CZ2003440A3

CZ2003440A3 - Kompozice a způsoby pro terapii a diagnózu rakoviny vaječníků

Info

Publication number: CZ2003440A3
Application number: CZ2003440A
Authority: CZ
Inventors: Darrick Carter; Paul Hill; Earl Albone; Jenifer L. Mitcham; Gordon E. King; Paul A. Algate; Steven A. Fling; Marc W. Retter; Gary Richard Fanger; Steven G. Reed; Thomas S. Vedvick
Original assignee: Corixa Corporation
Priority date: 2000-07-17
Filing date: 2001-07-17
Publication date: 2003-12-17
Also published as: MXPA03000527A; KR20080068143A; CN100439395C; EP1349870B1; NO20030211D0; US20020119158A1; NO20030211L; AU2007202776B2; HUP0302532A2; ATE410446T1; AU2001276973B2; PT1349870E; WO2002006317A3; BR0112542A; NZ551214A; DK1349870T3; WO2002006317A2; IL153996A0; CN1529713A; EP1349870A2

Description

Tento vynález se týká obecně terapie rakoviny vaječniků. Vynález je konkrétně zaměřen na polypeptidy zahrnující alespoň část vaječníkového karcinomového proteinu a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy, stejně jako na protilátky a buňky imunitního systému, které specificky rozpoznávají tyto polypeptidy. Tyto polypeptidy, polynukleotidy, protilátky a buňky mohou být použity ve vakcínách a farmaceutických kompozicích pro ošetření rakoviny vaječniků.

Dosavadní stav techniky

Rakovina vaječniků představuje závažný zdravotní problém žen ve Spojených státech a na celém světě. Přestože byly učiněny pokroky v detekci a terapii tohoto druhu rakoviny, není dosud dostupná žádná vakcína nebo jiná univerzálně úspěšná metoda prevence nebo léčby. Metoda zvládnutí této nemoci v současnosti spočívá na kombinaci včasné diagnózy a agresivní léčby, která může zahrnovat jeden nebo více způsobu ošetření, jako je chirurgický způsob, radioterapie, chemoterapie a hormonální terapie. Postup při léčbě konkrétního případu rakoviny je často vybrán na základě různých prognostických parametrů, které zahrnují analýzu specifických signálních znaků nádoru.

Avšak použití signálních znaků často vede k výsledkům, které je těžké interpretovat a u mnoha pacientů s rakovinou dochází k úmrtí.

Imunoterapie mají potenciál k podstatnému zlepšení léčení rakoviny a k přežití pacienta. Tyto terapie mohou zahrnovat vyvolání nebo zvýšení imunitní odezvy na vaječníkový karcinomový antigen. Avšak doposud je známo ········ pouze relativně málo vaj eční kových . kareinomových. antigenů a vyvolání imunitní odezvy vůči těmto antigenům se neukazuje jako terapeuticky výhodné.

V této oblasti tak existuje potřeba vylepšených metod identifikace antigenů vaječníkových nádorů a užití těchto antigenů při terapii rakoviny vaječníků. Tento vynález vyhovuje uvedeným požadavkům a dále poskytuje jiné související výhody..

Podstata vynálezu

Stručně řečeno, tento vynález poskytuje kompozice a způsoby pro terapii rakoviny, jako je rakovina vaječníků.

V jednom aspektu tak tento vynález poskytuje polypeptidy zahrnující imunogenní část vaječníkovéhó'karcinomového proteinu nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercí tak, že schopnost této varianty reagovat s antiséry specifickým k vaječníkovému karcinomovému proteinu není podstatně omezena. V různých provedeních vaječníkový karcinomový protein zahrnuje sekvenci, která je kódována polynukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny sestávající ze sekvencí SEQ ID NO (sekvencí s identifikačním číslem): 456 až 457, 460 až 477 a 512 až 570 a komplementárních částí těchto polynukleotidů.

Tento vynález dále poskytuje polynukleotidy, které kódují polypeptid, jak je popsán výše, nebo jeho část, expresívní vektory zahrnující tyto polynukleotidy a hostitelské buňky transformované nebo transfektované těmito expresívními vektory.

Tento vynález dále poskytuje polypeptidové kompozice zahrnující sekvence aminokyselin vybrané ze skupiny sestávající ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 394 až 455, 458 až 459, 478 až 511 a 571 až 596.

• ·

. .. V jiném provedení tento vynález poskytuje . .....

farmaceutické kompozice, a vakciny. Farmaceutické kompozice mohou obsahovat fyziologicky přijatelný nosič nebo vehikulum v kombinaci s jedním nebo více z i) polypeptidů zahrnujících imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercí tak, že schopnost této varianty reagovat s antisérem specifickým k vaječníkovému karcinomovému proteinu není podstatně omezena, kde vaječníkový karcinomový protein zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je kódována polynukleotidem, který zahrnuje sekvenci SEQ ID NO (sekvencí s identifikačním číslem): 456 až 457, 460 až 477 a 512 až 570, nebo ii) polynukleotidů kódujících tento polypeptid; iii) protilátek, které se specificky vážou na tento polypeptid; iv) buněk poskytujících antigen, které exprimují (poskytují expresí) tento, polypeptid a/nebo (v) T buněk, které specificky reagují s těmito polypeptidy. Vakciny mohou obsahovat zesilovač nespecifické imunitní odezvy v kombinaci s jedním nebo více z: i) polypeptidů zahrnujících' imunogenní 'část vaječníkového karcinomového proteinu nebo jeho variantu, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercí tak, že schopnost této varianty reagovat s antiséry specifickými k vaječníkovému karcinomovému proteinu není podstatně omezena, kde vaječníkový karcinomový protein zahrnuje aminokyselinové sekvence, které jsou kódovány polynukleotidem, který zahrnuje sekvence SEQ ID NO: 394 až 455, 458 až 459, 478 až 511 a 571 až 596 nebo aminokyselinové sekvence kódované polynukleotidem, který zahrnuje sekvence uvedené v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 456 až 457, 460 až 477 a 512 až 570, nebo ii) polynukleotidů kódujících tento polypeptid; iii) antiidiotypových protilátek, které se specificky vážou protilátkou, která se specificky váže na tento polypeptid;

• · • · iv) buněk, poskytuj ících. .antigen, které exprimují tento . polypeptid a/nebo (v) T buněk, které specificky reaguji s tímto polypeptidem.

Tento vynález dále poskytuje v jiném aspektu fúzní proteiny, které zahrnují alespoň jeden polypeptid, jak je popsán výše, stejně jako polynukleotidy kódující tyto fúzní proteiny.

V podobných aspektech jsou poskytovány farmaceutické kompozice obsahující fúzní protein nebo polynukleotid kódující fúzní protein v kombinaci s fyziologicky přijatelným nosičem.

Dále jsou poskytovány vakcíny obsahující fúzní protein nebo polynukleotid kódující fúzní protein v kombinaci se zesilovačem nespecifické imunitní odezvy.

V dalším aspektu tento vynález poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, které zahrnují podávání výše uvedené farmaceutické kompozice nebo vakcíny pacientovi.

_Tento vynález dále poskytuje způsoby stimulace a/nebo expanze T buněk, který zahrnuje kontakt T buněk s a) polypeptidem zahrnujícím imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu nebo jeho varianty, která se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercí tak, že schopnost této varianty reagovat s antiséry specifickými k vaječníkovému karcinomovému proteinu není podstatně omezena, kde vaječníkový karcinomový protein zahrnuje aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 394 až 455, 458 až 459, 478 až 511 a 571 až 596 nebo aminokyselinové sekvence kódované polynukleotídem, který zahrnuje sekvence uvedené v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 456 až 457, 460 až 477 a 512 až 570, nebo b) polynukleotídem kódujícím tento polypeptid a/nebo c) buňkami poskytujícími antigen, které poskytují expresi • · ··

tohoto polype.ptidu za podmínek_a po dobu dostatečnou k dosažení stimulace a/nebo expanze T buněk. Tento polypeptid, polynukleotid a/nebo buňka/buňky poskytující antigen mohou být přítomny ve farmaceutické kompozici nebo vakcíně pro použití při stimulaci a/nebo expanzi T buněk u savců.

V jiném aspektu tento vynález poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny vaječníků u pacienta, který zahrnuje podávání T buněk připravených výše uvedeným způsobem tomuto pacientovi.

V jiném aspektu tento vynález poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny vaječníků u.pacienta, který zahrnuje kroky: a) inkubace CD4 ⁺ a/nebo CD8⁺ T buněk izolovaných z pacienta s jedním nebo více z: i) polypeptidů zahrnujících imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu nebo jejich variant, které se liší v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercí tak, že schopnost těchto variant reagovat s antiséry specifickými k vaječníkovému karcinomovému proteinu není podstatně omezena, kde vaječníkový karcinomový protein zahrnuje aminokyselinové sekvence, které jsou kódovány polynukleotidem, který zahrnuje sekvence SEQ ID NO: 456 až 457, 460 až 477 a'512 až 570, nebo ii) polynukleotidů kódujících tento polypeptid; iii) buňkami poskytujícími antigen, které poskytují expresi tohoto polypeptidů; takže se rychle množí T buňky; a b) podávání pacientovi účinného množství proliferovaných T buněk, čímž se inhibuje rozvoj rakoviny vaječníků u pacienta. Proliferované buňky mohou být klonovány před podáváním pacientovi.

Tento vynález také poskytuje způsoby identifikace vylučovaných nádorových (tumorových) antigenů. Tyto způsoby zahrnují tyto kroky:

• ·

. · · · : i · · ·..·

a) , implantaci rakovinných buněk .do imuno.deficientního zvířete;

b) získání séra z imunodeficientního zvířete po době dostatečné k dosažení sekrece nádorových antigenů do séra;

c) imunizaci imunokompetentního zvířete sérem;

d) získání antiséra z imunokompetentního zvířete; a

e) screening tumorové expresní knihovny antisérem a dále identifikace vyloučeného nádorového antigenů.

Výhodný způsob identifikace vylučovaného vaječníkóvého karcinomového antigenů zahrnuje kroky: a) implantaci vaječníkových karcinomových buněk do SCID myši; b) získání séra ze SCID myši po době dostatečné k dosažení sekrece vaječníkových karcinomových antigenů do séra; c) imunizaci imunokompetentní myši sérem; d) získání antiséra z imunokompetentní myši; a e) screening vaječníkové karcinomové expresní knihovny antisérem a dále identifikac vyloučeného vaječníkového karcinomového antigenů.

Tento vynález také popisuje protilátkové. epitopy zjištěné polyklonálními antisé.ry 08-E, přičemž tyto-epitopy jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO: 394 - 415.

Dále jsou v tomto vynálezu popsány 10-mer a 9-mer peptidy, u kterých je předpovězeno, že se vážou k HLA-0201 přičemž tyto peptidy jsou zde popsány jako SEQ ID NO: 416 435 a SEQ ID NO: 436 - 455.

Tyto a jiné aspekty tohoto vynálezu budou zřejmější v souvislosti s následujícím detailním popisem a připojenými obrázky. Všechny zde uvedené odkazy jsou zahrnuty ve své celistvosti, jako by každý z nich byl zahrnut individuálně.

V jiném aspektu tohoto vynálezu byla neočekávaně identifikována série nových sekvencí jednotek repetice (repetičních sekvencí) na 5' konci genu kódujícího O772P.

*« « • *

Tento vynález tak poskytuje polypeptidy O772P mající vzorce představované X_n-Y, kde X zahrnuje sekvenci mající alespoň 50% identitu, výhodně alespoň 70% identitu a zvláště výhodně alespoň 90% identitu s repetiční sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 596. Y bude typicky zahrnovat sekvenci mající alespoň 80% identitu, výhodně alespoň 90% identitu a výhodně alespoň 95% identitu se sekvencí konstantní oblasti uvedenou v SEQ ID NO: 594. V tomto provedení bude n obecně celé číslo od 1 do 35, výhodně celé číslo od 15 do 25, a X může být stejná nebo různá.

V jiném výhodném provedení X zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z jakékoli sekvenci SEQ ID NO: 574 až 593 a Y zahrnuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 594. ' . . .

V jiném výhodném provedení ilustrativní polypeptid · O772P zahrnuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 595, zahrnující 20 prvků sekvence repetice (tj . X₂o) , kde prvky X jsou uvedeny v následujícím pořadí (od N-konce k C-konci v oblasti repetice O772P): SEQ ID NO: 574 - SEQ ID NO: 575

- SEQ ID NO: 576 - SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578 - SEQ ID NO: 579 - SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581 - SEQ ID NO: 582

- SEQ ID. NO: 583 - SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585 - SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587 - SEQ ID NO: 588 - SEQ ID NO: 589

- SEQ ID NO: 590 - SEQ ID NO: 591 - SEQ ID NO: 592 - SEQ ID NO: 593.

V jiném aspektu je tímto vynálezem poskytován polynukleotid O772P mající strukturu X_n-Y, kde X zahrnuje repetiční sekvenční prvek vybraný ze skupiny sestávající z kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 512 až 540, 542 až 546 a 548 až 567. Y bude obecně zahrnovat sekvence mající alespoň 80% identitu, výhodně alespoň 90% identitu a nejvýhodněji alespoň 95% identitu se sekvencí konstantní oblasti O772P uvedenou v SEQ ID NO: 568. V tomto provedení je n typicky

• · ♦ ·* · ♦ * «ν ·«·· ·* ·* < * ♦ • ► • * • · ··»· ·**· celé číslo od 1 do 35, výhodně od 15 do 25 a X může.být stejná nebo odlišná.

V jiném provedení zahrnuje ilustrativní polynukleotidovou O772P sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 569, obsahující 20 prvků sekvence repetice (tj . X₂o) ·

Podle jiného aspektu tohoto vynálezu jsou poskytovány polypeptidy 0772 obsahující alespoň sekvenci epitopu protilátky uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 490 až 511.

Podle jiného aspektu tohoto vynálezu jsou poskytovány polypeptidy O8E zahrnující alespoň sekvenci epitopu protilátky uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 394 až 415 . ........... - ............. - ........

Stručný popis identifikací sekvencí a obrázků

SEQ ID NO: 1 až 71 jsou polynukleotidy vaječníkového karcinomového antigenu uvedené na obrázcích 1A až 1S.

SEQ ID NO:.72až74 jsou polynukleotidy vaječníkového karcinomového antigenu uvedené na obrázcích 2A až 2C.

3g	SEQ ID (Obrázek	NO: 4) .	75	je	vaj ečníkový	karcinomový	polynukleotid
3f	SEQ ID (obrázek	NO: 5) .	76	je	vaječníkový	karcinomový	polynukleotid
6b	-SEQ ID (obrázek	NO: 6) .	77	je	vaječníkový	karcinomový	polynukleotid
8e	SEQ ID (obrázek	NO: 7A)	78	je	vaj ečníkový	karcinomový	polynukleotid
8h	SEQ ID (obrázek	NO: 7B)	79	je	vaječníkový	karcinomový	polynukleotid
	SEQ ID	NO:	80	je	vaječníkový	karcinomový	polynukleotid

12e (obrázek 8) • · · · — 9 - ·* ·* ········ ···· ···· ·· ·· ·· ··

SEQ ID NO: 81 je vaječníkový karcinomový polynukleo.tid 12h (obrázek 9).

SEQ ID NO: 82 až 310 jsou vaječníkové karcinomové polynukleotidy antigenů (uvedené na obrázcích 15A až 15EEE).

SEQ ID NO: 311 je sekvence vaječníkového karcinomového polynukleotidu o plné délce.

SEQ ID NO: 312 aminokyselinová sekvence O772P.

SEQ ID NO: 313 až 384 jsou polynukleotidy vaječníkových karcinomových antigenů.

SEQ ID NO:	385	představuj e	sekvenci	cDNA	formy	klonu
O772P, označovaného	21013.
SEQ ID NO:	386	představuj e	sekvenci	cDNA	formy	klonu
O772P, označovaného	21003.
SEQ ID NO:	387	představuje	sekvenci	cDNA	formy	klonu
O772P, označovaného	21008.
SEQ ID NO:	38 8	je sekvence	aminokyselin

(aminokyselinová sekvence) odpovídající SEQ ID NO: 385.

SEQ ID NO: 389 je sekvence aminokyselin odpovídající SEQ ID NO: 386.

SEQ ID NO: 390 je sekvence aminokyselin odpovídající SEQ ID NO: 387.

SEQ ID NO: 391 je sekvence vaječníkového karcinomového polynukleotidu O8E o plné délce.

SEQ ID NO: 392 až 393 jsou sekvence proteinu kódované

O8E.

SEQ ID NO: 394 až 415 jsou peptidové sekvence odpovídající protilátkových epitopům OE8.

• ·

SEQ ID NO: 416.až 435 jsou potenciální HLA-A2 iO.-mer.

li ? 1 ' .·- / ip vázající peptidy předpovídající použití otevřeného čtecího rámce z OE8 o plné délce.

SEQ ID NO: 436 až 455 jsou potenciální HLA-A2 9-mer vázající peptidy předpovídájíčí použití otevřeného čtecího rámce z OE8 o plné délce.

SEQ ID NO: 456 je zkrácená nukleotidová sekvence sekvence Genbank o plné délce, vykazující homologii s O772P.

SEQ ID NO: 457 je sekvence Genbank o plné délce, vykazující významnou homologii s O772P.

SEQ ID NO: 457 je sekvence Genbank o plné délce, vykazující významnou homologii s 0772?.

SEQ ID NO: 458 je protein kódující zkrácenou verzi sekvence Genbank, vykazující homologii s O772P.

SEQ ID NO: 459 je sekvence proteinu o plné délce z Genbank, vykazující významnou homologii se sekvencí proteinu u O772P.

SEQ ID NO: 460 kóduje unikátní N-terminální část O772P obsaženou ve zbytcích 1 až 70.

SEQ ID NO: 461 obsahuje.unikátní sekvenci a kóduje zbytky 1 až 313 v SEQ ID NO: 456.

SEQ ID NO: 462 je hypotetická sekvence pro klon O772P.

SEQ ID NO: 463 je sekvence cDNA pro klon FLJ14303.

SEQ ID NO: 464 je parciální sekvence cDNA pro klon O772P.

SEQ ID NO: 465 je parciální sekvence cDNA pro klon O772P.

SEQ ID NO: 466 je parciální sekvence cDNA pro klon

O772P.

• ·

	- 11 -	• · · • • · • · • · · · · · ·	• · · · · • · · · ·	• · • * • · 4 • ·
• · • ··	• · • ·
SEQ ID O772P.	NO: 467 je parciální	sekvence	. cDNA	pro.	..klon
SEQ ID O772P.	NO: 468 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO: 469 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO:. 470 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO: 471 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO: 472 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO: 473 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID O772P.	NO: 474 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID 0772,P.	NO: 475 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon
SEQ ID	NO: 476 je parciální	sekvence	cDNA	pro	klon

O772P.

SEQ ID NO: 477 představuje nový 5' konec vaječníkového nádorového antigenu O772P.

SEQ ID NO:478 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ

ID NO: 462.

SEQ ID NO: 479 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 463

SEQ ID NO: 480 je parciální aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 472.

SEQ ID NO: 481 je parciální aminokyselinová sekvence kódovaná možným otevřeným čtecím rámcem SEQ ID NO: 471.

• · • · · · · ·

	- 12 -	• · · · · · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··
SEQ ID NO:	482 je parciální	. am in o kys e1ino vá-sekvence
kódovaná druhým	možným otevřeným	čtecím rámcem SEQ ID NO:
471.
SEQ ID NO:	483 je parciální	aminokyselinová sekvence
kódovaná SEQ ID	NO: 467.
SEQ ID NO:	484 je parciální	aminokyselinová sekvence
kódovaná možným	otevřeným čtecím	rámcem SEQ ID NO: 466.
SEQ ID NO:	485 je parciální	aminokyselinová sekvence
kódovaná druhým	možným otevřeným	čtecím rámcem SEQ ID NO:
466.
SEQ ID NO:	486 je parciální	aminokyselinová sekvence

kódovaná SEQ ID NO: 465.

SEQ ID NO: 487 je parcilní aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 464.

SEQ ID NO: 488 představuje extracelulárni, transmembránovou a cytoplazmatickou oblast O772P.

SEQ ID NO: 489 představuje předpokládanou extracelulárni doménu O772P,

SEQ ID NO: 490 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #2, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 491 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #6, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 492 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #7, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 493 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #8, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

···· ····

SEQ ID NO: 494 představuje peptidu #9, který koresponduje protilátky.

SEQ ID NO: 495 představuje peptidu #11, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 496 představuje peptidu,#13, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 497 představuje peptidu #22, který koresponduje epitopem protilátky.

....... SEQ !D NO: 498 představuje peptidu #24, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 499 představuje peptidu #27, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 500 představuje peptidu #40, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 501 představuje peptidu #41, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 502 představuje peptidu #47, který koresponduje epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 503 představuje peptidu #50, který koresponduje epitopem protilátky.

aminokyselinovou sekvenci ; O772P specifickým epitopem aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým aminokyselinovou sekvenci s O772P specifickým .· · ·· • ··

SEQ ID NO: 504 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #51, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 505 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #52, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 506 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #53, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 507 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #58, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

.....SEQ ID NO: 508' představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu .#59, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 509 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #60, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 510 představuje aminokyselinovou sekvencí peptidu #61, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 511 představuje aminokyselinovou sekvenci peptidu #71, který koresponduje s O772P specifickým epitopem protilátky.

SEQ ID NO: 512 (O772P repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 513 (O772P repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 20 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 514 (O772P repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 19 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 515 (O772P repeat4) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 18' z 5 variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 516 (O772P repeat5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 17 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 517 (HB repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 518' ( (HB repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 20 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 519 (HB repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 19 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 520. (HB ropeai.4) představuje přiklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 18 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 521 (HB repeat5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 17 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 522 (HB repeat6 5-konec) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 16 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 523 (1043400.1 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 524 (1043400.1 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 10 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 525 (1043400.1 repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 10/11 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 526 (1043400.1 repeat4) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 11 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 527 (1043400.1 repeat5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 14 z 5' variabilní oblasti O772P.

·- SEQ ID NO: 528 (10434 00.1 repeatG) představuje' příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 17 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 529 (1043400.3 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 20 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 530 (10434,00.3 rep,eal2) .představu j e příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO:,531 (1043400.5 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 8 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 532 (1043400.5 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 9 z 5' variabilní oblasti O772P, která dále obsahuje sekvenci intronu.

SEQ ID NO: 533 (1043400.5 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 9 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 534 (1043íOC.8 .repeatI) ..představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 17 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 535 (1043400.8 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 18 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 536 (1043400.8 repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 19 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 537 (1043400.9 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 4 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO': 538 (1043400.9 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídájící číslu repetice 5 z 5 variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 539 (1043400.9 repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 7 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 540 (1043400.9 repeat4) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 8 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 541 (1043400.11 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 1 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 542 (1043400.11 repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 2 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 543 (1043400.11 repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 3 z 5' variabilní oblasti O772P.

·· ·· ·· »· ·· ·· ··· · · · · · · • · · · · · · · · • · ·· ·· ··· · • · ···· · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··

SEQ ID NO: 544 (1043400.11 repeat4) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 11 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 545 (1043400.11 repeat5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 12 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 546 (1043400.12 repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídájíi variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 547 (PB repeatA) sekvence cDNA·odpovídájící číslu oblasti O772P.

SEQ ID NO: 548 (PB repeat.B) sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P.

SEQ ID NO: 549 (PB repeatE) sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P.

SEQ ID NO: 550 (PB repeat.G) sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P. .

SEQ ID NO: 551 (PB repeatC) sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P.

SEQ ID NO: 552 (PB repeatH) sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P.

SEQ ID NO: 553 (PB repeatJ)· sekvence cDNA odpovídající číslu oblasti O772P.

:í číslu repetice 20 z 5' představuje příklad repetice 1 z 5' variabilní představuje příklad* repetice 2 z 5; variabilní představuje příklad repetice 3 z 5' variabilní představuje příklad repetice 4 z 5' variabilní představuje příklad repetice 4 z 5' variabilní představuje příklad repetice 6 z 5' variabilní představuje příklad repetice 7 z 5' variabilní ·· ···*

SEQ ID NO: 554 (PB repeatK) představuje příklady sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 8 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 555 (PBrepeatD) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 9 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 556 (PB repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 10 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 557 (PB repeatM) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 11 z 5' variabilní oblasti O772P.

.....SEQ ID NO: 558 (PB repeat.9) představuje příklad .sekvence cDNA odpovídající· číslu repetice 12 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 559 (PB repeat8.5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 13 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 560 (PB repeat.8) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 14 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 561 (PB repeat7) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 15 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 562 (PB repeat6) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 16 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 563 (PB repeat5) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 17 z 5' variabilní oblasti O772P.

* · · *

• « • · · • ·« • · ·

4· *··*>

··

SEQ ID NO: 564 (PB repeat4) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 18 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 565 (PB repeat3) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 19 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 566 (PB repeat2) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 20 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 567 (PB repeatl) představuje příklad sekvence cDNA odpovídající číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ -ID· NO: 568- představuje sekvenci cDNA tvoříc: 3' ’ konstantní oblast. . . .

SEQ ID NO: 569 představuje sekvenci cDNA obsahující konvenční sekvenci o 21 repeticích, 3' konstantní oblast a 3' nepřeloženou oblast.

SEQ ID NO: 570. představuje sekvenci cDNA konstantní sekvence repetice.

SEQ ID NO: 571 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci jednoho potenciálního otevřeného čtecího rámce o číslu repetic¹ 1. z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 572 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci jednoho potenciálního otevřeného čtecího rámce o číslu repetice 1 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 573 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci třetího potenciálního otevřeného čtecího rámce o číslu repetice 1 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 574 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci o číslu repetice 2 z 5' variabilní oblasti O772P.

«« ·· « · * »

Λ· ···· ···· • · · «< ·* ·» • 5··» • * • · * » t · « • «

SEQ ID NO: 575 představuje sekvenci o číslu repetice 3 z 5

SEQ ID NO: 576 představuje sekvenci o číslu repetice 4 z 5

SEQ ID NO: 577 představuje sekvenci o číslu repetice 5 z 5

SEQ ID NO: 578 představuje sekvenci o číslu repetice 6 z 5

SEQ ID NO: 579 představuje sekvenci o číslu repetice 7 z 5

SEQ ID NO: 580 představuje sekvenci o číslu repetice 8 z 5

SEQ ID NO: 581 představuje sekvenci o číslu repetice 9 z 5

SEQ ID NO: 582 představuje sekvenci o číslu repetice 10 z

SEQ ID NO: 583 představuje sekvenci o číslu repetice 11 z

SEQ ID NO: 584 představuje sekvenci o číslu repetice 12 z

SEQ ID NO: 585 představuje sekvenci o číslu repetice 13 z

SEQ ID NO: 586 představuje sekvenci o číslu repetice 14 z

SEQ ID NO: 587 představuje sekvenci o číslu repetice 15 z

SEQ ID NO: 588 představuje sekvenci o číslu repetice 16 z

SEQ ID NO: 589 představuje sekvenci o číslu repetice 17 z konstantní. aminokyselinovou., variabilní oblasti O772P.

konstantní aminokyselinovou variabilní oblasti O772P.

konstantní aminokyselinovou d variabilní oblasti O772P.

konstantní aminokyselinovou d variabilní oblasti O772P...

konstantní aminokyselinovou d variabilní oblasti O772P.

konstantní aminokyselinovou variabilní oblasti O772P.

konstantní aminokyselinovou d variabilní oblasti O772P.

• · · · · · «

SEQ ID NO: 590 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci o číslu repetice 18 z 5^Z variabilní oblasti 0772P.

SEQ ID NO: 591 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci o číslu repetice 19 z. 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 592 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci o číslu repetice 20 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 593 představuje konstantní aminokyselinovou sekvenci o číslu repetice 21 z 5' variabilní oblasti O772P.

SEQ ID NO: 594 představuje aminokyselinovou sekvenci 3' konstantní oblasti.

SEQ ID NO: 595 představuje aminokyselinovou sekvenci obsahující konvenční sekvenci repetice.

SEQ ID NO: 596 představuje aminokyselinovou sekvenci konvenční sekvenci repetice.

Obrázky 1A-1S (SEQ ID NO: 1 až 71) uvádí parciální sekvence polynukleotidů kódující reprezentativní vylučované vaječníkové karcinomové antigeny.

Obrázky 2A až 2C uvádějí celé sekvence insertů pro tři klony z obrázku 1. Obrázek 2A ukazuje sekvenci označenou O7E (11731; SEQ ID NO: 72), obrázek 2B ukazuje sekvenci označenou O9E (11785; SEQ ID NO: 73) a obrázek 2C ukazuje sekvenci označenou O8E (13695; SEQ ID NO: 74).

Obrázek 3 představuje výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené O8E.

Obrázek 4 představuje parciální sekvenci polynukleotidu (označeného 3g; SEQ ID NO: 7ř) kódujícího vaječníkovou karcinomovou sekvenci, která je sestřihovou fúzí mezi TAX onkoproteinem viru leukemie lidských T-buněk typu Ia osteonektinu.

Obrázek 5 představuje vaječníkový karcinomový polynukleotid označený 3f (SEQ ID NO: 76).

• ·

Obrázek 6 představuje vaječníkový^karcinomový .. _ .

polynukleotid označený 6b (SEQ ID NO: 77).

Obrázek 7A a 7B představuje vaječníkové karcinomové polynukleotidy označené 8e (SEQ ID NO: 78) a 8h (SEQ ID NO: 79) .

Obrázek 8 představuje vaječníkový karcinomový polynukleotid označený 12c (SEQ ID NO: 80).

Obrázek 9 představuje vaječníkový karcinomový polynukleotid označený 12h (SEQ ID NO: 81).

Obrázek 10 uvádí výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené 3f.

Obrázek 11 uvádí výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené 6f.

Obrázek 12 uvádí výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené 8e.

Obrázek 13 uvádí výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené 12c.

Obrázek 14 uvádí výsledky mikrošípové analýzy exprese vaječníkové karcinomové sekvence označené 12h.

Obrázky 15A až 15EEE uvádí parciální sekvence dalších polynukleotidů kódujících reprezentativní vylučované vaječníkové karcinomové antigeny (SEQ ID NO: 82 až 310).

Obrázek 16 je diagram ilustrující umístění (lokaci) různých parciálních sekvencí O8E na sekvenci o plné délce.

Obrázek 17 je graf ilustrující výsledky epitopové mapovací studie na proteinu O8E.

Obrázek 18 je graf FACS analýzy (fluorescence activated cell sorting) povrchové exprese O8E u buněk.

Obrázek 19 je graf FACS analýzy povrchové exprese O8E u buněk.

Obrázek 20 ukazuje výsledky EACS analýzy, .pro. O8E ... transfektované HEK293 buňky vykazující povrchovou expresi O8E.

Obrázek 21 ukazuje výsledky EACS analýzy u SKBR3. rakovinných buněk prsu demonstrující povrchovou expresi O8E.

Obrázek 22 ukazuje expresi 08E u buněk HEK 293. Buňky byly sondovány anti-08E králičím polyklonálním antisérem #2333L.

Obrázek 23 ukazuje analýzu ELISA anti-08E králičího séra.

Obrázek 24 ukazuje analýzu ELISA afinity přečištěné králičí ánti-08E polyklonální protilátky.

Obrázek 25 je graf stanovení protilátkové internalizace anti-O8E mAB ukazující, že mABs proti aminokyselinám 61 až 80 indukuje ligandovou internalizaci.

Detailní popis vynálezu

Jak bylo uvedeno výše, tento vynález je obecně zaměřen na kompozice a metody pro terapii rakoviny, jako je rakovina vaječníků. Zde popsané kompozice mohou zahrnovat imunogenní polypeptidy, polynukleotidy kódující tyto polypeptidy, vazebná činidla, jako jsou protilátky, která se vážou na polypeptidy, buňky poskytující antigen (APC antigen presenting cell) a/nebo buňky imunitního systému (např. T-buňky).

Polypeptidy podle tohoto vynálezu obecně zahrnují alespoň imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu nebo její variantu. Určité vaječníkové karcinomové proteiny byly identifikovány za použití imunozkoušek a jsou zde označovány jako vaječníkové karcinomové antigeny.

I • ·· · „Vaječníkový karcinomový antigen je protein, který je. . ., exprimován (tj. produkován expresí) vaječníkovými rakovinnými buňkami (výhodně lidskými buňkami) na úrovni, která je alespoň dvakrát vyšší, než je úroveň u normálních vaječníkových buněk. Určité vaječníkové karcinomové antigeny reagují detekovatelně (pomocí imunozkoušky,jako je ELISA nebo westernovým přenosem) s antiséry produkovanými proti séru z imunodeficientních zvířat s implantovaným lidským vaječníkovým tumorem.

Tyto vaječníkové karcinomové antigeny jsou uvolňovány nebo vylučovány z vaječníkového nádoru do séra u imunodeficientního zvířete. Určité zde uvedené vaječníkové karcinomové antigeny jsou vylučované antigeny. Určité sekvence nukleových kyseliny podle tohoto vynálezu obecně obsahují sekvence DNA nebo RNA, které kódují celý nebo část tohoto polypeptidu nebo jsou komlementární k takové sekvenci.

Tento vynález dále poskytuje sekvence vaječníkového karcinomu, které jsou identifikovány za použití technik k vyhodnocení změněné exprese u nádoru vaječníků. Tyto sekvence mohou být polynukleotidové nebo proteinové sekvence. Sekvence vaječníkového karcinomu jsou obecně produkovány expresí ve vaječníkovém tumoru na úrovni, která je alespoň dvakrát, výhodně alespoň pětkrát, vyšší než je úroveň exprese v normální tkáni vaječníků, jak je stanoveno zde uvedenou reprezentativní zkouškou. Jsou zde uvedeny určité parciální polynukleotidové sekvence vaječníkového karcinomu. Proteiny kódované geny zahrnující tyto polynukleotidové sekvence (nebo jejich komplementární část) jsou také považovány za proteiny vaječníkového karcinomu.

Protilátky jsou obecně proteiny imunitního systému nebo jejich fragmenty vázající antigen, které jsou schopny vázat alespoň část zde popsaných polypeptidů karcinomu vaječníků. T buňky, které mohou, být. použity ve zde...........

popsaných kompozicích jsou obecně T buňky (např. CD4⁺a/nebo CD8⁺) , které jsou specifické pro tyto polypeptidy. Určité zde popsané způsoby dále využívají buňky poskytující antigen (jako jsou dendritické buňky nebo makrofágy), které poskytují expresi zde popsaného polypeptidu vaječníkového karcinomu.

Vaječnxkové karcinomové polynukleotidy

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá jakýkoli polynukleotid, který kóduje vaječníkový karcinomový protein nebo jeho část nebo jinou jeho variantu, jak jsou zde popsány.- Výhodné polynukleotidy obsahují alespoň 15 za sebou následujících nukleotidů, výhodně alespoň 30' následujících nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 45 za sebou následujících nukleotidů, které kódují část vaječníkového karcinomového proteinu. Výhodně polynukleotid kóduje imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu, jako je vaječníkový karcinomový antigen. Polynukleotidy komplementární k jakékoli takové sekvenci jsou také zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu. Polynukleotidy mohou být jednořetězcové (pozitivní nebo negativní) nebo dvouřetězcové a mohou být to být molekuly DNA (genomová, cDNA nebo syntetická) nebo RNA. Další kódující nebo nekódující sekvence mohou ale nemusí být přítomny v polynukleotidu podle tohoto vynálezu a polynukleotidy mohou ale nemusí být napojeny na jiné molekuly a/nebo nosičové materiály^

Polynukleotidy mohou obsahovat nativní sekvenci (tj. endogenní sekvenci, která kóduje vaječníkový karcinomový protein nebo jeho část) nebo mohou obsahovat variantu této sekvence. Polynukleotídové varianty mohou obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí tak, že

6’) _ 9 7 - ♦ · ······· «·····»· »· · · φ o ·· imunogenicita kódovaného polypeptídu není snížena oproti. . nativnímu vaječníkovému karcinomovému proteinu. Imunogenní účinek kódovaného polypeptídu může být odhadnut obecně zde popsaným způsobem. Varianty výhodně vykazují alespoň asi 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu a nejvýhodněji alespoň 90% identitu s polynukleotidovou sekvencí, která kóduje nativní vaječníkový karcinomový protein nebo jeho část.

Procentická identita dvou polynukleotidových nebo polypeptidových sekvencí může být snadno stanovena porovnáním sekvencí za použití počítačového algoritmu dobře známého odborníkům v oboru, jako je Megalign, za použití defaultních parametrů. Porovnání mezi dvěmi sekvencemi je typicky prováděno porovnáním'sekvencí přes srovnávací okno k identifikaci a srovnání lokálních oblastí podobných sekvencí. Pojem „srovnávací okno, jak je zde použit, označuje segment alespoň 20 následných pozic, obvykle 30 až asi 75 nebo 40 až asi 50, ve kterém může být sekvence porovnána s referenční sekvencí stejného počtu následných pozic poté, co jsou dvě sekvence optimálně uspořádány vedle sebe. Optimální uspořádání sekvencí pro srovnání může být provedeno například za použití programu Megalign v bioinformatickém software Lasergene (DNASTAR, lne.,

Madison, W1} za použití defaultních parametrů. Výhodně je procentická identita sekvencí stanovena srovnáním dvou optimálně uspořádaných sekvencí přes okno při srovnání alespoň 20 pozic, kde část polynukleotídové nebo polypeptidové sekvence V okně může zahrnovat adice nebo delece (tj. díry) z 20 % nebo méně, obvykle 5 až 15 % nebo 10 až 12 % oproti referenční sekvenci (která neobsahuje adice nebo delece. Procentická identita může být vypočtena stanovením počtu pozic, ve kterých se identické báze nukleových kyselin nebo zbytků aminokyselin vyskytují λρ obou sekvencí k získání počtu odpovídajících si pozic, • · · ·

dělením počtu odpovídajících si pozic. celkovým, počtem .pozic, v referenční sekvenci (tj. velikostí náhledu) a násobením výsledků 100 k získání procentické identity sekvencí.

Varianty mohou být také nebo alternativně v podstatě homologní s nativním genem nebo jeho částí nebo komplementem. Tyto polynukleotidové varianty jsou schopny hybridizace za středně přísných (stringentních) podmínek na přirozeně se vyskytující sekvencí DNA kódující nativní vaječníkový karcinomový protein (nebo komplementární sekvence). Vhodné středně přísné podmínky zahrnují předopláchnutí v roztoku 5 X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridizaci při 50 °C až 65 °C, 5 X SSC přes noc; a poté dvakrát promytí pří 65 °C po dobu 20 minut s 2 X,

0,5 X a 0,2 X SSC obsahujícím 0,1 % SDS.

Jak je zřejmé odborníkovi v oboru, jako výsledek degenerace genetického kódu existuje mnoho nukleotidových sekvencí, které kódují zde popsaný polynukleotid. Některé z těchto polynukleotidů mají minimální homologii s nukleotidovou sekvencí jakéhokoliv nativního genu.

Nicméně polynukleotidy, které se liší v důsledku rozdílů kodonu, jsou specifický zahrnúty do tohoto vynálezu. Kromě toho i alely genů zahrnující zde poskytované polynukleotidové sekvence spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Alely jsou endogenní geny, které jsou pozměněny jako výsledek jedné nebo více mutací, jako jsou delece, adice a/nebo substituce nukleotidů. Výsledná mRNA a proteiny mohou ale nemusí mít změněnou strukturu nebo funkci. Alely mohou být identifikovány za použití standardních způsobů (jako je hybridizace, amplifikace a/nebo porovnáním s databází sekvencí).

Polynukleotidy mohou být připraveny za použití různých způsobů. Například vaječníkový karcinomový polynukleotid může být identifikován, jak je popsáno detailně dále,

screeningem expresní knihovny..pozdních, fází- nádoru - - .....

vaječníku antiséry vytvořenými proti séru imunokompetentních myší po naočkování těchto myší sérem ze SCID myši s implantovanými pozdními fázemi vaječníkových nádorů. Vaječníkové karcinomové polynukleotidy mohou být také identifikovány za použití kterékoli varianty způsobu určeného k vyhodnocení různé exprese genu. Alternativně mohou být polynukleotidy amplifikovány z cDNA připravené z buněk nádoru vaječníku. Tyto polynukleotidy mohou být aplifikovány PCR (polymerase chain reaction). Pro tento způsob mohou být vytvořeny sekvenčně specifické prímery založené za zde uvedené sekvenci a mohou být nakoupeny nebo syntetizovány.

Amplifikovaná část může být použita k izolaci genu o plné délce z vhodné knihovny (např. knihovny cDNA vaječníkového karcinomu) za použití dobře známých technik. Těmito technikami je knihovna (cDNA nebo genomická) podrobena screeeningu za použití jedné nebo více polynukleotidových sond nebo primerů vhodných pro amplifikací. Výhodně je knihovna vybrána ,z hlediska velikosti tak, aby obsahovala větší molekuly. Náhodně připravené knihovny mohou být také výhodné pro identifikaci 5' a oblastí genů proti směru replikace. Genomické knihovny jsou výhodné pro získání intronů a sekvencí rozšiřujících 5' konec.

Pro techniky hybridizace může být parciální sekvence označena (např. posunem jednořetězcového zlomu nebo označením konce pomocí 32P) za použití známých technik. Bakteriální nebo bakteriofágová knihovna je poté podrobena screeningu pomocí hybridizačních filtrů obsahujících denaturované bakteriální kolonie (nebo kolonií obsahujících fágové plaky) s označenými sondami (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spríng Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Kolonie nebo plaky jsou vybrány .a namnoženy a .DNA je izolována pro další analýzu. Klony cDNA mohou být analyzovány ke zjištění množství dodatečných sekvencí například PCR využívající primer z parciální sekvence a primer z vektoru. Restrikční mapy a parciální sekvence mohou být vytvořeny k identifikaci jednoho nebo více překrývajících se klonů Kompletní sekvence pak může být přesně určena standardními způsoby, které mohou zahrnovat vytvoření série delečních klonů. Výsledné překrývající se sekvence jsou poté sestaveny do jedné přiléhající sekvence. Molekuly cDNA o plné délce mohou být vytvořeny navázáním vhodných fragmentů za použití dobře známých technik.

Obdobně existuje mnoho technik amplifikace pro získání kódující sekvence o plné délce z parciálních sekvencí cDNA. V rámci těchto technik je amplifikace obecně prováděna pomocí PCR. K provedení amplifikačního kroku může být použita jakákoli z množství komerčně dostupných souprav. Primery mohou být navrženy za použití například v oboru dobře známého software. Primery jsou výhodně o délce 22 až 30 nukleotidů, mají GC obsah alespoň 50 % a cílové sekvence dosahují při teplotách asi 68 až 72 °C. , Simplifikovaná oblast může být. sekvencována (sekvenčně analyzována) výše popsaným způsobem a překrývající se sekvence sestaveny do jedné přiléhající sekvence.

Jednou z těchto amplífikačních technik je inverzní PCR (viz Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), která používá restrikční enzymy ke generování fragmentu ve známé oblasti genu. Z fragmentu je poté vytvořen kruh intramolekulárním navázáním a je poté použit jako matrice pro PCR s divergentními primery odvozenými od známé oblasti. V alternativním přístupu mohou být získány sekvence sousedící s parciální sekvencí amplifikací s primerem na sekvenci linkeru a primerem specifickým k známé oblasti. Amplifikované sekvence jsou typicky podrobeny druhému kolu. amplifikacese stejným linkerovým primerem a druhým primerem specifickým k známé oblasti. Obměna tohoto způsobu, která využívá dva primery, které iniciují nastavení známé sekvence v opačných směrech je popsána ve WO 96/38591. Další techniky zahrnují záchytnou PCR (Lagestrom et al., PCR Methods Applix. 1: 111 - 19, 1991) a „walking PCR (Parke et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055 - 60, 1991). K získání sekvence cDNA o plné délce lze použít i jiné metody amplifikace.

V určitých případech je možno získat sekvenci cDNA o plné délce analýzou sekvencí poskytovaných v databází EST (expressed sequence tag), jako je databáze dostupná od GenBank. Rešerše na překrývající se EST mohou být obecně provedeny dobře známými programy (např. NCBI BLAST) a tyto EST mohou být použity k vytvoření přiléhající sekvence o plné délce.

Určité sekvence nukleových kyselin molekul cDNA kódujících části vaječníkových karcinomových antigenů jsou uvedeny na obrázcích 1A - 1S (SEQ'ID NO: 1 až 71) a obrázcích 15A až 15EEE (SEQ ID NO: 82 až -310). Tyto......

sekvence uvedené na obrázcích 1A - 1S se jeví jako nové.

Pro sekvence na obrázcích 15A - 15EEE databázové vyhledávání zjistilo případy vykazující podstatnou míru identity. Tyto polynukleotidy byly izolovány serologickým screehingem expresní knihovny vaječníkové nádorové cDNA a za použití technik určených k identifikaci vylučovaných nádorových antigenů. Expresní knihovna pozdních fází nádoru vaječníku byla připravena z od SCID odvozeného lidského tumoru vaječníku (OV9334) ve vektoru λ-screen (Novagen). Séra použitá při screeningu byla získána injekcí imunokompetentních myší séra ze SCID myší s implantovanými pozdními fázemi vaječníkových nádorů. Tato technika umožňuje identifikací cDNA molekul, které kódují imunogenní části vylučovaných nádorových antigenů.

Zde .uvedené polynukleotidy, stejně jako - - polynukleotidy o plné délce zahrnující sekvence, jiné části těchto polynukleotidů o plné délce a sekvence komplementární k celým nebo částem těchto molekul o plné délce, jsou specificky zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že tyto techniky mohou být také aplikovány k identifikací antigenů, které jsou vylučovány z jiných typů nádorů.

Jiné sekvence nukleových kyselin molekul cDNA zahrnující části vaječníkového karcinomového proteinu jsou uvedeny na obrázcích 4 až 9 (SEQ ID NO: 75 až 81) stejně jako SEQ ID NO: 313 až 384. Tyto sekvence byly identifikovány screeningem mikrošípy cDNA na expresi spojenou s nádorem (tj. expresí, která je alespoň pětkrát větší ve vaječníkovém.nádoru než u normálních vaječníkových tkání, jak bylo stanoveno za použití reprezentativních zde uvedených zkoušek). Tyto zkoušky byly provedeny za použití mikrošípu Synteni (Palo Alto, CA) podle instrukcí výrobce (a v podstatě způsobem popsaným v Schena et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 93: 10614 - 10619, .1996 a Heller et.....

al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2150 - 2155, 1997). SEQ ID NO: 311 a 391 poskytují sekvence o plné délce zahrnujících určitou z těchto sekvencí nukleových kyselin.

Kterákoli z množství dobře známých technik může být použita k vyhodnocení s tumorem spojené exprese cDNA. Například mohou být použity hybridizační techniky za použití značených polynukleotidových sond. Alternativně nebo navíc mohou být použity amplifikační techniky, jako je PCR v reálném čase (viz Gigsaon et al., Genome research 6: 99R - 001, 1996; Heid et al., Genomre Research 6: 986 994, 1996). PCR v reálném čase je technika, která vyhodnocuje úroveň akumulace produktu PCR během amplifikace. Tato technika umožňuje kvantitativní vyhodnocení hladin mRNA v několika vzorcích. Stručně, mRNA ·· ···· je extrahována z tumoru a normální tkáně a cDNA je..........

připravena za použití standardních technik. PCR v reálném čase může být provedena například za použití přístroje Perkin Elmer/Applied Biosystms (Foster City, CA) 700 Prism. Primery a fluorescenční sondy mohou být sestrojeny pro zkoumané geny za použití například programu exprese primeru poskytovaného Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Optimální koncentrace primerů a sond může být stanovena odborníkem v oboru a řídící primery (např. βactin) a sondy mohou být získány komerčně, například od Perkin Elmer(Applied Biosystms (Foster Ctiy, CA). Ke kvantifikaci množství specifické RNA ve vzorku se vytváří standardní křivka za použití plazmidu obsahujícího zkoumaný gen. Standardní křivky mohoubýt vytvořeny za použití Ct hodnot stanovených PCR v reálném čase, které jsou podobné původní koncentraci cDNA použité při zkoušce. Standardní ředění jsou v rozsahu 10 až 10⁶ kopií zkoumaného genu jsou obecně dostatečné. Kromě toho je standardní křivka vytvořena pro řídící sekvenci. To umožňuje standardizaci původního obsahu RNA vzorku tkání na množství kontrolního vzorku pro účely srovnání.

Polynukleotidové varianty mohou být obecně.připraveny jakoukoli metodou známou v oboru, včetně chemické syntézy, například chemickou fosforamíditovou syntézou v pevné fázi. Modifikace polynukleotidové sekvence mohou být také zavedeny za použití standardních technik mutagenéze, jako je oligonukleotidově zaměřená místně specifické' mutagenéz® (viz Adelman et al, DNA 2: 183, 1983) . Alternativně mohou být molekuly RNA vytvořeny in vitro nebo in vivo transkripcí sekvence DNA kódující vaječníkový karcinomový antigen, jeho část, za předpokladu že DNA je zavedena do vektoru s vhodným RNA polymerázovým promotorem (jako je Z7 nebo SP6). Určité části mohou být použity k přípravě kódujícího polypeptidu, jak je zde popsán. Kromě toho nebo ·>

·· ·«·· ·· ·· alternativně může být. část..podávána..pacientovi, -takže kódovaný polypeptid je tvořen in vivo.

Část sekvence komplementární ke kódující sekvenci (tj. antimediátorový polynukleotid) může být také použita jako sonda nebo k modulaci exprese genu. Konstrukty cDNA, které mohou být transkribovány do antimediátorové RNA mohou být také zavedeny do buněk nebo tkání k usnadnění produkce antimediátorové RNA. Antimediátorový polynukleotid může být použit, jak je zde popsáno, k inhibici exprese vaječníkového karcinomového proteinu. Antimediátorové technologie může být použita k řízení exprese genu přes tvorbu trojité šroubovíce,· které usnadňuje schopnost dvojité šroubovice otevřít se dostatečně pro vázání polymeráz, transkripčních faktorů nebo regulátorových molekul (viz Gee et al., v Huber a Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co: (Mt. Kisco,. NY; 1994). Alternativně může být sestavena antimediátorové molekula k hybridizaci s řídící oblastí genu (např. promotor, zesilovač transkripce nebo iniciační místo transkripce) a blokování transkripce genu,· nebo k blokovánítranslace iniciování vazby transkriptu k ribozomům.

Jakýkoli polynukleotid může být dále modifikován ke zvýšení stability in vivo. Možné modifikace zahrnují, ale nejsou omezeny na, adici lemovací sekvence na 5'a/nebo 3' koncích; použití fosforothioatu nebo 2' O-methylových spíše než fosfodiesterázových vazeb na páteř; a/nebo inkluzi netradičních bází, jako je inosin, queosin a wybutosin, stejně jako acetylem, methylem, thi- a jinak modifikovaných forem adeninu, cytidinu, guaninu, thyminu a uridinu.

Nukleotidové sekvence zde popsané mohou být napojeny na různé jiné nukleotidové sekvence za použití známých rekombinantních technik pro DNA. Polynukleoid může být například klonován do různých klonovacích vektorů, zahrnuj ících p.l axmi dy,. fagomidy, . lambda fágové-deriváty a — kosmidy. Vektory zvláště zajímavé zahrnují expresivní vektory, replikační vektory, sondové vektory a sekvenční vektory. Obecně platí, že vektory budou obsahovat replikační místo funkční v alespoň jednom organismu, vhodné místa restrikční endonukleázy a jeden nebo více selektovatelných markérů. Jiné prvky budou záviset na požadovaném použití a jsou zřejmé odborníkovi v oboru.

V určitých provedeních mohou být sestrojeny polynukleotidy tak, aby umožňovaly vstup do buněk savců a expresi v nich. Tyto útvary jsou zvláště vhodné pro terapeutické účely, jak je popsáno dále. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že existuje mnoho cest k dosažení exprese polynukleotidu v cílové buňce a může být použita jakákoli vhodná metoda. Například může být polynukleotid zabudován do virových vektorů, jako jsou adenovirus, adenoasociovaný virus, retrovirus nebo virus kravských neštovic nebo jiné neštovicové viry (například ptačí neštovicový virus). Techniky začlenění DNA do těchto vektorů jsou dobře známé odborníkovi v oboru. Retrovirový vektor.může přídavně-. převádět nebo začleňovat gen pro selektovatelný markér (k pomoci při identifikaci nebo selekci transdukovaných buněk) a/nebo cílovou část, jako je gen, který kóduje ligand pro receptor na specifické cílové buňce, k vytvoření vektoru cílově specifického. Cílení může také být dosaženo způsoby známými odborníkům v oboru za použití protilátky.

Jiné kompozice pro terapeutické účely zahrnují koloidní disperzní systémy, jako jsou makromolekulární komplexy, nanokapsle, míkrokuličky, lože a lipozomy.

Výhodné koloidní systémy pro použití jako dávkovači vehikulum in vitro a in vivo jsou lipozomy (tj. umělé membránové měchýřky). Příprava a použití těchto systémů jsou dobře známé v oboru.

·· • · < · * · • · ·· · · • · ♦ · · · · ·· ·· ·* ·

Vaječníkové karcinomové polypeptidy

V kontextu tohoto vynálezu mohou polypeptidy obsahovat alespoň imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu nebo jeho varianty, jak je zde popsáno. Jak bylo uvedeno výše, určité vaječníkové karcinomové proteiny jsou vaječníkové karcinomové antigeny, které jsou produkovány expresí (exprimovány) v rakovinných vaječníkových buňkách a reagují detekovatelně v ímunozkouškách (jako je ELISA) s antiséry vytvářenými proti séru z imunodeficientních zvířat, kterým byl implantován vaječníkový tumor (nádor). Jiné Vaječníkové karcinomové proteiny jsou kódovány zde uvedenými vaječníkovýmí polynukleotidy. Zde.popsané - -polypeptidy mohou být jakékoli délky. Mohou být přítomny další sekvence odvozené od nativního proteinu a/nebo heterologní sekvence a tyto sekvence mohou (ale nemusí) vykazovat další imunogenní nebo antigenní vlastnosti.

Pojem „imunogenní část jak jezde použít, je část antigenu, která, je rozpoznávána (tj. specificky vázána) povrchovým antigenovým receptořém B-buněk a/nebo T-buněk. Tyto imunogenní části obecně zahrnují alespoň 5 aminokyselinových zbytků, výhodně alespoň 10 a zvláště výhodně alespoň 20 aminokyselinových zbytků vaječníkového karcinomového proteinu nebo jeho varianty. Výhodné imunogenní části jsou kódovány molekulami cDNA izolovanými zde popsanými způsoby. Další imunogenní části mohou být vytvořeny identicky za použití známých technik, jako jsou ty, které jsou shrnuty v Paul, Fundamental Immunology, 3. vydání, 243 - 247 (Raven Press, 1993) a zde uvedených odkazech. Tyto techniky zahrnují screeníng polypeptidů na jejich schopnost reagovat se specifickými protilátkami na vaječníkový karcinomový protein, antiséry a/nebo Tbuněčnými liniemi nebo klony. Antiséra a protilátky jsou ·· «· *· ·· »« ··*· • · « · · · · • · ·♦ « · · ······· · • · · · ···· ·· ·· ·· ·· „specifické na.vaječníkový. karcinomový protein, pokud se specificky vážou na vaječníkový karcinomový protein (tj. reagují s vaječníkovým karcinomovým proteinem v ELISA nebo jiných imunozouškách a nereagují detekovatelně s nepříbuznými proteiny). Tato antiséra, protilátky a T buňky mohou být připraveny_í jak je zde popsáno, a za použití dobře známých způsobů. Imunogenní část nativního vaječníkového proteinu je část, která reaguje s antiséry, protilátkami a/nebo T-buňkami na úrovni, která není podstatně menší než reaktivita polypeptidu o plné délce (např. v ELISA a/nebo zkoušce reaktivity T-buněk). Tyto imunogenní části mohou reagovat v těchto zkouškách na úrovních, které jsou obdobné nebo větší než reaktivita proteinu o plné délce. Tyto screeningové metody mohou být obecně provedeny za použití způsobů dobře známých odborníkovi v oboru, jako jsou metody popsané v Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Polypeptidy mohou být imobilizovány například na pevném nosiči a být kontaktovány se sérem pacienta k tomu, aby bylo dosaženo vazby protilátek se séry na imobiiizovaný polypeptid. Nenavázané sérum může být poté odstraněno a navázané protilátky mohou být detekovány za použití například ¹²⁵I-značeného proteinu A.

Jak je výše uvedeno, kompozice může obsahovat variantu nativního vaječníkového karcinomového proteinu. „Varianta polypeptidu, jak je zde označována, je polypeptid, který se odlišuje od nativního vaječníkového karcinomového proteinu jednou nebo více substitucemi, delecemi, adicemi a/nebo inzercemi tak, že imunogenita polypeptidu není podstatně omezena. Jinými slovy, schopnost varianty reagovat s antiséry specifickými na vaječníkový karcinomový protein může být zvýšena nebo nezměněna oproti reaktivitě nativního vaječníkového karcinomového proteinu, nebo může být snížena o méně než 50 % a výhodně o méně než 20 % oproti nativnímu ·· ···« ·· ·· ·· • ·· · · ·· · · * · • ··♦<►· · * · • · ··«·«·· · ···· «··· ·· ·· «· ·· vaječníkovému. proteinu... Tyto var .i anty mohoubýt: obecně' identifikovány modifikací jedné ze sekvencí výše uvedeného polypeptidu a vyhodnocením reaktivity modifikovaného polypeptidu s antiséry nebo s protilátkami specifickými na vaječníkový karcinomový protein, jak jsou zde popsány. Výhodné varianty zahrnují ty, kde jedna nebo více částí, jako je N-terminální vedoucí sekvence nebo transmembránová doména, byly odstraněny. Jiné výhodné varianty zahrnují varianty, kde malá část (například 1 až 30 aminokyselin, výhodně 5 až 15 aminokyselin) byla odstraněna z N- a/nebo C-terminálu zralého proteinu.

Polypeptidové varianty vykazují alespoň asi 70%, výhodně alespoň asi 90% a nejvýhodněji alespoň asi.. 9.5% .

identitu s nativním polypeptidem. Výhodně varianta obsahuje konzervativní substituce. „Konzervativní substituce je ta, ve které je nahrazena aminokyselina jinou aminokyselinou, která má obdobné vlastnosti, takže odborník v oboru chemie peptidů by mohl očekávat, že není podstatně změněna sekundární struktura a hydropatická povaha peptidu. Aminokyselinové substituce mohou být.obecně provedeny na bázi podobnosti polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobity, hydrofility a/nebo amfipatické povahy zbytků. Například negativně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu asparagovou a glutamovou; pozitivně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin; aminokyseliny s nenabitými polárními skupinami mající obdobné hodnoty hydrofility zahrnují leucin, isoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; a serin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Jiné skupiny aminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny, zahrnují: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, íle, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; a (5) phe, tyr, trp, his. Varianty mohou také nebo alternativně obsahovat nekonzervativní změny. Varianty mohou být také »«»· «« ·· • · · 4 • · ·· »···«··« (nebo alternativně) modifikovány napří klad-delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na imunogenitu, sekundární strukturu a hydropatickou povahu polypeptidu.

Jak bylo uvedeno výše, polypeptidy mohou obsahovat signální (nebo vedoucí) sekvenci na N-terminálním konci proteinu, která může kotranslačně nebo posttranslačně vést transfer proteinu. Polypeptidy mohou být také konjugovány na linker nebo jinou sekvenci pro usnadnění syntézy, přečištění nebo identifikaci polypeptidu (např. poly-His) ke zlepšení vazby polypeptidu na pevný nosič. Polypeptid může být konjugován například na Fc oblast imunoglobulinu.

Polypeptidy mohou být připraveny za použití jakékoli z množství dobře známých technik. Výše uvedené . ..

rekombinantní polypeptidy kódované sekvencemi DNA mohou být snadno připraveny ze sekvencí DNA za použití jakéhokoli z různých expresívních vektorů známých odborníkovi v oboru. Exprese může být dosaženo v jakékoli vhodné hostitelské buňce, která byla transfektována nebo transformována expresívním vektorem obsahujícím molekulu DNA, která kóduje rekombinantní polypeptid. Vhodné hostitelské buňky zahrnují buňky prokarytické, kvasinkové nebo buňky vyšších eukaryotů. Výhodně jsou použitými buňkami' E. coli, kvasinky nebo savčí buněčné linie, jako jsou COS nebo CHO. Supernatanty z vhodných hostítelských/vektorových systémů, které vylučují rekombinantní protein nebo polypeptid do kultivačního media, mohou být nejprve zakoncentrovány za použití komerčně dostupného filtru. Po koncentraci může být koncentrát nanesen na vhodnou purifikační matrici, jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Nakonec může být k dalšímu přečištění rekombinantního polypeptidu použito jedné nebo více HPLC s reverzní fází.

• · ·«*« ·· <· ·· • · · ··«· » · • · · · ·· < * • · · ········ • * · · « ·· ·Λ «·

Části nebo jiné varianty, mající méně než -asi .100 “ ~ aminokyselin a obecně méně než asi 50 aminokyselin mohou být také vytvořeny prostřednictvím syntézy za použití technik dobře známých odborníkovi v oboru. Tyto polypeptidy mohou být například syntetizovány za použití jakékoli komerčně dostupné techniky na pevné fázi, jako je Merrifieldova metoda na pevné fázi, kde aminokyseliny jsou postupně přidávány k narůstajícímu aminokyselinovému řetězci. Viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2146, 1963. Zařízení pro automatickou syntézu polypeptidů jsou komerčně dostupná od výrobců, jako je Applied BioSystems, lne. (Foser City, CA) a mohou být použita podle instrukcí výrobce.

V rámci specifických provedení může být polypeptidem fúzní protein, ‘ který zahrnuje řadu polypeptidů, jak je-zde popsáno, nebo zahrnuje jeden polypeptid, jak je zde popsán, a známý nádorový antigen, jako je vaječníkový karcinomový protein nebo varianty tohoto proteinu.. Fúzní partner může například asistovat při poskytování „T helperových epitopu (imunologický fúzní partner),výhodně Thelperových epitopů rozpoznávaných člověkem, nebo může asistovat při expresi proteinu (enhancer - zesilovač exprese) s vyššími výtěžky, než nativní rekombinantní protein. Určití výhodní fúzní partneři jsou jak imunologičtí, tak expresí zvyšující fúzní partneři. Jiní fúzní partneři mohou být vybráni tak, že zvyšují rozpustnost proteinu nebo umožňují zacílení proteinu na požadované intracelulární složky. Další fúzní partneři zahrnují afinítní markéry, které usnadňují purifikaci proteinu.

Fúzní proteiny mohu být obecně připraveny za použití standardních způsobů zahrnujících chemickou konjugaci. Výhodně je fúzní protein připravován expresí jako rekombinantní protein, což umožňuje produkci v expresním systému na vyšší úrovni oproti nefúznímu proteinu.

·· ·« ·» ·· ·· • · · * ♦ · · · · « * · · · *» t · ·

Zkráceně, sekvence DNA kódující polypeptidové složky-mohou' být uspořádány odděleně a ligovány (navázány) na vhodný expresívní vektor. 3' konec sekvence DNA kódující polypeptidovou složku je navázán . s nebo bez peptidového spojovníku (linkeru) na 5' konec sekvence DNA kódující druhou polypeptidovou složku tak, že čtecí rámce sekvencí jsou ve fázi. To umožňuje translaci do jednoho fúzního proteinu, kde zůstává biologická aktivita obou složek polypeptidů.

Sekvence peptidového linkeru může být použita k oddělení první a druhé polypeptidové složky na vzdálenost dostatečnou k zajištění toho, že každý polypeptid bude složen do své sekundární a terciární struktury. Tato sekvence peptidového linkeru je začleněna do fúzního proteinu za použití standardních technik dobře známých v oboru. Vhodné sekvence peptidového linkeru mohou být vybrány na základě následujících faktorů: (1) jejich schopnost adaptace na flexibilně rozšířenou konformaci; (2) jejich neschopnost se přizpůsobit sekundární struktuře, která by mohla interagovat s funkčními epitopy na prvním a druhém polypeptidů; a (3) ztráta hydrofilních nebo nabitých zbytků, které mohou reagovat s polypeptídovými funkčními epitopy. Výhodné sekvence peptidového linkeru obsahují zbytky Gly, Asn a Ser. Jako sekvence linkeru mohou být použity jiné téměř neutrální aminokyseliny, jako je Thr a Ala. Aminokyselinové sekvence, které mohou být vhodně použity jako linkery, zahrnují ty popsané v Maratea et al., Gene 40: 39 - 46, 11985; Murphy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8259 - 8262. 1986; US patent č. 4935333 a US patent č. 4751180. Sekvence linkeru mohou mít obecně délku od 1 do asi 50 aminokyselin. Sekvence linkeru nejsou nutné, když první a druhý polypeptid mají neesenciální N-koncovou aminokyselinovou oblast, která může být použita k oddělení funkčních domén a k prevenci sférické interference.

-Λ „Λ

• · · • · · • · · · ·· ·· • < · · • · • · · · · • · · 09 ·

Ligované sekvence.DNA jsou operabilně· navázány na vhodné transkripční nebo translační prvky. Regulační prvky odpovědné za expresi DNA jsou umístěny pouze v části 5' na DNA sekvenci kódující první polypeptid. Obdobně stop kodony požadované pro konec translace a transkripční uvolňovací (terminační) signály jsou pouze na 3' části DNA sekvence kódující druhý polypeptid.

Také jsou poskytovány fúzní proteiny, které zahrnují polypeptid podle tohoto vynálezu spolu s nepříbuzným imunogenním proteinem. Výhodně je imunogenní protein schopen zajistit zpětnou odezvu. Příklady těchto proteinů zahrnují proteiny tetanu, tuberkulózy a hepatitidy (viz např. Stoute et al. New Engl. J. Med., 336 : 86 - 91,

1997).

V rámci výhodných provedení je imunologický fúzní partner odvozen od proteinu D, povrchového proteinu gram negativní bakterie Haemophílus ínfluenza B (WO 91/18926). Výhodně obsahuje derivát proteinu D přibližně první třetinu proteinu (např. prvních 100 až 110 N-terminálních aminokyselin) a derivát proteinu D může být lipidovánl

V určitých výhodných provedeních je zahrnuto prvních 109 zbytků fúzního partnera lipoproteinu D do N-terminálu k poskytnutí polypeptidu s dalšími exogenními epitopy Tbuněk a ke zvýšení hladin exprese v E. coli (tímto fungující jako zesilovač exprese). Lipidický konec zajišťuje optimální prezentaci antigenů na buňku poskytující antigen. Jiní fúzní partneři zahrnují nestrukturální protein z viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Typicky je užito 81 N-terminálních aminokyselin, přestože je možno použít i různé fragmenty, které zahrnují Thelperové epitopy.

V jiných provedeních je imunologický fúzní partner protein známý jako LYTA nebo jeho část (výhodně C• · · · terminální část).. LYTA je- odvozen od Streptococcus * pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu, známou jako Tyta amidáza (kódovaná LytA genem; Gene 43: 265 - 292, 1986). SYTÁ je autolysin, který specificky degraduje určité vazby v peptidoglykanové kostře. C-terminálni doména LYTA proteinu je odpovědná za afinitu k cholinu nebo určitým analogům cholinu, jako je DEAE. Tyto vlastnosti byly použity pro vytvoření E. coli C-LYTA expresivních plazmidů užitečných pro expresi fúzních proteinů.

Přečištění hybridních proteinů obsahujících fragment C-LYTA na aminokonci bylo popsáno, viz Biotechno.logy 10: 7 95 798, 1992). Ve výhodném provedení může být do fúzního proteinu začleněna repetiční část LYTA. Repetiční část se nachází v C-termináiní oblasti, počínaje od zbytku 178. Zvláště výhodné repetiční části zahrnují zbytky 188 až 305.

Obecně platí, že polypeptidy (včetně fúzních proteinů) a polynukleotidy, jak jsou zde popsány, se izolují. „Izolovaný polypeptid nebo polynukleotid je ten, který je vyňat ze svého původního prostředí. Například přírodně se vyskytující protein je izolován, pokud je oddělen od některých nebo od všech koexistujících.látek v přirozeném systému. Výhodně mají tyto polypeptidy čistotu alespoň asi 90 %, zvláště výhodně alespoň asi 95 % a nejvýhodněji čistotu alespoň asi 99 %. Polynukleotid je považován za izolovaný, pokud je například nakloňován do vektoru, který není částí jeho přirozeného prostředí.

Vazebná činidla

Tento vynález dále poskytuje činidla, jako jsou protilátky a jejich fragmenty vázající antigen, které se specificky vážou na vaječníkový karcinomový protein. Protilátka nebo její fragment vázající antigen, jak jsou zde označeny, jsou označeny za „specificky se vázající na • ·

vaječníkový karcinomový protein, pokud reagují na -- detekovatelné úrovni (například ELISA) s vaječníkovým karcinomovým proteinem a nereagují detekovatelně s nepříbuznými proteiny za obdobných podmínek. Pojem „vázání nebo „vazba, jak je zde použit, označuje nekovalentní spojení mezi dvěmi separátními molekulami tak, že je tvořen „komplex. Schopnost se vázat může být zjištěna například stanovením vazebných konstant pro tvorbu komplexu. Vazebná konstanta je hodnota získaná, když koncentrace komplexu je dělena koncentracemi složek produktu. Obecně platí, že v kontextu tohoto vynálezu se o dvou sloučeninách tvrdí, že se „vážou, pokud vazebná konstanta pro tvorbu komplexu přesahuje asi 10³ 1/mol. Vazebná konstanta může být stanovena způsoby dobře známými v oboru.

Vazebná činidla mohou být dále schopna rozlišení mezi pacienty s rakovinou a bez rakoviny, jako je rakovina vaječníků, za použití zde představených reprezentativních zkoušek. Jinými slovy, protilátky nebo jejich vazebná činidla, která se vážou na vaječníkový karcinomový antígen, budou obecně signálem indikujícím přítomnost rakoviny u alespoň asi 20 % pacientů s touto chorobou a budou obecně negativním signálem indikující nepřítomnost této choroby u alespoň asi 90 % jedinců bez rakoviny. Ke stanovení, zda vazebná činidla vyhovují těmto požadavkům, mohou být zkoušeny vzorky (například krev, sérum leukophoresis, moč a/nebo tumorové biopsie) od pacientů s a bez rakoviny (jak bylo stanoveno za použití standardních klinických testů) zde popsaným způsobem na přítomnost polypeptidů, které vážou vazebné činidlo. Je zřejmé, že by mělo být zkoušeno statisticky významné množství vzorků s a bez této choroby. Každé vazebné činidlo by mělo vyhovovat následujícím kritériím; avšak odborníci v oboru vědí, že vazebná činidla mohou být použita v kombinaci ke zlepšení citlivostí.

i·

Vazebným, činidlem může být-jakékoli činidlo, které ' splňuje výše uvedené požadavky. Vazebným činidlem může být například ribozom s nebo bez peptidové složky, molekula RNA nebo polypeptid. Ve výhodném provedení je vazebným činidlem protilátka nebo její fragment vázající antigen. Protilátky mohou být připraveny jakoukoli ze škály technik známých odborníkovi v oboru. Víz např. Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Obecně platí, že protilátky mohou být produkovány technikami využívajícími buněčné kultury včetně tvorby monoklonálních protilátek, jak je zde popsána, nebo přes transfekci protilátkových genů do vhodné hostitelské bakteriální nebo savčí buňky k dosažení produkce rekofnbinantních protilátek. V jednom způsobu je imunogen zahrnující polypeptid nejprve irijektován do jednoho z řady savců (např. myši, krysy, králíci, ovce nebo kozy). V tomto kroku mohou polypeptidy podle tohoto vynálezu sloužit jako imunogen bez další modifikace. Alternativně, zvláště pro relativně krátké polypeptidy, může být výrazné imunitní odezvy dosaženo, pokud je polypeptid napojen na nosičový protein, jako je hovězí sérový albumin nebo klíčový hemokyanin (keyhole limpet hemocyanin). Imunogen je injektován do zvířecích hostitelů, výhodně podle předem stanoveného rozvrhu aplikace druhé imunizace a krev je zvířatům periodicky odebírána. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid mohou být poté přečištěny od antisér například afinitní chromatografií za použití polypeptidu navázaného na vhodný pevný nosič.

Monoklonální protilátky specifické pro konkrétní antigenní polypeptid mohou být připraveny například za použití techniky uvedené v Kohler a Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 - 519, 1976 a jejích vylepšení. Zkráceně, tyto metody zahrnují přípravu imortalizovaných buněčných linií schopných produkce protilátek majících požadovanou • · • · · · specifiku, .(t j reaktivitu s požadovaným polypeptidem) . Tyto buněčné linie mohou být získány například ze slezínných buněk získaných ze zvířete imunizovaného výše popsaným způsobem. Slezinné buňky jsou poté imortalizovány například fúzí s myelomovými buňkami fúzního partnera, výhodně syngenického s imunizovaným zvířetem. Může být použito řady fúzních technik. Například mohou být slezinné buňky a myelomové buňky kombinovány s neionogenním detergentem po dobu několika minut a poté naneseny při nízké hustotě na selektivní médium, které podporuje růst hybridních buněk ale ne myelomových buněk. Výhodné selekční techniky užívají HAT (hypoxantin, aminopterin, thymidin) selekci. Po dostatečném čase, obvykle asi 1 až 2 týdnech, se získájí kolonie hybridů. Jednotlivé kolonie jsou vybrány a jejich kultivační supernatanty jsou testovány na vazebnou aktivitu proti polypeptidu. Hybridomy mající vysokou reaktivitu jsou zvláště výhodné.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány ze supernatantů rostoucích hybridomových kolonií. Kromě toho mohou být použity ke zvýšení výtěžnosti- ......různé techniky, jako je injekce hybridomových buněčných linií do peritoneální dutiny vhodného obratlovce, jako je myš. Monoklonální protilátky jsou poté získány z ascitové kapalíny nebo z krve. Kontaminanty mohou být odstraněny z protilátek konvenčními technikami, jako je chromatografie, gelová filtrace, precipitece a extrakce. Polypeptidy podle vynálezu mohou být použity při procesu přečištění například v kroku afinitní chromatografie.

V rámci určitých provedení může být výhodné použití fragmentů protilátek vázajících antigen. Tyto fragmenty zahrnují FAB fragmenty, které mohou být připraveny za použití standardních technik. Zkráceně, imunoglobuliny mohou být přečištěny z králičího séra afinitní chromatografií na kolonách s ložem proteinu A (Harlow a • · · ·

·· ··

Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, 1988) a rozloženy papainem za vniku Fab a Fc fragmentů. Fragmenty Fab a Fc mohou být odděleny afinitni chromatografií na kolonách ložem s proteinem A.

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou být navázány na jedno nebo více terapeutických činidel. Vhodná činidla v tomto ohledu zahrnují radionuklidy, látky vyvolávající diferenciaci, léčiva, toxiny a jejich deriváty. Výhodné radionuklidy zahrnují ⁹⁰Y, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At a ²¹²Bi. Výhodná léčiva zahrnují methotrexat a pyrimidinové a pyrinové analogy. Výhodné látky vyvolávající diferenciaci zahrnují kyselinu máselnou a estery forbolu. Výhodné toxiny zahrnují ricin, abrin, toxin. difterie, toxín cholery, gelonin, exotoxin Pseudomonas, toxín Shigella a antivirový protein líčidla amerického.

Terapeutické činidlo může být napojeno (například kovalentně navázáno) na vhodnou monoklonální protilátku buď přímo nebo nepřímo (např. prostřednictvím linkerové (spojovníkové) skupiny). Přímá reakce mezi činidlem a protilátkou je možná, pokud každá z těchto látek vykazuje vzájemně reagující substituenty. Například nukleofilní skupina, jako je animoskupina nebo sulfhydrylová skupina, na jednom z nich může být schopna reakce se skupinou obsahující karbonyl, jako je anhydrid a halid kyseliny nebo a alkylovou skupinou obsahující dobrou odstupující skupinu (například halid) na druhém.

Alternativně může být žádoucí napojit terapeutické činidlo a protilátku přes skupinu linkeru. Linkerová skupina může působit jako oddělovač k vytvoření určité vzdálenosti protilátky od činidla za účelem zabránění interference s částmi schopnými vazby. Linkerová skupina může také sloužit ke zvýšení chemické reaktivity substituentu na činidle nebo protilátce a tak zvyšovat &

účinnost napojení.. Zvýšení-chemické- reaktivity můžetaké usnadňovat použití činidel nebo funkčních skupin činidla, které by jinak nebylo možné.

Pro odborníka v oboru je zřejmé, že jako línkerová skupina může být použita řada bifunkčních nebo polyfunkčních činidel, jak homo-, tak heterofunkčních (jako jsou ta popsaná v katalogu Pierce Chemical Co., Rockford,

IL).Činidla pro napojení mohou působit například přes aminoskupiny, karboxylové skupiny, sulfhydrylové skupiny nebo oxidované uhlovodíkové zbytky. Existuje řada odkazů popisujících tuto metodu, např. US patent č. 4671958 (Rodwell et al.).

Tam, kde., jo terapeutické činidlo silnější pokud je uvolněno z části protilátky· imunokonjugátu podle tohoto vynálezu, může být žádoucí použít linkerovou skupinu, která je štěpitelná během nebo po internalizaci do buňky. Bylo popsáno mnoho štěpitelných linkerových skupin. Mechanismus intracelulárního uvolnění činidla z těchto linkerových skupin zahrnuje štěpení redukcí disulfidické vazby (např.

US patent č. 4489710 (Spitler)), nabuzením fotolabilní vazby (např. US patent č. 4625014 (Senter et al.)), hydrolýzou derivatizovaných aminokyselinových postranních řetězců (např. US patent č. 4638045 (Kohn et al.)) hydrolýzou zprostředkovanou sérovým komplementem (např. US patent č 4671958 (Rodwell et al.)) a hydrolýzou katalyzovanou kyselinou (např. US patent č 459789 (Blattler et al.)) hydrolýzou derivatizovaných aminokyselinových bočních řetězců (např. US patent č. 4638045 (Kohn a kol.), sérovým komplementem zprostředkovanou hydrolýzou (např. US patent č 4671958 (Rodwell a kol.) a kysele katalyzovanou hydrolýzou (např. US patent č. 4569789 (Blattler a kol.).

Může být žádoucí navázat na protilátku více než jedno činidlo. V jednom provedení se váže na jednu molekulu • · · ·

- 49 - ·*·· ··*· ·· ·· ·· protilátky vice_ molekul činidla.- -V jiném -provedení může'být na jednu protilátku navázán více než jeden typ činidla. Bez ohledu na konkrétní provedení mohou být imunokonjugáty s jedním nebo více činidly připraveny různými způsoby. Například může být navázáno více než jedno činidlo přímo na molekulu protilátky, nebo může být použito linkeru, který poskytuje více míst pro připojení. Alternativně může být použito nosiče.

Nosič může nést činidla řadou způsobů, včetně kovalentní vazby přímo nebo přes skupinu linkeru. Vhodné nosiče zahrnují proteiny, jako jsou albuminy (např. US patent č. 4507234 (Kato a kol.), peptidy a polysacharidy, jako je aminodextran (např. US patent č. 4699784 (Shih a kol.). Nosič může také nést činidlo nekovalentní vazbou nebo pomocí zapouzdření, jako.v lipozomových vezikulách (např. US patent č. 4429008 a 4873088). Nosiče specifické pro radionuklidová činidla zahrnují radiohalogenované malé molekuly a chelatační činidla. Například US patent č. 4735792 popisuje reprezentativní radiohalogenované malé molekuly a jejich syntézu....Radionuklidový chelát může být vytvořen z chelatačních sloučenin, které zahrnují ty, které obsahují atomy dusíku a síry jako donorové atomy pro vazbu kovu nebo oxidu kovu radionuklidu. Například US patent č. 4673562 (Davison a kol.) popisuje reprezentativní chelatační sloučeniny a jejich syntézu.

Pro podávání protilátek může být použita celá řada způsobů podávání. Typické bude podávání intravenózní, intramuskulární, subkutánní nebo v loži resekovaného nádoru. Je zřejmé, že přesné dávkování protilátky/imunokonjugátu se bude lišit v závislosti na použité protilátce, antigenové hustotě na tumoru a rychlosti rozkladu protilátky.

♦ · ·

Tento vynález také poskytuje anti-idiotypické protilátky, které napodobují imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu. Tyto protilátky mohou být vytvořeny proti protilátce, jejím fragmentu vázajícímu antigen, které se specificky vážou na imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu za použití dobře známých způsobu. Anti-idiotypické protilátky, které napodobují imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu jsou ty protilátky, které se vážou na protilátku nebo její fragment vázající antigen, které se specificky vážou·na imunogenní část vaječníkového karcinomového proteinu, jak je zde popsán.

T buňky

Imunoterapeutické kompozice mohou také nebo v alternativním provedení obsahovat T buňky specifické pro vaječníkový karcinomový protein. Tyto buňky mohou být obecně připraveny in vivo nebo ex vivo za použití standardních procedur. T buňky mohou být napřiklad přítomny , nebo izolovány z kostní dřeně nebo periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve savce jako pacienta, nebo za použití komerčně dostupných systémů separace buněk, jako je systém CEPRATE™, dostupný u CellPro lne., Bothell WA (víz také US patent č. 5240856; US patent č. 5215936; WO 89/06280; WO 91./16116 a WO 92/07243). Alternativně mohou být T buňky odvozeny od příbuzných nebo nepříbuzných lidí, zvířat, buněčných linií nebo kultur.

T buňky mohou být stimulovány vaječníkovým karcínomovým polypeptídem, polynukleotidem kódujícím vaječníkový karcinomový polypeptid a/nebo buňkou poskytující antigen (APC), která produkuje tento polypeptid expresí. Tato stimulace je prováděna za vhodných podmínek a po dobu dostatečnou k dosažení tvorby T buněk, které jsou specifické pro polypeptid. Výhodně je přítomen vaječníkový

I- • · · · £7-1 « » «·· ·*·*· karcinomový polypeptid nebo. polynukleotid-v dodávacím vehikulu, jako je mikrokulička, k usnadnění tvorby specifických T buněk.

T buňky jsou považovány za specifické pro vaječníkový karcinomový polypeptid, pokud T buňky zabíjí cílové buňky s povlakem vaječníkového karcinomového polypeptidu nebo produkující gen kódující tento polypeptid. Specifita T buněk může být stanovena za použití různých standardních technik. Například při zkoušce uvolňování chrómu nebo zkoušce proliferace index stimulace dvakrát větší u lýzy a/nebo proliferace ve srovnání s negativním kontrolním stanovením indikuje specifitu T buněk. Tyto zkoušky mohou být provedeny například způsobem popsaným v Chen et. al.., . .. Cancér Řes. 54: 1065 - 1070, 1994. Alternativně může být detekce prolifereace T buněk provedena různými známými technikami. Například proliferace T buněk může být stanovena měřením zvýšené rychlosti syntézy DNA např. pulzně značených kultur. T buněk s tritiovaným thymidinem a měřením množství tritiovaného thymidinu začleněného do DNA . Kontakt s vaječníkovým karcinomovým.polypeptidem (200 ng/ml až 100 pg/ml, výhodně 100 g/ml až 25 pg/ml) po dobu 3 až 7 dnů by měl mít za následek alespoň dvojnásobný nárůst proliferace T buněk a/nebo výše uvedený kontakt po dobu 2 až 3 hodiny by měl mít za následek aktivací T buněk měřenou za použití standardních cytokinových zkoušek, kde dvojnásobné zvýšení hladiny uvolňování cytokinu (např. TNF nebo IFN-γ) je indikátorem aktivace T buněk (víz Coligan et al., Current Protocols· in Immunology), sv. 1, Viley Interscience (Greene 1998)). T buňky, které byly aktivovány v odezvě na vaječníkový karcinomový polypeptid, polynukleotid nebo APC exprimující vaječníkový karcinomový polypeptid, mohou být CD4⁺ a/nebo CD8⁺. T buňky specifické k vaječníkovému karcinomovému polypeptidu mohou být expandovány za použití standardních technik. Ve výhodném &

• · · ·

provedení jsou T buňky .odvozeny od pacienta nebo příbuzných nebo nepříbuzných dárců a jsou podávány pacientovi po stimulaci a expanzi.

Pro terapeutické účely CD4⁺ a/nebo CD8⁺ T buňky, které proliferují v odezvě na vaječníkový karcinomový polypeptid, polynukleotid nebo APC, mohou být expandovány in vitro nebo in vivo. Proliferace těchto T buněk in vitro může být provedena různými způsoby. T buňky mohou být například znovu vystaveny působení vaječníkového karcinomového polypeptidů s nebo bez přídavku růstových faktorů T buněk, jako je interleukin-2, a/nebo stimulátorů buněk, které syntetizuji vaječníkový karcinomový polypeptid. Alternativně může být jedna nebo vlče..T .buněk,. . které proliferují v přítomnosti vaječníkového karcinomového polypeptidů, expandována co do množství klonováním. Metody pro klonování buněk jsou dobře známé v oboru a zahrnují limitující zředění. Po expanzi mohou být buňky podávány zpět pacientovi, jak je popsáno například v Chang et al., Crit. Rev. Cncol. Hematol. 22: 213, 1996.

Farmaceutické kompožice a vakcíny

V dalším aspektu vynálezu mohou být zde uvedené polypeptidy, polynukleotidy, vazebná činidla a/nebo buňky imunitního systému začleněny do farmaceutických kompozic a vakcín. Farmaceutické kompozice obsahují jednu nebo více těchto sloučenin nebo buněk a fyziologicky přijatelný nosič. Vakcíny mohou obsahovat jednu nebo více těchto sloučenin nebo buněk a zesilovač nespecifické imunitní odezvy. Zesilovačem nespecifické imunitní odezvy může být jakákoli látka, která zvyšuje imunitní odezvu na exogenní antigen. Příklady zesilovačů nespecifické imunitní odezvy zahrnují adjuvans, biodegradovatelné mikrokuličky a lipozomy (do nichž je sloučenina začleněna; víz např.

Μ Λ

Fullerton, US patent č. 4235877). Příprava-vakcíny je obecně popsána například v M. F. Powell a M. J, Newman, eds., „Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), Plenům Press (NY, 1995). Farmaceutické kompozice a vakcíny spadající do rozsahu tohoto vynálezu mohou také obsahovat jiné sloučeniny, které mohou být biologicky aktivní nebo inaktivní. Může být přítomna například jedna nebo více imunogenních části jiného nádorového antigenů, ať už začleněných do fúzního polypeptidu, nebo jako separátní sloučenina v kompozici nebo vakcíně.

Farmaceutická kompozice nebo vakcína může obsahovat DNA kódující jeden nebo více polypeptidů, jak jsou výše popsány, takže polypeptid je vytvořen in šitu. Jak je , uvedeno výše, DNA může být přítomna v jakémkoli z řady dodávacich systémů známých odborníkovi v oboru, které zahrnují systémy exprese nukleové kyseliny a bakteriální a virové expresní systémy. Vhodné expresívní systémy pro nukleovou kyselinu obsahují sekvence DNA nezbytné pro expresi v pacientovi (jako jsou vhodné promotory a terminační signály). Bakteriální dodávací systémy zahrnují podávání bakterií (jako je Bacillus-Calmette-Guerin), které expresí vytváří imunogenní část polypeptidu na povrchu buňky. Ve výhodném provedení může být DNA zavedena za použití virových expresívních systémů (např. vir kravských neštovic nebo jiný vir neštovic, retrovirus nebo adenovirus), které mohou zahrnovat použití nepatogenního (defektního) replikačního kompetentního viru. Vhodné systémy jsou popsány například v Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317 - 321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 - 103, 1989, Flexner et al., Vaccine 8: 17 - 21, 1990; US patent č. 4603112, 4769330 a 5017487; WO 89/01973; US patent č. 4777127; GB 2200651; EP0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616 - 627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431 - 434, 1991; Kolls et

• « - > ·· · · ♦ * * «··· ···· »· ·· ·· al., PNA 91: 215 - 219, 1994;.....Kass—Eisler. etal., PNAS 90: 11498 - 11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 21838 2848, 1993; a Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202 -1207;

1993. Způsoby začlenění DNA do těchto expresívních systémů jsou dobře známé odborníkovi v obou. DNA může být také „odkryta, jak je například popsáno v Ulmer et al., Science 259: 1745 - 1749, 1993 a v Cohen, Science 259: 1691 - 1692, 1993. Příjem odkryté DNA může být zvýšen zavedením DNA na biodegradovatelná lože, která jsou účinně transportována do buněk.

Přestože pro použití ve farmaceutických kompozicích podle vynálezu mohou být použity jakékoli vhodné nosiče známé odborníkovi v oboru, typ nosiče bude záviset na způsobu podávání. Kompozice podle tohoto vynálezu mohou být Vytvořeny pro jakýkoli vhodný způsob podávání, zahrnující například topické, orální, nazální, intravenózní, intrakraniální, intraperitoneální, subkutánní nebo intramuskulární podávání. Pro parenterální podávání, jako je podávání subkutánními injekcemi, je nosičem výhodně voda, fyziologický roztok, alkohol, tuk, vosk nebo pufr......

Pro orální podávání může být použito jakéhokoli z výše uvedených nosičů nebo pevných nosičů, jako je mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sodná sůl sacharinu, mastek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Jako nosiče pro farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být také použity biodegradovatelné mikrokuličky (např. polyglykolatpolylaktat). Vhodné biodegradovatelné mikrokuličky jsou použity například v US patentech č. 4897268 a 5075109.

Tyto kompozice mohou také obsahovat pufry (například neutrálně pufrovaný fyziologický roztok nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), uhlovodíky (například glukóza, mannóza, sacharóza nebo dextrany), mannitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny, jako je glycin,

• · ·· *> · * »· ·· « · · · · * · · * ·· cc ······

- 05 - ···· ···· ·· ·» antioxidanty, chelatační. činidla,...jako jeEDTA nebo glutathion, adjuvans (např. hydroxid hlinitý) a/nebo konzervovadla. Alternativně mohou být kompozice podle tohoto vynálezu vytvořeny jako lyofilizáty. Sloučeniny mohou být zapouzdřeny v lipozomech za použití dobře známé technologie.

Ve vakcínách podle tohoto vynálezu může být použito jakéhokoliv z řady zesilovačů nespecifické imunitní odezvy. Například může být začleněno adjuvans. Většina adjuvans obsahuje látky určené k ochraně antigenu před rychlým katabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a stimulátor imunitní odezvy, jako je tuk A, od Rotradella pertussis nebo Mycobacterium ťube.rculosiš odvozené proteiny. Vhodná vehikula jsou komerčně dostupná například jako Freundovo nekompletní adjuvans (Freunďs Incomplete Adjúvant) a kompletní adjuvans (Complete Adjuvant) (Difco Laboratories, Detroit, MI), Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ), kamenec, biodegradovatelné . mikrokuličky, monofosforylový tuk A. a quil A. Jako adjuvans může být použito i cytokinů, jako je GM-CSF nebo .......

interleukin-2, -7 nebo -12.

Ve zde uvedených vakcínách je složení adjuvans výhodně provedeno tak, aby indukovalo Imunitní odpověď převážně typu Thl. Vysoké hladiny cytokinů typu Th-1 (např. IFN-γ, IL-2 a IL-12) mají tendencí podporovat indukci imunitních odezev na podávaný antigen zprostředkovaných buňkami. Naproti tomu vysoké hladiny cytokinů typu Th-2 (např. IL-4, TL-5, IL-6, IL-10 a TNF-β) mají tendenci preferovat indukci hormonálních imunitních odezev. Po aplikace zde uvedené vakciny bude pacient vykazovat imunitní odezvu, která zahrnuje typ odezev Thl a Th2. Ve výhodném provedení, kde odezva je převážně typu Th-1, bude zvýšena hladina cytokinů typu Th-1 do větší míry, než hladina cytokinů typu Th2.

·· ·· • · · ·

• · ···· ·«··

Hladiny těchto cytok inů mohou být -snadno- stanoveny za - --použití standardních zkoušek. Pro informace o těchto rodinách cytokínů viz Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 144 - 173, 1989.

Výhodnými adjuvans pro použití při vyvolání odezvy převážně typu Thl jsou například kombinace monofosforylového tuku A, výhodně 3-de-0-acylovaného monofosforylového tuku A (3D-MPL) spolu s hlinitými solemi. Vehikula MPL jsou dostupná u Ribi ImmunolChem Reesearch lne. (Hamilton, Mt; viz US patenty č. 4436727, 4877611; 4866034 a 4912094). Výhodné je také AS-2 (SmithKline Beecham). Oligonukleotídy obsahující CpG (kde CpG dinukleotid není methylovaný) také vyvolávají převážně odezvu Thl. Tyto oligonukleotídy jsou velmi známé a jsou popsané například ve WO96/02555. Jiné výhodné adjuvans je saponin, výhodně QS21, který může být použit samostatně nebo v kombinaci s jiným adjuvans. Vylepšené systémy například zahrnují kombinaci monofosforylového tuku A a derivátu saponinu, jako je kombinace QS21 a 3D-MPL, jak je popsána ve WO 94/00153 nebo slaběji, reagující kompozice,kde reaktivita QS21 je oslabena cholesterolem, jak je popsáno ve WO 96/33739. Jiné výhodné směsi zahrnují emulze olej ve vodě a tokoferol. Zvláště silná kompozice adjuvans zahrnující QS21,3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě je popsána ve WO 95/17210. Jakákoli zde popsaná vakcína může být připravena za použití dobře známých metod, které dávají kombinaci antigenu, zesilovače imunitní odezvy a vhodného nosiče nebo vehikula.

Zde popsané kompozice mohou být podávány jako část kombinace se zpomaleným uvolňováním (tj. kompozice, jako je kapsle nebo houbovitá forma, které mají za důsledek pomalé uvolňování sloučeniny po podávání). Tyto kompozice mohou být obecně připraveny za použití dobře známých technologií a podávány například orálně, rektálně nebo subkutánní ř ♦ * * * ♦ · * • » · »

-.9 · '* ·«·· ···· ·· implantací nebo implantací. na-požadované cílové místo. Kompozice se zpomaleným uvolňováním mohou obsahovat polypeptid, polynukleotíd nebo protilátku, dispergované v matrici nosiče a/nebo obsažené v zásobníku obklopeném membránou, která řídí rychlost uvolňování. Nosiče pro použití v těchto kompozicích jsou biokompatibilní a mohou být také bíodegradovatelné; výhodně kompozice poskytuje relativně konstantní hladinu uvolňování aktivní složky. Množství aktivní složky obsažené v kompozici se zpomaleným uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a předpokládané době uvolňování a povaze léčených stavů nebo stavů, kterým se má předcházet.

Ve farmaceutických kompozicích a vakcínách.může být použito jakékoli z dávkovačích vehikul k usnadnění produkce antigenově specifické imunitní odezvy, která je cílená na nádorové buňky. Dávkovači vehikula zahrnují buňky poskytující antígen (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B buňky, monocyty a jiné buňky, které mohou být upraveny na .účinné APC. Tyto buňky mohou, ale nemusí být geneticky modifikovány ke zvýšení .kapacity pro poskytování antigenu, ke zlepšení aktivace a/nebo udržení odezvy T buněk, k nabytí protinádorových účinků per se a/nebo k tomu, aby byly imunologicky kompatibilní s příjemcem (tj. úprava HLA haplotypu). APC mohou být obecně izolovány z jakékoli ze škály biologických kapalin a orgánů včetně nádorových a peritumorálních tkání a mohou být autologní, allogenní, syngenní nebo xenogenní buňky.

Určitá výhodná provedení tohoto vynálezu používají dendritických buněk nebo jejich progenitorů (předchůdců) jako buněk poskytujících antigen. Dendritické buňky jsou vysoce potentní APS (Banchreau a Steinman, nátuře 392: 245 - 251, 1998) a bylo dokázáno, že jsou účinné jako fyziologické pomocné látky pro vyvolání profylaktické nebo terapeutické protinádorové imunity (viz Timmerman a Levý, ·*·· ···« «« ·· ·· ···· • · * * · » · • « ·♦ · · · * · · · * * · · ··«« w · · ♦ ·· ··, · * · ·'

Ann. Rev. Med. 50: 507 529,. 199$)) . Obecně platí, že dendritické buňky mohou být identifikovány na základě jejich typického tvaru (hvězdicového in šitu, s cytoplazmatickými procesy (dendrity) viditelnými in vitro) a na základě ztráty diferenciačních znaků B buněk (CD19 a CD20), T buněk (CD3) monocytů (CD114) a buněk přirozených killerů (CD56), jak je stanoveno za použití standardních zkoušek. Dendritické buňky mohou být samozřejmě upraveny k expresi specifických buněčných povrchových receptorů nebo ligandů., které se obecně nachází na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo a takto modifikované dendritické buňky jsou zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu. Jako alternativa dendritických buněk mohou být ve vakcíně použity vylučované vesikuly dendritických buněk s-antigenem (nazývaných expošomy) (viz Zítvogel et al., Nátuře Med. 4: 594 - 600, 1998).

Dendritické buňky a progenitory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, tumor infiltrujících buněk, peritumorální tkáně infiltrujících buněk,, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, pupečníkové krve a jiných vhodných tkání nebo tekutin. Dendritické buňky mohou být například diferenciovány ex vivo přídavkem kombinace cytokinů, jako je GM-CSF, IL4, IL-13 a/nebo TNFa ke kulturám monocytů získaných z periferní krve. CD34 pozitivní buňky získané z periferní krve, pupečníkové krve nebo kostní dřeně mohou být diferencovány na dendritické buňky přídavkem kombinací kultivačního média GM-CSF, IL-3, TNFa, ligandu CD40, LPS, ligandu flt3 a/nebo jiné sloučeniny/jiných sloučenin, které indukují zrání a proliferaci dendritických buněk.

Dendritické buňky jsou obvykle rozdělovány do kategorií jako „nezralé a „zralé buňky, což umožňuje jednoduchý způsob rozlišení mezi dvěmi dobře charakterizovanými fenotypy. Tato nomenklatura by neměla »·· ···· η ·· • · * * • · ·♦ • · · · · • · · · ·· ·· být vytvořena, tak.,, aby. vylučovala všechny možné mez i fáze diferenciace. Nezralé dendritické buňky jsou charakterizovány jako APC s vysokou kapacitou příjmu a zpracování antigenu, což koreluje s vysokou expresí Fcy receptoru, mannosového receptoru a DEX-205 markéru. Zralý fenotyp je typicky charakterizován nižší expresí těchto markérů, ale vysokou expresí molekul buněčného povrchu odpovědných za aktivaci T buněk, jako je třída I a třída IIMHC, adhezních molekul (např. CD54 á CDU) a kostimulátorových molekul (např. CD40, CD80 a CD86) .

APC mohou být obecně transfektovány polynukleotidem kódujícím vaječníkový karcinomový antigen (např. jeho část nebo jeho . jinou variantu) tak,, že antigen nebo jeho···· imunogenní část je produkována expresí na povrchu buňky. Tato transfekce může probíhat ex vivo a kompozice nebo vakcína obsahující takové transfektované buňky může pak být použita pro terapeutické účely, jak je zde popsáno. Gen nesoucí vehikulum, které má za cíl dendritickou buňku nebo jinou buňku poskytující antigen, může být alternativně podáváno pacientovi, což má za následek transfekci, která probíhá in vivo. In vivo. a ex vivo transfekce dendritických buněk může být obecně například provedena za použití jakékoli metody známé v oboru, jako jsou metody popsané ve WO 97/24447 nebo přístup popsaný v Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456 - 460, 1997 („genová puška). Zavedení antigenu dendritických buněk může být dosaženo inkubací dendritických buněk nebo progenitorových buněk s polypeptidem, DNA (obnažené nebo v plazmidovém vektoru) nebo RNA; nebo s antigen exprimující rekombinantní bakterií nebo viry (např. vektory z viru kravských neštovic, drůbežích neštovic, adenovirů nebo lentivirů). Před zavedením mohou být polypeptidy kovalentně konjugovany na imunologického partnera, který poskytuje pomoc T buňkám (např. molekula nosiče). Alternativně mohou být dendritické • ···· «« »· • · · • ♦ ·· • · · * • · · · ·<!

buňky pulzovány s nekonjugovaným imunologickým partnerem, separátně nebo v přítomnosti polypeptidu.

Ošetřeni rakoviny

V dalších aspektech tohoto vynálezu mohou být zde popsané kompozice použity pro imunoterapii rakoviny, jako je rakovina vaječníků. V rámci těchto metod jsou farmaceutické kompozice a vakcíny typicky podávány pacientovi. Pojem „pacient, jak je zde použit, označuje teplokrevného živočicha, výhodně člověka. Pacient může ale nemusí být postižen rakovinou. V souladu s tím mohou být výše uvedené farmaceutické kompozice nebo vakcíny použity k prevenci rozvoje rakoviny nebo k léčbě pacienta, postiženého rakovinou. V určitých výhodných provedeních je pacient postižen rakovinou vaječníků. Tato rakovina může být diagnostikována za použití kritéria obecně přijatého v oboru, které zahrnuje přítomnost zhoubného nádoru. Farmaceutické kompozice a vakcíny mohou být podávány buď před nebo po chirurgickém odstranění primárních nádorů a/nebo léčení, jako je použití radioterapie, nebo obvyklých chemoterapeutických léčiv.

V určitých provedeních může být imunoterapii aktivní imunoterapie, kde ošetření počítá s in vivo stimulací endogenního hostitelského imunitního systému k reakci proti nádorům pomocí podávání imunitní odezvu modifikujících činidel (jako jsou tumorové vakcíny, bakteriální adjuvans a/nebo cytokiny).

V určitých provedeních může být imunoterapie pasivní imunoterapii, kde ošetření počítá s dodáním činidel s určitou tumor-ímunítní reaktivitou (jako jsou efektorové buňky nebo protilátky), které mohou přímo nebo nepřímo zprostředkovat protinádorové účinky a nezávisí nezbytně na hostitelském imunitním systému. Příklady efektorových buněk ·· ·· • » · · • ♦ · · «4 4·»« • 9 9 · ·

9 9 w · · · • · · ·.

zahrnují T lymfocyty (jako je CD8⁺ cytotoxlcké T lymfocyty a CD4⁺ T-helperové lymfocyty infiltrující tumor), killerové buňky („buňky-zabíječe)(jako jsou přirozené killerové buňky a lymfokinem aktivované killerové buňky), B buňky a antigen ppskytující buňky (jako jsou dendritické buňky a makrofágy) poskytující expresi zde popsaných polypeptidů. T buněčné receptory a receptory protilátek specifické pro zde popsané polypeptidy mohou být klonovány, podrobeny expresi a převedeny do vektorů nebo efektorových buněk pro adoptivní imunoterapii. Zde popsané polypeptidy mohou být také použity ke generování protilátek nebo antiidiotypických protilátek (jak je popsáno v US patentu č. 4918164) pro pasivní imunoterapii.

Efektorové buňky mohou být obecně získány v dostatečných množstvích pro adoptivní imunoterapii získáváním in vitro zde popsaným způsobem. Kultivační podmínky pro expanzi jednotlivých antigen-specifických efektorových buněk v množství několika miliard s retencí rozpoznání antigenu in vivo jsou dobře .známé v oboru. Tyto kultivační podmínky in vivo typicky používají občasnou stimulaci antigenem, často v přítomnosti cytokinů (jako je IL-2) a nedělících se pomocných buněk. Jak je poznamenáno výše, zde popsané imunoreaktivní polypeptidy mohou být použity k rychlé expanzi antigen-specifických kultur T buněk za účelem vytvoření dostatečného množství buněk pro imunoterapii. Konkrétně antigen poskytující buňky, jako jsou dendritické, makorfágové nebo B buňky, mohou být pulzovány s imunoreaktivními polypeptidy nebo transfektovány jedním nebo více polynukleotidy za použití standardních technik dobře známých v oboru. Antigen poskytující buňky, mohou být transfektovány s polynukleotidem majícím promotor vhodný pro zvýšení exprese v rekombinantních virech nebo jiných expresních systémech.

·· ·♦ ·· ·* <. ♦ · · · · ♦ · • · · · ·· ·* · ' · · * · ······*· · · · · ·* ·«

Kultivované efektorové buňky pro., použiti v terapii________ musí být schopné růstu a široké distribuce dlouhodobého přežití in vivo. Studie ukázaly, že kultivované efektovové buňky mohou být indukovány k růstu in vivo a dlouhodobému přežití v podstatném množství opakovanou stimulací s antigenem dodávaným IL-2 (viz např. Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177, 1997).

Alternativně mohou být vektory k expresi zde popsaného polypeptidu zavedeny do kmenových buněk odebraných od pacienta a klonově namnoženy in vitro pro autologní transplantaci zpátky do stejného pacienta.

Cesta a frekvence podávání stejně jako dávkování se bude lišit jedinec od jedince a.mohou být snadno zjištěny za použití standardních způsobů. Farmaceutické kompozice a vakcíny mohou být obecně podávány injekcí (např.

intrakutánní, intramuskulární, intravenózní nebo subkutánní), intranazálně (např. aspirací) orálně nebo v loži resekovaného nádoru. Výhodně může být podáno mezi 1 a 10 dávkami během 52 týdnů. Výhodně je podáno 6 dávek v intervalech 1 měsíce a další očkování může být prováděno poté periodicky. Změna protokolů může být u každého pacienta. Vhodná dávka je množství sloučeniny při výše uvedeném podání, které je schopno vyvolání protinádorové imunitní odpovědi a je alespoň 10 - 50 % nad základní hodnotou (tj. bez ošetření). Tato odezva může být monitorována měřením protinádorových protilátek u pacienta nebo vakcinově dependentní tvorba cytolytických efektorových buněk schopných zabíjet pacientovy nádorové buňky in vitro. Tyto vakcíny by měly být schopny vyvolávat imunitní odezvu, která vede ke zlepšenému klinickému obrazu (např. častější vyléčení, naprostý nebo částečný ústup nebo delší období přežití bez choroby) u očkovaných pacientů ve srovnání s neočkovanými pacienty. Obecně pro farmaceutické kompozice a vakcíny obsahující jeden nebo více polypeptidů ·· ·· « · ♦ · • s « e ® • · ·«·····* ·* ·* • * ♦ · « · ·* • · O 9 • · · · ♦ · ·· ·· 9··· • · * • · · β « * 9 « · · · ·· ·· je množství každého polypeptidů přítomného v dávkových rozmezích od asi 100 pg do 5 mg na kg hostitele. Vhodná velikost dávky se bude lišit podle velikosti pacienta, ale bude typicky v rozmezí od asi 0,1 ml do asi 5 ml.

Obecně vhodná dávka a režim ošetření poskytuje aktivní sloučeninu/sloučeniny v množství dostatečném k poskytnutí terapeutického a/nebo profylaktického účinku. Tato odezva může být monitorována zlepšením vybraných klinických výstupů (např. častější vyléčení, naprostý nebo částečný ústup nemoci nebo delší období přežití bez choroby) u ošetřených pacientů ve srovnání s neošetřenými pacienty. Zlepšení u dříve existujících imunitních odezev na vaječníkový karcinomový antigen obecně koreluje se zlepšením klinických výstupů. Tyto imunitní odezvy mohou být obecně vyhodnoceny za použití standardní prolíferačních, cytotoxických nebo cytokinových zkoušek, které mohou být provedeny za použití vzorků získaných od pacientů před a po ošetření.

Způsoby identifikace vylučovaných (sekretovaných) vaječnikových karcinomových antigenů

Tento vynález poskytuje způsoby identifikace vylučovaných nádorových antigenů. U těchto metod jsou nádory implantovány do imunodeficientních zvířat, jako jsou SCID myši, a jsou udržovány po dobu nezbytnou k dosažení sekrece nádorových antigenů do séra. Obecně mohou být nádory implantovány subkutánně nebo v gonadálních tukových ložích imunodeficientních zvířat a udržovány po dobu 1 až 9 měsíců, výhodně 1 až 4 měsíce. Implantace může být obecně provedena způsobem popsaným ve WO 97/18300. Sérum obsahující vylučované antigeny je poté použito k přípravě antiséra v imunokompetentních myších za použití zde popsaných standardních technik. Stručně, 50 až 100 μΐ séra • ·

• * · · • · ·· • · · 6 • · · · ·· ···· (odebraného ze tří souborů imunodeficientních myší, kde ~ každý soubor nese odlišný od SCID odvozený lidský vaječníkový nádor) může být smícháno 1 : 1 (obj. : obj.) s vhodným adjuvans, jako je RIBI-MPL nebo MPL - TDM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a injektováno intraperitoneálně do syngenických imunokompetitních zvířat v měsíčních intervalech po celkovou dobu 5 měsíců. Antiséra ze zvířat imunizovaných tímto způsobem mohou být získána odebráním krve po třetí, čtvrté a páté imunizaci. Výsledné antisérum je obecně předčištěno E. coli a fágovými antigeny a použito (obecně po zředění, jako je 1 : 200) v serologickém screeningu exprese.

Knihovna je typicky expresní knihovna obsahující cDNA z jednoho nebo více nádorů typu, které jsou implantovány do SCID myši. Tato expresní knihovna může být připravena ve vhodném vektoru, jako je λ-screen (Novagen). cDNA, které kódují polypeptid, který reaguje s antisérem mohou být identifikovány za použití standardních technik a podrobeny sekvenční analýze. Tyto molekuly cDNA mohou být dále charakterizovány k vyhodnocení exprese v nádorové a normální tkání a k vyhodnocení sekrece antigenů u pacientů.

Zde uvedené metody mají oproti jiným metodám výhody při zjištění nádorového antigenů. Všechny těmito metodami identifikované antigeny by měly být vylučované nebo uvolňované nekrózou nádorových buněk. Tyto antigeny mohou být přítomny na povrchu nádorových buněk po dobu nutnou k zacílení a zničení imunitního systému po vakcinaci.

Metody detekce rakoviny

Obecně může být rakovina detekována u pacienta na základě přítomnosti jednoho nebo více vaječníkových karciomových proteinů a/nebo polynukleotidů kódujících tyto proteiny v biologickém vzorku (jako je krev, sérum, moč • · · a/nebo nádorové biopsie) - získaném od pacienta-. Jinými · slovy, tyto proteiny mohou být použity jako signální znaky (markéry) k identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny, jako je rakovina vaječníků. Kromě toho tyto proteiny mohou být užitečné pro detekci jiných druhů rakoviny. Vazebná činidla zde poskytnutá obecně dovolují detekci hladiny proteinu, který se váže na činidlo v biologickém vzorku. Polynukleotidové primery a sondy mohou být použity k detekci hladin mRNA kódující nádorový protein, což je také indikací přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny. Obecně by měla být sekvence spojená s vaječníkovým karcinomem přítomna v množství, které je alespoň trojnásobně vyšší v nádorové tkání než v normální tkáni.

K detekci polypeptidových markérů ve vzorku za pomoci vazebných činidel je odborníkovi v oboru.známa celá řada zkoušek. Viz např. Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Obecně platí, že přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny u pacienta může být stanovena (a) kontaktem biologického, vzorku získaného od pacienta s vazebným činidlem; (b) detekcí hladiny polypeptidů, který se váže na vazebné činidlo ve vzorku; a

c) srovnáním hladiny polypeptidů s předem určenou hraniční hodnotou.

Ve výhodném provedení tato zkouška zahrnuje použití vazebného činidla imobilízovaného na pevný nosič k vazbě a odstranění polypeptidů od zbytku vzorku. Navázané polypeptidy mohou být poté detekovány za použití detekčních činidel, které obsahují reportérovou skupinu a specificky se vážou na komplex vazebné činidlo/polypeptid. Tato detekční činidla mohou obsahovat například vazebné činidlo, které se specificky váže na polypeptid nebo protilátku nebo jiné činidlo, které se specificky váže na vazebné činidlo, jako je anti-imunoglobulin, protein G, protein A nebo i;.

• ·

lektin. Alternativně může být použito kompetitivni zkoušky,“' ve které je polypeptid označen reportérovou .skupinou a ponechán se navázat na imobilizované vazebné činidlo po inkubaci vazebného činidla se vzorkem. Rozsah, v jakém složky vzorku inhibují vazbu značeného polypeptidu na vazebné činidlo je indikací reaktivity vzorku s imobilizovaným vazebným činidlem. Vhodné polypeptidy pro použití v rámci těchto zkoušek zahrnují vaječníkové karcinomové proteiny o plné délce a jejich části, na které se vazebné činidlo váže, jak je zde popsáno.

Pevný nosič může být kterákoli látka známá oborníkovi v oboru, na kterou může být připojen nádorový protein. Pevným nosičem může být například testovací jamka v mikrotitrační destičce nebo nitrocelulózová nebo jiná vhodná membrána. Alternativně může být nosičem lože nebo disk z materiálu, jako je sklo, skleněná vlákna, latex nebo plastická látka, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Nosič může být také magnetická částice nebo vláknitý optický senzor, jak je popsán v US patentu č. 5359681.

Vazebné činidlo může být imcbílizováno na pevný nosič za použitý řady technik známých odborníkovi v oboru, které jsou detailně popsány v patentové a odborné literatuře.

V kontextu tohoto vynálezu pojem „imobilizace označuje jak nekovalentní spojení, jako je adsorpce, tak kovalentní spojení (které může být přímou vazbou mezi činidlem a funkčními skupinami na nosiči nebo může být vazbou prostřednictvím zesíťovacího činidla). Výhodná je imobilizace adsorpcí na jamku v mikrotitrační desce nebo na membránu. V těchto případech může být dosaženo adsorpce kontaktem vazebného činidla ve vhodném pufru s pevným nosičem po vhodnou dobu. Kontaktní doba se liší v závislosti na teplotě, ale typicky je od asi 1 hodiny do asi 1 dne. Obecně platí, že kontakt jamky plastické mikrotitrační destičky (jako je polystyrénová nebo ·· ·· ·· ·· ·· ···· • · · · ···· ·· · ο β · · · · ··· polyvinylchloridová)-s-množstvím vazebného činidla pohybujícím se od asi 10 ng do asi 10 gg a výhodně od asi 100 ng do asi 1 gg je dostatečný k imobilizaci adekvátního množství vazebného činidla.

Kovalentního napojení vazebného činidla na pevný nosič může být obecně dosaženo nejprve reakcí nosiče s bifunkčním reagentem, který bude reagovat jak s nosičem, tak funkční skupinou, jako je hydroxylová skupina nebo aminoskupina na vazebném činidle. Vazebné činidlo může být například kovalentně připojeno na nosiče mající vhodný polymerní povlak za použití benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny na nosiče s aminem.a aktivním vodíkem na vazebném partnerovi (viz např. Pierce lrnmunotech.noJ.ogy Cataloq and Handbook, 1991, A12 - A13) .·

V určitých provedením je zkouška zkouškou „sendvičovou se dvěmi protilátkami. Tato zkouška může být provedena nejprve kontaktem protilátky, která byla imobilizována na pevném nosiči, obecně jamce mikrotitrační destičky, se vzorkem tak, že polypeptidy ve vzorků jsou ponechány navázat na imobilizovanou protilátku. Nenavázaný vzorek je .poté odstraněn z komplexů imobílizovaný polypeptid-protilátka a je přidáno detekční činidlo (výhodně druhá protilátka schopná vazby na jiném místě tohoto polypeptidu) obsahující reportérovou skupinu. Množství detekčního činidla, které zůstává nenavázáno na pevný nosič, je poté stanoveno za použití metod vhodných pro specifickou reportérovou skupinu.

Jakmile je protilátka imobilizovaná na nosiči výše popsaným způsobem, zbylá místa vázající protein na nosiči jsou typicky blokována. Lze použít jakákoli vhodná blokovací činidla známá odborníkovi v oboru, jako je hovězí sérový albumin nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0). Imobilizovaná protilátka je poté inkubována se • · · · vzorkem a polypeptid. je ponechán navázat.se s protilátkou. Vzorek může být zředěn před inkubací vhodným ředidlem, jako je PBS (fosfátem pufrovaná solanka). Obecně platí, že vhodná doba kontaktu (tj. inkubační doba) je časové období, které je dostatečné k detekci přítomnosti polypeptidu ve vzorku získaného z individuálního vaječníkového karcinomu. Výhodně je doba kontaktu dostatečná k dosažení hladiny vazby, která je alespoň 95% oproti té, která představuje rovnováhu mezi navázaným a nenavázaným peptidem.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že doba nezbytná k dosažení rovnováhy může být snadno zjištěna zjištěním hladiny vazby, které se dosahuje za časovou periodu.. Obecně je inkubační doba asi 30 minut při pokojové teplotě dostatečná.

Nenavázaný vzorek může být odstraněn promytím pevného nosiče vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1 % Tween 20™. Druhá protilátka, která obsahuje reportérovou skupinu, může být poté přidána k pevnému nosiči. Výhodné ' reportérové skupiny zahrnují ty skupiny, které byly uvedeny výše.

Detekční činidlo je poté inkubováno s komplexem zmobilizovaná protilátka-polypeptid po časové období, která je dostatečné k detekci navázaného polypeptidu. Vhodné časové období může být obecně stanoveno zjištěním hladiny vazby, které je dosaženo během určité časové periody. Nenavázané detekční činidlo je poté odstraněno a navázané detekční činidlo je detekováno za použití reproterových skupin. Způsob použitý pro detekci reportérových skupin závisí na povaze reportérových skupin. Pro radioaktivní skupiny jsou obecně vhodné scintilační načítání nebo autoradiografické metody. Spektroskopických metod může být použito k detekci barviv, luminscenčních skupin a fluorescenčních skupin. Biotin může být detekován za použití avidinu navázaného na různé reportérové skupiny (obecně radioaktivní nebo fluorescenční skupiny nebo ···· enzymy). Enzymové.reportérové -skupiny-mohou být obecně detekovány přídavkem substrátu (obecně po určitou časovou periodu) a poté spektroskopicky nebo jinou analýzou reakčních produktů.

Ke stanovení přítomností nebo nepřítomnosti rakoviny, jako je rakovina vaječníku, je signál detekovaný z reportérových skupin, které zůstanou navázány na pevný nosič, obecně porovnán se signálem, který odpovídá předem určené hraniční hodnotě. Ve výhodném provedení je hraniční hodnota pro detekci rakoviny průměrný střední signál, který je získaný, když je imobilizovaná protilátka inkubována se vzorky od pacientů bez rakoviny. Obecně je za pozitivní pro rakovinu považován vzorek generující signál, který představuje tři standardní odchylky nad předem určenou hraniční hodnotu. V jiném výhodném provedení je hraniční hodnota stanovena za použití hodnot Reciver Operátor Curve (operační křivka) způsobem uvedeným v Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, str. 106 - 107. Při tomto provedení může být stanovena hraniční hodnota z grafu párů pravdivě pozitivních poměrů (tj. citlivosti) a falešně pozitivních poměrů (100% specifita), které odpovídají každé možné hraniční hodnotě pro výsledky diagnostických testů. Hraniční hodnota na grafu, která je nejblíže levému hornímu rohu (tj. hodnota, která zahrnuje největší plochu) je nejpřesnější hraniční plocha a vzorky generující signál, který je větší než hraniční hodnota stanovená touto metodou, mohou být považovány za pozitivní. Alternativně může být hraniční hodnota posunuta na grafu doleva k minimalizaci falešně pozitivního' poměru nebo doprava k minimalizaci falešně negativního poměru. Obecně platí, že vzorky generující signál, který je vyšší než hraniční hodnota stanovená touto metodou, jsou považovány za pozitivní na rakovinu.

V obdobném provedeni, se zkouška provádí v průtokovém uspořádání nebo formou testovacího proužku, přičemž vazebné činidlo je imobilizováno na membránu, jako je nitrocelulózová membrána. Při testu v průtokovém uspořádání jsou polypeptidy ze vzorku vázány na imobilizované vazebné činidlo během toho, jak vzorek prochází membránou. Druhé, značené vazebné činidlo se poté váže na komplex vazebné činidlo-polypeptid, jak roztok obsahující druhé vazebné činidlo protéká přes membránu. Detekce navázaného druhého vazebného činidla pak může být provedena výše uvedeným způsobem. V proužkovém uspořádání je konec membrány, na kterou je vázáno vazebné činidlo, ponořen do roztoku obsahujícího vzorek.'Vzorek se pohybuje po membráně přes oblastí obsahující druhé vazebné činidlo k ploše s imobilízovaným vazebným činidlem. Koncentrace druhého vazebného činidla na ploše s imobilizovanou protilátkou indikuje přítomnost rakoviny. Typicky pak koncentrace druhého vazebného činidla v tomto místě vytváří vzorek, jako jsou čáry, které mohou být snadno vízuelně detekovány. Nepřítomnost těchto vzorků indikuje negativní výsledek. Obecně je množství vazebného činidla imobilizovaného na membráně vybráno tak, aby se vytvořily vizuelně patrné vzorky, pokud biologický vzorek obsahuje hladinu polypeptidu, která by měla být dostatečná k vytvoření pozitivního signálu v sendvičové zkoušce se dvěmi protilátkami ve výše uvedeném uspořádání. Výhodnými vazebnými činidly pro použití v těchto zkouškách jsou protilátky a jejich fragmenty vázající antigen. Výhodně je množství protilátky imobilizované na membránu v rozmezí od asi 25 ng do asi 1 pg a výhodně od asi 50 ng do asi 500 ng. Tyto testy mohou být typicky provedeny s malým množství biologického vzorku.

Existuje samozřejmě řada jiných zkoušek, které jsou vhodné pro použití s nádorovými proteiny nebo vazebnými ···· '-s η · · ········ / ± ~~ ···· ···· ·· ·· ·* ♦· činidly podle tohoto vynálezu... .Výše uvedený popis je zamýšlen pouze jako uvedení příkladů. Pro odborníka v oboru je například z výše uvedených provedení zřejmé, že je možno snadno modifikovat výše uvedené zkoušky pro použití vaječníkových karcinomových polypeptidů pro detekci protilátek, které vážou tyto polypeptidy, v biologickém vzorku. Detekce těchto protilátek specifických pro vaječníkové karcinomové proteiny může korelovat s přítomností rakoviny.

Rakovina může být také nebo alternativně detekována na základě přítomnosti T buněk, které specificky reagují s vaječníkovým karcinomovým proteinem v biologickém vzorku. V rámci těchto metod je biologický vzorek., obsahující CD4⁺ a/nebo CD8⁺ T buňky, získaný od pacienta, inkubován s vaječníkovým karcinomovým proteinem, polynukleotídem kódujícím tento polypeptid a /nebo APC, která je schopna exprese alespoň imunogenní části tohoto polypeptidů, a je detekována přítomnost nebo nepřítomnost specifické aktivace T buněk. Vhodné biologické vzorky zahrnují izolované T buňky, ale nejsou na ně omezeny. T buňky mohou být například izolovány od pacienta běžnými způsoby (jako je Ficoll/Hypaque hustotní gradientovou centrifugací periferních krevních lymfocytů). T buňky mohou být inkubovány in vitro 2 až 9 dnů (typicky 4 dny) při 37 °C s vaječníkovým karcinomovým proteinem (např. 5 až 25 pg/ml). Může být vhodné inkubovat jiné alíkvotní díly vzorku T buněk v nepřítomnosti vaječníkového karcinomového proteinu k použití jako kontrolní vzorek. U CD4⁺ T buněk je aktivace výhodně detekována vyhodnocením proliferace T buněk. U CD8⁺ T buněk je aktivace výhodně detekována vyhodnocením cytolytické aktivity. Úroveň proliferace, která je alespoň dvakrát větší a/nebo úroveň cytolytické aktivity, která je alespoň o 20 % vyšší než u zdravých pacientů indikuje přítomnost rakoviny u pacienta.

Á.

·· ···· ···· ····

Jak bylo uvedeno výše, může být rakovina také nebo alternativně detekována na základě hladiny mRNA kódující vaječníkový karcinomový protein v biologickém vzorku. Lze například použít alespoň dva oligonukleotidové primery ve zkoušce založené na PCR k amplifikaci části DNA vaječníkového karcinomového proteinu odvozené od biologického vzorku, přičemž alespoň jeden z oligonukleotidových primerů je specifický (tj.

hybridizuje) pro polynukleotíd kódující vaječníkový karcinomový protein. Amplifikovaná cDNA je poté oddělena a podrobena detekci za použití způsobů dobře známých v oboru, jako je gelová elektroforéza. Obdobně mohou být použity k hybridizační zkoušce k detekci přítomnosti polynukleotidu kódujícího nádorový protein'V biologickém vzorku oligonukleotidové sondy, které se specificky hybridizují na polynukleotíd kódující vaječníkový karciomový protein.

K dosažení hybridizace za podmínek zkoušky by měly oligonukleotidové primery a sondy obsahovat sekvenci oligonukleotidu, která má alespoň asi 60%, výhodně alespoň .75%, zvláště výhodně asi alespoň 90% identitu s částí polynukleotidu kódující vaječníkový karcinomový protein, který má délku alespoň 10 nukleotidů a výhodně alespoň 20 nukleotidů. Výhodně oligonukleotidové primery a/nebo sondy se hybridizují s polynukleotidem kódujícím zde popsaný polypeptid za středně přísných podmínek, jak je definováno výše. Oligonukleotidové primery a/nebo sondy, které mohou být vhodně použity při zde popsaných diagnostických metodách, mají výhodně délku alespoň 10 za sebou jdoucích nukleotidů, výhodně alespoň 15 za sebou jdoucích nukleotidů, molekuly DNA mající zde uvedenou sekvenci. Techniky pro zkoušky založené na PCR a hybridizaci jsou dobře známé v oboru (viz např. Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

• · · · · · · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··

Jedna z výhodných zkoušek, používá RT-PCR, ve -které-je PCR aplikována ve spojení s reverzní transkripcí. Typicky je RNA extrahována z biologického vzorku, jako je bioptická tkáň, a je reverzně transkribována pro produkci molekul cDNA. PCR amplifikace za použití alespoň jednoho specifického primeru generuje molekuly cDNA, které mohou být odděleny a vizuelně detekovány například gelovou elektroforézou. Amplifikace může být provedena na biologických vzorcích odebraných z testovaných pacientů a z jedince, který není postižen rakovinou. Amplifikační reakce může být provedena na několika zředěních cDNA v rozsahu dvou řádů. Dvojnásobné nebo větší zvýšení exprese v několika zředěních u vzorku testovaného pacienta ve srovnání se stejnými’zředěními pacienta bez rakoviny je. považováno za pozitivní‘výsledek.

V jiném provedení jsou vaječníkové karcinomové proteiny a polynukleotidy kódující tyto proteiny použity jako markéry pro monitorování postupu rakoviny. V tomto provedení mohou být zkoušky výše popsané pro diagnózu rakoviny provedeny ω různé době a může být vyhodnocena.....

změna hladiny reaktivního polypeptidů /polypeptidů. Například může být zkouška provedena každých 24 až 72 hodin po dobu 6 měsíců až 1 roku a poté v případě potřeby. Obecně platí, že rakovina postupuje u toho pacienta, u kterého vazebným činidlem zjištěné hladiny polypeptidů rostou během času. Naopak rakovina nepostupuje, pokud hladina reaktivního polypeptidů buď zůstává konstantní nebo se snižuje během času.

Určité diagnostické zkoušky mohou být provedeny in vivo přímo na nádoru. Jedna z těchto zkoušek zahrnuje kontakt buněk nádoru s vazebným činidlem. Vazba vazebného činidla může být poté stanovena přímo nebo nepřímo přes reportérovou skupinu. Tato vazebná činidla mohou být také ····

použita v histologických aplikacích. Alternativně může být použito u těchto aplikaci polynukleotidových sond.

Jak je uvedeno výše, může být v daném vzorku ke zlepšení citlivosti použito zkoušek více markérů karcinomových proteinů. Je zřejmé, že vazebná činidla specifická pro zde uvedené různé proteiny mohou být v jedné zkoušce zkombinována. Současně může být použito více primerů nebo sond. Výběr markérů tumorového proteinu může být založen na běžných experimentech ke stanovní kombinací, které dávají optimální citlivost. Kromě toho nebo alternativně zde uvedené zkoušky na nádorové proteiny mohou být kombinovány se zkouškami na jiné známé nádorové antigeny.

Diagnostické soupravy (kity)

Tento vynález dále poskytuje soupravu pro použití v rámci jakékoli výše uvedené diagnostické metody. Tyto soupravy typicky, obsahují dvě nebo více složek nezbytných pro provádění diagnostické zkoušky. Složky mohou být sloučeniny, činidla, nádoby a/nebo další vybavení. Jedna nádoba v této soupravě může například obsahovat monoklonální protilátku nebo její fragment, které specificky vážou vaječníkový karcinomový protein. Tyto protilátky nebo fragmenty mohou být poskytnuty jako navázané na nosičovém materiálu, jak je popsáno výše. Jedna nebo více dalších nádob může obsahovat prvky, jako jsou činidla nebo pufry, které se používají při zkoušce. Tyto soupravy mohou také nebo alternativně obsahovat detekční činidlo, jak je popsáno výše, které obsahuje reportérovou skupinu vhodnou pro přímou nebo nepřímou detekci vázání protilátek.

V alternativním provedení může být souprava upravena k detekci hladin mRNA kódující vaječníkový karcinomový ·· ·· ·· ·· ·· ···· ··· · » · · · · · • · · · ·· · · · protein v biologickém.vzorku. Tyto.soupravy, obecně obsahují alespoň jednu oligonukleotidovou sondu (probu) nebo primer, jak jsou popsány výše, které se hybridizují s polynukleotidem kódujícím vaječníkový karcinomový protein. Tento oligonukleotid může být použit například v PCR nebo hybridizační zkoušce. Přídavné komponenty, které mohou být přítomny v této soupravě, zahrnují druhý oligonukleotid a/nebo diagnostické činidlo nebo kontejner k usnadnění detekce polynukleotidu kódujícího vaječníkový karcinomový protein.

Následující příklady jsou určeny pouze k ilustraci vynálezu, nikoli k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace reprezentativních cDNA vaječníkových karcinomových proteinů

Tento příklad ilustruje, identifikaci molekul-cDNA kódujících vaječníkové karcinomové proteiny.

Anti-SCID myší séra (vytvořené proti sérům ze SCID myší s pozdním stádiem vaječníkového karcinomu) byly předčištěny fágovými a E. coli antigeny a byly použity v ředění 1 : 200 při screeningu serologické exprese. Knihovna pro screening byla vytvořena z lidského vaječníkového nádoru (OV9334) odvozeného od SCID za použití konstrukčního kitu RH oligo(dT) cDNA knihovny a vektoru ÁScreen (Novagen). Byl použit bakteriofág lambda. Bylo testováno přibližně 400000 pfu amplifikované knihovny 0V9334 ..

Bylo izolováno 196 pozitivních klonů. Některé sekvence, které jsou zřejmě nové, jsou uvedeny na obrázcích » · · • · « • ·· »· ··*·

1A-1S a. SEQ ID NO: .1 až. 71·. Tři kompletní. . sekvence inzertů jsou uvedeny na obrázcích 2A - 2C (SEQ ID NO: 72 až 74). Jiné klony mající známé sekvence jsou uvedeny na obrázcích 15A až 15EEE (SEY ID NO: 82 až 310). Databázové rešerše identifikovaly následující sekvence jako v podstatě identické se sekvencemi uvedenými na obrázcích 15A až 15ΕΈΕ.

Tyto klony byly dále charakterizovány za použití mikrošípové technologie ke zjištění hladiny exprese mRNA v různých nádorových a normálních tkáních. Tyto analýzy byly provedeny za použití mikrošípu Synteni (Palo Alto,

CA) podle instrukcí výrobce. Produkty PCR amplifikace byly šípově naneseny na plátky, přičemž každý produkt byl na šípu individuálně lokalizován. mRNA byla extrahována z testovaného vzorku tkáně, podrobena reverzní transkripci a byly vytvořeny fluorescenčně označené sondy cDNA. Mikrošípy byly opatřeny označenými sondami cDNA a plátky byly skenovány ke zjištění intenzity fluorescence. Data byla analyzována za použití software Synteni GEMtools. Výsledky pro jeden klon (13695, také označovaný jako 08E) jsou uvedeny na obrázku 3.

Příklad 2

Identifikace cDNA vaječníkového karcinomu za použití mikrošípové technologie

Tento příklad ilustruje identifikaci polynukleotidů vaječníkového karcinomu pomocí analýzy PCR a mikrošípové analýzy. Mikrošípy cDNA byly analyzovány na expresi specifickou pro vaječníkový nádor za použití mikrošípu Synteni (Palo Alto, CA) podle instrukcí výrobce (a jak je v podstatě popsáno v Schena et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 10614 - 10619, 1996 a Heller et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2150 - 2155, 1997).

·* ·· ·· ··« · ·« ·« • · · · ···· · · » • «···· · φ · • · · · · · ···· ···· ···· t· ·· ·· ··

PCR analýza byla použita za .použiti testeru . ......

obsahujícího cDNA čtyř nádorů vaječníku (tři z nich byly metastázující tumory) a driveru CDNA z pěti normálních tkání (nadledvinky, plíce, pankreas, slezina a mozek). Fragmenty cDNA zjištěné touto analýzou byly podrobeny DNA mikrošípové analýze, kde byly fragmenty amplifikovány PCR, připojeny na částečky a hybridizovány s fluorescenčně označenými vzorky odvozenými od mRNA lidských vaječníkových nádorů a různých normálních lidských tkání. V této analýze byly plátky skenovány a byla měřena intenzita fluorescence a data byla vyhodnocena za použití software Synteni GEMtools. Obecně platilo, že sekvence vykazující alespoň pětinásobné zvýšení exprese v buňkách nádoru (oproti normálním buňkám) byly považovány za antigeny vaječníkového nádoru. Výsledky fluorescence byly analyzovány a klony, které vykazovaly zvýšenou expresi ve vaječníkových nádorech byly dále charakterizovány sekvenční analýzou DNA a rešerší v databázi ke stanovení novosti sekvencí.

Použitím těchto zkoušek bylo zjištěno, že antigen vaječníkového tumoru je sestřihovou fúzí mezi TAX onkoproteinem virového typu I lidských leukemických T-buněk (viz Jin et al., Cell 93: 81 - 91, 1998) a extracelulárním matricovým proteinem nazývaným osteonectin. Sestřihová sekvence existuje ve fúzním bodu. Sekvence tohoto klonu je uvedena na obrázku 4 a SEQ ID NO: 75. U této zkoušky byl také nezávisle identifikován nesestřižený a nezměněný osteonectin.

Jiné klony identifikované touto metodou jsou zde značeny jako 3f, 6b, 8e, 8h, 12c a 12h. Sekvence těchto klonů jsou uvedeny na obrázcích 5 až 9 a SEQ ID NO: 7 6 až 81. Mikrošípové analýzy byly provedeny výše popsaným způsobem a jsou uvedeny na obrázcích 10 až 14. Sekvence o plné délce zahrnující klony 3f, 6b, 8e a 12 h byla získána screeningem knihovny cDNA vaječníkových tumorů (od SCID ·· ·· ·· ····«· • · · · · · · ·· · • » * · ·· ··· odvozených). Tato sekvence 2996 párových^bází.(označená O772P) je uvedena v SEQ ID NO: 311 a kódovaná sekvence proteinu o 914 aminokyselinách je uvedena v SEQ ID NO: 312. Analýza PSORT indikuje transmembránový protein typu la lokalizovaný na plažmatické membráně.

Kromě určitých výše popsaných sekvencí tento screening identifikoval následující sekvence, kterou jsou detailně popsány v tabulce 1.

Tabulka 1

Sekvence	Poznámky
0V4vGll (SEQ ID NO: 313)	lidský klon 1119D9 na chromosomu 20pl2 ........
0V4vBll (SEQ ID NO: 314)	lidský UWGC:yl4cO94 z chromosomu 6p21
OV4vD9 (SEQ ID NO: 315)	lidský gen KIAA0014
OV4vD5 (SEQ ID NO: 316)	lidský gen KIAA0084
OV4vC2 (SEQ ID NO: 317)	lidský chromosom 19 kosmid Ř31167
0V4vF3 (SEQ ID NO: 318)	nová
0V4vCl (SEQ ID NO: 319)	nová
OV4vH3 (SEQ ID NO: 320)	nová
OV4vD2 (SEQ ID NO: 321)	nová
O815P (SEQ ID NO: 322)	nová
OV4vC12 (SEQ ID NO: 323)	nová
OV4vA4 (SEQ ID NO: 324)	nová
OV4vA3 (SEQ ID NO: 325)	nová
OV4v2A5 (SEQ ID NO: 326)	nová
88819P(SEQ ID NO: 327)	nová
O818P(SEQ ID NO: 328)	nová
0817P(SEQ ID NO: 329)	nová
O816P(SEQ ID NO: 330)	nová

·« ·· ·· ·* ··«· ·*»·» · · · ♦ « · * * ·>···· ··· • ······· <· · • · ···· ···· ···· ··*· ·· ·· ·· ··

OV4vc5 (SEQ ID NO: 331).	nová. ... .
21721(SEQ ID NO: 332)	lidský lumican
21719(SEQ ID NO: 333)	lidský kyselinu retinovou vázající protein II
21717(SEQ ID NO: 334)	lidská 26S proteasomová ATPasová subjednotka
21654(SEQ ID NO: 335)	lidský copin I
21627(SEQ ID NO: 336)	lidská neuron specifická gama-2 enolasa
21623 (SEQ ID NO: 337)	lidská geranylgeranyltransferáza II
21621(SEQ ID NO: 338)	lidská cyklin-dependentní proteinkináza
21616(SEQ ID NO: 339)	lidský prepro- megakaryocytpotenciační faktor
21612(SEQ ID NO: 340)	lidský UPH1
21558(SEQ ID NO: 341)	lidskýGGL2 (RalGDS-podobný 2)
21555(SEQ ID NO: 342)	lidský autoantigen P542
21548(SEQ ID NO: 343)	lidský aktinu příbuzný protein (ARP2)
21462(SEQ ID NO: 34 4)	lidský s huntingtinem interagující protein
21441(SEQ ID NO: 345)	lidský 90K produkt (tumorasociovaný antigen)
21439(SEQ ID NO: 346)	lidský guaninnukleotid regulátorový protein (timl)
21438(SEQ ID NO: 347)	lidský Ku autoimunitní (p70/p80) antigen
21237(SEQ ID NO: 348)	lidský S-laminin
21436(SEQ ID NO: 349)	lidský ribophorin I
21435(SEQ ID NO: 350)	lidský cytoplasmický chaperonin hTRiC5
21425(SEQ ID NO: 351)	lidský EMX2
21423(SEQ ID NO: 352)	lidský p87/p89 gen

*· 4« ** ·« »· «·»· • · » · · · · · · · • · · · 99 t · · • · · · « · ···· ···> ··· *· «· ·» ··

21419 (SEQ .ID NO: .353)	lidský. HPBRII-7 . .. ........
21252 (SEQ ID NO: 354)	lidský T1-227H
21251 (SEQ ID NO: 355)	lidský cullin I
21247 (SEQ ID NO: 356) '	proteásový inhibitor typu kunitz (KOP)
21244-1(SEQ ID NO: 357)	lidský proteintyrosinfosfatázový receptor f (PTPRF)
21718 (SEQ ID NO: 358)	lidská LTR repetice
OV2-90(SEQ ID NO: 359)	nový
Lidský zinkový prst (SWQ ID NO: 360)
lidský polyA vázající protein(SEQ ID NO: 361)
lidský pleitrofin (SEQ ID NO: 362)
lidský PAC klon 278C19 (SEQ ID NO': 363)
lidský LLRep3 (SEQ ID NO: 364)
lidský Kunitzův typ proteázového inhibitoru (SEQ ID NO: 365)
lidský gen KIAAO106 (SEQ ID NO: 366)
lidský keratin (SEQ ID NO: 367)
lidský HIV-1TAR (SEQ ID NO: 368)
lidský glia odvozený nexin (SEQ ID NO: 369)
lidský fibronectin (SEQ ID NO: 370)
lidský ECMproBM40 (SEQ ID NO: 371)
lidský kolagen (SEQ ID NO: 372)
lidská alfa enolasa (SEQ ID NO: 373)
lidská aldoláza (SEQ ID NÓ: 374)
lidský transf. růstový faktor BIG H3(SEQ ID NO: 375)
lidský SPARC osteonectin (SEQ ID NO: 376)
lidská SLP1 leukocytová proteáza (SEQ ID NO: 377)
lidská mitochondriální ATP synt. (SEQ ID NO: 378)
lidský DNA sekv. klon 461P17(SEQ ID NO: 379)
lidský dbpB pro Y box (SEQ ID NO: 380)
lidský 40 kDa keratin (SEQ ID NO: 381)
lidská arginosukcinatsynt.(SEQ ID NO: 382)

·· ·· ·.· • · 9 · · · 9 9 » · · · ·· • · « · · φ 9 • · · · · 9 ··«··»·· ·· ·· • · · • · 9

9 · • · 9 9 *· 99 lidský kyselý.ribosomální fosfoprotein · (SEQ- ID NO: 383) - lidská tračníkové karcinomální laminin vázající pro.(SEQ ID NO: 384)

Tento screening dále identifikoval řadu forem klonu O772P, zde označených jako 21013, 21003 a 21008. PSORT analýza ukázala, že 21003 (SEQ ID NO: 386; přeložená jako SEQ ID NO: 389) a 21008 (SEQ ID NO: 387; přeložená jako SEQ ID NO: 390) představuje formu la transmembránového proteinu O772P. 21013 (SEQ ID NO: 385; přeložená jako SEQ ID NO: 3388) se jeví být zkrácenou formou proteinu a PSORT analýza naznačuje, že je to vylučovaný (sekretovaný) protein.

' Další sekvenční analýza vyústila v nezkrácený klon 08E (2627 bp, což-souhlasí s výsledky velikosti získanými Northern analýzou; SEQ ID NO: 391). Tato sekvence nukleotidů byla získána následujícím způsobem: Bylo zjištěno, že původní O8E sekvence (Orig 08Econs) se překrývá s 33 nukleotidů sekvence z EST klonu (IMAGE#1987589). Tento klon poskytoval 1042 dalších nukleotidů proti směru replikace originální O8E sekvence. Spojení mezi EST a O8E bylo potvrzeno sekvenční analýzou několika PCR fragmentů generovaných z knihovny vaječníkových primárních tumorů za použití primerů u sekvencí EST a 08E /EST x 08EPCR). Plná délka byla dále potvrzena, když PCR z knihovny vaječníkových tumorů dala několik klonů (AnchoredPCR cons), které všechny končily proti směru od domnělého výchozího methioninu, ale nedaly jakékoli další sekvenční informace. Obrázek 16 představuje diagram, který ilustruje umístění každé parciální sekvence v rámci sekvence O8E o plné délce.

Z O8E o plné délce mohou být přeloženy dvě sekvence proteinu. Forma „a (SEQ ID NO: 393) začíná u domnělého výchozího methioninu. Druhá forma „b (SEQ ID NO: 392)

• · zahrnuje dalších 27 zbytků proti .směru k .5/ konci sekvence nukleotidu.

Příklad 3

Tento příklad popisuje identifikaci a charakterizaci epitopů protilátek zjištěných 08Έ polyklonálními antiséry.

Králičí antiséra byla získána proti od E. coli odvozenému 08E rekombinantnímu proteinu a bylo testováno poznávání epitopů protilátek proti 20 nebo 21 mer peptidům,. které odpovídají sekvenci aminokyselin O8E. Peptidy v rozsahu aminokyselinových oblastí 31 až 65, 76 až 110, 136 až 200 a 226 až 245 proteinu 08E o plné délce byly rozpoznány afinitně přečištěnými anti 08E séry z kyselinou eluovaného píku a/nebo solí eluovaného píku. Odpovídající sekvence aminokyselin výše uvedených peptidů představují protilátkové epitopy rozpoznané afinitně přečištěnými antiO8E protilátkami.

ELISA analýza anfi-O8E králičího séra je uvedena na obrázku 23, ELISA analýza, afinitně přečištěné králičí antiO8E polyklonální protilátky je uvedena na obrázku 24.

Pro epitopové mapování byly syntetizovány 20 nebo 21 mer peptidy odpovídající proteinu 08E. Pro afinitní přečištění protilátek byla králičí anti-08E séra převedena přes 08E-sepharosovou kolonu, poté byly protilátky eluovány solným pufrem obsahujícím 0,5 M NaCl a 20 mM PO₄, a poté následoval krok kyselé eluce za použití 0,2 M glycinu, pH 2,3. Přečištěná protilátka byla neutralizována přídavkem 1 M Tris o pH 8 a převedena do fosfátem pufrované solanky (PBS). Pro analýzu ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) byly naneseny O8E peptidy a 08E rekombinantní proteiny do 96 jamkové ploché desky při 2 pg/ml na 2 hodiny při pokojové teplotě (RT). Desky byly poté 5 krát promyty • · · · · · · · · ··· ···« ·· ·* *· ··

PBS + 0,1 % Tween 20 a blokovány PBS + 1% hovězího sérového albuminu (BSA) po dobu 1 hodiny. Poté bylo do jamek přidáno 1 pg/ml afinitně přečištěné anti-08E protilátky, kyselinou nebo solí eluované frakce, a proběhla inkubace při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Desky byly opět promyty, následoval přídavek oslí anti-králičí-Ig-křenové peroxídázové (HRP) protilátky po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Desky byly promyty, poté byly zpracovány přídavkem chromogenního substrátu 3, 35,5'-tetramethylbenzidinu (TMB) (popsáno v Bos et al., J. of Immunoasssay 2: 187 204 (1981); dostupný u Sigma (St. Louis, MO)). Reakční směs byla inkubována 15 minut při pokojové teplotě a poté byla reakce zastavena přídavkem 1 N kyseliny sírové. Desky byly vyhodnoceny z hlediska optické hustoty při 450 (OD450) na automatickém přístroji na vyhodnocení desek. Sekvence peptidů odpovídajících eptitopům protilátek OE8 zde byly popsány jako SEQ ID NO: 394 - 415. Epitopy protilátek rozpoznané E8E polyklonálními anti-séry jsou zde popsány na obrázku 17.

Příklad 4

Tento příklad popisuje IHC analýzu exprese 08E ve vzorcích rakovinných tkání vaječníku.

Pro imunohistochemické testy vzorky rakovinných tkání vaječníku fixované formalinem a zapouzdřené v parafinu naplátkovány na 8mikronové sekce. Pro optimální podmínky detekce byl použit SH1ER (Steam heat induced epitope retrieval) v 0,1 M pufru citrátu sodném (pH 6,0). Sekce byly inkubovány s 10% sérem/PBS 5 minut. Ke každé sekci byla na 25 minut přidána primární protilátka (anti-08E králičí afinitně přečištěná polyklonální protilátka) a poté následovala 25 minutová inkubace s anti-králičí biotinylovanou protilátkou. Aktivita endogenní peroxidázy ·· ·· ····

byla blokována třemi 1,5 min inkubacemi .. ... .....

s hydrogenperoxidázou. Systém komplex avidinbiotinu/křenová peroxidáza byl použit spolu s chromogenem DAB k vizualizaci exprese antigenů. Proužky byly vybarveny hematoxylinem. Jedna (papilárni sérový karcinom) ze šesti sekcí vaječníkových rakovinných tkání vykazovala imunoreaktivitu k 08E. Po optimalizaci detekčních podmínek byly pozitivní na polyklonální protilátky 08E 4/5 vzorků vaječníkových rakovinných tkání. Exprese 08E byla lokalizována na plazmatickou membárnu.

Šest vaječníkových rakovinných tkání bylo analyzováno pomocí anti-O8E králičí polyklonální protilátky. Jeden (papilárni sérový karcinom) ze šesti vzorků vaječníkové rakovinné tkáně byla pozitivní na expresi 08E. Exprese 08E byla lokalizována na povrchovou membránu.

Příklad 5

Tento příklad popisuje peptidy 08E, u kterých se předpokládá, že se vážou na ΉΤΑ-Α2 a že jsou imunogenní pro odezvy CD8 T buněk u lidí.

Potenciální HLA-A2 vázající peptidy 08E byly. zjištěny za použití ORF (open-reading frame). plné délky z 08E a s využitím „Épiseek, programu používaného k předpovídání MHC vázajících peptidů. Použitý program je založen na algoritmu publikovaném v Parker, K. C. et al., J. Immunol. 152(1): 163 - 175 (1994) (na který se v jeho úplnosti odkazuje). 10 mer a 9 mer peptidy predikované k vazbě HLA0201 jsou zde popsány jako SEQ ID NO: 416 - 435 a SEQ ID NO: 436 - 455.

♦ · ···· · · ·

Příklad 6 (

Tento příklad popisuje expresi 08E na povrchu buňky měřenou sortováním fluorescenčně aktivovaných buněk.

Pro analýzu FACS byly buňky promyty ledovým pufrem (PBS/1 % BSA/azid). Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut na ledu s 10 mikrogramy/ml afinitně přečištěné králičí anti-B305D polyklonální protilátky. Buňky byly promyty 3 krát pufrem a poté byly při zředění 1 : 100 inkubovány s kozí anti-králičí Ig (H+L)-FITC činidlem (Southern biotechnology) po dobu 3é minut na ledu. Po 3 promytích byly buňky resuspendovány v detekčním pufru obsahujícím prodiumjodid, vitální barvivo umožňující identifikaci permeabilních buněk, a analyzovány FACS. Povrchová exprese O8E byla potvrzena na buňkách rakoviny prsu SKBR3 a HEK293, které stabilně nadprodukují expresí cDNA pro 08E. Ani buňky MB415 ani buňky HEK293 stabilně transfektované kontrolním irelevantním plazmidem DNA nevykazovaly povrchovou expresi O8E (obrázky 18 a 19).

Příklad 7

Tento příklad dále vyhodnocuje expresi a povrchovou lokalizaci O8e.

Pro expresi a přečištění antigenu použitého pro imunizaci byl rekombinantní expresní systém O8E s expresí v E. coli kultivován přes noc v LB médiu s vhodnými antibiotiky při 37 °C v protřepávaném inkubátoru. Následující ráno bylo 10 ml kultury přidáno k 500 ml 2x YT plus vhodným antibiotikům v 21 Erlenmeyerově baňce. Když optická hustota (při 560 nanometrech) kultury dosáhla 0,4 0,6, byly buňky indukovány IPTG (1 mM). 4 Hodiny po indukci pomocí IPTG byly buňky sklizeny pomocí odstředění. Buňky byly poté promyty fosfátem pufrovanou solankou a opět ··

odstředěny.~Supernatant.byl.odstraněn a buňky-byly buď zmrazený pro další použití nebo bezprostředně zpracovány. Dvacet mililitrů pufru pro lýzu bylo přidáno k peletám buněk a směs byla promíchána. K otevření buněk E. coli byla směs proháněna přes French press při tlaku 16 000 psi.

Buňky byly poté opět odstředěny a supernatant a pelety byly zkontrolovány SPD-PAGE pro parcionování rekombinantního proteinu. U proteinu, který byl lokalizován do buněčných pelet, byly pelety resuspendovány v 10 mM Tris pH 8,0, 1 % CHAPS a pelety byly promyty a znovu odstředěny. Tato procedura byla ještě dvakrát zopakována. Promyté pelety byly rozpuštěny pomocí buď 8 M močoviny nebo 6 M guanidin HC1 obsahujících 10 mM Tris pH 8,0 plus 10 mM imidazol. Solubilizovaný protein byl přidán k 5 ml nikl-chelátové pryskyřice (Qiagen) a inkubován po dobu 45 minut až po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě za neustálého míchání. Po inkubaci byla směs pryskyřice a proteinu nalita přes kolonu a to., co proteklo, bylo shromážděno. Kolona byla poté promyta 10 - 20 objemy kolony solubílizačním pufrem.

Antigen byl poté eluován z kolony za použití .8 M močoviny, '10 mM Tris, pH 8,0, a 3Ó0 mM imidazolem a shromážděn ve 3ml frakcích. Stanovení na gelu SDS-PAGE bylo provedeno k zjištění, které frakce shromáždit pro další přečištění. Jako konečný krok přečištění byla připravena pomocí vhodného pufru silná anionaktivní iontoměničová pryskyřice, jako je Hi-Prep Q (Biorad) a shromážděné frakce z výše uvedeného postupu byly na tuto kolonu naneseny. Každý antigen byl eluován z kolony pomocí zvyšujícího se gradientu soli. Frakce byly shromažďovány během průtoku kolonou a byl připraven další SDS-PAGE gel ke stanovení, které frakce z kolony shromažďovat. Shromážděné frakce byly dialyzovány proti 10 mM Tris pH 8,0. Tento materiál byl poté vyhodnocen z hlediska přijatelnosti čistoty, jak byla stanovena SDS-PAGE nebo HPLC, koncentrace, jak byla

stanovena Lowryho zkouškou nebo analýzou aminokyselin, identity, jak byla stanovena aminoterminální sekvencí proteinu, a hladiny endotoxínu, jak byla stanovena Limulusovou zkouškou (LAL). Proteiny byly poté po filtraci přes 0,22 mikronový filtr rozděleny do ampulí a antigeny byly zamraženy do dalšího zpracování při imunizaci.

Pro vytvoření polyklonálních antisér bylo 400 mikrogramů každého prostatíckého antigenu smícháno se 100 mikrogramy muramyldipeptidu (MDP). Byl přidán stejný objem IFA (Incomplete Freunďs Adjuvantj a látky byly promíchány. Každé čtyři týdny byla zvířata vystavena působení 100 mikrogramů antigenu smíchaného se stejným objemem IFA. Sedm dní po každém vystavení působení byla zvířatům odebrána krev. Séra byla vytvořena inkubací krve při 4 °C po dobu 12 až. 24 hodin a odstředěním.

Pro charakterizaci polyklonálního antiséra byly 96jamkové desky pokryty antigenem inkubací s 50 mikrolitry (typicky 1 mikrogram) při 4 °C po dobu 20 hodin. Bylo přidáno 250 mikrolitrů BSA blokovacího pufru a jamky byly inkubovány při pokojové teplotě pod dobu 2 hodin. Desky byly šestkrát promyty systémem PBS/0,01% Tween. Antí-O8E králičí séra nebo afinitně přečištěná anti-08E protilátka byla zředěna v PBS. Padesát mikrolitrů zředěné protilátky bylo přidáno do každé jamky a inkubováno při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Desky byly promyty výše uvedeným způsobem před přídavkem 50 mikrolitrů kozí anti-králičí křenové peroxidázy (HRP) při zředění 1 : 10 0000 a byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Desky byly promyty výše uvedeným způsobem a do každé jamky bylo přidáno 100 mikrolitrů TMB mikrojamkového peroxidázového substrátu. Po 15 minutách inkubace v temnu při pokojové teplotě byla kolorimetrická reakce ukončena 100 mikrolitry 1N kyseliny sírové a výsledky byly ihned odečteny při 450 ·· nm. Všechny polyklonální protilátky vykazovaly imunoreaktivitu k 08E antigenů.

Pro rekombinantní expresi v savčích buňkách HEK293 byla 08E cDNA o plné délce subklonována do savčích expresních vektorů pcDNA3.1+ a pCEP4 (Invitrogen), které byly modifikovány tak, aby obsahovaly HIS a FLAG epitopové značky. Tyto konstrukty byly transfektovány do buněk HEK293 (ATCC) za použití činidla Fugene 6 (Roche). Buňky HEK293 byly naneseny při hustotě 100 000 buněk/ml v DMEM (Gibco) obsahujícím 10 % FBS (Hyclone) a kultivovány přes noc.Následující den bylo přidáno 2 ul Fugene6 k 100 ul DMEM neobsahujícím FBS a proběhla inkubace po dobu 15 minut při pokojové teplotě. K buňkám HEK293 byla poté přidána směs Fugene/DNA a proběhla inkubace po dobu 48 až 72 hodin při 37 °C se 7 % C'O₂. Buňky byly' opláchnuty PBS, potě shromážděny a napeletovány odstředěním. Pro analýzu Western blot (westernovým přenosem) byly lyzáty celých buněk vytvořeny inkubací buněk v lýzovém pufru obsahujícím Triton-X100 na ledu po dobu 30 minut. Lyzáty byly poté čištěny odstředěním při 10 000 ot./min po dobu 5 minut při 4 °C. Vzorky byly zředěny nanášecím pufrem SDS-PAGE obsahujícím beta-merkaptoethanol, poté vařeny 10 minut před nanesením na SDS-PAGE gel. Protein byl převeden na nitrocelulózu a navázán na anti-08E králičí polyklonální séra #2333L při ředění 1 : 750. Analýza byla provedena s kozím anti-králičím Ig navázaným na HPR a inkubací v substrátu ECL.

Pro analýzu FACS byly buňky dále promyty ledovým detekčním pufrem (PBS + 1% BSA + azid). Poté byly buňky inkubovány 30 minut na ledu s 10 ug/ml Proteinem A přečištěnými anti-O8E polyklonálními séry. Buňky byly promyty třikrát detekčním pufrem a poté byly inkubovány při zředění 1 : 100 s kozím anti-králičím IG(H+L)-FITC činidlem (Southern Biology) po dobu 30 minut na ledu. Po 3 promytích byly buňky resuspendovány v.detekčním pufru obsahujícím propidiumjodid (PI), vitální barvivo, které umožňuje identifikaci permeability buněk, a analyzovaly se FACS.

U těchto experimentů, jejichž výsledky jsou uvedeny na obrázcích 20 až 21 byla detekována exprese O8E na povrchu transfektovaných buněk HEK293 a buněk SKBR3 analýzou FACS za použití králičích anti-O8E sér. Exprese byla také detekována v lyzátech transfektovaných buněk HEK293 pomocí analýzy Western blot (obrázek.22).

Příklad 8

Vytvoření a charakterizace antí-O8E mAbs

Myší monoklonální protilátky byly získány proti od E. coli odvozeným proteinům O8E dále popsaným způsobem. A/J myši byly imunizovány íntraperitoneálně (IP) úplným Freudovým adjuvans (CFA -Complete Freunďs Adjuvant) obsahujícím 50 pg rekombinantního O8E a poté následným přeočkováním IP pomocí neúplného Freundova adjuvans (IFA Incomplete Freunďs Adjuvant) obsahujícím 10 pg rekombinantního proteinu O8E. Tří dny před odstraněním slezin byly myši imunizovány intravenózně přibližně 50 pg rozpustného rekombinantního proteinu 08E. Sleziny myší s pozitivním titrem na O8E byly vyňaty a byla vytvořena suspenze jednotlivých buněk vyrobená a použitá pro fúzi

SP2/O myelomálních buněk k přípravě hybridomů B buněk. Supernatanty z hybridních klonů byly testovány ELISA na specifitu k rekombinantnímu 08E a epitopovému mapování za použití peptidů, které zahrnovaly celou sekvenci 08E. Byly také testovány mAbs průtokovou cytometrií na jejich schopnost detekce O8E na povrchu buněk stabilně transfektovaných 08Έ a na povrchu buněčných linií nádoru prsu.

w w ·· ·· · · · • · ···· » · · * ···· ···· ·· ·· *· ··

Pro.analýzu ELISA byly 96jamko.vé desky pokryty buď ~rekombinantním proteinem O8E nebo překrývajícími 20-mer peptidy zahrnujícími celou molekulu O8E při koncentraci buď 1-2 pg/ml nebo 10 pg/ml. Po pokrytí byly desky pětkrát promyty promývacím pufrem (PBS +0,1 Tween-20) a blokovány PBS obsahujícím 0,5 % BSA, 0,4 % Tween-20. Poté byly přidány supernatanty hybridů nebo přečištěné mAbs a desky byly inkubovány po dobu 60 minut při pokojové teplotě.

Desky byly promyty pětkrát promývacím pufrem a po dobu 60 minut byla přidána sekundární protilátka, oslí anti myší Ig napojený na křenovou peroxidázu (HRP) (Jackson ImmunoResearch). Desky byly opět promyty pětkrát promývacím pufrem a byl přidán peroxidázový substrát. Z vytvořených hybridomových klonů· jich 15 vylučovalo mAbs, který rozpoznával celý protein O8E. Epitopové mapování odhalilo, že z těchto 15 klonů jich 14 vylučovalo mAbs, který rozpoznával aminokyselinové zbytky O8E 61 až 80 a jeden klon vylučoval mAb, který rozpoznával aminokyselinové zbytky 151 až 170.

Pro analýzu průtokovou cytometrií byly buňky HEK293, které byly podrobeny stabilní transfekci s O8E a SKBR3 buňkami, které vykazují expresi O8E mRNA, sklizeny a promyty v protékajícím vybarvovacím pufru (PBS + 1% BSA + azid). Buňky byly inkubovány se supernatantem z hydridů mAb 30 minut na ledu a poté 3 krát promyty vybarvovacím pufrem. Buňky byly inkubovány s kozím-anti myším Ig-FITC po dobu 30 minut na ledu a poté třikrát promyty vybarvovacím pufrem před resuspendováním v promývacím pufru obsahujícím propidiumjodid. Analýza průtokovou cytometrií odhalila, že 15/15 mAbs bylo schopno detekce proteinu O8E vzniklého expresí na povrchu 08E-transfektovaných HEK293 buněk. 6/6 mAbs testovaných na SKBR3 buňkách bylo schopno poznat O8E z povrchové exprese.

• ·· ·

Příklad 9 ........... . ............... ... . .

Rozšířená sekvenční analýza DNA a proteinu sekvence OZZ2P

Sekvence zahrnující klony 3f, 6b, 8e a 12 o plné délce byly získány screeningem knihovny cDNA vaječníkového tumoru (od SC1D odvozené) popsaným detailně v příkladu 2. Těchto 2996 párových bází, označených O772P, je uvedeno v SEQ ID NO: 311 a kóduje sekvenci 914 aminokyselin proteinu, jak je uvedena v SEQ ID NO: 312. Sekvence DNA O772P byla zkoumána proti veřejným databázím včetně Genbank a vykazovala významnou podobnost s přírůstkovým číslem Genbank AK024365 (SEQ ID NO: 457). Bylo zjištěno, že tato sekvence Genbank je délky 3557 párů bází a kóduje protein o 1156 aminokyselinách ( SEQ ID NO: 459). Zkrácená.verze.této sekvence, zbytek 25 až 3471, kde zbytek 25 odpovídá prvnímu iniciačnímu kodonu ATG u sekvence z Genbank, SEQ ID NO: 456 kóduje protein, který má délku 1148 aminokyselin (SEQ ID NO: 458). Publikovaná sekvence DNA (SEQ ID NO: 457) se liší od O772P v tom, že má inzerci 5 párů bází odpovídající bázím 958 až 962 SEQ ID NO: 457. Tato inzerce má za·, následek posun čtecího rámce, takže SEQ ID-NO: 457 kóduje · další N-terminální sekvenci 'proteinu oproti O772P (SEQ ID NO: 312). Kromě toho O772P kóduje jedinečnou N-terminální část obsaženou ve zbytcích 1 až 79 (SEQ ID NO: 460). Nterminální část SEQ ID NO: 456, zbytky 1 až 313, také obsahuje unikátní (jedinečnou) sekvenci a je uvedena jako SEQ ID NO: 461.

·· ·· ·· ·· ·'· ····

Příklad 10 ...............

Tvorba polyklonálních protilátek pro imunohistochemickou analýzu a cytometrickou analýzu s buňkami spojeného expresního vzoru molekuly O772P

Molekula O772P byla identifikována v příkladech 2 a 9 této přihlášky. K vyhodnocení subcelulární lokalizace a specifity exprese antigenu v různých tkáních byly vytvořeny polyklonální protilátky proti O772P. K produkci těchto protilátek byly podrobeny expresi O772P-1 (aminokyseliny 44 až 772 SEQ ID NO: 312) a O772P-2 (477-914 SEQ ID NO: 312) v rekombinantním expresívním systému E. coli při kultivaci přes noc při 37- °C v živném médiu LB. Následující den bylo 10 ml této kultury přidáno k 500 ml 2x ΎΤ obsahující vhodná antibiotika. Když optická hustota kultur (560 nm) dosáhla 0,4 až 0,6, byly buňky indukovány IPTG. Po indukci byly buňky sklizeny, promyty, lyžovány a převedeny přes French press při tlaku 16 000 psí. Buňky byly poté odstředěny a pelety byly analyzovány SDS-PAGE pro rozdělení rekombinantního proteinu. Pro proteiny, které byly lokalizovány v peletách buněk byly pelety resuspendovány v 10 mM Tris, pH 8,0, 1% CHAPS a pelety byly promyty a odstředěny. Promyté pelety byly znovu rozpuštěny buď 8 M močovinou nebo 6 M guanidin HC1 obsahujícími 10 mM Tris,, pH 8,0, plus 10 mM imidazolu. Solubilizovaný protein byl , poté přidán do 5 ml níkl-chelátové pryskyřice (Qiagen) a inkubován 45 minu při pokojové teplotě.

Po inkubaci byla směs pryskyřice a proteinu nalita na kolonu a to, co proteklo, bylo shromážděno. Kolona byla poté promyta 10 až 20 objemy kolony solubilizačního pufru. Antigen byl poté eluován z kolony za použití 8 M močoviny, 10 mM Tris , pH 8,0, a 300 mM imidazolu a shromážděn ve 3ml frakcích. Stanovení na gelu SDS-PAGE bylo provedeno

• « ke zjištění, které frakce, shromáždit pro další přečištění. Jako konečný purifikační krok byla připravena silná anionaktivní iontoměníčová pryskyřice a vhodným pufrem a shromážděné frakce z výše uvedeného postupu byly na tuto kolonu naneseny. Každý antigen byl eluován z kolony pomocí zvyšujícího se gradientu soli. Frakce byly shromažďovány během průtoku kolonou a byl připraven další SDS-PAGE gel ke stanovení, které frakce z kolony shromažďovat. Shromážděné frakce byly dialyzovány proti 10 mM Tris, pH 8,0, a výsledný protein byl podroben kontrole kvality pro konečné uvolnění. Kritéria uvolnění byly: čistota, jak byla stanovena SDS-PAGE nebo HPLC; b) koncentrace, jak byla stanovena Lowryho zkouškou nebo analýzou aminokyselin; c) identita, jak byla stanovena aminoterminální sekvencí proteinu; ad) hladina endotoxinu, jak byla stanovena Limulusovou zkouškou (LAL). Proteiny byly poté přefiltrovány přes 0,22 μΜ filtr a zamraženy do dalšího zpracování při imunizaci.

Pro vytvoření polyklonálních antisér bylo 400 mikrogramů O772P-1 nebo O772P-2 antigenu smícháno se 100 mikrogramy muramyldipeptidu (MDP). Každé čtyři týdny byli králíci imunizováni 100 mikrogramy antigenu Smíchaného se stejným objemem IFA. Sedm dní po každém vystavení byla zvířatům odebrána krev a séra byla vytvořena inkubací krve při 4 °C po dobu 12 až 24 hodin a následujícím odstředěním.

K charakterizaci antisér byly 96 jamkové desky pokryty antigenem a poté byly blokovány BSA. Králičí séra byla zředěna PBS a přidána do každé jamky. Desky byly poté promyty a byla přidána kozí-anti-králíčí křenová peroxidáza (HRP). Desky byly opět promyty a byl přidán TMB mikrojamkový peroxidázový substrát. Po inkubaci byla kolorimetrická reakce ukončena a desky byly ihned odečteny při 450 nm. Všechny polyklonální protilátky vykazovaly imunoreaktivitu k odpovídajícímu antigenu.

·· ··· · ·· ·· ♦ · · · · • · · • « • ·· « · · · · · · · · · ···· ···· ·· ·· ♦ · ·· imunohistochemické analýza exprese.Q772P hýla ......

provedena na formalinem fixované tkáni v parafinovém loži. Bylo zjištěno, že O772P je vytvářen expresí v normálních vaječnících a vaječníkových nádorech, ale ne v normálním srdci, ledvinách, tračníku, plicích nebo játrech. Kromě toho imunochemická analýza a analýza průtokovou cytometrií ukazují, že O772P je molekulou spojenou s plazmatickou membránou. O772P obsahuje 1 plazmatickou transmembránovou doménu, která je zřejmě kódována aminokyselinami 1 až 859, přičemž C-konec je intracelulární. Sekvenční analýza ukázala, že obsahuje 17 potenciálních N-spojených glykosylačních míst.

Příklad 11 . , . ·

O771P je vytvářen expresí na povrchu primárních vaječníkových nádorových buněk

Pro rekombinantní expresi v savčích buňkách byly 0772P-21008 (SEQ ID nO: . 38,7 ) a O772P cDNA (SEQ ID NO: 311 kódující protein SEQ ID MO: 312) o plné délce subklonovány do savčích expresních vektorů pBIB nebo pCEP4. Tyto konstrukty byly transfektovány do buněk HEK293 za· použití činidla Fugene 6 (Roche). Buňky HEK byly naneseny, při hustotě 100 000 buněk/ml v DMEM obsahujícím fetální hovězí sérum (FBS) a kultivovány přes noc. Následující den bylo přidáno 2 μΐ Fugene 6 k 100 μΐ DMEM neobsahujícímu FBS a proběhla inkubace po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Směs Fugene 6/DMEM byla poté přidána k 1 pg 077P/pBIB nebo O772P/pCEP4 plazmidové DNA a proběhla inkubace po dobu' 48 až 7 2 hodin při 37 °C se 7 % CO2. Buňky byly opláchnuty PBS, poté shromážděny a napeletovány odstředěním.

Pro analýzu Western blot byly lyzáty celých buněk vytvořeny inkubací buněk v lýzovém pufru následovanou přečištěním a odstředěním. Vzorky byly zředěny a převedeny ·· ···· ·· ·· ·· ·· ♦ · · · · * · · · · · • · ···· · · · • · « · · » · · · · ···· ···· ·· ·· ·· «· na SDS-PAGE. Gel byl poté převeden na.nitrocelulózu-a - · navázán na anti-O772P-2 králičí polyklonální protilátky. Přenesení bylo vyhodnoceno pomocí kozí anti-králičí 1G navázané na HRP a inkubací v ECL substrátu. Analýza Western blot odhalila, že 0772P-21008 by mohl být detekován v buňkách HEK293, které byly transfektovány O772P.

Pro stanovení expresního profilu O772P v buňkách byly kultivovány primární vaječníkové tumorové buňky v SCID myších. Buňky byly vyňaty z myší a analyzovány průtokovou cytometrií. Buňky byly promyty ledovým vybarvovacím pufrem obsahujícím PBS, 1 % BSA a azid sodný. Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut na ledu s 10 pg/ml přečištěného anti-O772P 1 a 0772-P2-polyklonálního séra. Po této inkubaci byly buňky třikrát promyty vybarvovacím pufrem a inkubovány s kozím anti-králičím Ig(H+L) konjugovaným na FITC (Southern Biotechnology). Buňky byly promyty a resuspendovány ve vybarvovacím pufru obsahujícím propidiumjodid (PI), kterým se identifikovaly neživotaschopné buňky. Buňky byly poté analyzovány za použití FACS (Fluorescence.Activated Cell Sorting). Analýza FACS odhalila, že O772P byl přítomen na povrchu buněk. Povrchová exprese O772P na buňkách nádoru umožňuje imunitní cílení terapeutických protilátek.

Příklad 12

Funkční charakterizace anti-O8E monoklonálních protilátek

Myší monoklonální protilátky (mAb) vytvořené proti od E. coli odvozenému O8E, jak bylo popsáno v příkladu 8, byly testovány na jejich schopnost podporovat internalizaci antigenu 08E. Internalizace protilátky byl® stanovena za použití cytotoxické zkoušky in vitro. Zkráceně, transfektované buňky HEK293 a O8E/HEK byly naneseny na 96 jamkové desky obsahující DME plus 10 % teplem ·· ·* ·· ·· ·· ··♦· • · · · · · · · · · · • · · · ·· . · · · • · ···· · · 9 · ···· ···· ·» ·· ·· ·· inaktivvoaného FBS v přítomnosti 50 .ng/jamku přečištěného anti-O8E nebo kontrolních protilátek. Izotyp anti-08E mABs byl následující: HA6-IgGl/kappa, 15C6-lgG2b/kappa, 18A8IgG2b/kappa a 14Fl-IgG2a/kappa. W6/32 je anti-lidská MHC třídy I myší monoklonální protilátka, která poskytuje pozitivní kontrolní stanovení, a dvě irelevantní mAbs, IrPharm a Ir-Crxa, byly použity pro negativní kontrolní stanovení. Po inkubaci s O8E specifickými protilátkami nebo odpovídajícími kontrolními protilátkami byl přidán mAb-zap, kozí anti-myší Ig-saporinem konjugovaná sekundární protilátka. (Advanced Targeting Systems) v koncentraci 100 ng/ml do poloviny jamky a desky byly inkubovány po dobu 48· až 72 hodin při 37 °C v inkubátoru se 7 % CO₂. Toto stanoveni má výhody vyplývající z toxické povahy saporinu, proteinu'inaktívujícího ribozym, který má při internalizaci cytotoxický účinek. Po inkubaci s mAb-zap byla internalizace kvantitativně vyhodnocena přídavkem MTS činidla a poté odečtením OD490 desky na ELISA mikrodeskovém odečítači. Obrázek 25 ukazuje výsledky této· zkoušky. Horní panel představuje HEK buňky, které nebyly transfektovány O8E a proto' by se protilátka O8E neměla vázat a být internalizována. Hladiny proliferace byly stejné u všech vzorků, ať už byly inkubovány s nebo bez mAb-zap, s výjimkou pozitivní kontroly Ab, W6/32. Spodní panel představuje buňky, které bylý transfektovány O8E a proto by měly vázat O8E specifické protilátky. Protilátky z hybridomů 11H6,

14E1 a 15C6, které rozpoznávají aminokyseliny 61 až 80 O8E, byly schopny vyvolat internalizaci. povrchového proteinu 08E, jak bylo stanoveno snižujícími se hodnotami proliferace v důsledku toxické povahy mAb-zap (viz obrázek 25). Protilátky tvořené hybrídomem 18Ά8, které rozpoznávají aminokyseliny 151 až 170 O8E nebyly schopny vyvolat internalizaci, jak bylo stanoveno normálními hladinami .V ·· '·· ·· ·· • · · · · · · · 9 « · • · · 9 · · · · ♦ • ···»···»· 9 • · · 9 · 9 9 · 9 9

9*99 9999 99 99 99 ·· proliferace ať už v nepřítomnosti, tak i v přítomnosti mAbzap.

Příklad 13

Charakterizace vaječníkového nádorového antigenu, 0772P

Sekvence cDNA a proteinu pro různé formy vaječníkového nádorového antigenu O772P byly popsány výše (např. příklady 2 a 9). Rešerše v Genbank ukázala, že O772P má vysoký stupeň podobnosti s FLJ14303 (přírůstkové číslo AK024365; SEQ ID NO: 457 a 463). Sekvence proteinů odpovídajících O772P a FLJ jsou uvedeny v SEQ ID NO: 478 a 479. FLJ 14303 byl identický s většinou O772P, přičemž 3' konec vykazoval 100% homologii. Bylo však zjištěno, že 5' konec FLJ14303 je delší než 5' O772P. Kromě toho FLJ14303 obsahoval inzert 5bp (SEQ ID NO: 457), což má za následek posun aminoterminální proteinové sekvence tak, že FLJ14303 využívá odlišný výchozí methionin než O772P a proto kóduje odlišný protein. Tato inzerce byla přítomna v genomové sekvenci a byla přítomna ve všech EST klonech, které vykázaly identitu v této oblasti, což naznačuje, že FLJ (SEQ ID NO: 457) představuje sestřihovoú variantu O772P s ORF obsahujícím rozsáhlejší a odlišný aminokonec. Další 5'-nukleotidové sekvence zahrnují repetiční sekvence, které byly identifikovány během genomového mapování O772P. 5' konec O772P a odpovídající oblast FLJ14303 vykazují homologii mezi 90 a 100 %. To celkově naznačuje, že O772P a FLJ14303 jsou odlišné sestřihové varianty stejného genu s odlišnými unikátními repetičními sekvencemi, které byly sestřiženy na 5'-konci genu.

Identifikace dalších deseti nebo více repetičních sekvencí ve stejné oblasti chromozomu 19 ukazuje, že může být mnoho forem O772P, každá s různým 5' koncem, v důsledku různého sestřihu nebo různých repetičních sekvencí.

·* «« • « · · · • · · ·« ·· • · * ·· • · · · · · · * · 9 *♦·· ··«· *· ·* ♦· ··

Analýza Northern blot 0772? dokazuje několik O772Phybridizačních transkriptů různé velikostí, některé přesahující 10 kb.

Během dalších analýz bylo identifikováno 13 dalších s O772P spřízněných sekvencí, kde sekvence cDNA a aminokyselinové sekvence jsou popsány v tabulce 2.

Tabulka 2

SEQ ID NO:	Popis	Transmembránové domény
464	LS#1043400.1(cDNA)	nd
465	LS#1043400.10(cDNA)	0
4 66	LS#1043400.11(cDNA)	2
467	LS#1043400.12(cDNA)	2
468	LSH043400.2(cDNA)	nd
469	LS#1043400.3(cDNA)
470	LS#1043400.5(cDNA)	nd
471	[,3()1043400.8 (cDNA)	1
472	LS#1043400.9(cDNA)	0
473	LSH043400.6(cDNA)	nd
474	LS#1043400.7(cDNA)	nd
475	LS#1043400.4(cDNA)	nd
47 6	LS#1397610.1(cDNA)	0
477	1043400.10(cDNA) nová 5'(cDNA)	-
480	LS#1043400.9 (aminokyselina)	-
481	LS#1043400.8B (aminokyselina) obsahuje transmembránovou doménu
482	LS#1043400.8A (aminokyselina)	-
483	LS#1043400.12 (aminokyselina) obsahuje transmembránovou

«· ·« ·· ·· *· ··♦· *·<· ···· · · , · • · · · ·* · « · • ««··»··*» · e · ·«·*«··» ····«*· * · ·· »· · ·

-----	doménu
484............	LS#1Ó434ÓO.1ÍB (aminokyselina) obsahuje transmembránovou doménu
485	LS#1043400.11A (aminokyselina)	-
486	LS#1043400.10 (aminokyselina)	-
487	LS#1043400.1 (aminokyselina)	-

nd = nestanoveno (not determíned)

Původně se zdálo, že tyto sekvence představují překrývající se a/nebo diskrétní sekvence sestřižených forem O772P, které byly schopny kódovat unikátní polypeptidy k specifickým sestřiženým formám O772P. Avšak seřazení nukleotidu těchto sekvencí nevedlo k identifikaci jakýchkoli identických oblastí v prvcích repetice. To naznačuje, že sekvence mohou představovat různé specifické oblasti jednoduchého O772P genu, jednu, která obsahuje 16 nebo více repetičních domén, přičemž všechny tvoří jednoduchý lineární transkript.

5' konec sekvence LS #1043400.10 (tabulka 2, SEQ ID NO: 465) je jednotný u O772P a FLJ14303 a neobsahuje repetíční prvky, což indikuje, že tyto sekvence mohou představovat 5' konec O772P.

Předtím transmembránová analýza naznačovala, že O772P obsahovala mezi 1 a 3 transmembránovými doménami. To bylo ověřeno za použití imunohistochemie a průtokové cytometrie, které ukázaly existenci s plazmatickou membránou spojených molekul představujících O772P. Imunohistochemie také ukázala přítomnost sekretované formy (forem) O772P, které jsou pravděpodobně důsledkem alternativní sestřižené formy O772P nebo posttranslačního štěpení. Analýza několika sekvencí uvedených v tabulce 2 ukázala, že sekvence ·· ·· > 9 · * • · ·· ·β··

- 100 ···· «·<» «· »· • · · · » · 9 • « ·* t « · * * · · · · · · · • · · · · · · · · «· ·« '««

1043400. Β.. 12, 1043400.8Β a 1043400.11Β všechny obsahovaly transmembránové oblasti, zatímco 1043400.8A, 1043400.10,

1043400.1, 1043400.1, 1043400.11Ά a 1043400.9 všechny postrádaly transmembránové sekvence, což naznačuje, že tyto proteiny mohou být vylučovány.

Analýza ukazuje, že část O772P je tvořena expresí a/nebo zachycena na plazmatické membráně, což činí z O772P atraktivní cíl zaměření specifických imunoterapií, například terapeutickými protilátkami proti tomuto proteinu. Předpokládaná extracelulární doména O772P je uvedena v SEQ ID NO: 489 a sekrece O772P pravděpodobně probíhá jako výsledek štěpení v této sekvenci:

SLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQ.LVĎIHVTEMESSVYQP

Proteolytické štěpení nejpravděpodobněji probíhá na lyzínu (K) v pozici 10 SEQ ID NO: 489. Extracelulární, transmembránové a cytoplazmatické oblasti O772P jsou všechny uvedeny v SEQ ID NO: 488.

Extracelulární:

SLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSS

TQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQKNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQ

VSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDR

SSVLVDGYFPNRNEPLTGNSDLPF

Transmembránové:

WAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTT

Cytoplazmatická:

RRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ

101 «· ·· ·· «· ·· ···· «··· ···· · · · • ····· ··· * ······»·· « • · ···· · · 9 · ···· ···· ·· »· ·« «4

Příklad 14 .......

Imunohistochemická (IHC) analýza exprese O8E ve vaječnikových rakovinných a normálních tkáních

K tomu, aby se zjistilo, které tkáně produkují expresi vaječníkového rakovinného antigenu 08E, byla provedena analýza IHC s různými vzorky tkání za použití jak polyklonálních, tak monoklonálních protilátek specifických pro O8E. Tvorba monoklonálních protilátek specifických pro O8E je popsána detailně v příkladu 8. Monoklonální protilátky použité pro detekci byly 11A6 a 14F1, kde obě jsou specifické pro aminokyseliny 61 - 80 08E a 18A8, které rozpoznávají aminokyseliny 151 až 170 08E (detaily tvorby viz příklad 12). ............

K provedení detekce byly vzorky tkání fixovány v roztoku formalinu po dobu 12 až 24 hodin a ukotveny v parafinu před rozřezáním na 8mikronové proužkové sekce. SHEIR (steam heat induced epitope retrieval) v 0,1M pufru citrátu sodného (pH 6,0) bylo použito pro optimální detekční podmínky. Sekce byly inkubovány s 10% sérem/PBS po dobu 5 minut. Poté bylý na 25 minut přidány ke každé sekci primární protilátky a poté následovala 25minutová inkubace buď s anti-králičí nebo anti-myší biotinylovanou protilátkou. Endogenní peroxídázová aktivita byla blokována třemi l,5minutoými inkubacemi s hydrogenperoxidázou. Systém komplex avidinbiotin/křenová peroxidáza (ABC/HRP) byl použit spolu s DAB chromogenem k vizualizaci exprese antigenu. Plátky byly vybarveny hematoxylinem k vizualizaci buněčných jader.

Výsledky za použití králičích afinitně přečištěných polyklonálních protilátek proti 08E (a.a. 29 - 383; detaily tvorby této Ab viz příklad 3) jsou uvedeny v tabulce 3. Výsledky použití tří monoklonálních protilátek jsou uvedeny v tabulce 4.

• ·

- 102

Tabulka 3

Imunohistochemická analýza O8E za použití polyklonálních protilátek.

Tkáň	Exprese O8E
Vaječníková rakovinná	Pozitivní
Prsní rakovinná	Pozitivní
Normální vaječníková	Pozitivní
Normální prsní	Pozitivní
Cévní	Pozitivní
Ledvinová	Negativní
Plicní	Negativní
Tračníkové	Negativní
Jaterní	Negativní
Srdeční	Negativní

Tabulka 4

Imunohistochemická analýza O8E za použití monoklonálních protilátek

Normální tkáň	1ΊΑ6	18A8	14F1
	Endotel 1	Epitel	Endotel	Epitel	Endotel	Epitel
Kůže	2	2	0	0	1	1
Kůže	1	1	0	0	1	1
Prs	0	1	n/a	n/a	1	1
Tračník	0	0	0	0	0	0
Lačník	0	0	0	0	0	0
Tračník	0	0	0	Ó	0	0

• ·

- 103

Tračník	o.	0 . .	o.	o	0 - -
Vaječník	0	0	0	1	0
Tračník	0	0	0	0	1
Játra	0	0	0	1	2
Kůže	0	0	0	1	0
Dvanáctník a pankreas	0	0	0	0	0
Apendix	0	0	0	0	0
Kyčelník	0	0	0	0	0

= bez zbarvení, 1 = mírné zbarvení, 2 = střední zbarvení, n/a = nedostupné

Příklad 15

Epitopové mapování polyklonálních protilátek O772P

K provedení epitopového mapování O772P byly vytvořeny peptidy, jejichž sekvence byly odvozeny od sekvencí O772P. Tyto peptidy byly 15mery, které se překrývaly v 5 aminokyselinách a byly vytvořeny chemickou syntézou na membránových nosičích. Tyto peptidy byly koValentně navázány na Whatman 50 celulózový nosič jejich Cterminálními konci s N-terminály nenavázanými. Ke stanovení epitopové specifity byly membrány zvlhčeny 100% ethanólem na 1 minutu a poté blokovány 16 hodin v pufru

TBS/TWEEN/Triton (50 M Tris, 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 0,5 % BSA, 0,05 % Tween 20, 0,05 % Triton X-100, pH 7,5). Tyto peptidy byly poté označeny 2 O772P specifickými protilátkami, O772B-1 (aminokyseliny 44 až 772 SEQ TD NO: 312) a O772P-2 (477 až 914 SEQ ID NO: 312; pro detaily tvorby protilátek viz příklad 10). Protilátky byly zředěny na 1 pg/ml a inkubovány na membránách po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Membrány byly poté promývány 30 minut v TBS/Tween/Triton pufru před inkubací s HRP-konjugovanou • · « · · · · ·

- 104 ani-králičí sekundární protilátkou v ředění 1 : 10000 po dobu 2 hodin. Membrány byly opět promyty 30 minut v TBS/Teen/Tríton a antipeptidová reaktivita byla vizualizována za pužití ECL. Specifická epitopová vazebná specifita pro každou z 0772P-polyklonálních protilátek je popsána v tabulce 5:

Tabulka 5

SEQ ID NO:	Peptid #	Anti-O772Pl	Anti-O772P2	Sekvence peptidu
490	2	***	-	TCGMRRTCŠTLAPGS
491	6	*	*/-	CRLTLLRPEKDGTAT
492	7	*	-	DGTATGVDA1CTHHP
493	8	-	-	CTHHPDPKSPRLDRE
494	9	***.	***	RLDREQLYWELSQLT
495	11		-	LGPYALDNDSLFVNG
496	13	****	-	SVSTTSTPGTPTYVL
497	22	-	-	LRPEKDGEATGVDAI
498	24	**	*/-	DPTGPGLDREQLYLE
499	27	*/-.	-	LDRDSLYVNGFTHRS
500	40	*/-	-	GPYSLDKDSLYLNGY
501	41	-	-	YLNGYNEPGPDEPPT
502	47	***		ATFNSTEGVLQHLLR
503	50	-	***	QLISLRPEKDGAATG
504	51	-		GAATGVDTTCTYHPD
505	52		*/-	TYHPDPVGPGLD1QQ
506	53	-	*	LDIQQLYWELSQLTH
507	58	-	*	H1VNWNLSNPDPTSS
508	59	-	*	DPTSSEY1TLLRD1Q
509	60_:	-	*	LRDIQDKVTTLYKGS
510	61	-	***	LYKGSQLHDTFRFCL
511	71	-	**	DKAQPGTTNYQRNKR

* relativní hladina reaktivity, - bez vazby, **** maximální vazba

- 105 ·· ·· ····

Příklad 16 . . . . . . . ...

Identifikace nových N-terminálních repetitivních struktur spojených s O772P

Jak bylo detailně uvedeno výše (např. příklady 1, 2, 9 a 14) byly identifikovány a charakterizovány různé formy O772P cDNA a proteinu. Je důležité, že bylo dokázáno, že O772P RNA a protein jsou oproti normálním tkáním nadprodukovány expresí v rakovinné tkání vaječniků a tak představují atraktivní cíl diagnostických a terapeutických aplikací při rakovině vaječniků.

Za použití bioinformační analýzy otevřených čtecích rámců (ORFj z genomové nUkleotidové sekvence, u které bylo předem zjištěno, že má homologii s O772P,bylo identifikováno v 5' oblasti genu kódujícího O772P protein několik nukleotidových repetičních sekvencí. Množství těchto repetičních sekvencí bylo potvrzeno RT-PCR za použití primerů jako specifických pro individuální repetice. Fragmenty, které obsahovaly několik repetic byly amplifikovány z cDNA, čímž se potvrdila přítomnost specifických repetic a dovolilo tó zjistit pořadí těchto repetic.

Neočekávaně bylo zjištěno, že když byly analyzovány různé sady sekvencí O772R odvozených od různých databází a laboratorních zdrojů, bylo identifikováno v 5' oblasti genu O772P a odpovídající N-koncové oblasti proteinu O772P alespoň 20 různých repetičních struktur, přičemž všechny navzájem vykazují podstatnou hodnotu identity (viz tabulku 6). Každá repetice zahrnuje konvenční otevřený čtecí rámec kódující polypeptidovou jednotku, která je schopna být sestřižena na jednu nebo více jiných repetic, takže konkatomery těchto repetic jsou tvořeny v různých počtech a pořadích. Je zajímavé, že v odborné literatuře byly popsány jiné molekuly mající repetíční strukturní domény analogické · ·

106 • · ······· · · • · · · « · · · · ♦ ···· ···· ·· ·· ·· ·· s těmi, které jsou zde popsané pro O772P. Například u mucinové rodiny proteinů, které představují hlavní glykoproteínovou složku mukózy, která povléká povrchy buňky dýchacího, zažívacího a urogenitálního traktu, bylo dokázáno, že jsou složeny z tandemových repetičních sekvencí, které se liší v počtu, délce a aminokyselinové sekvenci mucin od mucinu (PereZ-Vila a Hill, J. Biol. Chem. 274 (45): 31751 - 31754, 1999).

Předpokládá se, že různé zde uvedené identifikované struktury repetic dávají vzniknout různým formám O772P, nejpravděpodobněji alternativním sestřihem. Sekvence cDNA identifikovaných repetíc jsou uvedeny v SEQ ID NO: 513 až 540, 542 až 546 a 548 až 567. Aminokyselinové sekvence kódované těmito repeticemi jsou uvedeny v SEQ ID NO: 573 až 593. V mnoha případech tyto aminokyselinové sekvence představují konvenční sekvence, které jsou odvozené od seřazení více než jedné experimentálně odvozené sekvence.

Každá z těchto sestřižených forem je schopna kódovat jedinečný O772P protein s řadou repetičních domén připojených na konstantní karboxyterminální proteinovou část O772P, která obsahuje transmembránovou oblast.

Sekvence cDNA konstantní oblasti O772P je uvedena v SEQ ID NO: 568 a kódovaná aminokyselinová sekvence je. uvedena v SEQ ID NO: 594.

Všechny dostupné sekvence O772P, které byly získány, byly rozloženy na své identifikovatelné repetice a tyto sekvence byly porovnány za použití Clustalovy metody s tabulkou hmotností zbytků (software MegAlign v balíčku pro sekvenční analýzu DNASTAR) k identifikaci vztahu mezi sekvencemi repetic. Za použití těchto informací, dat poskytnutých RT-PCR a sekvenčním srovnáním (automatickým a manuálním) za použití SEQMan (DNASTAR) byla identifikována jedna konvenční sekvence kontigu O772P o plné délce ·· * · · β · ·

- 107 obsahující 20. .odlišných repetičních-jednotek. cDNA pro kontig O772P je uvedena v SEQ ID NO: 569 a kódovaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 595. Tato forma proteinu O772P zahrnuje následující konstantní repetiční struktury v následujícím pořadí: SEQ ID NO: 574 SEQ ID NO: 575 - SEQ ID NO: 576 - SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578 - SEQ ID NO: 579 - SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581

- SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583 - SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585 - SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587 - SEQ ID NO: 588

- SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590 - SEQ ID NOr 591 - SEQ ID NO: 592 - SEQ ID NO: 593.

SEQ ID NO: 595 tak představuje jednu ilustrativní konstantní sekvenci pro protein O772P o plné délce. Jak je uvedeno výše,- na základě stávajících znalostí tohoto proteinu a na základě výše uvedené odborné literatury popisující proteiny obsahující analogické repetiční struktury, však může být očekávána existence mnoha jiných forem O772P s buď méně nebo více repeticemi. Kromě toho se předpokládá, že mnoho forem O772P má různé uspořádání, např. různá pořadí, těchto N-terminálních repetičních struktur. Existence řady forem OZZ2P majících různý počet repetic je podpořena Northern analýzou O772P. V této studii Northern hybridizace O772P specifické sondy měla za výsledek řadu různých hybridizačních transkriptů O772P, některé převyšující 10 kb.

Variabilní repetiční oblast proteinu O772P může být ilustrativně představována strukturou Xn-Y, kde X zahrnuje strukturu repetice mající alespoň 50% identitu, s repetiční sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 596, n je počet repetic přítomných v proteinu a předpokládá se, že bude typicky celé číslo od 1 do 35; Y zahrnuje sekvenci konstantní oblasti 0772P uvedenou v SEQ ID NO: 594 nebo sekvenci mající alespoň 80% identitu se SEQ ID NO: 594. Každá X přítomná v repetiční oblasti Xn molekuly 0772 je různá.

- 108 ··· ·

Ke stanovení konvenčních sekvencí.každé u 20 repetičních oblastí byly srovnány sekvence experimentálně stanovené pro určitou repetiční oblast a byla stanovena konvenční sekvence. Kromě stanovení konvenční sekvence pro individuální repetiční oblasti byla stanovená také konvenční repetiční sekvence. Tato sekvence byla získána srovnáním 20 individuálních konvenčních sekvencí. Variabilita repetic byla stanovena srovnáním konvenčních aminokyselinových sekvencí z každé individuální repetiční oblasti se všemi repetičními konvenčními sekvencemi. Data o identitě jsou uvedena v tabulce 6.

Repetice (aminokyselina)	.SEQ ID NO:	Procentická identita s konvenční repetiční sekvencí
2	574	88
3	.57 5	84
4	576	88
5	577	89
6	578 -	93
7	579	90
8	580	⁹¹
9	581	88
10	582	85
¹¹	583	⁸⁶
12	584	87
13	585	87
14	586	89
15	587	89
16	588	89
17	589	83
18	590	84
19	591	83

- 109 « ·· · • · · é · · · · · « « «««· · · · i ···· ···« ·· ** «· ··

20	592.....	57
²¹	593	68

Z předcházejícího popisu je zřejmé, že přestože byla za účelem ilustrace popsána specifická provedení, je možno učinit řadu modifikací bez opuštění smyslu a rozsahu tohoto vynálezu. Proto tento vynález není omezen jinak, než následujícími nároky.

Claims

1. Polypeptid O772P mající strukturu:

X_n-Y kde X zahrnuje sekvenci s alespoň 50% identitou s konvenční repetíční sekvencí O772P uvedenou v SEQ ID NO: 596;

Y zahrnuje sekvenci s alespoň 80% identitou s O772P konstantní oblastí uvedenou v SEQ ID NO: 594;

n je celé číslo od 1 do 35;

pncemz kazda X přítomna jiná.

2. Polypeptid podle nároku 1, vybranou ze skupiny sestávají SEQ ID NO: 574 až 593.

3. Polypeptid podle nároku 1, uvedenou v SEQ ID NO: 594.

4. Polypeptid podle nároku 1,

25.

5. Polypeptid podle nároku 1,

6. Polypeptid podle nároku 1, zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:

v uvedeném polypeptidů je kde X zahrnuje sekvenci :í z jakýchkoli ze sekvencí kde Y zahrnuje sekvenci kde n je celé číslo od 15 do kde n je 20.

kde uvedený polypeptid

7. Polypeptid podle nároku 1, přičemž uvedený polypeptid je ve srovnání s normálními tkáněmi produkován expresí více ve vaječníkových rakovinných buňkách.

- 111 ····

8. Polypeptid O772P mající strukturu:

Xn-Y kde X zahrnuje repetíční sekvencí 0772P vybranou ze skupiny sestávající z jakékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 574 až 593;

Y zahrnuje sekvenci mající alespoň 90% identitu s O772P sekvencí konstantní oblasti uvedené v SEQ ID NO: 594;

n je celé číslo od 15 do 25;

přičemž každá X přítomná v uvedeném polypeptidu je jiná. - .. .

.9. Polypeptid podle nároku 8, kde n je 20.

10. Polypeptid podle nároku 8, kde uvedený polypeptid zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 595.

11. Polypeptid podle nároku 8, přičemž uvedený polypeptid je ve srovnání s normálními tkáněmi produkován expresí více ve vaječníkových rakovinných buňkách.

12. Polypeptid O772P mající strukturu:

Xn-Y kde n je 20 a X zahrnuje následující repetiční sekvence O772P:

SEQ ID NO: 574 - SEQ ID NO: 575 - SEQ ID NO: 576 - SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578 - SEQ ID NO: 579 - SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581 - SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585 - SEQ ID NO: 586 - SEQ ID

112 • - · · · · · · · · * « • · · · · · · · · · ·*·· ·»*· ·· ·· ··

NO: 587 - SEQ ID NO: 588,- SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590 - SEQ ID NO: 591 - SEQ ID NO: 592 - SEQ ID NO: 593; a

Y zahrnuje sekvence uvedené v SEQ ID NO: 594.

13. Polypeptid podle nároku 12, kde uvedený polypeptid zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 595.

14. Polypeptid podle nároku 12, přičemž uvedený polypeptid je ve srovnání s normálními tkáněmi produkován expresí více ve vaječníkových rakovinných buňkách.

15. Polynukleotid O772P mající strukturu:

' Xn-Y kde

X zahrnuje O772P repetíční sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z jakékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 512 až 540, 542 až 546 a 548 až 567;

Y zahrnuje sekvenci mající alespoň 95% identitu s O772P konstantní oblastí uvedenou v SEQ ID NO: 568;

n je celé číslo od 1 do 35;

přičemž každá X přítomná v uvedeném polypeptidu je jiná.

16. Polynukleotid podle nároku 15, kde uvedený polynukleotid zahrnuje SEQ ID NO: 569.

17. Polynukleotid podle nároku 15, kde n je od 15 do 25.

18. Polynukleotid podle nároku 15, kde n je 20.

113 »·« · ···· ·· ··· ·

19, Polynukleotid podle-nároku 15, přičemž-uvedený polynukleotid je ve srovnání s normálními tkáněmi produkován expresí více ve vaječníkových rakovinných buňkách.

20. Izolovaný polynukleotid zahrnující sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze:

a) sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až

569;

b) komlementů sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569;

c) sekvencí sestávajících z alespoň 20 následujících zbytků sekvencí uvedených V SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569;

d) sekvencí, které se hybridízují na sekvence uvedené v SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569 za velmi přísných podmínek;

e) sekvencí majících alespoň 75% identitu se sekvencemi z SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569;

f) sekvencí majících alespoň 90% identitu se sekvencemi z SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569; a

g) degenerativních variant sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 464 až 477 a 512 až 569.

21. Izolovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze:

a) sekvencí kódovaných polynukleotidem podle nároku

20; a

b) sekvencí majících alespoň 80% identitu se sekvencí kódovanou polynukleotidem podle nároku 20; a

114

9<9 9 9 99

99 9999 • 9 9

9 9 9

9 · *

9 4 · *

c) sekvencí majících alespoň 90% identitu se sekvencí kódovanou polynukleotidem podle nároku 20.

22. Expresívní vektor zahrnující polynukleotid podle nároku 20 operativně napojený na expresní řídící sekvenci.

23. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektované expresívním vektorem podle nároku 22.

24. Izolovaná protilátka nebo její fragment vázající antigen, které se specificky vážou na polypeptid podle nároku 21.

25. Způsob detekce výskytu rakoviny u pacienta, zahrnující kroky:

a) získání biologického vzorku od pacienta;

b) kontakt biologického vzorku s vazebným činidlem, které se váže na polypeptid podle nároku 21;

c) detekce množství polypeptidu ve vzorku, které se váže na vazebné činidlo; a

d) srovnání množství polypeptidu s předem stanovenou hraniční hodnotou a z toho pak stanovení výskytu rakoviny u pacienta.

26. Fúzní protein zahrnující alespoň jeden polypeptid podle nároku 21.

27. Způsob stimulace a/nebo expanze T buněk specifických pro nádorový protein, zahrnující kontakt T buněk s alespoň jednou složkou vybranou ze skupiny sestávající z:

a) polypeptidů podle nároku 21;

b) polynukleotidů podle nároku 20; a

c) buněk poskytujících antigen, které poskytují expresi polynukleotidu podle nároku 20;

i

115 «· ·· ·* ··· · · · ♦ · · « · · • * ·♦ · · za dostatečných podmínek a po*dobu dostatečnou k poskytnutí stimulace a/nebo expanze T buněk.

28. Izolovaná populace T buněk obsahující T buňky připravené způsobem podle nároku 27.

29. Kompozice obsahující první složku, vybranou ze skupiny sestávající z fyziologicky přijatelných nosičů a imunostimulátorů, a druhou složku vybranou ze skupiny sestávající z:

a) polypeptidů podle nároku 21;

b) polynukleotidu podle nároku 20; a

c) protilátek podle nároku 24;

d) fúzních proteinů podle nároku 26;

e) populací T buněk podle nároku 28; a

f) buněk poskytujících antigen, které poskytují expresi polypeptidu podle nároku 21.

30. Způsob stimulace imunitní odezvy u pacienta zahrnující podávání kompozice podle nároku 29 pacientovi.

31. Způsob ošetření rakoviny vaječníků u pacienta, zahrnující podávání kompozice podle nároků 29 pacientovi.

32. Způsob stanovení výskytu rakoviny u pacienta, zahrnující kroky:

a) získání biologického vzorku od pacienta;

b) kontakt biologického vzorku s oligonukleotidem, který se hybridizuje na polynukleotídovou sekvenci podle nároku 21 za středně přísných podmínek; a

c) detekce množství uvedeného polynukleotidu, které se hybridizuje na oligonukleotid; a «« ····

116 . d) srovnání množství uvedeného polynukleotidů, který se hybridizuje na oligonukleotid, s předem stanovenou hraniční hodnotou a z toho pak stanovení výskytu rakoviny u pacienta.

33. Polypeptid 0772 zahrnující alespoň sekvenci protilátkového epitopů uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 490 až 511.

34. Polypeptid 08E zahrnující alespoň sekvenci protilátkového epitopů uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 394 až 41535. Izolovaná protilátka, její fragment vázající antigen, které specificky vážou polypeptid podle nároku 1.

·· **

- 117 • ·· · »·· · ···· 'Μ

Anotace ?V . . .....

Název vynálezu: Kompozice a způsoby pro terapii a diagnózu rakoviny (ompozice a způsoby pro terapii a diagnózu rakoviny, jako je rakovina vaječníků. Kompozice mohou obsahovat jeden nebo více vaječníkových karcinomových proteinů, jejich imunogenních částí, polynukleotidů, které kódují tyto části nebo protilátek nebo buněk imunitního systému specifických pro tyto proteiny. kompozice mohou být použity například pro prevenci a léčení chorob, jako je rakovina vaječníků. Dále jsou poskytovány metody pro identifikaci nádorových antigenů, které jsou vylučovány z vaječníkových karcinomů a/nebo jiných nádorů. Zde poskytované polypeptidy a polynukleotidy mohou být dále použity pro diagnózu a monitorování rakoviny vaječníků.