BR112017028063B1 - Método para produção de um extrato de café - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM EXTRATO DE CAFÉ. A presente invenção se refere a um método para produzir um extrato de café que compreende o uso de uma enzima que tem atividade de mananase. A invenção também se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador que é incorporada aqui por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[0002] A presente invenção se refere à produção de extratos de café auxiliada por enzimas. A invenção também se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4- mananase polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

[0003] O extrato de café, i.e., uma solução aquosa de sólidos solúveis extraídos do grão de café, tem várias aplicações industriais. É usado, por exemplo, na fabricação de café instantâneo; em produtos de café prontos para beber tais como café enlatado e bebidas de café engarrafadas; e em aplicações diferentes de bebidas tais como sobremesas instantâneas, produtos de confeitaria e flavorizantes.

[0004] Os extratos de café comerciais são tipicamente produzidos por processamento térmico por etapas, uma combinação de etapas de molhagem, extração e hidrólise, que solubiliza uma elevada percentagem de sólidos de café torrados e triturados. São requeridas temperaturas muito elevadas para efetivar a hidrólise térmica e isto pode levar a sabores indesejados e a processos intensivos em termos de custos e capital.

[0005] Foi sugerido o uso de diferentes enzimas na produção de extratos de café para melhorar a qualidade e economia de processos (ver, por exemplo, US4.983.408, WO2007/011531, US5.714.183). O uso de mananase na produção de um extrato de café solúvel foi divulgado em, por exemplo, WO2007/011531 e US5.714.183.

[0006] É um objetivo da presente invenção obter extratos de café tendo um elevado rendimento de sólidos solúveis.

Sumário da Invenção

[0007] Os presentes inventores identificaram enzimas mananase inovadoras e mostraram que as mesmas são úteis para a extração de café torrado e triturado, gerando, assim, uma alta produção de matéria seca no extrato de café obtido.

[0008] A presente invenção se refere, portanto, a um método para produção de um extrato de café compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências com qualquer uma dentre as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 18.

[0009] Os inventores constataram adicionalmente que enzimas mananase termoestáveis são particularmente úteis para extração de café torrado e triturado. Os extratos de café obtidos têm um alto rendimento de matéria seca. O uso de uma enzima mananase termoestável é uma vantagem na produção de extratos de café visto que isso permitirá a extração em temperatura mais alta. Em geral, a extração em alta temperatura gerará um rendimento mais alto. Além disso, a alta temperatura reduzirá o crescimento microbiano. Além disso, no processo de extração em passos usado na produção comercial de extratos de café, uma extração em temperatura muito alta pode ocorrer imediatamente antes de uma extração em que uma enzima mananase é aplicada, e o uso de uma mananase termoestável permitirá menos resfriamento entre essas duas extrações.

[0010] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere, portanto, a um método para produção de um extrato de café compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase é termoestável.

[0011] De preferência, a enzima que tem atividade de mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial de pelo menos 80 °C, de preferência, pelo menos 85 °C ou pelo menos 90 °C.

[0012] De preferência, a incubação no passo d. é realizada a uma temperatura de pelo menos 60 °C, tal como pelo menos 65 °C, de preferência, pelo menos 70 °C, tal como pelo menos 75 °C ou pelo menos 80 °C.

[0013] Os inventores constataram adicionalmente que as enzimas mananase compreendendo um domínio de ligação de CBM1 são particularmente úteis para extração de café torrado e triturado.

[0014] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere, portanto, a um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase compreende um domínio de ligação de CBM1.

[0015] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4- mananase selecionados dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; e (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13.

[0016] Em uma modalidade, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase selecionados dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase.

[0017] Em outra modalidade, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase selecionados dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase.

[0018] Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase selecionados dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase.

Definições

[0019] Mananase: No contexto da presente invenção, uma "mananase" é uma beta-mananase. A mesma pode ser uma enzima definida de acordo com a técnica como uma endo-beta-mananase (EC 3.2.1.78) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta- D-manosídicas em mananas, galactomananas e glucomananas, cuja enzima tem os nomes alternativos manana endo-1,4-beta- mananase; 1,4-beta-D-manana mananoidrolase; endo-1,4-beta- mananase; beta-mananase B; beta-1,4-manana 4-mananoidrolase; endo-beta-mananase; e beta-D-mananase. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de mananase pode ser determinada com o uso do ensaio de atividade descrito por Staalbrand et al. (1993), Purification and characterization of two beta-mannanases from Trichoderma reesei, J. Biotechnol., 29:229 a 242. Em um aspecto, uma mananase a ser usada em um método da presente invenção tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 10 % da atividade de mananase do polipeptídeo do número de acesso de GENESEQP AXU66990 mostrado aqui como SEQ ID NO: 16.

[0020] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0021] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" designa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0022] cDNA: O termo “cDNA” designa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, emendada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo a emenda, antes de aparecer como mRNA maduro emendado.

[0023] Sequência codificante: O termo "sequência de codificação" designa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificante são geralmente determinados por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0024] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” designa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0025] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo, incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e segregação.

[0026] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” designa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que fornecem a sua expressão.

[0027] Fragmento: O termo "fragmento" designa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. Em um aspeto, um fragmento do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 contém pelo menos 350 resíduos de aminoácidos, pelo menos 375 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 400 resíduos de aminoácidos. Em um aspeto, um fragmento do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 contém pelo menos 300 resíduos de aminoácidos, pelo menos 315 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 330 resíduos de aminoácidos. Em um aspeto, um fragmento do polipeptídeo da SEQ ID NO: 13 contém pelo menos 300 resíduos de aminoácidos, pelo menos 315 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 330 resíduos de aminoácidos.

[0028] Condições de estringência alta: O termo “condições de estringência alta” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0029] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0030] Isolado: O termo "isolado" designa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância).

[0031] Condições de estringência baixa: O termo “condições de baixa severidade” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50 °C.

[0032] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 são os aminoácidos 18 a 431 de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 são os aminoácidos 18 a 367 de SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 são os aminoácidos 18 a 361 de SEQ ID NO: 12. Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0033] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante de polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. Em um aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 são os nucleotídeos 52 a 1.545 de SEQ ID NO: 1 ou na sua sequência de cDNA. Em um aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 são os nucleotídeos 52 a 1.219 de SEQ ID NO: 6 ou na sua sequência de cDNA. Em um aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 são os nucleotídeos 52 a 1.200 de SEQ ID NO: 11 ou na sua sequência de cDNA.

[0034] CONDIÇÕES DE ESTRINGÊNCIA MÉDIA: O termo “condições de estringência média” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 35%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55 °C.

[0035] CONDIÇÕES DE ESTRINGÊNCIA MÉDIA ALTA: O termo “condições de estringência médio-alta” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 35%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0036] Construto de ácido nucleico: O termo "construto de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outro modo não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0037] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligada” designa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo, de tal forma que a sequência de controle direciona a expressão da sequência codificadora.

[0038] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[0039] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção - nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0040] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0041] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de endo- beta-1,4-mananase.

[0042] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou exclusão, em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um ou mais aminoácidos adjacentes ao e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[0043] Condições de estringência muito alta: O termo “condições de estringência muito alta” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70 °C.

[0044] Condições de estringência muito baixa: O termo “condições de estringência muito baixa” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25%, que seguem os procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 45 °C.

[0045] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 são os aminoácidos 18 a 431 de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 são os aminoácidos 18 a 367 de SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 são os aminoácidos 18 a 361 de SEQ ID NO: 12. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro do polipeptídeo de SEQ ID NO: 17 são os aminoácidos 28 a 319 de SEQ ID NO: 17 (com base na sequenciação N-terminal e na espectrometria de massa (MS) da proteína de comprimento completo). Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N- terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0046] Termoestável: No contexto da presente invenção, uma enzima termoestável que tem atividade de mananase pode ter uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) de pelo menos 80 °C, de preferência, pelo menos 85 °C, mais preferencialmente, pelo menos 90 °C. A Tm pode ser determinada conforme descrito nos Exemplos. Descrição Detalhada da Invenção

[0047] A presente invenção, em um aspecto, se refere a um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências com qualquer uma dentre as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 18.

[0048] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade, a enzima difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, tal enzima é termoestável.

[0049] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase, de preferência, compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de mananase. Em outro aspecto, a enzima compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, tal enzima é termoestável.

[0050] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 18 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade, a enzima difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade, tal enzima é termoestável.

[0051] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase, de preferência, compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de mananase. Em outro aspecto, a enzima compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade, tal enzima é termoestável.

[0052] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade, a enzima difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[0053] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase, de preferência, compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de mananase. Em outro aspecto, a enzima compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0054] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade, a enzima difere em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13.

[0055] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase, de preferência, compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de mananase. Em outro aspecto, a enzima compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

[0056] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase é termoestável.

[0057] A descrição e as modalidades abaixo são relevantes para ambos esses aspectos da presente invenção.

[0058] Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) de pelo menos 80 °C, de preferência, pelo menos 85 °C, mais preferencialmente, pelo menos 90 °C. A temperatura de fusão Tm pode ser determinada conforme descrito nos Exemplos.

[0059] Em uma modalidade preferencial, a incubação é realizada a uma temperatura de pelo menos 60 °C, tal como pelo menos 65 °C, de preferência, pelo menos 70 °C, tal como pelo menos 75 °C ou pelo menos 80 °C.

[0060] Em outra modalidade preferencial, a incubação é realizada a uma temperatura tipicamente na faixa de cerca de 50 °C a cerca de 100 °C, de preferência, cerca de 60 °C a cerca de 100 °C, mais preferencialmente, cerca de 70 °C a cerca de 100 °C, ainda mais preferencialmente, cerca de 80 °C a cerca de 100 °C.

[0061] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase foi isolada.

[0062] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase é uma endo-beta-1,4-mananase, de preferência, uma GH5 endo-beta-1,4-mananase, mais preferencialmente, uma GH5_7 endo-beta-1,4-mananase ou uma GH5_8 endo-beta-1,4-mananase. Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de mananase é uma GH5_7 endo-beta-1,4-mananase. Em outra modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de mananase é uma GH5_8 endo-beta-1,4-mananase.

[0063] Uma enzima que tem atividade de mananase da presente invenção pode ser obtida a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de”, como usado aqui em conexão com uma dada fonte, deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0064] A enzima pode ser uma enzima fúngica. Por exemplo, a enzima pode ser obtida a partir de levedura, tal como a partir de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou a partir de um fungo filamentoso, tal como a partir de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[0065] Em outra modalidade, a enzima é obtida a partir de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[0066] Em outra modalidade, a enzima é obtida a partir de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[0067] Em uma modalidade, a enzima é obtida a partir de Talaromyces, p. ex., a partir de Talaromyces leycettanus.

[0068] Em outra modalidade, a enzima é obtida a partir de Chaetomium, p. ex., a partir de Chaetomium virescens.

[0069] Em outra modalidade, a enzima é obtida a partir de Sordaria, p. ex., a partir de Sordaria macrospora.

[0070] Em outra modalidade, a enzima é obtida a partir de Caldicellulosiruptor, p. ex., a partir de Caldicellulosiruptor saccharolyticus.

[0071] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[0072] Cepas destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0073] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser depois obtido por meio da triagem de modo similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado com o uso de técnicas que são conhecidas por aqueles versados na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0074] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de mananase não é obtida a partir de Aspergillus niger.

[0075] O método da presente invenção pode ser aplicado a grãos de café recém-torrados e triturados ou a grãos de café torrados que foram previamente extraídos com água.

[0076] Em uma modalidade preferencial, os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos.

[0077] Em uma modalidade, uma primeira extração é realizada no passo b.

[0078] O método da invenção pode ser aplicado a grãos de café triturados obtidos por processamento convencional de café solúvel. Aí, o café torrado é tipicamente triturado e (termicamente) extraído com água em múltiplas etapas. Uma execução em duas etapas é típica na técnica, em que a primeira etapa compreende molhar as borras de café, recuperação do sabor e extração dos componentes prontamente solúveis (tais como cafeína, minerais e açúcares simples). A segunda etapa é tipicamente uma etapa de hidrólise, onde grandes biopolímeros de café e componentes ligados são desagregados até formarem componentes solúveis em água mais pequenos. Na primeira etapa, o café torrado é tipicamente extraído com água a ou abaixo de 100 °C. As borras desta extração, que podem ser referidas como "borras atmosféricas", são depois extraídas com água superaquecida a temperaturas entre 140 °C e 180 °C ou mesmo mais elevadas. As borras parcialmente extraídas da extração superaquecida podem ser referidas como "borras superaquecidas".

[0079] Se o método da invenção for aplicado a borras parcialmente extraído, uma primeira extração pode ser levada a cabo por adição do café torrado e triturado que pode ter um tamanho das partículas médio de cerca de 900 mícrons a um tanque agitado encamisado que contenha água, em que a razão de sólidos em relação a água é cerca de 1:5. A pasta é agitada, aquecida indiretamente até uma temperatura de menos do que cerca de 140 °C, preferencialmente na gama de cerca de 85 a 90 °C, e mantida a esta temperatura durante cerca de 30 minutos. A pasta é depois descarregada do vaso e as borras subsequentes e extrato separados usando um filtro. As borras parcialmente extraídas são submetidas a uma secunda extração de acordo com a invenção, e o extrato produzido na primeira extração (passo b) pode ser mesclado com o segundo extrato obtido no passo e.

[0080] Além disso, uma execução em múltiplos passos (isto é, mais de duas extrações) é típica na técnica. Após o primeiro passo, múltiplos passos subsequentes são realizados. O método da invenção pode ser parte de tal extração com múltiplos passos. As borras parcialmente extraídas que foram submetidas a uma ou mais primeiras extrações são submetidas a uma extração de acordo com a invenção, e o extrato produzido na uma ou mais extrações anteriores pode ser mesclado com o extrato obtido no passo e.

[0081] No contexto da presente invenção, grãos de café triturados parcialmente extraídos ou borras de café parcialmente extraídas significam que os grãos de café triturados foram submetidos a pelo menos uma extração. Tais grãos de café triturados parcialmente extraídos podem ser também denominados borras de café gastas.

[0082] O método da invenção pode, em geral, ser aplicado a café torrado e triturado compreendendo grãos torrados que foram triturados até um tamanho de partículas médio de entre cerca de 0,1 e cerca de 5 mm, preferencialmente entre cerca de 0,2 e cerca de 1 mm.

[0083] Adicionalmente, um passo de pré-tratamento de gestão do sabor pode ser adicionado ao método da invenção para recuperar os compostos de aroma ou constituintes aromáticos do café antes das etapas de extração e/ou hidrólise. Processos úteis incluem, mas não estão limitados, àqueles descritos no documento EP 0 489 401. Uma execução prática inclui molhar café torrado e triturado com água em um vaso em uma razão de cerca de 1:0,5 por peso. É aplicado vácuo ao vaso (por exemplo, cerca de 15 kPa (150 mbar)) e depois é aplicado vapor de baixa pressão ao leito de borras molhadas durante até cerca de 4 a 8 minutos para evaporar os compostos de aroma do café torrado e triturado. Os compostos voláteis retirados são condensados, por exemplo a cerca de 5 C, e retidos para serem adicionados de volta aos extratos ou sólidos extraídos.

[0084] O método da invenção pode ser praticado em café torrado que tenha sido purgado por vapor a baixa pressão para extrair componentes de sabor voláteis, como descrito acima.

[0085] O método da invenção pode ser aplicado a qualquer tipo de borras de café com matéria hidrolisável conhecida daqueles peritos na técnica, tais como borras de café sem óleo, borras de café descafeinadas, borras de café moídas a úmido, borras de café tratadas com asparaginase, etc.

[0086] O tratamento enzimático de grãos de café torrados e triturados é para ser realizado a uma temperatura em que as enzimas são ativas e durante tempo suficientemente longo para permitir reação das enzimas.

[0087] Em um modo de operação em batelada possível, após a reação enzimática estar essencialmente completa, a mistura é submetida a uma separação grosseira, por exemplo centrifugação ou filtração em cinto, que remove a maioria dos sólidos insolúveis. O extrato separado, contendo ainda particulados finos, óleo e proteína enzimática, é recirculado através de um dispositivo de membrana de fluxo cruzado, que remove todos os insolúveis e pode também remover enzima. A maioria da ou toda a enzima permanece no retentado da membrana e pode ser reciclada para a reação.

[0088] Em um modo de operação possível, permeado da membrana semipermeável é constantemente retirado durante a reação enzimática, i.e., uma porção da mistura reacional é continuamente circulada através da célula de separação com membrana semipermeável de fluxo cruzado. O processo pode ser operado em um modo semicontínuo, em que é retirado permeado até o volume no vaso de reação diminuir até ao ponto em que a sua viscosidade ou a queda de pressão se tornar elevada. Nesse momento, algum retentado é purgado e pasta de café fresca alimentada e alguma enzima fresca adicionada. O retentado purgado pode ser descartado ou pode ser lavado para recuperar a enzima que é depois reusada. A enzima no retentado remanescente (não purgado) é retido e reusado.

[0089] Alternativamente, pasta de alimentação fresca pode ser continuamente adicionada ao tanque de alimentação em conjunto com alguma enzima com uma purga retirada da corrente de reciclagem de volume igual.

[0090] Em qualquer dos casos, a operação do processo em um modo de operação semicontínuo ou contínuo permite permeação de componentes solubilizados para fora da zona de reação antes de serem adicionalmente desagregados.

[0091] Se o método da invenção for usado para tratamento de borras de café torrado e triturado que tenham sido previamente extraídas com água e/ou termicamente hidrolisadas, o extrato obtido do método desta invenção pode ser combinado com os extratos obtidos antecipadamente.

[0092] Em que borras atmosféricas são usadas como alimentação para o método da invenção, o extrato produzido pode ser combinado com o extrato obtido durante a etapa de extração atmosférica. Os extratos são combinados com base na razão de rendimentos torrados extraídos de cada etapa. O extrato combinado é depois concentrado, aromatizado e seco como é convencional na técnica.

[0093] O extrato de café pode ser desidratado, tal como um café solúvel ou composição de mistura seca, ou pode ser um produto de café pronto-a-beber, uma composição de mistura líquida, uma composição congelada ou uma composição de concentrado líquida. O extrato de café da invenção pode ser também usado em aplicações de não bebida, tal como sobremesas instantâneas ou produtos de confeitaria, etc.

[0094] Os processos para produzir essas composições de café a partir de extratos de café solúveis são conhecidos para uma pessoa perita na técnica.

[0095] No método da invenção, água e enzima são adicionadas aos grãos de café que podem ter sido submetidos a uma ou mais primeiras extrações.

[0096] Água pode, por exemplo, ser adicionada de modo que a concentração final de matéria seca seja entre 2% a 30% (p/p), preferencialmente entre 5% a 20% (p/p), tal como cerca de 10% (p/p).

[0097] A enzima tendo atividade de mananase pode ser adicionada a uma concentração de pelo menos 0,001 g de proteína enzimática/kg de matéria seca, preferencialmente pelo menos 0,005 g de proteína enzimática/kg de matéria seca, tal como a uma concentração de 0,001 a 1 g de proteína enzimática/kg de matéria seca, preferencialmente 0,005 a 0,5 g de proteína enzimática/kg de matéria seca.

[0098] A enzima tendo atividade de mananase pode ser adicionada a uma concentração de pelo menos 0,001 g de proteína enzimática/kg de grãos de café, preferencialmente pelo menos 0,005 g de proteína enzimática/kg de grãos de café, tal como a uma concentração de 0,001 a 0,5 g de proteína enzimática/kg de grãos de café, preferencialmente 0,005 a 0,2 g de proteína enzimática/kg de grãos de café.

[0099] A enzima tendo atividade de mananase é preferencialmente adicionada como uma preparação enzimática caracterizada por pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10% ou pelo menos 20%, da proteína total na preparação, ser uma enzima tendo atividade de mananase como a sua atividade enzimática predominante.

[0100] A enzima tendo atividade de mananase pode ser adicionada como uma mistura com outras enzimas, tal como, p. ex., celulase e/ou enzima (ou enzimas) galactanase.

[0101] No método da invenção, após a água e a enzima terem sido adicionadas aos grãos de café torrados e triturados que foram opcionalmente submetidos a uma ou mais primeiras extrações, a composição compreendendo os grãos de café, a água e a enzima é incubada para produzir um extrato de café aquoso.

[0102] A incubação deve ser realizada a uma temperatura em que a enzima é ativa, tipicamente na faixa de cerca de 25 °C a cerca de 100 °C. Nos aspectos da invenção em que uma enzima termoestável é usada, a incubação pode ser realizada e uma temperatura tipicamente na faixa de cerca de 50 °C a cerca de 100 °C, de preferência, cerca de 60 °C a cerca de 100 °C, mais preferencialmente, cerca de 70 °C a cerca de 100 °C, ainda mais preferencialmente, cerca de 80 °C a cerca de 100 °C.

[0103] A incubação pode ser realizada por cerca de 1 a cerca de 48 horas, de preferência, cerca de 2 a cerca de 24 horas ou cerca de 4 a cerca de 24 horas para permitir a reação enzimática.

[0104] Após a incubação, o extrato de café é separado dos grãos de café extraídos por qualquer meio conhecido na técnica.

[0105] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c, em que as ditas uma ou mais primeiras extrações são denotadas como passo b, e uma explosão de vapor é realizada após o passo b e a antes do passo c. Alternativamente, se mais de uma primeira extração for realizada, a explosão de vapor pode ser realizada entre algumas das primeiras extrações e antes da etapa c.

[0106] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c, em que as ditas uma ou mais primeiras extrações são denotadas como passo b, e uma segunda trituração dos grãos de café é realizada após o passo b e a antes do passo c. Alternativamente, se mais de uma primeira extração for realizada, a segunda trituração pode ser realizada entre algumas das primeiras extrações e antes da etapa c.

[0107] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c, em que a dita primeira extração (ou extrações) é denotada como passo b, e pelo menos 8% em peso, de preferência, pelo menos 10% em peso, da matéria seca dos grãos de café parcialmente extraídos obtidos após o passo b são recuperados no extrato de café obtido no passo e. Em outra modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c, em que a dita primeira extração (ou extrações) é denotada como passo b, e pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 14% em peso, da matéria seca dos grãos de café parcialmente extraídos após o passo b são recuperados no extrato de café obtido no passo e. Em outra modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c, em que a primeira extração (ou extrações) é denotada como passo b, e 8 a 40% em peso, de preferência, 10 a 30% ou 12 a 25% em peso, da matéria seca dos grãos de café parcialmente extraídos obtidos após o passo b são recuperados no extrato de café obtido no passo e.

[0108] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 100% mais matéria seca, de preferência, pelo menos 200% ou pelo menos 300% mais matéria seca, então um extrato de café preparado por um método similar sem a adição de uma enzima que tem atividade de mananase.

[0109] Em algumas aplicações, o teor de monossacarídeos livres no extrato de café é importante, visto que os mesmos podem influenciar o sabor do extrato de café.

[0110] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 2% em peso, p. ex., pelo menos 5% ou pelo menos 8% em peso, de monossacarídeos livres com base no peso dos açúcares totais como monossacarídeos. Em outra modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o extrato de café obtido no passo e compreende 2 a 30% em peso, p. ex., 5 a 30% ou 8 a 30% em peso, de monossacarídeos livres com base no peso dos açúcares totais como monossacarídeos.

[0111] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 2% em peso de manose livre com base no peso total de sólidos de café solúveis. Em outra modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma 32/127 ou mais primeiras extrações antes do passo c e o extrato de café obtido no passo e compreende 2 a 5% em peso de manose livre com base no peso total de sólidos de café solúveis.

[0112] Em uma modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o teor de manose livre no extrato de café obtido no passo e é pelo menos 5% em peso, de preferência, pelo menos 10% em peso, do teor de manose total no dito extrato de café. Em outra modalidade, os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes do passo c e o teor de manose livre no extrato de café obtido no passo e é 5 a 30% em peso, de preferência, 10 a 25% em peso, do teor de manose total no dito extrato de café.

[0113] A manose total no extrato de café no contexto da presente invenção significa manose livre solubilizada mais manose ligada em oligossacarídeos solubilizados.

[0114] Pouco ou nenhum teor de glucose em extratos de café é um parâmetro de qualidade, e o teor de glucose tem que estar abaixo de 2,46% em peso para estar de acordo com a Descrição de Item Comercial (CID) de 16 de maio de 2013, autorizado pelo Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) (http://www.ams.usda.gov/AMSv1.0/getfile?dDocName=STELPRD3237 484).

[0115] Em uma modalidade, o extrato de café obtido no passo e compreende menos de 2,46% em peso, de preferência, menos de 2% em peso, mais preferencialmente, menos de 1% ou menos de 0,5% em peso, de glucose total com base no peso total de sólidos de café solúveis.

[0116] Em uma modalidade, o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 15% em peso de manose total com base no peso total de sólidos de café solúveis. Em outra modalidade, o extrato de café compreende 15 a 30% em peso de manose total com base no peso total dos sólidos de café solúveis. Polipeptídeos que têm Atividade de Endo-beta-1,4-mananase

[0117] Em outro aspecto, a invenção se refere a polipeptídeos que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

[0118] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 75%, p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de endo-beta-1,4- mananase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0119] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 90%, p. ex., pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de endo-beta- 1,4-mananase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[0120] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 de pelo menos 80%, p. ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de endo-beta-1,4-mananase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13.

[0121] Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.

[0122] Em uma modalidade, um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endo-beta- 1,4-mananase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0123] Em uma modalidade, um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endo-beta- 1,4-mananase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0124] Em uma modalidade, um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endo-beta- 1,4-mananase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

[0125] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições 35/127 de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0126] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).

[0127] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).

[0128] O polinucleotídeo de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1, 6 ou 11 ou uma subsequência de qualquer uma dessas, assim como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, 7 ou 12 ou um fragmento de qualquer uma dessas, pode ser usado para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos codificantes de DNA tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase de cepas de diferentes gêneros e espécies de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0129] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras cepas pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase. O DNA genômico ou outro tipo de DNA de tais outras cepas pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[0130] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo (i) a SEQ ID NO: 1, 6 ou 11; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, 6 ou 11; (iii) a sua sequência de cDNA; (iv) o seu complemento de comprimento total; ou (v) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito alta estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0131] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase específica para PI codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[0132] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase específica para PI codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[0133] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase específica para PI codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[0134] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a variantes do polipeptídeo de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 8 ou 13 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 8 ou 13 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxil-terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0135] Exemplos de substituições conservativas são dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0136] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0137] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de endo- beta-1,4-mananase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59 a 64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0138] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de triagem relevante, tal como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; patente n° U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0139] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de triagem automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0140] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[0141] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências de codificação codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2.575 a 2.583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776 a 779).

[0142] Um polipeptídeo de fusão pode compreender, adicionalmente, um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 a 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245 a 251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3.488 a 3.493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498 a 503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378 a 381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505 a 512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982 a 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240 a 248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35 a 48. Fontes de Polipeptídeos que têm Atividade de Endo-beta-1,4- mananase

[0143] Um polipeptídeo tendo atividade de endo-beta-1,4- mananase da presente invenção pode ser obtido a partir de microrganismos de quaisquer gêneros. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de”, como usado aqui em conexão com uma dada fonte, deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0144] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura, como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou um polipeptídeo fúngico filamentoso, como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[0145] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[0146] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[0147] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces, p. ex., um polipeptídeo obtido a partir de Talaromyces leycettanus.

[0148] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Chaetomium, p. ex., um polipeptídeo obtido a partir de Chaetomium virescens.

[0149] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Sordaria, p. ex., um polipeptídeo obtido a partir de Sordaria macrospora.

[0150] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[0151] Cepas destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0152] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser depois obtido por meio da triagem de modo similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado com o uso de técnicas que são conhecidas por aqueles versados na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Domínios Catalíticos

[0153] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos tendo uma identidade de sequência com os aminoácidos 75 a 414 da SEQ ID NO: 3 de pelo menos 75%, p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em um aspecto, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, dos aminoácidos 75 a 414 de SEQ ID NO: 3.

[0154] O domínio catalítico preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 75 a 414 de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase.

[0155] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos que hibridam sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência (como definido acima) com (i) os nucleotídeos 317 a 1545 de SEQ ID NO: 1, (iii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o seu complemento de comprimento total (Sambrook et al., 1989, supra).

[0156] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 317 a 1.545 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

[0157] O polinucleotídeo codificando o domínio catalítico preferencialmente compreende os ou consiste nos nucleotídeos 317 a 1.545 de SEQ ID NO: 1.

[0158] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com variantes do domínio catalítico dos aminoácidos 75 a 414 de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em um aspecto, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 75 a 414 de SEQ ID NO: 3 é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ou 10.

Domínios de Ligação

[0159] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios de ligação a CBM1 tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 75 a 37 de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 75%, p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em um aspeto, os domínios de ligação a CBM1 compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, dos aminoácidos 1 a 37 de SEQ ID NO: 3.

[0160] O domínio de ligação a CBM1 preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 37 de SEQ ID NO: 3, ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de ligação a CBM1.

[0161] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios de ligação a CBM1 codificados por polinucleotídeos que hibridam sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência (como definido acima) com (i) os nucleotídeos 1 a 111 de SEQ ID NO: 1, (iii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o seu complemento de comprimento total (Sambrook et al., 1989, supra).

[0162] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios de ligação a CBM1 codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência com os nucleotídeos 1 a 111 de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 75%, p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

[0163] O polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a CBM1 preferencialmente compreende os ou consiste dos nucleotídeos 1 a 111 de SEQ ID NO: 1.

[0164] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com variantes do domínio de ligação a CBM1 dos aminoácidos 1 a 37 de SEQ ID NO: 3 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em um aspecto, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 1 a 37 de SEQ ID NO: 3 é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ou 10.

[0165] Um domínio catalítico operacionalmente ligado ao domínio de ligação a CBM1 pode ser de uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase ou transferase, por exemplo, uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobio-hidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa- glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou beta-xilosidase. O polinucleotídeo codificando o domínio catalítico pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica ou outra. Polinucleotídeos

[0166] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, um domínio catalítico, ou domínio de ligação a CBM1 da presente invenção, como descrito aqui. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo, um domínio catalítico, ou domínio de ligação a CBM1 da presente invenção foi isolado.

[0167] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com as mesmas características estruturais. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Talaromyces, Chaetomium ou Sordaria, ou um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo.

[0168] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou similares As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, 6 ou 11 ou a sua sequência de cDNA, por exemplo, uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construtos de Ácido Nucleico

[0169] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0170] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para proporcionar a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0171] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0172] Os exemplos de promotores adequados para o direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97 a 107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301 a 315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3.727 a 3.731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 a 25). Os promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74 a 94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são revelados no documento sob o n° WO 99/43835.

[0173] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácidos de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente US No 6.011.147.

[0174] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfogliceratocinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para 53/127 células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 a 488. A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[0175] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[0176] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

[0177] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces 54/127 cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0178] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência de codificação de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0179] Os exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidas a partir de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471).

[0180] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado à terminação 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer líder que seja funcional pode ser usado na célula hospedeira.

[0181] Os líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes de amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0182] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0183] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada à terminação 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional pode ser usada na célula hospedeira.

[0184] As sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0185] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5.983 a 5.990.

[0186] A sequência de controle pode ser também uma região de codificação do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo e que direciona o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência de codificação do peptídeo sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da sequência de codificação que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma sequência de codificação do peptídeo sinal que é estranha à sequência de codificação. Uma sequência de codificação do peptídeo sinal estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contiver naturalmente uma sequência de codificação do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência de codificação do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência de codificação do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de codificação do peptídeo sinal que direcione o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira pode ser usado.

[0187] Sequências de codificação do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos- sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 a 137.

[0188] Sequências de codificação do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[0189] Peptídeos-sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de codificação do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0190] A sequência de controle pode ser também uma sequência de codificação do pró-peptídeo que codifica um pró- peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de codificação de pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes de protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), laccase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0191] Quando ambas as sequências de peptídeo sinal e pró- peptídeo estão presentes, a sequência do pró-peptídeo está posicionada junto à terminação N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto à terminação N da sequência do pró-peptídeo.

[0192] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos, pode ser usado o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei e promotor de celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene de di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão

[0193] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor tal que a sequência de codificação esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0194] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0195] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Adicionalmente pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[0196] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[0197] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, porém sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, porém sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae genes e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus são preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus. Os genes adeA, adeB, amdS, hph, e pyrG são preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma. O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável duplo como descrito no documento sob o n° WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.

[0198] O vetor contém, preferencialmente, um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[0199] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização (ou localizações) precisa no cromossomo (ou cromossomos). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências em relação à sequência-alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[0200] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[0201] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMβl permitindo a replicação em Bacillus.

[0202] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[0203] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61 a 67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9.163 a 9.175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos revelados no documento sob o n° WO 00/24883.

[0204] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[0205] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por um versado na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[0206] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[0207] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

[0208] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram- positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0209] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, porém sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[0210] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, porém sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0211] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, porém sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[0212] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consulte, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111 a 115), transformação com células competentes (consulte, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823 a 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209 a 221), eletroporação (ver, p. ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 a 751) ou conjugação (consulte, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5.271 a 5.278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consulte, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557 a 580) ou eletroporação (consulte, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6.127 a 6.145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (consulte, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praga) 49: 399 a 405), conjugação (consulte, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3.583 a 3.585) ou transdução (consulte, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6.289 a 6.294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (consulte, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391 a 397) ou conjugação (consulte, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 a 57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (consulte, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1.295 a 1.297), transformação de protoplastos (consulte, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189 a 207), eletroporação (consulte, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3.800 a 3.804), ou conjugação (consulte, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409 a 436). Entretanto, pode-se usar qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[0213] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, vegetal ou fúngica.

[0214] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, como usado no presente documento, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[0215] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, conforme usado no presente documento, inclui levedura ascosporógena (Endomicetales), levedura basidiosporógena e a levedura que pertence ao Fungi Imperfecti (Blastomicetos). Uma vez que a classificação de leveduras pode variar no futuro, para os propósitos da presente invenção, a levedura será definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0216] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.

[0217] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente distinguidos por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contrapartida, o crescimento vegetativo por leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[0218] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[0219] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[0220] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470 a 1.474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1.419 a 1.422. Os métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 a 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada com o uso dos procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[0221] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[0222] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[0223] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser 69/127 recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado de lisados celulares.

[0224] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptídeo.

[0225] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, porém sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.

[0226] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (consulte, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.

[0227] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[0228] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende, adicionalmente, ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares, e meio de cultura.

[0229] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que passa por nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando as culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e segregação no meio de cultura celular. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no fim da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[0230] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreende um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1 a 5 carbonos e/ou um sal do mesmo, e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[0231] Em um aspecto, a composição contém um ácido (ou ácidos) orgânico e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que está isenta destes componentes.

[0232] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem compreender ainda um agente conservante e/ou antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas sem limitação, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio, e outros conhecidos na técnica.

[0233] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no fim da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[0234] Um caldo inteiro ou composição de células, como descrito aqui, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima (ou enzimas) insolúvel. Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionarem uma composição líquida clarificada.

[0235] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. Composições de Enzimas

[0236] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido" indica que a atividade de endo-beta-1,4-mananase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[0237] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, betaglucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[0238] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[0239] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica. Usos

[0240] A presente invenção também se refere ao uso de um polipeptídeo da invenção em extração de café.

[0241] A presente invenção também se refere a um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. adicionar aos ditos grãos de café água e um polipeptídeo da invenção tendo atividade de endo-beta-1,4-mananase; c. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e d. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. 74/127 Modalidades

[0242] A invenção é adicionalmente definida pelos seguintes parágrafos: 1. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase é termoestável. 2. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 18. 3. O método do parágrafo 2, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 18. 4. O método do parágrafo 3, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3. 5. O método do parágrafo 3, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 18. 6. O método de qualquer um dos parágrafos 3-5, em que a enzima que tem atividade de mananase é termoestável. 7. O método de qualquer um dos parágrafos 1 ou 6, em que a enzima que tem atividade de mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial de pelo menos 80 °C, de preferência, pelo menos 85 °C ou pelo menos 90 °C. 8. O método de qualquer um dos parágrafos 1 ou 6 ou 7, em que a incubação no passo d. é realizada a uma temperatura de pelo menos 60 °C, tal como pelo menos 65 °C, de preferência, pelo menos 70 °C, tal como pelo menos 75 °C ou pelo menos 80 °C. 9. O método de qualquer um dos parágrafos 1 ou 6 a 8, em que a incubação no passo d é realizada durante pelo menos uma hora, de preferência, durante pelo menos 2 horas ou pelo menos 4 horas. 10. O método de qualquer um dos parágrafos 1 ou 6 a 9, em que a incubação no passo d é realizada durante 1 a 48 horas, de preferência, durante 2 a 24 horas ou 4 a 24 horas. 11. O método do parágrafo 2, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 13. 12. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a enzima que tem atividade de mananase é uma endo-beta-1,4-mananase. 13. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a enzima que tem atividade de mananase é uma GH5 endo-beta-1,4-mananase, de preferência, uma GH5_7 endo- beta-1,4-mananase ou uma GH5_8 endo-beta-1,4-mananase. 14. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma primeira extração antes do passo c. 15. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais extrações antes do passo c. 16. O método de qualquer um dos parágrafos 14 ou 15, em que uma explosão a vapor é realizada após as uma ou mais primeiras extrações (passo b) e antes do passo c. 17. O método de qualquer um dos parágrafos 14 a 16, em que uma segunda trituração dos grãos de café é realizada após as uma ou mais primeiras extrações (passo b) e antes do passo c. 18. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 100% mais matéria seca do que um extrato de café preparado por um método similar sem a adição de uma enzima que tem atividade de mananase. 19. O método de qualquer um dos parágrafos 14 a 18, em que pelo menos 8% em peso da matéria seca dos grãos de café parcialmente extraídos obtidos após o passo b é recuperada no extrato de café obtido no passo e. 20. Um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4- mananase, selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; e (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 21. O polipeptídeo do parágrafo 20 que é uma GH5_7 endo-beta-1,4-mananase. 22. O polipeptídeo do parágrafo 20 ou 21, selecionado dentre do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; e (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 23. O polipeptídeo do parágrafo 20 ou 21, selecionado dentre do grupo que consiste em (a) um polipeptídeo que se difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; e (b) um polipeptídeo que se difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 24. O polipeptídeo do parágrafo 20 ou 21, selecionado dentre do grupo que consiste em (a) um polipeptídeo que se difere em até 5 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; e (b) um polipeptídeo que se difere em até 5 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 25. O polipeptídeo do parágrafo 20 que compreende ou que consiste em: (a) o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; ou (b) o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 26. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20 a 25, que é um polipeptídeo isolado. 27. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20-26. 28. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20 a 26 para o tratamento de café. 29. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20 a 26 para o tratamento de grãos de café torrados e triturados. 30. O uso do parágrafo 29, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 31. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. adicionar aos ditos grãos de café água e o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20 a 26; c. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e d. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. 32. O método do parágrafo 31, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 33. Um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20-26. 34. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 33 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. 35. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 33 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo. 36. Um método de produção do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20-26, compreendendo cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 37. O método do parágrafo 36, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 38. Um método de produção de um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase, compreendendo cultivo da célula hospedeira do parágrafo 35 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 39. O método do parágrafo 38, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 40. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 20-26. 41. Um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4- mananase, selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. 42. O polipeptídeo do parágrafo 41 que é uma GH5_7 endo-beta-1,4-mananase. 43. O polipeptídeo do parágrafo 41 ou 42 que tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8. 44. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 43 que se difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8. 45. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 44 que é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência, condições de baixa- média estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii). 46. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-45 que é codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 ou sua sequência de cDNA. 47. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-46, que compreende ou que consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 8. 48. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 46 que é uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. 49. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-46, que é um fragmento de SEQ ID NO: 8, em que o fragmento tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. 50. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 49 que é obtido a partir de Chaetomium. 51. O polipeptídeo do parágrafo 50 que é obtido a partir de Chaetomium virescens. 52. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 51 que é um polipeptídeo isolado. 53. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-51. 54. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 51 para o tratamento de café. 55. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 51 para o tratamento de grãos de café torrados e triturados. 56. O uso do parágrafo 55, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 57. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. adicionar aos ditos grãos de café água e o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41 a 51; c. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e d. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. 58. O método do parágrafo 57, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 59. Um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-51. 60. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 59 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. 61. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 59 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo. 62. Um método de produção do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-51, compreendendo cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 63. O método do parágrafo 62, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 64. Um método de produção de um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase, compreendendo cultivo da célula hospedeira do parágrafo 61 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 65. O método do parágrafo 64, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 66. Um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo de sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 7. 67. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 41-51. 68. Um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4- mananase, selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. 69. O polipeptídeo do parágrafo 68 que é uma GH5_7 endo-beta-1,4-mananase. 70. O polipeptídeo do parágrafo 68 ou 69, tendo pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 71. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 70 que se difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 72. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 71 que é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência, condições de baixa- média estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii). 73. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-72 que é codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 ou sua sequência de cDNA. 74. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-73, que compreende ou que consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 13. 75. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 73 que é uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições. 76. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-74, que é um fragmento de SEQ ID NO: 13, em que o fragmento tem atividade de endo-beta-1,4-mananase. 77. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 76 que é obtido a partir de Sordaria. 78. O polipeptídeo do parágrafo 77 que é obtido a partir de Sordaria macrospora. 79. O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 78 que é um polipeptídeo isolado. 80. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-78. 81. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 78 para o tratamento de café. 82. Uso do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 78 para o tratamento de grãos de café torrados e triturados. 83. O uso do parágrafo 82, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 84. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. adicionar aos ditos grãos de café água e o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68 a 78; c. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e d. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. 85. O método do parágrafo 84, em que os grãos de café torrados e triturados foram parcialmente extraídos. 86. Um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-78. 87. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 86 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. 88. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 86 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo. 89. Um método de produção do polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-78, compreendendo cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 90. O método do parágrafo 89, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 91. Um método de produção de um polipeptídeo que tem atividade de endo-beta-1,4-mananase, compreendendo cultivo da célula hospedeira do parágrafo 88 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 92. O método do parágrafo 91, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. 93. Um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo de sinal compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 12. 94. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 68-78. 95. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 19 em que a enzima que tem atividade de mananase compreende um domínio de ligação de CBM1. 96. Um método para produção de um extrato de café, compreendendo os passos de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. realizar, opcionalmente, uma ou mais primeiras extrações dos ditos grãos de café; c. adicionar aos ditos grãos de café, que foram, opcionalmente, submetidos a uma ou mais primeiras extrações, água e uma enzima que tem atividade de mananase; d. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e e. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos. em que a enzima que tem atividade de mananase compreende um domínio de ligação de CBM1. 97. O método do parágrafo 96, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19. 98. O método de qualquer um dos parágrafos 96 ou 97, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 19. 99. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 98, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 3. 100. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 98, em que a enzima que tem atividade de mananase tem pelo menos 60% de identidade de sequências, de preferência, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 19. 101. O método de qualquer um dos parágrafos 96-100, em que a enzima que tem atividade de mananase é termoestável. 102. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 101, em que a enzima que tem atividade de mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial de pelo menos 80 °C, de preferência, pelo menos 85 °C ou pelo menos 90 °C. 103. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 102, em que a incubação no passo d. é realizada a uma temperatura de pelo menos 60 °C, tal como pelo menos 65 °C, de preferência, pelo menos 70 °C, tal como pelo menos 75 °C ou pelo menos 80 °C. 104. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 103, em que a incubação no passo d é realizada durante pelo menos uma hora, de preferência, durante pelo menos 2 horas ou pelo menos 4 horas. 105. O método de qualquer um dos parágrafos 96 ou 104, em que a incubação no passo d é realizada durante 1 a 48 horas, de preferência, durante 2 a 24 horas ou 4 a 24 horas. 106. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 105, em que a enzima que tem atividade de mananase é uma endo- beta-1,4-mananase. 107. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 106, em que a enzima que tem atividade de mananase é uma GH5 endo-beta-1,4-mananase, de preferência, uma GH5_7 endo- beta-1,4-mananase ou uma GH5_8 endo-beta-1,4-mananase. 108. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 107, em que os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma primeira extração antes do passo c. 109. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 108, em que os grãos de café torrados e triturados são submetidos a um ou mais extrações antes do passo c. 110. O método de qualquer um dos parágrafos 108-109, em que uma explosão a vapor é realizada após as uma ou mais primeiras extrações (passo b) e antes do passo c. 111. O método de qualquer um dos parágrafos 108 a 110, em que uma segunda trituração dos grãos de café é realizada após as uma ou mais primeiras extrações (passo b) e antes do passo c. 112. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 111, em que o extrato de café obtido no passo e compreende pelo menos 100% mais matéria seca do que um extrato de café preparado por um método similar sem a adição de uma enzima que tem atividade de mananase. 113. O método de qualquer um dos parágrafos 96 a 112, em que pelo menos 8% em peso da matéria seca dos grãos de café parcialmente extraídos obtidos após o passo b é recuperada no extrato de café obtido no passo e. Exemplos Enzimas

[0243]

Materiais

[0244] Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais pelo menos de grau reagente. Meios e Soluções

[0245] O meio YP + glucose a 2% era composto por extrato de levedura a 1%, peptona a 2% e glucose a 2%.

[0246] As placas de ágar PDA eram compostas por infusão de batata (a infusão de batata foi preparada por ebulição de 300 g de batatas fatiadas (lavadas, mas não descascadas) em água durante 30 minutos e depois decantação ou coação do caldo através de gaze). Água destilada foi depois adicionada até o volume total da suspensão ser um litro, seguido por adição de 20 g de dextrose e 20 g de pó de ágar. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 0,1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998).

[0247] As placas LB eram constituídas por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto e água desionizada até 1 litro. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 0,1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998).

[0248] As placas de sacarose COVE eram compostas por 342 g de Sacarose (Sigma S-9378), 20 g de pó de Ágar, 20 ml de solução de sais Cove (26 g de MgSO4.7H2O, 26 g de KCl, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solução de metais vestigiais Cove) e água desionizada até 1 litro) e água desionizada até 1 litro). O meio foi esterilizado por autoclavagem a 0,1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C, e foram adicionados acetamida a 10 mM, CsCl a 15 mM, TRITON X100 (50 μl/500 ml).

[0249] A solução de metais vestigiais Cove era composta por 0,04 g de Na2B4O7^10H2O, 0,4 g de CuSO4^5H2O, 1,2 g de FeSO4^7H2O, 0,7 g de MnSO4^H2O, 0,8 g de Na2MoO4^2H2O, 10 g de ZnSO4-7H2O e água desionizada até 1 litro. Exemplo 1: Clonagem, expressão e purificação da endo-mananase de Talaromyces leycettanus(MANANASE 1) Cepas

[0250] A cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68 foi usada como a fonte de um polipeptídeo que tem atividade de mananase. A cepa de Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para a expressão do gene de Talaromyces leycettanus codificando o polipeptídeo com atividade de mananase. A. oryzae MT3568 é um derivado genético de amdS (acetamidase) destruído de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 02/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por destruição do gene de acetamidase (amdS) de A. oryzae. Fonte de informações de sequência de DNA para a Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68

[0251] Informação de sequências genômicas foi gerada por sequenciação de DNA Illumina no Beijing Genome Institute (BGI) em Pequim, China, a partir de DNA genômico isolado da Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68. Uma montagem preliminar do genoma foi analisada usando a Suíte de Análise de Sequências Pedant-ProTM (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemanha). Modelos de genes construídos pelo software foram usados como um ponto de partida para detecção de homólogos de GH5 no genoma. Modelos de genes mais precisos foram manualmente construídos usando múltiplas sequências de proteínas conhecidas de GH5 como uma orientação. Extração de DNA genômico da Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68

[0252] Para gerar DNA genômico para amplificação por PCR, a Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68 foi propagada em placas de ágar PDA por cultivo a 26 °C por 7 dias. Esporos coletados das placas PDA foram usados para inocular 25 ml de meio YP + glucose a 2% em um frasco agitado com chicanas e incubados a 26 °C durante 72 horas com agitação a 85 rpm.

[0253] O DNA genômico foi isolado de acordo com um protocolo modificado do Kit DNeasy Plant Maxi (QIAGEN Danmark, Copenhaga, Dinamarca). O material fúngico da cultura acima foi coletado por centrifugação a 14.000 x g durante 2 minutos. O sobrenadante foi removido, e 0,5 g do pélete foi congelado em nitrogênio líquido com areia de quartzo e triturado em um pó fino em um almofariz pré-refrigerado. O pó foi transferido para um tubo de centrífuga de 15 ml, e adicionados 5 ml de tampão AP1 (pré-aquecido até 65 °C) e 10 μl de solução estoque de RNase A (100 mg/ml) seguido por vórtex vigoroso. Após incubação durante 10 minutos a 65 °C com inversão regular do tubo, 1,8 ml de tampão AP2 foi adicionado ao lisato por mistura gentil seguida por incubação em gelo durante 10 min. O lisato foi depois centrifugado a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi decantado em uma coluna QIAshredder maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml. Isto foi seguido por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi transferido para um novo tubo de 50 ml e adicionado 1,5 volume de tampão AP3/E seguido por vórtex. 15 ml da amostra foram transferidos para uma coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi descartado, e 12 ml de tampão AW foram adicionados à coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após descarte do fluxo contínuo, a centrifugação foi repetida para descartar o álcool restante. A coluna DNeasy Maxi spin foi transferida para um novo tubo de 50 ml, e 0,5 ml de tampão AE (pré- aquecido até 70 °C) foi adicionado. Após incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente, a amostra foi eluída por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. A eluição foi repetida com 0,5 ml adicional de tampão AE, e os eluatos foram combinados. A concentração do DNA coletado foi medida por um espectrofotômetro de UV a 260 nm. Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae contendo sequência genômica da Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68 codificando um polipeptídeo da Família GH5 que tem atividade de mananase

[0254] Dois iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos mostrados abaixo foram planejados para amplificar por PCR o gene P23YST da Cepa de Talaromyces leycettanus CBS398.68 (SEQ ID NO: 1) do DNA genômico preparado conforme descrito acima. Foi usado um Kit de Clonagem IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pDau109 (WO 2005/042735). F-P23YST 5'-acacaactggggatccaccATGAAGTTGTCTACCCTCAATTTCCT-3' (SEQ ID NO: 4) R-P23YST 5'-ccctctagatctcgagCACGTCAGTATCAGCGAAGCAT-3' (SEQ ID NO: 5)

[0255] As maiúsculas representam uma sequência de genes. A sequência sublinhada é homóloga com os locais de inserção de pDau109.

[0256] Um dispositivo PTC-200 DNA da MJ Research foi usado para realizar as reações PCR. Foi usado um Kit de PCR Phusion® High-Fidelity (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) para a amplificação por PCR. A reação PCR era composta por 5 μl de 5X tampão HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 0,5 μl de dNTPs (10 mM), 0,5 μl de DNA polimerase Phusion® (0,2 unidades/μl) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 2 μl de iniciador F-P23YST (2,5 μM), 2 μl de iniciador R-P23YST (2,5 μM), 0,5 μl de DNA genômico de Talaromyces leycettanus (100 ng/μl) e 14,5 μl de água desionizada em um volume total de 25 μl. As condições de PCR foram 1 ciclo a 95 °C durante 2 minutos. 35 ciclos cada um a 98 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 2 minutos; e 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. A amostra foi então mantida a 12 °C até ser removida da máquina de PCR.

[0257] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando Tris base a 40 mM, acetato de sódio a 20 mM, tampão de EDTA dissódico (TAE) a 1 mM em que uma banda de produto de 1.613 pb foi excisada do gel e purificada usando um Kit illustra GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento foi depois clonado em pDau109 digerido com Bam HI e Xho I usando um Kit de Clonagem IN-FUSION™ resultando no plasmídeo pP23YST. A clonagem do gene P23YST em pDau109 digerido com Bam HI-Xho I resultou na transcrição do gene P23YST de Talaromyces leycettanus sob o controle de um promotor duplo NA2-tpi. NA2-tpi é um promotor modificado do gene codificando a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando a triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0258] O protocolo de clonagem foi realizado de acordo com as instruções do Kit de Clonagem IN-FUSION™ gerando um construto de P23YST GH5. Os plasmídeos e inserções tratados 97/127 foram transformados em células de E. coli Quimicamente Competentes ONE SHOT® TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e plaqueados em placas LB suplementadas com 0,1 mg de ampicilina por ml. Após incubação a 37 °C durante a noite foram vistas colônias crescendo sob seleção nas placas LB com ampicilina. Duas colônias transformadas com o construto P23YST GH5 foram cultivadas em meio LB suplementado com 0,1 mg de ampicilina por ml, e o plasmídeo foi isolado com um Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0259] Os plasmídeos isolados foram sequenciados com iniciadores de vetores e iniciadores específicos quanto ao gene P23YST de modo a se determinar um clone de expressão de plasmídeo representativo que estivesse isento de erros de PCR. Caracterização da sequência genômica de Talaromyces leycettanus CBS398.68 codificando um polipeptídeo P23YST GH5 que tem atividade de mananase

[0260] A sequenciação de DNA do clone genômico P23YST GH5 de Talaromyces leycettanus CBS398.68 foi realizada com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 3700 da Applied Biosystems usando química de terminador BIG-DYE™ versão 3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA) e estratégia de caminhada de iniciadores. Os dados das sequências de nucleotídeos foram escrutinados quanto à qualidade, e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, EUA).

[0261] A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida do gene P23YST de Talaromyces leycettanus são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. A sequência codificante tem 1.548 pb incluindo o códon de terminação e está interrompida por três íntrons. A proteína prevista codificada tem 431 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foi previsto um peptídeo sinal de 17 resíduos. A proteína madura prevista (SEQ ID NO: 3) contém 414 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 45 kDa e um ponto isoelétrico de 4,8. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 mostrou atividade de mananase conforme mostrado abaixo.

[0262] Foi determinado um alinhamento global de par a par comparativo de sequências de aminoácidos usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) com penalidade por intervalo aberto de 10, penalidade pela extensão do intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do gene de Talaromyces leycettanus codificando o polipeptídeo P23YST GH5 que tem atividade de mananase partilha 71% de identidade (excluindo intervalos) com a sequência de aminoácidos deduzida de uma proteína da família GH5 de Talaromyces stipitatus (número de acesso SWISSPROT:B8M6W7) com atividade de endo mananase. Expressão da GH5 mananase de Talaromyces leycettanus (MANANASE 1)

[0263] O plasmídeo de expressão pP23YST foi transformado em Aspergillus oryzae MT3568. Aspergillus oryzae MT3568 é um derivado de AMDS (acetamidase) desagregado de JaL355 (WO 02/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restaurada no processo de desativação do gene da acetamidase (AMDS) de Aspergillus oryzae. Protoplastos de MT3568 são preparados de acordo com o método da Patente Europeia n° 0238023, páginas 14-15, que são incorporadas aqui por referência.

[0264] Os transformantes foram purificados em placas de seleção com sucrose COVE mediante conídios isolados antes da sua esporulação em placas PDA. A produção do polipeptídeo GH5 de Talaromyces leycettanus pelos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura de cultivos estacionários em 96 poços profundos de 1 ml a 30 °C em meio YP + glucose a 2%. A expressão foi verificada em um gel de SDS-PAGE 8% em 48 poços E-Page (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por coloração com Coomassie. Um transformante foi selecionado para manipulação adicional e designado Aspergillus oryzae 11.7.

[0265] Para produção a maior escala, esporos de Aspergillus oryzae 11.7 foram espalhados em uma placa PDA e incubados durante cinco dias a 37 °C. A placa de esporos confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de TWEEN® 20 a 0,01% para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão de esporos foi depois usada para inocular quinze frascos de 500 ml contendo 150 ml de meio Dap-4C (WO 2012/103350). A cultura foi incubada a 30 °C com agitação constante a 100 rpm. No quarto dia pós-inoculação, o caldo de cultura foi coletado por filtração através de um filtro de PES de gargalo MF75 Supor MachV de 0,2 μm (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). O caldo de cultura fresco deste transformante produziu uma banda de proteína GH5 de aproximadamente 42 kDa. A identidade da banda proeminente como o polipeptídeo GH5 de Talaromyces leycettanus foi verificada por sequenciação de peptídeos. Método alternativo para a produção da GH5 mananase de Talaromyces leycettanus (MANANASE 1)

[0266] Com base na sequência de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 1, um gene sintético pode ser obtido a partir de vários vendedores, tais como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) ou DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, EUA). O gene sintético pode ser planejado para incorporar sequências de DNA adicionais, tais como sítios de restrição ou regiões de recombinação homóloga, para facilitar a clonagem em um vetor de expressão.

[0267] Usando os dois iniciadores oligonucleotídicos sintéticos F-P23YST e R-P23YST descritos acima, uma reação de PCR simples pode ser usada para amplificar a fase de leitura aberta completa do gene sintético da SEQ ID NO: 1. O gene pode ser depois clonado em um vetor de expressão, por exemplo, como descrito acima, e expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, em Aspergillus oryzae como descrito acima. Purificação da GH5 mananase de Talaromyces leycettanus (MANANASE 1)

[0268] O caldo filtrado foi ajustado até pH 7,0 e filtrado em filtro PES de 0,22 μm (Nalge Nunc International, cat de material laboratorial da Nalgene n° 595-4520). Em seguida, ao filtrado foi adicionado sulfato de amônio a 1,8 M. O filtrado foi carregado em uma coluna de Fluxo Rápido Phenyl Sepharose™ 6 (elevada sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em sulfato de amônio a 1,8 M, HEPES a 25 mM pH 7,0. Após lavagem com sulfato de amônio a 1,0 M, as proteínas ligadas foram eluídas em lotes com HEPES a 25 mM pH 7.0. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. As frações foram agrupadas e aplicadas a uma coluna Sephadex™ G-25 (meio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em HEPES a 25 mM pH 7,5. As frações foram aplicadas a uma coluna SOURCE™ 15Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em HEPES a 25 mM pH 7,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear a partir de cloreto de sódio a 0 a 1.000 mM ao longo de 20 CV. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. Exemplo 2. Clonagem, expressão e purificação da endo-mananase de Chaetomium virescens (MANANASE 2) Cepas

[0269] Chaetomium virescens CBS547.75 foi usado como a fonte de um polipeptídeo que tem atividade de mananase. A cepa de Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para a expressão do gene de Chaetomium virescens codificando o polipeptídeo com atividade de mananase. A. oryzae MT3568 é um derivado genético de amdS (acetamidase) destruído de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por destruição do gene de acetamidase (amdS) de A. oryzae. Fonte de informações de sequência de DNA para a Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75

[0270] Informação de sequências genômicas foi gerada por sequenciação de DNA Illumina no The National Center for Genome Resources em Santa Fe, Novo México do DNA genômico isolado da Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75. Uma montagem preliminar do genoma foi analisada com o uso do Montador de Sequências Abyss 1.2.0 (GSC Software Center, Vancouver, Canadá). Modelos de genes construídos pelo software foram usados como um ponto de partida para detecção de homólogos de GH5 no genoma. Modelos de genes mais precisos foram manualmente construídos usando múltiplas sequências de proteínas conhecidas de GH5 como uma orientação. Extração de DNA genômico da Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75

[0271] Para gerar DNA genômico para amplificação por PCR, a Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75 foi propagada em placas de ágar PDA por cultivo a 26 °C por 7 dias. Esporos coletados das placas PDA foram usados para inocular 25 ml de meio YP + glucose a 2% em um frasco agitado com chicanas e incubados a 26 °C durante 72 horas com agitação a 85 rpm.

[0272] O DNA genômico foi isolado de acordo com um protocolo modificado do Kit DNeasy Plant Maxi (QIAGEN Danmark, Copenhaga, Dinamarca). O material fúngico da cultura acima foi coletado por centrifugação a 14.000 x g durante 2 minutos. O sobrenadante foi removido, e 0,5 g do pélete foi congelado em nitrogênio líquido com areia de quartzo e triturado em um pó fino em um almofariz pré-refrigerado. O pó foi transferido para um tubo de centrífuga de 15 ml, e adicionados 5 ml de tampão AP1 (pré-aquecido até 65 °C) e 10 μl de solução estoque de RNase A (100 mg/ml) seguido por vórtex vigoroso. Após incubação durante 10 minutos a 65 °C com inversão regular do tubo, 1,8 ml de tampão AP2 foi adicionado ao lisato por mistura gentil seguida por incubação em gelo durante 10 min. O lisato foi depois centrifugado a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi decantado em uma coluna QIAshredder maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml. Isto foi seguido por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi transferido para um novo tubo de 50 ml e adicionado 1,5 volume de tampão AP3/E seguido por vórtex. 15 ml da amostra foram transferidos para uma coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi descartado, e 12 ml de tampão AW foram adicionados à coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após descarte do fluxo contínuo, a centrifugação foi repetida para descartar o álcool restante. A coluna DNeasy Maxi spin foi transferida para um novo tubo de 50 ml, e 0,5 ml de tampão AE (pré- aquecido até 70 °C) foi adicionado. Após incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente, a amostra foi eluída por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. A eluição foi repetida com 0,5 ml adicional de tampão AE, e os eluatos foram combinados. A concentração do DNA coletado foi medida por um espectrofotômetro de UV a 260 nm. Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae contendo sequência genômica da Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75 codificando um polipeptídeo da Família GH5 que tem atividade de mananase

[0273] Dois iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos mostrados abaixo foram planejados para amplificar por PCR o gene P23NUR da Cepa de Chaetomium virescens CBS547.75 (SEQ ID NO: 6) do DNA genômico preparado conforme descrito acima. Foi usado um Kit de Clonagem IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pDau109 (WO 2005/042735). F-P23NUR 5'-acacaactggggatccaccATGAAGGCAATCCTCACAGCC-3' (SEQ ID NO: 9) R-P23NUR 5'-ccctctagatctcgagTGCGTATCACGGGACTTCAGA-3' (SEQ ID NO: 10)

[0274] As maiúsculas representam uma sequência de genes. A sequência sublinhada é homóloga com os locais de inserção de pDau109.

[0275] Um dispositivo PTC-200 DNA da MJ Research foi usado para realizar as reações PCR. Foi usado um Kit de PCR Phusion® High-Fidelity (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) para a amplificação por PCR. A reação PCR era composta por 5 μl de 5X tampão HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 0,5 μl de dNTPs (10 mM), 0,5 μl de DNA polimerase Phusion® (0,2 unidades/μl) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 2 μl de iniciador F-P23NUR (2,5 μM), 2 μl de iniciador R-P23NUR (2,5 μM), 0,5 μl de DNA genômico de Chaetomium virescens (100 ng/μl) e 14,5 μl de água desionizada em um volume total de 25 μl. As condições de PCR foram 1 ciclo a 95 °C durante 2 minutos. 35 ciclos cada um a 98 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 2,5 minutos; e 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. A amostra foi então mantida a 12 °C até ser removida da máquina de PCR.

[0276] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando Tris base a 40 mM, acetato de sódio a 20 mM, tampão de EDTA dissódico (TAE) a 1 mM em que uma banda de produto de 1.288 pb foi excisada do gel e purificada usando um Kit illustra GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento foi depois clonado em pDau109 digerido com Bam HI e Xho I usando um Kit de Clonagem IN-FUSION™ resultando no plasmídeo pP23NUR. A clonagem do gene P23NUR em pDau109 digerido com Bam HI-Xho I resultou na transcrição do gene P23NUR de Chaetomium virescens sob o controle de um promotor duplo NA2-tpi. NA2-tpi é um promotor modificado do gene 105/127 codificando a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando a triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0277] O protocolo de clonagem foi realizado de acordo com as instruções do Kit de Clonagem IN-FUSION™ gerando um construto de P23NUR GH5. Os plasmídeos e inserções tratados foram transformados em células de E. coli Quimicamente Competentes ONE SHOT® TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e plaqueados em placas LB suplementadas com 0,1 mg de ampicilina por ml. Após incubação a 37 °C durante a noite foram vistas colônias crescendo sob seleção nas placas LB com ampicilina. Quatro colônias transformadas com o construto P23NUR GH5 foram cultivadas em meio LB suplementado com 0,1 mg de ampicilina por ml, e o plasmídeo foi isolado com um Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0278] Os plasmídeos isolados foram sequenciados com iniciadores de vetores e iniciadores específicos quanto ao gene P23NUR de modo a se determinar um clone de expressão de plasmídeo representativo que estivesse isento de erros de PCR. Caracterização da sequência genômica de Chaetomium virescens CBS547.75 codificando um polipeptídeo P23NUR GH5 que tem atividade de mananase

[0279] A sequenciação de DNA do clone genômico P23NUR GH5 de Chaetomium virescens CBS547.75 foi realizada com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 3700 da Applied Biosystems usando química de terminador BIG-DYE™ versão 3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA) e estratégia de caminhada de iniciadores. Os dados das sequências de nucleotídeos foram escrutinados quanto à qualidade, e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, EUA).

[0280] A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida do gene P23NUR de Chaetomium virescens são mostradas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente. A sequência codificante tem 1.222 pb incluindo o códon de terminação e está interrompida por dois íntrons. A proteína prevista codificada tem 367 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foi previsto um peptídeo sinal de 17 resíduos. A proteína madura prevista (SEQ ID NO: 8) contém 350 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 39 kDa e um ponto isoelétrico de 6,9. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 8 mostrou atividade de mananase conforme mostrado abaixo.

[0281] Foi determinado um alinhamento global de par a par comparativo de sequências de aminoácidos usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) com penalidade por intervalo aberto de 10, penalidade pela extensão do intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do gene de Chaetomium virescens codificando o polipeptídeo P23NUR GH5 que tem atividade de mananase partilha 86% de identidade (excluindo intervalos) com a sequência de aminoácidos deduzida de uma proteína da família GH5 de Chaetomium virescens (número de acesso SWISSPROT:Q2H1Y9) com atividade desconhecida. Expressão da GH5 mananase de Chaetomium virescens P23NUR

[0282] O plasmídeo de expressão pP23NUR foi transformado em Aspergillus oryzae MT3568. Aspergillus oryzae MT3568 é um derivado de AMDS (acetamidase) desagregado de JaL355 (WO 02/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restaurada no processo de desativação do gene da acetamidase (AMDS) de Aspergillus oryzae. Protoplastos de MT3568 são preparados de acordo com o método da Patente Europeia n° 0238023, páginas 14-15, que são incorporadas aqui por referência.

[0283] Os transformantes foram purificados em placas de seleção com sucrose COVE mediante conídios isolados antes da sua esporulação em placas PDA. A produção do polipeptídeo GH5 de Chaetomium virescens pelos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura de cultivos estacionários em 96 poços profundos de 1 ml a 30 °C em meio YP + glucose a 2%. A expressão foi verificada em um gel de SDS-PAGE 8% em 48 poços E-Page (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por coloração com Coomassie. Um transformante foi selecionado para manipulação adicional e designado Aspergillus oryzae 29.8.

[0284] Para produção a maior escala, esporos de Aspergillus oryzae 29.8 foram espalhados em uma placa PDA e incubados durante cinco dias a 37 °C. A placa de esporos confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de TWEEN® 20 a 0,01% para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão de esporos foi depois usada para inocular quinze frascos de 500 ml contendo 150 ml de meio Dap-4C (WO 2012/103350). A cultura foi incubada a 30 °C com agitação constante a 100 rpm. No quarto dia pós-inoculação, o caldo de cultura foi coletado por filtração através de um filtro de PES de gargalo MF75 Supor MachV de 0,2 μm (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). O caldo de cultura fresco deste transformante produziu duas bandas de proteína GH5 de aproximadamente 45 e 50 kDa. A identidade das duas bandas como o polipeptídeo GH5 de Chaetomium virescens foi verificada por sequenciação de peptídeos. A diferença entre o tamanho aparente e o observado das proteínas recombinantes pode ser provavelmente atribuída à glicosilação e/ou outras modificações pós-traducionais. Método alternativo para a produção da GH5 mananase de Chaetomium virescens (MANANASE 2)

[0285] Com base na sequência de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 6, um gene sintético pode ser obtido a partir de vários vendedores, tais como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) ou DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, EUA). O gene sintético pode ser planejado para incorporar sequências de DNA adicionais, tais como sítios de restrição ou regiões de recombinação homóloga, para facilitar a clonagem em um vetor de expressão.

[0286] Usando os dois iniciadores oligonucleotídicos sintéticos F-P23NUR e R-P23NUR descritos acima, uma reação de PCR simples pode ser usada para amplificar a fase de leitura aberta completa do gene sintético da SEQ ID NO: 4. O gene pode ser depois clonado em um vetor de expressão, por exemplo, como descrito acima, e expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, em Aspergillus oryzae como descrito acima. Purificação da endo-mananase de Chaetomium virescens (MANANASE 2)

[0287] O caldo filtrado foi ajustado até pH 7,0 e filtrado em filtro PES de 0,22 μm (Nalge Nunc International, cat de material laboratorial da Nalgene n° 595-4520). Em seguida, ao filtrado foi adicionado sulfato de amônio a 1,8 M. O filtrado foi carregado em uma coluna de Fluxo Rápido Phenyl Sepharose™ 6 (elevada sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em sulfato de amônio a 1,8 M, HEPES a 25 mM pH 7,0. Após lavagem com sulfato de amônio a 1,0 M, as proteínas ligadas foram eluídas em lotes com HEPES a 25 mM pH 7.0. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. As frações foram agrupadas e aplicadas a uma coluna Sephadex™ G-25 (meio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em ácido acético a 12,5 mM pH 4,3 ajustado com NaOH. As frações foram aplicadas a uma coluna SOURCE™ 15S (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em ácido acético a 12,5 mM pH 4,3/NaOH, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear a partir de cloreto de sódio a 0 a 1.000 mM ao longo de 20 CV. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. Exemplo 3: Clonagem, expressão e purificação da endo-mananase de Sordaria macrospora(MANANASE 3) Cepas

[0288] Sordaria macrospora DSM997 foi usado como a fonte de um polipeptídeo que tem atividade de mananase. A cepa de Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para a expressão do gene de Sordaria macrospora codificando o polipeptídeo com atividade de mananase. A. oryzae MT3568 é um derivado genético de amdS (acetamidase) destruído de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por destruição do gene de acetamidase (amdS) de A. oryzae. Extração de DNA genômico da Cepa de Sordaria macrospora DSM997

[0289] Para gerar DNA genômico para amplificação por PCR, a Cepa de Sordaria macrospora DSM997 foi propagada em placas de ágar PDA por cultivo a 26 °C por 7 dias. Esporos coletados das placas PDA foram usados para inocular 25 ml de meio YP + glucose a 2% em um frasco agitado com chicanas e incubados a 26 °C durante 72 horas com agitação a 85 rpm.

[0290] O DNA genômico foi isolado de acordo com um protocolo modificado do Kit DNeasy Plant Maxi (QIAGEN Danmark, Copenhaga, Dinamarca). O material fúngico da cultura acima foi coletado por centrifugação a 14.000 x g durante 2 minutos. O sobrenadante foi removido, e 0,5 g do pélete foi congelado em nitrogênio líquido com areia de quartzo e triturado em um pó fino em um almofariz pré-refrigerado. O pó foi transferido para um tubo de centrífuga de 15 ml, e adicionados 5 ml de tampão AP1 (pré-aquecido até 65 °C) e 10 μl de solução estoque de RNase A (100 mg/ml) seguido por vórtex vigoroso. Após incubação durante 10 minutos a 65 °C com inversão regular do tubo, 1,8 ml de tampão AP2 foi adicionado ao lisato por mistura gentil seguida por incubação em gelo durante 10 min. O lisato foi depois centrifugado a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi decantado em uma coluna QIAshredder maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml. Isto foi seguido por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi transferido para um novo tubo de 50 ml e adicionado 1,5 volume de tampão AP3/E seguido por vórtex. 15 ml da amostra foram transferidos para uma coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O fluxo contínuo foi descartado, e 12 ml de tampão AW foram adicionados à coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 ml e centrifugados a 3.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após descarte do fluxo contínuo, a centrifugação foi repetida para descartar o álcool restante. A coluna DNeasy Maxi spin foi transferida para um novo tubo de 50 ml, e 0,5 ml de tampão AE (pré- aquecido até 70 °C) foi adicionado. Após incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente, a amostra foi eluída por centrifugação a 3.000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. A eluição foi repetida com 0,5 ml adicional de tampão AE, e os eluatos foram combinados. A concentração do DNA coletado foi medida por um espectrofotômetro de UV a 260 nm. Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae contendo sequência genômica da Cepa de Sordaria macrospora DSM997 codificando um polipeptídeo da Família GH5 que tem atividade de mananase

[0291] Dois iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos mostrados abaixo foram planejados para amplificar por PCR o gene P2453A da Cepa de Sordaria macrospora DSM997 (SEQ ID NO: 11) do DNA genômico preparado conforme descrito acima. P2453A corresponde à sequência genômica de entrada no SwissProt D1ZM91, anotada como uma GH5 celulase putativa. Foi usado um Kit de Clonagem IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pDau109 (WO 2005/042735). F-P2453A 5'-acacaactggggatccaccATGAAGTCCTTGTTCACCCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 14) R-P2453A 5'-ccctctagatctcgagGTACGCAGCCACGGCGACA-3' (SEQ ID NO: 15)

[0292] As maiúsculas representam uma sequência de genes. A sequência sublinhada é homóloga com os locais de inserção de pDau109.

[0293] Um dispositivo PTC-200 DNA da MJ Research foi usado para realizar as reações PCR. Foi usado um Kit de PCR Phusion® High-Fidelity (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) para a amplificação por PCR. A reação PCR era composta por 5 μl de 5X tampão HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 0,5 μl de dNTPs (10 mM), 0,5 μl de DNA polimerase Phusion® (0,2 unidades/μl) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 2 μl de iniciador F-P2453A (2,5 μM), 2 μl de iniciador R-P2453A (2,5 μM), 0,5 μl de DNA genômico de Sordaria macrospora (100 ng/μl) e 14,5 μl de água desionizada em um volume total de 25 μl. As condições de PCR foram 1 ciclo a 95 °C durante 2,5 minutos. 35 ciclos cada um a 98 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 2,5 minutos; e 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. A amostra foi então mantida a 12 °C até ser removida da máquina de PCR.

[0294] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando Tris base a 40 mM, acetato de sódio a 20 mM, tampão de EDTA dissódico (TAE) a 1 mM em que uma banda de produto de 1.260 pb foi excisada do gel e purificada usando um Kit illustra GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento foi depois clonado em pDau109 digerido com Bam HI e Xho I usando um Kit de Clonagem IN-FUSION™ resultando no plasmídeo pP2453A. A clonagem do gene P2453A em pDau109 digerido com Bam HI-Xho I resultou na transcrição do gene P2453A de Sordaria macrospora sob o controle de um promotor duplo NA2-tpi. NA2-tpi é um promotor modificado do gene codificando a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não 113/127 traduzido do gene codificando a triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0295] O protocolo de clonagem foi realizado de acordo com as instruções do Kit de Clonagem IN-FUSION™ gerando um construto de P2453A GH5. Os plasmídeos e inserções tratados foram transformados em células de E. coli Quimicamente Competentes ONE SHOT® TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e plaqueados em placas LB suplementadas com 0,1 mg de ampicilina por ml. Após incubação a 37 °C durante a noite foram vistas colônias crescendo sob seleção nas placas LB com ampicilina. Duas colônias transformadas com o construto P2453A GH5 foram cultivadas em meio LB suplementado com 0,1 mg de ampicilina por ml, e o plasmídeo foi isolado com um Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0296] Os plasmídeos isolados foram sequenciados com iniciadores de vetores e iniciadores específicos quanto ao gene P2453A de modo a se determinar um clone de expressão de plasmídeo representativo que estivesse isento de erros de PCR. Caracterização da sequência genômica de Sordaria macrospora DSM997 codificando um polipeptídeo P2453A GH5 que tem atividade de mananase

[0297] A sequenciação de DNA do clone genômico P2453A GH5 de Sordaria macrospora DSM997 foi realizada com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 3700 da Applied Biosystems usando química de terminador BIG-DYE™ versão 3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA) e estratégia de caminhada de iniciadores. Os dados das sequências de nucleotídeos foram escrutinados quanto à qualidade, e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, EUA).

[0298] A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida do gene P2453A de Sordaria macrospora são mostradas em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente. A sequência codificante tem 1.203 pb incluindo o códon de terminação e está interrompida por dois íntrons. A proteína prevista codificada tem 361 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) foi previsto um peptídeo sinal de 17 resíduos. A proteína madura prevista contém 344 aminoácidos (SEQ ID NO: 13) com uma massa molecular prevista de 38 kDa e um ponto isoelétrico de 6,4. O polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 mostrou atividade de mananase conforme mostrado abaixo.

[0299] Foi determinado um alinhamento global de par a par comparativo de sequências de aminoácidos usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) com penalidade por intervalo aberto de 10, penalidade pela extensão do intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do gene de Sordaria macrospora codificando o polipeptídeo P2453A GH5 que tem atividade de mananase partilha 77% de identidade (excluindo intervalos) com a sequência de aminoácidos deduzida de uma proteína da família GH5 de Chaetomium virescens (número de acesso SWISSPROT:Q2H1Y9) com atividade desconhecida. Expressão da GH5 mananase de Sordaria macrospora (MANANASE 3)

[0300] O plasmídeo de expressão pP2453A foi transformado em Aspergillus oryzae MT3568. Aspergillus oryzae MT3568 é um derivado de AMDS (acetamidase) desagregado de JaL355 (WO 02/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restaurada no processo de desativação do gene da acetamidase (AMDS) de Aspergillus oryzae. Protoplastos de MT3568 são preparados de acordo com o método da Patente Europeia n° 0238023, páginas 14-15, que são incorporadas aqui por referência.

[0301] Os transformantes foram purificados em placas de seleção com sucrose COVE mediante conídios isolados antes da sua esporulação em placas PDA. A produção do polipeptídeo GH5 de Sordaria macrospora pelos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura de cultivos estacionários em 96 poços profundos de 1 ml a 30 °C em meio YP + glucose a 2%. A expressão foi verificada em um gel de SDS-PAGE 8% em 48 poços E-Page (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por coloração com Coomassie. Um transformante foi selecionado para manipulação adicional e designado Aspergillus oryzae 46.7.

[0302] Para produção a maior escala, esporos de Aspergillus oryzae 46.7 foram espalhados em uma placa PDA e incubados durante cinco dias a 37 °C. A placa de esporos confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de TWEEN® 20 a 0,01% para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão de esporos foi depois usada para inocular quinze frascos de 500 ml contendo 150 ml de meio Dap-4C (WO 2012/103350). A cultura foi incubada a 30 °C com agitação constante a 100 rpm. No quarto dia pós-inoculação, o caldo de cultura foi coletado por filtração através de um filtro de PES de gargalo MF75 Supor MachV de 0,2 μm (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). O caldo de cultura fresco deste transformante produziu duas bandas de proteína GH5 de aproximadamente 47 e 50 kDa. A identidade das duas bandas como o polipeptídeo GH5 de Sordaria macrospora foi verificada por sequenciação de peptídeos. A diferença entre o tamanho aparente e o observado das proteínas recombinantes pode ser provavelmente atribuída à glicosilação e/ou outras modificações pós-traducionais. Método alternativo para a produção da GH5 mananase de Sordaria macrospora (MANANASE 3)

[0303] Com base na sequência de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 11, um gene sintético pode ser obtido a partir de vários vendedores, tais como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) ou DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, EUA). O gene sintético pode ser planejado para incorporar sequências de DNA adicionais, tais como sítios de restrição ou regiões de recombinação homóloga, para facilitar a clonagem em um vetor de expressão.

[0304] Usando os dois iniciadores oligonucleotídicos sintéticos F-P2453A e R-P2453A descritos acima, uma reação de PCR simples pode ser usada para amplificar a fase de leitura aberta completa do gene sintético da SEQ ID NO: 7. O gene pode ser depois clonado em um vetor de expressão, por exemplo, como descrito acima, e expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, em Aspergillus oryzae como descrito acima. Purificação da endo-mananase de Sordaria macrospora (MANANASE 3)

[0305] O caldo filtrado foi ajustado até pH 7,0 e filtrado em filtro PES de 0,22 μm (Nalge Nunc International, cat de material laboratorial da Nalgene n° 595-4520). Em seguida, ao filtrado foi adicionado sulfato de amônio a 1,8 M. O filtrado foi carregado em uma coluna de Fluxo Rápido Phenyl Sepharose™ 6 (elevada sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em sulfato de amônio a 1,8 M, HEPES a 25 mM pH 7,0. Após lavagem com sulfato de amônio a 1,0 M, as proteínas ligadas foram eluídas em lotes com HEPES a 12,5 mM pH 7.0. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. As frações foram agrupadas e aplicadas a uma coluna Sephadex™ G-25 (meio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em HEPES a 25 mM pH 7,0. As frações foram aplicadas a uma coluna SOURCE™ 15Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em HEPES a 12,5 mM pH 7,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear a partir de cloreto de sódio a 0 a 1.000 mM ao longo de 20 CV. As frações foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. A proteína foi recuperada no efluente. Exemplo 4: Termoestabilidade de mananases avaliada por DSC

[0306] MANNANASE 4 usada nesse e em alguns dos exemplos a seguir é uma GH5_8 mananase originalmente obtida a partir de Caldicellulosiruptor saccharolyticus e que tem uma sequência de aminoácidos representada pela sequência de aminoácidos maduros de SEQ ID NO: 17. A sequência de aminoácidos maduros foi determinada como os aminoácidos 28-319 por sequenciação N-terminal e espectrometria de massa (MS) da proteína comprimento total. A sequência de aminoácidos maduros é mostrada como SEQ ID NO: 18.

[0307] As termoestabilidades de MANANASE 1, MANANASE 2, MANANASE 3 e MANANASE 4 foram avaliadas por Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) na solução de tampão apropriada (acetato de Sódio a 20 mM pH 5). A temperatura correspondendo ao ápice do pico no termograma foi notada como o ponto médio de transição térmica (Tm (°C)) para as enzimas.

[0308] Tabela 1: Temperaturas no ponto médio Enzima Temperatura [0308] Tabela 1: Temperaturas no ponto médio

[0309] Para comparação, o ponto médio de transição térmica para Mannaway determinado por DSC a pH 5 é 73 °C. O ponto médio de transição térmica para Gamanase (beta-mananase de Aspergillus niger) determinado por DSC a pH 5 é 87 °C. E o ponto médio de transição térmica para beta-mananase de Trichoderma reesei usado no Exemplo 10 determinado por DSC a pH 5 é 81 °C. Exemplo 5: Atividade de mananase em AZCL-galactomanana

[0310] A atividade das mananases foi avaliada pela hidrólise de 0,2% em p/v de AZCL-galactomanana em Tampão de Britton-Robinson a 50 mM (ácido fosfórico a 50 mM, ácido acético a 50 mM, ácido bórico a 50 mM, KCl a 50 mM, CaCl2 a 1 mM) e 0,01% de Triton X-100, pH 5 a 40 °C por 10 min. As mananases experimentais e Mannaway® 25 l foram individualmente adicionadas para gerar uma concentração final de 0 a 0,01 mg/ml. As reações foram terminadas em um banho de gelo/água. Após a centrifugação (10.000 rpm, 5 min a 4 °C), os sobrenadantes foram transferidos para uma placa de microtitulação, e a absorvância a 595 nm foi medida. Os procedimentos foram realizados em triplicatas para todas as enzimas e um branco (nenhuma enzima). Para todas as 4 enzimas, uma resposta à dosagem poderia ser observada (Tabela 2).

[0311] Tabela 2. Absorvância a 600 nm.

Exemplo 6: Pré-tratamento de material de café

[0312] 800 ml de água em ebulição foram adicionados a 155 g de grãos de café Arábica torrados e triturados com um tamanho de partículas de 0,5 mm. Após incubação em um banho de água a 95 °C durante 30 min com mistura manual a cada 5 min, a pasta foi resfriada até à temperatura ambiente. Após uma filtração em vácuo inicial através de um filtro Whatman GF/D, 0 150 mm, o café gasto insolúvel no filtro foi lavado por adição de 500 a 1.000 ml de água MilliQ. O café gasto foi removido do filtro e espalhado em uma folha larga e deixado a secar durante a noite. As borras de café gastas foram adicionalmente desengorduradas por butanol saturado com água. A fração de butanol foi separada por filtração, e as borras de café gastas desengorduradas foi seca sob vácuo antes do uso. Estas borras de café gastas desengorduradas foram usadas no Exemplo 7. Exemplo 7: Hidrólise catalisada por enzimas de borras de café gastas desengorduradas a) Extração enzimática

[0313] As borras de café gastas desengorduradas produzidas de acordo com o Exemplo 6 (10% em peso) foram incubadas com água, e uma enzima adequadamente diluída (para gerar uma concentração de reação final de 1,47 nM para mananase 1 a 4 e 0,2% de Mannaway® 25 l) a 50 °C. As amostras foram retiradas após 2 e 24 horas, e a hidrólise enzimática foi interrompida imediatamente pelo aquecimento das amostras a 100 °C por 10 min. Após a centrifugação (10.000xg, 10 min) e filtração através de um filtro de 0,22 μm, os sobrenadantes foram adicionalmente analisados quanto à matéria seca, composição de carboidrato e absorvância. Os procedimentos foram realizados em duplicado para todas as enzimas e um branco (nenhuma enzima adicionada). b) Determinação de matéria seca

[0314] O conteúdo em matéria seca (DM) foi quantificado após secagem durante a noite a 110 °C de sobrenadantes a partir de borras de café gastas tratadas com enzima. O peso da matéria seca foi dividido pelo volume adicionado de sobrenadante, e um valor de DM com base em g/l foi calculado. As características do extrato com base em DM estão resumidas na Tabela 3.

[0315] Tabela 3: Matéria seca de extrato de borras gastas desengorduradas após diferentes tratamentos enzimáticos. Tratamento em enzimas

[0316] Todas as mananases experimentais solubilizam mais matéria seca do que Mannaway, tanto após 2 horas quanto 24 horas de tempo de incubação (Tabela 3). c) Análise de carboidratos

[0317] A composição em açúcares foi analisada por medição de monossacarídeos livres nos sobrenadantes por cromatografia de permuta aniônica de elevado desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Os açúcares totais foram analisados por HPAEC-PAD após hidrólise ácida em ácido trifluoroacético a 2 M durante 2 h a 95 °C. As amostras hidrolisadas por ácido foram neutralizadas por uma diluição inicial em NaOH a 0,2 M. Os monossacarídeos foram quantificados após diluições adequadas contra uma curva padrão de 5 pontos de arabinose (Ara), galactose (Gal), glucose (Glc) e manose (Man) entre 0,002 a 0,02 g/l. Os resultados podem ser vistos na Tabela 4, na Tabela 5 e na Tabela 6.

[0318] Tabela 4: Monossacarídeos livres no extrato de borras de café gastas desengorduradas após tratamento enzimático.

Tratamento em enzimas

[0319] Tabela 5: Composição em açúcar total no extrato de borras de café gastas desengorduradas após tratamento enzimático.

[0320] Tabela 6: Percentagem dos sacarídeos presentes como monossacarídeos com base no peso dos açúcares totais como monossacarídeos.

d) Absorvância

[0321] A absorvância a 361 nm de amostras foi medida após diluições adequadas de sobrenadantes e alcalinização por pelo menos uma diluição de 1:10 em Na2CO3 a 0,2 M. A divisão da absorvância pela DM (g/l) deu a medição da qualidade em relação à cor liberada por DM (Tabela 7). As mananases liberaram cor similar por DM como Mannaway.

[0322] Tabela 7: Qualidade de extrato. Absorvância de extrato após alcalinização a 361 nm por matéria seca.

Exemplo 8: Hidrólise catalisada por enzimas de borras de café gastas desengorduradas

[0323] A solubilização enzimática de borras de café desengorduradas gastas foi realizada com Mannaway e MANANASE4 com o uso do método descrito no Exemplo 7. A diferença foi que duas temperaturas foram testadas para a extração enzimática, 50°C e 80°C, e a matéria seca foi medida nos sobrenadantes resultantes.

[0324] Tabela 8. Matéria seca de extrato de borras gastas desengorduradas após diferentes tratamentos enzimáticos a 50 °C e 80 °C.

[0325] A Tabela 8 mostra claramente que usar uma mananase termoestável permite temperaturas de solubilização mais altas e atinge graus de solubilização mais altos a uma dosagem enzimática igual. Exemplo 9: Hidrólise catalisada por enzimas de borras de café gastas Preparação de café gasto

[0326] Grãos torrados de Arábica (238 g) foram triturados com o uso de uma peneira de 1 mm, e a fração triturada resultante foi extraída com água em ebulição a uma matéria seca de 20%. A temperatura após a mistura foi 87 °C. As borras de café gastas foram separadas do líquido por filtração a vácuo com o uso de filtros Whatman GF/D após 10 min de misturação. O café gasto foi lavado com um excesso de água antes da secagem durante a noite a 60 °C. Com base na matéria seca no filtrado, a divisão da matéria seca foi 25% na fase líquida e 75% na fase sólida. Hidrólise enzimática do café gasto produzido

[0327] As borras de café gastas produzidas conforme descrito acima foram incubadas a 10% em peso com água e uma mananase adequadamente diluída (para gerar uma concentração de reação final de 50 mg/l para MANANASE 1, MANANASE 4 e 0,2% em volume de Mannaway® 25 l) a 50, 70, 80 e 90 °C. As amostras foram inativadas a quente a 100 °C por 10 min após 2 ou 24 horas de hidrólise enzimática. Após a centrifugação (10.000xg, 10 min) e a filtração através de um filtro de 0,22 μm, os sobrenadantes foram analisados quanto à matéria seca. Os procedimentos foram realizados em duplicado para todas as enzimas e um branco (nenhuma enzima adicionada).

[0328] A matéria seca foi medida conforme descrito no Exemplo 7.

[0329] Tabela 9. O efeito da temperatura e do tempo no grau de solubilização do café gasto

1 Desvio padrão acima de 1 ponto percentual

[0330] Mannaway poderia solubilizar algumas das borras de café gastas a 50 °C nos tempos de incubação curto e longo, mas, a temperaturas a ou acima de 70 °C, não houve nenhuma solubilização significativa em comparação à amostra não tratada. Para MANANASE 1 e MANANASE 4, o ideal de solubilização para a incubação de enzima mais longa foi 70 °C, e, no tempo de incubação mais curto, 70 a 80 °C foi a faixa de temperatura ideal (Tabela 9). MANANASE 1 e MANANASE 4 poderiam, portanto, ser usadas a uma temperatura mais alta em que rendimentos de extração significativamente aumentados foram observados e, consequentemente, levam a uma melhor economia de processo. Exemplo 10:

[0331] As borras de café preparado de acordo com o Exemplo 6 foram usadas a uma concentração de ensaio final de 10% de matéria seca e hidrolisadas por 2 ou 24 horas a 55 °C em um termomisturador a 1.200 rpm. A concentração de enzimas foi 0,5 mg de enzima por kg de borras de café gastas. A enzima foi inativada por ebulição por 10 min, e o sobrenadante transferido para um tubo separado após 10 min de centrifugação a 10.000 rfc. Aproximadamente 0,75 g de extrato foi extraído, e o líquido evaporado a 105 °C antes da matéria seca ter sido registrada.

[0332] Gamanase é beta-mananase de Aspergillus niger. "T. reesei - CBM1" é beta-mananase de Trichoderma reesei incluindo um domínio de ligação de CBM1 que tem a sequência de aminoácidos mostrada como os aminoácidos 1 a 418 da SEQ ID NO: 19. "T. reesei - CBM1" é beta-mananase de Trichoderma reesei sem o domínio de ligação de CBM1 que tem a sequência de aminoácidos mostrada como os aminoácidos 1 a 355 da SEQ ID NO: 20.

[0333] Tabela 10. Solubilização enzimática de borras de café desengorduradas em comparação a um branco sem nenhuma enzima adicionada

[0334] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

Claims (13)

1. Método para produção de um extrato de café caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer grãos de café torrados e triturados; b. adicionar aos ditos grãos de café, água e uma enzima que tem atividade de mananase; c. incubar para produzir um extrato de café aquoso; e d. separar o extrato de café dos grãos de café extraídos, em que a enzima que tem atividade de mananase tem a sequência de SEQ ID NO: 3.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima que possui atividade de mananase é termoestável.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que a enzima que tem atividade de mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) de 80-100°C.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que a enzima com atividade mananase tem uma temperatura de fusão (Tm) determinada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) de 90-100°C.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa c é realizada durante 1-48 horas

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa c é realizada a uma temperatura de 60100°C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa c é realizada a uma temperatura de 80100°C.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a enzima que tem atividade de mananase é uma endo-beta-1,4- mananase.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a enzima que tem atividade de mananase é uma GH5 endo-beta-1,4- mananase.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os grãos de café torrados e triturados são submetidos a uma ou mais primeiras extrações antes da etapa b.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que uma explosão a vapor é realizada após a primeira extração e antes da etapa b.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma segunda trituração dos grãos de café é realizada após a primeira extração e antes da etapa b.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o extrato de café obtido na etapa d compreende 100-800% mais matéria seca do que um extrato de café preparado por um método similar sem a adição de uma enzima que tem atividade de mananase.