JP2008543314A - エピトープ類似体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年6月17日出願の米国特許仮出願第60/691,889号(参照によりその全体が放棄されることなく本明細書に援用される)の出願日の利益を主張する。
Tリンパ球(T細胞)は、特定の抗原シグナルに対する応答に機能する抗原特異的免疫細胞である。Bリンパ球及びそれらが産生する抗体も、抗原特異的な存在である。しかしながらBリンパ球とは違って、T細胞は、遊離又は可溶性形態で抗原に応答しない。T細胞が抗原に応答するには、主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質から成る提示複合体に結合された抗原を必要とする。
実施の形態は、MHCクラスI拘束性T細胞エピトープSSX−241-49、KASEKIFYV(配列番号1)の類似体、pAPCによってプロセシングされエピトープ類似体を提示するこれらの類似体を含むポリペプチド、及びこの類似体を発現する核酸を含む。類似体は、野生型エピトープと比較して類似するか又は改良された免疫学的性質を有し得
る。
もよい。
P1が、S、F、K又はWであり、
P2が、L、I、V、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D又はTであり、
P9におけるPΩが、C、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2である配列であって、
SLLMWITQ{C、V、I、L若しくはA}(配列番号26)、FVLMWITQA(配列番号27)、又はFILMWITQ{L若しくはI}(配列番号28)ではない配列を有する単離ペプチドに関する。
P1がYであり、
P2が、L、V、I、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D又はTであり、
P9におけるPΩが、V、I、L、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2である配列であって、
YVLMWITL(配列番号29)又はYLLMWIT{I若しくはL}(配列番号30)ではない配列を有する単離ペプチドに関する。
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)であり、
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2が、A、L、V、I、M、D−Ala、Nal−2、Abu、Aib、Nle、又はNvaであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9におけるPΩが、V、I、A、Nva、MeVal、Abu、又はV−NH2であ
るか、又はP9がVであり、P10におけるPΩが、I、L、V、Nle又はNvaであり、
PΩ+1が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)である配列であって、
KASEKIFYV(配列番号1)ではない配列を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
K{L、V、M、I、D−Ala、D−Val、Nal−2、Aib、Abu、Nle若しくはNva}SEKIFYV(配列番号2);又は
{F、Phg、Y、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、O−メチル−Tyr若しくはβ−(3−ベンゾチエニル)−Ala}ASEKIFYV(配列番号3);又は
{Y、F若しくはW}{V、M若しくはI}SEKIFYV(配列番号4);又は
{F若しくはW}LSEKIFYV(配列番号5);又は
K{A、V若しくはL}SEKIFYI(配列番号6);又は
K{L若しくはV}SEKIFYV−NH2(配列番号7);又は
FVSEKIFY{I、A、Nva、Abu若しくはMeVal}(配列番号8);又は
FVS{Q、Nle若しくはNva}KIFYV(配列番号9);又は
FVSEK{L、V、Nle若しくはNva}FYV(配列番号10);又は
FVSEKIF{F若しくはPhe(4−F)}V(配列番号11);又は
KASEKIFYV{I若しくはL}(配列番号12);又は
KVSEKIFYV{I、L、V若しくはNle}(配列番号13);又は
KLSEKIFYV{L、V、Nle若しくはNva}(配列番号14)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
K{L、V、M、Abu、Nle若しくはNva}SEKIFYV(配列番号15);又は
{F若しくはPhg}ASEKIFYV(配列番号16);又は
YVSEKIFYV(配列番号17);又は
F{L、V若しくはI}SEKIFYV(配列番号18);又は
W{L若しくはI}SEKIFYV(配列番号19);又は
K{V若しくはL}SEKIFYI(配列番号20);又は
FVSEKIFY{I若しくはNva}(配列番号21)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
K{V若しくはL}SEKIFYV(配列番号22);又は
{F若しくはY}ASEKIFYV(配列番号23);又は
FVSEKIFYI(配列番号24);又は
KVSEKIFYV(配列番号41)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2が、A、L、V、I、M、D−Ala、Nal−2、Abu、Aib、Nle、又はNvaであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9におけるPΩが、V、I、A、Nva、MeVal、又はAbuである配列であって、
KASEKIFYV(配列番号1)ではない配列;
又は
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeT
yr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2が、V、L、M、Abu、Nle、又はNvaであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9におけるPΩ が、V、I、A、Nva、MeVal、Abu、又はV−NH2である配列;
又は
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2が、A、L、V、M、Abu、Nle、又はNvaであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10におけるPΩが、I又はLである配列;
又は
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2がVであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10におけるPΩが、I、L、V、又はNleである配列;
又は
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala、又はD−Lysであり、
P2がLであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle、又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle、又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10におけるPΩが、I、L、V、Nle又はNvaである配列
を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規
定する)であり、
P1が、S、F、K、W、又はYであり、
P2が、L、I、V、Nle、又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L、又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V、又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D、又はTであり、
P9におけるPΩが、C、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2、又はL−NH2であり、
PΩ+1が、X、XX、XXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)である配列であって、
SLLMWITQ{C、V、I、L若しくはA}(配列番号26)、FVLMWITQA(配列番号27)、FILMWITQ{L若しくはI}(配列番号28)、YVLMWITL(配列番号29)、又はYLLMWIT{I若しくはL}(配列番号30)ではない配列;
又は
P1が、S、F、K、又はWであり、
P2が、L、I、V、Nle、又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L、又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V、又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D、又はTであり、
P9におけるPΩが、C、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2、又はL−NH2である配列であって、
SLLMWITQ{C、V、I、L若しくはA}(配列番号26)、FVLMWITQA(配列番号27)、又はFILMWITQ{L若しくはI}(配列番号28)ではない配列;
又は
P1がYであり、
P2が、L、V、I、Nle、又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L、又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V、又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D、又はTであり、
P9におけるPΩが、V、I、L、Nva、Nle、V、V−NH2、又はL−NH2である配列であって、
YVLMWITL(配列番号29)又はYLLMWIT{I若しくはL}(配列番号30)ではない配列
を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
157-165複合体であり得る。
B40、B48、B51、B52、B53、B60、B61、B62、B63、B67、B70、B71、B75、B77、C4、Cw1、Cw3、Cw4、Cw6、Cw7、及びCw10等の型であり得る。いくつかの態様では、MHCタンパク質は、HLA−A2又はA24であり得る。MHCは、アンカー残基結合ポケットを有することができ、このポケットはHLA−A*0201のB又はFポケットに相同である。結合ポケットの形成を担い、この結合ポケットがエピトープアンカー残基に適合し、それによってMHC分子の結合特異性を定義するMHC残基は、当該技術分野で十分に理解されている。このような情報の1つの編集物は、ハイパーテキスト転送プロトコル(http://)でのFIMM (機能免疫学)ウェブサイト「sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/.」で見出される(Schoenbach C., Koh J.L.Y., Sheng X., Wong L., and V.Brusic. FIMM「機能的な分子免疫学のデータベース(a database of functional molecular immunology)」Nucleic Acids Research, 2000,
Vol. 28, No. 1 222-224; Schoenbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. FIMM「機能的な分子免疫学のデータベース(a database of functional molecular immunology)」update 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229;及びZhang, C. et al., J. Mol. Biol. 281:929-947, 1998;(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)も参照のこと)。また、ペプチドは、上記MHCの上記セグメントの対応する特性と実質的に同一であるか又はより良好な少なくとも1つの結合特性を有し得る。例えば、結合特性を、上記セグメントのものと比較して高めることができる。いくつかの実施の形態では、結合特性は、例えば、結合親和性又は結合安定性であり得る。
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)であり、
P1が、G、A、S、Abu、又はSarであり、
P2が、L、M、I、Q、V、Nva、Nle、又はAbuであり、
P3が、P又はWであり、
P4がSであり、
P5がIであり、
P6がPであり、
P7がVであり、
P8がHであり、
P9が、P、A、L、S、又はTであり、
P10におけるPΩが、I、L、V、Nva、又はNleであり、
PΩ+1が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)である配列であって、
GLPSIPVHPI(配列番号42)ではない配列を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
{S、Sar若しくはAbu}LPSIPVHPI(配列番号43);又は
G{M若しくはNle}PSIPVHPI(配列番号44);又は
G{L、I、Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号45);又は
GLWSIPVHP{Nva若しくはV}(配列番号46);又は
GLPSIPVH{A若しくはS}I(配列番号47);又は
GLPSIPVHP{V、L、Nva若しくはNle}(配列番号48);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva若しくはNle}(配列番号49);又は
G{Nva}PSIPVHP{Nva}(配列番号50);又は
G{V、Nva若しくはNle}PSIPVHPV(配列番号51);又は
{Sar若しくはAbu}LPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号52);又は
A{V、I、Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号53);又は
AVPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号54);又は
A{Nva}PSIPVHPV(配列番号55);又は
ALWSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号56);又は
GVWSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号57);又は
G{Nva}WSIPVHPV(配列番号58)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
{Abu}LPSIPVHPI(配列番号59);又は
G{V、Nva若しくはAbu}PSIPVHPI(配列番号60);又は
GLPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号61);又は
GLWSIPVHP{I若しくはNva}(配列番号62);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva}(配列番号63);又は
G{Nle若しくはNva}PSIPVHPV(配列番号64);又は
{A若しくはAbu}LPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号65);又は
G{Nva}WPSIPVHP{I若しくはV}(配列番号66);又は
A{Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号67);又は
A{V若しくはNva}PSIPVHPV(配列番号68)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
{Abu}LPSIPVHPI(配列番号59);又は
GLPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号61);又は
GLWSIPVHPI(配列番号69);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva}(配列番号63)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)であり、
P1が、S、K、F、Y、T、Orn、又はHseであり、
P2が、L、V、M、I、Nva、Nle、又はAbuであり、
P3が、L、Nva、Nle、又はAbuであり、
P4がQであり、
P5がHであり、
P6が、L、Nva、Nle、又はAbuであり、
P7がIであり、
P8が、G、A、S、又はSarであり、
P9におけるPΩが、L、V、I、A、Nle、Nva、Abu、又はL−NH2であり、
PΩ+1が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)である配列であって、
SLLQHLIGL(配列番号71)ではない
配列を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
{K、F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGL(配列番号72);又は
S{V、M、I、Nva、Nle若しくはAbu}LQHLIGL(配列番号73);又は
SL{Nva、Nle若しくはAbu}QHLIGL(配列番号74);又は
SLLQH{Nva、Nle若しくはAbu}IGL(配列番号75);又は
SLLQHLI{A、S若しくはSar}L(配列番号76);又は
SLLQHLIG{V、I、A、Nle、Nva、Abu若しくはL−NH2}(配列番号77);又は
{F、Y、T、Orn若しくはHse}{Nva、Nle、M若しくはI}LQHLIGL(配列番号78);又は
S{Nva、Nle若しくはM}LQHLIG{Nva、Nle若しくはV}(配列番号79);又は
{K、F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGV(配列番号80);又は
{F若しくはT}LLQHLIG{Nle}(配列番号81);又は
{F若しくはT}{Nva若しくはM}LQHLIG{Nle}(配列番号82)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
{F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGL(配列番号83);又は
S{Nva、Nle若しくはM}LQHLIGL(配列番号84);又は
SLLQHLIG{Nle、Nva若しくはL−NH2}(配列番号85);又は
SLLQH{Nva若しくはAbu}IGL(配列番号86);又は
S{Nva}LQHLIG{Nle}(配列番号87);又は
{F若しくはT}{L若しくはNva}LQHLIG{Nle}(配列番号88)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
S{L若しくはNva}LQHLIG{Nle}(配列番号89);又は
T{Nva}LQHLIG{Nle}(配列番号90)
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
性を有する単離ペプチドに関する。解離半減期は、上記クラスI MHC結合クレフト由来のSLLQHLIGL(配列番号71)の解離半減期に類似するか又はこれを超え得る。単離ペプチドを、ペプチドSLLQHLIGL(配列番号71)に対する特異性を有するT細胞によって認識することができる。
GILT{V、Nva若しくはNle}(配列番号91);又はY{M、V、Nva若しくはNle}DGTMSQ{V、Nva若しくはNle}(配列番号92)のペプチドの配列であって、E{A若しくはL}AGIGILTV(配列番号93)又はYMDGTMSQV(配列番号94)ではない配列を有するクラスI MHC/ペプチド複合体に関する。他の実施の形態では、クラスI MHC/ペプチド複合体は、クラスI MHC/メラン−A26-35複合体を認識するTCRと交差反応する。クラスI MHC/ペプチド複合体は、HLA−A2/メラン−A26-35複合体である。
させる方法が提供される。さらに他の実施の形態では、本明細書中に開示される任意の免疫原性組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘起、維持又は同調させる方法が提供される。
1.TCRに対する交差反応性及び機能的アビディティ、
2.MHCクラスIへの結合に対する親和性及び安定性、
3.細胞傷害性によって評価される免疫に対するin vivoでの影響、
4.IFN−γのex vivo産生によって評価される免疫に対するin vivoでの影響、及び/又は
5.タンパク質分解に対する耐性の増加。
L., and V.Brusic. FIMM, a database of functional molecular immunology. Nucleic
Acids Research, 2000, Vol. 28, No.1 222-224;及びSchoenbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. FIMM, a database of functional molecular immunology; update 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No.1 226-229;(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)も参照のこと)で見出される。
on independent binding of individual peptide side-chains)」(J. Immunol. 152:163-175)を参照のこと)。ウェブサイトアルゴリズムも利用可能であり、これを使用してMHC結合を予想することができる。例えば、ワールドワイドウェブのHans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Emmerich, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI:MHCリガンド及びペプチドモチーフのためのインターネットデータベース(An Internet Database for MHC Ligands and Peptide Motifs)(以下を介したハイパーテキスト転送プロトコルアクセス: syfpeithi. bmi-heidelberg. com/ scripts/ MHCServer. dll/ home.
htm)及び"bimas. dcrt. nih. gov / molbio/ hla_bind"のページを参照のこと。クラスI拘束性エピトープについて、C末端の位置PΩは、一般的には一次アンカーである。第2の位置P2もしばしば一次アンカーであるか、或いは、P3及び/又はP5がこの役割を果たすことができる。位置P2〜P7は、全て、一方又は他方のMHCの二次又は補助
的アンカー位置として認識されている(Rammensee et al.,及び米国特許出願公開番号20030215425 (2001年12月7日に出願された、「抗原提示細胞におけるエピトープ同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS)」と題する米国特許出願第10/026,066号(その全開示全体について、参照によりその全体が本明細書に援用される)の表6を参照のこと)。クラスII拘束性エピトープP1、P4、P6、P7、及びP9は、アンカー位置として認識されている。前述は、一般的ガイドとして意図され、例示と見なすべきであり、網羅も限定もしていない。結合モチーフ及びアンカー残基等の多数の分析及び編集物は、化学文献及び特許文献並びにインターネットで利用可能である。その慣習及び結果は、本明細書中の教示と組み合わせると、エピトープ類似体設計に関する有用なガイダンスを当業者にさらに提供する。
ペプチドの末端は、一般に、モチーフに対応しなければならないが、結合ペプチドの中心領域の隆起及び折り畳みによって長さの有意な変動に適合することができ、その結果、少なくとも約14アミノ酸長までのペプチドを提示することができる(例えば、Probst-Kepper, M. et al., J. Immunol. 173:5610-5616, 2004を参照のこと)。
炎誘発性自己ペプチドのT細胞受容体(TCR)結合部位が修飾されているが、MHC結合部位(複数可)が修飾されていないペプチドであり、その結果、アレルギーを起こすことなく免疫応答が達成される(Karin et al., 1998; Vergelli et al, 1996)。
類似体を、当業者に既知の任意の方法(ペプチド合成法又は所望のペプチド類似体をコードする核酸の発現を使用したペプチドの製造が含まれる)を使用して産生することができる。したがって、類似体が1つ又は複数の非標準アミノ酸を含む場合、類似体がペプチド産生方法によって産生される可能性がより高い。類似体が標準的アミノ酸との1つ又は複数の置換のみを含む場合、類似体を、当業者に既知の任意の方法を使用して発現ベクターから発現することができる。或いは、ペプチドを、遺伝子治療法を使用して発現することができる。
類似体の有用性及び/若しくは活性、並びに/又は改良された性質を評価し、多少でも類似体を野生型と比較するために、以下の検定のうちの1つ又は複数を行った:HLA−A*0201に対するペプチド結合親和性、ペプチド−HLA−A*0201複合体の安定
性検定、交差反応性検定(野生型ペプチド特異的CTLによるペプチド類似体の認識又はペプチド類似体を使用して生成されたCTLによる野生型ペプチドの認識)、免疫原性検定(IFN−γ分泌検定、細胞傷害性検定、及び/又はElispot検定等)、抗原性検定(in vitro腫瘍細胞溶解検定、ex vivo腫瘍細胞溶解、及びin vivo腫瘍細胞溶解等)、及びタンパク質分解耐性の増加を同定するためのタンパク質分解検定。例示的検定の詳細を、以下の実施例に示す。
クラスIMHC拘束性T細胞応答、特に抗原に対するエフェクターメモリー(effector
and memory)CTL応答を誘起、同調、維持、調節及び増幅する上で、開示されている類似体を使用するのに有用な方法は、共に「CTL応答を誘起する方法(A Method of Inducing a CTL Response)」と題する米国特許第6,994,851号(2006年2月7日)及び同第6,977,074号(2005年12月20日);「MHCクラスI制限免疫応答を制御する方法(METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE)」と題する米国特許仮出願第60/479,393号(2003年6月17日出願);並びに共に「予防目的又は治療目的で、MHCクラスI拘束性エピトープに対する免疫応答を誘起、向上及び維持する方法(METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE)」と題する米国特許出願第10/871,707号(公開番号2005
0079152)及び米国特許仮出願第60/640,402号(2004年12月29日出願)に記載されている。また、類似体を研究に用いて、さらなる最適な類似体を得ることができる。多くのハウスキーピングエピトープは、米国特許出願第10/117,937号(2002年4月4日出願)(公開番号20030220239A1)及び同第10/657,022号(公開番号20040180354)、並びにPCT国際出願番号PCT/US2003/027706(公開番号WO04022709A2)(2003年9月5日出願);並びに米国特許仮出願第60/282,211号(2001年4月6日出願);同第60/337,017号(2001年11月7出願);同第60/363,210号(2002年3月7日出願);及び同第60/409,123号(2002年9月5日出願)で提示されており、これらの出願はそれぞれ、「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」と題されている。類似体はさらに、これらの出願に記載されている種々の形態のいずれでも用いることができる。本発明の類似体から成るか又はこれを含み得るエピトープクラスターは、「エピトープクラスター(EPITOPE CLUSTERS)」と題する米国特許出願第09/561,571号(2000年4月28日出願)に開示及びより詳細に定義されている。本発明の類似体を使用及び送達する方法は、それぞれ「CTL応答を誘起する方法(METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」と題する米国特許出願第09/380,534号及び米国特許第6977074号(2005年12月20日発行)、及びPCT国際出願番号PCTUS98/14289(公開番号WO9902183A2)に記載されている。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択原理は、全て「抗原提示細胞におけるエピトープの同調(EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTIN
G CELLS)」と題する米国特許出願第09/560,465号(2000年4月28日出願)、同第10/026,066号(公開番号20030215425A1)(2001年12月7日出願)及び同第10/005,905号(2001年11月7日出願);「エピトープの発見方法(METHOD OF EPITOPE DISCOVERY)」と題する米国特許第6,861,234号(2005年3月1日発行、出願第09/561,074号);「エピトープクラスター(EPITOPE CLUSTERS)」と題する米国特許出願第09/561,571号(2000年4月28日出願);「癌に関する抗新血管系の生成(ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER」と題する同第10/094,699号(公開番号20030046714A1)(2002年3月7日出願);共に「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」と題する出願第10/117,937号(公開番号20030220239A1)及びPCT国際出願番号PCTUS02/11101(公開番号WO02081646A2)(共に2002年4月4日出願);並びに、共に「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」と題する出願第10/657,022号及びPCT国際出願番号PCT/US2003/027706(公開番号WO04022709A2)(共に2003年9月5日出願)において開示されている。ワクチンプラスミドの全体的な設計の態様は、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」と題する米国特許出願第09/561,572号(2000年4月28日出願)、及び「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN)」と題する同第10/292,413号(公開番号20030228634A1)(2002年11月7日出願);共に「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES
OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS)」と題する同第10/225,568号(公開番号2003−0138808)(2002年8月20日出願)、PCT国際出願番号PCT/US2003/026231(公開番号WO2004/018666)(2003年8月19日出願);並びに「プラスミド増殖における望ましくない複製中間体の回避(AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION)」と題する米国特許第6,709,844号に開示されている。特定の癌に対する免疫応答に関して特定の利点を有する具体的な抗原の組合せは、全て「様々な種類の癌に対するワクチンにおける腫瘍関連抗原の組合せ(COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS)」と題する米国特許仮出願第60/479,554号(2003年6月17日出願)及び米国特許出願第10/871,708号(2004年6月17日出願)、並びにPCT国際出願番号PCT/US2004/019571(公開番号WO2004/112825)に開示されている。腫瘍新血管系に関する抗原(例えば、PSMA、VEGFR2、Tie−2)も、癌疾患に関して有用であり、それは、「癌に対する抗新血管系の生成(ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER」と題する米国特許出願第10/094,699号(公開番号20030046714A1)(2002年3月7日出願)に開示されている。生体応答調整物質の標的投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法は、米国特許仮出願第60/640,727号(2004年12月29日出願)に開示されている。免疫応答の誘起においてCD4+細胞をバイパスする方法は、米国特許仮出願第60/640,821号(2004年12月29日出願)に開示されている。例示的な疾患、組織及び抗原、並びに対象とされる組織、細胞及び疾患に関するエピトープは、「CTL応答を誘起させる方法(METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE)」と題する米国特許出願第6977074号(2005年12月20日発行)(2001年2月2日出願)に開示されている。例示的な方法は、共に「様々な種類の癌に関する診断における腫瘍関連抗原の組合せ(COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS)」と題する米国特許仮出願第60/580,969号(2004年6月17日出願)及び米国特許出願第2006−0008468号(A1)(2006年1月12日発行)に見出される。方法及び組成物はまた、「様々な種類の癌に対する組成物における腫瘍関連抗原の組合せ(CO
MBINATIONS OF TUMOR-ASSOCAITED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCER)」と題する米国特許仮出願第60/640,598号(2004年12月29日出願)に開示されている。本発明の類似体を利用することを含む免疫方法による免疫応答を評価及びモニタリングする診断技法の統合されたものは、共に「診断方法と治療方法とを統合することによる有効な免疫療法の有効性の改良(IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS)」と題する米国特許仮出願第60/580,964号(2004年6月17日出願)及び米国特許出願第US−2005−0287068号(A1)(2005年12月29日公開)により詳細に記載されている。免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法(EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN)と題する米国特許出願第10/292,413号(公開番号20030228634A1)(2002年11月7日出願)、並びに共に「癌細胞及び腫瘍問質において発現される優性エピトープ及びサブ優性エピトープに対する多価免疫応答を誘起させる方法及び組成物(METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA)」と題する米国特許仮出願第60/691,579号(2005年6月17日出願)及び対応する米国特許出願第 号(本出願と同一日付で出願、代理人整理番号MANNK.053A)に開示されている。問題の方法及び組成物を含むさらなる有用な開示は、「癌腫に対する多価維持増幅免疫治療薬(MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA)」と題する米国特許仮出願第60/691,581号(2005年6月17日出願)に見出される。さらなる方法、組成物、ペプチド、及びペプチド類似体は、それぞれ「SSX−2ペプチド類似体(SSX-2 PEPTIDE ANALOGS)」及び「NY−ESOペプチド類似体(NY-ESO PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許仮出願第60/581,001号及び同第60/580,962号(ともに2004年6月17日出願)に開示されている。上記の段落に記述されている出願及び特許はそれぞれ、教示する全てのものに関して参照によりその全体が本明細書に援用される。さらなる類似体、ペプチド及び方法は、「SSX−2ペプチド類似体(SSX-2 PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許出願公開番号20060063913;及び「エピトープ類似体(EPITOPE ANALOGS)」と題する米国特許出願公開番号2006−0057673A1(2006年3月16日公開);及び「エピトープ類似体(EPITOPE ANALOGS)」と題する及びPCT国際公開第WO/2006/009920(全て2005年6月17日出願)、並びに「エピトープ類似体(EPITOPE ANALOGS)」と題する米国特許仮出願第60/691,889号(2005年6月17日出願);並びに「初回刺激ペプチド類似体(PRAME PEPTIDE ANALOGUES)」と題する米国特許出願第 / 号(代理人整理番号MANNK.052A)、「PSMAペプチド類似体(PSMA PEPTIDE ANALOGUES)」と題する米国特許出願第 / 号(代理人整理番号MANNK.052A2)、並びに「黒色腫抗原ペプチド類似体(MELANOMA ANTIGEN PEPTIDE ANALOGUES)」と題する米国特許出願第 / 号(代理人整理番号MANNK.052A3)(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)に開示される。例示的な免疫原性産物は、それぞれ「癌腫のための多価維持増幅免疫療薬(MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA)」と題する米国特許仮出願第60/691,581号(2005年6月17日出願)及び米国特許出願第 / 号(本出願と同一日付で出願された代理人整理番号MANNK.054A)(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)に開示される。さらなる方法論及び組成物は、「SSX−2ペプチド類似体(SSX-2 PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許仮出願第60/581,001号(2004年6月17日出願)、及び「NY−ESOエピトープ類似体(NY-ESO PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許仮出願第60/580,962号(2004年6月17日出願)
(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)に開示されている。参照により本明細書に明示的に援用される他の出願は、「SSX−2ペプチド類似体(SSX-2 PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許出願第11/156,253号(公開番号 )(2005年6月17日出願)、「NY−ESO−1ペプチド類似体(NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS)」と題する米国特許出願第11/155,929号(2005年6月17日出願)(公開番号 )、「生体応答調整物質のリンパ組織への標的投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法(METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS」と題する米国特許出願第11/321,967号(2005年12月29日出願);「予防目的又は治療目的で、MCHクラスI拘束性エピトープに対する免疫応答を誘起、向上及び維持する方法(METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE
REPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES)」と題する米国特許出願第11/323,572号(2005年12月29日出願);「免疫応答の誘起においてCD4+細胞をバイパスする方法(METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE)」と題する米国特許出願第11/323,520号(2005年12月29日出願);「様々な種類の癌に対する組成物における腫瘍関連抗原の組合せ(COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS)」と題する米国特許出願第11/323,049号(2005年12月29日出願);「様々な種類の癌に関する診断における腫瘍関連抗原の組合せ(COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR
VARIOUS TYPES OF CANCERS)」と題する米国特許出願第11,323,964号(2005年12月29日出願)である。一例であってそれらに限定されないが、各参考文献は、クラスI MHC拘束性エピトープ、類似体、類似体の設計、エピトープ及び類似体の使用、並びにエピトープを使用及び生成する方法、それらの発現に関する核酸ベクターの設計及び使用、及び配合について教示しているものに関して参照により援用される。
そのエピトープをMHC制限様式でT細胞によって認識することができる抗原が多数存在し、これらの抗原に対して指示される免疫応答の操作は治療的又は予防的潜在性を有する。本明細書中に記載のMHC結合ペプチド類似体作製の原理は、一般に、これらの抗原及びそのエピトープのいずれかに適用可能である。本開示は、特に、腫瘍関連抗原((TuAA)SSX−2、NY−ESO−I、PRAME、PSMA、チロシナーゼ、及びメラン−A)由来のエピトープに注目している。
al., Cancer Res. 63(17): 5601-6, 2003; Ayyoub M, et al. J Immunol. 168(4): 1717-22, 2002)(参照によりその全体が本明細書に援用される)。2つのHLA−A2制限T細胞エピトープ、すなわち、SSX−241-49(Ayyoub M, et al. J Immunol. 168(4)
: 1717-22, 2002;「HLA分子と結合する、SSX分子又はNY−ESO−1分子に存在するアミノ酸配列から成る単離ペプチド(ISOLATED PEPTIDES CONSISTING OF AMINO ACID SEQUENCES FOUND IN SSX OR NY-ESO-1 MOLECULES, THAT BIND TO HLA MOLECULE)と題する米国特許第6,548,064号;「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」と題する米国特許出願第10/117,937号(米国特許出願公開番号2003−0220239A1)、並びにSSX−2103-111(Wagner C, et al. Cancer Immunity 3:18, 2003)(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)は近年、T細胞逆免疫を用いて同定されている。両方のエピトープのC末端は、in vitroプロテアソーム消化によって効率的に生成される。SSX−2陽性患者の腫瘍浸潤リンパ節から単離されたHLA−A*0201/SSX−241-49多量体+CD8+T細胞は、高機能性アビディティ(high functional avidity)を示し、SSX−2陽性腫瘍を効果的に識別することができる。しかしながら、この自然発生的な免疫学的応答が疾患の進行のかなり後期まで現れず、また、活性化T細胞が十分に多くないことから、この免疫学的応答は、腫瘍の成長を停止させるのに十分ではなかったであろう。米国特許第6,548,064号(参照によりその全体が本明細書に援用される)は、SSX−2エピトープのP2位置及びPΩ位置の両方において、T又はA残基を置換することをさらに記載している。
vitro検定で生成されることを報告している。単独又は別の部位のAと組み合わされる、PΩにおける類似体置換基A、V、L、I、P、F、M、W又はGは、共に「NY
−ESO−1ペプチド誘導体及びその使用(NY-ESO-1-PEPTIDE DERIVATIVES AND USES THEREOF)」と題する米国特許第6,417,165号及び同第6,605,711号に開示されている。この段落に記載されている参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
PREPARATIONS FOR CANCER)」と題する米国特許出願第10/094,699号(米国特許出願公開番号2003−0046714A1)(2002年3月7日出願)(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される)により詳細に記載されている。上記公開特許及び出願に記載されている教示及び実施形態は、本発明に関し、且つ本発明に関連して有用な支持する原理及び実施形態を提供する。簡潔に言うと、腫瘍が成長するにつれて、新たな血管の内部成長を高める。これは、非血管新生腫瘍の中心が一般的に懐死性であるため、成長を維持するのに必要であると理解され、また、血管形成阻害剤が腫瘍退縮を起こすことが報告されている。このような新たな血管、又は新血管系は、確立した脈管に見られない抗原を発現し、したがって、特異的に標的とされ得る。新血管系抗原に対するCTLを誘起することによって、脈管を破壊させ、腫瘍への栄養分の流れ(及び腫瘍からの水の除去)を妨げて、退縮をもらす可能性がある。
ぼ同一であり、異なる発現プロファイルを有する。したがって、より好ましいエピトープは、アミノ酸58〜308から見つかるN末端のものである。PSMA288-297は、「HLA結合ペプチド及びその使用(HLA BINDING PEPTIDES AND THEIR USES)」と題するPCT国際公開第WO01/62776号(参照によりその全体が本明細書に援用される)におけるHLA−A2結合モチーフを有すると確認された。ハウスキーピングプロテアソームを用いた消化及びHLA−A2への実際の結合によるin vitroにおけるその産生は、「エピトープ配列(EPITOPE SEQUENCES)」と題する米国特許出願公開番号20030220239に開示されている。
上記のように、癌患者におけるSSX−2に対する天然の免疫応答(SSX−241-49に対する応答が含まれる)は、癌の制御で有効でない場合がある。さらに、野生型SSX−241-49は、中程度にしか免疫原性を示さないペプチドであり、その臨床的潜在性がさらに制限され得る。スーパーアゴニスト類似体の使用によって誘導されたより強いSSX−2特異的免疫応答により、SSX−2陽性腫瘍を有する患者で臨床的利点が得られた。
peptides from the melanoma antigen gplOO modified at HLA-A*0201-binding residues)」(J Immunol. 1996, 157(6): 2539-48)(その全体が本明細書中で参考として援用される)及びHer−2 369−377(Vertuani et al.,「MHC接触残基の修飾によるHER−2/neuの免疫優勢エピトープの改善された免疫原性(Improved immunogenicity of an immunodominant epitope of the HER-2/neu protooncogene by alterations of MHC contact residues)」(J Immunol. 2004, 172(6): 3501-8)(その全体が本明細書中で参考として援用される)等)を有する類似の修飾物が首尾よく得られている。
ックマウスにおいて増強されたCTL免疫応答を誘導した。得られたCTLは、in vivo及びin vitroの両方でA2+及びSSX−2+腫瘍細胞株を有効に溶解することができ、このことは、類似体を使用して生成されたCTLが天然に細胞表面に提示される野生型SSX−241-49エピトープを認識することができることを示している。野生型SSX−241-49エピトープと比較して、類似体は、癌ワクチン開発のより良好な候補である。
実施形態は、配列KASEKIFYV(配列番号1)の置換を含むSSX−241-49ペプチドに関する(図1を参照のこと)。さらなる実施形態では、類似体は、一般に、配列KASEKIFYVY(配列番号1)を有するSSX−241-50十量体ペプチドの類似体であり得る。本明細書中で、ペプチド内の位置を指定するために、ペプチドを構成する残基又はアミノ酸を、P1〜P9又はP1〜P10という。N末端からC末端に番号をつける場合、九量体中のP1はN末端リジンに対応し、P9はC末端バリンに対応する。或いは、残基を、残基が含まれる分子の一次活性によって言及することができる。例えば、残基P2をN末端一次アンカー分子として記載し、P9(又は十量体ではP10)を一次C末端アンカーとして記載する。残基P4、P6、及びP8は、主にTCR相互作用に関与する。置換は任意のアミノ酸(当業者に既知の標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる)を使用することができる。多数の例示的アミノ酸を本明細書中に開示しているが、本明細書中に記載の置換は、全ての推測される置換が含まれるリストであることを意味せず、可能な置換の例である。当業者は、カタログ及び参考文献中に多数の他の非標準アミノ酸を見出すことができ、これらを本明細書中に記載の類似体と共に使用するために購入するか化学的に生成することができる。
ertuani S, et al. J Immunol. 172(6): 3501-8, 2004)(その全体が本明細書中で参考として援用される)等の多数の他の腫瘍関連エピトープを使用して、類似の修飾を行った。
N末端一次アンカーは、ペプチドの第2のN末端アミノ酸であり、且つN末端近位一次アンカーである。これは、主に、MHC分子との相互作用に関与し、置換によって結合及び安定性を改良することができる。しかし、TCR相互作用にも二次的に関与し得る。したがって、この部位での置換により、MHC分子との相互作用が改良され、TCRとの相互作用も改良されたペプチドを得ることができる。
N末端二次アンカーは、N末端の第1のアミノ酸である。この残基は、Lys41であり、HLA−A*0201分子との相互作用における二次アンカー残基と定義される。しかし、一定の程度までのT細胞受容体との相互作用にも関与している。したがって、この位置の修飾により、より免疫原性が高く、且つ腫瘍ワクチンの開発により適切ないくらかヘテロクリティックな類似体を生成することができる。この位置でのリジンは一般に好ましいと見なされているが、置換によってより改良された性質を得ることができる。
可能な任意のアミノ酸が含まれる)又は当業者に既知のアミノ酸(標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる)を使用することができる。さらなる実施形態では、Lys43を、芳香族アミノ酸に置換することができる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:Phe、Tyr、Trp、及びD−Lys。表2は、N末端二次アンカーの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
1つの実施形態では、一次及び二次アンカー残基の両方を置換して、HLA分子に対する結合親和性を改良した。さらなる実施形態では、二重置換により、HLA分子に対する結合安定性を改良した。さらなる実施形態では、結合及び/又は安定性が改良されずにさらに減少することさえあったが、分子の他の性質(寛容化個体による活性又は認識等)を改良した。表3は、N末端一次及び二次アンカーの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
野生型ペプチドのC末端Valは、一般に好ましいアンカー残基であり、主にMHC分子との相互作用に関与する。しかし、置換を行い、どのアミノ酸が一次及び二次N末端修飾をされた類似体を改良するかを同定した。これらのC末端置換は、1つ又は複数のN末端修飾の非存在下でも使用しえる。
ミノ酸に置換する。表4は、N末端一次/二次アンカーの修飾及びC末端一次修飾並びにそれぞれの結果のまとめである。
TCR部位は、一般に、残基P4、P6、及びP8として認識されており、TCRへの
結合に関与する一次残基である。しかし、他の残基もより小さな範囲の相互作用に関与し得る。1つの実施形態では、主にTCR相互作用に関与する1つ又は複数の部位を置換して相互作用を増加させることができる。好ましくは、これらの置換により、MHC分子への結合を妨害しないが、野生型ペプチドの寛容問題を克服するヘテロクリティック類似体を生成することができる。さらなる実施形態では、P1、P2、及び/又はP9位での少なくとも1つの置換と共に少なくとも1つのTCR置換を含むことができる。さらなる実施形態では、任意の1つ又は複数のP4、P6、及びP8位での置換は、極性アミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、P8位の芳香族アミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、P6位に大きな脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、相互作用を保存するためのより大きな側鎖を有するアミノ酸であり得る。表5は、N末端一次/二次アンカー及びTCR残基の修飾並びにそれぞれの結果のまとめである。
いくつかの実施形態では、遊離カルボン酸の代わりにアミドを含むようにC末端残基を修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが9量体(九量体)である場合、P9残基を修飾することができる。ペプチドが10量体(十量体)である場合、P10残基を修飾することができる。好ましくは、これにより、生体媒質(血液、リンパ、及びCNSが含まれるが、これらに限定されない)中での安定性が増加したペプチド又は類似体が得られる。好ましくは、ペプチドは、ワクチン接種又は免疫原として有用な類似体を得るための他の必要な活性を保持することができる。表6は、C末端アミドの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
一般的なMHC結合ペプチドの長さは、約8アミノ酸長から約11アミノ酸長まで変化し得る。しかし、前に使用したほとんどのHLA−A*0201は、9量体(九量体)又は10量体(十量体)である。したがって、1つの実施形態では、類似体は、野生型配列SSX−241-50の類似体であり得る。しかし、野生型10量体が正確な結合モチーフを有せず、且つ免疫学的活性を示さないので、P10位のアミノ酸の置換及び種々の野生型及び類似体の影響の同定によって10量体を作製した(図1Bを参照のこと)。
図1A及び図1Bに関して、任意の残基を保存的アミノ酸に置換することもできる。保存的置換を、影響を与えることができる上記置換のいずれかと組み合わせることができる。或いは、保存的置換は、一次、二次レベル、又は三次レベルでさえもいかなる活性にも関与しないと考えられる残基で特異的に行うことができる。このような残基には、P3、P5、及びP7が含まれる。例えば、P3位のセリンをアラニン又はトレオニンに置換して、類似体を生成することができる。一般的には、このような保存的置換は、類似体の活性に有意に影響を与えないが、いくつかの実施形態では、保存的置換は、一定の活性を増加させるか、一定の活性を減少させることができる。
一般的な又はSSX−2エピトープに適用されるような類似体設計の種々の実施形態及び態様に関する多数の特徴を上記に開示している。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
免疫学的性質を有し得る。
類似体は、一般に、配列SLLMWITQC(配列番号25)を有するNY−ESO−1157-165の類似体である。野生型アミノ酸が好ましいか否かの分析には、他のペプチド−MHC又はTCR相互作用の以前の分析を使用した。例えば、C末端のシステインは、HLA分子と強く相互作用しないので、一般に、好ましくないアンカー残基である。したがって、この残基を置換することが非常に好ましかった。しかし、P1位のセリンが一般に好ましいにもかかわらず、芳香族の置換により性質が改良されたペプチドを生成することができることが見出された。さらに、P2位のロイシンは一般に許容可能であるが、疎水性且つ/又は嵩高いアミノ酸の置換により、性質が改良されたペプチドが得られた。残基は、主に、TCRとの相互作用に関与し(P4、P6、及びP8)、これはいくらかの極性を優先する傾向があり、P8の場合、芳香族は、一般に、好ましい性質を有するペプチドを生成した。
含まれる)を置換することができる。さらなる実施形態では、P8の残基を芳香族残基に置換することができる。以下の置換の例を、図13A〜図13Cに示す。
N末端一次アンカーは、ペプチドの第2のN末端アミノ酸であり、したがって、N末端近位一次アンカーである。元のロイシン158はMHC分子への結合に「好ましくない」と見なされないが、置換によって結合が改良されたペプチドを生成することができる。したがって、1つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のLeu158を、類似又はより疎水性の高いアミノ酸と置換することができる。任意の疎水性アミノ酸(利用可能であるか当業者に既知のアミノ酸(標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる)が含まれる)を使用することができる。さらなる実施形態では、元のLeu158を、これもまた嵩高い側鎖を保有するより疎水性の高いアミノ酸と置換することができる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:Leu、Val、Ile、Met、α−アミノ酪酸、ノルロイシン、及びノルバリン。さらに、ナフタル側鎖も置換することができる。好ましくは、置換により、HLA分子との結合及び安定性が改良される。しかし、この残基は、TCR相互作用に二次的又は三次的に関与し得、置換により、TCRによる認識も改良することができる。
N末端二次アンカーは、N末端又はP1の第1のアミノ酸である。この残基は、多数の相互作用に関与する。Ser157残基を、HLA−A*0201分子との相互作用における二次アンカー残基と定義した。これは、一定の程度までのT細胞受容体との相互作用にも関与している。したがって、この位置の修飾により、より免疫原性が高く、且つ腫瘍ワクチンの開発により適切ないくらかヘテロクリティックな類似体が生成される。したがって、置換により、種々の質を改良することができる。
1つの実施形態では、一次及び二次アンカー残基の両方を置換して、HLA分子に対する結合親和性を改良した。さらなる実施形態では、二重置換により、HLA分子に対する結合安定性を改良した。さらなる実施形態では、結合及び/又は安定性が改良されずにさらに減少することさえあったが、分子の他の性質(寛容化個体による活性又は認識等)を改良した。
野生型ペプチドのC末端システインは、一般に好ましくないアンカー残基である。この残基は、一般に、主にMHC分子との相互作用に関与するので、MHC分子とのより強く相互作用する残基を置換することが好ましいと思われる。したがって、置換により、結合親和性及び安定性の改良が示され、いくつかの場合、交差反応性が減少した類似体が得られた。いくつかの実施形態では、C末端への置換により、交差反応性を減少させることなく結合及び/又は安定性が改良されたペプチドを得ることができる。しかし、他の実施形態では、C末端への置換により、交差反応性が同等又は減少した、結合及び/又は安定性が改良されたペプチドを得ることができる。この残基の置換によって改良されたペプチド
が得られることが以前に示されていたので、MHC分子との相互作用及び他の相互作用(TCRによる認識等)がより改良されたペプチドを生成することが好ましいと思われる。したがって、いくつかの実施形態では、C末端置換を、少なくとも1つの他の置換と組み合わせることができる。C末端へのアミノ酸置換の例には、バリン、リジン、アラニン、及びイソロイシンが含まれるが、これらに限定されない。
TCRとの相互作用に関与する一次残基を、一般に、残基P4、P6、及びP8として認識する。しかし、他の残基もより小さな範囲の相互作用に関与し得る。1つの実施形態では、主にTCR相互作用に関与する部位のうちの1つ又は複数を置換して相互作用を増加させることができる。好ましくは、これらの置換により、MHC分子への結合を妨害しないが、野生型ペプチドの寛容問題を克服するヘテロクリティック類似体が生成される。1つの実施形態では、P1、P2、及び/又はP9位での少なくとも1つの置換と共に少なくとも1つのTCR置換を含むことができる。1つの実施形態では、いくらかの極性を有するアミノ酸を、P4、P6、及びP8で置換することができる。さらなる実施形態では、芳香族アミノ酸を、P8位で置換することができる。
いくつかの実施形態では、遊離カルボン酸の代わりにアミンを含むようにC末端残基を修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが9量体(九量体)である場合、P9残基を修飾することができる。ペプチドが10量体(十量体)である場合、P10残基を修飾することができる。好ましくは、これにより、生体媒質(血液、リンパ、及びCNSが含まれるが、これらに限定されない)中での安定性が増加したペプチド又は類似体が得られる。好ましくは、ペプチドは、ワクチン接種又は免疫原として有用な類似体を得るための他の活性を保持する。
一般的なMHC結合ペプチドの長さは、約8アミノ酸長から約11アミノ酸長まで変化する。しかし、前に使用したHLA−A*0201のほとんどは、9量体(九量体)又は10量体(十量体)である。したがって、1つの実施形態では、類似体は、野生型配列NY−ESO−1157-166の10量体であり得る。しかし、野生型10量体が正確な結合モチーフを有せず、且つ免疫学的活性を示さないので、P10位のアミノ酸の置換及び種々の修飾の影響の同定によって10量体を作製した(図13A〜図13Cを参照のこと)。1つの実施形態では、C末端で野生型に付加又は置換した残基を、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群から選択することができる。
図13A及び図13Cに関して、任意の残基を保存的アミノ酸に置換することもできる。保存的置換を、影響を与えることができる上記置換のいずれかと組み合わせることができる。或いは、保存的置換は、一次、二次レベル、又は三次レベルでさえもいかなる活性にも関与しないと考えられる残基で特異的に行うことができる。このような残基には、P3、P5、及び/又はP7が含まれ得る。保存的置換は当業者に既知であるが、例えば、P3位のロイシンをアラニン又はトレオニンに置換して、類似体を生成することができる。一般的には、このような保存的置換は、類似体の活性に有意に影響を与えない。しかし、いくつかの実施形態では、保存的置換は、一定の活性を増加させるか、又は一定の活性を減少させることができる。既知の相互作用により、このような保存的置換が任意の活性に有意に影響を及ぼす可能性はない。
一般的な又は特定のエピトープに適用されるような類似体設計の種々の実施形態及び態
様に関する多数の特徴を上記に開示している。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
いくつかの実施形態では、PSMA288-297類似体は、配列GLPSIPVHPI(配列番号42)の置換を含み得る。以下の実施例2中の表7中等に示す結合モチーフデータを参照すると、P2アンカー残基がA2.1拘束性エピトープ中の任意の位置の親和性に個別に最も寄与することができることを示す。この場合、P2位のアミノ酸は、最適に好ましいロイシンである。PΩアンカー残基であるイソロイシンが好ましい。T2細胞検定系を使用したin vitro結合研究(図示せず)は、天然ペプチドが特にSSX−2及びNY−ESO−1エピトープと比較して一般により優れた結合特性を有することを示した。エピトープは、比較的低濃度で有意な結合を示したが、これは、飽和に対して比較的浅い上昇を伴った。野生型エピトープを改良することができる。表7及び表8に示される分析等の分析は平均であり、特定の配列中の所与の残基の挙動は平均から逸脱し得る。上記で考察されたSSX−2及びNY−ESO−1エピトープについてNle及びNvaを用いて得た好ましい結果と一致して、Nle及びNvaを、本発明のPSMAエピトープに首尾よく使用することもできる。最後に、存在し得るエピトープに対するどのような寛容の回避も補助する変化と組み合わせた場合、類似の結合特性でさえ、ペプチドの有効な免疫原性を増加させることができる。トランスジェニックマウスモデルでは、天然ペプチドは免疫原性が不十分であり(例えば、実施例35を参照のこと)、エピトープに対する寛容を反映し得る。このエピトープが由来するPSMA領域は、マウスPSMAとヒトPSMAとの間で同一である。
上記のように、このエピトープのP2位の天然残基が遺伝子コードされるアミノ酸の間で最適な残基である。他の好ましい残基又は嵩高い疎水性残基の置換の影響を、結合の潜在的改良、寛容の破壊、及び交差反応性免疫について試験した。例示的置換には、Met、Ile、Gln、Val、Nva、Nle、及びアミノ酪酸(Abu)が含まれ得る。
N末端二次アンカーは、N末端の第1のアミノ酸である。天然Glyは、この位置でわずかに好ましいだけである。種々の所見(例えば、表7及び表8を参照のこと)は、エピトープを改良する可能性を有するアミノ酸には、Ala、Ser、Abu、及びサルコシン(Sar、すなわち、N−メチルグリシン)が含まれることを示す。
この位置での天然Ileは、一般に好ましいが最適ではない残基である。この位置での置換により、結合を改良することができる。例示的置換には、Val、Leu、Nva、及びNleが含まれ得る。
最後から2番目の位置(PΩ−1)は、二次アンカー位置及びTCR相互作用位置として共に役立ち得る。Ala、Leu、Ser、又はThrの置換は、TCR相互作用に主な影響を与え得るが、この置換は、結合の改良にも寄与し得る。P3は、結合及び免疫原性の両方に影響を及ぼし得る別の位置である。この位置でのTrpの置換により、両方を改良することができる。
類似体設計の種々の実施形態及び態様に関する多数の特徴を、一般に、又は特定のエピトープに適用するものとして上記に開示する。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
いくつかの実施形態は、配列SLLQHLIGL(配列番号71)の置換を含み得るPRAME425-433の類似体に関する。以下の実施例2中の表7中等に示す結合モチーフデータを参照すると、P2アンカー残基がA2.1拘束性エピトープ中の任意の位置の親和性に個別に最も寄与し得ることを示す。この場合、P2位のアミノ酸は、最適に好ましいロイシンである。PΩアンカー残基であるイソロイシンが好ましいが非常に好ましいわけでもなく、野生型PΩ残基が必ずしもこの位置に最も好ましいわけでもない。表7及び表8等に報告される分析は平均であり、特定の配列中の所与の残基の挙動は平均から逸脱し得る。他のエピトープについてNle及びNvaを用いて得た好ましい結果と一致して、Nle及びNvaをこの配列と置換して同様に改良することができる。最後に、類似の結合特性すら、存在し得るエピトープに対するどのような寛容の回避をも補助する変化と組み合わせた場合、ペプチドの有効な免疫原性を増加させることができる。
以下の実施例は、類似体及び類似体の同定方法を提供する。類似体を、例えば、免疫原、ワクチンとして、及び/又は種々の癌治療のために使用することができる。類似体を、実施例1に記載のように生成した。SSX−241-49類似体を、実施例2に示すように同定し、実施例3に列挙する。類似体を、実施例4〜実施例21に示すように、改良された性質について試験した。改良された性質についてのNY−ESO−1157-165類似体の試験を、実施例22〜実施例30に示す。改良された性質についてのPSMA類似体の試験を、実施例33〜実施例38に示す。改良された性質についてのPRAME425-433類似体の試験を、実施例40〜実施例48に示す。
ペプチドを、Symphony多ペプチド合成機(PTI technologies, MA)又はABI
433Aペプチド合成機(Applied Biosystems, Foster City, CA)のいずれかによって、0.05〜0.1mmoleスケールで標準的なFmoc固相化学を使用して合成した。C末端遊離酸ペプチドを、プレロードPEG−PS樹脂(Symphony)又はWang樹脂(ABI)を使用して合成した。C末端アミド化ペプチドを、Fmoc−PAL−PEG−PS樹脂にて合成した。全ての樹脂を、Applied Biosystems (Foster Ciy, CA)から購入した。ペプチド合成で使用したFmoc−アミノ酸を、Novabiochem(San Diego, CA)及びAnaSpec(San Jose, CA)から購入した。標準的プロトコルによって合成後切断を行った。
中程度の免疫原性を示すペプチドの構造修飾により、ペプチド−MHC結合、CTL認識、及び/又は免疫原性を顕著に改良することができる。どのようにして効力が増強されたペプチド類似体を達成するために野生型エピトープを修飾するのかに関する一般的なガイドラインは、当該技術分野で既知である。認識されている戦略は、問題の特定のMHC分子への結合のためのいわゆるアンカー位置の残基を最適化することである。HLA−A2の場合、P2位及びPΩ位の疎水性残基の顕著な優先(特に、P2のL及びM、PΩのV)が認められた(PΩはエピトープのC末端残基を示す。HLA−A2については、PΩは、ペプチドの長さに応じてP9又はP10である)。P1位の芳香族残基(F、Y、及びW等)との置換も有利であり得る。
SSX−241-49類似体の試験
実施例3で生成された類似体を、活性(以下の実施例4〜実施例21中の結合及び生物学的影響等)について試験した。
HLA−A*0201へのペプチド類似体及び野生型エピトープの結合親和性を、T2細胞ベースの検定を使用して評価した(Regner M, et al., Exp Clin Immunogenet. 1996;13(l):30-5)(その全体が本明細書中で参考として援用される)。
MHC上のペプチド安定性(Koff)を、一般に、結合(Kon)から単独で推測することができない。結合に加えて、T細胞の活性化が「シグナル1」(MHCペプチド複合体のT細胞受容体との相互作用)の持続時間に依存するので、MHCクラスI上のペプチドの安定性は、このようなペプチドの免疫学的性質に関して重要であることが既知である。安定性検定について、簡潔に述べれば、TAP発現を欠き、それにより、細胞表面上に安定なMHCクラスIをアセンブリしないT2細胞を、MHCクラスIの最大負荷(「飽和」)を達成することが既知の異なる濃度のペプチド(対照又は類似体)にて37度で一晩パルスし、十分に洗浄し、内因性タンパク質合成を遮断するエメチンの存在下で異なる間隔で追跡した。十分な洗浄後、細胞を、MHCクラスI(A2対立遺伝子)を認識する蛍光タグ化抗体で染色し、FacsScan分析器に通した。所与の濃度の類似体及びネガティブ対照(非MHC結合物)に対応するMFI(平均蛍光強度)の相違は、MHCとペプチドとの間でいくつの安定化複合体がT2細胞表面上に提示されたかについての関数である。長期間のシグナルの減衰を、0時間(追跡間隔の開始時)での結合と比較した安定性指標の50%として数学的に示す。
又は治療上有利な改良された組成物を生成するためのプラットフォームとして有用である。
ペプチドの免疫学的性質を、MHC分子(Kon及びKoff)及びTCRへの結合の関数(TCRとMHC−ペプチド複合体との間の相互作用の親和性)として記載することができる。一次MHCアンカー残基の修飾は、一般に、MHC分子への結合に及ぼす全影響を有意に予測可能である。
1.T細胞活性化(例えば、サイトカイン産生)を示す効果を誘発するために必要なペプチド類似体の最小濃度、
2.任意の類似体濃度での最大(ピーク値)効果(例えば、サイトカイン産生)、
3.効果(例えば、サイトカイン産生)を活性化するピーク値での類似体濃度。
. 185(12):2043-51, 1997(その全体が本明細書中で参考として援用される))を、鼠径リンパ節への両側投与によって、25μgのpIpCと混合した50μgのSSX−2天然エピトープ(41−49)で免疫化した。最後の追加免疫から7日後、マウスを屠殺し、脾細胞の懸濁液を、完全HL−1培地中に5×106細胞/mlで調製した。平底96ウェルプレート(200μl/ウェル)中で細胞を異なる濃度のペプチドと48時間インキュベートし、ウェルに添加した10U/mlのrIL−2とさらに24時間インキュベートした。上清を回収し、ELISA等の標準的方法によってIFN−γ濃度を評価した。
上記の戦略(実施例6、図2)を適用して、その野生型バージョン中の天然SSX−241-49エピトープ(KASEKIFYV(配列番号1))と比較して1つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした(図3)。ex vivoでIFN−γ産生を誘発するために必要な類似体の最少量と任意の濃度の類似体での最大サイトカイン産生量との間に強い逆相関が認められた。
実施例6(図2)由来の戦略を適用して、その野生型バージョン中の野生型SSX−241-49エピトープと比較して2つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした(図4)。
でTCRへの結合に関与するので、このような二重変異ペプチドにより、寛容が破壊する(したがって、実際の適用に有用である)様式でTCRとの相互作用に影響を及ぼす機会が増加する。以下:Y(41位)のV(42位)との置換、W(41位)のI又はL(42位)の置換、及びF(41位)のL、V、I(42位)との置換の組み合わせにより、野生型ペプチドと比較してより活性が高い類似体が得られた。41位のYと42位のIとの間の組み合わせ又は41位のWと42位のV又はMとの間の組み合わせにより、野生型ペプチドに類似の活性が付与された。41位のKのD−リジンとの置換により、この検定で保持された活性が減少した類似体がもたらされた。非標準アミノ酸を含むこのようなペプチドの代謝性分解がin vivoで減少するので、このようなペプチドは非常に有用であり得る。
実施例6(図2)由来の戦略を適用して、その野生型バージョン中の天然SSX−241-49エピトープと比較して3つ以上の置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした(図5)。
実施例6(図2)由来の戦略を適用して、名目上のSSX−241-49ペプチドを含む十量体の類似体のライブラリーをスキャンした(図6)。
HCに対する安定性の増加及び/又はTCRとのとの相互作用のわずかな修飾に起因する潜在的に高いin vivo活性。
3つのマウス群(n=4)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってSSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、28日目及び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(類似の量)を行った。免疫化計画を、図7に示す。追加免疫から1週間後、脾細胞を、SSX−241-49天然ペプチドにてex vivoで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識標的細胞(T2細胞)に対して試験した(図8)。結果は、類似体A42Vが追加免疫剤として類似体A42L又は野生型ペプチド自体と比較して天然ペプチドを発現する標的細胞に対してより高い応答を誘発することを示した。これは、ex
vivo実験によって決定された結合及び安定性のパラメーターと相関した。
8つのマウス群(n=4)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってSSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図9に示すように、ネガティブ対照ペプチド(メラン−A 26−35「EAA」)、天然ペプチド、又は類似体を使用して、28日目及び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(類似の量)を行った。
8つのマウス群(n=4)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってSSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図9に示すように、ネガティブ対照ペプチド(メラン−A 26−35「EAA」)、天然ペプチド、又は類似体を使用して、28日目及び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(類似の量)を行った。
して増加した細胞傷害性を媒介した。
表3中に示す置換類似体を試験した場合、類似体は、野生型ペプチドエピトープと比較して、結合及び安定性プロファイルが改良された。しかし、各類似体の改良の程度は異なり、A42Vの置換はHLA−A*0201分子との結合親和性に関して最も高い改良を示した。さらに、A42V−HLA−A*0201複合体の安定性は、野生型ペプチドとHLA−A*0201との間で形成された複合体よりも良好であり、T1/2は、11.5時間〜20時間に延長された。42AからL、V、及びMに置換されたペプチドは、顕著により低い濃度で、野生型ペプチド特異的CTLのIFN−γ分泌を誘導することができた。42AのIへの置換により、結合及び安定性プロファイルが改良された類似体が生成された。P2位の残基は、一定の程度でTCRとの相互作用にも関与し得る。この所見はまた、野生型エピトープと比較してHLA−A*0201との結合親和性が類似した42AをAibに置換した類似体を用いた結果によって支持される。
N末端二次アンカーは、N末端の第1のアミノ酸である。したがって、1つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のLys43を、より疎水性が高く嵩高いアミノ酸で置換する。任意のより疎水性が高く嵩高いアミノ酸(任意の利用可能であるか当業者に既知のアミノ酸(標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる)が含まれる)を使用することもできる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:Phe、Tyr、Trp、及びD−Lys。
一次及び二次アンカー残基の両方のN末端を修飾した場合、一般的傾向として、得られた類似体はHLA−A*0201分子との親和性の改良及び安定性の拡大(表3)が証明され、わずかであるが以下が例外である:(K41Y、A42V)、(K41Y、A42M)、及び(K41(D−Lys)、A42V)。さらに、類似体は、野生型ペプチド特異的CTLと非常に良好な交差反応性を有していた。K41W置換のA42V又はA42Lとの組み合わせにより、結合/安定性プロファイルが改良された。これらの類似体はま
た、野生型ペプチドと望ましい交差反応活性を有していた。N末端一次アンカー及び二次アンカーの組み合わせ修飾により、より高い程度にペプチドの構造及び高次構造が変化した。
野生型ペプチドのC末端Valは、好ましいアンカー残基であった。しかし、1つのさらなる−CH2基を有するIleに変異した場合、効力が改良された。ValからAbuへの置換によって類似の改良も認められた。他の類似体は、MHC分子との結合親和性及び安定性が改良された。これらの類似体の結果は、ペプチドのC末端アンカー残基がT細胞認識で極めて重要な役割も果たすことを示した(表4)。
二次TCR結合アミノ酸残基の置換により、MHC分子への結合を妨害しないが、自己抗原の寛容問題を克服するヘテロクリティックな類似体が生成された。N末端一次/二次アンカー残基(K41F及びA42V)の置換及びTCR部位の置換の組み合わせにより、結合親和性及び安定性が改良された類似体が生成された(表6)。いくつかのこれらの類似体は、低濃度で野生型ペプチド特異的CTLのIFN−γ産生を誘導した(K41F、A42V、E44(Nva)/(Nle)変異体及びK41F、A42V、I46L/(Nva)/(Nle)変異体等)。
ペプチドの遊離カルボン酸C末端のアミドとの置換により、タンパク質分解に対する安定性の付与及びペプチドに対するジペプチジルカルボキシペプチダーゼ耐性の付与によって生体媒質中でのペプチドの安定性が改良された。しかし、得られた類似体のいくつかは、かなりの量のMHC分子とのその親和性並びに免疫原性及び抗原性が喪失した。予想外に、本明細書中の表7に開示の3つの類似体がMHC分子とのその結合能力を喪失したにもかかわらず、SSX−241-49−NH2(A42V)は、野生型ペプチドに類似の濃度でのIFN−γの分泌を誘導する能力によって示すように、野生型ペプチド特異的CTLとのその反応性が保持された。しかし、SSX−241-49−NH2(A42L)は、より低い濃度でIFN−γ産生を刺激することができた。
一般的なMHC結合ペプチドの長さは、8量体から11量体まで様々であり、ほとんどのHLA−A*0201結合ペプチドは9量体又は10量体である。以前の所見では、ネイティブ配列由来の9量体及び10量体は共に同一MHCの結合モチーフを保有することが見出され、同一のN末端を有していた。プロテオソームプロセシングの観点から、これらは異なるエピトープであるが、それにもかかわらず、抗原的に交差反応性を示した。野生型エピトープSSX−241-49の場合、エピトープは9量体ペプチドであり、10量体ペプチド(SSX−241-50)は、適切なMHC結合モチーフを欠き、免疫学的活性を示さなかった。したがって、野生型エピトープを、適切な結合モチーフを作製することができるアミノ酸を使用して10量体に伸長した。表8に示すように、多数の10量体類似体がHLA−A*0201分子とより低い結合親和性を有する一方で、類似体SSX−241-50(A42L、Y50L/V/Nle/Nva)は、HLA−A*0201分子との結合親和性が改良された。2つの10量体類似体(特に、A42L及びY50Nle/Nva)は、野生型ペプチドよりも低い濃度で、野生型ペプチドに対して免疫化したT細胞からのIFN−γ産生を誘導することができた。
類似体が野生型エピトープを超えて改良され得る1つの態様は、ヒト系での免疫原性及び寛容破壊の増加である。TCRレパートリーの相違は、生殖系列の相違又は負の選択の相違に起因するのかを問わず、特異な結果が得られる可能性がある。この問題に取り組むために、類似体をHLA−A2+血液のin vitro免疫化で使用して、CTLを生成した。in vitro免疫化技法は、ナイーブドナーを使用する場合でさえ、当該技術分野で既知である(例えば、Stauss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al., Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997;及びChung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999(それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される))。
NY−ESO−1157-165類似体の試験
図13に列挙した類似体を、以下の実施例22〜実施例30に示すように、活性(結合及び生物学的影響等)について試験した。
上記の戦略(実施例6)を適用して、その天然(又は野生型)バージョン中の野性型NY−ESO−1157-165エピトープと比較して1つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした(図13)。ex vivoでIFN−γ産生を誘発するために必要な類似体の最少量と任意の濃度の類似体での最大サイトカイン産生量との間に強い逆相関が認められた。
実施例6由来の戦略を適用して、野生型NY−ESO−1157-165エピトープと比較して2つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした。2位及び9位での同時半保存的修飾により、類似体の正確な同一性に応じて、類似体の免疫特性に対して顕著に影響を及ぼすことが見出された。L158IとC165V又はC165Lとの組み合わせにより、野生型ペプチドと比較して活性がさらに増加した。同様に、L158Vにより、C165V又はC165L類似体の活性が改良され、このような活性は、野生型ペプチドと比較してさらに増加した。L158Vにより、C165A又はC165I類似体の活性が保持され、一次アンカー残基の二重変異の興味深い影響を示す。同様に、L158Iにより、C165A類似体の活性が部分的に保持された。
実施例6由来の戦略を適用して、野生型NY−ESO−1エピトープと比較して複数の置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした。
実施例6由来の戦略を適用して、名目上のNY−ESO−1157-165ペプチドを含む十量体の類似体のライブラリーをスキャンした。十量体自体がin vitro活性を有意に欠く一方で、この位置での種々の置換(157位でのY及び165位でのVと組み合わせた166位でのL又は166位でのL、I、Nle等)によって活性が部分的に救済された。
HLA−A*0201に対するペプチド類似体及び野生型エピトープの親和性を、T2細胞ベースの検定によって評価した(Regner M, et al., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13 (l):30-5)(その全体が本明細書中で参考として援用される)。結合検定について、簡潔に述べれば、TAP発現を欠き、それにより、細胞表面上に安定なMHCクラスIをアセンブリしないT2細胞を、異なる濃度のペプチド(対照又は類似体)にて37℃で一晩パルスし、十分に洗浄し、MHCクラスI(A2対立遺伝子)を認識する蛍光タグ化抗体で染色し、FacsScan分析器に通した。A2に結合するペプチドは、細胞表面でのその存在を安定させる。所与の濃度の類似体及びネガティブ対照(非MHC結合物)に対応するMFI(平均蛍光強度)の相違は、MHCとペプチドとの間でいくつの安定化複合体がT2細胞表面上に提示されたかについての関数である。したがって、限界濃度のペプチドで主にKonを測定し、飽和レベルのペプチドでKon及びKoffの両方を測定する。
8つのマウス群(n=4)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対して25μgを含む25μlのPBSを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって野生型NY−ESO−1157-165エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図14に示すように、ネガティブ対照ペプチド(HBVc)、野生型ペプチド、又は類似体を使用して、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(類似の量)を行った。
野生型ペプチドに対して得られたin vivo応答を評価するために、同腹子対照HHDマウスから脾細胞を単離し、20μg/ml又は1μg/mlの野生型ペプチドと2時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、CFSEhi蛍光及びCFSEmed蛍光(それぞれ、4.0μM又は1μMで15分間)で染色し、同数のCFSElo蛍光(0.4μM)で染色した対照脾細胞を免疫化マウスに同時に静脈内注射した。18時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓及びPBMCの除去及びフローサイトメトリーによるCFSE蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照(非負荷)集団と比較して計算し、比溶解率として示した。図15Aは、ネガティブ対照ペプチドを投与したマウスにおけるin vivo細胞傷害性の欠如を示す。図15Bは、プラスミドで免疫化し、野生型ペプチドで増幅したマウスにおける種々の細胞傷害性を示す。図15Cは、プラスミドで免疫化し、類似体L158Nva
C165Vで増幅したマウスにおける実質的に一定の細胞傷害性を示す。
実施例8に記載の免疫化プロトコル及び実施例9に記載の方法論の使用の文脈では、限定量(1μM;図16A)又は最適以上の量(20μM、図16B)の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するin vivo細胞傷害性を、それぞれ2段階についてのプラスミド及びペプチド類似体を使用した同調(entrain)及び増幅プロトコル後に評価した。平均比溶解率+/−SEとして示した結果は、類似体L158V C165Nvaが最も高い活性を誘導し、類似体L158V C165V、L158V C165Nva及びS157K L158V C165Vが野生型ペプチド又はC165V変異体と同一範囲の効果を示した。複数の置換によってTCR結合部位を変化させることができるので、このような類似体は、自己エピトープに対する寛容の破壊において野生型ペプチドよりも有用であり得る。さらに、S157K三重変異体は、野生型ペプチド又は直接的使用を意図する他の類似体の不十分な可溶性を改善することができる。
実施例27に記載の免疫化プロトコル及び以下の実施例28に記載の攻撃誘発の文脈では、脾細胞を単離し、プールし、10μMの野生型ペプチドNY−ESO−1157-165でそれぞれ3日間及び6日間刺激した。上清を回収し、IFN−γ濃度を、ELISAによって測定した。
て、C165Vは、野生型ペプチドと比較して、T細胞のIFN−γを産生する能力の増加を誘導できなかった。
いわゆる代替ペプチド(placeholder peptide)を負荷したクラスI単量体を含むアビジンコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ペプチドの結合、親和性、及び解離(off-rate)を評価した。単量体コーティングしたプレートは、iTopiaエピトープ発見システムキット(Beckman Coulter, Inc., San Diego, CA, USA)の一部として供給された。検定緩衝液、抗MHC−FITC mAb、β2−マイクログロブリン、及び対照ペプチドもこのキットと共に供給された。
天然のペプチド及び類似体を、結合検定によってその各MHC分子への結合能力について最初に評価した。この検定は、各ペプチドが標準化された最適結合条件下でHLA分子に結合する能力を測定する。単量体コーティングしたプレートを最初に剥離し、代替ペプチドを放出させ、プレートに結合したMHC重鎖のみを遊離した。次いで、試験ペプチドを、抗MHC−FITC mAbと共に最適折り畳み条件下に導入した。プレートを、21℃で18時間インキュベートした。抗MHC−FITC mAbは、再折り畳みMHC複合体に優先的に結合する。したがって、各ペプチドに起因する蛍光強度を、ペプチドのMHC分子と複合体を形成する能力と比較した。各ペプチドの結合を、キットから提供されているポジティブ対照ペプチドと比較して評価し、結果を、「結合率」で示した。天然ペプチドと比較して「より良好な結合物」と同定された類似体を、その後に親和性及び解離検定で分析した。
親和性検定のために、代替ペプチドの最初の剥離後、漸増濃度(10-4〜10-8Mの範囲)の所与の対立遺伝子についての各試験ペプチドを、一連のウェルに添加し、前記条件下でインキュベートした。プレートを、フローサイトメーターで読み取った。Prismのソフトウェアを使用して、S字用量応答曲線を作成した。最大の50%を達成するのに必要なペプチドの量を、ED50値として記録した。
解離検定のために、21℃で18時間のインキュベーション後にプレートを洗浄して、過剰なペプチドを除去した。次いで、プレートを、対立遺伝子特異的単量体プレート上にて37℃でインキュベートした。プレートを、複数の時点で(0、0.5、1、1.5、2、4、6、及び8時間)、相対蛍光強度について測定した。MHC単量体から50%のペプチドを解離するのに必要な時間を、T1/2値(時間)と定義する。
iスコアは、iTopiaのソフトウェア内に提供された多重パラメーター計算である。その値を、結合、親和性、及び安定性データに基づいて計算した。
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0、3、14、及び17日目にPSMA288-297ペプチド(25μlPBS中の25μg+各リンパ節への12.5μgのpI:C)で免疫化した。追加免疫から1週間後、天然PSMA288-297ペプチドにてex vivoで脾細胞を刺激し、種々のE:T比で、51Cr標識ヒト腫瘍細胞(PSMA+A2+LnCap細胞、又はネガティブ対照としてのMHCクラスI遮断抗体でコーティン
グしたLnCap細胞)に対して試験した。比溶解率(平均±SEM)として示した結果は、PSMA特異的T細胞がMHCクラスI利用可能性に応じた様式でヒト腫瘍細胞を溶解することができ、免疫媒介性攻撃が可能な様式での腫瘍細胞のMHCクラスI上のPSMAエピトープの提示が確認されることを示した。
PSMA288-297類似体の試験
以下の実施例33〜実施例38の通りに、図19及び20に列挙した類似体を、改良された、結合の親和性及び安定性、天然エピトープとの交差反応性、並びに免疫原性等の種々の性質について試験した。
実施例31に記載の手順を使用して、PSMA288-297及び類似体の結合特性を、互いに比較して評価した(図19を参照のこと)。結合についてのポジティブ対照は、メラン−A26-35A27Lであった。天然エピトープとの交差反応性を、本質的に実施例6に記載のように、天然エピトープに特異的なT細胞株からのIFN−γ分泌を刺激するための類似体ペプチドの使用によって評価した。図19に示したデータを、10μg/mlの類似体(約10μM)での刺激によって作成した。この濃度により、一般に、類似体について最大又はほぼ最大のIFN−γが産生された。したがって、この濃度を交差反応性を示すために選択した。
上記で認められたパターンは、このエピトープにおける置換によって結合親和性が大きく損なわれず、試験した二重置換(図20)でも継続された。この二重置換は、天然ペプチドと比較して類似又は改良された結合親和性が一様に示された。両方の一次アンカー位置が置換された類似体のうち、P2でのNleのNva及びPΩでのVal並びにP2でのVal及びPΩでのNva置換を含む類似体は、結合安定性が改良され、前者の2つはIFN−γ産生が増加した(第3の類似体についてのデータは示さず)。PΩでのVal及びNva置換を、P1でのAla及びAbu置換とも組み合わせた。これらの類似体は全て、1つのPΩ置換と比較して強い結合安定性及び改良されたIFN−γ産生を示し、したがって、P1置換をさらに改良した。PΩNva置換はまた、P3 Trp置換と組
み合わせた場合、種々の結合パラメーターは一般に類似していたにもかかわらず、PΩ Vよりも良好な交差反応性を維持することができた。
P1、P2、及びP3;P1、P2、及びPΩ;P2、P3、及びPΩ;並びにP1、P3、及びPΩでの三重置換を行った(図21)。全ての場合、P1置換はAlaであり、P3置換はTrpであり、PΩ置換はVal又はNvaであった。上記のように、天然ペプチドと少なくとも類似する親和性が維持された。P1、P2、P3クラスについて、P2でのNva及びNle置換により、結合安定性が改良された。このP2 Nva類似体は、類似の量のIFN−γを誘発する一方で、Nle類似体は実質的増加を示した。
HHDトランスジェニックマウス群(n=8)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlの各リンパ節へのPBS+12.5μgのpI:Cでの鼠径リンパ節への直接接種によって、ペプチド(天然エピトープPSMA288-297又は一次又は二次アンカー残基が置換された類似体)で免疫化した。
2つのHHDマウス群(n=8)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対する25μgを含む25μlのPBSを使用した鼠径リンパ節への直接接種によって、PSMA288-297を発現するプラスミドで免疫化した。その後、天然ペプチド又はI297V類似体のいずれかを使用して、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(25μg)を行った。
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対する25μgを含む25μlのPBSを使用した鼠径リンパ節への直接接種によって、PSMA288-297エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、類似体I297Vを使用して、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫から1週間後に、脾細胞を天然PSMA288-297ペプチドにてex vivoで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識ヒト腫瘍細胞(Lncap、A2+PSMA+、又は624.38A2+PSMA-、又は対照624.28細胞A2-PSMA-)に対して一晩試験した。得られた免疫は、LNCAPに対する細胞傷害性の媒介で有効であった(図24)。
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0、3、14、及び17日目に、PRAME425-433ペプチド(各リンパ節に対する25μgを含む25μlのPBS+12.5μgのpI:C)で免疫化した。追加免疫から1週間後に、脾細胞を天然PRAME425-433ペプチドにてex vivoで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識ヒト腫瘍細胞(PRAME+A2+624.38黒色腫細胞又はA2発現が欠損されたネガティブ対照624.38細胞)に対して試験した。比溶解率(平均±SEM)として示した結果は、PRAME特異的T細胞がヒト腫瘍細胞を溶解することができ、免疫媒介性攻撃が可能な様式での腫瘍細胞のMHCクラスI上のPRAME425-433エピトープの提示が確認されることを示した(図25)。
PRAME425-433類似体の試験
図26〜図28に列挙した類似体を、以下の実施例40〜実施例48に従って、結合の親和性及び安定性の改良、天然エピトープとの交差反応性、並びに免疫原性等の種々の性質について試験した。実施例31に記載の手順を使用して、PRAME425-433及び69個の類似体のHLA−A*0201結合特性を、互いに比較して評価した。結合についてのポジティブ対照は、メラン−A26-35A27Lであった。認められた類似体の親和性を、結合率(ポジティブ対照との比較)及びED50として報告し、結合安定性を解離半減期として報告する。天然エピトープとの交差反応性を、本質的に実施例6に記載のように、天然エピトープに特異的なT細胞株由来のIFN−γ分泌を刺激するための類似体ペプチドの使用によって評価した。図26〜図28に示したデータを、約0.3μMでの類似体ペプチドでの刺激によって作成した。3つの個別の試験から結果を収集し、それぞれ天然ペプチドによって誘発されたIFN−γ量に対して正規化した。いくつかの場合、報告した値は、2つの決定値の平均である。アスタリスク「*」は、IFN−γ産生がバックグラウンドと区別できなかったことを示す。
P2一次アンカー位置のLeuに対してVal、Met、Ile、Nle、Nva、及びAbuの1つの置換を行った。これらの全類似体は、天然ペプチドの20%以内の結合率を示した。Met類似体についてのED50が天然ペプチドに匹敵する親和性を示した一方で、Nva及びIle類似体の親和性は約1/3以内に減少したが、依然としてPSMA288-287エピトープに匹敵した。全P2置換により、天然ペプチドに少なくとも類似する結合安定性が保持された。Met、Nle、及びNva類似体は、天然ペプチドの2倍以内のIFN−γ産生を誘発し、Val類似体はいくらか低かった。
上記の1つの置換の種々の組み合わせを使用して、P1及びP2、P2及びPΩ、並びにP1及びPΩで二重置換類似体を作製した(図27A及び27B)。試験したP1−P2二重置換によって結合親和性又は安定性に大きな変化はなかったが、IFN−γ検定において有意な交差反応性を示さなかった。P2−PΩ二重置換類似体で類似のパターンが認められたが、L426Nva L433Nle類似体は、IFN−γ検定において天然ペプチドと有意なレベルの交差反応性を示し、また同様に結合特性がいくらか改良された。最後に、P1−PΩ二重置換について、試験した類似体はまた、少なくとも類似の結合特性を有する一般的パターンに従うが、交差反応性検定において無視できるIFN−γを誘発した。この群の例外は、いくらか改良された結合安定性及び有意な交差反応性を示すS425F L433Nle類似体及び天然ペプチドよりもED50が1/4未満に減少し、解離半減期がほぼ2倍であり、より多くのIFN−γを誘発したS425F L433Nle類似体であった。
P1にPhe又はThr、P2にNva又はMet、及びPΩにNleを有する4つの三重置換類似体を調査した。S425T L426M L433Nale類似体が類似の親和性を有するのに対して、他の3つの類似体は親和性が改良された。P2 Nva置換された類似体は、結合安定性の増加及び有意なレベルの交差反応性を示した。図28を参照のこと。
2つのHDDトランスジェニックマウス群(n=8)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対して25μgを含む25μlのPBSを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、以下の実施例49に記載のPRAME425-433を発現するpCTLR2プラスミドで免疫化した。その後、ネガティブペプチド又はPRAMEエピトープ類似体L426Nva L433Nleを使用して、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行った。
2つのHDDトランスジェニックマウス群(n=8)を、上記の実施例43に記載のように免疫化した。
PRAME425-433を発現するプラスミド(pCTLR2)を用いて、0、3、14及び17日目に各リンパ節へ25μlのPBS中の25μgを、鼠径部のリンパ節に直接接種することによって、いくつかのHHDトランスジェニックマウス(n=4)群に免疫を与えた。この後、天然ペプチド、すなわちネガティブ対照(EAAGIGILTVペプチド(配列番号100))、又は一次及び/又は二次アンカー残基(S425F、L426Nva L433Nle、S425T L433Nle、及びS425T L426Nva L433Nle)に変異を有するPRAME425-433エピトープ類似体の28日目及び31日目の2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行なった。
3つのHHDトランスジェニックマウス群(n=4)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対して25μgを含む25μlのPBSを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、PRAME425-433を発現するプラスミド(pCTLR2)で免疫化した。その後、PRAMEエピトープ類似体L426Nva L433Nle及びS425T
L426Nva L433Nle又はネガティブ対照ペプチドメラン−A(EAAGIGILTV(配列番号100))の2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を、28日目及び31日目に行った。
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0、3、14、及び17日目の各リンパ節に対して25μgを含む25μlのPBSを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、PRAME425-433を発現するプラスミド(pCTLR2)で免疫化した。その後、類似体L426Nva L433Nleを使用した2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を、28日目及び31日目に行った。追加免疫から1週間後、脾細胞を、ex vivoにて天然ペプチドで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識ヒト腫瘍細胞(IFN−γで前処置しているか又はしていないPRAME+624.38黒色腫細胞又はHLA−A2発現が欠損したネガティブ対照624.38細胞)に対して試験した。類似体L426Nva L433Nleは、A2を発現するヒト腫瘍細胞(624.38)に対して有意
な細胞傷害性を媒介する免疫応答を誘発し、この応答は、IFNγでのその前処置の際にわずかに上昇した。対照的に、A2−624.28対照細胞に対する有意な活性は測定されなかった。図33を参照のこと。
図34に示す一般的スキームに従って、in vitro免疫化を行った。末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll分離によって健康なドナー(HLA−A*0201+)から得た。新鮮なPBMC(2.5×106)を、5ng/ml PRAME425-433又はペプチド類似体と共に、T細胞培養培地中にプレートした。その後、72時間後及び96時間後に20IU/mlのインターロイキン−2を各ウェルに添加し、7日目にさらなるペプチド(5ng/ml)を添加した。培養物をさらに10日間維持し、その後、エフェクター細胞を回収し、四量体染色で使用した。IVS PBMCを、PRAME425-433四量体で標識し、FACS Calibur(BD, San Jose, CA)にて分析した。ネガティブ対照に基づいて四分円(quadrant)を設定し、無関係のHBV四量体及びSSX2四量体で染色し、最小の10,000個のゲーティング事象を捕捉した。四量体陽性細胞を、リンパ球集団の比率として示した。PRAME425-433特異的四量体は、天然ペプチドと比較して、ペプチド類似体でのIVS後に有意に増強された。図35を参照のこと。これは、類似体が好ましい免疫原であり得ることを証明している。
pCTLR2は、PRAME由来のHLA A2特異的CTLエピトープ(アミノ酸残基425−433(SLLQHLIGL(配列番号71))及びPRAMEのエピトープクラスター領域(アミノ酸422〜509)を有する1つのポリペプチドをコードする組換えDNAプラスミドワクチンである。プラスミド中のポリペプチドのcDNA配列は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター/エンハンサー配列(CMVp)の調節下にあり、抗原提示細胞により取り込みの際にポリペプチドのメッセンジャーを有効に転写することが可能である。コード配列の3’末端のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHポリA)により、その安定性を増加させるためのメッセンジャーのポリアデニル化シグナルが得られ、このシグナルが核から細胞質に移動する。プラスミドの核への輸送を容易にするために、サルウイルス40由来の核輸送配列(NIS)を、プラスミド骨格に挿入した。CpG免疫刺激モチーフの1つのコピーをプラスミド中で操作して、免疫応答をさらに促進した。最後に、プラスミド中の2つの原核生物遺伝因子(カナマイシン耐性遺伝子(KanR)及びpMB細菌複製起点)は、大腸菌中での増幅を担う(図36を参照のこと)。
コードされたポリペプチドのアミノ酸配列(150アミノ酸残基長)を以下に示す。
するエピトープ遊離(Synchrotope(商標))配列である。隣接する定義されたPRAME CTLエピトープは、短いアミノ酸配列であり、PRAME CTLエピトープのプロセシングで重要な役割を果たすことが示されている。さらに、アミノ酸配列ispekeeqyia(配列番号197)(PRAMEアミノ酸276〜286に対応、斜体)を、数珠状(sting-of-beads)領域に操作して、コードされたポリペプチドの発現の検出を容易にした。
長い相補性オリゴヌクレオチド組の段階的ライゲーションにより、「数珠状」エピトープ遊離配列(アミノ酸90〜150)中にアミノ酸残基をコードするcDNAが生成された。これらのcDNAは、PRAMEエピトープクラスター領域(アミノ酸1〜89)をコードするcDNAでのさらなるライゲーションに使用することができる制限酵素の適切な付着末端を保有し、これらのcDNAを、鋳型としてPRAMEをコードするcDNAに対するPCRの実施によって増幅した。次いで、全挿入を、Afl IIとEcoR I部位との間のベクター骨格にライゲーションした。全コード配列を、DNA配列決定によって検証した。
H−2クラスI陰性HLA−A2.1トランスジェニックHHDマウスを、無病原体条件下に収容し、HLA−A2.1制限ヒト腫瘍関連細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープの免疫原性の評価のために使用した。8〜12週齢の雌マウスを、リンパ管内免疫化及びin vivo細胞傷害性研究のための脾細胞の単離のために使用した。マウスを、両側性鼠径リンパ節注射によって免疫化した。マウスを、イソフルレン吸入によって麻酔し、無菌条件下で外科処置を行った。外科処置のための準備の後、鼠径襞及び鼠径リンパ節を0.5cmの長さの切開によって露呈させた。最大体積25μl(25μg)のプラスミドDNAワクチン又はペプチドを、0.5mlインスリンシリンジを使用してリンパ節に直接注射した。滅菌6−0ナイロン皮膚縫合を使用して創傷を閉じた。
HHDトランスジェニックマウス(n=4/群)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってメラン−A26-35A27Lエピトープ類似体を発現するプラスミドpSEM(米国特許出願第10/292,413号(公開番号20030228634号A1)(その全体が本明細書中で参照により援用される)により完全に記載されている)で免疫化した。その後、類似体A27L、A27Nva又はA27L V35Nvaを使用して、28日目及び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫から1週間後、脾細胞を、メラン−A26-35ペプチドにてex vivoで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識ヒト腫瘍細胞(624.38細胞)に対して試験した。A27L又はA27Nva類似体での追加免疫後に得られた免疫は類似し、天然ペプチドEAAGIGILTV(配列番号100)よりも有効であった(図37)。初回刺激プラスミドがA27L類似体を発
現するので、試験は、このペプチドを支持して潜在的に偏っていた。したがって、A27Nva類似体を用いて得た実質的細胞傷害性は、初回刺激がこの配列を使用する場合に得られる効力よりも過小評価され得る。
CD8+抗原特異的T細胞の計数には、クラスI MHC/ペプチド複合体によるT細胞受容体(TCR)の同族認識が必要である。特定のペプチドにそれぞれ結合し、蛍光タンパク質と抱合した4つのHLA MHCクラスI分子の複合体から構成されるクラスI
MHC四量体を使用して、これを行うことができる。したがって、四量体検定により、特定のMHC分子中に複合体形成した所与のペプチドに特異的な総T細胞集団の定量が可能である。さらに、結合が機能的経路に依存しないので、この集団は、機能状態に関わらず全ての特異的CD8+T細胞を含む。免疫化動物におけるCTL応答を、HLA−A*0201 MART1(ELAGIGILTV(配列番号100))−PE MHC四量体(Beckman Coulter、T01008)又はチロシナーゼ369-377(YMDGTMSQV(配列番号94))特異的四量体試薬(HLA−A*0201チロシナーゼ−PE、Beckman
Coulter)及びFITC抱合ラット抗マウスCD8a(Ly−2)モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用した密度遠心分離(Lympholyte Mammal、Cedarlane Labs)後の末梢血から単離した単核細胞の同時染色によって測定した。BD FACS Caliburフローサイトメーターを使用してデータを収集し、cellquestのソフトウェアを使用して、リンパ球集団上のゲーティング及びCD8+CTL集団内の四量体+細胞の比率の計算によって分析した。
2つのHHDトランスジェニックマウス群(n=8)を、0、3、14、及び17日目の25μgを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ369−377を発現するプラスミドで免疫化した。その後、28日目及び31日目に天然ペプチド又は377Nva類似体の2回のさらなるペプチド追加免疫(類似の量)を行った。10日後、チロシナーゼ369-377特異的四量体試薬(HLA−A*0201チロシナーゼ−PE、Beckman Coulter)を使用して、免疫応答をモニタリングした。眼窩後洞静脈を介して各マウスから採血し、2000rpmで25分間の密度遠心分離(Lympholyte Mammal、Cedarlane Labs)を使用してPBMCを単離した。PBMCを、CD8に対するマウス特異的抗体(BD Biosciences)及びチロシナーゼ四量体試薬で同時染色し、特定の比率を、FACS Caliburフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用したフローサイトメトリーによって決定した。チロシナーゼ特異的CD8+細胞の比率は、天然ペプチドの類似体との置換によってチロシナーゼ特異的小集団の拡大が保存されることを示す。この傾向は、類似体がチロシナーゼ特異的T細胞の拡大を改良することができることを示す(図38)。
4つのHHDトランスジェニックマウス群(n=6)を、0、3、14、及び17日目の25μgのプラスミドを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ369-377及びメラン−A26-35A27Lエピトープを発現するプラスミド(pSEM)で免疫化した。その後、左鼠径リンパ節へのメラン−A26-35A27L及び右リンパ節への一次及び/又は二次アンカー残基の置換を有するチロシナーゼ369-377類似体の2回のペプチド追加免疫(類似の量)を28日目及び31日目に行った。対照として、プラスミドのみで免疫化したマウス又はナイーブマウスを使用した。
HHDトランスジェニックマウス(n=4/群)を、0、3、14、及び17日目の25μgのプラスミドを含む25μlのPBS/各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ369-377エピトープを発現するプラスミド(pSEM)で免疫化した(図40中の一般的プロトコルに従う)。その後、天然ペプチド又はP2及びPΩ(370及び377)の一次アンカー残基が置換された類似体を使用して、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫から1週間後、脾細胞を、天然チロシナーゼ369-377ペプチドにてex vivoで刺激し、種々のE:T比で51Cr標識ヒト腫瘍細胞(624.38細胞)に対して試験した。天然ペプチド及びM370V
V377Nva類似体の両方により、624.38細胞に対する強い細胞傷害性が得られた(図41)。天然ペプチドを使用して細胞溶解活性がいくらか弱まったのに対して、類似体では弱まらなかったので、実施例52中の四量体の結果から得られたより高い免疫原性の兆候を強化した。上記実施例とあわせると、この所見は、潜在的に有用な類似体を概説するためのより感度の高い検定(in vitro刺激後のex vivo細胞傷害性)でのよりストリンジェント検定(in vivo細胞傷害性及び四量体染色)の補助が有用であることを示す。
MHC1複合体に結合したペプチドの結合及び安定性が良好な免疫応答を得るのに不可欠であるので、天然エピトープ及びその類似体を、iTopiaエピトープ発見システムを使用してA0201制限MHCクラス1分子への結合及び安定性(T1/2)について試験した(実施例31でも考察されている)。6つの天然エピトープ及び免疫応答を増強するように設計したその類似体の結合及び解離(T1/2)を決定した。天然ペプチド及び類似体は以下であった:NY−ESO−1157-165、NY−ESO−1157-165(L158Nva、C165V))、メラン−A26-35、メラン−A26-35(A27Nva)、SSX−241-49、SSX−241-49(A42V)、Prame425-433、Prame425-433(L426Nva、L433Nle)、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ369-377(V377Nva)、PSMA288-297、及びPSMA288-297(I297V)。
Claims (69)
- 本質的に、
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)であり、
P1が、S、K、F、Y、T、Orn又はHseであり、
P2が、L、V、M、I、Nva、Nle又はAbuであり、
P3が、L、Nva、Nle又はAbuであり、
P4がQであり、
P5がHであり、
P6が、L、Nva、Nle又はAbuであり、
P7がIであり、
P8が、G、A、S又はSarであり、
P9におけるPΩが、L、V、I、A、Nle、Nva、Abu又はL−NH2であり、
PΩ+1が、X、XX、又はXXX(式中、Xは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)である配列であって、
SLLQHLIGL(配列番号71)ではない配列からなる、単離ペプチド。 - 本質的に、配列:
{K、F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGL(配列番号72);又は
S{V、M、I、Nva、Nle若しくはAbu}LQHLIGL(配列番号73);又は
SL{Nva、Nle若しくはAbu}QHLIGL(配列番号74);又は
SLLQH{Nva、Nle若しくはAbu}IGL(配列番号75);又は
SLLQHLI{A、S、若しくはSar}L(配列番号76);又は
SLLQHLIG{V、I、A、Nle、Nva、Abu若しくはL−NH2}(配列番号77);又は
{F、Y、T、Orn若しくはHse}{Nva、Nle、M若しくはI}LQHLIGL(配列番号78);又は
S{Nva、Nle若しくはM}LQHLIG{Nva、Nle若しくはV}(配列番号79);又は
{K、F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGV(配列番号80);又は
{F若しくはT}LLQHLIG{Nle}(配列番号81);又は
{F若しくはT}{Nva若しくはM}LQHLIG{Nle}(配列番号82)
から成る、請求項1に記載の単離ペプチド。 - 本質的に配列:
{F、Y、T、Orn若しくはHse}LLQHLIGL(配列番号83);又は
S{Nva、Nle若しくはM}LQHLIGL(配列番号84);又は
SLLQHLIG{Nle、Nva若しくはL−NH2}(配列番号85);又は
SLLQH{Nva若しくはAbu}IGL(配列番号86);又は
S{Nva}LQHLIG{Nle}(配列番号87);又は
{F若しくはT}{L若しくはNva}LQHLIG{Nle}(配列番号88)
から成る、請求項2に記載の単離ペプチド。 - 本質的に配列:
S{L若しくはNva}LQHLIG{Nle}(配列番号89);又は
T{Nva}LQHLIG{Nle}(配列番号90)
から成る、請求項3に記載の単離ペプチド。 - 本質的に配列:S{Nva}LQHLIG{Nle}(配列番号87)から成る、請求項4に記載の単離ペプチド。
- クラスI MHCペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項1に記載の単離ペプチド。
- 前記クラスI MHCがHLA−A2である、請求項6に記載の単離ペプチド。
- クラスI MHC結合クレフトにおいてSLLQHLIGL(配列番号71)の親和性に類似するか又はこれよりも大きい該クラスI MHC結合クレフトに対する親和性を有する、配列SLLQHLIGL(配列番号71)において、1〜3つの置換を含む単離ペプチド。
- 解離の半減期が、前記クラスI MHC結合クレフトからのSLLQHLIGL(配列番号71)の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項8に記載の単離ペプチド。
- ペプチドSLLQHLIGL(配列番号71)に対する特異性を有するT細胞によって認識される、請求項8に記載の単離ペプチド。
- ペプチドが、請求項1に記載のペプチド配列を有する、クラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/PRAME425-433複合体を認識するTCRと交差反応する、請求項11に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/複合体が、HLA−A2/PRAME425-433複合体である、請求項12に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- 遊離配列に組み込まれた請求項1に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 請求項14に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 請求項14に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
- 請求項1に記載のペプチドを発現する、核酸手段。
- 請求項17又は18に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
- 請求項15に記載の組成物を節内投与することを含む、CTL応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
- 請求項15に記載の組成物及び免疫賦活剤を節内投与することを含む、クラスI MHC拘束性T細胞応答を同調させる方法。
- 請求項19に記載の組成物を節内投与することを含む、CTL応答を誘起、維持又は同調させる方法。
- 本質的に、
P0が、X、XX、又はXXX(式中、Xは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する)であり、
P1が、G、A、S、Abu又はSarであり、
P2が、L、M、I、Q、V、Nva、Nle又はAbuであり、
P3がP又はWであり、
P4がSであり、
P5がIであり、
P6がPであり、
P7がVであり、
P8がHであり、
P9が、P、A、L、S又はTであり、
P10におけるPΩが、I、L、V、Nva又はNleであり、
PΩ+1が、X、XX、又はXXX(式中、Xは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在である)である配列であって、
GLPSIPVHPI(配列番号42)ではない配列から成る、単離ペプチド。 - 本質的に、配列:
{S、Sar若しくはAbu}LPSIPVHPI(配列番号43);又は
G{M若しくはNle}PSIPVHPI(配列番号44);又は
G{L、I、Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号45);又は
GLWSIPVHP{Nva若しくはV}(配列番号46);又は
GLPSIPVH{A若しくはS}I(配列番号47);又は
GLPSIPVHP{V、L、Nva若しくはNle}(配列番号48);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva若しくはNle}(配列番号49);又は
G{Nva}PSIPVHP{Nva}(配列番号50);又は
G{V、Nva若しくはNle}PSIPVHPV(配列番号51);又は
{Sar若しくはAbu}LPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号52);又は
A{V、I、Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号53);又は
AVPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号54);又は
A{Nva}PSIPVHPV(配列番号55);又は
ALWSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号56);又は
GVWSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号57);又は
G{Nva}WSIPVHPV(配列番号58)
から成る、単離ペプチド。 - 本質的に、配列:
{Abu}LPSIPVHPI(配列番号59);又は
G{V、Nva、若しくはAbu}PSIPVHPI(配列番号60);又は
GLPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号61);又は
GLWSIPVHP{I若しくはNva}(配列番号62);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva}(配列番号63);又は
G{Nle若しくはNva}PSIPVHPV(配列番号64);又は
{A若しくはAbu}LPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号65);又は
G{Nva}WPSIPVHP{I若しくはV}(配列番号66);又は
A{Nva若しくはNle}WSIPVHPI(配列番号67);又は
A{V若しくはNva}PSIPVHPV(配列番号68)
から成る、単離ペプチド。 - 本質的に、配列:
{Abu}LPSIPVHPI(配列番号59);又は
GLPSIPVHP{V若しくはNva}(配列番号61);又は
GLWSIPVHPI(配列番号69);又は
G{Nle}PSIPVHP{Nva}(配列番号63)
から成る、請求項25に記載の単離ペプチド。 - 本質的に配列:GLPSIPVHPV(配列番号70)から成る、請求項26に記載の単離ペプチド。
- クラスI MHCペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項23に記載の単離ペプチド。
- 前記クラスI MHCがHLA−A2である、請求項28に記載の単離ペプチド。
- ペプチドが、請求項23に記載のペプチド配列を有する、クラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/PSMA288-297複合体を認識するTCRと交差反応する、請求項30に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/複合体が、HLA−A2/PSMA288-297複合体である、請求項31に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- 遊離配列に組み込まれる請求項23に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
- 請求項23に記載のペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 請求項33に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 請求項33に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
- 請求項23に記載のペプチドを発現する、核酸手段。
- 請求項36又は37に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
- 請求項34に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
- 請求項33に記載の組成物及び免疫賦活剤の節内投与を含む、クラスI MHC拘束性T細胞応答を同調させる方法。
- 請求項38に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘起、維持又は同調させる方法。
- クラスI MHC結合クレフトに対するGLPSIPVHPI(配列番号42)の親和性に類似するか又はこれよりも大きい、クラスI MHC結合クレフトに対する親和性を有する、GLPSIPVHPI(配列番号42)において1〜3つの置換を含む単離ペプチド。
- 解離の半減期が、前記クラスI MHC結合クレフトからのGLPSIPVHPI(配列番号42)の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項42に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドGLPSIPVHPI(配列番号42)に対する特異性を有するT細胞によって認識される、請求項42に記載の単離ペプチド。
- 本質的に、配列:
E{A、L、Nva、Nle}AGIGILT{V、Nva、Nle}(配列番号91);又は
Y{M、V、Nva、Nle}DGTMSQ{V、Nva、Nle}(配列番号92);
から成る、pSEMプラスミドによって発現される免疫原性ペプチドの単離ペプチド類似体であって、
前記配列が、E{A、L}AGIGILTV(配列番号93)又はYMDGTMSQV(配列番号94)ではない、単離ペプチド類似体。 - ELAGIGILTNva(配列番号95)、ENvaAGIGILTV(配列番号96)、YVDGTMSQNva(配列番号97)、YVDGTMSQV(配列番号98)及びYMDGTMSQNva(配列番号99)から成る群から選択される、請求項45に記載の単離ペプチド類似体。
- 本質的にアミノ酸配列ENvaAGIGILTV(配列番号96)から成る、請求項46に記載の単離ペプチド類似体。
- 本質的に配列YMDGTMSQNva(配列番号99)から成る、請求項46に記載の単離ペプチド類似体。
- ペプチドが、クラスI MHCペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項45に記載の単離ペプチド類似体。
- 前記クラスI MHCがHLA−A2である、請求項49に記載の単離ペプチド類似体。
- クラスI MHC結合クレフトに対するEAAGIGILTV(配列番号100)の親和性に類似するか又はこれよりも大きい前記クラスI MHC結合クレフトに対する親和性を有する、配列EAAGIGILTV(配列番号100)において1〜3つの置換を含む単離ペプチド類似体。
- 解離の半減期が、前記クラスI MHC結合クレフトからのEAAGIGILTV(配列番号100)の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項51に記載の単離ペプチド。
- ペプチドEAAGIGILTV(配列番号100)に対する特異性を有するT細胞によって認識される、請求項51に記載の単離ペプチド。
- クラスI MHC結合クレフトに対するYMDGTMSQV(配列番号94)の親和性に類似するか又はこれよりも大きい前記クラスI MHC結合クレフトに対する親和性を有する、YMDGTMSQV(配列番号94)において、1〜3つの置換を含む単離ペプ
チド類似体。 - 解離の半減期が、前記クラスI MHC結合クレフトからのYMDGTMSQV(配列番号94)の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項54に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドYMDGTMSQV(配列番号94)に対する特異性を有するT細胞によって認識される、請求項54に記載の単離ペプチド。
- ペプチドが、請求項1に記載のペプチド配列を有する、クラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/メラン−A26-35複合体を認識するTCRと交差反応する、請求項57に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- 前記クラスI MHC/複合体が、HLA−A2/メラン−A26-35複合体である、請求項58に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- クラスI MHC/チロシナーゼ369-377複合体を認識するTCRと交差反応する、請求項57に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- 前記クラスI MHC/複合体が、HLA−A2/チロシナーゼ369-377複合体である、請求項60に記載のクラスI MHC/ペプチド複合体。
- 遊離配列に組み込まれた請求項45に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
- 請求項45に記載のペプチドのいずれかを含む、免疫原性組成物。
- 請求項62に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 請求項62に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
- 請求項65に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
- 請求項63に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
- 請求項63に記載の組成物及び免疫賦活剤の節内投与を含む、クラスI MHC拘束性T細胞応答を同調させる方法。
- 請求項66に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘起、維持又は同調させる方法。
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