CN102757495A - 一种全人源抗vegf抗体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明全人源抗VEGF抗体8B13，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12；本发明还公开了编码上述全人源抗VEGF抗体8B13的核苷酸序列，其中编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：11。本发明公开的全人源抗VEGF抗体8B13可以用于制备治疗抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗体、其制备方法及用途。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1-2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。
贝伐单抗(Avastin，bevacizumab)是抗人VEGF的人源化抗体(Cancer Res1997；57：4593-9)，它于2004年被美国食品药品管理局批准为转移性结直肠癌的一线治疗药物。但Trastuzumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化。进入上世纪90年代以后，抗体库技术的出现使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平，它绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实，因而显示出强大的生命力。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science，1985，228(4705)：1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science，1989，246(4935)：1275-1281；Proc Natl AcadSci USA，1991，88(18)：7978-7982；Human Antibodies，1997，8(4)：155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附-洗脱-扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于1010，那就可能从中筛选得到高亲和力(≥109M-1)的特异性抗体。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗VEGF抗体8B13，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12；本发明还公开了编码上述全人源抗VEGF抗体8B13的核苷酸序列，其中编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
本发明利用得到的全人源抗VEGF抗体8B13进行了一系列实验，实验结果表明：与人源化抗体bevacizumab相比，8B13具有更高的与VEGF的亲和力，明显更强地抑制HUVEC增殖的能力与体内抗肿瘤活性。
附图说明
图1细胞增殖实验
图2肿瘤生长曲线
具体实施方式
实施例
(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
(2)cDNA的制备
收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(3)引物设计
参考文献(Immunotechnology，1998，3：271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列请见(Immunotechnology，1998，3：271-278)。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有NotI位点的序列AT G CGG CCG C。
(4).噬菌体抗体库的构建及筛选
采用实施例(2)中的cDNA和实施例(3)中的引物，利用recombinant Phageantibody system试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinantPhage antibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人VEGF165蛋白”购自R&D公司。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人VEGF单链抗体8B13ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了8B13ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别显示了8B13ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
(5)全人源抗体在真核细胞中的表达
以8B13ScFv基因和pGEM-T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段8B13VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)进行连接，构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(8B13VHCH)。
以8B13ScFv基因和pGEM-T/CL载体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物8B13VLCL，其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段8B13VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(Invitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(8B 13VLCL)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(8B 13VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(8B 13VLCL)6μg)和20μlLipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418(Invitrogen公司产品)和250μg/ml Zeocin(Invitrogen公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)(KPL公司)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgG1，κ(Sigma)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)((Southern Biotechnology Associates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB显色液于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体8B13。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了全人源抗体8B 13的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12分别显示了全人源抗体8B13的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。
(6)VEGF抗体亲和力测定
运用Biacore T100(Biacore AB，Uppsala，Sweden)检测VEGF抗体的亲和力常数。将VEGF165(R&D公司产品)通过氨基共价结合与CM5生物传感芯片(GEHealthcare)上，将全人源抗体8B13，Bevacizumab，和阴性对照抗体(rituximab)(以PBS/0.05％TWEEN-20(ICI Americas)(去污剂)配)溶液，配成不同的浓度(2倍比浓度稀释)，以50μl/min的流速通过芯片。每次检查之后，用5μl 50mM盐酸水溶液以3μl/min的流速洗涤，从而将残留的抗体从固定化的配体上洗脱下来。用BIAevalution软件(T100 evalution 2.0版，GE Healthcare公司)，通过非线性回归法分析结合曲线。结果如表1所示，全人源抗体8B13的KD值显著低于Bevacizumab，说明全人源抗体8B13对VEGF的亲和力高于Bevacizumab。
| 抗体 | Kon(M-1S-1/104) | Koff(104S-1) | KD(nM) |
| 8B13 | 9.01 | 0.73 | 0.81 |
| Bevacizumab | 5.12 | 1.03 | 2.01 |
| Rituximab | ND | ND | ND |
(7)VEGF抗体抑制HUVEC细胞增殖实验
实验步骤：取生长状态良好的HUVEC细胞，调整细胞浓度为2.5×104/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％C02孵箱中培养24h后换无血清培养基，继续培养72h，加入不同浓度梯度的VEGF抗体，以抗CD20抗体rituximab为阴性对照，每个浓度取3个平行孔，37℃孵育1h，加入终浓度为25ng/ml的VEGF-A继续培养24h后，加入10μl[3H].TdR(18.5kBq/孔)，37℃孵箱中孵育7h，细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，采用[3H]液闪计数仪进行测定。如图1所示，结果表明阴性对照抗体(rituximab)不能有效抑制VEGF引起的HUVEC细胞增殖，而全人源抗体8B13，Bevacizumab均可有效抑制VEGF引起的HUVEC细胞增殖。全人源抗体8B13抑制VEGF引起的HUVEC细胞增殖的活性明显强于Bevacizumab(P＜0.05，t检验，抗体浓度范围为0.4-3.2nM)。
(8)VEGF抗体体内抑制肿瘤生长实验
实验步骤：为检测VEGF抗体体内抑瘤活性，首先用LM3细胞(人肝癌细胞)，接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予各VEGF抗体25mg/kg及无关对照蛋白Rituximab，然后隔天皮下注射持续4周.6周后，每3天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积，结果如图2所示。结果表明：阴性对照抗体(Rituximab)不能有效抑制肿瘤的生长，而全人源抗体8B13，Bevacizumab均可有效抑制重症免疫缺陷小鼠接种肿瘤的生长，且从第18天起，全人源抗体8B13对肿瘤生长的抑制作用较Bevacizumab强，有显著差异(P＜0.05，Mann-Whitney检验，当观察时间大于35天以后)。
Claims (9)
1.一种全人源抗VEGF抗体8B13，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12。
2.一种核苷酸分子，编码权利要求1所述的全人源抗VEGF抗体8B13。
3.权利要求2所述的核酸分子，其中编码重链的核酸分子为SEQ ID NO：9，编码轻链的核酸分子为SEQ ID NO：11。
4.一种载体，含有权利要求3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pcDNA3.1，pcDNA3.1/ZEO(+)之一。
5.一种宿主细胞，含有权利要求4所述的载体，为真核细胞。
6.权利要求5所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。
7.权利要求6所述的宿主细胞，为CHO细胞。
8.一种制备权利要求1所述的全人源抗VEGF抗体8B13的方法，该方法包括：
a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗体；
b)分离或纯化所述的抗体。
9.权利要求1所述的全人源抗VEGF抗体8B13在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。
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