CN104225594A - 抗her2人源化抗体及其相关的抗肿瘤组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗HER2人源化抗体及其相关的抗肿瘤组合物。本发明所提供的抗肿瘤组合物中一种抗HER2人源化抗体为含有人源化重链可变区M1-VH和人源化轻链可变区M1-VL的抗HER2人源化抗体M1，M1-VH和M1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；M1-VH和M1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；M1-VH的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1的第26-35位、第50-66位、第99-109位所示；M1-VL的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第24-40位、第56-62位、第95-103位所示。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中抗HER2人源化抗体及其相关的抗肿瘤组合物。
背景技术
HER2(人类表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor-2,HER2)，又名ErbB2/P185，是由原癌基因erbB2/Her2编码的酪氨酸激酶受体膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体EGFR家族第二个成员。HER2通过与EGFR家族中其他三个成员形成异二聚体，导致受体下游MAPK和PI3K等信号通路活化，因此发挥生物学作用。虽然目前尚未发现能与HER2直接结合的配基，但是由于HER2在EGFR家族的信号转导中起到核心的调控作用，因此HER2表达异常时，正常细胞和组织易于发生癌变，导致肿瘤形成。已知在人类多种肿瘤中，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等，都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象，临床上称为HER2阳性肿瘤。HER2阳性肿瘤临床表现为恶性程度高，浸润和转移能力性强，对常规化疗药物不敏感，且病人治疗预后差(Ross JS,Fletcher JA.(1999)The HER2/neu oncogene:prognostic factor,predictive factor and target for therapy.Semin Cancer Biol.9:125-138)。
近年来，靶向HER2的抗体药物已经成为HER2阳性肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗(赫塞汀，英文名Trastuzumab/Herceptin)是Genetech公司开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，美国FDA于1998年批准上市，目前曲妥珠单抗联合化疗药物(紫杉醇等)已经成为HER2过表达晚期转移性乳腺癌和晚期胃癌的一线治疗方案。美国FDA于2012年又批准Genetech公司的另一个抗HER2人源化单克隆抗体药物帕妥珠单抗(英文名Pertuzumab/Perjeta)上市，帕妥珠单抗联合曲妥珠单抗及化疗药物可进一步提高HER2过表达晚期转移性乳腺癌的临床治疗效果。
大量研究表明，靶向HER2的单克隆抗体药物可以通过直接机制和间接机制发挥抗肿瘤作用(Spector NL,Blackwell KL.(2007)Understanding the mechanisms behindtrastuzumab therapy for human epidermal growth factor receptor 2-positivebreast cancer.J Clin Oncol.27:5838-5847)。直接机制主要是抗体与肿瘤细胞过表达的HER2胞外区结合后，改变了HER2及EGFR家族其他受体的聚集、活化和循环形式，进而阻断MAPK和PI3K等下游信号通路活化，最终发挥抑制肿瘤细胞增殖和迁移，以及肿瘤血管生成等作用。间接机制主要是通过机体免疫效应实现，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。
但是，大量临床应用中发现，相当部分肿瘤病人对曲妥珠治疗初始治疗无效，或者治疗一段时间后肿瘤复发，促使人们对曲妥珠单抗的耐药性产生机制开展更深入的研究(Bailey TA,Luan H,Clubb RJ,Naramura M,Band V,Raja SM,Band H.(2011)Mechanisms of Trastuzumab resistance in ErbB2-driven breast cancer and neweropportunities to overcome therapy resistance.J Carcinog 10:28)。与此同时也迫切需要开发具有新型识别表位和作用机制的抗HER2抗体药物，以及新的抗体药物联用方案，以满足临床需求，提高肿瘤治疗效果。
chA21是一种靶向HER2胞外区的新型抗体药物(中国专利申请号200310106256.2)，抗体-抗原复合物晶体结构研究表明，chA21具有独特的的识别表位，它既不同于曲妥珠单抗也不同于帕妥珠单抗(Zhou H,Zha Z,Liu Y,Zhang H,ZhuJ,Hu S,Shen G,Cheng L,Niu L,Greene M,Teng M,Liu J.(2011)Structuralinsights into the down-regulation of over-expressed p185her2/neu oftransformed cells by the antibody chA21.J Biol Chem.286:31676-31683)。chA21独特的识别表位也导致了其抗肿瘤作用机制的特性，包括较强的内吞作用，以及与曲妥珠单抗联合使用时的协同增强作用(Shen G,Huang H,Zhang A,Zhao T,Hu S,ChengL,Liu J,Xiao W,Wu Q,Wei W,Song L.(2011)Anti-ErbB2 sigle-chain chimericantibody chA21 enhances antitumor activity of paclitaxel and Herceptin bydown-regulating ErbB2 expression.Cancer Immunol Immunother.60:339-348)。但是chA21是基因工程人鼠嵌合抗体，抗体的轻链可变区和重链可变区仍为鼠源成分，可能存在一定的免疫原性。单链抗体H1-2(中国专利申请号201010211554.8)是针对chA21开展的初步人源化改造得到的抗体，单链抗体H1-2含有完全人源化的轻链可变区和重链可变区。但是，无论是chA21还是H1-2，均存在与抗原结合的亲和力不高的弱点，它们的亲和常数在1×10-8M左右(Hu S,Zhu Z,Li L,Chang L,Li W,ChengL,Liu J.(2008)Epitope mapping and structural analysis of an anti-ErbB2antibody A21:Molecular basis for tumor inhibitory mechanism.Proteins 70:938-949)。因此，有必要研发具有新型识别表位的、具与HER2抗原亲和力更高、抗肿瘤活性更强的抗HER2人源化抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高抗HER2人源化抗体与抗原的亲和力及如何增强抗HER2抗体对肿瘤的抑制作用。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗HER2人源化抗肿瘤组合物。
本发明所提供的抗肿瘤组合物，它的活性成分由两种或两种以上抗HER2人源化抗体组成，其中一种抗HER2人源化抗体为抗HER2人源化抗体M1，所述抗HER2人源化抗体M1含有人源化重链可变区M1-VH和人源化轻链可变区M1-VL，所述M1-VH和M1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述M1-VH和所述M1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述M1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26-35位氨基酸所示；
所述M1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第50-66位氨基酸所示；
所述M1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99-109位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24-40位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56-62位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95-103位氨基酸所示。
其中，SEQ ID No.1由120个氨基酸组成，SEQ ID No.2由114个氨基酸组成。
上述抗肿瘤组合物中，所述M1-VH的框架区和所述M1-VL的框架区均可来源于人。
上述抗肿瘤组合物中，所述人源化重链可变区M1-VH和所述人源化轻链可变区M1-VL可通过连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列可为序列表中SEQ ID No.3第115-134位氨基酸。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M1是下述的a)或b)或c)或d)：
a)由所述M1-VH和所述M1-VL连接得到的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有所述M1-VH和所述M1-VL的Fab；
d)含有所述M1-VH和所述M1-VL的完整抗体(或称人源化单克隆抗体)。
上述抗肿瘤组合物中，a)所述单链抗体可由所述M1-VH和所述M1-VL通过连接肽连接得到，所述连接肽的氨基酸序列可为序列表中SEQ ID No.3的第115-134位氨基酸。
上述抗肿瘤组合物中，b)所述单链抗体的融合抗体(scFv-Fc)可为由a)所述单链抗体scFv与人源抗体的Fc连接得到的单链融合抗体；所述人源抗体的Fc可为人源任一抗体的Fc，具体可为人源IgG1、或人源IgG2、或人源IgG3、或人源IgG4、或人源IgM1、或人源IgM2、或人源IgA1、或人源IgA2的Fc，具体可为人源IgG1中重链的Fc。
上述抗肿瘤组合物中，b)所述单链抗体的融合抗体(scFv-Fc)氨基酸序列可为序列表中SEQ ID No.3。
其中，SEQ ID No.3由491个氨基酸组成。SEQ ID No.3的第135-254位氨基酸和SEQ ID No.1的第1-120位氨基酸一致，均为重链可变区VH；SEQ ID No.3的第1-114位氨基酸和SEQ ID No.2的第1-114位氨基酸一致，均为轻链可变区VL；SEQ ID No.3的第115-134位氨基酸为连接肽；SEQ ID No.3的第255-491位氨基酸为人源重链IgG1的Fc的氨基酸序列。
在本发明的一个实施例中，所述抗HER2人源化抗体M1，名称为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc，由两条氨基酸序列均为序列表中SEQ ID No.3所示的多肽组成，所述HuA21-1 scFv-Fc含有轻链可变区M1-VL(SEQ ID No.3的第1-114位氨基酸)、重链可变区M1-VH(SEQ ID No.3的第135-254位氨基酸)、人工连接肽linker(SEQ IDNo.3的第115-134位氨基酸)和IgG1的Fc片段(SEQ ID No.3的第255-491位氨基酸)。其中IgG1的Fc片段含有铰链区Hinge和两个恒定区结构域——CH2和CH3，铰链区含有3个半胱氨酸，所述HuA21-1 scFv-Fc通过两条多肽铰链区的3个半胱氨酸形成的三对链间二硫键连接而成。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M1的所述M1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1-120位所示；所述抗HER2人源化抗体M1的所述M1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1-114位所示。
上述抗肿瘤组合物中，所述组合物由所述抗HER2人源化抗体M1和抗HER2人源化抗体M2组成；
所述抗HER2人源化抗体M2含有重链可变区M2-VH和轻链可变区M2-VL；所述重链可变区M2-VH含有氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.7第26-35位氨基酸所示的CDR1、第50-66位氨基酸所示的CDR2和第99-109位氨基酸所示的CDR3；所述轻链链可变区M2-VH含有氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.8第24-34位氨基酸所示的CDR1、第50-56位氨基酸所示的CDR2和第89-97位氨基酸所示的CDR3。
上述抗肿瘤组合物中，所述M2-VH的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述M2-VL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M2具体可为曲妥珠单抗，所述曲妥珠单抗，也叫赫塞汀，英文名为Trastuzumab/Herceptin，是美国Roche/Genetech公司开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，进口药品注册证号为S20020036。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M1和所述抗HER2人源化抗体M2的质量比可为1:1。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M1和所述抗HER2人源化抗体M2均可独立包装，也可混合在一起。
在本发明的另一个实施例中，所述抗HER2人源化抗体M1(HuA21-1 scFv-Fc)与所述抗HER2人源化抗体M2曲妥珠单抗是按照1：1的质量比混合后使用。
上述抗肿瘤组合物中，所述抗HER2人源化抗体M1能与HER2结合，并具有抑制肿瘤的作用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了抗HER2人源化抗体。
本发明所提供的抗HER2人源化抗体，为上述抗肿瘤组合物中任一所述抗HER2人源化抗体M1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料。
本发明所提供的与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述抗HER2人源化抗体M1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，B1)所述抗HER2人源化抗体M1可为上述抗肿瘤组合物中任一所述抗HER2人源化抗体M1。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，B2)所述的含有编码抗HER2人源化抗体M1的核酸分子的表达盒(抗HER2人源化抗体M1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达抗HER2人源化抗体M1的DNA，该DNA不但可包括启动抗HER2人源化抗体M1基因转录的启动子，还可包括终止抗HER2人源化抗体M1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述抗HER2人源化抗体M1基因表达盒的重组载体。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pSectag2A(Zeo+)中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述HuA21-1 scFv-Fc的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.6)导入pSectag2A(Zeo+)中得到的重组载体，其名称为pSectag2A(Zeo+)/HuA21-1scFv-Fc。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述转基因动物细胞系和转基因植物细胞系均非繁殖材料；所述转基因动物细胞系可为将B1)所述核酸分子导入到CHO-K1细胞中得到的重组细胞。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述抗HER2人源化抗体M1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述抗HER2人源化抗体M1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码B1)所述抗HER2人源化抗体M1且具有抗HER2人源化抗体M1活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR1的编码序列如序列表中SEQ ID No.4的第76-105位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR2的编码序列如序列表中SEQ IDNo.4的第148-198位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR3的编码序列如序列表中SEQ IDNo.4的第295-327位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR1的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第69-120位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR2的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第166-186位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR3的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第283-309位核苷酸所示。
其中，SEQ ID No.4由360个核苷酸组成，编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；SEQ ID No.5由342个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料中，所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的编码序列如序列表中SEQ ID No.4的第1-360位核苷酸所示；所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的编码序列如序列表中SEQ ID No.5的第1-342位核苷酸所示。
上述与抗HER2人源化抗体相关的生物材料中，所述抗HER2人源化抗体M1的编码序列如序列表中SEQ ID No.6第1-1473位核苷酸所示。
其中，SEQ ID No.6由1473个核苷酸组成，编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。SEQ ID No.6的1-342位核苷酸为序列表中SEQ ID No.5的第1-342位核苷酸，SEQ ID No.6的403-762位核苷酸为序列表中SEQ ID No.4的第1-360位核苷酸。
扩增编码序列表中SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或其任一片段氨基酸序列的核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1-A3中的任一种用途：
A1、上述任一抗肿瘤组合物在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A2、上述任一抗HER2人源化抗体M1在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A3、上述任一与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
上述用途中，所述肿瘤抑制剂可为抑制肿瘤发生的抑制剂和/或抑制肿瘤生长的抑制剂。
上述用途中，所述肿瘤细胞抑制剂可为抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂和/或促进肿瘤细胞凋亡的抑制剂。
上述用途中，所述肿瘤为HER2高表达肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述C1-C3中的任一种产品：
C1、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为上述任一抗肿瘤组合物；
C2、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为上述任一抗HER2人源化抗体M1；
C3、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为上述任一与抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料。
上述产品中，所述肿瘤为HER2高表达肿瘤。
实验证明，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与HER2-ECD抗原有较高的结合能力：人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的EC50值为对照抗体chA21的9.0％(chA21的EC50值为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的11.0倍)。
实验证明，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc具有较高的抗原亲和力：chA21对抗原的亲和常数Kd为4.04nM；人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和常数Kd为0.173nM，是chA21对抗原的亲和常数Kd的4.3％。与chA21相比，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力提高了23.3倍。
实验证明，与曲妥珠单抗和chA21相比，肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc具有更强的结合能力及内吞能力：人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc能与肿瘤细胞表面的HER2受体特异性结合，肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc的内吞能力大于肿瘤细胞对曲妥珠单抗的内吞能力。
实验证明，与chA21相比，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和本发明的抗肿瘤组合物(曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc)对肿瘤细胞体外增殖有较强的抑制作用：在抗体浓度是3μg/mL时，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的0.75倍、1.25倍，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.40倍、1.13倍；在抗体总浓度是3μg/mL时，曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.21倍、2.03倍，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.59倍、1.28倍。
实验证明，与PBS和chA21相比，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和本发明的抗肿瘤组合物(曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc)对BT-474乳腺癌和OE19胃癌均有明显的抑制作用(P值<0.05)，对BT-474乳腺癌和OE19胃癌抑制作用的大小均为：曲妥珠单抗+HuA21-scFv-Fc>曲妥珠单抗>人源化融合抗体HuA21-scFv-Fc。在用抗体溶液或PBS对荷BT-474乳腺癌肿瘤细胞的BalB/C雌性裸鼠处理第28天，注射HuA21-1 scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.42倍；注射曲妥珠单抗溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.27倍；注射chA21溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.49倍；注射曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.08倍。在用抗体溶液或PBS对荷OE19胃癌肿瘤细胞的BalB/C雌性裸鼠处理第0天和处理第28天，注射HuA21-1scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.45倍；注射曲妥珠单抗溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.30倍；注射chA21溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.52倍；注射曲妥珠单抗+HuA21-1scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.01倍。表明人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌和OE19胃癌均有明显的抑制作用，且和曲妥珠单抗联合使用时，对BT-474乳腺癌和OE19胃癌抑制作用更为进一步增强，大部分肿瘤停止生长或完全消失，表明在抑制肿瘤生长时，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与曲妥珠单抗有明显的协同效应(P值<0.05)。
实验表明，本发明的人源化融合抗体HuA21-1可用于治疗肿瘤药物的制备；本发明的人源化融合抗体HuA21-1还可与曲妥珠单抗联用，用来制备对赫赛汀治疗有耐受性的肿瘤的药物，也可应用于抗体靶向药物(比如抗体-化药偶联物ADC)的研究开发。
附图说明
图1为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc基因的分子结构示意图。
图2为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的SDS-PAGE电泳检测结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为未经DTT变性的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的SDS-PAGE电泳检测结果，泳道2为经DTT变性的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的SDS-PAGE电泳检测结果。
图3为ELISA法检测人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与HER2-ECD抗原的结合特性的实验结果。
图4为乳腺癌细胞结合并内吞人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和曲妥珠单抗的免疫荧光实验结果。
图5为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和HuA21-1 scFv-Fc+曲妥珠单抗在体外分别对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率和对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率。其中，A为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc在体外对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率；B为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc在体外对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率。
图6为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和HuA21-1 scFv-Fc+曲妥珠单抗分别对BalB/C雌性荷瘤裸鼠的BT-474乳腺癌和OE19胃癌的治疗情况。其中，A为不同抗体治疗BalB/C雌性裸鼠的BT-474乳腺癌后的肿瘤体积；B为不同抗体治疗BalB/C雌性裸鼠的OE19胃癌后的肿瘤体积。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的曲妥珠单抗(赫塞汀，英文名Trastuzumab/Herceptin)为Roche/Genetech公司产品，进口药品注册证号S20020036。
下述实施例中的chA21是中国专利200310106256.2(CN1238381C)中的名称为“A21嵌合抗体(scFv-Fc)”的抗体。
下述实施例中的pSectag2A(Zeo+)载体为Invitrogen公司产品，目录号为V900-20。
下述实施例中的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc为发明内容中抗HER2人源化抗体M1，曲妥珠单抗为发明内容中抗HER2人源化抗体M2。
实施例1、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的制备
对申请号为201010211554.8的中国发明专利公开的H1-2人源化单链抗体氨基酸序列进行改构得到人源化单链抗体HuA21-1 scFv，对人源化单链抗体HuA21-1scFv进行改构得到人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc。
1、人源化单链抗体HuA21-1 scFv的氨基酸序列的获得
本申请对申请号为201010211554.8的中国发明专利公开的H1-2人源化单链抗体氨基酸序列进行改构，改构的氨基酸涉及H1-2人源化单链抗体重链可变区VH的CDR1、CDR3和轻链可变区VL的CDR1、CDR2、CDR3，得到了一个新的人源化单链抗体HuA21-1 scFv，将其命名为人源化单链抗体HuA21-1 scFv。人源化单链抗体HuA21-1 scFv的重链可变区VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1-120位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的VH的CDR1(以下简称H1)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第26-35位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1scFv的VH的CDR2(以下简称H2)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第50-66位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的VH的CDR3(以下简称H3)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第99-109位氨基酸所示。人源化单链抗体HuA21-1scFv的轻链可变区VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1-114位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的VL的CDR1(以下简称L1)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第24-40位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的VL的CDR2(以下简称L2)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第56-62位氨基酸所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的VL的CDR3(以下简称L3)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第95-103位氨基酸所示。
人源化单链抗体HuA21-1 scFv的重链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID No.4所示；人源化单链抗体HuA21-1 scFv的轻链可变区的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5所示。
具体方法如下：
(1)互补决定区突变引物设计和合成
根据中国专利号申请号201010211554.8公开的H1-2人源化单链抗体氨基酸序列，结合文献(Zhou H et al.，J Biol Chem，2011，286：31676-31683)发表的chA21单链抗体(中国专利申请号200310106256.2)与HER2胞外区复合物晶体结构数据，选择L1，L3，H1，H2和H3共五个CDR区的部分氨基酸位点，进行序列随机化，然后反转录成相应核苷酸序列，共设计几百条由简并密码子编码的多聚寡核苷酸突变引物，由杭州联川生物公司利用微流体基因芯片合成了5个CDR区，并以多聚寡核苷酸混合物(OligoMixTM)的形式提供。
(2)抗体突变体库构建、亲和淘筛和克隆鉴定。
利用Recombinant Phage Antibody System试剂盒(Amersham公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行亲和淘筛。
抗体库构建分两步进行：第一步，设计引物与每个CDR区的侧翼序列互补，以OligoMix为模板进行PCR扩增，分别获得相应的CDR区的双链DNA片段。第二步，设计合适引物，以H1-2人源化单链抗体基因为模板，PCR分别扩增除CDR区片段以外的抗体两端的基因片段，然后与相应CDR区片段混合，利用剪切重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法，获得完整的单链抗体突变体基因，利用SfiI和NotI酶切位点，克隆至pCANTAB-5E表达载体，获得5个CDR突变区的噬菌体单链抗体库。用于淘筛的抗原为重组抗原HER2-ECD(北京义翘神州公司，货号10004-H08H)，并利用EZ-LinkTM-Sulfo-NHS-Biotin标记试剂盒(Pierce公司)偶联成带生物素标记的抗原。
亲和淘筛步骤如下：分别扩增含有CDR区L1，L3，H1，H2和H3的5个重组噬菌体单链抗体库，针对浓度成倍稀释的可溶性生物素标记抗原开展多轮亲和淘筛，利用M280磁珠(Invitogen公司)富集结合抗原的噬菌体。针对多轮亲和淘筛后的CDR抗体库，随机挑选多个克隆，利用噬菌体ELISA方法检测克隆与抗原的结合能力，经Sanger测序方法测序。最终从每个CDR区重组噬菌体单链抗体库都淘筛获得了多个亲和力明显提高的抗体突变体。
(3)组合抗体库构建、亲和淘筛和克隆鉴定。
为了进一步提高抗体亲和力，设计合适引物，利用SOE-PCR方法，将含有L1，L3，H1和H2共四个CDR区筛选出的较高亲和力的突变体基因扩增，构建成组合抗体库，再对组合抗体库开展亲和淘筛和克隆鉴定，最终获得了多个亲和力进一步明显提高的单链抗体突变体。其中一个突变体为含有重链可变区的氨基酸序列SEQ ID No.1和轻链可变区氨基酸序列SEQ IN No.2，将该突变体命名为人源化单链抗体HuA21-1 scFv。
比较人源化单链抗体HuA21-1 scFv和H1-2的CDR区氨基酸序列，结果如表1所示，和H1-2相比，人源化单链抗体HuA21-1 scFv在L1、L3、H1和H2区域的12个位点的氨基酸发生了突变(用下划线表示)。
表1、人源化单链抗体HuA21-1 scFv和H1-2亲本抗体的CDR区氨基酸序列比较
2、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的氨基酸序列的获得
对上述步骤1得到的人源化单链抗体HuA21-1 scFv进行改构，得到人源化融合抗体，将其命名为人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc(以下简称HuA21-1 scFv-Fc)。HuA21-1 scFv-Fc的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.3的第135-254位氨基酸和SEQ ID No.1的第1-120位氨基酸一致，均为重链可变区VH；SEQID No.3的第1-114位氨基酸和SEQ ID No.2的第1-114位氨基酸一致，均为轻链可变区VL；SEQ ID No.3的第115-134位氨基酸为连接肽；SEQ ID No.3的第255-491位氨基酸为人源重链IgG1的Fc的氨基酸序列。HuA21-1 scFv-Fc的编码序列如序列表中SEQ ID No.6的第1-1473位核苷酸所示。
3、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的重组载体的构建
将序列表中SEQ ID No.6第1-1473位核苷酸所示的核苷酸序列替换pSectag2A(Zeo+)中SfiI和KpnI位点间的核苷酸序列，保持pSectag2A(Zeo+)的其他序列不变，得到的重组载体命名为pSectag2A(Zeo+)/HuA21-1 scFv-Fc，该重组载体即为含有人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的编码序列的重组载体。
4、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的制备
按照下述方法制备人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc：
于6cm细胞培养皿中接种1×106个CHO-K1细胞(CRL-9618TM)，细胞培养至90％密度时得到含有待转染的CHO-K1细胞的培养皿。
将15μL Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitrogen公司)和5μg步骤3中得到的重组载体pSectag2A(Zeo+)/HuA21-1 scFv-Fc加至500μL OptiMEM培养基中，混合均匀后静置30分钟，将得到的混合物加入上述含有待转染的CHO-K1细胞的培养皿中，置于CO2培养箱中6小时，然后将培养基更换为DMEM培养基+10％血清。细胞继续培养24小时后，胰酶消化传代至10块96孔细胞培养板，每孔加入100μL含有0.3mg/mL Zeocin的选择性培养基筛选抗性克隆。
待细胞克隆长出后(约2周)，取培养上清，用ELISA检测单克隆细胞的抗体表达量：取1：4000稀释的羊抗人IgG-F多抗(Pierce公司)包被ELISA板，4℃孵育过夜；用含有3％脱脂奶粉的PBST(PBS+0.1％Tween 20)于37℃封闭1小时；加入待测抗体克隆的细胞培养上清或标准抗体(chA21或人IgG)；室温振荡温育1小时；加入1：2000稀释的HRP-羊抗人IgG(Pierce公司)，室温振荡温育1小时；加入OPD底物显色5分钟，最后用H2SO4终止反应，用EXL800酶标仪(Biotek公司)测量OD 490nm光吸收值。
按照上述ELISA检测方法检测不同单克隆细胞的上清中的抗体表达量，根据不同上清中人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的含量选出人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc高表达的克隆。
将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc高表达的克隆逐级扩大培养，直至滚瓶培养。然后取滚瓶培养的上清液，经Protein A亲和层析柱和S200分子筛层析柱(均为GE公司产品)两步法纯化，最后用30KDa超滤离心管(Millipore公司)浓缩，得到纯化的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc，并用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)测定人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc浓度。
人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc基因的分子结构示意图如图1所示。人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc是由两个氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc单体通过三对链间二硫键聚合而成的同二聚体(scFv-Fc)2，每个人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc单体均含有轻链可变区VL(SEQID No.3的第1-114位氨基酸)、重链可变区VH(SEQ ID No.3的第135-254位氨基酸)、人工连接肽linker(SEQ ID No.3的第115-134位氨基酸)和IgG1的Fc片段(SEQ IDNo.3的第255-491位氨基酸)，其中IgG1的Fc片段含有铰链区Hinge和两个恒定区结构域——CH2和CH3，铰链区含有3个半胱氨酸，上述同二聚体是通过铰链区的3个半胱氨酸形成的三对链间二硫键聚合而成。
理论上，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc单体的分子量约为50KD，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的分子量约为110KD，但人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc单和人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的糖基化修饰等因素会增加其各自的分子量。纯化的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc及其单体的SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示，结果显示，未经DTT变性的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的泳道中有一条带，分子量大小为110KDa以上，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc经DTT变性得到的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc单体的泳道中有一条带，分子量大小约为55KDa。该检测结果显示人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与预测的分子量相符。
实施例2、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与抗原的结合特性
采用ELISA方法测定人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与抗原的结合特性。实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
将HER2-ECD抗原(北京义翘神州公司，货号为10004-H08H)用pH为9.6的50mM NaHCO3水溶液稀释至50ng/μL，得到50ng/μL的HER2-ECD抗原溶液。向ELISA板(Nunc公司)的每孔中加入50ng/μL的HER2-ECD抗原溶液100μL包被ELISA板；置于4℃孵育过夜，加入含有3％脱脂奶粉的PBST(PBS+0.1％Tween 20)置于37℃封闭1小时；加入人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc，使人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc的终浓度分别为9000ng/mL、3000ng/mL、1000ng/mL、333ng/mL、111ng/mL、37ng/mL、12.33ng/mL、4.11ng/mL，共8种人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的浓度，每浓度2个平行孔(2个重复)，室温振荡温育1小时；加入1:2000稀释的HRP-羊抗人IgG(Pierce公司)，室温振荡温育1小时；加入OPD底物显色5分钟，最后用H2SO4终止反应，测量不同人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc浓度的OD490nm。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法，计算人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的EC50值。
按照上述方法，将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc替换为对照抗体chA21，分别得到8个不同对照抗体chA21浓度(9000ng/mL、3000ng/mL、1000ng/mL、333ng/mL、111ng/mL、37ng/mL、12.33ng/mL、4.11ng/mL)的OD 490nm，并计算对照抗体chA21的EC50值。
人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与HER2-ECD抗原的结合特性如图3所示：
对照抗体chA21的EC50值为1050ng/mL，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的EC50值为95ng/mL，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc EC50值为对照抗体chA21的9.0％(chA21的EC50值为HuA21-1 scFv-Fc 11.0倍)；高浓度的人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc与HER2-ECD抗原反应的反应产物的490nm光吸收值明显高于高浓度的对照抗体chA21与HER2-ECD抗原反应的反应产物的490nm光吸收值。结果表明，与对照抗体chA21相比，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与HER2-ECD抗原的结合能力显著提高。
实施例3、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力
采用Biacore 3000生物分子相互作用分析仪(GE公司)，测定人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力。实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
将重组抗原HER2-ECD(北京义翘神州公司，货号10004-H08H)用EZ-LinkTM-Sulfo-NHS-Biotin标记试剂盒(Pierce公司)偶联成带生物素标记的抗原。将带生物素标记的抗原用PBS稀释至浓度为0.4μg/mL，得到0.4μg/mL的生物素标记的HER2-ECD抗原溶液。将0.4μg/mL的生物素标记的HER2-ECD抗原溶液流过SA芯片，使SA芯片与生物素标记的HER2-ECD抗原结合，至信号值约300RU时结束抗原对SA芯片的标记，得到抗原标记的SA芯片。
将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc或对照抗体chA21用PBS稀释至浓度为10μg/mL，得到10μg/mL的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc或对照抗体chA21。将10μg/mL的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc或对照抗体chA21流过抗原标记的SA芯片，结合时间为3分钟，解离时间为15分钟，测定响应值RU。每完成一次测试后，用0.1N NaOH溶液再生处理芯片30秒，将结合的抗体从芯片上洗脱下来。利用BIAevaluation软件，根据1:1结合模型对响应值RU进行曲线拟合，计算抗体对抗原的结合常数Kon值、解离常数Koff值和亲和常数Kd值，分别得到人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的结合常数Kon值、解离常数Koff值和亲和常数Kd值及对照抗体chA21对抗原的结合常数Kon值、解离常数Koff值和亲和常数Kd值，结果见表2。
实验结果显示，chA21对抗原的结合常数Kon为0.648×105M-1s-1、解离常数Koff为26.2×105M-1s-1，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的结合常数Kon为1.07×105M-1s-1、解离常数Koff为1.86×105M-1s-1，表明，与chA21相比，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc具有更大的结合常数Kon和更小的解离常数Koff。chA21对抗原的亲和常数Kd为4.04nM；人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和常数Kd为0.173nM，是chA21对抗原的亲和常数Kd的4.3％。与chA21相比，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力提高了23.3倍，表明，人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc具有更高的对抗原的亲和力。
根据文献(Carter P1，Presta L，Gorman CM，Ridgway JB，Henner D，WongWL,Rowland AM,Kotts C,Carver ME,Shepard HM.Humanization of ananti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci USA.1992,89:4285-4289)报道，曲妥珠单抗的亲和常数在0.1-0.2nM之间，因此人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力与曲妥珠单抗相当。
表2、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对抗原的亲和力
实施例4、肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的结合能力及内吞能力
采用免疫荧光法测肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的结合能力及内吞能力。实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
用PBS透析人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc，按照FITC抗体标记试剂盒(Pierce公司)说明书操作，将FITC荧光分子与人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc按照20：1摩尔比例混合，室温反应1小时，获得FITC标记的抗体。用含有10％特级胎牛血清的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)体外培养HER2高表达的SKBR3乳腺癌细胞(中国科学院上海细胞库)，胰酶消化后传代至8孔LabTek小室(Nunc公司)，每孔3×105个细胞，在CO2培养箱培养24小时后，更换含有10μg/mL FITC标记抗体的含有10％特级胎牛血清的RPMI 1640培养基，将此时记为培养0小时，继续培养，分别在培养1、4和24小时取SKBR3乳腺癌细胞，分别得到抗体处理1小时的SKBR3乳腺癌细胞、抗体处理4小时的SKBR3乳腺癌细胞和抗体处理24小时的SKBR3乳腺癌细胞。对抗体处理1小时的SKBR3乳腺癌细胞、抗体处理4小时的SKBR3乳腺癌细胞和抗体处理24小时的SKBR3乳腺癌细胞分别按照如下步骤进行处理：冰冷PBS洗2次，10％福尔马林固定15min，蒸馏水洗2次，DAPI染色1min，蒸馏水洗2次，50％甘油脱水2min，除去残余液体，用指甲油封片，最后置于荧光显微镜拍照(Olympus公司)，结果见图4。
按照上述方法，将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc替换为曲妥珠单抗，其他步骤不变，检测肿瘤细胞对曲妥珠单抗的结合能力及内吞能力，肿瘤细胞对曲妥珠单抗的结合能力及内吞作用见图4。
实验结果显示，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和曲妥珠单抗均能与肿瘤细胞表面的HER2受体特异性结合，但肿瘤细胞对这两种抗体的内吞能力有明显差别，肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的内吞能力大于肿瘤细胞对曲妥珠单抗的内吞能力。实验结果显示，在人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc处理肿瘤细胞的1、4和24小时，均有大量人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc进入肿瘤细胞内部，并且聚集形成内吞小体；在曲妥珠单抗处理肿瘤细胞的1、4和24小时，曲妥珠单抗主要分布于肿瘤细胞表面，仅有少量曲妥珠单抗进入肿瘤细胞内。结果表明，与曲妥珠单抗相比，肿瘤细胞对人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc具有更强的结合能力及内吞能力，表明人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc可应用于抗体靶向药物(比如抗体-化药偶联物ADC)的研究开发。
实施例5、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc体外抑制肿瘤细胞增殖的能力
CCK-8法检测人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc体外抑制肿瘤细胞增殖的能力。实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
体外培养HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞(中国科学院上海细胞库)。BT-474乳腺癌细胞经胰酶消化后接种于96孔细胞培养板(Nunc公司)，每孔含有2×104个细胞，培养板中每孔均有100μL含有10％特级胎牛血清的RPMI 1640培养基，在CO2培养箱中培养24小时后，将培养基更换为含有人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc和10％特级胎牛血清的RPMI 1640新鲜培养基，进行人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞的处理，培养基中人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc的浓度分别为3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL，每个浓度3个平行孔(即每个浓度3个重复)，继续培养96h后，将培养基更换为含有10μL CCK-8(上海东仁化学公司)显色试剂的含有10％特级胎牛血清的RPMI 1640新鲜培养基，继续培养1-2小时，用酶标仪在490nm下测定每孔中溶液的光密度吸收值(OD值)，分别得到不同HuA21-1 scFv-Fc浓度处理BT-474乳腺癌细胞的OD值。
按照上述方法，将BT-474乳腺癌细胞替换为HER2高表达的N87胃癌细胞(上海细胞库)，其他步骤不变，分别得到不同HuA21-1 scFv-Fc浓度处理的N87胃癌细胞的OD值。
按照上述方法，将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc分别替换为曲妥珠单抗、chA21、或曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc(曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc由曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc组成，其中曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc的质量比为1：1)，其他步骤不变，分别得到不同曲妥珠单抗浓度处理BT-474乳腺癌细胞的OD值、不同chA21浓度处理BT-474乳腺癌细胞的OD值、以及不同曲妥珠单抗+HuA21-1scFv-Fc抗体总浓度(该浓度为曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc的总浓度)处理BT-474乳腺癌细胞的OD值。
按照上述方法，将人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc分别替换为曲妥珠单抗、chA21、或曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc(曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc由曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc组成，其中曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc的质量比为1：1)，将BT-474乳腺癌细胞替换为N87胃癌细胞(上海细胞库)，其他步骤不变，分别得到不同曲妥珠单抗浓度处理N87胃癌细胞的OD值、不同chA21浓度处理N87胃癌细胞的OD值、不同曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc抗体总浓度(该浓度为曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc的总浓度)处理N87胃癌细胞的OD值。
根据细胞增殖抑制率计算公式：抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，分别计算上述不同浓度的不同抗体对不同细胞的增殖的抑制率，实验结果如图5所示。
实验结果显示，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc在浓度分别为3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL时，对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为54.61％±4.13％、52.67％±3.67％、40.85％±2.24％、17.37％±3.19％、8.17％±3.75％、2.03％±2.97％，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为63.68％±3.54％、61.42％±2.69％、41.41％±3.31％、22.72％±4.58％、11.23％±3.17％、5.46％±2.23％；曲妥珠单抗在浓度分别为3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL时，对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为72.98％±5.15％、66.49％±5.07％、48.86％±4.32％、22.29％±4.22％、10.68％±2.13％、3.31％±3.15％，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为45.56％±4.07％、41.85％±4.11％、33.51％±2.97％、14.83％±3.14％、5.56％±2.66％、-0.01％±1.19％；曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc在抗体总浓度分别为3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL时，对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为88.41％±5.43％、79.35％±4.29％、68.31％±3.95％、25.49％±3.68％、12.82％±3.74％、6.30％±3.18％，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为72.31％±4.42％、70.13％±3.56％、55.65％±2.98％、30.72％±2.17％、15.68％±3.24％、8.19％±3.03％；chA21在浓度分别为3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL时，对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为43.58％±3.56％、36.37％±3.42％、23.44％±2.19％、12.59％±1.18％、5.11％±1.76％、3.29％±1.43％，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为56.31％±4.29％、52.18％±2.18％、44.58％±3.13％、25.48％±2.52％、13.98％±3.18％、3.29％±3.04％。结果显示，在抗体浓度是3μg/mL时，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的0.75倍、1.25倍，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.40倍、1.13倍；在抗体总浓度是3μg/mL时，曲妥珠单抗+HuA21-1scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.21倍、2.03倍，对N87胃癌细胞的细胞增殖抑制率分别为曲妥珠单抗和chA21的1.59倍、1.28倍。
体外实验表明，与chA21相比，不同浓度的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌细胞增殖的抑制率均增强，高浓度的人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc对N87胃癌细胞的增殖的抑制率增强；与曲妥珠单抗相比，不同浓度的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对N87胃癌细胞的增殖的抑制率均增强；与曲妥珠单抗相比，曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc在不同抗体总浓度下对BT-474乳腺癌细胞增殖的抑制率和对N87胃癌细胞的增殖的抑制率均增强；表明人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc对肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用；当将人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc与曲妥珠单抗联合使用时，对肿瘤细胞增殖的抑制作用进一步增强，说明人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与曲妥珠联用具有体外协同增强效应。
实施例6、人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc体内抑制肿瘤生长的能力
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
用PBS分别溶解人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc、曲妥珠单抗、chA21、曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc(曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc由曲妥珠单抗和HuA21-1scFv-Fc组成，其中曲妥珠单抗和HuA21-1 scFv-Fc的质量比为1：1)，分别得到浓度为2mg/ml的HuA21-1 scFv-Fc溶液、浓度为2mg/ml的曲妥珠单抗溶液、浓度为2mg/ml的chA21溶液以及抗体总浓度为2mg/ml的曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc溶液。
取40只5-6周龄BalB/C雌性裸鼠(南京模式动物研究所)，每只于乳房垫部位皮下接种5×106个HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞，同时包埋0.72mg雌激素缓释片(Innovative Research of American公司)。每周两次测量肿瘤长径和短径，根据公式TV＝1/2×a×b2计算肿瘤体积。待肿瘤平均体积长至约100mm3时，将荷瘤BalB/C雌性裸鼠随机分为五组，每组8只，而后对每组的每只荷瘤BalB/C雌性裸鼠注射不同的抗体溶液或PBS进行治疗，将第一次注射不同的抗体溶液或PBS记为处理第0天，分别在处理第0天、处理第4天、处理第7天、处理第11天、处理第14天、处理第18天、处理第21天、处理第25天注射，每次对每只荷瘤裸鼠都注射与第一次相同的抗体溶液或PBS，每次注射的体积均为100μL，在每次注射前和处理第28天分别测量荷瘤BalB/C雌性裸鼠的体重和肿瘤的大小。每次注射的具体方法如下：在第一组的每只BalB/C雌性裸鼠的静脉中注射100μL上述HuA21-1 scFv-Fc溶液，在第二组的每只BalB/C雌性裸鼠的静脉中注射100μL上述曲妥珠单抗溶液，在第三组的每只BalB/C雌性裸鼠的静脉中注射100μL上述chA21溶液，在第四组的每只BalB/C雌性裸鼠的静脉中注射100μL上述曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc溶液，在第五组的每只BalB/C雌性裸鼠的静脉中注射100μL PBS。不同抗体对BalB/C雌性裸鼠的BT-474乳腺癌的治疗情况见图6中A。按照上述方法，将BT-474乳腺癌细胞替换为OE19胃癌细胞(Sigma公司)，其他步骤均不变，得到不同抗体对BalB/C雌性裸鼠的OE19胃癌的治疗情况，结果见图6中B。
实验结果显示，在用抗体溶液或PBS对荷BT-474乳腺癌肿瘤细胞的BalB/C雌性裸鼠处理第0天和处理第28天，注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小分别为136.0mm3±37.8mm3、518.3mm3±226.2mm3；注射HuA21-1 scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为140.3mm3±44.9mm3、219.6mm3±110.3mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.03倍和0.42倍；注射曲妥珠单抗溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为140.0mm3±62.5mm3、140.2mm3±105.1mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.03倍和0.27倍；注射chA21溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为133.83mm3±45.9mm3、255.2mm3±128.3mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.98倍和0.49倍；注射曲妥珠单抗+HuA21-1scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为142.1mm3±51.3mm3、40.8mm3±35.9mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.04倍和0.08倍。
实验结果显示，在用抗体溶液或PBS对荷OE19胃癌肿瘤细胞的BalB/C雌性裸鼠处理第0天和处理第28天，注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为76.5mm3±30.9mm3、1863.6mm3±484.4mm3；注射HuA21-1 scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为85.2mm3±44.4mm3、835.9mm3±567.2mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.05倍和0.45倍；注射曲妥珠单抗溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为78.3mm3±77.0mm3、557.7mm3±581.0mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.00倍和0.30倍；注射chA21溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为73.9mm3±19.9mm3、975.1mm3±434.2mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的0.97倍和0.52倍；注射曲妥珠单抗+HuA21-1scFv-Fc溶液的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小依次为82.9mm3±39.7mm3、13.4mm3±37.5mm3，分别为注射PBS的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤大小的1.08倍和0.01倍。
实验表明，与PBS和chA21相比，人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc对BT-474乳腺癌和OE19胃癌均有明显的抑制作用(P值<0.05)，对BT-474乳腺癌和OE19胃癌抑制作用的大小均为：曲妥珠单抗+HuA21-1 scFv-Fc>曲妥珠单抗>人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc。表明人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc对BT-474乳腺癌和OE19胃癌均有明显的抑制作用，且和曲妥珠单抗联合使用时，对BT-474乳腺癌和OE19胃癌抑制作用更为进一步增强，大部分肿瘤停止生长或完全消失，表明在抑制肿瘤生长时，人源化融合抗体HuA21-1scFv-Fc与曲妥珠单抗有明显的协同效应(P值<0.05)。
本发明的实验证明，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc与HER2抗原具有高亲和性和亲和力，且对肿瘤细胞具有较强的抑制作用，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc可用于治疗肿瘤药物的制备。本发明的实验还证明，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc在抑制肿瘤时与曲妥珠单抗具有明显的协同效应，本发明的人源化融合抗体HuA21-1 scFv-Fc可与曲妥珠单抗联合使用，用来制备对曲妥珠治疗有耐受性的肿瘤的药物。
Claims (10)
1.抗肿瘤组合物，它的活性成分由两种或两种以上抗HER2人源化抗体组成，其中一种抗HER2人源化抗体为抗HER2人源化抗体M1，所述抗HER2人源化抗体M1含有人源化重链可变区M1-VH和人源化轻链可变区M1-VL，所述M1-VH和M1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述M1-VH和所述M1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述M1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26-35位氨基酸所示；
所述M1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第50-66位氨基酸所示；
所述M1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99-109位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24-40位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56-62位氨基酸所示；
所述M1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95-103位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述抗HER2人源化抗体M1是下述的a)或b)或c)或d)：
a)由权利要求1所述的M1-VH和权利要求1所述的M1-VL连接得到的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有权利要求1所述的M1-VH和权利要求1所述的M1-VL的Fab；
d)含有权利要求1所述的M1-VH和权利要求1所述的M1-VL的完整抗体。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述抗HER2人源化抗体M1的所述M1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1-120位所示；所述抗HER2人源化抗体M1的所述M1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1-114位所示。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述抗HER2人源化抗体M1的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物由所述抗HER2人源化抗体M1和抗HER2人源化抗体M2组成；
所述抗HER2人源化抗体M2含有重链可变区M2-VH和轻链可变区M2-VL；所述重链可变区M2-VH含有氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.7第26-35位氨基酸所示的CDR1、第50-66位氨基酸所示的CDR2和第99-109位氨基酸所示的CDR3；所述轻链链可变区M2-VH含有氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.8第24-34位氨基酸所示的CDR1、第50-56位氨基酸所示的CDR2和第89-97位氨基酸所示的CDR3。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述M2-VH的氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示；所述M2-VL的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
7.权利要求1-4中任一所述的抗HER2人源化抗体M1。
8.与权利要求7所述抗HER2人源化抗体M1相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B16)中的任一种：
B1)编码权利要求7所述抗HER2人源化抗体M1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
具体地，
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR1的编码序列如序列表中SEQ IDNo.4的第76-105位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR2的编码序列如序列表中SEQ IDNo.4的第148-198位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的CDR3的编码序列如序列表中SEQ IDNo.4的第295-327位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR1的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第69-120位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR2的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第166-186位核苷酸所示；
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的CDR3的编码序列如序列表中SEQ IDNo.5的第283-309位核苷酸所示；
进一步，
所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VH的编码序列如序列表中SEQ ID No.4所示；所述抗HER2人源化抗体M1中所述M1-VL的编码序列如序列表中SEQ ID No.5所示；
更进一步，
所述抗HER2人源化抗体M1的编码序列如序列表中SEQ ID No.6所示。
9.下述A1-A3中的任一种用途：
A1、权利要求1-6中任一所述的组合物在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A2、权利要求7所述的抗HER2人源化抗体M1在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
A3、权利要求8所述的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
10.下述C1-C3中的任一种产品：
C1、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1-6中任一所述的组合物；
C2、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求7所述的抗HER2人源化抗体M1；
C3、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求8所述的生物材料。
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