CN107090482A - 制备Romidepsin - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备Romidepsin。本发明提供了制备romidepsin的改进方法。所述方法包括在防止形成不希望的加合物的条件下生产、纯化或储存romidepsin。已经发现，在小于约6.0的表观pH(例如4.0至6.0的表观pH)下纯化romidepsin，防止了romidepsin的二硫键的还原以及随后二聚、低聚或聚合加合物的形成。本发明还提供了不含有二聚、低聚或聚合加合物的单体romidepsin的组合物。

Description

制备Romidepsin
本申请是申请日为2007年12月28日，申请号为200780051908.3，发明名称为“制备Romidepsin”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求U.S.临时专利申请U.S.S.N.60/882,698和U.S.S.N.60/882,704的优先权，这两篇临时专利申请都是于2006年12月29日提交的，其分别引入本文以供参考。
发明背景
Romidepsin是一种天然产物，是由Fujisawa Pharmaceuticals从紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)中分离出来的。参见出版的日本专利申请Hei 7(1995)-64872；于1990年12月11日公布的U.S.专利4,977,138，其分别引入本文以供参考。其由4个氨基酸残基(D-缬氨酸、D-半胱氨酸、dehydrobutyrine和L-缬氨酸)和一种新的酸(3-羟基-7-巯基-4-庚烯酸)组成的二环肽。Romidepsin是含有酰胺和酯键的酯肽。除了使用发酵由紫色色杆菌(C.violaceum)生产以外，romidepsin还可以通过合成或半合成方法来制备。Kahn等人报道的romidepsin的全合成涉及14个步骤，并且以18％的总收率获得了romidepsin。J.Am.Chem.Soc.118：7237-7238，1996。romidepsin的结构如下所示：
Romidepsin已经显示具有抗微生物、免疫抑制或抗肿瘤活性。目前正对Romidpesin进行测试，例如用于治疗患有血液学恶性肿瘤(例如皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、周围T-细胞淋巴瘤(PTCL)、多发性骨髓瘤等)和实体瘤(例如前列腺癌、胰腺癌等)的患者。据信其通过选择性抑制脱乙酰酶(例如组蛋白脱乙酰酶、微管蛋白脱乙酰酶)而起作用，给开发一类新的抗癌治疗提供了新的靶目标。Nakajima等人，Experimental CellRes.241：126-133，1998。一种作用模式涉及抑制一类或多类脱乙酰酶(HDAC)。
组蛋白脱乙酰酶是一种在其活性位点具有锌的金属脱乙酰化酶。Finnin等人，Nature，401：188-193，1999。据信该酶通过调节乙酰化组蛋白对DNA的亲和力来调控一些基因的表达。组蛋白的乙酰化是通过乙酰化与脱乙酰化之间的平衡而控制的。组蛋白的乙酰化在组蛋白的赖氨酸残基上发生。赖氨酸残基的乙酰化引起蛋白失去某些其正电荷，由此降低与DNA的相互作用。已经发现，Romidepsin引起处理的细胞中组蛋白和其他调控蛋白的乙酰化增加。这影响了涉及细胞周期控制、分化和凋亡的各种基因的转录控制。最近，已经发现HDAC抑制剂可用于自噬的控制。
除了romidepsin以外，已经制备和研究了多种不同衍生物。下面的专利和专利申请描述了romidepsin的各种衍生物：U.S.专利6,548,479；WO 05/0209134；WO 05/058298；和WO 06/129105；每一专利都引入本文以供参考。
在考虑将romidepsin用作药物活性剂时，需要以成本有效方式制备大量高纯化材料。已经报道了从发酵肉汤中纯化romidepsin的不同方法。U.S.专利4,977,138；国际PCT申请WO 02/20817；每一专利都引入本文以供参考。例如，WO 02/20817描述了通过向培养基中加入特定氨基酸例如L-半胱氨酸来提高发酵方法中romidepsin的收率。虽然这样的发明已经提高了通过发酵来制备romidepsin的收率，但是仍然需要为了研究和医药用途而制备大量纯romidepsin的更好方法。
发明概述
本发明是基于以下认识：已经公开的分离romidepsin的方法不能可再现地获得纯romidepsin，特别是，不含污染物例如二聚、低聚或聚合romidepsin的romidepsin。基于该认识，本发明提供了用于在降低这些污染性副产物水平的条件下可再现地制备romidepsin的系统。已经发现，在低于大约6.5，更优选低于大约6.0的表观pH下生产、纯化和/或贮存romidepsin，防止了二聚、低聚或聚合romidepsin的形成。romidepsin纯化方法中的此改善提供了比常规方法更高的romidepsin收率和/或更高的romidepsin纯度。这一改善可特别用于制备在人类中使用的药物级的romidepsin。
Romidepsin一般是通过从产生该天然产物的微生物(例如紫色色杆菌)培养物中纯化romidepsin而制备的。本发明证实了，为了消除或减少还原的romidepsin的形成，所述还原的romidepsin随后可二聚、低聚或聚合以形成不希望的污染物，在至少某些纯化步骤期间，必须维持低的表观pH(apparent pH)。
在低于6.5的表观pH，或者甚至低于6.0的表观pH下，进行一个或多个纯化步骤。在一些实施方案中，在4.0至6.0的表观pH下，进行一个或多个纯化步骤。在一些实施方案中，在约4.0至约6.0的表观pH下，进行所有纯化步骤。为了防止形成不希望的污染物，含有romidepsin的溶液的表观pH不能达到高于约7.0，更优选高于约6.0的表观pH。优选监测所有纯化方法的表观pH，并且随后如果需要的话，调节至低于约6.0的表观pH。在一些实施方案中，将表观pH保持在大约4.0至大约6.0的范围内。已经发现，朝着方法或步骤结束，使用水溶液来在纯化步骤中控制表观pH在减少或消除不希望污染物方面是特别有用的。任何酸或缓冲液可用于控制pH。在一些实施方案中，在一个或多个纯化步骤中，使用有机酸例如乙酸或甲酸来控制pH。在一些实施方案中，使用无机酸例如磷酸或盐酸。
纯化romidpesin的任何操作，无论是从发酵、半合成还是全合成中，都可以基于本发明来修饰，以通过检测表观pH以及如果需要的话降低表观pH来防止不需要副产物形成。
在一个方面，本发明提供了从紫色色杆菌培养物中制备romidepsin的方法。将发酵肉汤酸化以灭活或杀死培养物中的微生物。通过分批或柱色谱法将酸化的发酵肉汤预先纯化。然后，可使用多个柱色谱步骤来实现所期望的纯度水平。在一些实施方案中，第一个色谱使用Sepabeads SP850，一种非离子吸附树脂。可通过另外的柱色谱步骤来进一步纯化Romidepsin。在一些实施方案中，然后通过使用Diaion HP20SS树脂的柱色谱纯化romidepsin，然后通过使用Diaion HP20树脂的柱色谱来纯化，最后通过氧化铝柱色谱进行纯化。在一些实施方案中，在大约4至大约6的表观pH范围内进行柱色谱。在一些具体实施方案中，第二个柱色谱步骤在降低的表观pH下(例如大约4-6的表观pH)进行。任选通过结晶进一步纯化romidepsin。可以进行一个或多个结晶步骤。在一些实施方案中，首先使用甲醇将romidepsin结晶，然后使用85％丙酮水溶液结晶。然后任选将所得romidepsin过滤，洗涤，并且干燥。在一些实施方案中，在大约4.0至大约6.0的降低的表观pH下进行结晶步骤或然后随后的步骤。特别重要的是，在降低的表观pH下进行最后的步骤，因为随后没有纯化步骤来除去不需要的污染物。用水或酸性溶液(例如乙酸)在发酵和/或纯化方法中使用的任何装置(例如管道、泵、过滤器、干燥器等)以除去或中和装置上的任何碱性残余物。
此外，制备romidepsin的药物剂型，包括用赋形剂、溶剂、助溶剂和/或用于提高romidepsin的药物活性的其他物质混合，可以在降低的表观pH(例如小于约4.0的表观pH)进行，以将二聚、低聚或聚合romidepsin的形成减至最少。
在另一个方面，本发明提供了基本上不含污染性二聚、低聚或聚合romidepsin的romidepsin的组合物。本发明提供的romidepsin是大于98％单体，大于99％单体，大于99.95％单体或大于99.9％单体。在一些实施方案中，关于所以污染物，romidepsin优选具有大于98％的纯度，大于99％的纯度，大于99.95％的纯度，或大于99.9％的纯度。在一些实施方案中，romidepsin包括小于1.0％，小于0.5％，小于0.2％或小于0.1％的所有其他未知物质。Romidepsin的组合物优选不包括可检测的二聚、低聚或聚合物质。Romidepsin的纯度一般是通过高效液相色谱(HPLC)、红外光谱、粉末X-射线衍射(XRPD)分析、气相色谱(GC)、比旋光度或NMR光谱测定的。在一些实施方案中，纯度是通过测定romidepsin在氯仿中的溶液的比旋光度而确定的。本发明还提供了romidepsin的缓冲制剂，所述制剂保持低于约6.0，优选约4.0至约6.0的表观pH。这样的制剂通常具有延长的储存期限。
定义
下面更详细地描述具体官能团和化学术语。对于本发明目的，化学元素是按照元素周期表，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics，75th Ed.，期内鉴定的，并且具体官能团通常是如其中所述进行定义的。此外，Organic Chemistry，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito，1999中描述了有机化学以及具体官能团部分和反应性的一般原理，其全文引入本文以供参考。
一些本发明化合物可以以特定几何异构体或立体异构体形式存在。本发明涉及所有这样的化合物，包括顺式和反式异构体，E-和Z-异构体，R-和S-对映体，非对映体，(d)-异构体，(1)-异构体，(-)-和(+)-异构体，其外消旋混合物，以及其他其混合物，都在本发明范围内。在取代基例如脂族(例如烷基)或杂脂族基团中可以存在另外的不对称碳原子。所有这样的异构体及其混合物都在本发明范围内。
含有任何多种异构体比例的异构体混合物可以根据本发明进行使用。例如，当仅合并两种异构体时，含有50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2、99∶1或100∶0异构体比例的混合物都包括在本发明内。本领域技术人员将容易地理解，对于更复杂的异构体混合物，包括类似的比例。
应当理解，本文描述的化合物可以被任何数目的取代基或官能团部分取代。通常，无论前面是否有术语“任选”，术语“取代的”和包含在本发明式中的取代基是指给定结构中的氢基团被所指定的取代基替代。在一些实施方案中，在给定结构中，只有一个氢基团被指定取代基替代。在其他实施方案中，在给定结构中，有一个、两个或三个氢基团被相同或不同的指定取代基替代。当在给定结构中有一个以上的位置可以被一个以上的选自指定组的取代基取代时，在每一位置上的取代基可以是相同或不同的。本文所用术语“取代的”意欲包括有机化合物的所有可容许的取代基。在一个宽方面，可容许的取代基包括有机化合物的非环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于本发明目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文所述有机化合物的满足杂原子化合价的任何可容许的取代基。此外，本发明不以任何方式受有机化合物的可容许取代基的限制。本发明涉及的取代基和变量的组合优选是导致形成可用于治疗例如增殖性疾病例如癌症的稳定化合物。本文所用术语“稳定的”优选是指这样的化合物，其具有的稳定性足以容许生产，并且在足以检测的时间内保持完整性，优选在足以用于本文详述目的的时间内保持完整性。
本文所用术语“脂族”包括饱和与不饱和直链(即非支链)、支链、非环。环状或多环脂族烃，其可以任选被一个或多个官能团取代。本领域技术人员理解，在本文中“脂族基团”包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，本文所用术语“烷基”包括直链、支链和环状烷基。类似规定适用于其他一般术语例如“烯基”、“炔基”等。此外，本文所用术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等包括取代和未取代的基团。在一些实施方案中，本文所用的“低级烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基(环状、非环状、取代的、未取代的、支链或非支链)。
在一些实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基和炔基含有1-20个脂族碳原子。在一些其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基和炔基含有1-10个脂族碳原子。在一些其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基和炔基含有1-8个脂族碳原子。在一些其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基和炔基含有1-6个脂族碳原子。在一些其他实施方案中，本发明中采用的烷基、烯基和炔基含有1-4个脂族碳原子。因此，示例性脂族基团包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-CH2-环己基部分等，其同样可以携带一个或多个取代基。烯基包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。代表性炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
本发明化合物的上述脂族(以及其他)部分的取代基的某些实例包括但不限于脂族基团；杂脂族基团；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-CO2(Rx)；-CON(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OCON(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族基团、杂脂族基团、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上述和本文中的任何脂族基团、杂脂族基团、芳基烷基或杂芳基烷基取代基可以是取代或未取代，支链或非支链，环状或非环状的，并且其中上述和本文中的任何芳基或杂芳基取代基可以是取代或未取代的。本文描述的实施例中显示的具体实施方案举例说明了通常适用的取代基的另外实例。
通常，本文所用术语“芳基”和“杂芳基”是指稳定的单环或多环、杂环、多环和多杂环不饱和部分，优选具有3-14个碳原子，每一碳原子可以是取代或未取代的。取代基包括但不限于任何上述取代基，即关于脂族部分或本文公开的其他部分所描述的导致形成稳定化合物的取代基。在本发明的一些实施方案中，“芳基”是指具有一个或两个芳环的单环或双环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。在本发明的一些实施方案中，术语“杂芳基”是指环状芳基，其具有5-10个环原子，其中一个环原子选自选自S、O和N；0、1或2个环原子是独立地选自S、O和N的另外的杂原子；并且其余环原子是碳，基团经由任何环原子与分子的其余部分连接，例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、唑基、异唑基、噻二唑基、二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基等。
应当理解，芳基和杂芳基可以是未取代或取代的，其中取代包括其上面的一个、两个、三个或多个或更多个氢原子被任何一个或多个下面的部分替代，这些部分包括但不限于：脂族基团；杂脂族基团；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-CO2(Rx)；-CON(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OCON(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族基团、杂脂族基团、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上述和本文中的任何脂族基团、杂脂族基团、芳基烷基或杂芳基烷基取代基可以是取代或未取代，支链或非支链，环状或非环状的，并且其中上述和本文中的任何芳基或杂芳基取代基可以是取代或未取代的。本文描述的实施例中显示的具体实施方案举例说明了通常适用的取代基的另外实例。
本文所用术语“杂脂族基团”是指含有一个或多个氧、硫、氮、磷或硅原子以例如替代碳原子的脂族部分。杂脂族部分可以是支链、非支链、环状或非环状的，并且包括饱和与不饱和杂环例如吗啉代基、吡咯烷基等。在一些实施方案中，杂脂族部分通过其上面的一个或多个氢原子被一个或多个部分替代而被取代，所述部分包括但不限于脂族基团；杂脂族基团；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO2；-CN；-CF3；-CH2CF3；-CHCl2；-CH2OH；-CH2CH2OH；-CH2NH2；-CH2SO2CH3；-C(O)Rx；-CO2(Rx)；-CON(Rx)2；-OC(O)Rx；-OCO2Rx；-OCON(Rx)2；-N(Rx)2；-S(O)2Rx；-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族基团、杂脂族基团、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上述和本文中的任何脂族基团、杂脂族基团、芳基烷基或杂芳基烷基取代基可以是取代或未取代，支链或非支链，环状或非环状的，并且其中上述和本文中的任何芳基或杂芳基取代基可以是取代或未取代的。本文描述的实施例中显示的具体实施方案举例说明了通常适用的取代基的另外实例。
本文所用术语“卤代”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
“独立地选自”：本文所用术语“独立地选自”是指R基团可以是相同或不同的。
在本说明书中使用的其他术语的定义包括：
“酸”：本文所用术语“酸”是指无机酸和有机酸。无机酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸和磷酸。有机酸的实例包括但不限于甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。可以使用任何酸来调节缓冲液或romidepsin溶液或romidepsin纯化中使用的溶液的pH。在一些实施方案中，使用乙酸。在一些实施方案中，使用乙酸。在一些实施方案中，使用柠檬酸。在一些实施方案中，使用硫酸。
“酯肽”：本文所用术语“酯肽”是指含有酯和酰胺键的多肽。天然酯肽通常是环状的。已经表明某些酯肽具有有效抗生素活性。酯肽的实例包括放线菌素、思镰刀菌素、缬氨霉素和romidepsin。
“肽”或“蛋白”：根据本发明，“肽”或“蛋白”包含通过肽键连接在一起的一串至少3个氨基酸。术语“蛋白”和“肽”可以交换使用。肽优选仅含有突然氨基酸，虽然可以替代地使用非天然氨基酸(即不是天然存在的但是可以引入多肽链内的化合物)和/或本领域已知的氨基酸类似物。此外，可以将肽中的一个或多个氨基酸修饰，例如通过加入化学实体例如糖基团、磷酸酯基团、法尼基、异法尼基、脂肪酸基团、用于缀合的连接基团(linker)、官能化或其他修饰等来进行修饰。在一些实施方案中，肽的修饰导致等稳定的肽(例如更长的体内半衰期)。这些修饰可以包括肽的环合，引入D-氨基酸等。修饰应当不显著干扰肽的所需生物活性。在一些实施方案中，肽是指酯肽。
“Romidepsin”：术语“romidepsin”是指以下化学结构的天然产物：
Romidepsin是有效的HDAC抑制剂，并且在本领域中还称为FK228、FR901228、NSC630176或depsipeptide。U.S.专利4,977,138中描述了romidepsin的鉴定和制备，该专利引入本文以供参考。分子式是C24H36N4O6S2；并且分子量为540.71。Romidepsin具有化学名称(1S，4S，10S，16E，21R)-7-[(2Z)-亚乙基]-4,21-二异丙基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂二环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮。Romidepsin已经被指定了CAS号128517-07-7。在晶体形式，romidepsin通常是白色至浅黄白色晶体或晶体粉末。术语“romidepsin”包括该化合物及其任何可药用盐形式。在一些实施方案中，术语“romidepsin”还可以包括前药、酯、保护的形式及其衍生物。
附图简述
图1显示了从紫色色杆菌培养物中纯化romidepsin的流程图。
本发明一些实施方案的详细描述
本发明提供了用于制备romidepsin，可用于治疗癌症的一种已知组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的改进的系统。遗憾的是，出版的制备romidepsin的方法不能可再现地制备纯的单体romidepsin。已经惊奇地发现，在纯化过程期间控制pH能够可再现地制备纯的单体romidepsin。特别是，在降低的表观(例如4-6的表观pH)下进行至少一部分纯化过程，以高产率获得了纯的单体romidepsin，而不含有污染性二聚、低聚或聚合副产物。
Romidepsin是具有二硫键的环状酯肽。本发明基于这样的发现：将romidepsin暴露于碱性条件(例如大于～7的表观pH)促进了该二硫键的还原。已经发现，具有其游离巯基的还原的romidepsin易于发生二聚、低聚或聚合。这样的加合物通常是不溶的，并且难以从纯化的romidepsin中除去。在一些实施方案中，这样的污染性加合物使得romidepsin的制备物不能满足所希望的规定(例如稳定性、纯度、旋光度等)。在药物组合物中，这些加合物降低了活性剂romidepsin的纯度。因为romidepsin正在人类中用作药物，所以从紫色色杆菌发酵中可再现地获得纯的、稳定的单体romidepsin是很重要的。本发明来自这样的认识：碱性条件引起这些不需要的romidepsin加合物的形成，并且提供了解决该问题的新方法。
本发明的系统还可用于制备romidepsin的衍生物，特别是含有二硫键的衍生物。在一些实施方案中，romidepsin的衍生物是式(I)化合物：
其中
m是1、2、3或4；
n是0、1、2或3；
p和q独立地为1或2；
X是O、NH或NR8；
R1、R2和R3独立地为氢；未取代或取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；未取代或取代的，支链或非支链的，环状或非环状杂脂族基团；未取代或取代的芳基；或者未取代或取代的杂芳基；
R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢；或取代或未取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；及其可药用盐。
在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，p是1。在一些实施方案中，q是1。在一些实施方案中，X是O。在一些实施方案中，R1、R2和R3是未取代或取代的，支链或非支链的，非环状脂族基团。在一些实施方案中，R4、R5、R6和R7都是氢。
在一些实施方案中，romidepsin的衍生物是式(II)化合物：
其中
m是1、2、3或4；
n是0、1、2或3；
q是2或3；
X是O、NH或NR8；
Y是OR8或SR8；
R2和R3独立地为氢；未取代或取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；未取代或取代的，支链或非支链的，环状或非环状杂脂族基团；未取代或取代的芳基；或未取代或取代的杂芳基；
R4、R5、R6、R7和R8独立地选自氢；或取代或未取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；及其可药用盐。
在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，q是2。在一些实施方案中，X是O。在其他实施方案中，X是NH。在一些实施方案中，R2和R3是未取代或取代的，支链或非支链的，非环状脂族基团。在一些实施方案中，R4、R5、R6和R7都是氢。
在一些实施方案中，romidepsin的衍生物是式(II)化合物：
其中A是在生理条件下裂解以生成巯基的部分，并且包括例如脂族或芳族酰基部分(以形成硫酯键)；脂族或芳族硫氧基(以形成二硫键)等；及其外消旋体、对映体、异构体、互变异构体、盐、酯和前药。这样的脂族或芳族基团可以包括取代或未取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；取代或未取代的芳族基团；取代或未取代的杂芳族基团；或取代或未取代的杂环基。A可以是例如-COR1、-SC(＝O)-O-R1或-SR2。R1独立地为氢；取代或未取代的氨基；取代或未取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团；取代或未取代的芳族基团；取代或未取代的杂芳族基团；或取代或未取代的杂环基。在一些实施方案中，R1是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基或溴苄基。R2是取代或未取代的，支链或非支链的，环状或非环状脂族基团基团；取代或未取代的芳族基团；取代或未取代的杂芳族基团；或取代或未取代的杂环基。在一些实施方案中，R2是甲基、乙基、2-羟基乙基、异丁基、脂肪酸、取代或未取代的苄基、取代或未取代的芳基、半胱氨酸、高半胱氨酸或谷胱甘肽。
在一些实施方案中，romidepsin的衍生物是式(IV)或(IV′)化合物；
其中R1、R2、R3和R4是相同或不同的，并且代表氨基酸侧链部分，每个R6是相同或不同的，并且代表氢或C1-C4烷基，且Pr1和pr2是相同或不同的，并且代表氢或巯基保护基。在一些实施方案中，氨基酸侧链部分是衍生自天然氨基酸的那些。在其他实施方案中，氨基酸侧链部分是衍生自非天然氨基酸的那些。在一些实施方案中，每个氨基酸测量是选自下列的部分：-H、-C1-C6烷基、-C2-C6烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″，其中L是C1-C6亚烷基，A是苯基或5-或6-元杂芳基，每个R’是相同或不同的，并且代表C1-C4烷基，每个R″是相同或不同的，并且代表H或C1-C6烷基，每个-Het-是相同或不同的，并且是选自-O-、-N(R″′)-和-S-的杂原子间隔基团(spacer)，并且每个R″′是相同或不同的，并且代表H或C1-C4烷基。在一些实施方案中，R6是-H。在一些实施方案中，Pr1和pr2是相同或不同的，并且选自苄基，所述苄基任选被C1-C6烷氧基取代，C1-C6酰氧基，羟基，硝基，甲基吡啶基，甲基吡啶基-N-氧化物，蒽基甲基，二苯基甲基，苯基，叔丁基，金刚烷基，C1-C6酰氧基甲基，C1-C6烷氧基甲基，四氢吡喃基，苄硫基甲基，苯硫基甲基，噻唑烷，乙酰胺甲基，苯甲酰氨基甲基，叔丁氧基羰基(BOC)，乙酰基及其衍生物，苯甲酰基及其衍生物，氨基甲酰基，苯基氨基甲酰基和C1-C6烷基氨基甲酰基。在一些实施方案中，Pr1和Pr2是氢。各种式(IV)和(IV′)的romidepsin衍生物公开在出版的PCT申请WO 2006/129105中，该专利于2006年12月7月出版，其引入本文以供参考。
本发明还可用于制备含有二硫键的其他天然产物。本发明可用于制备环状或非环状肽。在一些实施方案中，使用本发明系统纯化含有二硫键的环状肽。在一些实施方案中，基于本发明，使用降低的表观pH来限制或消除分子内二硫键的还原，以纯化除了romidepsin之外的其他酯肽。
根据本发明，romidepsin或romidepsin衍生物的不需要的加合物的形成可以通过让欲制备或纯化的romidepsin不置于大于～7.0的表观pH，更优选大于～6.5的表观pH，或者最优选大于～6.0的表观pH的条件下来防止。制备和纯化通常保持在大约表观pH 4.0至表观pH 6.0之间。在一些实施方案中，可以使用甚至更低的表观pH。该认识可应用于任何用于制备romidepsin的生产或纯化方法。在一些实施方案中，将romidepsin从发酵中纯化。在其他实施方案中，通过半合成或全合成制备romidepsin。这样发现还可以应用于romidepsin的类似物或衍生物(例如盐、酯、前药、异构体、对映体、互变异构体、保护形式、衍生产物等)。本文中描述了romidepsin的一些衍生物。
用于制备romidepsin的方法是本领域已知的。参见例如Ueda等人，J.Antibiot.(Tokyo)47：301-310，1994；Nakajima等人，Exp.Cell Res.241：126-133，1998；WO 02/20817；U.S.专利4,977,138；每一所述文献引入本文以供参考。因为romidepsin是天然产物，其一般是通过从产生romidepsin的微生物的发酵中分离romidepsin来制备的。在一些实施方案中，微生物属于色杆菌属(Chromobacterium)。已知产生romidepsin的示例性微生物是紫色色杆菌。紫色色杆菌的任何天然或人造变体可用于使用本发明系统分离romidepsin。在一些实施方案中，紫色色杆菌的菌株是紫色色杆菌WB968。在一些实施方案中，紫色色杆菌的菌株是紫色色杆菌WB968的突变株。在一些实施方案中，微生物是经基因工程改造的以生产romidepsin。例如，可将负责产生romidepsin的细胞机制的基因置于另一微生物例如细菌或真菌。
在适于其产生romidepsin的条件下让微生物生长。优选地，将培养条件优化以产生高水平的romidepsin，具有最小水平的污染性加合物或降解产物。培养基优选包括氮和碳源以及任何必需维生素和矿物质。培养物通常在需氧条件下生长。培养物的大小可以为10mL至10,000L或甚至更大。在一些实施方案中，培养体积大于500L。在其他实施方案中，体积大于1000L。在其他实施方案中，体积大于2000L。在其他实施方案中，体积大于3000L。在其他实施方案中，体积大于5000L。在其他实施方案中，体积大于6000L。在其他实施方案中，体积大于7000L。在其他实施方案中，体积大于8000L。在其他实施方案中，体积大于9000L。在一些实施方案中，培养体积为大约5000L至大约10000L。可以使用摇瓶、发酵罐、生物反应器或可用于发酵微生物的任何其他装置。如果适当的话，使用接种培养物和小的发酵罐培养物来接种逐渐长大的培养物。
在一些实施方案中，在较大的培养物中使用防泡剂(例如聚亚烷基二醇防泡剂(Adekanol LG-109))。也可以使用其他市售防泡剂。当使用发酵罐来生产romidepsin时，防泡剂是特别有用的。
培养基中的碳源可以是任何糖类。在一些实施方案中，碳源是单糖或二糖(例如葡萄糖)。在一些具体实施方案中，碳源是葡萄糖或麦芽糖糊精。在一些实施方案中，可以使用其他碳源例如淀粉、麦芽糖、果糖或甘油。在一些实施方案中，氮源是铵盐例如硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵等。在其他实施方案中，氮源是植物胨(例如多胨NS，玉米浸泡液，Hinute R)。可使用的其他氮源包括肉汤、酵母提取物、大豆胨、麸粗粉、棉籽粉、大豆粗粉和小麦胚芽。在一些实施方案中，氮源是脲或氨基酸。在一些实施方案中，氮源是含有氮的有机小分子。在一些实施方案中，给培养基补充氨基酸。例如，可以给培养基补充L-精氨酸、L-组氨酸或L-半胱氨酸。在一些实施方案中，给培养基补充L-半胱氨酸。参见WO 02/20817；其引入本文以供参考。在一些实施方案中，给培养基补充L-半胱氨酸和L-缬氨酸。据信，这样的补充提高了发酵中产生的romidepsin的量和/降低了相关物质和/或降解物的量。培养基可以包括材料例如镁(例如硫酸镁)和磷酸盐(例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钠)。在一些实施方案中，培养基包括葡萄糖、植物胨(多胨NS)或玉米浸泡液(CSL)、硫酸镁和水。在一些实施方案中，培养基包括葡萄糖、多胨(多胨NS)、硫酸镁、防泡剂和水。在一些实施方案中，培养基包括葡萄糖(0.45-1.0％)、植物胨(多胨NS)或CSL(0.9-4.0％)、硫酸镁(0.0054-0.010％)、防泡剂(0.09％-0.11％)和水(平衡)。在一些实施方案中，培养基包括葡萄糖、氧化淀粉(例如Pinedex#100)或麦芽糖糊精、大豆胨(例如Hinute-R)、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、防泡剂(例如Adekanol LG-109)、L-半胱氨酸、L-缬氨酸和水。在一些实施方案中，培养基包括葡萄糖(2-10％)、氧化淀粉(例如Pinedex#100)或麦芽糖糊精(1-15％)、大豆胨(例如Hinute-R)(1-6％)、硫酸铵(0-0.5％)、硫酸镁(0-2％)、磷酸二氢钾(0.275-1.65％)、磷酸氢二钠(0.18-1.08％)、防泡剂(例如Adekanol LG-109)(0.2-0.66％)、L-半胱氨酸(0-30mM)、L-缬氨酸(0-15mM)和水。
将培养基在适于生物生长的条件下(例如温度、pH、氧浓度等)生长。在一些实施方案中，监测和/或调节培养物的pH。培养物的pH可以为5.0至7.5的pH。用于romidepsin生产的任何生物具有优选的生长温度，这取决于培养物生长的条件。在一些实施方案中，培养物在15℃至37℃，优选23℃至32℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在18℃至27℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约18℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约19℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约20℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约21℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约22℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约23℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约24℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约25℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约26℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约27℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约28℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约29℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约30℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约31℃的温度下生长。在一些实施方案中，培养物在大约32℃的温度下生长。
培养物中的氧浓度保持在10-50％的水平。在一些实施方案中，氧浓度保持在20％以上。通过换气、压力和/或搅拌来保持氧水平。
所得培养物通常生长大约10-100小时。可以在20、30、40、50、60、70或80小时后收获培养物。在一些实施方案中，在大约30、35、40、45或50小时后收获培养物。在一些实施方案中，在大约36小时收获培养物。在一些实施方案中，在大约50小时收获培养物。通常让培养物生长直至饱和。因为romidepsin是二级代谢物，所以最大收率来自后期培养物。在一些实施方案中，在log期收获培养物。本领域技术人员应当理解，通常在形成大量降解物之前收获培养物。收获时间可以通过分析生产romidepsin的发酵样本而凭经验确定。在一些实施方案中，当romidepsin的滴度达到0.5至1.5g/kg时，收获培养物。在一些实施方案中，当滴度达到至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.1g/kg时收获培养物。在一些实施方案中，当滴度达到至少0.8g/kg时，收获培养物。还可以分析样本中的相关物质或降解物，并且当实现所希望的romidepsin水平、所希望的相关物质或降解物水平或者二者比例时收获培养物。还可以基于培养基中的成分例如葡萄糖的积聚来确定收获时间。在其他实施方案中，基于代谢物的生成来确定收获时间。可以基于上述标准的组合来确定收获时间。
在将培养物生长足够的时间后，收获培养物。可以在培养基以及培养物的细胞中发现所需romidepsin。任选在纯化之前将细胞杀死和/或裂解。在一些实施方案中，通过加入酸例如硫酸来杀死细胞。在一些实施方案中，将pH降至大约pH 2.0-3.0。
然后任选降低所得材料的体积。通过本领域已知用于纯化肽、天然产物和/或有机分子的任何纯化技术来纯化romidepsin。示例性纯化技术包括分批色谱、柱色谱和结晶。纯化方法可以包括一个或多个步骤以实现所需纯度。在一些实施方案中，使用非离子吸附树脂来纯化提取的材料。在一些实施方案中，在分馏步骤中使用反相树脂。在一些具体实施方案中，使用采用反相树脂的多个柱色谱步骤。用于纯化方法的示例性树脂比例氧化铝、硅胶、Sepabeads SP850、Diaion HP20SS和Diaion HP20。在一些实施方案中，Diaion HP20SS和/或Diaion HP20得自Mitsubishi Chemical Corporation。在一些实施方案中，使用氧化铝作为柱材料。在一些实施方案中，使用硅胶作为树脂。在一些实施方案中，在小于6.0的表观pH下进行一个或多个柱色谱步骤。在一些实施方案中，在4.0至6.0的表观pH下进行一个或多个这些步骤。在一些实施方案中，所有柱色谱步骤都在小于6.0的表观pH下进行。在一些实施方案中，所有柱色谱步骤都在4.0至6.0的表观pH下进行。
在一些实施方案中，romidepsin的纯化涉及使用一个以上柱或分批色谱步骤来纯化提取的材料。在一些实施方案中，在分批色谱步骤之后进行柱色谱步骤。在一些实施方案中，通过使用Sepabeads SP850的分批色谱纯化提取的材料，然后使用填充有DiaionHP20SS的柱，之后使用填充有Diaion HP20的柱，最后使用填充有氧化铝的柱。所有这些色谱步骤都优选在4.0至6.0的表观pH下进行。在其他实施方案中，使用填充有Diaion HP20的柱，然后使用填充有Diaion HP20SS的柱，最后使用填充有Diaion HP20的另一个柱来纯化提取的材料。在该纯化方法中，所有这些柱色谱步骤都优选在4.0至6.0的表观pH下进行。任选将每个柱用水或其他水溶液洗涤，然后使用有机溶剂(例如丙酮)的水溶液洗脱romidepsin。在一些实施方案中，使用硅胶纯化提取材料。还可以将硅胶色谱用作另外的纯化步骤来与使用其他树脂或填充材料的色谱联合使用。在一些实施方案中，使用氧化铝纯化提取材料。氧化铝色谱也可以用作另外的纯化步骤来与使用其他树脂或填充材料的色谱联合使用。
在一些实施方案中，将含有粗制romidepsin的材料加载到在小于6.0的表观pH下，优选在4.0至6.0的表观pH下，预平衡的基质上。然后将基质洗涤以除去杂质。通常，基质的洗涤是用极性大于romidepsin洗脱的溶液(即较高百分比的水)来进行。例如，可以将基质用最高达25-50％丙酮水溶液洗涤，然后用50-100％丙酮水溶液洗脱romidepsin。本领域技术人员应当理解，洗涤和洗脱溶剂是由使用的基质以及化合物的极性决定的。
在一些实施方案中，在小于6.0的表观pH下进行一个或多个色谱步骤(包括树脂的加载、洗涤以及洗脱)。在一些具体实施方案中，在3.0至6.0的表观pH下进行色谱步骤。在一些其他实施方案中，在4.0至6.0的表观pH下进行色谱步骤。可以通过加入酸将加载到基质上的溶液的表观pH调节至所期望的表观pH。可以使用本文描述的任何酸来降低溶液的表观pH。也可以将洗涤和洗脱溶液的表观pH调节至所期望的表观pH。在一些实施方案中，将含有romidepsin的所有溶液的表观pH保持在大约6.0的表观pH，由此阻止不希望的加合物的形成。在一些实施方案中，将溶液的表观pH缓冲在大约4.0至大约6.0的表观pH。在一些实施方案中，使用乙酸、盐酸、乙酸铵缓冲液或柠檬酸将丙酮/水溶液的表观pH调节至所期望的表观pH。在一些实施方案中，使用乙酸盐缓冲系统。
可选择地或者另外，可以通过结晶来纯化Romidepsin。通过结晶的纯化可以与其他纯化方法，包括柱色谱和/或分批色谱联合使用。在一些实施方案中，在通过柱色谱和/或分批色谱纯化之后使用结晶。在一些具体实施方案中，在如上所述通过柱色谱和/或分批色谱纯化后进行结晶。可以在任何适宜的溶剂中进行结晶。Romidepsin优选地最小程度地溶于溶剂中。在一些实施方案中，结晶溶剂是醇。在一些实施方案中，结晶溶剂是甲醇。在一些实施方案中，结晶溶剂是乙醇。在一些实施方案中，使用混合溶剂系统。结晶溶剂可以是醇/水混合物。在其他实施方案中，结晶溶剂是丙酮和水的混合物。在一些具体实施方案中，将romidepsin溶解在丙酮水溶液(例如85％丙酮)中，并且通过缓慢地加入水来沉淀。在一些实施方案中，将romidepsin溶解在溶剂(例如甲醇)中，并且将所得溶液浓缩，引起romidepsin结晶出来。在其他实施方案中，将romidepsin溶解在水/有机溶剂混合物(例如85％丙酮水溶液)中，并且通过加入水让romidepsin沉淀出来。一般通过过滤收集得自结晶步骤的晶体，并且任选洗涤和干燥。在一些实施方案中，结晶溶剂的表观pH低于6.0。在一些具体实施方案中，溶剂的表观pH为4.0至6.0。所得晶体的任何洗涤还可以在降低的表观pH(例如4.0至6.0的表观pH)下进行。
可选择地或者另外，在结晶过程中，romidepsin的储存或保留时间小于约20小时。在一些实施方案中，储存或保留时间小于10小时。在其他实施方案中，储存或保留时间小于5小时。在一些具体实施方案中，在形成结晶溶液之后立即进行结晶过程。
本发明提供了基本上不含不希望的加合物的纯化的romidepsin。在一些实施方案中，romidepsin是至少98％不含污染性加合物，至少99％不含污染性加合物，或者至少99.5％不含加合物。在一些实施方案中，romidepsin是至少98％单体，至少99％单体，或者至少99.5％单体。在一些实施方案中，romidepsin是至少99.9％单体。在一些实施方案中，romidepsin是至少99.95％单体。在一些实施方案中，romidepsin不包括可检测的二聚、低聚或聚合romidepsin。
在一些实施方案中，romidepsin具有至少98％的纯度，至少99％的纯度，或者至少99.5％的纯度。在一些实施方案中，romidepsin具有至少99.7％的纯度。在一些实施方案中，romidepsin具有至少99.8％的纯度。在一些实施方案中，romidepsin具有至少99.9％的纯度。在一些实施方案中，romidepsin具有至少99.95％的纯度。在一些具体实施方案中，romidepsin含有小于0.2％的称为“其他未知物”的杂质。在一些具体实施方案中，romidepsin含有小于0.1％的“其他未知物”。这样高纯化的romidepsin可用于制备药物组合物。这样的组合物可特别用于治疗其他增殖性疾病的癌症。组合物还可以用于可通过抑制组蛋白脱乙酰酶活性而治疗的组合物。组合物还可以用于可通过抑制微管蛋白脱乙酰酶活性而治疗的其他疾病。组合物还可以用于可通过抑制蛋白脱乙酰酶活性而治疗的其他疾病。本发明的纯化romidepsin还可用于研究目的。
romidepsin的纯度可以使用本领域已知的任何方法来评估。评估纯度的方法包括外观、HPLC、比旋光度、NMR光谱、IR光谱、UV/可见光谱、粉末X-射线衍射(XRPD)分析、元素分析、LC-质谱和质谱。在一些实施方案中，通过HPLC评估纯度，其具有大约0.05％的杂质检测限度。在一些实施方案中，通过NMR光谱评估纯度。在一些实施方案中，通过IR光谱评估纯度。在一些实施方案中，通过UV/可见光谱评估纯度。在一些实施方案中，通过XRPD评估纯度。
在一些实施方案中，通过在适当溶剂中的比旋光度评估纯度。在一些实施方案中，用于比旋光度的溶剂是氯仿(CHCl3)。在其他实施方案中，所使用的溶剂是醇例如甲醇或乙醇。在其他实施方案中，所使用的溶剂是水或水/醇溶液。在一些实施方案中，使用compendial方法例如U.S.Pharmacopeia、European Pharmacopeia、JP Pharmacopeia或British Pharmacopeia中描述的方法来检查比旋光度。在一些实施方案中，使用romidepsin在氯仿中的溶液来进行比旋光度测定。溶液的浓度可以为5mg/mL至30mg/mL。在一些实施方案中，浓度为大约20mg/mL。romidepsin的旋光度为+38°至+47°。在一些实施方案中，比旋光度为+39°至+41°。在一些实施方案中，比旋光度为+40.0°至+40.5°。在一些具体实施方案中，比旋光度为大约+40°。已经发现，当将romidepsin溶解在氯仿中时，污染性加合物的存在导致沉淀。
当在溶液中时，romidepsin优选储存在低于约6.0的表观pH下。在一些实施方案中，表观pH为大约4.0至大约6.0。在一些实施方案中，将romidepsin的制剂或制备物缓冲以防止表观pH高于7.0以上，更优选高于6.0以上。在一些实施方案中，将制剂或制备物缓冲至大约4.0至大约6.0的表观pH。
考虑下面的实施例可以进一步理解本发明的这些和其他方面，这些实施例是为了举例说明本发明的具体实施方案，而不是限制由权利要求书所界定的范围。
实施例
实施例1-Romidepsin的纯化
通过吸附树脂纯化romidepsin
提取含有大约400g romidepsin的紫色色杆菌培养物肉汤(约600L；用H2SO4调节至pH 2.5)，并且将提取肉汤施加到填充了Sepabeads SP850，一种非离子吸附树脂的柱上。将Romidepsin(不超过6g-romidepsin/L-树脂)结合到树脂上，流速不超过sv＝6。用自来水(约是树脂体积的3倍)和25％丙酮水溶液(约是树脂体积的5倍)洗涤之后，用约65％丙酮水溶液进行洗脱，并且流速不超过sv＝4。
通过HP20SS色谱纯化romidepsin
将洗脱液用水稀释以获得水溶液(约75％水含量)。将该溶液施加到DiaionHP20SS柱上。该非离子吸附树脂吸附romidepsin(约10g-romidepsin/L-树脂)，流速不超过sv＝5。用25％丙酮水溶液(约是树脂体积的0.5倍)和40％丙酮水溶液(约是树脂体积的4倍)洗涤之后，用47％丙酮水溶液进行洗脱。通过反相HPLC(RP-HPLC)分析洗脱液。将活性级份在中间收集器中合并。
用吸附树脂替换非水溶剂中的含水溶剂
将得自HP20SS柱的洗脱液用水稀释以获得水溶液(约80％水含量)。将该溶液施加到Diaion HP20柱上。用20％丙酮水溶液洗涤之后，用丙酮进行洗脱。将洗脱液真空浓缩。向浓缩物中加入乙酸乙酯之后，将浓缩物进一步真空浓缩。重复进行该步骤。
使用氧化铝纯化romidepsin
将所得浓缩物溶解在乙酸乙酯中(约6mg/mL)，并且施加到氧化铝树脂柱(约75g-romidepsin/L-树脂)上。使用乙酸乙酯(约是氧化铝体积的2倍)以及丙酮与乙酸乙酯的混合物(0.5-2.0v/v，约是氧化铝体积的8倍)将该柱展开。向浓缩物中加入丙酮后，将所得溶液进一步浓缩。
结晶1(甲醇)
将得自上一步骤的浓缩物用甲醇稀释，并且真空浓缩，获得了romidepsin晶体粗产物。通过过滤收集沉淀的晶体。
结晶2(丙酮/水)
将romidepsin晶体粗产物溶解在85％丙酮水溶液(约13L/kg-romidepsin晶体粗产物)中，并且通过在搅拌下缓慢地加入纯化水(约65L/kg-romidepsin晶体粗产物)来沉淀。通过过滤收集沉淀的晶体，并且用15％丙酮水溶液(约5L/kg-romidepsin粗产物)洗涤。将湿晶体在＜-70℃真空干燥。
等同方案和范围
上面已经描述了本发明的一些非限制性优选实施方案。本领域技术人员将认识到，或者能够确定，使用一种以上的常规实验，可以获得本文描述的本发明具体实施方案的很多等同方案。本领域技术人员应当理解，可以在不背离由权利要求书界定的本发明实质或范围的情况下对该描述作出多种不同改变和修饰。
在权利要求书中，除非与上下文矛盾或显然地，否则冠词“一个”、“一种”和“该”可以是指一个或多个。除非与上下文矛盾或显然地，在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或说明被认为是满足的，如果一个、多于一个或所有组成员都存在于、用于或相关于给定的产品或方法中。本发明包括这样的实施方案，其中确切地一个组成员存在于、用于或相关于给定的产品或方法中。本发明还包括这样的实施方案，其中一个以上或所有组成员都存在于、用于或相关于给定的产品或方法中。此外，应当理解，本发明包括所以变型、组合和排列，其中来自一个或多个权利要求或说明书相关部分的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语引入到另一权利要求中。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求都可以修饰以包括在从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限定。此外，当权利要求提及组合物时，应当理解，对于本文公开的任何目的而使用该组合物的方法也包括在内，并且根据本文公开的任何方法制备该组合物的方法也包括在内，除非对于本领域技术人员来说将产生明显的矛盾或不一致。此外，本发明包括根据本文公开的任何制备组合物的方法制备的组合物。
当要素作为明细存在时，例如在马库什基团格式中，应当理解，还公开了要素的每一亚组，并且可以从组中除去任何要素。还要注意，术语“包含”是开放式的，并且容许包括另外的要素或步骤。应当理解，通常情况下，当本发明或本发明的方面是指包括特定要素、特征、步骤等，本发明的一些实施方案或本发明的方面由或者基本上由这样的要素、特征、步骤等组成。出于简洁的目的，在本文中并未具体以签订协约的方式专门列出这些实施方案。因此，对于包括一个或多个要素、特征、步骤等的本发明的每一个实施方案，本发明还提供了由或者基本上由这样的要素、特征、步骤等组成的实施方案。
当给出范围时，包括端点在内。此外，应当理解，除非在上下文中另外指出或显然地和/或本领域技术人员所理解的，在本发明不同实施方案中以范围给出的值可假定在该范围内的任何具体值，在该范围下限的单位的十分之一程度上，除非上下文清楚地另外表明。应当理解，除非在上下文中另外指出或显然地和/或本领域技术人员所理解的，以范围表示的值可假定在该范围内的任何具体值，其中亚范围的端点是以与该范围下限的单位的十分之一相同精确度表示的。
此外，应当理解，本发明的任何具体实施方案都可以清楚地从任何一个或多个权利要求中排除。本发明组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面都可以从任何一个或多个权利要求中排除。为了简便起见，其中一个或多个要素、特征、目的或方面被排除的所有实施方案在本文中没有专门列出。

Claims (19)

1.制备romidepsin的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)发酵产生romidepsin的微生物；
(2)加入酸，裂解产生romidepsin的细胞；和
(3)通过分批色谱、柱色谱、重结晶或其组合纯化romidepsin，其中在约4.0-约6.0的表观pH下将romidepsin在85％丙酮/水混合物中重结晶，其中romidepsin是大于98％的单体romidepsin。
2.权利要求1的方法，其中发酵微生物是紫色色杆菌。
3.权利要求1的方法，其中通过使用有机酸调整纯化步骤的表观pH。
4.权利要求3的方法，其中所述有机酸是乙酸。
5.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括通过柱色谱纯化romidepsin的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括通过重结晶纯化romidepsin的步骤。
7.权利要求5或6的方法，其中所述纯化步骤是在约4.0-约6.0的表观pH下进行的。
8.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括使用非离子吸收树脂纯化romidepsin。
9.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括使用SEPABEDS SP850苯乙烯-二乙烯基苯树脂纯化romidepsin。
10.权利要求1的方法，所述纯化步骤包括使用DIAION HP20SS苯乙烯-二乙烯基苯树脂纯化romidepsin。
11.权利要求1的方法，所述纯化步骤包括使用DIAION HP20苯乙烯-二乙烯基苯树脂纯化romidepsin。
12.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括使用氧化铝纯化romidepsin。
13.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括通过依次使用SEPABEADS SP850苯乙烯-二乙烯基苯树脂的柱或批，DIAION HP20SS苯乙烯-二乙烯基苯树脂的柱，DIAION HP20苯乙烯-二乙烯基苯树脂的柱，以及氧化铝的柱的柱色谱来纯化romidepsin。
14.权利要求6的方法，其中所述重结晶步骤包括使用甲醇来重结晶romidepsin。
15.权利要求6的方法，其中所述重结晶步骤包括使用85％丙酮水溶液来重结晶romidepsin。
16.权利要求1的方法，其中romidepsin是大于99％的单体romidepsin。
17.权利要求16的方法，其中romidepsin是大于99.5％的单体romidepsin。
18.权利要求17的方法，其中romidepsin是大于99.9％的单体romidepsin。
19.权利要求18的方法，其中romidepsin是大于99.95％的单体romidepsin。
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