KR20020026530A - Ｔ-세포 수용체 γ알터네이트 리딩 프레임단백질(ＴＡＲＰ) 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전립선 상피 세포 및 많은 유방암 세포로부터의 TCRγ전사체 서열을 함유하는 핵산, 및 이러한 서열의 번역으로부터 발현되는 T-세포 수용체 감마 알터네이트 리딩 프레임 단백질("TARP")을 제공한다. TARP로부터 만들어진 백신은 전립선암세포 및 많은 유방암세포를 포함하는 이러한 단백질을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 일으키는 데 유용하다. 본 발명은 역시 전립선암 및 TARP발현 유방암의 진단방법, 및 환자에 TARP 및 TARP를 인코딩하는 핵산을 주입하는 방법을 역시 제공한다.
Description
전립선 암은 사람에서 가장 흔한 암이며, 암으로 사망하는 남성에 있어서 세번째로 많은 원인을 차지한다. 이러한 질병의 초기 진단 및 치료 방법은 전립선암 사망자를 감소시킬 수 있을 것이다. 악성 세포 및 극소수의 다른 세포가 발현시키는 종양-연관(associated) 단백질은 검출 및 치료에 있어서 표적으로서 유용하다. 전립선 특이 항원(PSA)를 포함하는 이러한 전립선 암과 연관된 다수의 단백질이 동정되었다.
면역치료는 암에 대한 새로운 잠재력 있는 무기이다. 면역치료는 표적 항원의 생산에 기초하여 암세포에 대한 면역 반응을 일으키는 것이다. 암세포 항원에 대한 체액석 면역 반응도 유용하지만, 암세포에 대한 세포-개재 면역 반응을 일으키는 것이 바람직하다. 세포-매개 면역 반응에 기초한 면역치료는 특정 항원 결정자(determinant)를 생산하는 세포에 대한 세포-매개 반응을 일으키는 것을 포함한다. 암세포는 면역치료의 표적이 될 수 있는 다양한 단백질을 생산한다. 어떤 암은 예를 들어 돌연변이의 결과로 면역반응체(immunogenic)와 같은 신규한 단백질을 생산한다. 그러나, 연구자들은 암세포의 변형되지 않은(un-mutated) 단백질을 특이적으로 인식하는 종양 침투 림프구를 발견하였다. 예를 들어, Rosenberg등은 정상 멜라닌 세포 및 악성 멜라민 세포 모두에 의하여 발현되는 항원 결정자 단백질 MART-1을 표적, 인식하는 종양침투 림프구를 발견하였다. 더 나아가, 능동 또는 수동 면역치료법은 MART-1 또는 이의 펩타이드 MHC Class I에 결합하여 MART-1을 발현하는 정상세포 및 멜라노마 세포의 파과를 가져온다(Y. Kawasaki et al., J. Immunol. 21:237(1998)).
신규한 암 항원은 비-자아 단백질로 인식되기 때문에 면역 반응을 일으킬 것이다. 그러나, 비자아 인식 단백질에 대한 면역 반응을 일으키는 면역 반응의 능력은 자아 단백질에 대한 내성을 갖는 면역 시스템이라는 점에서 놀라운 것이다. 면역 반응은 정상적으로 내성 또는 면역 반응을 일으키는 데 충분한 양으로 면역 시스템에 노출되지 않는 항원 결정자에 대한 것으로 생각된다. 그러나, 암에서는 이러한 결정자가 면역 시스템에 의한 검출을 빠져나가지 않는다. 이러한 것은 MHC Class I 분자에 의한 결정자의 제공(presentation)이 증가한 결과일 수 있다.
세포-매개 면역반응은 MHC의 작용을 포함한다. 인간에서 이러한 복합체는 "HLA(Human Leukocyte Antigen)" 복합체로 불린다. 마우스에서는 "H-2"복합체로 불려진다. 이러한 MHC는 세 개의 클래스 단백질, MHC Class I, MHC Class II, MHC Class III를 포함한다. MHC Class I은 거의 모든 핵(nucleated) 세포 표면에서 발현된다. 이들은 Tc 세포(CD8+)에 항원 펩타이드를 제공한다. 인간에서는 세 개의 MHC Class I 유전자 좌위, HLA A, HLA B, 및 HLA C를 갖는다. 각각의 좌위는 매우 다형성(polymorphic)하다. 따라서, 사람은 이들 세포표면에 여섯 개까지의 서로 다른 종류의 HLA분자를 갖을 수 있다. MHC Class II 단백질은 항원 펩타이드를 프로세스하여 TH세포에 제공하는 거대세포, 덴드라이트 세포 및 B세포와 같은 항원 제공 세포상에서 주로 발현된다. 인간에는 세 개의 MHC Class II 유전자 좌위, HLA DP, HLA DQ 및 HLA DR이 있다. MHC Class III 단백질은 수용성 혈액 단백질, 보체 시스템 및 종양 괴사 요소(TNF)을 포함하는 다양한 면역 반응과 관련이 있다(J.Kuby, Chapter9, Immunology, Third Edition W.H.Freeman and Company, New York(1997)).
암세포 및 건강한 세포에서, MHC Class I 분자는 Tc 세포에 제공하기 위한 내성 단백질의 에피토프를 제공한다. HLA A, HLA B 및 HLA C분자는 8 내지 10 아미노산 길이의 특정 앵커리지 잔기와 결합한다. 앵커리지 잔기는 HLA 분자의 특정 대립유전자 형태에 의존한 MHC Class I 분자에 의하여 인식된다. CD8+ T세포는 세포의 특정 HLA 분자에 의하여 제공되는 특이 에피토프를 인식하는 T세포 수용체를 갖는다. Tc세포가 제공된 항원에 의하여 자극을 받으면, HLA-펩타이드 복합체를 갖는세포와 접촉하고 접합체를 형성하여 이를 파괴하는 세포독성 T림포구(CTL)로 된다.
MHC Class I에 의한 펩타이드의 제공은 프로테오좀에서의 ER과 골지체를 통하여 처리되어 생성된 내성단백질 분해, 이들의 MHC Class I 분자 틈에의 펩타이드 앵커 분자에 의한 결합, 및 최종적인 세포 표면에의 제공을 포함한다. 다른 것보다 특정 앵커 잔기에 의존하여 어떠한 펩타이드가 다른 것들보다 특정 HLA분자에 더욱 밀착하게 결합할 수 있다. 잘 결합하는 펩타이드를 "도미난트(dominant)" 에피토프, 이보다 잘 결합하지 못하는 펩타이드를 "서브도미난트" 또는 "크립틱(cryptic)" 에피토프라고 한다.도미난트 에피토프는 강력한 내성 또는 면역반응을 일으키는 자신의 단백질 또는 외부 단백질이다. 서브도미난트 또는 크립틱 에피토프는 약한 반응을 보이거나 반응을 보이지 않는다. 도미난트 에피토프의 HLA분자에의 강한 결합이 세포 표면에 보다 밀집하게 제공하여 면역세포와 반응할 보다 많은 기회를 주어서 면역 반응 또는 내성을 일으킬 확률이 보다 높은 것으로 추정된다.
연구자들은 MART-1 단백질, 자가 단백질의 경우에 면역 시스템이 서브도미난트 또는 크립틱 에피토프에 대한 가장 강한 CTL 반응을 생성하는 것을 발견하였다(Y.Kawakami et al., 1997 Immunol. Res. 16:313). 암세포에서 제공되는 서브도미난트 또는 크립틱 에피토프가 보다 밀집되거나 정상보다 많은 양일 수 있다; 결과적으로 면역 시스템은 이러한 전에는 검출되지 않은 에피토프와 마주치고 이들을 외부 단백질로 인식하여 면역반응을 일으킬 수 있다. 이유와 상관없이, 면역 시스템을 많은 양의 자가 단백질의 서브도미난트 또는 크립틱 에피토프에 노출시키면, 면역반응을 일으키며, 이러한 단백질의 생산이 암 면역치료의 중요 요소이다. 물론, 자가 단백질에 대한 면역 반응을 일으키는 것이 암 세포 및 건강한 세포의 파괴를 가져올 수 있다. 따라서, 이러한 면역 요법이 성공하기 위해서는 건강한 세포는 생명에 필수적이지 않거나 다른 치료에 의하여 대체가능하여야 한다. 전립선암 및 유방암의 경우에 전립선 또는 유방의 수술적 제거가 흔한 치료방법이다. 이러한 경우에 전립선 또는 유방 항원을 보이는 대부분 또는 전부의 세포는 종양 세포일 것이다.
우리는 상피세포 근원의 암 또느 건강한 전립선 세포가 재배열되지 않은 TCRγ 유전자의 부분을 전사하는 것을 발견하였다. 시험관에서 이러한 전사체는 두개의 단백질로 그 중 하나는 절단된(truncated) 형태인 것이 되는 반면, 우리의 연구결과 놀랍게도 생체내에서는 TCRγ단백질이 아닌, 알터네이트 리딩 프레임으로부터 발현된 단백질을 발현함을 발견하였다. 다라서, 이러한 TCRγ 알터네이트 리딩 프레임 단백질 또는 "TARP"로 명명한다.
우리는 TARP가 상피 근원의 전립선 및 전립선 암 세포에서 발현되는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 우리는 동일한 단백질이 많은 유방암 세포에서도 발견됨을 알게되었다. 따라서 TARP는 TARP를 발현하는 전립선 암 세포 및 유방암 세포의 마커 및 면역치료를 위한 기초로 유용하다. 이러한 발명은 분리되거나 재조합된 형태의 단백질 및 핵산을 제공한다. 많은 유방암세포에서 발현되는 단백질은 최초로 전립선 세포에서 동정되어, 하기에서 종종 전립선-특이(PS)-TCRγ로 명명된다.
한 측면에서, 본 발명은 TCRγ 알터네이트 리딩 단백질"TARP"의 핵산 서열을포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 MHC 분자에서 제공되어, TARP를 발현하는 세포에 대한 T 림프구를 활성화시키는TARP의 면역 단편(전체 길이 TARP를 인식하고 결합할 수 있는 항체에 대한 단편 또는 TARP를 발현하는 세포를 인식할 수 있는 T-세포를 활성화할 수 있는 단편), 적어도 TARP에 대하여 90%의 상동성을 갖는 서열을 추가로 제공한다. 본 발명은 TARP, 이들의 면역단편, 또는 90%이상의 상동성을 갖는 펩타이드의 제약학적 수용가능한 담체의 상기 조건을 만족하는 조성물을 추가로 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 특이적으로 TARP를 인식하는 항체에 의하여 인식되는 TARP와 적어도 90%의 상동성을 갖는 폴리펩티드TCRγ 알터네이트 리딩 프레임 단백질의 아미노 서열, 또는 MHC 분자에서 프로세스되고 제공되어 TARP를 발현하는 세포에 대한 T 림포구를 활성화할 수 있는 아미노 서열과 90%의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 분리되거나 재조합된 핵산분자를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 TARP의 아미노산 서열을 갖는 분리된 폴리펩타이드, 이들의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식할 수 있는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 TARP와 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 MHC 분자로 프로세스되어 제공되어 TARP를 발현하는 세포에 대한 T 림포구를 활성화할 수 있는 TARP와 90%이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 중에서 선택된 조성물을 제공한다.
본 발명은 TARP의 아미노산 서열을 갖는 분리된 폴리펩타이드, 이들의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식할 수 있는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 TARP와 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 MHC 분자로 프로세스되어 제공되어TARP를 발현하는 세포에 대한 T 림포구를 활성화할 수 있는 TARP와 90%이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 중에서 선택된 조성물을 환자에 주입하는 방법을 제공한다.
본 발명은 환자에 TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드로 펄스된 항원 제공 세포를 포함하는 조성물을 주입하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 시험관에서 TARP에 민감화된 세포, TARP의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식할 수 있는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 TARP와 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 MHC 분자로 프로세스되어 제공되어 TARP를 발현하는 세포에 대한 T 림포구를 활성화할 수 있는 TARP와 90%이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 중에서 선택된 조성물을 환자에 주입하는 방법을 제공한다.
상기 기술된 방법의 조성물은 전립선 암 환자, 유방암 환자, 또는 유방암으로 진단되지 않은 여성 환자에 주입될 수 있다.
본 방법은 TARP 단백질의 에피토프에 대하여 민감회된 CD8+세포 및 민감화된 세포를 환자에 주입하는 것을 의도한다. CD8+세포는 Tc 세포일 수 있다. 어떤 구체예에서, Tc세포는 종양투과 림프구일 수 있다.
추가로, 본 방법은 환자에 비-특이 면역 어쥬반트로부터 선택된 면역 어쥬반트, 세포소기관 생성물 및 단편, 햅튼, 면역 단백질, 면역 조절제, 인터페론, 흉선 호르몬 및 콜로니 자극 호르몬을 환자에 같이 주입할 수 있다.
본 방법은 추가로 TARP의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드로 펄스된 항체 제공세포, 또는 TARP의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 바이러스의 핵산 서열을 주입할 수 있다. 본 방법은 추가로 TARP 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 주입을 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 방법은 TARP의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터를 포함할 수 있으며, 이러한 발현 벡터는 재조합 박테리아 세포이다. 추가로, TARP의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 자위(autologous) 재조합 세포의 벡터에 환자가 면역되도록 하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 이러한 발명은 남성 상피근원 세포 또는 여성 유방암 세포TARP를 인코딩하는 핵산, 전사체에 의한 TARP번역체의 검출을 통한 남성에서의 전립선암 또느 여성에서의 유방암을 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 세포로부터의 RNA를 하이브리드 조건하에서 프로브 특이 하이브리드하여 하이브리드 검출을 이용할 수 있다. 더 나아가, 본 방법은 세포의 파괴 및 세포 내용물 부분과 단백질과 특이 결합하는 표적 부분 및 단백질에 부착된 표지 검출 부분을 포함하는 카이메릭 분자와 접촉시킬 수 있다. 표적 부분 자체를 역시 표지할 수 있다(예를 들어, 방사성 잔기를 갖는 scFv와 같은 항체).
검사되는 세포는 림프 노드 또는 유방 생체검사 조직일 수 있다.
최종적으로 본 발명은 TCRγ 알터네이트 리딩 프레임 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 출원은 1999년 7월13일 출원된 미국 가출원 번호 60/143560, 및 1999년 10월1일 출원된 미국 가출원 번호 60/157471으로부터 우선권을 갖는다. 이들 출원의 내용은 여기에 참고문헌으로 삽입하였다. 연방정부에서 후원한 연구 및 개발하의 발명에 대한 권리에 대한 진술은 적용 없다(statement as to rights to invention made under federally sponsored research and development not applicable)
본 발명은 분자 생물학, 및 의료 진단법 및 치료법에 관한 것이다.
도1: 핵산 서열(서열번호13)의 PS-TCRγ 전사체. 시험관 번역 시스템에서의 이러한 전사체가 생성하는 두 개의 폴리펩타이드. MQM으로 시작하는 추정되는 아미노산 서열(PS-TCRγ-1, TARP로 명명, 서열번호14)을 갖는 첫 번째 폴리펩티드. 이러한 폴리펩타이드는 약 7.2kD의 분자량을 갖는다. 이 것은 리딩 프레임으로부터 번역된 것이며, 천연적인 TCRγ 리딩 프레임과 일치하지 않는다. 두 번째 폴리펩타이드는 약 13kD로 추정된다. 이것은 TCRγ를 리딩 프레임으로 번역된 것이고, TCRγ의 절단된 형태(truncated version)이다. 도의 단일선의 서열은 전사 개시 위치 및 폴리아데닐 위치를 나타낸다.
도2: TCRγ mRNA발현의 하이브리드 분석.
도2A는 인간 TCRγ의 다른 발현 양상을 도트 블롯으로 보인다. 양성 조직이 전립선(C7), 소장(E3), 비장(E4), 흉선(E5), 말초 백혈구(E6), 림프 노드(E7), 골수(E8), 및 폐(F2)이다.
도2B는 정상세포에서의 TCRγ 전사체 크기를 노던 블롯으로 보인다.
전립선에서 발현되는 두 개의 TCRγ 전사체는 1.1kb, 2.8kb인 반면, 비장, 흉선 및 말초 혈관 백혈구에서 발현되는 것은 1.5kb이다. 필름은 20시간동안 노출하였다.
도3:TCRγδ발현
도3A는 TCRγ Cr(구성 도메인)cDNA 프로브가 1.1 및 2.8kb의 전립선-특이 전사체를 보인다(도2B와 비교). 필름은 20시간동안 노출하였다.
도3B는 TCRγ Cr cDNA 프로브가 TCRγ mRNA가 전립선에서는 발현되지 않는 반면, 비장, 흉선, 및 말초혈관 백혈구에서는 발현됨을 보인다.
도3C는 TCRγ Cr cDNA 프로브가 TCRγ를 발현하는 LNCaP 세포 라인에서는 발현을 보이나, PC-3 세포 라인에서는 그렇지 않다. 필름은 20시간동안 노출하였다.인간 β-액틴 mRNA 발현을 대조군으로 사용하였다.
도4:35S-표지된 리보프로브, TCRγ(Cγ1-3' UTR) 안티 센스를 이용한 파라핀-고정된 조직 단편의 인-시추 RNA 하이브리드
도4A는 왼쪽 판넬의 사진은 다크 필드 현미경의 사진이며, 오른쪽 판넬 사진은 이에 상응하는 브라이트 필드 현미경 사진이다. 다크 필드 사진에서의 밝은 그레인은 RNA 하이브리드를 나타낸다.
도4B는 67세 남자로부터의 전립선 조직이 양성 포도상선(acinus) 상피 세포 및 음성 스트로말 세포를 보여준다(5배 확대).
도4C는 4A의 브라이트 필드이다.
도4D는 고배율(40배)의 오른쪽 밑 코너의 양성 부분을 보여준다.
도4E는 4C의 브라이트 필드이다. 신장 조직은 RNA 하이브리드를 보이지 않는다(5배 확대).
도4F는 4E의 브라이트 필드이다.
도5는 LNCaP mRNA의 프라이머 연장. 리버스 프라이머가 TCRγ의 구조 도메인에 Cγ1의 5' 말단으로부터 75뉴크레오티드 위치에서 시작한다. 리버스 프라이머는 약 128 뉴클레오티드 위치에서 전사가 정지하고, 화살표 표시, Cγ1의 업스트림쪽의 53 뉴클레오티드에서 전사가 시작된 것을 보인다. LNCaP의 TCRγ리버스 전사체는 72시간, 마커 레인인 8시간동안 노출하였다.
도6: 전립선 TCRγ전사체. 전립선 TCRγ전사체가 어떻게 전사되고 스프라이싱되는지를 보인다. 전사체는 Jγ1.2 세그먼트, 세 개의 Cγ1, 미번역 서열로 구성된다.
도7: 전립선 TCRγ의 시험관 전사-커플된 번역 분석. 8 및 13kDa으로 추정되는 두 개의 단백질을 얻었다(레인1). 빈 벡터를 이용한 음성 대조군(레인2)는 어떠한 단백질 생성물을 만들지 않았다.
도8은 PS- TCRγ전사체 분석용 프라이머(서열번호1-12)
도9는 전립선-특이 TCRγ전사체의 시험관 번역 분석. 전립선 특이 TCRγ전사체는 시험관에서 두 개의 단백질을 인코딩한다. 35S-Met 표지가 시험관내에서 번역된 단백지레 삽입되고, 16.5% 트리스-트리신 겔에서 전기영동하여 자동방사선 사진으로 분석하였다. 돌연변이 구성체의 도식이 오른쪽에 있다. 오픈 박스는 가능한 첫 번째 리딩 프레임을 보이며, 그늘진 박스는 두 번째 가능한 리딩 프레임을 보이고, 가능한 개시 코돈은 이탤릭체로 표시되어 있다. "X"는 ATG 토돈이 ATA로 돌연변이 된 것을 보인다. 위로부터 사이즈 마커가 kDa으로 표시되어 있다.
도10: TARP는 전립선 추출에서 발현된 핵 단백질이다. LNCaP세포, PC3, 또는 전립선 종양시료(암)로부터의 단백질 추출의 웨스턴 블롯이다. 20ug의 각각 단백질 추출은 16.5% 트리스-트리신 겔에서 영동하고 TARP(위) 또는 TCRγ(아래)에 대한 항체로 프로브하였다. 양성 대조군으로 1ug의 His-표지 TARP(위) 또는 100ng의 His-표지된 TCRγ(아래)를 겔(Recomb)에서 영동하였다. 왼쪽에 사이즈 마커가 kDa으로 표시되어 있다.
도11:유방암 세포에서 발현된 TARP mRNA.
(A) RT-PCR을 전립선(LNCaP 및 PC3), 뉴로블라스토마(A172), 코롱(COLO 205),가스트릭(KATO III) 및 유방(MCF7, BT-474, HS57Bst, SK-BR-3, CRL-1897 및 MDAD-468)세포 라인으로부터 추출된 RNA를 이용하여 TARP 또는 액틴에 대한 특이 프라이머로 수행하였다. 템플레이트 없는 RT-PCR은 ddH2O로 표시하였다.
(B) 12개의 인간 유방암조직으로부터 유래한 cDNA(레인1-12)를 이용하여TARP 또는 액틴에 대한 특이 프라이머로 PCR을 수행하였다. 양쪽 판넬에서 PCR생성물의 20%를 1% 아가로스 젤에서 영동하고, EtBr로 염색하였다.
도12: 유방암 세포 조직에서 발견된 TARP 전사체는 전립선-특이 형태와 동일 하다.
(A)전립선 세포에서 TCRγ좌위 및 TARP가 전사 및 스프라이싱되는 것을 도식적으로 보여준다. RT-PCR분석에 사용된 프라이머는 패넬B에서 보여준다.
(B)TARP mRNA 발현의 RT-PCR 분석. TARP 프라이머 1 및 3(위 패널), TARP프라이머 2 및 3(중간 패널) 또는 액틴 프라이머(아래 패널)로 전립선(LNCaP 및 PC3), 및 유방(MCF7, BT-474, HS57Bst, SK-BR-3, CRL-1897 및 MDAD-468)세포 라인으로부터 추출된 cDNA로 PCR을 수행하였다. PCR생성물의 20%를 1% 아가로스 젤에서 영동하고, EtBr로 염색하였다. 템플레이트 없는 RT-PCR은 ddH2O로 표시하였다.
(C) TARP 전사체의 노던 블롯. 전립선(LNCaP 및 PC3), 및 유방(MCF7, BT-474, HS57Bst, SK-BR-3, CRL-1897 및 MDAD-468)세포 라인으로부터 추출된 폴리(A) mRNA 2ug를 구조 도메인을 프로브로하여 분석하였다. 24시간 노출 후에 자동방사선사진을 생성하였다(위 패널). 동일한 필터를 스트리핑하여, 인간 베타-액틴 RNA를 프로브로 분석하여 동일량을 로딩하였다. 자동방사선사진은 1시간 노출후에 제작하였다(아래 패널). RNA사이즈 마커는 왼쪽에 표시되어 있다.
도13: 유방암 세포의 핵에 존재하는 TARP. LNCaP 및 PC3, MCF7, BT-474, 및 HS57Bst 세포로부터의 핵 추출액의 웨스턴 블롯. 각각의 핵 추출을 16.5% 트리스-트리신 겔에서 영동시키고, TARP(위) 또는 TCRγ (아래)에 대한 항체로 프로브하였다. 양성 대조군으로 1ug의 His-표지 TARP(위) 또는 100ng의 His-표지된 TCRγ(아래)를 겔(Recomb)에서 영동하였다. 왼쪽에 사이즈 마커가 kDa으로 표시되어 있다.
도14: TARP의 포텐샬 기능 도메인
(A)TARP은 포텐샬 류신 지퍼 모티프 및 포스포화 위치를 갖는다. 포텐샬 류신 지퍼 모티프는 염기부분이 따르는 류신이 밑줄쳐진 박스로 나타난다. cAMP 및 cGMP-의존 단백질 키나제 포그포화 위치(아미노산 19-21 및 20-22)이 표시되어 있다.
(B)TARP와 Tup1의 단백질 서열 비교. TARP(42-57)의 아미노산 서열,Dictyostelium dicodeumTup1(dTup1, 521-536), 및Saccharomyces cerevisiaeTup1(yTup1, 626-660)을 보여준다. 보존된 잔기는 박스로 표시되어 있다.
I. 서설
놀랍게도, 상피근원의 전립선 세포 및 많은 유방암세포들이 T-세포 수용체감마 체인(TCRγ)의 mRNA를 발현하는 것을 발견하였다. 전립선의 주요 TCRγ전사체는 T-림프구에서 발현되는 것과 상이한 크기를 갖는다. T-림포구에서만 발현된다고 생각된 유전자가 전립성 상피 세포 및 많은 유방암이 발현한다는 것은 매우 놀라운 일이다.
TCRγ리딩 프레임은 좋은 Kozak 서열(Kozak, M.Cell 44:283-92(1986))을 갖으며,우리는 초기 절단된 TCRγ단백질이 인코딩될 것으로 가정하였다. 따라서, 상피 전립선 세포및 유방암 세포에서 발현되는 TCRγ좌위가 7kDa 핵 단백질을 인코딩하는 것 또한 매우 놀라운 일이다. 따라서 TCRγ과 상이한 리딩 프레임으로부터 인코딩된 단백질을 "TARP", (TCRγAlternate Reading frame Protein)으로 명명하였다. TCRγ좌위의 인트론앤에서 시작한 전사체의 알터네이트 리딩 프레임으로부터 번역된 것을 제외하고, TARP는 두가지 특징이 있다. 첫째로, 대부분은 일반적을 분비되기때문에 세포내에서 그렇게 작은 단백질을 발견하는 것을 놀라운 일이다. 두째로, TARP는 좋은 Kozak서열이 없다는 것이다.
시험관내 및 생체내 이용
전립선 상피세포, 전립선 암세포, 및 많은 유방암 세포에 이러한 단백질의 존재는 시험관내 및 생체내 여러가지 이용의 기회를 부여한다. 첫째로 시료에서 TARP를 발현하는 세포의 존재를 검출하기위한 시험관내 검출방법에서 이 단백질에 대한 항체를 이용할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예는 정상 유방세포에서는 TARP 및 TARP전사체가 존재하지 않거나 매우 낮은 농도로 존재하지만, TARP를 발현하는유방암세포에서는 쉽게 검출된다. 환자로부터의 유방세포에서 높은 정도의 TARP 및 TARP전사체가 검출된다면 이것은 환자에 TARP-발현 유방암 세포가 존재하는 것을 나타내는 것이다. 전립선 세포에서 TARP 발현과 관련하여, 당업자는 심한 전립전 암의 경우에는 외과수술로 제거한다는 것을 인식하고 있다. 전립선이 제거된 환자 세포에서 TARP 검출은 전립선암이 아직도 존재한다는 것을 보여주는 것이다(당업자는 매년 약1000 남성이 유방암으로 진단된다는 사실을 알고 있다. 남성에서 전립선암이 200내가 더 흔하며 전립선암으로 진단되었던 환자가 유방암으로 다시 진단될 확률은 매우 낮다. 진단은 시료가 채취된 위치로부터 확인될 수 있으며, 세포의 조직학 및 형태학적 특징 및 다른 일상적인 진단 기준의 지식을 활용할 수 있다. 어떠한 경우에서도 전립선이 제거된 남성에서 TARP발현 세포를 추가 평가 및 모니터링하는 것은 그 환자가 전립선암, 유방암, 또는 둘다 갖고 있는 것과 상관없이 유용한 일이다. 전립선암을 갖지 않는 남성에서 TARP발현 세포가 검출되는 것은 유방암의 징후라 할 수 있다).
TARP자체, TARP의 면역단편, 및 TARP를 인코딩하는 핵산 또는 이들의 면역 단편들은 역시 환자로부터의 세포독성 T 림포구("CTL")을 시험관 내에서 활성화하여 환자에 주입되었을 때, 전립선암 세포 및 TARP발현 유방암세포를 공격하는 데 사용할 수 있다.
TARP자체, TARP의 면역단편, 및 TARP를 인코딩하는 핵산 또는 이들의 면역 단편들을 제약학적을 수용가능한 담체와 함께 환자에 주입하여 전립선암 또는 TARP발현 유방암에 대한 면역 반응을 높이는 데 사용할 수 있다. 이러한 조성물은전립선암 또는 TARP발현 유방암으로 진단된 환자에 치료용으로 주입할 수 있다
하기에서 논의하는 바와 같이, TARP는 전사를 조절하는 단백질의 구조적 특징을 함유하느 핵단백질이다. 세포에서의 TARP 수준의 조절은 세포의 성장, 복제 또는 이들 모두에 영향을 주는 것으로 예상된다. 따라서, TARP수준의 조절은 암세포의 악성을 조절하는 데 중요할 수 있다. 세포내 TARP수준의 감소는 리보자임 또는 안티센스 분자와 같은 RNA전사체가 단백질로 번역되는 능력을 방해하는 다양한 방식으로 가능하다. TARP수준을 역시 증가시킬 수 있다. 예를 들어, TARP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 함유하고 강력한 구조성 프로모터에 의하여 작동되는 발현 벡터를 세포에 도입하는 것이다. 핵산의 구조성(항상성) 전사체는 세포내 높은 수준의 단백질 발현 수준을 가져올 것이다.
본 부분의 나머지는 TARP의 다양한 구조 특성을 기술할 것이다. 본 출원서에서 사용된 용어의 정의, 및 TARP면역 단편, 환자에의 TARP주입, TARP에 대한 항체상성, TARP전사체 및 단백질, 및 제약학적 조성물에 대한 논의가 있을 것이다.
TARP의 구조특성
TARP는 헵타드 리피트(heptad repeat)에 다섯개의 류신을 갖으며, 이는 TARP가 류신 지퍼 이량체 형성 모티프(도7A)를 함유함을 나타낸다. 이것이 사실이려면, TARP는 반드시 암피파틱(amphipatic) 헬릭스를 가져아 한다. TARP가 암피파틱 헬릭스를 갖는 표시로 첫번째 류신 지퍼의 바로 앞에 헬릭스 표시로 알려진 세린 및 프롤린 잔기를 갖는다는 것이다. 두째로, 헵타드 리피트안에 암피파틱 특성 및 다른헬릭스와 솔트 브릿지 역할을 할 수 있는 많은 차지드 아미노산이 발견된다. 헵타드 리피트안에 류신의 존재가 발현되는 것을 류신 지퍼 모티프의 좋은 표시이나, 헵타드 리피트안에 다섯개의 류신을 함유하는 류신지퍼를 갖지 않는 단백질이 발견되었다. 예를 들어 케리오페린(karyopherin)의 크리스탈로그라피(Chook, Y.M. et al., Nature 399:230-237(1999)),B. stearothermophilus피리미딘 포스포릴레이즈(Pugmire, M.J. et al., Structure 6:1467-1479(1998)) 및T.thermophilus페닐알라닌 tRNA 합성효소(Mosyak, L. et al., Nat. Stuct. Biol.2:537-547(1995))는 헵타드 리피트 안에 다섯개의 류신을 함유하나 알파-헬릭스 구조를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. TARP에서 발견되 류신 리피트의 역할을 결정하기 위해 인터액션 및 구조 연구가 필요하다.
TARP 아미노산 서열의 또 다른 특징은 염기 아미노산이 잠재적인 류신 지퍼 모티프뒤에 있다는 것이며, 이는 DNA-결합 모티프를 의미한다(도7A). 그러나, 염기부분의 방향이 류신지퍼에 앞서기보다 뒤에 있는 독특한 방향성을 보이다. 대부분의 DNA 결합 류신 지퍼 단백질은 류신 지퍼 앞쪽에 염기부분을 갖는다(Chook, Y.M. et al., Nature 399:230-237(1999)). TARP의 염기부분은 핵 배치 신호로서만 역할을 할 수 있을 것이나, TARP가 핵단백질이라는 사실은 TARP가 DNA와 결합할 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
TARP가 임의의 알려진 단백질과 상동서을 갖는가를 확인하기 위하여 우리는 진뱅크에 대하여 단백질 블라스트 서치를 하였다. 이러한 탐색결과 TARP가Dictyostelium dicodeumTup1(Genbank accesion No. AAC29438), 및SaccharomycescerevisiaeTup1(Williams, F. E. et al., Mol.Cell.Biol. 10:6500-6511(1990))과 상동성을 보인다(도7C). 효모 Tup1은 Cys8(Ssn6)과 복합체로 발견되고 포도당, 산소, 및 DNA손상에 의하여 조절되는 유전자의 전사억제에 필요한 것으로 알려져 있다(Tzamarias, D.et al., Genes Dev.9:821-831(1995)). Cys8(Ssn6) 또는 Tup1은 DNA와 결합하지 않으나, α2, Mig1, Rox1 및 a1과 같은 특정 DNA결합 단백질과의 인터액숀을 통하여 코리프레서의 각각의 구성요소로 작용한다(Tzamarias, D.et al., Genes Dev.9:821-831(1995)). Tup1의 C-말단의 절반은 아스파테이트 및 트립토판이 많은 WD-40 또는 베타-트란스두신 리피트로 알려진 43아미노산 서열의 여섯 개의 리피트를 갖는다(Williams, F. E. et al., Mol.Cell.Biol. 10:6500-6511(1990); Fong, H.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2162-2166(1986)). WD-40 리피트는 많은 다백질에서 확인되었으며 단백질-단백질 인터액숀에서 역할을 하는 것으로 확인되었다. 중요하게 Tup1은 WD-40 리피트 두 개를 통하여 α2와 인터액숀하는 것으로 알려져 있다(Komachi, K et al., Genes Dev. 8:2857-2867(1994)). TARP가 Tup1의 다섯번째 WD-40 리피트와 상동성을 갖는 것은 관심을 끌만한 일이다(도7C). TARP는 핵 단백질이기 때문에 Tup1과의 상동성은 TARP가 전사조절에 관련된 기능성 핵 단백질 복합체의 구성요소임을 암시한다.
TARP 항체는 전립선 및 유방암 추출의 더블렛(doublet)을 인식한다(도6A). 빠른 7kDa 배드는 His-TARP 재조합 단백질과 함께 이동하느 반면, 약한 밴드는 더 큰 분자량을 보인다. 9kDa에 대한 가능한 한 가지 설명은 번역후 변형(modification)이다. TARP가 번역후 변형위치를 갖는가를 확인하기 위하여TARP 아미노산 서열을 Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy 프로테오믹스 서버(www.exoasy.ch)의 PROSITE 프로그램을 이용하여 분석하였다(Appeal, R.D. et al., Trends Biochem. Sci. 19:248-260(1994); Hofmann, K. et al., Nucleic Acids Res. 27:215-219(1999)). 도7A에서 보는 바와 같이 cAMP 및 cGMP의존성 단백질 카이네이즈 포스포화 위치(RRAT 및 RRGT) 및 단백질 카이네이즈 c 포스포화 위치(SSR 및 SRR)을 포함하는 다수의 포스포화 위치를 발견할 수 있었다. 많은 경우 포스포화는 단백질이 SDS-PAGE 상에서 보다 큰 크기와 같이 영동하게 만든다. 이러한경우 도6의 결과는 LNCaP세포에서는 변형되지 않은 형태가 대부분이나, MCF7 및 SK-BR-3세포에는 포스포화된 형태만이 존재하는 것으로 생각할 수 있다. TARP는 전립선 및 유방암세포에서 발현된 후 번역후 변형되었을 수 있다.
TARP 전사체에 대한 우리의 초기 연구는 유방에서는 TARP가 발현하지 것을 밝히지 못했다(Essand, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9287-9292(1999)). 정상세포에서 TARP가 낮은 농도로 발현되는 것이 검출하기 어려운 것이라는 것이 하나의 가능한 설명이다. 결과 부분에서 기술한 바와 같이, PCR결과 정상 유방암 시료에서는 암세포의 강한 신호에 비하여 매우 약한 신호를 검출할 수 있었다. 따라서, 유방암 세포에서의 TARP의 존재는 TARP의 발현이 유방세포의 암세포화 변환이 유도된 후에 발현된다는 것을 나타낸다. 추가로, 유방세포에서의 TARP 존재는 TARP가 에스트로겐에 의하여 조절됨을 나타낸다. 이러한 가설은 TARP의 인트론 프로모터내 요소가 안드로겐 반응 요소(ARE)와 에스트로겐 반응 요소(ERE)의 조합을 갖는 것으로 뒷받침될 수 있다. 하이브리드 요소는 5'말단의 ARE 및 3' 말단의 ERE의 하프-위치 특이적으로 구성되어 있다[(Zilliacus, J. et al., Mol.Endocrionol. 9:389-400(1995))미공표 데이터]. 에스트로겐이 TARP를 조절하는 지는 연구를 하여야 할 것이다. 돌연변이 ARE가 유방 종양의 어떤 전립선-특이 유전자의 발현을 일으키는 경우가 있다. 예를 들어 전립선 특이 항원(PSA)이 유방암에서 발현되었다(Majumdar, S. et al.,Br. J. Cancer 79:1594-1602(1999)). PSA의 비정상 발현의 분자 분석 결과 PSA 프로모터내 ARE에 하나의 점 돌연변이를 발견할 수 있었다. 이러한 돌연변이가 유방 종양에서 안드로겐-조절 PSA 발현의 상실을 가져온다(Majumdar, S. et al.,Br. J. Cancer 79:1594-1602(1999)). 현재 TARP 프로모터의 유사한 돌연변이가 세개의 유방암 세포 라인에서 일어난는 가를 조사중이다.
전립선은 그 구조 및 기능을 유지하는 데 있어서 안드로겐에 의존적이다. 전립선이 악성이 되면, 안드로겐 의존성을 상실하곤 한다. 이러한 연구에서, 두 개의 전립선 세포 라인이 성장에 있어서 안드로겐 의존성에 차이가 있음을 발견하였다: LNCaP 및 PC3세포. 안드로겐 의존성 LNCaP 세포 라인에서는 안드로겐 수용체가 존재하는 반면, 안드로겐 비의존성 PC3 세포 라인에서는 안드로겐 수용체가 존재하지 않는다(Tilley, W.D. et al., Cancer Res. 50:5382-5386(1990)). 도3에서 보는 바와 같이, LNCaP에서는 TARP를 발현하느 반면, PC3는 그렇지 않다. 이러한 결과는 TARP의 발현이 안드로겐 자극에 의하여 조절된다는 것을 나타낸다. TARP 프로모터내 ARE-유사 요소의 발견은 TARP가 안드로겐에 의하여 발현됨을 뒷받침한다. LNCaP에서는 TARP를 발현하는 반면, PC3는 그렇지 않은 것은 안드로겐 의존성 반응 조절의 중요성을 암시한다.
II.정의
특별히 정의되지 않았다면, 여기에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 당업자에 의하여 일반적으로 인식될 수 있다. 다음의 참고분헌은 본 발명에 사용된 많은 정의를 제공한다; Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENENTICS, 5TH ED.,R.Rieger et al.(eds.), Spring Veralg(1991); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991). 여기에 사용된 다음의 용어는 특별한 언급이 없으면 다음과 같다.
"T세포 수용체"는 α체인, β체인, γ체인, 및 δ체인으로 구성된 T세포 표면에서 발견되는 헤테로다이머를 말한다. T세포 수용체는 MHC과 연관된 프로세스된 항원을 인식한다.
"T-세포 수용체γ알터네이트 리딩 프레임 단백질" 및 "TARP"는 도14의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 이 폴리펩타이드는 상피 근원 전립선 세포, 전립선 암세포, 및 많은 유방암에서 전사체로 존재하는 T-세포 수용체γ유전자의 형태로부터 번역된다. "TARP"는 두문자어이며, "TARP 단백질"과 같은 의미이다.
여기에 사용된 TARP로부터의 핵산 전사체는 "TARP 핵산" 또는 "TARP를 인코딩하는 핵산"을 말한다. TARP로부터 전사된 유전자는 "TARP 유전자"를 말한다.
여기에 사용된 TARP의 "면역단편"이란 MHC와 함께 제공되어 T-세포 활성화 검정법에서 TARP를 발현하는 세포에 대하여 T-림포구를 활성화할 수 있는 단편을 말한다. 전형적으로 TARP의 8 내지 12개의 인접한 아미노산이며, 물론 이보다 더 긴 단편이 사용될 수 있다.
하나의 폴리펩티드를 다른 것과 비교하는 경우 "서열 상동성"은 TARP의 서열을 비교 서열과 대비한다. 전형적으로, 최대 또는 최상의 정렬을 얻도록 두 서열을 정렬한다.
"리간드"는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 화합물을 말한다.
"수용체"는 리간드에 특이적으로 결합하는 화합물을 말한다.
"세포독성 T 림포구"("CTL")는 종양 세포에 대한 면역반응에서 중요하다. CTL은 거의 모든 세포 표면에서 발현되는 HLA Class I상의 펩타이드 에피토프를 인식한다.
종양-특이 헬퍼 T 림프구("HTLs")는 역시 항종양 면역을 효율적으로 유지하는데 중요한 것으로 알려져 있다. 항종양 면역에서 이들의 역할은 동물 모델에서 이러한 세포들이 CTL의 유도 및 항체 반응을 도울뿐만 아니라, 직접 세포 접촉 및 림포카인(예를 들어, IFNγ, TNFα)을 분비하는 작용제(effector) 기능도 제공하는 것으로 보여졌다.
"항체"는 에피토프(예를 들어 항원)을 특이적으로 인식하고 결합하는 적어도 라이트 체인 또는 헤비 체인 면역글로불린 다양성 부분으로 구성된 폴리펩타이드 리간드를 말한다. 이는 Fab'단편, F(ab)'2단편, 단일체인 Fv 단백질("scFv"), 및디설피드 안정화된 Fv단백질("dsFv")와 같은 완전한 면역글로불린 및 이들의 변형체 및 부분을 포함한다. scFv 단백질은 면역글로불린의 라이트 체인 및 헤비 체인 변형 부분이 링커로 연결된 퓨전 단백질을 말한다. 천연 면역글로불린인 면역글로불린 유전자에 의하여 인코딩된다. 이러한 것들은 카파 및 람다 라이트 체인 구조 부분 유전자, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 헤비 체인 구조 부분 유전자 및 수많은 면역글로불린 변형 부분 유전자를 포함한다. "항체"용어는 면역화, 하이브리도마 또는 재조합적으로 제조된 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메릭 항체 및 인간화된 항체를 포함한다.
"에피토프" 또는 "항원 결정자"는 항원상 B및/또는 T 세포와 반응하는 위치를 말한다. 에피토프는 연속된 아미노산 또는 단백질의 삼차 폴딩에 의하여 인접한 연속되지 않은 아미노산으로부터 구성된다. 연속된 아미노산으로 구성된 에피토프는 변성 용매에 노출되어도 전형적으로 유지되는 반면, 삼차원 폴딩으로 형성된 에페토프는 변성 용매와 접촉하면 에피토프의 성질을 잃는다. 전형적으로 에피토프는 적어도 3, 일반적으로 적어도 5 또는 8-10아미노산의 독특한 공간 형태(spatial conformation)이다. 에피토프의 공간 형태는 예를 들어, x-레이 크리스탈로그라피 및 2-차원 NMR을 포함하는 방법으로 결정될 수 있다. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E.Morris, Ed(1996)참조.
"면역겸정법"은 항원과 리간드간의 특이 결합에 의하여 부여되는 분석물의 특이성을 시료에서 검출하는 방법이다. 이러한 방법은 항원과 리간드간의 특이 반응을 통한 항체 분석물을 검출하는 것을 포함한다. Harlow and Lane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York의 특이 면역반응 검출에 사용될 수 있는 조건 면역 검정 조건 및 포맷의 기술 참조한다.
"백신"은 생명체에 낮은 정도의 병적상태 및 치사율을 일으키는 치료적 정도의 면역력을 부여할 수 있는 작용제를 함유하는 작용제 또는 조성물을 말한다. 백신을 만드는 방법은 물론 면역 시스템을 연구하는 데 유용하고, 동물 또는 인간 질병을 예방 및 치료하는 데 유용하다.
"면역적 양"이란 환자에 면역반응을 일으키는 데 충분한 양을 말한다.
"폴리펩타이드"는 천연적으로 존재하는 구조적 변형체 및 합성 비-천연적으로 발생한 펩타이드 본드로 연결된 유사체, 관련된 천연적으로 일어난 구조 변형체, 및 합성 비-천연적 유사체와 관련된 아미노산 잔기로 구성된 폴리머를 말한다.
합성 폴리펩타이드는 예를 들어 자동화 폴리펩타이드 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩타이드를 말한다. "펩타이드"는 전형적으로 작은 폴리펩타이드를 말한다.
여기에 기술된 폴리펩타이드의 일반적 표시법은 폴리펩타이드 서열의 왼쪽 말단이 아미노-말단이도, 폴리펩타이드 서열의 오른쪽 말단이 카르복시 말단이다.
"퓨전 단백질"은 폴리펩타이드의 아미노 말단 및 다른 폴리펩타이드의 카르복시 말단으로 형성된 펩타이드 본드로 하나 또느 그 이상의 폴리펩타이드가 연결된 것을 말한다. 퓨전 단백질은 전형적으로 하나의 연속된 퓨전 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로부터 발현된 하나의 폴리펩타이드로부터 발현된다. 그러나, 퓨전 단백질은 구성 폴리펩타이드의 화학적 커플링으로 형성될 수 있다.
"보존적 치환"은 폴리펩타이드의 아미노산을 기능적을 유사한 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 다음의 여섯 아미노산 그룹은 서로 보존적 치환가능한 그룹니다:
1)알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T)
2)아스파틱산(D), 글루탐산(E)
3)아스파라긴(N), 글루타민(Q)
4)아르기닌(R), 리신(K)
5)이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V) 및
6)페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)
두 단백질이 상이한 종에 존재하면서 서로 "상동"이라는 것은 동일한 조상으로부터 유래하거나 적어도 70%의 아미노산 서열의 동일함을 나타낸다.
"실질적으로 순수한" 또는 "분리된"은 목적하는 종이 존재하는 지배적인 종인 것을 의미하고(즉, 몰라 기준으로 조성물에서 다른 각각의 거대분자 종보다 많은 것을 의미한다), 실질적으로 정제된 분배액은 (몰라 기준으로) 거대분자의 50%를 구성하는 목적하는 종이다. 일반적으로 실질적으로 정제된 조성물은 거대분자의 약 80 내지 90%가 관심의 정데된 종인 것을 의미한다. 조성물이 필수적으로 단일 거대분자 종으로 구성되어 있으면, 목적하는 종은 필수적으로 동종성(homogeneity)(일반적인 분석방법으로 오염종을 검출할 수 없는)이다. 용매 종, 미세분자(<500달톤), 안정화제(예를 들어, BSA), 및 원소 이온 종들은 이러한정의 에서 거대분자로 고려되지 않는다.
"핵산"은 뉴클레오티드 유니트(리보뉴클레오티드, 디옥시뉴클레오티드, 천연적으로 이와 관련있는 구조 변형체, 및 합성 비-천연적 이들의 유사체)가 포스포다이에스터 결합으로 연결된 것, 천연적 구조 변형체, 및 합성 비천연 유사체를 말한다. 따라서, 용어는 뉴클레오티드 및 이에 한정되지 않게 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩타이드-핵산(PNAs)와 같은 비천연적 합성 유사체 결합을 포함하는 뉴클레오티드 및 링키지를 포함한다.
이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드를 말하며, 일반적으로 50 뉴클레오티드보다 길지 않다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A,G, C,T)로 표시되고, 이것은 역시 RNA서열(즉, A,U,G,C)에서 "U"는 "T"를 대체한다.
여기에 사용된 일반적인 뉴클레오티드 서열의 표시법은 싱글-스트랜드 뉴클레오티드의 왼쪽 말단은 5'말단을 의미하고, 더블 스트랜드 뉴클레오티드 서열의 원쪽-방향은 5'방향을 의미한다. 초기 RNA 전사체에 대한 5' 에서 3' 방향은 뉴클레오티드 첨가방향은 전사방향을 의미한다. mRNA와 동일한 서열을 같는 DNA는 "코딩 스트랜드"; DNA 스트랜드 상 그로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 같는 서열의 5' 말단과 mRNA 전사체의 말단5'를 "업스트림"; DNA 스트랜드 상 그로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 같는 서열의 3' 말단과 mRNA 전사체의 말단3'를 "다운스트림"이라고 한다.
"cDNA"는 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 형태에서 mRNA와 동일하거나 상보적인 DNA를 말한다.
"인코딩"은 생물학적 과정에서 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같이 다른 폴리머 또는 거대분자의 합성에서 주형으로 작용하는, 정의된 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 이드로부터 유래한 상물학적 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 특정 뉴클레오티드 서열의 유전적 특성을 말한다. 따라서, 유전자는 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 유전자에 의하여 생성된 mRNA의 전사 및 번역되면 단백질을 인코딩한다. 코딩 스트랜드 및 mRNA와 동일한 뉴클레오티드를 갖는 서열이 일반적으로 서열 목록으로 제공되며, 전사에서 템플레이트로 사용되는 유전자 또는 cDNA의 논-코딩 스트랜드는 단백질 또는 다른 유전자 생성물을 인코딩하는 것을 말한다. 특별한 언급이 없으면, "아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 축퇴성(degeneracy)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"재조합 핵산"은 천연적으로 연결되지 않은 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 말한다. 이는 증폭되거나 조립된 핵산을 포함하는 알맞은 숙주 세포를 형질전화시킬 수 있는 핵산 벡터를 포함한다. 그리고 제조합 숙주 세포에서 발현 된 ㅐㅅㅇ산물은 예를 들어 "재조합 폴리펩타이드"이다. 재조합 핵산은 역시 논-코딩 기능(예를 들어, 프로모터, 복제기원, 리보솜 결합 위치 등)으로서 역할을 할 수 있다.
"발현 조절 서열"은 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 발현(전사및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. "작동가능하게 연결된"은 두 부분의 기능적 관계에서 하나의 부분(예를 들어, 전사 조절 능력)이 다른 하나(서열의 전사)의 부분과 기능적 관련성이 있는 것을 말한다. 발현 조절 서열은 제한 없이 예를 들어, 프로모터(예를 들어 유도성 또는 구조성), 인헨서, 전사 종결자, 개시코돈(즉 ATG), 인트론의 스프라이싱 신호, 정지 코돈등을 포함한다.
"발현 카세트"란 발현가능한 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 핵산 구성체를 말한다. 발현 카세트는 일반적으로 충분한 발현을 위한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의하여 공급될 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 리포좀에 함유되거나 노출된) 및 발현 카세트가 삽입된 바이러스와 같은 당업계에 알려진 모든 것을 포함하다.
폴리뉴클레오티드 서열이 두번째 서열과 특이적으로 하이브리드할 수 있는 첫번째 서열이면, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대하여 "안티센그 서열"이다.
2이사의 뉴클레오티드 서열 또느 아미노산 서열간 관게를 기술하는 용어는 "참조 서열", "선택된 형태", "대비창", "동일성", "서열 동일성 퍼센트", "실직적 동이", "상보적", 및 "실질적으로 상보적"등이다.
서열과 핵산 서열의 대비는 전형적으로 하나의 서열을 참조 서열로 하여, 시럼서열을 비교한다. 대비 알고리듬을 사용하는 경우, 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서브서열 코디네이트를 지정하며, 필요하다면 서열알고리드 프로그램기준치를지정할 수 있다. 선택된(default) 기준치가 사용되었다. 서열의 대비를 위한 정렬방법은 당업계에 알려져 있다. 서열의 대비를 위한 적절한 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)의 로칼 상동성 알고리듬, Needleman &Wunscj, J. Mol.Biol. 48:443(1970)의 상동성 정렬 알고리듬, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)의 유사성 탐색 방법, 이러한 알고리듬이 실행되는 컴퓨터화된 방법(GAP, BASTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 시가 조사법(Current Protocols in Molecular Bioogy(Ausubel et al., eds 1995 supplement)에 의하여 실시할 수 있다.
유용한 알고리듬의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP은 Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360(1987)의 프로그레시브 정렬 방법의 단순화를 이용한다. 이와 유사한 방법이 Higgins 7 Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)에 기술되어 있다. PILEUP을 이용하여 참조 서열을 다른 시험서열과 대비하여 다음의 기준치:디폴트 갭(3.00), 디폴트 갭 길이 웨이트(0.10) 및 웨이티드 엔드 갭을 이용하여 서열 상동성 퍼센트를 결정하였다. PILEUP은 GGG서열 분석 소프트웨어 팩키지, 예를 들어 7.0버전(Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984))으로부터 구할 수 있다.
서열 상동성 퍼센트 및 서열 유사성를 결정하는 데 알맞은 알고리듬의 또 다른 예는 Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403-410(1990) 및 Altschul et al.,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1977)에 기술된 BLAST 및 BLAST2.0 알고리듬이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트 웨어는 National Center for Biotechnology and Information(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 구할 수 있다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열을 위한)을 디폴트 워드 길이(W) 11, 정렬(B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=4 및 양쪽 모든 서열 비교 조건으로 이용하였다. (아미노산 서열을 위한) BLASTP 프로그램은 디폴트 워드 길이(W) 3, 및 기대값 10, 및 BLOSUm62 스코어링 매트릭스(Heinkoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)) 조건으로 이용하였다.
"엄격한 하이브리드 조건"은 50%포르마미드, 5x SSC 및 1%SDS, 42°C에서 인큐베이션, 또는 5x SSC 및 1%SDS, 65°C에서 인큐베이션과 0.2x SSC 및 0.1% SDS, 65°C에서 세척하는 조건을 말한다.
"천연적으로 존재하는"은 자연에서 발견될 수 있는 것을 말한다. 예를 들어, 자연에서 분리되는 실험실에서 사람에 의하여 의도적으로 변형되지 않은 생명체(바이러스 포함)속에 존재하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이다.
"링커"는 서로 다른 두 개의 분자를 예를 들어 공유적 또는 이온적, 반 데르 발스 또는 수소 결합으로 핵산의 5'말단과 상보적인 분자를 다른 상보적인 서열의 3'말단과 연결하여 두 대의 비-상보적인 서열을 연결하는 분자를 말한다.
"제약학적 조성물"이란 포유류에서 약학적으로 사용 적합한 조성물을 말한다. 제약학적 조성물은 활성 작용제 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 활성 양으로 포함한다.
"제약학적으로 활성 양"은 원하는 제약학적 결과를 가져올 수 있는 효과적인 작용제의 양을 말한다.
"제약학적으로 수용가능한 담체는 포스페이트 버퍼의 식염수, 5% 덱스트로스 용액, 기름/물 또는 물/기름의 유화제 및 다양한 종류의 습식(wetting)작용제 및/또는 어쥬반트와 같은 임의의 표준 제약학적 담체, 버터 및 희석제(excipients)를 말한다. 알맞은 제약학적 담체 및 제재(fromulation)은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19th Ed.(Mack Publishing Co., Easton, 1995)에 기술되어 있다. 바람직한 제약학적 담체는 원하는 활성 작용제의 주이방법에 따라서 다르다. 전형적인 주입 방법은 경구내(예를 들어 구강), 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 복막내 주사: 또는 국소적, 피부적 또는 트랜스뮤커스 주입)등이다. "제약학적으로 수용가능한 염"이란 예를 들어 금속 염(Na, K, Mg, Ca등) 및 암모니아 또는 유기 아민을 포함하는 제약학적으로 사용되는 화합물에 제제화될 수 있는 것을 말한다.
"환자"는 치료 또는 진단의 인간 또는 비-인간 포유류를 말한다.
조성물의 "주입"은 조성물을 선택된 주입 루트에 따라서 환자에 도입하는 것을 말한다. 예를 들어, 선택된 루트가 정맥내라면, 조서물을 환자의 정맥을 통하여 도입한다.
"치료"는 예방적 또는 치료적 치료를 말한다.
"예방적"치료란 질병의 징후가 없느 환자 또는 단지 초기 징후를 보이는 환자에서 병리가 발전할 위험을 낮출 목적을 위한 것을 말한다.
"치료적"은 병변을 보이는 환자에서 이러한 징후를 감소시키거나 제거하기 위한 치료를 말한다.
"진단"은 병변의 존재 또는 성질을 확인하는 것이다. 진단 방법은 그 민감성 및 특이성에서 차이가 있다. 진단 방법의 "민감성'이란 질병 환자에서 시험양성으로 판명될 퍼센트를 말한다(진정 양성의 퍼센트). "특이성"이란 질병없이 시험양성으로 판명된 비율로 정의되는 폴스 양성 비율인 1마이너스 폴스 양성의 비율로 정의된다. 특정 진단 방법만으로는 상태의 확정적 진단을 제공할 수 없으며, 양성은 진단에서 도움이 되는 것으로 족하다.
"예후 징후"린 질병 상태(예를 들어 심한 상태)로의 발전 가능성을 말한다.
III. TARP
본 발명은 분리되느 재조합 TARP를 제공한다. 우리는 처음에 전립선-특이 TCRγ전사체를 분리하였으므로, ~1.1kb PS-TCRγ전사체로부터 임의의 리딩 프레임으로 번역된 폴리펩타이드를 "PS-TCRγ단백질" 및 "PS-TCRγ폴리펩타이드"라고 명명하였다. 특히, 두 개의 PS-TCRγ-1(서열번호14) 및 PS-TCRγ-2(서열번호15)는 시험관내에서 번역된다. 우리는 전립선 세포에서 이들 리딩 프레임중에서 단지 첫번째 만이 번역되는 것을 알았다. 이러한 리딩 프레임이 TCRγ체인을 생성하는 것이 아니므로, 단백질을 "T-세포 수용체 알터네이트 리딩 프레임 단백질"로 명명하였다. TARP전체 길이는 58아미노산 단백질이며 서열은 도14에 서열번호14로 기술되었다.
어떠한 구체예에서, 본 발명은 TARP의 적어도 5 내지 15의 연속 아미노산을 포함하는 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 단백질은 TARP(여기에서 특별한 언급이 없으면 전체 길이 TARP를 의미한다)전체에 대한 항체에 결합한다. 다른 구체예에서 본 발명은 TARP의 에피토프를 나타내는 적어도 5개의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 부분의 첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드를 포함하는 퓨전 단백질을 제공한다. 한 구체예에서 TARP부분은 TARP의 전체 또는 실질적 부분이다. 다른 부분은 예를 들어 면역학적 단백질일 수 있다. 이러한 퓨전은 TARP에 대한 면역 반응을 일으키는데 유용할 수 있다. 또 다른 구체예에서 본 발명은 TARP와 90%이상의 상동성인(TARP에 대하여 91, 92, 93, 94, 95% 또는 보다 높은 퍼센트일 수 있다) TARP에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 TARP-유사 단백질(TARP 유사체)를 제공한다. 또 다른 구체예에서 본 발명은 TARP와 90%이상의 상동성인(TARP에 대하여 91, 92, 93, 94, 95% 또는 보다 높은 퍼센트일 수 있다) TARP를 발현하는 세포에 대한 T-림포구를 활성화할 수 있는 TARP-유사 펩타이드를 제공한다. 이러한 단백질은 PS-TCRγ단백질에 대한 내성을 막는 면역원으로 유용하다.
또 다른 구체예에서, MHC 분자, 예를 들어 HLA분자 또는 DR분자와 결합할 수 있는 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 분자들은 8 또는 9 아미노산 간격의 알맞은 앵커 아미노산을 갖는 폴리펩타이드와 결합할 수 있다. 이러한 TARP 서열은 당업계에 알려진 MHC 결합 모티프와 비교 조사하여 확인할 수 있다.
TARP, 이들의 면역 단편, 및 TARP 유사체는 재조합적으로 합성될 수 있다. TARP의 면역 단편 및 58-잔기 TARP자체는 표준 방법으로 화학적으로 합성될 수 있다. 원한다면, 폴리펩타이드는 화학적으로 신기술을 이요하여 합성될 수 있다. 이러한 한 방법은 W.Lu et al., Federation of European Biochemical Societies Letters. 429:31-35(1998)에 기술되어 있다.
IV. TARP 핵산
본 발명의 한 측면은 TARP 폴리펩타이드(도14 참조)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된, 재조합 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 TARP를 발현하는 데 유용하며, 예를 들어 이렇게 발현된 것으은 진단 목적의 항체 생산에 사용될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 핵산은 세 개의 리딩 프레임을 갖으며, 상이한 폴리펩타이드는 상이한 오픈 리딩 프레임에 의하여 정의된다. 여기에 기술된 한 구체예에서 관심의 리딩 프레임은 TARP를 인토딩하는 것이다.
언급한 바와 같이, 두 개의 프레임이 시험관내 번역 시스템에서 번역되었다. LNCaP cDNA로부터 얻은 ~1.1 kb PS-TCRγ전사체(서열번호13) 뉴클렝토티드 서열 및 전사체가 번역되었을 때 추정되는 아미노산 서열의 개시위치는 74번 위치이다(PS-TCRγ, 서열번허14), 및 뉴클레오티드 위치247(PS-TCRγ, 서열번호15)이다(도1 참조). Jγ1.2 세그먼트의 첫 10 뉴클레오티드내 전사개시 위치(밑줄)가 있다. 서열정보는 EMBL/GenBank/DDBJ에서 기탁번호 AF51103으로 얻을 수 있다. 실제 "+1" 위치는 도1의 서열의 6번째 뉴클레오티드이다.
실시자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 분리하기 위하여 PCR 프라이머 제작에 이 서열을 이용할 수 있다. LNCap 세포는 ~1.1kb 전사체 서열의 cDNA서열을 위한 유용한 분리원이다. 예를 들어 T-림포구 전구체가 아닌 인간 세포로부터의 게놈DNA는 TCRγ유전자 재배열하지 않으며 ~1.1kb 전사체로 전사시 프로세스될 수 있는 긴 서열에 유용하다. 서열은 공지 기술을 이용하여 본 발명과 관련된 분자를 인코딩하는 핵산으로 조작될 수 있다.
본 발명의 서열을 포함하는 핵산은 PCR, 리가제 체인 반응(LCR), 전사-기초 증폭 시스템(TAS), 자체 유지 서열 복제 시스템(3SR) 및 Qβ레프리카제 증폭 시스템과 같은 시험관내 방법을 이용하요 증폭하고 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자의 DNA서열에 기초한 프라이머를 이용하여 cDNA와 PCR반응시켜 분리될 수 있다.
당업계에 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, PCR방법은 미국특허번호 4,683,195;Mullins et al(1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; and Erlich, ed., PCR Techonology,(Stockton Press, NY, 1989). 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 원하는 폴리뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 프로브로 역시 게놈 및 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 분리할 수 있다.
핵산의 조작된 버전은 단백질을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드의 사이트-특이 돌연변이, 또는 0.1mM MnCl2 및 불균형 뉴클레오티드 농도에서 본래 뉴클레오티드의 PCR 에러를 증가시켜 랜덤 돌연변이로써 조작될 수 있다.
1.발현 벡터
본 발명은 TARP 전사체에 의하여 인코딩된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 발현 벡터를 역시 제공한다. 발현벡터는 알맞은 프로모터, 복제서열, 마커 등을 포함하여 mRNA의 전사 및 번역 기능을 진핵생물 또는 원핵생물에서 최적화할 수 있다. 발현벡터의 구성 및 형질전환된 세포에서의 유전자의 발현 조절은 당업계에 알려진 분자 클로닝 기술의 이용을 포함한다. Sambrool et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1989) and Current Potocols In Molecular Biology, F.M. Ausubel et alk.,eds.,(Current Protocols, A joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.) 이러한 목적에 알맞은 프로모터는 메탈로티오닌 프로모터, 구조성 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구조성 MPSV 프로모터, 테트라싸이클린-유도성 CMV 프로모터(인간 이미디어트-얼리 CMV 프로모터), 및 구조성 CMV 프로모터를 포함하나다. 유전자 치료에 유용한 플라스미드는 선택 마커, 확인 부분 및 다른 유전자와 같은 다른 기능성 요소를 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 원하는 용도에 의존한다. 이러한 발현벡터는 물론 숙주 세포에 알맞은 발현 및 복제 신호를 함유한다. 생물활성 접합체 발현에 유용한 발현 벡터는 레트로바이터스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 방러스, 플라스미드 벡터, 코슴드 및 이와 같은 것을 포함한다. 발현 벡터pcDNA1(Invitrogen, San Diego, CA)는 CMV 프로모터서열을 포함ㅎ하는 발현조절 서열을 갖으며, 좋은형질전화율 및 발현율을 보인다. 아데노-연관 바이러스 벡터도 본 발명의 방법에서 유용하다.
예를 들어 수용약상 분자의 직접 섭취, 리포펙틴(예를 들어, 리포좀 또는 면역리포좀), 입자-매개 트랜스펙션, 및 저해 뉴클레오티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 갖는 발현 카세트로부터의 세포내 발현과 같은 폴리뉴클레오티드의 세포로의 다양한 전달 방법이 가능하다. 미국특허번호 5,272,065참조; Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA(D.V.Goedddel, ed.)(1990) 또는 m.Krieger, Gene Transfer And Expression--A Laboratory Manual, Stockton Press, NY,NY,(1990). 재조합 DNA발현 플라스미드가 본 발며의 폴리뉴클레오티드의 유전자 치료가 아닌 수단으로 전달하기 위한 제조에 이용될 수 있으며, 시험관내 화학 합성이 짧은 올리고뉴클레오티드를 만드는 것이 경제적일 수 있다.
구성체는 역시 단백질의 분리를 단순화하기 위하여 태그를 함유할 수 있다. 예를 들어, 6 히스티딘 잔기와 같은 폴리히스티딘 태그를 단백질의 말단에 연결하는 것이다. 폴리히스티딘 태그는 니켈-킬레이트 크로마토그라피의 단일 단게롤 단백질을 쉽게 분리할 수 있다.
2. 재조합 세포
본 발명은 역시 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 숙주 세포는 단백질의 정제를 위한 높은 레벨의발현을 위하여 선택된다. 세포는 이. 콜라이와 같은 원핵세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 유요한 진핵세포는 효모 및 포유 세포를 포함하낟. 세포는 예를 들어, 배양에서 재조합 또는 생체내에서 재조합 세포로 될 수 있다.
TARP를 발현하는 세포는 이러한 펩타이드를 발현하는 세포에 대한 환자의 능동 또는 수동 면역화에 유용하다. 어떠한 구체예에서, 세포는 박테리아 세포이다. 능동 면역화, 재조합 세포에서 환자의 자가 세포는 HLA 분자와 연관된 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 이러한 목적에 있어서, 항원 제공 세포가 유용하다. 이러한 경우, 환자로부터 분리된 "자가세포"를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 세포는 MHC 양립성이다. TARP-인코딩 뉴클레오티드 서열은 세포 표면에 높은 밀도로 , 바람직하게 건강한 전립선 상피세포보다 높은 밀도로 발현하도록 세포의 구조성 프로모터의 조절하에 있어야 한다.
V.TARP 발현하는 세포에 대한 세포-매개 면역반응을 일으키는 방법.
상피 근원 전립선암 세포 및 많은 유방암에 의하여 TARP가 발현된다. 따라서, TARP는 본 발명의 전립선암 및 TARP-발현 유방암 치료 및 전립선 및 유방으로부터 전이된 암세포에 대한 마커로서 유용하다. 본 발명은 면역치료로 전립선암 및 TARP발현 유방암 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 환자를 TARP에 대하여 면역화하여, TARP-발현 세포에 대한 세포-매개 면역 반응을 일으키는 것을 포함한다. 면역화는 능동 또는 수동적일 수 있다. 능동 면역화에서, 환자 생체내에서 면역 반응이 야기된다. 수동 면역에서 폴리펩타이드에 대하여 활성화된 Tc세포가 시험관내에서배양되고 환자에 주입된다. 이러한 방법은 TARP-발현하는 건강한 상피 전립선 세포의 파과를 가져올 것이다. 그러나, 전립선은 피수 기관이 아니다. 전립선 상실은 환자의 전립선암으로 인한 사망과 균형적으로 결정하여야 하며, 실제로 TARP 면역치료전에 환자의 전립선이 제거될 수 있다. 정상 유방세포는 상당한 양으로 TARP-발현하지 않는 것으로 알려졌으므로, TARP-발현 세포에 대한 면역화가 여성의 정상 세포의 파괴를 가져오지 않을 것이다. 따라서, TARP 조성물을 여성에 예방적으로 주입하여 TARP-발현 세포 유방암이 후에 발생하는 것에 대한 면역 반응을 제공할 수 있다.
면역 작용제는 전체 길이 TARP, TARP의 면역 결정자, 예를 들어 TARP면역단편, 또는 TARP와 실질적으로 동일한 단백질 또는 펩타이드가 될 수 있다. TARP에 대한 세포-매개 면역 반응을 일으키는 경우, 항원 결정자를 포함하는 바람직한 펩타이드는 환자의 HLA분자 모티프에 결합하는 펩타이드를 포함한 것이 바람직하다. 이러한 모티프는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, HLA-A2는 인간 집단에서 공통적 대립유전자이다. 이러한 분자의 결합 모티프는 두 번째 위치에 류신 또는 메티오닌, 및 마지막 위치에 발린 또는 류신을 갖는 9 또는 10 아미노산의 폴리펩타이드를 포함한다. TARP 폴리펩타이드 서열에 기초하여 , 임의의 특이 HLA 분자에 대한 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 이러한 모티프를 포함하는 펩타이드는 전형적인 방법(예를 들어, 재조합, 화학적 방법 등)으로 제조될 수 있다. TARP는 자가 단백질이기때문에 HLA 결합 모티프를 갖는 바람직한 아미노산 서열은 서브도미난트 또는 크립틱 에피토프일 수 있다. 이러한 에피토프는 HLA 분자에 대하여 결합하는 분자의 다른 에피토프 또는 다른 분자와 비교할 때, HLA 분자에 대한 상대적으로 낮은 결합 친화성에 의하여 확인될 수 있다.
HLA 결합 모티프를 포함하는 TARP로부터의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 사실 면역 반응을 일으키는데 유용하다. 그렇기 때문에 이러한 단백질은 세포에 의하여 HLA 분자와 결합할 수 있는 분자로 프로세스되어 TARP에피토프를 갖게 된다.
HLA 분자 복합체 및 펩타이드 항원은 HLA-제한 T-세포에 의하여 인식되는 리간드로 작용한다(Buss, S. et al., Cell47:1071, 1986; Babbit, B.P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. and Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R.N., Annu. Rev.Immunol.11:403, 1993). 항원 유사체의 단일 아미노산 치환 연구 및 내부 결합 서열결정를 통하여, 천연적으로 프로세스되는 펩타이드, HLA항원 분자에 특이결합하는데 중요 잔기등이 확인되었다(Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363,1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., Sette, A. and Sidney, J.Curr.Opin.Immunol. 10:478,1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immul. 6:13, 1994; Sette, A. and Grey, H.M.,Current opinion Immunology 4:79,1992 참조).
더 나아가, HLA-펩타이드 복합체의 x-레이 크리스탈로그라피 분석은 대립유전자 특이적으로 펩타이드 리간드의 잔기와 알맞은 HLA 분자의 펩타이드 결합 크레프트내 포켓을 발견하였다; 펩타이드에 존재하는 이러한 잔기는 HLA결합 능력을 결정한다(Madden, D.R. Annu.Rev.Immunol. 13:587, 1995; Smith, et al., immunity4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure2:245, 1994; Jones, E.Y.Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J.H. et al.,Nature 364:33, 1993 참조).
이와 같이 클라스 I 및 클라스 II 대립유전자-특이 HLA 결합 모티프의 정의 또는 클라스 I 및 클라스 II 슈퍼모티프는 TARP내 인식 부분을 가능하게 하고 특정 HLA분자와 결합할 수 있게 한다.
TARP와 높은 정도의 동일성인 분자도 역시 면역반응을 일으키는데 유용하다. 이러한 분자는 면역시스템에서 "외부"로 인식될 수 있으며, TARP와 교차반응하는 항체 형성 또는 CTLs을 생성한다. TARP와 높은 정도의 동일성인 분자는 비-인가 TCRγ호모로그, 특히 영장류의 것을 포함한다. 적어도 90%(TARP와 91,92,93,94,95% 또는 이보다 높을 수 있는)의 아미노산 서열이 동일한, TARP에 대하여 특이적으로 결합하는 항체에 의하여 특이적을 결합되는TARP유사체는 유용하다. 더 나아가 적어도 90%(TARP와 91,92,93,94,95% 또는 이보다 높을 수 있는)의 아미노산 서열이 동일한, TARP를 발현하는 세포에 대한 T-림포구를 활성화하는 TARP유사체도 유용하다.
TARP 항원 결졍자에 실질적으로 호모로거스한 또 다른 분자가 HLA 분자에 보다 높은 친화성을 갖도록 천연 TARP에피토프 서열을 변형하는 데 사용될 수 있다.
항원 결정자를 인코딩하는 유전자를 확인하는 방법은 다음과 같다: 전이암 환자로부터의 TILs을 시험관내에서 자가 암으로 인식하는 능력을 시험하는 것이다.이러한 환자에 주입된 TILs은 종양 되행의 결과를 확인할 수 있다. TILs에 의하여인식되는 에피토프를 발현하는 유전자를 발현 라이브러리에서 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 환자는 이러한 유전자로 면역화될 수 있다. 또한, 이러한 유전자에 의하여 인코딩된 항원에 대하여 민감화된 림포구를 이용할 수 있다. 민감화된 림포구를 환자에 이식하고 이들의 종양 퇴화 능력을 시험한다. Rosenberg et al., (1997) Immunol.Today 1997 18:175.
이러한 분자의 응용을 기술한다. 이러한 방법들은 역시 Rosenberg et al.(1997) Immunol.Today 1997 18:175. 및 Restifo et al.(1999) Oncology 11:50에 기술되어 있다.
면역반응을 일으키는 한 방법은 환자에 TARP로부터의 항원 결정자를 포함하느 폴리펩타이드 단독 또는 보다 바람직하게 프로이드 불완전 어쥬반트, 지방질 또는 리포좀, gp96, Hsp70, 또는 Hsp90과 같은 어쥬반트로 면역화하는 것이다. 폴리펩타이드는 TARP, TARP 항원단편, 항원결정자를 포함하는 퓨전 단백질, 또ㅡㄴ 항원 결정자와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있다.
또 다른 방법은 TARP의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 항원 제공 세포에 펄스하고 환자에 세포를 주입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법에서, 발현 카세트의 TARP의 항원결정자를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열을 함유하는 재조합 바이러스를 환자에 주입하는 것이다. 바이러스는 선택적으로 시토카인(예를들어 IL-2), 동시자극(costimulatory) 분자 또는 면역반응을 높이는 다른 유전자을 인코딩할 수 있다. 예를 들어 바이러스는 아데노바이러스, 폴폭스(fowlpox) 바이러스, 또는 박시니아 바이러스일 수 있다.감염시 감염된 세포는 TARP 펩타이드를 발현하고, 세포표면에 항원 결정자와 동일한 모티프를 갖는 펩타이드와 결합하는 HLA 분자와 함께 세포표면에 항원결정자를 발현한다. 이러한 세포는 제공된 항원을 인식하는 CTLs을 활성화하여 이러한 결정자를 갖는 암세포를 파과한다.
또 다른 방법에서 TARP 항원 결정자를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA자체로 예를 들어 근육내, 비오리스틱(biolistic) 주사 또는 리피드와 연결하여 환자를 면역화할 수 있다. 이러한 방법은 폴리펩타이드를 인코딩하는 세포에 대한 세포-매개 면역반응을 자극한다.
또 다른 방법에서, 바실러스 칼메트-게린(BCG), 살모넬라 또는 리스테리아와 같은 에피토프, 선택적으로 면역반응을 증가시키는 시토카인 ,동시자극 부자 또는 다른 유전자를 인코딩하는 재조합 박테리아를 환자에 주입한다.
또 다른 방법에서 항원을 발현하는 세포를 환자에 주입할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 TARP 에피토프로 펄스된 덴드라이트 세포, TARP항원 결정자, HLA, 및 B7유전자를 포함하는 폴리펩타이드로 트랜스펙션된 세포를 포함한다. 복수의 트랜스펙션은 세포 표면에 한원 제공을 위한 여러개의 구성요소의 생산할 수 있게 한다. 한 구체예에서, 분자는 항원결정자가 HLA분자와 연결된(일반적으로 링커를 통하여)폴리펩타이드로 펩타이드의 HLA분자에의 결합을 향상시킨 퓨전 단백질이다. 한 구체예에서 세포는 항원 제공 세포이다. 바람직하게, 세포는 진핵세포, 더 바람직하게 포유류 세포, 더욱 바람직하게 인간세포, 더더욱 바람직하게 환자의 자가 인간 세포이다.
또 다른 구체예에서, 항원 제공 세포(APCs)는 시험관내에서 TARP 에피토프를 포함하는 펩타이드와 동시 배양 또는 펄스된다. 이러한세포는 전립선암 종양 또는 말초혈관 림프구와 같은 종양 침투 림프구CD8세포를 민감화하는데 사용된다. TILs 또는 PBLs는 바람직하게 환자로부터 유래한다. 그러나, 이들은 적어도 환자가 MHC Class I에 한정된 HLA 타입을 갖어야 한다. 민감화된 세포는 환자에 주입된다.
보완 방법에서, 이러한 면역치료는 IL-2, IL-3, IL-6, IL10, IL12, IL15, GM-CSF, 인터페론과 같은 시토카인을 주입하여 강화될 수 있다.
상기 펩타이드의 면역유발능을 평가하는 방법에 추가로, 면역유발능은 정상인의 일차 T-세포 배양의 평가(Wentworth, P.A. et al., Mol. Immunol.32:603,1995; Celis, E. et al., P.N.A.S. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998 참조); HLA형질전화 마우스의 면역(Wentwoeth, P.A. et al., J.Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P.A et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander , J. et al., J.Immunol. 159:4753, 1997 참조); 효율적으로 백신화되거나 종양을 갖는 환자로부터의 T-세포 반응의 시험(Rehermann, B. et al., J.Exp. MEd. 181:1047, 1995;Doolan, D.L. et al., immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S.C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H.M. et al., J.Virol. 71:6011, 1997 참조)에 의하여 평가할 수 있다.
관심의 CTL-유도 펩타이드를 백신 조성물로 선택함에 있어서, MHC Class I에대한 보다 높은 친화성인 펩타이드가 일반적으로 바람직하다. 펩타이드 결합은 시험관내에서 정제된 HLA분자에 대한 후보 펩타이드의 결합능력을 조사하여 평가할 수 있다.
백신으로 사용될 때, TARP 유사체가 실제로 생체내에서 TARP에 대한 CTL반응(또는 클라스II 에피토프인 경우 야생형 펩타이드와 교차 반응하는 헬퍼 T-세포를 자극하는)을 일으키는 것을 확실히 하기 위하여 알맞은 HLA대립유전자의 환자로부터 시험관내에서 T-세포를 면역화하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 면역화된 세포의 TARP 민간화된 표적 세포의 용해를 유도하는 능력을 평가할 수 있다.
더 일반적으로, TARP로부터의 펩타이드 또는 이들의 유사체(본 발명의 펩타이드)를 합성하고 이들의 HLA 단백질에 대한 결합능력 및 HTL 또는 CTL 반응을 활성화하는 능력, 또는 이들 모두를 평가할 수 있다.
T-세포 반응을 검출하는 데 사용되는 일반적인 검정법은 증식 검정법, 림포카인 분비 검정법, 세포독성의 직접 검정법 및 제한 희석 검정법을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드와 함께 배양된 항원-제공 세포는 반응 세포 군집에서 CTL반응을 일으키는 능력이 평가된다.
PBMCs가 CTL 전구체의 반응세포원으로 사용될 수 있다. 알맞은 항원-제공 세포는 펩타이드와 배양되고, 펩타이드과 로딩된 항원-제공 세포는 알맞은 배양조건에서 반응세포군집과 배양될 수 있다. 방사능-표지된 표적 세포, 특이 펩타이드 펄스된 표적 및 펩타이드 서열이 유래한 항원의 형태로 내부적으로 프로세스된 것을 발현하는 표적 세포를 죽일 수 있는 CTL의 존재하에서 배양의 양성 CTL 활성화를평가할 수 있다.
항원특이 T-세포의 직접 정량 방법은 형광-표지된 HLA 테트라머 복합체로 염색하여 가능하다(Altman et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 90:10330(1993); Altman et al., Science 274:94(1996)). 또한, 세포내 림포카인의 염색, 인터페론-감마 방출 검정법 또는 ELISPOT 검정법으로 T-세포 반응을 평가할 수 있다.
HTL 활성화는 T-세포 증식 및째포카인, 예를 들어 IL-2 분비와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 평가될 수 있다(Alexander et al, Immunity 1:751-761(1994) 참조).
VI.TARP에 대한 항체
본 발며의 한 구체예는 TARP에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 적어도 106M-1, 107M-1, 108M-1, 109M-1을 갖는다. 본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 모두 포괄한다.
다수의 면역원이 TARP에 특이적으로 결합하는 항체 생산에 이용될 수 있다. 전체길이-TARP 는 알맞은 면역원이다. 전형적으로, 관심의 면역원은 적어도 3개의 아미노산, 더 전형적으로 적어도 5 아미노산 길이, 바람직하게 적어도 10아미노산 길이, 더욱 바람직하게 적어도 15 아미노산 길이이다. 펩타이드는 담체 단백질에 커플될 수 있으며(예를 들어, 퓨전 단백질),또는 면역화 벡터에서 재조합적으로 발현되는 것일 수 있다. 전형적으로 3 내지 10 아미노선 길이가 펩타이드에서 항체에결합하는 항원결정자이다. 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드가 역시 정제 또는 미정제 형태로 사용될 수 있다.
재조합 폴리펩타이드는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 발혀뇔 수 있으며, 표준 방법으로 정제될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 이들의 합성 버전은 항체를 생산할 수 있는 동물에 주입된다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 폴리펩타이드의 존재 및 양을 측정하기위한 검정법에서 사용된다.
폴리클로날 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 간단히, 면역원, 바람직하게 정제된 폴리펩타이드, 알맞은 담체에 결합된 폴리펩타이드(예를들어 GST, 키홀 림펫 헤모시아닌등) 또는 재조합 박시니아 바이러스와같은 면역화 벡터에 삽입된 폴리펩타이드(미국특허번호 4,722,848 참조)를 어쥬반트와 혼합하고 이 혼합물로 면역화한다. 면역원에 대한 동물의 면역 반응은 시험채혈 및 관심의 폴리펩타이드에 대한 활성 타이터를 측정하여 모니터할 수 있다. 면역원에 대한 알맞게 높은 타이터의 항체르 얻으면, 동물로부터 채혈하고 항혈청을 얻는다. 폴리펩타이드에 대한 활성 항체를 농축하기 위한 분배를 할 수 있다(Colligan(1991) Current Protocols Im Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane(1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY 참조).
결합 단편 및 싱글 체인 재조합 버전을 포함하는, TARP 기결정 단편에 대한 항체는 상기 기술된 담체 단백질과 단편의 콘쥬게이트로 동물을 면역화하여 얻을 수 있다.
모노클로날 항체는 원하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조된다. 이러한항체는 정상 또는 변형된 폴리펩타이드에 대한 결합에 대한 스크리닝, 또는 애그노스틱 또는 애그노스틱 활성에 대하여 스크리닝한다. 어떤 경우에 있어서, 다양한 포유류 숙주, 예를 들어 마우스 , 설치류, 영장류, 인간 등으로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 Stites et al., (eds) Basic and Clinical Immunology(4th ed) Langer Medical Publications, Los Alto, CA; 상기 Harlow and Lane; Goding(1986) Monoclona Antibodies; Principles and Practices(2d ed.) Academic Press, New york, NY; Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497에 기술되어 있다.
다른 알맞은 기술은 파지 또는 유사 벡터의 재조합 항체 라이브러리에서의 선택이다(Huse et al.,(1989) Science 246:1275-1281; and Ward, et al., (1989)Nature 341:544-546 참조).
역시 재조합 면역글로불린이 제조될 수 있다(미국특허번호 4,816,567(Cabilly); Queen et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 참조).
종종, 폴리펩타이드 및 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질과 공유적 또는 비공유적으로 연결된다. 다양한 표지 및 접합 기술이 알려져 있으며, 과학 및 특허 문헌에 집중적으로 보고된다. 따라서, 검출물을 검출하기 위하여 사용되는 항체는 직접적으로 검출가능한 부분으로 표지되거나 예를 들어 이차 항체에 의하여 결합되는 간접적으로 직접 또는 간접 표지될 수 있다.
본 발명의 항체는 TARP를 분리하기 위한 친화성 크로마토그라피에 사용될 수있다. 항체가 연결된 지지체, 예를 들어 아가로스, 세파덱스, 또는 이와 유사한 입자로 팩킹된 컬럼에 세포 용해물을 통과시키고, 세척, 및 변성제의 보다 높은 처리로 정제된 TARP를 얻을 수 있다.
인간화된 면역글로불린을 제조하는 또 다른 방법은 비-인간 항체의 CDR부분을 인간 항상 부분과 재조합 DNA기술을 이용하여 연결하는 것이다(미국특허번호 5,585,089참조(Queen et al).
인간 모노클로날 항체 또는 이들의 결합 단편을 인코딩하는 DNA서열을 분리하는 방법은 Huse et al., Science 246:1275-1281(1989)에 기술된 일반 방법을 이용하여 인간 B세포의 DNA 라이브러리를 스크리닝하고, 원하는 특이성의 항체(또는 결합 단편)를 인코딩하는 서열을 증폭 및 클로닝하는 것이다. Huse에 의하여 기술된 방법은 파지 디스플레이 기술과 조합으로 더 효율적으로 된다(WO 91/17271(Dower et al) 및 WO 92/01047(McCafferty et al. 참조). 파지 디스플레이 기술은 TARP에 친화성을 갖는 항체의 CDR 부분을 돌연변이하는데 사용될 수 있다. 향상된 친화성을 갖는 항체가 분비된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 TARP 또는 단백질 유사체에 대한 항체 단편을 제공한다. 전형적으로, 이러한 단편은 TARP에 대하여 완전한 면역글로불린과 유사한 특이 결합을 보인다. 항체 단편은 분리된 헤비 체인 , 라이트 체인 Fab, Fab'F(ab')2 및 Fv를 포함한다. 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 완전한 면역글로불린의 분리에 의하여 단편을 제조할 수 있다.
VII. TARP 표적 키메릭 분자
본 발명은 TARP를 타겟팅하는 키메릭 분자를 제공한다. 키메릭 분자는 타게팅 부분 및 작용 부분을 포함한다. 키메릭 단백질은 폴리펩타이드 및 이를 함유한느 세포를 검출하는 데 유용하다.
A. 타게팅 부분
본 발명의 키메릭 분자는 타게팅 부분을 포함한다. 타게팅 부분은 TARP에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 바람직한 리간드는 항체의 결합 단편을 포함하는 항체이다. 그러나, 이러한 분자에 대한 다른 천연 리간드도 사용될 수 있다.
B.작용부분(Effector moiety)
작용부부은 항체, 성장 호르본, 또는 리간드와 같은 또 다른 특이 결합 부분일 수 있다. 키메릭 분자는 특이 양기능적 링커로 작용할 수 있다. 이러한 링커는 세포 또는 세포 구성요소와 겨랗ㅂ 퓨전 단백질과의 반응을 향상시킬 수 있다.
작용 분자의 또 다른 구체예는 제약학적 작용제(예를들어 약) 또는 제약 작용제를 함유하는 기구일 수 있다. 따라서, TARP에 특이적으로 결합하는 부분이 빈블라스틴, 옥소루비신, 제닌테인(티로신 카이네이즈 저해제), 안티센스 분자, 및 다른 제약학적 작용제로 당업자에 알려진 것들과 접합되어 제약학적 작용제를 종양 세포에 특이적으로 타겟팅할 수 있다.
또한, 타겟팅 분자는 치료 조성물을 함유하는 기구에 결합될 수 있다. 이러한 기구(vehicle)은 제한되지 않게 리포좀, 미셀, 다양한 합성 비드 등과 같은 것을 포함한다.
당업자는 본 발명의 키메릭 분자가 단일 작용제에 연결된 복수의 타겟팅 부분, 다시 말해 복수 작용제 부분에 연결된 단일 타겟팅 부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키메릭 분자는 복수의 타겟팅 부분 및 다수의 작요 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 키메릭 분자의 작용 분자 요소로 알맞은 검출가능한 표지는 스펙트로스코피, 광화학, 생화학, 면역학, 전기적, 광학, 또는 상기 모든 수단으로 검출가능한 것을 포함한다.
당업자는 타겟팅 부분과 작용 부분이 임의의 순서로 연결가능한 것을 알 것이다. 따라서, 타겟팅 부분이 폴리펩타이드면, 작용부분은 타겟팅 부분의 아미노 또는 카르복시 말단에 연결될 수 있다. 각각 부분의 활성을 방해하지 않는한, 타겟팅 부분이 역시 작용부분의 내부에 연결될 수 있고, 다시 말해 작용 분자는 타겟팅 부분의 내부에 연결될 수 있다.
타겟팅부분과 작용부분은 당업자에게 공지된 다수의 수단으로 연결될 수 있다. 전형적으로 작용분자가 링커(스페이서)를 통해 타겟팅 분자에 접합된다. 그러나, 작용부분 및 타겟팅 부분 모두 폴리펩타이드이며, 단일 체인 퓨전 단백질로서 키메릭 분자를 재조합적으로 발현하는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 타겟팅 분자는 화학적으로 작용 분자(예를 들어 싸이토톡신, 표지, 리간드, 또는 약, 또는 리포좀)에 접합된다. 분자의 화학적 접합수단은 당업자에게 공지되어 있다. 자용제를 항체 또느 다른 폴리펩타이드 타겟팅 분자에 부착하는 절차는 작용제의 화학구조에 따라서 다르다. 폴리펩타이드는 전형적으로 다양한 작용기를 갖는다: 카르복시산 또는 자유 아민그룹은 작용분자상 알맞은 기능기로 작용제를 결합시킬 수 있다. 또한, 타겟팅 분자 및/또는 작용 분자는 추가의 활성 기능기 노출 또는 첨가할 수 있다. 유도화는 Pierce Chemical Company, Rockford Illinois로부터 얻을 수 있는 임의의 숫자의 링커 분자의 추가하는 것을 포함할 수 있다.
특정 작용제상 그룹과 활성인 기능기 및 항체와 활서인 기능기를 갖는 양기능적 링커는 원하는 면역접합물을 형성하는데 사용할 수 있다. 또한, 유도화는 예를 들어 당단백질 항체의 당부분의 페리오데이트로써 글리콜 절단하여 자유 알데히드기의 생성과 같은 타겟팅 부분자의 화학 처리를 포함할 수 있다. 항체상 자유 알데히드기는 작용제상 자유 아민 또는 히드라진기와 반응하여 작용제를 결합시킬 수 있다(미국특허번호 4,671,958참조). 항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩타이드상 자유 설피드릴기의 생성과정도 알려져 있다(미국특허번호 4,659,839참조).
다양한 화합물의 부착을 위한 많은 방법 및 방사능 금속 킬레이트, 독소, 및 단백질에 대한 약을 포함하는 링커 분자들이 공지되어 있다(유럽특허출원 번호 188,256; 미국특허번호 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 4,589,071; Borlinghaus et al., Cancer Res. 47:4071-4075(1987) 참조). 특히, 다양한 면역독소의 제조는 공지되어 있으며, 예를 들어 Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190(1982), Waldmann, Science, 252:1657(1991), 미국특허번호 4,545,985 및4,894,443에서 찾을 수 있다.
타겟팅 분자 및/또는 작용부자가 상대적으로 짧으면(즉 50아미노산 이내) 표준 화학 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 모든 분자가 상대적으로 짧으면 키메릭 분자는 단일 연속 폴리펩타이드로 합성될 수 있다. 또한, 타겟팅 분자 및 작용 분자가 독립적으로 합성되고 하나의 아미노말단과 가은 하나의 카르복시말단을 응축하여 팹타이드 결합을 형성할 수 있다. 또한, 타겟팅 및 작용 분자가 펩타이드 스페이서 분자의 하나의 말단과 응축되어 퓨전 단백질을 형성한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 바람직한 화학 합성법은 솔리드 페이즈 합성으로 서열의 C-말단 아미노산에 잔여 아미노산을 순서적으로 첨가하는 것이다. 솔리드 페이즈 합성 방법은 Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis:pp. 3-284 in the Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2:Special Methods in Peptide Symthesis, Part A., Merrifield, et al., J. Am. Chem.Soc., 85:2149-2156(1963), 및 Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. Pierce Chem. Co. Rockford, Ill.(1984)에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 키메릭 퓨전 단백질은 재조합 DNA 방법을 이용하여 합성한다. 일반적으로 이는 퓨전 단백질을 인코딩하는 DNA서열을 제조, 알맞은 특정 프로모터하 발현 카세트에 위치, 숙주에서 단백질 발현, 발현된 단백질의 분리, 필요하다면, 단백질의 재구성하는 것을 포함한다.
본 발명의 퓨전 단백질을 인코딩하는 DNA는 예를 들어 알맞은 서열의 클로닝 및 제한 또는 Narang et al. Meth. Enzymol. 68:90-99(1979)의 포스포트리에스터방법; Brown et al., Meth.Enzymol.69:109-151(1979)의 포스포디에스터 방법; Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859-1862(1981)의 디에틸포스포라미디트 방법; 미국특허번호 4,458,066의 솔리드 서포트 방법으로 제조될 수 있다.
두 분자가 바람직하게 직접적으로 연결되지만, 당업자는 하나이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드 스페이서로 분리된 분자일 수 있다는 것을 알고 있다. 일반적으로 스페이서는 단백질을 연결하는 역할 또는 최소한의 거리 또는 이들의 공간 관계 유지외에는 특이 생물학적 활성이 없다. 그러나, 스페이서의 구성 아미노산은 분자의 폴딩, 네트 차지, 또는 배수성의 특성에 영향을 주도록 선택될 수 있다.
퓨전 단백질을 인코딩하는 핵산서열은 이.콜라이, 다른 박테리아, 효모 및 다양한 COS, CHO 및 HeLa 및 마이로마(myeloma) 세포 라인와 같은 진핵생물을 포함하는 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 각각의 숙주에 알맞은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 T7, trp, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 위치 및 바람직하게 전사 종결자를 포함한다. 진핵 세포에서 조절 서열은 프로모터, 바람직하게 면역글로불린 유전자로부터 유래한 인헨서, SV40, 싸이토메갈로바이러스 등, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 스프라이싱 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 선택된 숙주세포에 칼슘클로라이드 이.콜라이 형질전환방법 및 포유세포의 칼슘조성물은스페이트 또느 전기투과법과 같은 잘 알려진 방법으로 전달된다.
일단 발현되면, 재조합 퓨전 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그라피, 젤 전기영동 등(R.Scope, Protein Purification, Springer-Verlag, NY.(1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. NY(1990))을 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라서 정제된다. 실질적으로 순수한 조성물은 제약학적 용도를 위하여 적어도 90 내지 95%의 균질성이 선호되며, 더욱 바람직하게 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성이 필요하다. 부분적으로 또는 균일하게 일단 정제되면, 폴리펩타이드는 치료적으로 사용될 수 있다.
VIII. TARP-발현 세포 검출 방법
본 발명의 또 다른 측면은 TARP-발현 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 TARP 전사체 또는 폴리펩타이드를 검출을 포함한다. 상피근원 전립선암 세포 또는 많은 유방암 세포는 TARP를 발현하기 때문에 검출방법은 전립선암 또는 TARP-발현 유방암을 검출하는데 유용하다. 특히, 전립선암 세포 및 많은 유방암세포는 TARP발현으로 구별될 수 있다.
전립선 또는 유방을 포함하는 일차 또는 전이 암의 임의의 위치 및 림프 노드 및 다른 기관과 같은 떨어진 위치에서 조직 시료를 선택할 수 있다. 당업자는 여자뿐만 아니라 남자도 유방암을 갖음을 알 수 있다. 남성의 유방암은 상대적으로 낮으며, 단지 유방암 케이스의 약1%이다. 알려지지 않았기 때문에, 말기에 진단되는 것이 흔한 일이며, 이는 생존 확률에 영향을 준다. 따라서, 남성 유방암의 향상된 진단이 바람직하다.
한 방법에서, 환자에서 조직을 채취하고 수집된 조직을 시험관내에서 검사한다. 전형적으로 세포는 용해, 소닉 파괴, 삼투압, 냉동 및 융해, 효소 처리, 또는 당업계의 다른 수단으로 내용물을 변성시키지 않고 핵 단백질에 접근할 수 있게 한다. 세포 내용물(또는 핵 내용물은 분배될 수 있다)을 예를 들어 항TARP와 접촉시키는 것이다. 면역 복합체는 채취된 시료의 TARP존재를 나타낼 것이다. 이러한 검출을 촉진하기 위하여, 항체는 방사능 표지되거나, 방사능 표지된 작용분자에 커플되어 있을 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 생체내에서 전형적인 이미지 시스템을 이용하여 검출될 수 있다. 예를들어,환자에 세포 핵에 도달할 수 있는 표지된 조성물을 주입하는 것이다. 그리고, 임의의 방법으로 표지의 위치를 파악하는 것이다. 임의의 편리한 시각화 진단 이미지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 파라마그네틱 동위원소가 MRI에 사용될 수 있다.
TARP 검출
TARP는 당업계의 임의의 공지 방법으로 확인될 수 있다. 한 구체예에서, 본 방법은 특이적으로 폴리펩타이드를 인식하는 리간드로 폴리펩타이드를 검출할 수 있다(예를 들어, 면역검정법). 본 발명의 항체는 특히 TARP의 특이 검출에 유용하다. 당업계에 다양한 항체-기초 검출법이 공지되어 있다. 이러한 것들은 예를 들어, 방사능면역검정법, 샌드위치 면역검정법(Elisa 포함), 면역형광검정법, 웨스턴 블롯, 친화성 크로마토그라피(고체 페이즈에 결합된 친화 리간드) 및 표지된 항체로 인 시츄(in-situ) 검정법 등을 포함한다. TARP를 검출하는 또 다른 방법은 그 매스에 알맞은 폴리펩타이드를 확인하는 것이며, 예를 들면 젤 전기영동, 매스 스펙트로스코피, 또는 HPLC등이다. 환자 시료는 침샘, 복막액, 혈액 또는 혈액 생성물(예를 들어 형장), 소변, 조직 분리(예를 들어 림프 노드 조직) 등의 임의의 분리원으로부터 얻을 수 있다.
TARP는 세포에서 시험관내에서 검출될 수 있으며, 생체조직으로 부터의 시료를 생체내로 상기 이미지 시스템을 이용하여 검출할 수도 있다.
TARP 인코딩 전사체의 검출
TARP-발현 세포 전사체는 시료를 전사체와 특이적으로 결합하는 핵산 프로브로 하이브리드하고 하이브리드를 검출할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 표지된 프로브를 시료와 접촉하고 하이브리드에 부착된 표지를 검출하는 인 시츄 하이브리드를 포함한다. 따라서, 다른 방법은 RT-PCR과 같은 증폭방법을 이용한다. 이러한 방법에서, 프로브는 mRNA TARP서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 증폭 프라이머로 선택된다. 그리고, 증폭된 서열을 전형적인 방법으로 검출한다.
TARP전사체에 특이적으로 하이브리드하도록 프로브가 선택된다. 일반적으로 상보 프로브가 사용된다. 그러나, 엄격한 조건에서 충분한 서열 상동성 및 하이브리드하기 충분한 길이이면 프로브는 정확하게 상보적이지 않을 수 있다.
IX. 제약학적 조성물
본 발명의 한 측면은 본 발명의 조성물 및 제약학적 수용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 제약학적 조성물은 TARP, TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드인 면역 단편 또는 TARP 유사체를 환자에서 세포-매개 면역 반응 또는 체액 반응을 일으키기에 충분한 양의 MHC결합 모티프를 갖는 폴리펩탕드를 포함한다. 이러한 제약학적 조성물은 본 발명의 치료 방법 및 항체 생산을 위하여 유용하다.
한 구체예에서 제약학적 조성물은 환자에서 TARP-발현 세포에 대한 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 TARP를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함ㅎ한다. 이러한 조겅물은 본 발명의 치료방법에 유용하다.
또 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 관심의 세포에서 TARP 발현을 조절하기 위한 TARP를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 절단할 수 있는 리보자임, 이러한 핵산에 결합할 수 있는 안티센스 분자, 또는 TARP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 타겟팅 분자 및 TARP-발현 세포를 검출하는 검출 분자를 포함하는 키메릭 분자를 포함한다. 만약 검출 부자가 TARP를 인코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 능력(TARP를 인코딩하느 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질과 같은)이 있으면, 핵산을 발현하는 세포를 검출하는 데 조성물을 사용할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 환자에 주입하기 위한 유니트 투약량으로 제조될 수 있다. 주입 량 및 시간은 원하는 목적에 따라서 의사가 결정할 수 있다.
실시예1. 전립선 세포의 T-세포 수용체 γ-체인의 검출
우리는 전립선 세포의 T-세포 수용체 γ-체인(TCRγmRNA)의 발현을 확인하고 이것이 침투 T-림프구로부터 유래한 것이 아닌 상피근원 전립선으로부터 유래한 것임을 보였다. 반대로, T-세포 수용체 δ-체인(TCRγδ)은 인간에서 사이런트이다.전립선의 주요 T-세포 수용체 γ-체인은 흉선, 비장 및 혈액 백혈구에서 발현된는 전사체와 상이한 크기를 같는다. 이것은 정상 전립선 상피, 전립선의 아데노카르시노마 및 전립선 아데노카르시노마 세포 라인 LNCaP에서 발현된다. RNA는 재정렬되지 않은 TCRγ좌위로부터 유래하고 Jγ1.2의 바로 업스트림의 인크론 서열내에서 개시된다. 전립선 특이 TCRγ전사체는 Jγ1.2 및 Cγ1 유전자 세그먼트로 구성되며, 3' 말단의 폴리아데닐 신호 및 폴리(A) 서열을 포함하는 미번역 서열을 갖는다. T-림프구만이 발현한다고 생각되었던 것을 전립선 상피 세포가 유전자로부터 높은 레벨의 전사체를 발혐하는 것은 매우 신규하고 예상치 못한 일이다.
1. 재료 및 방법
RNA 도트 블롯 및 노던 블롯 하이브리드
RNA 도트 블롯(RNA master blot, Clontech, Palo Alto, CA) 및 노던 블롯(MTN, Clontech, Palo Alto, CA) 하이브리드를 다양한 인간 조직에 대하여 수행하였다. 전립선 아데노카르시노마 세포 라인 LNCaP 및 PC-3(ATCC, Rockville, MD)의 mRNA에 대하여 노던 블롯을 수행하였다. 폴리(A) RNA의 분리는 FastTrack kit(InVitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 수행하였다. RNA를 1% 아가로스 젤에서 전기영동하고 나이론-기초 막(GeneScreen Plus, DuPont, Wilmington, DE)로 정해진 방법에 따라서 옮겼다(Ausubel, 상기). EST 플라스미드 ng79d11(Genome Systems, St. Louis, MO)로부터 TCRγ전사체의 미번역 3'말단(3'UTR)에 대한 특이 cDNA 프로브를 제작하였다. TCRγ전사체 구조성 부분(TCR Cγ)에 대한 특이 프라이머를LNCap cDNA로부터 제작하고, TCRδ전사체 구조성 부분(TCR Cδ)에 대한 특이 프라이머를 TCRδ플라스미드로부터 제작하였다. 인간 베타-액틴 프로브를 이용하여 준비된 mRNA의 농도를 정량하였다. 프로브는 특정활성 1uCi/ng으로32P를 랜덤 프라이머 연장(Lofstrand Lab Limited, Gaithersburg, MD)로써 표지하였다. mRNA 멤브레인을 2시간동안 45°C에서 50%의 포르마마이드를 함유하는 하이브리드 용액(Hybrisol I, Oncor, Gaithersburg, MD)로 블록킹하고, 45°C에서 15시간동안 20uCi cDNA로 20ml 하이브리드 용액에서 프로브하였다. 실온에서 멤브레인을 15분씩 2회 2xSSC/0.1%SDS로 세척하고, 55-65°C에서 20분간 두 번씩 0.1%SSC/0.1%SDS로 세척하였다. -80°C에서 이미지 필름(X-OMAT, Kodak, Rochester, NY)에 멤브레인을 노출하고 현상하였다.
RNA 인 시츄 하이브리드
TCRγ구조 도메인 및 TCRγ 미번역 3'말단 뉴클레오티드 서열을 LNCaP mRNA로부터 리버스 전사효소 PCR(RT-PCR)로 증폭하고 pBluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA)에 클로닝하고 시퀀싱으로 DNA를 확인하였다. 항-센스 및 센스 TCRγ35S-리보프로브를 T7 및 T3 RNA 합성효소로 각각 만들었다. NCI로부터 전립선 트랜스유레탈의 8 경우의 절제 파라핀 블록을 얻었다. 환자의 평균나이는 69이고 조양의 Gleason 스코어는 3+3=6/10 내지 4+5=9/10이다. 블록을 유리 ㅡ슬라이드상에서 프로세스하고 리보프로브(Molecular Histology, Gaithersburg, MD)를 이용하여하이브리드하였다. 슬라이드를 하이브리드하고 헤마톡실린 및 이오신으로 카운터스테이닝하고 Zeiss Axiphot Microscope를 어두운 배경부터 밝은 배경을 제공하는 다양한 조리개를 이용하여 검사하였다.
RT-PCR 분석
150-250ng의 LNCaP 및 PC-3 폴리(A) mRNA로부터 올리고-dT 프라이밍(Pharmacia-Biotech, Piscataway, NJ)을 이용하여 싱글 스트랜드 cDNA를 제조하였다. TCRγ전사체의 상이한 부분을 증폭하도록 PCR프라이머를 고안하였다. cDNA를 단지 증폭하기 위하여 게놈DNA 양은 조사하지 않았으며, 항상 2이상의 엑손을 포괄하는 PCR생성물을 생성하도록 프라이머를 조합하였다. 하나의 PCR은 두 개의 TCRγ구조 도메인 유전자, Cγ1 또는 Cγ2를 증폭하기 위하여 엑손의 CI( TCRCγ.F)의 포워드 프라이머 및 엑손 CIII( TCRCγR4)의 리버스 프라이머를 사용하였다(도8). 구조 도메인-스패닝 PCR이 각각의 4개의 TCRγ다양화 유전자 부분( TCRVγI.F, TCRVγII.F, TCRVγiIII.F, TCRVγIV.F)의 서브그룹에 특이한 포워드 프라이머, 및 TCRγ구조 유전자 부분( TCRCγR1)의 리버스 프라이머와 조합으로 PCR을 셋업하였다(도8). Wax-매개, 핫-스타트 PCR을 고-충실 PCR 구성요소(Expand, Boehringer-Manheim, Indianapolis, IN)를 이용하여 30 순환 실시하였다. PCR생성물을 1.2%아가로스 겔상에서 0.5ug/ml로 분석하였다. 특이 PCR 생성물을 겔 정제(Qiagen, Valencia, CA)하고, T/A 클로닝(InVitrogen, Carlbad, CA)하고, 자동 캐필러리 서열분석기(Perkin Elmer Applied Systems, FosterCity,CA) 및 Perkin-Elmer의 dRhodamine 종결순환 키트를 이용하여 서열결정하였다.
TCRγVJ 유전자 재정렬(rearrangement) 분석
5 x 107LNCaP 세포로부터 확립된 방법에 따라서 게놈DNA를 제조하였다(Ausubel,상기). Vγ유전자 세그먼트( TCRVγI.F, TCRVγII.F, TCRVγiIII.F, TCRVγIV.F)의 서브그룹의 포워드 프라이머중 하나와 Jγ1유전자 세그먼트(TCRJγ1.1R, TCRJγ1.2R, TCRJγ1.3R) 중 하나의 리버스 프라이머와 조합으로 각각 12PCR을 수행하였다(도8). 핫-스타트 PCR을 게놈DNA 500ng을 사용하여 30순환 실시하고, PCR생성물을 1.2%아가로스 겔상에서 0.5ug/ml로 분석하였다. 인간 태반 DNA(Clontech, Palo Alto,CA)를 프라이머의 양성 대조군으로 사용하였고, Jγ1.1 내지 Jγ게놈 DNA를 템플레이트의 양성 대조군으로 사용하였다.
RNA의 프라이머-연장 분석
전립선 TCRγ전사체의 개시시점을 LNCaP mRNA의 프라이머 연장 분석으로 결정하였다. mRNA 5ug을 0.08pmol32P 표지된 TCRCγR2 프라이머와 혼합하고, Cγ1의 5'말단으로부터 48-75 뉴클레오티드를 어닐링하였다. 확립된 방법(C.P. George et al.(1996)"Primer-extension analysis of RNA" In a Laboratory Guide To RNA, Isolation, Analysis and Synthesis.ed. P. A. Krieg(Wiley-Liss, Inc., NewYrok,NY),pp. 133-139)에 따라서 MMLV-리버스 전사효소 20U(Superscript, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 분석을 수행하였다. 시료를 32P-표지된 분자랑 마커(Msp I 절단된 pBR322, Lofstand Labs Limited, Gaithersburg, MD)와 평행하게 6%폴리아크릴아미드-유레아 DNA 서열결정 겔에서 전기영동하였다. 전기영동후에 젤을 와트만 종이로 블롯팅하고, 건조하여 자동방사선사진을 제조하였다.
5'-RACE PCR 분석
500ng의 LNCaP 폴리(A) mRNA로부터 Marathon cDNA 증폭 키트(Clontech, Palo Alto, CA) 및 TCRγ유전자-특이 프라이머(TCRCγR3)를 사용하여 더블 스트랜드 cDNA를 제조하였다(도8). 마라톤-어댑터를 합성된 cDNA의 말단에 연결하였다. 리버스 전사에 사용되는 프라이머의 업스트림에 어닐링한 유전자-특이 프라이머(TCRCγR2) 및 어댑터-특이 프라이머를 이용하여 5'-cDNA 말단의 래피드 증식(5'-RACE)를 수행하였다(도8). 핫-스타트 조건을 적용하고(Advantagem Clontechm Palo Alto,CA) 및 PCR생성물을 분석하고 RT-PCR 분석을 위하여 클로닝하였다. 5'RACE PCR 분석젤의 DNA를 나일론 멤브레인으로 옮기고, 32P말단 표지된 프라이머(TCRCγR1)을 업스티림에 하이브리드하여 EtBr/UV로 검출가능하지 않은 밴드르 확인하였다.
시험관내 전사-커플된 번역
5'-RACE PCR로 얻은 완전한 전립선 TCRγ전사체를 RT-PCR로 증폭하고pBluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA)에 클로닝 및 서열결정하고, T7RNA 합성효소 및 밀 배아 추출(TnT, Promega, Madison, WI)을 이용ㅇ하여 시험관내 전사-커플된 번역 시스템으로 조사하였다.35S-Met(ICN, Costa Mesa, CA)를 반응에 삽입하여 번역된 생성물을 시각화하였다. 반응물은 폴리아크릴아마이드 겔(16.5% 트리스/트리신, BioRad, Hercules, CA)에서 전-염색 마커(Gibco-BRL, Gaithersbuers, MD)와 함께 환원조건에서 영동하여 분석하였다. 겔를 건조시키고 자동방사선사진을 제작하였다.
결과
A. 데이터 분석에 의한 TCRγ전립선 ESTs(ESTs representing TCRγ).
우리는 6 종양 및 2 정상 전립선 cDNA 라이브러리로부터 유래한 20 cDNA 클론으로부터 23TCRγEST를 확인하였다. 전립선 ESTs의 구성에 의한 완전한 TCRγ 서열은 TCRγ구조 도메인 서열의 76 뉴클레오티드, 미번역 3'부분 서열의 448뉴클레오티드, 및 폴리(A)서열을 갖는다. 전립선 ESTs를 혈액 T-림프구(GenBank Acc. No. M16768, M16804 및 M 30894)로 성립된 세포 라인으로부터의 성숙TCRγ전사체와 정렬하여 전립선 EST완전 서열이 말초혈관 T-림프구로부터의 완전한 TCRγ전사체와 동일하다는 것을 발견하였다. dbEST 데이터베이스 분석은 TCRγ유전자가 인간 전립선에서 높게 전사된다는 것을 나타낸다.
B. RNA 도트 블롯에 의한 인간 전립선에서의 TCRγ(3'UTR)발현 확인
인간 전립선에서의 TCRγ유전자의 전사 활성을 분석하기 위하여, TCRγ전사체의 미번역3'말단(3'UTR)로부터의 cDNA프로브로 50개의 상이한 인간 조직의 mRNA를 시험하였다(도2A). 우리는 정상 전립선(위치C7)이 TCRγmRNA를 발현하고, 도트 블롯 멤브레인상 대표되는 모든 조직중에서 가장 강력하게 발현한다는 것을 발견하였다. TCRγ유전자 발현은 역시 작은 창자(E3), 비장(E4), 흉선(E5), 말초혈관 백혈구(E6), 림프 노드(E7), 골수(E8), 및 폐(F2)에서도 발현되었다.
C.노던으로 인간 전립선에서의 두 개 크기-특이 TCRγ전사체의 확인
3'UTR을 이용한 노던 블롯 하이브리드가 전립선의 약 1.1 및 2.8kb의 두 개의 TCRγ전사체를 확인하였고(도2B), 반면 비장, 흉선, 작은 창자 및 혈액 백혈구에서의 주 전사체는 1.5kb 이었다. 1.5kb의 전사체 크기는 γδ T-림프구((GenBank Acc. No. M16768, M16804)(Krangel et al., Science 237, 64-47(1987))); M30894(Littman et al. Nature 326, 85-88(1987))의 TCRγmRNA와 일치한다. 데이터베이스 분석 결과 TCRγ의 구조 도메인이 전립선 전사체의 부분이며, 우리는 TCRγ구조 도메인 프로브(TCR Cγ)을 역시 이용하였다. 우리는 도3A(레인3)과 같이 동일한 1.1 및 2.8kb 밴드를 확인하였다.
D.TCRγ발현 전립선세포는 TCRδ또는 CD3 전사체를 발현하지 않는다.
TCRγ-체인 단백질은 정상적으로 TCRδ-체인 단백질과 함께 발현된다. 인간 전립선에서 TCRγ유전자가 전사적으로 활성이 있으므로 우리는 TCRδ유전자의 전사활성을 분석하였다. dbEST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 분석하여 TCRδ전사체 뉴클레오티드 서열을 이용하였다. 전립선 cDNA 라이브러리로부터의 ESTs는 TCRδ-체인 전사체의 임의의 부분과도 일치하지 않는다. 더 나아가, 노던 블롯분석은 TCRδmRNA의 전립선 발현을 발견하지 못 하였다(도3B, 레인3). 우리는 전립선에서 TCRδ유전자가 사이런트인 것으로 결론하였다. 예상한 바와 같이 TCRδ전사체는 비장, 흉선, 및 혈액 백혈구에서 발현되었다(도3B).
E.LNCaP세포는 전립선 특이 TCRγ전사체를 발현하나, PC-3세포는 그렇지 않다.
정상 전립선에서 TCRγmRNA가 발현된다면, 우리는 다음으로 역시 전립선암에서도 발현되는 가를 조사하였다. 전립선-특이 1.1kb전사체는 LNCaP의 mRNA에서는 발견되었은, PC-3의 mRNA에서는 발견하지 못 하였다(도3). 정상 전립선에서 발현되는 전립선-특이 2.8kb전사체 역시 LNCap에 훨씬 낮은 정도로 존재하였다.
F.RNA 인-시츄 하이브리드로써 전립선 상피 세포에서의 TCRγ발현 확인.
전립선은 다양하고 혼재된 심플 덕트 라이닝 상피 세포로부터 그랜듈라 구성부분의 복잡한 하이퍼플라스택 덕트가 혼합된 애시나 그랜듈라(acinar glandular) 조직으로 구성되었다. 이러한 구성요소는 전립선 스트로마의 민무늬 근육, 피브로블라스트 및 다른 세포 타입과 타이트하게 연결되어 있다. 인간 전립선 TCRγ발현의 세포 위치를 결정하기 위하여 TCR(Cγ-3'UTR) 센스 및 안티-센스 리보프로브로RNA 인-시츄 하이브리드를 실시하였다. 전립선 애시나 덕트의 상피세포에서는 TCRγmRNA가 높게 발현되나, 전립선의 스트로마 세포 및 다른 종류의 세포에서는 발현되지 않는다(도4A, 4C). TCRγ발현은 역시 전립선의 하이퍼플라스틱 및 네오플라스틱 영역에서도 검출되었다. 양성 및 네오플라스틱 애시나 상피에서의 발현은 대비할만 하다. TCRγ발현은 인간 신장 조직 또는 인간 뇌에서는 관찰하지 못 하였다(도4E).
G. 전립선 TCRγ전사체는 Cγ1은 함유하나, VJγ유전자는 함유하지 않는다.
전립선에서 TCRγδ발현 프로파일을 확립하고 우리는 주요한 1.1kb 전립선-특이 TCRγ전사체를 분석하였다. 벌크 전립선 조직으로부터의 mRNA 제조 추출물에서 침투 T-림프구의 mRNA 오염을 배제할 수 없으므로 우리는 분석을 위하여 LNCaP세포 라인을 사용하였다. 우리는 데이터베이스 분석으로부터 전립선 TCRγ전사체의 3'말단이 혈액 백혈구의 3'말단과 동일한 것을 발견하였고, 폴리아데닐화 신호 위치도 동일하다는 것을 발견하였다. 따라서, 전립선 및 백혈구의 전사체의 크기의 차이는 전립선 ESTs로 확인된 스트레치의 업스트림의 차임에 기인한 것을 알 수 있었다. TCRγ전사체의 구조 도메인 부분을 증폭하기 위하여 RT-PCR을 셋 업하고 TCRCγ1유전자를 확인하였다. 약간 큰 TCRCγ2는 LNCaP에서는 발현되지 않는다. 변화 도메인(Vγ)로부터 구조 도메인(Cγ)까지의 RT-PCR은 아무런 생성물이 없었으며, 이는 Vγdl 전립선-특이 TCRγ전사체의 부분이 아님을 나타낸다.
H.TCRγ좌위의 LNCaP는 VJ 유전자 재배열을 하지 않는다.
RT-PCR은 TCRγ의 변화 도메인을 증폭하기 위한 것으로 아무런 생성물을 만들지 못하였고, 다음으로 우리는 TCRγ좌위를 분석하였다. γδT-세포의 발생동안 TCR좌위는 V(D)J 유전자 재배열을 거쳐서 수용체의 변화 도메인의 유전자 세그먼트를 만든다. LNCaP 세포가 TCRγVJ유전자 재배열을 거치는 가를 확인하기 위하여 TCRVγ및 TCRJγ프라이머를 이용하여 게놈DNA상에서 모든 가능한 임의의 PCR제조물을 포괄하는 PCR을 수행하였다(재료 및 방법 참조). 프라이머 조합의 어느 것도 TCRγ좌위의 LNCaP가 VJ재배열을 나타내는 PCR생성물을 생성하지 못하였다. TCRγVJ재배열이 전립선 상피 세포에서 일어나지 않은 것은 성숙 γδT-림프구와는 상이한 전립선 발현을 나타내는 것이다.
I. TCR(JC)γ전사체 발현 전립선 상피세포
전립선 TCRγ전사체가 임의의 Vγ유전자 세그먼트를 포함하지 않고 Cγ로 구성되었기 때문에, 우리는 Cγ1의 업스트림 서열을 분석하였다. RNA 프라이머-연장 및 5'RACE PCR을 전사체의 개시점을 얻기 위하여 수행하였다. LNCaP mRNA에 대한 프라이머-연장 실험을 수행하여, 130-135 뉴클레오티드 부분의 마이너 밴드와 약 128 뉴클레오티드의 메이저 밴드를 확인하였다(도5). Cγ1의 5'말단으로부터 75 염기(재료 및 방법 참조)에서 역전사가 개시되므로 전사체는 약 Cγ1의 업스트림의 약53 뉴클레오티드를 갖는다. LNCaP cDNA상 5' 말단 RACE PCR을 수행하여 하나의PCR 특이 생성물을 얻었다. 증폭된 생성물은 Jγ1.2 유전자 세그먼트를 함유하고, 정확하게 Cγ1 유전자 세그먼트에 스프라이싱되는 것을 발현하였다. RACE-PCR로 분리된 다수의 클론을 서열결정하였다. 이들은 프라이머 연장 실험에서 결정된 개시위치와 유사한 곳에서 개시한다. 전사의 개시위치에 약간의 변화가 있는 것은 프라이머-연장 실험에서 주요한 거서보다 약간 큰 마이너 밴드와 일치하는 것이다. 전립선TCRγ전사체가 스프라이싱되는 것을 도6에서 도식화하였다. LNCaP로부터 얻은 TCRγ전사체의 뉴클레오티드 서열은 표1에서 보여진다. 완전한 서열은 1020+/-3 뉴클레오티드 길이이다. 이는 Jγ1.2 유전자 세그먼트의 ~53 염기로부터 Cγ1의 519염기, 뒤이은 3'말단의 폴리아데닐화 신호 및 폴리(A)서열을 함유하는 미번역 448 염기를 포함하는 것이다.
J. 전립선-특이 TCRγ전사체의 시험관내 번역
전립선 전사체는 표1에서 이중 밑줄쳐진 원 TCRγ리딩 프레임에서 4개의 번역 개시 코돈(ATG)를 갖는다. 4개의 개시시점의 번역되 단백질 크기는 각각 12.8, 12.0, 7.2 및 3,2kDa이다. 전립선 전사체의 번역활성을 조사하기 위하여 전체-길이 TCRγcDNA를 이용하여 시험관내 전사-커플된 번역을 수행하였다. 도7(레인1)에서 약8 및 13kDa의 단백질을 얻었다. 음성 대조군 반응은 어떠한 단백질도 생산하지 않았다.
논의
전립선 상피 세포의 TCRγ전사체 특이 발현
우리는 인간 전립선의 TCRγmRNA의 발현을 확인하였고, 이것이 침투 T-림프구가 아닌 전립선 상피세포로부터 유래함을 확인하였다. 우리는 역시 T-세포 δ체인 유전자가 전립선에서 사이런트임을 확인하였다. TCRγmRNA는 전립선의 애시나 덕트내 상피 세포 및 전립선암에서 발현된다. 인간 전립선에서 1.1 및 2.8kb의 TCRγ전사체가 존재한다. 이들은 비장, 흉선, 및 말초혈관 백혈구에서발견되 1.5kb TCRγ전사체와 비교할 때, 그 크기가 다르다. TCRγδmRNA 발현 프로파일은 전립선에서의 전사가 일반적인 γδT-림프구의 경로를 따르지 않음을 보인다. 전립선 TCRγ발현은 초기 공개적으로 입수가능한 EST 데이터베이스 분석으로 발견하였다. 우리의 결과는 EST클러스터링이 신규하고 예상하지 않은 유전자 발현을 확인하는 좋은 수단임을 보인다. TCRγ전사체로 나타난 전립선 ESTs는 모두 레이저 캡쳐 미세절단(Emmert-Buck et al., Science 274, 99801991(1996))으로 분리된 세포의 cDNA 라이브러리로부터 만들어진다. TCRγ전사체가 침투 γδT-림프구가 아닌 전립선 상피세포로부터 유래한다는 것은 조직의 특이 미세부분으로부터의 순수한 세포 서브군집을 입수하는 데 미세절단이 가치있는 기술임을 보인다.
전립선 TCR(JC)γ전사체
림프노드 전이로부터 얻은(Horoszewicz et al., Cancer Res. 43, 1809-1818(1983)) 전립선 아데노카르시노마 세포 라인, LNCaP는 1.1kb의 전립선 특이 TCRγ전사체를 발현한다. LNCaP에서의 발현은 전사체가 상피세포로부터 유래하였고, 전립선 악성으로의 발전둥에 일어날 수 있음을 보이는 것이다. LNCaP 전사체는 Jγ1.2유전자 세그먼트의 ~53 뉴클레오티드, 세개의 Cγ1 엑손, 미번역 서열 및 폴리(A) 서열로 구성된다. 성숙 T-세포 전사체 전립선 전사체의 차이점은 이것이 Vγ유전자가 결핍되어 있으며, 이거이 Jγ1.2의 바로 업스트림의 인트론 서열내에서 개시된다(데이터 미공개). 전립선 TCRγ전사체를 작동시키는 프로모터 및 전립선 상피 세포에서의 이의 활성화 기작은 연구중이다. LNCaP에서 2.8kb 전립선-특이 TCRγ전사체는 매우 희미하고, 5'RACE-PCR 실험은 2.8kb 전사체에 상응하는 어떠한 생성물도 얻을 수 없었다. 따라서, 2.8kb 전사체는 추가의 연구가 필요하다.
T-림프구의 TCR(JC)γ전사체와 비교
많은 연구결과는 헤파토포이틱 세포에서 V(D)J 재배열시 또는 앞서서 TCR유전자 전사를 검출할 수 있었다(Wang et al., Mol. Immunol.33, 957-964(1996); Shimamura, M., and Ohta, S., Eur. J. Immunol. 25, 1541-1546(1995); Villey et al., Eur.J.Immunol. 27, 1619-1625(1997); Sikes et al., J.Immunol. 161, 1399-1405(1998)). TCRγ유전자는 뮤린 골수-레지던트 미재배열 γ좌위의 T-림프구 전구체 세포의 전사 활성은 스테라일(sterile) TCR Cγ전사체를 가져온다(Wang et al., Mol. Immunol.33, 957-964(1996). 추가로 미재배열 TCR Vγ전사체 역시 개체발생시에도 보고되었다(Goldman et al.J.Exp.Med. 177, 729-739(1993)). TCR 및 면역글로불린 유전자 세그먼트의 스테라일 전사는 지금까지 림프구 계통의 세포에만 한정되었다(Lauzurica, P., and Krangel, M.S., J.Exp.Med. 179,,1913-1921(1994)). 더나아가, 거의 모든 TCR 및 면역글로불린에서의 점(germ)-라인 좌위 리콤비네이션 화성화와 임시적으로 관련이 있다(Sikles et al., J.Immunol. 161, 1399-1405(1998); Goldman et al. J. Exp. Med. 177, 729-739(1993); Lauzurica, O., and Krangel, M.S., J.Exp.Med. 179, 1913-1921(1994); Sleckman et al., Annu.Rev.Immunol.14, 459-481(1996)). 우리는 게놈DNA 및 cDNA를 독립적을 이용하여 전립선 상피세포의 TCRγ좌위에서는 리콤비네이션이 일어나지않음을 보였다. 따라서, 전립선 상피의 TCR(JC)γ전사체 발현은 재조합과 관련이 없으며, 이는 T-림프구 전구체에서 관찰된 스테라일 전사체와는 다른 기능을 할 것이다.
TCRγ좌위의 신규 전립선-특이 단백질의 가능성의 초기 가정
전립선 TCRγ전사체는 높게 전사되고 우리는 이것에 중요한 생물학적 이유가 있는 것으로 가정하였다. VJ 유전자 재배열이 전립선 상피세포의 TCRγ좌위에서 일어나지 않는 것은 성숙 TCRγ-체인 단백질 가능성을 배제하였다. Cγ업스트림에서 번역 개시 코돈(ATG)가 발견되지 않았으므로, 우리는 TCRγ 구조 도메인 단백질이 TCRγ변화 도메인 없이 구성될 가능성을 배제하였다. TCRγ-체인 단백질에서 Jγ세그먼트는 변화 도메인의 16-20 아니노산을 인코딩하는 반면, 변화 도메인의 주요 부분은 Vγ세그먼트에 의하여 인코딩된다. Jγ세그먼트에 의하여 인코딩되지 않은 아미노산이 Vγ유전자 세그먼트에 의하여 인코딩된 아미노산과 조합되지 않는다면, 이들은 MHC 인식에 있어서 TCR로 기느할 수 없다. 이는 Cγ내에서 인코딩되는 전립선-특이 신규 단백질의 가능성을 말한다. 우리는 본래의 TCRγ리딩 프레임내의 ATG코돈에서 번역을 개시하는 것으로 가정하였으나, 상이한 리딩 프레임 또는 덜 사용되는 개시 코돈이 사용될 수 있다.
시험관내 전사-커플된 번역 실험에서 전립선 TCRγcDNA를 사용하여 전사체가 완전히 기능함을 알았다. 두 개의 단백질을 얻었다. 13kDa 단백질은 아마도 도1의약 12.8kDa(PS-TCRγ1)으로 계산되는 첫 번째 이중 밑줄의 ATG에서 유래한 것이다. 8kDa 단백질은 아마도 도1의약 7.2kDa(PS-TCRγ2)으로 계산되는 첫 번째 이중 밑줄의 ATG에서 유래한 것이다. 이러한 단백질들은 다음의 실시예에서 연구되었다. 결론적으로, 전립선 상피 세포 또는 비-림프구-유래 세포 타입의 세포는 림프구 계통의 세포만이 발현하는 것으로 생각되었던 유전자로부터 높은 수준의 전사체를 발현하며, 이는 매우 놀라운 발견이다.
실시예2.TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질의 발견
전 실시예는 전립선 및 전립선암 세포의 TCRγ전사체의 예상치 못한 발견, 전사체의 시험관내 번역, 및 이러한 세포에서 TCRγ체인의 절단된(truncated) 형태의 존재에 의한 전사체의 초기 가정등을 뒷받침하였다. 실시예는 더 나아가 전사체가 미지의 새로운 "TARP"로 명명된 단백질을 알터네이트 리딩 프레임으로부터 발현한다는 놀라운 발견을 하였다. 더욱 놀라운 것은 하기에서 TARP가 핵 단백질이고, 많은 유방암세포에도 존재한다는 것이다.
재료 및 방법
프라이머.
TCRγ-upATGmut#1(5'-TTACAGATAAACAACTTGATACAGATGTTTCCCCCAAGCCC-3');
TCRγ-upATGmut#2(5'-GGGCTTGGGGGAAACATCTGTATCAAGTTGTTTATCTGTAA-3');
TCRγ-upATGmut#3(5'-GATAAACAACTTGATGCAGATATTTCCCCCAAGCCC-3');
TCRγ-upATGmut#4(5'-GGGCTTGGGGGAAATATCTGCATCAAGTTGTTTATC-3');
TCRγ-upATGmut#5(5'-GATAAACAACTTGATACAGATATTTCCCCCAAGCCC-3');
TCRγ-upATGmut#6(5'-GGGCTTGGGGGAAATATCTGTATCAAGTTGTTTATC-3');
TCRγ-downATGmut#1(5'-CCCAGGAGGGGAACACCATAAAGACTAACGACACATAC-3');
TCRγ-downATGmut#2(5'-GTATGTGTCGTTAGTCTTTATGGTGTTCCCCTCCTGGG-3');
TCR5.1(5'-GATAAACAACTTGATGCAGATGTTTCC-3');
TCR3.1(5'-TTATGATTTCTCTCCATTGCAGCAG-3');
TCRJγ1.2R(5'-AAGCTTTGTTCCGGGACCAAATAC);
B-Actin Forward(5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3');
B-Actin Reverse(5'-CTTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'). 프라이머들은 Sigma-Genosys사(텍사스, 더 우드랜즈 소재) 및 Lofstrand Labs Limited사(메릴랜드, 개더스버그 소재)가 합성하였다.
구성체
pBluescript II SK(+)(캘리포니아, 라 졸라 소재, Stratagene사)내로 클로닝되는TARP전사 유전 정보는 전에 기술된 바 있다(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999)). 이 플라스미드는 본서에서 pBSSK-TCRγ로 언급된다. Quickchange Site0Directed Mutagenesis kit(Stratagene사)를 사용하여 ATG를 위치 69에서 ATA로 돌연변이시켜 pBSSK-TCRγmutATGup1을 구축하였다. PCR 반응은 프라이머로서 TCRγ-upATGmut#1 및 TCRγ-upATGmut#2를, 주형으로서 pBSSK-TCRγ을 사용하였다. 상기와 같이 프라이머로서 TCRγ-upATGmut#3 및 TCRγ-upATGmut#4를, 주형으로서 pBSSK-TCRγ을 사용하여 ATG를 위치 73에서 ATA로 돌연변이시켜 pBSSK-TCRγmutATGup2를 구축하였다. 상기와 같이 프라이머로서 TCRγ-upATGmut#5 및 TCRγ-upATGmut#6을, 주형으로서 pBSSK-TCRγmutATGup1을 사용하여 ATG를 위치 69 및 73에서 ATA로 돌연변이시켜 pBSSK-TCRγmutATGup-양쪽을 구축하였다. 상기와 같이 프라이머로서 TCRγ-downATGmut#1 및 TCRγ-downATGmut#2를, 주형으로서 pBSSK-TCRγ을 사용하여 ATG를 위치 242에서 ATA로 돌연변이시켜 pBSSK-TCRγmutATGdown을 구축하였다. pET-TCRγ는 pET23a 벡터(위스콘신, 매디슨, Novagen사)내로 서브클로닝된TARP전사 유전 정보(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9287-9292(1999))의 누클레오티드 242-469를 함유한다. pET-TARP는 pET23a 벡터내로 서브클로닝된TARP전사 유전 정보(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9287-9292(1999))의 누클레오티드 56-242를 함유한다. pVCAD-TARP는 pVCAD 벡터(Bruggemann, E.P.등,BioTechniques 10:202-209(1991))내로 서브클로닝된TARP전사 유전 정보(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))의 누클레오티드 69-242를 함유한다.
역전사-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)
제조자의 지시에 따라 Micro-FastTrack™2.0 키트(캘리포니아, 칼스배드, Invitrogen사)을 사용하여 폴리(A) RNA를 분리하였다. 50pmol의 올리고-dT 프라이머(Invitrogen사) 존재하에 70℃에서 2분간 총 RNA 5㎍ 또는 폴리(A) RNA 500ng을 변성시켰다. 250μM의 dNTP, 2mM의 DTT, 8U의 RNasin(인디애나주, 인디애나포리스, Roche Molecular Biochemicals사), 50U의 SuperscriptII™RT(메릴랜드주, 로크빌, Life Technologies사)를 함유하는 10㎕의 반응물에서 일본쇄 cDNA를 제조하고 42℃에서 90분간 인큐베이팅하였다. 이후 시료를 75㎕의 10mM Tris-HCL[pH7.5]로 희석하고 72℃에서 10분간 인큐베이팅하였다. 250μM의 dNTP, 25pmol의 각 보존 프라이머, 1단위의 AmpliTaq?DNA 폴리머라제(Roche사)를 함유하는 PCR에 3㎕의 cDNA를 사용하여 35회 증폭시켰다. 사람의 유방 RAPID-SCAN™유전자 발현 패널(메릴랜드주, 로크빌, OriGene Technologies)에 유사한 PCR 조건을 사용하였다. 프라이머 TCRγJ1.2R, TCR5.1 및 TCR3.1을 사용하여 TARP 전사 유전 정보를 검출하면서 프라이머 B-Actin Forward 및 B-Actin Reverse를 사용하여 액틴 전사 유전 정보를 검출하였다.
노던 블롯 하이브리드 형성
앞서 기술한 바와 같이(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9287-9292(1999)) 2㎍의 폴리(A) RNA를 사용하여 노던 블롯 잡종형성 하였다.
시험관내 전사-커플링 번역
시험관내 전사-커플링 번역은 앞서 기술하였다(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9287-9292(1999)). pBSSK-TCRγ, pBSSK-TCRγmutATGdown, pBSSK-TCRγmutATGup1, pBSSK-TCRγmutATGup2 및 pBSSK-TCRγmutATGup-양쪽을 주형으로 사용하였다.
세포 배양
LNcAP, PC3, MCF7, BT-474 및 SK-BR-3 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 RPMI-1640 매질(메릴랜드주, 개더스버그, Quality Biological, Inc사)에서 유지시켰다. 이 매질은 10%의 태내 소 혈청(FBS, Quality Biological, Inc사), 2mM의 L-글루타민, 1mM의 소듐 피루베이트 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하였다. Hs57Bst 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 RPMI-1640 매질에서 유지시켰다. 매질은 10%의 FBS, 30ng/ml의 에피더말 성장 펙터(EGF, 오하이오주, 신시내티, Harlan사), 2mM의 L-글루타민, 1mM의 소듐 피루베이트 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하였다.
항체 생산
ΔPE-TARP 항체를 다음과 같이 제조하였다. 촉매 비활성 형태의 슈도모나스 엑소톡신(ΔPE)(Bruggemann, E.P.등,BioTechniques 10:202-209(1991))의 C'-말단에 융합된 전체 TARP 오픈 리딩 프레임을 함유하는 pVC4D-TARP를 Epicurian Coli?BL21-CodonPlus™(DE3)-RIL 세포(Stratagene사)에서 발현시켰다. 포함 항체의 제조 및 토끼 면역화는 앞서 기술하였다(Brinkmann, U등,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8616-8620(1991)). 제조자의 지시에 따라 ImmunoPure?IgG(단백질 A)Purification Kit(일리노이주, 로크포드, Pierce사)를 사용하여 항혈청을 정제하였다.
C'-말단 6-히스티딘 태그에 융합된 TCRγ의 세포외 도메인을 함유하는 발현 플라스미드, pET-TCRγ을 사용하여 상기 기술한 바와 같이 TCRγ항체를 제조하였다. 면역화에 앞서, 제조자의 지시에 따라 Ni-NTA 아가로즈 칼럼(캘리포니아, 발렌시아, QIAGEN사)을 사용하여 히스티딘-태그된 TCRγ단백질을 정제하였다.
세포 추출물의 제조
전체 세포 단백질 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 각각의 세포선에서 5x106의 생장 세포를 거두어 프로테이나제 저해제(50mM의 Tris-HCl[pH 7.5], 150mM의 NaCl, 1mM의 EDTA, 0.1%의 TritonX-100, 1mM의 PMSF, 1㎍/ml의 아프로티닌, 1㎍/ml의 류펩틴)를 함유하는 1 X RIPA 완충액에 재현탁하였다. 추출물을 빠르게 초음파처리하고 원심분리하여 맑게 하였다. 제조자의 지시에 따라 Coomassie Plus Protain Assay 시약(Pierce사)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. -80℃에서 냉동시킨 0.5g의 전립선암 조직을 저온 막자 및 막자사발을 사용하여 미세한 분말로 갈아 전립선 조직으로부터 단백질 추출물을 준비하였다. 분말화한 조직을 수거하여 1 X RIPA에 재현탁시키고 상기와 같이 가공하였다.
전에 공개된 프로토콜을 기준으로 하여 전립선 및 유방 세포선에서 핵, 막 및 세포질 추출물을 준비하였다(Dignam, J.D.등,Nucleic Acids Res. 11:1475-1489(1983); Sladek, F.M.등,Genes Dev.4:2353-2365(1990)).
웨스턴 블롯 분석
20 또는 40㎍의 단백질 추출물, 1㎍의 재조합 His-TARP 또는 100ng의 재조합 His-TCRγ를 16.5%의 Tris-Tricene gel(캘리포니아, 허큘레스, BIO-RAD사)에서 가동시키고 30V에서 4시간동안 4℃에서 운반 완충액(25mM의 Tris, 192mM의 글리신, 20%(v/v)의 메탄올, pH8.3)내 0.2㎛의 Immun-Blot™PVDF 멤브레인(BIO-RAD사)에 옮겼다. 10㎍/ml의 ΔPE-TARP 항혈청 및 1㎍/ml의 TCRγ항혈청으로 필터를 탐침하고 제조자의 지시에 따라 화학발광 웨스턴 블롯 키트(Roche사)를 사용하여 각 신호를 검출하였다.
TARP는 전립선 암세포에서 발현되는 핵단백질이다
전립선 암세포내 TARP 및 TCRγ가 존재하는가를 알아보기 위하여 두 단백질에 대한 항체를 발생시켜 상이한 전립선 암세포 추출물에 대하여 웨스턴 블롯을 하였다. 도3A(상부 패널)에 도시된 바와 같이, TARP는 전립선암 LNCaP 세포선 및 전립선암 종양 추출물에서 검출되었다. 7kDa 밴드는 재조합 His-TARP와 같이 이동하는데 이것은 LNCaP 및 암 추출물내 검출된 생성물이 TARP임을 암시한다. 앞서, 우리는 전림선-특이 TCRγ전사 유전 정보가 전립선 암 PC3 세포선에서 발현되지 않음을 보였다(Essand, M.등Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999)). 따라서, 우리는 PC3 세포 추출물을 네거티브 대조구로 사용하여 7kDa가 이들 추출물에 없음을 증명하였다(도 3A, 상부 패널). 슈도모나스 엑소톡신(PE, 재료 및 방법을 참조하시오)에 대한 항혈청 또는 미리 뽑은 항혈청을 사용할 경우(데이타는 나타내지 않음) 7kDa 밴드가 검출되지 않은 것이 중요하다. 재조합 단백질은 사용된 항체로 매우 강한 신호를 보이나 이들 추출물 어느 것에도 TCRγ는 검출되지 않았다. 이들 데이타는 전립선-특이 TCRγ전사 유전 정보가 TARP를 엔코드함을 나타낸다.
TARP의 세포 편재화를 알아보기 위하여, 우리는 LNCap 세포로부터 핵, 세포질 및 멤브레인 단편을 준비하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, TARP는 핵에서 검출되었으나 세포질 또는 멤브레인 단편에서는 검출되지 않았다. 수크로즈 큐션(Sladek, F.M.등,Genes Dev. 4:2353-2365(1990))을 통하여 세포 추출물을 분별하여 정제시킨 핵을 사용하여 비슷한 결과를 얻었다(데이타는 나타내지 않음).
TARP 전사 유전 정보는 유방 세포에서 발현된다
앞서, 우리는 TCRγEST 클러스터가 뇌 라이브러리에서 얻어지는 EST를 함유함을 기술하였다. 이러한 초기 보고후, 추가의 EST를 데이타베이스에 넣어 클러스터는 이제 유방, 결장, 신장 및 위장 라이브러리에서 얻어지는 EST 또한 함유한다. 이들 EST의 존재가 이들 세포내에서TARP전사 유전 정보가 발현됨을 지시하는지 또는 이것이 이들 라이브러리가 만들어질때 침투 γδ T-림포사이트의 존재로 인한 것일 수 있는지를 알아보기 위하여TARP전사 유전 정보 존재 테스트에 여러가지 세포선에 대한 RT-PCR을 실시하였다. 도4A에 도시한 바와 같이, 유방 세포선 MCF7, BT-474, SK-BR-3 및 CRL-1897에서의TARP전사 유전 정보 발현을 검출하였다. 신경아 세포선 A172, 신경교종세포 세포선 IMR32, 결장 세포선 COLO 205, 위장 세포선 KATO III 또는 신장 세포선 COS7 및 293(도4A 및 데이타는 도시하지 않음)에서는 신호가 검출되지 않았다.TARP전사 유전 정보가 사람의 유방 조직에서 발현되는지를 알아보기 위하여 RAPID-SCAN™패널(메릴랜드주, 로크빌, OriGene Technologies)을 사용하여 12개의 상이한 정상 유방 및 12개의 상이한 유방암 cDNA를 테스트하였다.TARPmRNA는 몇몇 유방암 샘플에서 많이 나타난 반면(도 4B, 상부 패널) 35회의 PCR 후 정상 유방 샘플에서는 거의 검출할 수 없었다(데이타는 나타내지 않음). 중요한 것은, cDNA가 결핍된 반응에서는 신호가 검출되지 않았다. 액틴은 유사한 양의 cDNA가 각 레인에 존재한다는 것을 보이기 위해 사용하였다(하부 패널). 정상 유방 샘플에서의 약한 신호는 Hs57Bst 세포선, 정상 유방 조직에서 유도된 유방 세포선에 대한 도 4A 및 5에 나타난TARP신호 결핍과 연관이 있다. 이들 결과는 유방에서TARP전사 유전 정보의 발현이 발암 형질전환후에 증가됨을 나타낸다. 그러나, 어떤 결정적인 결론을 내리기 전에 더 연구가 필요하다.
유방 세포선에서 발견되는TARP전사 유전 정보가 전립선 세포선에 발견되는 전사 유전 정보와 동일한가를 알아보기 위하여,TARP전사 유전 정보의 상이한 부분에 대한 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 도5A에 도시한 바와 같이, 전립선의TARP전사 유전 정보는 Jγ1.2 유전자 세그먼트, 세개의 Cγ1 엑손 및 폴리(A) 테일(7)이 뒤따르는 몇몇 번역되지 않은 서열을 함유한다. 프라이머 세트 1 및 3은 전체TARP전사 유전 정보를 증폭시키며(도 5B, 상부 패널) 프라이머 세트 2 및 3은 Cγ1 부분만을 증폭시킨다(도 5B, 중간 패널). 도 5B에 나타낸 바와 같이, 어떤 프라이머 세트를 사용하여도 세개의 유방 세포선(MCR7, BT-474 및 SK-BR-3)에서 전립선 세포선(LNCaP)과 비교할때 유사한 크기의 밴드가 검출되었다. 중요하게는, cDNA가 없는 반응(dH2O)에서는 신호가 검출되지 않아 액틴 대조구로 증명된 바와 같이 유사한 양의 cDNA를 사용하였다(도 5B, 하부 패널). 이들 데이타는 유방 세포선에서 발견되는TARP전사 유전 정보가 전립선 세포선에서 발견되는 전사 유전 정보와 동일하다는 것을 나타낸다. 이러한 결론을 더 뒷받침하기 위하여, 노던 블롯으로 각 세포선에서 얻은TARP전사 유전 정보 크기를 분석하였다. 앞서 1100 및 2800 누클레오티드 전사 유전 정보가 LNCaP 세포에 존재하며 1100 누클레오티드 전사 유전 정보가 우세한 형태임을 보인 바 있다(Essand, M.등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9287-9292(1999)). 도 5C에 나타낸 바와 같이, 강도는 더 약하지만 세개의 유방 세포선(MCF7, BT-474 및 SK-BR-3)에서 전립선 세포선(LNCaP)과 비교할때 유사한 크기의TARP전사 유전 정보가 검출되었다. 따라서,TARPmRNA가 전립선 및 유방암 세포에서 발현된다는 결론이 나온다.
유방암 세포선에 TARP 단백질이 존재하는가를 알아보기 위하여, TARP에 대한항체를 사용하여 유방암 핵 추출물로 웨스턴 블롯을 하였다. 도 6(상부 패널)에 나타낸 바와 같이, TARP 반응 밴드가 MCF7, BT-474 및 SK-BR-3 세포에서 검출되었다. TARP는 이들 유방암 세포의 멤브레인 또는 세포질 단편에서 검출되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 재조합 단백질은 사용된 항체로 매우 강한 신호를 보이지만 이들 핵 추출물 중 어느것에도 TCRγ가 검출되지 않았으므로(도 6, 하부 패널) TARP가 유방 세포선에서TARP전사 유전 정보에 의하여 엔코드된 단백질 생성물이라는 점이 중요하다. 이들 데이타는 유방암 세포에도 TARP가 존재함을 나타낸다.
전립선 및 유방암 세포에서 발현되는TCRγ로쿠스에서 유도된 특이 전사 유전 정보에 의하여 엔코드된 7kDa 핵 단백질을 확인하여 기술하고자 한다. 단백질은 TCRγ와 상이한 리딩 프레임에서 엔코드되므로TCRγAlternateReading frameProtain을 TARP로 칭한다. TARP는TCRγ로쿠스의 인트론내에서 전사 시작의 대체 리딩 프레임에서 번역된다는 것 외에 두가지 다른 특징을 가진다. 첫째, 이러한 세포내 작은 펩티드는 대부분 보통 분비되므로 발견하는 것이 놀라운 일이라는 것이다. 둘째, TARP는 양호한 Kozac 서열(Kozac, M.Cell 44:283-92(1986))이 부족하다는 것이다. TCRγ리딩 프레임은 양호한 Kozac 서열을 함유하므로 처음에는 결절된 TCRγ단백질이 엔코딩되었다고 가정하였다. 그러나, 도3에 도시된 바와 같이, 우리의 처음 가설은 맞지 않았다. 실험 번역 결과는 TARP 단백질이 선호됨을 나타내고 TARP 리딩 프레임내 ATG가 단백질 합성을 개시하는데 사용될 수 있다는 것이 흥미롭다. ATG가 TARP 단백질 합성을 개시하는데 사용됨을 알아보기 위하여 단백질 시퀀싱이 필요할 것이다.
TARP 단백질 서열의 대단히 흥미로운 특징은 이것이 7개조 반복단위에 5개의 류신을 함유한다는 것인데, 이것은 TARP가 류신 지퍼 이량체화 모티프를 함유할 수 있음을 암시한다(도 7A). 이것이 사실이기 위하여는, TARP는 양친매성 나선을 함유하여야 한다. TARP가 양친매성 나선을 함유한다는 한 증거는 세린 및 프롤린 잔기, 나선 개시제로 작용하는 것으로 사료되는 잔기가 제1 류신 반복단위 직전에 발견된다는 것이다. 두번째로, 7개조 반복단위에 다수의 전하를 띤 아미노산이 존재함으로써 나선에 양친매성을 부여하여 잠재적으로 다른 나선들과의 염 가교로 작용한다. 7개조 반복단위내 류신의 존재는 류신 지퍼 모티프의 좋은 증거이나 7개조 반복단위내 5개 류신을 함유하는 것으로 확인되었으면서도 류신 지퍼 단백질로 사료되지 않는 단백질들이 있다. 예를들어, 카료페린의 결정 구조(Chook, Y.M.등,Nature 399:230-237(1999)),B. sterarothermophilus피리미딘 누클레오시드 포스포릴라제(Pugmire, M.J.등,Structure 6:1467-1479(1998)) 및T. thermophilus페닐알라닌-tRNA 신테타제(Mosyak, L.등,Nat.Struct.Biol. 2:537-547(1995))는 이들 단백질이 7개조 반복단위내 5개 류신을 함유하는 서열 부분에서 α-나선 구조를 포함하지 않음을 보였다. TARP내에서 발견되는 류신 반복단위의 중요성을 알아보기 위하여 작용 및 구조적 연구가 필요하다.
TARP 아미노산의 또다른 특징은 잠재성 류신 지퍼 모티프 뒤를 기본 아미노산 부분이 따른다는 것인데(도 7A), 이것은 DNA-결합 모티프가 가능함을 나타낸다. 그러나, 기본 부분의 방향은 류신 반복단위에 앞서는 방향이기 보다는 뒤따르는 방향이라는 점에서 독특하다. DNA를 결합시키는 대부분의 류신 지퍼 단백질은 기본 부분 뒤에 류신 반복단위를 가진다(참고로 (Chook, Y.M.등,Nature 399:230-237(1999))를 참조하시오). TARP내 기본 부분은 핵 편재화 신호로 작용할 수 있을 뿐이나 TARP가 핵 단백질이라는 사실은 TARP가 DNA를 결합시킬 수 있다는 가정을 강화한다. 어떤 결정적인 결론을 내리기 전에 기능적인 연구가 필요하다.
TARP가 혹종의 공지된 단백질과 상동성을 가지는가를 알아보기 위하여, GenBank에 대하여 단백질 BLAST 연구를 하였다. 이 연구는 TARP의 아미노산 서열이Dictyostelium dicoideumTup1(GenBank 검색 번호 AAC29438) 및Saccharomyces cerevisiaeTup1(Williams, F. E.등,Mol.Cell.Biol. 10:6500-6511(1990)(도 7C)과 얼마간 상동성임을 보였다. 이스트 Tup1은 통상적으로 Cys8(Ssn6)과의 착물에서 발견되며 글루코스, 산소 및 DNA 손상으로 조절되는 유전자 전사 억제에 필요하다(Tzamarias, D.등,Genes Dev. 9:821-831(1995)). Cys8(Ssn6)도 Tup1도 DNA를 결합시키지 않으나 각각 α2, Mig 1, Rox1 및 al과 같은 특이 DNA -결합 단백질과의 상호작용을 통하여 동시억제자 착물의 일부로 작용한다(Tzamarias, D.등,Genes Dev. 9:821-831(1995)). Tup1의 C'-말단 반쪽은 WD-40 또는 β-트랜스듀신 반복단위로 알려진, 아스파테이트 및 트립토판에 많은 43-아미노산 서열 6 단위를 포함한다(Williams, F. E.등,Mol.Cell.Biol. 10:6500-6511(1990); Fong, H.K.등,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2162-2166(1986)). WD-40 반복단위는 많은 단백질에서 확인되었고 단백질-단백질 상호작용에서 한 역할을 한다. 중요한 것은, Tup1은 두 WD-40 반복단위를 통하여α2와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다(Komachi, K.등,Genes Dev. 8:2857-2867(1994)). TARP가 Tup1의 5번째 WD-40 반복단위와 상동성을 가진다는 것이 흥미롭다(도 7C). TARP는 핵 단백질이므로 Tup1과 상동성을 가진다는 것은 TARP가 전사 조절에 연루된 기능성 핵 단백질 착물의 일원일 수 있음을 암시한다. 따라서, 그 기능을 알아보기 위하여 TARP-상호작용 단백질을 확인할 필요가 있다.
TARP 항체는 전립선 및 유방 핵 추출물에서 이중선을 인식한다(도 6A). 더 빠른 7 kDa 밴드가 His-TARP 재조합 단백질과 동시이동하는 동안 더 약한 밴드는 더 큰 분자량에서 움직인다. 9 kDa에 대한 한 가능한 설명은 번역후 변질이다. TARP가 혹종의 공지된 번역후 변질 부위를 가지는가를 알아보기 위하여,Swiss Institute of BioinformaticsExPASy 프로테오믹스 서버(http://www.eapasy.ch)의 PROSITE 프로그램을 사용하여 TARP 아미노산 서열을 분석하였다(Appel, R.D.등,Trends Biochem.Sci.19:248-260(1994); Hofmann, K.등,Nucleic Acids Res.27:215-219(1999)). 도 7A에 나타낸 바와 같이, cAMP- 및 cGMP-의존 단백질 키나제 포스포릴화 부위(RRAT 및 RRGT) 및 단백질 키나제 C 포스포릴화 부위(SSR 및 SRR)를 포함하는 다수의 잠재성 포스포릴화 부위가 발견되었다. 포스포릴화는 많은이 경우, 도6의 결과는 변질되지 않은 형태가 LNCaP 세포에서 우세하며 포스포릴화된 형태는 MCF7 및 SK-BR-3 세포에서만 존재함을 나타낼 수 있을 것이다. 9kDa의 진정한 성질 및 전립선 및 유방암 세포에서 발현될 때 TARP가 번역후 변질되지는지 알아보기 위하여 더욱 실험이 필요한다.
유방암 세포에서 단백질 및 TARP mRNA의 발현에 대하여 여기 기술한다.TARP전사 유전 정보에 대한 초기 연구는 유방에서의TARP발현을 밝히지 못하였다(Essand, M.등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9287-9292(1999)). 가능한 한 설명은 정상 유방에서TARP가 저농도로 발현되어 검출하기 어렵다는 것이다. 결과부분에 기술하는 바와 같이, 암 샘플에서 검출되는 강한 신호에 비하여 정상 유방 샘플의 PCR 분석에서는 매우 약한 신호가 검출되었다. 따라서, 유방암 세포내TARP의 존재는TARP발현이 유방 세포의 발암 형질전환후에 포함됨을 나타내는 것일 수 있을 것이다. 또한, 유방암 세포내TARP의 존재는TARP가 에스트로겐에 의하여 조절됨을 나타내는 것일 수 있을 것이다. 이러한 가정은 안드로겐 반응 원소(ARE)와 에스트로겐 반응 원소(ERE)를 조합하는TARP의 인트론 촉진유전자내 원소를 밝힘으로써 강화된다. 이러한 잡종 원소는 ARE 5'말단 및 ERE 3'말단에 특이적인 두 반쪽-부위로 이루어진다[Zilliacus, J.등,Mol. Endocrinol. 9:389-400(1995) 및 비공개 데이타]. 에스트로겐이TARP를 조절하는가를 알아보기 위하여 추가 실험이 필요하다. 그러나 돌연변이 ARE가 유방 종양내에 어떤 전립선-특이 유전자의 발현을 야기하는 경우가 있다. 예를들어 전립선 특이 항원(prostate specific antigen; PSA)은 유방 종양내에서 발현되는 것으로 알려졌다(Majumdar, S.등,Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999)). PSA의 이상 발현을 분자 분석하면 PSA 촉진유전자내에서 발견되는 ARE 중 하나에서 단일점 돌연변이를 발견하게 된다. 이 돌연변이가 유방 종양에서 안드로겐-조절 PSA 발현을 손상시키는 것으로 사료된다(Majumdar, S.등,Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999)). 현재 테스트되는 세개의 유방 세포에서TARP촉진유전자내 비슷한 돌연변이가 발생하는가는 불분명하다.
전립선은 구조 및 기능의 유지에 대하여 안드로겐에 의존한다. 전립선 세포가 악화될 경우, 이들은 종종 안드로겐 의존성을 상실한다. 이 연구에서 우리는 성장에 대하여 안드로겐 의존성이 상이한 두 전립선 세포선, LNCap 및 PC3 세포를 사용하였다. 안드로겐 수용체는 안드로겐-의존성 LNCap 세포선에 존재하나 안드로겐-독립성 PC3 세포선에는 없다(Tilley, W.D.등,Cancer Res. 50:5382-5386(1990)). 도3에 나타낸 바와 같이TARP는 LNCaP 세포에서는 발현하는 PC3 세포에서는 발현하지 않는다. 이 결과는TARP발현이 안드로겐 자극에 의하여 조절될 수 있음을 암시한다.TARP촉진유전자내 ARE-류 원소의 확인은 TARP가 안드로겐에 의하여 유도된다는 생각을 강화한다. 현재 안드로겐이TARPmRNA 발현을 유도하는가를 알아보기 위한 실험이 이루어지고 있다. LNCaP 세포에서는 발현되나 PC3 세포에서는 발현되지 않는다는 것은TARP가 안드로겐-의존성 반응을 조절하는데 중요하다는 것을 암시할 수 있을 것이다.
본 발명은 특히 전립선 세포, 전립선암 및 유방 세포 및 유방암에 관한 신규한 물질 및 방법을 제공한다. 특정 예들을 제공하였으나 상기 기술은 예시적인 것으로 제한적인 것이 아니다. 본 명세서를 참고로 당업자에게는 본 발명의 다수의 변형이 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 명세서가 아니라 첨부되는 청구의 범위를 기준으로 결정되어야 한다.
본 명세서에 인용된 공개공보 및 특허 서류는 각기 개별적으로 명시한 범위의 모든 목적에서 전체 내용을 참고문헌으로 포함시켰다. 본원에 여러가지 참조문헌을 인용하여 어떤 특정 문헌이 본원의 "선행 기술"임을 뜻하는 것은 아니다.
Claims (44)
- 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는, TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질("TARP"), 이들의 면역 단편(immunogenic fragment), TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식될 수 있는 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP의 면역단편 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 분리된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는 분리된 폴리펩타이드.
- 청구범위 제2항의 폴리펩타이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 조성물.
- 청구범위 제3항의 폴리펩타이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 조성물.
- 청구범위 제4항의 폴리펩타이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 조성물.
- 청구범위 제5항의 폴리펩타이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체담체담체담체성물.
- 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는, TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질("TARP"), 이들의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식될 수 있는 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, TARP서열을 포함하는 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP의 면역단편인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, 폴리펩타이드가 TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 폴리펩타이드인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는 폴리펩타이드인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제10항에 있어서, 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현벡터인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제15항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질("TARP") 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 것인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제15항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 TARP의 면역단편의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 것인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제12항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 분리된 폴리펩타이드를 인코딩하는 것인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 제12항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는 분리된 폴리펩타이드를 인코딩하는 것인 분리된, 재조합 핵산 분자.
- 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는, TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질("TARP"), 이들의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식될 수 있는 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드중 하나를 인코딩하는 분리된 핵산, TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드로 펄스된(pulsed) 항원제공세포(antigen presenting cell), 시험관내에서 TARP, 이들의 면역 단편, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식될 수 있는 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 TARP와 90%이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 민감화된 세포로 구성되는 그룹에서 선택된 조성물을 환자에 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, 환자에 TARP 또는 이들의 면역단편을 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, TARP를 특이적으로 인식하는 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 폴리펩타이드가 TARP와 90%이상의 상동성을 갖고, 프로세스되어 MHC 복합체 분자와 제공된 경우 TARP-발현 세포에 대한 T-림프구를 활성화하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 전립선암으로 고통받는 환자에 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, 유방암으로 고통받는 환자에 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, 유방암으로 진단받은 여성 환자에 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, 시험관내에서 TARP 에피토프에 CD+8 세포를 민감화하는 것을 포함하고, 환자에 민감화된 세포를 주입하는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 비-특이 면역 어쥬반트, 서브세포(subcelluar) 미생물 생성물(products) 및 프랙션(fraction), 햅튼, 면역적 단백질, 면역조절제, 인터페론, 흉선 호르몬, 및 콜로니 자극 팩터(colony stimulating factor)로부터 선택된 면역 어쥬반트를 환자에 동시-주입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, TARP 에프토프를 포함하는 폴리펩타이드로 펄스된 항원 제공 세포를 주입하는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는, 재조합 바이러스 핵산을 주입하는 방법.
- 제20항에 있어서, TARP 단백질 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열을 주입하는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는, 재조합 박테리아 발현벡터를 주입하는 것을 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, TARP 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는, 재조합 박테리아 발현벡터로 환자를 면역화하는 것을 포함하는 방법.
- 제27항에 있어서, CD+8세포가 Tc세포인 방법.
- 제34항에 있어서, Tc세포가 종양 침투 림프구(tumor infiltrating lymphocytes)인 방법
- 남성의 전사체 또는 단백질 검출 세포가 전립선 상피세포로 확인 및 여성의 전사체 또는 단백질 검출 세포가 유방암 세포로 확인하고 TARP 인코딩 핵산 전사체, 또는 전사체 번역에 의하여 생성된 TARP 검출하는 것을 포함하는 남성에서 상피근원 전립선 세포, 또는 여성에서 유방암세포를 검출하는 방법.
- 제36항에 있어서, 전사체 검출을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 단백질 검출을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 하이브리드 조건하에서 전사체와 특이적으로 하이브리드하는 프로브와 세포의 RNA를 접촉시키고, 하이브리드를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 단백질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 부분 및 검출가능한표지를 포함하는 키메릭 분자와 세포 내용물(cel contents)의 부분을 접촉시키고, 단백질에 부착된 표지를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 세포가 림프노드로부터 추출된 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 세포가 유방 생체검사로부터 추출된 것인 방법.
- TCRγ알터네이트 리딩 프레임 단백질 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체
- TARP 인코딩 핵산을 특이적으로 절단하는 리보자임, TARP 인코딩 핵산에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, TARP 인코딩 핵산 및 TARP 인코딩 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 단백질로 구성되는 그룹에서 선택된 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 세포의 TARP 레벨을 조절하는 방법.
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| EP3079716B1 (en) | 2013-12-13 | 2019-05-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Multi-epitope tarp peptide vaccine and uses thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2379345A1 (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-18 | Ira Pastan | T-cell receptor .gamma. alternate reading frame protein, (tarp) and uses thereof |
| US20030108963A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-06-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer |
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