CN102120772B - 一种嵌合抗体及免疫细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗体及免疫细胞。本发明的嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、HLA-A₂分子的跨膜区片段、CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。本发明嵌合体抗体可表达于任何细胞的表面，当使其表达于免疫细胞表面时，该免疫细胞便通过其上的目的抗体具有了特异的免疫功能，所以本发明的嵌合抗体可以随着其中的目的抗体的不同而特异结合多种抗原。本发明的嵌合抗体、单域抗体及表达嵌合抗体的免疫细胞在细胞免疫治疗中将会有广阔的应用前景。

Description

一种嵌合抗体及免疫细胞

技术领域

本发明涉及一种嵌合抗体及免疫细胞。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural killer，NK)是淋巴细胞的一个亚类，在宿主对恶性肿瘤的细胞免疫应答中扮演了重要的角色。NK细胞对肿瘤的杀伤无MHC限制性，无特异性，不需抗原预先致敏。许多细胞因子(包括IL-2)能增强NK细胞的杀瘤活性。NK细胞的功能受其细胞表面表达的活化受体和抑制性受体的调节。

研究表明，NK细胞能有效杀伤MHC-I分子下调的肿瘤细胞，这使得它们能有效杀伤逃逸免疫应答的肿瘤变异细胞。许多研究表明，体外培养的、活化的自体或异体的NK细胞通过释放穿孔素和细胞因子，能有效抑制小鼠体内肿瘤的生长。然而，NK细胞的分离和扩大培养在技术上存在很大的难度。而且，病人起源的NK细胞功能受到损害，即使在体外经过淋巴因子活化培养后也不能恢复，这使得该方法的应用受到很大的限制。最重要的是，NK细胞的体外扩增比较困难，而且少数扩增得到的各批次的NK细胞也不一样，导致应用于临床实验的NK细胞无法标准化，这就促使研究者去探索细胞毒NK细胞系的特性和治疗潜力。连续生长的人IL-2依赖的NK-92细胞系被认为是一个很好的肿瘤免疫治疗的候选效应细胞。研究证实，NK-92细胞对多种不同来源的恶性细胞在体外和人源化的小鼠体内模型中均显示了很强的细胞毒活性。而且，NK-92细胞对同种异体的正常细胞没有毒性。目前，研究者正在评价NK-92细胞临床应用的安全性与有效性。NK-92细胞具有活化的NK细胞的功能，它们表达典型的NK细胞表面受体，缺少Fc-γRIII(CD16)。它们的高内源性的细胞毒活性极有可能归因于NK细胞抑制性受体的缺乏。NK-92细胞仅表达一种抑制性受体，即KIR2DL4，该受体通过结合靶细胞表面的人白细胞抗原G(HLA-G)来抑制NK细胞的细胞毒活性。

NK-92-MI细胞是NK-92细胞的变体，持续性分泌中等水平的IL-2，保留了母本细胞的表型特征和高细胞毒活性，但具有NK-92细胞所不具备的几个优点：首先，NK-92-MI细胞具有不依赖外源IL-2的长期的高细胞毒活性，因此避免了系统注射IL-2所产生的毒性；其次，NK-92-MI细胞的保持和扩增比母本细胞系更简单，不需在培养基中另加IL-2，这对NK细胞的大规模扩增显得尤其重要；而且，NK-92-MI细胞能杀伤体外和异种移植的小鼠体内的人肿瘤细胞系。

研究表明，嵌合受体能成功表达在NK-92细胞系的表面，赋予NK-92细胞特异、有效地杀伤表达膜抗原的肿瘤细胞的能力。这类嵌合受体具有两个功能：抗体片段依赖的抗原结合；信号受体的活化结构域依赖的效应细胞活化。然而，因为抗体不能穿透细胞膜去结合胞内表达的肿瘤抗原，这使得以该类抗原为靶标的NK-92或NK-92-MI的细胞靶向治疗至今停滞不前。而且，因为大多数肿瘤抗原都是胞内蛋白，寻找能特异结合该类抗原的抗体将极大地扩展肿瘤靶向治疗的适用范围。

研究表明，细胞内的肿瘤抗原被蛋白酶或溶酶体降解为小肽，与HLA-I或HLA-II分子结合后，形成HLA/peptide复合物，被呈递到肿瘤细胞表面，进而被T细胞表面的TCR受体识别，介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

目前，以抗体为基础的肿瘤靶向治疗常用的抗体是单链抗体或抗体Fab段，与它们相比，单域抗体具有几个独一无二的优点：(1)单域抗体仅含有抗体重链的一个可变区，是最小的全功能性的抗原结合片段，因此容易进行基因工程操作；(2)单域抗体与人的VH3域有很高的同源性。这些特性使它们成为肿瘤靶向治疗的极合适的候选抗体。直到现在，仅有一篇文献报道了以单域抗体为基础的免疫毒素用于肿瘤的免疫治疗。

通过杂交瘤技术制备MHC/肽复合物特异的TCR样抗体仍存在很大的技术难度。重组抗体及噬菌体展示技术的发展为TCR样抗体的制备提供了新的途径。

Gp100是黑色素细胞分化抗原，定位于细胞内，被加工后以MHC/肽复合物的方式呈递到肿瘤细胞表面，进而被T细胞识别和杀伤。Gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}是主要的HLA-A2限制性的表位。研究表明，以特异识别HLA/gp 100-肽复合物的Fab抗体为基础的免疫毒素能有效抑制裸鼠体内人黑色素瘤细胞的生长。源于黑色素肿瘤浸润的HLA-A2限制性的CTL能识别gp100表位。这些报告证实HLA-A2/gp100-肽复合物是肿瘤靶向治疗的有效靶标。目前，仅有一篇文献报道了以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的Fab抗体为基础的免疫毒素用于黑色素瘤的免疫治疗，未见以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的单域抗体为基础的靶向治疗的报道，也未见以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的抗体为基础的细胞靶向治疗的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可在细胞表面表达的嵌合抗体，这种抗体特别适用于在杀伤细胞中表达，然后使细胞行使杀伤性免疫功能。

本发明所提供的嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、HLA-A₂分子的跨膜区片段、CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。

本发明所提供的嵌合抗体还可以是如下的抗体：其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、标签、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体。此抗体即是附加了标签的抗体，附加标签的作用在于便于检测嵌合抗体的表达。

所述跨膜区片段可为HLA-A₂分子的跨膜区片段；所述胞内区片段可为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段；所述标签可为Myc标签。

所述Myc标签的氨基酸序列具体可如序列表中序列2所示；所述HLA-A₂分子的跨膜区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列4所示。

所述目的抗体的氨基酸序列具体可如序列表中序列1所示。

本发明的另一个目的是提供一种特异结合黑色素瘤细胞分化抗原HLA-A2/gp 100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的单域抗体。

本发明所提供的单域抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

表达上述任一所述抗体的免疫细胞也属于本发明的保护范围。

所述表达上述任一所述抗体的免疫细胞具体可以是通过向宿主细胞中导入所述抗体的编码基因得到的。

上述任一所述单域抗体或嵌合抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述单域抗体的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述单域抗体的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述单域抗体的DNA分子；

所述嵌合抗体中所述Myc标签的编码基因具体可为序列表中序列6所示的DNA分子；

所述嵌合抗体中所述HLA-A₂分子的跨膜区片段的编码基因具体可为如下a)或b)或c)的基因：

a)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；

c)与a)或b)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子；

所述嵌合抗体中所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因具体可为如下I、II或III的基因：

I其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；

II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；

III与I或II限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子；

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也均属于本发明的保护范围。

所述转基因细胞系的宿主细胞具体可为免疫细胞；所述免疫细胞具体可为自然杀伤细胞。

实验证明，本发明的单域抗体能特异结合固化的HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(1MDQVPESV)}复合物，不能结合固化的HLA-A2/p65_495-503或HLA-A2/Core_18-27对照复合物。GPAT-pen五聚体能特异结合gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞，而不结合无关肽脉冲的T2细胞或无肽脉冲的T2细胞。表明，本发明的单域抗体能与黑色素瘤表面呈递的HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物结合，且特异性强。

本发明嵌合体抗体可表达于任何细胞的表面，当使其表达于免疫细胞表面时，该免疫细胞便通过其上的目的抗体具有了特异的免疫功能，所以本发明的嵌合抗体可以随着其中的目的抗体的不同而特异结合多种抗原。例如，本发明的嵌合体抗体GPAT-ζ能表达于NK-92-MI细胞的表面，含有该嵌合体抗体编码基因的NK-92-MI细胞(即NK-92-MI-GPAT-ζ细胞)与母本NK-92-MI细胞相比，无论是体内还是体外，均更能有效地、特异的裂解表达HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的黑色素瘤细胞，杀伤率高。

本发明的表达嵌合抗体的免疫细胞可以用于靶向多种黑色素瘤细胞进行细胞免疫治疗，与现有的免疫毒素治疗方法相比，细胞免疫治疗具有如下优点(1)效果确切，有效率高。一般为40-50％，对有些癌症，有效率高达70％；(2)无明显毒副作用，病人不痛苦；(3)适应症广；(4)特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤。因此，本发明的嵌合抗体、单域抗体及表达嵌合抗体的免疫细胞在细胞免疫治疗中将会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为重组载体pVT2-GPAT和pVT2-GPAT-pen的结构示意图。

图2为GPAT单体及GPAT五聚体的电泳图。

图3为GPAT的抗原结合特异性检测。

图4为GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合。

图5为嵌合抗体GPAT-ζ的结构示意图及在NK-92-MI细胞表面的表达。

图6为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞、p65_495-503肽或Core_18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性。

图7为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对人黑色素瘤细胞Malme-3m、Mel-624或T2细胞的杀伤活性。

图8为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞的体内抗黑色素瘤活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

原核表达载体pVT2(Zhang等，J Mol Biol，335，2004，49-56)(中国科学院微生物研究所)。

实施例1、HLA-A₂/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}特异的单域抗体(GPAT)的制备与功能验证

NK-92-MI细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-2408；T2细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1992^TM；人黑色素瘤细胞Malme-3m购自ATCC，产品目录号HTB64。

人NK-92-MI细胞系和人的T淋巴瘤/B细胞杂交细胞T2(HLA-A2⁺and gp100^-)用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640完全培养基培养。

NK-92-MI-GPAT-ζ细胞用含有1000μg/ml G418的1640完全培养基培养。

人黑色素瘤细胞系Mel-624(HLA-A2⁺和gp100⁺)和Malme-3m(HLA-A2⁺和gp100⁺)用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基培养。

一、单域抗体(GPAT抗体)的编码基因的制备

以表达GPAT的噬菌体(北京表源生物技术有限公司)为模板，以gpaF：5’

TAATAA

CGCAGGCGCGTCTGGGGGAG 3’和gpaR：5’

ATTATTATGGGCCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT  3’

为引物，PCR扩增得到编码GPAT的cDNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，扩增得到的基因两端的酶切位点为BbsI/ApaI。该GPAT抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

二、重组载体pVT2-GPAT和pVT2-GPAT-pen的构建

(1)重组载体pVT2-GPAT-pen的构建：

原核表达载体pVT2自身依次含有信号肽片段的编码序列、VTB1片段的编码序列、连接子、myc标签的编码序列和His标签的编码序列。将序列表中序列5所示的GPAT片段克隆到原核表达载体pVT2的BbsI/ApaI位点，得到pVT2-GPAT-VTB1重组质粒，命名为pVT2-GPAT-pen，其中GPAT-pen是由序列表中序列5所示的GPAT片段、VT1B的编码序列、Myc标签(EQKLISEEDL)的编码序列和His标签的编码序列融合而成，GPAT-pen的结构示意图如图1B所示。(1表示信号肽片段的编码序列、2表示GPAT片段，3表示VT1B的编码序列，4表示连接子，5表示Myc标签的编码序列，6表示His标签的编码序列)

Myc标签的氨基酸序列如序列表中序列2所示；Myc标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

大肠杆菌中的B亚基毒素基因VT1B能自我装配形成五聚体，将该亚基融合到目的蛋白的C端，可使融合蛋白五聚体化。

(2)重组载体pVT2-GPAT的构建：

将引物ABF(cggcggcggct)和ABR(ccggagccgccgccgggcc)直接退火得到编码三个甘氨酸、两端酶切位点为ApaI/BspEI的DNA片段，将该片段以读码框一致的方式克隆到用ApaI/BspEI酶切位点消化过的pVT2-GPAT-pen载体，VT1B序列被删除，得到重组质粒pVT2-GPAT，其中，GPAT由序列表中序列5所示的GPAT片段、myc标签(EQKLISEEDL)的编码基因和由5个组氨酸组成的His标签的编码基因融合而成，GPAT的结构示意图如图1A所示(1表示信号肽片段的编码序列、2表示GPAT片段，3表示连接子，4表示Myc标签的编码序列，5表示His标签的编码序列)。

三、重组载体转化大肠杆菌得到重组菌

将重组载体pVT2-GPAT转入大肠杆菌TG1，通过氨苄青霉素筛选、酶切鉴定得到阳性克隆，再测序验证，得到含有重组载体pVT2-GPAT的重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT。按照同样的方法，得到含有重组载体pVT2-GPAT-pen的重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT-pen。

四、GPAT-pen五聚体和GPAT单体的表达与纯化

将重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT和TG1/pVT2-GPAT-pen分别接种到含100μg/ml氨苄青霉素钠的10ml LB培养基中，37℃，220rpm振摇过夜。将10ml培养物接种到含有100μg/ml氨苄青霉素钠的1L LB培养基中，37℃，220rpm振摇5小时。5小时后，加入1mM IPTG到培养物中诱导蛋白表达，24℃，180rpm，继续振摇培养22h。将培养物在8000g离心15分钟。将沉淀重悬在25ml 20mM的Tris-Hcl(pH 8.0)缓冲液中，加入5mg溶菌酶，室温反应30分钟。然后，将混合物用超声破碎仪超声，直到混合物变清澈后，12000rpm，20分钟离心，重复两次，通过0.22μM滤纸过滤。His₅标记的GPAT和GPAT-pen通过金属离子亲和层析(IMAC)(GE Healthcare)进行纯化。纯化的蛋白通过10％SDS-PAGE进行分析。

重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT表达的目的蛋白是由GPAT、连接子、Myc标签和His标签组成的单体融合蛋白。

重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT-pen表达的目的蛋白是以GPAT、VTB1、连接子、Myc标签和His标签组成的融合蛋白为单体形成的五聚体。

实验设3次重复，电泳结果如图2所示(1表示融合蛋白五聚体，2表示融合蛋白单体)。GPAT-pen和GPAT以可溶形式在大肠杆菌TG1中表达，在变性条件下，目标蛋白GPAT的分子量约为17kDa，目标蛋白GPAT-pen五聚体的分子量约为24kDa。纯化的蛋白纯度大于95％。三次实验重复GPAT-pen的产量分别是9mg/L培养物、10mg/L培养物、9.5mg/L培养物，三次实验重复GPAT的产量分别是95mg/L培养物、100mg/L培养物、90mg/L培养物。

五、GPAT的功能验证

(一)ELISA方法检测GPAT的抗原结合特异性

(1)BSA的生物素标记：将BSA用sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce，Rockford)进行标记，标记方法按照说明书进行。

(2)HLA-A₂-肽复合物的生物素标记：

HLA-A₂-gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}、HLA-A₂-CMV p65_{495-503(NLVPMVATV)}、HLA-A₂-HBV Core_{18-27 (FLPSDFFPSV)}的制备均根据Dirk Busch制备Tetramer protocol中的相关步骤进行(Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.Science 274，94-6)。概述如下：将HLA-A₂分子的细胞外部分和β2m轻链在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，再加相应的肽进行折叠；在折叠后，再将HLA-A₂-肽复合物浓缩。所有肽由SBS Genetech Co.(Beijing)合成。

以上各复合物的生物素标记：用BirA生物素化连接酶(Avidity)进行生物素化，然后通过Superdex 200(GE Healthcare)柱进行纯化。

(3)ELISA方法检测GPAT的抗原结合特异性

将生物素化的BSA(10μg/ml，稀释于PBS，pH 7.4)过夜包被在96孔板(NUNC，maxi sorp)中，用PBST(含0.1％Tween 20的PBS，pH 7.4)洗三次后，加入抗生物素蛋白链菌素(10μg/ml，稀释于PBS，pH7.4)，温育1小时。用PBST洗三次后，将生物素化的HLA-A₂-肽复合物(5μg/ml，稀释于PBS，pH7.4，呈递gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}，p65_495-503或Core_18-27三种不同的肽)通过抗生物素蛋白链菌素包被在96孔板上。仔细洗涤后，96孔板用MPBS(含2％牛奶的PBS，pH7.4)阻断30分钟，再加入重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT表达的目的蛋白(50μg/ml，稀释于PBS，pH7.4)室温温育1小时，然后用抗myc的抗体(9E10克隆，用MPBS稀释)染色，接下来用HRP-偶联的山羊抗小鼠的免疫球蛋白(用MPBS稀释)染色。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺试剂(Jingmei，China)进行检测。用2M硫酸终止反应，用读板器测A₄₅₀值。用小鼠抗人HLA-A₂的单克隆抗体BB7.2作为阳性对照以检测复合物的正确折叠。实验设3次重复。结果如图3所示(A表示HLA-A₂/gp 100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物，B表示HLA-A₂/CMV p65_{495-503(NLVPMVATV)}复合物，C表示HLA-A₂/HBV Core_{18-27(FLPSDFFPSV)}复合物；1表示实验组，2表示单克隆抗体BB7.2阳性对照)。GPAT能特异结合固化的HLA-A₂/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物，不能结合固化的HLA-A₂/p65_495-503或HLA-A₂/Core_18-27对照复合物。HLA-A₂构象特异的单克隆抗体BB7.2作为阳性对照，证实HLA-A₂/肽复合物成功地包被到了96孔板上。

(二)通过FACS检测GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合

T2细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1992^TM。

T2细胞含有HLA-A₂基因，但仅在细胞表面表达很低水平的HLA-A₂分子，不能呈递内源性抗原。外源肽的脉冲能稳定HLA-A₂分子，进而提高T2细胞表面HLA-A₂分子的表达水平。为了检测GPAT是否能特异结合细胞表面表达的HLA-A₂/gp100_{209-21(215E)(IMDQVPESV)7}复合物，本实验将特异肽gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}，无关肽p65_495-503或Core_18-27脉冲的T2细胞用作靶细胞，通过FACS分析的方法来分析结合能力。

检测GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合：将2×10⁶个T2细胞与20μM的肽置于RPMI-1640培养基中，37℃温育4小时；洗细胞，将细胞重悬在染色缓冲液中(含0.5％BSA与2mM EDTA的PBS缓冲液)，细胞浓度调整为5×10⁶个细胞/ml，将3μg融合蛋白五聚体GPAT-pen加入到100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在100μl含有1μg抗myc抗体的染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在含1μl FITC标记的山羊抗小鼠多克隆抗体的100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟，洗细胞，将细胞重悬在0.5ml的染色缓冲液中，用FACScan仪器(Guava Easycyte mini)进行检测，结果用Flowjo软件进行评价。

用BB7.2检测HLA-A2的总体表达水平：2×10⁶个T2细胞与20μM的肽在RPMI-1640培养基中，37℃温育4小时，洗细胞，将细胞重悬在染色缓冲液中(含0.5％BSA与2mM EDTA的PBS)，细胞浓度调整为5×10⁶细胞/ml，将1μg BB7.2加入到100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在含1μl FITC标记的山羊抗小鼠多克隆抗体的100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟，洗细胞，将细胞重悬在0.5ml的染色缓冲液中，用FACScan仪器(Guava Easycyte mini)进行检测，结果用Flowjo软件进行评价。

实验设3次重复。表明，GPAT-pen五聚体能特异结合gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞，而不结合无关肽脉冲的T2细胞或无肽脉冲的T2细胞(图4A)。HLA-A2构象特异的单克隆抗体BB7.2用于检测肽脉冲的T2细胞表面上调表达的HLA-A2，证实肽正确的装载到了T2细胞表面(图4B)。图4中，gp100表示HLA-A₂-gp100_{209-217 (215E)(IMDQVPESV)}的结果、CMV表示HLA-A₂-CMV p65_{495-503(NLVPMVATV)}的结果、HBV表示HLA-A₂-HBV Core_{18-27(FLPSDFFPSV)}的结果、不加肽表示不加任何肽的结果。

实施例2、嵌合抗体GPAT-ζ的构建与应用

一、含有嵌合抗体GPAT-ζ的编码基因的重组载体的构建

GPAT-ζ嵌合抗体的编码基因由HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}特异的单域抗体GPAT的编码基因(图5A中GPAT)、编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列(图5A中Myc标签)、人HLA-A₂分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因(图5A中TM，即下述a2tm)，人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因(图5A中ζ)融合而成，其结构如图5A所示。

人HLA-A₂分子的跨膜区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示；人HLA-A₂分子的跨膜区片段的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。

人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列4所示；人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因如序列表中序列8所示。

将单域抗体GPAT的编码基因、编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A₂分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因，人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因，以读码框一致的方式顺次插入到自带信号肽序列的真核表达载体pEF/myc/ER(Invitrogen，catalog V890-20)中，单域抗体GPAT的编码基因插入到载体的pstI/BamHI位点，由编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A₂分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因、人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因组成的融合基因插入到载体的BamHI和NotI位点。

单域抗体GPAT的编码基因的获得：以表达GPAT的噬菌体(北京表源生物技术有限公司)为模板，以pEF-gpat-sense：(gatctgcaggcgtctgggggaggctt)和pEF-gpat-anti-sense：(ctGGATCCTGAGGAGACGGTGAC)为引物，PCR扩增得到GPAT片段，其两端的酶切位点为pstI/BamHI；将该GPAT片段插入pEF/myc/ER的pstI/BamHI位点，得到pEF-GPAT重组质粒。

pEF-A2TM购自invitrogen，产品目录号为V893-20；pEF-ζ购自invitrogen，产品目录号为V893-20。

myc-a2tm-ζ片段的获得：以pEF-A2TM为模板，用P1和P2引物通过PCR扩增得到myc-a2tm片段。以pEF-ζ为模板，用P3和P4引物通过PCR扩增得到a2tm-ζ片段。以上述两种PCR产物为模板，用P1和P4引物通过重叠PCR扩增得到myc-a2tm-ζ片段。将myc-a2tm-ζ片段通过BamHI和NotI酶切位点插入pEF-GPAT重组质粒，得到pEF-GPAT-ζ重组质粒，该重组质粒中含有GPAT-ζ嵌合抗体基因。

P1：ctggatccgaacaaaaactcatct

P2：ttttctatctgagctcttcctcctccacatcacagcacgcg

P3：aggaagagctcagatagaaaaagagtgaagttcagcaggag

P4：tgacgcggccgcttagcgagggggcag

二、GPAT-ζ嵌合抗体在293T真核细胞中的表达

293T真核细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-11268。

1、用磷酸钙法将pEF-GPAT-ζ重组质粒转入293T真核细胞。

转染前一天，按4x10⁵个细胞/孔，将293T细胞接种到6孔板中。将10μgpEF-GPAT-ζ质粒稀释到50μl双蒸水中，再加入50μl 500mM的氯化钙，混匀。将混合物逐滴加入到等体积的2xHeBs溶液中，混匀。室温温育15分钟后，将沉淀加入细胞中，37℃，温育5小时，换培养基。

2xHeBs溶液：每100ml 2xHeBs溶液中含有Nacl 1.636g，HEPES 1.19g，Na₂HPO₄0.0213g，pH值为7.00。

2、嵌合抗体GPAT-ζ在293T细胞中的表达

转染48小时后，消化转染的293T和对照293T细胞，4℃，300g离心5分钟，将沉淀重悬在裂解缓冲液(0.5％NP40in PBS)中，细胞浓度调整为1x10⁷个细胞/毫升，冰浴10分钟后，13,000rpm，4℃，离心15分钟，吸上清，加入4xSDS上样缓冲液中，94℃加热5分钟。将10μl样本加入10％SDS-PAGE的上样孔中，用抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)做免疫印记检测，检测GPAT-ζ在真核细胞293T中的表达。

实验设3次重复，结果如图5B所示。检测到一条分子量大小为35kDa的蛋白条带(第2泳道)，这与预测的分子量大小不太一致(约为33kDa)，这是由于抗体片段或跨膜区的糖基化造成的。该结果显示嵌合抗体能在真核细胞中成功表达。

三、GPAT-ζ嵌合抗体在NK-92-MI细胞中的表达

NK-92-MI细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-2408。

1、NK-92-MI细胞的基因修饰

用电转染方法将pEF-GPAT-ζ重组质粒转入NK-92-MI细胞。

NK-92-MI细胞用the sysytem进行电转。1.5x10⁶个NK-92-MI重悬在0.1毫升电转缓冲液中，加入4μg pEF-GPAT-ζ质粒，混匀。电转后(电转参数：脉冲电压1000v；脉冲宽度50毫秒；脉冲数1)，将细胞放入1毫升含10％胎牛血清，不含抗生素的1640培养基中，培养48小时后，加入0.6mg/ml的G418，选择正确转入pEF-GPAT-ζ重组质粒的阳性细胞，命名为NK-92MI-GPAT-ζ阳性细胞。

2、富集表达GPAT-ζ嵌合抗体的NK-92-MI细胞

通过FACS分选富集高表达嵌合抗体的NK-92-MI-GPAT-ζ细胞。将1x10⁷G418抵制的NK-92MI-GPAT-ζ细胞重悬在1mlPBS缓冲液中，加入20μg抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，用PBS洗两次，细胞重悬在1mlPBS中，加入20μg FITC标记的山羊抗小鼠的IgG多克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，用FACSCalibur(BD Biosciences)进行分选。

实验设3次重复。结果如图5C-c所示。分选得到的细胞显示了均一的、高水平的GPAT-ζ表达。这些NK-92-MI-GPAT-ζ细胞群体用在接下来的实验中。

3、嵌合抗体GPAT-ζ在NK-92-MI细胞表面的表达

将5x10⁵个NK-92-MI-GPAT-ζ和5x10⁵个NK-92-MI细胞分别重悬在100μl PBS中，加入1μg抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，PBS洗两次后，将细胞重悬在100μl PBS中，加入1μg FITC标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，PBS洗两次，将细胞重悬在500μl PBS中，用GuavaEasycyte mini(Guava Technologies.Inc，CA)流式细胞仪检测表面表达。

将1x10⁶个NK-92-MI-GPAT-ζ和1x10⁶个NK-92-MI细胞分别重悬在100μl PBS中，加入1μg HLA-A₂/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}PE-标记的四聚体(Epigenbiotec)，37℃温育30分钟。PBS洗两次，将细胞重悬在500μl PBS中，用GuavaEasycytemini(Guava Technologies.Inc，CA)流式细胞仪检测表面表达。

实验设3次重复。结果GPAT-ζ嵌合抗体在NK-92-MI细胞表面的表达通过四聚体染色得到证实。多于90％富集的NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异结合可溶性的HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}四聚体(图5C-a)，而不能结合可溶性的HLA-A2/Core_18-27四聚体或HLA-A2/p65_495-503四聚体(图5C-b)；而且，对照NK-92-MI细胞不能结合可溶性的HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}四聚体(图5C-a)，这说明GPAT-ζ嵌合抗体对抗原的结合有特异性。

四、NK-92-MI-GPAT-ζ和NK-92-MI细胞的细胞毒活性

人黑色素瘤细胞Malme-3m购自ATCC，产品目录号HTB64；人黑色素瘤细胞Mel-624(Peter Shamamian，Marie Mancini，Yutaka Kawakami，Nicholas P.Restifo，Steven A.Rosenberg，and Suzanne L.Topal ian.Cancer ImmunolImmunother.1994 August；39(2)：73-83.)中国科学院微生物研究所。

通过以FACS为基础的检测方法分析NK-92-MI-GPAT-ζ和母本NK-92-MI细胞对gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞、p65_495-503肽或Core_18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性。

对于T2细胞的肽脉冲：3x10⁶个T2细胞用PBS洗两次，重悬在0.1ml完全的1640培养基中，分别加入0.01ml 0.2M的gp100_{209-217(IMDQVPESV)(215E)(IMDQVPESV)}或p65_{495-503 (NLVPMVATV)}或Core_{18-27(FLPSDFFPSV)}肽，37℃温育4小时。对于靶细胞的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Sigma-aldrich，st.Louis，MO)染色：2x10⁶个靶细胞(人黑色素瘤细胞Malme-3m，人黑色素瘤细胞Mel-624或T2)或2x10⁶个肽脉冲的T2靶细胞用PBS洗两次，重悬在0.25ml 0.2％BSA/PBS溶液中。将1.5μl 5mM的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯稀释到2.5ml 0.2％BSA/PBS溶液中，混匀。将0.25ml的上述稀释液加入0.25ml的细胞悬液中，混匀，避光，37℃水浴10分钟，期间振摇2-3次，加入0.5ml的胎牛血清终止染色，PBS洗细胞两次，用完全1640培养基重悬靶细胞。调整细胞浓度为1x10⁵个/ml，将靶细胞按照100μl/孔加入96孔圆底聚苯乙烯板中，自发释放孔再加入100μl完全1640培养基，实验组再分别加入100μlNK-92-MI效应细胞或NK-92-MI-GPAT-ζ效应细胞。每种效应细胞设置6个不同的效靶比32∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1和1∶1。将细胞混匀，300g离心5分钟，37℃，5％CO₂温育4小时。温育后，将细胞悬液转移到1.5ml的小离心管中，混匀，加入1μl 1mg/ml的碘化丙啶(Sigma-aldrich，st.Louis，MO)，冰上放置3分钟后加入100μl完全1640培养基，用Guava Easycyte mini(Guava Technologies.Inc，CA)检测荧光强度。同时，设置仅含靶细胞或效应细胞的对照管。5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和碘化丙啶双阳性的细胞为死亡的靶细胞。杀伤率的计算公式：5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和碘化丙啶双阳性的细胞数/5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯单阳性的细胞数。

实验设3次重复。

检测NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞、p65_495-503肽或Core_18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性的实验结果表明，仅gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞能被NK-92-MI-GPAT-ζ细胞裂解，而p65_495-503肽或Core_18-27肽脉冲的T2细胞都不能被NK-92-MI-GPAT-ζ细胞裂解(图6，1表示gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}肽脉冲的T2细胞，2表示p65_495-503肽脉冲的T2细胞，3表示Core_18-27肽脉冲的T2细胞)。对照NK-92-MI细胞不能裂解任何一种肽脉冲的T2细胞。以上结果显示，GPAT-ζ嵌合抗体能特异识别并激活NK-92-MI细胞对表达HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}的靶细胞的杀伤活性。

检测NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对人黑色素瘤细胞Malme-3m、Mel-624或T2细胞的杀伤活性的实验结果表明，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异裂解表达HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的Malme-3m或Mel-624细胞，而不能裂解HLA-A2⁺/gp100^-的T2细胞(图7，1表示人黑色素瘤细胞Malme-3m，2表示人黑色素瘤细胞Mel-624，3表示T2细胞)。以上结果显示，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异杀伤自然呈递HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的黑色素瘤细胞。

五、NK-92-MI-GPAT-ζ和NK-92-MI细胞的体内抗肿瘤活性

雄性bablc nu/nu裸鼠(4-6周龄)购自北京大学医学部实验动物中心。

将右腋接种1x10⁷个Malme-3m肿瘤细胞的裸鼠任意分组，每组6只，再用NK-92-MI-GPAT-ζ细胞加以治疗，记录肿瘤体积，记录天数为32天。具体方法为：将Malme-3m细胞(1x10⁷个/0.2ml PBS)注射到裸鼠的右腋皮下(第0天)，NK-92-MI或NK-92-MI-GPAT-ζ细胞(5x10⁷个细胞/注射/0.2ml PBS)或对照PBS在第1天和第5天注射到相同的位置。肿瘤直径每周观察两次，肿瘤体积根据下面的公式计算：肿瘤体积＝长x(宽)²x 0.5。组间统计学差异通过双尾Student’s t检验评价。当肿瘤直径达到3.0cm时，将所有小鼠杀死。P＜0.05被认为具有显著统计学差异。

实验设3次重复。结果如图8所示(1表示NK-92-MI-GPAT-ζ细胞实验组，2表示NK-92-MI细胞对照组，3表示PBS对照组)，表明，与PBS对照组相比，NK-92-MI细胞治疗组没有显著的抑瘤作用(P＞0.05)。相反，与对照组相比，NK-92-MI-GPAT-ζ治疗组能显著抑制肿瘤的生长(P＜0.05)。与NK-92-MI治疗组相比，在治疗的晚期(第22到第32天)，NK-92-MI-GPAT-ζ治疗组显示了明显的统计学差异(P＜0.05)(图8)。以上结果显示，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能有效减慢表达HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的肿瘤在小鼠体内的生长，即NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能在体内杀伤呈递HLA-A2/gp100_{209-217(215E)(IMDQVPESV)}复合物的肿瘤。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种嵌合抗体及免疫细胞

<160>8

<210>1

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1               5                   10                  15

Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Asp Ala Met Ala Trp Phe

            20                  25                  30

Arg Gln Thr Arg Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg

        35                  40                  45

Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Tyr

                85                  90                  95

Trp Arg Gly Ser Tyr Tyr Thr Glu Gly Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Arg Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1               5                   10

<210>3

<211>50

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile

1               5                   10                  15

Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile

            20                  25                  30

Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp

        35                  40                  45

Arg Lys

    50

<210>4

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1               5                   10                  15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

            20                  25                  30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

        35                  40                  45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

    50                  55                  60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65                  70                  75                  80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

                85                  90                  95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

            100                 105                 110

Arg

<210>5

<211>360

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gcgtctgggg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct    60

ggacgcacct tcaatgtcga tgccatggct tggttccgcc agactcgcgg gaaggagcgt    120

gagtttgtag cagctattag ccggagtggt ggtagcacgt actatgcaga ctccgtgaag    180

ggccgattca gcatctccaa agacaacgcc aaaaacacga tgtatctgca aatgaacagc    240

ctcaaacctg aggacacggc catttattac tgtgcagctg caatctactg gcgtggtagt    300

tactacactg aaggcaacta tgactactgg ggccagagga cccaggtcac cgtctcctca    360

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaacaaaaac tcatctcaga  agaggatctg                                     30

<210>7

<211>150

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc    60

atcattgctg gcctggttct ctttggagct gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg    120

atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa                                     150

<210>8

<211>339

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc    60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc    120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac    180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag    240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac    300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc                           339

Claims (12)

1.一种嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述跨膜区片段为HLA-A₂分子的跨膜区片段；所述胞内区片段为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。

2.一种嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、标签、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述跨膜区片段为HLA-A₂分子的跨膜区片段；所述胞内区片段为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段；所述标签为Myc标签。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于：所述HLA-A₂分子的跨膜区片段的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

4.根据权利要求2所述的嵌合抗体，其特征在于：所述Myc标签的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述HLA-A₂分子的跨膜区片段的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

5.一种单域抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

6.表达权利要求1-5中任一所述抗体的免疫细胞。

7.权利要求5所述单域抗体或权利要求1-4中任一所述嵌合抗体的编码基因。

8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于：

权利要求5所述单域抗体的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

权利要求2或4所述嵌合抗体中所述Myc标签的编码基因为序列表中序列6所示的DNA分子；

权利要求1-4中任一所述嵌合抗体中所述HLA-A₂分子的跨膜区片段的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

权利要求1-4中任一所述嵌合抗体中所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子。

9.含有权利要求8所述编码基因的重组载体。

10.含有权利要求8所述编码基因的重组菌。

11.含有权利要求8所述编码基因的转基因细胞系。

12.含有权利要求8所述编码基因的表达盒。

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