CN107417791A - 抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途。本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体，是通过在Trastuzumab抗体的重链N端通过连接肽连接上抗人ErbB2的单链抗体后得到的；所述单链抗体中的重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；所述单链抗体中的轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区；所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列1的第275‑289位。本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体具有良好的抗肿瘤作用，并且相对于原Trastuzumab抗体和HuA21抗体，具有更加优异的内吞效果，这对于其作为载药工具用于制备抗体靶向药物具有重要意义。

Description

抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途。

背景技术

ErbB2受体又称HER2或P185，是一种糖蛋白，属于I型受体酪氨酸激酶家族中的表皮生长因子受体(ErbB/HER)家族，该家族还拥有以下成员：ErbB1/HER1/EGFR、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。ErbB家族受体在未与配基结合时，一般以非活化的单体形式存在，而胞外配基的结合会促进受体二聚化，导致受体下游MAPK和PI3K等信号通路活化，进而发挥生物学功能。尽管到目前为止能与ErbB2结合的配基尚未见报道，它在整个ErbB家族受体的活化过程中却是处于核心地位，因此，其表达异常将会对人体组织的正常生长分化产生重要影响。

在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多数癌症中都可以检测到ErbB2原癌基因扩增或者蛋白过表达的现象，其中20％-30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。ErbB2的过度表达与肿瘤体积，淋巴结转移以及雌激素受体缺失具有相关性，肿瘤的恶性程度较高而且容易复发，化疗药物难以治愈，且肿瘤的预后效果差。HER2基因的过表达不仅与肿瘤的发生发展相关，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，因此，ErbB2已经成为肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。

靶向HER2治疗的药物主要包括小分子酪氨酸蛋白激酶抑制剂如Lapatinib等和各种形式的抗体药物，其中抗体药物以其高特异性、高亲和力、低体内代谢速率、低毒性以及抑制机制多样等优点，成为抗肿瘤生物药研发的热点。曲妥珠单抗(商品名Herceptin，英文名Trastuzumab/Herceptin)是美国FDA批准的第一个用于肿瘤治疗的抗ErbB2人源化单克隆抗体，主要是用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌，临床有效率达到50％以上，患者生存期明显延长。2010年，曲妥珠单抗又被批准用于治疗HER2阳性晚期胃癌。曲妥珠单抗主要是通过抑制ErbB2二聚化或下游信号活化、阻断ErbB2胞外区切割引起的p95片段活化、促进ErbB2内吞和降解等机制发挥作用，另外它也可以通过诱导的ADCC效应来发挥功能。帕妥珠单抗(商品名Perjeta，英文名Pertuzumab)是另一个抗ErbB2人源化单克隆抗体，它主要是通过抑制HER2与其他的ErbB家族受体形成异二聚体，进而阻断下游的信号通路来发挥功能。T-DM1是由曲妥珠单抗与一种小分子微管抑制剂DM1偶联而成的抗体偶联药物(ADC)，被用来治疗HER2高表达同时又对Tratuzumab耐受的转移性乳腺癌。

尽管Tratuzumab在乳腺癌中的高治疗效率已经被广泛的证明，然而，它的作用仅局限于30％HER2高表达的乳腺癌，另外70％乳腺癌患者对Tratuzumab并不能产生足够有效的反应，甚至没有反应，这主要是由于这些患者的乳腺癌细胞并不高表达HER2或者HER2表达量不够高，而且由于肿瘤异质性，同一患者不同肿瘤细胞，它的HER2表达量也可以在43％-69％区间内变化。不仅如此，大量临床研究发现，很多肿瘤患者对Tratuzumab产生初始治疗无效的原发性耐药或者在治疗过程中出现的肿瘤复发的继发性耐药，促使人们对抗体靶向药物耐药性产生机制进行更深入的研究。2011年美国又批准Pertuzumab与Trastuzumab联用，以克服Trastuzumab单独使用产生的耐药性问题，但是部分病人仍旧产生耐药性，因此，寻找更加有效的抗HER2抗体药物已经成为当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途。

本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体，是通过在Trastuzumab抗体(商品名Herceptin)的重链N端通过连接肽连接上抗人ErbB2的单链抗体后得到的。所述单链抗体中的重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；所述单链抗体中的轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区；所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列1的第275-289位。

进一步，所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，轻链的氨基酸序列为序列表中序列2所示。所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链即为Trastuzumab抗体的轻链。

其中，序列1共由740个氨基酸组成。第21-134位为HuA21抗体的轻链可变区；第155-274位为HuA21重链可变区；第135-154位为连接HuA21抗体的轻链可变区和重链可变区形成单链抗体的连接肽；第290-740位为Trastuzumab抗体的重链；第275-289位为连接Trastuzumab抗体重链N端和抗人ErbB2的单链抗体的连接肽。

编码所述抗人ErbB2双特异性抗体的基因也属于本发明的保护范围。

进一步，所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因的序列如序列表中序列3所示；所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因的序列如序列表中序列4所示。

含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组载体为将所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因和所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒。相应的，所述转基因细胞系为向受体细胞中转入所述重组载体(即所述两个重组质粒)后得到的细胞系。

更加具体的，所述重组载体为将序列3所示的DNA片段(所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因)插入到pcDNA3.4载体的酶切位点BamHⅠ和HindⅢ之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4(A_3LHVHCH))，以及将序列4所示的DNA片段(所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因)插入到pcDNA3.4载体的BamHⅠ和HindⅢ之间后得到的重组质粒(命名为pcDNA3.4(A_3LHVLCL))。

本发明所提供的制备所述抗人ErbB2双特异性抗体的方法，具体可包括如下步骤：

(1)将所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因(序列3)和所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因(序列4)分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒(即前文所述的两个重组质粒pcDNA3.4(A_3LHVHCH)和pcDNA3.4(A_3LHVLCL))。

(2)将步骤(1)所得的两个重组质粒共转染受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述抗人ErbB2双特异性抗体。

所述方法中，可以用亲和层析的方法对所述抗人ErbB2双特异性抗体进行分离和纯化，利用此方法可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

在本发明中，以上所述受体细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞。所述哺乳动物细胞具体如人肾上皮细胞系HEK293F。

所述抗人ErbB2双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述抗人ErbB2双特异性抗体在作为载药工具用于制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述抗人ErbB2双特异性抗体在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述应用中，所述肿瘤具体可为乳腺癌。所述肿瘤细胞具体可为乳腺癌细胞，如SKBR3细胞或BT474细胞。

实验证明，本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体具有良好的抗肿瘤作用，并且相对于原Trastuzumab抗体和HuA21抗体，具有更加优异的内吞效果，这对于其作为载药工具用于制备抗体靶向药物具有重要意义。

附图说明

图1为双特异性抗体结构示意图。

图2为双特异性抗体SDS-PAGE图。左图为还原条件下的SDS-PAGE图，右图为非还原条件下的SDS-PAGE图。

图3为毛细管电泳测A_3LH等电点。

图4为ELISA方法测定双特异性抗体与抗原结合特性。

图5为双特异性抗体的竞争结合实验。其中，A为H_1LA H_2LA H_3LA对人ErbB2抗原上HuA21结合位点的竞争实验结果；B为A_1LH A_2LH A_3LH对人ErbB2抗原上HuA21结合位点的竞争实验结果；C为H_1LA H_2LA H_3LA对人ErbB2抗原上Herceptin结合位点的竞争实验结果；D为A_1LHA_2LH A_3LH对人ErbB2抗原上Herceptin结合位点的竞争实验结果。

图6为免疫荧光方法检测双特异性抗体与肿瘤细胞结合和内吞。

图7为流式细胞术检测细胞表面抗原的内化效率。

图8为CCK-8方法测定双特异性抗体抑制肿瘤细胞增殖作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于基因扩增、重组质粒构建、以及将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.,et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press。

实施例1、用于表达抗人ErbB2双特异性抗体的重组载体的构建

抗人ErbB2单克隆抗体Trastuzumab(IgG1,κ)的序列来自于Genentech公司的专利US5821337，抗人ErbB2单克隆抗体HuA21是由合肥瀚科迈博生物技术有限公司自行创建，其序列来自专利ZL201410489895X，根据两个抗体之间串联顺序以及连接短肽氨基酸数目的不同，分别构建了如下六个双特异性抗体：A_1LH，A_2LH，A_3LH以及H_1LA，H_2LA和H_3LA。

A_1LH，A_2LH，A_3LH是将HuA21的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到Herceptin的重链的N端。同理，H_1LA，H_2LA和H_3LA是将Herceptin的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到的HuA21的重链的N端。简单来讲，就是讲X抗体的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到Y抗体的重链的N端，这里的X，Y抗体指的就是Herceptin和HuA21，其ScFv中连接轻重链可变区的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，连接ScFv和另一个抗体重链之间的linker的氨基酸序列为GGGGS(记为1L)、GGGGSGGGGS(记为2L)或GGGGSGGGGSGGGGS(记为3L)。双特异性抗体结构示意图如图1所示。

下面以A_3LH为例，详细说明用于表达双特异性抗体的重组载体构建过程：

根据文献中的报道，直接合成Herceptin的重链的核苷酸序列(如序列表中序列3的第868-2223位所示)(通用生物)，另外根据HuA21的核苷酸序列直接合成HuA21轻重链可变区连接而成的ScFv的核苷酸序列(如序列表中序列3的第61-822位所示(通用生物))。根据Herceptin重链的5’和3’端的核苷酸序列，设计正向引物5’-GAGGTGCAGCTGGTCGAGAG-3’和反向引物5’-CCGAAGCTTTCACTTCCCGGGGCTCAGGCTCAGG-3’，在反向引物中引入了HindⅢ酶切位点(通用生物)。根据HuA21-ScFv的5’和3’端的核苷酸序列设计正向引物5’-AATGGATCCACTGGTGACATCGTTTTGACTCAATCTCC-3’和反向引物5’-GCTCTCGACCAGCTGCACCTCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCTGAAGAAACAGTAACCAAAGTAC-3’，在正向引物中引入了BamHⅠ酶切位点(通用生物)。另外，前者的正向引物和后者的反向引物中引入一段互补序列，通过这段互补序列，经OverlapPCR将HuA21-ScFv和Herceptin的重链串联到一起，得到A_3LHVH，再经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的pcDNA3.4(Life公司)载体上，经测序验证正确后获得pcDNA3.4(A_3LHVHCH)。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s；59℃30s；72℃2min1 0s，30个循环；72℃10min。

人工合成Herceptin的轻链基因并在两端添加BamHⅠ和HindⅢ识别序列，具体序列为“GGATCC+序列4+AAGCTT”(通用生物)，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，克隆到经同样双酶切pcDNA3.4载体(Life公司)上，经测序验证正确后获得pcDNA3.4(A_3LHVLCL)。

用于表达其他五种双特异性抗体的重组载体构建方法同A_3LH。

实施例2、双特异性抗体的表达和纯化

以A_3LH为例，将pcDNA3.4(A_3LHVHCH)和pcDNA3.4(A_3LHVLCL)同时瞬转到人肾上皮细胞系HEK293F(ATCC美国细胞库)，培养三天后，利用Protein A亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白。通过BCA方法对纯化的抗体蛋白进行定量。纯化的抗体分别在还原和非还原条件下利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量和纯度。另外，通过毛细管电泳检测了A_3LH的等电点。

结果显示，在还原条件下(10％)，六个双特异性抗体的重链均在75-80KD，轻链大小略有差异，但是也在25-30KD的范围内(图2)。毛细管电泳测等电点的结果显示，A_3LH的等电点在8.5左右(图3和表1)。

表1 A_3LH的等电点结果结果

实施例3、ELISA方法测定双特异性抗体与抗原结合特性

T6-17细胞(美国宾夕法尼亚大学医学院Mark I Greene教授赠予，记载于“王弦,谢小强,曹亮等.T6-17细胞培养上清中肿瘤蛋白P185的表达.细胞与分子免疫学杂志,2008,24(10):1018-1019”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)为小鼠上皮成纤维细胞NIH3T3转入人Her2/ErbB2基因后的稳转细胞株，其细胞膜表面高表达HER2蛋白。将对数生长期的T6-17细胞经胰酶消化培养基重悬以后，1000rpm/min离心5min，取上清，按照1×10⁷个细胞/mL的比例加入细胞裂解液(配方：50mM Tris-HCl pH7.5，150mMNaCl，体积分数1％Triton-100，4mM蛋白酶抑制剂Complete(Roche))重悬，冰上裂解20min，然后，12000rpm/min，离心15min，取上清。裂解液用50mM NaHCO₃pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)及对照抗体(HuA21和Herceptin)，均稀释至1、0.25、0.0625、0.015625、0.003906、0.000977、0.000244、0.000061μg/mL，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-IgG(Thermo公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5分钟，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量测量OD 490值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果显示，相对于HuA21，六个双特异性抗体的亲和力均有所减弱，其中H_2LA的减弱较为明显，其他双特异性抗体之间没有太明显的区别。而相对于Herceptin，除H_2LA外，其他抗体对抗原的亲和力均未有明显变化。具体参见图4。

实施例4、双特异性抗体的竞争结合实验

将T6-17细胞裂解液(同实施例3)用50mM NaHCO₃pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)；置于4℃孵育过夜，加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)及对照抗体(HuA21和Herceptin)，均稀释至200、66.6667、22.2222、7.4074、2.4691、0.8230、0.2743、0.0914、0.03048、0.01016μg/ml，共10个梯度，每个梯度2个平行孔，同时在其中加一定浓度的生物素标记的竞争性抗体(生物素标记的HuA21 0.25μg/ml或者生物素标记的Herceptin 2μg/ml)，充分混合以后每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)按照1:8000的体积比进行稀释，然后每孔加入100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5min，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量OD 490值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

ELISA实验结果如图5所示，由图可以看出，相对于HuA21，H_1LA、H_2LA和H_3LA对抗原的亲和力有所下降，而A_1LH、A_2LH、A_3LH对抗原的亲和力未有明显变化，而相对于Herceptin，这六个双特异性抗体对ErbB2抗原的相对亲和力均未发生明显改变。这与之前测定双特异性抗体与抗原亲和力的实验结果基本吻合。

实施例5、免疫荧光方法检测双特异性抗体与肿瘤细胞结合和内吞

体外培养SKBR3或BT474乳腺癌细胞(上海细胞库)至对数生长期，胰酶消化后传至24孔板(Nunc公司)中过夜培养，孔中预先铺有圆形的细胞培养板。次日，将原培养基吸走，分别加入含有10μg/mL的待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)或对照抗体(HuA21、Herceptin和Pertuzumab)的培养基，并处理4小时，之后，再按照以下步骤对细胞进行处理：冰冷PBS洗2次，每遍5min；3.7％甲醛的PTEM(配方：100mM Pipes，pH 6.8，10mM EGTA，1mMMgCl₂，0.2％Triton X-100)处理10min；PBS洗两遍，每遍5min；用含有1％(10g/L)BSA的PBST(配方：PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)4℃封闭过夜；加入10μg/mL FITC标记的羊抗人IgG，室温反应40min-1h，之后，用PBS洗四遍，每遍5min；加入DAPI反应5min，之后，用PBS洗三遍，每遍5min；将细胞培养板从24孔板中取出倒置到加有抗淬灭剂的载玻片上，指甲油封片，最后置于荧光显微镜拍照(Zeiss公司)。

免疫荧光实验结果如图6所示。H_3LA和A_3LH均能与肿瘤细胞表面的ErbB2受体很好的结合，而且在4h时，大量抗体进入到细胞内部，形成吞噬小体，细胞膜上仅存在有少量抗体。然而，HuA21，Herceptin以及Pertuzumab的内吞能力相对来说就比较弱，在4h时，大量抗体仍然只是位于细胞表面，只有极少被内吞到细胞内。以上实验结果表明，本发明中的双特异性抗体在抗体靶向药物(比如抗体-化药偶联物ADC)的研究开发中将会有很好的应用价值。

实施例6、流式细胞术检测细胞表面抗原的内化效率

对数生长期的SKBR3或BT474乳腺癌细胞(上海细胞库)经胰酶消化培养基重悬后，收集于锥形底离心管中。4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入培养基重悬细胞，使重悬后的细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，将细胞悬液以50μl每管分装至各离心管中。

将用培养基稀释的100μg/ml的待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)及对照抗体(HuA21、Herceptin和Pertuzumab)和细胞悬液混合至终体积100μl(50μl抗体样品和50μl细胞悬液)。混匀后，冰浴60min，期间每隔一段时间轻弹几次，防止细胞长时间沉淀，然后4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，去上清，用1ml的RPMI1640培养基洗涤两次，以去除残留的抗体，对于每组抗体其中一管加入500μl固定液(1％的多聚甲醛溶液：多聚甲醛5g，1mol/L氢氧化钠溶液250μl，加10×PBS 50ml，用水定容至500ml)冰上固定20min，离心1000rpm×5min，弃上清。

每管加入200μl培养基，于37℃孵育15min至2hr不同时间(15min、40min、60min、120min)，使结合于细胞表面的抗体内化。在每个时间点，将该时间点对应的37℃孵育试管立即移至冰浴，并4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入500μl固定液冰上固定20min，离心1000rpm，5min，弃上清。在各离心管中加入100μl 10μg/ml FITC标记的羊抗人IgG，4℃避光孵育30min后，加入1ml的PBS洗涤细胞，重复此过程两次，最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式观察。

实验结果如图7所示。在SKBR3或BT474这两种乳腺癌细胞中，A_3LH表现出更强的内吞强度和更快的内吞速度，而对应的Herceptin和HuA21以及Pertuzumab的内吞却不是非常的明显。这进一步说明本发明中的双特异性抗体A_3LH适宜用于开发抗体靶向药物。相比之下，其他五种双特异抗体的内吞强度和内吞速度均显著不及A_3LH。

实施例7、CCK-8方法测定双特异性抗体抑制肿瘤细胞增殖作用

体外培养的SKBR3或BT474乳腺癌细胞(上海细胞库)经胰酶消化培养基重悬后，接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，在CO₂培养箱培养24h后，加入含有待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)及对照抗体(HuA21和Herceptin)的新鲜培养基，最高浓度20μg/ml，3倍梯度稀释，共10个浓度，每个浓度取3个平行孔，继续培养72h后，弃去培养基，每孔加入100μl的含有CCK-8试剂(东仁化学)(CCK-8显色试剂是按照1:10的体积比进行稀释的)的培养基，在37℃、5％CO₂的条件下进行显色，BIO-TEK ELX-800酶标仪在490nm的波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝(OD值对照孔-OD值给药孔)/OD值对照孔×100％

利用GraphPad软件，采用四参数回归法对数据进行处理。

CCK-8方法测定肿瘤细胞增殖实验结果如图8所示。无论是在BT474细胞还是在SKBR3细胞中，六个双特异性抗体彼此之间的肿瘤细胞增殖抑制率没有显著性差异，并且都优于HuA21，与Herceptin相比也表现出非劣性。

<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司

<120> 抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途

<130> GNCLN171503

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 740

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Pro

35 40 45

Leu Glu Tyr Ser Asn Asn Gln Trp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gly Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys

165 170 175

Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gln Tyr Phe Ile His Trp Val Lys

180 185 190

Gln Asn Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Ser Ser Ser

195 200 205

Tyr Ala Thr Val Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

210 215 220

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ser Gly Asn Tyr

245 250 255

Glu Glu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

290 295 300

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

305 310 315 320

Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

325 330 335

Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

340 345 350

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

355 360 365

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

370 375 380

Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

405 410 415

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

435 440 445

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

450 455 460

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

465 470 475 480

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

485 490 495

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser

500 505 510

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

515 520 525

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

530 535 540

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

545 550 555 560

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

565 570 575

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

580 585 590

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

595 600 605

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

610 615 620

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

625 630 635 640

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

645 650 655

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

660 665 670

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

675 680 685

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

690 695 700

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

705 710 715 720

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

725 730 735

Ser Pro Gly Lys

740

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala

35 40 45

Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser

50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

100 105 110

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

130 135 140

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

145 150 155 160

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

165 170 175

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

180 185 190

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

195 200 205

Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccactggt 60

gacatcgttt tgactcaatc tccagactct ttggctgttt ctttgggtga aagagttact 120

attaactgta agtcttctca accgttggaa tactctaaca accaatggaa ctacttggct 180

tggtatcaac aaaagccagg tcaatctcca aagttgttga tctcttgggc ttccactaga 240

aagtctggtg ttccagacag attctctggt tctggttctg gtactgactt cactttgact 300

atctcttctg ttcaagctga agacgttgct gtttactact gtgggcaata ctctgactac 360

ccaaacactt tcggtgctgg tactaagttg gaaattaaga gaggtggtgg tggttctggt 420

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttccggt ggtggtggtt ccgaagttca attggttcaa 480

tctggtgctg aagttgttaa gccaggtgct tctgttaaga tcagttgtaa ggcttctggt 540

tacccgttca ctcagtactt catccactgg gttaagcaaa acccaggtca aagattggaa 600

tggatcggtc agatctcttc gtcttacgct actgtgacct acaaccaaaa attcaagggt 660

aaggctactt tgactgttga cacttctgct tctactgctt acatggaatt gtcttctttg 720

agatcggaag acactgctgt ttactactgt gttagatcgg gtaactacga agaatacgct 780

atggactact ggggtcaagg tactttggtt actgtttctt caggaggagg aggaagcgga 840

ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgag gtgcagctgg tcgagagcgg cgggggcctc 900

gtgcagccgg gcgggtcgct gcggctgagc tgcgccgcga gcgggttcaa catcaaggac 960

acctacatcc actgggtgcg ccaggccccc ggcaagggcc tcgagtgggt cgcccggatc 1020

taccccacga acgggtacac ccgctacgcc gacagcgtga agggccggtt caccatcagc 1080

gcggacacct cgaagaacac ggcctacctg cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc 1140

gccgtgtact actgcagccg gtggggcggc gacgggttct acgccatgga ctactggggg 1200

cagggcaccc tcgtcaccgt gagcagcgcg tcgacgaagg ggcccagcgt gttcccgctg 1260

gcccccagca gcaagagcac cagcggcggg accgccgccc tgggctgcct cgtcaaggac 1320

tacttccccg agcccgtgac cgtgtcgtgg aacagcggcg cgctgacgag cggggtccac 1380

accttcccgg ccgtgctgca gagcagcggc ctctactcgc tgagcagcgt ggtcaccgtg 1440

cccagcagca gcctggggac ccagacgtac atctgcaacg tgaaccacaa gccctcgaac 1500

accaaggtcg acaagaaggt ggagcccccg aagagctgcg acaagaccca cacctgcccg 1560

ccctgccccg cccccgagct cctgggcggg cccagcgtgt tcctgttccc gcccaagccc 1620

aaggacacgc tcatgatcag ccgcaccccc gaggtcacct gcgtggtggt cgacgtgagc 1680

cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtcgacg gcgtggaggt gcacaacgcc 1740

aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac tcgacgtacc gcgtcgtgag cgtgctgacc 1800

gtcctgcacc aggactggct caacggcaag gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc 1860

ctgcccgcgc ccatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg ggcagccccg ggagccgcag 1920

gtgtacaccc tgccccccag ccgcgacgag ctcacgaaga accaggtcag cctgacctgc 1980

ctggtgaagg gcttctaccc ctcggacatc gccgtggagt gggagagcaa cgggcagccg 2040

gagaacaact acaagaccac cccgcccgtc ctcgacagcg acggcagctt cttcctgtac 2100

agcaagctga cggtggacaa gtcgcggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtc 2160

atgcacgagg ccctccacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgag ccccgggaag 2220

tga 2223

<210> 4

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgacccaga gcccgtcgag cctgagcgcc agcgtgggcg accgggtcac gatcacctgc 60

cgcgcgagcc aggacgtgaa caccgccgtg gcctggtacc agcagaagcc cgggaaggcc 120

cccaagctcc tgatctactc ggcgagcttc ctgtacagcg gcgtccccag ccggttcagc 180

gggtcgcgca gcggcaccga cttcacgctc accatcagca gcctgcagcc ggaggacttc 240

gccacctact actgccagca gcactacacc acgcccccca ccttcgggca gggcaccaag 300

gtggagatca agcggaccgt ggccgccccc agcgtcttca tcttcccgcc cagcgacgag 360

cagctgaagt cgggcacggc cagcgtggtg tgcctcctga acaacttcta cccccgcgag 420

gcgaaggtcc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagagcg ggaacagcca ggagagcgtg 480

accgagcagg actcgaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaag 540

gccgactacg agaagcacaa ggtctacgcc tgcgaggtga cccaccaggg gctctcgagc 600

cccgtgacca agagcttcaa ccggggcgag tgctga 636

Claims (10)

1.一种抗人ErbB2双特异性抗体，是通过在Trastuzumab抗体的重链N端通过连接肽连接上抗人ErbB2的单链抗体后得到的；

所述单链抗体中的重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；所述单链抗体中的轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区；所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列1的第275-289位。

2.根据权利要求1所述的抗人ErbB2双特异性抗体，其特征在于：所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，轻链的氨基酸序列为序列表中序列2所示。

3.编码权利要求1或2所述抗人ErbB2双特异性抗体的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因的序列如序列表中序列3所示；所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因的序列如序列表中序列4所示。

5.含有权利要求3或4所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

6.根据权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，其特征在于：所述重组载体为将所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因和所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒；所述转基因细胞系为向受体细胞中转入所述重组载体后得到的细胞系。

7.制备权利要求1或2所述抗人ErbB2双特异性抗体的方法，包括如下步骤：

(1)将所述抗人ErbB2双特异性抗体的重链的编码基因和所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒；

(2)将步骤(1)所得的两个重组质粒共转染受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述抗人ErbB2双特异性抗体。

8.权利要求1或2所述抗人ErbB2双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1或2所述抗人ErbB2双特异性抗体在作为载药工具用于制备抗肿瘤药物中的应用。

10.权利要求1或2所述抗人ErbB2双特异性抗体在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。