BRPI0720991A2 - Preparação da romidepsina - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA- ÇÃO DA ROMIDEPSINA".

Pedidos de Patente Relacionados

O presente pedido de patente reivindica prioridade sob o 35 U.S.C. § 119(e) 5 com relação aos Pedidos de Patente U.S. Provisórios, U.S.S.N. 60/882.698, e U.S.S.N. 60/882.704, ambos os quais foram depositados em 29 de de- zembro de 2006, cada um dos quais fica incorporado aqui por referência. Antecedentes da Invenção

A Romidepsina é um produto natural que foi isolado a partir da Chromobacterium violaceum pela Fujisawa Pharmaceuticals. Ver, Pedido de Patente Japonesa Publicado Hei 7 (1995)-64872; Patente U.S. 4.977.138, concedida em 11 de dezembro de 1990, cada uma das quais fica incorpora- da aqui por referência. Ela é um peptídio bicíclico que consiste em quatro resíduos de aminoácidos (D-valina, D-cisteína, deídrobutirina, e L-valina) e um novo ácido (ácido 3-hidróxi-7-mercapto-4-heptenoico). A Romidepsina é um depsipeptídio que contém ambas as ligações de amido e de éster. além da produção de C. violaceum com a utilização de fermentação, a Romidep- sina também pode ser preparada através de meios sintéticos ou semissinté- ticos. A síntese total da Romidepsina relatada por Kahn et al. envolve 14 etapas e produz a Romidepsina em um rendimento total de 18%. J. Am. Chem. Soc. 118:7237-7238, 1996. A estrutura da romidepsina é mostrada abaixo:

A Romidepsina tem mostrado ter atividades antimicrobianas, imunossupressoras e antitumor. A romidepsina está correntemente sendo testada, por exemplo, para ser usada no tratamento de pacientes com ma- Iignidades hematológicas (por exemplo, Iinfoma de célula T cutânea (CTCL)1 Iinfoma de célula T periférica (PTCL), mieloma múltiplo, etc.) e em tumores sólidos (por exemplo, câncer da próstata, câncer pancreático, etc.). Ela é imaginada como atuando através da inibição seletiva das desacetilases (por 5 exemplo, desacetilase histona, desacetilase tubulina), prometendo novos alvos para o desenvolvimento de uma nova classe de terapias anticâncer. Nakajima et ai, Experimental Cell Res. 241: 126 a 133, 1998. Um modo de ação envolve a inibição de uma ou mais classes de desacetilases de histo- nas (HDAC).

A desacetilase de histona é uma enzima de metalodesacetilação

que tem zinco em seu sítio-ativo. Finnin et ai, Nature, 401: 188 a 193, 1999. Esta enzima é imaginada como regulando a expressão de determinados ge- nes através da modulação da afinidade das histonas acetiladas com relação ao DNA. A acetilação de histonas é controlada através do equilíbrio entre a 15 acetilação e a desacetilação. A acetilação das histonas ocorre em um resí- duo de Iisina da proteína histona. A acetilação do resíduo de Iisina faz com que a proteína perca um pouco de sua carga positiva, diminuindo, por meio disso, a interação da mesma com o DNA. A romidepsina foi descoberta como ocasionando a acetilação crescente das histonas e outras proteínas 20 reguladoras em células tratadas. Isso afeta o controle de transcrição dos diversos genes envolvidos no controle, diferenciação e apoptose no ciclo da célula. Mais recentemente, os inibidores de HDCA têm sido implicados no controle da autofagia.

Além da romidepsina, vários derivados têm sido preparados e estudados. A patente e os pedidos de patente que se seguem descrevem vários derivados da romidepsina: Patente U.S. 6.548.479; WO 05/0209134; WO 05/058298; e WO 06/129105; cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Dado o interesse na romidepsina como um agente farmacêutico, continua a existir uma necessidade com relação à preparação de grandes quantidades de material altamente purificado em uma maneira de custo efi- ciente. Diversos relatórios com relação à purificação da romidepsina a partir de uma calda de fermentação tem sido relatados. A Patente U.S. 4.977.138; Pedido de Patente Internacional PCT WO 02/20817; cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Por exemplo, o WO 02/20817 descreve o aumento da produção da romidepsina a partir de um processo de fermenta- 5 ção através da adição de aminoácidos específicos tais como a L-cisteína ao meio de cultura. Embora essas descobertas tenham proporcionado produ- ções aumentadas da romidepsina através da fermentação, continua existin- do uma necessidade melhores maneiras para a preparação de grandes quantidades de romidepsina pura para uso em pesquisa e em medicina.

Sumário da Invenção

A presente invenção é baseada no reconhecimento de que os procedimentos publicados para o isolamento da romidepsina não produzem de modo reproduzível a romidepsina pura, especificamente, a romidepsina isenta de contaminantes tais como a romidepsina dimerizada, oiigomerizada 15 ou polimerizada. Com base nesse reconhecimento, a presente invenção proporciona um sistema para preparar de forma reproduzível a romidepsina sob condições que reduzem os níveis desses produtos secundários conta- minantes. Produzindo, purificando, e/ou armazenando a romidepsina em um pH aparente de menos do que aproximadamente 6,5 mais preferencialmente 20 menos do que aproximadamente 6,0, foi descoberto como impedindo a for- mação de romidepsina dimerizada, oiigomerizada ou polimerizada. Esse me- lhoramento no processo de purificação da romidepsina permite rendimentos mais elevados de romidepsina e/ou romidepsina de pureza mais alta do que aquela provida através de processos conhecidos. Esse melhoramento é es- 25 pecificamente útila para a preparação de romidepsina de qualidade farma- cêutica para ser usada em seres humanos.

A romidepsina é tipicamente produzida através da purificação da mesma a partir de uma cultura de um micro-organismo (por exemplo, Chro- mobacterium violaceum) que produz o produto natural. A presente invenção 30 demonstra que é necessário manter um pH baixo durante pelo menos algu- mas das etapas de purificação com a finalidade de eliminar ou reduzir a for- mação da romidepsina reduzida que pode em seguida se dimerizar, oligome- rizar, ou polimerizar para a formação de contaminantes indesejáveis.

Uma ou mais das etapas de purificação são executadas em um pH aparente de menos do que 6,5 ou mesmo em um pH aparente de menos do que 6,0. Em determinadas modalidades, uma ou mais das etapas de puri- 5 ficação são executadas em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas de purificação são executa- das em um pH aparente de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. Com a finalidade de evitar a formação de contaminantes indesejáveis, o pH aparente de uma solução que contém a romidepsina não é deixado chegar a 10 um pH aparente acima de aproximadamente 7,0, ou mais preferencialmente acima de aproximadamente 6,0. O pH aparente de todos os processos da purificação é monitorado de preferência e em seguida ajustado, se necessá- rio, para ser um pH aparente abaixo de aproximadamente 6,0. Em determi- nadas modalidades, ele é mantido dentro de uma faixa de pH aparente de 15 aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. O controle do pH aparente nas etapas de purificação com relação ao final do processo ou etapas que usam soluções aquosas tem sido considerado como sendo especificamente útila na diminuição ou na eliminação da formação de contaminantes indese- jáveis. Qualquer ácido ou tampão pode ser usado para o controle do pH. Em 20 determinadas modalidades, um acido orgânico como o ácido acético ou o ácido fórmico é usado para o controle do pH em uma ou mais das etapas de purificação. Em determinadas modalidades, um ácido inorgânico tal como o ácido fosfórico ou o ácido clorídrico é usado.

Qualquer procedimento para a purificação da romidepsina, seja a partir de fermentação, semissíntese ou síntese total, pode ser modificado com base na presente invenção para impedir a formação de produtos colate- rais indesejados através da monitoração do pH aparente e da redução do pH aparente se necessária.

Em um aspecto, a invenção proporciona um processo para a preparação da romidepsina a partir de uma cultura de Chromobacterium vio- laceum. A calda de fermentação é acidificada com a finalidade de inativar ou matar os micro-organismos na cultura. A calda de fermentação acidificada é preliminarmente purificada através de cromatografia em batelada ou de co- luna. Em seguida, podem ser usadas múltiplas etapas de cromatografia de coluna para alcançar o nível de pureza desejado. Em determinadas modali- dades, a primeira cromatografia usa Sepabeads SP850, uma resina de ad- 5 sorção não-iônica. A romidepsina pode ser ainda purificada através de eta- pas de cromatografia de coluna adicionais. Em determinadas modalidades, a romidepsina é em seguida purificada através de cromatografia de coluna com a utilização da resina Díaion HP20SS, seguida por cromatografia de coluna com a utilização da resina Díaion HP20, e finalmente através de cro- 10 matografia de coluna sobre alumina. Em determinadas modalidades, a cro- matografia de coluna é realizada em um pH aparente que varia a partir de aproximadamente 4 até aproximadamente 6. Em determinadas modalidades específicas, a segunda etapa de cromatografia de coluna é realizada em um pH aparente reduzido (por exemplo, um pH aparente de aproximadamente 4 15 a 6). A romidepsina é opcionalmente ainda mais purificada através de crista- lização. Uma ou mais etapas de cristalização podem ser realizadas. Em de- terminadas modalidades, a romidepsina é primeiro cristalizada com a utiliza- ção de metanol e em seguida cristalizada com a utilização de acetona aquo- sa a 85%. A romidepsina resultante é em seguida opcionalmente filtrada, 20 lavada, e seca. Em determinadas modalidades, as etapas de cristalização ou quaisquer etapas subsequentes são realizadas em um pH aparente reduzido que varia a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. É de importância específica que as etapas finais sejam realizadas em um pH apa- rente reduzido uma vez que nenhuma etapa de purificação está disponível 25 para a remoção dos contaminantes não-desejados. Qualquer equipamento (por exemplo, tubulação, bombas, filtros, secores, etc.) usado nos processos de fermentação e/ou purificação é lavado com água ou uma solução ácida (por exemplo, ácido acético) para a remoção ou a neutralização de qualquer resíduo alcalino no equipamento.

Além do mais, a preparação de formas de dosagem farmacêuti-

cas da romidepsina, incluindo a composição com excipientes, solventes, cossolventes e/ou outros agentes usados para aumentar a atividade farma- cológica da romidepsina, pode ser executada em um pH aparente reduzido (por exemplo, um pH aparente de menos do que aproximadamente 4,0) com a finalidade de minimizar a formação da romidepsina dimerizada, oligomeri- zada ou polimerizada.

5 Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição de

romidepsina substancialmente isenta de romidepsina dimerizada, oligomeri- zada ou polimerizada. A romidepsina proporcionada pela presente invenção e mais do que 98% monomérica, mais do que 99% monomérica, ainda mais do que 99,95% monomérica, ou mais do que 99,9% monomérica. Em algu- mas modalidades, a romidepsina é de preferência mais do que 98% pura, mais do que 99% pura, mais do que 99,95% pura ou mais do que 99,95% pura com relação a todos os contaminantes. Em determinadas modalidades, a romidepsina inclui menos do que 1,0%, menos do que 0,5%, menos do que 0,2% ou menos do que 0,1% do total de outros desconhecidos. A com- posição da romidepsina inclui de preferência nenhum material detectável dimerizado, oligomerizado ou polimerizado. A pureza da romidepsina é tipi- camente determinada através de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC), espectroscopia infravermelha, análise de difração de raios X sobre pó (XRPD), cromatografia gasosa (GC), rotação específica, ou espectrosco- pia RMN. Em determinadas modalidades, a pureza é determinada através da medição da rotação específica de uma solução de romidepsina em cloro- fórmio. A invenção também proporciona preparações tamponadas de romi- depsina que mantêm o pH aparente da preparação abaixo de aproximada- mente 6,0, de preferência entre aproximadamente 4,0 e aproximadamente 6,0.

Essas preparações têm tipicamente um tempo de prateleira prolongada. Definições

As definições de grupos funcionais específicos e termos quími- cos estão descritos em mais detalhes abaixo. Para as finalidades da inven- ção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Peri- ódica de Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. capa interna, e grupos funcionais específicos são em geral definidos como descritos no mesmo, além disso, os princípios gerais de química orgâ- nica, bem como as porções funcionais específicas e a reatividade, estão descritas em Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999, o conteúdo total do qual é incorporado aqui por referência.

5 Determinados compostos da presente invenção podem existir

em formas específicas geométricas ou estereoisoméricas. A presente inven- ção contempla todos esses compostos, incluindo os isômeros c/s e trans, isômeros E- e Z-, enantiômeros R- e S-, diastereômeros, isômeros (D), isô- meros(L), isômeros (-) e (+), misturas racêmicas dos mesmos e outras mis- 10 turas dos mesmos, como estando dentro do âmbito da invenção. Os átomos de carbono assimétricos adicionais podem estar presentes em um substituin- te como um grupo alifático (por exemplo, alquila) ou heteroalifático. Todos esses isômeros, bem como as misturas dos mesmos, são considerados com estando dentro desta invenção.

As misturas isoméricas que contenham qualquer uma de uma

variedade de proporções de isômeros podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção. Por exemplo, quando somente dois isômeros estão com- binados, as misturas que contenham 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1, ou 100:0 proporções de isômeros são todas contem- 20 piadas pela presente invenção. Aquelas pessoas versados na técnica irão observar com facilidade que as proporções análogas são contempladas com relação às misturas de isômeros mais complexas.

Será observado que os compostos, como descritos aqui, podem ser substituídos com qualquer número de substituintes ou porções funcio- 25 nais. Em geral, o termo "substituído", seja precedido pelo termo "opcional- mente" ou não, e os substituintes contidos nas fórmulas desta invenção, re- ferem-se à substituição de radicais hidrogênio em uma determinada estrutu- ra, como radical de um substituinte específico. Em determinadas modalida- des, somente o radical hidrogênio em uma determinada estrutura é substitu- 30 ído com o radical de um substituinte específico. Em outras modalidades, um, dois, ou três radicais de hidrogênio em uma determinada estrutura são subs- tituídos com o mesmo radical ou com um radical diferente de um substituinte específico. Quando mais do que uma posição em qualquer estrutura dada pode ser substituída com um ou mais do que um substituinte selecionado a partir de um grupo especificado, o substituinte pode ser tanto o mesmo como diferente em todas as posições. Na forma usada aqui, o termo "substituído" 5 é contemplado como incluindo todos os substituintes permissíveis de com- postos orgânicos. Em um aspecto amplo, os substituintes permissíveis inclu- em substituintes de compostos orgânicos acíclicos e cíclicos, ramificados ou não-ramificados, carbocíclicos ou heterocíclicos, aromáticos e mão aromáti- cos. Para as finalidades desta invenção, os heteroátomos, tais como o nitro- 10 gênio, podem ter substituintes de hidrogênio e/ou quaisquer substituintes permissíveis de compostos orgânicos descritos aqui, que satisfaçam as va- lências dos heteroátomos. além do mais, esta invenção não está destinada a ser limitada de qualquer maneira pelos substituintes permissíveis dos com- postos orgânicos. As combinações de substituintes e variáveis imaginadas 15 por esta invenção são de preferência aquelas que resultam na formação de compostos estáveis úteis para o tratamento de, por exemplo, doenças proli- ferativas, tais como o câncer. O termo "estável", na forma usada aqui, refere- se a compostos que possuam estabilidade suficiente para permitir a fabrica- ção e que mantenham a integridade do composto durante um período de 20 tempo suficiente para ser detectado e de preferência durante um período de tempo suficiente para ser utilizável para as finalidades detalhadas aqui.

O termo "alifático, na forma usada aqui, inclui ambos os hidro- carbonetos alifáticos, saturados ou não-saturados, de cadeia linear (por e- xemplo, não-ramificada), ramificada, acíclica, cíclica ou policíclica, que são 25 opcionalmente substituídos com um ou mais grupos funcionais. Como será observado por uma pessoa versada na técnica, "alifático" está destinado aqui, a incluir, porém não está limitado a porções de alquila, alquenila, alqui- nila, cicloalquila, cicloalquenila e cicloalquinila. Desse modo, na forma usada aqui, o termo "alquila" inclui grupos de alquila lineares, ramificados e cícli- 30 cos. Uma convenção análoga se aplica a outros termos genéricos tais como "alquenila", "alquinila" e similares, além disso, na forma usada aqui, os ter- mos "alquila", "alquenila", "alquinila" e similares englobam ambos os grupos substituídos e não-substituídos. Em determinadas modalidades, na forma usada aqui, "alquila inferior" é usado para indicar aqueles grupos de alquila (cíclicos, acíclicos, substituídos, não-substituídos, ramificados ou não- ramificados) que tenham de 1 a 6 átomos de carbono.

Em determinadas modalidades, os grupos alquila, alquenila e

alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 20 átomos de carbono ali- fáticos. Em determinadas outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 10 átomos de carbono ali- fáticos. Em ainda outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila 10 empregados na invenção contêm de 1 a 8 átomos de carbono alifáticos. Em ainda outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila emprega- dos na invenção contêm de 1 a 6 átomos de carbono alifáticos. Em outras modalidades adicionais, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contém de 1 a 4 átomos de carbono. Desse modo, os grupos 15 alifáticos ilustrativos incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, a porções de metila, etila, n-propila, isopropila, ciclopropila, -CH2-ciclopropila, vinila, alila, n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, ciclobutila, -CH2- ciclobutila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, terc-pentila, ciclopentila, -CH2- ciclopentila, n-hexila, sec-hexila, ciclo-hexila, -CH2-ciclo-hexila e similares, 20 que de novo podem conter um ou mais substituintes. Os grupos alquenila incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, etenila, propenila, bute- nila, 1-metila-2-buten-1-ila, e similares. Os representativos dos grupos alqui- nila incluem porém não estão limitados a, etinila, 2-propinila (propargila), 1- propinila, e similares.

Alguns exemplos de substituintes das porções alifáticas (e ou-

tras) acima descritas dos compostos da invenção incluem, porém não estão limitados a, alifáticos; heteroalifáticos; arila; heteroarila; arilalquila; heteroari- lalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; heteroal- quiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCI2; - 30 CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não está limitada a alifáticos, heteroalifáticos, arila, heteroarila, arilalquila, ou heteroa- rilalquila, em que cada um dos substituintes alifáticos, heteroalifáticos, arilal- quila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não- substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, e em que qual- 5 quer um dos substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não-substituído. Os exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades específicas mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui.

Em geral, os termos "arila" e "heteroarila", na forma usada aqui, 10 referem-se a porções mono- ou poli- cíclicas, heterocíclicas, policíclicas e poli-heterocíclicas não-saturadas que tenham de preferência de 3 a 14 áto- mos de carbono, cada uma das quais pode ser substituída ou não- substituída. Os substituintes incluem, porém não estão limitados a, qualquer um dos substituintes previamente mencionados, isto é, os substituintes rela- 15 cionados para as porções alifáticas, ou com relação a outras porções como as descritas aqui, e que resultam na formação de um composto estável. Em determinadas modalidades da presente invenção, "arila" refere-se a um sis- tema de anel carboxílico mono- ou bicíclico, que tenha um ou dois anéis a- romáticos, incluindo porém não limitados a, fenila, naftila, tetra-hidronaftila, 20 indanila, indanila, e similares. Em determinadas modalidades da presente invenção, o termo "heteroarila", na forma usada aqui, refere-se a um radical aromático cíclico que tem a partir de cinco até dez átomos no anel, dos quais um dos átomos do anel é selecionado a partir de S, O e N; zero, um ou dois átomos do anel são heteroátomos adicionais selecionados independente- 25 mente a partir de S, O e N; e o restante átomos do anel é carbono, o radical estando junto ao restante da molécula através de qualquer dos átomos do anel, tais como, por exemplo, piridila, pirazinila, pirimidila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, oxazolila, isoxazolila, tiodiazolila, oxadiazolila, tiofenila, furanila, quinolinila, isoquinolinila, e similares.

Será observado que os grupos arila e heteroarila podem ser

não-substituídos ou substituídos, em que a substituição inclui a substituição de um, dois, três ou mais dos átomos de hidrogênio no mesmo de forma in- dependente com qualquer uma ou mais porções que se seguem, incluindo, porém não limitadas a, alifáticos; heteroalifáticos; arila; heteroarila; arilalqui- la; heteroarilalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; - CHCI2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não está limitada a, alifáticos, heteroalifáticos, arila, heteroarila, arilalquila, ou heteroa- rilalquila, em que cada um dos substituintes alifáticos, heteroalifáticos, arilal- quila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui, pode ser substituído ou não- substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, e em que, qualquer um dos substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não-substituído. Os exemplos adicionais de substitu- intes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades específi- cas mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui.

O termo "heteroalifático", na forma usada aqui, refere-se às por- ções alifáticas que contêm um ou mais átomos de oxigênio, enxofre, nitrogê- nio, fósforo ou sílica, por exemplo, no lugar de átomos de carbono. As por- ções heteroalifáticas podem ser ramificadas, não-ramificadas, cíclicas ou 20 acíclicas e incluem heteróciclos saturados ou não-saturados tais como mor- folino, pirrolidinila, etc. Em determinadas modalidades, as porções heteroali- fáticas são substituídas por substituintes independentes de um ou mais dos átomos de hidrogênio nos mesmos com uma ou mais porções incluindo po- rém não limitadas a, alifáticos; heteroalifáticos; arila; heteroarila; arilalquila; 25 heteroarilalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; - CHCI2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não está 30 limitada a, alifáticos, heteroalifáticos, arila, heteroarila, arilalquila, ou heteroa- rilalquila, em que cada um dos substituintes alifáticos, heteroalifáticos, arilal- quila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui, pode ser substituído ou não- substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, e em que qual- quer um dos substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não-substituído. Os exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades específicas 5 mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui.

Os termos "halo" ou "halogênio", na forma usada aqui, referem- se a um átomo selecionado a partir de flúor, cloro, bromo ou iodo.

"Selecionados independentemente": o termo "selecionados in- dependentemente", na forma usada aqui, indica que os grupos R podem ser idênticos ou diferentes.

As definições de outros termos usados através de todo o relató- rio específico incluem:

"Ácido": o termo "ácido", na forma usada aqui, refere-se a ácidos inorgânicos e orgânicos. Os exemplos de ácidos inorgânicos incluem, porém não são limitados a ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido (hidroiódico), ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico. Os exemplos de ácidos orgâ- nicos incluem, porém não estão limitados a, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico e ácido p-toluenossulfônico. Qualquer ácido pode ser usado para o ajuste do pH dos tampões ou soluções de romidepsina ou aqueles usados na purificação da romidepsina. Em determinadas modalida- des, o ácido acético é usado. Em determinadas modalidades, o ácido clorí- drico é usado. Em determinadas modalidades, o ácido cítrico é usado. Em determinadas modalidades, o ácido sulfúrico é usado.

"Depsipeptide": o termo "depsipeptídio", na forma usada aqui, refere-se aos polipeptídios que contêm ambas as ligações de éster e de a- mida. Os depsipeptídios de ocorrência natural são usualmente cíclicos. Al- guns dos depsipeptídios têm mostrado ter uma atividade antibiótica potente. 30 Os exemplos de desipeptídios incluem a actinomicina, eníatinas, valinomici- na e romidepsina.

"Peptídio" ou "proteína": de acordo com a presente invenção, um "peptídio" ou "proteína" compreende uma fita de pelo menos três aminoáci- dos ligados em conjunto através de ligações de peptídio. Os termos "peptí- dio" e "proteína" podem ser usados de forma intercambiável. Os peptídios contêm de preferência somente aminoácidos naturais, embora aminoácidos 5 não-naturais (isto é, compostos que não ocorrem na natureza, porém que podem ser incorporados dentro de uma cadeia de polipeptídio) e/ou análo- gos de aminoácidos, como são conhecidos na técnica, possam ser alternati- vamente empregados. Também, um ou mais dos aminoácidos em um peptí- dio pode ser modificado, por exemplo, através da adição de uma entidade 10 química tal como um grupo de carboidrato, um grupo de fosfato, um grupo de farnesila, um grupo de isofarnesila, um grupo de ácido graxo, um Iigante para conjugação, funcionalização, ou outra modificação, etc. Em determina- das modalidades, as modificações do peptídio levam a um peptídio mais es- tável (por exemplo, uma maior meia-vida in vivo). Essas modificações po- 15 dem incluir a ciclização do peptídio, a incorporação de aminoácidos D, etc. Nenhuma das modificações devem substancialmente interferir com a ativi- dade biológica desejada do peptídio. Em determinadas modalidades, o pep- tídio refere-se ao depsipeptídio.

"Romidepsina": o termo "romidepsina" refere-se a um produto natural da estrutura química:

A romidepsina é um inibidor potente HDAC e também é conhe- cida na técnica pelos nomes de FK228, FR901228, NSC630176, ou depsi- peptide. A preparação e a identificação da romidepsina estão descritas na Patente U.S. 4.977.138, que fica incorporada aqui por referência. A fórmula 25 molecular é C24H36N4O6S2; e o peso molecular é 540,71. A Romidepsina tem o nome químico, (1S,4S,10S,16E,21R)-7-[(2Z)-etiiideno]-4,21-di-isopropiia-2- oxa-12,13-ditia-5,8,20,23-tetra-azabiciclo[8.7.6]tricos-16-eno-3,6,9,19,22- pentanona. A romidepsina teve atribuído o número CAS 128517-07-7. Na forma cristalina, a romidepsina é tipicamente um cristal ou um pó cristalino de cor branca a amarela-clara. O termo "romidepsina" engloba este compos- 5 to e quaisquer formas de sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. Em determinadas modalidades, o termo "romidepsina" também pode incluir pro- fármacos, ésteres, formas protegidas e derivados da mesma.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra um fluxograma para a purificação da romidep- sina a partir de uma cultura de Chromobacterium violaceum.

Descrição Detalhada de Determinadas Modalidades da Invenção

A presente invenção proporciona um sistema aperfeiçoado para a preparação da romidepsina, um inibidor conhecido da histona desacetilase (HDAC) útila para o tratamento de câncer. Infelizmente, os métodos publica- 15 dos para a preparação da romidepsina não produzem de modo reproduzível a romidepsina monomérica pura. Surpreendentemente, o controle do pH du- rante o processo de purificação foi descoberto como provendo a romidepsina monomérica pura de forma reproduzível. Especificamente, executando pelo menos determinadas porções do processo de purificação em um pH aparen- 20 te reduzido (por exemplo, um pH aparente variando a partir de 4 até 6), re- sulta na produção mais elevada de romidepsina monomérica purificada sem os produtos colaterais contaminantes dimerizados, oligomerizados ou poli- merizados.

A romidepsina é um depsipeptídio cíclico que tem uma ligação 25 de dissulfeto. A presente invenção é baseada na descoberta de que a expo- sição da romidepsina a condições básicas (por exemplo, maiores do que um pH aparente de ~ 7) facilita a redução dessa ligação de dissulfeto. A romi- depsina reduzida com os seus tióis livres foi descoberta como sendo susce- tível à dimerização, oligomerização ou polimerização. Esses adutos são tipi- 30 camente insolúveis e difíceis de serem removidos a partir da romidepsina purificada. Em determinadas modalidades, esses adutos contaminantes im- pedem uma preparação da romidepsina de satisfazer as especificações de- sejadas (por exemplo, solubilidade, grau de pureza, rotação ótica, etc.). Nas composições farmacêuticas, esses adutos diminuem a pureza do agente ativo, a romidepsina. Uma vez que a romidepsina está sendo usada como um agente farmacêutico em seres humanos, é importante que a romidepsina 5 monomérica pura estável seja obtida de forma reproduzível a partir de uma fermentação de Chromobacterium violaceum. A presente invenção aparece a partir do reconhecimento de que condições alcalinas ocasionem a forma- ção de tais adutos indesejáveis da romidepsina e proporciona uma nova so- lução para esse problema.

O sistema da invenção também é útila para a preparação de de-

rivados da romidepsina, especificamente de derivados que contenham uma ligação de dissulfeto. Em determinadas modalidades, o derivado da romi- depsina tem a fórmula (I):

substituídos ou substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou ací- clicos; heteroalifáticos não-substituídos ou substituídos, ramificados ou não- ramificados, cíclicos ou acíclicos; arila não-substituída ou substituída; ou he- teroarila não-substituída ou substituída;

em que

15

m é 1, 2, 3 ou 4; n é 0, 1, 2 ou 3;

p e q são independentemente 1 ou 2;

X é O, NH, ou NR8;

Ri, R2, e R3 são independentemente hidrogênio; alifáticos não-

R4, R5, R6, R7 e R8 são independentemente hidrogênio; ou alifá- ticos substituídos ou não-substituídos, ramificados ou não-ramificados, cícli- cos ou acíclicos; e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em determinadas modalidades, m é 1. Em determinadas modalidades, n é 1. Em determinadas modalidades, p é 1. Em determinadas modalidades, q é 1. Em 5 determinadas modalidades, X é O. Em determinadas modalidades, R1, R2, e R3 são alifáticos acíclicos não-substituídos, ou substituídos, ramificados ou não-ramificados. Em determinadas modalidades, R4, Rs, R6> e R7 são todos hidrogênio.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é da

fórmula (II):

em que

m é 1, 2, 3 ou 4;

n é 0, 1, 2 ou 3; q é 2 ou 3;

X é O, NH, ou NR8;

Y é OR8, ou SR8;

R2 e R3 são independentemente hidrogênio; alifáticos não- substituídos ou substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou ací- clicos; heteroalifáticos não-substituídos ou substituídos, ramificados ou não- ramificados, cíclicos ou acíclicos; arila não-substituída ou substituída; ou he- teroarila não-substituída ou substituída;

R4, R5, R6, R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de hidrogênio; ou alifático substituídos ou não-substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou acíclicos; e os sais farmaceuticamente aceitá- veis do mesmo. Em determinadas modalidades, m é 1. Em determinadas modalidades, n é 1. Em determinadas modalidades, q é 2. Em determinadas modalidades, X é O. Em outras modalidades, X é NH. Em determinadas mo- dalidades, R2 e R3 são alifáticos acíclicos não-substituídos ou substituídos, 5 ramificados ou não-ramificados. Em determinadas modalidades, R4, R5, R6, e R7 são todos hidrogênio.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é da

fórmula (III):

em que A é uma porção que é clivada sob condições fisiológicas para dar um grupo tiol e inclui, por exemplo, uma porção acila alifática ou aromática (para a formação de uma ligação de tioéster); um tióxi alifático ou aromático (para a formação de uma ligação de dissulfeto); ou similares; e racematos, enantiômeros, isômeros, tautômeros, sais, ésteres, e profármacos dos mes- mos. Esses grupos alifáticos ou aromáticos podem incluir um grupo alifático substituído ou não-substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou não cíclico; um grupo aromático substituído ou não-substituído; um grupo hete- roaromático substituído ou não-substituído; ou um grupo heterocíclico substi- tuído ou não-substituído. A pode ser, por exemplo, -CORi, -SC(=0)-0-Ri, ou -SR2. Ri é independentemente hidrogênio; amino substituído ou não- substituído; alifáticos substituídos ou não-substituídos, ramificados ou não- ramificados, cíclicos ou acíclicos; um grupo aromático substituído ou não- substituído; um grupo heteroaromático substituído ou não-substituído; ou um grupo heterocíclico substituído ou não-substituído. Em determinada modali- dade, Ri é hidrogênio, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, benzila, ou bromobenzila. R2 é um grupo alifático substituído ou não- substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou não cíclico; um grupo aromático substituído ou não-substituído; um grupo heteroaromático substi- tuído ou não-substituídos; ou um grupo heterocíclico substituído ou não- substituído. Em determinadas modalidades, R2 é metila, etila, 2-hidroxietila, isobutila, ácidos graxos, um benzila substituída ou não-substituída, uma ari- Ia, cisteína, homocisteína, ou glutationa substituída ou não-substituída.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é das fórmulas (IV ou IV'):

em que R1, R2, R3, e R4 são os mesmos ou diferentes e representam uma porção de cadeia lateral de aminoácido, cada R6 é o mesmo ou é diferente e 10 representa hidrogênio ou C1-C4 alquila, e Pr1 e Pr2 são os mesmos ou são diferentes e representam hidrogênio ou um grupo de proteção de tiol. Em determinadas modalidades, as porções de cadeia lateral de aminoácidos são aqueles derivados a partir de aminoácidos naturais. Em outras modalidades, as porções laterais da cadeia de aminoácidos são aqueles derivados a partir 15 de aminoácidos não-naturais. Em determinadas modalidades, cada cadeia lateral de amino acido é uma porção selecionada a partir de -H, -C1-C6 al- quila, -C2-C6 alquenila, -L-O-C(O)-R', -L-C(O)-O-R", -L-A, -L-NR"R", -L-Het- C(O)-Het-R", e -L-Het-R", nas quais L é um grupo de C1-C6 alquileno, A é fenila ou um grupo de heteroarila de 5- ou 6- elementos, cada um de R' é o 20 mesmo ou é diferente e representa CrC4 alquila, cada um de R" é o mesmo ou é diferente e representa H ou C1-C6 alquila, cada um de -Het- é o mesmo ou é diferente e é um espaçador de heteroátomo selecionado a partir de -O-, -N(R"')-, e -S-, e cada um de R'" é o mesmo ou é diferente e representa H ou CrC4 alquila. Em determinadas modalidades, R6 é -H. Em determinadas

O

O

(IV') modalidades, Pr1 e Pr2 são os mesmos ou são diferentes e são selecionados a partir de hidrogênio e de um grupo de proteção selecionado a partir de um grupo benzila, o qual é opcionalmente substituído com C1-C6 alcóxi, CrC6 acilóxi, hidróxi, nitro, picolila, picolila-N-óxido, antrilmetila, difenilmetila, fenila, 5 t-butila, adamantila, CrC6 aciloximetila, C1-C6 alcóximetila, tetra- hidropiranila, benziltiometila, feniltiometila, tiazolidina, acetamidemetila, ben- zamidometila, butoxicarbonila terciário (BOC), acetila e os derivados do mesmo, benzoila e os derivados do mesmo, carbamoila, fenilcarbamoila, e C1-C6 alquilacarbamoila. Em determinadas modalidades, Pr1 e Pr2 são hi- 10 drogênio. Diversos derivados da Romidepsina das fórmulas (IV) e (IV) estão descritos no Pedido de Patente PCT WO 2006/129105, publicado em 7 de dezembro de 2006; que fica incorporado aqui.

A presente invenção também é útila para a preparação de outros produtos naturais que contenham uma ligação de dissulfeto. A invenção po- 15 de ser usada para a preparação de peptídios cíclicos ou acíclicos. Em de- terminadas modalidades, os peptídios cíclicos que contém uma iigação de dissulfeto são purificados com a utilização do sistema da invenção. Em de- terminadas modalidades, outros depsipeptídios. além da romidepsina, são purificados com base na presente invenção com a utilização de uma redução 20 do pH aparente para limitar ou eliminar a redução de uma ligação intramole- cular de dissulfeto.

De acordo com a invenção, a formação de adutos indesejáveis da romidepsina ou de um derivado da romidepsina pode ser evitada através de não permitir que a romidepsina seja preparada ou purificada sob condi- 25 ções maiores do que um pH aparente de ~7,0, mais preferencialmente maio- res do que um pH aparente de -6,5, ou de maior preferência maior do que um pH aparente de -6,0. A preparação e a purificação é tipicamente mantida entre aproximadamente um pH aparente de 4,0 e um pH aparente de 6,0. Em determinadas modalidades, um pH aparente ainda mais baixo pode ser 30 usado. Esse reconhecimento pode ser aplicado a qualquer método de pro- dução ou de purificação para a preparação da romidepsina. Em determina- das modalidades, a romidepsina é purificada a partir de uma fermentação. Em outras modalidades, a romidepsina é preparada através da semissíntese ou da síntese total. Esta descoberta também pode ser aplicada com relação à preparação e/ou à produção de análogos ou derivados da romidepsina (por exemplo, sais, ésteres, profármacos, isômeros, enantiômeros, tautôme- 5 ros, formas protegidas, produtos derivatizados, etc.). Determinados deriva- dos da romidepsina estão descritos aqui.

Os processos para a preparação da romidepsina são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Ueda et ai, J. Antibiot. (Tokyo) 47: 301-310, 1994; Nakajima et ai, Exp. Cell Res. 241: 126-133, 1998; WO 02/20817; Patente U.S. 4.977.138; cada uma das quais fica incorporada aqui por refe- rência. Uma vez que a romidepsina é um produto natural, ela é preparada tipicamente através do isolamento da mesma a partir de uma fermentação de um micro-organismo que produz a mesma. Em determinadas modalida- des, o micro-organismo pertence ao gênero Chromobacterium. Um micro- organismo de exemplo que é conhecido para a produção da romidepsina é o Chromobacterium violaceum. Qualquer variante natural ou feita pelo homem do Chromobacterium violaceum pode ser usada para isolar a romidepsina com a utilização do sistema da invenção. Em determinadas modalidades, a cepa de Chromobacterium violaceum é a Chromobacterium violaceum WB968. Em determinadas modalidades, a cepa da Chromobacterium viola- ceum é uma cepa mutante da Chromobacterium violaceum WB968. Em de- terminadas modalidades, o micro-organismo é geneticamente manipulado para a produção da romidepsina. Por exemplo, os genes responsáveis com relação ao mecanismo celular que produz a romidepsina podem ser coloca- dos dentro de outros micro-organismos, tais como bactérias ou fungos.

O organismo é cultivado sob condições adequadas para a sua produção de romidepsina. De preferência, as condições de cultura são otimi- zadas para a produção de um nível elevado de romidepsina com níveis mí- nimos de adutos de contaminação ou de degradantes. O meio de cultura 30 inclui, de preferência, uma fonte de carbono e de nitrogênio e quaisquer vi- taminas e minerais essenciais. A cultura é tipicamente cultivada sob condi- ções aeróbicas. O tamanho da cultura pode variar a partir de 10 ml até 10.000 I ou ainda maior. Em determinadas modalidades, o volume da cultura é maior do que 500 I. Em outras modalidades, o volume é maior do que 1000 I. Em ainda outras modalidades, o volume é maior do que 2000. Em outras modalidades, o volume é maior do que 3000. Em outras modalidades, o vo- 5 lume é maior do que 5000. Em outras modalidades, o volume é maior do que 6000. Em outras modalidades, o volume é maior do que 7000. Em outras modalidades, o volume é maior do que 8000. Em outras modalidades, o vo- lume é maior do que 9000. Em determinadas modalidades, o volume da cul- tura varia aproximadamente de 5000 litros até aproximadamente 10000. 10 Frascos de agitação, fermentadores, biorreatores ou qualquer outra apare- lhagem útila para a fermentação de micro-organismos pode ser usada. Na forma apropriada, as culturas de semente e culturas de pequenos fermenta- dores são usadas para semear culturas maiores.

Em determinadas modalidades, um agente de antiformação de 15 espuma (por exemplo, o antiformador de espuma de polialquileno glicol (A- dekanol LG-109)) é usado em culturas maiores. Outros agentes de antifor- mação de espuma comercialmente disponíveis também podem ser usados. Os agentes antiformação de espuma são especificamente úteis quando é usado um fermentador para a produção da romidepsina.

A fonte de carbono no meio de cultura pode ser qualquer carboi-

drato. Em determinadas modalidades, a fonte de carbono é um monossaca- rídio ou um dissacarídio (por exemplo, a glicose). Em determinadas modali- dades específicas, a fonte de carbono é a glicose ou a maltodextrina. Outros carboidratos tais como o amido, maltose, frutose ou glicerina podem ser u- 25 sados em determinadas modalidades. Em determinadas modalidades, a fon- te de nitrogênio é um sal de amônio tal como o sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de amônio, etc. Em outras modalidades, a fonte de nitrogê- nio é uma peptona vegetal (por exemplo, a polipeptona NS, água de mace- ração de milho, Hinute R). Outras fontes de nitrogênio que podem ser usa- 30 das incluem caldo ("bouillon"), extrato de fermento, peptona de soja, farelo de glúten, farinha de sementes de algodão, farelo de soja, fermento seco e germe de trigo. Em determinadas modalidades, a fonte de nitrogênio é a u- reia ou aminoácidos. Em determinadas modalidades, a fonte de nitrogênio é uma molécula orgânica pequena que contenha nitrogênio. Em determinadas modalidades, o meio é suplementado com aminoácidos. Por exemplo, o meio pode ser suplementado com L-arginina, L-histidina ou L-cisteína. Em 5 determinadas modalidades, o meio é suplementado com L-cisteína. Ver o WO 02/20817; incorporado aqui por referência. Em determinadas modalida- des, o meio é suplementado com L-cisteína e L-valina. Essa suplementação é considerada como aumentando a quantidade de romidepsina produzida na fermentação e/ou reduzindo a quantidade de substâncias relacionadas e/ou 10 degradantes. O meio de cultura pode incluir minerais tais como o magnésio (por exemplo, o sulfato de magnésio) e fosfato (por exemplo, o di- hidrogenfosfato de potássio, hidrogenofosfato de dissódio). Em determina- das modalidades, o meio de cultura inclui glicose, peptona vegetal (polipep- tona NS) ou água de maceração de milho (CSL), sulfato de magnésio e á- 15 gua. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose, poli- peptona (polipeptoina NS), sulfato de magnésio, um agente antiformação de espuma, e água. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose (0,45 a 1,0%), peptona vegetal (polipeptona NS) ou CSL (0,9 a 4,0%), sulfato de magnésio (0,0054 a 0,010%), um agente antiformação de 20 espuma (0,09% a 0,11%) e água (o restante). Em determinadas modalida- des, o meio de cultura inclui glicose, amido oxidado (por exemplo, Pinodex # 100) ou maltodextrina, peptona de soja (por exemplo, Hinute R), sulfato de amônio, sulfato de magnésio, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofos- fato de dissódio, agente antiformação de espuma (por exemplo, Adekanol 25 LG-109), L-cisteína, L-valina, e água. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose (2 a 10%), amido oxidado (por exemplo, Pinodex # 100) ou maltodextrina (1 a 15%), peptona de soja (por exemplo, Hinute R)(1 a 6%), sulfato de amônio (0 a 0,5%), sulfato de magnésio (0 a 2%),di- hidrogenofosfato de potássio (0,275 a 1,65%, hidrogenofosfato de dissódio) 30 (0,18 a 1,08%), agente antiformação de espuma (por exemplo, Adekanol LG- 109) (0,2 a 0,66%), L-cisteína (0 a 30 mM), L-valina (0 a 15 mM), e água.

A cultura é tipicamente cultivada sob condições (por exemplo, temperatura, pH, concentração de oxigênio, etc.) adequadas para a cultura do organismo. Em determinadas modalidades, o pH da cultura é monitorado e/ou ajustado. O pH da cultura pode variar a partir de um pH de 5,0 até 7,5. Qualquer organismo para a produção da romidepsina terá uma temperatura 5 preferida para crescimento dependendo das condições sob as quais a cultu- ra é cultivada. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura que varia a partir de 15°C até 37°C, de preferência a partir de 23°C até 32°C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura entre 18°C até 27°C. Em determinadas modalidades, a cultura é 10 cultivada em uma temperatura de aproximadamente 18 0C. Em determina- das modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproxima- damente 19 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 20 0C. Em determinadas modalida- des, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 21 0C. 15 Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 22 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultiva- da em uma temperatura de aproximadamente 23 0C. Em determinadas mo- dalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente

24 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma tempe- ratura de aproximadamente 25 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 26 0C. Em determina- das modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproxima- damente 27 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 28 0C. Em determinadas modalida- des, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 29 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 30 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultiva- da em uma temperatura de aproximadamente 31 0C. Em determinadas mo- dalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 32 0C.

A concentração de oxigênio na cultura é mantida em um nível que varia a partir de 10 a 50%. Em determinadas modalidades, a concentra- ção de oxigênio é mantida acima de 20%. O nível de oxigênio é mantido a- través de aeração, Pressão e/ou agitação.

A cultura resultante é tipicamente cultivada durante aproxima- damente de 10 até 100 horas. A cultura pode ser colhida depois de 20, 30, 5 40, 50, 60, 70 ou 80 horas. Em determinadas modalidades, a cultura é colhi- da depois de aproximadamente 30, 35, 40, 45 ou 50 horas. Em determina- das modalidades, a cultura é colhida em aproximadamente 36 horas. Em determinadas modalidades, a cultura é colhida em aproximadamente 50 ho- ras. Tipicamente, a cultura é cultivada até a saturação. Uma vez que a romi- 10 depsina é um metabólito secundário, os rendimentos máximos são derivados a partir das últimas etapas da cultura. Em algumas modalidades, a cultura é colhida em fase log. Como poderá ser apreciada por uma pessoa versada na técnica, a cultura é tipicamente colhida antes que quantidades significativas de degradantes sejam formadas. O tempo da colheita pode ser determinado 15 de forma empírica através da análise de uma amostra da fermentação para a produção da romidepsina. Em determinadas modalidades, a cultura é co- lhida quando a titulação da romidepsina atinge entre 0,5 e 1,5 kg. Em deter- minadas modalidades, a cultura é colhida quando a titulação atinge pelo me- nos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, ou 1,1 g/kg. Em determinadas modalidades, a cul- 20 tura é colhida quando a titulação atinge pelo menos 0,8 g/kg. A amostra também pode ser analisada com relação a substâncias relacionadas ou de- gradantes, e a cultura colhida quando um nível desejado de romidepsina, nível desejado de substâncias relacionadas ou degradantes ou uma propor- ção das duas é alcançado. O tempo da colheita também pode ser determi- 25 nado com base no consumo de um componente no meio tal como a glicose. Em outras modalidades, o tempo de colheita é baseado sobre a produção de um metabólito. O tempo da colheita pode ser determinado com base sobre uma combinação dos critérios acima.

Depois que a cultura é cultivada durante uma quantidade de tempo suficiente, a cultura é colhida. A romidepsina desejada pode ser en- contrada no meio de cultura bem como nas células da cultura. As células são opcionalmente mortas e/ou Iisadas antes da purificação. Em determina- das modalidades, as células são mortas com a adição de um ácido tal como o ácido sulfúrico. Em determinadas modalidades, o pH é abaixado para a- proximadamente o pH 2,0 a 3,0.

O material resultante é em seguida opcionalmente reduzido em volume. A romidepsina é purificada através de qualquer técnica de purifica- ção conhecida na técnica para a purificação de peptídios, produtos naturais e/ou moléculas orgânicas. As técnicas de purificação de exemplo incluem a cromatografia em batelada, cromatografia de coluna e cristalização. O pro- cesso de purificação pode incluir uma ou mais etapas com a finalidade de alcançar o grau de purificação desejado. Em determinadas modalidades o material extraído é purificado com a utilização de uma resina de adsorção não-iônica. Em determinadas modalidades, é usada uma resina de fase re- versa na etapa de fracionamento. Em determinadas modalidades específi- cas, são usadas etapas múltiplas de cromatografia de coluna com a utiliza- ção de uma resina de fase reversa. As resinas úteis para o processo de puri- ficação, a título de exemplo, incluem alumina, sílica-gel, Sepabeads SP850, Díaion HP20SS, and Díaion HP20. Em determinadas modalidades, a Díaion HP20SS e/ou a Díaion HP20 são obtidas da Mitsubishi Chemical Corporati- on. Em determinadas modalidades, a alumina é usada como o material da coluna. Em determinadas modalidades, o sílica-gel é usado como a resina. Em determinadas modalidades, uma ou mais etapas da cromatografia de coluna são executadas em um pH aparente de menos do que 6,0. Em de- terminadas modalidades, uma ou mais dessas etapas é executada em um pH aparente entre 4,0 e 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas da cromatografia de coluna são executadas em um pH aparente de menos do que 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas da cromatogra- fia de coluna são executadas em um pH aparente que varia a partir de 4,0 até 6,0.

Em determinadas modalidades, a purificação da romidepsina envolve a purificação do material extraído com a utilização de mais do que uma etapa de cromatografia em batelada ou de coluna. Em determinadas modalidades, uma etapa de cromatografia em batelada é seguida por etapas de cromatografia em coluna. Em determinadas modalidades, o material ex- traído é purificado através de cromatografia em batelada com Sepabeads SP850, seguida por uma coluna empacotada com Díaion HP20SS, seguida por uma coluna empacotada com Díaion HP20, e finalmente por uma coluna

5 empacotada com alumina. Todas essas etapas de cromatografia são execu- tadas de preferência em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Em outras modalidades, o material extraído é purificado com a utilização de uma coluna empacotada com Díaion HP20, seguida por uma coluna empacotada com Díaion HP20SS, e finalmente seguida por outra coluna empacotada

com Díaion HP20. Nesse processo alternativo de purificação, todas as eta- pas da cromatografia de coluna são executadas de preferência em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Cada uma das colunas é opcio- nalmente lavada com água ou com outra solução aquosa seguida pela elui- ção da romidepsina com a utilização de uma solução aquosa de um solvente 15 orgânico (por exemplo, a acetona). Em determinadas modalidades, o mate- rial extraído é purificado com a utilização de sílica-gel. A cromatografia em sílica-gel também pode ser usada como uma etapa adicional de purificação em conjunto com cromatografia usando outras resinas ou materiais de em- pacotamento. Em determinadas modalidades, o material extraído é purifica- 20 do com a utilização de alumina. A cromatografia com alumina também pode ser usada como uma etapa adicional de purificação em conjunto com a cro- matografia utilizando outras resinas ou materiais de empacotamento.

Em determinadas modalidades, o material com a romidepsina bruta é empacotado sobre uma matriz preequilibrada em um pH aparente de

menos do que 6,0, de preferência com um pH aparente variando a partir de

4,0 até 6,0. A matriz é em seguida lavada para a remoção das impurezas. Tipicamente, a lavagem da matriz é feita com uma solução mais polar (isto é, uma percentagem maior de água) do que a da eluição da romidepsina. Por exemplo, a matriz pode ser lavada com até de 25 a 50% de acetona a- 30 quosa seguida pela eluição da romidepsina com de 50 até 100% de acetona aquosa. Como poderá ser apreciado por aquelas pessoas versadas na téc- nica, os solventes de lavagem e de eluição são determinados pela matriz usada e a polaridade do composto.

Em determinadas modalidades, uma ou mais das etapas da cromatografia (incluindo a carga, lavagem e eluição da resina) são executa- das em um pH aparente de menos do que 6,0. Em determinadas modalida- 5 des específicas, as etapas da cromatografia são executadas em um pH apa- rente que varia a partir de 3,0 até 6,0. Em outras determinadas modalidades, as etapas da cromatografia são executadas em um pH aparente que varia a partir de 4,0 até 6,0. O pH aparente da solução empacotada sobre a matriz pode ser ajustado para o pH aparente desejado com a adição de um ácido. 10 Qualquer um dos ácidos descritos aqui pode ser usado para o abaixamento do pH aparente da solução. O pH aparente das soluções de lavagem e de eluição também pode ser ajustado para o pH aparente desejado. Em deter- minadas modalidades, o pH aparente de todas as soluções que contenham a romidepsina é mantido abaixo de um pH aparente de aproximadamente 15 6,0, impedindo, por meio disso a formação de adutos indesejáveis. Em de- terminadas modalidades, o pH aparente da solução é tamponado em um pH aparente que varia a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. Em determinadas modalidades, o pH aparente das soluções de acetona e água é ajustado para o pH aparente desejado com a utilização de ácido 20 acético, ácido clorídrico, tampão de acetato de amônia, ou ácido cítrico. Em determinadas modalidades, é usado um sistema de tamponamento de ace- tato.

A romidepsina pode alternativamente ou adicionalmente ser puri- ficada através de cristalização. A purificação por cristalização pode ser usa- 25 da em conjunto com outros métodos de purificação incluindo a cromatografia de coluna e/ou em batelada. Em determinadas modalidades, a cristalização é usada depois da purificação por cromatografia de coluna e/ou em batela- da. Em determinadas modalidades específicas, a cristalização é realizada depois da purificação através de cromatografia de coluna e/ou em batelada, 30 como descrito acima. A cristalização pode ter lugar em qualquer solvente adequado. A romidepsina é, de preferência, minimamente solúvel no solven- te. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é um álcool. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é o metanol. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é o etanol. Em de- terminadas modalidades, é usado um sistema de solventes misto. O solven- te de cristalização pode ser uma mistura de álcool e água. Em outras moda- 5 lidades, o solvente de cristalização é uma mistura de acetona e água. Em determinadas modalidades específicas, a romidepsina é dissolvida em uma solução aquosa de acetona (por exemplo, 85% de acetona) e precipitada através da adição lenta de água. Em determinadas modalidades, a romidep- sina é dissolvida em um solvente (por exemplo, metanol), e a solução resul- 10 tante é concentrada, fazendo com que a romidepsina se cristalize. Em outras modalidades, a romidepsina é dissolvida em uma mistura de água e um sol- vente orgânico (por exemplo, acetona aquosa à 85%), e a romidepsina é precipitada através da adição de água. Os cristais obtidos a partir da etapa de cristalização são tipicamente coletados por filtragem e opcionalmente Ia- 15 vados e secos. Em determinadas modalidades, o pH aparente dos solventes de cristalização é abaixo de 6,0. Em determinadas modalidades específicas, o pH aparente do solvente fica entre 4,0 e 6,0. Qualquer lavagem dos cris- tais resultantes também é executada em um pH aparente reduzido (por e- xemplo, entre um pH aparente de 4,0 e 6,0).

Alternativamente ou adicionalmente, o armazenamento ou o

tempo de retenção da romidepsina durante o processo de cristalização é de menos do que cerca de 20 horas. Em determinadas modalidades, o armaze- namento ou o tempo de retenção é de menos do que 5 horas. Em determi- nadas modalidades específicas, o processo de cristalização é realizado ime- diatamente quando da formação da solução de cristalização.

A invenção proporciona a romidepsina purificada isenta ou subs- tancialmente isenta de adutos indesejáveis. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 98% isenta de adutos contaminantes, pelo me- nos 99% isenta de adutos contaminantes, ou pelo menos 99,5% isenta de 30 adutos. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 98% monomérica, pelo menos 99% monomérica, ou pelo menos 99,5% monomé- rica. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,9% monomérica. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,95% monomérica. Em determinadas modalidades, a romidepsina não inclui romidepsina dimerizada, oligomerizada ou polimerizada que possa ser detectada.

5 Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos

98% pura, pelo menos 99% pura ou pelo menos 99,5% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,7% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,8% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,9% pura. Em determina- 10 das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,95% pura. Em determina- das modalidades específicas, a romidepsina contém menos do que 0,2% de de "outras desconhecidas". Em determinadas modalidades específicas, a romidepsina contém menos do que 0,1% de impurezas denominadas de "ou- tras desconhecidas". Essa romidepsina altamente purificada é útila para a 15 preparação de composições farmacêuticas. Essas composições são especi- ficamente úteis para o tratamento do câncer e de outras doenças proliferati- vas. A composição também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas através da inibição da atividade da desacetilase histona. A com- posição também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas 20 através da inibição da atividade de desacetilase tubulina. A composição também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas através da inibição da atividade de desacetilase. A romidepsina purificada da inven- ção também é útila para as finalidades de pesquisa.

A pureza da romidepsina pode ser avaliada com a utilização de 25 qualquer método conhecido na técnica. Os métodos para a avaliação da pu- reza incluem a aparência, HPLC, rotação específica, espectroscopia RMN, espectroscopia IV, espectroscopia UV visível, análise por difração de raios X sobre pó (XRPD), análise de elementos, espectroscopia de massa LC, e es- pectroscopia de massa. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada 30 através de HPLC, que tem um limite de detecção de impurezas de aproxi- madamente 0,05%. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada a- través de espectroscopia RMN. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de espectroscopia IV. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de espectroscopia de UV visível. Em determina- das modalidades, a pureza é avaliada através de análise por XRPD.

Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de rotação específica em um solvente apropriado. Em determinadas modalida- des, o solvente usado para a rotação específica é o clorofórmio (CHCL3). Em outras modalidades, o solvente usado é um álcool tal como o metanol ou etanol. Em ainda outras modalidades, o solvente usado é a água ou uma solução de água e álcool. Em determinadas modalidades, a rotação especí- fica é verificada com a utilização de um método de compêndio tal como a- quele descrito nas U.S. Pharmacopeia, European Pharmacopeia, JP Phar- macopeia, or British Pharmacopeia. Em determinadas modalidades, a rota- ção específica é executada com a utilização de uma solução de romidepsina em clorofórmio. A concentração da solução pode variar a partir de 5 mg/ml até 30 mg/ml. Em determinadas modalidades, a concentração é de aproxi- madamente 20 mg/ml. A rotação da romidepsina varia a partir de ± 38° até ± 47°. Em determinadas modalidades, a rotação específica varia a partir de ± 39° até ± 41°. Em determinadas modalidades, a rotação específica varia a partir de ± 400° até ± 40,5°. Em determinadas modalidades específicas, a rotação específica é de aproximadamente ± 40°. Foi descoberto que a pre- sença adutos contaminantes resulta em um precipitado quando a romidepsi- na é dissolvida em clorofórmio.

Quando em solução, a romidepsina é armazenada de preferên- cia em um pH aparente abaixo de aproximadamente 6,0. Em determinadas 25 modalidades, o pH aparente varia a partir de aproximadamente 4,0 até apro- ximadamente 6,0. Em determinadas modalidades, uma formulação ou pre- paração de romidepsina é tamponada para impedir que o pH aparente se eleve acima de 7,0, mais preferencialmente acima de 6,0. Em determinadas modalidades, a formulação ou preparação é tamponada para um pH aparen- 30 te variando a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0.

Usos

A romidepsina preparada como descrito aqui pode ser usada in vitro ou in vivo. A romidepsina é especificamente útila para o tratamento de neoplasmas in vivo. No entanto, a combinação também pode ser usada in vitro para finalidades de pesquisa ou clínicas (por exemplo, para a determi- nação da suscetibilidade da doença de um paciente com relação a romidep- 5 sina). Em determinadas modalidades, o neoplasma é um neoplasma benig- no. Em outras modalidades, o neoplasma é um neoplasma maligno. Qual- quer câncer pode ser tratado com a utilização da romidepsina de forma iso- lada ou em combinação com outro agente farmacêutico.

Em determinadas modalidades, a malignidade é uma malignida- de hematológica. As malignidades hematológicas são tipos de cânceres que afetam o sangue, a medula óssea, e/ou os nódulos linfáticos. Os exemplos de malignidades hematológicas que podem ser tratadas com a romidepsina incluem, porém não estão limitados a, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielogênica aguda (AML), leucemia mielogênica crônica (CML), leucemia linfócita crônica (CLL), leucemia de célula de cabelo, Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma não-Hodgkin, Iinfoma de célula T cutânea (CTCL), Iinfoma de célula T periférica (PTCL), mieloma múltiplo e síndrome mielodisplásica. Em determinadas modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento de mieloma múltiplo. Em determinadas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo relapso e/ou refratário. Em outras modalidades, a com- binação da invenção é usada para o tratamento da leucemia linfócita crônica (CLL). Em determinadas modalidades específicas, o câncer é a CLL relapsa e/ou refratária. Em outras modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da leucemia mielogênica crônica (CML). Em determinadas modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da leu- cemia linfoblástica aguda (ALL). Em determinadas modalidades, a combina- ção da invenção é usada para o tratamento da leucemia mielogênica aguda (AML). Em determinadas modalidades, o câncer é o Iinfoma da célula T cu- tânea (CTCL). Em outras modalidades, o câncer é o Iinfoma da célula T peri- férica (PTCL). Em determinadas modalidades, o câncer é uma síndrome mi- elodisplásica.

Outros cânceres além das malignidades hematológicas também podem ser tratados com a utilização da romidepsina. Em determinadas mo- dalidades, o câncer é um tumor sólido. Os cânceres que podem ser tratados, a título de exemplo, com a utilização da terapia de combinação incluem o câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer ósseo, câncer pancreático, cân- 5 cer do estomago, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer do cérebro, câncer do fígado, câncer do ovário, câncer cervical, câncer do útero, câncer do testículo, câncer da próstata, câncer da bexiga urinária, câncer do rim, câncer neuroendócrino, etc. Em determinadas modalidades, a romidepsina é usada para o tratamento do câncer pancreático. Em determinadas modali- 10 dades, a romidepsina é usada para o tratamento do câncer da próstata. Em determinadas modalidades específicas, o câncer da próstata é refratário ao hormônio do câncer da próstata.

No tratamento de neoplasmas tais como o câncer em um sujeito, a romidepsina é tipicamente dosada a 1 a 28 mg/m2. Em determinadas mo- dalidades, Romidepsina é dosada a 1 a 15 mg/m2. Em determinadas moda- lidades, Romidepsina é dosada a 5 a 14 mg/m2. Em determinadas modali- dades específicas, a romidepsina é dosada a 8, 10, 12 ou 14 mg/m2. A romi- depsina é tipicamente administrada em um ciclo de 28 dias com a romidep- sina sendo administrada nos dias 1, 8 e 15. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada nos dias 1 e 15 com o dia 8 sendo pulado. Como será notado por uma pessoa versada na técnica, a dosagem e a sin- cronização da administração de uma dosagem de romidepsina podem variar dependendo do paciente que está sendo tratado. Por exemplo, efeitos cola- terais adversos podem ser considerados para o abaixamento da dosagem da romidepsina administrada.

A romidepsina também pode ser usada para tratar e/ou matar células in vitro. Em determinadas modalidades, uma concentração citotóxica de romidepsina é posta em contato com células com a finalidade de matar as mesmas. Em determinadas modalidades, a concentração da romidepsina 30 varia a partir de 0,01 nM até 100 nM. Em determinadas modalidades, a con- centração da romidepsina varia a partir de 0,1 nM até 50 nM. Em determina- das modalidades, a concentração da romidepsina varia a partir de 1 nM até 10 nM.

Qualquer tipo de célula pode ser testado ou morto com a romi- depsina. As células podem ser derivadas a partir de uma fonte animal, vege- tal, bacteriana ou de fungos. Em determinadas modalidades, as células são células de animais. Em determinadas modalidades as células são células de mamíferos. Em determinadas modalidades, as células são células de seres humanos. As células podem ser derivadas de um ser humano macho ou fê- mea em qualquer estágio de desenvolvimento. Em determinadas modalida- des, as células são células de primatas. Em determinadas modalidades, as células são derivadas a partir de um roedor (por exemplo, camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbo). Em determinadas modalidades, as cé- lulas podem ser derivadas a partir de um animal doméstico tal como um cão, gato, vaca, cabra, porco, etc. As células também podem ser derivadas a par- tir de um animal ou vegetal geneticamente manipulado, tal como um camun- dongo transgênico.

As células usadas podem ser do tipo natural ou células mutan- tes. As células podem ser geneticamente manipuladas. Em determinadas modalidades, as células são células normais. Em determinadas modalida- des, as células são células neoplásicas. Em determinadas modalidades, as 20 células são células de câncer. Em determinadas modalidades, as células são derivadas a partir de uma malignidade hematológica. Em outras modali- dades, as células são derivadas a partir de um tumor sólido. Por exemplo, as células podem ser derivadas a partir de um tumor do paciente (por exemplo, a partir de uma biopsia ou de uma excisão cirúrgica). Esses testes com rela- 25 ção a citotoxidez podem ser úteis para a determinação de se um paciente irá responder a uma terapia de combinação específica. Esse teste pode ser útila na determinação da dosagem necessária para o tratamento da malignidade. Esse teste da susceptibilidade de um câncer de um paciente com relação a romidepsina poderá evitar a administração desnecessária de fármacos sem 30 nenhum efeito para o paciente. O teste também pode permitir o uso de do- ses mais baixas de um ou de ambos os fármacos se o câncer do paciente for especificamente suscetível à romidepsina. Em outras modalidades, as células são derivadas a partir de li- nhas de células de câncer. Em determinadas modalidades, as células são a partir de malignidades hematológicas tais como aquelas discutidas aqui. As linhas de células da leucemia humana incluem U937, HL-60, THP-1, Raji, 5 CCRF-CEM, e Jurkat. As linhas de células CLL, a título de exemplo, incluem JVM-3 e MEC-2. As linhas de células de mieloma, a título de exemplo, inclu- em as MM1.S, MM1.R (resistentes à dexametasona), RPMI8226, NCI-H929, e U266. As linhas de células de linfoma, a título de exemplo, incluem Karpas, SUDH-6, SUDH-16, L428, KMH2, e a linhagem de células de linfoma de 10 manto Granta. Em determinadas modalidades, as células são células AML ou células de mieloma múltiplo (CD138+). Em determinadas modalidades, as células são células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. Por e- xemplo, em determinadas modalidades, as células são células progenitoras hematopoiéticas tais como as células CD34+ da medula óssea. Em determi- 15 nadas modalidades, as linhas de células são resistentes à um agente quimi- oterapêutico específico. Em outras modalidades, a linhagem de células é resistente a esteróides (por exemplo, resistentes à dexametazona). Em de- terminadas modalidades específicas, as células são células de mieloma múl- tiplo humano resistentes à esteróides.

Composições Farmacêuticas

Esta invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem a romidepsina preparada na forma descrita aqui. Em de- terminadas modalidades, as composições exibem atividade citostática ou citotóxica contra células neoplásicas tais como as das malignidades hemato- 25 lógicas. A dosagem de exemplo da romidepsina está descrita acima. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica irá incluir a quanti- dade de romidepsina para uma dose do fármaco. Outras composições far- macêuticas da invenção podem incluir doses múltiplas de romidepsina, tais como o número total de doses necessárias para completar um ciclo de tra- 30 tamento ou um regime total de tratamento. Em determinadas modalidades, a quantidade de romidepsina administrada é suficiente para alcançar níveis citotóxicos (por exemplo, em níveis nanomolares) na corrente sanguínea do sujeito. Em determinadas modalidades, a quantidade administrada é sufici- ente para chegar a concentrações citotóxicas (por exemplo, em níveis na- nomolares) de romidepsina no local do câncer do sujeito.

As preparações farmacêuticas da invenção também podem in- cluir outros agentes farmacêuticos, de tal forma que a romidepsina e o outro agente possam ser administrados em conjunto. Essas preparações incluem quantidades de cada um dos agentes apropriadas para a administração de ambos. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, como por e- xemplo, outro agente citotóxico. Os agentes citotóxicos de exemplo que po- dem ser administrados em combinação com a romidepsina incluem a genci- tabina, decitabina, e flavopiridol. Em outras modalidades, a romidepsina é administrada em combinação com um agente anti-inflamatório, tal como a aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno, etc. ,medicação para alívio da dor, anti- náusea, ou antipirética. Em outras modalidades determinadas, a romidepsi- na é administrada em combinação com um agente esteróide (por exemplo, a dexametasona). Em determinadas modalidades, a romidepsina é adminis- trada em combinação com um agente para o tratamento de distúrbios gas- trointestinais tais como a náusea, vômito e diarréia. Esses agentes adicio- nais podem incluir antieméticos, antidiarréicos, recomposição de fluido, re- composição de eletrólito, etc. Em outras modalidades, a romidepsina é ad- ministrada em combinação com uma recomposição ou suplementação de eletrólitos, tais como o potássio, magnésio e cálcio, especificamente potás- sio e magnésio. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administra- da em combinação com um agente antiarrítmico. Em determinadas modali- dades, a romidepsina é administrada em combinação com um concentrado de plaquetas, por exemplo, um agente que aumente a produção de plaque- tas. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada em com- binação com um agente para aumentar a produção de células do sangue tal como a eritropoietina. Em determinadas modalidades, a romidepsina é ad- ministrada em combinação com um agente para prevenir a hiperglicemia. Em determinadas modalidades, a romidepsina, que possui uma atividade de inibição de HADC1 não é administrada com outro inibidor de HDAC.

Também será observado que a romidepsina pode existir na for- ma livre para o tratamento, ou quando apropriado, como uma forma farma- ceuticamente aceitável da mesma. De acordo com a presente invenção, uma 5 forma farmaceuticamente aceitável inclui, porém não está limitada a, sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, sais de tais ésteres, ou qualquer ou- tro aduto ou derivado que, quando da administração a um pacieníe que este- ja necessitando, seja capaz de prover, diretamente ou indiretamente, a romi- depsina, ou um metabólito ou resíduo da mesma, por exemplo, um profár- 10 maco.

Na forma usada aqui, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles sais que estão, dento do âmbito de um julgamento médico acertado, adequados para ser usados em contato com os tecidos de seres humanos e de animais inferiores sem toxidez indevida, irritação, resposta 15 alérgica e similares, e são comensurados com uma proporção ris- co/benefício razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem- conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge, et ai. descreve os sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhe no J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1 a 19, 1977; incorporado aqui por referência. Os sais podem ser prepa- 20 rados in situ durante o isolamento final e a purificação da romidepsina, ou de modo separado através da reação da funcionalidade de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Os exemplos de sais de adição áci- dos não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, são os sais de um grupo a- mino formado com ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, ácido 25 bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico, ou com ácidos orgânicos tais como o ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tar- tárico, ácido cítrico, ácido succínico, ou ácido malônico ou através da utiliza- ção de outros métodos usados na técnica tais como a troca de íons. Os ou- tros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, 30 ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, buti- rato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicero- fosfato, gluconato, herníssulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2- hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurila, ma- lato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- 5 fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, sucinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato, e similares. Os sais representativos de metal alcalino ou alcalino-terroso inclu- em os sais de sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio, e similares. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, cátions de amô- 10 nio não-tóxico, amônio quaternário e de aminas formadas com a utilização de contra-íons tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquila inferior e sulfonato de arila.

Além disso, na forma usada aqui, o termo "éster farmaceutica- mente aceitável" refere-se a ésteres que de preferência se hidrolisam in vivo 15 e incluem aqueles que se quebram com facilidade no corpo humano para deixar o composto de origem (por exemplo, a romidepsina) ou um sal do mesmo. Os grupos de ésteres adequados incluem, por exemplo, aqueles derivados a partir de ácidos carboxilicos alifáticos farmaceuticamente aceitá- veis, especificamente os ácidos alcanóicos, alquenoicos, cicloalcanóicos e 20 alcanodióicos, nos quais cada porção de alquila ou de alquenila não tenha vantajosamente não mais do que 6 átomos de carbono.

Os exemplos de ésteres específicos incluem os formatos, aceta- tos, propionatos, butiratos, acrilatos e etilsuccinatos. Em determinadas mo- dalidades, os ésteres são clivados por enzimas tais como as esterases.

Além dessa, o termo "profármacos farmaceuticamente aceitá-

veis", na forma usada aqui, refere-se àqueles profármacos da romidepsina, dentro do âmbito do julgamento médico fundamentado, adequados para se- rem usados em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferio- res, sem toxidez indevida, irritação, resposta alérgica e similares, e são co- 30 mensurados com uma proporção risco/benefício razoáveis e eficazes com relação ao uso pretendido para os mesmos, bem como as formas zwitteriô- nicas, quando possível, da romidepsina ou de derivados da mesma. O termo "profármaco" refere-se a compostos que são transformados de forma rápida in vivo para dar o composto de origem, por exemplo, através de hidrólise no sangue. Uma discussão completa está provida em T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Se- 5 ries, e em Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, A- merican Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ambos os quais ficam incorporados aqui por referência.

Como descrito acima, as composições farmacêuticas da presen- te invenção compreendem, além disso, um veículo farmaceuticamente acei- tável, o qual, na forma usada aqui, inclui qualquer e todos os solventes, dilu- entes e outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou de suspensão, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou de emulsificação, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes, e simi- lares, na medida em que adequados para a forma de dosagem específica desejada. O Remington1S Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) descreve os diversos veícu- los usados na formulação de composições farmacêuticas e as técnicas co- nhecidas para a preparação dos mesmos. Exceto no que se qualquer meio de veículo convencional seja incompatível com a romidepsina, tal como atra- vés da produção de qualquer efeito biológico indesejável ou de outra forma interaja de uma maneira deletéria com qualquer um de outros componentes da composição farmacêutica, o uso dos mesmos é contemplado como es- tando dentro do âmbito desta invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados a, açúcares tais como a lactose, glicose e sacarose; a- midos tais como o amido de milho e amido de batata; celulose e derivados tais como carboximetila celulose de sódio, etila celulose e acetato de celulo- se; goma tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; Cremophor; Solutol; exci- pientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos tais como o óleo de amendoim; óleo de sementes de algodão, óleo de açafrão; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais co- mo o prolileno glicol; ésteres tais como o oleato de etila e o Iaurato de etila; ágar; agentes de tamponamento tais como o hidróxido de magnésio e o hi- dróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool de etila, e soluções de tampão de fosfa- to, bem como outros lubrificantes compatíveis não-tóxicos tais como o Iaurila 5 sulfato de sódio e estearato de magnésio; bem como agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adulcorantes, aro- matizantes e de perfume, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

Esses e outros aspectos da presente invenção serão também apreciados quando da consideração dos Exemplos que se seguem, que es- tão destinados a ilustrar determinadas modalidades específicas da invenção porém não pretendem limitar o âmbito da mesma, como definido através das reivindicações.

Exemplos

Exemplo 1 - Purificação da Romidepsina

Purificação da Romidepsina por Resina de Adsorção

O caldo de cultura de Chromobacterium violaceum contendo cerca de 400 g of Romidepsina (cerca de 600 I; ajustado para o pH 2,5 com H2SO4) é extraído, e o caldo da extração é aplicado a uma coluna empaco- 20 tada com Sepabeads SP850, uma resina de adsorção não-iônica. A Romi- depsina (não mais do que 6 g de Romidepsina/resina L) é ligada à resina com uma velocidade de fluxo de não mais do que sv = 6. Depois da lavagem com água de bica (cerca de 3 vezes o volume de resina) e acetona aquosa a 25% (cerca de 5 vezes o volume de resina), a eluição é executada com cer- 25 ca de acetona aquosa a 65% e uma velocidade de fluxo de não mais do que sv = 4.

Purificação da Romidepsina por Cromatografia de HP20SS

O material da eluição é diluído com água para produzir uma so- lução aquosa (cerca de 75% de conteúdo de água). Esta solução é aplicada a uma coluna Díaion HP20SS. Essa resina a de adsorção não-iônica adsor- ve a Romidepsina (cerca de 10 g de Romidepsina/Resina L) em uma veloci- dade de fluxo de não mais do que sv = 5. Depois da lavagem com acetona aquosa a 25% (cerca de 0,5 vez o volume de resina) e acetona aquosa a 40% (cerca de 4 vezes o volume de resina a), eluição é executada com ace- tona aquosa a 47%. O resíduo da eluição é analisado por HPLC de fase re- versa (RP-HPLC). As frações ativas são combinadas em um tanque de re- 5 tenção intermediário.

Substituição do Solvente Aquoso com Solvente não-aquoso com a Resina de Adsorção

O resíduo da eluição obtido a partir da coluna HP20SS é diluído com água para a produção de uma solução aquosa (cerca de 80% de teor 10 de água). Esta solução é aplicada a uma coluna Díaion HP20. Depois da lavagem com acetona aquosa a 20%, a eluição é executada com acetona. O resíduo da eluição é concentrado in vacuo. Depois da adição do acetato de etila do concentrado, o concentrado é ainda mais concentrado in vacuo. Esta etapa é executada repetidamente.

Purificação da Romidepsina com Alumina

O concentrado resultante é dissolvido em acetato de etila (cerca de 6 mg/ml) e aplicado a uma coluna de resina de alumina (cerca de 75 g de Romidepsina/Resina L). A coluna é revelada com acetato de etila (cerca de 2 vezes o volume da alumina) e uma mistura de acetona e acetato de etila 20 (0,5 a 2,0 v/v, cerca de 8 vezes o volume da alumina). Depois da adição da acetona ao concentrado, a solução resultante é ainda mais concentrada. Cristalização 1 (metanol)

O concentrado obtido a partir da etapa anterior é diluído com metanol e concentrado in vacuo para a produção de cristais de Romidepsina bruta. Os cristais precipitados são recolhidos através de filtragem. Cristalização 2 (acetona/água)

Os cristais de Romidepsina bruta são dissolvidos em acetona aquosa a 85% (cerca de 13 l/kg de cristais de Romidepsina bruta), e precipi- tados através da adição lenta de água purificada (cerca de 65 l/kg de cristais 30 de romidepsina bruta) com agitação. Os cristais precipitados são recolhidos através de filtragem e lavados com acetona aquosa a 15% (cerca de 5 l/kg de romidepsina bruta), os cristais molhados são secos sob vácuo á < - 70°C. Equivalentes e Âmbito

Anteriormente exposto foi uma descrição de determinadas mo- dalidades não-limitativas da invenção. Aquelas pessoas versadas na técnica irão reconhecer, ou serão capazes de determinar usando não mais do que a 5 experimentação de rotina, muitos equivalentes com relação às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Aquelas pessoas versadas na técnica irão apreciar que várias mudanças e modificações a esta descrição podem ser feitas sem que se afastem do espírito e do âmbito da presente invenção, na forma em que é definida nas reivindicações em anexo.

Nas reivindicações, os artigos tais como "um", "uma" e

”o(s)/a(s)" significam um ou mais do que um, a não ser que indicado ao con- trário ou evidente de outra forma a partir do contexto. As reivindicações ou as descrições que incluam "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do 15 grupo estejam presentes no, empregados no ou relevantes de outro modo com relação a um determinado produto ou processo, a não ser que indicado ao contrário ou evidente de outra forma a partir do contexto. A invenção in- clui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente no, empregado no, ou relevante de outro modo com relação a um determi- 20 nado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais do que um ou todos os membros do grupo éstão presentes no, empregados no, ou relevantes de outro modo com relação a um determinado produto ou pro- cesso. além disso, deve ser entendido que a invenção engloba todas as va- riações, combinações e permutações, nas quais uma ou mais limitações, 25 elementos, cláusulas, termos descritivos, etc., a partir de uma ou mais das reivindicações ou a partir de porções relevantes da descrição, são introduzi- dos(as) em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para a inclusão de uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que 30 seja dependente da mesma reivindicação base. além disso, quando as rei- vindicações descrevem uma composição, deve ser entendido que os méto- dos para a utilização da composição para qualquer uma das finalidades des- critas aqui e métodos para a fabricação da composição de acordo com qual- quer um dos métodos para a fabricação descritos aqui, ou outros métodos conhecidos na técnica sejam incluídos, a não ser que indicado, ou a não ser que se torne evidente a uma pessoa versada na técnica que uma contradi- 5 ção ou uma inconsistência poderia ser levantada, além disso, a invenção engloba composições feitas de acordo com qualquer um dos métodos para a preparação de composições descritas aqui.

Quando elementos estão presentes como listas, por exemplo, no formiato do grupo Markush, deve ser entendido que cada subgrupo dos ele- mentos também está descrito, e que qualquer elemento(s) pode(m) ser re- movido(s) a partir do grupo. Também é notado que o termo "compreenden- do" está destinado a ser aberto e permite a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Deve ser entendido que, em geral, quando a invenção ou aspec- tos da invenção é/são referidos como compreendendo elementos, caracte- rísticas, etapas, etc., específicos, determinadas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em tais ele- mentos, características etapas, etc. Para finalidades de simplicidade, aque- las modalidades não foram especificamente mostradas in haec verba aqui. Desse modo, para cada uma das modalidades da invenção que compreen- dem um ou mais elementos, características, etapas, etc., a invenção tam- bém proporciona modalidades que consistem ou consistem essencialmente naqueles elementos, características, etapas, etc.

Quando são dadas faixas, os pontos finais estão incluídos, além do mais, deve ser entendido que, a não ser que indicado de outro modo ou 25 evidente de outra forma a partir do contexto e/ou do entendimento de uma pessoa versada na técnica, os valores que estão expressos como faixas po- dem assumir qualquer valor específico dentro das faixas estabelecidas nas diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do limite mais baixo da faixa, a não ser que o contexto indique claramente de outra forma. 30 Também deve ser entendido que, a não ser que indicado de outro modo ou evidente de outra forma a partir do contexto e/ou do entendimento de uma pessoa versada na técnica, os valores que estão expressos como faixas po- dem assumir qualquer uma faixa dentro da faixa determinada, na qual os pontos finais da subfaixa são expressos no mesmo grau de exatidão como o décimo da unidade do limite mais baixo da faixa.

Além disso, deve ser entendido que qualquer modalidade espe- 5 cifica da presente invenção pode ser explicitamente excluída a partir de qualquer uma de uma ou mais das reivindicações. Qualquer modalidade, elemento, característica, aplicação ou aspecto das composições e/ou dos métodos da invenção pode ser excluído de qualquer de uma ou mais reivin- dicações. Com a finalidade de sumarizar, todas modalidades nas quais um 10 ou mais dos elementos, características, finalidades ou aspectos forem exclu- ídos não estão descritas explicitamente aqui.

Claims (50)

1. Método para a preparação da romidepsina, o método compre- endendo a etapa de purificar a romidepsina a partir de uma calda de fermen- tação, em que pelo menos uma porção da etapa de purificação é executada em um pH aparente abaixo de 6,0.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pH apa- rente varia a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pH apa- rente é mantido abaixo de 6,0 através da utilização de um ácido orgânico.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o ácido or- gânico é o ácido acético.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de purificação compreende extração, purificação através de cromatografia em batelada, cromatografia de coluna, recristalização, ou combinações das mesmas.

6. Método para a preparação da romidepsina, o método compre- endendo etapas de: fermentar um micro-organismo que produza a romidepsina; e purificar a romidepsina a partir da calda de fermentação, em que a etapa de purificação é executada em um pH aparente abaixo de 6,0.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a etapa de purificação compreende a etapa de purificação da romidepsina através de cromatografia de coluna.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a etapa de purificação da romidepsina através de cromatografia de coluna é executada em um pH aparente abaixo de 6,0.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a etapa de purificação compreende uma etapa de purificação da romidepsina através de recristalização.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a etapa de purificação da romidepsina através de recristalização é executada em um pH aparente abaixo de 6,0.

11. Método de acordo com as reivindicações 6, 8, ou 10, em que o pH aparente é mantido abaixo de 6,0 com a utilização um ácido orgânico.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o ácido orgânico é o ácido acético.

13. Método para a preparação da romidepsina (FK228), o méto- do compreendendo etapas de: fermentação de um organismo que produza a romidepsina; purificação através de cromatografia de coluna da romidepsina a partir da calda de fermentação; e recristalização da romidepsina em que a etapa de purificação ou de recristalização é executada em um pH aparente de menos do que 6,0.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de fermentação compreende a fermentação de Chromobacterium violaceum.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina com a utilização de uma resina de adsorção não-iônica.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a etapa de purificação é executada em um pH aparente de menos do que 6,0.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a etapa de purificação é executada em um pH aparente que varia a partir de aproxi- madamente 4,0 até aproximadamente 6,0.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina com a utilização da resina Sepabeads SP850.

19. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina com a utilização da resina Díaion HP20SS.

20. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina com a utilização da resina Díaion HP20.

21. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina com a utilização de alumina.

22. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de purificação compreende a purificação da romidepsina através de croma- tografia de coluna com a utilização uma coluna ou batelada de resina Sepa- beads SP850, seguida por uma coluna de resina Díaion HP20SS, seguida por uma coluna de resina Díaion HP20, e seguida por uma coluna de of alu- mina.

23. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de recristalização compreende a recristalização da romidepsina com a utili- zação de metanol.

24. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a etapa de recristalização compreende a recristalização da romidepsina com a utili- zação de acetona aquosa a 85%.

25. Método das reivindicações 13, 16, ou 17, em que o pH apa- rente é mantido abaixo de 6,0 com a utilização um ácido orgânico.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o ácido orgânico é o ácido acético.

27. Composição de romidepsina, em que a romidepsina é substancialmente isenta de romidepsina dimerizada, oligomerizada, ou polimerizada, e em que a romidepsina é preparada através da purificação da romidepsina em pelo menos uma etapa em um pH aparente abaixo de 6,0.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, em que o pH aparente é entre 4,0 e 6,0.

29. Composição de acordo com a reivindicação 27, em que o pH aparente é mantido abaixo de 6,0 com a utilização um ácido orgânico.

30. Composição de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido orgânico é o ácido acético.

31. Composição de romidepsina, em que a romidepsina é prepa- rada através do método como definido na reivindicação 1.

32. Composição compreendendo romidepsina, em que substan- cialmente toda a romidepsina é monomérica.

33. Composição compreendendo romidepsina, em que pelo me- nos 98% da romidepsina é monomérica.

34. Composição de acordo com a reivindicação 33, em que pelo menos 99% da romidepsina é monomérica.

35. Composição de acordo com a reivindicação 33, em que pelo menos 99,5% da romidepsina é monomérica.

36. Composição de acordo com a reivindicação 33, em que pelo menos 99,9% da romidepsina é monomérica.

37. Composição de acordo com a reivindicação 33, em que pelo menos 99,95% da romidepsina é monomérica.

38. Composição compreendendo romidepsina, em que a com- posição é substancialmente isenta de romidepsina dimerizada, oligomeriza- da, ou polimerizada.

39. Composição compreendendo romidepsina, em que a com- posição é romidepsina pelo menos 98% pura.

40. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição é romidepsina pelo menos 99% pura.

41. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição é romidepsina pelo menos 99,5% pura.

42. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição é romidepsina pelo menos 99,8% pura.

43. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição é romidepsina pelo menos 99,9% pura.

44. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição é romidepsina pelo menos 99,95% pura.

45. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição contém menos do que ou igual a 1,0% de impurezas totais e menos do que ou igual a 0,2% de impurezas individuais.

46. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que a composição contém menos do que ou igual a 0,5% de impurezas totais e menos do que ou igual a 0,1% de impurezas individuais.

47. Composição de acordo com a reivindicação 39, em que uma solução da composição em clordeórmio não produz um precipitado em uma concentração de aproximadamente 20 mg/ml.

48. A composição de acordo com as reivindicações 31, 32, 33,38, ou 39, em que uma solução da composição em clordeórmio em uma concentração de aproximadamente 20 mg/ml tem uma rotação ótica varian- do a partir de +38° até +47°.

49. Composição de acordo com a reivindicação 48, em que a rotação ótica varia a partir de +39° to +41°.

50. Composição de acordo com a reivindicação 48, em que a rotação ótica é de aproximadamente +40°.