具体实施方式:
实施例1、A21单链抗体(A21ScFv)的构建
单链抗体构建流程如图1所示:从杂交瘤细胞中抽提出总RNA;采用反转录(RT)和聚合酶链扩增反应(PCR)结合的方法,分别获得抗体轻链和重链可变区(VL和VH)的基因,并对克隆的基因序列进行测定;在序列测定的基础上,合成用于构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点;通过片段重叠延伸PCR即SOE-PCR方法将重链和轻链可变区通过一个连接肽linker连接起来,重组形成VL-linker-VH形式的单链抗体片段;然后,片段被双酶切回收并且与同样用双酶切处理的名为pCANTAB 5E的载体(phagemid)连接,构建成可表达重组单链抗体的表达质粒;将重组质粒转染大肠杆菌,通过活性检测筛选出单链抗体表达阳性的菌株。
具体实验步骤如下:
1.1杂交瘤细胞总RNA的提取:
1)培养足够数量(10×106以上)的、用细胞表面表位包埋法制备的、可分泌特异性抗p185抗体的杂交瘤细胞A21(可参见《中国免疫学杂志》2000,10:539-546),按上海维特洁公司生产的总RNA提取试剂盒所述的步骤,提取细胞的总RNA,最终反应产物100微升,取5-10微升,按通常使用的RNA电泳分析方法检测提取的RNA,其余置于-70℃备用。检测合格后进入下一步试验。
1.2反转录-聚合酶链扩增(RT-PCR):
1.2.1引物设计
a.C端反转录(RT)引物设计:
本发明中的反转录引物的设计没有采用polyT引物,而是根据小鼠抗体恒定区5’端的保守的序列设计引物,这样可以保证能获得完整的可变区C端的cDNA序列。
反转录重链cDNA的引物Cγ设计为:5’GGGGCCAGTGGATAGAC 3’
反转录轻链cDNA的引物Cκ设计为:5’GTTGGTGCAGCATCAGC 3’
这两个反转录引物同时也作为下一步构建单链抗体时PCR扩增反应的C端引物使用。
b.N端简并引物(即不含有信号肽引物)的设计:
由于载体要求基因本身不含信号肽,为了适应这种载体,需设计N端不含信号肽的可变区PCR引物,而由于抗体可变区N端的多样性,在抗体基因序列未知的情况下,本方法设计了几种简并性引物,即:
VH:5’CCG
GAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC 3’(下划线处为EcoRI位点)
VC:5’GGA
GAATTCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC 3’
VL:5’AGG
GAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA 3’(下划线处为SacI
位点)
VLC:5’GGT
GAGCTCGTTGGTGCAGCATCAGCCCG 3’(其中K=G/T,M=A/C,
N=A/T/G/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T,Y=C/T)
T-pseu:5’AGTGTCAGTACATCTGGCTA 3’
其中VH、VC为重链引物,VL、VLC为轻链引物
1.2.2.反转录反应(RT反应物):
以提取的总RNA为模板,采用1.2.1a中设计的C端反转录引物,按常规方法进行反转录反应,获得50微升产物cDNA,此即为用于抗体基因PCR扩增反应的模板cDNA。
1.2.3 PCR扩增反应(注:重链和轻链除引物不同外,反应步骤均相同)
1)在PCR管中混合如下反应物:1微升反转录反应产物,5微升10×pfu Buffer,1微升pfu酶,重链或轻链N端和C端引物各1微升(25微摩尔浓度),2mM dNTP,补水至50微升,混匀后用石蜡油封顶;
2)PCR仪上将反应程序设为:94℃5分钟变性后,94℃、55℃各1分钟、72℃2分钟进行30轮循环,然后72℃10分钟延伸;
3)取PCR反应物5微升走1%琼脂糖电泳,观察结果:如果重链没有扩增出来,则采用下列措施:换酶为Taq酶,退火温度降为45℃,进行第一轮PCR,如无明显带出现则取2.5微升第一轮PCR反应物进行同样条件的第二轮扩增;
4)回收目的DNA:取余下的所有PCR反应物在琼脂糖凝胶上电泳,观察结果,按上海生工公司的凝胶回收试剂盒的方法进行切胶,回收目的DNA条带中的DNA;其中1-2微升继续5)所述的作序列分析,其余回收的DNA待5)的序列分析
结果正确后,按1.3所述进行下一步实验。
5)将回收的1-2微升重链或轻链PCR扩增产物分别用其相应的限制性内切酶处理,获得的重链或轻链可变区基因分别与用同样限制性内切酶处理的pGEM-T载体或pBluescript载体DNA作常规的连接反应,将连接的产物转化感受态大肠杆菌Top10细胞,全部菌液铺氨卞青霉素平板,放入37℃过夜培养。随机挑选平板上独立生长的单菌落,转入3ml LB(含氨卞青霉素)培养基中振摇,依照常规分子生物学操作法抽提质粒,经酶切鉴定后,将含有重链或轻链可变区基因的阳性质粒送往上海生工公司测序。
1.3片段重叠延伸PCR(SOE-PCR)搭建单链抗体
根据以上序列测定结果,设计构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点;通过片段重叠延伸PCR即SOE-PCR方法将重链和轻链可变区通过一个连接肽linker连接起来,重组形成VL-linker-VH形式的单链抗体片段;
1.3.1引物:
根据以上序列测定结果,设计构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点,对进一步扩增A21重链和轻链以及加一段寡核苷酸序列分别设计的引物为:
VLBack:5’AGCCGGCCGAYATTGTGMTSACCCAAACTCCA 3’
VLFor:5’GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACC
ACCCCGTTTGATTTCCAGCCTGG 3’
VHBack:5’GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTCCAGCTGCA
GCAGTC 3’
VH For:5’AGGATTC
GCGGCCGCTGACGAGACGGTGACTGAGGT 3’
Sc Back:5’AAGGAA
GGCCCAGCCGGCCGAYATTGTG 3’
Sc For:5’AGGATTC
GCGGCCGCTG 3’(下划线处为SfiI和NotI位点,其中K=G/T,M=A/C,N=A/T/G/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T,Y=C/T)
(注:Back表示“上游”、For表示”下游”)
1.3.2将重链和轻链加上一段寡核苷酸linker的PCR反应
1)在PCR管中混合如下反应物:1微升模板DNA(即1.2中已克隆入质粒的抗体重链、轻链可变区基因),5微升10×PCR Buffer,1微升Taq酶,Mg2+溶液3微升,上、下游(即Back和For)引物各1微升(25微摩尔浓度),5微升dNTP,补水至50微升,混匀后用石蜡油封顶;
2)在PCR仪上将反应程序设为:94℃3分钟变性后,94℃、58℃、72℃各1分钟进行30轮循环,然后72℃10分钟延伸;
3)取PCR反应物5微升走1%琼脂糖电泳,观察结果,确定已形成了VL-linker和linker-VH形式的DNA片段,切胶法回收目的DNA条带中的DNA,用于下一步重链和轻链可变区基因连接PCR:
1.3.3.剪切重叠延伸PCR(Splice Overlaping Extend PCR即SOE-PCR),即重链轻链可变区基因连接的PCR:
4)按以下配方加入各反应物:去离子水73微升,dNTP 10微升,10×pfu Buffer 10微升,上、下游引物各4微升,(注意引物10轮循环后才加入),模板(上一步PCR所得的重链和轻链)各1微升,pfu酶1微升;
5)第一步反应条件如下:94℃3分钟变性,然后92℃1分钟、72℃3分钟进行10轮循环,之后加入引物(Sc Back、Sc For);
6)第二步反应条件如下:92℃1分钟、66℃1分钟、72℃2分钟进行30轮循环,随后72℃延伸10分钟;
7)跑电泳,将预计为产物VL-linker-VH的单链抗体片段DNA通过切胶法回收。
1.4分泌型单链抗体的克隆:
使用噬菌体质粒(phagemid)pCANTAB 5E作为单链抗体克隆的载体,单链抗体可在分泌到细菌细胞的周质腔,便于抽提和纯化。具体实验步骤为:
1)对回收的单链抗体DNA片段采用SfiI、NotI双酶切,注意SfiI的酶切温度与NotI不同所以要分别去做,酶切产物切胶回收后与同样双酶切的pCANTAB 5E载体连接,转化大肠杆菌HB2151,通过氨卞青霉素(Amp)板筛选重组子。
2)单菌转入3ml 2×YT-AG(2×YT含100微克/ml氨卞青霉素和2%葡萄糖)中,30℃250rpm摇过夜;
3)将全部3ml过夜菌加入30ml 2×YT-AG,30℃250rpm摇1小时;
4)1500g离心20分钟,弃去上清;
5)重悬细胞于30ml 2×YT-AI(含1mM的IPTG),30℃250rpm摇3小时;
6)1500g离心20分钟,弃去上清;
7)用0.3ml冰预冷1×TES(0.2MTris·HCl pH8.0,0.5mMEDTA,0.5M蔗糖)悬浮细胞,加0.45ml冰预冷0.2×TES混匀,冰上放30分钟,其间不时摇动;
8)12000g离心10分钟,上清为菌株周质腔抽提物,用于作表达蛋白即单链抗体的检测,将其转入一干净Ep管中,-20℃保存。
1.5酶联免疫分析(ELISA)法对可表达活性蛋白的菌落筛选:
a.T6-17(转p185基因的NIH3T3细胞,其表面高表达p185抗原)和NIH3T3细胞(表面不表达p185抗原)裂解液的制备:
1)T6-17、NIH3T3细胞传代至瓶中长满;
2)吸去上清,PBS洗去血清,对100ml培养瓶加入40微升PMSF、500微升细胞裂解液(50mM Tris-HCl(pH7.5),1%Triton X-100,150mM NaCl),冰浴30分钟,其间不时摇匀之;
3)吹打瓶底,吸出裂解液至5ml离心管中,13000rpm4℃离心10分钟;
4)吸上清,即为抗原裂解液,每管50微升分装,放于-70℃保存之。
b.ELISA实验:
1)将鼠源抗体A21作为标准抗体对照,取抗原裂解液倍比稀释多个浓度后100微升/每孔铺板(抗原稀释液为0.05MNaHCO3(pH9.0)),加100微升标准抗体,(0.1微克/ml),做ELISA反应,摸索一个抗原抗体反应的最适抗原裂解液浓度;
2)取最适浓度抗原裂解液100微升/每孔铺板,4℃放置过夜;
3)取出板平衡至室温,TPBS(PBS加入Tween至0.05%)洗三次;
4)加入TPBS稀释的1%BSA,350微升/每孔,室温下封闭1小时;
5)TPBS洗三次,加入100微升/每孔的待测样品,室温振荡1小时或4℃过夜反应;
6)TPBS洗三次,加入封闭剂稀释的二抗100微升/每孔,室温下振荡反应1小时;
7)TPBS洗三次,按100微升/每孔加入浓度为1微克/微升的OPD底物(OPD Buffer配方:18g Na2HPO4,5g柠檬酸,加水至1升),室温反应15-30分钟;
8)每孔加入100微升1M H2SO4终止反应,在ELISA仪上OD490nm测吸收值,上清显示与阳性抗原T6-17细胞裂解物有明显的颜色反应、而与阴性对照NIH3T3细胞裂解物无颜色反应的菌株即为阳性克隆菌株。
1.6单链抗体表达阳性菌株的筛选结果:
a.A21单链抗体表达阳性菌株的筛选结果
对将近100个不同的转染的大肠杆菌挑单菌落进行了诱导表达,然后又分别抽提周质腔分泌物,进行ELISA检测,有三株样品显示了明显的阳性反应,即这三株菌分泌的到周质腔的单链抗体具有特异结合p185抗原的活性。单独取这三株菌株,经常规方法IPTG诱导表达后,再提取周质腔分泌物,进行ELISA法测定,以OD490nm吸收值对样品编号作图,结果如图2,即筛选的三株A21单链抗体阳性菌株周质腔抽提物的酶联免疫分析(ELISA)结果直方图:编号1、2为第一号菌株,编号3、4为第二号菌,编号5、6为第三号菌;编号1、3、5样品用T6-17裂解液测试,编号2、4、6样品用NIH3T3裂解液测试。从图中可见,其中第二号株菌有最强的抗原结合反应,在100微克/ml抗原浓度时吸收峰达到0.75左右,取第二号菌株(命名为pChar)进行序列测定。
b.A21单链抗体的序列测定结果:将菌株pChar中的质粒抽提纯化后,进行了序列测定,获得的基因序列即为A21单链抗体的基因序列,即:
GACATTGTGCTGACCCAAACTCCATCCTCCCTACCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTT
ACTATGACCTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTAC
TTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTCCTGGGC
ATTCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAG
ATTTCACTCTCACCATCGGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTC
AGCAATATTCTAACTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAGGCTGGAAATCAAA
CGGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTG
GTGGATCCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTAGTGAAGACTGGGGC
TTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTTACTTCATAAAC
TGGGTCAAGAAGAACTCTGGAAAGAGCCCTGAGTGGATTGGACACATTAGTTCTTC
CTATGCTACCTCTACCTACAACCAGAAGTTTAAAAACAAGGCCGCATTTACTGTAGA
CACATCCTCCAGCACAGCCTTCATGCAGCTTAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTG
CAGTCTATTATTGTGTTAGAAGTGGTAACTACGAAGAATATGCTATGGACTATTGGGG
TCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGTCA
由该基因序列推导的A21单链抗体的氨基酸序列为:
VL
D I V L T Q T P S S L P V S V G E K V T
M T C K S S Q T L L Y S N N Q K N Y L A
W Y Q Q K P G Q S P K L L I S W A F T R
K S G V P D R F T G S G S G T D F T L T
I G S V K A E D L A V Y Y C Q Q Y S N Y
Linker
P W T F G G G T K L E I K
R G G G G S G
VH
G G G S G G G G S G G G G S E V Q L Q Q
S G P E V V K T G A S V K I S C K A S G
Y S F T G Y F I N W V K K N S G K S P E
W I G H I S S S Y A T S T Y N Q K F K N
K A A F T V D T S S S T A F M Q L N S L
T S E D S A V Y Y C V R S G N Y E E Y A
M D Y W G Q G T S V T V S S
其中的黑体部分为重链和轻链的抗原结合区,下划线部分为重链和轻链可变区之间的连接区(linker)。
实施例2、scFv-Fc嵌合抗体分子的构建和表达:
本实施例所述抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体scFv-Fc的构建,是将已经实验证明与p185抗原能特异结合的单链抗体scFv与人抗体IgG1(hu IgG1)的恒定区Fc通过基因操作连接,形成一条重组的单链的抗体融合基因,即嵌合抗体基因scFv-Fc,将基因先克隆到瞬时表达载体pSecTag并转染到瞬时表达细胞COS7中,测定瞬时表达的嵌合抗体蛋白,确定其具有与p185抗原特异结合的活性后,再将融合基因A21scFv-hu IgG1Fc即scFv-Fc基因克隆到含谷氨酰胺合成酶GS基因的pEE14载体质粒DNA中,然后转染哺乳动物细胞CHO,通过不断增加培养细胞体系中甲硫氨酸硫氧化胺(methioninesulfoximine MSX)的浓度,筛选出能高表达抗肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的细胞株。
具体实验步骤:
2.1A21嵌合抗体scFv-Fc分子的构建:
2.1.1.引物设计:
pEE14 IgG1:5’GGG
AAGCTTATGGAGACAGACACACTCCT 3’(下划线处为
HindIII位点)
IgHinge B:5’GGG
GCGGCCGCAGAGCCCAAATCTFGTGACAAA 3’(下划线处
为NotI位点)
IgCH3F:5’GGG
GAATTCTCATTTACCCGGAGACAG 3’(下划线处为EcoRI位
点,斜体处为中止密码子)
2.1.2.scFv-Fc嵌合抗体基因的构建及克隆:
图3为嵌合抗体基因瞬时表达质粒构建流程图:从已证明可表达具有良好结合抗原活性单链抗体的菌株如实施例1中的pChar中提取质粒DNA,采用双酶SfiI和NotI酶切,从该表达质粒中将单链抗体基因scFv切出来;与此同时,用一对引物IgHinge B和IgCH3F从含有人抗体IgG1基因的质粒中扩增出人抗体Fc片段huIgG1 Fc,并且用合适的的双酶切处理;然后,将双酶切的单链抗体scFv和Fc以及瞬时表达载体pSecTag进行三片段连接(linkage),使前两者连接成为scFv-Fc形式的嵌合抗体分子基因,最后测序确定该基因的序列。由于载体上已经有自带信号肽序列,所以可将此重组质粒DNA转染COS-7细胞,然后检测转染细胞scFv-Fc基因的表达和活性。
基因构建和克隆过程涉及的所有PCR、酶切、连接、转化、测序等反应均在前面实施例1中已经阐述,在此不一一重复。
2.1.3 A21嵌合抗体基因结构及序列:
图4给出了A21嵌合抗体基因结构示意图:它表示嵌合抗体基因是由A21单链抗体基因scFv和人抗体IgG1恒定区Fc(Fc即图中的CH2和CH3基因,又称huIgG1Fc片段)两部分组成,两段基因中间靠一段称为hinge的片段连接,它含有三个编码半胱氨酸的密码子序列,这使得scFv-Fc基因在真核细胞表达过程中,在两条嵌合抗体的单链之间可通过半胱氨酸两两配对,形成三对二硫键,从而保证最终表达产物是以同源二聚体形式存在。
该嵌合抗体基因(scFv-Fc)的全基因序列如下:
GACATTGTGCTGACCCAAACTCCATCCTCCCTACCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAC
CTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGC
AGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTCCTGGGCATTCACTAGGAAATCTGGGGTCCC
TGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGGCAGTGTGAAGGCT
GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTCTAACTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCAC
CAGGCTGGAAATCAAACGGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTC
CGGTGGTGGTGGATCCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTAGTGAAGACTGGGGC
TTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTTACTTCATAAACTGGGTCAA
GAAGAACTCTGGAAAGAGCCCTGAGTGGATTGGACACATTAGTTCTTCCTATGCTACCTCTACCT
ACAACCAGAAGTTTAAAAACAAGGCCGCATTTACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTTCAT
GCAGCTTAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTGTTAGAAGTGGTAACTACG
AAGAATATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGTCA
GCGGCCGCAGA
GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG
ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG
GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG
GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC
CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA
AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC
CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCA
GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC
TATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
以上基因序列中有下划线的部分即为hinge片段的序列,黑体为编码半胱氨酸的密码子,在hinge片段之前为ScFv的基因,在其之后为Fc的基因。
2.2 A21嵌合抗体的COS-7细胞瞬时转染与表达:
具体步骤为:
1)在一个6孔细胞培养板内,培养COS-7细胞至40-60%密度;
2)在12×75mm灭菌管中制备如下溶液:
A:对每个转化孔,稀释1微克含scFv-Fc基因的瞬时表达重组pSecTag质粒DNA入100微升无血清培养基,
B:对每个转化孔,稀释5微升脂质体lipofectin入100微升无血清培养基,然后室温下放置45分钟;
3)合并A、B液,混匀之,室温放置15分钟;
4)用2ml无血清培养基洗涤6孔板中细胞一次;
5)对每孔加0.8ml无血清培养基入lipofectin-DNA复合物,混匀后倒入细胞内;
6)37℃CO2培养箱培养12-18小时后,用2ml正常血清培养基替换含DNA培养基,继续培养48-72小时;
7)吸取瞬时转染COS-7细胞上清,对分泌到上清的表达的嵌合抗体进行结合活性检测,检测方法放在下面的实施例3中说明,检测结果可表明表达的嵌合抗体结合抗原活性好,可以进入下一步稳定转染。
2.3 A21嵌合抗体的CHO细胞稳定转染和筛选:
在上一步瞬时转染COS-7细胞、并证明转染细胞表达出的嵌合抗体分子scFv-Fc具有结合抗原活性的基础上,设计新的N端引物,从N端信号肽开始扩增,从而获得N端带有信号肽的scFv-Fc基因;将此重组基因双酶切,然后与同样双酶切的稳定表达载体pEE14进行连接,最终构建成真核稳定表达重组质粒scFv-Fc/pEE14,并转化哺乳动物CHO K1细胞(简称CHO细胞),通过增加细胞培养基中甲硫氨酸硫氧化胺(methioninesulfoximine MSX)的浓度,筛选出能高表达scFv-Fc嵌合抗体的细胞株。
具体实验步骤如下:
1)转染的前一天,每孔2ml正常DMEM加血清,培养CHO K1细胞于6孔板中至60-70%密度;
2)转染前,在12×75mm灭菌管中制备如下溶液:
A:对每个转化孔,稀释1微克含scFv-Fc基因的重组稳定表达pEE14质粒DNA入100微升vv无血清培养基,
B:对每个转化孔,稀释5微升脂质体(LipofectAMINE 2000)入100微升无血清培养基,然后室温下放置5分钟;
3)合并A、B液,混匀之,室温放置20分钟,倒入细胞培养孔内,温和晃动混匀;
4)转染24小时后,用选择性培养基(不含谷氨酰胺的DMEM)加透析的小牛血清和终浓度至25微摩尔的MSX(methionine sulfoximine),替换转染时用的培养基,继续培养之;
5)大约4-5天后换一次选择性培养基,这时大部分细胞死亡,继续培养到直至可见的细胞克隆出现,此过程一般需2-3周左右;
6)挑取单个细胞克隆,转移至96孔板中继续用选择性培养基培养,待细胞长满后取上清进行ELISA测定抗体的表达量(方法见2.5),阳性克隆可以进一步加压(即提高MSX浓度)筛选;
7)对首轮96孔板中筛选获得的阳性克隆转到6孔板培养,先用不含MSX的选择性培养基培养24小时;
8)替换培养基为逐渐增加MSX浓度(终浓度100、250、500、1000微摩尔)的选择性培养基,又会有大部分细胞死亡,继续培养到直至可见的细胞克隆出现,每次克隆细胞均约生长2-3周;如前挑取可见克隆,测定上清表达量后进行下一轮加压筛选;
9)待MSX升至1mM浓度后,不再增加MSX浓度,对长出的克隆进行有限稀释法亚克隆,选择抗体产量最高的细胞株进行扩大化培养。
2.4 CHO细胞稳定转染和筛选表达的结果:
经过5轮加压,不断挑取单克隆进行亚克隆和下一轮的筛选过程,最终细胞在高达1mM浓度的MSX中生长,此时检测抗体表达量,并筛选出了约30个高表达量的单克隆细胞株,它们的表达量在10-200微克/ml(累积表达量)不等,最高的达到200微克/ml。我们选取了三株表达量最高且稳定的细胞株,分别命名为Nu3、Oa4、Yg1,作为未来进行规模化扩大培养的种子株。
2.5捕获(capture)ELISA法测定抗体的表达量:
1)用PBS稀释羊抗人Fc多抗(Fizegiald公司产品)至10微克/ml,每孔100微升铺板,室温振荡3小时;
2)加入封闭剂(1%BSA溶于TPBS)350微升/孔,室温放置1小时;
3)TPBS洗三次,加入待测细胞表达上清100微升,室温振荡1小时,注意要将标准人IgG1(Sigma公司产)从0.1微克/ml倍比稀释作为标准含量对照;
4)TPBS洗三次,加入1∶8000稀释的HRP标记羊抗人Fc多抗(Pirece公司产品)100微升,室温振荡1小时;
5)TPBS洗三次,如前所述用OPD底物显色;
6)与标准人IgG对照相对比,找出所测样品对应的人IgG1含量,乘以2/3,即为所测的样品绝对含量。
2.6嵌合抗体的protein-G柱亲和纯化:
1)将稳定转染筛选出的细胞表达上清用0.22微米的滤膜过滤,以除去不溶性颗粒;
2)过滤液采用millipore超滤膜(截留分子量>10kDa的蛋白)超滤之,浓缩度为10倍;
3)采用分子量3000型透析袋透析样品,用结合缓冲液Binding Buffer(20mMNa3PO4,pH7.0)为透析液;
4)准备好收集过柱样品的Ep管,每个Ep管内加入中和缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH9.0)100微升;
5)用10倍柱体积Binding Buffer洗protein-G柱,流速1ml/分钟;
6)将样品过柱,流速同前;
7)用10倍柱体积Binding Buffer洗柱去除未结合蛋白;
8)用10倍柱体积洗脱缓冲液Elution Buffer(0.1M甘氨酸-HCl,pH2.7)洗脱结合的蛋白,用准备好的Ep收集管收集之,注意每管收集900微升洗脱样品;
9)用10倍柱体积Binding Buffer洗去protein-G柱内的Elution Buffer;将柱子保存在20%的乙醇中,4℃放置保存;
10)收集的样品取少量走SDS-PAGE电泳,观察纯化结果,其余全部放-20℃,用于生物活性测定。
2.7protein G亲和层析柱纯化结果:
图5给出了亲和层析柱纯化后样品的电泳图,图中Lane7:过柱后的表达上清;Lane8:过柱前的表达上清;Lane9:亲和柱洗脱样品;Lane10:巯基乙醇处理的亲和柱洗脱样品。
电泳结果表明,CHO细胞表达的上清样品经超滤和过亲和层析柱后,大量牛血清白蛋白被分离出去:过柱前的样品(Lane8)在50kDa处有大量牛血清白蛋白,与过柱后样品(Lane7)相比较,在105kDa处有一条清晰的条带,该条带在纯化的样品(Lane9)中被大量富集,且分子量大小与估算完全一致,另外,加巯基乙醇处理纯化的嵌合抗体,则在约55kDa处出现条带(Lane10),说明纯化的样品被解链前是以同二聚体结构存在,被巯基乙醇解链成为两个单体,故可以断定,这就是我们表达的嵌合抗体。
实施例3、scFv-Fc嵌合抗体分子的活性鉴定
实验步骤:
3.1嵌合抗体抗原结合活性的ELISA鉴定实验:
该实验与实施例1的1.5中单链抗体的ELISA实验步骤基本相同,所不同的是将二抗变为羊抗人辣根过氧化酶(goat-anti-human HRP)二抗。
3.2嵌合抗体的抗原结合特性ELISA分析结果:
图6给出了嵌合抗体抗原结合活性ELISA分析结果直方图,图中a和b:含A21ScFv-Fc的pSectag重组载体转染COS-7的上清(a的包被抗原是T6-17细胞裂解物,b的包被抗原是NIH/3T3细胞裂解物);c和d:单独pSectag载体(即不含A21 ScFv-Fc)转染COS-7的上清(c的包被抗原同a,d的包被抗原同b)。由该图结果可以很明显地看出:只有表达的嵌合抗体对含p185抗原的T6-17细胞裂解物有特异的免疫学结合活性,说明scFv-Fc结构能够很好的维持其亲代鼠源单抗A21对p185抗原的特异性抗原结合活性,这个分子设计和构建是成功的。
由于在真核COS-7细胞中能够成功的表达出具有免疫学活性的重组嵌合抗体分子,所以才确定在CHO细胞中建立稳定表达体系。在CHO细胞中表达出来的嵌合抗体经ELISA分析,结果也确与COS-7细胞中表达的结果基本相同。
3.3抗原结合竞争性抑制反应:
该实验是为了进一步验证表达的嵌合抗体是否能保持其亲代鼠源单抗A21相同的特异性抗原结合表位,具体实验步骤为:
1)用最适的抗原浓度包被ELISA,放置于4℃过夜;
2)TPBS洗三次,每孔350微升封闭剂(TPBS配制的1%BSA)封闭1小时;
3)TPBS洗三次,加入100微升连续10倍稀释的待测抗体和最佳浓度的被竞争抗体混合物,振荡反应过夜;
4)TPBS洗三次,加入针对待测抗体的HRP标记二抗100微升反应1小时;
5)再次洗涤后,用OPD如前所述显色,ELISA仪上490nm测吸收;
6)ELISA结果绘制成竞争抑制曲线。
3.4竞争性抑制反应实验结果:
图7为嵌合抗体与两种单抗的竞争性抑制反应曲线图:从竞争性抑制反应曲线上可以看出:鼠源单抗A21对A21嵌合抗体与p185的结合有竞争性抑制作用,随单抗的浓度不同抑制强度有所不同,呈现剂量依赖性趋势;与之对照,另一同样结合p185胞外区的鼠源单克隆抗体A18则对嵌合抗体与抗原的结合没有竞争性抑制反应,即使提高A18浓度,抑制率也未见增加,即A21嵌合抗体ScFv-Fc与鼠源单抗A21有相同的抗原结合表位。
3.5嵌合抗体的免疫印迹实验(western blot实验):
方法与常规的免疫印迹实验方法基本相同,其中聚丙烯酰胺凝胶采用8%浓度,转膜后二抗为羊抗人HRP标记二抗。
3.6western blot实验鉴定结果:
图8为嵌合抗体的免疫印迹实验结果;图中Lane11:人IgG1对照;Lane 12:纯化后的嵌合抗体;Lane 13:巯基乙醇处理后的纯化抗体。
从western blot的结果可以明显看出,我们表达的嵌合抗体分子量大约在105kDa左右,和估算的相符,而人抗体对照为150kDa。由于用还原性试剂处理后分子量降为55kDa左右,约为嵌合抗体分子量的一半,所以我们可以得出结论,嵌合抗体是一个同二聚体的结构。其结构示意图如图9所示:两个scFv-Fc单体通过铰链区的三对二硫键被共价连接到一起,形成了与IgG1抗体类似的二价抗体结构。
3.7细胞免疫组化实验:
与常规的免疫组化分析方法基本相同。不同之处是用了两组细胞片:一组为T6-17(表面高表达p185,为阳性细胞)和NIH3T3(为阴性细胞),另外一组为人乳腺癌细胞MCF7(阴性)和SKBR3(阳性);此外,二抗采用羊抗人HRP标记的二抗。
3.8细胞免疫组化分析结果:
图10-13为嵌合抗体分子抗原结合活性的细胞免疫组化分析照片。图10为T6-17细胞与嵌合抗体反应后染色的结果;图11为NIH3T3细胞与嵌合抗体反应后染色的结果;图12为SKBR3细胞与嵌合抗体反应后染色的结果;图13为MCF7细胞与嵌合抗体反应后染色的结果。
如前所述,T6-17是表面高表达p185的细胞而NIH3T3细胞不是:SKBR3与MCF7细胞则均为人乳腺癌细胞,不同之处是前者表面高表达p185,后者则表达量很低。从这四种细胞的免疫组化照片结果上看,与嵌合抗体反应后,T6-17和SKBR3细胞的细胞膜上都有很明显的染色,而其胞质部分及NIH3T3和MCF7细胞基本上看不到染色,说明嵌合抗体分子是与细胞膜抗原特异结合的。
3.9MTT法测定嵌合抗体对肿瘤细胞生长抑制活性实验:
实验步骤:
1)胰酶消化SKBR3细胞后计数,用1640培养基稀释至2×105个/ml;
2)每孔100微升将细胞加入96孔培养板中,37℃培养24小时;
3)每孔加入不同稀释度的待测嵌合抗体100微升,继续培养48小时;
4)每孔加MTT(用PBS培成5mg/ml)10微升,继续培养4小时;
5)小心吸去上清,每孔加入100微升DMSO,振荡混匀之,在ELISA仪上570nm处测吸收值;
6)按以下公式计算抗体的抑制率:[(不加抗体对照OD-加抗体样品OD)/(不加抗体对照OD-不加MTT样品OD)]×100%。
3.10MTT法测定实验结果:
图14为MTT法测定A21嵌合抗体的肿瘤细胞生长抑制活性结果直方图,(每个样品均不少于5个复孔),SKBR3和MCF7均为每孔2×104个细胞;其中A:SKBR3不加抗体;B:SKBR3加入抗体至6微克/ml;C/D/E:SKBR3加入抗体至0.7/0.07/0.007微克/ml;G:MCF7不加抗体;H:MCF7加入抗体至6/微克/ml:I/J/K:MCF7加入抗体至0.7/0.07/0.007微克/ml。
利用MTT法,测定不同浓度抗体对SKBR3和MCF7细胞生长抑制活性的作用结果显示:抗体特异性的对SKBR3细胞的生长有明显的影响,而对MCF7的生长则基本无作用。在浓度为0.7微克/ml时,抗体对SKBR3的抑制率为19%,与其鼠源母本单抗A21的结果21%基本相同。当降低抗体的浓度为0.07微克/ml时,抗体的抑制活性下降,到0.007微克/ml时,抗体的抑制活性基本上消失。
3.11长期培养法测嵌合抗体的细胞增殖抑制实验:
1)培养SKBR3和MCF7乳腺癌细胞至对数生长期,胰酶消化;
2)用2×RPMI1640培养基悬浮细胞,调整细胞浓度为每毫升1×105个,每孔取1ml加入6孔板中;
3)对照孔每孔加入1ml灭菌双蒸水,测试孔每孔加1ml双蒸水稀释的融合抗体(浓度为20微克/ml),温和混匀之;
4)37℃CO2培养箱培养1星期,中间换一次液,每孔替换培养液成份均与被替换液相同;
5)一周后,取出培养皿,在光学显微镜下观察结果并拍摄照片。
3.12长期培养法测嵌合抗体的细胞增殖抑制实验结果:
图15-18为经嵌合抗体处理后的乳腺癌细胞显微镜下观察的照片图,其中图15为未加抗体培养生长的SKBR3细胞;图16为与抗体温育培养一周后的SKBR3细胞;图17为未加抗体培养生长的MCF7细胞;图18为与抗体温育培养一周后的MCF7细胞。
其中图15显示未经抗体处理的SKBR3细胞生长状态良好,细胞密度很高而且形态上看呈梭形;而图16是与抗体一起温育生长的细胞则形状十分不规则,细胞密度明显低于对照,且有大量细胞呈球状聚集成团。与此相对应,MCF7则受抗体的影响不大,图17和图18细胞形状均为米粒状,密度也基本相同。