ES2212801T3 - Peptidos sinteticos y composiciones farmaceuticas que los contienen para el tratamiento del lupus eritematoso sistemico. - Google Patents

Peptidos sinteticos y composiciones farmaceuticas que los contienen para el tratamiento del lupus eritematoso sistemico.

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ES2212801T3 ES96911449T ES96911449T ES2212801T3 ES 2212801 T3 ES2212801 T3 ES 2212801T3 ES 96911449 T ES96911449 T ES 96911449T ES 96911449 T ES96911449 T ES 96911449T ES 2212801 T3 ES2212801 T3 ES 2212801T3
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Abstract

SE DESCUBREN PEPTIDOS SINTETICOS BASADOS EN LA REGION DETERMINANTE DE COMPLEMENTARIEDAD (CDR) DE LA CADENA PESADA O LIGERA DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-DNA PATOGENICO QUE INDUCE UNA ENFERMEDAD SIMILAR AL LUPUS ERITHEMATOSUS (SLE) EN RATONES, Y ANALOGOS, Y SALES Y DERIVADOS QUIMICOS DE LOS MISMOS; PEPTIDOS DUALES QUE COMPRENDEN DOS DE ESTOS PEPTIDOS O ANALOGOS UNIDOS COVALENTEMENTE UNO CON OTRO BIEN DIRECTAMENTE O BIEN A TRAVES DE UNA CORTA CADENA DE UNION; POLIMEROS PEPTIDICOS QUE COMPRENDEN UNA PLURALIDAD DE SECUENCIAS DE DICHO PEPTIDO O ANALOGO DEL MISMO; Y POLIMEROS PEPTIDICOS UNIDOS A UN VEHICULO MACROMOLECULAR, ASI COMO COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS COMPRENDEN PARA EL TRATAMIENTO DE LA SLE EN HUMANOS.

Description

Péptidos sintéticos y composiciones farmacéuticas que los contienen para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
Campo de la invención
La invención se refiere a péptidos sintéticos y a composiciones farmacéuticas que los comprenden para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico (SLE) en humanos.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por las respuestas inmunes dirigidas contra antígenos propios. Estas respuestas se mantienen por la persistente activación de linfocitos T autorreactivos. Los linfocitos T son activados específicamente por el reconocimiento de antígenos extraños y/o propios como un complejo con el producto del gen del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC).
El lupus eritematoso sistémico (SLE) es una enfermedad autoinmune de origen y cura desconocidos. A pesar de las extensas investigaciones sobre los mecanismos subyacentes a la inducción y el desarrollo del SLE, la información disponible sobre la etiología de la enfermedad es muy limitada debido a la heterogenicidad de pacientes con SLE por un lado, y la falta de un modelo experimental en el que la inducción de la enfermedad pudiera ser controlado, por otro lado.
La causa del SLE es desconocida y presenta manifestaciones clínicas heterogéneas. Además, no hay tratamiento específico disponible dirigido hacia la prevención o cura del SLE. A pesar de las extensas investigaciones sobre los mecanismos subyacentes a la inducción de SLE, la información sobre la etiología de la enfermedad es muy limitada. Hasta recientemente, los estudios sobre SLE se han realizado usando linfocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes en diferentes fases clínicas y bajo varios protocolos de tratamiento. Alternativamente, fueron investigadas unas cepas murinas que desarrollan espontáneamente una enfermedad semejante al SLE como modelo para el SLE. Esta clase de análisis condujo a interpretaciones incompletas y confusas de la función de varios factores inmunológicos y no inmunológicos en la inducción o mantenimiento de la enfermedad, debido, principalmente, a la heterogenicidad de los pacientes, por un lado, y a la incapacidad para controlar la fase de inducción de la enfermedad en las cepas murinas de SLE, por otro lado.
Hace varios años, se ha establecido un modelo animal de SLE en el laboratorio de uno de los presentes inventores. Este modelo, basado en el concepto de la red idiotípica, desarrolló un amplio espectro de autoanticuerpos relacionados con el lupus y manifestaciones clínicas (Mendlovic et al., 1988). La inducción se realizó mediante la inmunización de cepas de ratón que no desarrollan ningún trastorno autoinmune espontáneo, con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-ADN humano que porta un idiotipo común denominado 16/6 Id (Shoenfeld et al., 1983). Tras la inmunización, los ratones producían anticuerpos específicos contra el Id 16/6, anticuerpos que portan el Id 16/6, y anticuerpos dirigidos contra diferentes antígenos nucleares (ADNds, ADNss, Sm, ribonucleoproteína (RNP), Ro, La y otros). Los hallazgos serológicos se asociaron con leucopenia, velocidad de sedimentación de eritrocitos elevada, proteinuria, abundancia de complejos inmunes en los riñones y esclerosis de los glomérulos (Mendlovic et al., 1988), las cuales son manifestaciones clínicas del SLE. Los presentes inventores han demostrado además que la enfermedad experimental podía ser inducida por un mAb anti-Id 16/6 murino (Mendlovic et al., 1989) y por el mAb anti-anti-Id 16/16 (Id 16/6+) murino (Waisman et al., 1993). La inducción de la enfermedad está controlada genéticamente, y por eso es dependiente de la cepa (Mendlovic et al., 1990). El único modelo para la inducción de SLE experimental proporciona las herramientas para disecar claramente las diferentes etapas y parámetros inmunes ligados implicados en la inducción y desarrollo del SLE.
El SLE es una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por la formación de autoanticuerpos contra antígenos propios, tales como ADN, Sm, Ro, La, RNP, cardiolipina e histonas. Se desconoce la etiología del SLE y el entendimiento del mecanismo por el cual surgen estos autoanticuerpos debería proporcionar la capacidad de profundizar en este problema. Con este propósito, los presentes inventores han producido varios anticuerpos monoclonales a partir de ratones C3H.SW en los que se indujo SLE experimental. Como regla, se secuenciaron los anticuerpos monoclonales que unían ADN o extracto nuclear de HeLa (NE), aislado de ratones C3H.SW con SLE experimental (Waisman y Mozes, 1993). Se analizaron los anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades en un intento de determinar la conexión entre los diferentes autoanticuerpos. Se encontraron tres mAb que unían ADN y se demostró que exhibían características de secuencia de anticuerpos anti-ADN patogénicos. Uno de estos mAb, designado como 2C4C2, se demostró que usaba idénticos genes de la región V de la cadena pesada (H) (V_{H}) a la V_{H} del mAb anti-ADN aislado de otros ratones propensos al lupus, concretamente (NZB x NZW)F_{1}. Los genes de la región V de la cadena ligera (L) (V_{L}) del mAb 2C4C2 tiene un 98% de homología con la V_{L} de otro mAb anti-ADN, también aislado de ratones (NZB x NZW)F_{1}. Los otros dos mAb anti-ADN, designados como 5G12-4 y 5G12-6, comparten el 93% de sus secuencias V_{H} con la del mAb 2C4C2. Seis mAb unían proteínas de NE de HeLa. Los nueve mAb usan un total de cinco genes V_{H} y cuatro genes V_{L} de la línea germinal, demostrando que los anticuerpos inducidos en ratones con SLE experimental no se originan a partir de un clon de células B. Tres de los nueve V_{H} y V_{L} eran idénticos en secuencia a los genes de la línea germinal, mientras que al menos otros tres tenían mutaciones somáticas. Esto último sugiere que estos autoanticuerpos surgen en los ratones por el uso de células B existentes (pre-inmunes) y a través de un proceso dirigido por antígeno. Además, parece que los autoanticuerpos encontrados en ratones con SLE experimental usan elementos génicos similares a los usados por mAb que se aislaron de cepas de ratón que desarrollan espontáneamente lupus.
Las células T tienen una función importante en la inducción y desarrollo del SLE experimental. Así, se demostró que líneas celulares y clones T específicos del Id 16/6 inducen SLE experimental en receptores singénicos, de forma similar al anticuerpos 16/6. Por tanto, tras la inoculación de células activadas de las líneas, los ratones desarrollan la serología y el daño renal que es típico del SLE (Fricke et al., 1991). Además, una línea de células T específicas del Id 16/6 originada de C3H-SW inducía SLE en ratones C57BL/6 que se demostró que eran resistentes a la inducción de la enfermedad tras las inyecciones con Id 16/6 o con el mAb anti-Id 16/6 (Mendlovic et al., 1990).
En un intento de identificar la región patogénica del Id 16/6, se prepararon fragmentos (Fab')_{2} del mAb Id 16/6 y se encontró que retenían la especificidad y la capacidad patogénica de la molécula de Id 16/6 completa (Ruiz et al., 1994).
El mAb 5G12 que se aisló de ratones con SLE experimental y se demostró que unía ADN y portaba el Id16/6, es capaz de inducir SLE experimental en ratones (Waisman et al., 1993). Las células T que reaccionan específicamente al mAb proliferando, están reaccionando probablemente a péptidos que representan secuencias de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). Es muy probable que las células T reconozcan las regiones V de los anticuerpos anteriores puesto que no reaccionan con otros anticuerpos que llevan la misma región constante pero que tienen diferentes especificidades. En la región variable, las regiones reconocidas con la más alta probabilidad son las CDR, puesto que esas son las regiones que más se diferencian entre los distintos anticuerpos. Las regiones CDR de las secuencias V_{H} de los nueve mAb murinos patogénicos mencionados anteriormente que inducen en ratones SLE, se adjuntan en la figura 1 de Waisman y Mozes, 1993, en la que se presentan las secuencias completas de nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos de las V_{H} de los nueve mAb.
Resumen de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para el tratamiento específico de pacientes con SLE.
Con este propósito, la invención proporciona péptidos y análogos de ellos basados en las regiones CDR de autoanticuerpos monoclonales patogénicos aislados de ratones con SLE experimental.
Así, en un aspecto, la invención se refiere a un péptido sintético seleccionado del grupo formado por:
(i) un péptido de como mínimo 12 y como máximo 30 restos de aminoácidos basados en la región determinante de complementariedad (CDR) de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo monoclonal anti-ADN patogénico que induce una enfermedad semejante al lupus eritematoso sistémico (SLE) en ratones (de aquí en adelante péptido basado en CDR), una sal o un derivado químico de él;
(ii) un análogo de un péptido basado en CDR definido en (i), una sal o un derivado químico de él;
(iii) un péptido sintético doble que comprende dos péptidos de (i) o análogos de (ii) unidos covalentemente uno a otro directamente o a través de una corta cadena de unión.
(iv) un polímero peptídico que comprende numerosas secuencias de dicho péptido (i) o un análogo de él (ii); y
(v) un polímero de péptido (iv) unido a un vehículo macromolecular.
En una realización de este aspecto, el péptido sintético es capaz de:
(i) inhibir específicamente la respuesta proliferativa y la secreción de citocinas de linfocitos T de ratones que son buenos respondedores a autoanticuerpos inductores de SLE; o
(ii) inhibir el desarrollo de SLE en ratones que son susceptibles a la inducción de SLE por autoanticuerpos patogénicos.
Los péptidos sintéticos y análogos de ellos según la invención pueden seleccionarse del grupo formado por péptidos que tienen las secuencias I a V de la presente invención, en donde:
(i) el péptido de secuencia I tiene la fórmula:
[I]TGYYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}QSPEKSLEWIG
en donde X_{1} es Met, Ala o Val; X_{2} es Gln, Asp, Glu o Arg; X_{3} es Trp o Ala; X_{4} es Val o Ser; y X_{5} es Lys , Glu o Ala;
(ii) el péptido de secuencia II tiene la fórmula:
[II]EINPSTGGX_{6}X_{7}X_{8}X_{9}X_{10}X_{11}X_{12}KAKAT
en donde X_{6} y X_{7} son cada uno Thr, Val o Ala; X_{8} es Tyr o Phe; X_{9} es Asn o Asp; X_{10} es Gln o Glu; X_{11} es Lys o Glu; y X_{12} es Phe o Tyr;
(iii) el péptido de secuencia III tiene la fórmula:
[III]YYCARX_{13}X_{14}X_{15}X_{16}PYAX_{17}X_{18}YWGQGS
en donde X_{13} es Phe, Thr o Gly; X_{14} es Leu, Ala o Ser; X_{15} es Trp o Ala; X_{16} es Glu o Lys; X_{17} es Met o Ala; y X_{18} es Asp, Lys o Ser;
(iv) el péptido de secuencia IV tiene la fórmula:
[IV]GYNX_{19}X_{20}X_{21}X_{22}X_{23}X_{24}SHGX_{25}X_{26}LEWIG
en donde X_{19} es Met o Ala; X_{20} es Asn, Asp o Arg; X_{21} es Trp o Ala; X_{22} es Val o Ser; X_{23} es Lys o Glu; y X_{24} es Gln o Ala; X_{25} es Lys o Glu; y X_{26} es Ser o Ala; y
(v) el péptido de secuencia V tiene la fórmula:
[V]YYCARX_{27}X_{28}X_{29}YGX_{30}X_{31}X_{32}GQGTL
en donde X_{27} es Ser o Phe; X_{28} es Gly o Ala; X_{29} es Arg, Ala o Glu; X_{30} es Asn o Asp; X_{31} es Tyr o Phe; y X_{32} es Trp, His o Ala.
En las realizaciones preferidas, los péptidos I a V tienen las secuencias Ia a Va de la presente invención:
1
Los péptidos Ia a IIIa están basados en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena V_{H} del mAb 5G12, y los péptidos IVa y Va están basados en las regiones CDR1 y CDR3, respectivamente, de la cadena V_{H} del mAb 2C4C2 (Waisman y Mozes, 1993).
En otro aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento del SLE que comprenden un péptido sintético o un polímero peptídico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente con SLE que comprende la administración a un paciente con SLE de una cantidad efectiva de un péptido sintético o un polímero de péptido de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-B muestran la presencia de anticuerpos anti-ADN en sueros de ratones SJL (1A) y BALB/c (1B) inmunizados con el mAb 5G12, péptidos Ia y IIIa y un péptido control 278, o sin inmunizar. Se testó el título de anticuerpos anti-ADNss de los sueros de ratones SJL o BALB/c individuales inmunizados con uno de los antígenos indicados, tomados tres meses después de la inyección de reinmunización, y sueros de ratones vírgenes de edad compatible. Tras la incubación con el suero diluido, se añadió un anti-IgG de ratón (específico de la cadena \gamma) de cabra conjugado con peroxidasa. Los resultados se expresan como la media de la DO de cada grupo de ratones.
Las figuras 2A-B muestran la presencia de anticuerpos anti-extracto nuclear (NE) de HeLa en los sueros de ratones SJL (2A) y BALB/c (2B) inmunizados con los mismos antígenos que en la figura 1.
Las figuras 3A-B muestran la presencia de anticuerpos anti-RNP, Sm, Ro y La en los sueros de ratones SJL (3A) y BALB/c (3B) inmunizados con los péptidos Ia y IIIa o con el péptido control 278, y ratones normales.
Las figuras 4A-B muestran la presencia de anticuerpos anti-ADN (4A) y anti EN de HeLa (4B) en los sueros de ratones BALB/c en los que se indujo la tolerancia con el péptido Ia o con el péptido control p307, e inmunizados con el péptido Ia o el mAb 5G12.
Las figuras 5A-B muestran la inhibición in vivo de la respuesta proliferativa de células de ganglios linfáticos (LNC) en ratones BALB/c (5A) y SLJ (5B) a los péptidos basados en CDR Ia y IIIa, respectivamente, tras el tratamiento con el último.
Las figuras 6A-B muestran la inhibición in vivo de LNC al mAb 5G12 en ratones BALB/c (6A) o SJL (6B) tratados con el péptido Ia y IIIa, respectivamente.
Las figuras 7A-B muestran la inhibición in vivo de la proliferación de LNC al anticuerpo monoclonal Id 16/6 humano anti-ADN en ratones BALB/c (7A) y SJL (7B) tratados con el péptido Ia y IIIa, respectivamente.
La figura 8 muestra la unión de los péptidos Ia y IIIa a la superficie de células presentadoras de antígeno de diferentes cepas de ratón.
La figura 9 muestra los títulos de anticuerpos en sueros de pacientes con SLE y controles humanos sanos mediante el ensayo de la capacidad de sus sueros para unir los péptidos Ia, IIa y IIIa, o el mAb 5G12 o un péptido control.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a péptidos sintéticos que están basados en los CDR de autoanticuerpos monoclonales patogénicos aislados de ratones con SLE experimental. Tales anticuerpos monoclonales se obtienen de sobrenadantes de hibridomas producidos por fusión, por ejemplo, de células de bazo de ratones C3H.SW inmunizados con el mAb anti-Id 16/6, con células de plasmocitoma X63.653 (Waisman y Mozes, 1993).
Son ejemplos de tales péptidos aquellos de formulas Ia a Va de la presente invención, basados en, respectivamente, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del mAb 5G12 y las regiones CDR1 y CDR3 de la cadena pesada del mAb 2C4C2 (Waisman y Mozes, 1993) y análogos de ellos.
Los análogos de los péptidos originales Ia a Va contemplados por la invención incluyen análogos de sustitución, deleción y adición como se describe en la presente invención. Los análogos de sustitución tienen sustituciones de aminoácidos en diferentes posiciones, haciéndose estas sustituciones en base al volumen, patrón hidrofóbico-hidrofílico y carga de los aminoácidos.
Los aminoácidos pueden dividirse a lo largo de las líneas de volumen, patrón hidrofóbico-hidrofílico y carga. Con respecto al volumen, lo que un experto corriente en la materia entiende como aminoácidos con el volumen más grande son Trp, Tyr, Phe, Arg, Lys, Ile, Leu, Met e His, mientras que aquellos con volúmenes más pequeños son Gly, Ala, Ser, Asp, Thr y Pro, estando los demás entre éstos.
Con respecto al patrón hidrofóbico-hidrofílico, es bien conocido que los aminoácidos Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met y Trp son hidrofóbicos, mientras que todos los restantes aminoácidos son hidrofílicos. Entre los aminoácidos hidrofílicos, Ser, Thr, Gln y Tyr no tienen carga, mientras que Arg, Lys, His y Asn tienen una carga positiva y Asp y Glu tienen cargas negativas.
En la selección de péptidos para testarlos por su potencial en la inhibición de la respuesta proliferativa de linfocitos T de ratones que son buenos respondedores a autoanticuerpos inductores de SLE, es importante que la sustitución se seleccione a partir de aquellos cuya acumulación no cambie sustancialmente el volumen, patrón hidrofóbico-hidrofílico y la carga de la porción correspondiente del péptido original sin sustituir. De este modo, un resto hidrofóbico puede ser sustituido con un resto hidrofílico, o viceversa, siempre que el efecto total no cambie sustancialmente el volumen, patrón hidrofóbico-hicrofílico y la carga del correspondiente péptido original sin sustituir.
Debería entenderse que otras modificaciones de los péptidos y análogos de ellos también se contemplan por la presente invención. Así, el péptido o análogo de la presente invención está destinado a incluir un "derivado químico" de él que retiene al menos una porción de la función del péptido que permite su utilidad en la prevención o inhibición de la respuesta proliferativa de células T y la enfermedad autoinmune.
Un "derivado químico" de un péptido o análogo de la presente invención contiene restos químicos adicionales que no son parte normalmente del péptido. Se incluyen modificaciones covalentes del péptido en el ámbito de esta invención. Tales modificaciones pueden introducirse en la molécula mediante la reacción de los restos de aminoácidos en cuestión del péptido con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales o restos terminales seleccionados. Muchos de tales químicos derivatizantes y los métodos para hacerlos son bien conocidos en la materia.
También se incluyen en el ámbito de la invención sales de los péptidos y análogos de la invención. Como se usa en la presente invención, el término "sal" se refiere tanto a sales con grupos carboxilo como a sales con adición de ácido de grupos amino de la molécula peptídica. Las sales con un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la materia e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, hierro o zinc y similares, y sales con bases orgánicas tales como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína, y similares. Las sales con adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhódrido o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Tales derivados químicos y sales se usan preferiblemente para modificar las propiedades farmacéuticas del péptido en la medida en que la estabilidad, solubilidad, etc. son consideradas.
Ejemplos de péptidos y análogos de estos son como sigue:
(i) Péptido Ia de fórmula
2
y análogos de sustitución de éste en el que la Met en la posición 5 se sustituye por Ala o Val; el Gln en posición 6 se sustituye por Asp, Glu o Arg; el Trp en posición 7 se sustituye por Ala; la Val en posición 8 por Ser; y la Lys en posición 9 se sustituye por Glu o Ala; y los análogos de deleción de éste en el que se delecionan hasta 5 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal del péptido Ia.
(ii) Péptido IIa de fórmula
3
y análogos de sustitución de éste en el que las Thr en posiciones 9 y 10 son cada una sustituidas por Val o Ala; la Tyr en posición 11 es sustituida por Phe; la Asn en posición 12 es sustituida por Asp; la Gln en posición 13 por Glu; la Lys en posición 14 por Glu; y la Phe en posición 15 por Tyr; y los análogos de deleción de éste en el que se delecionan hasta 5 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal del péptido IIa.
(iii) Péptido IIIa de fórmula
4
y análogos de sustitución de éste en el que la Phe en posición 6 es sustituida por Thr o Gly; la Leu en posición 7 es sustituida por Ala o Ser; el Trp en posición 8 es sustituido por Ala; el Glu en posición 9 es sustituido por Lys; la Met en posición 13 por Ala; y el Asp en posición 14 por Lys o Ser; y los análogos de deleción de éste en el que se delecionan hasta 5 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal del péptido IIIa.
(iv) Péptido IVa de fórmula
5
y análogos de sustitución de éste en el que la Met en posición 4 es sustituida por Ala; la Asn en posición 5 es sustituida por Asp o Arg; el Trp en posición 6 es sustituido por Ala; la Val en posición 7 es sustituida por Ser; la Lys en posición 8 por Glu; la Gln en posición 9 por Ala; la Lys en posición 13 por Glu; y la Ser en posición 14 por Ala; y los análogos de deleción de éste en el que se delecionan hasta 5 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal del péptido IVa.
(v) Péptido Va de fórmula
6
y análogos de sustitución de éste en el que la Ser en posición 6 es sustituida por Phe; la Gly en posición 7 es sustituida por Ala; la Arg en posición 8 es sustituida por Ala o Glu; la Asn en posición 11 es sustituida por Asp; la Tyr en posición 12 por Phe; y el Trp en posición 13 por His o Ala; y los análogos de deleción de éste en el que se delecionan hasta 5 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal del péptido Va.
Una vez se produce un análogo según la presente invención, se puede determinar fácilmente su capacidad para inhibir la respuesta proliferativa de linfocitos T de ratones que son buenos respondedores a autoanticuerpos inductores de SLE por expertos corrientes en la materia sin excesiva experimentación usando ensayos como los descritos en la presente invención. Un ensayo que puede realizarse fácilmente es para la capacidad de péptidos sustituidos para inhibir in vitro la respuesta proliferativa de ciertas líneas celulares y clones T específicos de autoanticuerpos inductores de SLE. Las líneas celulares y clones T pueden ser, por ejemplo, líneas celulares y clones T específicos del mAb anti-Id 16/6 (Fricke et al., 1991) establecidos a partir de células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados mediante metodología previamente descrita (Axelrod y Mozes, 1986). Se exponen las células al anticuerpo estimulante presentado sobre células de bazo irradiadas en presencia de un medio enriquecido cada dos semanas. Las líneas celulares y clones T se testan, por ejemplo, mediante el método descrito en Materiales y métodos, sección (g), de la presente invención.
Otro ensayo que puede realizarse con el fin de seleccionar análogos con la actividad deseada es testar la capacidad de péptidos sustituidos para inhibir la capacidad de las líneas celulares y clones T de proporcionar cooperación a las células B específicas de péptido en presencia del péptido original. Puede también testarse la capacidad del péptido sustituido para unirse directamente, tras la biotinilización, a productos del MHC clase II o a células presentadoras de antígeno de las cepas relevantes. Con este propósito, se llevó a cabo la biotinilización del extremo N-terminal de los péptidos relevantes a 0ºC con un exceso de biotina-N-hidroxisuccinamida es solución acuosa (Mozes et al., 1989). Se incuban las células esplénicas adherentes o los linfocitos de sangre periférica (PBL) adherentes (1 x 10^{6}/muestra) con péptidos biotinilados en PBS con 0,1% de albúmina sérica bovina (PBS/BSA) a 37ºC durante 20 h, seguido por la incubación con ficoeritrina-estreptavidina durante 30 min a 4ºC. Después de cada incubación, las células se lavan dos veces con la solución anterior. Después de esto, las células se analizan mediante citometría de flujo usando un FACScan. En cada análisis, se analizaron un mínimo de 5.000 células (para los procedimientos anteriores, ver, por ejemplo, Mozes et al., 1989; Zisman et al., 1991).
Un ensayo más que puede realizarse es para testar la capacidad de los análogos para inhibir la secreción de citocinas de la línea célular T o de linfocitos T de ganglios linfáticos de ratones que son buenos respondedores a autoanticuerpos inductores de SLE. Las citocinas se detectan como sigue: la actividad IL-1 se valora por ELISA usando un par de anticuerpos de captura y de detección (como se describe a continuación para IL-4, IL-6, IL-10) o usando el ensayo LBRM-33(1A5) (Conlon, 1983), en el que se estimulan las células 1A5 en presencia de fitohemaglutinina (PHA), con sobrenadante o IL-1 recombinante a diferentes concentraciones para secretar IL-2. Tras una incubación durante toda la noche, se transfieren los sobrenadantes de las células 1A5 a la línea de linfocitos T citotóxicos (CTLL) dependiente de IL-2. La estimulación de la línea CTLL por IL-2 se mide tras 24 h por la incorporación de ^{3}[H]-timidina. IL-2 se detecta directamente usando la línea CTLL dependiente de IL-2 o por ELISA. Los niveles de IL-4, IL-6, IL-10, INF\gamma y TNF\alpha en los sobrenadantes se determinan por ELISA usando anticuerpos contra las diferentes citocinas (Pharmingen, San Diego, Ca, USA) según las instrucciones del fabricante.
Los péptidos que dan positivo en uno o más de estos ensayos in vitro proporcionarán un expectativa razonable de actividad in vivo. Sin embargo, los ensayos in vivo también se pueden realizar sin excesiva experimentación. De este modo, por ejemplo, se pueden inyectar ratones adultos con el péptido candidato a día -3 o a día 0. Los ratones se inmunizan entonces con el autoanticuerpo que induce la enfermedad o con el péptido. Diez días después, se testa la capacidad de proliferación de las células de ganglios linfáticos de los ratones en respuesta al inmunógeno con el fin de averiguar la capacidad inhibitoria del péptido candidato.
Otro de tales ensayo de animales in vivo consiste en medir la actividad terapéutica directamente en el modelo murino in vivo para la producción de SLE como se describe anteriormente. El péptido puede inyectarse en los ratones en los que se ha inducido el SLE experimental por diferentes rutas a diferentes dosis y en diferentes programas de tiempo. Con el fin de determinar los parámetros farmacocinéticos de los análogos, incluyendo el volumen de distribución, la captación en las células presentadoras de antígeno y el aclaramiento, se pueden usar derivados biotinilados de los análogos. La concentración de la fracción soluble de los análogos en los diferentes fluidos corporales puede determinarse por ELISA, usando placas cubiertas con avidina y anticuerpos específicos anti-péptido. Los análogos unidos a células pueden analizarse por FACS, usando un fluorocromo conjugado con avidina o esptreptavidina. Además, se pueden testar periódicamente los ratones tratados con el fin de determinar el efecto de los péptidos sobre la respuesta de autoanticuerpos y sobre las manifestaciones de la enfermedad provocadas en los ratones por los autoanticuerpos inductores de SLE.
Otro procedimiento in vivo consiste en ratones recién nacidos en los que se ha inducido la tolerancia con el péptido candidato seguido por la inmunización de los ratones con el autoanticuerpo patogénico, como Id 16/6+, o con el mismo péptido, y el seguimiento de las manifestaciones clínicas, tales como hallazgos serológicos asociados con leucopenia, elevada velocidad de sedimentación de eritrocitos, proteinuria, abundancia de complejos inmunes en el riñón y esclerosis de los glomérulos.
Se puede ver así que, además de las realizaciones preferidas que se ha demostrado son operativas en los ejemplos de la presente invención, los expertos corrientes en la materia serán capaces de determinar análogos adicionales que serán también operativos siguiendo las directrices presentadas en la presente invención sin excesiva experimentación.
Puede realizarse también un ensayo in vitro relativamente fácil con el fin de valorar la eficacia terapéutica esperada de cualquier péptido sustituido dado sobre cualquier paciente con SLE dado. Con el fin de valorar el objetivo final de producir péptidos que se unirán con alta afinidad a las moléculas de MHC clase II apropiadas, pero no conducirán a la posterior activación de células T y tendrán, por tanto, un efecto terapéutico sobre los pacientes con SLE, tras la biotinilización, puede ensayarse la capacidad de los péptidos para unirse directamente a los productos del HLA clase II sobre las células presentadoras de antígeno en linfocitos de sangre periférica de pacientes con SLE. Se pueden usar en tales ensayos donantes control sanos y péptidos control para verificar su especificidad.
Una forma preferida de agente terapéutico de la invención es un péptido seleccionado del grupo de péptidos de fórmulas I a V de la presente invención, incluyendo los péptidos Ia a Va y los análogos de sustitución y/o deleción de ellos.
Otra forma preferida del agente terapéutico según la presente invención es la forma de un único péptido multiepítopo. Así, en una realización preferida, péptidos dobles que consisten en dos péptidos diferentes seleccionados del grupo de péptidos de fórmula I a V de la presente invención, se unen covalentemente el uno al otro por una corta cadena de restos de Ala o por un sitio probable de proteolisis por la catepsina. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. 5,126,249 y la Patente Europea 495,049 con respecto a tales sitios. Esto inducirá proteolisis específica de sitio de la forma preferida en los dos análogos deseados. Alternativamente, pueden formarse varios péptidos iguales o diferentes de la presente invención en un polímero peptídico, tales como, por ejemplo, polimerización de los péptidos con un agente de polimerización adecuado, como glutaraldehido al 1% (Audibert et al. (1981), Nature 289:593). El polímero contendrá preferiblemente de 5 a 20 restos peptídicos. Tales polímeros peptídicos pueden también formarse por el entrecruzamiento de péptidos o la unión de múltiples péptidos a vehículos macromoleculares. Los vehículos macromoleculares adecuados son, por ejemplo, proteínas, como toxoide tetánico y copolímeros lineales o ramificados de aminoácidos, como un copolímero lineal de L-alanina, L-ácido glutámico y L-lisina y un copolímero ramificado de L-tirosina, L-ácido glutámico, L-alanina y L-lisina (T,G)-A--L-, o una multicadena de poli-DL-alanina (M. Sela et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 77:6175). Los conjugados se obtienen, por ejemplo, primero acoplando el péptido con una carbodiimida hidrosoluble, como clorhidrato de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida, y luego realizando la conjugación con el vehículo macromolecular como describen Muller, G.M. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:569. Los contenidos del péptido acoplado en cada conjugado se determinan mediante el análisis de aminoácidos, en comparación con la composición del vehículo solo.
Según una realización de la presente invención, se pueden unir uno o más péptidos activos a un vehículo macromolecular adecuado o se pueden polimerizar en presencia de glutaraldehido.
Los péptidos, polímeros de ellos o sus conjugados con vehículos macromoleculares adecuados, se darán a pacientes en una forma que asegure su biodisponibilidad, haciéndoles adecuados para el tratamiento. Si se encuentra que más de un péptido análogo tiene una actividad inhibitoria significativa, estos análogos se darán a pacientes en un formulación que contiene una mezcla de los péptidos.
La invención además incluye composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un péptido sintético según la presente invención, un conjugado de él con un vehículo macromolecular adecuado o un polímero de él opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención abarca cualquier ruta de administración aceptable, incluyendo oral, intravenosa, subcutánea, intraarticular, intramuscular, inhalación, intranasal, intratecal, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica u otras rutas conocidas, incluyendo la ruta enteral.
Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones de la presente invención deberán ser suficientemente grandes como para producir el efecto deseado, por lo cual, por ejemplo, una respuesta inmune a los autoanticuerpos inductores de SLE, como la medida por la proliferación de células T in vitro, se previene o inhibe sustancialmente y, además, donde la enfermedad es tratada significativamente. Las dosis no deberán ser tan grandes como para causar efectos secundarios adversos, como una reacción cruzada no deseada, inmunosupresión generalizada, reacciones anafilácticas y similares.
Las dosis efectivas de los péptidos de esta invención para su uso en el tratamiento del SLE están en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a 100 mg/kg de peso corporal. La dosis administrada dependerá de la edad, sexo, salud y peso del paciente, clase de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Los péptidos sintéticos y análogos de la invención, particularmente los de secuencias I a V de la presente invención, se dirigen a la inhibición o supresión de respuestas específicas de antígeno de pacientes con SLE, sin afectar todas las otras respuestas inmunes. Esta aproximación es de la mayor importancia puesto que la mayoría de los pacientes diagnosticados son mujeres jóvenes que tienen que ser tratadas durante muchos años y el tratamiento aceptado actualmente para SLE implica la administración de agentes inmunosupresores, tales como corticoesteroides y/o drogas citotóxicas, que son inespecíficas y tienen efectos secundarios adversos.
La presente invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y las figuras que acompañan:
Ejemplos Materiales y métodos
a) Ratones: Los ratones (BALB/c y SJL/J) se obtuvieron de Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA y Olac, Show's farm, Bicesper Oxon, Inglaterra. Los ratones se usaron a la edad de 6 a 12 semanas. En algunos estudios se usaron también ratones neonatos.
b) mAb Id 16/6 humano: El mAb Id 16/6 humano es un anticuerpo anti-ADN originalmente del isotipo IgM que se cambió en cultivo a IgG1. El mAb derivaba de un paciente y expresa un idiotipo común, el Id 16/6 (Shoenfeld et al., 1983; Mendlovic et al., 1988). Las células del hibridoma que secretan este mAb se crecen de forma rutinaria en cultivo, y el anticuerpo se aisla del sobrenadante del cultivo usando una columna de afinidad de proteína G acoplada a Sepharose^{TM}.
c) Producción de los mAb 5G12 y 2C4C2 de ratón: La SLE experimental se indujo en ratones hembra C3H.SW mediante inmunización con el mAb anti-Id 16/6 murino anteriormente descrito (Mendlovic, et al., 1989). Cuatro meses después, se sacrificaron dos ratones y sus células de bazo se fusionaron con células de plasmocitoma X63.653. Las células de hibridoma que secretaban autoanticuerpos se clonaron por dilución límite en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se caracterizaron las secuencias de nueve autoanticuerpos monoclonales secretados por nueve de los clones de hibridoma (Waisman and Mozes, 1993). Los mAb denominados 5G12 y 2C4C2 se aislaron y purificaron por afinidad a partir de los sobrenadantes de los hibridomas usando una columna de anticuerpo de cabra anti- Ig de ratón-Sepharose^{TM}. Se encontró que el mAb 5G12 era un mAb anti-ADN que portaba el Id 16/6 y tenía el isotipo IgG2a. Se encontró que el mAb 2C4C2 era un mAb anti-ADN y anti-cardiolipina y era del isotipo IgM. Los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas para la V_{H} de ambos mAb, 5G12 Y 2C4C2, se presentan en la figura 1 de Waisman y Mozes, 1993, en la cual las regiones CDR están recuadradas.
d) Inducción de la SLE experimental en ratones: Se inyectaron los ratones con el monoclonal humano Id 16/6 (1 \mug/ratón) o el mAb murino Id 16/6, por ejemplo, el mAb 5G12 (20 \mug/ratón), en adyuvante completo de Freund en las almohadillas de las patas traseras. Tres semanas después de la inyección, los ratones se reinmunizaron con la misma cantidad de anticuerpo inmunizante en fosfato tamponado salino (PBS). Se testó entonces la producción de autoanticuerpos de los ratones y las manifestaciones clínicas características del SLE experimental.
e) Detección de las manifestaciones clínicas asociadas a SLE: La velocidad de sedimentación de eritrocitos se determinó mediante la dilucción de sangre heparinizada en PBS a una relación de 1:1. Se pasó, entonces la sangre diluida a una micropipeta y se midió la sedimentación después de 6 horas. El recuento de glóbulos blancos se determinó tras la hemólisis de la sangre heparinizada. La proteinuria se midió de una forma semicuantitativa, usando un kit Combistix (Ames, Stoke Poges, Slough, U.K.). La inmunohistología se realizó mediante la incubación de los cortes congelados realizados en el criostato con anticuerpos marcados con FITC contra Ig de ratón. La tinción se visualizó por medio de un microscopio de fluorescencia.
f) Inmunoensayo enzimático (ELISA): El ELISA se utilizó para la detección y cuantificación de anticuerpos en ratones experimentales y humanos. Se cubrieron placas de microtitulación de poliestireno con el antígeno o anticuerpo relevante, y se añadió a las placas bloqueadas diluciones de los sueros o sobrenadantes derivados de los cultivos de células humanas o de ratón. La unión específica se determinó tras la adición de anticuerpos contra la inmunoglobulina (Ig) apropiada conjugados con peroxidasa (por ejemplo, anticuerpos de cabra anti-humano o anti-ratón conjugados con peroxidasa) y el sustrato de la peroxidasa. Se leyó la densidad óptica a 414 nm usando un lector de ELSA.
g) Respuestas proliferativas de células de bazo y de ganglios linfáticos: Se cultivaron células (0,5 x 10^{6}/pocillo) derivadas de bazo o de ganglios linfáticos de ratones tratados y sin tratar en placas de microtitulación en presencia de diferentes concentraciones de varios autoanticuerpos patogénicos inmunizantes. Al final de 96 horas de incubación, se añadió 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante 18 horas más, tras lo cual las células se recogieron y se contó la radioactividad.
h) Tratamiento de ratones experimentales: Con el fin de prevenir la inducción del SLE experimental o de curar los ratones que padecían la enfermedad, se siguieron los siguientes procedimientos: (i) Se indujo la tolerancia de ratones recién nacidos con un péptido de la invención (100 \mug del péptido en PBS, vía intraperitoneal a la 24 y 72 horas del nacimiento). Seis semanas después, se inmunizaron los ratones con el autoanticuerpo patogénico, por ejemplo, 5G12 (Id 16/6+), y se examinaron las manifestaciones de la enfermedad; (ii) Se inyectó un primer grupo de ratones adultos con varias concentraciones de los péptidos antes de la inducción de la enfermedad con el autoanticuerpo patogénico o la línea celular T patogénica; otro grupo se inyectó con los péptidos para testar su efecto terapéutico seis semanas después de inmunización en el pico de la respuesta serológica; y un grupo más se trató a los 4 a 6 meses después de la inmunización tras establecer la enfermedad SLE manifiesta. El número de inyecciones de los péptidos se determinó en base a su efecto sobre la inducción y progresión de la enfermedad. Se evaluó, entonces, el efecto del tratamiento con péptido sobre la proliferación de células T, sobre la producción de autoanticuerpos y sobre las manifestaciones de la enfermedad.
i) Respuestas proliferativas de líneas celulares y clones T: Se establecieron las líneas celulares y clones T específicos de Id 16/6 a partir de células de ganglios linfáticos, como se describió previamente (Axelrod y Mozes, 1986). Se expusieron las células al anticuerpo estimulante presentado sobre células de bazo singénicas irradiadas en presencia de medio enriquecido cada dos semanas. Las líneas celulares T se clonaron por la técnica de dilución límite. Se cultivaron las células (10^{4}/pocillo) con 0,5 x 10^{6} células de bazo singénicas irradiadas (3.000 rad) en presencia de diferentes concentraciones del estimulador específico de la línea o reactivos control. Al final de las 48 horas de incubación, se añadieron 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante 18 horas más, tras lo cual las células se recogieron y se contó la radioactividad.
j) Proliferación y producción de citocinas por linfocitos de sangre periférica (PBL): Se cultivaron PBL de pacientes con SLE humanos y de los apropiados donantes control (2 x 10^{5}/pocillo) en placas de microtitulación en medio enriquecido que contenía mezcla de sueros AB al 10% en presencia del anticuerpo monoclonal Id 16/6 humano o de ratón, en presencia de péptidos de la invención o en presencia de fitohemaglutinina (PHA). La tasa de proliferación se evaluó mediante la incorporación de ^{3}[H]-timidina en el cultivo celular. Se usaron péptidos irrelevantes como controles específicos. La producción de citocinas estimulada por antígeno y mitógeno se cuantificó en los sobrenadantes de los cultivos anteriores usando las líneas dependientes de citocina o las parejas apropiadas de anticuerpos en ensayos de ELISA. La inhibición de las respuestas proliferativas se llevó a cabo in vitro por la adición de dosis crecientes de los análogos de péptidos testados en las mezclas de cultivo en proliferación.
k) Líneas celulares y clones T humanos: Las líneas celulares T humana específicas del Id 16/6 pueden establecerse a partir de PBL de pacientes con SLE o controles tras la estimulación in vitro con el mAb Id 16/6 humano o de ratón o los péptidos. El mantenimiento y clonación de las líneas se realizó de forma similar a la descrita anteriormente para las líneas celulares T murinas, con la excepción de que la estimulación se llevó a cabo usando células autólogas irradiadas o líneas transformadas con EBV de PBL autólogos (usadas como células presentadoras de antígeno).
l) Biotinilización de péptidos: La biotinilización N-terminal de los péptidos se realizó en solución de bicarbonato sódico 0,1 N a temperatura ambiente, con un exceso de éster de biotinamidocaproato N-hidroxisuccinamida (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en 1-metil-2-pirrolidona (Sigma).
m) Unión directa de péptidos biotinilados a APC: Se incubaron células de bazo suspendidas en medio RPMI 1640 que contenía FCS al 10% en placas de Petri durante 60 min a 37ºC. Después de esto, las células no adherentes se eliminaron, se lavaron las placas y se recogieron las células adherentes de las placas usando un raspador de goma (Costar, MA, USA). Estas células (1 x 10^{6}/100 \mul/tubo) se incubaron con los péptidos biotinilados en PBS con 0,1% de BSA (grado de alta pureza, Amresco, OH, USA) durante 16 h a 37ºC, seguido por la incubación con ficoeritrina (PE)-estreptavidina (Jackson ImmunoResearch) durante 30 min a 4ºC. A continuación, las muestras se incubaron con anti-estreptavidina biotinilada (1:60, Vector Laboratories, Burlingame, CA) y durante un periodo adicional con PE-estreptavidina, todo durante 30 min a 4ºC. Se lavaron las células dos veces con una solución de PBS/BSA fría después de cada incubación. Después de esto las células se analizaron mediante citometría de flujo usando el citómetro FACSort y el programa CELLQuest (Becton-Dickinson, Mountainview, CA). Se usaron tres péptidos para la inhibición de la unión en estos experimentos: 34-5-3 (anti-I-A^{b}, Pharmingen, San Diego, CA); MKD6 (anti-I-A^{d}, Becton-Dickinson) y 10.3.6.2 (anti-I-A^{s} (Zamvil et al., 1988)).
Ejemplo 1 Síntesis de los péptidos
Los péptidos sintéticos de la invención de las fórmulas Ia, IIa y IIIa en la presente invención, así como los péptidos control, se prepararon con un sintetizador automatizado (Applied Biosystem modelo 430A, Alemania) usando los protocolos del fabricante para el procedimiento de t-butiloxicarbonil (BOC) (ver Kent et al., 1984; Shnolzer et al., 1992). Brevemente, en este procedimiento se usaron aminoácidos de cadena lateral protegida disponibles comercialmente, añadiéndose los aminoácidos en cada paso con al menos un 99% de eficacia. Los grupos protectores eran eliminados de los péptidos y aclarados de la resina con HF anhidro. Posteriormente se purificaron los péptidos mediante la extracción con etil acetato y por HPLC. La pureza de los péptidos Ia, IIa y IIIa así obtenidos se verificó por HPLC y análisis de aminoácidos.
Para la preparación de los péptidos IVa y Va de la presente invención y análogos de los péptidos Ia a Va de la invención se usó el mismo procedimiento que el indicado anteriormente.
Se analizó, entonces, la actividad biológica de los péptidos Ia, IIa y IIIa y otras características, como se explica en los ejemplos 2-14 más adelante. Ha de entenderse que los otros péptidos no tan testados pueden ser sometidos al mismo análisis.
Ejemplo 2 Detección de anticuerpos anti-ADN en los sueros de ratones inmunizados con los péptidos Ia y IIIa
Se inmunizaron ratones hembra SJL/J y BLAB/c (6 a 8 semanas de edad) con 20 \mug del péptido Ia o IIIa de la invención, o con un péptido control designado p278 (el péptido designado Pep 278h descrito en PCT International Application WO 94/03208 publicada) o con el mAb 5G12 emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA) en las almohadillas de las patas. Tres semanas después los ratones recibieron una inyección de reinmunización con la misma cantidad de péptido o de mAb, en PBS. Después de esto, se extrajo sangre cada dos semanas. Un quinto grupo incluía ratones no inmunizados.
La figura 1 representa los anticuerpos anti-ADN en el suero de los ratones tres meses después de la inyección de reinmunización, y es muy similar a la cantidad de autoanticuerpos producidos en periodos tardíos.
Como se muestra en la figura 1A, los ratones SJL/J que se inmunizaron con el péptido IIIa (círculos blancos) muestran un alto nivel de anticuerpos anti-ADN, que es mayor que el de los ratones inmunizados con el anticuerpo completo 5G12 (cuadrados blancos). Se observaron bajos niveles de anticuerpos anti-ADN en los sueros de los ratones SJL/J inmunizados con el péptido Ia (rombos blancos), péptido control p278 (triángulos blancos) o ratones normales sin inmunizar (cuadrados cruzados).
Como se muestra en la figura 1B, los ratones BALB/c que se inmunizaron con el anticuerpo completo 5G12 (cuadrados blancos) o el péptido Ia (rombos blancos) muestran la presencia de anticuerpos anti-ADN en los sueros. Sin embargo, los sueros de los ratones BALB/c inmunizados con el péptido IIIa (círculos blancos), p278 (triángulos blancos) o ratones normales sin inmunizar (cuadrados cruzados) no mostraron la presencia de anticuerpos anti-ADN.
Se utilizó el ELISA para testar la presencia de anticuerpos anti-ADN en los sueros de los ratones: Las placas (Nunc) se cubrieron durante 90 min con BSA metilada 10 \mug/ml. Después se lavaron las placas (todos los lavados se hicieron 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05% (Sigma)) y se incubaron durante 90 min más con ADN de hebra simple 10 \mug/ml (ADN de timo de ternero (Sigma) que se calentó durante 15 min a 90ºC y enfrió rápidamente). Se lavaron las placas y se bloquearon durante toda la noche con 1% de avoalbúmina en PBS (Sigma). Después de esto las placas se lavaron e incubaron con los sueros de los ratones diluidos en el reactivo de bloqueo, seguido por el lavado e incubación con una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (específico del receptor de Fc) conjugado con peroxidasa. Se lavaron después las placas y se desarrollaron usando el sustrato ABTS (Sigma), y se leyó el color a 414 nm usando un lector de ELISA. Los resultados se expresan como la media de la DO de cada grupo de ratones (5 ratones por grupo).
Ejemplo 3 Detección de anticuerpos anti-extracto nuclear (NE) en los sueros de ratones inmunizados con los péptidos Ia y IIIa
Se inmunizaron 5 grupos de ratones según el ejemplo 2, y se testó la presencia de anticuerpos anti-NE en sus sueros.
Como se muestra en la figura 2A, los ratones SJL/J inmunizados con el mAb 5G12 (cuadrados blancos) o con el péptido IIIa (círculos blancos) producían un alto nivel de anticuerpos anti-NE, mientras que se los ratones inmunizados con el péptido Ia (rombos blancos) o el péptido control p278 (triángulos blancos) o ratones normales sin inmunizar (cuadrados cruzados), producían niveles más bajos de anticuerpos anti-NE.
Como se muestra en la figura 2B, los ratones BALB/c inmunizados con el mAb 5G12 (cuadrados blancos) o con el péptido Ia (rombos blancos) producían altos niveles de anticuerpos anti-NE, mientras que se detectaron niveles muy bajos de anticuerpos anti-NE en los sueros de los ratones BALB/c inmunizados con el péptido IIIa (círculos blancos). No se detectaron anticuerpos anti-NE en el grupo de ratones inmunizados con el péptido control p278 (triángulos blancos) ni en los ratones normales sin inmunizar (cuadrados cruzados).
Se utilizó el ELISA para testar la presencia de anticuerpos anti-NE en los sueros de los ratones como sigue: Las placas (Nunc) se cubrieron con 5 \mug/ml de NE de células HeLa durante 90 min. Después de esto se lavaron y bloquearon las placas y el ELISA se continuó al día siguiente como se describe en el ejemplo 2 para los anticuerpos anti-ADN.
Ejemplo 4 Detección de anticuerpos anti-RNP, Sm, Ro y La en los sueros de los ratones inmunizados con los péptidos Ia y IIIa
Se usaron los mismos sueros de los ratones como se describe en los ejemplos 2 y 3 para la detetección de anticuerpos anti-RNP, Sm, Ro y La.
Como se muestra en la figura 3A, los ratones SJL/J inmunizados con el péptido IIIa (barra rayada) producían niveles extremadamente altos de autoanticuerpos anti-Ro, anticuerpos que son típicos de SLE en humanos. Se detectaron altos niveles de anticuerpos anti-RNP, anti-Sm y anti-La, no sólo en ratones SJL/J inmunizados con el péptido IIIa (barra rayada), sino también con el péptido Ia (barra negra), comparado con ratones normales (barra blanca) o con ratones inmunizados con el péptido control p278 (barra puntada).
Como se muestra en la figura 3B, los ratones BALB/c inmunizados con el péptido Ia (barra negra) o el péptido IIIa (barra rayada) producían niveles muy altos de anticuerpos anti-RNP. Sin embargo, los ratones BLAB/c inmunizados con el péptido IIIa (barra rayada) mostraban niveles muy bajos de anticuerpos anti-Sm, anti-La y anti-Ro, comparado con los ratones BALB/c inmunizados con el péptido Ia (barra negra) que producían anticuerpos detectables en los sueros.
Las placas se adquirieron como placas precubiertas y se bloquearon con ovoalbúmina al 1% en PBS durante 2 h. Después se lavaron las placas como en el ejemplo 2 anterior, se incubaron en duplicados con sueros diluidos 1:10, lavadas de nuevo, y el ELSA se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 2 anterior.
Ejemplo 5 Manifestaciones clínicas del SLE en ratones inmunizados con los péptidos Ia y IIIa
Los ratones BALB/c y SJL/J se inmunizaron con el mAb 5G12 o con los péptidos Ia y IIIa, y cinco meses después se chequearon los dos criterios para la manifestación de SLE: recuento de glóbulos blancos (WBC) y proteinuria.
(i) Recuento de glóbulos blancos (WBC): Los ratones se sangraron, su sangre se diluyó 1:10 con ácido acético al 1% (vol/vol) con el fin de eliminar los glóbulos rojos, y se contaron los glóbulos blancos en un microscopio óptico.
(ii) Proteinuria: Se testó la presencia de proteína en la orina de los ratones usando combisticks (Combistix Kit, Ames). Altos niveles de proteína en la orina es indicativo de daño renal, una manifestación típica del SLE.
TABLA 1 Manifestaciones clínicas de ratones inmunizados con los péptidos
7
Los resultados para WBC y proteinuria se muestran en la tabla 1: Los ratones inmunizados con el mAb 5G12 o los péptidos Ia o IIIa tienen un número más bajo de glóbulos blancos en comparación con los ratones sin inmunizar o los inmunizados con el péptido control p278. Se midieron altos niveles de proteinuria en la orina de ratones BALB/c y SJL/J inmunizados con el péptido Ia, mientras que se detectó un pequeño incremento en el nivel de proteínas en la orina de ratones inmunizados con el péptido control p278, de ratones BALB/c inmunizados con IIIa y ratones SJL/J inmunizados con Ia.
Ejemplo 6 Especificidad de la respuesta de ratones a los péptidos
Como se muestra en los anteriores ejemplos, los péptidos Ia y IIIa se usaron para la inmunización de diferentes cepas de ratón, en paralelo a su inmunización con el anticuerpo monoclonal completo. Los ganglios linfáticos drenantes de los ratones proliferaban en respuesta a los péptidos inmunizantes a diferentes grados dependiendo de la cepa de ratón. Así, se encontró que los ratones BALB/c eran los que mejor respondían al péptido Ia, mientras que se encontró que los ratones SJL eran los que mejor respondían al péptido IIIa. Ambos péptidos se usaron con la intención de inducir SLE experimental usando el protocolo utilizado para los autoanticuerpos patogénicos. Se encontró que los ratones SJL que se inmunizaron con el péptido IIIa y los ratones BALB/c que se inmunizaron con el péptido Ia producían niveles elevados de autoanticuerpos, incluyendo anticuerpos anti-ADN (ver figura 1) y anti-NE (ver figura 2). Además, los ratones inmunizados desarrollaron leucopenia y proteinuria (ver tabla 1) de forma similar a los ratones en los que ha sido inducido el SLE experimental usando el mAb patogénico murino Id 16/6+ 5G12. El análisis de los riñones de los ratones inyectados con péptido revelaron leves depósitos de complejos inmunes en parte de los ratones. Estos resultados indican que los péptidos Ia y IIIa son epítopos importantes de células T de la molécula completa del autoanticuerpo patogénico.
Con el fin de valorar la correlación entre los péptidos de la invención y células T, se estableció una línea celular T específica del péptido IIIa de origen SJL (buenos respondedores al péptido IIIa). Las células T de la línea proliferaban específicamente en respuesta al péptido IIIa, pero no al péptido control irrelevante p278, y tras la estimulación con el péptido IIIa, secretaban citocinas de tipo Th1, concretamente, IL-2, IFN\gamma y TNF\alpha. La inyección de la línea celular T en ratones sanos singénicos condujo a la producción de autoanticuerpos y el desarrollo de manifestaciones clínicas que son características de ratones con SLE experimental. Estos resultados confirman la función de los péptidos basados en CDR de la invención en el SLE experimental y demuestran la función de las células T específicas de péptido en la enfermedad autoinmune.
Ejemplo 7 Detección de anticuerpos anti-ADN y anti-NE en los sueros de ratones BALB/c a los que se les indujo la tolerancia con el péptido Ia e inmunizados con otro péptido Ia o con el mAb 5G12
Con el fin de elucidar mejor la función de los péptidos en el SLE, se utilizó el péptido Ia para inducir la tolerancia en ratones BALB/c. Ratones recién nacidos se inyectaron dos veces (a día 1 y 3) con el péptido Ia o el péptido control. Así, los ratones BALB/c neonatos, de 24 h de edad, se inyectaron vía intraperitoneal (i.p.) con 100 \mug del péptido Ia o del péptido control p307 (un péptido relacionado con la miasthenia gravis descrito en la Solicitud PCT Nº WO 94/00148 publicada) en PBS, y recibieron una segunda inyección 48 h después con la misma cantidad de péptido. De seis a siete semanas después de la inyección, los ratones se inmunizaron como se describe en el ejemplo 2 anterior con el mAb 5G12 o con el péptido Ia. Los ratones se sangraron dos semanas después de la reinmunización (y luego periódicamente cada dos semanas) y se testó la presencia de anticuerpos anti-ADN y anti-NE en el suero de los ratones, como se describe en los ejemplos 1 y 2 anteriores. Los ensayos realizados para medir el título de los anticuerpos en los sueros de los ratones experimentales indican que los ratones a los que se les indujo la tolerancia con el péptido Ia no producen un título significativo de anticuerpos contra ADN o antígenos del extracto nuclear, mientras que los ratones a los que se les indujo la tolerancia al péptido control p307 antes de su inmunización con el péptido Ia o el mAb 5G12 producían altos títulos de anticuerpos.
Como se muestra en las figuras 4A-B, los ratones BALB/c a los que se les indujo la tolerancia con el péptido Ia y luego inmunizados con el mAb 5G12 (cuadrados semirrellenos), o inducida la tolerancia con el péptido Ia y luego inmunizados con el mismo péptido Ia (cuadrados negros) producían niveles menores de anticuerpos anti-ADN y anti-NE en comparación con los ratones a los que se les indujo la tolerancia con el péptido irrelevante p307 y luego inmunizados con el mAb 5G12 (triángulos negros), o inducida la tolerancia con el péptido p307 y luego inmunizados con el péptido Ia (círculos negros).
Esto indica que la inducción de tolerancia neonatal con el péptido Ia podría disminuir los niveles de autoanticuerpos en los sueros de ratones posteriormente inmunizados con el péptido Ia o el mAb 5G12.
Ejemplo 8 Inhibición in vivo de las respuestas proliferativas de células de ganglios linfáticos (LNC) a los péptidos basados en CDR Ia y IIIa
Ratones BALB/c (figura 5A) y SJL (figura 5B) se inmunizaron con los péptidos Ia y IIIa (20 \mug/ratón en CFA en las almohadillas de la patas traseras), respectivamente. Los ratones se inyectaron también vía i.v. con 200 \mug de los péptidos anteriores en PBS tres días antes de la inmunización (cuadrados blancos), el día de la inmunización (círculos blancos) o en ambos días (triángulos blancos). Diez días después los ratones se sacrificaron y se extrajeron sus ganglios linfáticos y se testó la proliferación en presencia de diferentes concentraciones del péptido inmunizante. Los grupos controles fueron de LNC tomadas de ratones que se inmunizaron, pero no se trataron (cuadrados negros), o tratados con el péptido control p307 (cuadrados semirrellenos). Las mezclas de cultivo se incubaron durante 96 horas en medio RPMI enriquecido que contenía suero normal de ratón al 1% antes de la adición de ^{3}H-timidina. Dieciséis horas después se recogieron las células y se contó la radioactividad. Los resultados se expresan como la media de CPM de triplicados. Los valores de la SD no excedían el 10%.
Como se muestra en las figuras 5A-B, ambos péptidos Ia (5A) y IIIa (5B) inhibían las respuestas proliferativas de LNC de ratones BALB/c y SJL, respectivamente, cuando se inyectaba a los ratones 3 días antes o el día de la inmunización: Se inhibía hasta el 95% de la capacidad proliferativa de las células por los péptidos. La inhibición era específica puesto que las respuestas proliferativas de las LNC a Con A no estaba inhibida por los péptidos Ia y IIIa (no mostrado).
Ejemplo 9 Inhibición in vivo de la proliferación de LNC de ratones inmunizados con el mAb 5G12 y tratados con los péptidos Ia y IIIa
Los ratones BALB/c (figura 6A) y SJL (figura 6B) se inmunizaron con el mAb 5G12 (20 \mug/ratón en CFA vía i.d. en las almohadillas de las patas traseras) y se inyectaron (200 \mug/ratón vía i.v. en PBS) con el péptido Ia o IIIa, respectivamente. Se midieron las respuestas proliferativas al mAb 5G12 en LNC tomadas de ratones que se inmunizaron y no se trataron (cuadrados negros) tratados conjuntamente con la inmunización con el péptido control p307 (cuadrados semirrellenos) o tratados con el apropiado pépido basado en CDR Ia (6A) o IIIa (6B) (cuadrados blancos). Las respuestas proliferativas al péptido basado en CDR inmunodominante Ia y IIIa se monitorizó también en LNC tomadas de ratones sin tratar (círculos negros) o de ratones tratados con el apropiado péptido basado en CDR Ia o IIIa (círculos blancos). Los resultados se expresan como la media de CPM de triplicados. Los valores de SD no excedían el 10%.
Como se muestra en las figuras 6A-B, las respuestas proliferativas al mAb 5G12 de LNC tomadas de ratones tratados con el apropiado péptido basado en CDR se inhibía comparando con las respuestas de ratones sin tratar.
Ejemplo 10 Inhibición in vivo de la proliferación de LNC al anticuerpo monoclonal anti-ADN Id 16/6+ humano
Los ratones BALB/c (figura 7A) y SJL (figura 7B) se inmunizaron con el mAb humano Id 16/6+ (1 \mug/ratón en CFA vía i.d. en las almohadillas de las patas traseras) y se inyectaron (200 \mug/ratón vía i.v. en PBS) con el péptido Ia o IIIa, respectivamente. Se midieron las respuestas proliferativas al mAb Id 16/6 en LNC tomadas de ratones inmunizados pero sin tratar (cuadrados negros), de ratones tratados conjuntamente con la inmunización con el péptido control p307 (cuadrados semirrellenos) o de ratones tratados con el apropiado péptido basado en CDR Ia o IIIa (cuadrados blancos). Se mostraron también las respuestas proliferativas para el péptido basado en CDR inmunodominante Ia o IIIa de LNC tomadas de ratones inmunizados con Id 16/6 sin tratar (círculos negros) o de ratones tratados con el apropiado péptido basado en CDR Ia o IIIa (círculos blancos). Los resultados se expresan como la media de CPM de triplicados. Los valores de SD no excedían el 10%.
Como se muestra en las figuras 7A-B, las respuestas proliferativas al mAb Id 16/6 de LNC tomadas de ratones tratados con el apropiado péptido basado en CDR Ia o IIIa se inhibían en comparación de las respuestas de ratones inmunizados pero sin tratar, o ratones tratados con el péptido control p307.
Ejemplo 11 Unión de los péptidos basados en CDR Ia y IIIa a la superficie de células presentadoras de antígeno (APC) esplénicas
Se incubaron células adherentes esplénicas (10^{6}/100 \mul/tubo) aisladas de ratones BALB/c, SJL, C3H.SW o C57BL/
6 durante 16 horas con el péptido basado en CDR Ia o IIIa biotinilado seguido por la incubación con PE-estreptavidina durante 30 min a 4ºC. Después de esto, las muestras se incubaron con anti-estreptavidina biotinilada y durante un periodo adicional con PE-estreptavidina, todo a 4ºC durante 30 min. Después de lavar, las células se analizaron por citometría de flujo usando el citómetro FACSort y el programa CELLQuest.
Los resultados se muestran en la figura 8: la tinción de células que se incubaron con los péptidos biotinilados basados en CDR está marcado por las líneas continuas y la tinción de fondo con el péptido no biotinilado está marcado con líneas discontinuas. Las células presentadoras de antígeno esplénicas derivadas de todas las cepas de ratones testadas (excepto ratones C57BL/6 que son resistentes a la inducción de SLE) mostraban una unión significativa de ambos péptidos basados en CDR Ia y IIIa a los productos del MHC clase II, indicando que su capacidad de unión concuerda con la susceptibilidad de las cepas de ratón a la inducción de SLE.
La unión de los péptidos basados en CDR Ia y IIIa a APC se determinó como se describe en Materiales y métodos de la presente invención y los resultados se muestran en la tabla 2. El porcentaje de unión era aproximadamente 38 a 53% para todas las cepas, excepto para APC de la cepa C57BL/6 que mostraba sólo 19,3% y 8,5% de unión con los péptidos Ia y IIIa, respectivamente. La unión se inhibía con los anticuerpos anti-Ia relevantes demostrando la especificidad de la unión a los productos del MHC clase II. Los resultados se muestran en la tabla 3: La inhibición de la unión era específica y oscilaba desde el 60% al 100%.
TABLA 2 Unión de los péptidos Ia y IIIa a APC de ratones
8
TABLA 3 Inhibición de la unión de los péptidos Ia y IIIa a APC por mAb anti-Ia
9
Ejemplo 12 Detección de anticuerpos contra los péptidos Ia, IIa y IIIa, y anticuerpos anti-Id 16/6 en los sueros de pacientes con SLE y controles sanos
Se tomaron muestras de sangre de pacientes con SLE humanos (32 pacientes) y se testó la capacidad de sus sueros por ELISA para unirse a los péptidos Ia, IIa y IIIa, un péptido control p195-212 (un péptido miastogénico descrito en la publicación PCT Nº WO 94/00148) o el mAb 5G12.
La detección de los anticuerpos se llevó a cabo en placas que se cubrieron con 10 \mug/ml de péptidos Ia, IIa, IIIa o p195-212 o el mAb 5G12, en PBS durante 2 h, lavadas y bloqueadas con 1% de ovoalbúmina en PBS durante 2 h más. El ELISA se continuó como se describe después del bloqueo en el ejemplo 2 anterior, usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa.
Como se muestra en la figura 9, los pacientes con SLE mostraban unos niveles significativamente más altos de anticuerpos que unían el péptido Ia (cuadrados blancos), IIa (rombos blancos) o IIIa (círculos blancos), o el mAb 5G12 (triángulos blancos), en comparación con los controles sanos (péptidos Ia-sano: rombos negros; péptido IIa-sano: círculos cruzados; péptido IIIa-sano: triángulo blanco invertido; 5G12-sano: cuadrados semirrellenos). No se pudo observar unión cuando los sueros de los pacientes o los controles se testaron en placas cubiertas con el péptido irrelevante p195-212 (p195-212-SLE: cuadrados cruzados; p195-212-sano: rombos semirrellenos). Los resultados indican una correlación entre la molécula de anticuerpo completa y los péptidos basados en CDR sobre los niveles de los títulos de anticuerpos.
Ejemplo 13 Proliferación de PBL de pacientes con SLE y controles sanos en presencia del mAb Id 16/6 humano y péptidos
Se aislaron los linfocitos de sangre periférica (PBL) de la sangre de pacientes con SLE o de controles sanos usando un gradiente en ficoll. Después de esto, se incubaron los PBL en presencia de diferentes concentraciones de los péptidos Ia, IIa o IIIa, o del mAb Id 16/6 humano durante 24 h, cuando se tomó una muestra para medir IL-2. El ensayo se continuó durante un total de 7 días, y se añadió ^{3}H-timidina durante las últimas 16 horas. La proliferación se detectó por la lectura de la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN de las células.
Como se observa en la tabla 4, una proporción menor de PBL tomados de pacientes con SLE reaccionaba con los péptidos o con el mAb Id 16/6, cuando se comparaba con los controles sanos. Los resultados se expresan en porcentaje del respondedor (34% en la primera línea) y el número real de pacientes (11 de 32: 11/32).
Se obtuvieron resultados similares cuando se testaron los niveles de IL-2 producidos por los PBL en presencia de los péptidos o del mAb Id 16/6, como se muestra en el siguiente ejemplo.
TABLA 4 Proliferación de PBL de pacientes con SLE y controles sanos en presencia del mAb Id 16/6 y los péptidos Ia-IIIa
10
Ejemplo 14 Producción de IL-2 por PBL de pacientes con SLE o controles sanos en presencia del mAb Id 16/6 humano y péptidos
Se aisló PBL de sangre de pacientes con SLE y de controles sanos usando un gradiente de ficoll, y se incubaron como en el ejemplo 13. Se tomó una muestra de 50 \mul 24 h después del comienzo del ensayo y se incubó en presencia de células sensibles a IL-2 (CTLD) durante 24 h, tras lo cual se añadió ^{3}H-timidina durante 16 h, y las placas se recogieron y se contaron en un contador beta.
Al igual que en la tabla 4, también se puede observar en la tabla 5 que una proporción menor de los PBL tomados de pacientes con SLE reaccionaba con los péptidos o con el mAb Id 16/6, cuando se comparaba con los controles sanos, indicando, así, que la respuesta al péptido corresponde a la de las células T del paciente a los autoanticuerpos humanos patogénicos.
TABLA 5 Producción de IL-2 por PBL de pacientes con SLE y controles sanos en presencia del mAb Id 16/6 y los péptidos Ia-IIIa
11
Referencias
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3. Fricke, H., Offen, D., Mendlovic, S., Shoenfeld, Y., Bakimer, R., Sperling, J. and Mozes, E. Internatl. Immunol. 2: 225, 1990.
4. Fricke, H., Mendlovic, S., Blank, M., Shoenfeld, Y., Ben-Bassat, M. and Mozes, E. Immunology 73: 421, 1991.
5. Mendlovic, S., Brocke, S., Shoenfeld, Y., Ben-Bassat, M., Meshorer, A., Bakimer, R. and Mozes, E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2260, 1988.
6. Mendlovic, S., Fricke, H., Shoenfeld, Y. and Mozes E. Eur. J. Immunol. 19: 729, 1989.
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9. Ruiz, P.J., Zinger, H. and Mozes, E. Immunol. Lett. 41: 79, 1994.
10. Shoenfeld, Y., Isenberg, D.A., Rauch, J., Madaio, M.P., Stollar, B.D. and Schwartz, R.S.J. Exp. Med 158: 718, 1983.
11. Sthoeger, Z.M., Tartakovsky, B., Bentwich, Z. and Mozes, E.J. Clin. Immunol. 13: 127, 1993.
12. Waisman, A., Mendlovic, S., Ruiz, P.J., Zinger, H., Meshorer, A. and Mozes, E. Internal. Immunol. 5: 1293, 1993.
13. Waisman, A. and Mozes, E. Eur. J. Immunol. 23: 1566, 1993.
14. Zisman, E., Sela, M. and Mozes. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9738, 1991.
15. Zamvil et al., J. Exp. Med. 167: 1586, 1988.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: P. O. Box 95
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rehovot
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Israel
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 76100
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 011-972-8-470618
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 011-972-8-470739
\vskip0.333000\baselineskip
(I)
TELEX: 381300
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MOZES, Edna
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 51 Hanassi Harishon Street
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rehovot
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Israel
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 76303
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: WAISMAN, Ari
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 29B Maze Street
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Tel-Aviv
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Israel
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 65214
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RYCUS, Avigail
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 16 Kipnis Street
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rehovot
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Israel
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 76305
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS SINTÉTICOS Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN PARA EL TRATAMIENTO DEL LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (SLE)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: IL 113, 159
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 DE MARZO DE 1995
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= Xaa en la posición 5 es Met, Ala o Val; Xaa en la posición 6 es Gln, Asp, Glu, o Arg; Xaa en la posición 7 es Trp o Ala; Xaa en la posición 8 es Val o Ser; y Xaa en la posición 9 es Lys, Glu o Ala.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu}
\sac{Glu Trp Ile Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= Xaa en la posición 9 es Thr, Val o Ala; Xaa en la posición 10 es Thr, Val o Ala; Xaa en la posición 11 es Tyr o Phe; Xaa en la posición 12 es Asn, o Asp; Xaa en la posición 13 es Gln o Glu; Xaa en la posición 14 es Lys o Glu; y Xaa en la posición 15 es Phe o Tyr.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys}
\sac{Ala Lys Ala Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= Xaa en la posición 6 es Phe, Thr o Gly; Xaa en la posición 7 es Leu, Ala o Ser; Xaa en la posición 8 es Trp o Ala; Xaa en la posición 9 es Glu o Lys; Xaa en la posición 13 es Met o Ala; y Xaa en la posición 14 es Asp, Lys o Ser.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Ala Xaa Xaa Tyr Trp}
\sac{Gly Gln Gly Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= Xaa en la posición 4 es Met, o Ala; Xaa en la posición 5 es Asn, Asp o Arg; Xaa en la posición 6 es Trp o Ala; Xaa en la posición 7 es Val o Ser; Xaa en la posición 8 es Lys o Glu; Xaa en la posición 9 es Gln o Ala; Xaa en la posición 13 es Lys o Glu; y Xaa en la posición 14 es Ser o Ala.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser His Gly Xaa Xaa Leu Glu}
\sac{Trp Ile Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= Xaa en la posición 6 es Ser, o Phe; Xaa en la posición 7 es Gly o Ala; Xaa en la posición 8 es Arg, Ala o Glu; Xaa en la posición 11 es Asn o Asp; Xaa en la posición 12 es Tyr o Phe; y Xaa en la posición 14 es Trp, His o Ala.
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gln Gly}
\sac{Thr Leu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu}
\sac{Glu Trp Ile Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys}
\sac{Ala Lys Ala Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Cyr Ala Arg Phe Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp}
\sac{Gly Gln Gly Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu}
\sac{Trp Ile Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr}
\sac{Leu}

Claims (14)

1. Un péptido sintético seleccionado del grupo formado por:
(i) un péptido de como mínimo 12 y como máximo 30 restos de aminoácidos que comprende una secuencia que incluye una región determinante de complementariedad (CDR) que se encuentra en la cadena pesada o ligera de un anticuerpo monoclonal anti-ADN patogénico que induce una enfermedad semejante al lupus eritematoso sistémico (SLE), o un sal de él o un derivado químico de él;
(ii) un péptido sintético doble que comprende los dos péptidos de (i) unidos covalentemente el uno al otro directamente o a través de una corta cadena de unión;
(iii) un polímero peptídico que comprende numerosas secuencias de dicho péptido (i); y
(iv) un polímero peptídico (iii) unido a un vehículo macromolecular.
2. Un péptido sintético según la reivindicación 1, que tiene una secuencia Ia de fórmula:
12
3. Un péptido sintético según la reivindicación 1, que tiene una secuencia IIa de fórmula:
13
4. Un péptido sintético según la reivindicación 1, que tiene una secuencia IIIa de fórmula:
14
5. Un péptido sintético según la reivindicación 1, que tiene una secuencia IVa de fórmula:
15
6. Un péptido sintético según la reivindicación 1, que tiene una secuencia Va de fórmula:
16
7. Un péptido sintético doble según la reivindicación 1, en el que se unen covalentemente dos secuencias diferentes de los péptidos Ia a Va.
8. Un polímero peptídico según la reivindicación 1, que contiene numerosas secuencias idénticas seleccionadas a partir de las secuencias Ia a Va.
9. Una composición farmacéutica que comprende un péptido sintético o un polímero peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una mezcla de al menos dos péptidos diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. El uso de un péptido sintético o un polímero peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una mezcla de al menos dos péptidos diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
11. Un método de selección de péptidos capaces de inhibir la respuesta proliferativa de linfocitos T de un paciente con lupus eritematoso sistémico (SLE), que comprende:
(i) sintetizar un péptido según la reivindicación 1 (i);
(ii) testar la capacidad de dicho péptido para inhibir la respuesta proliferativa de linfocitos T de un paciente con SLE, o una línea celular o clon T que es específico para el anticuerpo monoclonal Id 16/6 anti-ADN para el cual las células T son específicas; y
(iii) seleccionar y producir dicho péptido sólo si es capaz de inhibir dicha respuesta proliferativa.
12. Una composición farmacéutica que comprende un péptido sintético o un polímero peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una mezcla de al menos dos péptidos diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. El uso de un péptido o un polímero peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una mezcla de al menos dos péptidos diferentes según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
14. Un método de selección de péptidos capaces de inhibir la respuesta proliferativa de linfocitos T de un paciente con SLE, que comprende:
(i) sintetizar un péptido de como mínimo 12 y como máximo 30 restos de aminoácidos, con una secuencia basada en la región CDR de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo monoclonal anti-ADN patogénico que induce una enfermedad semejante al SLE en ratones, o un análogo de él;
(ii) testar la capacidad de dicho péptido o análogo para inhibir la respuesta proliferativa de células T de un paciente con SLE, o una línea celular o clon T que es específico para el anticuerpo monoclonal Id 16/6 anti-ADN para el cual las células T son específicas; y
(iii) seleccionar y producir dicho péptido sólo si es capaz de inhibir dicha respuesta proliferativa.
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ES2606464T3 (es) * 2003-01-14 2017-03-24 Yeda Research And Development Co. Formulaciones parenterales de péptidos para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico
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CA2572765C (en) 2004-07-08 2013-05-21 Amgen Inc. Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen
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