQKIFKIL (SEC ID NO: 16), QYDPVAALF (SEC ID NO: 17), YVKVYLESF (SEC ID NO: 18), DIYRIFAEL (SEC ID NO: 19), VFETSGGLW (SEC ID NO: 20) KARDHLAVL (SEC ID NO: 21), QARLTVSGL (SEC ID NO: 22) KARAKKDEL (SEC ID NO: 23), QIKVRVDMV (SEC ID NO: 24), RRRHRQDAL (SEC ID NO: 25), ARVYEIKCR (SEC ID NO: 26), KMQVIGDQY (SEC ID NO: 27), NVRRSWEEL (SEC ID NO: 28), CPSQEPMSIYVY (SEC ID NO: 29), KPGKISHIMLDVA (SEC ID NO: 30), ELRRKMMYM (SEC ID NO: 31), IPSINVHHY (SEC ID NO: 32), FEQPTETPP (SEC ID NO: 33), YAYIYTTYL (SEC ID NO: 34), QEFFWDANDIY (SEC ID NO: 35), YEQHKITSY (SEC ID NO: 36), QEPMSIYVY (SEC ID NO: 37), SEHPTFTSQY (SEC ID NO: 38), QAIRETVEL (SEC ID NO: 39), TRATKMQVI (SEC ID NO: 40), DALPGPCI (SEC ID NO: 41), CEDVPSGKL (SEC ID NO: 42), HERNGFTVL (SEC ID NO: 43), PTFTSQYRIQGKL (SEC ID NO: 44), QMWQARLTV (SEC ID NO: 45), HELLVLVKKAQL (SEC ID NO: 46), o DDYSNTHSTRYV (SEC ID NO: 47), SLYNTVATL (SEC ID NO: 48), GLCTLVAML (SEC ID NO: 49), GILGFVFTL (SEC ID NO: 50) STNRQSGRQ (SEC ID NO: 51), LLFGYPVYV (SEC ID NO: 52) FAEGFVRAL (SEC ID NO: 53), LIVIGILIL (SEC ID NO: 54), o ILHTPGCV (SEC ID NO: 55), WYAQIQPHW (SEC ID NO: 56), AFSGVSWTM (SEC ID NO: 57), ILIGW ITW (SEC ID NO: 58), MMIPTW AF (SEC ID NO: 59), PFPQSNAPI (SEC ID NO: 60), LLLTLLATV (SEC ID NO: 61), IVLEHGSCV (SEC ID NO: 62), LLFKTENGV (SEC ID NO: 63), PLNEAIMAV (SEC ID NO: 64), NLVRLQSGV (SEC ID NO: 65), LVISGLFPV (SEC ID NO: 66), LLLVAHYAI (SEC ID NO: 67), LALLAAFKV (SEC ID NO: 68), VILAGPMPV (SEC ID NO: 69), HVLGRLITV (SEC ID NO: 70), o una variante de los mismos que comprende entre 1 y 3 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos.
En una modalidad, el péptido de origen vírico es un péptido derivado de citomegalovirus humano. En una modalidad, el péptido de origen vírico presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de la SEC ID NO: 01 y la SEC ID NO: 70. En una modalidad, el péptido de origen vírico presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de la SEC ID NO:01 y la SEC ID NO: 47.
En una modalidad, el péptido de origen vírico presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01.
En una modalidad, la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior presenta una frecuencia relativa de 10% o superior.
En una modalidad, la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior es HLA-A*0201 ó HLA-A*1101 ó HLA-A*2402 ó HLA-A*340101 ó HLA-C*0304 ó HLA-C*0401 ó HLA-C*0702.
En una modalidad, la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona según la región del individuo en la que debe administrarse la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, de la manera siguiente: para un individuo de origen europeo, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*4402, HLA-C*0401, HLA-C*0501, HLA-C*0701 y HLA-C*0702, para un individuo de origen australiano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-B*1301, HLA-B*1521, HLA-B*5601, HLA-B*5602, HLA-C*0102, HLA-C*0401, HLA-C*0403 y HLA-C*1502, para un individuo de origen norteamericano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-C*0202, HLA-C*0304, HLA-C*0401 y HLA-C*0702, y para un individuo de origen en el sudeste asiático, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702 y HLA-C*0801.
En una modalidad, la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona según la región del individuo en la que debe administrarse la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, de la manera siguiente: para un individuo de origen Europeo, la molécula de CMH de clase I es HLA-A*0201, para un individuo de origen australiano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*2402, HLA-B*1301, HLA-C*0102 y HLA-C*0401, para un individuo de origen norteamericano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*2402 y HLA-C*0304, y para un individuo de origen en el sudeste asiático, la molécula de CMH de clase I es HLA-A*2402.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un péptido inductor de respuesta de células T, una microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un péptido inductor de respuesta de células T, los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior y una microglobulina b2, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un péptido inductor de respuesta de células T, una microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un péptido inductor de respuesta de células T, los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1% y una microglobulina b2, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1% se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701 y HLA-B*7802.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende: (i) un péptido de origen vírico, (ii) microglobulina b2, (iii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, y (iv) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende : (i) un péptido de origen vírico, (ii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, y (iii) microglobulina b2, (iv) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, la microglobulina b2 es la microglobulina b2 humana.
En una modalidad, la microglobulina b2 es la microglobulina b2 humana de tipo salvaje.
En una modalidad, la microglobulina b2 consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 ylO intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos.
En una modalidad, la microglobulina b2 es la microglobulina b2 humana y la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 10% o superior es la HLA-A*0201 humana.
En una modalidad, los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 140 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 ylO intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, una microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1 % o superior, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1% y una microglobulina b2, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el péptido de origen vírico se encuentra fusionado con la microglobulina b2 mediante un primer péptido conector.
En una modalidad, el péptido de origen vírico se encuentra fusionado con el extremo N-terminal de la microglobulina b2.
En una modalidad, la microglobulina b2 se fusiona con el dominio extracelular al de una molécula del CMH de clase I mediante un segundo péptido conector.
En una modalidad, los dominios extracelulares a3 de una molécula de CMH de clase I se encuentran fusionados con una de las cadenas polipeptídicas unidas mediante disulfuros mediante un tercer péptido conector.
En una modalidad, el primer, segundo y tercer péptidos conectores son iguales o diferentes.
En una modalidad, el primer péptido conector, el segundo péptido conector y el tercer péptido conector se seleccionan independientemente de entre las secuencias de aminoácidos GS (SEC ID NO: 73), GGS (SEC ID NO: 74), GSG (SEC ID NO: 136), GGGS (SEC ID NO: 75), GGGSGGGS (SEC ID NO: 76), GGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 77), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 78), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 79), GGGGS (SEC ID NO: 80), GGGGSGGGGS (SEC ID NO: 81), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 82), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 83), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 84), y GCGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 139).
En una modalidad de todos los aspectos, el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139.
En una modalidad de todos los aspectos, el segundo péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83.
En una modalidad de todos los aspectos, el tercer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 136.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende las SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende las SEC ID NOs: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71, (iv) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 140, (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140, (iv) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71, (v) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108.
En una modalidad: el primer péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139 y/o el segundo péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83 y/o el tercer péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 136.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se caracteriza porque el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (iv) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140 o es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227 y un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se caracteriza porque el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal , (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (iv) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71 o es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (v) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 108 y un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la clase IgG o de la clase IgE.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 ó IgG3 ó IgG4.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 y comprende por lo menos una mutación en E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330 y/o P331 (numeración según el índice EU de Kabat).
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó de la subclase IgG2 con las mutaciones L234A y L235A y/o las mutaciones D265A y N297A, g/o contiene la mutación PVA236 y/o contiene la mutación P329G.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl con las mutaciones L234A y L235A y/o P329G.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 con la mutación S228P y/o L235E.
En una modalidad, el primer y segundo polipéptidos de región Fe de anticuerpo se seleccionan independientemente de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 87 y NO: 101.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 94.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 100.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 101.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 89 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, independientemente, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 o en la posición 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 o 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (ii) una microglobulina b2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, y (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, (iii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, (iii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína raultifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID NO: 104 a 106, y un dominio variable de cadena pesada que comprende SEC ID NO: 108 a 100, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM).
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una icroglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: uno o dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada.
Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 117, una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 118, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 137, una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 118, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 117, una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 118, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 137, una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 118, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos cadenas polipeptídicas de SEC ID NO: 117, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos cadenas polipeptídicas de SEC ID NO: 137, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos cadenas polipeptídicas de SEC ID NO: 117, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, Un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos cadenas polipeptídicas de SEC ID NO: 137, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende un RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 108, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 109, y un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende un RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 104, un RHV-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RHV-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende un RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 108, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 109, un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110 y una secuencia del dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende un RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 104, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende un RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 111, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 112, y un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende un RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 107, un RHV-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RHV-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende un RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 111, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 112, un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110 y una secuencia del dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende un RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 107, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 114, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 113.
En una modalidad, el sitio de unión a PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de SEC ID NO: 114 y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID NO: 113.
En una modalidad, el sitio de unión a PCSM comprende SEC ID NO: 114 y SEC ID NO: 113.
En una modalidad, el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 116, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 115.
En una modalidad, el sitio de unión a PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de SEC ID NO: 116, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID NO: 115.
En una modalidad, el sitio de unión a PCSM comprende SEC ID NO: 116 y SEC ID NO: 115.
En un aspecto, la invención proporciona proteínas multifunción multivalente unidas mediante disulfuro que comprenden la especificidad de unión, es decir, las RVP o dominios variables, de anticuerpos aislados que se unen al PCSM. En particular, la especificidad de unión de los anticuerpos anti-PCSM, es decir los HVRs o dominios variables, comprendidos en las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro proporcionadas en el presente documento se unen a un epítopo membranal proximal del PCSM humano. Tal como se comenta en Staub E. et al . (FEBS Lett. 527 (2002) 114-1 18), la región membranal proximal de PCSM comprende múltiples nuevos dominios repetitivos, denominados dominios repetitivos de PGCS.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un ácido nucleico codificante de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento.
En una modalidad, el ácido nucleico comprende dos a cuatro casetes de expresión que comprenden genes estructurales codificantes de polipéptidos con diferente secuencia de aminoácidos.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una célula hospedera que comprende el ácido nucleico informado en el presente documento.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método para producir una proteina multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento que comprende cultivar la célula hospedera tal como se informa en el presente documento de manera que se produzca la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se recupera de las células o del medio de cultivo y de esta manera se produce la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una formulación farmacéutica que comprende la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad, la formulación farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para la utilización como medicamento.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para el tratamiento del cáncer.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para el tratamiento de una infección vírica.
Un aspecto como es informado en el presente documento es la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para la utilización en la atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para la eliminación de células de cáncer.
Un aspecto como es informado en el presente documento es una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para la eliminación de células infectadas por virus.
Un aspecto como es informado en el presente documento es la utilización de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para la preparación de un medicamento.
En una modalidad, el medicamento está destinado al tratamiento del cáncer.
En una modalidad, el medicamento está destinado al tratamiento de una infección vírica.
En una modalidad, el medicamento es para atraer células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana .
En una modalidad, el medicamento está destinado a la eliminación de células de cáncer.
En una modalidad, el medicamento está destinado a la eliminación de células infectadas por virus.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método de tratamiento de un individuo que presenta cáncer, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento.
En una modalidad, el método comprende además administrar un agente terapéutico adicional en el individuo.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método de tratamiento de un individuo que presenta una infección vírica, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento.
En una modalidad, el método comprende además administrar un agente terapéutico adicional en el individuo.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método de atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad efectiva de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para atraer células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método de eliminación de células de cáncer en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para eliminar/desintegrar células de cáncer.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método de eliminación de células infectadas por virus en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento para eliminar/desintegrar células infectadas por virus.
Un aspecto como es informado en el presente documento es un método para la producción recombinante de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, que comprende: i) un polipéptido de fusión de microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I, ii) una pareja de cadenas polipeptídicas unidas mediante disulfuro, comprendiendo cada una, una región bisagra de anticuerpo, e iii) por lo menos una pareja de dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo en una célula eucariótica, comprendiendo las etapas de i) cultivar una célula eucariótica que comprende uno o más ácidos nucleicos codificantes de la proteína multifunción, e ii) recuperar la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro a partir de la célula o del medio de cultivo, en dondela proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende uno, dos o más polipéptidos de fusión unidos mediante disulfuro de microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I, en la que el enlace disulfuro se encuentra entre los residuos 11 y 227.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende un polipéptido derivado de CMH o un polipéptido de fusión que comprende una molécula derivada del CMH.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende dos polipéptidos derivados de CMH o dos polipéptidos de fusión que comprenden una molécula derivada del CMH.
En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se obtiene a una concentración de 1 mg/1 o más en el medio de cultivo. En una modalidad, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se obtiene a una concentración de 4 mg/1 o más en el medio de cultivo .
En una modalidad, la célula eucariótica es una célula de mamífero. En una modalidad, la célula de mamífero es una célula renal embrionaria humana o una célula ovárica de hámster chino o una célula renal de hámster neonato o una célula de mieloma de ratón.
Las modalidades siguientes pueden combinarse con cualquiera de los aspectos informados en el presente documento. Además, puede combinarse cualquier modalidad informada en el presente documento con cualquier otra modalidad o combinación de modalidades informada en el presente documento.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Esquema anotado de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro bivalente unida mediante disulfuro ejemplar tal como se informa en el presente documento; secuencia N-terminal a C-terminal del polipéptido de fusión de HLA-región Fe: 1-2-3-4-5-6-(3-6 enlace disulfuro) -7-8-9-12-13-14 (con II); secuencia N-terminal a C-terminal del polipéptido de fusión de HLA-cadena pesada: 1-2-3-4-5-6-(3-6 enlace disulfuro)-7-8-9-10-11-12-13-14 (con I); cadena ligera: a-b.
Figura 2 Polipéptidos ejemplares comprendidos en la proteína multifunción informada en el presente documento: se fusionaron polipéptidos de fusión N-terminalmente a un polipéptido que comprendía cadena ligera de anticuerpo o una región bisagra de cadena pesada de anticuerpo.
Figura 3 Western blot de un gel de SDS-poliacrilamida de sobrenadante de cultivo celular de células HEK 293 transfectadas con los plásmidos de expresión correspondientes. Se llevó a cabo la tinción con anticuerpo policlonal de conejo anti-cadena ligera k humana conjugado con peroxidasa y anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Carriles: 1: péptido de dos brazos-microglobulina b2-HLA-A0201-IgG-Fc; 2: péptido de un brazo-microglobulina b2-HLA-A0201-IgG-Fc + IgG-Fc; 3: péptido de un brazo-microglobulina b2-HKA-A0201-q3?qh3 pesada de IgG + cadena ligera de IgG + IgG-Fc; 4: péptido de un brazo-microglobulina b2-HKA-AO2O1-o ?0h pesada de IgG + cadena ligera de IgG + cadena ligera de IgG; 5: péptido de dos brazos-microglobulina b2-HLA-A0201-cadena ligera de IgG + cadena pesada de IgG; 6: péptido de dos brazos-microglobulina b2-HLA-A0201-cadena ligera de IgG + cadena pesada de IgG; 7: péptido de dos brazos-microglobulina p2-HLA-A0201-cadena pesada de IgG + cadena ligera de IgG; 8: péptido de dos brazos-microglobulina b2-H?A-A0201-^0-Rs-3sRn; 9: péptido de un brazo-microglobulina b2-HI·A-A0201-Ro de IgG + IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera); 10: marcador de peso molecular; 11: anticuerpo IgGl estándar de referencia.
Figuras 4A y 4B Análisis de citometría de flujo para determinar el número de células T citolíticas específicas de CMV de diferentes donantes antes y después de la estimulación in vitro con péptido específico: análisis de linfocitos de sangre periférica (LSP) derivados de 4 donantes humanos; anticuerpo anti-CD8 conjugado con tinción de mareaje FITC (BD, NO: de cat.345772) en combinación con CPA pentámero Pro5 (Prolmmune, NO: de cat. F008-4A-E), CMH de clase I que reconoce RCT teñido (HLA-A*0201) cargado con péptido derivado del CMV (NLVPMVATV, SEC ID NO: 01); círculo: células T CD8+ específicas de CMV; Fig.4A: Donante 1; Fig.4B: Donante 3.
Figuras 5A-5C Fig.5A: Gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie: carril 1: estándar de peso molecular, carril 2: péptido de un brazo-microglobulina p2-HLA-A0201-IgG-Fc + IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera), condiciones no reductoras; carril 3: péptido de un brazo-microglobulina b2-HLA-A0201-IgG-Fc + proteína multifunción IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera), condiciones reductoras.
Fig. 5B : Cromatograma de cromatografía de exclusión por tamaño; 1: formas de peso molecular elevado (0.7 % del área); 2: proteína multifunción monomérica (99.3 % del área).
Fig. 5C: esquema de la molécula.
Figuras 6A-6E Fig.6A: gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie tras HPLC de proteína A y CET; condiciones no reductoras; carril 1: estándar de peso molecular, carril 2: péptido-microglobulina P2-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, carril 3: péptido-microglobulina p2-HLA-A0201-HC + LC + IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera).
Fig. 6B: gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie tras HPLC de proteína A y CET; condiciones reductoras; carril 1: estándar de peso molecular, carril 2: péptido-microglobulina b2 -HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, carril 3: péptido-microglobulina b2-HLA-A0201-HC + LC + IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera).
Fig. 6C: cromatograma de cromatografía de exclusión por tamaño de péptido-microglobulina 2-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc; 1: formas de peso molecular elevado (1,9 % del área); 2: proteína multifunción monomérica (98,1 % del área).
Fig. 6D: cromatograma de cromatografía de exclusión por tamaño de péptido-microglobulina b2-HLA-A0201-HC + LC + IgG de un brazo (cadenas pesada y ligera); 1: formas de peso molecular elevado (2.1 % del área); 2: proteína multifunción monomérica (99.3 % del área).
Fig. 6E: moléculas esquemáticas 2: péptido-microglobulina 2-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, 3: péptido-microglobulina 32-HLA-A0201-HC + LC + IgG de un brazo.
Figura 7 Unión de diferentes proteínas multifunción CMH-I sobre células diana PCSM+ (Colo38): Se incubaron las células Colo38 durante 5 minutos con acutasa (PAA, NO: de cat. Lll-007) para obtener una suspensión de células individuales. Se incubaron 2xl05 células en cada vial con 1 pg/ml de proteína multifunción CMH-I en 100 ml de PBS/FCS al 2% durante 45 minutos a 4°C. Tras la incubación, las células se lavaron con 1 mi de PBS frío/FCS al 2% y se centrifugaron durante 7 minutos con 910 rpm. Las células se resuspendieron en 100 ml de PBS/FCS al 2% con anticuerpo secundario (conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgGl humano y PE, Jackson, NO: de cat. 109-116-088) (2 mg/ml) y se incubaron durante 45 minutos adicionales a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 1 mi de PBS/FCS al 2% y se midieron con el citómetro de flujo BD Canto II.
Figuras 8A-8C Ensayo de citotoxicidad: la proteína multifunción de unión a antígeno informada en el presente documento induce la lisis de las células tumorales H460M2 mediante las células T específicas de CMV humanas. Fig. A: células diana (6 h): células T efectoras específicas de CVM 1:1.5; Fig. 6B células diana (6 h)rcélulas T efectoras específicas de CMV 1:0.75; Fig. 8C células diana (6 h):células T efectoras específicas de CMV 1:0.5; barra izquierda: proteína multifunción tal como se informa en el presente documento; barra derecha, mAb de IGF-IR-afucosilado.
Figuras 9A-9C Ensayo de citotoxicidad: la proteína multifunción de unión a antígeno informada en el presente documento induce la lisis de las células tumorales 124 3T3 mediante las células T específicas de CMV humanas. Fig.9A: células diana (9 h): células T efectoras específicas de CMV 1:1.5; Fig. 9B: células diana (9 h): células T efectoras específicas de CMV 1:0.75; Fig. 9C: células diana (9 h): células T efectoras específicas de CMV 1:0.5; barra izquierda: proteína multifunción informada en el presente documento; barra intermedia: mAb IGF-lR-afu; barra derecha: anticuerpo anti-digoxigenina.
Figuras 10A-10C Análisis de FACS de la unión de anticuerpo anti-IGF-lR y proteínas multifunción informadas en el presente documento a la línea celular de adenocarcinoma pulmonar H460M2; Fig. 10A anticuerpo secundario únicamente (de cabra anti-IgG(H+L) humano (Jackson Laboratories, NO: de cat. 109-116-088); Fig. 10B: proteína multifunción tal como se informa en el presente documento, en la que el polipéptido de fusión se encuentra fusionado con el extremo N-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-lR que comprende únicamente una pareja de dominios variables; Fig. 10C: anticuerpo anti-IGF-lR.
Figura 11 Eficacia y especificidad in vitro (ensayo de citotoxicidad) de diferentes proteínas multifunción informadas en el presente documento; a: proteína multifunción que comprende un anticuerpo anti-IGFIR monovalente y un péptido derivado de CMV, b: proteína multifunción que comprende un anticuerpo anti-IGFIR monovalente y un péptido derivado del VEB (control), c: proteína multifunción que comprende un anticuerpo anti-IGFIR bivalente y un péptido derivado de CMV, d: anticuerpo anti-IGF-lR (control), e: anticuerpo anti-digoxigenina (control).
Figura 12 Eficacia y especificidad in vitro (valor de EC50) de una proteína multifunción informada en el presente documento, en la que el polipéptido de fusión se fusiona con el extremo N-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-lR completo determinadas a diferentes proporciones de células diana (T) a células efectoras (E).
Figura 13 Lisis de células diana tras 6 horas de incubación con a: una proteína multifunción que comprende un anticuerpo anti-IGFIR monovalente y un polipéptido de fusión que comprende un péptido derivado de CMV, y b: un anticuerpo anti-IGF-lR a una proporción de células diana a efectoras de 1:1.5.
Figura 14 Curso del índice celular normalizado para células Colo38 incubadas con proteínas multifunción MHC-I-anti-PCSM; concentración de proteína multifunción: 1 ug/ml (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), MHCI-0030 (3), MHCI-0031 (4)), proporción de células efectoras a diana de 10:1; las CMSP del donante 3 (200.000 células, el donante 3 es positivo para CMV pero negativo para VEB) y la línea celular tumoral de melanoma Colo38 (20.000 células), por cada 96 pocilios, los datos se han obtenido por triplicado.
Figura 15A: Curso del índice celular normalizado para células Colo38 incubadas con proteínas multifunción CMH-I-anti-PCSM; concentración de proteína multifunción: 1 mg/ml (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), CMSP solas (3)), proporción de células efectoras a diana de 10:1; las CMSP del donante 3 (200.000 células, el donante 3 es positivo para CMV pero negativo para VEB) y la línea celular tumoral de melanoma Colo38 (20.000 células), por cada 96 pocilios, los datos se han obtenido por triplicado.
Figura 15B: Curso del índice celular normalizado para células WM266 incubadas con proteínas multifunción CMH-1-anti-PCSM; concentración de proteína multifunción: 1 mg/ml (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), MHCI-0030 (3), MHCI-0031 (4)), células diana solas (5), células diana + células T (6)), proporción de células efectoras a diana de 10:1; las CMSP del donante 3 (200.000 células, el donante 3 es positivo para CMV pero negativo para VEB) y la línea celular tumoral de melanoma MW266 (20.000 células), por cada 96 pocilios, los datos se han obtenido por triplicado.
Figura 16 Lisis de células diana tras 42 horas de incubación con proteína multifunción en presencia de CMSP no estimuladas por las proteínas multifunción MHCI-0008 (monovalentes, péptido de CMV cargado, 1), MHCI-0010 (monovalente, control cargado con péptido de VEB, 2), MHC-0026 (bivalente, cargado con péptido de CMV, control no ligante, 3), MHCI-0030 (monovalente, cargado con péptido de CMV, activo, 4) y MHCI-0031 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo, 5).
Figura 17 Lisis de células diana tras 48 horas de incubación con proteína multifunción lleva a cabo en presencia de CMSP no estimuladas por las proteínas multifunción MHCI-0008 (monovalentes, péptido de CMV cargado, 1) , MHCI-0010 (monovalente, control cargado con péptido de VEB, 2), MHC-0026 (bivalente, cargado con péptido de CMV, control no ligante, 3), MHCI-0030 (monovalente, cargado con péptido de CMV, activo, 4) y MHCI-0031 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo, 5).
Figura 18A: Lisis de células Colo38 tras 10 horas de incubación con proteína multifunción en presencia de CMSP estimuladas por las proteínas multifunción MHCI-0008 (monovalentes, péptido de CMV cargado, 1), MHCI-0010 (monovalente, control cargado con péptido de VEB, 2), MHC-0026 (bivalente, cargado con péptido de CMV, control no ligante, 3), MHCI-0030 (monovalente, cargado con péptido de CMV, activo, 4) y MHCI-0031 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo, 5) a una concentración de 1 mg/ml.
Figura 18B: Lisis de células WM266 después de 10 horas de incubación con proteína multifunción en presencia de CMSP estimuladas por las proteínas multifunción MHCI-0008 (monovalentes, péptido de CMV cargado, 1), MHCI-0010 (monovalente, control cargado con péptido de VEB, 2), MHC-0026 (bivalente, cargado con péptido de CMV, control no ligante, 3), MHCI-0030 (monovalente, cargado con péptido de CMV, activo, 4) y MHCI-0031 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo, 5) a una concentración de 1 pg/ml.
Figuras 19A y 19B Cromatograma analítico de exclusión por tamaño tras cromatografía de afinidad de proteína A aunque antes de la cromatografía preparativa de exclusión por tamaño de una proteína multifunción estabilizada por disulfuros (Fig. 19A) y una proteína multifunción estabilizada por disulfuros (Fig.19B).
Figura 20 Lisis de células Colo38 en presencia de CMSP estimuladas con las proteínas multifunción MHCI-0031 (bivalentes, cargadas con péptido de CMV, activas, no unidas por disulfuros, 1) y MHCI-0054 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo, versión unida por disulfuros de MHCI-0031, 2) a una concentración de 1 mg/ml.
Figura 21 Estabilidad térmica de IgG de longitud completa de tipo salvaje (triángulos), proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tal como se informan en el presente documento (rombos), proteínas multifunción multivalente sin estabilización con enlaces disulfuro (asteriscos).
Las figuras 22A-22K son proteínas multifunción que comprenden uno, dos o más sominios presentadores de antígeno que contienen un complejo de proteínas del CMH-I, según se describen en la Tabla 4.
Las figuras 23A-23J son proteínas resultantes del ejemplo 3.
Las figuras 24A-24D son proteínas resultantes del ejemplo 14.
Breve Descripción del Listado de Secuencias SEC ID NO: 01 a 47 Péptidos derivados de citomegalovirus humano.
SEC ID NO: 48 Péptido derivado de virus de inmunodeficiencia humana.
SEC ID NO: 49 Péptido derivado de virus herpes 4 humano.
SEC ID NO: 50 Péptido derivado de virus de influenza A.
SEC ID NO: 51 Péptido derivado de virus de la hepatitis B.
SEC ID NO: 52 Péptido derivado de virus linfotrópico tipo 1 de células T humanas.
SEC ID NO: 53 Péptido derivado del homólogo del oncogén V-jun del virus 17 del sarcoma (JUN).
SEC ID NO: 54 Péptido derivado de adenovirus tipo 3 humano.
SEC ID NO: 55 Péptido derivado de virus de la hepatitis C.
SEC ID NO: 56 a 70 Péptidos derivados de virus Dengue.
SEC ID NO: 71 Secuencia de aminoácidos de la microglobulina b2 humana.
SEC ID NO: 72 Secuencia de aminoácidos de la cadena al as de HLA-A*0201 humana.
SEC ID NO: 73-84 Secuencias de aminoácidos de péptido conector SEC ID NO: 85 Secuencia de aminoácidos del dominio CH2 de IgGl humana.
SEC ID NO: 86 Secuencia de aminoácidos del dominio CH2 de IgGl humana.
SEC ID NO: 87 Secuencia de aminoácidos de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 88 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 89 Secuencia de aminoácidos mutante T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 90 Secuencia de aminoácidos mutante T366W de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 91 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 92 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, T366W de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 93 Secuencia de aminoácidos mutante P329G de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 94 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 95 Secuencia de aminoácidos mutante P329G, T366S , L368A, Y407V de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 96 Secuencia de aminoácidos mutante P329G, T366W de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 97 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgGl humana .
SEC ID NO: 98 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366W de la región Fe de IgGl humana.
SEC ID NO: 99 Secuencia de aminoácidos de la región Fe de IgG4 humana.
SEC ID NO: 100 Secuencia de aminoácidos mutante S228P, L235E de la región Fe de IgG4 humana.
SEC ID NO: 101 Secuencia de aminoácidos mutante S228P, L235E, P329G de la región Fe de IgG4 humana.
SEC ID NO: 102 Secuencia de aminoácidos mutante S228P, L235E, P329G, T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgG4 humana.
SEC ID NO : 103 Secuencia de aminoácidos mutante S228P, L235E, P329G, T366W de la región Fe de IgG4 humana.
SEC ID NO: 104 RVP-L1 SEC ID NO: 105 RVP-L2 SEC ID NO: 106 RVP-L3 SEC ID NO: 107 RVP-L1 SEC ID NO: 108 RVP-H1 SEC ID NO: 109 RVP-H2 SEC ID NO: 110 RVP-H3 SEC ID NO: 111 RVP-H1 SEC ID NO: 112 RVP-H2 SEC ID NO: 113 VL SEC ID NO: 114 VH SEC ID NO: 115 VL SEC ID NO: 116 VH SEC ID NO: 117 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgGl de CMH-I-VH (PCSM).
SEC ID NO: 118 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366W de la región Fe de IgGl de VH(PCSM).
SEC ID NO: 119 Secuencia de aminoácidos de VL(PCSM)-CL SEC ID NO: 120 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (kappa) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IGF-1R.
SEC ID NO: 121 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IGF-lR.
SEC ID NO: 122 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de botón) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IGF-lR.
SEC ID NO: 123 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de ojal) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IGF-lR.
SEC ID NO: 124 Región bisagra de mutante de región Fe de IgGl humana y mutante L234A, L235A y variante de botón.
SEC ID NO: 125 Fv de cadena sencilla estabilizado por disulfuro de anticuerpo monoclonal humanizado anti-IGF-lR.
SEC ID NO: 126 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (kappa) de anticuerpo monoclonal murino anti-PCSM.
SEC ID NO: 127 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (kappa) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-PCSM.
SEC ID NO: 128 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A) de anticuerpo monoclonal murino anti-PCSM.
SEC ID NO: 129 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-PCSM.
SEC ID NO: 130 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de botón) de anticuerpo monoclonal murino anti-PCSM.
SEC ID NO: 131 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de botón) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-PCSM.
SEC ID NO: 132 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de ojal) de anticuerpo monoclonal murino anti-PCSM.
SEC ID NO: 133 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgGl mutante L234A, L235A y variante de ojal) de anticuerpo monoclonal humanizado anti-PCSM.
SEC ID NO: 134 Fv de cadena sencilla estabilizado por disulfuro de anticuerpo monoclonal murino anti-PCSM.
SEC ID NO: 135 Fv de cadena sencilla estabilizado por disulfuro de anticuerpo monoclonal humanizado anti-PCSM.
SEC ID NO: 136 Péptido conector 13.
SEC ID NO: 137 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V de la región Fe de IgGl de CMH-I-VH (PCSM) estabilizada por disulfuro.
SEC ID NO: 138 Secuencia de aminoácidos del PCSM humano.
SEC ID NO: 139 Conector para proteínas multifunción unidas mediante disulfuro.
SEC ID NO: 140 Secuencia de aminoácidos de la cadena al ce de HLA-A*0201 humana modificada para proteínas multifunción unidas mediante disulfuro.
SEC ID NO: 141 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V de VH (PCSM)-región Fe de IgGl.
SEC ID NO: 142 Secuencia de aminoácidos mutante L234A, L235A, P329G, T366W de la región Fe de IgGl de VH(PCSM).
Descripción Detallada de la Invención I . DEFINICIONES El término "afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse de manera general con la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos de la téenica, incluyendo los indicados en el presente documento. A continuación se describen modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para la medición de la afinidad de unión.
El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere al grupo de carboxi-a-aminoácidos, que directamente o en forma de un precursor pueden encontrarse codificados por un ácido nucleico. Los aminoácidos individuales se encuentran codificados por ácidos nucleicos que consisten de tres nucleótidos, denominados codones o tripletes de bases. Cada aminoácido se encuentra codificado por como mínimo un codón. Esto se conoce como "degeneración del código genético". El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a los carboxi-a-aminoácidos naturales que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), U sina (lys, K), metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P.), serina (ser, S) , treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).
Las expresiones "anticuerpo an i-diana" y "un anticuerpo que se une a una diana" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a una diana con suficiente afinidad para que el anticuerpo resulte útil como agente diagnóstico y/o terapéutico focalizado en la diana. En determinadas modalidades, un anticuerpo que se une a la diana presenta una constante de disociación (¾) de £ 10 nM, £ 1 nM, £ 0.1 nM, £ 0.01 nM, ó £ 0.001 nM (por ejemplo de 108 M o inferior, por ejemplo de entre 108 M y 10~13 M, por ejemplo de entre 10-9 M y 1013 M).
El término "anticuerpo" en el presente documento se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad de unión al antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Fv, Fab, Fab' , Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo scFv), anticuerpos de dominio simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La expresión "sitio de unión al antígeno" se refiere a una fracción proteica que puede unirse específicamente a una diana. Son sitios de unión a antígeno ejemplares, péptidos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de dominio simple o dominios variables de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo anticuerpo de camello o de tiburón). El sitio de unión a antígeno puede ser un sitio de unión a antígeno natural o un sitio de unión a antígeno manipulado. Son sitios de unión a antígeno manipulados ejemplares, los DARPIN, los anticuerpos de dominio intercambiado o los fragmentos de anticuerpo de dominio intercambiado y los anticuerpos de dominio variable dual.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, Y y m, respectivamente.
La expresión "molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de" se refiere a que la molécula de CMH de clase I respectiva presenta una frecuencia de aparición en una población específica humana o entre todos los seres humanos de la frecuencia relativa dada. Es decir, una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 10% o superior puede encontrarse en 10% o más de todos los seres humanos de una población específica, tal como, por ejemplo, en 27.2% de todos los seres humanos de origen europeo.
La "conjugación" de una proteína multifunción con su pareja de conjugación puede llevarse a cabo mediante diferentes métodos, tales como la unión química, o la unión mediante una pareja de unión específica, o mediante fusión genética. La expresión "pareja de conjugación" se refiere, por ejemplo, a polipéptidos, mareajes detectables, miembros de parejas de unión específicas. En una modalidad, la conjugación de proteína multifunción ultivalente unida mediante disulfuro con su pareja de conjugación se lleva a cabo mediante unión química mediante grupos N-terminales y/o e-amino (lisina), grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólicos de la secuencia de aminoácidos de las partes de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro y/o grupos de alcohol de sacárido de la estructura de carbohidrato de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro. E Enn uunnaa mmooddaalliiddaadd,, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se conjuga con su pareja de conjugación mediante una pareja de unión específica.
La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Entre los agentes citotóxicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, iissóóttooppooss rraaddiiooaaccttiivvooss (por ejemplo At211, I3i, I125 , Y90, Re186 , Re188 , Sm153 , Bi212 , P32, Pb2 12 isótopos radioactivos de Lu), agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes), agentes inhibidores del crecimiento, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticos, antibióticos, toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticáncer.
Los cromógenos (grupos y pigmentos fluorescentes o luminiscentes), las enzimas, los grupos activos en RMN o las partículas metálicas, los haptenos, por ejemplo la digoxigenina, son ejemplos de "mareajes detectables". El mareaje detectable también puede ser un grupo reticulante fotoactivable, por ejemplo un grupo azido o un grupo azirina. Los quelatos metálicos que pueden detectarse mediante electroquimioluminiscencia también son grupos emisores de señal adecuados, resultando de particular interés los quelatos de rutenio, por ejemplo un quelato de (bispiridil)32+ rutenio. Los grupos de mareaje de rutenio adecuados se describen en, por ejemplo, la patente EP 0 580 979 y en los documentos WO 90/05301, WO 90/11511 y WO 92/14138. Para la detección directa, el grupo de mareaje puede seleccionarse de entre cualesquiera grupos marcadores detectables conocidos, tales como pigmentos, grupos de mareaje luminiscente, tales como grupos quimioluminiscentes, por ejemplo ésteres de acridinio o dioxetanos, o pigmentos fluorescentes, por ejemplo fluoresceína, coumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina y derivados de los mismos. Otros ejemplos de grupos de mareaje son los complejos metálicos luminiscentes, tales como los complejos de rutenio o de europio; las enzimas, por ejemplo las utilizados para ELISA o para CEDIA (inmunoensayo de enzima donante clonado, por ejemplo el documento EP NO: A-0 061 888) y los isótopos radioactivos.
La expresión "funciones efectoras" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, las cuales varían con el isotipo del anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen: unión de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión de receptor de Fe, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de células B) y activación de las células B.
Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo de una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad que r resulta efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "expresión" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la transcripción y/o traducción y a los procesos de secreción que se producen dentro de una célula. El nivel de transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que se encuentra presente en la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de una secuencia de interés puede cuantificarse mediante RT-PCR o mediante hibridación northern (ver Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY, 1989). Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico pueden cuantificarse mediante diversos métodos, por ejemplo mediante ELISA, mediante el ensayo para la actividad biológica del polipéptido o mediante la utilización de ensayos que son independientes de tal actividad, tales como la Western blot o el radioinmunoensayo, utilizando inmunoglobulinas que reconocen y se unen al polipéptido (ver Sambrook et al., supra, 1989).
Un "casete de expresión" se refiere a un constructo que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como un promotor y un sitio de poliadenilación, para la expresión de por lo menos el ácido nucleico contenido en una célula.
La expresión "maquinaria de expresión" se refiere a la suma de enzimas, cofactores, etc. de una célula que participa en las etapas desde la etapa de transcripción de un ácido nucleico o gen (es decir, la también denominada "maquinaria de expresión génica") hasta la modificación post-traduccional del polipéptido codificado por el ácido nucleico. La maquinaria de expresión comprende, por ejemplo, las etapas de transcripción del ADN en pre-ARNm, el procesamiento de pre-ARNm en ARNm maduro, la traducción en un polipéptido del ARNm y la modificación post-traduccional del polipéptido.
Un "plásmido de expresión" es un ácido nucleico que proporciona todos los elementos necesarios para la expresión del gen o genes estructurales comprendidos en una célula hospedera. Típicamente, un plásmido de expresión comprende una unidad de propagación plásmido procariótico, por ejemplo para E. coli , que comprende un origen de replicación y un marcador seleccionable, un marcador de selección eucariótico y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen o genes estructurales de interés, comprendiendo cada uno un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción, incluyendo una señal de poliadenilación. La expresión génica habitualmente se somete al control de un promotor, y tal gen estructural se dice que se encuentra "operablemente ligado" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor mínimo se encuentran operablemente ligados en el caso de que el elemento regulador module la actividad del promotor mínimo.
La expresión "región Fe" se refiere a la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La región Fe es una molécula dimérica que comprende dos polipéptidos de cadena pesada de anticuerpo unidos mediante disulfuros. Puede generarse una región Fe mediante digestión con papaína, o digestión con IdeS o digestión con tripsina de un anticuerpo intacto (de longitud completa) o puede producirse recombinantemente .
La región Fe obtenible a partir de un anticuerpo o inmunoglobulina de longitud completa comprende por lo menos entre el residuo 226 (Cys) y el extremo C-terminal de la cadena pesada de longitud completa y, de esta manera, comprende una parte de la región bisagra y dos o tres dominios constantes, es decir, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4 adicional/extra en el caso de los anticuerpos de clases IgE e IgM. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede encontrarse presente o no. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos aminoácidos en la región Fe o en la región constante se lleva a cabo según el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, publicación del N1H 91-3242.
La formación de la región Fe dimérica que comprende dos polipéptidos de región Fe de cadena pesada de anticuerpo idénticos o no idénticos se encuentra mediada por la dimerización no covalente de los dominios CH3 comprendidos (para los residuos aminoácidos participantes ver, por ejemplo, Dall'Acqua, Biochem.37 (1998) 9266-9273). La región Fe se encuentra estabilizada covalentemente por la formación de enlaces disulfuro en la región bisagra (ver, por ejemplo, Huber et al., Nature 264:415-420, 1976; Thies et al., J. Mol. Biol .293:67-79, 1999).
Es conocido a partir de las patentes US 5,648,260 y US 5,624,821 que la modificación de los residuos aminoácidos definidos en la región Fe resulta en efectos fenotípicos.
La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento puede comprender en una modalidad como polipéptido de región bisagra de cadena pesada de anticuerpo una región Fe humana o una región Fe derivada de origen humano. En una modalidad adicional, la región Fe es una región Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 ó una región Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2 ó IgG3, que ha sido modificada de manera que no pueda detectarse ninguna unión de receptor de Fcy (por ejemplo FcYRIIIa) y/o de Clq. En una modalidad, la región Fe es una región Fe humana y especialmente de la subclase IgG4 humana o una región Fe mutada de la subclase IgGl humana. En una modalidad, la región Fe es de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G. Aunque IgG4 muestra una unión reducida a Fcy (FcyRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran un nivel de unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y/o His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de Fcy (Shields R.L. et al . , J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001; Lund J. et al., FASEB J. 9:115-119, 1995; Morgan A. et al . , Immunology 86:319-324, 1995; EP 0307 434) . En una modalidad, una proteína mult ifuñeion multivalente unida mediante disulfuro tal como se informó en el presente documento se refiere a la unión de receptores de Fcy de la subclase IgG4 ó de la subclase IgGl ó IgG2, con una mutación L234, L235, P329 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, las mutaciones son S228P, L234A, L235A, L235E, PVA236 (PVA236 se refiere a la secuencia de aminoácidos ELLG (proporcionada en el código de una letra de los aminoácidos) entre las posiciones aminoácidas 233 y 236 de IgGl, o EFLG de IgG4 es sustituido por PVA) y/o P329G. En una modalidad, las mutaciones son S228P y P329G de IgG4, y L234A, L235A y P329G de IgGl. La región Fe de un anticuerpo participa directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos) y en la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que no se una a receptores de Fcy y/o al factor del complemento Clq no induce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana de tipo salvaje del isotipo IgGl presenta la secuencia de aminoácidos siguiente : EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 87).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones L234A, L235A presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 88).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones T366S, L2368A y Y407V presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 89).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con una mutación T366W presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 90).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones L234A, L235A y T366S, L2368A y Y407V presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 91).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con una mutación L234A, L235A y T366W presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 92).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con una mutación P329G presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 93).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con una mutación L234A, L235A y P329G presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 94).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones P239G, T366S, L368A y Y407V presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 95).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con mutaciones P329G y T366W presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 96).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones L234A, L235A, P329G y T366S, L368A y Y407V presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 97).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgGl con las mutaciones L234A, L235A, P329G y T366W presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 98).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana de tipo salvaje del isotipo IgG4 presenta la secuencia de aminoácidos siguiente : ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEC ID NO: 99).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgG4 con mutaciones S228P y L235E presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ( SEC ID NO : 100 ) .
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgG4 con mutaciones S228P, L235E y P329G presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEC ID NO : 101 ) .
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgG4 con las mutaciones S228P, L235E, P329G y T366S, L368A y Y407V presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEC ID NO: 102).
Una cadena polipeptídica de una región Fe humana variante del isotipo IgG4 con mutaciones S228P, L235E, P329G y T366W presenta la secuencia de aminoácidos siguiente: ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEC ID NO: 103).
Las expresiones "célula hospedera", "línea celular hospera" y "cultivo de células hospederas" se utilizan intercambiablemente y se refieren a células en las que se han introducido ácidos nucleicos exógenos, incluyendo la progenie de tales células. Entre las células hospederas se incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma con independencia del número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en su contenido de ácidos nucleicos a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado o selección de entre las células originalmente transformadas se encuentra incluida en el presente documento.
El término "célula" incluye tanto células procarióticas, que se utilizan para la propagación de plásmidos, como células eucarióticas, que se utilizan para la expresión de un ácido nucleico. En una modalidad, la célula eucariótica es una célula de mamífero. En una modalidad, la célula de mamífero se selecciona de entre el grupo de células de mamífero que comprende células CHO (por ejemplo CHO K1, CHO DG44), células BHK, células NSO, células Sp2/0, células HEK 293, células HEK 293 EBNA, células PER.C6 y células COS.
Un "anticuerpo humano" es uno que presente una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivada de una fuente no humana que utiliza los repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos ligantes de antígeno no humanos.
Un "inmunoconjugado" se refiere a una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento conjugada con una o más moléculas heterólogas, incluyendo, aunque sin limitación, un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, animales domesticados (por ejemplo vacas, ovejas, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo ratones y ratas). En determinadas modalidades, el individuo o sujeto es un ser humano.
Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro "aislada" es una que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. En algunas modalidades, una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se purifica hasta una pureza superior a 95% ó 99% según se determina mediante, por ejemplo, métodos electroforéticos (por ejemplo SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (EIE), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo HPLC de intercambio iónico o de fase inversa).
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenido en células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, aunque la molécula de ácido nucleico se encuentra presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "PCSM", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier PCSM (proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma) nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo seres humanos) y roedores (por ejemplo ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término comprende PCSM no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de PCSM que resulte del procesamiento en la célula. El término comprende además variantes naturales de PCSM, por ejemplo variantes de procesamiento o variantes alélicas. El PCSM también es conocido como proteoglicano condroitín-sulfato 4 (PCS4), proteoglicano condroitín-sulfato NG2, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (AAM-APM) y proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma. La secuencia de aminoácidos de un PCSM humano ejemplar se muestra en la SEC ID NO: 1. Ver también Pluschke G. et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:9710-9715, 1996; Staub E. et al . , FEBS Lett.527 (2002) 114-118, y GenBank No: de acceso NP_001888.
La expresión "un dominio presentador de antígeno" se refiere exactamente a un, es decir un único, dominio presentador de antígeno tal como se ha definido, y excluye la presencia de un adicional, es decir un segundo, dominio presentador de antígeno adicional. El término "uno" se refiere a "exactamente uno" o "un único".
La expresión "dos dominios presentadores de antígeno" se refiere a la presencia de exactamente dos dominios presentadores de antígeno tal como se define y excluye la presencia de únicamente un solo, es decir uno, dominio presentador de antígeno.
La expresión "operablemente ligado" se refiere a una yuxtaposición de dos o más componentes, en la que los componentes indicados de esta manera se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida.
Por ejemplo, un promotor y/o un intensificador se encuentran operablemente ligados a una secuencia codificante, en el caso de que actúen en cis controlando o modulando la transcripción de la secuencia ligada. De manera general, aunque no necesariamente, las secuencias de ADN que se encuentran "operablemente ligadas" son contiguas y, en caso necesario, unen dos regiones codificantes de proteína, tales como un líder secretorio y un polipéptido, contiguos y en el mismo marco (de lectura). Sin embargo, aunque un promotor ligado operablemente generalmente se encuentra situado cadena arriba de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo a la misma. Los intensificadores no son necesariamente contiguos. Un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que el intensificador incremente la transcripción de la secuencia codificante. Los intensificadores ligados operablemente pueden encontrarse situados corriente arriba, en el interior o corriente abajo de las secuencias codificantes y a una distancia considerable del promotor. Un sitio de poliadenilación se encuentra ligado operablemente a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado en el extremo de corriente abajo de la secuencia codificante, de manera que se produce la transcripción de la secuencia codificante hasta entrar en la secuencia de poliadenilación. Un codón de parada de la traducción se encuentra operablemente ligado a una secuencia de ácidos nucleico exónico en el caso de que se encuentre situado en el extremo de corriente abajo (extremo 3') de la secuencia codificante, de manera que se produce la traducción de la secuencia codificante hasta el codón de parada y se termina en el mismo. El ligamiento se lleva a cabo por métodos recombinantes conocidos de la téenica, por ejemplo utilizando métodos de PCR y/o mediante ligación en sitios de restricción convenientes. En el caso de que no existan sitios de restricción convenientes, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o conectores según la práctica convencional.
La expresión "impresos dentro del paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes a la utilización de tales productos terapéuticos.
La expresión "péptido conector" se refiere a secuencias de aminoácidos de origen natural y/o sintético. Consisten de una cadena lineal de aminoácidos en la que los 20 aminoácidos naturales con los bloques constructivos monoméricos. El péptido conector presenta una longitud de entre 1 y 50 aminoácidos; en una modalidad, de entre 1 y 28 aminoácidos; en una modalidad adicional, de entre 2 y 25 aminoácidos. El péptido conector puede contener secuencias de aminoácidos repetitivas o secuencias de polipéptidos naturales. El conector presenta la función de garantizar que los polipéptidos conjugados entre sí puedan llevar a cabo su actividad biológica al permitir que los polipéptidos se plieguen correctamente y sean correctamente presentados. En una modalidad, el péptido conector es rico en residuos de glicina, glutamina y/o serina. Estos residuos se disponen, por ejemplo, en unidades repetitivas pequeñas de hasta cinco aminoácidos, tales como GS (SEC ID NO: 73), GGS (SEC ID NO: 74), GGGS (SEC ID NO: 75) y GGGGS (SEC ID NO: 80). Esta pequeña unidad repetitiva puede repetirse una a cinco veces. En los extremos aminoterminal y/o carboxiterminal de la unidad multimérica pueden añadirse seis aminoácidos adicionales naturales arbitrarios. Otros conectores peptídicos sintéticos están compuestos de un solo aminoácido, que se repite entre 10 y 20 veces y que puede comprender en el extremo aminoterminal y/o carboxiterminal hasta seis aminoácidos adicionales naturales arbitrarios. Todos los conectores peptídicos pueden encontrarse codificados por una molécula de ácidos nucleicos y por lo tanto pueden expresarse recombinantemente . Debido a que los conectores son ellos mismos péptidos, el polipéptido conectado por el conector se conecta al conector mediante un enlace peptídico que se forma entre dos aminoácidos.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma resulte efectiva, y que no contiene componentes adicionales que resulten inaceptablemente tóxicos para un sujeto en dondese administre la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, aparte de un ingrediente activo, que no resulta tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitación, una solución amortiguadora, excipiente, estabilizador o conservante.
Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, producidos natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 25 residuos aminoácidos pueden denominarse "péptidos", mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos aminoácidos pueden denominarse "proteínas". Un polipéptido también puede comprender componentes no aminoácidos, tales como grupos carbohidrato, iones metálicos o ésteres de ácido carboxílico. Los componentes no aminoácidos pueden ser añadidos por la célula, en la que se expresa el polipéptido, y pueden variar según el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en el presente documento en términos de su estructura del esqueleto de aminoácidos o el ácido nucleico codificante del mismo. Las adiciones, tales como grupos carbohidrato, generalmente no se especifican, aunque de todos modos pueden encontrarse presentes.
Un "gen estructural" se refiere a la región de un gen sin una secuencia de señal, es decir, la región codificante.
La expresión "péptido inductor de respuesta de células T" se refiere a un péptido presentado en el surco de unión a péptidos de una proteína multifunción CMH de clase I y que resulta reconocido por células T de memoria o efectoras circulantes. El reconocimiento del péptido resulta en una respuesta inmunológica de eliminación de la célula presentadora de la proteína multifunción CMH de clase I.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refieren a la intervención clínica en un intento para alterar el curso natural del individuo bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la reducción de la velocidad de avance de la enfermedad, la mejora o el alivio del estado de la enfermedad y la remisión el pronóstico mejorado. En algunas modalidades, se utilizan anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para enlentecer el avance de la misma.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente presentan estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (RM) y tres regiones hipervariables (RHV). Ver, por ejemplo, Kindt T.J. et al . , Kuby Immunology, 6a edición, W.H. Freeman and Co., N.Y., 2007, página 91). Un único dominio VH o VL puede resultar suficiente para proporcionar especificidad de unión a antígeno. Además, pueden aislarse anticuerpos que se unen a un antígeno particular utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno con el fin de cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo. Portolano S. et al . , J. Immunol.150(1993) 880-887; Clackson T. et al . , Nature 352 (1991) 624-628.
El término "vector", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de propagar otro ácido nucleico al que se encuentra unido. El término incluye el vector en forma de estructura de ácidos nucleicos autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedera en la que ha sido introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se encuentran ligados operablemente. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS ?. Proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro ejemplar En el presente documento se informa de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende como primera parte una parte derivada de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana, y como segunda parte un péptido de origen vírico unido a un complejo de proteínas de CMH de clase I.
Con la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento, las células T citotóxicas circulantes específicas de virus (células T de memoria y/o células T efectoras) de un individuo pueden focalizarse en células que expresan el antígeno diana, al que se une específicamente la parte derivada de anticuerpo de la proteína multifunción, mediante el recubrimiento de estas células con complejos multifunción de CMH de clase I que imitan una infección vírica aguda.
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en el resultado de que una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento, que comprende como primera parte un péptido de origen vírico unido a una proteína de CMH de clase I y como segunda parte una molécula derivada de anticuerpo unida por disulfuro, puede utilizarse para focalizar las células T citotóxicas específicas de virus existentes de un individuo en células que expresan un antígeno diana que imita una infección vírica aguda, iniciando de esta manera la eliminación de las células que expresan el antígeno diana.
Se ha encontrado que, en contraste con las proteínas multifunción que comprenden CMH de clase I no unido mediante disulfuro, en las que como máximo puede encontrarse presente una única unidad de CMH de clase I en combinación con una región bisagra de anticuerpo para permitir la producción recombinante, en las proteínas multifunción que comprenden CMH de clase I unido mediante disulfuro pueden encontrarse presentes uno, dos o más unidades de CMH de clase I unidas mediante disulfuro sin dificultar la producción recombinante en combinación con una región bisagra de anticuerpo en la proteína multifunción multivalente.
Mediante la utilización de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento que comprende un solo, es decir un, dominio presentador de antígeno, algunos modos de acción de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento que comprende dos o más dominios presentadores de antígeno ya no resultan posibles, tal como reticulación de receptores de células T. Además, pueden producirse proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento con rendimientos mejorados y que presentan una estabilidad térmica mejorada. Además, sin restringirse a esta teoría, las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tales como las informadas en el presente documento que comprenden un dominio presentador de antígeno son más específicas con respecto a la activación de las células T (ver el Ejemplo 15).
En determinadas modalidades, se proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende uno, dos o más dominios presentadores de antígeno, que comprende cada uno: (i) un péptido de origen vírico, (ii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, e (iii) microglobulina beta-2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna en por lo menos las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En determinadas modalidades, se proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende uno, dos o más dominios presentadores de antígeno, cada uno que comprende: (i) un péptido de origen vírico, (ii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, e (iii) microglobulina beta-2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
Las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro informadas en el presente documento resultan útiles, por ejemplo para el diagnóstico o el tratamiento de diversas enfermedades tales como el cáncer o las infecciones víricas.
En un aspecto, la invención proporciona una proteína multifunción que se une (i) a un antígeno de superficie celular, e (ii) a las células T citotóxicas.
Las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro informadas en el presente documento explotan una respuesta inmunológica antivírica natural altamente eficaz para eliminar/desintegrar las células diana, por ejemplo las células tumorales o las células infectadas por virus. La eliminación celular se consigue mediante la utilización de las células T muy potentes circulantes del propio individuo, las cuales no requieren ninguna coestimulación para su activación. Además, resulta necesario un pequeño número de moléculas terapéuticas sobre la superficie celular para este mecanismo de acción (ver, por ejemplo, Mottez et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502.
Durante el tratamiento, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro puede inducir una respuesta inmunológica antivírica del individuo similar a una inmunización. De esta manera, múltiples tratamientos/aplicaciones pueden incrementar la eficacia del tratamiento. De esta manera, puede utilizarse una inmunización como pretratamiento para incrementar la eficacia .
Además, puede utilizarse un alotipo cuya frecuencia dentro de la población sea muy reducida, tal como, en una modalidad, menos de 1%. La utilización de tal alotipo puede provocar que resulte innecesaria una etapa de inmunización, ya que el alotipo será reconocido por el sistema inmunológico del individuo como foráneo y se iniciará una respuesta inmunológica.
El sitio de unión del antígeno diana debe ser altamente específico de célula o de antígeno para limitar la toxicidad y los efectos secundarios.
De esta manera, mediante la utilización de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento: (i) únicamente se activa una población de células T altamente específica (células efectoras/de memoria positivas para CD8 específicas para un único péptido de origen vírico expresado en el complejo de proteínas CMH-I de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro) ; ninguna de las demás células CD3+ resulta afectada (células T CD4+: TH1, TH2 , TH17, células T reguladoras) , (ii) se imita la respuesta natural del sistema inmunológico del individuo (eliminación normal de células infectadas por virus), y (iii) la respuesta a la aplicación/tratamiento de/con la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro es reducida al inicio pero puede reforzarse durante el tratamiento (resultan activadas células T específicas y se expanden en número), de manera que pueden reducirse las reacciones de infusión inicialmente y la liberación inicial de citoquinas.
En una modalidad, el método comprende el paso de estimular las células T citotóxicas positivas para CD8 mediante la aplicación de un péptido de origen vírico seleccionado, por ejemplo un péptido derivado del citomegalovirus humano (CMVhu). En una modalidad preferida, el péptido presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 01.
Se ha demostrado que las células T específicas de péptido de CMV activado median en una eliminación eficaz de las células tumorales in vitro (células tumorales cargadas con el péptido derivado de CMV in vitro .
Las células infectadas por virus presentan un complejo de péptidos derivados de virus con proteínas del CMH de clase I sobre la superficie celular. Éstas resultan reconocidas por células T CD8+ específicas, eliminando/reduciendo las células presentadoras de péptido de origen vírico. Las células T CD8+ citolíticas (citotóxicas) (CTL) reconocen péptidos en las proteínas del CMH de clase I por su receptor de células T específico. Los LTC inducen la eliminación de las células infectadas por virus sin necesidad de una señal de coestimulación.
Pueden utilizarse células efectoras, por ejemplo células mononucleares de sangre periférica (CMSP) o células T CD8+ separadas mediante FACS, las cuales pueden preestimularse con el péptido derivado de CMV comprendido en el polipéptido de fusión informado en el presente documento.
Debe reconocerse el alotipo de HLA del individuo que debe tratarse.
Según el NCBI, los alotipos de HLA con una frecuencia de 10% o superior se distribuyen tal como se muestra en la tabla a continuación.
Tabla 1 De esta manera, un aspecto informado en el presente documento es una proteína multifunción ultivalente unida mediante disulfuro de unión a antígeno caracterizada porque comprende: uno, dos o más dominios presentadores de antígeno, - una región Fe de anticuerpo, y - uno o más sitios de unión a antígeno, en la que los dominios presentadores de antígeno comprenden, independientemente, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en dondeel sitio de unión a antígeno se une a un antígeno de superficie de las células de cáncer. en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, un dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, una microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1 %, comprende además en su extremo N-terminal un péptido de unión al surco de unión peptídica del CMH, en dondeel dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro. En una modalidad, el péptido es un péptido inductor de la respuesta de células T.
En una modalidad, el péptido inductor de una respuesta de células T es un péptido de origen vírico. En una modalidad, el virus se selecciona de entre adenovirus, virus herpes 1 humano, virus herpes 2 humano, virus herpes 4 humano (virus de Epstein-Barr), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, citomegalovirus humano, virus de la inmunodeficiencia humana, papilomavirus humano de tipo 16, papi lomavirus humano de tipo 18, papilomavirus humano de tipo 31, papilomavirus humano de tipo 33, papilomavirus humano de tipo 35, papilomavirus humano de tipo 39, papilomavirus humano de tipo 45, papilomavirus humano de tipo 51, papilomavirus humano de tipo 52, papilomavirus humano de tipo 56, papilomavirus humano de tipo 58, papilomavirus humano de tipo 59, papilomavirus humano de tipo 68, papilomavirus humano de tipo 73, papilomavirus humano de tipo 82, virus linfotrópico de células T humanas de tipo I, virus de influenza A humana, virus de influenza B humana o virus Vaccinia.
En una modalidad, el péptido de origen vírico se selecciona de entre NLVPMVATV (SEC ID NO: 01), SLYNTVATL (SEC ID NO: 48), GLCTLVAML (SEC ID NO: 49), GILGFVFTL (SEC ID NO: 50), STNRQSGRQ (SEC ID NO: 51), LLFGYPVYV (SEC ID NO: 52), FAEGFVRAL (SEC ID NO: 53), LIVIGILIL (SEC ID NO: 54), o ILHTPGCV (SEC ID NO: 55).
En una modalidad, la microglobulina b2 es la microglobulina b2 humana. En una modalidad, la microglobulina b2 consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71.
En una modalidad, la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior es HLA-A*0201 humana. En una modalidad, los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I consisten de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 140.
En una modalidad, el péptido de origen vírico se fusiona con la microglobulina b2 mediante un primer péptido conector.
En una modalidad, la microglobulina b2 se fusiona con el dominio extracelular al de una molécula del CMH de clase I mediante un segundo péptido conector.
En una modalidad, el dominio extracelular a3 de una molécula del CMH de clase I se fusiona con el polipéptido (unido mediante disulfuros o no unido mediante disulfuros) mediante un tercer péptido conector.
En una modalidad, el primer, segundo y tercer péptidos conectores son iguales o diferentes.
En una modalidad, el primer péptido conector, el segundo péptido conector y el tercer péptido conector se seleccionan independientemente de entre las secuencias de aminoácidos GS (SEC ID NO: 73), GGS (SEC ID NO: 74), GGGS (SEC ID NO: 75), GGGSGGGS (SEC ID NO: 76), GGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 77), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 78), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 79), GGGGS (SEC ID NO: 80), GGGGSGGGGS (SEC ID NO: 81), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 82), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 83), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 84), y GCGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 139).
En una modalidad, el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 82.
En una modalidad, el segundo péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83.
En una modalidad, el tercer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 73.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la clase IgG o de la clase IgE.
En una modalidad, la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 ó IgG3 ó IgG4.
En una modalidad, el primer polipéptido unido mediante disulfuro y el segundo polipéptido unido mediante disulfuro comprenden un dominio CH2 y un dominio CH3 de origen humano. En una modalidad, el dominio CH2 y el dominio CH3 de origen humano son de un anticuerpo humano de la clase IgG o IgE. En una modalidad, el dominio CH2 y el dominio CH3 son de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 ó IgG3 ó IgG4. En una modalidad, el dominio CH2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 85. En una modalidad, el dominio CH2 es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 y comprende por lo menos una mutación E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330 y/o P331 (numeración según el índice EU de Kabat). En una modalidad, el dominio CH2 es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó de la subclase humana IgG2 con las mutaciones L234A y L235A y/o las mutaciones D265A y N297A, y/o contiene la mutación PVA236 y/o contiene la mutación P329G. En una modalidad, el dominio CH2 es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl con las mutaciones L234A y L235A y/o P329G. En una modalidad, el dominio CH2 es de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 con las mutaciones S228P y/o L235E.
En una modalidad, el primer polipéptido unido mediante disulfuro comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 89 y el segundo polipéptido unido mediante disulfuro comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90.
En una modalidad, el primer y el segundo polipéptidos unidos mediante disulfuro comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 94 ó SEC ID NO: 101.
En una modalidad, el primer polipéptido unidos mediante disulfuro o el segundo polipéptido unido mediante disulfuro consisten de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 o SEC ID NO: 98.
En una modalidad, el primer polipéptido unido mediante disulfuro comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido unido mediante disulfuro comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103.
En una modalidad, los polipéptidos unidos mediante disulfuro se unen mediante dos, o tres o cuatro enlaces disulfuro .
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno se caracteriza porque comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido de origen vírico que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 01, (ii) un primer péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139. (iü ) una microglobulina b2 que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71, (iv) un segundo péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140, (vi) un tercer péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 136, y (vii) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
En una modalidad, el dominio presentador de antígeno se caracteriza porque comprende, en dirección de extremo titerminal a extremo C-terminal, (i) un péptido de origen vírico que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 01, (ii) un primer péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139. (iii) una microglobulina b2 que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71, (iv) un segundo péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140 (vi) un tercer péptido conector que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 136, y (vii) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
En las figuras 10A-10C puede observarse que la proteína multifunción mantiene las propiedades de unión del sitio de unión a antígeno con el que se encuentra combinado (figuras 10B y 10C)).
En las figuras 11 y 13 se muestran la eficacia y la especificidad in vitro de una proteína multifunción.
El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo en presencia de células T CD8+ específicas de CMV. Puede observarse que una proteína multifunción que comprende un péptido vírico derivado de CMV induce la lisis/eliminación/desintegración de las células diana (ver a en la figura 11) para un anticuerpo monovalente; b en la figura 11) para un anticuerpo bivalente). Puede observarse además que la lisis de las células diana es altamente específica, ya que la incubación con la proteína multifunción que comprende un péptido vírico derivado de VEG (b en la figura 11) y con los anticuerpos de control (d y e en la figura 11)) no resultan en una lisis celular extensiva (la lisis espontánea es de aproximadamente 3.5%).
En la figura 13 se muestra la lisis de la línea celular de adenocarcinoma pulmonar positiva para IGF-1R H460M2.
El valor de EC50 para una proteína multifunción que comprende un péptido derivado del CMV y un anticuerpo bivalente es aproximadamente de 10 ng/ml, correspondiente a aproximadamente 50 pM. El valor de EC50 determinado es independiente de la proporción de células diana a células efectoras (ver la figura 12; la proporción de células diana a células efectoras es de entre 1:3 y 1:1, correspondiente a una proporción efectiva de entre 1:0.44 y 1:0.14 (el 76% de las células efectoras son positivas para CD8 y el 19% son específicas para el CMV)). 1. Afinidad En determinadas modalidades, una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se proporciona en el presente documento comprende un sitio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo, por ejemplo una pareja de dominios variables de anticuerpo o un anticuerpo de dominio simple. En determinadas modalidades, un sitio de unión a antígeno presenta una constante de disociación (¾) £ 10 nM, £ 1 nM, £ 0.1 nM, £ 0.01 nM, ó £ 0.001 nM (por ejemplo de 10-8 M o inferior, por ejemplo de entre 108 M y 1013 M, por ejemplo de entre 109 M y 1013 M) con respecto a su antígeno.
En una modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia del plasmón superficial.
Por ejemplo, lo anterior puede llevarse a cabo mediante la utilización de un aparato BIACORE®-2000 ó BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato sódico 10 mM, pH 4.8, hasta 5 mg/ml (~0.2 mM) antes de la inyección a un caudal de 5 ml/minuto hasta alcanzar aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato-20 al 0.05 % (T EEN-20™) (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 ml/min. Se calcularon las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) utilizando un modelo de unión simple uno a uno de Langmuir (software de evaluación de BIACORE® versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y de disociación. La constante de equilibrio de disociación (Kd) se calcula como la proporción koff/kon. Ver, por ejemplo, Chen Y. et al., J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881. 2. Expresión La expresión de diferentes proteínas multifunción bivalentes no unidas mediante disulfuro (diferente conector, diferentes combinaciones de HLA y microglobulina b2) en células HEK 293 y CHO condujo a una acumulación de la proteína multifunción bivalente no unida mediante disulfuro, en caso de ser detectable, dentro del retículo endoplasmático, es decir, el aislamiento y la secreción de la proteína multifunción bivalente no unida mediante disulfuro resultaron fuertemente reducidos, en caso de ser detectables en absoluto.
No pudo detectarse secreción de la proteína multifunción no unida mediante disulfuro al medio de cultivo en los casos en que la proteína multifunción estaba destinada a comprender uno de los polipéptidos tal como se indica de manera general en las tablas siguientes.
Tabla 2 Tabla 3 H [O Se ha encontrado que la expresión, y especialmente la secreción, de proteínas multifunción que comprenden dos dominios presentadores de antígeno no unidos mediante disulfuro formados de un péptido de origen vírico unidos a un complejo de proteínas de CMH de clase I y por lo menos un dominio variable y un dominio constante de un anticuerpo no resulta posible en células eucarióticas.
Además, se ha encontrado que la expresión, y especialmente la secreción, de proteínas multifunción que comprenden dos dominios presentadores de antígeno formados de un péptido de origen vírico unidos a una proteína multifunción de CMH de clase I, por lo menos un dominio variable y una región bisagra de anticuerpo no resulta posible en células eucarióticas.
Se ha encontrado que la expresión, y especialmente la secreción, de proteínas multifunción que comprenden uno o dos dominios presentadores de antígeno unidos mediante disulfuro formados de un complejo de péptido de origen vírico unido a un CMH de clase I y por lo menos un dominio variable y un dominio constante de un anticuerpo no resulta posible en células eucarióticas. Además, se incrementa el rendimiento de expresión en comparación con los complejos no unidos mediante disulfuro.
De esta manera, en una proteína multifunción tal como se informa en el presente documento, uno, dos o más dominios presentadores de antígeno que comprenden un péptido de origen vírico unido a una proteína de CMH de clase I y uno o más dominios variables de anticuerpo y un dominio constante de anticuerpo pueden encontrarse presentes, permitiendo la producción recombinante y la secreción de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro utilizando células eucarióticas.
De esta manera, puede producirse recombinantemente y secretarse a partir de células eucarióticas una proteína multifunción que comprende uno, dos o más dominios presentadores de antígeno de un péptido de origen vírico unido a una proteína del CMH de clase I, una región bisagra de cadena pesada de anticuerpo y uno o más dominios variables de anticuerpo y un dominio constante de anticuerpo.
De esta manera, puede producirse recombinantemente y secretarse a partir de células eucarióticas una proteína multifunción que comprende una región bisagra de cadena pesada de anticuerpo, por lo menos una pareja de dominios variables de anticuerpo, opcionalmente un dominio constante de anticuerpo y uno, dos o más dominios presentadores de antígeno unidos mediante disulfuro.
Se sometieron a ensayo diversas combinaciones. La expresión secretada de proteínas multifunción puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, la fusión N-terminal de un péptido de señal derivado de inmunoglobulina, en dondeel péptido de origen vírico se fusiona N-terminalmente con la molécula de CMH de clase I. La cadena pesada (a1-a2-a3 sin dominios transmembranal y citoplasmático) y la cadena ligera (microglobulina b2) de la molécula de CMH de clase I pueden cambiarse de orden. Los diferentes dominios presentadores de antígeno se fusionaron N-terminalmente con un polipéptido que comprendía una cadena ligera de anticuerpo o una región bisagra de cadena pesada. Se muestran combinaciones ejemplares en la figura 2.
Tal como puede observarse en la tabla 4 siguiente, las proteínas multifunción que comprenden uno, dos o más dominios presentadores de antígeno que contienen un complejo de proteínas del CMH-I únicamente pueden expresarse en presencia de polipéptidos derivados de dominio variable de anticuerpo y región bisagra de anticuerpo en el caso de que los dominios presentadores de antígeno se encuentren unidos mediante disulfuro. Además, se incrementa el rendimiento obtenible.
Tabla 4 N LnJ ) O o Tl t U1 NJ > ?? O O Un DO en J NJ l O O Un co En algunas modalidades, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento comprende diferentes parejas de polipéptidos. Con el fin de permitir el emparejamiento correcto de los polipéptidos, puede utilizarse la teenología de botones-en-ojales o la tecnología de Ab cruzados para reducir la cantidad de proteínas multifunción incorrectamente asociadas .
La modificación de botón se refiere a la mutación T366W en el dominio CH3 de un anticuerpo (numeración según el índice EU de Kabat) .
La modif icación de oj al se refiere a las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el dominio CH3 de un anticuerpo (numeración según el índice EU de Kabat) .
Además de la modif icación de botón y oj al , puede encontrarse presente la mutación S354C en el dominio CH3 y la mutación Y349C en el otro dominio CH3 .
Se informa de la tecnología de mAb cruzados en, por ej emplo, los documentos WO 2009/080251 , WO 2009/080252 , WO 2009/080254 , WO 2009/080253 , WO 2010/112193 , WO 2010/115589 , WO 2010/136172 , WO 2010/145792 y WO 2010/145793 . 3 . Variantes En determinadas modalidades, se encuentran contempladas las variantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, puede resultar deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos codificante de las cadenas polipeptídicas de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro o mediante síntesis peptídica. Entre tales modificaciones se incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro. Puede realizarse cualquier combinación de supresiones, inserciones y sustituciones para conseguir el constructo final, con la condición de que el constructo final presente las características deseadas, por ejemplo la unión a antígeno. a) Variantes por sustitución, inserción y supresión En determinadas modalidades, se proporcionan variantes de proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que presentan una o más sustituciones de aminoácidos en una o más de las cadenas polipeptídicas. Se proporcionan cambios ejemplares en la tabla 5 siguiente bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares", y tal como se indica adicionalmente después en referencia a las clases de cadenas laterales de los aminoácidos. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla a continuación bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de interés y los productos cribarse para una actividad deseada, por ejemplo una unión a antígeno conservada/mejorada, una menor inmunogenicidad, o una ADCC o CDC mejorada.
Tabla 5 Los aminoácidos pueden agruparse según propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) neutros hidrofílíeos. Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen sobre la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadores implican el intercambio de un elemento de una de tales clases por el de otra clase.
Entre las inserciones de secuencias de aminoácidos se incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxilo-terminales de longitud comprendida entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos individuales o múltiples. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende un polipéptido con un residuo metionilo N-terminal. Entre otras variantes por inserción se incluyen la fusión con el extremo N-terminal o C-terminal de las cadenas polipeptídicas de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro con una enzima. b) Variantes por glucosilación En determinadas modalidades, uno o más polipéptidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro proporcionados en el presente documento pueden alterarse para incrementar o reducir el grado en dondese encuentran glucosilados el polipéptido o polipéptidos. La adición o supresión de sitios de glucosilación a un polipéptido puede llevarse a cabo convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que se genere o se elimine uno o más sitios de glucosilación.
La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende una región Fe de anticuerpo y el carbohidrato unido al mismo puede alterarse. Las regiones Fe nativas producidas por las células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente se une mediante un enlace de nitrógeno a Asn297 del dominio CH2 de la región de Fe. Ver, por ejemplo, Wright A. et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetil-glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunas modalidades, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento con el fin de crear variantes con determinadas propiedades mejoradas.
En una modalidad se proporcionan una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que comprende variantes de polipéptido que presentan una estructura de carbohidrato que no presenta fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en la región Fe puede ser de entre 1% y 80%, de entre 1% y 65%, de entre 5% y 65% o de entre 20% y 40%. La cantidad de fucosa se determina mediante el cálculo de la cantidad media de fucosa dentro de la cadena sacárida en Asn297, respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo estructuras de proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro y estructuras ricas en mañosa), según medición realizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración EU de los residuos de la región Fe) ; sin embargo, Asn297 también puede localizarse aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden presentar una función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, los documentos US 2003/0157108 y US 2004/0093621. Entre los ejemplos de publicaciones relacionadas con las variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" se incluyen: los documentos US 2003/0157108, WO 2000/61739, WO 2001/29246, US 2003/0115614, US 2002/0164328, US 2004/0093621, US 2004/0132140, US 2004/0110704, US 2004/0110282, US 2004/0109865, WO 2003/085119, WO 2003/084570, WO 2005/035586, WO 2005/035778, WO 2005/053742, WO 2002/031140; Okazaki A. et al., J. Mol. Biol.336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng.87 (2004) 614-622. Entre los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados se incluyen las células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de las proteínas (Ripka J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 24:533-545, 1986; los documentos US 2003/0157108 y WO 2004/056312, especialmente el Ejemplo 11) y las líneas celulares con inactivación génica tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, las células CHO con inactivación génica (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622,; Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94:680-688, 2006, y el documento WO 2003/085107).
Las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro que comprenden variantes de región Fe están provistas además de oligosacáridos biantenarios, por ejemplo en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fe resulta bisectado por GlcNAc. Tales variantes pueden presentar una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de tales variantes de anticuerpo en, por ejemplo, el documento WO 2003/011878, la patente US 6,602,684 y el documento US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de región Fe con por lo menos un residuo galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Tales variantes de región Fe pueden presentar una función CDC mejorada. Se describen tales variantes de anticuerpo correspondientes en, por ejemplo, los documentos WO 97/30087, WO 98/58964 y WO 99/22764. c) Variantes de región Fe En determinadas modalidades, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro proporcionada en el presente documento, generando de esta manera una variante de región Fe. La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones aminoácidas.
En determinadas modalidades, la invención contempla una variante de región Fe que presenta algunas, aunque no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro in vivo resulta importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y la ADCC) resultan innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o de ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión de receptor de Fe (FcR) para garantizar que la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro no se une a FcyR (por lo tanto que probablemente no presenta actividad de ADCC), aunque conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias que median en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII únicamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch J.V. y Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol.9 (1991) 457-492. Se describen ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente US 5,500,362 (ver, por ejemplo, Hellstrom I. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986) y Hellstrom I. et al . , Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente US 5.821.337 (ver Brueggemann M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987).
Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayo no radioactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96, Promega, Madison, WI). Entre las células efectoras útiles para tales ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes R. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 5 (1998) 652-656. También pueden llevarse a cabo ensayos de unión de Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a Clq y que por lo tanto no presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, el ELISA de la unión de Clq y de C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro H. et al., J. Immunol. Methods 202:163-171, 1996; Cragg M.S. et al., Blood 101(2003) 1045-1052; y Cragg M.S. y M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743) . Las determinaciones de unión y eliminación/vida media in vivo también pueden llevarse a cabo utilizando métodos conocidos de la téenica (ver, por ejemplo, Petkova S.B. et al., Intl. Immunol.18 (2006) 1759-1769).
Entre las regiones Fe con una función efectora reducida se incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de la región Fe 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente US 6,737,056). Entre tales mutantes de la región Fe se incluyen los imitantes de la región Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoácidas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo la región Fe mutante denominada "DANA", con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente US 7,332,581).
Se describen determinadas variantes de región Fe con unión mejorada o reducida a los FcR (ver, por ejemplo, US 6,737,056 y WO 2004/056312, y Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001).
En determinadas modalidades, una variante de proteína ultifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de los residuos).
En algunas modalidades, pueden realizarse alteraciones en la región Fe que resultan en una unión de Clq y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterada (es decir, mejorada o reducida), por ejemplo tal como se describe en la patente US 6,194,551, en el documento WO 99/51642, y en Idusogie E.E. et al., J. Immunol.164:4178-4184, 2000.
Los anticuerpos con vidas medias incrementadas y unión mejorada al receptor de Fe neonatal (FcRn), los cuales son responsables de la transferencia de las IgG maternas hasta el feto (Guyer R.L. et al., J. Immunol.117:587-593, 1976, y Kim J.K. et al., J. Immunol.24 (1994) 2429-2434), se describen en el documento US 2005/0014934. Tales anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Entre tales variantes de región Fe se incluyen aquéllas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ó 434, por ejemplo la sustitución del residuo 434 de la región Fe (patente US 7,371,826).
Ver también Duncan A.R. y Winter G., Nature 322 (1988) 738-740, las patentes US 5,648,260 y US 5,24,821 y el documento WO 94/29351, referentes a otros ejemplos de variantes de la región Fe.
B. Métodos y composiciones recombinantes Pueden producirse proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tales como las informadas en el presente documento, utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo tal como se describe en la patente US 4,816,567. En una modalidad, se proporcionan ácidos nucleicos aislados codificantes de los polipéptidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro descrita en el presente documento. En una modalidad adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una modalidad adicional, se proporciona una célula hospedera que comprende tal ácido nucleico. En una de tales modalidades, una célula hospedera comprende (por ejemplo ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula hospedera es eucariótica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo una célula YO, NSO ó Sp2/0). En una modalidad, se proporciona un método de preparación de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro informada en el presente documento, en dondeel método comprende cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico codificante de los polipéptidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, tal como se ha proporcionado anteriormente, bajo condiciones adecuadas para la expresión de los polipéptidos y la formación de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, y opcionalmente recuperar la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro a partir de la célula hospedera (o del medio de cultivo de la célula hospedera).
Para la producción recombinante de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, se aísla un ácido nucleico codificante de los polipéptidos de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o la expresión adicionales en una célula hospedera. Tal ácido nucleico puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Entre las célula hospederas adecuadas para la clonación o expresión de vectores se incluyen las células procarióticas o eucarióticas indicadas en el presente documento. Por ejemplo, pueden producirse proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro en bacterias, en particular en el caso de que la glucosilación y la función efectora de Fe no resulten necesarias. Para la expresión de fragmentos y polipéptidos de anticuerpo en bacterias, ver, por ejemplo, las patentes US 5,648,237, US 5,789,199 y US 5,840,523 (ver también Charlton K.A. , Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 2003, páginas 245 a 254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli) . Tras la expresión, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro puede aislarse a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras son hospederos de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación han sido "humanizadas", resultando en la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Ver Gerngross T.U., Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, y Li H. et al . , Nat. Biotech.24(2006) 210-215 .
También se derivan célula hospederas adecuadas para la expresión de proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro glucosiladas, a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden utilizarse conjuntamente con células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda .
También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como hospederos. Ver, por ejemplo, las patentes US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 y US 6,417,429 (que describe la teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También pueden utilizarse células de vertebrado como hospederos. Por ejemplo, pueden resultar útiles líneas celulares de mamífero adaptadas para el crecimiento en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares hospederas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea renal embrionaria humana (293 ó células 293 tal como se describe en, por ejemplo, Graham F.L. et al . , J. Gen. Virol.36 (1977) 59-74), células renales de hámster nenonato (BHK), células de sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe en, por ejemplo, Mather J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252, las células renales de mono (CV1), las célula renales de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células renales caninas (MDCK), células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A), células pulmonares humanas (W138), células hepáticas humanas (Hep G2), tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI, tal como se describe en, por ejemplo, Mather et al . , Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5 y células FS4. Entre otras líneas celulares hospederas de mamífero útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO DHFR (Urlaub G. et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216) y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares hospederas de mamífero para la producción de anticuerpos, ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo B.K.C. (editor), Humana Press, Totowa, NJ, 2004, páginas 255-268.
C. Formulaciones farmacéuticas Se prepararon formulaciones farmacéuticas de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se ha descrito en el presente documento mediante la mezcla de TAL proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro que presenta el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A. (editor), 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación: soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamónico, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes tales como metilparabén o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextriñas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbítol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o t nsioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Entre los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento se incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticial, tales como glucoproteínas hialuronidasa activas a pH neutro (sHASEGP), por ejempo las glucoproteínas hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX , Baxter International, Inc.). Se describen determinados sHASEGP y métodos de utilización, incluyendo rhuPH20, en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglicanasas adicionales, tales como condroitinasas .
Se describen formulaciones liofilizadas ejemplares de anticuerpos en la patente US 6,267,958. Entre las formulaciones acuosas de anticuerpos se incluyen los indicados en la patente US 6,171,586 y en WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones una solución amortiguadora de histidina- acetato.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo, según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no presenten efectos mutuos adversos. Tales ingredientes activos se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, téenicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración coloidal de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, encontrándose las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas.
Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede alcanzarse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril.
D. Métodos y composiciones terapéuticos Puede utilizarse cualquiera de las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro proporcionadas en el presente documento en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización como medicamento.
En aspectos adicionales, se proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en el tratamiento del cáncer.
En determinadas modalidades, se proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en un método de tratamiento.
En determinadas modalidades, la invención proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que presenta cáncer o una infección vírica, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento. En una de tales modalidades, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente.
En modalidades adicionales, la invención proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en la eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus. En determinadas modalidades, la invención proporciona una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en un método de eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la eliminación de células de cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona la utilización de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento está destinado al tratamiento del cáncer o de una infección vírica. En una modalidad adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de tratamiento del cáncer o de una infección vírica, que comprende administrar en un individuo que presenta cáncer o una infección vírica una cantidad eficaz del medicamento. En una de tales modalidades, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional. En una modalidad adicional, el medicamento está destinado a la eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus. En una modalidad adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus en un individuo, que comprende administrar en un individuo una cantidad eficaz del medicamento para eliminar las células de cáncer o las células infectadas por virus. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el tratamiento del cáncer o de una infección vírica. En una modalidad, el método comprende la administración en el individuo que presenta cáncer o una infección vírica, de una cantidad eficaz de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento. En una de tales modalidades, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus en un individuo. En una modalidad, el método comprende la administración en el individuo de una cantidad eficaz de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para eliminar células de cáncer o las células infectadas por virus. En una modalidad, un "individuo" es un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tales como las informadas en el presente documento, por ejemplo para la utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriormente indicados. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tales como las informadas en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro tales como las informadas en el presente documento y por lo menos un agente terapéutico adicional.
Las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro de la invención pueden utilizarse solas o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, puede coadministrarse una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de la invención con por lo menos un agente terapéutico adicional.
Tales terapias de combinación indicadas anteriormente comprenden la administración combinada (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración de la proteína multifunción de la invención puede realizarse antes, simultáneamente y/o después de la administración de los agentes terapéuticos adicionales y/o adyuvante. Las proteínas multifunción de la invención también pueden utilizarse en combinación con terapia de radiación .
Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede realizarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como las inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se encuentran contempladas dentro del presente documento diversos programas de dosificación, aunque sin limitación, las administraciones individuales o múltiples en diversos puntos del tiempo, la administración de bolo y la infusión de pulsos.
Las proteínas multifunción multivalentes unidas mediante disulfuro de la invención pueden formularse, dosificarse y administrarse de un modo consistente con la buena práctica médica. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen el trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por el profesional médico. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro no necesariamente sino que opcionalmente se formula con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores comentados anteriormente.
Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y por vías de administración tales como las indicadas en el presente documento, o entre aproximadamente 1% y 99 % de las dosis indicadas en el presente documento, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que resulta apropiada.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de la invención (utilizada sola o en combinación con otro u otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, del tipo de proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, de la severidad y curso de la enfermedad, de si la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta a la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, y del criterio del médico responsable. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se administra convenientemente en el paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial puede ser de entre aproximadamente 1 g/kg y 15 mg/kg (por ejemplo de entre 0.5 mg/kg y 10 mg/kg) de proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro para la administración en el paciente mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o mediante la infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 mg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendría hasta producirse una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se encontraría comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0.05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, puede administrarse en el paciente una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga más alta inicial, seguido de una o más dosis inferiores. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. Se realiza fácilmente un seguimiento del avance de tal terapia utilizando téenicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriormente indicados puede llevarse a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en sustitución o adicionalmente a una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento.
Un aspecto tal como se informa en el presente documento es la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la utilización en un método de tratamiento de un cáncer o de una infección vírica en un paciente, en dondela proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro debe administrarse antes, simultáneamente o después de la inmunización del paciente con el péptido de origen vírico comprendido en la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro.
Un aspecto informado en el presente documento es la utilización de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer o de una infección vírica en combinación con la inmunización contra el péptido de origen vírico comprendido en la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro.
En la primera etapa, el péptido de origen vírico contenido en la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro se administra en primer lugar en el individuo que debe tratarse. En un determinado periodo de tiempo posterior, es decir entre 4 y 28 días, la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento se administra en el individuo.
Mediante esta aplicación sucesiva y separada del polipéptido de origen vírico, en la primera etapa por sí sola y en la segunda etapa dentro de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro tal como se informa en el presente documento, resulta posible incrementar el número de células T específicas de péptido de origen vírico y, de esta manera, incrementar la eficacia del tratamiento.
III. Artículos fabricados En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o impreso en el paquete o asociado al recipiente. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación contra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y que puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es una proteína multifunción de la invención. La etiqueta o impreso en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. Además, el artículo fabricado puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en dondela composición comprende una proteína multifunción de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en dondela composición comprende un agente citotóxico o de otra manera terapéutico, adicional. El artículo fabricado en la presente modalidad de la invención puede comprender además un impreso en el paquete que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo fabricado puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende una solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos fabricados anteriormente indicados puede incluir un in unoconjugado de la invención en sustitución o adicionalmente a una proteina multifunción informada en el presente documento.
IV. MODALIDADES ESPECÍFICAS 1. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: - dos o más dominios presentadores de antígeno, - una región Fe de anticuerpo, y - uno o más sitios de unión a antígeno, en la que los dominios presentadores de antígeno comprenden, independientemente, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, OÍ2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el sitio o sitios de unión a antígenos se unen a un antígeno de superficie de una célula de cáncer o a un antígeno de superficie de una célula infectada por virus, y en los que los dominios presentadores de antígeno presentan residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos la posición 11 y en la posición 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro . 2. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: - un dominio presentador de antígeno, - una región Fe de anticuerpo, y - uno o más sitios de unión a antígeno, en la que el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el sitio o sitios de unión a antígenos se unen a un antígeno de superficie de una célula de cáncer o a un antígeno de superficie de una célula infectada por virus, y en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos la posición 11 y en la posición 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro. 3. Proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 2, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende un primer y un segundo polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuro, en la que el sitio de unión a antígeno o uno de los sitios de unión a antígeno comprende el primer polipéptido de región Fe y el segundo sitio de unión a antígeno, en caso de encontrarse presente, comprende el segundo polipéptido de región Fe. 4. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 3, caracterizada porque los sitios de unión a antígeno comprenden, independientemente, i) una pareja de una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo, o ii) un polipéptido de fusión scFv que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un fragmento de anticuerpo scFv y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o iii) un polipéptido de fusión de scFab que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un scFab y un polipéptido de región Fe de anticuerpo. 5. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 4, caracterizada porque: i) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de la cadena pesada o al extremo N-terminal de la cadena ligera de un sitio de unión a antígeno, o ii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal de la cadena pesada o a cada extremo N-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno, o iii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo C-terminal de la cadena pesada o al extremo C-terminal de la cadena ligera del sitio de unión a antígeno, o iv) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo C-terminal de la cadena pesada o a cada extremo C-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno, o v) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión de scFv, o vi) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal o C-terminal de cada polipéptido de fusión de scFv, o vii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo C-terminal o N-terminal de un polipéptido de fusión de scFab, o viii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal o C-terminal de cada polipéptido de fusión de scFab, o ix) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de la región Fe, o x) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del primer polipéptido de región Fe y un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de región Fe. 6. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5, caracterizada porque el antígeno de superficie de la célula de cáncer es proteoglicano condroitín-sulfato asociado al melanoma (PCSM). 7. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 6, caracterizada porque el péptido inductor de respuesta de células T es un péptido de origen vírico. 8. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 7, caracterizada porque el péptido inductor de respuesta de células T es un péptido inductor de la respuesta de células T CD8+. 9. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 7 a 8, caracterizada porque el péptido de origen vírico es un péptido derivado del citomegalovirus humano. 10. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 9, caracterizada porque el péptido de origen vírico presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70. 11. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 10, caracterizada porque el péptido de origen vírico presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 01. 12. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 11, caracterizada porque la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-C*0304, HLA-C*0401 y HLA-C*0702. 13. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 12, caracterizada porque la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona según la región del individuo en la que debe administrarse la proteína multifunción, de la manera siguiente: para un individuo de origen europeo, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*4402, HLA-C*0401, HLA-C*0501, HLA-C*0701 y HLA-C*0702, para un individuo de origen australiano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-B*1301, HLA-B*1521, HLA-B*5601, HLA-B*5602, HLA-C*0102, HLA-C*0401, HLA-C*0403 y HLA-C*1502, para un individuo de origen norteamericano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-C*0202, HLA-C*0304, HLA-C*0401 y HLA-C*0702, y para un individuo de origen en el sudeste asiático, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702 y HLA-C*0801. 14. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 13, caracterizada porque la molécula de CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona según la región del individuo en la que debe administrarse la proteína multifunción, de la manera siguiente : para un individuo de origen europeo, la molécula de CMH de clase I es HLA-A*0201, para un individuo de origen australiano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*2402, HLA-B*1301, HLA-C*0102 y HLA-C*0401, para un individuo de origen norteamericano, la molécula del CMH de clase I se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*2402 y HLA-C*0304, y para un individuo de origen en el sudeste asiático, la molécula de CMH de clase I es HLA-A*2402. 15. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 14, caracterizada porque la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1% se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701 y HLA-B*7802. 16. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 15, caracterizada porque la microglobulina b2 es la microglobulina b2 humana y la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 10% o superior es la HLA-A*0201 humana. 17. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 16, caracterizada porque el dominio presentador de antígeno comprende: (i) un péptido de origen vírico, (ii) microglobulina b2, (iii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, y (iv) los residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisterna en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro o (i) un péptido de origen vírico, (ii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, (iii) una microglobulina b2, y (iv) los residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro. 18. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 17, caracterizada porque la microglobulina b2 consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 71 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. 19. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 18, caracterizada porque los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula de CMH de clase I consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 72 ó SEC ID NO: 140 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. 20. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 19, caracterizada porque el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal : (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende la SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71, (iv) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140, (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, 21. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 20, caracterizada porque la proteína multifunción se caracteriza porque el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal: (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) una microglobulina b2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 71 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 ylO intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (iv) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende las SEC ID NOs: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 140 ó es una variante de la misma que comprende entre 1 y 10 intercambios, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que comprende las SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84, 136, y (vii) el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, 22. La proteína multifunción de acuerdo con el punto 21, caracterizada porque: el primer péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 139 y/o el segundo péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 83, y/o el tercer péptido conector presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 136. 23. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 22, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la clase IgG o de la clase IgE. 24. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 23, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo se selecciona de entre una región Fe de anticuerpo de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 ó IgG3 ó IgG4. 25. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 24, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó IgG2 y comprende por lo menos una mutación E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330 y/o P331 (numeración según el índice EU de Kabat). 26. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 25, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl ó de la subclase humana IgG2 con las mutaciones L234A y L235A y/o las mutaciones D265A y N297A, y/o contiene la mutación PVA236 y/o contiene la mutación P329G. 27. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgGl con las mutaciones L234A y L235A y/o P329G. 28. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo es de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 con la mutación S228P y/o L235E. 29. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque el primer y el segundo polipéptidos de región Fe de anticuerpo se seleccionan independientemente de entre el grupo que comprende las SEC ID NOs: 87 a NO: 103. 30. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 94. 31. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 100. 32. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende dos polipéptidos de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 101. 33 . La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 89 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 90. 34. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98. 35. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 26, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende un primer polipéptido de región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y un segundo polipéptido región Fe con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103. 36. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y o¡3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 37. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 38. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 39. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, o¡2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno. 40. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno. 41. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende SEC ID NO: 104 a 106, y un dominio variable de cadena pesada que comprende SEC ID NO: 108 a 100, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM). 42. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110. 43. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112. 44. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro. 45. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables. 46. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO : 01 , (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables. 47. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada. 48. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos dominios presentadores de antígeno, que comprenden, en dirección N-terminal a C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisterna en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisterna en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada. 49. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 117 ó NO: 137, una cadena polipeptídica de SEC ID NO: 118, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos la posición 11 y en la posición 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro. 50. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: dos cadenas polipeptídicas de SEC ID NO: 117 ó NO: 137, dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales presenta la secuencia SEC ID NO: 119, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos la posición 11 y en la posición 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro. 51. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 52. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 53. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, y uno o más sitios de unión a antígeno. 54. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno. 55. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno. 56. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende las SEC ID NO: 104 a 106, y un dominio variable de cadena pesada que comprende SEC ID NO: 108 a 100, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM). 57. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 108 y NO: 110. 58. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 110 y NO: 112. 59. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 105 a 107 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro. 60. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y uno o más sitios de unión a antígeno, que se unen específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM) y que comprenden una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende SEC ID NO: 104 a 106 y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondela región Fe de la cadena pesada de anticuerpo es uno de los polipéptidos de región Fe unido mediante disulfuro, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables. 61. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 104 a 106, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 108 y NO: 110, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables. 62. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende. en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 97 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 98, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada. 63. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: un dominio presentador de antígeno, que comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) un péptido inductor de una respuesta de células T de SEC ID NO: 01, (ii) una microglobulina b2 de SEC ID NO: 71, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I de SEC ID NO: 72, en los que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227, y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o los residuos cisteína en por lo menos las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro, exactamente una región Fe de anticuerpo, que comprende dos polipéptidos de región Fe unidos por disulfuro, en la que el primer polipéptido de región Fe unido por disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 102 y el segundo polipéptido de región Fe unido mediante disulfuro presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 103, y dos sitios de unión a antígeno, que se une específicamente a proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (PCSM), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 105 a 107, y una cadena pesada de anticuerpo con un dominio variable que comprende las SEC ID NO: 110 y NO: 112, en dondelas regiones Fe de las cadenas pesadas de anticuerpo son polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuros, en dondeel dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de uno de los dominios variables de cadena pesada. 64. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 108, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 109, y un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110. 65. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 104, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106. 66. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 108, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 109, un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 104, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106. 67. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 111, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 112, y un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110. 68. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 107, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106. 69. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una RVP-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 111, un RVP-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 112, un RVP-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 110, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una RVP-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 107, un RVP-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 105, y un RVP-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 106. 70. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 114, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 113. 71. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de SEC ID NO: 114, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID NO: 113. 72. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende SEC ID NO: 114 y SEC ID NO: 113. 73. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 116, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 115. 74. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de SEC ID NO: 116, y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID NO: 115. 75. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 63, caracterizada porque el sitio de unión de PCSM comprende SEC ID NO: 116 y SEC ID NO: 115. 76. Un ácido nucleico codificante de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75. 77. Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico según el punto 76. 78. Una formulación farmacéutica que comprende la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 y opcionalmente un portador farmacéutic mente aceptable. 79. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 para la utilización como medicamento. 80. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 para la utilización en el tratamiento del cáncer o de una infección vírica. 81. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75, para la utilización en la atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana. 82. La proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 para la utilización en la eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus. 83. Un método para la producción recombinante de una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de acuerdo con el punto 1, que comprende las etapas siguientes: cultivar una célula eucariótica que comprende un ácido nucleico según el punto 76, y recuperar la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro a partir de la célula o del medio de cultivo, en dondela proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro comprende exactamente dos o más dominios presentadores de antígeno que comprenden una microglobulina b2 y los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I, en la que el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro o el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro. 84. La utilización de la proteína multifunción de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 en la preparación de un medicamento. 85. La utilización de acuerdo con el punto 84, en la que el medicamento está destinado al tratamiento del cáncer o de una infección vírica. 86. La utilización de acuerdo con el punto 84, en la que el medicamento está destinado a la atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana. 87. La utilización de acuerdo con el punto 84, en la que el medicamento está destinado a la eliminación de células de cáncer o de las células infectadas por virus. 88. Un método de atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 para atraer células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana. 89. Un método de eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad eficaz de la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 75 para eliminar células de cáncer o células infectadas por virus.
Aunque la invención anteriormente proporcionada ha sido descrita en detalle a título ilustrativo y ejemplar con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativas del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citada en el presente documento se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.
V. Ejemplos A continuación se proporcionan ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas otras modalidades, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1 Procedimiento para el aislamiento y la estimulación de células T positivas para CD8 específicas del CMV procedentes de donantes humanos Aislamiento de los LSP Se aislaron LSP mediante centri fugac ión en gradiente de Ficol l procedentes de sangre de donante humano ( Gre iner bio -one , NO : de cat . 227290 ) . Los LSP se cult ivaron en RPMI suplementado con suero humano al 5 % ( S igma , NO : de cat . H2520 ) , L-glutamina 2 mM (PAN Biotech, NO : de cat . P04-80100) , penicilina/estreptomicina 100 pg/ml (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, NO : de cat . 14001100) .
Estimulación de los LSP Se cultivaron células (2xl07 células/ml) en medio de cultivo celular suplementado con 50 mg/ml de péptido derivado de pp65 del CMV (SEC ID NO: 01) durante dos horas bajo condiciones de cultivo celular (37°C, 5% de CO2, 80% de humedad) . A continuación, la suspensión celular se diluyó 20 veces con medio de cultivo y se cultivó adicionalmente en placas de 96 pocilios de fondo plano a una densidad de siembra de 2xl05 células por cada pocilio de los 96. Tras 4 a 5 días, se añadieron 20 U/ml de IL-2 (Roche, NO: de cat.11011456001), IL-7 25 ng/ml (Preprotech, NO: de cat. 200-01) e IL-15 25 ng/ml (Preprotech, NO: de cat. 200-15) y las células se cultivaron durante 7 a 8 días adicionales. La estimulación de las células T era visible bajo el microscopio como grupos de células .
Re-estimulación de los LSP Las células T se cocultivaron con células estimuladoras, que eran LSP primarios autólogos del mismo donante pulsados con péptido (preparado fresco o derivado de reservas congeladas). Las células estimuladoras se pulsaron con el péptido tal como se ha indicado anteriormente. Tras las dos horas de incubación con péptido, se irradiaron los LSP (4000 rad; STS GmbH OB29 NO: 9510-5) y se lavaron dos veces en medio de cultivo sin péptido. La reestimulación se llevó a cabo en placas de fondo redondo de 96 pocilios. Se utilizaron 8xl04 a lxlO5 células estimuladoras por cada pocilio de los 96. Las células del cultivo primario se lavaron dos veces con medio de cultivo, se resuspendieron en 200 ml de medio de cultivo y 80 ml fueron transferidos a cada pocilio de las células estimuladoras. Tras 3 días, se añadieron 20 u/ml de IL-2, 25 ng/ml de IL-7 y 25 ng/ml de IL-15. Las células proliferaron y se expandieron cada 2 a 3 días en nuevos pocilios con medio fresco.
Análisis de las células T Las células se tiñeron para la expresión de CD8 (BD, NO: de cat. 345772) y receptores de células T específicas de CMV (Prolmmune, NO: de cat. F008-4A-E) y se analizaron mediante FACS.
Medio de cultivo celular RPMI1640 (PAN Biotech, NO: de cat. P04-17500), suero humano al 5% (HS, Sigma, NO: de cat. H2520), L-glutamina 2 mM (PAN Biotech, NO: de cat. P04-80100), 100 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, NO: de cat.14001100).
Resultados Se llevó a cabo el análisis de FACS de linfocitos de sangre periférica (LSP) derivados de cuatro donantes humanos. Las células se marcaron con un anticuerpo anti-CD8 conjugado con FITO (BD, NO: de cat.345772) en combinación con pentámero Pro5 conjugado con APC (Prolmmune, NO: de cat. F008-4A-E) para teñir las células T que portan un receptor de células T (RCT) que reconoce el CMH-clase I (HLA-A*0201) cargado con péptido derivado del CMH (NLVPMVATV (SEC ID NO: 01)). Para los resultados ver las figuras 4A y 4B. El día 0, los donantes 1 y 4 portaban un número reducido de células T CD8 específicas de CMV (0.08% y 0.1%, respectivamente). Los donantes 2 y 3 portaban un número más alto de células T CD8 específicas de CMV en su sangre periférica (0.25% y 3.12%, respectivamente). Catorce días después de la estimulación con células autólogas pulsadas con péptido derivado del CMV, los donantes 2 y 3 mostraban un incremento significativo de las células T CD8 específicas de CMV (6.2% y 71.2%, respectivamente), mientras que los donantes 1 y 4 no mostraban números incrementados de células T CD8 específicas de CMV (0.01% y 0.05%, respectivamente) . Catorce días después de una segunda estimulación con células autólogas pulsadas con péptido derivado de CMV, los donantes 2 y 3 mostraban un incremento adicional de las células T CD8 específicas de CMV (15.1% y 96.6%, respectivamente).
Ejemplo 2 Ensayo de citotoxicidad Las células de leucemia linfoblástica aguda MN60 portan el alelo A*0201 HLA-A. Se incubaron las células MN60 (lxlO6 células/ml) con 50 ug/ml de péptido pp65 del CMV (SEC ID NO: 01) durante 45 minutos bajo condiciones de cultivo celular (37°C, 5% de C02, 80% de humedad). La incubación resultó en un intercambio de péptidos en el surco de unión del péptido HLA-A*0201. Las células MN60 de péptido intercambiado se centrifugaron y se diluyeron hasta una densidad de lxlO6 células/ml con PBS (PanBiotech, NO: de cat. P04-36500) y se tiñeron con 1 mM del trazador celular succinimidil-éster de carboxifluoresceína (CFSE, Invitrogen, NO: de cat. 34554) durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA). A continuación se lavaron las células una vez con PBS y se diluyeron a lxlO5 células/ml con medio AIM-V (Gibco, NO: de cat. 0870112DK). Para el ensayo, las células MN60 (células diana) se cocultivaron en placas de fondo redondo de 96 pocilios con células T CD8+ específicas de CMV derivadas del donante humano 3 (células efectoras, ver el Ejemplo 1) durante cuatro horas bajo condiciones de cultivo celular. La proporción de células efectoras a células diana era de 4:1. Las células muertas se tiñeron con 1 mI/100 ml de yoduro de propidio (PI, Sigma, NO: de cat. P-4864) y se analizaron mediante FACS.
Resultados Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo para analizar la capacidad citolítica de los LTC estimulados mediante la lisis de las células tumorales MN60 cargadas con el péptido de CMV.
Se llevó a cabo un cocultivo de las células MN60 no cargadas con el péptido derivado del CMV. Las células MN60 son positivas para FITC. Las células efectoras son negativas para FITC. Las células muertas son positivas para PI; las células vivas son negativas para PI. Más del 85% de las células MN60 se encontraban vivas en caso de no encontrarse cargadas con el péptido derivado de CMV (Q2 y Q4).
Se llevó a cabo un cocultivo de las células MN60 con el péptido derivado del CMV. Más del 80% de las células MN60 se encontraban muertas (Q2 y Q4), mientras que la proporción de células efectoras vivas a muertas no resultó alterado notablemente entre los análisis de FACS, indicando que se había producido una lisis específica de las células diana cargadas con péptido de CMV.
Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo para analizar la capacidad citolítica de los LTC estimulados mediante la lisis de las células tumorales MN60 cargadas con el péptido de CMV según la proporción de células efectoras a células diana.
El ensayo citotóxico se llevó a cabo tal como se ha indicado anteriormente. Se aplicaron diferentes proporciones de células efectoras a células diana, comprendidas entre 0.5 células efectoras por cada célula diana y cuatro células efectoras por cada célula diana. El tiempo de incubación fue de cuatro horas. Las células MN60 que no se encontraban cargadas con el péptido derivado del CMV no mostraron un número incrementado de células muertas con una proporción de efectoras a diana incrementado, es decir, comprendido entre 8% y 13% con una proporción de entre 0.5:1 y 4:1.
Prácticamente el 20% de las células MN60 cargadas con el péptido derivado de CMV ya se encontraban muertas con una proporción de efectoras a diana bajo, de 0.5:1, dentro de las primeras cuatro horas. El número de células muertas se incrementaba rápidamente al elevar la proporción de efectoras a diana, alcanzando el 83% a una proporción de 4:1 de células efectora por cada célula diana.
Ejemplo 3 Preparación, transfección, expresión, purificación y análisis de DN Preparación de ADN Se recolectaron 250 mi de cultivo LB bacteriano durante la noche y se extrajo el ADN plasmídico siguiendo el protocolo del fabricante (kit High speed Maxi, Qiagen, NO: de cat. 12663). El ADN plasmídico resultante se eluyó en 1 mi de amortiguador TE y se determinó la concentración de ADN mediante espectrofotometría (Epoch, BioTek).
El vector de expresión final comprendía los elementos siguientes: los sitios de restricción endonucleolítica HindIII, Nhel, un promotor del CMV, un 5'UTR 1 (derivado del CMV humano), intrón A, un 5'UTR 2, un gen de resistencia a la ampicilina, un sitio poliA de BGH (señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina), pUC Orí.
Secuencias de aminoácidos de los elementos de la proteína multifunción que comprende un péptido derivado de CMV y especificidad de unión a IGF1R (anticuerpo anti-IGFIR): péptido pp65 del CMV: SEC ID NO: 01 NLVPMVATV Conector 1: SEC ID NO: 82 GGGGSGGGGSGGGGS microglobulina b2: SEC ID NO: 71 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSF YLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Conector 2: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 al - a3: SEC ID NO: 72 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYI ALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPK THMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAW VPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW Conector 3: SEC ID NO: 73 GS Conector 4: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Conector 13: SEC ID NO: 136 GSG cadena ligera de Ig: SEC ID NO: 120 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGQGTKVESKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A): SEC ID NO: 121 QVELVESGGGW QPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYAD SVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNV HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY STYRW SVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de botón): SEC ID NO:122 QVELVESGGGW QPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYAD SVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal): SEC ID NO: 123 QVELVESGGGW QPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWFDGSSTYYAD SVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK región Fe de cadena pesada de Ig (región Fe de IgGl mutante L234A, L235A con variación de botón): SEC ID NO: 124 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK scFv: SEC ID NO: 125 QVELVESGGGWQPGRSQRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAIIWFDGSSTYYAD SVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARELGRRYFDLWGRGTLVSVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSKWPPWTFGCGTKVESK Secuencias de aminoácidos de los elementos de la proteína multifunción que comprende un péptido derivado de CMV y especificidad de unión a PCSM (anticuerpo anti-PCSM): péptido pp65 del CMV: SEC ID NO: 01 NLVPMVATV Conector 1: SEC ID NO: 82 GGGGSGGGGSGGGGS microglobulina b2: SEC ID NO: 71 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSF YLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Conector 2: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 al a3 : SEC ID NO : 72 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYI ALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPK THMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAW VPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW Conector 3: SEC ID NO: 73 GS Conector 4: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Conector 13: SEC ID NO: 136 GSG cadena ligera de Ig: CMHI-0008 SEC ID NO: 126 D I VLTQ S P S S L S AS LGDRVT I S C S AS QG I RNYLNWY QQRPDGTVKLL I Y YTS S LHS GVP S RF SGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena ligera de Ig: CMHI-0030 y CMHI-0031 SEC ID NO: 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A): CMHI-0008 SEC ID NO : 128 EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNP SLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A): CMHI-0030 y CMHI-0031 SEC ID NO: 129 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de botón): CMHI-0008 SEC ID NO: 130 EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNP SLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de botón): CMHI-0030 y CMHI-0031 SEC ID NO: 131 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal): CMHI-0008 SEC ID NO: 132 EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNP SLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKE YKCKV SNKAL P AP I E KT I S KAKGQ PREPQVCTLPPSRDELTKN QVS LS CAVKGF YP S D I AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal): CMHI-0030 y CMHI-0031 SEC ID NO: 133 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK región Fe de cadena pesada de Ig (región Fe de IgGl utante L234A, L235A con variación de botón): SEC ID NO: 124 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP I EKT I SKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK scFv: CMHI - 0008 SEC ID NO : 134 EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYITYDGSNNYNP SLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCADFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGIRNYLNWYQQRPDGTVKLLIYYTSSL HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIK scFv: CMHI-0030 y CMHI-0031 SEC ID NO: 135 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSL HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIK Transfeccion Se diluyeron las células HEK 293 a 8xl05 células/ml el día antes de la transf ección. Se transf ectaron aproximadamente 1 a 1.6xl06 células siguiendo el protocolo del fabricante. Para un volumen de transfección final de 30 mi, se diluyeron 30 mg de ADN hasta un volumen final de 1 mi con medio sérico reducido Opti-MEM (Gibco, NO: de cat . 31985070). Se diluyeron igualmente 2 ml de reactivo 293fectin™ (Invitrogen, NO: de cat. 12347019) por cada 1 pg de ADN hasta un volumen final de 1 mi con medio Opti-MEM y se incubaron durante 5 minutos. Tras la incubación, se añadió ADN diluido al reactivo 293fectin™ diluido, se mezcló suavemente, se incubó durante 20-30 minutos adicionales y después se pipeteó gota a gota a 28 mi de las células HEK 293 hasta obtener un volumen final de 30 mi. Las células se incubaron bajo condiciones de cultivo celular (37°C, 8% de CO2, humedad del 80%) en un agitador orbital girando a 125 rpm y se recolectaron tras 72 horas. Lo recolectado se centrifugó durante 10 minutos a 1.000 rpm y durante 10 minutos a 3,000 rpm, y se filtró a través de un filtro estéril de 22 mm (Millipore, NO: de cat. SCGPU05RE) .
Western blot Se concentraron 500 ml de sobrenadante de cultivo celular con dispositivos de centrífuga Pall Nanosep Omega-Membrane (Pall, NO: de cat. OD030C33) hasta un volumen de 50 ml. Se diluyeron 17.5 m? de cada concentrado hasta un volumen final de 25 m? con 4x tampón para muestras XT (BioRad, NO: de cat. 161-0791) y 20x agente reductor XT (BioRad, NO: de cat. 161-0792), se calentaron durante 8 minutos a 96°C y se aplicaron a un gel premoldeado Criterion XT al 4-12% (NO: de cat. 345-0124) . Se llevó a cabo la transferencia con celda de transferencia semiseca Trans-Blot SD (BioRad) a 20 V durante 30 minutos en una membrana de nit rocelulosa Trans-blot Puré (0.45 m) (BioRad, NO: de cat.162-0117). El bloqueo de la membrana se llevó a cabo con lx reactivo de bloqueo western (Roche, NO: de cat. 11921681001) durante una hora a temperatura ambiente. La tinción se llevó a cabo con anticuerpo policlonal de conejo anti-cadena ligera k humana conjugado con peroxidasa (DAKO, NO: de cat. P0129, diluido 1:3000) y compeljo de anticuerpo policlonal d econejo anti-IgG humano y HRP (DAKO, NO: de cat. P0214, diluido 1:5000) durante una hora a temperatura ambiente. La detección de la luminiscencia se llevó a cabo con LUMI-Imager F1 (Roche) .
Purificación Las células se separaron del medio de cultivo mediante centrifugación. Las proteínas multifunción se purificaron a partir de los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad de proteína A (MabSelect-sefarosa en un ÁKTA-Avant). Las proteínas multifunción eluidas se concentraron con tubos de centrifugación Amicon hasta una concentración de proteínas de 3 mg/ml. Se analizó una alícuota en una cromatografía de exclusión por tamaño (HPLC TSKgel GC300 Sys89). Se llevó a cabo CET preparativa en un Superdex 200 para separar los agregados y amortiguar las proteínas de fusión en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0. Las proteínas multifunción eluidas se concentraron con tubos de centrifugación Amicon hasta una concentración de proteínas de 1 mg/ml y se filtraron a esterilidad (0.2 mm de tamaño de poro).
Análisis Las muestras de proteínas multifunción se analizaron a partir de la DO280 utilizando un espectrofotómetro de UV para determinar la concentración de proteínas en la solución. El coeficiente de extinción requerido para ello se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos según Pace (Pace et al., Protein Science 4:2411-2423, 1995) . La cromatografía de exclusión por tamaño (ET-HPLC ) se llevó a cabo en columnas TSK-Gel3 0 OSWXL ó Superdex 200 con un tampón de fosfato potásico 0.2 M, que comprendía KC1 0.25 M, pH 7.0, como fase móvil con el fin de determinar el contenido de especies mono éricas, agregadas y degradas en las muestras. Se llevó a cabo la electrof oresis en gel de pol iacrilamid -dodec i1sulfato sódico (SDS) (reductor y no reductor) con el fin de analizar la pureza de las preparaciones de proteínas multifunción con respecto a productos de degradación relacionados con el producto e impurezas no relacionadas . Se llevó a cabo espectrometría de masas con ionización por electropulverización (EM-IEP) con muestras reducidas (TCEP) y desglucosiladas (N-glucosidasa F) con el fin de confirmar la correcta masa/ identidad de cada cadena y detectar las modificaciones químicas. Se llevó a cabo la EM-IEP de las muestras desglucos iladas para analizar la naturaleza y calidad de la proteína totalmente ensamblada y detectar los potenciales productos secundarios relacionados con el producto.
Método SDS-PAGE y tinción de Coomassie Dispositivo: Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell Gel :gel de tris-glicina al 4-20%, Invitrogen EC6025BOX Solución amortiguadora: solución amortiguadora de migración Tris-glicina SDS (lOx), Invitrogen LC2675-5 Solución amortiguadora: solución amortiguadora para muestras Tris-glicina SDS (2x), Invitrogen LC2676 Solución amortiguadora: Agente reductor de muestras NuPAGE (lOx), Invitrogen NP0004 Marcador de peso molecular:Mark 12, estándar de PM, Invitrogen LC5677 Preparación de muestras de proteínas La muestra se ajustó a una concentración de proteínas de 1 mg/ml con solución amortiguadora. Para la reducción de muestras se llevó a cabo el procedimiento siguiente: Solución amortiguadora de reducción: 4 mi de solución amortiguadora para muestras (2x) y 1 mi de solución amortiguadora reductora (lOx), dilución 1:1 de las muestras con solución amortiguadora de reducción, - incubación durante 5 minutos a 70°C.
La electroforesis en gel se llevó a cabo a 125 V durante 90 minutos. Los geles se tiñeron con tinción Simply Blue Safe (Invitrogen, NO: de cat. LC6065).
Resultados Tabla 6 El gel de SDS con tinción de Coomassie y los cromatogramas de CET correspondientes de las proteínas multifunción seleccionados con una estructura correspondiente a los números 1, 2A y 3A de acuerdo con la tabla anterior se muestran en las figuras 5A y 6E. Puede apreciarse que resulta posible obtener proteínas multifunción definidas.
Ejemplo 4 Unión de proteína multifunción CMH-I-anti-IGF-lR a la línea celular positiva para IGF-IR humana Se diluyeron células H460M2 a 8xl05 células/ml en medio AIM-V (Gibco, NO: de cat. 0870112DK). Se tiñeron 500 ml de la suspensión celular con 10 mg de una proteína multifunción CMH-I-anti-IGF-lR tal como se informa en el presente documento a 4°C o a 37°C durante una hora. A continuación, las células se lavaron una vez con medio AIM-V helado y se tiñeron con un segundo anticuerpo, que era un anticuerpo F(ab')2 de cabra anti-IgG (H+L) humana conjugado con R-PE (Dianova, NO: de cat. 109-116-088, dilución 1:50) durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio AIM-V helado y se midió la fluorescencia mediante FACS Canto II (BD Bioscience) con separación de las células vivas. Un anticuerpo biespecífico sirvió como control de isotipo, un anticuerpo anti-IGF-lR (ver, por ejemplo, los documentos WO NO: 2004/087756 y NO: 2007/115814) sirvió como control positivo.
Resultados Considerando el desplazamiento en la medición de la fluorescencia de la PE (eje X), la proteína multifunción CMH-I-anti-IGF-lR no mostraba ninguna diferencia visible en la unión a las células diana H460M2 con el anticuerpo de control. Tampoco se observaban diferencias si la incubación con la proteína multifunción CMH-1-anti-IGF-lR se lleva a cabo a 4°C o a 37°C. Ni la incubación con el control de isotipo ni con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia mostraba ningún desplazamiento en las mediciones de fluorescencia de PE. A pesar de la fusión de la molécula de CMH de clase I, el dominio variable de anticuerpo de la proteína multifunción CMH-l-anti-IGF-lR en el presente documento todavía se unía a las células diana H460M2.
Ejemplo 5 Eliminación in vi tro de células que expresan antígeno Se sembraron células diana 124 (lxlO5 células/ml) en medio de cultivo celular (RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, NEAA 0,1 mM y FCS al 10% (v/p)) en placas de fondo de vidrio WillCo (FA. WillCo Wells BV, REF GWST-3522) durante 24 a 48 horas. Se prerecubrieron placas de fondo de vidrio WillCo con 50 ml/ml de hidrocloruro de poli-L-lisina (Sigma Aldrich, NO: de cat. P2658) en cada placa durante 30 minutos. Tras recubrir las placas, se enjuagaron uniformemente con agua estéril de grado de cultivo de tejidos y se secaron durante dos horas.
Tras el cultivo, se eliminó el medio de cultivo celular y la proteína multifunción de unión a IGF-IR que comprendía un polipéptido de fusión [péptido pp65-CMV]- [conector 1]-[microglobulina b]-[conector 2]-[HLA-A-al-a2-a3]-[conector 3]-[IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal], un polipéptido IgGl mutante L234A, L235A región Fe variante de botón unido por disulfuro y una cadena ligera de Ig, en la que la proteína multifunción se unía específicamente a IGF-1R humana tal como se informa en el presente documento (ver, por ejemplo, el Ejemplo 3), se añadió a una concentración final de 5 mg/ml en tampón K+ Krebs Ringer-HEPES 3 mM pH 7,3 (suplementado con DL-ditiotreitol 0.5 mM, ácido ascórbico 1 mM y glutatión 4 mM).
Se añadieron las células T en una proporción de células diana a células efectoras de 1:10. La obtención de imágenes se llevó a cabo durante 4 horas con un microscopio Zeiss Axiovert 135.
Resultados Lisis mediada por proteína multifunción de unión a IGF-IR de células 1243T3 que expresan IGF-IR humana (células grandes de crecimiento adherente). La lisis se encuentra mediada por células T específicas de CMV humanas (células pequeñas de forma redondeada o células migrantes ameboides). Se incubaron células 124 con la proteína multifunción a una concentración de 5 mg/ml y células T específicas de CMV humanas (preactivadas con APC pulsadas con HLA-A0201+/péptido de CMV). Observar la interacción de las células 124 con las células T a los 56 y 76 minutos y posteriormente el colapso de la célula 124 tras 125 minutos.
Se llevó a cabo un control que muestra la ausencia de lisis de las células 124 3T3 (células grandes de crecimiento adherente, puntas de flecha blancas) por células T específicas de CMV humanas (células pequeñas de forma redondeada o células migratorias ameboides) en ausencia de proteína multifunción de unión a antígeno tal como se da a conocer en el presente documento. Se incubaron células 124 con células T citotóxicas específicas (preactivadas con APC pulsadas con HLA-A0201+/péptido de CMV). Se indica el periodo de tiempo transcurrido en la parte inferior de cada fotografía.
Ejemplo 6 Ensayo de citotoxicidad Se pipeteó medio de cultivo celular (50 ml) en cada pocilio de una placa E de 96 pocilios Xcelligence (Roche, NO: de cat.05232368001) para llevar a cabo una medición del nivel de fondo.
Se diluyeron las células 124 a lxlO6 células/ml en medio de cultivo celular (RPMI 1640, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, NEAA 0.1 mM, FCS al 10% (v/p)) y se pipetearon 50 ml (2xl04 células/pocillo) en cada pocilio de una placa de 96 pocilios Xcelligence hasta un volumen final de 100 ml y se cultivaron durante 24 horas (37°C, 8% de CO2, humedad del 80%). Tras 24 horas, se eliminó el medio y las células se lavaron con 200 ml de medio AIM-V (medio sin suero (Invitrogen) para células T (NO: de cat): 12055-083). La proteína multifunción de unión a IGF-1R que comprendía un polipéptido de fusión [péptido pp65-CMV] -[conector 1]- [microglobulina b2]-[conector 2]-[HLA-A-al-a2-a3]-[conector 3]-[IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal], un polipéptido IgGl mutante L234A, L235A región Fe variante de botón unido por disulfuro y una cadena ligera de Ig, en la que la proteína multifunción se unía específicamente a IGF-1R humana se añadió a las células diana lavadas a una concentración final de 1 mg/ml en medio AIM-V. Se añadieron células efectoras en la proporción correspondiente en medio AIM-V hasta un volumen final de 150 m?. Se utilizó anticuerpo monoclonal IgGl afucosilado contra IGF-1R humana (anticuerpo anti-IGF-lR afucosilado) y anticuerpo anti-digoxigenina humano no ligante (anticuerpo anti-digoxigenina) a modo de control de isotipo y control específico de anticuerpo, respectivamente. Las mediciones se llevaron a cabo durante 6 a 9 horas, respectivamente, con el sistema Xcelligence (Roche).
Resultados La proteína multifunción de unión a IGF-1R induce la lisis de las células tumorales H460M2 mediante las células T específicas de CMV humanas.
Se incubaron las células tumorales durante 4 horas con 1 mg/ml de la proteína multifunción de unión a antígeno que comprendía un polipéptido de fusión [péptido pp65-CMV]-[conector 1]-[microglobulina b2]-[conector 2]-[HLA-A-al-a2-OÍ3]-[conector 3]-[IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal], un polipéptido IgGl mutante L234A, L235A región Fe variante de botón unido por disulfuro y una cadena ligera de Ig, en la que la proteína multifunción se unía específicamente a IGF-1R humana y células T específicas en la proporción respectiva (1:1.5 a 1:0.5) (ver las figuras 8A-8C) . Se indica el porcentaje de lisis en la parte superior de las barras respectivas. El anticuerpo monoclonal IgGl afucosilado dirigido contra IGF-IR humano (mAb IGF-1R-afu) no indujo una lisis significativa de las células tumorales .
La proteína multifunción informada en el presente documento indujo la lisis de las células diana 124 3T3 mediante las células T específicas de CMV.
Se incubaron las células diana durante 4 horas con 1 pg/ml de la proteína multifunción de unión a antígeno que comprendía un polipéptido de fusión [péptido pp65-CMV]- [conector 1]-[microglobulina b2]-[conector 2]-[HLA-A-al-a2-a3]- [conector 3]-[IgGl mutante L234A, L235A con variación de ojal], un polipéptido IgGl mutante L234A, L235A región Fe variante de botón unido por disulfuro y una cadena ligera de Ig, en la que la proteína multifunción se unía específicamente a IGF-1R humana y células T específicas en la proporción respectiva (1:1.5 a 1:0.5) (ver las figuras 9A-9C) . Se indica el porcentaje de lisis en la parte superior de las barras respectivas. El anticuerpo monoclonal IgGl afucosilado contra IGF-1R humana (anticuerpo anti-IGF-1R afucosilado) y el anticuerpo anti-digoxigenina humano no ligante (anticuerpo anti-digoxigenina) no indujeron una lisis significativa de las células diana.
Ejemplo 7 Eficacia in vi tro Se incubó la línea celular de adenocarcinoma pulmonar positiva para IGF-1R H460M2 con 1 mg/ml de una proteína multifunción que comprendía un péptido derivado del CMVh y un anticuerpo anti-IGF-lR y células T positivas para CD8 específicas para CMV a una proporción baja de células efectoras a células diana (1.5 a 0.5 células T específicas por cada célula tumoral). El anticuerpo de control era un anticuerpo anti-IGF-lR glucomanipulado. El tiempo de incubación fue de 6 horas. La incubación con proteína multifunción resultó en una potente eliminación de las células tumorales H460M2.
Unión de diferentes proteínas multifunción CMH-I-anti-PCSM a células diana positivas para PCSM Se incubaron las células Colo38 durante 5 minutos con acutasa (PAA, No de ca . Lll-007) para obtener una suspensión de células individuales. Se incubaron 2xl05 células en cada vial con 1 mg/ml de proteína multifunción CMH-I-anti-PCSM en 100 ml de PBS/FCS al 2% durante 45 minutos a 4°C. Tras la incubación, las células se lavaron con 1 mi de PBS frío/FCS al 2% y se centrifugaron durante 7 minutos a 910 rpm. Las células se resuspendieron en 100 ml de PBS/FCS al 2% con anticuerpo secundario (conjugado de anticuerpo de cabra an i-IgGl humano y PE, Jackson, No de cat. 109-116-088) (2 pg/ml) y se incubaron durante 45 minutos adicionales a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 1 mi de PBS/FCS al 2% y se midieron con el citómetro de flujo BD Canto II. Se muestran los resultados en la figura 7.
Ejemplo 9 Incubación de células positivas para PCSM con proteínas multifunción CMH-I-anti-PCSM Se incubaron las células Colo38 ó WM266-4 durante 5 minutos con acutasa (PAA, NO: de cat. Lll-007) para obtener una suspensión de células individuales. Se incubaron 2xl04 células de la línea celular Colo38 ó lxlO4 células de la línea celular WM266-4 en cada pocilio durante 24 h en placas Eplates96 (Roche, NO: de cat. 05232368001) en 100 m? del medio de cultivo celular respectivo (línea celular Colo38: RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM, FCS al 10%; línea celular WM-266-4: RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM, FKS al 10%, piruvato sódico 2 mM, NEAA 2 mM) y se midió la adherencia (impedancia) cada 15 minutos utilizando teenología ACEA (Xcelligence RTCA) . Tras 24 h (etapa de crecimiento sin perturbaciones) , las células se lavaron con 200 ml de medio AIM-V (Gibco, NO: de cat. 0870112DK). Se añadieron proteínas multifunción CMH-1-anti-PCSM a una concentración final de 1 mg/ml conjuntamente con células T estimuladas o CMSP en diferentes proporciones hasta un volumen final de 150 ml en medio AIM-V a las células. Se continuó la incubación durante 4 a 48 horas adicionales con medición simultánea de ACEA cada 5 minutos. La lectura se basa en mediciones de la impedancia, detectando las células lisadas o colapsadas como desprendidas del fondo de la placa Eplate . El índice celular se normalizó a 1 en el primer punto de medición tras la adición de la proteína multifunción. Los resultados para la concentración de 1 pg/ml de proteína multifunción (CMHI-0008 (1), CMHI-0010 (2), CMHI-0030 (3), CMHI-0031 (4)), proporción de células efectoras a diana de 10:1, CMSP del donante 3 (200.000 células; el donante 3 era positivo para CMV aunque negativo para el VEB) y la línea celular tumoral de melanoma Colo38 (20.000 células) y por cada pocilio de 96; los datos se han obtenido por triplicado y se muestran en la figura 14. Los resultados para la concentración de 1 pg/ml de proteína multifunción (CMHI-0008 (1), CMHI-0010 (2), CMSP solas (3)), proporción de células efectoras a células diana de 10:1, CMSP del donante 3 (200.000 células; el donante 3 era positivo para CMV pero negativo para VEB) y la línea celular tumoral de melanoma Colo38 (20.000 células) y por cada pocilio de 96, datos obtenidos por triplicado, se muestran en las figuras 15A (Colo38) y 15B (WM266).
Ejemplo 10 Ensayo de citotoxicidad Se pipeteó medio de cultivo celular (50 ml) en cada pocilio de una placa E de 96 pocilios Xcelligence (Roche, NO: de cat. 05232368001) para llevar a cabo una medición del nivel de fondo.
Se diluyeron células Colo38 a lxlO6 células/ml en medio de cultivo celular (RPMI 1640, L-glutamina 2 mM, FCS al 10% (v/p)) y se pipetearon 50 ml (2xl04 células/pocillo) en cada pocilio de una placa de 96 pocilios Xcelligence hasta un volumen final de 100 m? y se cultivaron durante 24 horas (37°C, 8% de CO2, humedad del 80%) . Tras 24 horas, se eliminó el medio y las células se lavaron con 200 m? de medio AIM-V (medio sin suero (Invitrogen) para células T (NO: de cat): 12055-083). Se añadieron individualmente a las células diana lavadas a una concentración final de 1 mg/ml en medio AIM-V, las proteínas multifunción ligantes de PCSM CMHI-0008 (monovalente, cargado con péptido de CMV), CMHI-0010 (monovalente, control cargado con péptido de VEB), CMH-0026 (bivalente, cargado con péptido de CMV, control no ligante), CMHI-0030 (monovalente, cargado con péptido de CMV, activo) y CMHI-0031 (bivalente, cargado con péptido de CMV, activo) . Se añadieron células efectoras en la proporción correspondiente de 10:1 (E:D) en medio AIM-V hasta un volumen final de 150 ml. Las mediciones se llevaron a cabo durante 42 horas tras la adición con el sistema Xcelligence (Roche).
Los resultados obtenidos para 200.000 CMSP (células efectoras) recién aisladas del donante 3 cocultivadas con 20.000 células Colo38 adherentes (placas de 96 pocilios, datos por triplicado) se muestran en la figura 16 (lisis de las células tras 42 horas de incubación con proteína multifunción) . El 25% de las CMSP eran células T positivas para CD8, de las que, a su vez, 3% eran específicas de péptido pp65 de CMV, resultando en aproximadamente 1.500 células T CD8+ específicas de péptido pp65 de CMV por cada 20.000 células diana Colo38 (proporción real E:D (proporción de células efectoras a células diana)=1:13).
Resultados La proteína multifunción de unión a PCSM inducía la lisis de las células tumorales Colo38 mediante las células T específicas de CMV humanas.
Ejemplo 11 Ensayo de liberación de LDH Se centrifugaron placas ACEA durante 7 minutos a 910 rpm. Se transfirieron 50 ml de los sobrenadantes de ACEA a otra placa de fondo plano de 96 pocilios (Costar). Se diluyó reactivo LDH (kit de detección de citotoxicidad, Roche, No de cat. 11644793001) 1 y 2 siguiendo las instrucciones del fabricante y se añadieron 50 ml de la solución al sobrenadante. Se detectó la absorción tras un periodo de incubación de 5 a 25 minutos en el lector Tecan Reader Sunrise (Tecan). Se detectó lisis total mediante la adición de Tritón X-100 al 1% (Sig a, NO: de cat. T-8787) a las células diana antes de la centrifugación.
Los resultados obtenidos para 200.000 CMSP (células efectoras) recién aisladas del donante 3 cocultivadas con 20.000 células Colo38 adherentes (placas de 96 pocilios, datos por triplicado) se muestran en la figura 17 (liberación de LDH tras 48 horas de incubación con proteína multifunción). Se cocultivaron 200.000 CMSP recién aisladas del donante 3, con 20.000 células Colo38 adherentes (placas de 96 pocilios, datos por triplicado). El 25% de las CMSP eran células T positivas para CD8, de las que, a su vez, 3% eran especificas de péptido pp65 de CMV, resultando en aproximadamente 1.500 células T CD8+ específicas de péptido pp65 de CMV por cada 20.000 células diana Colo38 (proporción E:D (proporción de células efectoras a células diana)=1:13).
Resultados La proteína multifunción de unión a PCSM inducía la lisis de las células tumorales Colo38 mediante las células T específicas de CMV humanas.
Ejemplo 12 Ensayo de citotoxicidad Se obtuvieron CMSP a partir de sangre completa mediante centrifugación en Ficoll. Se diluyeron lxlO7 CMSP por mi en medio de células T (RPMI 1640 suplementado con HS al 10%, glutamina 2 mM) y se llevó a cabo el intercambio de péptidos con moléculas de HLA-A0201 mediante la adición de 50 mg/ml de péptido pp65 de CMV a la suspensión. Tras incubar durante 2-3 horas, se diluyeron las CMSP 1:10 y se sembraron en placa a razón de 200 ml en placas de fondo redondo de 96 pocilios. El día 3, se añadieron 20 U/ l de IL-2, y 25 ng/ml de IL-7 e IL-15. Tras 14 d, se llevó a cabo una nueva estimulación.
Las células T estimuladas se lavaron dos veces en las placas de 96 pocilios y se diluyeron en 200 ml de medio de células T, a partir del que se transfirieron 80 m? a nuevas placas de fondo redondo de 96 pocilios.
Las CMSP se estimularon según el protocolo anteriormente indicado. Las CMSP estimuladas se irradiaron tras el intercambio de péptidos con 4.000 Gray, se lavaron con medio de células T dos veces y se pipetearon lxlO5 CMSP en los 80 ml de células T. El día 3, se añadieron 20 U/ml de IL-2, y 25 ng/ml de IL-7 e IL-15. Se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad Xcelligence con células T nuevamente estimuladas el día 11.
El 63% de las células efectoras eran células T CD8+ específicas de péptido pp65 de CMV.
La proporción de células diana a células efectoras era de 1:3.5. Se determinó la lisis celular 10 horas después de la adición de la proteína multifunción respectiva. Se añadió la proteína de fusión multifunción a una concentración final de 1 pg/ml.
Se muestran los resultados en la figura 18A para las células Colo38 y en la figura 18B para las células WM266.
Ejemplo 13 Proteínas multifunción estabilizadas por disulfuros Se introdujo un puente disulfuro entre las posiciones 11 y 227 del dominio presentador de antígeno en la proteína multifunción tal como se informa en el presente documento.
La secuencia de aminoácidos del dominio presentador de antígeno estabilizado por disulfuros era: NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPS DIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKW DRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDS DAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYG CDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEG TCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQ TQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVW PSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWGSGQVQLQESGP GLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNPSLKSRVTIS RDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV W DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQD LNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 137).
Sin estabilización con disulfuros, pueden obtenerse 6.4 mg de proteína multifunción a partir de 11 de sobrenadante de cultivo tras la purificación de afinidad de proteína A. El rendimiento final tras la cromatografía de exclusión por tamaño para separar los agregados fue de 2.2 mg.
Con la estabilización con disulfuros, pueden obtenerse 17.8 mg de proteína multifunción a partir de 1 1 de sobrenadante de cultivo tras la purificación de afinidad de proteína A. El rendimiento final tras la cromatografía de exclusión por tamaño fue de 11.4 mg debido a la menor cantidad de agregados debida a una mayor estabilidad térmica por el puente disulfuro introducido.
Los cromatogramas analíticos de exclusión por tamaño tras la cromatografía de afinidad de proteína A aunque anteriores a la eliminación de los agregados mediante cromatografía preparativa de exclusión por tamaño se muestran en las figuras 19A y 19B.
Las proteínas multifunción unidas por disulfuro mostraban la misma funcionalidad que las proteínas multifunción no unidas por disulfuro (ver la figura 20).
Se obtuvieron CMSP a partir de sangre completa mediante centrifugación en Ficoll. Se diluyeron lxlO7 CMSP por mi en medio de células T (RPMI 1640 suplementado con HS al 10%, glutamina 2 mM) y se llevó a cabo el intercambio de péptidos con moléculas de HLA-A0201 mediante la adición de 50 mg/ml de péptido pp65 de CMV a la suspensión. Tras incubar durante 2-3 horas, se diluyeron las CMSP 1:10 y se sembraron en placa a razón de 200 ml en placas de fondo redondo de 96 pocilios. El día 3, se añadieron 20 U/ml de IL-2, y 25 ng/ml de IL-7 e IL-15. Se recolectaron las células 11 d después de la estimulación primaria, el 45% de las células eran específicas de CMV. En la figura 20 se muestran los resultados para una proporción de células diana a células efectoras de 1:3.
Las proteínas multifunción unidas mediante disulfuro mostraban una estabilidad térmica incrementada (figura 21).
Ejemplo 14 Preparación, transfección, expresión, purificación y análisis de ADN Preparación de ADN Se recolectaron 250 mi de cultivo LB bacteriano durante la noche y se extrajo el ADN plasmídico siguiendo el protocolo del fabricante (kit High speed Maxi, Qiagen, NO: de cat. 12663). El ADN plasmídico resultante se eluyó en 1 mi de solución amortiguadora TE y se determinó la concentración de ADN mediante espectrofotometria (Epoch, BioTek).
El vector de expresión final comprendía los elementos siguientes: los sitios de restricción endonucleolítica HindIII, Nhel, un promotor del CMV, un 5'UTR 1 (derivado del CMV humano), intrón A, un 5'UTR 2, un gen de resistencia a la ampicilina, un sitio poliA de BGH (señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina), pUC Ori.
Secuencias de aminoácidos de los elementos de la proteína multifunción monovalente unida mediante disulfuro que comprendía un péptido derivado del CMV y especificidad de unión a PCSM (anticuerpo anti-PCSM): péptido pp65 del CMV: SEC ID NO: 01 NLVPMVATV Conector 1: SEC ID NO: 139 GCGGSGGGGSGGGGS microglobulina b2: SEC ID NO: 71 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSF YLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Conector 2: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 al - a3: SEC ID NO: 140 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYI ALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPK THMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAW VPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW Conector 13: SEC ID NO: 136 GSG cadena ligera de Ig: SEC ID NO: 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY E KHKVYACE VTHQGLS S PVTKS FNRGEC cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de botón): SEC ID NO: 141 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de ojal): SEC ID NO: 142 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK región Fe de cadena pesada de Ig (región Fe de IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de botón): SEC ID NO: 98 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Secuencias de aminoácidos de los elementos de la proteína multifunción divalente unida mediante disulfuro que comprendía un péptido derivado del CMV y especificidad de unión a PCSM (anticuerpo anti-PCSM): péptido pp65 del CMV: SEC ID NO: 01 NLVPMVATV Conector 1: SEC ID NO: 139 GCGGSGGGGSGGGGS microglobulina b2: SEC ID NO: 71 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSF YLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Conector 2: SEC ID NO: 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 al - a3: SEC ID NO: 140 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYI ALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPK THMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAW VPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW Conector 13: SEC ID NO: 136 GSG cadena ligera de Ig: SEC ID NO : 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de botón): SEC ID NO: 142 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de ojal): SEC ID NO: 141 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK Secuencias de aminoácidos de los elementos de una proteína multifunción divalente unida mediante disulfuro adicional que comprendía un péptido derivado del CMV y especificidad de unión a PCSM (anticuerpo anti-PCSM): péptido pp65 del CMV: SEC ID NO: 01 NLVPMVATV Conector 1: SEC ID NO: 139 GCGGSGGGGSGGGGS HLA-A*0201 al - a3: SEC ID NO: 140 GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYI ALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVE LRRYLENGKETLQRTDAPK THMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAW VPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW Conector 2: SEC ID NO: 77 GGGGSGGGGSGGGGS microglobulina b2: SEC ID NO: 71 IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSF YLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM Conector 13: SEC ID NO: 81 GGGGSGGGGS cadena ligera de Ig: SEC ID NO: 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de botón): SEC ID NO: 142 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK cadena pesada de Ig (IgGl mutante L234A, L235A, P329G con variación de ojal): SEC ID NO: 141 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYITYDGSNNYNP SLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCADFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK Transfección Se diluyeron las células HEK 293 a 8xl05 células/ml el día antes de la transfección. Se transf ectaron aproximadamente 1 a 1.6xl06 células siguiendo el protocolo del fabricante. Para un volumen de transfección final de 30 mi, se diluyeron 30 mg de ADN hasta un volumen final de 1 mi con medio sérico reducido Opti-MEM (Gibco, NO: de cat. 31985070) . Se diluyeron igualmente 2 ml de reactivo 293fectin™ (Invitrogen, NO: de cat. 12347019) por cada 1 pg de ADN hasta un volumen final de 1 mi con medio Opti-MEM y se incubaron durante 5 minutos. Tras la incubación, se añadió ADN diluido al reactivo 293fectin™ diluido, se mezcló suavemente, se incubó durante 20-30 minutos adicionales y después se pipeteó gota a gota a 28 mi de las células HEK 293 hasta obtener un volumen final de 30 mi. Las células se incubaron bajo condiciones de cultivo celular (37°C, 8% de CO2, humedad del 80%) en un agitador orbital girando a 125 rpm y se recolectaron tras 72 horas. Lo recolectado se centrifugó durante 10 minutos a 1.000 rpm y durante 10 minutos a 3.000 rpm, y se filtró a través de un filtro estéril de 22 mm (Millipore, NO: de cat. SCGPU05RE).
Western blot Se concentraron 500 ml de sobrenadante de cultivo celular con dispositivos de centrífuga Pall Nanosep Omega -Membrane (Pall, No de cat . OD030C33) hasta un volumen de 50 ml . Se diluyeron 17.5 ml de cada concentrado hasta un volumen final de 25 m? con 4x solución amortiguadora para muestras XT (BioRad, No de cat. 161-0791) y 20x agente reductor XT (BioRad, No de cat. 161-0792) , se calentaron durante 8 minutos a 96°C y se aplicaron a un gel premoldeado Criterion XT al 4-12% (No de cat. 345-0124) . Se llevó a cabo la transferencia con celda de transferencia semiseca Trans-Blot SD (BioRad) a 20 V durante 30 minutos en una membrana de nitrocelulosa Trans-blot Pure (0.45 mm) (BioRad, NO: de cat. 162-0117) . El bloqueo de la membrana se llevó a cabo con lx reactivo de bloqueo western (Roche, NO: de cat. 11921681001) durante una hora a temperatura ambiente. La tinción se llevó a cabo con anticuerpo policlonal de conejo anti-cadena ligera k humana conjugado con peroxidasa (DAKO, NO: de cat. P0129, diluido 1:3.000) y compeljo de anticuerpo policlonal d econejo anti-IgG humano y HRP (DAKO, NO: de cat. P0214, diluido 1:5.000) durante una hora a temperatura ambiente. La detección de la luminiscencia se llevó a cabo con LUMI-Imager F1 (Roche).
Puri ficac ión Las células se separaron del medio de cultivo mediante centrifugación. Las proteínas multifunción se purificaron a partir de los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad de proteína A (MabSelect-sefarosa en un ÁKTA-Avant) . Las proteínas multifunción eluidas se concentraron con tubos de centrifugación Amicon hasta una concentración de proteínas de 3 mg/ml. Se analizó una alícuota en una cromatografía de exclusión por tamaño (HPLC TSKgel GC300 Sys89) . Se llevó a cabo CET preparativa en un Superdex 200 para separar los agregados y tamponar las proteínas de fusión en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0. Las proteínas multifunción eluidas se concentraron con tubos de centrifugación Amicon hasta una concentración de proteínas de 1 mg/ml y se filtraron a esterilidad (0.2 mm de tamaño de poro).
Anal isis Las muestras de proteínas multifunción se analizaron a partir de la DO280 utilizando un espect rof otómetro de UV para determinar la concentración de proteínas en la solución. El coeficiente de extinción requerido para ello se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos según Pace (Pace et al . , Protein Science 4:2411-2423, 1995). La cromatografía de exclusión por tamaño (ET-HPLC) se llevó a cabo en columnas TSK-Ge1300SWXL ó Superdex 200 con una solución amortiguadora de fosfato potásico 0.2 M, que comprendía KCl 0.25 M, pH 7.0, como fase móvil con el fin de determinar el contenido de especies monoméricas, agregadas y degradas en las muestras. Se llevó a cabo la electrof oresis en gel de pol iacrilamida -dodec i1sulf ato sódico (SDS) (reductor y no reductor) con el fin de analizar la pureza de las preparaciones de proteínas multifunción con respecto a productos de degradación relacionados con el producto e impurezas no relacionadas. Se llevó a cabo espectrometría de masas con ionización por electropulverización (EM-IEP) con muestras reducidas (TCEP) y desglucosiladas (N-glucosidasa F) con el fin de confirmar la correcta masa/ident idad de cada cadena y detectar las modificaciones químicas. Se llevó a cabo la EM-IEP de las muestras desglucos i1adas para analizar la naturaleza y calidad de la proteína totalmente ensamblada y detectar los potenciales productos secundarios relacionados con el producto. Método SDS-PAGE y tinción de Coomassle Dispositivo: Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell Gel: gel de tris-glicina al 4-20%, Invitrogen EC6 025BOX Solución amortiguadora: solución amortiguadora de migración Tris-glicina SDS (IOc), Invitrogen LC2675 - 5 Solución amortiguadora para muestras: solución amortiguadora para muestras Tris-glicina SDS (2x), Invitrogen LC2676 Solución amortiguadora reductor: Agente reductor de muestras NuPAGE (IOc) , Invitrogen NP0004 Marcador de peso molecular: Mark 12, estándar de PM, Invitrogen LC5677 Preparación de muestras de proteínas La muestra se ajustó a una concentración de proteínas de 1 mg/ml con tampón. Para la reducción de muestras se llevó a cabo el procedimiento siguiente: Solución amortiguador de reducción: 4 mi de solución amortiguadora para muestras (2x) y 1 mi de solución amortiguadora reductora (lOx), dilución 1:1 de las muestras con solución amortiguadora de reducción, - incubación durante 5 minutos a 70°C.
La electrof oresis en gel se llevó a cabo a 125 V durante 90 minutos. Los geles se tiñeron con tinción Simply Blue Safe (Invitrogen, NO: de cat. LC6065).
Tabla 7 Puede observarse que resulta posible obtener proteínas multifunción definidas.
Ejemplo 15 Activación de células T por complejos que comprenden un dominio presentador de antígeno en comparación con complejos que comprenden dos dominios presentadores de antígeno Se estimularon veinte mil PBMC por cada pocilio en medio AIM-V (Gibco) a una concentración final de 100 m9/th1, 10 m9/pi1, 1 m9/ih1, 100 ng/ml con constructos CMHI-0054 [ligante anti-PCSM bivalente con CMV-CMHI de un brazo estabilizado por disulfuro] o CMHI-0065 [ligante anti-PCSM bivalente con dos CMV-CMHI de dos brazos estabilizado por disulfuro] en un volumen de 150 ml de medio AIM-V durante 16 horas. Se agruparon las PBMC de cuatro pocilios y se tiñeron con: 1) anticuerpo anti-CD8 marcado con PE-Cy7 (BD No 557746) (5 mI/100 ml de PBS/FCS al 2%), o 2) anticuerpo anti-CD4 marcado con FITC (BD No 555346) (20 mI/100 m? de PBS/FCS al 2%), o 3) dextrámero APC-CMV (Immudex No WB2132) (10 mI/100 m? de PBS/FCS al 2%), o 4) anticuerpo anti-CD25 marcado con PE (BioLegend No 302606) (5 mI/100 m? de PBS/FCS al 2%), o 5) anticuerpo anti-CD69 marcado con PerCP/Cy5.5 (BioLegend No 310925) (5 mI/100 m? de PBS/FCS al 2%) sobre hielo durante 45 minutos, seguidamente se lavó dos veces con PBS/FCS al 2% (500xg, 10 minutos).
Para determinar la activación de las células T se utilizaron las variables siguientes: 1) frecuencia de células CD25+ de entre todas las células CD8+ específicas de CMV (NLVPMVATV pp65), 2) frecuencia de células CD69+ de entre todas las células CD8+ específicas de CMV (NLVPMVATV pp65), y 3) regulación negativa del RCT afín para el péptido pp65 NLVPMVATV del CMV (NLVPMVATV pp65) en complejo HLA A*0201 CMH de clase I sobre células CD8+.
Resultados: 1) regulación positiva de CD25 sobre células T CD8 específicas para pp65 de CMV-HLA A*0201: Tabla 8 De esta manera, con 10 ug/ml y 100 mg/ml de CMHI-0065 se observa una regulación positiva de la expresión de CD25 en comparación con CMHI-0054 (4.4 veces y 1.9 veces, respectivamente). 2) regulación positiva de CD69 sobre células T CD8 específicas para pp65 de CMV-HLA A*0201: Tabla 9 De esta manera, con 10 yg/ml y 100 pg/ml de CMHI-0065 se observa una regulación positiva de la expresión de CD69 en comparación con CMHI-0054 (9.0 veces y 1.8 veces, respectivamente). 3) regulación negativa de RCT sobre células T CD8 específicas para pp65 de CMV-HLA A*0201: Tabla 10 De esta manera, con 10 pg/ml y 100 pg/ml de CMHI-0065 se observa una regulación negativa de la expresión de RCT en comparación con CMHI-0054 (6.5 veces y 1.8 veces, respectivamente).
De esta manera, la activación de las células T CD8 específicas de CMV es más fuerte con la fusión homodimérica bivalente de anticuerpo que porta dos complejos CMH en comparación con la fusión heterodimérica bivalente de anticuerpo que porta únicamente un solo complejo CMH.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro, caracterizada porque comprende: - uno o dos dominios presentadores de antígeno, - una región Fe de anticuerpo, y - uno o más sitios de unión a antígeno, en donde el dominio presentador de antígeno comprende, en dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal, (i) una microglobulina b2, y (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, o (i) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1%, y (ii) una microglobulina b2, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) una microglobulina b2, y (iii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, o (i) un péptido inductor de una respuesta de células T, (ii) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1 % o superior, y (iii) una microglobulina b2, en donde el sitio de unión a antígeno se une a un antígeno de superficie de las células de cáncer. en donde el dominio presentador de antígeno tiene por lo menos dos residuos de cisterna no naturales que forman un enlace disulfuro intracadena/interdominio.
2. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un residuo de cisterna no natural en el dominio presentador de antígeno se encuentra en el conector entre el péptido inductor de respuesta de células T y un residuo de cisterna no natural se encuentra en uno de los dominios extracelulares al, a2 y a3 de la molécula de CMH de clase I.
3 . La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque: el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro, o el dominio presentador de antígeno presenta residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 108 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 108 forman un enlace disulfuro.
4. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la región Fe de anticuerpo comprende un primer y un segundo polipéptidos de región Fe unidos mediante disulfuro, por lo que el sitio de unión a antígeno o uno de los sitios de unión a antígeno comprende el primer polipéptido de región Fe y el segundo sitio de unión a antígeno, en caso de encontrarse presente, comprende el segundo polipéptido de región Fe.
5. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el sitio de unión a antígeno comprende: i) una pareja de una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo, o ii) un polipéptido de fusión scFv que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un fragmento de anticuerpo scFv y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o iii) un polipéptido de fusión de scFab que comprende, en dirección N-terminal a C- terminal, un scFab y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o los sitios de unión a antígeno comprenden, independientemente, i) una pareja (afín) de cadena pesada de anticuerpo y cadena ligera de anticuerpo, en la que las cadenas individuales pueden ser cadenas de tipo salvaje o cadenas modificadas (sustituidas, mutadas o de dominio intercambiado), o ii) un polipéptido de fusión de scFv que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un fragmento de anticuerpo scFv y un polipéptido de región Fe de anticuerpo, o iii) un polipéptido de fusión scFab que comprende, en dirección N-terminal a C-terminal, un scFab y un polipéptido de región Fe de anticuerpo.
6. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque: i) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal de la cadena pesada o al extremo N-terminal de la cadena ligera de un sitio de unión a antígeno, o ii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal de la cadena pesada o a cada extremo N-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno, o iii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo C-terminal de la cadena pesada o al extremo C-terminal de la cadena ligera del sitio de unión a antígeno, o iv) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo C-terminal de la cadena pesada o a cada extremo C-terminal de la cadena ligera de cada sitio de unión a antígeno, o v) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión de scFv, o vi) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido a cada extremo N-terminal o C-terminal de cada polipéptido de fusión de scFv, o vii) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión de scFab, o ix) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de región Fe, o x) un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del primer polipéptido de región Fe y un dominio presentador de antígeno se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del segundo polipéptido de región Fe.
7. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el péptido inductor de respuesta de células T es un péptido derivado del citomega1ovirus humano.
8. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el péptido de origen vírico presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 01.
9. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa de 1% o superior se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-C*0304, HLA-C*0401 y HLA-C*0702.
10. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la molécula del CMH de clase I con una frecuencia relativa inferior a 1% se selecciona de entre el grupo que comprende HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701 y HLA-B*7802.
11. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el dominio presentador de antígeno comprende: (i) un péptido de origen vírico, (ii) microglobulina b2, (iii) el alelo A*0201 de HLA-A soluble, y (iv) residuos de cisteína por lo menos en las posiciones 11 y 227 y los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227 forman un enlace disulfuro.
12. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el dominio presentador de antigeno comprende, en dirección N-terminal a C-terminal: (i) un péptido de origen vírico que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 01 y SEC ID NO: 70, (ii) un primer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 139, (iii) una microglobulina b2 que tiene una secuencia de aminoácidos de la EC ID NO: 71, (iv) un segundo péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEC ID NO: 77, 78, 79, 82, 83 y 84, (v) los dominios extracelulares al, a2 y a3 de una molécula del CMH de clase I que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 140, (vi) un tercer péptido conector que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84 y 136, y (vii) residuos de cisterna por lo menos en las posiciones 11 y 227 y un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 227.
13. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
14. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para usarse como medicamento.
15. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para usarse en el tratamiento del cáncer.
16. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para usarse en la atracción de células T citotóxicas específicas de virus de un individuo a una diana.
17. La proteína multifunción multivalente unida mediante disulfuro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para usarse en la eliminación de células de cáncer o de células infectadas por virus.
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