JP5503837B2 - 非共有結合により誘導される求核性タンパク質へのリガンドの共有結合 - Google Patents

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Description

発明の概要
非触媒タンパク質は求電子性の低い活性部位特異的化合物に特異的結合する際に求核反応性を示すことが発見された。これらの活性化求核体はタンパク質中の通常の非共有結合部位を見定めて機能する。現在まで、そのように活性化した求核体は、セリンプロテアーゼにみられるような酵素の触媒部位にのみ存在すると考えられていた。本発明では、アルブミン、カルモジュリン、gp12O、ならびにgp120、EGFRおよび第VIII因子に対する抗体を含めたいくつかの非酵素タンパク質で求核部位が同定された。これらのタンパク質に活性化した求核体が存在することは、タンパク質のフォールディングならびに他の高分子および低分子とのタンパク質相互作用から生じる、本発明化合物との特異的非共有結合相互作用が形成されることを示している。
ビオチン含有求電子エステルおよび蛍光求電子エステルが求核部位を同定するために使用されている。求電子性原子と空間的に近い部分への非共有結合により、確定した結合特異性でタンパク質の活性部位求核体にターゲッティングすることが可能となった。本発明のために、リガンドとレセプターは、非共有結合力を介して会合できる同一タンパク質の分子を含めた任意の分子対と定義される。そのような求核タンパク質は求核レセプター(NuR)と称される。非共有結合相互作用により誘導されてNuRと共有結合することが可能な求電子リガンドアナログはCAL(共有結合リガンドアナログ；Covalent Analogs of Ligands)と称される。極端な場合、(CaLNuRと称される)NuRのCALを調製し、求核体を発現するCALNuRの所与の分子を第二のCALNuR内に組み込まれた共有結合反応性求電子体でそのCALNuR分子と共有結合させることが可能になる。
本発明は、
・ CALを用いた病原性NuR活性の不可逆阻害、
・ 相応に安定化された生物学的活性を有する非共有結合CALNuR超分子複合体の共有結合安定模擬体の形成、
・ ウイルス、原核細胞および真核細胞の表面に提示されたライブラリーからの、天然未修飾高分子および低分子に共有結合できるNuRを含めた個別のNuRポリペプチドおよびそれらの遺伝子の容易な単離、
・ ランダムまたは特異的配列多様化による、所望の結合活性を発現するNuRの定方向進化後の、非共有結合部位と合致した活性部位求核体の選択、
のために使用できる。
本発明の目的は、式(1):
Figure 0005503837
[式中、L1...Lx...Lmはリガンド決定基の構成要素であり、
Lxはアミノ酸残基、糖残基、脂肪酸残基およびDNA残基からなる群から選択されるリガンド決定基の構成要素単位であり、
L'はLxの官能基であり、
Y"はリンカーまたは共有結合であり、
Y'は荷電した基または中性基であり、
Yは前記リガンド決定基に結合するレセプターと特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、
nは1から1000の整数であり、かつ
mは1から30の整数である] の共有結合反応性リガンドアナログ(CAL)を提供することである。
本発明の別の目的は、式(1)の化合物を前記化合物のリガンド決定基と特異的に反応するNURを含有する溶液と接触させることを含む、可溶性求核レセプター(NUR)を不活性化または活性化する方法を提供することである。
１つの目的は、式(1)の化合物を、前記化合物のリガンド決定基と特異的に反応するNURを含有する、具体的にはHIV-1およびHCVなどの病原ウイルスを含めた微生物と接触させることを含む、微生物により産生される求核レセプターを不活性化または活性化する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、式(1)の化合物を、前記化合物のリガンド決定基と特異的に反応する具体的には上皮増殖因子のレセプター、血管作用性腸管ペプチドのレセプターおよびCD4を含めた求核レセプター(NUR)を含有する細胞と接触させることを含む、細胞表面に発現されるNURの拮抗作用または作動作用のための方法を提供することである。
別の目的は、式(1)の化合物を、前記化合物のリガンド決定基と特異的に反応するNURを発現するリンパ球と接触させることを含む、リンパ球の死滅を誘導するための方法を提供することである。
なお別の目的は、式(1)の化合物の多数の単位を備える安定な自己集合生体分子を調製するための方法を提供することである。
別の目的は、HIVに対するワクチン接種のための安定な自己集合オリゴマー性gp120-CALを提供することである。
別の目的は、HIV感染の免疫治療に適したモノクローナル抗体を生成させるための免疫原として自己集合生体分子であるオリゴマー性gp120-CALを使用することである。HIV。
本発明の別の目的は、適当に標識された式(1)のCALの誘導体を画像化すべき細胞に曝露すること、およびその標識を検出することを含む、表面にNURを発現する細胞を画像化するための方法を提供することである。
別の目的は、抗体の単離、誘導および阻害に適した化合物を提供することである。
別の目的は、in vitroの定方向進化法(directed evolution)によって、具体的には成長ホルモンなどのホルモン、血管作用性腸管ペプチドなどの神経ペプチド、スブチリシンなどの酵素、およびHIV-1に対する抗体などの抗体を含めた、リガンド結合活性および酵素活性が改良されたタンパク質の単離に適した化合物を提供することである。
別の目的は、具体的にはHIVおよびHCVなどのウイルスに対する抗体の検出を含めた、式(1)の化合物の使用による抗体および抗原の検出のための改良イムノアッセイを提供することである。
発明の説明
1. 抗体の求核反応性
タンパク質の求核反応性は、ある種のアミノ酸側鎖の活性化から生じる。セリンプロテアーゼでは、Ser-His-Asp三つ組構造の正確な空間配置によりSerの酸素に求核反応性を付与する水素結合ネットワークの形成が可能になる。ベンスジョーンズタンパク質のCDR1とセリンプロテアーゼの活性部位Ser残基周辺のペプチド領域との間の配列ホモロジーに基づいて、Abは酵素様活性部位を発現することが1973年に予測された(1)。Ser27a-His93-Asp1から構成されるセリンプロテアーゼ様触媒三つ組構造が、部位特異的突然変異誘発によってVIPに対する抗体(Ab)の軽鎖(L鎖)に存在することが同定された(2)。
セリンプロテアーゼの触媒にとって共有結合反応性は必要条件であるが十分条件ではない。これは、触媒サイクルの完了が共有結合アシル-酵素中間体の形成後に起こる事象、すなわち中間体の加水分解および産生したペプチドの放出が容易になることを必要とするからである(図1)。このように、触媒活性の不在にもかかわらずタンパク質は求核反応性を発現できる。最近の研究は、全てでないにしても大部分のAbが通常の酵素よりも大きなレベルで求核反応性を発現することを示している(3)。これらのAbはCALと称される共有結合により活性化したリガンドを用いて同定された。これらのCALは活性化求核体と安定共有結合を形成する求電子リン原子を含んでいた。以前の研究は、求核活性が生殖細胞Vドメインによってコードされる遺伝性形質であることを示した(2、4)。[約50個のVHおよび50個のVL遺伝子ならびに少数のD遺伝子(diversity gene)およびJ遺伝子(joining gene)が遺伝Abレパートリーを構成している]。求核反応性が生殖細胞にコードされていることから、原則として免疫系は任意のポリペプチド抗原に対する求核Ab応答を生じることができるはずである。
我々は、本発明のハプテンであるホスホン酸ジエステルとの共有結合アダクトの生成速度から決定されるとおり、IgG調製物がトリプシンよりも強力な求核反応性を表すことができることを発見した。ポリクローナルIgGおよび個別の単鎖Fv(scFv)クローンの研究は、Abに明らかに普遍的に求核反応性が存在することを示している。Abを熱処理した場合、求核反応性のレベルの混乱が明白であり、これは求核体の活性化がタンパク質の天然コンホメーションに依存するという考えと一致している。
成熟Abの抗原特異的認識を担う従来の非共有結合力と、それらAbの求核部位との間の機能的協調を高分子量ポリペプチド性CAL(LaCAL)を用いて検討した。LaCALはペプチド主鎖内またはタンパク質の側鎖基内にホスホン酸基を含んでいる(図2)。LaCALに組み込まれたペプチドエピトープに対して特異的なAbは、関連性のないAbを超えるレベルで不可逆結合を示した(3)。実施例Iに記載するように、このことはいくつかの非触媒Abを含め、検討された各Abで真実であった。
抗原特異的求核反応性が優れているにもかかわらず、大部分のIgG Abは抗原特異的触媒活性を発現しない。抗原によるBリンパ球レセプター(BCR、Igα/Igβに結合している表面Ab)の占有はB細胞の増殖を促進する。効率的なBCR触媒は、生成物放出が細胞分裂を誘導するのに必要なBCR膜貫通シグナル伝達よりも速いならば、クローン増殖を中断する。免疫系のこの特性は免疫応答過程の際に触媒機能の適応改良を制限する生理学的障壁となる。比較として、これがBCRの占有を延長するならば改良したAb求核性を阻むものはない。極端な場合には、求核性の増大は抗原との完全な共有結合の形成を招きうる。共鳴電子共有メカニズムによる部分共有結合の形成の方が出現が少ない(図3参照、部分共有結合性を有する弱結合のよく知られている例は水素結合である)。求核Abは抗原と安定なデッドエンドの共有結合複合体も形成する可能性があり、そのような例の2つが刊行され(5、6)、我々の研究室の未発表の研究では、ある種のAbによるアルブミンの安定結合が観察された。その結合はSDS処理に耐性であった。
2. 非共有結合力と協調したタンパク質求核性の広い分布
実施例5に開示しているように、低分子量CAL(ハプテンCAL)に対する共有結合についての一連の精製タンパク質のスクリーニングは、求核反応性がHIV gp120、アルブミン、上皮増殖因子レセプターの可溶性細胞外ドメイン(sEGFR)、カゼインおよびCD4の可溶性細胞外ドメイン(sCD4)を含めた多様なタンパク質に広範囲に分布していることを示した。これらのタンパク質のいずれも公知の酵素活性を全く有さない。求核反応性のレベルは種々のタンパク質で多様であり、このことはそれぞれのタンパク質の独自の分子性質を示唆している。
2つのリガンドsCD4-CALおよびVIPのCAL誘導体と、それらのレセプターそれぞれgp120およびカルモジュリンとの間の共有結合に及ぼす非共有結合相互作用の促進性の影響も本発明に開示されている。非共有結合相互作用によるsCD4-gp120およびVIP-カルモジュリン結合は以前に記載されている(7、8)。SCD4-CALおよびVIP-CALは、非タンパク質ハプテンCALの制御に秀でたレベルでそれぞれgp120およびカルモジュリンに対して特異的および不可逆結合を示す。gp120およびカルモジュリンによってそれぞれsCD4およびVIPとの非共有結合を担う活性部位内で発現される天然求核体の存在によって、共有結合相互作用が可能になる。gp120およびカルモジュリンは、LaCALによる共有結合活性化または不活性化に感受性の求核レセプター(NuR)の例である。
振り返ってみると、通常の非共有結合力と協調したタンパク質求核反応性の相互作用が広く分布していることは、分子間タンパク質-タンパク質結合を担うタンパク質決定基の固有の性質として理解できる。天然タンパク質-タンパク質複合体のこの新規なモデルにおいて、複合体中のある原子が共通のオービタル中の電子を共有でき、複合体の安定化をもたらす。その複合体における天然共有結合相互作用が強度において安定共有結合と同等である必要性はない。結合は部分共有結合性を有する相互作用(例えば、水素結合は部分共有結合性を有する結合の例となる)を伴ってもよい。上に言及したように、図3に示す複合体における求核酸素と求電子炭素原子との間の電子の共有は、複合体の基底状態の安定化を担う擬似共有結合状態の例として適格である。現在までにそのような結合相互作用は酵素触媒に関連する遷移状態複合体において専ら形成すると考えられていたが、部分共有結合が遷移状態相互作用に限られると予測する理論的基盤は存在しない。求核-求電子結合相互作用の出現は、基底状態の複合体におけるタンパク質間の天然分子間結合を安定化し、化学触媒において反応がさらなるステップに進む必要のないメカニズムとして起こると我々のモデルでは考えられている。このように我々は、本発明におけるCALおよびLaCALを用いて観察される求核反応性の発見を、それらの多様な強度の共有結合相互作用において天然リガンドとかみ合うタンパク質活性部位の固有の能力の反映と考えている。
3. 共有結合による高分子の集合
同一タンパク質の個別の分子を伴う分子間ホモ会合反応は、異なるタンパク質間のヘテロ複合体形成反応に使用される力と類似した力を必要とする。HIV gp120-CAL調製物を含めるがそれに限定されないタンパク質の共有結合ホモ集合の自然形成が本発明に開示されている。LaCALとNuRとの間のヘテロ複合体化の場合と同様に、集合はgp120の自然集合の形成に必要な非共有結合相互作用により誘導される。gp120は非共有結合オリゴマーとしてHIV表面に発現することがよく知られている。gp120オリゴマーの間の接触領域が我々のモデルでは部分共有結合力を介して結合する天然求核体-求電子体対を含むことから、非共有結合gp120オリゴマーの天然構造を刺激するgp120-CALの共有結合性集合の形成が起こる。本発明に開示されているgp120-CAL調製物は、天然求電子体よりも強い共有結合反応性を発現する人工求電子体を含有する。したがって、天然求核体と安定共有結合が形成し、天然gp120オリゴマーに類似したコンホメーションを有するgp120-CALオリゴマーの集合が生じる。
4. CALの構造
種々の種類の生体現象への有用性を開拓するために、多様なハプテンCAL構造およびLaCAL構造が本発明に開示される。共有結合反応性求電子体および弱結合基が空間的に見当し合ってNuRの活性部位に対する特異的共有結合を達成することが可能になるという考えがCALの設計を推進した。設計特性の例は以下のように開示されている。
ハプテンCALは、普通は分子量1000Da以下を有する低分子量CALと定義される。NuRとのハプテンCALの反応性はハプテンCALに含まれる求電子体との共有結合反応および隣接基の非共有結合性認識に限定される。LaCALは一般式L-Eで表すことができ、式中Lは弱結合相互作用をもたらし、EはNuRと共有結合する能力をもたらす。NuRは膜結合型レセプター、可溶性レセプター、酵素または抗体でありうる。自己集合反応の場合、NuR内の天然求核体は、別のNuR分子のLaCAL誘導体に人工的に挿入された求電子体と反応する。一般に、LaCAL構造の設計は結合相互作用のスプリットサイトモデル(split site model)に基づき、そのモデルではL構成要素における弱結合リガンドサブサイトおよびE構成要素における求電子反応性サブサイトは別個であるが分子の機能的に協調した領域として扱われる(図2)。
説明の都合上、低分子量ハプテンCALを、LaCALの高分子量L-E構造に組み込まれたE単位に等しいと見なすことができる。共有結合を招く求電子体-求核体対形成はE単位で起こる。本発明のために用語「高分子量」は7.1kcal/mol以上(Kd10-5M以下に相当)の集合体の結合自由エネルギーを十分に弱い結合力に供給することができる任意の実体を含む。用語「弱い」は従来の非共有結合力および部分共有結合性を有する結合をもたらす求電子体-求核体対の自然の形成反応を含む。特定の最小エネルギーは、自然の生体反応に必要な特異的レセプター-リガンド相互作用、酵素-基質相互作用、抗原-抗体相互作用および高分子自己集合反応をもたらす弱い結合に典型的な相互作用の最小結合エネルギーに対応する。
例えば、LaCALのL単位は4つ以上のアミノ酸から構成されるペプチドから構成されうる。また、高分子量タンパク質に含まれる別個のL内に含まれる線状または不連続エピトープはL構成要素として働きうる。オリゴヌクレオチド、オリゴ糖およびオリゴ脂質繰り返し構造もLaCALにおいて弱く結合するL部分として含まれるのに適格である。
ポリペプチドの場合、[LI...Lx...Lm]はLaCALによって弱く認識されるリガンド決定基の構成要素アミノ酸である。これらの弱い相互作用は、1つまたは複数のLaCAL求電子体と1つまたは複数のNuR求核体(Nu)との間の共有結合相互作用と共に起こる。[L1...Lx...Lm]は求電子体と空間的に近接したアミノ酸の線状セットまたは不連続セットでありうる。図2において[L1...Lx...Lm]をつなぐ点線は結合相互作用をもたらさない長短のポリペプチド主鎖を表す。タンパク質は1つまたは複数の結合決定基を発現しうるため、ポリペプチドLaCALは1つまたは複数のセットのそれぞれ共有結合反応性の求電子体を含む場合があり、各セットはそれ自体の[L1...Lx...Lm]サブサイトを伴う。
一般的なLaCAL構造を図4に示す。求電子体Eは全てのCALの本質的構成要素である。標的タンパク質(NuR)にみられる求核体(Nu)との共有結合反応はE内の求電子性原子で起こる。Eは最小には一般式Y"-Y'-Yから構成され、式中、(a)Yは求電子基を含み、(b)Y'はP1部位の非共有結合性認識を果たす正荷電した基、負荷電した基、かさ高い芳香族基または中性基を含み、(c)Y"はLとの連結を可能にするように設計されたアダプター基である。
EはLaCAL主鎖内または側鎖基の1つに局在しうる。米国特許第6,235,714号は触媒抗体の用途に有用なLaCALの変異体、すなわち隣接するP1正荷電基と共にペプチドの主鎖内に局在する求電子体を開示している。本発明において一般的な有用性を有する追加のLaCAL、すなわち負荷電した基、かさ高い芳香族基および大小の中性基を含めた多様な隣接P1およびP1'基を有する主鎖にEを有するLaCALが開示されている。Eが側鎖基Lに局在する追加のLaCALが本発明で開示されている。
Yにおける求電子性原子(Z)はNuRと安定共有結合を形成できる任意の求電子性原子、例えばリン原子、炭素原子、ホウ素原子またはバナジウム原子でありうる(図5A)。あるLaCALにおいて、Yは求電子性原子に隣接する追加の部分荷電または完全荷電した原子、例えばホスホン酸モノエステルを含むLaCALの負荷電した酸素原子を含む(図4、実施例1)。米国特許出願第10/114,716号(出願日04/01/2002)は触媒抗体への応用に有用なLaCALの変異体、すなわちペプチドの主鎖内に局在する負荷電した隣接酸素と共に求電子性リン原子を含むホスホン酸モノエステルLaCALを開示している。Y基がLaCAL側鎖に局在する負荷電した隣接基と共に求電子性原子を含む、追加のLaCALが本発明において
開示される。
求電子基以外に、Yは確定した電子吸引能および電子供与能を有する置換基を含みうる。そのような置換基の例を図5Bおよび5Cに示す。電気吸引基および電子供与基は求電子性原子に直接、またはスペーサー基を介して連結し、誘起効果のため求核体と求電子体との共有結合反応性を増加および減少させる。図5Bにおける置換基1〜18は多様な電子吸引能を有する基を表している。理想的な置換基は、他のNuRに結合せずに望みのNuRの活性部位に対する選択的結合を可能にする置換基である。例えば、求電子性原子の共有結合反応性を非常に高いレベルに増加させることは望ましくない。それは、これがアセチルコリンエステラーゼなどの生命に不可欠な酵素との共有結合を生じるおそれがあるからである。リン原子の共有結合反応性の減少は図5Cに示す置換基19〜35を用いて達成される。
NuRがP1およびP1'を非共有結合的に認識する必要性は、それぞれY'およびY内に適当な荷電およびかさ高さを有する基を組み込むことにより達成される。異なるNuRは異なるP1およびP1'を認識する必要がある。このように、正荷電した基、負荷電した基、かさ高い基または中性基がこれらの位置に組み込まれ、LaCALと標的NuRとの相互作用を最適化する。
Y"はY'-Y単位を結合できるアダプター官能基を表す。例えば、ポリペプチドリガンドのアミノ酸側鎖へのY'-Yの連結は直接またはアダプター基の使用により成し遂げることができ、それでアダプター基はLaCAL一般構造におけるEの構成要素と見なされる。アダプター官能基は、構築体の柔軟性およびLaCAL全般の溶解度のような特性を多様にするためにも有用である。例えば、周囲で非束縛回転が可能な単結合のみを含むアダプターを使用できる。これは構築体に含まれる求電子体および他の付属基が大きなコンホメーション空間をサンプリングして、標的NuRの求核体と接触する機会を増やすことを可能にする。同様に、水と溶媒和する傾向のあるY"基内に例えばアミンおよびカルボキシル基を含ませることによって、LaCALの溶解特性を変更することができる。
一般構造におけるLxはEが結合しているリガンドの官能基に対応する。ポリペプチドの場合、Lxの典型的な例はLys、Asp、Glu、Cys、Ser、ThrおよびTyrの側鎖である。これらのアミノ酸に対するY"-Y'-Yの連結部位の例には、-NH2、-COOH、-SHおよび-OH基がある。ポリペプチドの場合、Lxはアミン末端またはカルボキシル末端にも対応しうる。X'がペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端であるならば、かつペプチドが構成要素Yとしても使用されるならば(例えば図6)、生じるLaCALはどちらの側にもペプチドが隣接した求電子基を含む。
5. CALの有用性
標的NuRに共有結合するCALは以下の目的に使用できる:
・ 可溶性NuRの永続的不活性化、
・ 微生物NuRの永続的不活性化、
・ 細胞表面に発現したNuRの強力な拮抗作用および作動作用、
・ 様々な細胞活性および機能の不活性化または活性化
・ 表面にNuRを発現している細胞の死滅の成長停止の誘導、
・ 生体分子の自然自己集合アレイの共有結合模倣体の発生、
・ ワクチン候補としての共有結合性gp120オリゴマー模倣体の使用、
・ 表面にNuRを発現している細胞および微生物の高感度画像化
・ 抗原特異的な抗体の単離、誘導および阻害、
・ 診断イムノアッセイ応用における抗体および抗原の高感度検出。
(a)可溶性NuRの永続的不活性化。 可溶性NuRの一クラスは、病原作用を有する分泌抗体、例えば移植拒絶に関与する移植抗原に対する抗体および自己免疫疾患の病原に関与する自己抗原に対する自己抗体である。上皮増殖因子レセプター(EGFR)、血管作用性腸管ペプチド(VIP)、gp120、DNAおよび第VIII因子に対する抗体にLaCALが共有結合的にかみ合う例が実施例1、3および4に記載されている。第VIII因子に対する抗体はある種の血友病の患者の出血障害の原因である。EGFRに対する抗体は自己免疫疾患である全身性硬化症に関連している。DNAに対する抗体は自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスに病原的な役割を果たすと考えられている。抗体介在疾患の治療は、非特異的免疫抑制を生じる薬物に現在のところ限られており、有用な免疫応答も副作用として抑制される結果を有する。LaCALの開発は、抗原特異性に基づいて不活性化するために個別の抗体集団をターゲッティングすることを初めて可能にした。LaCALは個別の抗体集団と特異的かつ不可逆的に結合する。したがって、通常の抗原が抗原-抗体複合体から解離し病原抗体を再生するという点で、LaCALは通常の抗原よりも利点をもたらす。
ある種の追加の可溶性NuR、例えば実施例5、図26)に記載されている可溶性カルモジュリンがLaCALの有益効果を受けやすい。カルモジュリンは多くのシグナル伝達酵素、例えばミソシン(mysosin)軽鎖キナーゼおよびホスホジエステラーゼの活性を制御することから、細胞代謝機能の重要な調節因子である。VIPはカルモジュリンと高親和性結合し、カルモジュリンによる酵素の活性化を阻害する。したがって、実施例2、図13および実施例3、図18に記載されているVIP-CALを、そのような作用が有益である状況、例えば筋肉細胞過反応でカルモジュリンの不可逆的拮抗剤として適用できる。
追加のLaCALの可溶性NuR標的を表1に示す。この群の類似的な分子には、TNF、IL-1ベータ、EGF、TGFα、p53生成物、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原、プロラクチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、c-myc、c-fos、c-jun、P糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質、メタロプロテイナーゼ、ステロイドレセプターおよび血管新生因子がある。出発物質としてCALを用いてこれらのNuRと高親和性結合することが知られている試薬、例えばEGFターゲッティングするためのEGF可溶性レセプターのLaCAL誘導体およびステロイドレセプターをターゲッティングするためのステロイドのCAL誘導体。そのようなCALを、癌、炎症性疾患および心血管疾患を含めるがそれらに限定されない様々な疾患の治療に使用できる。
(b)微生物NuRの永続的不活性化。 微生物タンパク質も本発明のLaCALによる不活性化のためにターゲッティングされうる。これらにはgp120、gp160、Lex1リプレッサー、gag、pol、B型肝炎表面抗原、細菌外毒素(ジフテリア毒素、破傷風菌(C. tetani)毒素、ボツリヌス菌(C. botulinum)毒素、百日咳毒素)があるが、それらに限定されない。
sCD4-CALによるHIV gp120の不可逆結合は実施例6に記載されている。sCD4-CALによるgp120のCD4結合部位の永続的占有が原因で、gp120はもはや宿主細胞CD4レセプターと結合できず、H1V-1は宿主細胞に進入できない結果となる。sCD4はHIV治療の候補として提案されているが、sCD4の効力はsCD4が治療目的に有用であるには低すぎる。sCD4-CALがgp120と共有結合する能力はsCD4調製物の治療効力を増強すると期待できる。
(c)細胞表面に発現されたNuRの強力な拮抗作用および作動作用。 ホルモン、神経伝達物質および他の可溶性リガンドに対する細胞レセプターのリガンド結合部位が共有結合的にかみ合うと、レセプター結合部位内の共有結合の正確な部位およびその結果生じるレセプターコンホメーションが受ける作用に応じて拮抗作用または作動作用が発揮されると期待できる。細胞レセプターはリガンドの特異的結合後に起こるシグナル伝達事象によってリガンドの生物学的作用を仲介する。リガンドの結合はレセプターのコンホメーション変化を誘導し、これは様々なセカンドメッセンジャー系を活性化する。例えば、VIP細胞レセプターに対するVIPの結合は酵素アデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックAMP産生の増加を招く。EGFレセプターへのEGFの結合はそのレセプターの細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化し、様々な細胞タンパク質のリン酸化の増加を可能にする。VIPレセプターに対するVIP-CALの共有結合がレセプターに対するVIPの弱い結合を正確に模倣しているならば、レセプターの持続活性化が起こり、その活性化は、例えばレセプターのインターナリゼーションによりレセプターがシグナル伝達系から切断した場合に終了する。他方でレセプターに拮抗剤が結合すると、おそらくレセプターに誘導されるコンホメーション変化がシグナル伝達の成功に必要なコンホメーション変化を十分に模倣しないことが原因で、リガンドの生物学的作用に根本的なシグナル伝達系を活性化しない。
膜レセプターに及ぼすそれらの正確な拮抗効果または作動効果とは無関係に、CALは新しいクラスの潜在的な治療試薬に相当する。例えば、VIPの過剰産生はある種の膵臓癌に関連し、生命を脅かす水様便を生じる(9)。VIPレセプターに対する拮抗剤としての強力かつ特異的なVIP-CALの開発は水様便の抑制に適用できる。さらに、VIPレセプターは多くの癌で過剰発現され、VIPはある種の腫瘍の成長を刺激する(10)。拮抗性VIP-CALを腫瘍成長の抑制に使用できる。同様に拮抗性EGF-CALをEGFR過剰発現腫瘍の成長抑制に使用できる。EGFRのチロシンキナーゼ活性の拮抗剤およびEGFRに対する抗体は抗癌剤として現在臨床応用されている(イレッサ)。
レセプターに対する永続的結合が可逆的なリガンド結合よりも持続的にシグナル伝達を活性化できるという点で、CALの作動作用も都合がよいと考えることができる。有益な例は、糖尿病におけるインスリンレセプターの持続性活性化を達成するためにインスリン-CALを使用することである。
表1はこの取り組みにおいてCALによりターゲッティングされうるレセプターの一覧を含んでいる。標的にはサイトカインレセプター、増殖因子レセプター、ホルモンレセプター、神経伝達因子レセプターおよび血管新生因子レセプターがあるが、それらに限定されない。
(d)表面にNuRを発現しているリンパ球の死滅の誘導。 リンパ球は様々な自己免疫疾患および移植拒絶において有害免疫応答を備える原因である。現在のところ所定の抗原標的に対して免疫寛容性を誘導する効果的な手段は得られていない。その結果、シクロホスファミドおよびコルチコステロイドを用いた治療のように一般化した免疫抑制治療がこれらの免疫障害の治療の主力である。
本発明のCALはB細胞レセプター(BCR)およびT細胞レセプター(TCR)の永続的占有を達成するのに適している。細胞表面に発現したBCRによるハプテンCALの選択的共有結合を実施例3図20に記載している。BCRが抗原に結合する能力は、分泌抗体による特異的抗原結合の基礎をなす非共有結合力と同じものに具体的に由来する。したがって、分泌抗体の場合のように、LaCALに適当な抗原エピトープを含ませることによってLaCALが抗原特異的BCRに選択的に共有結合することが可能になる(BCRはIgαおよびIgβサブユニットと複合体を形成した表面抗体から構成される)。TCRも個別の抗原に特異性を表す。このように、LaCALはそれらの抗原特異性に基づいて個別のB細胞およびT細胞集団にターゲッティング可能である。
持続性のレセプター占有は免疫寛容性を誘導することが十分に知られている。例えば大用量の抗原の免疫はこの効果が原因で寛容の誘導を招く。本質的に持続性のレセプター占有は細胞のクローン選択とは対照的にアポトーシスを招く。例えば大用量の精製第VIII因子を用いた治療は、第VIII因子に対する抗体を発現する血友病患者の亜集団に寛容を誘導するのに成功する。細胞表面の第VIII因子特異的BCRに対する第VIII因子-CALの不可逆結合はこれらの患者における血友病の治療法として免疫寛容を誘導するための、効力が高く費用効率の高い方法を提供する。抗体に対する第VIII因子-CALの結合が不可逆性であることから、本出願において第VIII因子よりも少量の第VIII因子-CALしか必要ない。LaCALによるTCRの持続性占有が原因で、B細胞のようにT細胞はこれらの化合物による寛容誘導に感受性である。T細胞寛容の誘導の場合、T細胞エピトープとして働くことが知られている抗原のLaCALペプチドフラグメントとして使用することが望ましい。それは、このときTCRに対するLaCALの結合がMHC抗原と共に起こるからである。
LaCALによる免疫寛容の誘導は、抗原の正確な分子特性にかかわらず潜在的に一般的な取り組みである。このように、様々なタンパク質、核酸、糖および脂質抗原に対する寛容誘導がこの取り組みによって実行できる。
重要なことには、抗原特異性に基づきB細胞およびT細胞の死滅を誘導する必要があるならば、細胞毒性物質をLaCALに結合でき、それによって持続性レセプター占有が原因の寛容誘導を補足できる。抗原特異的B細胞およびT細胞に対するLaCALの共有結合がこれらの細胞の死滅を選択的に誘導できる一方で、細胞毒性物質が原因の一般的なマイナス効果を生物に受けさせないことから、これは実現可能である。この目的に有用なLaCAL-毒素結合体の例を図17に示す。
(e)生体分子の自然自己集合アレイの共有結合模倣体の発生;ワクチン候補としての共有結合gp120オリゴマー模倣体。 実施例7、図31に二量体および三量体へのHIV gp120-CALの自然集合を記載する。対照EGFR-CALはこの挙動を示さず、gp120とハプテンCALとの共有結合速度はgp120-CALの自己集合速度よりもかなり小さかった。これらの観察から、ウイルス表面で天然gp120のオリゴマーへの分子間集合体をもたらす弱い非共有結合相互作用は二量体および三量体へのgp120-CALの自己集合を促進することが示唆されている。HIV表面上のオリゴマーgp120の天然構造を模倣したgp120オリゴマーの設計は過去10年間で研究が最も集中した領域である。それは、単量体タンパク質のコンホメーションが天然オリゴマー構造のコンホメーションから顕著に逸脱し、単量体タンパク質がgp120の最も易変の領域であるV3ドメインに対する抗体を主に誘導することが理由である。これは、最近Vaxgen社が報告したように(11)、HIV-1感染のためのワクチンとして精製単量体gp120調製物が失格であった一因と思われる。なお、gp120調製物はHIV-1に対するワクチン接種として依然として最大に期待されている。それは、このタンパク質が宿主細胞CD4との結合およびケモカインレセプターとの結合に役割を果たすことに基づいて宿主細胞へのウイルスの進入を担っているからである。
我々は共有結合的に集合した二量体および三量体を含むgp120-CAL調製物がHIV-1初代単離物の培養における感染性を中和できる求核Abの形成を誘導することを観察した。gp120オリゴマーが非共有結合する膜貫通タンパク質であるGp41がgp120-CAL調製物に加えられ、共有結合gp120-CALオリゴマーの正しい集合を促進する。gp120-CALオリゴマー調製物は2つの方法で潜在的に有用である:(a)HIV感染のための受動免疫治療のためのgp120に対するモノクローナル抗体の開発、および(b)HIV-1に対する予防抗体を誘導できるワクチンとして。
(f)表面にNuRを発現している腫瘍細胞の高感度画像化。 腫瘍細胞上のレセプターに対する高分子の結合は原発腫瘍および腫瘍の転移位置の画像化に有用である。例えば、放射性標識ソマトスタチンアナログはソマトスタチンレセプターを発現している腫瘍の画像化に有用である(12)。放射性標識VIPはVIPレセプター発現腫瘍の画像化に使用されている(13)。腫瘍細胞レセプターに対する適当なLaCALの不可逆結合はそのような画像化応用のための改良された高感度の方法にあたる。例えば、実施例2図13および実施例3図18に記載されているVIP-CALを放射性標識し腫瘍の位置を画像化するために患者に静脈内投与できる。この方法はin vivoで短い半減期を有するプローブに特に適している。それは、不可逆的に結合したLaLALが腫瘍細胞から解離せず、通常の可逆結合リガンドに比べ低濃度のLaCALしか腫瘍の標識に必要でないという結果を有するからである。放射性プローブがこれらの応用に使用されることが多い。現代の画像化応用に従う他のプローブ、例えば近赤外蛍光プローブおよびポジトロンエミッショントモグラフィーラジオトレーサー(14、15)も利用できる。
(g)共有結合抗体および触媒抗体の単離、誘導および阻害。 米国特許第6,235,714号、米国特許出願第10/114,716号(出願日04/01/2002)、および本出願と同時に提出された「タンパク質分解抗体および共有結合抗体」という名称のPCT特許出願は、自己免疫レパートリーから共有結合抗体および触媒抗体を単離すること、免疫法によってそのような抗体の合成を誘導することおよびそのような抗体の病原作用を阻害することを目的としてLaCALが使用された方法を記載している。
(h)診断イムノアッセイ応用における抗体および抗原の高感度検出。 抗体によるLaCALの不可逆結合は検出感度の増加をもたらす。抗体と混合された可逆的結合リガンドは反応の平衡状態に向けて進み、平衡状態では正反応および逆反応の速度は等しくなり抗原-抗体複合体の濃度は一定を維持する。これに比べ、抗体との共有結合によって全てのLaCALが消費されるまで結合反応は継続してLaCALについて完了する。例えば、免疫ブロッティングまたはELISA法(enzyme linked immunosorbent method)を用いたHIV感染のための診断テストでは可逆的に結合するHIV抗原(gp120、gp160、p24)に対する高レベルの抗体が存在する。これらの手法において可逆的に結合する抗原の代わりにgp120-CAL、gp160-CALおよびp24-CALを使用することは、結合した抗体の量が増加することによって抗体検出の向上が可能になると予想できる。例として、実施例7、図31に記載されているgp120-CALをELISA平板にコートでき、抗体を検出すべきヒト試料血清を適当な時間だけ固定化gp120-CALと共に温置し、未結合の物質を洗浄除去し、結合した抗体を蛍光プローブに連結した高ヒト抗体を用いて検出できる。詳細なELISA法は参考文献3、16に記載されている。
ハプテンCALおよびLaCALの構造を設計する上で重要であると見なされる経験的な実験基準には、
・ NuRとの結合速度について一連のハプテンCALおよびpCALをスクリーニングすることによって、これらの化合物のうち最良のものを同定する。これには可逆結合ステップに対するKdおよび共有結合ステップに対する一次速度定数k3の大きさの測定がある。
・ ハプテンCALおよびLaCALの特異性を、標的NuRと構造が無関係のNuRを含めた一連のNuRに対する結合についてスクリーニングすることによって決定する。通常のセリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼ酵素の結合についてのスクリーニングは、CALおよびLaCALがこれらのタンパク質に対して許容できない非特異性を示さないことを確実にするために実施される。
CALの投与。
本明細書において記載されるCALは製剤として患者に投与されることが意図される。本明細書において使用される用語「患者」は、ヒトまたは動物の被験者を指す。本発明のハプテンCALおよびLaCALを含む製剤は水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、油、界面活性剤、懸濁化剤またはそれらの適当な混合物のような許容可能な媒質と共に投与するために都合よく製剤される。選択された媒質中のハプテンCALおよびLaCALの濃度は媒質の疎水性または親水性に依存する。当業者は溶解限度を容易に決定できる。
本明細書に使用される「生物学的に許容可能な媒質」は、前節に例示されるような製剤の望みの投与経路に適当でありうる任意および全ての溶媒、分散媒など含む。薬学的有効物質のためのそのような媒質の使用は当技術分野で公知である。投与されるCALと通常の媒質または薬剤が不適合性である場合を除いて、製剤における媒質または薬剤の使用が考えられる。
通常の免疫法が抗体合成を誘導するために適用される。Ab合成を誘導するために免疫原の注射が数回(それぞれペプチド約100μg)投与される。RIBIが動物実験に使用される。ヒトへの使用にはアジュバントとしてミョウバン(alum)が使用される。ミョウバンはヒトへの使用が承認されている。RIBIはフロイント完全アジュバントの低毒性代替物であり、多様なAgに対する良好なAb応答を再現性をもって促進する。血流への静脈内注射により、または皮下、筋肉内または腹腔内注射により免疫原を非経口的に投与できる。非経口注射のための製剤は当技術分野で一般に公知である。
製剤は投与が容易な単位剤形で、均一な投薬量で製剤される。本明細書において使用される単位剤形は、治療を受けている患者に適した製剤の物理的に別々の単位を指す。各投薬は望みの効果をもたらすと計算された量の有効成分と、選択された医薬担体とを含むはずである。適当な投薬単位を決定するための方法は当業者に十分公知である。
NuRを阻害することを意図される製剤を適当な間隔で、例えば病気の症状が縮小または軽減するまで1日1回投与でき、その後投薬量を維持レベルに下げることができる。特定の場合において適当な間隔は、患者において治療しようと努める状態および病状に普通は依存する。
好ましい実施形態において、CALは患者に静脈内点滴される。ある種の医学障害の治療のために、十分な量の分子が標的細胞に達して生物学的作用を発揮することを確実にするために対策を講じなければならない。
分子の親油性またはそれらの分子を送達する製剤を増やして分子が標的位置に到達できるようにしなければならない場合もある。さらに、細胞を標的とする担体中に存在する形で本発明のAbを送達し、十分な数の分子が標的細胞に達するようにしなければならない場合もある。親油性の増加および治療分子のターゲッティングのための方法は、本発明のAbを抗体が散在するリポソームに被包することを含み、当技術分野で公知である。
本発明の主題であるCALをポリエチレングリコールのような担体と結合させることもできる。さらに細胞膜または血液脳関門を含めた様々な血液-組織関門を通過したCALの輸送を引き起こすことができる担体に前記CALを結合させることができる。
許容可能な予防剤または治療剤のための標準的な基準を満たすCALが選択される:(1)NuRの共有結合は標的ペプチド抗原を機能的に活性化するか機能的に不活性化するかのどちらかによって病理学的過程の有益な変化をもたらし、(2)前記CALの投与は臨床有益性が任意の副作用に関連する罹患に勝るような好都合の治療指数をもたらす。そのような基準をいかにして予防または治療剤のアクセプタビリティについて定められるかの議論は当技術分野によくあるものであり、Bert Spilkerによる「Guide to Clinical Trials」、Raven Press、ニューヨーク、1991のような文章にみられる。効力の実証のための許容可能な基準には、例えば腫瘍治療の場合には、腫瘍容積の減少、進行までの時間および生存率の改善がある。HIV免疫治療の場合、血中感染ウイルス数、CD4+T細胞数および日和見感染の発生率を測定することにより効力が決定される。
例えばモノクローナルAbを使用することによる不活性化に適することが知られている任意の露出したNuRエピトープは本発明の主題であるCALに適した標的の候補である。本発明に考えられているCALは、それらの優れた効力が原因で通常のモノクローナルAbを超える大きな改良となり、治療コストを減らす。CAL治療に適したNuRのいくつかと、対応する医学適応の一覧を表1に示す。
本発明の実施のための予防または治療用標的NuRの適当な部門には、サイトカイン、増殖因子、サイトカインレセプターおよび増殖因子レセプター、増殖因子レセプターにより開始される刺激の伝達に関与するタンパク質、凝固因子、インテグリン、抗原レセプター、酵素、詳細には細胞プログラム(分化、増殖およびプログラム細胞死)の制御に関与する転写調節因子、これらの細胞プログラムの他の誘導因子、抗癌剤を排出できる細胞ポンプ、微生物抗原およびウイルスペプチド抗原があるが、それらに限定されない。
以前に開発された方法を用いて望みの抗原に対する防御抗体応答を誘発するように設計されたワクチンを用いて能動免疫が行われる。例えば、ミョウバンのような適当なアジュバント処方と混合されたgp120-CALを、抗体の合成が最大となるように最適化された用量で筋肉内投与でき、血清中の触媒抗体濃度が一定レベルに達するまで4週間間隔で2または3回のブースター注射を投与できる。ワクチン接種が、原因生物または癌細胞の曝露に応答して刺激されAbを産生することができる特異的長寿命記憶細胞の形成をもたらすことから、そのように発生した防御免疫は数年間持続すると期待される。大部分の抗原に対するAb合成応答はT細胞依存性であるため、適当なT細胞エピトープをペプチド合成によって免疫原に組み込むことができる。代わりに、キーホールリンペットヘモシアニンのような担体をlysの側鎖アミノ基またはCys側鎖スルフヒドリル基を介して結合することによってCALと複合させ、必要ならば抗体応答を最大にすることができる。
本発明の好ましい実施形態の若干が記載され、具体的に例示されたが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。本発明の範囲および思想から逸脱せずにそれらに様々な修正を施すことができる。
以下の実施例は本発明の理解を容易にするために提供される。多様なCALおよびLaCALを調製するための、可溶性NuRおよび細胞表面NuRによるCALおよびLaCALの不可逆結合を測定するための、CALによるNuR生体活性の不活性化を測定するための、LaCALの共有結合自己集合を調製するためのおよびLaCALに対する抗体を作製するための方法が開示されている。
参考文献
Figure 0005503837
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特異的抗原結合活性と協調して発現した天然抗体の広範に分布する化学的反応性
多くの酵素は、基質との共有結合的な相互作用を利用して化学的変換を触媒する。一方、Ab触媒に関するほとんどの研究は、反応物と生成物との間のエネルギー障壁を下げる機構としての非共有的結合力、例えば、エステル加水分解の負に荷電したオキシアニオン遷移状態を安定化する静電力に注目してきた(1、2の総説)。元となる仮説は、Abは専ら非共有的手段によってリガンドと相互作用するということである。天然のAbは酵素とは見分けのつかない化学反応性を表すという当初の指摘は、自己抗体のタンパク質分解活性およびヌクレアーゼ活性の報告(3、4)から得られた。同様の活性が後に多発骨髄腫の患者のAb軽鎖(5)、輸血によって誘発された血友病の患者の同種異系抗体(6)、ポリペプチドによる通常免疫で生じたAb(7、8)および抗酵素Abに対する抗イディオタイプAb(9)で発見された。変異誘発および阻害剤の研究から、天然Abのタンパク質分解活性は、従来のセリンプロテアーゼで使用されるものと同様の求核機構によって生じることが明らかになった(10、11)。天然Abの触媒活性は、B細胞クローン選択理論の原理に反するものと解釈することができた。V領域をコードする生殖細胞系遺伝子の配列多様化、その後の最も親和性の高いB細胞レセプターによる選択的な抗原結合、それによるAbのクローン増殖の刺激という免疫過程の中で抗原特異的Abが生成される。触媒には、抗原の化学的変換およびB細胞選択の中断を引き起こすことが予測される生成物(IgαおよびIgβサブユニットに関連した表面イムノグロブリン)の遊離が必要である。したがって、Ab触媒活性の適応選択は、敬遠される現象である。この理由のため、天然に生じるAbによる触媒は、機能と密接な関係のある一般的現象とは対照的に、V領域の配列多様性によって生じる分子の偶発的な出来事であると考えられることが多い。
前記の制限は、セリンプロテアーゼ触媒の触媒過程の最初の段階には適応されない。従来の酵素と同様に、タンパク質分解性Abに属する求核体(図1AのNu)は、非共有結合の基底状態複合体が形成された後に抗原に対する求核攻撃を開始すると考えられる。B細胞レセプターが占有されたままなので、もし結果が共有結合アシル-Ab複合体の形成であるならば、Abの求核性の適応発生はB細胞クローン選択性と完全に合致する。触媒過程が完了するかどうかは、アシル-Ab複合体の加水分解および生成物の遊離の効率に左右される。最近、ハプテンホスホン酸エステルは、セリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼ活性を示すAbの活性部位求核体に共有結合するためのプローブとして開発された(11、12)(CALと称される、共有結合反応性抗原アナログ)。これらの化合物は、触媒の実現のために必要な他の活性とは独立したAb化学的活性の直接的な研究に適用することができる。さらに、ホスホネートは、Ab求核反応性と個々のポリペプチドの特異的認識を可能にする非共有結合力との間の相互作用を研究するために、ペプチドおよびタンパク質内部に配置することができる(図1Bおよび1C)。
IgGおよび組換えFv調製物には、従来のセリンプロテアーゼトリプシンの程度を上回る求核反応性が広い範囲で分布することを示唆する所見を本明細書で説明する。触媒Abのプローブとして元々調製されたので、EGFRおよびHIV gp120合成ペプチドのCALアナログは、ホスホネート基を持たない抗原で免疫することによって生じる通常のAbと共に共有結合アダクトを形成することが認められ、適応変異過程は求核反応性の発現に有利であることが示唆される。これらの所見は、抗体求核性は発現したAbレパートリーの形成に関与する力であることを明らかにしており、Abの永久的な不活性化に対する新しい経路を示唆する。
方法
Ab。 ヒトポリクローナルIgGは、6人の健常人被験者の血清(研究室認識番号、1086、1087、1088、1091、1092、1518)からプロテインG-セファロース(Amersham Pharmacia)のアフィニティークロマトグラフィーによって調製した。8匹のBALB/cマウス(4〜5週齢)から収集した血清のIgGも同様に得た。KLHに結合させた合成Cys-gp120(421〜436)(KQIINMWQEVGKAMYA;gp120 HIV SF2種の421〜436残基)で過免疫することによるポリクローナルAbの調製は、(13)に説明されている。雌BALB/cマウス(5〜6週齢)は、0日目、27日目および41日目にRIBIアジュバントに入れてexEGFR(10μg/注射)を、14日目にはA431腫瘍細胞(生理食塩水に溶かした107個の細胞)を注射して免疫することによって、exEGFRに対するポリクローナルAbを得た。exEGFRに対するモノクローナルAb(クローンC225、H11およびC116)は、Labvision(Fremont、CA)から購入した。対照の抗BSAモノクローナルIgG(クローンBGN/H8)は、Biogenesis(Kingston、NH)から入手した。単鎖Fv構造物(N=15)は、(11)に記載された狼瘡患者から得られたヒトFvライブラリーから無作為に選択した。(MM系クローン、12、14、18、20、24、F1、F2、F4、F5、F6、F7、F11、F12、F14、F17、F18)。scFVタンパク質は、Ni-NTAカラムの金属アフィニティークロマトグラフィーによって電気泳動的に均一(27kDaのバンド)になるまで精製した(11)。発現濃度は、細菌培養液1リットル当り0.3〜5.7mgであった。該ライブラリーには、ヌクレオチド配列決定によって決定された異なるscFvクローンが含まれており(11)、多様なAbのV領域を確実にサンプリングすることが可能である。この研究で調べたscFvクローンの1つ、MM-F4の配列決定を行い(GenBank番号AF522073)、そのVLおよびVH領域がそれぞれXおよびIファミリーに属することが決定され、生殖細胞系遺伝子相対物はそれぞれ、V1-13およびVH1-2であった。SDS電気泳動ゲルにおけるscFvバンドの確認は、c-mycに対するモノクローナルAbを使用したイムノブロッティングによって行った(10)。
求核体用プローブ。 ハプテンCAL Iの合成(図8)および天然に生じるタンパク質分解性Abとの共有結合反応性は、既に記載されている(11、14)。求核ホスホン酸ジエステルはペプチド結合に似ており、正に荷電したアミジノ基は天然に生じるタンパク質分解性AbのLys/Arg P1選択性に似ており(11)、ビオチン基によってAbホスホネートアダクトを高感度で検出することが可能である。IIは、Iで説明したように、ジフェニルアミノ(フェニル)メタンホスホネート(化合物a)および6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Sigma)を縮合することによって調製した。IIIを調製するために、化合物a(160mg、0.34mmol)を30% HBr/CH3COOH(5ml)で処理した。得られたジフェニルアミノ(フェニル)メタンホスホネート臭化水素酸塩(100mg、0.24mmol)は、メタノールに溶かしたナトリウムメトキシド0.5M溶液(9.5ml)に溶解し、該溶液はN2下で撹拌した(室温、2h)。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をCH2Cl2(50ml)で抽出して、該抽出物を水(5mlx3)で洗浄して、Na2SO4で乾燥して、乾燥するまで留去した。黄色味を帯びた油状残渣をジエチルエーテル(30ml)に溶解した。ジエチルエーテルに溶かしたHCl(1M)(0.25ml)を添加し、沈殿物は濾過によって収集し、ジエチルエーテルで洗浄して得られた、収量35mg、68%、tR 11.8分(純度>97%、C18カラム、0.1%トリフルオロ酢酸に溶かした5〜80%アセトニトリル、50分、1.0ml/分)、エレクトロスプレイイオン化質量分析によるm/z 216(MH+)。この化合物のビオチン化は、通常通り(14)実施した。IVを調製するために、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.11ml、0.63mmol)およびビス(スルホスクシニミジル)スベリン酸二ナトリウム塩(150mg、0.26mmol、Pierce)を含有するDMF(2ml)に溶かしたジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(0.13mmol)を2時間混合することによって、ジフェニルN-[O-(3-スルホスクシニミジル)スベロイル]アミノ(4アミノフェニル)メタンホスホネート(化合物b)をまず合成した。bは、逆相HPLCによって精製し、凍結乾燥して無色粉末を得た。収率54%、50mg、m/z 715 (MH+)。電気泳動的に純粋なexEGFR(0.5mg、O'Connor-McCourt博士から恵与、文献15)をHEPES 10mM、NaCl 150mM、CHAPS 0.1mM、pH7.5緩衝液0.53ml中で6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル(59nmol、Sigma)と反応させた(50分、25℃)。未反応のビオチン化試薬をゲル濾過によって除去した(Micro BioSpin 6カラム、BioRad)。次に、ビオチン化exEGFR(0.33mg)を緩衝液3.3ml中で化合物b(136nmol)と2時間反応させた。Tris-HCl 50mM、グリシン100mM、CHAPS 0.1mM、pH7.8でゲル濾過することによって過剰なbを除去した後、最初のタンパク質およびCAL-誘導体化タンパク質の遊離アミンの濃度をフルオレスカミンを使用して測定した(16)。2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(17)を使用して測定したビオチン含量は、1.1mol/mol exEGFRであった。ホスホン酸ジエステル標識の密度は19mol/mol exEGFRであった。総タンパク質量は、BCA(Pierce)を使用して測定した。実験の中にはexEGFR CAL IVaを使用して実施されたものもあった。この化合物は、リンカーにジスルフィド結合が存在することを別にすればIVと同一である。IVaを調製するために、前駆体ジフェニルN-((3-スルホスクシニミジル)-3,3'-ジチオビスプロピオニル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(化合物c)は、3,3'-ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)(Pierce)を使用して化合物bで説明したように得られた。収量6.0mg、21.4%、tR24.49分、純度>98、0.1% TFAに溶かした20〜50%アセトニトリル、60分)、m/z 751 (MH+)。ビオチンおよびcの標識は、IVで説明した通りである(IVaのビオチンおよびホスホン酸ジエステルの含量はそれぞれ、2.3molおよび18.3mol/mol exEGFR)であった。ペプチジル-CAL VおよびVaの合成およびそれらの化学的特徴付けは、(18)に記載されている。Vは、(13)のようにγ-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシニミドエステルを使用してBSAと結合させた。BSAは、潜在的V結合部位を遮断するために、ジフェニルN-(ベンジルオキシカルボニル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネートで予備処理した(BSA、21.3μM、ホスホネート、0.5mM、溶媒、5% DMSOを含有するPBS 10mM、15.5時間)。V/BSAモル比は、エルマン試薬を使用して-SH基の消費から3.9であることが測定された。I〜IIIの保存は、N,N-ジメチルホルムアミドに溶かした10mM溶液として-70℃で行った。IVおよびIVaは、50mM Tris-HCl、pH8.0、グリシン0.1M、CHAPS 0.1mM中で-70℃で保存した。VおよびVaは、N,N-ジメチルホルムアミドに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。
ELISA。 Maxisorp96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)を、100mM 重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.6)に溶かしたBSA結合gp120(421〜436)(20ngペプチド相当量/ウェル、ペプチドの結合法については文献13を参照すること)、BSA結合V(20ngペプチド-CAL相当量/ウェル)、exEGFR(200ng/ウェル)またはexEGFR-CAL(200ngタンパク質相当量/ウェル)でコーティングした(2時間)。ELISAの方法は本質的に(13)に記載された通りであった。結合したマウスIgGは、ヤギ抗マウスIgG-HRP複合体(Fc特異的、Sigma、Saint-Louis、MO、1:1000)で検出した。
不可逆的CAL結合。 50mM Tris、HCl、グリシン100mM、CHAPS 0.1mM、pH7.7中でビオチン化CALをAbまたはトリプシン(ブタ、IX型、Sigma)と共に37℃でインキュベートした後、該反応混合物を2% SDSで煮沸して(5分間)、SDS-PAGE(4〜20%、Bioradまたは8〜25% Phastゲル、Amersham)で泳動した。電気ブロッティングならびにストレプトアビジン-HRPおよび化学発光基質(Supersignal、Pierce)を使用したビオチン検出方法は(11)に記載されている。画像処理および定量は、Unscan-itソフトウェア(Silk scientific、Orem、Utah)またはFluoro-STM MultiImager(Biorad)を使用してX線フィルム(Kodak)上で行った。バンドの強度はarbitrary area unit(AAU)で表した。曝露および現像時間は一定ではないので、異なる実験のバンド強度の確実な比較は不可能である。フルオロリン酸ジイソプロピル(Sigma)は、使用するまで4℃で維持した。いくつかの実験では、ビオチン化BSA(Pierce、8molビオチン/モルタンパク質)は試料と平行していくつかの濃度で電気泳動し、CALアダクトのビオチン含量を測定した。擬一次反応速度定数(Kobs)は、式Bt=Bmax(1-exp(-kobst)(式中、Btは様々な時点でのアダクトの濃度を表し、Bmaxは初期Ab濃度を表す)にあてはめて反応進行曲線から算出した。ヤギ抗マウスIgG Abによるイムノブロットは(7)の通りであった。
タンパク質分解測定法。 触媒活性は、短いペプチド-MCA基質のC末端アミノ酸にアミノメチルクマリンを結合するアミド結合の切断を蛍光計で測定することによって測定した(λex360nm、λem470nm、Varian Cary Eclipse)(10)。触媒は、96ウェルプレートにおいて50mM Tris HCl、グリシン0.1M、0.025% Tween-20、pH8.0中でペプチド-MCA基質(Pro-Phe-Arg-MCA、Boc-Glu-Ala-Arg-MCA、Boc-Ile-Glu-Ala-Arg-MCA、200μM、Peptide International)と共に37℃でインキュベートした。いくつかの測定では、IgGおよびトリプシンのタンパク質分解活性の比較は10mM リン酸ナトリウム、pH7.4、NaCl 0.137M、KCl 2.7mM、CHAPS 0.1mMにおいて実施した。標準アミノメチルクマリン(Peptide International)を使用して、生成物遊離をモル値で算出する標準曲線を作成した。
結果
ハプテンCALで確認したAb求核性。 ホスホネートハプテンCAL I〜III(図8)は、セリンプロテアーゼの公知の活性部位特異的阻害剤のアナログである(19)。セリンプロテアーゼトリプシンのように、健常人被験者から得られたIgGは煮沸した変性SDSに耐性があるCAL Iアダクトを形成した(図9、IgG、150kDアダクト、トリプシン、21KDアダクト)。免疫学的に操作されていないBALB/cマウスから得られた収集IgGは同様のIアダクトを形成した。CAL I内の正に荷電したアミジノ基は元来、化合物に取り込まれて、P1部位の塩基性残基に対する選択性を示すトリプシンの選択的認識を可能にした(該残基はペプチド基質の切断部位のすぐ側にある、文献20)。CAL IIは、共有結合反応性リン原子に隣接した正に荷電したアミジノ基を持たない。IgGは、IよりもIIに対する反応性が240倍少なかったので、Abのトリプシン様P1特異性が示唆される。Iよりも弱い遊離基を含有するIIIは、IgGとは検出可能なアダクトを形成しなかった(メトキシ遊離基が存在すると、リン原子の求核性が減少する、メトキシ含有ホスホン酸ジエステルはある種のセリンプロテアーゼと弱く結合することが報告されている、文献21)。IgGおよびトリプシンとの共有結合Iアダクトの形成増加は、反応時間の関数であることが明白であった(図9B)。IgGの反応速度は、同一条件下で測定したトリプシンよりも14.5倍速かった(それぞれ、172.7±14.2および11.9±0.6 AAU/分、図9Bデータの直線回帰より)。ホスホニル化されたタンパク質複合体の加水分解は同等であると推定されたので(図1の反応スキームを参照すること)、IgGの求核効果はトリプシンよりも優れていると結論づけることが可能である。
健常人および免疫学的に操作されていないマウスのIgG調製物は、塩基性残基のC末端側の小さなモデルペプチド基質を切断することが報告され、該切断活性は、試験したいくつかのIgG調製物それぞれに認められ、該活性は変性ゲル濾過実験においては完全な150kD IgGと一緒に移動し、該活性はパパイン消化によって調製されたFab調製物によって示された(22)。この研究において、トリプシンと健常人被験者由来のIgG(求核性研究と同じ調製物)のタンパク質分解活性を比較した。IgGによるタンパク質分解の初期速度は、Glu-Ala-Arg-MCAではトリプシンよりも1.8x105倍、Pro-Phe-Arg-MCA基質では、6.8x105倍少なかった(図8Aおよび8B、進行曲線の勾配から決定)。Glu-Ala-Arg-MCAはトリプシンの好ましい基質である。Glu-Ala-Arg-MCAおよびPro-Phe-Arg-MCA基質は、以前にペプチド-MCA基質のパネルのスクリーニングで決定されたヒトIgGの好ましい基質である(22)。このIgG調製物によるタンパク質分解の強さは、その他のヒトIgG調製物で既に報告された範囲内に入る。該IgGの求核反応性は優れているが、明らかにトリプシンと比較して不十分な触媒である。
CAL IおよびDFP(セリンプロテアーゼの他の活性部位特異的阻害剤)は、IgG触媒ペプチドMCA切断の触媒活性を阻害し(図8C)、DFPはIgGによるCAL Iの不可逆的な結合を阻害した(95%)。これらの結果から、CAL IはIgGの触媒部位に結合することが確実になった。DFPはセリンプロテアーゼの活性部位に結合するので、その阻害効果によってIgGのI結合部位のセリンプロテアーゼ特性が裏付けられた。還元条件下でI-IgGアダクトを電気泳動することによって、ハプテンCALによって両サブユニットが標識されることが明らかになり、ビオチン含有バンドが50kD重鎖バンドおよび25kD軽鎖バンドにあることがはっきりした(図8D)。IgGの不可逆的なI結合活性は、タンパク質を60℃で10分間予備加熱することによって失われるので、求核反応性が天然タンパク質構造に左右されることが示された。
健常人から得られた5種類のポリクローナルIgG調製物それぞれは、Iに不可逆的な結合を示した(表3)。ヒトライブラリーから無作為に抽出された16個のscFvクローンはそれぞれ、Iアダクトを形成し(図9Aの例を参照すること)、結合部位にVドメインが位置することが示され、求核反応性は異なるAbに共通の特性であることが示唆された。図11A(GenBank #AF522073)で示されたFv MM-F4で利用できる総タンパク質の91%は、求核反応性を示した[ビオチン モル/27kD IアダクトバンドのFvタンパク質 モルとして算出、Fv結合価1]。非還元条件下で電気泳動して分析すると、いくつかのcFv反応混合物は、27kDaのモノマーscFvアダクトに加えて55〜90kDのCAL Iアダクトを含有した。CALアダクトバンドの全てはまた、c-mycに対するAbで染色可能で、アダクト中にscFvが存在することが裏付けられた(組換えタンパク質は10残基c-mycペプチドを含有する、文献10)。scFvが凝集物を形成する傾向があることは既に報告されている(23)。scFvクローンをI処理する前にDFPで処理するとき、Iアダクトの濃度減少が検出された(72%)。異なるFvクローンによる共有結合アダクト形成の速度は、34倍の範囲にわたって変化し(表3)、Abが異なると求核反応性の程度が異なることを示している。異なるAbの混合物を表す5種類のポリクローナルIgG試料の反応性は変化が少なかった(5.4倍)。ペプチド-MCA切断活性(Glu-Ala-Arg-MCA基質)とscFvクローンによる不可逆的I結合とを比較すると、強い相関性が示され(p<0.005、r2=0.77、図9B)、優れた求核反応性には官能基が重要であることが裏付けられた。
ペプチジルおよびタンパク質CALの特異的な共有結合。 タンパク質CAL IVおよびペプチドCAL Vaについて、抗原特異的Abが抗原の非共有結合認識と協調して求核反応性を表すことができるかどうかを評価するために分析した。CAL IVは、腫瘍関連タンパク質、exEGFRの細胞外ドメインで、アダクトの検出を可能にする少量のビオチンと共にホスホン酸ジエステル(19mol/mol)を有するLys側鎖を誘導体化した様々な抗原エピトープを提示する。CAL IVのSDS電気泳動によって、名目質量90kDa(exEGFRの質量 85kDa、ハプテンホスホネート基の質量、714Da)の主要な銀染色およびビオチン含有バンドが明らかになった。CAL Vは、Lys432のアミジノ代用物およびC末端に位置する共有結合反応ホスホン酸ジエステル基と共にHIVコートタンパク質gp120の421〜431残基に対応する。このペプチジルCALの純度および化学特性は、既に報告されている(18)。exEGFRおよびgp120の421〜436残基に対応する合成ペプチドで通常に免疫することによって生じたAbは、最初はこれらのCALの抗原強度を保証するために使用された。ELISA研究によって、exEGFRおよび合成gp120(421〜436)に対するポリクローナルAbによる(BSAに結合させた)IVおよびVaへの結合はそれぞれ、ホスホン酸ジエステル基を持たない対照抗原、すなわちexEGFRおよびgp120(421〜436)への結合よりもわずかに低いだけであることが示された(図10)。Lys側鎖(IV)およびC末端(Va)にホスホン酸ジエステルを導入しても、この2種類の抗原のエピトープ構造は明らかに保存されている。抗exEGFRまたは抗gp120(421〜436)Abは、固定化カルモジュリンおよびアルブミンに対して結合しないことが検出され(1:1000に希釈した抗血清ではA490<0.05)、非特異的タンパク質結合効果がないことが裏付けられた。固定化(BSAに結合した)CAL IVおよびCAL Vaは、ELISA用の対照として使用した非免疫Abに異常な結合を示さず、ホスホン酸ジエステル基は無差別な共有結合効果を生じないことが示唆された。
Abによる共有結合は、ハプテンCALで説明したように変性電気泳動を使用して研究した。exEGFRに対するAbでビオチン含有IVアダクトが飽和形成されることは明らかであった(名目上の質量250kDa)。非免疫IgGのIVアダクトは検出されなかった(図11)。IV濃度が低いので(図11では0.2μM)、ハプテンCAL Iを使用して認められたものと同様のアダクト形成は予測されない。exEGFR(1μM)が存在するとアダクトの形成は少量であるか、または全く形成されないが、アダクト形成は同濃度のカルモジュリンによっては妨害されないので、共有結合反応はAbの抗原結合部位またはその近隣にあることが示唆される。250kD IVアダクトは抗IgGで染色可能であった(データは示さず)。exEGFRに対する市販の3種類のモノクローナルAbはそれぞれ、IVaと共有結合アダクトを形成し(供給業者によれば、Ab C225はEGFRの細胞外ドメインの351〜364残基に結合し、Ab H11およびC111.6によって認識される線状ペプチド決定基は未知であるが、両Abは該タンパク質の細胞外ドメインに結合する)、無関係なモノクローナルAbはアダクトを形成せず、該モノクローナルAbによるアダクトの形成はホスホン酸ジエステル基を持たないexEGFRによって阻害されたが、無関係なタンパク質、カルモジュリンでは阻害されなかった。本質的に同様の結果が、CAL Vaを使用して得られた(図12)。ビオチン含有152kDアダクトの形成は、時間の関数で飽和し(Vaの質量、2.2kD)、アダクトの形成はgp120(421〜436)-BSA複合体(3μM)によって阻害されるが、同濃度のBSAでは阻害されず、非免疫Abとの反応は、特異的Abと比較してゆっくり進行した。
exEGFRに対するポリクローナルIgGのIVアダクトの蓄積についての擬一次反応速度定数は、1.0±0.1h-1であった。非免疫IgGでは反応が検出されなかったので、kobsの正確な推定は不可能である。図12における観察期間中のアダクト蓄積の上限として画像システムの検出感度を使用すると(133AAU)、kobsの上限は7.2x10-3h-1であった。同様に、Vaの抗ペプチドIgGアダクト蓄積のkobsは非免疫IgGアダクトよりも496倍高かった(それぞれ、17.8±3.3h-1および0.4x10-1±0.1x10-1h-1、図12のデータ)。
考察
従来のセリンプロテアーゼの活性化された求核残基は、ホスホン酸ジエステルプローブ、例えばセリンプロテアーゼの触媒性Ser-His-Asp三つ組構造の水素結合によって活性化されたSer残基と共有結合的に反応する。タンパク質分解性およびエステル分解性のAbにおけるこのような求核体の存在は、変異誘発およびホスホネート共有結合の研究から推理されてきた(10〜12)。基質への求核攻撃は、ある種の酵素による触媒における速度制限段階である(24)。Abで報告されている触媒速度定数(kcat)の大きさは一般的に酵素よりも小さいので、一般的にAbの求核反応性には不完全性が存在すると思われる。本明細書で報告した研究は他の場合を示す。ハプテンホスホン酸ジエステルとの共有結合アダクトの形成速度から測定したところ、タンパク質分解活性が低いにもかかわらず、IgG調製物はトリプシンよりも強力な求核反応性を示した。ポリクローナルIgGおよび個々のscFvクローンの研究は、見かけ上共通の求核活性を示した。対照実験では、この反応性は熱変性で失われたので、求核体の活性化はタンパク質の天然構造に左右されるという予測と一致する。ホスホン酸ジエステルに結合する共有結合Abは、確立されたセリンプロテアーゼ反応試薬DFPによって阻害された。さらに、Abのタンパク質分解活性は、ホスホネートならびにDFPによって阻害されたので、ホスホネートと反応する求核体はセリンプロテアーゼ様の特性であることが裏付けられた。これらの研究によって、Abに本来備わっている特性としての求核反応性は、免疫応答中に生じた非共有型抗原結合力と独立して発現したことが示唆される。この結論は、タンパク質分解性Ab軽鎖の触媒的三つ組構造は生殖細胞系V遺伝子によってコードされるという以前の我々の報告と一致する(25)。
IgGの両Abサブユニットはハプテンホスホン酸ジエスエルIの共有結合を表すので、軽鎖(8、10)および重鎖(12、26)で触媒的Ser求核体が同定された研究と一致した。組換えscFvクローンの研究によって、V領域に求核部位が存在することが確かめられた。タンパク質CAL IVおよびペプチジルCAL Vaに対する抗原特異的Abでは共有結合の改善が認められることによって示唆されるように、求核体は抗原結合部位内またはすぐ側に位置する。本研究はV領域に起因する触媒活性に関して実施したので、定常領域の求核部位の存在は調べなかった。V領域および定常領域をコードする遺伝子はある種の配列同一性(27)を示すので、定常領域求核体の存在を否定することはできない。求核反応性が印象深いにもかかわらず、Abによる触媒速度は制限される。おそらく、これは アシル化および生成物遊離段階に関連したエネルギー障壁のためであろう(図1)。アシル化反応中間体の蓄積増大は、反応過程のその後の段階が類似しているにもかかわらず、質量作用の法則に従ってタンパク質分解を加速するので、この説は、scFvクローンのタンパク質分解と求核性の相関性の所見と矛盾しない。プロテアーゼに加えて、脂質、炭化水素および核酸の化学的変換に関与する様々な酵素の触媒力は共有結合機構に起因する(28〜30)。これらの酵素の中には、ホスホネートプローブとの反応が報告されているものもある(例えば、31)。アルドラーゼAbは、ホスホン酸ジエステルハプテンで免疫することによって生じたが(32)、固有のAb求核性との関係ははっきりしない。プロテアーゼおよびエステラーゼ活性に加えて、Abはヌクレアーゼ(4)、ペルオキシダーゼ(33)およびキナーゼ(34)活性を発現する。本明細書で説明した求核性Ab反応は、おそらくこれらの反応で役割を担っているのであろう。
EGFRおよび合成gp120(421〜436)ペプチドに対する特異的ポリクローナルAbおよびモノクローナルAbは、非免疫IgGよりも実質的に高い程度でこれらの抗原のCALアナログ(それぞれ、IVおよびVa)に対する共有結合を示したので、該求核体は非共有型抗原結合相互作用と協調してそれらの反応性を発現することが示唆された。したがって、非共有型Ab-抗原結合は、求電子体(ホスホン酸基)をAb求核体へより効果的に輸送することを可能にする機構として解釈することができる。ホスホン酸ジエステル基を持たない同族抗原は共有結合反応を阻害するので、求核体と非共有的結合が生じる残基との間は空間的に近接していることが示唆された。CALアダクトの実験的に観察された抗原特異的形成を説明するために、以下の条件を揃えなければならない、(a)生殖細胞系コード求核体は、Ab結合部位に保持されるか、または新規求核体は適応Ab特殊化の最中に生成されなければならない、(b)ホスホネートプローブの共有結合距離内にAb求核体がさらに接近するのを可能にするための機構を利用しなければならない。該Abはこれらの基を含有しないポリペプチドで免疫することによって生じるので、IVおよびVa内のホスホネート基で見当を合わせてAb求核体を空間的に正確に配列させることは成功しそうにない。逆に、Abの非共有結合部位と求核結合部位との間の部分的関係を予知しなくても、ホスホネート求電子体はタンパク質IVの側鎖Lys残基およびペプチドVaのC末端に配置された。これらの考察から、求核体は抗原エピトープ内に不正確に位置するホスホネート求電子体と接触させるために十分な立体的自由度を持っていることが示唆される。抗原に結合した後のAbの個々のアミノ酸の移動度は、他のグループによって報告されている(35、36)。以前に行われたエピトープマッピングおよび変異誘発研究によって、タンパク質分解性Abの触媒残基はAb抗原基準状態複合体の安定化に最低限関与することが示されたので(11、37)、求核体の移動度は非共有結合相互作用によって制限されないことが示唆された。おそらく、空間的に隣接したペプチド結合への攻撃を開始するために、求核体が自由なもう1つの遷移状態が形成されることによって、VIP(38)およびgp41(8)に対するMAbはこれらの抗原における複数のペプチド結合を切断できるという所見によって、このモデルはさらに支持される。
Abによる触媒速度を適応改善することは、B細胞のクローン選択に関与する機構によって制限される。生成物放出が細胞分裂を刺激するために必要なBCRによる膜貫通情報伝達の速度を超過すると、細胞増殖は停止する。一方、本研究の結果によって示唆されるように、Ab求核性を適用改善するために制約はない。本明細書で説明した抗原特異的Abの改善された求核反応性は、ポリペプチドによる通常免疫から生じる。該反応性は2種類の異なる抗原を対象とするポリクローナルAbおよび3種類の異なるモノクローナルAbで認められるので、該反応性を偶発的な免疫学的現象によるものと見なすのは困難である。IVおよびVaのホスホネート基に当たる天然の部分、例えば、ペプチド主鎖および側鎖アミドの求電子カルボニル基への求核攻撃は、共有結合アシル-Ab複合体の形成を引き起こすことが予測され(図1)、BCRの長期占有を可能にし、反応性の高まったAbの出現に有利である。明らかに、CALのホスホン酸ジエステル基は、タンパク質抗原のカルボニル基よりも求電子性が高いが、Ab求核性はトリプシンに匹敵するか、またはトリプシンより優れており、タンパク質抗原に対して求核性Abによる攻撃が起こり得ることが示唆される。ハプテン抗原と不可逆的な共有結合複合体を形成する能力を備えたAbの2例が報告されており(39、40)、あるAbはアルブミンに対してSDS耐性結合を示す(Paulおよび共同研究者、別の場所で報告される予定である)。Ab求核反応性は、安定な共有結合を形成せずにAb抗原結合に関与することができると考えられた。例えば、該求核反応は、プロトンを遊離基(図1のC末端ペプチドフラグメント、攻撃が側鎖アミド基に生じる場合はアンモニア)の窒素原子に与えるために利用できる機構がないために、アシル-Ab複合体には推移しない部分的な共有結合特性を備えた構造を導くことができる。
重要な生物学的影響は、自己免疫、同種免疫およびリンパ球増殖性疾患(41)で見いだされるAbのタンパク質分解活性、例えば、免疫制御の妨害(42)および神経ペプチドVIPの平滑筋弛緩作用(43)が原因であると考えられてきた。非共有結合相互作用によってホスホン酸ジエステル基のAb共有結合が促進されることを考慮すると、ペプチジルおよびタンパク質CALは触媒活性の永久的および選択的遮断を可能にするという仮説を立てることができる。さらに、非共有結合抗原結合と協調した求核性の発現が一般的なAb特性である限り、CAL阻害は一般的に、触媒活性に関わりなく、Abの生物学的影響を阻害する有用な手段とすることができる。例えば、CAL IVおよびVaを使用して、EGFR(44)および合成gp120(421〜436)(45)に結合することがそれぞれ報告されている全身性硬化症および狼瘡の患者のAbの機能的役割を研究することができる。
実施例１の参考文献
Figure 0005503837
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1略語:Ab、抗体、AMC、7-アミノ-4-メチルクマリン、BSA、ウシ血清アルブミン、CAL、共有結合反応性抗原アナログ、DFP、フルオロリン酸ジイソプロピル、exEGFR、ヒト上皮増殖因子レセプターの細胞外ドメイン、KLH、キーホールリンペットヘモシアニン、MCA、メチルクマリンアミド、V領域、可変領域、VIP、血管作用性腸管ペプチド。
選択的な共有結合による病原性抗体の不活性化に関して: 触媒性自己抗体を不活性化する血管作用性腸管ペプチドのホスホン酸ジエステルアナログ
自己免疫、アレルギーおよび移植拒絶反応の結果として産生されるある種のAbの病原性効果の元となるのは、可変領域による特異的抗原認識である。例えば、重症筋無力症(文献1の概説)および血友病(文献2の概説)に見いだされるAbは、アセチルコリンレセプターおよび第VIII因子それぞれの重要なエピトープに結合し、立体的な妨害機構によってこれらのタンパク質の生物学的活性を妨害する。その他のAbは、Fc領域を利用して病原作用を媒介するが、Ab可変領域による抗原認識はこれらの効果を開始する刺激であり、例えば、赤血球抗原のAb認識は、自己免疫溶血性貧血および不適合輸血におけるFc領域による補体活性化を刺激する。同様に、肥満細胞表面のFcレセプターに結合したIgEによるアレルゲン認識は脱顆粒を刺激する。他の疾患では、Ab病原性の機構ははっきりしない。例えば、狼瘡(文献3の概説)および橋本甲状腺炎(文献4の概説)では核酸に対するAbは明白に疾患関連性があるが、他の免疫異常もまた、これらの疾患で明白で、Abの正確な機能的効果には議論の余地が残されている。最近、Ab病原性の基礎となる新規可変領域機構、すなわち抗原の触媒的切断が明らかになった。ポリペプチド(5〜8)および核酸(9)に対するAbなどの加水分解触媒は、永久的に抗原を不活性化する能力を備えていた。さらに、触媒は交代能力を備えており、すなわち、1個のAb分子が複数の抗原分子を加水分解することができるので、このようなAbは化学量論的な抗原認識に左右されるAbよりも能力が高い機能的効果を発揮できることが示唆される。
VIPの切断を触媒するAbは、自己免疫疾患の患者で同定された(10)。VIPは、Tリンパ球に対する作用による免疫制御(文献11の概説)、並びに平滑筋に対する作用による血流および気流の制御(文献12の概説)を含めた重要な生物学的作用をするアミノ酸28個のペプチドである。モデルのタンパク質分解Abは、培養T細胞によるサイトカイン合成を妨害すると同時に細胞性VIPを減少させ(13)、該Abをマウスに投与すると気道平滑筋の弛緩を妨害する(14)。VIPに対するタンパク質分解性Abは、セリンプロテアーゼを連想させる共有結合触媒機構を利用するようである。これは、活性部位Ser残基の置換によって触媒活性の消失が生じる研究(15)およびハプテンホスホン酸ジエステルによる触媒の阻害(10)によって示唆される。これらの化合物は、求電子的リン原子の共有結合反応性によって酵素の求核体が活性化したアダクトを形成し(文献16の概説)、最近、セリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼ活性を表すAbの活性部位求核体のためのプローブとして開発された(17、18)[共有結合反応性抗原アナログ(CAL)と称する]。
通常のAbの場合のように、伝統的な非共有結合抗原認識は、VIPのタンパク質分解性Abの特異性の基礎となるとの仮説が立てられる。したがって、VIP配列のCALは、Ab活性部位に対する共有結合と隣接するペプチドエピトープでの非共有結合とを併せ持つ反応表面を提供することによって、Abを標的化する潜在的に特異的な手段となる。本明細書で、モノクローナルAbおよびポリクローナルAbの合成VIP-CAL化合物との抗原特異的共有結合反応を説明する。単一部位、Lys20にホスホネート基を配置するにもかかわらず、共有結合反応によって、残基7と22との間に位置するいくつかのペプチド結合でVIPを切断するポリクローナルAbの不可逆的な阻害がもたらされる。これらの結果から、個々のAb集団の特異的不活性化の実現可能性は、抗原特異性に基づくことが示唆される。
材料および方法
CAL。 ジフェニルN-(6-ビオチンアミドヘキサノイル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(1)は、PyBOP(Novabiochem、San Diego、CA)を使用してジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(19、20)および6-ビオチンアミドヘキサン酸(Anaspec、San Jose、CA)から調製した。HPLC精製物質[保持時間20.76分、純度95%(220nm)、YMC ODS-AMカラム(4.6x250nm)、TFA 0.05% 水溶液(A)、アセトニトリルによるTFA 0.05%溶液(B)、90:10から20:80で45分(1.0ml/min)]は、ESI-MSによって特徴付けし[測定m/z 721.3(MH+、C36H45N6O6PSの算出MH+、721.3)]、DMFに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。活性化エステル2は、同前駆体アミンをジスベリン酸スクシニジル(Pierce、Rockford、IL)でアシル化することによって調製し、同様の方法で特徴付けした[測定m/z、635.3(MH+、C32H35N4O8Pの算出MH+、635.2)]。VIP-CAL(3)は以下の通りに合成した。N末端にビオチンを有するVIP配列は、4-メチルトリチル(22)をLys20の側鎖保護として使用すること以外は、標準的9-フルオレニルメトキシカルボニル方法(21)によってRinkアミドMBHA樹脂(0.72nmol/g、Novabiochem)で作製した。該ペプチド樹脂は、ジクロロメタンに溶かした1%TFA溶液(5分x10)で処理して、4-メチルトリチル基を除去し、Lys20の脱保護したアミノ基はN,N-ジイソプロピルエチルアミン0.1mMを含有する1-メチル-2-ピロリジノンに溶かした2でアシル化した。ペプチド樹脂は、TFA-エタンジチオール-チオアニソール-フェノール(90:1:1:8)で室温で2時間処理した。濾過によって樹脂を除去した後、ジエチルエーテルを溶液に添加して沈殿を生成し、遠心によって収集してジエチルエーテルで洗浄した。HPLC精製物質[保持時間50.25分、純度96%(220nm)、Vydac 214TP C4カラム(4.6x250mm)、A:B、90:10から60:40で60分(1.0ml/min)]は、ESI-MSによって特徴付けし[測定m/z 4071.4(MH+、C185H282NO49O49PS2の算出MH+ 4072.0)]、DMSOに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。
Ab。 抗VIPモノクローナルIgGクローンc23.5および対照のアイソタイプが一致したIgGクローンUPC10(IgG2a、κ;Sigma、St.Louis、MO)は、プロテインG-セファロースを固定したアフィニティークロマトグラフィーによって覆水から精製した(23)。慢性閉塞性肺疾患のヒト患者の血清から得られたポリクローナルIgG(文献24ではHS2と称される)はまた、プロテインG-セファロースクロマトグラフィーによって精製した。抗VIP Abクローンc23.5(GenBank#L34775)の組換え軽鎖は、細菌の周辺質抽出物で発現し、Ni-アフィニティーカラムにhis6タグを結合させることによって精製した(15)。Abは全て、塩基泳動的に均一であった。タンパク質濃度は、Micro BCAタンパク質測定キット(Pierce)で測定した。
CALアダクト。 共有結合の測定は、既に説明したように実施した(17、20)。簡単に説明すると、IgG(1μM)をリン酸ナトリウム10mM、NaCl 0.137M、KCl 2.7mM(PBS、pH7.4)中で化合物1または3(10μM)と共にインキュベートした。いくつかの実験では、該反応はEDTAに収集したヒト血漿(8人の健康な血液提供者から収集、1%v/v)の存在下で実施した。反応混合物の一定量を10分、20分、40分、60分、90分および120分の時点で水浴中において3.3% 2-メルカプトエタノールを含有する2% SDSで煮沸し(5分)、次に電気泳動を行った(ポリアクリルアミドゲル4〜20%、Bio-Rad、Hercules、CA)。ニトロセルロース膜(TransBlot、Bio-Rad)にエレクトロブロットした後、ビオチン含有アダクトをストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体および化学ルミネセンス基質キット(Supersignal、Pierce)で染色した。バンドの濃度は、Fluoro-STM MultiImager(Bio-Rad)を使用して測定したarbitrary area unit(AAU)で表し、濃度が直線応答範囲内であるように気をつけた。
触媒測定法。 Pro-Phe-Arg-AMC(0.2mM、Peptides International、Louisville、KY)は、96ウェルプレートで、0.6% DMSOおよび0.025% Tween 20を含有する50mM Tris・HCl-0.1M グリシン(pH8.0)中でAb(0.8μM)と37℃でインキュベートして、AMCの遊離を蛍光計によって測定した(λem470nm、λex360nm、Cary Eclipse分光計、Varian、Palo Alto、CA)。[Tyr10-125I]-VIPの切断の調製および測定は、既に記載されている(24)。CALがABを不可逆的に阻害するかどうかを決定するために、IgG(2μM)を1または3と共に2.5% DMSOおよび0.025% Tween 20を含有する50mM Tris・HCl-0.1M Gly(pH8.0)中で16時間インキュベート(37℃)した。次に、文献35のように、未反応の1または3は反応混合物(0.2ml)をプロテインGカラムでクロマトグラフィーを行うことによって除去した(降下ゲル50μl、50mM Tris・HCl、pH7.4、0.8mlで洗浄し、0.1M Gly・HCl、pH2.7、0.2mlで溶出し、1M Tris・HCl、pH9で中和した)。回収されたIgG(およびIgG-CAL複合体)の一定量50μlを[Tyr10-125I]-VIP(86,000c.p.m)で18時間インキュベートし、ペプチド切断はトリクロロ酢酸に溶解した放射活性を測定することによって測定した。対照IgG試料は、CAL無しでインキュベートし、同様にクロマトグラフィーを行いVIP切断活性を分析した。
結果
VIP-CAL。 VIP-CAL(化合物3、図14A)の設計における重要な点は、(a)セリンプロテアーゼで見いだされるような活性化求核体と選択的に反応することができる求電子ホスホン酸ジエステル基が含まれていること(16)、(b)塩基性アミノ酸のC末端側鎖のペプチド結合(Arg/Lys)を選択的に切断するタンパク質分解性IgGモデルクローンc23.5による認識を可能にするために、ホスホネートの近隣に正に荷電したアミジノ基が配置されていること(23、25)、および(c)VIP配列のLys20の側鎖にこれらの基を取り込むことである。ハプテンCAL 1は、ホスホン酸ジエステル基およびアミジノ基を含有するが、VIP配列を持たない。Lys20に共有結合性反応部分が位置するという根拠は、Lys20-Lys21ペプチド結合はモノクローナルAbクローンc23.5(23)およびVIPに対するAbを含有するヒトポリクローナルIgG調製物(24)によって切断される結合の1つであることが観察されたことである。プロテアーゼのペプチド阻害剤は、ペプチド主鎖内またはペプチド末端に位置する共有結合性反応基を常に含有する(例えば、26、27)。本研究では、異なるAb活性部位に含まれる求核体の共有結合距離内にホスホネート基が接近する機会を最大限にすることが目的である。この理由のため、(該ホスホネートをペプチド主鎖に含めると、この基の接近しやすさにより立体的な制限をもたらし得るのとは対照的に)該ホスホネート基は、いくつかのC-C結合での回転を可能にさせる柔軟なリンカーを使用してLys20の側鎖に配置された。
図14Bに概略を示したように、VIP-CAL 3は、領域選択的な樹脂上でのアシル化によって合成した。該VIP配列は、4-メチルトリチル基を20位のLysの側鎖保護として使用すること以外は、標準的9-フルオレニルメトキシカルボニル化学物質で固相ペプチド合成することによって作製した(4a)。4-メチルトリチルを選択的に除去した後、ペプチド樹脂4bを、ジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネートおよびスベリン酸ジスクシニミジルから調製した2でアシル化した。得られたペプチド樹脂4cを無水TFAで処理して3を得て、HPLCで精製して、予測質量を有する単一種を得た(m/z、4071.4、計算値、4072.0)。
共有結合Ab標識。 モノクローナルAb c23.5は、VIPで過免疫することによって生じた。これは、伝統的な非共有結合Abパラトープ-エピトープ相互作用によって可能となった基準状態VIPの認識の高いことが特徴である(Kd 1.9nM、Km 0.34nM)(23)。該Abの触媒部位は、軽鎖サブユニットに位置し、セリンプロテアーゼ様触媒三つ組構造から構成される(15)。本明細書で、このAbとVIP-CAL 3およびハプテンCAL 1との共有結合を比較した。アイソタイプが合致したAb UPC10(IgG2a、κ)は、VIPの非共有結合的認識とは独立したAb求核反応のバックグラウンドを測定する対照として使用した。共有結合反応は、反応混合物を煮沸し、その後SDS電気泳動で変性し、ビオチン含有アダクトを検出することによって視覚化した(図15A、挿入図)。抗VIP Abとの共有結合VIP-CAL 3アダクトの蓄積は、アダクトの大部分を占める軽鎖サブユニット(分子量標準物と比較することによって決定した名目上質量29kD)と共に時間2の関数として直線的に増加した。対照AbとのVIP-CAL 3のアダクトは、低濃度で形成された。同様に、ハプテンCAL 1の抗VIPおよび対照Abとの反応はVIP-CALと比較してゆっくりで、軽鎖サブユニットのハプテンCALの共有結合への選択性はなかった。見かけ上の反応速度(Vapp)は、最小二乗法分析による経過データの一次回帰曲線の勾配から得られた([Ab-CAL]=Vapp・t、式中、[Ab-CAL]はAb-CALアダクトの強度をAAUで表したもので、tは反応時間を表す]。Vapp値を表5にまとめて示す。抗VIP Abでは、VIP-CAL 3と軽鎖との反応のVappは重鎖の6.6倍であった。このAbの2個のサブユニットに対するハプテンCAL 1のVapp値は、ほとんど等しかった。VIP-CALと抗VIP軽鎖との反応のVappは、対照Ab軽鎖との対応する反応の66倍であった。これらの所見によって、抗VIP軽鎖の求核反応性は選択的であることが示唆される。該反応混合物にホスホネート基を持たないVIPを含めると、抗VIP軽鎖とのVIP-CAL 3アダクトの形成が阻害された(図15B、3回反復した実験における阻害、41.0±7%)。抗VIP AbによるVIPーCAL 3の選択的共有結合は、VIP配列が存在するために生じる非共有型相互作用によって可能となると結論づけることができる。
VIP-CALの選択性をさらに調べるために、健常人から収集した血漿をVIPアーゼc23.5と共に反応に含めた。予測通り、VIPアーゼAbの軽鎖サブユニットの位置にVIP-CAL 3アダクトが優勢に出現した(図15C)。VIP-CALは、血漿タンパク質および対照IgGとはほとんど、または全く反応しないことが観察された。同様に、ハプテンCAL 1の反応混合物は、血漿タンパク質または外部から添加されたモノクローナルAbとはほとんど、または全くアダクト形成を生じなかった。図15Cに示した各レーンにおいて、長時間曝露すると不鮮明なビオチンバンドが質量67〜70kDに認められた。これらのバンドは、ハプテンCALおよびVIP-CALと、血漿中に存在する主要タンパク質であるアルブミンとの低濃度のアダクト形成を反映しているのであろう(図15Cの銀染色電気泳動列を参照すること)。アルブミンと有機リン酸化合物との共有結合反応は、既に報告されている(28、29)。
よく確立されているセリン加水分解酵素阻害剤、フルオロリン酸ジイソプロピル(DFP)は、抗VIP軽鎖c23.5による触媒を阻害することが既に報告されている(15)。本研究では、DFPはVIP-CALと軽鎖との共有結合を阻害し(図15D)、セリンプロテアーゼ様部位の存在と一致した。
触媒活性の阻害。 抗VIP Ab c23.5の組換え軽鎖によってペプチド基質モデルPro-Phe-Arg-AMCが切断されることは既に報告されている(15)。部位特異的変異誘発研究によって、軽鎖はセリンプロテアーゼの活性部位と同様の触媒性三つ組構造を含有することが示唆された(15)。本明細書で、軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMC切断の進行は、Arg-AMCアミド結合の切断によって生じるAMCを蛍光計で測定することによって測定した。予測通り、AMC蛍光の直線的増加が明らかとなった(図16A)。反応混合物にVIP-CAL 3を含めると、時間に依存した様式で反応を阻害した。VIP-CALが存在すると進行曲線が直線から逸脱するので、阻害様式が不可逆的であることが示唆される(30)。VIP-CAL 3およびハプテンCAL1を使用して阻害能力を比較すると、前者の化合物の能力が優れていることが示された(それぞれのIC50は1.5μMおよび27μMである、図16B)。VIP-CAL 3の優れた潜在能力は、前項で報告した共有結合アダクトのデータと矛盾せず、VIP-CAL 3のペプチジル成分の改善された非共有結合認識に起因する可能性がある。該阻害の化学量論は、制限された量のVIP-CAL 3で力価測定することによって測定した([3]/[軽鎖]比:0.0375〜3.75、図16C)。残存活性(%)のx切片対[VIP-CAL 3]/[軽鎖]プロットは0.89で、化学量論的には1:1であると示唆される。これは、軽鎖の測定分子量と矛盾しない。VIP-CALアダクト、すなわち、29kD(軽鎖、25kD、VIP-CAL、4kD)。
次に、気道疾患の患者から単離されたヒトポリクローナルIgG調製物(文献24でHS-2と称された)について取り組んだ。Fabフラグメントに活性が保持されていること、IgG結合試薬によって活性が吸着されること、および対照、すなわち、同様に精製されたヒトIgG調製物によってVIP切断が起こらないことに基づいて考えると、この調製物によるVIPの切断はIgG自己抗体に起因した。このIgGによって生じるVIPフラグメントのN末端の配列決定によって、以下の切断しやすい結合、Thr7-Asp8、Argl4-Lysl5、G1n16-Metl7、Met17-A1a18、Ala18-Vall9、Lys20-Lys2lおよびLys21-Tyr22が確認された(24)。本明細書で、VIPの複数のペプチド結合を切断するポリクローナルIgG調製物の能力を最初に確認した。IgGで処理することによって、[Tyr10-125I]-VIPから3個の新しい放射活性ピークが出現した(図17A)。前述のペプチド結合での切断によって生じるVIPフラグメントは、HPLCから同様の保持時間で溶出することが既に示されているので(24)、図17Aで観察された放射活性生成物ピークは、ペプチドフラグメントの混合物を表すものと思われる。
VIP-CAL 3が不可逆的な阻害剤であるかどうかを決定するために、様々な濃度(10、20、40、80μM)のこの化合物で処理したIgGの一定量についてプロテインGのアフィニティークロマトグラフィーを行って未反応の阻害剤を除去して、その後[Tyr10-125I]-VIPの切断を測定した(図17B)。対照IgGは、VIP-CAL無しで同様のインキュベーションを行い、その後クロマトグラフィー操作を行った。触媒活性が用量依存阻害であることは明らかで、触媒のほとんど完全な阻害がVIP-CAL濃度>20μMで認められた。不可逆的な阻害が認められたことから、前項で調べたモノクローナルAbによる作用と同様に、VIP-CALはポリクローナルAbとの共有結合アダクトを形成することが示唆される。VIP-CAL阻害効果の選択性は、ハプテンCAL 1と比較することによって確かめられた。予測通り、VIP-CALは、ハプテンCALよりもVIPの切断を阻害する能力が高かった(それぞれのIC50:7μMおよび36μM)。
考察
これらのデータから以下の結論が導かれる。(a)非共有結合および共有結合相互作用を機能的に協調させることによって、求核性抗VIP AbがVIP-CALと特異的かつ共有的なアダクトを形成することが可能になり、(b)VIP-CALは、いくつかのペプチド結合でVIPの切断に関与する反応それぞれを阻害し、様々な抗VIP触媒Abの汎用阻害剤としての能力が示唆される。VIP-CALがAb求核体を導くために非共有結合Abパラトープ-抗原エピトープ結合が重要であることは、以下の観察、VIP配列を持たないハプテンCALとの抗VIPモノクローナルAbの反応性は低いこと、関係のないアイソタイプの一致したAbとVIP-CALを有する血漿タンパク質との反応は限られていること、およびCAL部分のないVIPによってVIP-CALと抗VIP Abとの共有結合反応が阻害されることから明らかである。最近、その他のポリペプチド抗原(HIV gp120および上皮増殖因子レセプター)のCAL誘導体はまた、これらの抗原に特異的な特異的Abと共有結合アダクトを形成することが報告されているが、関係のないAbに特異的なAbでは反応がほんわずかな程度であることが明らかであった(31、32)。これらをもとにすると、これらの考察によって、抗原特異性に基づいて個々のAb亜集団が永久的阻害を行う過程が明らかにされる。
軽鎖サブユニットは、VIP-CALを有する抗VIPモノクローナルAbの共有結合反応性のほとんどの割合を占めた。ハプテンCALとの反応性は、Ab-抗原複合体化を担う伝統的な非共有結合力から独立したAb求核性の指標として役立つ。抗VIP重鎖および軽鎖サブユニットのハプテンCAL反応性は似ており、本来の求核反応性の差によって、軽鎖とVIP-CALとのアダクトの迅速な形成を説明することはできない。軽鎖求核体はAbの非共有結合部位のすぐ側にあり、非共有結合相互反応は共有結合を促進すると結論づけることができる。この意見は、このAbの精製された軽鎖はVIPの切断を特異的に触媒することができる(25)という観察と矛盾しない。以前に、非共有結合Ab-抗原複合体について従来の測定によって測定したところ(軽鎖、重鎖およびIgG全体のKdはそれぞれ、10.1、6.8および1.9nMである、文献33)、該Abの精製軽鎖および重鎖サブユニットは、VIPに独立して結合することが報告された。軽鎖に加えて、重鎖サブユニットは、VIPとのAb複合体化の非共有結合エネルギーに関与するものと思われるが、重鎖は共有結合反応に関与するVIP-CALのホスホネート基とは十分にはかみ合わないようである。
VIP-CALによって付加逆的かつ特異的にAb認識されることの他の証拠は、触媒測定から得ることができる。未反応VIPを除去した後に得られたAbのVIP-CALアダクトは、触媒活性を示さなかった。モノクローナルAbの組換え軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMCの触媒的切断は既に報告されている(15)。この反応は、軽鎖によるVIPの切断よりもKmが57.5倍高いことが特徴で、親和性の高い非共有結合に関与することができる抗原エピトープを持たないペプチド基質と触媒部位との交差反応性に起因すると考えられる。軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMC切断は、ハプテンCALよりもVIP-CALによってより強く阻害された。同様に、VIPに対するポリクローナルヒト自己抗体によるVIPの切断は、ハプテン-CALよりもVIP-CALによってより強く阻害された。
Abの多様性は、病原性Abの抗原特異的共有結合不活性化を実現するときの興味深い問題を提起する。様々なドメインの構造的差異が個々の抗原エピトープに対するAb特異性の根底にあり、小分子に対するAbを提示する限定された表面領域であっても構造的に異なる結合部位を含有することができる(例えば、34、35)。自己免疫疾患の患者の触媒性IgG調製物は、ポリペプチド(7、24)およびオリゴヌクレオチド(9)抗原のいくつかの主鎖結合を切断する。これは、ポリクローナルIgG調製物に複数のAb種が存在し、それぞれが異なる易切断結合特異性を備えていることに依る可能性がある。Abと抗原との非共有結合が生じるとき、求核体は制限を受けないAb活性部位内でいくらかの移動度が許されることを既に示唆した(31、32)。この仮説が妥当である限り、ホスホネート基が抗原エピトープ内でいくらか不正確に位置していても、異なるペプチド結合特異性を備えたAbはVIP-CALと共有結合的に反応することができた。本発明では、(ペプチド主鎖とは対照的に)Lys20側鎖のホスホネートを配置し、柔軟なリンカーを含めることは、共有結合反応に使用できる構造空間をさらに拡大するための取り組みである。VIP残基7と22との間のいくつかの結合を切断するポリクローナルAbによるVIPの触媒的加水分解が、VIP-CALによって競合阻害されることは明らかであった。したがって、異なるAbの抗原特異的共有結合を阻害するために有望な手段には、Ab触媒部位に本来備わっている構造特性を利用し、リンカー構造を操作することによってホスホネート基への接近しやすさを高めることが含まれる。これに対して、Ab-抗原結合が柔軟性のない表面接触に関与する剛体相互作用と考えるならば、共有結合阻害剤の設計には、それぞれの易切断性結合の遷移状態に形状的に近いシミュレーションが必要で、個々の阻害剤は異なる触媒Abを効率的に阻害するように開発しなければならない。阻害剤設計において構造的要素を評価することの重要性は、非共有結合サブサイトでの抗原結合が触媒サブサイトをほとんど、または全く構造的に束縛せず、遷移状態が形成されるときに該触媒残基が他のペプチド結合とかみ合うような位置になるのを可能にする触媒の分割部位モデル(31、32)を提案した以前の報告によって支持される。
既に述べたように、Abは自己免疫疾患の病理発生に関与するように企図される。特異的な共有結合阻害剤は、Abの正確な機能的効果の限定を助ける新規手段である。このような阻害剤は、有害なAb作用を改善することができる治療薬を開発するための試作品として役立ち得る。分泌型Abの不活性化に加えて、VIP-CALなどの試薬は、抗原特異的B細胞を標的とするために有用であり得る。この目的が実現可能であることは、B細胞レセプター3の成分としてB細胞の表面上に発現するAbにCALが共有結合するという証拠によって示される。Ab求核性は、共有結合触媒の第1段階、すなわち、アシル-Ab反応中間体の形成を完了させる能力の表れとして見なすことができる。これは、Ab求核反応性の大きさがタンパク質分解活性に相関するという観察によって支持される(31)。最近の研究によって、非触媒Abはまた、求核体を含有するが、抗原に対する共有結合攻撃、すなわち、アシル-Ab中間体に対する水攻撃および生成物遊離の後の触媒過程における段階を促進することができないことが示唆された(31)。非触媒Abによって発現した求核体の生理学的機能にかかわらず、それらが存在することによって、確立された病原的役割を備えたAb集団、例えば、血友病における抗第VIII因子AbをCALで標的化することが可能である。
参考文献
Figure 0005503837
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脚注
使用した略語:AAU、恣意的面積単位、Ab、抗体、AMC、7-アミノ-4-メチルクマリン、CHAPS、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸、CAL、共有結合反応性アナログ、DMF、N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO、ジメチルスルホキシド、ESI-MS、イオンスプレイイオン化質量分析、Fc、フラグメント定常部、PyBOP、(ベンゾトリアゾール-1-イル)オキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、SDS、ドデシル硫酸ナトリウム、TFA、トリフルオロ酢酸、Vapp、見かけの反応速度、VIP、血管作用性腸管ペプチド。
2CAL-Ab反応は、二次反応速度法則にしたがって予測されるが、反応の初期段階ではアダクトの直線的な蓄積が生じる。
3S.Paulおよび共同研究者、未発表データ。
非触媒性抗体の可逆的阻害および耐性（寛容）誘発
最初に、CAL反応は、抗原特異性に基づいて分泌型AbおよびAb産生細胞を不可逆的に不活性化する機会を提供する。この目的の実現可能性は、Lys20側鎖にホスホン酸ジエステル基を含有する合成VIP-CALによって血管作用性腸管ペプチド(VIP)に対するAbが特異的に共有結合によって遮断されることに関する観察によって支持される(1)。原則として、この取り組みによって、有害なAb作用に関係する疾患、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患および移植片拒絶を治療するための基本的な技術を導くことができた。非触媒Abはまた、非共有結合抗原認識と協調して求核反応性を発現するので、CALの能力的に改良された効果は、タンパク質分解性Abとの反応に限定されない。以下の抗原、VIP(1)、完全長HIV gp120(2)およびペプチドgp120フラグメント、上皮増殖因子レセプター(細胞外ドメイン、3)および第VIII因子に特異的なAbは、適切なLaCALに共有結合することが以前の研究で観察された。
分泌型病原性Abの共有結合による不活性化は、短期間で緩和がもたらされることが予測されるが、Ab合成に関与する細胞の阻害は、より興味深い治療過程を示す。限定された濃度では、B細胞に結合する抗原はクローンの増大およびAb合成の促進を誘発する。対照的に、過剰な抗原濃度でのBCR飽和は、クローンアネルギー(clonal anergy)およびアポトーシス死を誘発する(4)。非共有結合アレルゲンおよび自己抗原による耐性誘発は、良く確立された現象であるが、成功率は限られている。CALによってBCRが永久的に占有されると、B細胞がアポトーシス死へと追いやられることが予測される。従来の抗原結合の場合のように、(細胞分裂とは対照的に)この結果の実現させるためには、十分な数のBCRを飽和しなければならない。CAL-BCR複合体の解離が妨害されるので、BCR飽和は、少ないCAL濃度でより容易に実現することができる。
1.VIP抗体およびDNA抗体の標的化
LaCALの2種類の標的、DNAおよびVIPに対する抗体をこの実施例で検討する。この考察では、どちらの抗体集団が触媒活性を有するかということは想定していない。実施例1で説明したように、適切な抗原エピトープをLaCALに組み入れるならば、このように調べた抗原特異的抗体は全て、LaCALにはるかに特異的な共有結合を示す。
抗DNA Abは、狼瘡を治療するための有望な候補標的である。2本鎖DNA(dsDNA)に対するAbは、狼瘡の診断基準であり、単鎖DNA(ssDNA)および様々な核酸-タンパク質複合体に結合することができるAbもまた発見されている(5、6)。狼瘡患者の腎臓から溶出したAbは、DNAと強い反応性を示し、狼瘡患者の血液から単離した抗DNA Abは腎臓切片に結合し、抗DNA Abの養子移入によって実験動物で腎臓障害が誘発される(7、8)。抗DNA病原性の基礎となる主要な機構は、以下の現象、DNA含有ヌクレオソームまたは交差反応性タンパク質抗原への結合、細胞膜および核膜の貫通並びにアポトーシス細胞死の誘導と考えられる(8〜11)。いくつかの報告によって、ある種の狼瘡AbのDNA分解酵素活性は、細胞毒性活性を高めることが示唆される(12、13)。もう1つの機構は、Fcレセプターへの結合による免疫複合体の沈着を引き起こし、その後補体が活性化されることによって障害を招く。様々な大きさのDNA含有免疫複合体が同等に病原性である可能性はない。これらの機構は互いに相反するものではなく、例えば、ヌクレオソームに抗DNA Abが結合することによって、補体活性化を誘導することができ、該細胞によるAb内在化もまた起こる可能性がある。
VIPは、神経によって合成され、T細胞によって内部で産生されるアミノ酸28個のペプチドである。元々平滑筋を弛緩させる能力は知られていたが(14)、現在ではVIPはT細胞の重要な調節因子として認識されている。VIPに対するAbは、Tリンパ球および該ペプチドがその生物学的効果を発揮するその他の細胞種が利用するVIPを削減することができる。病原性媒介物としてのVIPに対するAbの役割は、これらの考察、(a)コラーゲンで誘導した動物の疾患モデルでは、外因性VIPの投与により関節リウマチは完全に抑制されること(15)、(b)VIP自己抗体は呼吸器疾患の患者、狼瘡患者および狼瘡様疾患を発症したMRL/lprマウス種で発見されること、(c)ヒトの自己免疫ファージから単離されたある種の組換えFvクローンは、VIP特異的結合を示すライブラリー(狼瘡)を示し、活性部位がV領域に位置することが確認されたこと(16、17)、(d)抗VIPポリクローナルAbは、VIPによって第2のメッセンジャーとして利用されるVIP誘導性AMP合成を抑制すること(18)、(d)VIPはT細胞によるサイトカインの産生を制御し(19、20)、T細胞上で異常にVIPレセプターが発現すると抗原に対する応答が変化することが示されたこと(21)、および(e)VIPの組織濃度の変化がマウス狼瘡で示されたこと(22)によって支持される。
2.CAL
求核性抗ペプチドAbの研究から得られた概念は、以下の理由、ある種のDNA切断酵素の求核中心によるタンパク質-DNA共有結合中間体の形成はよく知られた現象であること、ハプテンホスホネートプローブによって、Ab求核反応性がパラトープ特異性とは独立していることが確認されたこと、およびAb求核活性は、生殖細胞系によってコードされており、抗DNA Abが成熟するとき該活性は失われると予測する理由はないことによって、抗DNA Abに適用することができる。DNA-CALおよびCIP-CALの設計は、Ab求核体が非共有結合抗原結合部位から空間的に分離されている分割部位モデルをベースとしている。図1の反応スキームでは、Abに対する可逆的抗原結合を完全に模倣したCALのKiは低く(平衡解離定数)、k3は大きい(共有結合反応の強度)。これらは望ましいCALの動力学的特性である。
DNA-CAL(構造について図17参照)。 抗DNA Abの抗原特異性は、Abの阻害剤設計においてかなり重要である。抗dsDNAは、腎臓障害の原因になり得ることが確立されており、抗ssDNA Abはまた病原性があるといういくつかの証拠が得られている(23、24)。dsDNAに対するAbはまた、通常ssDNAに結合するが、抗ssDNA AbはdsDNAを認識しない(5、23〜26)。抗dsDNAの結合部位は、通常割れ目があるが、一方抗ssDNA Abはタンパク質へのDNAの貫通を制限するように、より浅い部位を含有するようである(24、27)。5マーのオリゴヌクレオチドは十分Abに結合することができ、個々のDNA配列を認識するための特異性は限定されている(5、28)。しかし、塩基選択性は明らかで、いくつかの抗dsDNA AbはG-Cリッチな領域に選択性を示し、その他はA-Tリッチな領域に選択性を示す(5、23)。Ab結合部位残基が負に荷電したリン酸基並びに塩基と接触することは記載されており、いくつかのAbでは、結合部位内に塩基が積み重なることによってAb-DNA複合体を安定化させる。
いくつかのCAL型、例えば、大きなdsDNA-CAL 1および単鎖標準オリゴヌクレオチド-CAL 2(オリゴ-CAL 2)は容易に調製することができる。開始物質は、制限酵素で約200bpフラグメントに消化したウシ胸腺dsDNAとすることができる。狼瘡で見いだされるdsDNAに対する自己抗体スペクトラムを標的とするためには、不均一なdsDNAを使用することが望ましい。[注記:狼瘡の抗DNA AbがDNAのA-Tリッチな構造的核に対する選択性を示すという発見に基づいて、より小さなdsDNA-CALを容易に調製することができる(例、文献28)]。dsDNA-CALは、光化学反応4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン(AMT)によって調製する。最初の反応は、DNAのチミジンの5、6位の二重結合とプソラレンの4'、5'位または3、4位の二重結合との間のシクロブタン環形成である。4'、5'位の二重結合(矢印a)での反応によって1アダクトが生じ、さらに相補鎖のピリミジン(矢印b)と反応してストランド間架橋結合(AおよびB)を形成する(30)。予め活性化したビオチン含有CAL部分(挿入図)は、AMTのアミン(矢印c)と結合する。反応化学量論は、CAL 1分子/30bpを含有するようなアダクトを生成するように最適化する。これは、全体のDNA構造を破壊することなく、Ab共有結合を可能にするように企図されている。必要であれば、CAL濃度を変更することができる。プソラレンは、1級アミンを測定することによって測定する。CALの取り込みは、アルカリ性加水分解完了後に4-ニトロフェノールを光学的に評価することによって測定する。オリゴヌクレオチドの場合、共有結合反応性は、主鎖リン酸ジエステル結合をトリエステルまたはフルオロリン酸ジエステルに変更することによって導入される。必要であれば、ホスホネートはまた、主鎖に導入することができる。しかし、アルコキシ基は電子吸引が不十分で、その結果この場合リン原子は弱い求電子性を示すのみである。図中の矢印はオリゴ-CALの遊離基を示す。前駆体、H-ホスホネートDNAアナログ(化合物i)は、従来の固相DNA合成における中間体として使用される(31)。アンモニア水で保護基を除去した後、適切な量の4-ニトロフェノール(化合物ii)を使用して、5個の主鎖
H-ホスホネート官能基の1個を4-ニトロフェニルホスホネートに変換する。次に、未反応のH-ホスホネートをヨウ素で酸化して、トリエステルを散在させた通常のリン酸ジエステル結合を得る。フルオロホスフェートCALを合成するために、該生成物を通例のDNA合成法(I酸化/NH3水溶液)によって、次に18-クラウン-6塩化チオニル(iii)の存在下でKFで処理する。これによって、リン酸ジエステルがフルオロリン酸ジエステルに変換される(フルオロホスフェート基1個/塩基5個になるようにKFを滴定する)。誘導体化は、アルカリ性加水分解後に4-ニトロフェノールを光度的に測定することによって、または元素分析によってフッ素を定量することによって評価する。オリゴ-CALの長さは、塩基30個に維持することができる。ビオチンは、合成中にオリゴ-CALの5'末端に結合させる。CAL部分を無作為に配置するが、その濃度はAb結合をもたらすために十分である(エピトープの最小限の長さはヌクレオチド5個である)。狼瘡の抗ssDNA Abは、ポリ(dT)鎖に選択性を示すが(5、24)、個々の配列への特異性は比較的に限定されていない。したがって、オリゴ-CAIの中心領域は、両側に7マーのランダム配列が隣接した16マー[(N)7-(T)16-(N)7]であることができ、合成中にA/T/G/C/の混合物を使用して隣接部に縮重が導入されている。
VIP-CAL[構造について図18参照)。 VIP-CALは、ペプチド(残基7〜29、VIP-CAL6〜9)または完全長VIP(VIP-CAL1〜5)の切断型から得られる。切断配列は、レセプター結合を回避するために望ましい[完全なVIP配列は、レセプターによる結合に必要である。自己抗体はVIPのC末端半分を認識する]。示されたCAL変種は、主鎖CALおよび側鎖CALを含む。
VIP-CALの合成および特徴付けは、実施例IIIで説明する。ホスホン酸エステルVIP-CALに加えて、カルボニルCALは半減期が長く、Abによるペプチド結合切断においてカルボニル反応中心をよく刺激するので有用である。カルボニルVIP-CALの例を図18に示す。この化合物の構造は、ホスホネートCALと同様に、ピルビン酸アミジノフェニルはセリンプロテアーゼとの共有結合複合体を形成するという報告(32、33)に基づく。
ホスホネートVIP-CALの鍵となる要素は、(a) Abパラトープへの非共有結合を可能にするペプチド構造、(b)モノエステルの場合、非エステル化酸素上の負電荷の発現を可能にする、リンの化学的活性程度を決定する1個(モノエステル)または2個(ジエステル)の遊離基、および(c)正に荷電したアミジノ基である。担体タンパク質に結合させるためのビオチンおよびアミノ酸は、必要に応じてN末端に組み入れる。速度定数k3(図1)は、リン原子の共有結合反応性に左右される。異なるk3値を有するCALは、様々な目的に有用である。k3値が大きな反応性の高いCALによって、迅速かつ完全なAbの阻害が実現する。弱い共有結合CAL(低k3)は、弱い求核体では反応せずに強いAb求核体と反応する。図1の反応スキームにおいて、VIPとAbとの可逆的な結合を完全に模倣したVIP-CALは、VIPのKdと同等の平衡定数Ki(k2/k1)を有する。さらに、負に荷電したモノエステルCALが遷移状態の非共有結合反応を模倣しているので、Kiは遷移状態の結合エネルギーのいくつかの要素を反映する。
ホスホン酸ジエステルは、共有結合部分としての役割を果たし、正に荷電したアミジノ基は場合によってホスホネートのN末端側に位置することができ、K/R様物質である。N-末端ビオチンはAb結合の検出を可能にする。VIP-CAL 3および6は、K20の代わりにペプチド主鎖内に組み入れられたアミジノ-ホスホン酸ジエステルを含有する。該ペプチド隣接部は、より完全な非共有結合的パラトープ-エピトープ相互作用の捕捉に望ましい。VIP-CAL 3〜5および7〜9は、VIPの3K残基のNH2側鎖に位置するホスホネートを含有する。標準的化学合成法を適用する(1〜3、34)。主鎖VIP-CALは、最初は溶液中でホスホン酸ジエステル単位を合成することによって調製する。保護されたペプチジルホスホネートは、N末端グリコール酸残基を使用して固相合成によって調製したC末端ペプチドフラグメントに結合し、該生成物を無水TFAで処理して所望するCALを得る。側鎖CALは、ホモ二官能性リンカー、ビス-スルホスクシニミジルスベリン酸を使用してアミノ(4-アミジノフェニル)メタンスルホン酸ジフェニルとVIP(またはビオチン化VIP)を結合させることによって調製し、次にHPLCによって様々なLys残基で標識した個々の異性体を分離する。CALであることは、質量分析/NMRによって確認する。アシル化Lysの位置は、MS/MS分析によって決定する。合成における主な落とし穴は、意図しない基での副反応である。これは、適切な保護基を利用することによって最小限に抑える。
ピルビニルVIP-CALは、構造的に3と同様である。この化合物の調製には、ピルビン酸カルボキシルとLysの側鎖アミンとの間の不可欠な反応はVIP-CAL 4によく似た反応を進行させるので、困難な点は存在しない。
これらのCALの研究によって、Ab求核体が受ける柔軟性の検討が可能である。ホスホネートの両側にペプチドが存在することは、非共有結合的パラトープ-エピトープ相互作用の捕捉に望ましい可能性がある。ホスホネートのC末端側のVIP領域(残基22〜28)は、Ab-VIP認識に重要なエネルギー的寄与を与えることが示されている。
共有結合的Ab結合。
以下の段階、(a)狼瘡のAbによる共有結合的CAL結合の大きさおよび特徴の決定並びに(b)CAL結合がDNAまたはVIPに対するAb結合の欠失を誘導するかどうかの決定は、CAL設計の妥当性を検証するために行う。in vivoにおいて見いだされる様々な抗DNA/抗VIP Abが標的となるに違いないので、ほとんどの検証研究にはポリクローナルAbを使用する。場合によっては、例えば、動力学的定数を正確に決定するために、モノクローナルAbを使用することが必要である。以下の原料、(a)対照被験者と共にアメリカリウマチ学会の基準によって診断された狼瘡患者(N=20)、(b)8週齢のMRL/lprマウスおよび対照MRL/++マウス(N=8)、(c)20週齢のMRL/lprマウスおよび対照MRL/++マウス(N=8)から収集したIgGについて研究する。プロテインG-セファロースで精製したIgGは、高いCAL濃度で処理する。共有結合は、SDS電気泳動並びにストレプトアビジン-ペルオキシダーゼおよび化学ルミネセンス基質を使用したブロットにおけるビオチン化バンドの染色によって測定する。DNA-CALの場合、複合体の質量測定は不可能であるが、Ab複合体と遊離DNA-CALの明確な分離は可能である。対照には、過剰なDFP(Ab求核体での結合に対する競合剤)および過剰なDNAまたはVIP(非共有結合競合剤、これは、CAL結合が活性部位で生じることを示す)による処理が含まれる。この反応は、Biorad画像化装置を使用して濃度測定によって定量する(ビオチンの5ログのオーダーにわたって直線である)。
抗原エピトープでの非共有結合によって、VIP-CALおよびDNA-CALがそれぞれの特異的Ab集団に対して、対照Abと比較して優れた結合性を示すことが可能になる。IgGのポリクローナル性に関連した曖昧さは原因ではないことを確かめるために、DNAおよびVIPに対する少なくとも1種類のモノクローナルAb(例えば、DNA-CALについてはBV04-01クローン、VIP-CALについてはc23.5クローン)を使用してCALを分析する。CAL結合および従来の酵素の阻害は、CAL選択性を確認するのと同様に研究する(セリンアシラーゼ、例えば、トリプシン、DNA切断酵素、例えば、DNAアーゼI)。共有結合を時間およびCAL濃度の関数としてKitz-Wilsonプロットすることによって(35)、Ki(非共有結合の強度)およびk3(求核反応性の強度)の推定が可能である。不可逆性は、(遊離CALを除去するために)Ab-CAL複合体のプロテインGクロマトグラフィーを行い、次いでDNAおよびVIP結合を再度分析することによって確定される。結合活性の消失は、共有結合によるAb阻害を示す。この目的のために、抗原(DNA、VIP)を固相に固定し、結合したAbはペルオキシダーゼ結合抗ヒト/マウスIgGを使用して測定する標準的ELISA方を使用する。ELISA研究は、N末端および5'末端それぞれをビオチン化した合成VIP/オリゴヌクレオチドでコーティングしたストレプトアビジンプレートを使用して行う。ウシ胸腺のdsDNAおよびssDNAは、プレートに直接固定する(ssDNAは文献36のように調製する)。
dsDNA-CALで以前に使用したジフェニルホスホン酸ジエステルを使用することで、この化合物の共有結合反応性は抗DNA求核性を探索するために十分であることが保証される。オリゴ-CALは、主鎖にリン酸トリエステル/フルオロリン酸ジエステルを含有し、その共有結合反応性はジフェニルホスホネートおよびDFPに匹敵する。
VIP-CAL設計および合成は、ポリペプチドCALに関する以前の研究をモデルにしている。狼瘡に存在する様々なAbを標的とするので、任意の1CALでは完全な、またはほとんど完全な共有結合Abの遮断を得るために十分ではない可能性がある。したがって、その後の研究ではCALの混合物を使用することが必要である可能性がある。非共有結合パラトープ-エピトープ認識による親和性の高い結合は、無関係なAbおよび酵素とCALとの反応を最小限に抑える。
3.抗体の生物学的活性に対するCALの作用
Ab細胞毒性のAb DNA-CALによる阻害。 狼瘡の抗DNA Abは、膜を貫通して、アポトーシスを引き起こす。DNA-CALで処理した抗DNA Abの細胞毒性作用は、尿細管細胞系(LLC-PK)およびMTT測定を使用して評価することができる(37)。該IgGの原料は、狼瘡患者、健常人被験者、8週齢のMRL/lprマウス、20週齢のMRL/lprマウスおよび同齢の対照MRL/++マウスである。さらに、少なくとも1本のモノクローナルL鎖を分析して、Ab不均一性による予期しない影響を排除する(例えば、KM38クローン)。IgGは、希釈した、または様々な濃度のDNA-CALおよび(CAL部分のない)対照DNAとインキュベートして、遊離のリガンドをAim1のように除去して、該混合物を細胞と混合して24ウェルプレートで培養した。細胞毒性は、24時間後に定量する。対照ウェルにはAbを入れない。ヨウ化プロピジウム(死細胞)およびHoechst33342(死細胞+生細胞)で染色した後、顕微鏡検査によって確認する。他の研究は、遊離CALを除去せずに、AbおよびCALで細胞を処理することによって行う。CAL自体は細胞毒性作用を生じず、CALおよび細胞が互いにAb結合を競合するとき有益な効果が得られることを示すために、これらが必要である。腎臓における狼瘡のAbの直接的な細胞毒性作用は一般的に、DNA含有抗原および/または交差反応性タンパク質抗原へのAb結合に関与し、その後、完全には定義されていない経路によって細胞/核膜を貫通すると考えられる。CALによる共有結合Abの機序は、永久に抗原結合機能を破壊するだろう。したがって、Fcエフェクター機能が関与しなければ、CAL結合Abは細胞毒性作用がないと予測される(培養物中に補体またはADCC競合細胞のもととなるものがなく、Fc関与の機会が最小限に抑えられていることに注意されたい)。
腎臓抗原認識のDNA-CALによる阻害。 抗原認識が腎臓における狼瘡Abの沈着の機構である限り、DNA-CALによってAbを共有結合的に遮断すると、腎臓部分へのAb結合の低下がもたらされるだろう。狼瘡腎臓におけるAb沈着の機構としての抗原認識対Fcレセプター結合の量的重要性は知られていない。狼瘡におけるヌクレオソーム形成の増加は、抗DNA Ab結合の機会の増加させることを示すので、野生型MRL/++マウス並びにMRL/lprマウスの腎臓凍結切片を分析する(38)。免疫蛍光法を使用して、対照IgGおよびDNA-CALで処理したIgGの結合を測定する(8週齢のMRL/lprマウス、20週齢のMRL/マウスおよび同齢の対照MRL/++マウスのIgG、抗マウスIgG-FITC複合体)。CAL誘導体化Abによる残存結合がFcレセプターを必要とするかどうかを決定するために、(パパイン消化/プロテインAクロマトグラフィーによって調製した)過剰なマウスFcフラグメントの存在下で結合実験を繰り返す。
in vivoにおけるDNA-CALの有益な効果。 MRL/lprマウスの狼瘡の臨床経過は、ヒト狼瘡と類似点がある。ヒト狼瘡の多くのホールマーク、例えば、様々な自己抗原に対するAbの形成、腎臓障害、タンパク尿、多臓器障害およびTヘルパー細胞活性の上昇がこれらのマウスで観察される。DNAおよびVIPに対するAbは、MRL/lprマウスの血清中に自然に発生する。したがって、MRL/lprモデルは、CALの潜在的な改善効果を測定するために適した最初の類似物である。DNA-CALは、2齢、すなわち8週齢および14週齢のMRL/lprマウスに投与することができる。ある種の自己抗原に対する血清Abは、8週齢で出現し始め、狼瘡に特徴的なAbのほとんどは14週齢で検出され、腎臓障害が明白となる。死亡率は14週齢後急速に上昇し、50%死亡率は22〜24週齢で生じる。最初は、DNA-CALを3回、例えば、2週間隔で静脈内投与して調べることが適切である。対照マウスには希釈剤を投与する。8週齢の同齢集団群のマウス8匹それぞれを2週間隔で安楽死させ、26週齢まで詳細な分析を行う(マウス8匹/群、基準となる8週齢の群を含めて10群)。同様に、14週齢の同齢集団のそれぞれマウス8匹の群を26週齢まで2週間隔で安楽死させた(基準となる14週齢を含めて7群)。さらに、Ab結合および触媒活性に対するCALの急性効果を研究するために、CAL投与それぞれの1日後に目の血液を採取する(以下参照)。in vitroでの有効性データに基づいてCAL投与量を調節し(配分量は約10mlと仮定した)、抗DNA Abを阻害するにはnM濃度のCALで十分であることを示すと予測される。dsDNA-CAL/オリゴ-CALの混合物は、様々なAbサブタイプの阻害を得るために最初に研究された。その後の研究には、必要に応じて別々に投与したCALの様々な濃度の分析が含まれる。血清抗dsDNA/ssDNA力価は、ELISAによって測定する。(抗DNA Ab再補給が共有結合遮断よりも速くなければ)抗DNA力価が減少することが予測される。血清IgGの残存するDNA-CAL結合活性は、以前のように測定する。これらから導かれるように、DNA-CALが他の抗dsDNA Ab合成の免疫原として役割を果たすことは期待されない。Abは、DNA結合タンパ
ク質および補助剤と一緒に免疫することが必要である(39)。
抗DNA免疫応答は、狼瘡を開始することが理論付けられている(例、40)。例えば、いくつかの他の自己抗原に対するAb応答は、DNAに対して感作された細胞が存在するとDNAに関連したタンパク質に対するAb応答を促進することができるという「エピトープ拡大」現象によって説明することができる。したがって、これはDNA-CAL処理マウスにおける全体の免疫応答の程度を評価するために有用である。これは、血清免疫複合体およびリウマチ因子を標準的方法で測定することによって実施する。腎糸球体障害の研究は、ヒト生検を評価するための標準的方法(WHO分類、半定量的指標)を使用して、細胞肥大の程度、糸球体硬化/瘢痕化、細胞外マトリックス過剰および炎症細胞の存在に注意を払って、病理学の専門家が組織学的に調べることである。タンパク尿は、Chemstripで読み取る。腎臓切片のAbおよびC3沈着は、FITCで標識した抗マウスIg/抗マウスC3で染色することにより、大きさおよび染色部位(例えば、基底膜、上皮下、細胞表面、核)の考察を行う。全身の健康状態および死亡率は、マウスを毎日検査することによって記録する。初期データを入手したら、必要に応じて、死亡率の20%改善を検出できるように統計学的に強化すべき研究のために、十分な数のマウスで繰り返し実験を実施することができる。
サイトカイン合成に対するVIP-CALの効果。 VIPは、サイトカイン合成および膜タンパク質合成を含めたT細胞分化のいくつかの重大な段階で重要な効果を発揮する(例えば、Fasリガンド発現、共刺激タンパク質B7.2)。自己免疫応答の抑制においてVIPが有益な効果をもたらすことは公知である(15)。抗VIP Abによって誘導されるT細胞合成の変化を修正するVIP-CALの能力について研究する。2型VIPレセプター(VPACR2)を過剰発現するトランスジェニックマウスのT細胞を前記の研究のように使用する(41)。Tヘルパー応答は、この実験系を直接狼瘡に関連させるVPACR2上方制御に関係づける。VIPの減少に伴う容易に検出可能なサイトカイン合成の変化は、VPACR2過剰発現T細胞を抗VIP Abで処理することによって観察される。抗CD4磁気ビーズを使用してマウスから単離したT細胞を、抗VIP Abと混合したVIP-CAL(モノクローナルIgG c23.5およびアイソタイプが一致した非免疫IgG:IgGは8週齢MRL/lprマウス、:20週齢MRL/lprマウスおよび同齢の対照MRL/++マウスから得る)と共に96時間培養する。10nMという少量の抗VIP濃度で、IFN-γ分泌の減少およびIL-4分泌の減少を引き起こすのに十分である。ELISA法を使用してT細胞によるIFN-γおよびIL-4分泌を測定する。以前のように、細胞をAb処理する前に遊離のCALを除去すると、不可逆的なVIP-CALの効果を測定することが可能である。抗VIP Ab処理によって、ペプチドによって自己分泌T細胞制御を妨害すると考えられるT細胞中のVIPは減少する。したがって、Ab処理細胞においてVIP-CALがVIP濃度を正常濃度まで回復する能力を(以前の研究のように、酸性pHでAb-VIP複合体の解離後に総VIPを放射性免疫測定することによって、文献18、42)測定することは有用である。レセプター結合にはVIPの完全な配列が必要なので(CALは切断型VIPを含有する)、VIP-CALとリンパ球VIPレセプターとの直接的な相互作用は妨害される。
in vivoにおけるVIP-CALの有益な効果。 in vivoでのVIP-CAL研究は、本質的にDNA-CALで説明したように設計する。鍵となる特性は、(a)血清抗VIP Ab結合活性は、VIP-CALを投与した後でELISAおよび放射測定法それぞれによって測定する、(b)血清および脾臓抽出物中の総VIP濃度は、放射免疫測定法によって測定する(18、42)、(c)総IgG、抗DNA Ab、リウマチ因子および免疫複合体の血清濃度は、免疫化学相関のために測定する、(d)T細胞亜集団(CD4+、CD8+、活性化CD4+細胞、全B細胞(CD19)およびNK細胞(DX1.1)のフローサイトメトリー測定を実施する。活性化されたTヘルパー細胞の数が減少していれば、VIP-CAL処理の全体的な有益効果が示され、(f)腎臓の組織学、Ab沈着および生存データが得られる。DNA-CAL研究の場合のように、VIP-CALは有益な効果のために別々に分析することができ、またはin vitroにおける有効性データに基づいてVIP-CALの混合物を分析することができる。
CALの半減期が時間で表されるとしても、有益な効果が認められると予測される。十分なCAL初期濃度が得られると仮定すれば、Abとの反応は迅速に完了するだろう。MRL/lpr研究の結果に応じて、ヒトの研究を考慮する前にその他の狼瘡を起こしやすいマウス種を分析することができる(NZB/W F1; BXSB)。
4.耐性誘発
抗原特異的共有結合レセプターの機序は、LaCALの開発によって実現可能になった。共有結合BCRおよびTCRを占有することによって、これらの細胞をアポトーシスさせることによってB細胞およびT細胞の抗原特異的耐性（免疫寛容）を誘導する能力が維持された。必要であれば、LaCALの効果はこれらの化合物内に毒素を含めることによって補強され、前進的な副作用を引き起こすことなく標的細胞を選択的に殺す。シュードモナス内毒素およびリシンなどの毒素を様々なタンパク質に結合させることは、文献に詳細に記載されており、タンパク質化学結合または遺伝子融合技術によって実現することができる(43)。
BCRとハプテンCALとの共有結合反応。 化合物I(図19)などのハプテンCALは、従来のセリンプロテアーゼの求核性部位およびAbと不可逆的に反応する(3、35、44〜47)。この化合物の合成方法、マウスからのB細胞の調製方法、細胞への結合のフローサイトメトリーによる分析方法およびIgサブユニットに対する共有結合の電気泳動による測定方法は、文献3、35、48に記載されている。予め免疫されたレパートリー(すなわち、意図的な免疫学的攻撃をすることなく自然に生じたレパートリー)のB細胞表面で発現する求核反応性を評価するために、BALB/cマウスの生脾細胞をハプテンCAL Iで処理した。対照化合物IIは、ホスホネート基がエステル化されておらず、求核性残基との共有結合活性の消失が生じること以外は、ハプテンCAL Iと構造が一緒である(3、35)。ハプテンCAL Iで処理すると、ほとんどの細胞が化合物IIよりも高い濃度で染色され、強い染色を示す細胞が少数あった(11±2、実験回数3回、UV顕微鏡を使用して400個のリンパ球を計数することによって測定した)。ハプテンCAL I染色細胞は全て、リンパ球形態を示し、単球の染色は不明瞭で、好塩基球は時折染色された。トリパンブルー排除法によって測定したように、ハプテンCAL Iまたは化合物IIと共にインキュベートした後で、細胞の生存性の消失が無いことは明らかであった。フローサイトメトリーによって顕微鏡による結果が裏付けられた。ハプテンCAL Iで処理した細胞の79パーセントが化合物IIで処理した細胞を超える蛍光強度を示し、少数の亜集団は非常に高い蛍光強度を示した(14%、図20Aの亜集団2)。3回実験を繰り返して、B細胞マーカー CD19が陽性のハプテンCAL I染色細胞の集団の割合は82±4%であった(図20B)。逆重畳積分顕微鏡によって、ハプテンCAL I結合による蛍光パターンは、好CD-19 Ab蛍光パターンとほとんど一致することが示された(図20C〜E)。CAL蛍光のほとんどは、B細胞の表面に限定された(図20F)。
細胞表面上の求核分子を同定するために、精製したB細胞をハプテンCAL Iで標識し、細胞の界面活性剤抽出物を煮沸し、その後SDS電気泳動で分析した。限られたハプテン-CAL含有タンパク質のみがはっきりしていた(図21A)。予測通り、銀染色によって異種の存在が明らかとなり、細胞の複合タンパク質構造が反映されていた。優勢なハプテンCALアダクトバンドの質量は70kDで、このバンドは抗μ鎖Abによって染色された(図21B)。少量のハプテンCAL含有バンドが、25kD、40kD、50kD、55〜60kD、90〜135kDおよび140kDに明白に表れた。55〜60kDおよび140kDのバンドは、抗μ Abによって染色可能であり、25kDおよび50kDのバンドは抗κ/λ Abで染色可能であった。分泌型AbおよびB細胞抽出物の以前の研究でも観察されたように(22〜24)、完全長モノマータンパク質とは異なる質量範囲の変則的なμおよびκ/λバンドは、おそらく還元されていないオリゴマー、分解産物および切断型B細胞Ig産物を表している。μ、γ、κ/λ(図21B)およびδ鎖(示さず)に対するAbで染色されなかった40kDおよび90〜135kDにおける微小バンドは、おそらく非Igタンパク質を表す。Igγ鎖に対応するハプテンCAL含有アダクトは検出されなかった。細胞抽出物のイムノブロットによって、抗γ Abで染色可能な50kDのバンドが同定されたが、このバンドは強く過剰露出されたゲルでのみ視覚化可能で、ほんの少量のγ鎖が抽出物中に存在したことを示唆した。
ハプテンCAL IアダクトはIgサブユニットを含有することの確認は、μ、δ、γおよびκ/λ鎖に対する固定化Abのカラムでのアフィニティークロマトグラフィー、その後のSDS電気泳動によって行った(図21C)。ハプテンCAL含有μおよびκ/λバンドは、抗μおよび抗κ/λカラムからの溶出液中で明らかであった。抗κ/λカラムからの溶出液中にハプテンCAL-含有μ鎖が回収されたことは、細胞表面上のジスルフィド結合軽鎖および重鎖複合体の存在によって説明することができる。抗γおよび抗δカラムからの溶出物にはハプテンCAL含有バンドは存在しないことが明白であるが(データ示さず)、これらのタンパク質は免疫学的に未処理のマウスのB細胞では低濃度でのみ発現したので、γ/δ鎖求核反応性の欠如の反映と解釈することはできない。Igサブユニットとの複合体化に起因すると考えられる細胞全体のハプテンCAL染色の割合を測定するために、B細胞抽出物をμおよびκ/λ鎖に対する固定化Abから成る1本のアフィニティーカラムで分画した。未結合画分のビオチン含有バンドおよびカラムに添加した抽出物を濃度測定によって測定したところ、細胞のハプテンCAL含量の80パーセントがカラムに吸着した(デーた示さず)。総合すると、これらの観察によって、完全なB細胞のハプテンCAL染色のほとんどは、表面Igに対する不可逆的な結合に起因しており、共有結合反応性のほとんどはμ鎖で説明される。
抗原特異的BCR共有結合標識化。 LaCALの抗原特異的共有結合反応性を確認するために、B細胞をMRL/lprマウスの脾臓から調製する。これらのマウスは、VIP(16、17)およびDNA(23)に対する特異的抗体を合成する。必要であれば、B細胞はまた、VIPおよびdsDNAで免疫したマウスから調製することができる(DNAに対するAbの誘導は、DNAをヒストンなどのタンパク質に複合体化すると可能である)。脾臓から精製したB細胞は、MRL/lprマウス(10〜12週齢)と共に、陰性選択キット(Miltenyi)を使用して自己抗体に対して陰性の対照非自己免疫種(MRL/++)から得られる。
B細胞のVIP-CALおよびDNA-CAL反応性の大きさおよび細胞表面Igに起因する反応性の割合を分析する。ハプテンCALと共にLaCALを分析して、抗原特異的BCR共有結合をもたらす最適構造を決定する。B細胞は、適切な時間の長さ、CALと共にインキュベートし、該細胞を洗浄して、次に界面活性剤(CHAP 9mM)で抽出する。Igサブユニットは、μ/δ/α/γ/ε/κ/λ/代理L鎖に対する固定化Abを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製する(代理L鎖は未成熟B細胞で発現する前駆体BCRの成分である)。対照アフィニティーカラムは、無関係なタンパク質に対する固定化Abから構成される。CAL-アダクトは、還元SDSゲルでのビオチン検出によって同定する。個々のIgサブユニットの濃度は、Igサブユニットに対する固定化Abを使用した従来のELISAによって測定する(標準は標準タンパク質である)。データは、バンド強度/IG濃度として表す。バンドの確認のために、ブロットをIgサブユニットに対する抗体を結合させた特異的ペルオキシダーゼで染色する。以前の研究におけるように、細胞-CAL反応混合物の粗細胞抽出物はまた、SDS-PAGEによって分析する(事前にアフィニティークロマトグラフィーは行わない、これは、BCRに起因すると考えられる標識の割合を算出するために必要である)。VIP-CALとB細胞との反応にVIPを含めると、VIP-CAL結合が非共有結合ペプチド相互作用に依存する程度を測定する一助となる。DFPによるVIP-CAL結合の阻害は、Ig結合が活性化求核体で生じることを示すのに役立つ。同様の研究は、抗原特異性を示すDNA-CAL結合の阻害剤としてDNAを使用して実施する。
アダクト形成の動力学的分析は、KiおよびK3の値を得ることである(35)。これらは、非共有結合的反応性および求核反応性それぞれの寄与の客観的な評価となる。
以前の免疫化学的分析によって、B細胞抽出物中のハプテンCALアダクトの約80%はIgサブユニットに起因することが示されている。したがって、BCR求核性に関連するある種の特性は、無傷の細胞を使用して決定することができる。CD19に対するAbに結合させたフィコエリトリンを使用してB細胞を同定する。細胞は、CALおよびストレプトアビジン-FITCとのインキュベーションが完了するまで生きた状態で維持する。ホルマリン固定細胞は、UV顕微鏡で調べる。生存は、CALインキュベーションの前後にトリパンブルー排除法によって測定する。共焦点顕微鏡は、逆重畳積分機能を装備したオリンパス顕微鏡を使用して実施する。凍結脾臓切片はCAL染色で分析して、CAL標識B細胞によって占有される特有の形態学的位置を確認する[瀘胞細胞は未成熟なB細胞である傾向がある、辺縁領域の細胞はより成熟している]。μ/δ/α/γ/ε/κ/λおよび代理L鎖に対するAbで染色した細胞のフローサイトメトリーによって、ほとんどのCAL反応性細胞によって合成される好ましいAb型を同定する。
以下のようにCALで染色可能な細胞のB-1/B-2性質に関して他の有用な情報が得られた。B-1細胞[CD45(B220lo)、IgMhi、CD23-、CD43+、IgDlo]は、自己反応性Ab産生の原因となる傾向がある。VIPおよびDNAは自己抗原であるので、これらの抗原に対する求核性Abの優先的産生が起こると考えられる。脾臓は、あまり多くのB-1細胞/初期B細胞前駆体を含有しない。必要であれば、B-1細胞に富んだ腹膜細胞をさらに分析することができる。
in vitroにおけるCALによる細胞刺激。 培養細胞は、ハプテンCAL、VIP-CALまたはDNA-CAL(濃度を増加させ、時間の長さを変化させる)で刺激する。共有結合反応基を持たない化合物3は対照である。もう1つの対照は、抗IgM Ab処理した細胞である。以下の測定法を実施する。細胞のDNA合成は、BrDU取り込みキットを使用して測定する。対照には、CAL無しでヌクレオチドとインキュベートした細胞が含まれる。CALが細胞にAb合成をさせるかどうかを決定するために、CALによるin vitro処理の後に該細胞を洗浄し、抗原のない培地で維持し、抗体形成細胞の数をフローサイトメトリーによって測定する(μ/δ/γに対するAbで染色する)。
通常抗原によるBCR飽和は、細胞をアポトーシスさせることが知られているので、CALは耐性誘導性細胞死を引き起こす能力を保持する。TUNEL法によるフローサイトメトリー法によって以下のCAL処理を試験する(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling、標識鎖分解にフルオレセインdUTPを使用)。機器による較正、側方および前方散乱光および補償値を設定して、定期的に再確認する。抗Fas Abは、陽性対照として使用する。各アッセイにおいて、in vitroで誘導された効果の特異性は、ハプテンCALを超える濃度でのVIP-CALおよびDNA-CALに対する応答によって示される。VIP-CALおよびDNA-CALの効果を、CAL部分を持たないVIPおよびDNAの効果それぞれと比較することは、共有結合反応に起因すると考えられる効果の指標として役立つ。
in vivoにおける耐性（免疫寛容）誘導。 B細胞によるLaCAL共有結合は、免疫学的耐性を誘導すると予測される。以前に、過剰な抗原で表面Igを飽和することによって誘導したB細胞アネルギーについて詳細に報告した(49、50)。前述のように、in vivoにおいてVIP-CALおよびDNA-CALで処理したマウスのVIPおよびDNAに対する細胞反応性をそれぞれ分析する。
本質的に、VIP結合B細胞およびDNA結合B細胞の数は、対応するLaCAL投与を受けたマウスの脾臓調製物で測定する。これは、ビオチン化VIP、dsDNAおよび単鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用したフローサイトメトリーで実施する。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを使用して、該細胞に結合したVIPおよびDNAを同定する。フィコエリトリンに結合させた抗CD19で染色して、B細胞亜集団を同定する。確認研究は、ELISASPOT法を使用して実施し、B細胞をin vitroでVIPまたはDNAによって刺激して、in vivoにおけるCAL処理に起因するAb合成応答の下方制御を測定する。
通常の自己抗原で分泌型AbおよびBCRを標的とする従来の方法は、過剰な内在性自己抗体を克服するために非常に親和性の高いアナログを使用しなければならないという事実のために限界がある。Abに対する可逆的な結合によって最終的に自己抗原アナログの分離が引き起こされ、活性化Abが再生する。一方、共有結合LaCALは、Ab結合部位に永久に組み合わさるように企図されている。永久的な(共有結合)BCR結合は、過剰な抗原による飽和と類似しており、B細胞クローンのアポトーシスおよびアネルギーを誘導することがよく知られている。
前記で引用した実施例では、LaCALは免疫原として作用することはあり得ない。抗dsDNAの誘発は、一般的に非常に困難である。同様に、ペプチドを担体タンパク質で誘導体化し、強力な補助剤と共に注射するとき以外は、VIP投与によって抗VIP合成は誘発されない。
参考文献
Figure 0005503837
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第VIII因子Abの阻害および第VIII因子に対する耐性（免疫寛容）の誘導
第VIII因子(FVIII)に対するAbは、FVIIIIで治療したある種の血友病患者における出血増加の明らかな原因である(文献14の概説)。血友病患者が産生するAbの重要なFVIIIエピトープの1つは、A2ドメインの残基484〜508で構成される(15)。FVIIIは、血液凝固の固有経路の1成分で、第10因子から第10a因子への変換を触媒する第9a因子の補因子としての役割を担う。第VIII因子(FVIII-CAL)のCAL誘導体は、分泌型抗FVIII Abを選択的な共有結合阻害を実現する候補試薬で、抗FVIII産生B細胞の死を引き起こす。
FVIII-CAL。
2種類のCAL、(i)前駆体として組換えFVIIIを使用してアミジノホスホン酸ジエステル基を有するLys操作を誘導体化した完全なタンパク質FVIII-CAL(図22)、および(ii)C末端にアミジノホスホン酸ジエステルを配置されたペプチジルFVIII(484〜508)-CALをここに例として挙げる。柔軟なリンカーを使用してタンパク質にホスホネート基を結合させ、Ab-CAL複合体内で利用できる大きな構造空間をホスホネート基が動けるようにする。これは、非共有結合エピトープ認識部位とはいくらか異なる形態で配置されたAb求核体との反応を可能にするように設計されている。最近、Lys20にホスホネート基を含有する単一のVIP-CALが様々なAbに共有結合することを示し、Ab結合部位構造の微細な違いがあるにもかかわらず、広範囲のAbの不活性化が実現可能であることが示された。同様に、FVIII(484〜508)-CAL、すなわち比較的小さなペプチドの誘導体は、ある程度の柔軟性、すなわち誘導された適切な結合機構および高い結合強度に都合の良い特性を備えるようである。ペプチジル-CALはまた、完全なタンパク質FVIII-CALに関連した潜在的な安定性の限界を克服している(FVIIIは300kDのタンパク質で、分離しやすい2個の非共有結合したサブユニットから構成される)。CALの合成方法は、以前の研究に記載されており(5〜7)、望ましくない反応を回避するために保護基を使用して、従来のリンカー化学合成および固相ペプチド合成を使用したホスホネート結合を必要とする。ビオチンは、共有結合による複合体の測定を可能にするためにCALに組み込まれる。
分泌型Abの反応性。
血友病患者のFVIIIに対する良く特徴付けられたポリクローナルAbおよび実験的な免疫によって生じたモノクローナルAbを使用する。該Abを2種類のFVIII-CALおよび対照の無関係なCAL(例えば、gp120-CAL)または共有結合的反応性のない対照FVIIIで処理し、遊離で、可逆的に結合したリガンド(CALおよびFVIII)は、希釈してプロテインGカラムに固定化したAb複合体で何度も洗浄することによって除去する。未処理のAbと共に、これらの調製物を以下について分析する。
(i) 以前のように変性電気泳動測定法による共有結合Ab-CAL複合体の形成。該反応の動力学的変数を測定する(最初の非共有結合複合体化のKd、k3、共有結合段階の一次反応速度定数)(16)。
(ii) 機能効果、すなわち、aPPT試験による凝固の延長(活性化部分トロンボプラスチン時間)、第IX因子活性化の測定(FVIIIはこの段階に欠かせない補因子である、Chromogenix assay)、抗FVIII Abのベセスダ力価、および
(iii) ELISAプレートにコーティングしたFVIIIの結合。AbとCALとの不可逆的な複合体化は、凝固パラメータを生理学的濃度に回復することが予測される。ELISA実験を実施して、Ab-CAL複合体がもはやFVIIIと反応しないことを確認する。血液における効果を測定するために、CALはAb陽性の後天性血友病患者の分画していない血液と混合して、血液の凝固パラメータが生理学的濃度まで回復することを測定する。
B リンパ球の反応性。
最初の研究は、FVIIIで免疫したマウスの脾臓から得られたBリンパ球をFVIII-CAL、対照FVIIIおよび無関係なCALで時間の長さを変えて処理することから構成される。細胞によるこれらの試薬の結合は、フローサイトメトリーによって測定し、結合の共有的特性は、該細胞の界面活性剤抽出物の変性電気泳動によって測定する。FVIII-CAL結合の特異性は、ホスホネート基のないFVIIIを使用した競合阻害によって確認する。アポトーシスは、TUNELフローサイトメトリー測定法を使用して測定し、この現象を診断するDNAフラグメント化パターンを調べることによって確かな証拠が得られる。CALに曝露した後、特異的Ab形成細胞の数は、様々なIg型に対する特異的Abを使用したフローサイトメトリーによって測定する。
耐性の誘導は、以下のデータ、抗FVIII産生B細胞に対する特異的な共有結合CAL、細胞死の誘導、Ab産生細胞の数の減少を示すことによって示される。
参考文献
Figure 0005503837
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CALを使用したNuRSの同定
この実施例では、ハプテンCALおよびLaCALによって標的化するために適したNuRの発見方法を説明する。
商用材料から得られた9種類の精製タンパク質は、ハプテンCAL Iに不可逆的に結合する能力をベースにした求核反応性についてスクリーニングした(図23)。9種類のタンパク質のうち7種類は、煮沸およびSDS処理による分離に耐性のハプテンCAL I結合を示した。該反応の実施およびアダクトの定量のために使用した方法は、本質的に実施例1の通りである。SDSゲル電気泳動によって見いだされたハプテンCAL Iタンパク質アダクトバンドの質量は、該アダクトの予測質量に対応した[gp120約120kD、ヒト血清アルブミン約67kD、可溶性上皮増殖因子レセプター(sEGFR、残基1〜621)約85kD、オボアルブミン約44kD、可溶性CD4(2個のドメイン、残基1〜183)約26kD、カルモジュリン約19kD、カゼイン約22kD]。我々の知る限りでは、図23に示した7個のハプテンCAL I結合タンパク質はいずれも、酵素活性を示すことが知られていない。反応は全て、同等タンパク質/ハプテンCAL Iモル比で実施した。単位タンパク質当たりのハプテンCAL I結合活性は、4段階の大きさにわたって変化した。2種類のタンパク質、アルブミンおよびsEGFRは、ハプテンCAL II、P1位に正に荷電したアミジノ基のない化合物とアダクトを形成した。
これらの所見によって、非酵素タンパク質の求核反応性の広範な分布が示唆される。様々なタンパク質の可変性および反応性に基づいて、個々のタンパク質の分子特性に応じてタンパク質の求核性は多形特性であることが結論づけられる。
ハプテンCAL Iにおける求電子性リン原子の近くに正電荷が存在することは、タンパク質の求核性の検出に好都合である。したがって、求核体に加えて、図23で分析したタンパク質は、P1位の正電荷を認識することができる認識部位 を含有すると思われる。
gp120のハプテンCAL I結合特性をさらに調べた。gp120-ハプテンCAL Iアダクトの形成は時間依存的であった(図24A)。示された曲線は、最小二乗法による一次反応速度式[B/Bmax=1-e-kobs・t、B、観察されたバンドの強度(AAU)、Bmax、Bの外挿最大値(AAU)、kobs、擬一次反応速度定数、t、インキュベーション時間]である(r2=0.98)。
反応溶媒のpHが増加するとアダクトが増加することは明らかで、pH7.5とpH9.0との間に鋭い屈折がある(図24B)。各pHでのkobs値は、図24Aで説明したように得られた。求核性反応部位の見かけのpKaは、最小二乗法による以下の式、kobs=kobs(max)/(1+10pKa-pH)(式中、kobs(max)はkobsの外挿最大値を表す)によって(r2、>0.99)、7.31±0.08として計算された。gp120の求核部位の中性付近のpKa値は、セリンプロテアーゼに見いだされる酵素部位と同様である。
動力学的変数は、図24Cに示したように様々なハプテンCAL I濃度で反応を実施することによって推論された。各ハプテンCAL I濃度でのkobs値は、前記のように最小二乗法による進行曲線(r2、0.93〜0.99)から推論された。非共有結合1-gp120複合体の解離定数(Kd)および非共有結合複合体からの共有結合アダクト形成の1次反応速度定数(k2)は、kobs対[1]のプロット(r2、0.96) 最小二乗法による式、kobs=k2・[1]/(Kd+[1])から算出した。値は以下の通りである。Kd、0.71±0.50mM、k2、0.015±0.007min-1。
熱変性研究によって、タンパク質構造に対する求核反応性の依存性を示す興味深い結果が得られた。予測通り、トリプシンのハプテンCAL I結合活性は、このタンパク質を65℃で予備加熱することによってほとんど完全に失われた(図25)。このことは、トリプシンの酵素活性が60℃で不可逆的に失活することと一致する。しかし、温度を80℃まで上げると、ハプテンCAL Iアダクト形成の増加が再び誘導された。モノクローナルIgG c23.5を使用した結果はさらに劇的であった。IgGを80℃の温度まで加熱した後、この抗体の重鎖および軽鎖は、37℃での基準値を上回るハプテンCAL Iアダクト形成の増加を示した。該温度をさらに100℃まで上げると、求核反応性の消失が引き起こされた。抗原結合および生物物理学的分析に関する以前の研究によって、抗体は、求核反応性の増加をもたらすことが示された温度で構造に不可逆的な変化を受けることが示された。
これらの観察によって、非生理学的な構造をとったときでも求核部位がタンパク質中に形成され得ることが示唆される。この認識によって、これらの部位がタンパク質中に広く分布し、それらが存在するからといってタンパク質分解活性またはその他の触媒活性の存在を意味するわけではないという前提が支持される。実施例1で記載したように、タンパク質分解における触媒サイクルの完成には、共有結合アシルタンパク質複合体の加水分解が必要である。求核反応性がまた、複合体に対する水攻撃を支持することができないならば、触媒も生じない。
次に、カルモジュリンとVIP-CALとの求核反応性に対する非共有結合相互作用の促進効果を研究しようと試みた。カルモジュリンは、高い親和力で非共有結合的手段によってCAL基を持たないVIPに結合することが知られている(2)。VIP-CALの調製および特徴付けは、実施例II、図13で説明する。図23で示したように、カルモジュリンは低レベルの求核反応性しか示さない。それにもかかわらず、カルモジュリンはVIP-CALとのアダクトを迅速に形成した(図26B)。カルモジュリンとVIP-CALとの反応速度は、後者の試薬が50倍高い濃度で有効であるとしても、ハプテンCALより実質的に速い。カルモジュリンとVIP-CALおよびハプテンCALとの反応の二次反応速度定数はそれぞれ、567±77M-1min-1および0.212±0.017M-1min-1であった。反応混合物にCAL基を持たないVIPを含めると、VIP-CALとのカルモジュリンアダクトの形成の減少が引き起こされ、該反応の特異性が示された。
これらの観察から、(a)ほとんどのタンパク質がNuRsと称する資格があり、かつ(b) NuRsに非共有結合するリガンドのCAL誘導体によって、NuRsは特異的に共有結合的に不活性化されるために標的とされ得る。
参考文献
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gp120の不可逆的sCD4-CAL阻害
抗レトロウイルス治療の進歩にもかかわらず、HIV-1感染患者の多くは検出不可能なウイルス負荷を克服することができない。ほとんどの治療の失敗および抵抗の原因である耐性変異は既に、最新世代のペプチドをベースとした融合阻害剤に認められた[1]。逃れられる見込みが少ないHIVの治療の新しい試みが必要とされている。親和性の高い宿主細胞CD4レセプターに対するgp120結合がHIV感染を開始する。研究に適した種では早期の結果が見込まれたにもかかわらず、可溶性CD4治療では今まで一次単離物を中和することはできなかった(2、3)。これは、利用できるgp120部位全てをsCD4で飽和することができないことによると思われた(4)。この実施例では、gp120に対するsCD4模倣物の共有結合が従来のCD4に見られる化学量論的問題を補うHIV不活性化の新しい試みの概略を述べる。
NuRとしてHIV gp120を同定する観点から(前記の実施例参照)、CD4のCAL誘導体を有するこのタンパク質を標的化した(図27)。1種または複数の求核-求電子対の相互作用がgp120-CD4複合体の安定化に必要とされることが前提である。この仮説が正しければ、gp120のCD4結合部位はホスホネートが共有結合する求核体を含有するであろう。
残基1〜173に対応するCD4の2種類のドメインの可溶性形態は、laCAL調製の開始物質として適している。ホスホン酸ジエステル基は、本質的に実施例1で説明したEGFRで説明したように、この分子のLys側鎖に配置された。ビオチンは、結合反応をモニターするためにペプチドのN末端またはLys側鎖に組み込まれる。
CD4から得られたある種の線状ペプチドは、モノマーgp120並びにウイルス表面上の天然のタンパク質に結合する。小ペプチドCDアナログの中でも、シラトキシン骨格にはめ込まれたある種のCD4接触残基を含有する模倣物は高い親和性でgp120に結合するようである(5)。このペプチドは、gp120の標的化に使用することができるペプチド-CAL誘導体の1例である(図27)。
次段階は、sCD4-CALの確認であった。これは、精製gp120がsCD4-CALと特異的な共有結合アダクトを形成する能力を測定することによって、前記実施例におけるように実施された(図28)。変性SDS電気泳動では、反応混合物中において予測したアダクトに対応する140kDアダクトの形成が示された。アルブミンはこれらの反応条件下で、sCD4-CALと検出可能なアダクトを形成しなかった。gp120のsCD4-CALアダクトの形成は、反応中にホスホン酸ジエステルのないsCD$を含めることによって阻害された(図28B)。無関係なタンパク質、ダイズトリプシン阻害剤はアダクト形成を阻害しなかった。これらのデータは、sCD4-CALとgp120との共有結合反応の特異性を示す。
CALの反応の他の特徴付けは、前実施例で説明したように実施することができる。簡単に説明すると、反応のKdおよびK3を測定する(Kdは非共有結合の強度の測定値であり、k3は求核反応性の強度である)。特異性は、無関係なCAL、例えば、VIP-CALおよび第VIII因子-CALの結合を測定することによって測定する。
gp120の不活性化は、sCD-CALおよびホスホン酸ジエステル基のない対照物がHIVを阻害する能力を測定することによって測定する。この目的のために、sCD4-CALまたは対照(非誘導体化ペプチド[20AGSF23]STおよび非誘導体化sCD4)の濃度を増加させて、HIV感染の中和のために分析する[6]。sCD4-CALを96ウェル測定用プレートで4連でHIV-1と共にインキュベートする。TCID50 100個/ウェルのウイルスを使用する。3x105 PHA-誘発ヒト末梢血単核細胞(PBMC)/ウェルを添加して、該プレートを72時間インキュベートした。該プレートを遠心して、該プレートを新鮮な培地で3回細胞洗浄した。24時間インキュベートした後、p24はBeck-manCoulter製のキットを使用して酵素免疫測定法によって定量した。データは、プリズムソフトウェアを使用して可変勾配(ヒル型関数)のS字型用量-応答曲線に重ね合わせた。中和の終点力価は、対照に対するp24発現の50%阻害から90%阻害がある補間力価として定義される。
クレードA、B、C、DおよびEから取り出したいくつかのHIV-1種について研究する。R5とX4の両方のケモカイン共レセプターを利用する種をこの研究に含める。対照sCD4による中和を超える程度でsCD4-CalによってHIVが中和されることによって、共有結合反応による能力の増加が示唆される。
sCD4-CALの共有結合反応性は、優れた遊離基、例えば、p-ニトロフェノールを使用することによってさらに最適化することができ、隣接する残基の特異性は、アミジノ基および様々なアミノ酸を他のアナログ/アミノ酸によって置換する経験的研究によって改善することができる。治療に欠かせない他の要素には、in vivoにおけるsCD4-CALの安定性および大量のHIVを収容できるリンパ器官に侵入する能力が含まれる。stailityの促進は、sCD4のカルボニルCALを使用することによって得ることができる可能性がある。CALの組織侵入能力は、ペプチドタグまたは様々な血液組織関門を迅速に輸送される他の分子への結合を使用して実現することができた。
参考文献
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共有結合gp120自己集合およびワクチン使用
この実施例では、生物学的に自己集合した共有結合模倣物をLaCAL技術を使用して調製する用途を例示する。弱い求電子体-求核体対が生物学的分子を必要とするホモ対合およびヘテロ対合反応に多大な寄与をすることが前提である。自己集合NuRの場合、1分子内の求核部位は、NuR複合体を順番に集合させる要因として他の分子の求電子部位と組み合わさることができる。したがって、人工的な求電子プローブをNuR内に配置すると、天然NuRが集合した構造に類似した、安定かつ正確に集合したNuR複合体を生成する能力が確保される。gp120モノマー間の共有結合相互反応は、天然のオリゴマーを模倣した安定なオリゴマーの形成に必要な求核体および求電子体の正確な組み合わせをもたらすので、該反応は順番通りに着々と進行することが期待される。
以前の研究によって、gp41非存在下で哺乳類細胞で発現するgp120は、ある種の実験条件下でオリゴマー種を形成することが示された[1]。優勢な形態はダイマーである。gp41とは独立したgp120組み立て過程には、V2ループが重要であることが発見された[1]。しかし、互いに対するgp120モノマーの親和性は、実験的研究で一般的に使用される濃度(ナノモル〜低マイクロモル)で安定な、非共有結合オリゴマーを形成するには低すぎる。gp41が存在すると、gp120のオリゴマー化がより迅速に検出される。
この前提は、天然の状態ではトリマー集合体としてウイルス粒子表面上に発現するHIVタンパク質gp120を使用して確かめる。実施例6および7で示したように、gp120は、NuRと称する基準を満たす。
1.gp120-CAL調製およびオリゴマー化
gp120-CALおよびビオチン化gp120-CALの調製は、最近の報告に記載した(2)。簡単に説明すると、gp120-CALは、組換えgp120およびアシル化剤Iから調製され(図29)、これは、ジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタン-ホスホネート[3]および市販のホモ二機能性架橋結合剤、ビス(スルホスクシニミジル)スベリン酸二ナトリウム塩から調製される。ビオチン化gp120-CAL(Bt-gp120-CAL)は、同様の方法でビオチン化gp120から調製され、これは組換えgp120および市販のビオチン化試薬、6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシ-3-スルホスクシニミジルエステルから調製した。導入されたビオチンおよび2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸[4]およびフルオレスカミン[5]を使用して消費されたアミンの定量によって、ビオチン/gp120およびホスホネート/gp120モル比は、それぞれ、0.6〜0.8および5〜27であることが明らかになった。ホスホネート含量の多様さは、反応の再現性のなさを示しているのではないことに注意されたい。オリゴマー化過程におけるそれらの役割を研究するために、様々なホスホネート含量のBt-gp-120-CALを得るよう試みた。gp120に関係のないタンパク質、上皮増殖因子レセプター(exEGFR)の細胞外ドメインは、オリゴマー化反応の対照として使用した。exEGFR-CALは、gp120-CALと同様の方法を使用して調製した。
変性ゲル電気泳動分析によって、gp120-CALの自己オリゴマー化が明らかになった(図30A)。該オリゴマーは、10分間煮沸しても安定であった。exEGFR-CALは、オリゴマー化種を示さず(図30B)、共有結合自己オリゴマー化は、gp120の特異的な特性であることが示された。オリゴマー化は、ホスホネート誘導体化の程度に左右されるようである。求電子基で誘導体化されなかったgp120は、教諭結合型オリゴマーを形成しなかった。したがって、起こり得る反応は、ホスホン酸ジエステル部分と活性化求核体を表すアミノ酸との間の共有結合である。実施例5で示したように、gp120はハプテンCALと迅速に反応し、自己オリゴマー化研究によって到達した結論と一致する。これらの結果から、gp120-CALの構造は、図31に示したように仮定される。
2.gp120-CALオリゴマーの利用性
Abの広範な中和を誘導することは、HIV-1ワクチンの開発に対する重要な挑戦であった[7〜10]。実験的なワクチン接種によってgp120単量体に対して誘発されたAbのほとんどは、1次単離物のHIV-1感染を中和することができなかった[11〜14]。これらの抗体は一般的に、免疫学的に優勢なgp120のV3ループに対して特異的で、これはまた、高率で変異を受ける領域であり、Abによって制御することができないウイルス変種の出現を可能にする。モノマーgp120のCD4-結合部位(CD4bs)を認識する多くのAbはまた、HIV-1を中和することができない。これは、モノマーgp120のCDbsおよびウイルス表面上に発現する天然のgp120トリマーとの構造の違いが原因であった。オリゴマーgp120に対するAb結合は、Abの中和活性を予測すると一般に考えられている[15〜17]。したがって、天然gp120と構造的に同じ免疫原は、予防ワクチン研究並びに受動的免疫治療研究の両方のために必要である。したがって、その後は、天然のトリマー型のHIVエンベロープ(env)糖タンパク質に類似したアナログを開発することに労力が払われた。
抗体を産生するための免疫原としてgp120-CAL調製物をよく使用した。詳細は、最近の報告(2)に記載されている。gp120-CAL調製物は、モノマー50%、ダイマー21%およびトリマー29%から構成される。品質管理基準として、ホスホネートを持たない対照モノマーgp120に対して生じた抗体Abとのgp120-CALの免疫反応を測定した。抗gp120抗体調製物は、固定化gp120と比較して固定化gp120-CALに3〜4倍低い結合を示した(例えば、血清希釈度1:1000では、固定化gp120-CALについてはA490 0.44±0.03で、固定化gp120については1.40±0.03であった)。非免疫Abによるgp120-CAL結合はごくわずかで、ハプテン基での無差別な共有結合は問題ではないことが示された。これらの結果は、gp120-CALのgp120抗原成分の保存性を示した。
gp120-CALで免疫したマウスでは強いポリクローナル抗体の反応がELISAによって観察された。gp120-CALに対して生じたAbは、ホスホン酸ジエステル基を持たない対照gp120よりも固定化gp120-CALといくらか高い濃度で結合した(図32)。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法を使用してgp120-CALで免疫したマウスから調製した。712個のハイブリドーマウェルの上清をgp120-CALに対する結合でスクリーニングした。固定したgp120-CALに抗体が結合した後、ELISAプレートを変性SDSで処理して、可逆的に結合した抗体を除去した。SDS処理によって、ホスホネート基を持たない対照gp120による抗gp120抗体を本質的に完全に除去することができた。対照的に、7種類の抗gp120-CALモノクローナル抗体は、SDS耐性gp120-CAL結合を示した(2)。これらの抗体の3種類は、電気泳動測定によって測定したところ、ビオチン化gp120の切断を触媒した(2)。
7種類の抗gp120-CALモノクローナルAbのうち3種類は、フィトヘマグルチニン(PHA)刺激末梢血単核細胞(PBMC)のHIV-1(クローンYZ-18、YZ-22およびYZ-23)の感染を中和した。中和の測定は、本質的に実施例7、図33および最近の報告で説明したように実施した(18)。図33は、クレードC(ZA009株、R5共通レセプター依存性)に属するHIV-1の1次単離物についての結果を示す。3種類の抗gp120-CALモノクローナル抗体によって中和される他の種は、BR004およびSF-162であった。これらのデータは、gp120-CALが抗体応答の中和を誘導する能力を示す。
実験的HIVワクチンのベースとして使用するとき、HIV-1 gp120モノマーでは、何度繰り返しても効果的に交差保護免疫応答を起こすことができなかった。一般的に、これらの抗体はHIV感染の交差クレード中和、特にCCR5ケモカイン共レセプターを利用するHIV種の中和を示さない。gp120-CALに対する抗体で観察された中和特性によって、この調製物は通常のgp120とは異なるエピトープ特異性を備えた抗体を誘導することが示された。免疫原におけるgp120-CALオリゴマーの存在は、異なるHIV種で発現するエピトープに対する抗体を誘導するときの適切な要素である。
3.ワクチン接種用に改良されたgp120-CALオリゴマー
以下の戦略は、オリゴマーgp120-CALワクチン候補を得るために有用である。
・ gp41の可溶性変種をgp120-CAL調製物に含めて、gp120オリゴマーの正確な集合を促進する。反応を最適化するために、様々なモル比のgp41変種/gp120-CAL混合物を分析する。
・ モノマーgp120-CALの構造を変化させて、正確な自己集合を促進する。求電子体にgp120を連結するリンカーは、オリゴマー形成速度および天然gp120オリゴマーの模倣程度に影響を及ぼす可能性がある。さらに、求電子体が導入されるgp120の部位が重要であり得る。したがって、鎖長(例えば、4-炭素および12炭素リンカー、現行では8炭素長)および反応化学的性質(Asp/Glu結合およびSer/Thr結合、現行ではLys結合)が異なるリンカーについて調べる。様々なアミノ酸側鎖の結合を可能にする官能基を有する4-炭素長および12-炭素長の二機能性リンカーは市販されている。ホスホネートによるこれらの誘導体化は、図29に示したアシル化剤で示したのと同様の方法で実施することができる。
Gp120オリゴマーは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって安定なオリゴマーとして精製される。gp120-CALの用途は、以前の我々の研究におけるようにマウスの免疫によって決定する(2)。ホスホネート基を持たないモノマーgp120は、対照免疫原として使用する。BALB/cマウスで生じたポリクローナルIgG試料は、固定化抗原として前記免疫原を使用したELISAおよびHIV-1の1次単離物の中和によって特徴付けられる。モノクローナルAbを調製して、ELISAによってスクリーニングして、中和活性を決定する。ポリクローナルIgGの研究は、所望する活性を備えたAb応答全体の割合の確認に役立つ。モノクローナルAb研究は、応答の不均一性の確認および個々のAbが広範な中和活性を有するかどうかの決定に必要である。最初のスクリーニングで、HIV中和活性が見込まれるモノクローナルAbは、天然env複合体への結合(HIV感染細胞を使用したフローサイトメトリーによって)および様々なクレードから取り出された様々な、R-5依存性HIV-1の1次単離物を中和する能力について特徴付けられる。
抗体産生方法およびHIV中和方法は、他のグループおよび我々の以前の報告に詳細に記載されている(2、18)。フローサイトメトリーは、以下のように実施する。PHAで刺激したヒトPBMCに前述のようにHIV-1を感染させる。PBMCのいくつかのクレードは他のクレードよりも速く複製するので、予備実験では細胞はHIVIG(AIDS Research and Reference Reagent Program)を使用したフローサイトメトリーによってウイルス抗原の発現をモニターする。5x105 HIV感染PBMCおよび非感染PBMC、PHA活性化PBMCをモノクローナルAbと氷上で45分間インキュベートし、次にPBSで2回洗浄する。次に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)と結合させたヤギ抗マウスIgGを添加し、氷上でさらに45分間インキュベートして、次にPBSで2回洗浄する。染色した細胞を0.1%ホルマリンのPBS溶液で固定し、フローサイトメトリーで分析するまで4℃で暗所で保存する。対照には、無関係な、アイソタイプの一致した抗体を含める。
gp120-CAL免疫原が広範囲な中和抗体の形成を誘導することが確立されたら、NIHによって提案させたHIVワクチン開発の指針並びに完了した、および進行中のHIVワクチン候補臨床治験における知見にしたがって、さらなるワクチン開発を実施する。
多くの研究室は、天然トリマー型HIV env糖タンパク質を候補ワクチンとして形成しようと試みてきた。しかし、これらの試みは、複合体の不安定さによって失敗に終わった。gp120間相互反応およびgp120-gp41相互反応はいずれも不安定である[19、20]。したがって、安定性の高いenv模倣物、例えば、gp120配列とgp41配列との間に位置するタンパク質分解部位が除去され、他のペプチド配列に置換されたgp140構築物の操作に焦点は移った[21〜24]。ジスルフィド結合は、gp120とgp41との関連を安定化させるもう一つの手段として使用した。通常、gp41の膜貫通領域および細胞質領域はまた、可溶性タンパク質として効率的に分泌させるために切断される。本明細書で提案した共有結合gp120-CALオリゴマーは、防御的抗ウイルス応答を誘導するための有望な免疫原としての可能性を保持している。ワクチンに適用するために、該オリゴマーでB細胞を持続的に繰り返し刺激することが望ましい。非共有結合オリゴマーは、該タンパク質がモノマー自己会合するKdより実質的に過剰な濃度で維持されるのでなければ、この目的を実現する能力が限られている。一方、共有結合で安定化したオリゴマーは、タンパク質濃度にかかわらず会合したままで、in vivoにおける優れた抗オリゴマー応答を可能にするとの仮説が立てられる。この共有結合による戦略は、gp120はNuRであるという最近の我々の発見から得られた。ジカルボキシレートジスクシニミジエステルなどの通常使用される架橋結合剤とは異なり、本明細書で提案したホスホン酸ジフェニルエステルは、弱い求電子体である。この試薬は、一般的な塩基(Hisのイミダゾール基など)の力を借りて活性化した求核性官能基(Serの水酸基など)と共に特異的に共有結合を形成する。したがって、本明細書で提案した方法による架橋結合は領域選択的で、すなわち、ホスホネート基が活性化された求核体の側にちょうど並んだ場合のみ、架橋結合を生じさせる。
参考文献
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なお、図面において、図7〜12は実施例1に関係した図、図13〜16は実施例2に関係した図、図17〜21は実施例3に関係した図、図22〜26は実施例4に関係した図、図27〜28は実施例6に関係した図、図29〜33は実施例7に関係した図である。
パネルA及びBはそれぞれ、セリンプロテアーゼ様Abと抗原およびホスホン酸ジエステル含有抗原アナログとの反応を示す図である。パネルCは、CAL構造を示す図である。パネルAにおいて、Nuは求核体を示し、Ag'およびAg"は、Abとの非共有結合的接触が生じる抗原エピトープの成分であり、Ag'-Lys-OHはN末端抗原フラグメントであり、NH2-Ag"はC末端抗原フラグメントである。活性部位の求核体は、抗原(基質)内の切断可能な結合のカルボニル炭素を攻撃して、四面体をした遷移状態の複合体を形成する。C末端抗原フラグメントは遊離して、アシル-Ab複合体が形成される。アシル-Ab複合体の加水分解によって、N末端抗原フラグメントの遊離が引き起こされ、触媒Abが再生する。触媒速度定数kcatは、k3'+k3"の和である。パネルBにおいて、Ab求核体は(カルボニル基の代わりに)求電子ホスホン酸ジエステルを攻撃し、ホスホン酸エステル含有抗原(CAL)は、基底状態および遷移状態のAb-Ag複合体において残存する相互作用(ペプチドエピトープでの非共有結合)を繰り返すが、アシル-Ab中間体とは違ってホスホニル-Abアダクトは安定な生成物である。パネルCにおいて、Iはトリプシン様酵素の活性部位特異的阻害剤である。IIは側鎖アミジノ基を持たないI誘導体で、IIIは弱い脱離基を含有するI誘導体である。IVおよびVはそれぞれ、exEGFRおよびgp120の421〜432残基に特異的なAb内の求核体の検出を可能にするために意図されている。ビオチンおよびホスホン酸ジエステル基は、IVのLys側鎖に組み込まれた。Vaは、N末端にビオチン、C末端にホスホン酸ジエステルを含有する。 求核レセプター(NuR)とリガンドの大きな共有結合アナログ(LaCAL)との間の相互作用の概略図である。LaCALの単位構造は、一般式L〜Eによって表すことができ、式中、Lは親リガンド分子のレセプター結合決定基を、EはレセプターNuRの求核基Nuと完全なまたは部分的な共有結合を形成することができる求電子基を含有する化学的単位変化を表す。Lは、レセプター(NuR)によって認識される直線状または断続的な領域[L1…Lx…Lm]から構成される。[L1…Lx…Lm]をつなぐ点線は、レセプター結合決定基として作用しないリガンド領域の短い、または長い範囲を表す。Eとリガンドとの結合は、直接またはアダプター官能基を介して実現することができ、したがってアダプター官能基は本明細書で示した一般式LaCALのEの成分であると考えられる。Lxは、Eが結合したリガンドの官能基に相当する。Lxの一般的な例は、-NH2、-COOH、-SHおよび-OH基である。大分子リガンドは1種または複数のレセプター結合決定基を発現することができ、LaCALは[L1…Lx…Lm]およびEから構成される各反応単位の1団または複数を含有することができる。レセプターのNuとLaCALのEとの間の共有結合は、Lによって媒介される古典的なレセプター-リガンド相互作用と相まって生じる。 セリンプロテアーゼAbの反応機構を示す図である。左図。レセプター(NuR)の求核基(Nu)は非共有的にリガンド基底状態(ΔGリガンド)を安定化する。活性化したSer残基などの求核体はペプチド結合を攻撃して、不安定な共鳴遷移状態(TS1)を形成する。この反応が完了すると共有結合アシル-Ab中間体が形成され、C末端ペプチドフラグメントが遊離する。第2の反応では、水分子が第2の四面体遷移状態(TS2)を介して共有結合中間体を加水分解する。右図。この反応は、部分的な共有結合を含有する共鳴リガンド-NuR複合体(前記のTS1)はリガンド-NuR複合体の基底状態よりも安定であること以外は前述のように進行する。ΔG* uncatは非触媒反応、ΔG* catは触媒反応の活性化エネルギーに対応する。Kmは基底状態安定化(ΔGs)の程度の関数である。Kcat/Kmは、触媒-基質基底状態複合体に対する遷移状態安定化の程度の関数である。 LaCALの一般的表示。これらの化合物は、求電子基と関連するレセプターに結合する1種または複数の決定基から構成される。該レセプター結合決定要素は、連続した、または不連続なリガンド成分[L1…Lx…Lm]から構成される。L'は、求電子体を含有するY-Y'-Y"単位が結合するリガンド成分Lxの官能基である。Yは、抗体の求核基(Nu)と完全なまたは部分的な共有結合を形成することができる求電子原子または基である。Y'は任意選択のP1サブサイトで、Y"は任意選択のアダプター官能基である。Y'は、原子、結合またはYおよびL'もしくはY"を連結する化学基で、Yの求電子性から独立したLaCALの反応性を制御する他の効果をもたらすことができる。Y"は、原子、結合またはY'とLx'を連結する化学基で、Yとレセプター結合決定基との間の距離およびこれらの基の空間的位置を制御することができる。例1:Yは、ホスホン酸モノフェニルエステル基で、Ab Nuと共有結合を形成する。Y'は、アミド結合(Y")を介してYとAsp(Lx)のβ-カルボキシル基(L')とを連結するエチルアミン基で、抗体とNu近傍の小さな疎水性ポケットとの共有結合を促進することができるメチル側部を提供する。例2:Yは、ホスホン酸ジフェニルエステル基で、Ab Nuと共有結合を形成する。Y'は、Yおよびスベリン酸基(Y")を連結する(4-アミジノフェニル)メチルアミン基である。Y'の4-アミジノフェニル側部は、レセプターとNu近傍の負に荷電したポケットとの共有結合を促進することができる。Y"の他の官能基は、Lys(Lx)のε-アミノ基(L')に連結される。例3:Yは、ボロン酸基で、Nuと共有結合を形成する。Y'は、Yとγ-マレイミド酪酸基(Y")とを連結する1-アミノ-4-グアニジノブチルアミン基である。Y'の該グアニジノプロピル側部は、レセプターとNu近傍の負に荷電したポケットとの共有結合を促進することができる。Y"のマレイミド基は、Cys(Lx)のスルフヒドリル基(L')に連結される。 (A)Yの変種を示す図である。求電子基Yは、Nuと共有結合を形成する電子不足原子(Z)およびZに結合した1個(例2)または複数(例1)の置換基(-R1および-R2)から構成される。R1およびR2は、ZとNuとの間の共有結合を可能にする任意の原子または基とすることができる。R1およびR2の一般的な例には、アルキル基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、水素および水酸基が含まれる。R1およびR2は、同一の、または異なる置換基の対とすることができる。(B)Yの共有結合反応性を高めるR1およびR2の例を示す図である。R1およびR2の電子特性は、Yの求電子反応性を制御することである。Yの共有結合反応性を高めるR1およびR2の例を示す。(C)Yの共有結合反応性を低下させるR1およびR2の例を示す図である。(D)ペプチド伸長を有するR1およびR2の例を示す図である。 (B)Yの共有結合反応性を高めるR1およびR2の例を示す図である。R1およびR2の電子特性は、Yの求電子反応性を制御することである。Yの共有結合反応性を高めるR1およびR2の例を示す。 (C)Yの共有結合反応性を低下させるR1およびR2の例を示す図である。 (D)ペプチド伸長を有するR1およびR2の例を示す図である。 R1にペプチド伸長を有するLaCAL例を示す図である。Xは、HIV-1 gp120の残基426〜431から構成される。Gly431(X')のカルボキシル基は、アミド結合(Y")および(4-アミジノフェニル)メチルアミン基(Y')を介してホスホン酸ジエステル基Yに連結する。Yサブユニットは、2個の置換基(R1およびR2)を備えた反応性リン酸原子(Z)から構成される。本明細書で示したR1基は、図3Dの44の1例であり、R3はエチル基で、VはジペプチドMet-Tyrである。 IgGおよびトリプシンによるハプテンCAL結合を示す図である。A、Iとヒト(#1518)およびマウス(BALB/c)血清IgG(1μM)とのアダクトを示したSDS-ポリアクリルアミドゲルの代表的なストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。ゲルを長期間(4時間)曝露することによって、IgGとIIの弱い反応が認められたが、IIIとは全く反応しないことがはっきり示された。ハプテンCAL、10μM、60分。B、3連で測定したIgG-Iとトリプシン-I結合の経時変化を示す図である。Y軸の値は、恣意的な面積単位（arbitrary area unit(AAU)）で表した150kD(IgG)または23kD(トリプシン)アダクトバンドの強度である。ハプテンCAL、1、100μM。挿入図、ビオチン含有アダクトを示したSDS-ポリアクリルアミドゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である(上部、IgG、下部、トリプシン)。 ヒトIgG(#1518)およびトリプシンの触媒性およびハプテンCAL I結合特性を示す図である。A、Pro-Phe-Arg-MCA(200μM、IgG 500nM、トリプシン 0.1nM)の切断の経時変化。B、Glu-Ala-Arg-MCA(200μM、IgG 500nM、トリプシン 0.1nM)の切断の経時変化。C、IgG(375nM)およびトリプシン(1nM)によるペプチド-MCA(Glu-Ala-Arg-MCA、Pro-Phe-Arg-MCAおよびIle-Glu-Gly-Arg-MCA、各67μMの混合物)の切断のDFP(5mM)およびCAL I(0.1μM)による阻害、それぞれ21時間および1.5時間。D、DFP(5mM)および10分間のタンパク質予備加熱によるI(10μM)のアダクト形成阻害を示したSDS-ポリアクリルアミドゲルの代表的なストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。IgG、1μM、トリプシン、1μM。1時間反応。Iとインキュベートする前にDFPで30分処理する。A〜Cの値は、3回反復の平均±s.d.である。 単鎖FvのハプテンCAL I(A、B)との反応性およびタンパク質分解との相関(B)を示す図である。A、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(レーン2)、抗c-myc抗体(レーン3)および銀(レーン4)で染色したハプテンCAL IとのFv(クローンMMF-4)アダクトを示す還元SDS電気泳動ゲルを示す図である。レーン1、ゲルの較正のために使用した標準タンパク質。レーン2における反応では、Fv(0.45μM)をハプテンCAL I(200μM、60分反応)で処理した。レーン2において微量のc-mycを含有するバンドは、His6 tagを含有するので、ニッケルカラムで完全長Fvと共に精製された分解産物である。B、Glu-Ala-Arg-MCAの切断(y軸、200μM、反応時間17時間)および8個のクローン(MM18、20、24、F4、F5、F6、F11、F14)から精製したFvによるCAL I(200μM、60分)の結合の値を示す。相関は、直線回帰によって評価した。点線、95%信頼限界。FU、蛍光単位。183 FU、1μM アミノメチルクマリン。 従来のELISA法によって測定した、ホスホン酸ジエステルを含有するタンパク質CAL IVおよびペプチドCAL Vによる抗体結合を示す図である。A、exEGFRに対する抗血清(黒四角)および対照非免疫血清(白抜き四角)による固定化IVの結合を比較した図である。(黒丸)は、抗exEGFR抗血清による固定化exEGFRの結合を示す。B、gp120(421〜436)-KLH複合体に対する抗血清(黒四角)および対照非免疫血清(白抜き四角)による固定化Vaの結合を比較した図である。(黒丸)は、抗gp120(421〜436)抗血清による固定化gp120(421〜436)-BSA複合体の結合を示す。対照非免疫血清では固定化exEGFRにもgp120(421〜436)-BSA複合体にも結合しないことが明白であった(図示せず)。吸光度(490nm)±s.d.を示す。 EGFRに対するポリクローナルAbおよびモノクローナルAbによるexEGFRタンパク質CAL IVの特異的な不可逆結合を示す図である。A、IV(0.2μM)を抗EGFRポリクローナルIgG(0.7μM)で、時間を徐々に長くして(レーン1〜8はそれぞれ、0.05、1、2、3、4、6および8時間)処理することによって形成された250kDアダクトを示したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。レーン9は、対照非免疫IgG(0.7μM)と共に8時間インキュベートしたIV(0.2μM)の反応混合物である。B、パネルAの250kDバンドの強度(arbitrary area unit)。C、時間の関数として、EGFRに対するモノクローナルAb(0.5μM、クローンC225、H11、111.6)とのIV(0.2μM)の250kDビオチン含有アダクトの蓄積を示す図である。同様に対照モノクローナルAb(BGN/H8)で処理してもアダクトは形成されなかった。D、IV(0.2μM)をexEGFRに対するポリクローナルIgG(0.5μM)で、exEGFRの非存在下(レーン1)および存在下(1μM、レーン2)またはカルモジュリンの存在下(1μM、レーン3)で2時間処理することによって形成されたビオチン含有250kDアダクトを示す図である。対照反応では、IV(0.2μM)を非免疫IgG(0.5μM、レーン4)およびexEGFRに対する煮沸済ポリクローナルIgG(100℃で10分、0.5μM、レーン5)で2時間処理した。exEGFRの非存在下でモノクローナルIgG c225(0.5μM)で2時間処理したIVa(0.2μM)をレーン6に示し、exEGFR(1μM)またはカルモジュリン(1μM)の存在下で処理したものはそれぞれレーン7およびレーン8に示した。Abは、IVまたはIVaを添加する前に競合タンパク質で30分処理した。 gp120(421〜436)に対するAbによるペプチジルCALの特異的な不可逆結合を示す図である。A、gp120(421〜436)に対するIgG(1μM)と共にインキュベートしたVa(10μM)のアダクト形成の経時変化を示す図である。挿入図、抗gp120(421〜436)IgG(上部)および同濃度の非免疫IgG(下部)で形成された非還元SDS電気泳動ゲルにおけるストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色152kDアダクトを示す図である。B、競合タンパク質の非存在下(レーン1)およびアルブミン(3μM)またはgp120(421〜436)-BSA(BSA相当3μM、ペプチド相当30μM)の存在下で、抗gp120(421〜436)IgG(1μM、1時間)で処理することによって形成されたVa(10μM)アダクトを示すストレプトアビジン-ペルオキシダーゼで染色した非還元SDS電気泳動ゲルを示す図である。 (A)ハプテンCAL1、VIP-CAL3および合成中間体2の構造を示す図である。(B)VIP-CAL 3合成の概略図である。パネルBの段階i〜viの試薬および条件。(i)9-フルオレニルメトキシカルボニル化学物質による固相ペプチド合成[脱保護、DMF中のピペリジン20%溶液(3分x2、20分x1)、カップリング、DMFに溶かしたN-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸(2.5当量)、PyBOP(2.5当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.5当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.5当量)(60分)]、(ii)DMF中のピペリジン20%溶液(3分x2、20分x1)、(iii)DMFに溶かしたD-ビオチン(2.5当量)、PyBOP(2.5当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.5当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.5当量)(60分)、(iv)CH2Cl2中のTFA1%溶液(5分x10)、(v) DMFに溶かした2(3当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン 0.1mM(一晩)、(vi)TFA-エタンジチオール-チオアニソール-フェノール(90:1:1:8、2時間)。いずれの段階も室温で実施。保護基:Boc、tert-ブトキシカルボニル、tBu、tert-ブチル、Pmc、2,2,5,7,8,-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル、Trt、トリチル、Mtt、4-メチルトリチル。 抗VIPモノクローナルIgG(クローンc23.5)による特異的なVIP-CAL共有結合を示す図である。パネルA:電気泳動および濃度測定によって測定したアダクトバンドをarbitrary area unit(AAU)で示したVIP-CAL 3またはハプテンCAL 1アダクトの蓄積を示す図である。反応条件:IgG 1μM、CAL 10 μM、37℃。データは、ほぼ一致した2連データの平均である。直線回帰によって進行曲線にあてはめた曲線の相関係数は、0.9以上であった。抗VIP L鎖について示したように、6箇所の時点で反応全てについて分析した。わかりやすくするために、抗VIP H鎖ならびに対照のAb H鎖およびL鎖(UPC10 IgG)について120分の最終データ点のみを示す。挿入図、c23.5軽鎖(29kD)および重鎖(58kD)の3-アダクトを示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。レーン1〜6は、図に示した反応点(10、20、40、60、90および120分)に対応する。パネルB:VIP-CAL 3の抗VIP軽鎖アダクト形成のVIP(10μM)による阻害を示した代表的なプロット図である。%阻害は、100-100(Vapp、+VIP)/(Vapp、-VIP)として測定し、式中、+VIPはVIPの存在を、-VIPはVIPが存在しないことを意味する。挿入図、VIPの存在下および非存在下で形成された軽鎖アダクトを示すストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色電気泳動の一部。1から6の見出しは、図に示された徐々に長くなる反応時間に対応する。パネルC:ヒト血漿の存在下での抗VIP AbへのCAL結合を示すSDS電気泳動ゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である(1%体積/体積、1時間、CAL、それぞれ10μM、外部から添加したAb、10μM)。使用した外来AbおよびCALは、抗-VIP c23.5 IgG+VIP-CAL3(レーン1)、対照UPC10 IgG+VIP-CAL 3(レーン2)、VIP-CAL 3単独(レーン3)、抗-VIP c23.5+ハプテン1(レーン4)、UPC10 IgG+ハプテン1(レーン5)、およびハプテン1単独(レーン6)である。レーン1〜6のビオチン含有バンドは、パネルAのように検出した。レーン7およびレーン8はそれぞれ、ヒト血漿(1%体積/体積)および分子量標準物の銀染色ブロットである。パネルD:抗VIP c23.5軽鎖へのVIP-CAL結合のDFPによる阻害を示した還元SDS-ポリアクリルアミドゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。抗VIP IgG c23.5(1μM)は、DFP(5mM)と共に、または伴わずに5分間インキュベートして、次にVIP-CAL 3(2μM)と60分間反応させた。 抗VIP軽鎖c23.5が触媒するPro-Phe-Arg-AMC加水分解のVIP-CAL 3による阻害を示す図である。パネルA:VIP-CAL 3(3μM)の非存在下(白丸)および存在下(黒丸)での軽鎖(0.8μM)によるPro-Phe-Arg-AMC(0.2mM)切断進行曲線を示す図である。曲線は、最小二乗法による式[AMC]=V・t(r20.99)(白丸)または[AMC]/[AMC]MAX=1-e-kobs・t(r20.89)(黒丸)であり、式中VはAMC遊離速度で、[AMC]maxはAMC遊離の外挿最大値で、kobsは測定された一次反応速度定数である。データは、3回の反復の平均±SDである。蛍光の値は、基準AMCを使用して作成された標準曲線と比較することによって、遊離AMCとして表された。触媒非存在下でのバックグラウンド蛍光は、0.05±0.03μM AMCに相当した。パネルB:VIP-CAL 3(黒丸)およびハプテンCAL 1(白丸)による軽鎖触媒Pro-Phe-Arg-AMC加水分解の阻害の比較を示す図である。曲線は、式、%阻害=100/(1+10logEC50-log[CAL])にあてはめ、式中EC50は50%阻害を生じる濃度である(r20.98)。様々なCAL濃度(1、3、10、30μM)を使用すること以外は、パネルAのような反応条件を使用した。%阻害は、100(V-V13)/Vとして計算され、式中、V13は13時間阻害した後の残存活性を表す(パネルAのように得られた最小二乗法による進行曲線のタンジェント)。値は、3回の反復の平均±SDである。CALが存在しない場合、反応速度は22nM AMC h-1であった。パネルC:抗体軽鎖(c23.5)のVIP-CAL3との反応の化学量論を示す図である。様々な濃度のVIP-CAL3の存在下(VIP-CAL濃度が0.03、0.1、0.3、1.0および3.0μMであり、反応時間が36時間であること以外はパネルBと同じ反応条件)での軽鎖の残存触媒活性(Pro-Phe-Arg-AMC加水分解)のプロットを示す。残存活性は、100Vi/Vとして測定し、式中、Vは阻害剤が無い場合の速度で、Viは競合阻害剤消費条件下での速度の計算値である。Vi値は、最小二乗法による式[AMC]=Vi・t+A(1-e-kobs・t)から得られ、式中、Aおよびkobsはそれぞれ、阻害剤の消費進行段階において計算されたAMC遊離および測定された一次反応速度定数を表す(個々の進行曲線のr2は>0.97である)。この式は、初期の1次相およびその後の0次相の反応に妥当である。プロットで示されたX切片は、[VIP-CAL 3]/[軽鎖]比<1におけるデータ点の最小二乗法から測定された。挿入図、Vi値を計算した進行曲線の例を示す図である。VIP-CAL 3、0.03μM。 ポリクローナル抗体が触媒するVIP切断のVIP-CAL 3およびハプテンCAL 1による阻害を示す図である。パネルA:ヒトIgG HS-2による[Tyr10-125I]-VIPの複数部位での切断を示した逆相HPLC図である。[Tyr10-125I]-VIPをHS-2 IgG(2μM)の存在下(黒丸)または非存在下(白丸)で16時間インキュベートし、HPLC[Nova-pak C18 3.9x150mm、TFAの0.1%水溶液:80%アセトニトリルに溶かしたTFA0.1%溶液、95:5で10分間、95:5から30:70で55分間、30:70から0:100で5分間、0:100で5分間(0.5ml/分)]を行った。HPLC画分(0.5ml)で回収された125I放射活性の値を示す。パネルB:HS-2 IgGが触媒する[Tyr10-125I]-VIP切断のVIP-CAL 3およびハプテンCAL 1による不可逆阻害を示す図である。VIP-CAL 3(黒丸)またはハプテンCAL 1(白丸)の非存在下または徐々に濃度を増加させて、IgG(2μM)を16時間予備インキュベートした。固定化プロテインGのクロマトグラフィーで未反応のCALを除去した後、IgGの残存触媒活性は基質として[Tyr10-125I]-VIPを使用して測定した。データは、平均±SDである。CAL非存在下でインキュベートした対照HS-2 IgGは、2791c.p.m. [Tyr10-125I]-VIPを切断した。 DNA-CAL1〜3を示す図である。プソラレンDNAのストランド間架橋結合アダクトのDNA-CALの概略図である。(A)における大きなDNA-CALは、DNAと4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン(AMT)とを光化学反応させ、その後予備活性化させたCAL誘導体(挿入図)を使用してAMTのアミノ基をアシル化することによって調製する。UV照射(365nm)によって、AMTは光化学的添加によって共有結合核酸アダクトを形成する。最初の反応は、DNA中のチミジンの5、6位の二重結合とプソラレンの4'、5'位または3、4位のいずれかの二重結合との間のシクロブタン環形成である。4'、5'位の二重結合(矢印a)での反応は、フラン側の1アダクトを生じ、さらに反対鎖の隣接するピリミジン(矢印b)を有する部位で反応して(A)および(B)で示したようなストランド間架橋結合を形成することができる。該CAL部分は、AMTのアミノ基(矢印c)に導入される。さらに改変するとDNA構造が崩壊するだろう。したがって、反応条件は、CAL/ヌクレオチドモル比がおよそ1:100であるCAL-DNAアダクトをもたらすように最適化する。組み込まれたプソラレンの量は、フルオレスカミンまたは類似試薬を使用して1級アミノ基を測定することによって調べる。組み込まれたCALは、同様の方法で消費された1級アミンを測定することによって調べる。略語:AMT、4'-アミノメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、T、3'-デオキシチミジン1リン酸。(B)は主鎖修飾オリゴDNA-CALを示す。DNAのリン酸ジエステル結合は、リン酸トリエステルまたはフルオロホスフェート部分に部分的に変更され、その求核体に対するその感受性はホスホン酸ジフェニルおよびフルオロリン酸ジイソプロピルと同等に保持されている。図中の矢印は潜在的脱離基を示す。(i)前駆体、H-ホスホネートDNAアナログは、H-ホスホネート法による従来の固相DNA合成における中間体である。(ii:リン酸トリエステル型)アンモニア水で塩基保護基および固相支持体を除去した後、制限された量の4-ニトロフェノールを使用して、主鎖H-ホスホン酸官能基を部分的に4-ニトロフェニルホスホネートに変換する。未反応のH-ホスホン酸基は、従来のDNA合成のようにヨウ素で酸化し、リン酸ジエステル結合を得る(元のDNA主鎖構造)。(iii)固相合成後、生成物は、通常のDNA合成のようにヨウ素で酸化し、アンモニア水で処理する。得られたオリゴ-DNAは、18-クラウン-6および塩化チオニルの存在下で、制限された量のKFで処理して、部分的にリン酸ジエステルからフルオロホスフェートに変換する。鎖の長さはほぼ塩基数である。主鎖のリン酸を置換すると、DNAの高次構造が相当崩壊する可能性がある。したがって、反応条件は、修飾/非修飾リン酸モル比がおよそ1:5であるオリゴDNA-CALをもたらすように最適化する。修飾/非修飾平均比は、水酸化ナトリウム水溶液で加水分解した後で4-ニトロフェノールを光学的測定し、元素分析でフッ素を定量することによって測定する。参考文献:プソラレン-DNAアダクト構造について：(1)Straub,K.; Kanne, D.; Hearst, J. 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Nucleic Acids Reseach 1986, 14, 5399〜5407。 VIP-CAL 1〜9を示す図である。 化合物I〜IV、フルオロリン酸ジイソプロピル(DFP)を示す図である。ハプテンCAL Iは、トリプシン様酵素の活性部位特異的阻害剤である。化合物IIは、共有結合反応性を持たないIの非エステル化ホスホン酸アナログである。IIIは側鎖アミジノ基を持たないI誘導体で、IVは弱い脱離基を含有するI誘導体である。これらの構造は、不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤DFPのアナログである。 ハプテンCAL Iの脾臓細胞との反応性を示す図である。A、ビオチン化ハプテンCAL I(灰色の線)および化合物II(黒線、いずれの化合物も100μM、4時間、ストレプトアビジン-FITC(50μg/ml)で染色したマウス脾細胞(未処理のBALB/cマウス)のフローサイトメトリーを示す図である。25000個の細胞を計数した。B、ハプテンCAL I標識細胞、ストレプトアビジン-FITC (1μg/ml)の抗CD19 Ab染色(灰色の線、フィコエリトリン複合体)を示す図である。(黒線)は、アイソタイプの一致した対照抗体のフィコエリトリン複合体による染色を示す。C〜F、CAL I(ストレプトアビジン-FITC、1μg/ml、パネルC)およびフィコエリトリン結合抗CD19 Ab(パネルD)で標識した2個のB細胞を示す逆重畳積分(5回反復)した取得蛍光を示す図である。Eは、FITCおよびフィコエリトリンプローブを併用して表したものである。Fは、30個の個々の部位から収集し、その後分割スクリーン抽出を行ったFITC発光パターンの3Dワイヤーフレームモデルである。青色の対比染色、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 B細胞抽出物におけるハプテンCAL I標識Igサブユニットの免疫化学的同定。A、ハプテンCAL I(100μM、4時間)で標識し、その後銀(レーン1)およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(レーン2)で染色したB細胞抽出物を示したSDSゲル電気泳動列である。マーカータンパク質の移動度を左に示した。B、μ(レーン3)、λ(レーン4)、κ(レーン5)およびγ(レーン6)鎖に対するAbで染色したハプテンCAL I標識B細胞抽出物のSDSゲルイムノブロットである。C、抗μ(レーン7)、抗κ/λ(レーン8)および抗γAb(レーン9)の固定化アフィニティークロマトグラフィーによって脾細胞抽出物から回収されたハプテンCAL I標識タンパク質を示すストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲルである。 第VIII因子-CALの構造を示した概略図である。求電子ホスホン酸ジエステルは、リジン側鎖に結合する。 非酵素タンパク質による不可逆的ハプテンCAL 1(黒塗りの棒グラフ)およびハプテンCAL 2(斜線棒グラフ)結合を示す図である。該タンパク質(1μM)を、CHAPS 1mMおよび5%DMFを含有する10mM PBS(pH 7.4)中でCAL(0.5mM)と37℃(16時間)でインキュベートし、SDSゲル電気泳動で泳動した。ハプテンCAL 1および2のタンパク質アダクトは、SDSゲルのストレプトアビジン-HRP染色ブロットの濃度測定によって測定した。バンドの強度は、参照として各ゲルに含めたビオチン化BSAを使用して補正した恣意的な面積単位(AAU)で表す。略語:TRY、トリプシン、SBTI、ダイズトリプシン阻害剤、BAL、ウシαラクトアルブミン、OVA、オボアルブミン、exEGFR、上皮増殖因子レセプターの細胞外ドメイン、HSA、ヒト血清アルブミン、CAM、カルモジュリン。 gp120による不可逆的ハプテンCAL1結合を示す図である。(A)不可逆的ハプテンCAL 1結合の経時変化を示す図である。gp120(MN株、1μM)を10mM リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中で1(0.5mM)と37℃で15、45、90、180および240分間インキュベートして、1-gp120アダクトのバンドを図23と同様の方法で検出した。示した曲線は、最小二乗法による一次反応速度式[B/Bmax=1-e-kobs・t、B、観察されたバンドの強度(AAU)、Bmax、B(AAU)の推定最大値、kobs、擬一次反応速度定数、t、インキュベーション時間]である(r2=0.98)。挿入図、15分(レーン1)、45分(レーン2)、90分(レーン3)、180分(レーン4)および240分(レーン5)インキュベートした後、1-gp120アダクトの蓄積を示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットの図である。(B)不可逆的1-gp120結合のkobsのpH依存性を示す図である。酢酸50mM-MES 50mM-Tris 50mM(pH、3.9、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)中で、1(0.1mM)と共に37℃で30、60、120、180、240および360分インキュベートしたgp120(1μM)をSDS電気泳動で泳動した。各pHのkobs値は、(A)で説明したように得られた。反応部位の見かけのpKaは、最小二乗法によって、以下の式、kobs=kobs(max)/(1+10pKa-pH)(式中、kobs(max)はkobsの外挿最大値を表す)から(r2>0.99)、7.31±0.08として計算された。(C)不可逆的な1-gp120結合の動力学的パラメータを示す図である。gp120による不可逆的な1の結合は、1の0.05、0.1、0.2、0.3および0.5mMを使用して、(A)と同様の方法で分析した。各1の濃度のkobs値は、(A)のように最小二乗法による進行曲線(r2、0.93〜0.99)から得られた。非共有結合1-gp120複合体の解離定数(Kd)および非共有結合複合体から得られた共有結合アダクト形成の1次反応速度定数(k3)は、kobs対[1]のプロット(r2、0.96)の最小二乗法による式、kobs=k2・[1]/(Kd+[1])から算出した。 様々な温度で予備加熱したトリシン(A)およびIgG c23.5による不可逆的なハプテンCAL 1の結合を示す図である。CHAPS 1mMを含有する10mM PBS(pH7.4)中でタンパク質(1μM)を37、50、65、80および100℃で30分間処理した。該溶液を氷浴で15分間、その後37℃で30分間維持した。予備加熱したタンパク質(1μM)は、5% DMFを含有する10mM PBS(pH7.4)中で1(0.5mM)と共に37℃で2時間インキュベートした。1-結合タンパク質を図23と同様の方法で測定した。データは、37℃で処理したタンパク質に対する1-タンパク質アダクトバンドの強度の%として表す。挿入図、1-タンパク質アダクト(各温度で独立して2回反応させる)を示したSDSのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。IgG反応混合物の電気泳動は還元条件下で実施したので、H鎖(上部パネル)およびL鎖(下部パネル)(各温度で独立して2回反応させる)の1-アダクトに分離した。 カルモジュリンとBt-VIP-CALとの不可逆的結合を示す図である。(A)Bt-VIP-CAL3の構造。(B)カルモジュリンによるハプテン1およびBt-VIP-CAL 3結合の反応速度。カルモジュリン(1μM)は、CHAPS 1mM、CaCl2 1mM、NaCl 150mM、5%DMSO(3用)またはDMF(1用)を含有する60mM HEPES(pH7.3)中で3(10μM)または1(0.5mM)と共に37℃で1、2、4、8、19時間インキュベートした。該反応混合物は、SDSゲルで電気泳動して、共有結合アダクトを図23で説明したのと同様の方法で測定した。Bは所与のインキュベーション時間でのバンド強度を表し、BmaxはBの外挿最大値を表す。示した曲線は、最小二乗法による擬一次反応速度式、B/Bmax=1-e-kobs・t(kobs、擬一次反応速度定数)である。カルモジュリン-3および-1の二次反応速度定数はそれぞれ、567±77M-1および0.212±0.017M-1min-1であった。挿入図、3-カルモジュリンアダクトの蓄積を示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。(C)VIPによる3-カルモジュリン結合の阻害。カルモジュリン(1μM)をVIP(100μM)の存在下および非存在下で、3(10μM)と共に37℃で10、20および30分インキュベートした。これらの条件下でのVIPによる%阻害は、VIP非存在下(Vapp -)および存在下(Vapp +)での見かけの初期結合速度から測定した。%阻害=100(1-Vapp+/Vapp-)=65%。 ペプチジルおよびタンパク質性CD4-CAL構造の概略図である。 sCD4-CALとgp120との不可逆的結合を示す図である。(A)gp120(レーン3、5μM)、ウシ血清アルブミン(レーン2、5μM)または希釈液(レーン1)と共に2時間インキュベートしたBt-sCD4-CAL(0.1μM)を示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットである。Bt-sCD4-CALは、ホスホン酸ジエステル5モルおよびビオチン1モル/sCD4(1〜183残基)1モルを含有する。140kDのビオチン化sCD4-CAL含有複合体は、共有結合gp120:CD4-CAL複合体の予測質量に位置する。21kDのバンドは、CD4-CALモノマーで、42kDのバンドは、開始物質に存在するCD4-CALダイマーの予測位置と一致する。(B)sCD4による140kD gp120:sCD4-CAL複合体形成の阻害。sCD4(レーン2、5μM)またはダイズトリプシン阻害剤(レーン3、5μM)の存在下、および競合剤の非存在下(レーン4)でgp120(5μM)と8時間インキュベートしたBt-sCD4-CAL(0.1μM)のSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す。レーン1は、gp120の非存在下でのsCD4(5μM)およびBt-sCD4-CAL(0.1μM)の対照インキュベーションを示す。 gp120-CAL調製に使用したアシル化剤を示す。 gp120-CALの共有結合3量体化。(A)タンパク質1モル当たり様々な数のホスホネート基を含有するBt-gp120-CALにおけるオリゴマー形成を示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットを示す図である。レーン1、ホスホネート4.4モル/gp120 1モル、レーン2、14.2モル/gp120 1モル、レーン3、23.4モル/gp120 1モル。Bt-gp120-CAL調製物は、中性pH緩衝液中で37℃で4時間インキュベートした。(B)Aのように処理したexEGFR-CALではオリゴマー化が生じないことを示したSDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットの図である。ホスホネート/exEGFR比は27.9モル/モルであった。 gp120-CALトリマー(A)およびそのサブユニット間結合(B)の可能な構造を示す図である。gp120-CAL分子のホスホン酸ジエステル部分は、他のgp120分子の求核部位と共有結合を形成する。gp120の求核部位のpKaが中性付近であることから(図24)、求核体としてSerまたはThrが関与する可能性が示唆される。 抗gp120-CALモノクローナルAbによるgp120-CALおよびgp120結合を示す図である。gp120-CAL(YZ系)で免疫することによって生じたモノクローナルAbを含有する組織培養上清によるgp120-CALおよびgp120結合を示すELISAの図である。モノクローナルAb CRL1689は、YZ21およびYZ23と同様のアイソタイプである無関係なモノクローナルIgGである。SDS耐性gp120-CAL結合は、gp120-CAL+SDSで標識された棒グラフおよび曲線によって示されている。 gp120-CALで免疫することによって生じたモノクローナルIgGによる濃度依存性HIV-1中和を示す図である。PBMCを一次HIV-1単離物ZA009で感染させた。電気泳動的に純粋なIgGを測定用に使用した。同等に精製された無関係な対照Abは、アイソタイプが一致したCRL1689である。IgG b12は、陽性対照として使用した(IC50は25μg/mlであった)。中和は、p24濃度を測定することによって決定した。値は、4回の反復の平均である。

Claims (24)

  1. 式(1) :
    Figure 0005503837
    ［式中、[L1 . . . Lx . . . Lm] は求核性レセプター（NuR）と非共有結合することができるリガンド決定基であり、
    L1、LxおよびLmは、連続した、または不連続な決定基構成アミノ酸残基であり、
    L'は共有結合によってY”−Y’−Yに連結されるLx の側鎖官能基であり、
    Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
    Y'は荷電した基または中性基であるか、または不在であり、
    Yは前記NuRと特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、かつ
    mは4から30の整数である］の決定基を含む、VIP、CD4、EGFR、gp120または第VIII因子より選択されるリガンドから調製された、共有結合反応性リガンドアナログ（CAL）。
  2. L'が以下のアミノ酸残基:アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、セリン、トレオニンまたはプロリンの側鎖官能基である、請求項１に記載のCAL。
  3. Y"がスベロイル基、ピメロイル基、スクシニル基、アミノヘキサノイル基、アミノアセチル基、ポリ(エチレンオキシド) α,ω-ジカルボキシル基またはアセチレンジカルボキシル基である、請求項１に記載のCAL。
  4. Y'がアミノ(4-アミジノフェニル)メチル基、2,6-ジアミノペンチル基、1-アミノ-4-グアニジノブチル基、1-アミノ-3-カルボキシプロピル基およびアミノ(4-カルボキシフェニル)メチル基から選択される荷電した基である、請求項１に記載のCAL。
  5. Y'が、アミノ(フェニル)メチル基、1-アミノ-2-フェニルエチル基、1-アミノ-2-メチルブチル基、アミノメチル基、2-アミノエチル基および1-アミノシクロヘキシル基から選択される中性基である、請求項１に記載のCAL。
  6. Yが1つまたは複数の置換基Rに結合した求電子性原子Zから構成される、請求項１に記載のCAL。
  7. 置換基Rが電子吸引基である、請求項６に記載のCAL。
  8. Rがフェノキシル基、4-ニトロフェノキシル基、4-シアノフェノキシル基、ペンタクロロフェノキシル基、4-ニトロフェニル基、4-シアノフェニル基、シアノメトキシル基、トリフルオロメトキシル基および4-ニトロフェニルメルカプチル基から選択される、請求項７に記載のCAL。
  9. Rが電子供与基である、請求項６に記載のCAL。
  10. Rが4-メトキシフェノキシル、4-メチルフェノキシル、メトキシメトキシル、4-メトキシフェニル、4-メチルフェニル、メトキシメチルおよび4-メトキシフェニルメルカプチルから選択される、請求項９に記載のCAL。
  11. Zがリン、炭素、ホウ素またはバナジウム原子である、請求項６に記載のCAL。
  12. Yが式(2) :
    Figure 0005503837
    ［式中、Zはリン原子で表され、
    R1は酸素または硫黄原子であり、
    R2 およびR3は水素原子、酸素原子、ヒドロキシル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、硫黄原子、スルフヒドリル基、アミノ基、アルコキシ基、およびフェノキシ基から選択される原子または基であり、かつ
    mは4から22である］を有する、請求項１１に記載のCAL。
  13. Rがグリオキシルペプチドまたはアミノアシルペプチドである、請求項６に記載のCAL。
  14. 式(1) :
    Figure 0005503837
    ［式中、[L1. . . Lx . . . Lm] は求核レセプター（NuR）と特異的に反応するリガンド決定基であり、
    L1、Lx およびLmは、連続した、または不連続な決定基構成アミノ酸残基であり、
    L'は共有結合によってY”−Y’−Yに連結されるLx の側鎖官能基であり、
    Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
    Y'は荷電した基または中性基であるか、または不在であり、
    Yは前記NuRと特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、かつ
    mは4から30の整数である］の決定基を含む、VIP、CD4、EGFR、gp120または第VIII因子より選択されるリガンドから調製された共有結合反応性リガンドアナログ（CAL）を含む、細胞表面に発現したNuRとの接触により、前記NuRの作動または拮抗によって細胞シグナル伝達系を活性化または不活性化するための組成物。
  15. 前記NuRとの前記CALの接触が細胞活性化または非活性化をもたらす、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記NuRとの共有結合が細胞の成長停止または細胞死を誘導する、共有結合によって細胞増殖抑制剤または細胞毒性物質が結合しているか、または前記細胞増殖抑制剤または細胞毒性物質が結合していない、請求項１４に記載の組成物。
  17. 前記細胞がリンパ球である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 共有結合により自己集合した、リガンドがgp120である請求項1記載のCALを調製するための方法であって、前記CALの自己集合体の形成を補助するために反応溶液中に含めたポリペプチド補因子gp41の存在下、または非存在下で、分子間非共有結合によるCAL分子の会合とそれに続く前記CAL分子間の分子間共有結合反応を促進するpH、温度およびイオン強度条件に前記CALを曝露することを含む方法。
  19. 前記自己集合CALに対する抗体を生成させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. リガンドがgp120である共有結合により自己集合した請求項1記載のCALを含む、それを必要とする生物に投与するためのワクチン組成物。
  21. 細胞表面にNuRを発現する細胞または組織を、請求項１に記載のCALの検出可能に標識された誘導体に曝露することおよび前記標識を検出することを含む、画像化する方法。
  22. 腫瘍組織、腫瘍細胞、感染組織または感染細胞を画像化する、請求項２１に記載の方法。
  23. 固定化した請求項１に記載のCALまたは検出可能に標識された請求項１に記載のCALを接触させることを含む、抗体または抗原の検出のためのイムノアッセイ。
  24. HIVを検出するための、請求項２３に記載のイムノアッセイ。
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