JP2931609B2 - 触媒抗体を使用する治療方法 - Google Patents

触媒抗体を使用する治療方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般にインビボ生体分子内における特定の
結合の開裂速度または形成速度を増加させることによつ
て、生物学的機能における変化を得る方法に関する。さ
らに特に、本発明はタンパク質内の特定のアミド結合、
ペプチド結合またはエステル結合の開裂速度または形成
速度を増加させることができる抗体を、動物中に導入す
ることによつて、あるいは所望の速度増加性抗体を誘発
させる免疫原を動物に導入することによつて、これらの
開裂速度または形成速度を増加させることに関する。
本出願は、1983年11月29日付で出願された米国出願Se
r.No.556,016の継続出願である、1984年11月27日付で出
願された米国出願Ser.No.674,253の継続出願である、19
88年５月４日付で出願された米国出願Ser.No.190,271の
継続出願であり、これらの出願の内容を、ここに引用し
て、本明細書に組入れる。
本明細書中に、カツコ内のアラビア数字によつて、い
くつかの刊行物が引用されている。これらの刊行物の完
全名は本明細書の終りで、請求の範囲の直前に見い出さ
れる。これらの刊行物には、本発明が属する技術の水準
および本発明それ自体の或る局面が、さらに充分に記載
されている。
発明の背景 種々の化学反応を触媒することができる多くの酵素が
同定されている。同様に、種々の化学反応を触媒させる
ために、抵抗を誘発させることができることが発見され
ている（米国出願Ser.No.674,253）。抗体と酵素とが他
の分子に結合するタンパク質を特異化するという基本的
類似性を共有することは、よく知られている。しかしな
がら、抗体と酵素との間には、重要な生理学的差違が存
在する。
抗体は典型的に、分子または抗原に結合し、この抗体
を産生した有機体に対し、抗原を異物としてマークす
る。抗体の抗原に対する結合は、有機体からの抗原の分
離を可能にする。酵素は、分子または基質を含む反応の
活性エネルギーを低下させ、これによつて、その反応の
速度を増加させるような方法で、分子を結合させる生物
学的触媒である。
リノス ポーリング（Linus Pauling）は、タンパク
質とこれらのタンパク質を結合する分子との間の相互反
応には２種のタイプがあるという仮説を立てた。抗体
は、それらの基底状態で、最も強く分子に結合するのに
対し、酵素は、より高いエネルギー状態で、最も強く分
子に結合する。
ポーリングは、このような結合にもとづいて、酵素触
媒のメカニズムを説明しようとした。化学反応の進行期
間中では、反応体は、反応体または生成物のどちらより
も、エネルギー的に好ましくない中間構造または遷移状
態を経る、１種または２種以上の遷移を受ける。ペプチ
ド架橋またはエステル結合の水性媒質中における加水分
解は正四面体炭素遷移状態を通過する。この遷移状態で
は、正四面体炭素原子が、ペプチド架橋またエステル結
合の酸部分の炭素原子に;2個の酸素原子（このうちの１
個はカルボニル基に相当し、他の１個は触媒中の水分子
またはヒドロキシルイオンに相当する）に；およびペプ
チド架橋のアミン部分の窒素原子またはエステルのアル
コール部分の酸素原子のうちのどちらかに、結合されて
いる。この遷移状態は、僅かに約10-13秒しか存在しな
いので、単離することも、あるいは検出することもでき
ない。
分子の分野で、この遷移状態は、結合の長さおよび結
合の角度、ならびに結合の形成および切断における変化
に反映する。遷移状態を得るために要するエネルギー
は、活性エネルギーと表わされ、このエネルギーは、遷
移状態のエネルギーと反応体のエネルギーとの間のエネ
ルギーの差であると考えることができる。ポーリングの
仮説によれば、酵素は遷移状態の反応体と好んで結合
し、酵素をその基質および生成物に対して安定にし、こ
の反応の活性エネルギーを減少させ、このようにして、
反応速度を増加させる。
この理論を拡大することによつて、ポーリングはま
た、遷移状態の安定な類似体は、酵素に堅く結合するこ
とを予言した。酵素による速度増加のいくつかの可能な
要因のうちの一つとしての基質のゆがみの検討におい
て、「遷移状態類似体」の用語を、この種の阻害物質を
説明するために使用できることが示唆された。
ポーリングの予言は、現在充分に確立されている、酵
素阻害物質のデザイン方法への基礎となつた。酵素阻害
物質をデザインするための作戦は、抗原を機能的原則に
もとづいてデザインし、この抗原デザインに含蓄されて
いる反応メカニズムを行なわせることによつて、このよ
うな抗原に応答して生じる抗体が化学反応を触媒すると
いう、触媒性抗体の調製戦略を示唆した。この戦略は、
数多く試みられている。
一例として、エステル結合開裂に係る遷移状態を擬装
する遷移状態類似体が触媒性エステラーゼとして作用す
るモノクローナル抗体の誘発に使用された（２）。詳細
に言えば、この誘発されたモノクローナル抗体は、酢酸
のアリールエステルの加水分解を15,000のフアクターで
加速した。
もう一つの例では分子内６員環環化遷移状態を擬装す
る遷移状態類似体が、立体特異的酵素様触媒として作用
するモノクローナル抗体の誘発に使用された（３）。詳
細に言えば、このようにして誘発されたモノクローナル
抗体は、相当するラセミ体形δ−ヒドロキシエステルか
らのδ−ラクトンの１個だけのエナンチオマーの形成
を、約800フアクターまで加速した。
同様に、アリールアミド類の加水分解における遷移状
態の類似体としてデザインされた、モノアリールホスホ
ンアミデートエステルが、アリールアミド類の加水分解
を触媒することができる、特異的モノクローナル抗体の
誘発のためのハプテンとして合成され、使用された
（４）。或る種の誘発抗体は、特定のアリールエステル
の加水分解に対して、触媒性でかつまた選択性であり、
250,000の速度加速をもたらすことが見い出され、報告
されている。
アミドまたはエステルリガンドの加水分解の遷移状態
の形態に実質的に相当する形態を有し、抗体の産生に使
用されている、ホスホンアミデート類またはホスホネー
ト類似体リガンドは、Tramontano等に対する米国特許第
4,659,567号（Tramontano）に記載されている。その記
載によれば、このようにして産生された抗体は、このリ
ガンドのエステル加水分解遷移状態の正四面体炭素原子
に結合し、この原子を安定にし、このリガンドを予め定
められた部位で加水分解させるというパラトープ（para
tope）を含有している。
エステルおよびアミドの加水分解のための、抗体触媒
の生成に使用することができる類似体−リガンドはま
た、Kollmorgen Corpのヨーロッパ特許出願0,251,093
（Kollmorgen）に記載されている。
タンパンク質遷移状態類似体内の遷移状態の安定性を
最高にし、かつまた原子関係を最適にし、それによつて
酵素触媒の２種の劇的効果、すなわち分子認識および速
度加速を生じさせることができる抗体を誘発させること
ができる類似体リガンドが合理的なデザイン手法に従つ
てデザインされている。触媒性抗体を産生するための、
抗原、免疫原および免疫学的方法は、共通して譲渡され
た、1988年５月４日出願の親出願Ser.No.190,271（この
出願の内容をここに引用して組入れる）および本出願と
同一日付で出願された、ともに我々自身による出願Ser.
No. （この出願の内容をここに引用し
て組入れる）に記載されている。
ペプチドに対して生じた抵抗は、このペウチドが完全
タンパク質内に位置している場合には、同一配列で結合
させることができることは知られている。たとえば、腫
瘍壊死因子（TNF）のアミノ酸１〜15よりなるペプチド
に対して誘発された抗体は生体腫瘍壊死因子に結合させ
ることができ、結合すると、細胞表面レセプターとのそ
の相互反応を阻止する（１）。同様に、HIVからのgp120
コートタンパク質のアミノ酸よりなるペプチドに対する
抗体は、完全ウイルスと交さ反応し、ウイルスとその細
胞レセプターとの相互反応を阻止する（２）。もう一つ
の例では、鶏卵リゾチームのアミノ酸67〜83よりなるペ
プチドに対して生成させたモノクローナル抗体は完全タ
ンパク質と交さ反応することができ、かつまた、エピト
ープ内の配列が実質的に同一である他の家禽種のリゾチ
ームを認識することができる（３）。
触媒性抗体の調製方法は開示されているが、そしてま
た、非触媒性抗体を、対象の抗原または基質に結合する
方法は開示されているが、従来技術の中で、選ばれる標
的生体分子に対する、速度増加性抗体を使用する治療方
法を提供するものはない。さらにまた、或る種の望まし
くないタンパク質、たとえば腫瘍壊死因子の生物学的作
用を減少させるか、または別の様相で制御する方法は、
従来技術によつて提供されていないし、またアレルギー
症状の軽減、HIVウイルスの感染性の減少、高血圧の作
用の減少、ならびに或る種の生体分子の開裂または形成
によつて制御することができるその他の疾患および生理
学的症状の減少をもたらす方法は従来技術によつて提供
されていない。従来技術はまた、プロドラツグ（prodru
g）から、活性医薬形態を放出させるために、触媒を使
用するプロドラツグの活性化方法を提供していない。
発明の目的 本発明の目的は、生体分子内の特定のアミド、ペプチ
ド、エステルまたはグリコシド結合のインビボ開裂また
は形成の速度を増加させる方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、本発明による合論的デザ
インによつて調製される速度増加性抗体を、動物に導入
することにより、特定の結合のインビボ開裂または形成
の速度を増加させる方法を提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は、動物の免疫系に作
用することによつて、生体分子内の特定のアミド、ヘプ
チド、エステルまたはグリコシド結合のインビボ開裂ま
たは形成の速度を増加させる抗体を誘発させる抗原の有
効量を、動物に導入することによつて、これらの結合の
開裂または形成の速度を増加させる方法を提供すること
にある。
本発明のさらにもう一つの目的は、所望の生物学的活
性化をうることができるように、開裂または形成しよう
とする生体分子を特定し、次いで所望の速度増加抗体を
彪発させることができる適当な抗原を選択することを包
含する合理的デザイン方法によつて、特定の結合のイン
ビボ開裂または形成の速度を増加させることにより、動
物内における生物学的機能を活性化または不活性化する
ことにある。
本発明のさらにもう一つの、関連する目的は、所望の
開裂または形成をうることができる生体内分子内の或る
アミノ酸配列を同定し、アルゴリズムで記録することに
ある。
本発明のさらにもう一つの目的は、ワクチンに類似し
ており、動物の免疫系に所望の触媒性抗体を発現させる
抗原を提供することにあり、この抗体は生体分子に作用
して、その開裂速度を増加させ、生物学的機能の活性化
または不活性化を生じさせるものである。
本発明のさらにもう一つの目的は、インビボで、或る
種の生物学的機能を活性化または不活性化させること、
たとえばアレルギー性症状の軽減ウイルスの感染性の減
少、リポ多糖類の無毒性化、腫瘍壊死因子の作用の鎮静
化、およびヒトレニンの量の減少による高血圧の降下を
生じさせることにある。
本発明のさらに別の目的は、プロドラツグを活性化さ
せることにある。
発明の要旨 本発明のこれらのおよびその他の目的は、動物に速度
増加性抗体の有効量を導入することによつて、生体分子
内の特定のアミド、ペプチド、エステルまたはグリコシ
ド結合のインビボ開裂または形成の速度を増加させる方
法において達成される。この抗体は、先ず形成または開
裂しようとする生体分子を同定し、開裂または形成しよ
うとするこの生体分子内の特定の配列を、以下にさらに
詳細に説明する理論を使用することにより同定し、所望
の反応の速度を増加させる抗体を合理的にデザインする
ことによつて、得られる。
本発明のもう一つの態様においては、インビボで形成
または開裂させようとする生体分子が同定され、形成ま
たは開裂させる結合を含有する、その配列が種々の理論
によつて同定され、そして動物に導入されると、動物の
免疫系に作用することによつて、所望の機能を有する抗
体を誘発させる免疫原が合理的にデザインされる。
本発明はまた、或る種の生物学的状態および疾患症状
の処置、たとえば後天性免疫不全症候群の処置に関し、
この処置は、ウイルスコートタンパク質中の或るペプチ
ド結合の開裂速度を増加させることができる抗体の有効
量により、患者を処置することによつて、病因ウイルス
を阻害することによるものである。
本発明はまた、ヒト レニン中のペプチド結合の開裂
速度を増加させることによつて、ヒトレニンを阻害する
ことによる、高血圧症の処置方法にある。
本発明はまた、プロドラツグ内の或る種の結合の選択
的速度増加開裂させ、これにより、活性成分を放出させ
ることによる、プロドラツグの活性化方法にある。
本発明はまた、リポ多糖類内の結合を開裂させること
によつて、リポ多糖類を無毒化する方法、腫瘍壊死因子
の生物学的作用を減少させる方法、およびIgEを分裂さ
せ、これにより、IgEを不活性化することにより、アレ
ルギー症状を軽減させる方法にある。
図面の簡単な説明 本発明、ならびにその他の目的、特徴および利点は、
以下の詳細な説明を、添付図面を参照して読むことによ
つて、さらに明白に、かつまた充分に理解される。
第１図は、感染H9細胞内における、HIV−I p24gagの
クローンAHIV1.3の産生による投与量依存性阻害を示し
ており；そして 第２図は、HIV−１誘発細胞融合のクローンAHIV1.3、
AHIV1.6およびAHIV2.0による、投与量依存性阻害を示す
ものである。
発明の詳細な説明 用語の定義 その最も広い意味で、「抗原」の用語は、抗体の形成
を誘発させる分子であると定義される。本明細書で使用
するものとして、「抗原」の用語は、本発明に係る固有
の免疫原性を有するハプテンである分子、または適当な
カツプリング基によつて、キヤリア分子に結合されてい
る、本発明に係るハプテンを含む免疫原を意味する。キ
ヤリヤ分子は、たとえばキイホールリンペツト ヘモシ
アニン（Keyhole limpet hemocyanin＝KLH）、チログロ
ビン、チキン イムノグロブリン、オバルブミン、ウシ
血清アルブミン（BSA）、Ｔ−ヘレパーペプチドなどを
包含する。本明細書で使用されているものとして、「カ
ツプリング分子」の用語は、当技術で充分に知られてい
るバイオテクノロジイの交さ結合性反応剤（たとえば、
Pierce、Rockford、Illinaisから市販されている）を意
味し、たとえばTroutの試薬、ジスサクシニル基質など
を包含する。
「抗体」の用語は、全免疫グロブリンおよび抗原のた
めの結合部位を有するその断片を包含する。
本明細書で使用するものとして、「遷移状態類似体」
の用語は、加水分解遷移状態で存在するアミド結合また
はエステル結合とほとんど同一の、もしくはこれらの結
合を「擬装」する形状にデザインされている原子の配列
を意味する。
本明細書で使用するものとして、「ジペプチド類似
体」の用語は、遷移状態類似体の構造、または変形され
た基底状態、類似体の構造、または擬装するジペプチド
の位置と同様の位置にある、２個のアミノ酸の側鎖を有
する上記２種の類似体の要素（element）の構造を意味
する。換言すれば、ジペプチド類似体では、その２個の
アミノ酸間の正常のアミド結合（すなわち−CO−NH−）
が上記に定義されている原子の配列によつて置き換えら
れている。このジペプチド類似体の周囲に、追加のアミ
ノ酸残基を導入し、ポリペプチドを形成することができ
る。すなわち、ジペプチド類似体は、基質分子内の開裂
標的のペプチド結合を置き換える。このジペプチド類似
体の周囲の分子は、ペプチド結合架橋を含有し、この架
橋は、天然生成Ｃ＝Ｏ基がNH,O,S,CH2,CF2またはＣ＝Ｓ
により置き換えられ、そして（または）天然生成NH基が
O,S,CH2,CF2,C＝ＯまたはＣ＝Ｓにより置き換えられる
ように、変えることができる。たとえば、この基は、そ
のアミド結合のＣ＝Ｏ基およびNH基が相互変換されてい
るレトロペプチドであることができる。
「若干または全部」の用語は、開裂させる、少なくと
も１個のアミド結合、エステル結合またはグリコシド結
合を有する標的分子の一部分または標的分子の全体を意
味する。たとえば、本発明の態様において、多くのアミ
ノ酸残基を有するポリペプチドよりなるタンパク質分子
中の特定のペプチド結合の開裂を触媒する抗体を誘発さ
せる目的のために、ハプテンをデザインする場合に、標
的ペプチド結合に相当するジペプチド類似体は約８個よ
り多くないアミノ酸残基によつて取り囲まれていること
が必要なだけである。しかしながら、標的分子が比較的
短鎖のペプチドである場合には、このペプチド結合類似
体は、標的分子中の全アミノ酸残基で取り囲まれている
と有利である。当業者は、所望の特異性、標的分子の種
類およびその他の因子が、ジペプチド類似体の包囲に必
要なアミノ酸残基の理想的な数を指示していることを認
識している。
「実質的に相当する」の用語は、開裂させる結合の類
似体を含有する抗原中の基に対し、変化および（また
は）サイズの点で類似している基を意味する。好ましく
は、これらの基は、サイズおよび変化の点で同一である
が、本発明のハプテンにおいて、このような同一性は必
須ではない。ハプテンは、１個または２個以上の不斉中
心を含有することができ、従つて、エナンチオマー形態
および（または）ジアステレオマー形態で存在すること
ができる。一般に、ハプテンは、ラセミ体形またはジア
ステレオマーの混合物の形で得られる。所望により、こ
れらの混合物を立体的に同種の成分に分離する技術で周
知の技法を使用することができる。純粋な状態の光学異
性体も、立体的に同種の出発物質を使用することによつ
て、調製することができる。
本明細書で使用するものとして、「ハプテン」の用語
は、エピトープとして動作することができる分子として
定義される。ハプテンは、開裂または形成しようとする
アミド結合、ペプチド結合、エステル結合またはグリコ
シド結合を含有する。
生理学的に許容される塩は、鉱酸の塩、たとえば塩
酸、硫酸、硝酸など、一塩基性カルボン酸の塩、たとえ
ば酢酸、プロピオン酸など、二塩基性カルボン酸の塩、
たとえばマレイン酸、フマール酸など、および三塩基性
カルボン酸の塩、たとえばクエン酸など、を包含する。
本明細書で使用するものとして、「天然産生アミノ
酸」の用語は、タンパク質中に見い出すことができる
か、または見い出すことができない、20個の必須アルフ
ア−アミノ酸およびその他のアルフア−アミノ酸を包含
する。これらのアミノ酸は、アラニン、アルギニン、ア
スパラキン、アスパラギン酸、システイン、グルタミ
ン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、リジン、メチオニン、フエニルアラニ
ン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、
チロシン、バリン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒド
ロキシセリン、エプシロン−Ｎ−メチルリジン、３−メ
チルヒスチジン、ベーター−アラニン、ガンマ−アミノ
酪酸、ホモシステイン、ホモセリン、シトルリン、オル
ニチン、カナバニン、ジエンコル酸およびベーターシア
ノアラニンを包含する。アミノ酸は、アミノ基、カルボ
キシル基、水素原子および「側鎖」と称される特殊な基
が結合している炭素原子よりなる。本明細書で使用する
ものとして、「側鎖の類似体」の用語は、天然産生アミ
ノ酸の側鎖であり、この天然産生側鎖中の１個または２
個以上の基は、天然産生基に実質的に相当する異なる１
個または２個以上の基により置き換えられている側鎖で
あると定義される。ヒドロキシ基を含有する、このよう
な側鎖は、グリコシル化されていてもよく、ホスホリル
化されていてもよく、スルホニル化されていてもよく、
あるいはヒドロキシ保護基により保護されていてもよ
い。いずれの側鎖中のヒドロキシ基も、いずれかの数
の、当技術で周知の適当なヒドロキシ保護基によつて保
護されていることができる。これらの保護基は、たとえ
ばtert−ブチル基を包含する。
「末端アミノ保護基」の用語は、ペプチドまたはアミ
ノ酸の末端アミノ基を保護することができるいずれかの
基を意味する。従つて、末端アミノ保護基は、アセチ
ル、スクシニル、ビフエニルカルボニル、ベンゾイル、
ｔ−ブチルオキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、
トシル、ダンシル、イソバレリル、フタリル、１−アダ
マンタンスルホニル、アセチミド、ベンズイミド、アミ
ジノ、カルバミルおよびその官能性同等基を包含する。
「末端カルボキシル保護基」の用語は、ペプチドまた
はアミノ酸の末端カルボキシル基を保護することができ
るいずれかの基を意味する。末端カルボキシル保護基
は、（C1〜C9）アルキル、フエニル、置換メチルエステ
ル、たとえばメトキシメチルおよびフエナシルエステ
ル、２−置換エチルエステル、たとえばシクロヘキシル
およびアリル、置換ベンジルエステル、たとえばパラ−
メトキシベンジルおよびパラ−プロモベンジル、アミ
ド、たとえばピペリジニルおよびヒドラシド、ならびに
その官能性同等基を包含する。
「生体分子」（biomolecule）の用語は、インビボま
たはインビトロで、生物学的系に関与するいずれかの分
子であると定義される。生体分子の例は、タンパンク
質、グリコタンパク質、ペプチド、ステロイド、核酸お
よびオリゴ多糖またはポリ多糖を包含する。ペプチド、
ステロイド、核酸などの合成有機同族体もまた、包含さ
れる。テオフイリン、カポテン、シクロスポリンなどの
ような医薬的に活性な物質もまた、生体分子であると考
えられる。
「アクセツシブル」（accessible）の用語は、抗体の
結合部位と結合することができることを意味する。
触媒性抗体（catalytic antibody）は、他の全部の条
件（たとえば、温度、反応体／基質温度など）が同一で
ある下で、化学反応の速度を変えることができ、該化学
反応中に入らず、従つて該反応で消耗されず、かつまた
１モルの触媒性抗体が多数モルの反応体／基質を変換す
ることができる抗体である。メカニズムの観点から、こ
の抗体は反応体／基質に結合し、この反応体／基質の生
成物への加速された変換に作用し、次いで生成物を放出
し、平衡位置を変えることなく、その化学反応の速度を
変える。前記の定義は理想的触媒の特徴である。しかし
ながら、実際には、最良の触媒でさえも、反応系内の、
あるいは反応の進行中の化学的または物理的分解の結果
としての、夾雑により、毒性にされるか、または不活性
化される。当技術で周知の理由によつて、触媒の真正な
動作は、反応系の成分によつて、あるいは反応環境の条
件によつて、不明であることもある。
化学量論的抗体は、化学反応の速度を化学量論的に増
加する、すなわち反応速度は増加するが、触媒性抗体と
は異なり、反応中に化学量論的に消耗される抗体であ
る。
治療作用に係る標的としての、生体分子およびその配列
の同定 触媒性モノクローナル抗体の報告されている例では、
当該抗体の特異性が得られている。これは触媒分子、基
質が、免疫原中にだけ存在する、遷移状態構造であるこ
とを除いて、免疫原と基本的に同一であるからである。
ここに、この試みを、免疫原またはハプテンのデザイン
にまで拡大し、その基質がさらに大きく、さらに複雑な
生物学的分子の一部分である場合に、その基質の反応を
触媒することができる触媒性抗体を誘発させることがで
きることが見い出された。
たとえば、オリゴペプチドハプテンのデザインにおい
て、遷移状態類似体は、ペプチダーゼ活性を有する触媒
性モノクローナル抗体の誘発を導く配列内のどこかに位
置している。この抗体の特異性は、この遷移状態類似体
構造の側面に位置するアミノ酸によつて決定される。こ
のようにして誘発される抗体は、ペプチドを特異的に加
水分解し、類似しているが、同一の配列または構造を有
していないペプチドは加水分解されない。このような触
媒性抗体はまた、そのペプチドがタンパク質の一部分で
ある場合に、そのヘプチドを加水分解するが、ただし
（ａ）問題のペプチド配列は、天然タンパク質中に存在
する場合には、触媒性抗体との結合に関してアクセツシ
ブルであり、すなわちそのエピトープが表面に位置して
おり、かつまた（ｂ）問題のペプチド配列がアクセツシ
ブルである場合には、その自由な基質活性形態におい
て、完全なオリゴペプチドによつて示されるタンパク質
中の構造を擬装することができるものである。
ここに、抗原デザインのプロセスを補助するために
は、生体分子内のペプチド、エステルまたはグリコシド
の結合を「アクセツシブル」（accessible）として、ま
たは「ノンアクセツシブル」（nonaccesible）として、
あるいは「表面」として、または「非表面」として、同
定するという理論を使用することができることが見い出
された。このような情報は種々の形で、かつまた種々の
正確度で入手することができる。第一に、生体分子の三
次元構造が既知である場合には、その構造の検討によつ
て、表面に位置するものと決定された領域は可能な抗原
として同定することができる。全ての発表されているタ
ンパク質構造の三次元構造は、Brookhavenデータベース
（４）に保存されており、容易に手に入れることがで
き、またその他の生体分子の三次元構造は、Cambridge
のデータベースに保存されている。
構造が判らない場合には、正確さは小さいが、類似の
情報を生体分子のコンピューターモデルまたは予想構造
を参考にして得ることができる。これは、対象の生体分
子が同族生体分子の一族の一部である場合に特に有用で
あり、この場合には、「知見にもとづく」予想（５）を
することができ、表面に位置する配列を同定することが
できる。
正確度が小さくても、生体分子に係る親水性プロフイ
ールをもたらすアルゴリズムを使用することができる。
生体分子内の、高い割合で親水性基または帯電基を有す
る領域はまた、表面位置になるものと見做される。
タンパク質鎖の切断が目的である場合には、或る種の
アミノ酸配列が好ましい標的である。たとえば、タンパ
ク質またはペプチド鎖中に存在する場合に、次のアミノ
酸の組合せ、ASN−GLY、ASN−PRO、ASP−GLYおよびASP
−PROを含有する配列は、接触切断の好ましい部位であ
る。同様に、グルタミン酸およびグルタミンを含有する
配列、すなわちGLN−ＸおよびGLU−Ｘ（Ｘはいずれかの
アミノ酸である）は好ましい切断部位である。
その他の情報が得られない場合には、タンパク質の切
断をデザインするための、さらに別の手段として、抗体
は、抗体とタンパク質との間の交さ反応性の領域が位置
している所まで、そのタンパク質配列に沿つて、種々の
ペプチドにレイズさせる（raised）、純粋に無作為の方
法に従う手段がある。
モノクローナル抗体技法を治療用途に使用するために
は、モノクローナル抗体をその抗原に結合せねばなら
ず、かつまたその抗原から解離してはならない。この抗
原は、可溶性タンパク質、ウイルスまたはその他の毒性
分子であることができ、あるいは細胞の表面であること
ができる。結合の後に、抗体−抗原複合物は、溶菌酵素
カスケードの活性化を誘発させるか、あるいは食細胞に
よつて排除される。
他方で、触媒性抗体は、基本的に異なるメカニズムで
動作する。触媒性抗体、プロテアーゼは、たとえばその
結合の部位でタンパク質を「切断」することができるの
で、その位置およびエピトープのデザインは、タンパク
質分解および引き続く、その目標、標的の生物学的機能
からの解離が不可逆的に失なわれるようなものでなけれ
ばならない。すなわち、HIVからのgp120のレセプター結
合領域内のエピトープに対して向けられる非触媒性抗体
は、このウイルスのそのCD4レセプターに対する結合を
阻害することができる（４）。この阻害は、大量の抗体
が、ウイルスとそのレセプターとの接触を防止すること
によつて生じる。
ウイルスの同一領域に対して向けられる触媒性抗体プ
ロテアーゼはまた、レセプター相互反応の消失を導くこ
とができるが、別の一組の出来事が後から生じる。プロ
テアーゼは、ウイルスタンク質鎖を切断した後に結合し
たままで残らないので、切断それ自体の作用が、結合の
消失を効果的に導かねばならない。このことは、必ず起
ることではない。たとえば、特定のペプチドの切断が、
レセプター結合活性を破壊するのに充分な、三次元構造
の開裂を導かないことがある。これに対して、レセプタ
ー結合領域から離れているエピトープ内のペプチド結合
のタンパク質分解が、タンパク質構造に対するその不安
定化作用によつて、感染性の消失を導くこともある。従
つて、触媒性抗体プロテアーゼは、単純な立体結合効果
を経て作用するものではないので、標的配列に対する根
本的に異なるデザイン方法を確立しなければならない。
この方法を如何に実行できるかを示す特別の例は以下に
記載する。
本発明の方法はまた、いくつかの生物学的機能の活性
化を導く、開裂を行うために使用することもできる。こ
のような反応には、ペプチド結合の開裂が含まれるが、
またエステル結合またはグリコシル結合あるいはその他
のタイプの結合が含まれる。
生物学的機能の活性化を導く生体分子の開裂の例の一
つに、インシユリン依存性糖尿病の処置がある。患者は
自分自身がインシユリンを注射する人である。この技術
では、循環器中に放出されると、天然の膵臓インシユリ
ンの放出の薬物動態学的挙動を擬装するインシユリン製
剤を要求する。インシユリンは、膵臓内に前駆形態のプ
ロインシユリンとして存在するが、この前駆形態の活性
はインシユリンそれ自体よりもかなりの大きさで低い。
プロインシユリンのインシユリンへの変換を導く、ペプ
チド結合に特異的な抗体プロテアーゼは、その動態学的
特性が、プロインシユリンおよび抗体プロテアーゼの注
射後に、インビボで、インシユリンの放出を可能にする
ようにデザインすることができる。これは、この場合の
薬物が天然タンパク質ホルモンである、プロドラツブ活
性化の例である。プロドラツグは、生物学的機能の活性
化を導く、かなりの治療的に活性な分子を含有すること
ができる。この前駆形態は、薬物の自然の修飾の利点を
有するか、またはそのいずれか適当な合成的修飾の利点
を有することができる。低活性（治療的に有益または毒
性）の適当な薬物誘導体が、適当な触媒性抗体で修飾さ
れることによつて、活性形態に変えられる。このプロセ
スの特定の例を以下に示す。
速度増加性抗体の調製および使用 速度増加性抗体、すなわち化学量論的および触媒的速
度増加体は、インビトロおよびインビボの両方の技術で
誘発させることができる。本明細書で使用するものとし
て、「誘発される」（elicited）の用語は、インビトロ
およびインビボ技術によつて、本発明による抗原による
触媒性抗体の誘発を意味する。しかしながら、インビト
ロ誘発が包含される場合には、本発明によるハプテンが
それら自体によつて、触媒性抗体の誘発に使用できるこ
とは当業者に容易に認識されることである。誘発がイン
ビボ技術によつて達成される場合には、適当なキヤリア
分子に複合されているハプテンよりなる免疫原が触媒性
抗体の誘発に使用されるものと理解される。抗原は、抗
体分子中に相当する超可変性結合領域を誘発させ、化学
反応、特に加水分解反応の遷移状態のための固有の結合
エネルギーを示すようにデザインされているハプテンを
含有する。この組合せ部位に生じるアミノ酸側鎖の配置
は、対象エピトープの化学的修飾を行なうために適応す
る。触媒効率における追加の改良は、部位指向突然変異
によつて得られる。
広く言えば、本発明の方法は、抗体を産生することが
できる細胞を抗原にさらし、これによつて、抗体産生性
細胞を生成させ；この抗体産生性細胞をミエローマ細胞
とハイブリツド形成させ、これによつて、それぞれがモ
ノクローナル抗体を産生する、複数のハイブリドーマ細
胞を生成させ；次いで複数のモノクローナル抗体をスク
リーニングし、対象の化学反応を触媒するモノクローナ
ル抗体を固定することよりなる。このようにして同定さ
れたモノクローナル抗体は次いで再びインビボまたはイ
ンビトロのどちらかの技法によつて、複製し、対象の化
学反応を触媒するのに、量的に充分の抗体を得ることが
できる。
所望の触媒活性および特異性を有する抗体の検出は、
ハイブリドーマが誘発された時点でこれらのハイブリド
ーマをスクリーリングすることによつて達成される。た
とえば、スクリーニングは、高速液体クロマトグラフイ
（HPLC）または分光測光法（ELISA）によつて達成する
ことができる。触媒性モノクローナル抗体は、1980年４
月１日付で発行された米国特許第4,196,265号に、Kopro
wski等により開示された技術の変法によつて、インビボ
で誘発させる。この特許の内容をここに組入れる。この
方法の詳細は当技術分野で知られている。特定の分子に
対する、一連のモノクローナル抗体は、適当な条件の下
に調製される。この方法は、先ずBALB/Cマウスに相当す
る抗原で免疫付与することを包含する。この抗原はペプ
チドまたはその他のキヤリア分子に結合させた本発明に
よるハプテンを含有する。
抗体産生性リンパ球を次いで、この免疫付与されたマ
ウスの脾臓から取り出し、SP2/O細胞のようなミエロー
マ細胞とハイブリツド形成させ、ハイブリドーマ細胞を
生成させる。これらのハイブリドーマ細胞を次いで微量
滴定板の凹部中に入れる。このハイブリドーマ細胞によ
つて産生される一連のモノクローナル抗体を、相応する
条件の下に所望の反応を触媒するモノクローナル抗体を
同定するために適する条件の下にスクリーニングする。
別法として、この培地は、免疫原に結合する抗体に係り
試験することができ、次いでこれらの抗体産生性ハイブ
リドーマを組織培養によつて増殖させるか、またはイン
ビボで増殖させる。スクリーニングは、微量滴定板凹部
から採取した培地の一定量で反応体の標準化溶液を処理
し、次いで慣用の装置を用いる方法によつて、所望の生
成物の存在を検出することにより、都合良く行なうこと
ができる。この検出は、たとえば分光測光法により、ま
たは気体−液体あるいは高圧液体クロマトグラフイによ
り、容易に行なうことができる。所望の生成物または反
応剤の標準化試料と比較することによつて、反応速度を
定量することができる。この方法で、触媒性モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含有する凹部
が同定される。選ばれたハイブリドーマ細胞は次いで、
培養し、コロニイを生成させる。
これらのコロニイは、インビトロまたはインビボ系で
さらに増殖させることができる。インビトロ系の場合に
は、同系BALB/Cマウスのようなマウスに、この選ばれた
ハイブリドーマ細胞を腹腔内接種し、次いで一般に２〜
３週間以内に腫瘍を生じさせる。これらの腫瘍は、所望
のモノクローナル抗体を含有する腹水の生成を伴なう。
モノクローナル抗体は次いで、限外濾過、超遠心分離、
透析およびイムノアフイニテイ クロマトグラフイなど
の慣用の方法によつて、この腹水から、別々に分離され
る。
この別々に採取されたモノクローナル抗体を、このモ
ノクローナル抗体と標的分子との間の複合物の形成を可
能にする適当な条件の下に、インビボで動物中に導入す
る。一般に、使用される触媒性抗体の濃度は、標的分子
の濃度と等しい濃度より少なくし、ピコモル範囲である
ことができる。この抗体は、インビボの正常な生理学的
条件の下に機能しなければならない。この複合物の形成
に適する条件は、対象として考えられている特定の分子
および抗体によつて変えることができることは当業者に
とつて明白である。
上記した方法のいずれによつても、産生される抗体
は、不動化細胞ラインを経て、インビトロで生成させる
こともできる。適当な形態の抗体（たとえば、「ヒト
化」（humanized.）マウスモノクローナル抗体）を、次
いで治療「薬物」として投与することができる。
化学反応の進行中に、反応剤は、反応剤または生成物
のどちらよりもエネルギー的に好ましくない構造を経
て、１種または２種以上の遷移を受ける。分子の観点
で、これらの遷移状態（または中間構造）は結合の長さ
および結合の角度、ならびに結合の形成および開裂にお
ける変化に反映する。遷移状態をうるために必要なエネ
ルギーは、活性化エネルギーと称され、これはまた、遷
移状態のエネルギーと反応剤のエネルギーとの間のエネ
ルギー差であると考えることもできる。
触媒は、この反応の活性化エネルギーを低下させるこ
とによつて、化学反応速度を増加させる。その抗原が、
中でも、予想される遷移状態構造（すなわち、遷移状態
類似体、変形された基底状態構造またはその両方）に似
ていることから選ばれる、抗原またはハプテンに対して
誘発される抗体は反応を触媒することができる。このよ
うにして産生される抗体は、反応剤および生成物に比較
して、遷移状態のエネルギーを安定化しなければならな
い。この方法は、いくつかの触媒性モノクローナル抗体
の発現において、充分に証明されている。
合理的にデザインされたハプテンにより誘発された触
媒性抗体は、これらが生体分子中の特定の部位に存在す
る或る構造配座の結合の開裂を触媒するだけに熟慮され
たデザインであることから、「部位特異性」である。同
様に、これらの触媒性抗体は、それらの末端に或る構造
配座を有する基の末端からの結合の形成を触媒するだけ
にデザインすることができる。従つて、本発明に従い合
理的にデザインされたハプテンは、生体分子内の特定の
部分に存在する結合を開裂させ、２種または３種以上の
開裂生成物を生成させることができる、部位特異性の触
媒性抗体の誘発に使用することができる。同一の抗体が
また、正しい構造配座を有するこれらの開裂生成物を接
続する、結合の形成を触媒することができる。
従つて、これらのハプテンは、種々の化学反応に係る
遷移状態を擬装するべくデザインされている。好ましく
は、反応は、ペプチド、エステル、アミドまたはグリコ
シドの結合の開裂または形成である。一例として、下記
のハプテンは、ジペプチド類似体〔CD〕ばかりでなく、
またサブサイトアミノ酸残基Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆを同時に有
する： これらのアブサイトアミノ酸残基は、環状構造および線
状構造の一部であることができる。サブサイト残基の最
適数は、抗体が結合する部位のサイズにより決定され
る。同様に、ペプチドに対する抗体の有効な結合に係る
唯一の必須要件は、抗体の抗原結合部位と結合させるペ
プチドの分子表面との間の補償が両方の形状および電荷
に関して維持されていることである。
ハプテンは、これらのハプテンに対して生成される抗
体が、アミド、ペプチド、エステルまたはグリコシドの
結合の開裂または形成において、高エネルギー中間状態
または遷移状態のうちの一つまたはいずれをも、選択的
に安定化することができるような方法でデザインされ
る。これらのハプテンは次の三種の一般的クラスに入
る：（１）アミド結合またはエステル結合の中の切断で
きる結合のカルボニル炭素に相当する原子のハイブリツ
ド形成がSP2ハイブリツド形成からSP3ハイブリツド形成
に変えられるもの；（２）アミド、エステルまたはグリ
コシドの結合に相当する原子のいずれかを、異なる原子
により置き換えるもの；および（３）アミド、エステル
またはグリコシドの結合に相当する原子が一環状系また
は二環状系の一部であるもの。
本発明の一態様に係る触媒性抗体によつて、加水分解
されること求められる結合部位にジペプチド類似体を含
有するペプチドの配列は、この触媒性抗体が天然タンパ
ク質において加水分解するであろう配列を定める。この
抗体の結合エネルギーは、配列特異性認識および対象の
天然タンパク質またはペプチドとの化学的反応の両方を
可能にするように分布させる。
全部の連続エピトープの証明には、８個より長いアミ
ノ酸残基を有するペプチド（オクタペプチド）を調製す
る必要はないことが報告されている（５）。抗体が再現
性様相でペプチドに結合することも証明されている
（６）。使用されるアミノ酸の光学異性が、ジペプチド
による抗体結合の強さおよび特異性に対して強力な影響
力を有することも確立されていることである。従つて、
免疫付与性抗原中に存在するＬおよびＤのアミノ酸残基
の重要性は、生じる抗体結合部位のカイラリテイに対す
る深遠な効果にある。本発明の一態様による、天然タン
パク質中の特定の配列（連続）の、または構築されたエ
ピトープ、タンパク質の測定できる性質とその免疫原性
部位との、関係に関して予め定められた特異性を有する
触媒性抗体は一般に、重要である（７）。タンパク質配
列が容易に利用できる場合には、最も広く使用されてい
るアルゴリズムは、親水性プロフイール中の極限的最高
の部位に、逐次（sequential）エピトープが見い出され
る可能性が強いという知見にもとづいている（８）。表
面アクセツシピリテイ プロフイール（９）およびタン
パク質の柔軟性（10）はまた、天然タンパク質の配列中
の抗原部位に関する情報を提供する。レセプター介在相
互反応またはその他の疾患を伴なうメカニズムにおけ
る、これらの部位の知見およびこれらのエピトープの重
要性によつて、これらの重要な「生物活性」エピトープ
内のシペプチド類似体を含有するペプチドハプテンを、
本発明に従いデザインすることができる。これらのハプ
テンによつて誘発される触媒性抗体は次いで、たとえば
ウイルスタンパク質または腫瘍由来増殖因子に対するエ
ピトープあるいは生命を脅かす状況に含まれるその他の
ペプチド（たとえば、最近種など中の腫瘍壊死因子）を
消化させるために、使用することができる。
すなわち、本発明に係るハプテンは、酵素触媒のメカ
ニズム上の特徴に係る知見から合理的にデザインされて
おり、触媒性が付与されている抗体結合部位を生成させ
るのに適する鋳型を提供する。従つて、分子を認識する
ことができ、かつまた触媒として機能することができる
抗体を提供するために必要な特徴の全部を組合せて有す
る。すなわち、式〔１〕で示される環状カルボハイドレ
ートハプテンは、以下に説明するように、典型的なＯ−
結合グリコシド〔３〕中のグリコシド結合の加水分解の
ための、提案された遷移状態〔２〕（11）の良好な擬装
体を提供する： 触媒性抗体は、たとえばウイルス感染の免疫治療法に
おいて、部位特異性タンパク質分解能力を有する。ウイ
ルスは、それらの外側コートタンパク質を利用し、細胞
レセプターに付着し、付着後に細胞を侵略する。たとえ
ば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、その表面に存在
するgp120タンパク質の一部を使用し、リンパ球上のCD4
レセプターに付着する。この細胞付着に係る配列は、ウ
イルスタンパク質上の領域に対してマツピングされてい
る。この情報を用いると、本発明によつて開示された方
法によつて、抗体を発現させ、このペプチド配列に結合
させ、次いでこれを、部位特異性方法で開裂させること
ができる。しかしながら、このような抗体は、線状配列
（これは変性タンパク質中に生じる）に結合するのでは
なく、タンパク質中の「天然」（native）の配列に結合
する。従つて、「天然」タンパク質中の抗原決定基また
はエピトープは、多くの場合に、ランダムな線状配置で
あるよりはむしろ、高次形態（すなわち、三次元形態）
である。ここで再び、タンパク質上のエピトープの知見
が、このようなエピトープの修飾を生じさせることがで
きるパラトープを有する抗体のデザインにおいて重要に
なる。従つて、ハプテンは、ランダムな形状であるより
はむしろ、エピトープの同一構造特徴を有するようにデ
ザインすることができる。これらの構造上の特徴は、単
純な線状ペプチドによつて適合させることができ、この
場合に、最低エネルギーコンホーマーは問題解決の好適
構造である。第二の構造特徴は、アミノ酸側鎖の交さ結
合または−ターン擬装体（−turn mimetics）の使用に
よつて導入することができる。天然タンパク質中のエピ
トープと両立する構造を組入れて、高次的に構築された
ハプテンは、触媒性抗体超可変性結合領域の三次元構造
内に正しいチーフを生じさせるために必須であることが
できる。高次に構築されたハプテンの利点は、これらが
タンパク質中で天然構造を擬装し、開裂を受け易いタン
パク質の領域を擬装する傾向を有することにある。
宿主細胞に侵入するために、特異的細胞レセプターを
使用するウイルスの、レセプター結合領域からの配列
で、変化する長さを有し、かつまたその配列中の必須領
域に遷移状態類似体ジペプチド同配体を有するオリゴペ
プチドは、場合により、適当なキヤリアタンパク質に結
合させた後に、免疫付与によつて、ウイルスコートタン
パク質を開裂させ、ウイルスの細胞への侵入を防ぐ、触
媒性抗体を誘発する。リノ14ウイルスおよびポリオ１ウ
イルスの粒子の次元構造は、Ｘ線走査によつて図に示さ
れている。細胞レセプターに対する結合部位である領域
は同定されている。Ｔ−リンパ球上のCD4レセプターと
の相互反応に必須の、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１
（HIV1）内の領域は、gp120コートタンパク質中の配列
に位置しており、マツピングされている。すなわち、本
発明の態様の一つにおいては、宿主細胞への付着に必須
の、ウイルスエンベロープタンパク質からの部分配列を
含有し、かつまた本発明によるハプテンから選ばれる遷
移状態ジペプチド同配体を含有するオリゴペプチドが使
用される。生成するペプチド類似体を使用し、感染に必
須のウイルスコートタンパク質のタンパク質分解性セグ
メント（エピトープ）によつて、ウイルスを不活性にす
る触媒性抗体を誘発させる。好ましくは、レトロウイル
ス、たとえばHIV I、HIV IIおよびピコリナウイルス、
たとえばリノ14、ウイルスポリペプチド、炎症性タンパ
ク質、アナフイラキシ性タンパク質、リンホカイン、サ
イタカイン、およびその他の宿主感染または毒性症候群
のポリペプチドメデイエーターからの配列を有するオリ
ゴペプチドが使用される。
本発明の抗原によつて誘発される触媒性抗体は自己免
疫疾患、癌およびトロンビン溶解性疾患の処置に有用で
あることができる。本発明の触媒性抗体はまた、高濃度
リポタンパク質を消失させることによつて、心臓血管系
疾患の処置に、およびまた、細菌性エンドトキシンの解
毒にも有用であることができる。
ワクチンとしての抗原の調製および使用 或る種の抗原的刺激に応答して、インビボで抗体を産
生する、身体それ自体の能力を発現させることによつ
て、利益をうることができることがまた見い出された。
特定の病原体に対する免疫応答が、不活性の形態の病原
体または病原体と交さ反応するペプチド、対抗抗体のど
ちらかを投与することによつて、感作することができる
方法は周知である。真の病原体に遭遇した場合に、正し
い抗体特異性を有する抗体産生性のＢ細胞はすでに存在
している。このような感作剤は、通常、ワクチンと称さ
れている（＿）。触媒性抗体を誘発させるために、同様
の方法を想定することができる。誘発させる特定の触媒
性抗体が組織的方法の一部である方法では、ハプテン
は、特定の位置における開裂のための遷移状態類似体を
含有するようにデザインする。このハプテンによる免疫
付与は次いで、或るＢ細胞を活性化し、その一部は触媒
的活性を有する抗体を産生する。「普通」の抗原（基
質）にさらされると、動物内の、この感作された細胞は
次いで、応答して、インビボで触媒性抗体を生じさせ
る。従つて、非経口投与の必要性が明らかになる。これ
らの「触媒性」ワクチンは、ウイルスおよびその他の病
原体、有毒薬剤、誤用薬剤、天然産生タンパク質、治療
的に有用なプロドラツグに対して活性を有する触媒性抗
体の活性化において、非常に一般的な用途を有する。
本発明を下記の代表例によりさらに充分に説明する。
これによつて、本発明はさらに充分に理解されるだろ
う。
例 １ ヒトレニンの「フラツプ」領域を開裂するモノクローナ
ル触媒性抗体の調製、スクリーニングおよび単離の方法 レニン−アンギオテンシン カスケード反応を開始さ
せる働きをするレニン、アスパラギン酸プロテイナーゼ
の阻害は近年の多の研究の目的であつた。レニン阻害に
よる高血圧症の処置能力は、天然基質のアンギオテンシ
ノ−ゲンのペプチド配列にもとづく、種々の強力なレニ
ン阻害剤の合成をもたらした。別の手段として、レニン
に対するタンパク質分解性抗体の使用がある。
ヒトレニンのフラツプ（flap）領域が、Thr85およびG
ly86のアミノ酸基と相互反応するTry83のカルボニル基
を導く、４個のアミノ酸残基のループ状領域を含む、ヘ
アピン状であることは報告されている（12）。環状デカ
ペプチドである。
ヒトレニンは、この同一ヘアピン構造を取ることが見
い出された。
この例では、本発明に従い、ジフルオロケトン含有免
疫原を用いて、モノクローナル抗体を誘発させる。この
モノクローナル抗体は、ヒトレニン分子中のペプチド配
列 における残基85と86との間の開裂を触媒するものと見做
される。残基85および86は、この基質を触媒性部位に保
持している「フラツプ」領域を構成しているので、この
開裂は、この酵素の触媒としての機能の破壊を生じさせ
る。合成ペプチド断片（配列81−90）に対して誘発され
たウサギ ポリクローナル抗血清が、合成ヒトテトラデ
カペプチド基質とのその反応によつて測定して、ヒトレ
ニン活性を40％まで抑制することができることは、すで
に証明されている（14）。
ヒトレニンのこのフラツプ領域に対する触媒性抗体を
生じさせるために、次式の環状ペプチドハプテンを合成
する： （式中、（TS）は、遷移状態類似体を表わす）。この例
では、この環状ペプチド ハプテン （式中、TS（TS）Ｇは、本発明に従う遷移状態類似体ト
リペプチドに相当する） を固定相法（15）に従つて合成し、このハプテンをその
無水物を経て、構築されたペプチド中に組入れる（1
5）。完成されるペプチドは、三フツ化酢酸を使用し、
その固体支持体から、充分に脱保護化し、分離する。
このペプチドの環化は、このペプチドを低濃度で１時
間、水溶液（pH8）中で放置し、２個の末端システイン
残基間のジスルフイド架橋を生じさせることによつて達
成される。このペプチドのＮ−末端アミノ基は、マウス
免疫付与のために、キヤリア タンパク質に結合させ
る。
A. 免疫原の調製 1. ペプチド合成 このペプチド ハプテンは、ポリアミ−キーゼルガー
複合樹脂を使用する固定相法によつて合成する（35）。
側鎖保護基には次のものがある:O−tert−ブチル（チロ
シン、グルタミン酸、セリン、スレオニン）;N−４−メ
トキシ−2,3,6−トリメチル ベンゼンスルホニル（ア
ルギニン）；およびＳ−トリチル（システイン）。Ｎ−
官能性基の一時的保護は、フルオレニルメトキシカルボ
ニルによつて行ない、この基は10分内に、ピペリジン/D
MF:20/80により分離する。カツプリング反応は、FMOC−
無水アミノ酸を用いて行なう（35）。保護されているペ
プチジル−樹脂は、三フツ化酢酸／チオアニソール/m−
クレゾール／チオフエノール／エタンジチオール溶液:9
0/2/2/2/4で、３時間処理することによつて、充分に脱
保護化させる。濾過後に、濾液を小容積にまで、減圧で
濃縮する。エーテルを加え、ペプチドの沈殿を得る。エ
ーテル性上澄液を除去し、ペプチドの沈殿をエーテルで
２回洗浄し、ペプチドハプテンを得る： （式中、カツコ内の部分は、ジフルオロケトン遷移状態
類似体トリペプチド イソステアである）。
2. ペプチド ハプテンの環化 このペプチド ハプテンを、その２個の末端システイ
ン残基間にジスルフイド結合を形成することによつて
「β−ヘアペン」形態に環化させる。このジスルフイド
結合は、ペプチド0.3mg/mlの濃度の水溶液（pH8）を空
気酸化させることによつて、１時間で完了する。酸化生
成物を次いで、凍結乾燥により分離し、次いでHPLCによ
り精製する。
3. キヤリア分子に対するハプテンの結合 この環状ペプチド ハプテン を、グルタルアルデヒドを使用して、キイーホール リ
ンペツト ヘモシアニン（KLH）に結合させる（36）。
カツプリング効率は、反応混合物に添加した、痕跡量の
I125ペプチドの結合により推定し、50〜80％である。
B. モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング 完全Freundアジユバント中のKLH結合ペプチド（50μ
ｇ）をBALB/Cマウスに注入する。融合相手としてSP2/O
ミエローマを使用して、標準的方法によつて、ハイブリ
ドーマ融合を行なう。この融合から生成する、ポリクロ
ーナル抗血清に応答するハイブリドーマ分泌細胞をELIS
Aにより、その結合活性に関してスクリーニングする。
プラステイツク製微量滴定板（Falcon3915 Probind.B
ecton Dickinson Labware CA、米国）の凹部にTris−HC
l緩衝液（0.1M,pH9.6）内のペプチド（５μg/ml）50μ
を付着させる。
この滴定板を、先ず37℃で30分間、次いで室温で一夜
にわたり、インキユベートする。Tween含有リン酸塩緩
衝塩類溶液（PBS−Tween0.1％,pH7.4）で３回洗浄した
後に、この抗血清のPBS−BSA1％（pH7.4）中の連続稀釈
物50μを、このペプチド付着させた一対の凹部に加
え、37℃で２時間インキユベートする。この滴定板を再
び、PBS−Tween0.1％で３回洗浄し、次いでこれらの凹
部を1:500に稀釈した、アルカリ性ホスフアターゼ・標
識ヤギ抗マウスIgG（Sigma.MO、米国）で処理する。37
℃で１時間のインキユベーシヨンを行なう。
PBS−Tween0.1％による洗浄をさらに長く行なつた後
に、MgCl2およびZnCl2、1mMを含有する、0.1Mグリシン
−NaOH緩衝液（pH10.4）中に溶解したアルカリ性ホスフ
アターゼ基質（Sigma104−105の２錠/10ml）105μと
ともに、インキユベートする。この酵素反応は、37℃で
２時間進行させ、Na2CO3（1.5M）50μＭの添加により止
める。
Titerteck Multiskan ELISAリーダー（Flow Laborato
ries）で、405nmにおいて、吸光値を読み取る。その力
価は、陰性対照（1:100に稀釈されている。採集正常マ
ウス血清よりなる）の３倍の高さの吸光値を与える最高
稀釈とこの光学濃度とを掛け算することによつて、測定
して決定する。
このスクリーニング検定において、陽性の反応を示す
ハイブリドーマを、後続の研究用に選択する。IgGは、B
akerbond ABx HPLCカラムを用いるHPLCによつて、腹水
から精製する。
C. ヒトレニンの「フラツプ」領域に対し特異性の触媒
性抗体によるペプチド開裂の触媒作用 デカペプチド基質（2.7μＭ） を、上記に概述した方法によつて産生された触媒性抗体
とともにインキユベートし、この反応を、混合物の逆相
HPLC分析によつて追跡する。この反応は、触媒性抗体に
よる高Kcatに最適のpHで行なう〔最適pHは、発色団ｐ−
ニトロアニリド基質： または螢光団クマリン基質： を使用し、そのPHで電荷を有する開裂部位のＣ末端部位
上の残基に対する、触媒性抗体の結合エネルギーを考慮
して、決定される〕。
このデカペプチド基質の開裂に関して、最良のkcat値
を示す抗体を、それらのヒトレニン阻害能力について試
験する。
D. ヒトレニンに対する、抗−遷移状態類似体抗体の結
合および「フラツプ」領域の残基85−86の開裂によるそ
の酵素活性の抑制 血漿レニン活性の阻害、すなわち触媒性抗体のレニン
活性阻害能力、を高レニン活性（アンギオテンシンI 40
ng/時間/ml）を有する一団のヒト血漿で試験する。血漿
（25μ）は、１％EDTAを含有するPBS（pH7.5）100μ
とともに種々の時間の間、予備インキユベートする
（最終容積0.2ml）。次いで、ゼロ−オーダー挙動を確
保するために、過剰量の血漿レニン基質（200pmol）を
加え、この混合物をPBS（pH5.7）中で37℃において、30
分間インキユベートする。この触媒性抗体の最終稀釈度
は1:5および1:50である。生成されるアンギオテンシン
Ｉは、ラジオイムノアツセイ（17）によつて測定する。
ブランクは、相当するアブザイム（abzymes）の同一稀
釈物の使用を包含する。生じるアンギオテンシンＩの量
は、完全レニンで見い出される量よりも少なく、このこ
とは、フラツプ領域中の残基85−86の開裂および阻害を
示している。
例 ２ HIV gp120コートタンパク質からの免疫原性遷移状態類
似体含有ペプチドのインビボ調製 HIV gp120コートタンパク質からのオクタペプチド配
列−Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Tyr−は、T4
ヘルパー／インデューサー細胞のOKT4抗原とのウイルス
相互反応に関して重要である。このオクタペプチドと、
配列上で同一であるか、または非常に類似している合成
ペプチドは、HIVの抗原レセプターに対する付着を強力
に阻害する（18）。コンピューター推定調査によつて、
Epstein−Barrウイルスのエンベロープ領域に見い出さ
れるペプチドと相同であることが証明された。さらに、
強力な相同関係が、HIVオクタペプチドとヒトリンホア
デノパシイウイルス（LAV）およびヒトＴ細胞白血病ウ
イルス（HTLV−III b）の単離物中に生じるペプチドと
の間に存在する。もう一つの相同関係が、HIVペプチド
とウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（RNase A）の残基19−2
6よりなる配列との間に存在する。この配列は、残基20
と21および21と22との間のRNase Aの露出されたサブチ
リシン開裂部位を含有する。
本発明によるペプチドハプテンには、 がある。Ａが開裂させるアミド結合の類似体である遷移
状態ジペプチド イソステア（isostere）（カツコ内に
示されている部分）を、例１に記載されているように、
ペプチド中に組入れる。各ペプチド ハプテンを、交さ
結合剤ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドＢを使用し、末端システイン残基を介して、
キイホール リンペツト ヘモシアニン（KLH）キヤリ
ア タンパク質とカツプリングさせる（20）。
B. モノクロナール抗体の調製 BALB/Cマウスを、完全Ereundアジユバント中に乳化し
たKLH−ペプチド類似体結合物で免疫付与する。各マウ
スから血液試料を採取し、遠心分離により血清を分離
し、４℃で保存する。この方法で得られた血清を、標準
的ELISA法によつて、元の遷移状態類似体免疫原に対す
る結合活性に関してスクリーニングする。上記のように
して免疫付与されており、遷移状態類似体ペプチド免疫
原との反応性が検出された抗体を産生するマウスを犠牲
にし、それらの脾臓を分離し、例1Bに上記したように、
SP2/Oミエローマ細胞を使用し、ハイブリドーマ細胞を
調製する。
C. 触媒性モノクローナル抗体産生性のハイブリドーマ
細胞のスクリーニング 各遷移状態類似体含有ペプチドに対する抗体の結合に
関するスクリーニングは、基本的に、上記例１に記載の
とおりに行なう。モノクローナル抗体を分泌し、陽性の
結合反応を示すハイブリドーマを、Brakerbond AB X HP
LCによるHPLCによつて、腹水から精製する。
例 ３ ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）を選択的に阻害する、
ウイルス エピトープに対する触媒性モノクローナル抗
体のインビトロ誘発 A. 免疫原の調製 ジペプチド遷移状態同配体： （色中、Ａは、開裂させるアミド結合の類似体である）
を、例１に記載されているように、ペプチド中に組入
れ、ハプテン： を得る。生成するハプテンは、HIV gp120コートタンパ
ク質の一部を擬装するようにデザインされている。この
合成ペプチドを、刊行物記載（21）の方法の変法を用い
るインビトロ免疫付与法で使用する。脾臓細胞を、50％
新鮮イーグルMEMおよび20％ウシ胎児血清、５×10-5M
β−メルカプタノール、2mMグルタミンおよびBLAB/Cマ
ウス胸腺リンパ球からの50％条件調整培地よりなる培地
中で、106細胞/mlで培養する。条件調整培地を供給する
ためには、胸腺リンパ球を、上記と同一のEales MEM培
地中で、３〜５×106細胞/mlで培養する。48〜72時間後
に、この培地を分離し、濾過により殺菌し、次いでイン
ビトロ活性化用に、直ちに使用する。この脾臓細胞培養
培地に、抗原を、約１μｇペプチド/mlに等しい濃度で
加える。脾臓細胞を、培地を変えることなく、抗原の存
在の下に４日間培養し、次いでハイブリツド形成させ
る。
ハイブリツド形成は、Cell Distribution Center of
the Salk Instituteから得られるマウス プラズマサイ
トーマ（plasmacytoma）セルライン45 6TGL.7（22）を
用いて行なう。脾臓細胞（新しく単離したものである
か、あるいはインビトロ活性化培地からのものかのどち
らか）およびプラズマサイトーマ細胞は、血清を含有し
ていないEagles MEM中で２回洗浄し、次いで刊行物（4
3）に従来開示されているように、PEG100を用いて融合
させる。ハイブリツドは、この培養物をHATで処理する
ことによつて選択する（44）。このペプチド遷移状態類
似体と反応性の（ELISA検定によつて判定する）、抗体
を産生するハイブリツド細胞をクローン化し、次いで条
件調製培地中で親のプラズマサイトーマ細胞から制限稀
釈により、再−クローン化する。
各遷移状態類似体含有ペプチドに対する結合に関する
抗体のスクリーニングは、基本的に、上記例６に記載の
とおりに行なう。陽性の結合反応を示す、モノクローナ
ル抗体分泌性ハイブリドーマを後続の研究用に選別す
る。IgGは、Bakerbond ABX HPLCによるHPLCによつて、
腹水から精製する。これらの抗体を、遷移状類似体を含
有していないペプチドに対して試験できることは、当業
者の認識できることである。
基本的に刊行物（25）の記載に従うが、培養物を200
μ含有マイクロチユーブ凹部で増殖させて、ウイルス
複製検定を行なう。インビトロ免疫付与法から、あるい
は緩衝液だけから得られた、精製抗体、各25μ中の勾
配濃度を、25μ中の50TCID50HTLV−III Bとともに、
５％CO2中で、37℃において１時間、予備インキユベー
トする。予備インキユベーシヨンに引続いて、これらの
凹部に、H9細胞（20％熱−不活性化したFCSを補給され
ているRPM1−040 150μ中の細胞１×105）を加え、
0.1μg/ml〜10μg/mlの範囲の最終抗体濃度を生成す
る。微量滴定板を、５％CO2中で37℃において14日間イ
ンキユベートする。３日目、７日目および10日目に、細
胞を含有していない上澄液100μを新しい培地と交替
することによつて、これらの細胞を飼育する。抗体はこ
の期間中はさらに加えない。細胞を含有していない上澄
液（100μ）を、RIA CDupont、NEK−040）によりp24
抗原に関して分析する。
C8166融合検定法は、刊行物（46）に記載されてい
る。３種のモノクローナル抗体（クローンAHIV1.6;AHIV
1.3およびAHIV2.0）を２時間検定で試験する。HTLV−II
I Bでクローン形成感染させたH9細胞（１×104）を、96
個の凹部を有する板において、150μ培地中の種々の
濃度の抗体とともに予備インキユベートする。抗体の最
終凹部濃度は、41μg/mlおよび５μg/mである。対照と
しては、OKT4A（Ortho Diagnostics）を25μg/mlで用い
る予備インキユベーシヨンを使用する。この板を、５％
CO2中で、37℃において２時間インキユベートした後
に、融合細胞（細胞質は、３個のリンパ細胞の径よりも
大きく膨脹する）の数を測定する。計数期間中の偏りを
防ぐために、試料には、コード番号を付ける。
クローンAHIV1.3、AHIV1.6およびAHIV2.0の抗ウイル
ス活性をHIV−Ｉ複製および細胞融合検定によつて評価
する。第１図は、感染H9細胞におけるHIV−1p.24gag産
生のクローンAHIV1.3による、投与量依存性阻害を示す
ものである。第２図には、HIV−誘発細胞融合のクロー
ンAHIV1.3、AHIV1.6およびAHIV2.0による投与量依存性
阻害が示されている。
HIV gp120の露出ペプチド配列中に組込まれている、
インビトロ免疫付与により誘発された触媒性モノクロー
ナル抗体は、リンパ球のCD4レセプターへの結合を含
む、ウイルス コプロテインの重要な領域を破裂させる
ことによつて、HIVウイルスによる感染を防止すること
ができる。この触媒性モノクローナル抗体は、タンパク
質分解酵素の作用と類似の様相で、選ばれた配列（すな
わち、例２に示されているオクタペプチドの左側から、
初めて２個のスレオニン残基の間）のヘプチド結合を切
断する。このオクタペプチドの抗体触媒加水分解のメカ
ニズムは、金属イオンを含むものではなく、抗体の活性
部位における求核性あるいは抗体結合部位のアミノ酸残
基により活性化された水の求核的付加のどちらかも含む
ものと見做れる。
例 ４ 腫瘍壊死因子を標的とするアブザイムプロテアーゼの調
製 腫瘍壊死因子（TNF）は活性化されたマクロフアージ
により分泌されるサイトカインである。TNFは、エンド
トキシン−誘発発作、プレアジポサイト（preadipocyt
e）におけるリポタンパク質リパーゼ（LPL）活性の抑
圧、滑液細胞によるプロスタブランジンE2産生およびコ
ラゲナーゼ活性の刺激、インタ−ロイキン１産生の刺激
およびヌードマウスにおけるカヘキシーの誘発を包含す
る、種々の生物学的作用を媒介するものであることが証
明されている。TNF特異性の細胞表面レセプターは、数
種のタイプの細胞に存在する。これらのレセプターに対
するTNFの結合が、TNFの生物学的作用の誘発に必要であ
ると考えられている。hTNFのアミノ酸１−15に対する抗
体が細胞表面レセプターに対するその結合を防止するこ
とは証明されている（Socher等によるRroc.Natl.Acad.S
oi.米国、1987年、84、8829〜8833頁）。hTNFのＮ−末
端の８個のアミノ酸が、レセプター認識に対して必要な
いことも知られている。従つて、レセプター結合のため
の必須の領域は残基９−15を包含することができる。下
記の式は、TNFのＮ末端の25個のアミノ酸、必須残基９
−15（大）および準安定部位NP,Asm−Proを示すもので
ある： この遷移状態ジペプチド イソステアを含有するペプチ
ド類似体の合成を、基本的に、例１にすでに記載されて
いる方法に従つて行なう。免疫原調製、免疫付与および
触媒性抗体のスクリーニングは基本的に、前記されてい
る通りに行なうが、バイオアツセイを使用し、TNFアブ
ザイムタンパク質分解および不活性化を評価する。
腫瘍壊死因子細胞溶解試験 ネズミＬ−929繊維芽細胞（30,000/凹部）を、96個の
凹部を有する組織培養板で、１μg/mlアクチノマイシン
Ｄの存在の下に、培養する。触媒性抗体で処理する前と
処理した後とのTNFの連続稀釈物を、これらの凹部に加
え、18時間インキュベートする。培養培地を次いで取り
除き、細胞を25％メタノール中の0.5％クリスタル バ
イオレツト溶液で染色する。540nmにおける吸光値を、B
iotek ELISAミクロプレート リーダーで測定する。培
地だけの場合の細胞は０％溶解と考え、3Mグアニジン−
HClで処理した細胞は完全溶解であると見做した。TNF1
単位は50％の細胞溶解を得るのに必要な量であると定義
する。
例 ５ HIVポリペプチドを標的とするアブザイム プロセスの
調製 細胞のHIVによる感染における最初の出来事は、ウイ
ルス エソベロープ グリコタンパク質、gp120とその
細胞レセプター、CD4との間の相互反応である。このgp1
20とCD4との間の相互反応を阻止するモノクローナル抗
体が生成されている。このgp120エピトープは、アミノ
酸397〜439内に含まれていることが示されている。この
領域から12個のアミノ酸を、インビトロ突然変異により
削除すると、結合は完全な消失され、この領域の１個の
アミノ酸の置換は結合の有意の減少をもたらす。このエ
ピトープロ397−439は、次の配列を有する： この配列はまた、Mab−結合性エピトープの輪郭をまた
示している残基406−414の典型的ペプチド（＊）を示し
ている。410−421削除突然変異部分はまた、 で、ジスルフイド結合を形成するものと考えられている
削除領域（Ｃ）を吊り下げている２個のシステイン残基
および点変異によつてアスパラギン酸に変えられると、
CD4結合能力が減じられるアニリン417とともに示されて
いる。Lask等により提示されたこのデータは（Cell、19
87年、50、975〜985頁）、このポリペプチド領域がレセ
プター結合に関して必須の部位であることを含んでお
り、従つて、これを完全HIV gp120エンベロープ中のこ
の領域のタンパク質分解を誘発する触媒性抗体を誘発さ
せる免疫原の調製に、強力な候補ペプチドとして選択す
る。
このジペプチド同配体の選択された配列への組込み、
キヤリア タンパク質への結合、免疫付与、および触媒
性抗体のスクリーニングは、基本的に、上記の例１〜４
に記載の通りに行なう。触媒性抗体プロテアーゼの、標
的細胞のインビトロ感染を干渉する能力に係る検定は、
例３に記載の方法により行なう。
例 ６ エンドトキシン発作グラム陰性細菌感染期間中における
LPSの解毒 背景 抗生物質の出現にもかかわらず、約200,000人の患者
に、約80,000人の死亡をもたらす院内菌血症が発現して
いる（Maki、1981年）。グラム陰性菌敗血症は30％の死
亡率を有し、発作を含めると、70％になる（Kreger等、
1980年）。多くの症状および効果、ならびに抗生物質治
療に対する耐性は、エンドトキシンまたはリポ多糖（LP
S）のいくつかが、細菌誘発性発作の病因体であるとい
う前提と一致している。LPSの生物学的作用のうちのい
くつかには、血圧上昇、発熱、血管内凝血および死が含
まれる。LPSは種々のタイプの細胞を刺激し、メデイエ
ーター、ホルモンまたはその他の因子（特に腫瘍壊死因
子）を放出し、放出されたこれらは、次いで他の臓器ま
たは標的を刺激し、作用を及ぼす。治療には、通常、抗
生物質の使用が含まれるが、これらの処置は、LPSの病
因的作用を止めるためには多くの場合に成功をもたらさ
ない。細菌およびLPSが他の臓器に作用を及ぼす前に、
これらを中和する、新しい治療法が開発されつつある。
細菌生成物 グラム陰性細菌は、リポタンパク質、リポ多糖、ムコ
複合体および細胞質膜層よりなる特徴的膜を有する。若
干の外側表面構造およびタンパク質は、この有機体を血
清群もしくは血清型に分類するための手段である。たと
えば、莢膜はメニンゴコツシ（meningococci）をグルー
プA,B,Cなどの血清群に分けるために用いられる。抗原
性であり、血清型分類（Ｏ−抗原）に使用される、もう
一つの構造要素はLPSである。多糖分子は外側コアを構
成しており、見い出される抗原変異に応答することがで
きる。LPSはまた、１−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトー
スおよびKDO（２−ケト−３−デオキシマンノ−オクツ
ロソン酸）単位の内側コアを有し、これらの単位はグラ
ム陰性細菌に共通している（数種の突然変異種を除
く）。細菌膜内で、このリピドＡコア（Ｉ）は、保護さ
れており、そしてグルコサミン二糖類、脂肪酸鎖および
ホスフエート単位よりなる。このリピドＡコアは、前記
の判定症状の発現において、また構造上で重要である。
リピドＡ（II）に対する単糖プリカーサーであるリピ
ドＸは、マウスにおいて3mgより多い投与量で、また羊
において1mg/kgの投与量で毒性ではなく、致死量のエン
ドトキシンからマウスを防護する（MunfordおよびHal
l、1986年）。この例は、このアシルオキシアシル加水
分解が触媒性抗体によつて解媒される方法を概述するも
のである。
抗原の合成 図式１は、抗原（III）の合成に必要な、可能な合成
反応の概略を示すものであり、この方法は部分的に、Ku
sumato等により使用された方法（1984年）に従う方法で
ある。
ハイブリドーマ調製およびスクリーニング リピドＸ類似体（III）を異なるサイズおよびリピド
組成のリポゾーム中に組入れるか、あるいはBrade等に
より記載された方法（1987年）に従い、BALB/Cマウス中
への注入以前に最適抗原が提供されるようにするため
に、羊赤血球上に付着させる。
アシルオキシアシル ヒドロラーゼ遷移状態類似体
（III）に対する抗体を産生するハイブリドーマは標準
的方法によつて調製する。このハイブリドーマ上澄液
を、ELISAおよび（または）受身溶血阻止によつて、リ
ピドＸ類似体に結合する抗体に関して試験する。その触
媒活性は、後記する方法により評価する。
エステラーゼ活性の評価 生合成的にラベルされたLPSは、S.typhimurium PR122
（gal Em nag−）を〔3H〕−アセテートおよびＮ−アセ
チル−１−〔14C〕−グルコサミン（New England Nucle
ar Corp.,Boston,Mass.）とともに培養することによつ
て調製する。低分子量LPS（粗いLPS〔Ｒ−LPS〕）を生
成させるためには、S.typhimurinをＤ−ガラクトースの
不存在の下で培養する。これらの細胞を一定量づつ分
け、そのうちの一つは、50％グリセロール中の懸濁液と
して、−70℃で保存し、フエノール／クロロホルム／石
油エーテル2:5:8（容積／容積）用いて抽出する。高分
子量LPS（なめらかなLPS〔Ｓ−LPS〕）を生成させるた
めには、S.typhimuriumをＤ−ガラクトースの添加の下
に、上記の通りに培養する。これらの細胞は２等分す
る。このうちの一つは50％グリセロール中で完全細胞と
して−70℃で保存する。もう一つの方から、45％（重量
／容積）フエノールを用いて、Ｓ−LPSを抽出し、次い
で水に対して透析する。これら２種のLPS調製物を、ジ
エチルエーテルによる抽出によつて、さらに精製し、次
いで水およびトリエチルアミン中に懸濁し（１μg/m
l）、一定量毎に分け、次いで−70℃で保存する。
アブザイム−処理LPSの生物学的活性： インビボ試験；発熱物質の試験 処理されたLPSおよび対照LPSを、ウサギにおいて、そ
の発熱性に関して試験する。少なくとも３匹のウサギ
（1.7〜2.3kg）に、LPS調製物を注射し、それらの体温
の変化を記録する。最初に、対照LPS5μｇを試験し、次
いで処理LPS50μｇ、100μｇおよび200μｇを試験す
る。
致死率の測定 C57BL/6マウスに、Ｄ−ガラクト−スアミン16mgを注
射し（I.P.）、LPSに対する感受性を生じさせる。処理
されたLPSおよび未処理LPSを注射し（I.V.）、LD50を測
定する。2ng〜20μｇの濃度を試験する。
インビトロ評価：マクロフアージ拡散 マクロフアージを、処理されたLPSおよび対照LPSの存
在下、および不存在下に、培養する。マクロフアージ拡
散率〔これは、拡散数／総付着細胞の数）×100に等し
い〕を計算する。それらの膜エプロンが、非拡散細胞の
膜エプロンの二倍の面積をおおつている場合に、そのマ
クロフアージは拡散したものと定義される。
脾細胞刺激 マウス脾細胞の刺激を、チミジン吸収によつて追跡す
る。BALB/C nu/nu、C3H/HeNおよびC3H/HeJのマウスの脾
細胞を〔3H〕−チミジンと処理されたLPSおよび対照LPS
とともに、数種の濃度でインキユベートする。LPSを含
有しない対照倍養物をまた、調製する。この刺激作用
は、対照培養物に対する試験培養物をcpmの比として表
わされる。
試薬： （ａ）ベンジル クロロホーメート/NaOH;（ｂ）アリル
アルコール/HCl;（Ｃ）アセトン/TaOH/CaSO4;（ｄ）N
aH/SnBr;（ａ）〔１−（COD）（PMaPh2〕２〕PF8;
（ｆ）I2/H2O/THF;（ｇ）nBuLi、−70゜；（ｈ）（Ph
O）2P（ｈ）（PhO）2P（Ｏ）Cl;（ｉ）H2/Pd/C;（ｊ）D
CCl/DMAP/化合物A;（ｋ）PhSH/Et3N;（ｌ）H2/Pd/C/PtO
2/AcOH;（ｍ）HCl/THF;（ｎ）Ｐ（OMe）3;（ｏ）NaOH;
（ｐ）SOCl2;（ｑ）（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカ
ン酸；（ｒ）H2/Pd/C。
例 ７ ヒトIgEを開裂させるモノクローナル抗体の調製、スク
リーニングおよび単離の方法およびアレルギー反応の防
止 背景 アレルギー性応答の抑制におけるIgEの役割は、60年
以上にわたる広大な研究の主題である。これらの研究
は、アレルギー反応に関する経路の詳細な理解を導い
た。アレルギー反応の抑制において最初に生じる出来事
は、アレルゲン（抗原）のIgEへの結合である。これに
よつて、肥満細胞および好塩基性細胞の表面上のIgEの
交さ結合が生じ、この場合に、IgEはそのFc領域を介し
て、標的細胞上に存在するFcレセプターに結合する。こ
の交さ結合の結果として、ヒスタミン、SRS−Ａおよび
その他のバソアクテイブ アミン類の放出が誘発され、
これらの放出物質は最終的に、身体内の別の組織に対す
るそれらの作用を介して、有害なアレルギー反応の作用
を導く。
IgE分子は、機能的に、それらの結合活性により定め
られる、２つの部分に分けられる。これは、この分子を
パパイン タンパク質分解させると、２つの断片が生じ
ることによつて証明される。このタンパク質分解の結果
として、IgEは、アレルギー反応を誘発させるその能力
に関して、不活性化される。事実として、IgEはFc断片
によるFcレセプターの遮断による阻害剤になる。
抗アレルギー性モノクローナル抗体を生じさせるため
に、その他の有害な作用を伴なうことなく、IgEを特異
的に開裂させ、IgEを不活性にすることができる触媒性
抗体を調製した。この目的を達成するために、対象の配
列の中に含まれている環状ジペプチド類似体（第１図）
により、モノクローナル抗体を誘発させる。このように
して誘発された触媒性モノクローナル抗体は、天然IgE
ペプチド配列を下記に示されている位置で開裂させる： この配列は、IgEのCH2ドメインとCH3ドメインとの間に
位置しており、その開裂はIgE分子の活性を破壊し、そ
してアレルギー応答の発現を抑止する。
この領域に対する触媒性抗体を生じさせるために、ペ
プチド ハプテンADS（Ｘ）RGV〔（Ｘ）は下記で示す環
状ジペプチド類似体を表わす〕を、標準的固体相または
溶液相法によつて合成する。完成されるペプチドは、充
分に脱保護化し、次いで固体相が使用された場合には、
三フツ化酢酸を使用して、固体支持体から分離する。こ
のペプチドのＮ−末端アミノ基は、マウスの免疫付与用
のキヤリア タンパク質に付着することができる。
A. 免疫原の調製 1. ペプチド合成 ペプチド ハプテンを、ポリアミド−キーゼルガー複
合樹脂を使用する固体相技術によつて合成する。その側
鎖保護基は次のとおりである:O−tert−ブチ（チロシ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニ
ン）;N−４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンス
ルホニル（アルギニン）。Ｎ−官能性基の一時的保護
は、フルオレニルメトキシカルボニルによつて行ない、
この保護基は、ピペリジン/DMF:20/80によつて、10分内
に取り除かれる。このカツプリング反応は、FMOC−無水
アミノ酸を使用して行なう。保護されているペプチジル
−樹脂は、三フツ化酢酸／チオアニソール/m−クレゾー
ル／チオフエノール／エタンジチオール溶液:90/2/2/2/
4で、３時間処理することによつて、充分に脱保護化さ
せる。濾過後に、濾液を、小容積にまで、減圧で濃縮す
る。エーテルを加え、ペプチドの沈殿を得る。エーテル
性上澄液を分離し、ペプチド沈殿をエーテルで２回洗浄
し、ペプチド ハプテンを得る。
（式中、カツコ内の部分は、下記で示す環状ジペプチ
ド類似体である）。
2.キヤリア分子へのハプテンの結合 上記のペプチド ハプテンを、グルタルアルデヒドを
使用し、キイホール リンペツト ヘモシアニン（KL
H）に結合させる。反応混合物に添加された、痕跡量の
ヨー素−125ラベル付きペプチドの結合により推定し
て、この結合効率は50〜80％である。
B. モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング 完全Freundアジユバンド中のKLH結合ペプチド（50μ
ｇ）を、BALB/Cマウスに注射する。ハイブリドーマ融合
は、融合相手としてPS2/Oミエローマを使用し、標準的
方法により行なう。この融合から生成する。ポリクロー
ナル抗血清応答およびハイブリドーマスクリーニング細
胞を、ELISAによつて、結合活性に関してスクリーニン
グする。
プラステイツク微量滴定板（Falcon3915Probind.Bect
on Dickinson Labware CAS、米国）の凹部に、Tris−HC
l緩衝液（0.1M、pH9.6）中のペプチド（５μg/ml）50μ
を付着させる。
この板を、先ず37℃で30分間、次いで室温で一夜にわ
たりインキユベートする。Tween含有リン酸塩緩衝塩類
溶液（PBS−Tween0.1％、pH7.4）で３回洗浄した後に、
PBA−BSA1％pH7.4中の抗血清の連続稀釈物50μを、こ
のペプチド付着している１対の凹部に加え、次いで37℃
で２時間インキユベートする。この板を再び、PBS−Twe
en0.1％で３回洗浄し、次いでこれらの凹部を1:500に稀
釈された、アルカリ性ホスフアターゼ−ラベル付きヤギ
抗マウスIgG50μ（Sigma.MO、米国）で処理する。イ
ンキユベーシヨンは、37℃で１時間行なう。
PBS−Tween0.1％でさらに長く洗浄した後に、0.1Mグ
リシン−NaOH緩衝液（pH10.4）中に溶解した、MgCl2お
よびZnCl2、1mMを含有するアルカリ性ホスフアターゼ基
質（Sigma104−105の２錠/mi）150μとともにインキ
ユベートする。この酵素反応は、37℃で２時間進行さ
せ、次いでNa2CO3（1.5M）50μの添加により止める。
Titertech Multiskan ELISA Reader（Flow Laborator
ies）で、405nmにおける吸光値を読み取る。力価は、そ
の光学濃度を、陰性対照（1:100で稀釈された、採集正
常マウス血清よりなる）の３倍の高さの吸光値を与える
最高稀釈度と掛け算することによつて決して表わす。
このスクリーニング分析で陽性反応を示すハイブリド
ーマを、後続の研究用に選択する。IgGはBakerbond ABX
HPLCカラムを用いるHPLCによつて、腹水から精製す
る。
C. ヒトIgEのCH2CH3領域に対して特異性の触媒性抗体
によるペプチド開裂の触媒作用 ペプチド基質ADSNPRGV（2.7μＭ）を、前記で概述し
た方法によつて生成された触媒性抗体とともにインキユ
ベートし、この反応を、混合物の逆相HPLC分析によつて
追跡する。このペプチド基質に対して触媒的ペプチダー
ゼ活性を示す抗体を、IgE開裂に係るそれらの能力に関
して処理する。
IgE不活性化の評価 精製IgE抗−NPを、IgE1μｇと触媒性抗体１μｇとを
使用し、精製触媒性抗体により消化させる。インキユベ
ーシヨンは、PBS（pH8.5）中で、37℃において、期間を
変えて（数時間〜数日）行なう。この反応における非特
異性対照として、非触媒性モノクローナル抗体を平行反
応で包含させる。
開裂を評価するためには、好塩基性結合の喪失を試験
する。上記消化からのIgE抗−NPの試料（１〜5ng）を、
RPMI200μ、ウシ胎児血清10％およびEDTA10mM中で或
る範囲（６×105−107細胞/ml）の好塩基性細胞ととも
に37℃で15の間インキユベートする。これらの細胞を次
いで、同一緩衝液で３回洗浄し、次いで35S−BSA−NIP
（0.1μCi）を添加し、37℃で15′間、さらにインキユ
ベートする。これらの細胞を洗浄し、次いで放射能を測
定する。IgE対照インキユベーシヨンに対する、これら
の細胞の35S−結合の減少もしくは喪失は、IgEの開裂が
生じたことを表わす。
例 ８ グリコシダーゼとして触媒性抗体を使用するプロドラツ
グの活性化 背景 代謝拮抗物質は、生合成、利用または正常細胞代謝物
の代謝機能のいずれかを干渉する化合物である。腫瘍の
化学療法における選択を成功するためには、代謝拮抗物
質が、正常な組織を重大な危険にさらすことなく、腫瘍
において、１種または２種以上の生体代謝反応に対して
有害に作用しなければならない。
大部分の成功している抗癌医薬のうちのいくつかは、
プリンまたはピリジン同族体に由来するものであり、そ
の活性はDNAまたはRNA合成を阻害するそれらの能力に依
存している。このような医薬の一つに、アラビノシル
シトシン（Ｉ）〔サイタリビン（cytaribine）、Ara C
またはCA〕があり、そのDNA合成阻害剤としての活性
は、リボースの代りにアラビノースが存在していること
から誘導される。この差違は、２′ヒドロキシ基の立体
化学にある。Ara Cは遊離の５′−ヒドロキシル形態で
投与され、細胞中に入つた後に、５′−トリホスフエー
ト形態にスルホリル化されることによつて、活性になる
だけである。従つて、この医薬はすでに、プロドラツグ
であるが、全身的に投与されると、その活性化は、この
医薬が入つた細胞の全部で、すなわち腫瘍細胞または正
常細胞で生じることができる。
ここに、Ara Cを、自発的細胞内活性化が減じられて
いるプロドラツグの形態に変えることができることが見
い出された。第一に、抗腫瘍モノクローナル抗体の標的
を腫瘍に定め、それに触媒性抗体を担持させ、これら２
つを化学的に、または遺伝学的に結合させる。第二に、
プロ形態のAra Cを投与し、その活性化はアブザイム活
性を有する組織に制限する。このようにして、腫瘍組織
と正常組織との、さらに好ましい識別が得られる。Ara
Cは非常に短い血漿中半減期を有するので、活性化され
た医薬の腫瘍部位からの拡散は、有意の全身的に有毒に
なる前に、迅速に不活性化される。
５′−ガラクトシルAra Cおよびその遷移状態類似体の
合成 Ara Cのアミジン ガラクトシル同族体の合成（15）
は、下記の合成経路２および３に概述されている。合成
経路１からのトリベンゾイル化誘導体（３）を、ピリジ
ン中のメタンスルホニル クロライドで処理することに
よつて（９）に変換し、次いでN,NM−ジメチルホルムア
ミド中のリチウムアジドにより、75℃で置換する。
（９）をエタノール中で、50psiの水素圧において、10
％木炭上パラジウムの存在の下に水素添加し、４′アミ
ノ誘導体を得る。
β−ガラクトノラクタム（13）は、先ず2,3,4,6−テ
トラ−Ｄ−ベンジル−２−ｄ−ガラクトピラノース（1
1）を、ジメチル スルホキシドおよび無水酢酸で処理
し、2,3,4,6−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトノ
−1,5−ラクトン（12）を生成させ、この生成物を次い
で、ジオキサン中で痕跡量のAmberlite 1R 120H+の存在
の下に、アンモニア水溶液（25％重量／重量）と６時間
縮合させ、（13）を得ることによつて、製造する。この
生成物（13）を、トリメチルオキソニウム テトラフル
オロバレートで処理することによつて、そのイミド エ
ステルに変換し、次いで５′アミノ誘導体（10）と反応
させ、充分に保護されているアミジン ガラクトシル同
族体（14）を得る。10％木炭上パラジウムの存在の下
に、50psiの水素圧において水素添加することにより脱
保護化させ、次いで濃水性アンモニアで処理し、（15）
を得る。
シトシン−ベーター−Ｄ−アラビノフラノシド（５）
の５′−ベーター−Ｄ−ガラクトース同族体の合成は、
合成経路１に概述されている。
Ara C（１）をピリジン中でビス（ｐ−メトキシフエ
ニル）フエニル メチル クロライドで処理し、次いで
ベンゾイル クロライドを用いてトリベンゾイル化し、
次に（２）をジクロロメタン中で三塩化酢酸により脱ト
リチル化すると、部分的に保護されている誘導体（３）
が得られる。ベーター−Ｄ−ガラクトース ペンタアセ
テート（６）を稀水性酸で処理し、次いで水素化ナトリ
ウムおよび過剰のトリクロロアセトニトリルで処理する
と、トリクロロアセトイミデート（８）が得られる。
（８）と（３）とを、ルイス酸三フツ化ホウ素エーテレ
ートの存在の下にジクロロメタン中でカツプリングさ
せ、（４）を得る。この（４）を濃水性アンモニアを用
いて脱保護化させた後に、Ara Cの５′−データー−Ｄ
−ガラクトース同族体（５）が得られる。
抗体の産生および遷移状態類似体に対する結合に関する
スクリーニング 合成経路４における（15）に対するモノクローナル抗
体は、適当なキヤリアに結合させた後に、基本的に、例
１に記載の通りにして調製される。抗体産生性クローン
を先ず、例１に記載の方法と同様の方法によつて、Ara
C同族体（15）に結合するそれらの能力に関して、スク
リーニングする。
インビトロ触媒活性の試験 （15）に対する結合活性を示す抗体クローンを、Ara
C基質（５）からのガラクトシル部分を開裂させるそれ
らの能力に関してスクリーニングする。このスクリーニ
ングは、基本的に、KoernerおよびNiemanによつて記載
された方法であるが（J.Chromatography449、216〜228
頁、（1988）、グルコース オキシダーゼの代りに、ガ
ラクトース オキシダーゼを用いる検定法によつて行な
う。この検定法の原理は、触媒性抗体によつてプロドラ
ツグから放出されるガラクトースを、ガラクトース オ
キシダーゼ／ルミノール化学ルミネセンス法を用いて検
出することにある。
インビボ試験 標的細胞の存在における触媒性抗体による、ガラクト
シルAra CからAra Cへの変換は、DNA合成および細胞殺
滅を抑止する結果をもたらす。DNA合成の簡単な検定
は、基本的に、Gish等により記載された通りに行なう
（J.Med.Chem.14、1159〜1162頁、1971年）。この方法
においては、トリチル化チミジン取り込み検定法を使用
し、フイトヘマグルチン（PHA）刺激ヒトリンパ球にお
けるDNA合成を阻害する、Ara Cの能力が測定される。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マッセイ，リチャード ジェイ. アメリカ合衆国 20852 メリィランド 州 ロックビル，バレリアン コート ５ (56)参考文献 欧州公開251093（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】活性成分として有効量の触媒性抗体を含有
    する、インビボで生体分子内の標的のアミド結合、ペプ
    チド結合、エステル結合またはグリコシド結合の開裂ま
    たは形成の速度を増加させる医薬組成物であって、この
    触媒性抗体が当該生体分子内の標的のアミド結合、ペプ
    チド結合、エステル結合またはグリコシド結合の天然の
    コンフォーメーションを擬装するハプテンから誘導され
    る抗体である医薬組成物。
  2. 【請求項２】活性成分として有効量の触媒性抗体を含有
    する、インビボで生体分子内の標的のアミド結合、ペプ
    チド結合、エステル結合またはグリコシド結合の開裂ま
    たは形成の速度を増加させる医薬組成物であって、この
    抗体が、 （ａ）開裂または形成される標的のアミド結合、ペプチ
    ド結合、エステル結合またはグリコシド結合を選択し； （ｂ）上記生体分子の類似体よりなり、そして開裂また
    は形成される上記結合の類似体を含有する抗原を選択
    し、ここで上記類似体は生体分子内の標的のアミド結
    合、ペプチド結合、エステル結合またはグリコシド結合
    の天然コンフォーメーションを擬装するものであり； （ｃ）抗体を産生することができる細胞をこの抗原にさ
    らし、これによって抗体産生細胞を生じさせ； （ｄ）この抗体産生細胞をミエローマ細胞とハイブリッ
    ド形成させ、これによって、それぞれがモノクローナル
    抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を生じさせ；
    次いで （ｅ）これらの複数のモノクローナル抗体をスクリーニ
    ングし、上記標的アミド結合、ペプチド結合、エステル
    結合またはグリコシド結合の開裂または形成の速度を増
    加させるモノクローナル抗体を同定する； 方法によって産生された上記医薬組成物。
  3. 【請求項３】インビボで生体分子内の標的のアミド結
    合、ペプチド結合、エステル結合またはグリコシド結合
    の開裂または形成の速度を増加させることにより動物に
    おける生物学的機能を活性化または不活性化させる医薬
    組成物であって、活性成分として有効量の触媒性抗体を
    含有し、この抗体が、 （ａ）その形成または開裂が所望の生物学的機能の活性
    化または不活性化を導く生体分子であって、開裂または
    形成されるアクセッシブルな結合を含有する生体分子を
    同定し； （ｂ）上記生体分子の類似体よりなり、そしてこの開裂
    または形成される結合の類似体を含有する抗原を選択
    し、ここで上記類似体は生体分子内の標的のアミド結
    合、ペプチド結合、エステル結合またはグリコシド結合
    の天然コンフォーメーションを擬装するものであり； （ｃ）抗体を産生することができる細胞をこの抗原にさ
    らし、これによって、抗体産生細胞を生じさせ； （ｄ）この抗体産生細胞をミエローマ細胞とハイブリッ
    ド形成させ、これによって、それぞれがモノクローナル
    抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を生じさせ；
    次いで （ｅ）この複数のモノクローナル抗体をスクリーニング
    し、上記アミド結合、ペプチド結合、エステル結合また
    はグリコシド結合の開裂または形成の速度を増加させる
    モノクローナル抗体を同定する； 方法によって産生された上記医薬組成物。
  4. 【請求項４】後天性免疫不全症候群処置用の医薬組成物
    であって、活性成分として、HIV gp120コートタンパク
    質中のヘプチド結合の開裂速度を増加させることができ
    る触媒性抗体の有効量を含有し、この抗体がHIV gp120
    コートタンパク質中のペプチド結合の天然コンフォーメ
    ーションを擬装する抗原から誘導された上記医薬組成
    物。
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