BRPI0716960B1 - uso de uma xilanase, composição, e, método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal - Google Patents

Abstract

USO DE UMA XILANASE, COMPOSIÇÃO, E, MÉTODO PARA MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL. A presente invenção se refere ao uso em uma ração animal de uma xilanase com uma porcentagem de identidade em relação a uma xilanase de Paenibacillus com a sequência de aminoácidos 1-184 de SEQ ID NO: 4 de oelo menos 82,7%, assim como aos aditivos de ração e composições de ração compreendendo tal xilanase. Essas xilanases são significativamente melhores do que as xilanases de ração animal conhecidas para solubilizar e também para degradar polissacarídeos de fibras insolúveis (polissacarídeos que não são amido, abreviadamente NSP), tais como polissacarídeos de arabinoxilano.

Description

Referência à Listagem de Sequências

[0001] Esse pedido contém uma Listagem de Sequências em uma forma legível por computador. A forma legível por computador é aqui incorporada por referência.

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

[0002] Essa invenção se refere ao campo da ração animal.

[0003] Grãos de cereais são componentes importantes da ração animal. Eles contêm, i.a., polissacarídeos vegetais os quais podem funcionar como um componente nutricional principal na dieta (por exemplo, amido), porém também uma variedade de polissacarídeos diferentes de amido (NSP) incluindo, dentre outros, arabinoxilanos. Os principais animais de fazenda tais como aves domésticas e porcos, não têm as enzimas relevantes nos seus tratos digestivos para digerir os NSP. É conhecido a partir da técnica o uso de xilanases em ração animal para melhorar a utilização da ração.

[0004] A presente invenção se refere ao uso em ração animal de uma xilanase com uma porcentagem de identidade em relação a uma xilanase de Paenibacillus (aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4) de pelo menos 82,7%.

Descrição da Técnica Relacionada

[0005] WO 2006/083240 revela, no Exemplo 6, o uso em ração de galinha de uma xilanase nomeada XylA1A. A sequência de aminoácidos XylA1A corresponde à SEQ ID NO: 2 em WO 2006/083240, a qual é idêntica à parte madura de UNIPROT:Q6TLP3, a qual está incluída na presente listagem de sequência como SEQ ID NO: 9. De acordo com a entrada do banco de dados UNIPROT, essa sequência deriva de uma bactéria isolada a partir de uma amostra ambiental. A identidade porcentual da xilanase da SEQ ID NO: 9 em relação aos aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4 está abaixo de 82,7%.

[0006] A xilanase RONOZYME WX é uma xilanase de ração animal de um único componente conhecida a partir de Thermomyces lanuginosus e comercialmente disponível de DSM Nutritional Products, DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576, CH-4303 Kaiseraugst, Suíça. Essa xilanase e seu uso em ração animal também são descritos em WO 96/23062. Essa xilanase não tem um peso molecular menor do que 24 KDa.

[0007] Uma xilanase de Paenibacillus pabuli com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2 aqui, e seu uso em um processo para preparar um produto baseado em massa de farinha, estão descritos na WO 2005/079585.

[0008] A sequência de aminoácidos de uma xilanase de Paenibacillus sp. KCTC 8848P foi submetida ao banco de dados Uniprot público com No. de acesso UNIPROT:Q9F9B9, e está incluída na presente listagem de sequências como SEQ ID NO: 4.

[0009] WO 97/13853 revela (SEQ ID NO: 6) uma xilanase de Aspergillus niger a qual é idêntica, exceto por um aminoácido à sequência de aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO: 6 aqui (“xyl II” de Aspergillus niger).

[0010] WO 2004/018662 revela (conforme a SEQ ID NO: 9 em WO 2004/018662) outra xilanase de Aspergillus niger a qual é idêntica à SEQ ID NO: 8 aqui (“xyl III” de Aspergillus niger).

[0011] Chesson et al, em J. Sci. Food Agric. 1997, 75, 289-295, reporta estudos de porosidade de parede celular e área superficial disponível de palha de trigo e frações de grãos de trigo.

[0012] É um objeto da presente invenção melhorar a solubilização e/ou degradação de polissacarídeos diferentes de amido insolúveis (NSP), tais como arabinoxilanos tendo em vista a melhoria do valor nutricional da ração animal, por exemplo, melhorando a proporção de conversão de ração (FCR), a taxa de crescimento e/ou o ganho de peso.

Sumário da Invenção

[0013] A presente invenção se refere ao uso em ração animal de uma xilanase com uma porcentagem de identidade em relação aos aminoácidos 1184 da SEQ ID NO: 4 de pelo menos 82,7%, a porcentagem de identidade sendo determinada por: i) alinhamento das duas sequências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contagem da quantidade de emparelhamentos exatos no alinhamento; iii) divisão da quantidade de emparelhamentos exatos pelo comprimento da mais curta das duas sequências de aminoácidos, e iv) conversão do resultado da divisão de iii) em porcentagem.

[0014] A invenção também se refere ao uso de tal xilanase na preparação de uma composição para uso em ração animal.

[0015] A invenção ainda se refere a uma composição compreendendo tal xilanase e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura; (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou (c) pelo menos um mineral traço.

[0016] Ainda adicionalmente, a invenção se refere a uma composição de ração animal com um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/Kg e compreendendo tal xilanase, assim como um método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, em que tal xilanase é adicionada à ração.

[0017] Finalmente, a invenção se refere ao uso de tal xilanase para a solubilização e/ou degradação de polissacarídeos diferentes de amido durante a digestão gástrica e intestinal; e para o pré-tratamento de ração animal ou de componentes de ração animal.

Descrição Detalhada da Invenção

[0018] A seguir, a expressão “xilanase da invenção” se refere a uma xilanase para uso de acordo com a invenção, conforme descrito aqui.

[0019] Classes EC de Enzimas - Famílias Bernard Henrissat Glicosídeo Hidrolase

[0020] As enzimas podem ser classificadas com base no handbook Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), ver também o sítio ENZYME na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informações relacionadas com a nomenclatura de enzimas. Ele é primeiramente baseado nas recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUB-MB) e ele descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número EC (Comissão de Enzima) tenha sido fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305). Essa nomenclatura IUB-MB Enzyme é baseada na sua especificidade de substrato e ocasionalmente nos seus mecanismos moleculares; tal classificação não reflete as características estruturais dessas enzimas.

[0021] Outra classificação de certas enzimas glicosídeo hidrolase, tal como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase e alfa- galactosidase, em famílias baseadas nas similaridades das sequências de aminoácidos, foi proposta alguns anos atrás. Elas atualmente caem em 90 famílias diferentes: Ver o sítio da internet CAZy(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) servidor Carbohydrate-Active Enzymes em: http://afmb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html (documentos correspondentes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. Em "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H. J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat e B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. Em "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tóquio, pp. 15-23). Xilanase

[0022] Para os presentes propósitos, uma xilanase significa uma proteína, ou um polipeptídeo, com atividade xilanase.

[0023] A atividade da xilanase pode ser medida usando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregado, que incluam endoligações 1,4-beta-D- xilosídicas nos xilanos. O pH de ensaio e a temperatura de ensaio devem ser adaptados à xilanase em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas de ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50 ,55, 60, 65, 70 ou 80 °C.

[0024] Diferentes tipos de substratos estão disponíveis para a determinação da atividade xilanase, por exemplo, tabletes de arabinoxilano reticulado Xylazyme (da MegaZyme) ou dispersões de pós insolúveis e soluções de arabinoxilano coradas com azo.

[0025] Para analisar xilanase em rações, pré-misturas e amostras semelhantes, a enzima é extraída em temperaturas variando de 50 °C até 70 °C (com as maiores temperaturas usadas para as enzimas mais termoestáveis) em um meio de extração consistindo tipicamente de um tampão fosfato (0,1 M e pH ajustado até o pH ótimo da enzima em questão) por um período de tempo de 30 a 60 min. Um ensaio de xilanase preferido é revelado no Exemplo 4.

[0026] Todas as medições estão baseadas nos princípios de determinação espectrofotométrica em aproximadamente 590-600 nm. A enzima, ou a enzima extraída, conforme aplicável, é incubada com uma quantidade conhecida de substrato e a liberação de cor é medida em relação a uma curva padrão obtida pela adição de quantidades conhecidas de um padrão enzimático a uma dieta de controle similar sem enzima. Quando nenhuma ração de controle está disponível, uma quantidade conhecida de enzima é adicionada à amostra (reforço) e a partir das diferenças na resposta entre a amostra reforçada e não-reforçada a quantidade adicionada de enzima pode ser calculada.

[0027] Em uma modalidade particular, a xilanase é uma enzima classificada como EC 3.2.1.8 (ver o sítio ENZYME referido acima). O nome oficial é endo-1,4-betaxilanase. O nome sistemático é 1,4-beta-D- xilanoidrolase. Outros nomes podem ser usados, tais como endo-(1-4)- betaxilanase; *1-4)-betaxilanoidrolase; endo-1,4-xilanase; xilanase; beta-1,4- xilanase; endo-1,4-xilanase; endo-beta-1,4-xilanase; endo-1,4-beta-D- xilanase; 1,4-beta-xilanxilanoidrolase; beta-xilanase; beta-1,4- xilanxilanoidrolase; endo-1,4-betaxilanase; beta-D-xilanase. A reação catalisada é a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas nos xilanos.

[0028] De acordo com o sítio CAZy(ModO) referido acima, as xilanases são atualmente classificadas em alguma das seguintes famílias de glicosídeo hidrolases: 5, 8, 10, 11, 16, 43 ou 62. Por exemplo, a família GH 11 das glicosídeo hidrolases pode ser caracterizada como a seguir: Família CAZy: Família glicosídeo hidrolase 11 Atividades conhecidas: Xilanase (EC 3.2.1.8) Mecanismo: Retenção Nucleófilo/base catalítica: Glu (experimental) Doador de próton catalítico: Glu (experimental) Status de estrutura 3D: disponível (ver PDB). Dobra: beta-jelly roll Família: GH-C

[0029] Em modalidades particulares, a xilanase da invenção é i) uma xilanase da família da glicosídeo hidrolase (GH) 5, 8, 10, 11, 16, 43 ou 62, preferivelmente da família GH 10 ou 11, mais preferivelmente da família GH 11. A expressão “da família glicosídeo hidrolase NN” significa que a xilanase em questão é ou pode ser classificada na família GH “NN” (por exemplo, 10 ou 11).

[0030] Em outra modalidade particular, a xilanase da invenção é derivada de uma xilanase bacteriana, preferivelmente de uma bactéria (i) do filo das Firmicutes; (ii) a classe de bacilos; (iii) a ordem Bacillales; (iv) a família Paenibacillaceae; ou (v) o gênero de Paenibacillus; ainda mais preferivelmente de uma bactéria (iv) da espécie de Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa, ou Paenibacillus sp.; mais preferivelmente (vii) cepas de Paenibacillus pabuli ou Paenibacillus polymyxa.

[0031] A expressão “xilanase derivada de uma xilanase bacteriana (ou Firmicutes, ..., ou Paenibacillus pabuli)”, conforme aqui utilizado acima, inclui qualquer xilanase do tipo selvagem isolada das bactérias em questão, assim como variantes ou fragmentos seus os quais retenham a atividade da xilanase.

[0032] O termo “variante” se refere a uma xilanase a qual compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em comparação com a xilanase especificada. A variante pode ser uma variante natural (variante alélica) ou preparada sinteticamente. Preferivelmente, alterações de aminoácidos são de uma natureza menor, por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas que não afetem significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas anulações; pequenas extensões amino ou carboxiterminal, tal como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante; ou uma pequena extensão que facilita a purificação pela alteração da carga líquida ou outra função, tal como uma região de poliistidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0033] Um “fragmento” de uma xilanase especificada tem um ou mais aminoácidos anulados dos terminais amino e caboxil da sequência de aminoácidos da xilanase.

[0034] Para os propósitos das definições acima de variante e fragmento, o termo “pequeno”, assim como o termo “um ou mais” se referem a um máximo de 30 alterações em comparação com a xilanase especificada. Em modalidades preferidas de qualquer uma dessas definições, a quantidade de alterações está abaixo de 30, 25, 20, 15, 10 ou abaixo de 5.

[0035] Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As trocas de ocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, assim como essas ao contrário.

[0036] Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não- padronizados (tal como hidroxiprolina, 6-N-metil-lisina, ácido 2- aminoisobutírico, isovalina e alfa-metilserina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo do tipo selvagem. Uma quantidade limitada de aminoácidos não-conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não-naturais pode ser substituída pelos resíduos de aminoácidos. “aminoácidos não-naturais” foram modificados depois da síntese proteica, e/ou têm uma estrutura química na(s) sua(s) cadeia(s) lateral/laterais diferentes daquela dos aminoácidos padrões. Aminoácidos não-naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente são comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidinocarboxílico, deidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3- dimetilprolina.

[0037] Alternativamente, as alterações de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, alterações de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, alterar o pH ótimo e assim por diante.

[0038] Aminoácidos essenciais podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações individuais de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica (isto é, atividade da xilanase) para identificar resíduos de aminoácidos que sejam críticos para a atividade da molécula. Ver também Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica pode também ser determinado por análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação de fotoafinidade, juntamente com modificação dos aminoácidos do sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir da análise das identidades com os polipeptídeos os quais são relacionados com um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[0039] Substituições de aminoácidos individuais ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou mistura, seguido por um procedimento de varredura relevante, tais como aqueles descritos por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 - 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso a erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991 , Biochem. 30: 10832-10837; Patente Americana No. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada a região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

[0040] Métodos de mutagênese/mistura podem ser combinados com métodos de varredura automatizados de alto rendimento para detectar a atividade de polipeptídeos clonados e modificados expressos pelas células hospedeiras. Moléculas de DNA modificadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente seqüenciadas usando métodos padrões na técnica. Esses métodos permitem a rápida determinação da importância dos resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados aos polipeptídeos de estrutura desconhecida.

[0041] Numa outra modalidade particular, a xilanase da invenção é derivada de uma xilanase fúngica. A definição acima de “derivada de” (no contexto das xilanases bacterianas) é também aplicável por analogia às xilanases fúngicas. As xilanases fúngicas incluem xilanases de fungos filamentosos e de levedura. Em modalidades preferidas, a xilanase é derivada de um fungo (i) do filo de Ascomycota; (ii) da classe Pezizomycotina; (iii) da ordem Eurotiomycetes; (iv) da sub-ordem Eurotiales; (v) da família Trichocomaceae, preferivelmente Trichocomaceae mitospórica; ainda mais preferivelmente de um fungo (vi) do gênero Aspergillus; mais preferivelmente (vii) das cepas de Aspergillus niger. Será entendido que a definição das espécies anteriormente mencionadas inclui tanto os estados perfeito quanto imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente dos nomes das espécies pelos quais eles são conhecidos. As pessoas versadas na técnica irão prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.

[0042] Cepas das bactérias e fungos acima mencionados são prontamente acessíveis ao público em uma variedade de coleções de culturas, tais como na American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0043] Questão relacionadas com a taxonomia podem ser solucionadas através da consulta de um banco de dados taxonômico, tal como o Pesquisador de Taxonomia NCBI, o qual está disponível no seguinte sítio da internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/. Entretanto, é tida preferivelmente referência aos seguintes handbooks: Dictionary of the Fungi, 9" edição, editado por Kirk, P.M., P. F. Cannon, J. C. David & J.A. Stalpers, CAB Publishing, 2001; e Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Segunda Edição (2005).

[0044] O termo “um”, conforme aqui usado em qualquer contexto, significa “um ou mais”, preferivelmente “pelo menos um”. Este é o caso, por exemplo, para o uso na reivindicação 1 de “uma” xilanase conforme especificada, a qual é considerada equivalente à reivindicação do uso de “pelo menos um” ou “um ou mais” tais xilanases.

[0045] O termo um polipeptídeo “maduro” ou sequência de aminoácidos madura se refere àquela parte de uma sequência de aminoácidos a qual permanece após uma parte do peptídeo sinal potencial e uma parte do propeptídeo potencial serem removidos por clivagem. Alguma variação pode ser observada nas partes maduras das enzimas, dependendo i.a. dos hospedeiros de expressão e das condições de fermentação. Por exemplo, a experiência demonstra que algumas vezes mutilações C-terminais menores ocorrem durante o processo de secreção. O termo parte madura, conforme aqui utilizado, também leva em consideração tais mutilações C-terminais, se houver alguma. Enquanto a parte do peptídeo maduro pode ser identificada por programas de computador conhecidos na técnica (por exemplo, SignalP 3.0, ver J. D. Bendtsen et al, J. Mol. Biol., 340: 783- 795, 2004), preferivelmente ela é identificada pela determinação do N-terminal, e preferivelmente também do C-terminal da enzima xilanase expressa e secretada, caso seja relevante. Por exemplo, de acordo com nossas observações, a parte madura da xilanase da SEQ ID NO: 2 é composta pelos seus aminoácidos 1 - 182, e a parte madura da xilanase da SEQ ID NO: 4 é composta pelos seus aminoácidos 1 - 184.

[0046] Em uma modalidade particular a xilanase da invenção é isolada, isto é, essencialmente livre de outros polipeptídeos de atividade enzimática, por exemplo, pelo menos 20% pura, preferivelmente pelo menos cerca de 40% pura, mais preferivelmente cerca de 60% pura, ainda mais preferivelmente cerca de 80% pura, mais preferivelmente cerca de 90% pura, e ainda mais preferivelmente cerca de 95% pura, conforme determinado por SDS-PAGE. Conforme é geralmente conhecido na técnica, para propósitos de detecção o SDS-gel pode ser marcado com Coomassie ou manchamento com prata. Deve ser assegurado que a sobrecarga não tenha ocorrido, por exemplo, verificando-se a linearidade através da aplicação de várias concentrações em diferentes raias do gel. Tais preparações polipeptídicas são, particularmente, obteníveis usando métodos recombinantes de produção, enquanto que elas não são tão facilmente obtidas e também sujeitas a uma variação lote-a-lote muito superior quando o polipeptídeo é produzido por métodos de fermentação tradicionais.

[0047] Os polipeptídeos compreendidos na composição da invenção também são preferivelmente purificados. O termo purificado se refere a uma preparação enriquecida com proteína, na qual uma quantidade substancial de componentes de baixo peso molecular, nutrientes residuais típicos e minerais se originando da fermentação tenha sido removida. Tal purificação pode, por exemplo, ser por métodos cromatográficos convencionais, tais como cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão por tamanho (ver, por exemplo, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. Editores: Jan-Christer Janson, Lars Ryden, VCH Publishers, 1989). O Exemplo 2 da WO 2005/079585 descreve um procedimento adequado para a purificação da xilanase de Paenibacillus pabuli, expressa de Bacillus subtilis.

[0048] O uso de um polipeptídeo isolado e/ou purificado de acordo com a invenção é vantajoso. Por exemplo, é muito mais fácil dosar enzimas corretamente que sejam essencialmente livres de interferentes ou contaminando outras enzimas. Os termos dosar corretamente se referem particularmente ao objetivo de obter resultados de rações animais consistentes e constantes, e à capacidade de otimização da dosagem baseada no efeito desejado. Identidade

[0049] A relação entre duas sequências de aminoácidos é descrita pelo parâmetro “identidade”.

[0050] A presente invenção se refere ao uso em ração animal de uma xilanase com uma porcentagem de identidade em relação aos aminoácidos 1184 da SEQ ID NO: 4 de pelo menos 82,7%.

[0051] Em modalidades particulares, o grau de identidade é de pelo menos 85%, 90%, 95%, 97% ou pelo menos 99%. Em modalidades adicionais, o grau de identidade é de pelo menos 82,8%, 82,9%, 83,0%, 83,2%, 83,4%, 83,6%, 83,8%, 84,0%, 84,5%, 85,0% ou de pelo menos 85,5%. Ainda em outras modalidades, o grau de identidade é de pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96% ou de pelo menos 98%.

[0052] A invenção, em particular, se refere ao uso em ração animal de uma xilanase com uma porcentagem de identidade em relação aos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, e/ou uma porcentagem de identidade em relação aos aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4 de pelo menos 86%.

[0053] Ainda em outras modalidades particulares, a xilanase da invenção compreende (preferivelmente tem, ou consiste de) uma parte madura de qualquer uma das xilanases da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 8; ou uma variante ou fragmento seu que tenha atividade xilanase.

[0054] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado com base em um alinhamento das duas sequências de aminoácidos feitas pelo uso do programa Needle do pacote EMBOSS (HTTP://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito por Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443- 453. A matriz de substituição usada é a BLOSUM62, penalidade de abertura de intervalo sendo de 10, e penalidade de extensão de intervalo sendo de 0,5.

[0055] O grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção (“sequência da invenção”; por exemplo, aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4 e uma sequência de aminoácidos diferente (“sequência estranha”) é calculado como a quantidade de emparelhamentos exatos em um alinhamento das duas sequências, dividido pelo comprimento da “sequência da invenção” ou pelo comprimento da “sequência estranha”, a que for menor. O resultado é expresso em identidade porcentual.

[0056] Um emparelhamento exato ocorre quando a “sequência da invenção” e a “sequência estranha” têm resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo, isto é representado por “|”). O comprimento de uma sequência é a quantidade de resíduos de aminoácidos na sequência (por exemplo, o comprimento dos aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4 é de 184).

[0057] No alinhamento puramente hipotético abaixo, a sobreposição é a sequência de aminoácidos "HTWGER-NL" da Sequência 1; ou a sequência de aminoácidos "HGWGEDANL" da Sequência 2. No exemplo, um intervalo é indicado por um “-“. Exemplo de alinhamento hipotético: Sequencial: ACMSHTWGER-NL 12 Illi II Sequência 2 : HGWGEDANLAMNPS 14

[0058] Nesse exemplo hipotético, a quantidade de emparelhamentos exatos é 6. O comprimento da sequência mais curta é 12. Concordantemente, o grau de identidade da Sequência 1 em relação à Sequência 2 é de 50%.

[0059] Em uma modalidade particular, a porcentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo com, ou para os aminoácidos 1 a 184 da SEQ ID NO: 4 é determinada i) pelo alinhamento das duas sequências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, com uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e com uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) pela contagem da quantidade de emparelhamentos exatos no alinhamento; iii) pela divisão da quantidade de emparelhamentos exatos pelo comprimento da mais curta das duas sequências de aminoácidos, e iv) pela conversão do resultado da divisão de iii) em porcentagem. A porcentagem de identidade para ou com outras sequências da invenção, tais como os aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2 é calculada de forma análoga. Ração Animal

[0060] A presente invenção também é direcionada aos métodos para usar a xilanase da invenção em ração animal, assim como as composições de ração e aditivos de ração compreendendo eles.

[0061] O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Exemplos de animais são os não-ruminantes e os ruminantes. Animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras e gado, por exemplo, vacas tais como gado de corte e vacas leiteiras. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não-ruminante. Animais não- ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, porém sem se limitar, aos leitões, porcos em crescimento e porcas). aves, tais como perus, patos e galinhas (incluindo, porém sem se limitar, a galinhas para assar e assentadoras); peixe (incluindo, porém sem se imitar, a salmão, truta, tilápia, lampreia e carpa); e crustáceos (incluindo, porém sem se limitar, a camarão e pitus).

[0062] Em modalidades particulares, a xilanase da invenção é para ser usada em ração para (i) animais não-ruminantes; preferivelmente (ii) animais monogástricos; mais preferivelmente (iii) porcos, aves, peixes e crustáceos; ou, mais preferivelmente, (iv) porcos e aves.

[0063] A xilanase da invenção pode ser alimentada ao animal antes, depois ou simultaneamente com a dieta. A última é preferida.

[0064] O termo ração, composição de ração ou dieta significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição adequada para ou tencionada para ser ingerida pelo animal. Maiores informações acerca das composições de ração são encontradas abaixo.

[0065] Grãos de cereais são importantes componentes de ração animal. Grãos de cereais contêm polissacarídeos vegetais, alguns dos quais, por exemplo, amido, podem funcionar como um componente nutricional principal da dieta. Porém certos cereais também contêm vários tipos de polissacarídeos diferentes do amido (NSP), os quais não podem ser utilizados por animais não-ruminantes, tais como aves e porcos.

[0066] Exemplos de NSP são xilanos, arabinoxilanos, beta-glicanos e celulose. O tipo e quantidade de NSP varia de cereal para cereal. Os seguintes são exemplos de teor de NSP aproximado (% em p/p, matéria seca) de vários grãos de cereais: Arroz perolizado 1%, sorgo 5%, milho 8%, trigo 11%, centeio 13%, triticale 16% e cevada 17%. Para o trigo, triticale e milho, arabinoxilanos compõem mais de 50% de NSP, enquanto que da cevada, sorgo, centeio e arroz, os arabinoxilanos compõem aproximadamente de 25 a 45% de NSP, isto é, ainda uma quantidade substancial.

[0067] Para arabinoxilanos e beta-glicanos, é feita uma distinção entre polissacarídeos solúveis e insolúveis. Os termos solúvel e insolúvel são conhecidos na técnica e se referem á solubilidade/insolubilidade em água, particularmente à forma (solúvel/insolúvel) desses polissacarídeos a) sob condições digestivas, b) sob condições intestinais (no intestino delgado), ou preferivelmente c) depois de um procedimento in vitro conforme esboçado no Exemplo 1 (isto é, 1,5 hora em pH 3,0 e 40 °c na presença de pepsina, e 4,5 horas em pH 6,8 e 40 °C na presença de pancreatina).

[0068] Arabinoxilanos insolúveis estão associados com o encapsulamento dos nutrientes, tais como amido e proteína. Esse encapsulamento permite que nutrientes valiosos ignorem a digestão. Quando arabinoxilanos também são digeridos, ou solubilizados, isto resulta em uma exposição aumentada dos nutrientes.

[0069] Em uma modalidade particular, a xilanase da invenção é capaz de solubilizar polissacarídeos de fibras insolúveis, tal como NSP. Concordantemente, a invenção se refere ao uso de uma xilanase da invenção para a solubilização de polissacarídeos diferentes do amido (de outro modo insolúveis) durante a digestão gástrica e intestinal. Polissacarídeos diferentes do amido preferidos são arabinoxilanos (polissacarídeos de arabinoxilano).

[0070] O termo polissacarídeo é conhecido na técnica para designar sacarídeos com 10 ou mais monossacarídeos (ver, por exemplo, Food Chemistry, 3a edição, Springer Verlag, ISBN 3-540- 40817-7, Belitz, Grosch, Schieberle (editores), seção 4.3.1 na p. 294), em outras palavras, com um grau de polimerização (DP) de pelo menos 10.

[0071] Polissacarídeos com um DP de pelo menos 10 podem ser distinguidos dos oligossacarídeos com um DP menor do que 10, conforme é conhecido na técnica, por exemplo, por filtração em gel em Biogel P-2 nos sobrenadantes obtidos depois de precipitação com etanol 80% (ver “The Uppsala method for rapid analysis of total dietary fiber" de Theander et al, particularmente na Fig. 2 na p. 277 em New Developments in Dietary Fiber, Furda and Brine (editores), Plenum Press, 1990, p. 273-281).

[0072] Particularmente, a xilanase da invenção é capaz de reduzir a quantidade de xilanos e arabinoxilanos insolúveis em um modelo in vitro mimetizando os passos de digestão gástrico e do intestino delgado na digestão monogástrica - conforme descrito nos Exemplos 1, 2 e 5 aqui. Preferivelmente, a quantidade de arabinoxilanos insolúveis residuais (isto é, após a indução com xilanase) não é maior do que 85% (p/p), mais preferivelmente não maior do que 84, 83, 82, 81 , 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 , ou 70% 9p/p) em relação a um controle sem enzima xilanase adicionada (100%). Isso corresponde a uma redução da quantidade de arabinoxilanos insolúveis de pelo menos 15%, preferivelmente de pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou pelo menos 30% 9p/p)em relação a um controle sem a enzima xilanase adicionada (0%).

[0073] Ainda em outras modalidades particulares, as condições do modelo in vitro são: (i) substrato (dieta): 0,35 g de trigo, 0,21 g de cevada, 0,13 g de farinha de soja e 0,11 g de farelo de trigo, fornecido como uma dieta pré-misturada, moída para passar por uma malha de 0,5 mm; (ii) um passo gástrico de incubação, no qual a dieta é incubada com 0,1 mL de xilanase a ser testada juntamente com 4,1 mL de HCl 0,072 M por 1,5 hora e com 0,5 mL de HCl 0,072 M/pepsina (Sigma P-7000; 3000 U/g de dieta) por 1 hora (isto é, 30 min. de pré-mistura de HCl-substrato) em pH 3,0 e 40 °C; (iii) um passo de incubação intestinal subsequente com 0,9 mL de NaOH 0,215 M mais 0,4 mL de NaHCO3 1 M e 8 mg de pancreatina/g de dieta por 4 horas (Sigma P-7545) em pH 6,8-7,0 e 40 °C; seguido pela (iv) determinação da quantidade de arabinoxilano insolúvel residual, por exemplo, usando o método Uppsala, conforme descrito no Exemplo 1 e 5.

[0074] A invenção também se refere ao uso de uma xilanase da invenção para a degradação de polissacarídeos diferentes de amido durante a digestão gástrica e intestinal. Polissacarídeos diferentes do amido preferidos são polissacarídeos fibrosos, particularmente arabinoxilanos (polissacarídeos de arabinoxilano).

[0075] Particularmente, a xilanase da invenção é capaz de degradar polissacarídeos de xilano e arabinoxilano em um modelo in vitro mimetizando os passos de digestão gástrico e do intestino delgado na digestão monogástrica - conforme descrito ali no Exemplo 5. Preferivelmente, a quantidade de arabinoxilanos residual (Isto é, após a incubação com xilanase) não é maior do que 94% (p/p), mais preferivelmente não maior do que 93, 92, 91 , 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 ou 80% (p/p) em relação a um controle sem enzima xilanase adicionada (100%).

[0076] Ainda em outras modalidades particulares, as condições do modelo in vitro são: (i) substrato (dieta): 0,35 g de trigo, 0,21 g de cevada, 0,13 g de farinha de soja e 0,11 g de farelo de trigo, fornecido como uma dieta pré-misturada, moída para passar por uma malha de 0,5 mm; (ii) um passo gástrico de incubação, no qual a dieta é incubada com 0,1 mL de xilanase a ser testada juntamente com 4,1 mL de HCl 0,072 M por 1,5 hora e com 0,5 mL de HCl 0,072 M/pepsina (Sigma P-7000; 3000 U/g de dieta) por 1 hora (isto é, 30 min. de pré-mistura de HCl-substrato) em pH 3,0 e 40 °C; (iii) um passo de incubação intestinal subsequente com 0,9 mL de NaOH 0,215 M mais 0,4 mL de NaHCO3 1 M e 8 mg de pancreatina/g de dieta por 4 horas (Sigma P-7545) em pH 6,8-7,0 e 40 °C; seguido pela (iv) determinação da quantidade de arabinoxilano total residual, por exemplo, usando o método Uppsala, conforme descrito no Exemplo 1 e 5.

[0077] A dosagem da xilanase da invenção pode ser otimizada usando métodos simples de tentativa e erro conforme é conhecido na técnica. Diferentes xilanases podem ter diferentes faixas de dosagem ótimas. Exemplos de faixas de dosagem adequadas são: 0,1 - 500 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de dieta (substrato); preferivelmente 0,2-400, 0,3-300, 0,4-200 ou 0,5-100 mg de EP/Kg de dieta. Outras faixas de dosagem preferidas são 0,6-90, 0,7-80, 0,7-70, 1-70, 2-70, 3-70, 4-70, 5-70, 6- 70, ou 7-70 - todas em mg EP/Kg de dieta. Ainda outras dosagens enzimáticas preferidas são de 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-90, 10-80 ou 10-70 - todas em mg EP/Kg de dieta. A quantidade da proteína da enzima xilanase (EP) pode ser determinada conforme descrito no Exemplo 1.

[0078] Para determinar a proteína da enzima xilanase por Kg de ração, a xilanase é purificada a partir da composição de ração, e a atividade específica da xilanase purificada é determinada usando um ensaio relevante. A atividade da xilanase da composição de ração como tal também é determinada usando o mesmo ensaio, e com base nessas duas determinações, a dosagem em mg de proteína da enzima xilanase por Kg de ração é calculada.

[0079] Os mesmos princípios se aplicam para a determinação da quantidade em MG da proteína da enzima xilanase nos aditivos de ração. É claro que se uma amostra estiver disponível da xilanase usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partir dessa amostra (sem necessidade de purificar a xilanase da composição de ração ou do aditivo).

[0080] O termo melhorar o valor nutricional de uma ração animal significa melhorar a disponibilidade de nutrientes, por meio do que a taxa de crescimento, ganho de peso e/ou conversão de ração (isto é, o peso de ração ingerida em relação ao ganho de peso) do animal é/são melhorados.

[0081] A xilanase pode ser adicionada à ração de qualquer forma, seja ela como uma xilanase purificada e/ou isolada, ou em mistura com outros componentes tencionados para adição na ração animal, isto é, na forma de aditivos de ração animal, tais como as chamadas pré-misturas para ração animal.

[0082] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere às composições para uso em ração animal, tais como ração animal, e aditivos de ração animal, por exemplo, pré-misturas.

[0083] Além da xilanase da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina lipossolúvel, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço. Macrominerais também são geralmente incluídos nos aditivos de ração.

[0084] Além disso, ingredientes aditivos de ração opcionais são agentes corantes, por exemplo, carotenóides tais como betacaroteno, astaxantina e luteína; compostos aromáticos; estabilizantes; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poliinsaturados; espécies geradoras de oxigênio reativas; e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre outra xilanase (EC 3.2.1.8); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

[0085] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMPs) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1 , Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina, tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos revelados em WO 03/044049 e WO 3/048148, assim como variantes ou fragmentos desses acima que retêm atividade antimicrobiana.

[0086] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFPs) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos seus os quais retêm atividade antifúngica, conforme revelado em WO 94/01459 e WO 02/090384.

[0087] Exemplos de ácidos graxos poliinsaturados são ácidos graxos poliinsaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosoexaenóico, ácido eicosapentaenóico e ácido gama-linoleico.

[0088] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são substâncias químicas tais como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[0089] Geralmente vitaminas hidro ou lipossolúveis, assim como minerais traço, formam parte de uma chamada pré-mistura tencionada para a adição à ração, enquanto que macrominerais são geralmente separadamente adicionados à ração. Uma pré-mistura enriquecida com uma xilanase da invenção é um exemplo de um aditivo de ração animal da invenção.

[0090] Em uma modalidade particular, o aditivo da ração animal da invenção é tencionado para ser incluído (ou prescrito como tendo que ser incluídos ) em dietas animais ou rações em níveis de 0,01 a 10,0%; mais particularmente de 0,05 a 5,0%; ou de 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Deste modo, isto se aplica particularmente em misturas.

[0091] Os seguintes são listas não-exclusivas dos exemplos desses componentes:

[0092] Exemplos de vitaminas lipossolúveis são vitamina A, vitamina D3, vitamina E e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

[0093] Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

[0094] Exemplos de minerais traço são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

[0095] Exemplos de macrominerais são cálcio, fósforo e sódio.

[0096] Os requerimentos nutricionais desses componentes (exemplificados com aves e leitões/porcos) estão listados na Tabela A de WO 01/58275. Requerimento nutricional significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

[0097] Na alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos uma forma de qualquer um dentre um ou mais de, um ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até treze ou até quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual PE incluído no aditivo da invenção numa quantidade tal de modo a proporcionar uma concentração na ração na faixa indicada na fileira quatro, ou na fileira cinco, ou na fileira seis da Tabela A.

[0098] A presente invenção também se refere às composições de ração animal. As composições ou dietas de ração animal têm um teor relativamente alto de proteína. Dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B de WO 01/58275, fileiras 2-3. Dietas de peixe podem ser caracterizadas conforme indicado na fileira 4 dessa Tabela B. Além disso, tais dietas de peixe geralmente têm um teor de gordura bruto de 200-310 g/Kg.

[0099] WO 01/58275 corresponde à Patente Americana No. 6.960.462, a qual é por meio disso incorporada por referência.

[00100] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/Kg (preferivelmente de 50 a 600 g/Kg, mais preferivelmente de 60 a 500 g/Kg, ainda mais preferivelmente de 70 a 500, e mais preferivelmente de 80 a 400 g/Kg) e ainda compreende pelo menos uma xilanase, conforme aqui reivindicado. Em modalidades adicionais preferidas, o teor de proteína bruto é de 150- 800, 160-800, 170-800, 180-800, 190-800 ou 200-800 - todos em g/Kg (matéria seca).

[00101] Além disso, ou alternativamente (ao teor de proteína bruto indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10 a 30 MJ/Kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 a 200 g/Kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 a 200 g/Kg; e/ou um teor de metionina de 0,1 a 100 g/Kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1 a 150 g/Kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 a 50 g/Kg.

[00102] Em modalidades particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina está dentro de qualquer uma das faixas de 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).

[00103] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é, proteína bruta (g/Kg) = N (g/Kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método Kjedahl (A.O.A.C, 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[00104] A energia metabolizável pode ser calculada com base em NRC publication Nutrient requirements in swine, nona edição revisada 1988, subcomitê de nutrição suína, comitê de nutrição animal, conselho de agricultura, conselho de pesquisa nacional. National Academy Press, Washington, D. C, pp. 2-6, e em European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 da Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & Iooijen bv, Wageningen. ISBN 90- 71463-12-5.

[00105] O teor na dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos nas dietas animais completas é calculado com base nas tabelas de ração, tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90- 72839-13-7.

[00106] Em modalidades particulares, a composição de ração animal da invenção contém de 0 a 80% de milho; e/ou de 0 a 80% de sorgo; e/ou de 0 a 70% de trigo; e/ou de 0 a 70% de cevada; e/ou de 0 a 30% de aveia; e/ou de 0 a 40% de farinha de soja; e/ou de 0 a 25% de farelo de peixe; e/ou de 0 a 25% de carne e farelo ósseo; e/ou de 0 a 20% de soro de leite.

[00107] As dietas animais pode, por exemplo, ser produzidas como ração de mingau (não-peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os materiais de ração moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais são adicionadas de acordo com as especificações para as espécies em questão. Enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação de enzima sólida é tipicamente adicionada antes ou durante o passo de mistura; e uma preparação de enzima líquida é tipicamente adicionada depois do passo de peletização. A enzima também pode ser incorporada em um aditivo de ração ou pré-mistura, conforme descrito acima. Modalidades particulares adicionais

[00108] Estas são modalidades particulares adicionais da invenção:

[00109] O uso em ração animal de uma xilanase com um peso molecular por SDS-PAGE abaixo de 24 KDa, em que preferivelmente a xilanase tem um grau de identidade em relação aos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 50%. A xilanase também pode ter uma porcentagem de identidade em relação a qualquer um dos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO: 6 ou aminoácidos 1-228 da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 50%. Em modalidades particulares, o grau de identidade é de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou de pelo menos 99%. A xilanase pode ser uma xilanase bacteriana, preferivelmente obtenível de uma cepa bacteriana do gênero Paenibacillus, ou uma variante ou fragmento seu.

[00110] A invenção ainda se refere ao uso de tal xilanase na preparação de uma composição para uso em ração animal, assim como composições compreendendo tal xilanase e (a) pelo menos uma vitamina lipossolúvel, (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral traço.

[00111] A invenção também se refere a uma composição de ração animal com um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/Kg e compreendendo tal xilanase, assim como um método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, em que tal xilanase é adicionada à ração.

[00112] A invenção também se refere ao uso de uma xilanase, conforme definido acima, na preparação de uma composição para uso em ração animal.

[00113] A invenção também se refere a uma composição compreendendo uma xilanase, conforme definido acima, e (a) pelo menos uma vitamina lipossolúvel, (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral traço. A composição preferivelmente compreende ainda pelo menos uma enzima selecionada dentro do seguinte grupo de enzimas: outra xilanase, e/ou beta-glucanase. A composição é preferivelmente um aditivo de ração animal.

[00114] A invenção também se refere a uma composição de ração animal com um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/Kg e compreendendo xilanase, conforme definido acima.

[00115] A invenção também se refere a um método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, em que uma xilanase, conforme definido acima, ou uma composição, conforme definido acima, é adicionada à ração.

[00116] A invenção também se refere ao uso de uma xilanase, conforme definido acima, na preparação de ração animal ou de componentes de ração animal. Peso molecular

[00117] A xilanase da invenção pode ter um PM menor do que 24 KDa. Em modalidades particulares, o PM está abaixo de 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou abaixo de 10 KDa. Em modalidades alternativas, o PM é menor do que 30, 29, 28, 27, 26 ou 25 kDa.

[00118] A xilanase da invenção também pode ter um PM menor do que 24000 Da. Em modalidades particulares, o PM é menor do que 23000, 22000, 21000, 20000, 19000, 18000, 17000, 16000, 15000, 14000, 13000, 12000, 11000 ou menor do que 10000 Da. Em modalidades alternativas, o PM é menor do que 30000, 29000, 28000, 27000, 26000 ou 25000 Da.

[00119] Em uma modalidade particular, o PM indicado da xilanase da invenção inclui glicosilação caso haja alguma. Na alternativa, o PM da xilanase da invenção exclui a glicosilação.

[00120] O PM pode ser determinado por SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio), o qual é um método útil, bem conhecido na técnica, de determinação do peso molecular (PM) das proteínas.

[00121] Um protocolo adequado para determinar o PM por SDS-PAGE é encontrado no Exemplo 3. Em modalidades alternativas, o experimento do Exemplo 3 é efetuado: (i) com um gel Bis-Tris 10% com tampão de corrida MOPS; (ii) usando BenchMark Ladder (No. cat. 10747-012) comercialmente disponível da Invitrogen/Novex e o qual inclui proteínas em 20, 25 e 30 KDa; e/ou (iii) com os géis Tricina e Tris-glicina também disponibilizados de Invitrogen/Novex. O Exemplo 3 é uma SDS-PAGE de um sobrenadante de fermentação, e não há dúvidas de que banda representa a xilanase (somente uma banda principal; do tamanho esperado). Porém no caso onde pudesse haver dúvida, a xilanase pode ter que ser purificada até uma extensão maior ou, se você tiver um anticorpo poderia fazer um western blot, ou poderia cortar as bandas em questão e ter uma sequência N-terminal determinada e isso poderia identificar a xilanase.

[00122] Na alternativa, o PM da xilanase pode ser calculado como a soma das massas atômicas de todos os átomos de uma molécula de xilanase. Até este ponto, as massas isotópicas médias dos aminoácidos na proteína madura e a massa isotópica média de uma molécula de água são usadas. Os pesos moleculares podem ser derivados dos pesos atômicos padrões da IUPAC 1997. Programas para calcular o PM das proteínas são disponibilizados, por exemplo, no seguinte sítio da internet: http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html (ver também Gasteiger et al, em John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), pp. 571- 607).

[00123] Ainda em uma outra alternativa, a PM da xilanase pode ser medida usando espectrometria de massa, por exemplo, Maldi-TOF, e é também bem conhecida na técnica.

[00124] Glicosilação é um fenômeno no qual os sacarídeos estão ligados às proteínas. A glicosilação somente é observada ao expressar proteínas em eucariotos, tais como fungos e plantas transgênicas, porém não em procariotos, tais como bactérias. Existem vários tipos de glicosilação: a glicosilação N-ligada ao nitrogênio da amida das cadeias laterais de asparagina, e a glicosilação O-ligada ao oxigênio da hidroxila das cadeias laterais de serina e treonina. Por exemplo, glicoproteínas maduras podem conter uma variedade de oligossacarídeos N-ligados de oligomanose contendo entre 5 e 9 resíduos de manose.

[00125] Obviamente, quando um peso molecular é calculado com base da sequência de proteína, ele não é responsabilizado pelos efeitos das modificações pós-traducionais, tal como glicosilação.

[00126] Porém a glicosilação de fato afeta a migração proteica em um gel SDS-PAGE, e isso também é observado por espectrometria de massa (Maldi- TOF). Consequentemente, se alguém quiser excluir o efeito da glicosilação nesses métodos, a xilanase pode ser primeiramente desglicosilada. Kits de desglicosilação são bem conhecidos na técnica e úteis para esse propósito, por exemplo, o kit enzimático CarboRelease™ (No. cat. KE-DG01, o qual é comercialmente disponível de QA-Bio, LLC, 73 Sutton Place West, Palm Desert, CA 9221 1 , EUA). Esse kit inclui as enzimas, controles e reagentes necessários para remover todos os oligossacarídeos N-ligados e muitos açúcares O-ligados. As seguintes enzimas de desglicosilação estão incluídas no kit: PNGase F (Chryseobacterium meningosepticum), O-glicosidase (Streptococcus pneumoniae), Sialidase (Arthrobacter ureafaciens), beta-galactosidase (Streptococcus pneumoniae), Glicosaminidase (Streptococcus pneumonia).

[00127] O peso molecular de uma proteína claramente depende da quantidade, assim como da composição química exata dos seus aminoácidos constituintes. Como uma aproximação do PM, uma pessoa pode escolher somente se referir à quantidade de aminoácidos. Concordantemente, a xilanase da invenção, ao invés de ter uma limitação de seu peso molecular, pode ter uma sequência de aminoácidos madura consistindo de menos de 220 resíduos de aminoácidos. Em modalidades particulares desse aspecto, a quantidade de aminoácidos é menor do que 215, 210, 200 ou menor do que 195; preferivelmente menor do que 194, 193, 192, 191 ou menor do que 190; ainda mais preferivelmente menor do que 189, 188, 187, 186, 185, 184 ou menor do que 183.

[00128] Em modalidades particulares, (i) a xilanase da invenção é usada como a única xilanase; (ii) a xilanase não é uma GH11 xynA de 23 KDa de Becillus subtilis; (iii) a xilanase não é uma parte madura da xilanase com a sequência de SWISSPROT:P18429; (iv) a xilanase não é uma xilanase contida no produto Belfeed B 1100 MP ou ML (comercialmente disponível de BelFeed, Bélgica, ver: http://www.agrimex.be).

[00129] A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos, os quais não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção. Exemplos

[00130] Substâncias químicas usadas como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau reagente. Exemplo 1: Teste in vitro das xilanases - solubilização de NSP

[00131] O propósito do presente estudo foi investigar a eficácia de várias xilanases, considerando solubilização de polissacarídeos que não sejam amido (NSP). Xilanases

[00132] As seguintes xilanases foram testadas:

[00133] A xilanase RONOZYME WX, uma xilanase de ração animal de um único componente conhecido derivada de Thermomyces lanuginosus e comercialmente disponível de DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576, CH-4303 Kaiseraugst, Suíça (essa xilanase também é descrita em WO 96/23062);

[00134] Uma xilanase de Paenibacillus pabuli com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2 e descrita em WO 2005/079585;

[00135] Uma xilanase de Paenibacillus sp. (polymyxa) com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-184 da SEQ ID NO: 4 (UNIPROT:Q9F9B9);

[00136] Uma xilanase (“xyl II”) de ASpergillus niger com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO: 6 (muito similar à xilanase com SEQ ID NO: 6 em WO 97/13853); e

[00137] A parte madura (excluindo o peptídeo de sinal e o propeptídeo, se houver) de outra xilanase (“xyl III”) de Aspergillus niger, a sequência de aminoácido completa da qual sendo a SEQ ID NO: 8 aqui (idêntica à xilanase com SEQ ID NO: 9 em WO 2004/018662).

[00138] As duas xilanases bacterianas foram expressas no Bacillus subtilis, e as duas Aspergillus xilanases foram expressas em Aspergillus oryzae conforme é conhecido na técnica. As cepas de expressão foram fermentadas e os sobrenadantes contendo xilanase usados nos seguintes experimentos, exceto pela xilanase de Paenibacillus pabuli, as quais foram adicionalmente purificadas usando procedimentos padronizados. O teor de proteína enzimática dos sobrenadantes de xilanase foi estimado baseando-se em géis SDS, enquanto que o teor de proteína enzimática da xilanase de Paenibacillus pabuli purificada foi determinado conforme descrito abaixo.

[00139] O estudo foi focado na quantificação do arabinoxilano insolúvel depois da incubação in vitro em um procedimento mimetizando os passos de digestão gástrico e do intestino delgado na digestão monogástrica. No sistema in vitro, até 60 tubos de proveta, contendo um substrato de interesse, foram incubados com HCl/pepsina (simulando a digestão gástrica), e subsequentemente com pancreatina (simulando a digestão intestinal). Três tubos de proveta foram usados para cada tratamento incluído. No final da fase de incubação intestinal, as amostras do digerido in vitro foram removidas e analisadas quanto ao NSP insolúvel.

[00140] Um resumo do procedimento in vitro está mostrado no diagrama abaixo, no qual o pH e a temperatura indicam os respectivos pontos de ajuste (valores alvo). Resumo do procedimento de digestão in vitro

Substrato: 0,35 g de trigo, 0,21 g de cevada, 0,13 g de farinha de soja e 0,11 g de farelo de trigo, fornecido como uma dieta pré-misturada, a qual foi moída para passar por uma tela de 0,5 mm. pH: passo estomacal = pH 3,0/passo intestinal = pH 6,8 - 7,0 HCl: 0,072 M por 1,5 hora (isto é, 30 min de pré-mistura HCl- substrato) Pepsina: 3000 U/g de dieta por 1 hora (Sigma P-7000) Pancreatina: 8 mg/g de dieta por 4 horas (Sigma P-7545) Temperatura: 40 °C Replicatas: 3 Soluções NaOH 0,215 M HCl 0,072 M HCl 0,072 M contendo 6000 U de pepsina por 5 mL NaHCO3 1 M contendo 16 mg de pancreatina por mL Tampão NaAc 100 mM, pH 5,0 Determinações da proteína enzimática

[00141] A quantidade de proteína da enzima xilanase (EP) é calculada com base nos valores de A280 e as sequências de aminoácidos (composições de aminoácidos) usando os princípios esboçados em S.C.Gill & P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989). Procedimento experimental para o modelo in vitro

[00142] O procedimento experimental foi de acordo com o resumo acima. O pH foi medido nos tempos de 1, 2,5 e 5,5 horas. As incubações terminaram depois de 6 horas e as amostras foram removidas e colocadas em gelo antes da centrifugação (10000 x g, 10 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram descartados e o resíduo do grânulo foi lavado uma vez com tampão acetato 100 mM (pH 5,0). Análise

[00143] A análise de NSP residual foi feita de acordo com Theander et al (1995): Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, e Klason lignin (método Uppsala): Collaborative study, em J. AOAC Int. vol. 78, no. 4, pp. 1030-1044, exceto pelo fato de que a celulose não foi analisada no presente exemplo. Em resumo, o amido na amostra é removido por um procedimento de digestão enzimática com alfa-amilase e amiloglicosidase. Os polissacarídeos que não são amido são, a seguir, precipitados com etanol 80% e hidrolisados a 125 °C em ácido sulfúrico 0,4 M. Os açúcares neutros liberados são quantificados por cromatografia gás- líquido como acetatos de alditol, e seus teores foram calculados em relação a um padrão interno e levando-se o peso da amostra original em consideração.

[00144] A Tabela 1 abaixo mostra o teor dos resíduos de (% de matéria seca) de arabinose, xilose e arabinoxilano (soma de arabinose e xilose) na ração depois da incubação in vitro com as várias xilanases. O controle é sem xilanase adicionada. Tabela 1 Dosagem enzimática (MG EP/Kg de dieta)

[00145] Parece que, a partir da Tabela 1, surpreendentemente as xilanases de P. pabuli e P. polymyxa são estatisticamente significativamente melhores quando ocorre a solubilização dos polissacarídeos das fibras insolúveis (NSP) em comparação com 1) o controle sem xilanase adicionada, 2) com a xilanase de ração animal conhecida de RONOZYME WX, assim como 3) com as duas xilanases de A. niger. Exemplo 2: Efeito dose-resposta

[00146] A xilanase de Paenibacillus pabuli foi testada em várias dosagens em um experimento in vitro, conforme descrito no Exemplo 1.

[00147] A Tabela 2 abaixo apresenta o teor dos resíduos de (% de peso fresco) de xilose, arabinoxilano (soma de arabinose e xilose) e arabinose insolúvel na ração depois da incubação in vitro com essa xilanase em várias dosagens. O controle é sem a xilanase adicionada. Tabela 2.

[00148] Parece que, a partir da Tabela 2, existe um efeito dose-resposta claro e significativamente estatístico da xilanase de Paenibacillus pabuli na solubilização de polissacarídeos de fibras insolúveis (NSP). Exemplo 3. Determinação do peso molecular

[00149] Um hospedeiro Aspergillus oryzae transformado expressando a xilanase dos aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO: 6 foi fermentado por quatro dias em 500 mL de frascos de agitação com septos com 100 mL de meio YP + 2% de G (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, água até 1 L, autoclavagem a 121 °C, 20 minutos, adição de 100 mL de solução de glicose estéril 20%) a 30 °C e 200 RPM. O líquido de fermentação foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,22 um (micrômetro) para fornecer o sobrenadante.

[00150] 10 uL (microlitros) do sobrenadante foram misturados com 10 uL de tampão de amostra NuPAGE® LDS (4x) (disponível de Invitrogen, No. cat. NP0007), 2 uL de EDAT 1%, 2 uL de PMSF 6%, 4 uL de DTT 0,5 M e 2 uL de H2O, até um volume total de 20 uL.

[00151] A amostra de 20 uL foi aquecida até 99 °C por 3 minutos e aplicada até um gel SDS-PAGE do tipo Géis 1 mm de NuPAGE® Novex BisTris 10%, disponível da Invitrogen (cat. no. NP0301BOX).

[00152] Tampão de corrida: câmara de tampão superior, 200 mL de tampão de corrida 1X NuPAGE® MES DOS (No. cat. NP2002) contendo 500 uL de antioxidante NuPAGE® (No. cat. NP0005). A câmara de tampão inferior, 600 mL de tampão de corrida 1 X NuPAGE® MES DOS.

[00153] Condições de corrida: Dois passos, viz. 30 min 50 mAmp, e 20 min 100 mAmp.

[00154] Coloração: corante Simply Blue Stain™ Safe, da Invitrogen (No. cat. LC6065).

[00155] Rinsagem: 3 vezes por 5 min em água deionizada, aproximadamente 100 mL em cada vez.

[00156] Coloração: Cobrir o gel com solução corante Simply Blue. Corar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente.

[00157] Descoloração: Descartar o corante e lavar o gel em água deionizada.

[00158] Marcador de PM: Kit de calibração de baixo peso molecular Amersham para eletroforese SDS (código do produto 17-0446-01).

[00159] Do gel SDS-PAGE, o peso molecular da xilanase de Aspergillus niger xyl II foi considerado como sendo menor do que 24 KDa. Exemplo 4: Determinação da atividade da xilanase

[00160] Esse ensaio é um exemplo de uma atividade xilanase. Ele é particularmente adequado para determinar a atividade das xilanases de Paenibacillus da presente invenção.

[00161] Substrato: 0,2% de AZCL-arabinoxilano do trigo (Megazyme) em tampão fosfato de sódio 0,2 M pH 6,0 + 0,01% de Triton-x-100.

[00162] Padrão: Padrão Bio-Feed wheat FXU de trigo (tal como o lote 43-1195, o qual é disponível sob solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca).

[00163] Diluição: em Triton-x-100 0,01%.

[00164] FXU/mL: 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,40.

[00165] Método: 900 uL (microlitros) de substrato são pré-aquecidos a 37 °C em um termomisturador. 100 μL de amostra são adicionados. Incubados por 15 min a 37 °C em velocidade máxima. Colocadas em gelo por 2 min. Giradas por 1 min a 20000 x G . 2 x 200 uL de sobrenadante são transferidos para uma placa de microtitulação. O ponto final em OD 590 nm é medido. Exemplo 5. Solubilização e degradação total de NSP IN VITRO

[00166] O propósito do atual estudo foi comparar a eficácia de uma xilanase da invenção com uma xilanase de ração animal conhecida, homóloga, levando-se em consideração a solubilização e a degradação total de polissacarídeos diferentes de amido (NSP). Xilanases

[00167] As seguintes xilanases foram testadas:

[00168] A xilanase RONOZYME WX e uma xilanase da invenção de Paenibacillus pabuli (ambas descritas no Exemplo 1), e uma xilanase comparativa com a sequência dos aminoácidos 1-185 da SEQ ID NO: 9 (Swissprot Q6TLP3).

[00169] A xilanase comparativa foi expressa a partir de um gene sintético em uma cepa de Bacillus subtilis fraca de protease. Um caldo de cultura contendo xilanase foi preparado pela sua fermentação, e a xilanase foi purificada usando procedimentos padronizados. Para inativar possíveis proteases, o caldo de cultura filtrado, adicionado ao mesmo volume de ácido acético 50 mM pH 4,0 e ajustado até pH 4,0 com ácido acético 50%, foi incubado por 30 minutos a 37 °C em frascos de agitação de 500 mL contendo 250 mL em banho-maria. A solução foi suavemente misturada com um agitador magnético durante a incubação. Depois da incubação, a solução foi centrifugada por 30 minutos a 12.000 g e o sobrenadante foi separado do grânulo. A atividade da protease foi medida como se segue: Substrato N- Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNitroanilid (Sigma, S7388), tampão de ensaio: HEPES 100 mM, pH 7,5 (0,01% de Triton X-100), diluições de enzima em Triton X-100 0,01%, e leitura em OD405 depois de 10 minutos a 25 °C.

[00170] A xilanase resultante estava substancialmente pura (uma banda em gel SDS) e tinha um peso molecular de aproximadamente 22 KDa (por SDS-PAGE).

[00171] O teor de proteína enzimática da xilanase comercial foi estimado baseando-se nos géis SDS, enquanto que o teor de proteína enzimática da xilanase de Paenibacillus pabuli e a xilanase comparativa foram determinados conforme descrito no Exemplo 1. Procedimento experimental para o modelo in vitro

[00172] O estudo foi focado na quantificação de teor insolúvel, assim como de arabinoxilano total depois da incubação in vitro em um procedimento de digestão monogástrico conforme descrito no Exemplo 1 (ver: Resumo do procedimento de digestão in vitro, Condições, Soluções e Determinações de proteína enzimática).

[00173] Para a determinação dos arabinoxilanos insolúveis, o pH foi medido nos tempos de 1, 2,5 e 5,5 horas. As incubações terminaram depois de 6 horas e as amostras foram removidas e colocadas em gelo antes da centrifugação (10000 x g, 10 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram descartados e o resíduo do grânulo foi lavado uma vez com tampão acetato 100 mM (pH 5,0).

[00174] Para a determinação de arabinoxilanos total, o pH foi medido nos tempos de 1, 2,5 e 5,5 horas. As incubações terminaram depois de 6 horas. Etanol absoluto foi adicionado para obter uma concentração de 80% de etanol na amostra para precipitar todos os polissacarídeos de um grau de polimerização (DP) maior do que 10 (DP > 10). As amostras foram, a seguir, esfriadas (4 °C) em gelo antes da centrifugação (10000 x g, 10 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram descartados e o resíduo do grânulo lavado uma vez com etanol 80%. Análise

[00175] A análise de NSP arabinoxilano no resíduo do grânulo foi efetuada de acordo com Theander et al., conforme descrito no Exemplo 1. Os polissacarídeos (DP > 10) são hidrolisados em ácido sulfúrico, juntamente com um padrão interno (Myo-inositol) e os açúcares neutros liberados (arabinose + xilose) são quantificados. Resultados

[00176] A Tabela 3 mostra o teor de matéria seca (%) de resíduos de arabinose + xilose (arabinoxilano) insolúveis na ração, isto é, NSP arabinoxilano, o qual é insolúvel depois da incubação in vitro com as xilanases.

[00177] A Tabela 4 mostra o teor de matéria seca (%) de resíduos de arabinose + xilose (arabinoxilano) na ração, isto é, a soma de NSP arabinoxilano insolúvel e solúvel.

[00178] Em ambas as Tabelas o controle não tem xilanase adicionada. Tabela 3

Tabela 4 Dosagem enzimática (mg de EP/Kg de dieta)

[00179] Parece que, a partir da Tabela 3, surpreendentemente, a xilanase de P. pabuli é estatisticamente significativamente melhor levando-se em consideração a capacidade de solubilizar a fração de arabinoxilano em comparação com 1) o controle sem xilanase adicionada, 2) a xilanase de ração animal comercial de RONOZYME WX, assim como 3) a xilanase Q6TLP3 comparativa.

[00180] O teor de arabinoxilanos solúvel irá para o sobrenadante depois da centrifugação das misturas de incubação in vitro, e não serão consequentemente incluídos na determinação de arabinoxilanos insolúveis.

[00181] O teor de arabinoxilano total (Tabela 4) inclui o teor de arabinoxilano insolúvel, assim como o teor de arabinoxilanos solúvel.

[00182] As diferenças entre os valores da Tabela 4 e da Tabela 3 correspondentes são indicativos da quantidade de NSP a qual foi degradada em oligômeros menores do que DP 10 pelas xilanases durante a incubação in vitro.

[00183] Claramente, as xilanases investigadas são mais eficientes na solubilização da fração de arabinoxilano (Tabela 3) do que elas são na degradação total (Tabela 4). Esta é uma característica típica da família das xilanases 11. Ainda parece a partir da Tabela 4 que a xilanase de P. pabuli na dieta de 5 mg de EP/Kg também é significativamente melhor levando-se em consideração a capacidade de degradar a fração de arabinoxilano em comparação com 1) o controle sem xilanase adicionada, e 2) a xilanase de ração animal conhecida da RONOZYME WX, e ela é 3) numericamente mais eficiente (4%) do que a xilanase Q6TLP3 comparativa. Exemplo 6. Ração animal e composições aditivas de ração

[00184] Uma formulação da xilanase de Paenibacillus pabuli da SEQ ID NO: 2 contendo 0,050 g da proteína enzimática xilanase é adicionada à seguinte pré-mistura (por quilo de pré-mistura): 5000000 IE vitamina A 1000000 IE vitamina D3 13333 mg vitamina E 1000 mg vitamina K3 750 mg vitamina B1 2500 mg vitamina B2 1500 mg vitamina B6 7666 mcg vitamina B12 12333 mg niacina 33333 mcg biotina 300 mg ácido fólico 3000 mg D-pantotenato de cálcio 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5,8 % cálcio 25 % sódio Ração animal

[00185] Este é um exemplo de uma ração animal (ração de galinha para assar) compreendendo 0,5 mg/Kg (0,5 ppm) da xilanase de Paenibacillus pabuli da SEQ ID NO: 2 (calculado como proteína da enzima xilanase): 65,00% de trigo 32,35% de farinha de soja (50% de proteína bruta, CP) 1,0% de óleo de soja 0,2% de DL-metionina 0,22% de DCP (fosfato dicálcico) 0,76% de CaCO3 (carbonato de cálcio) 0,32% de areia 0,15% de NaCl (cloreto de sódio) 1% da pré-mistura acima

[00186] Os ingredientes são misturados, e a ração é peletizada na temperatura desejada, por exemplo, 70 °C.

[00187] A invenção aqui descrita e reivindicada não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que esses aspectos são tencionados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são tencionados para estarem dentro do escopo dessa invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas demonstradas e aqui descritas, se tornarão aparentes para as pessoas versadas na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também são tencionadas a caírem dentro do escopo das reivindicações em associadas. Em caso de conflito, a presente descoberta, incluindo definições, irá comandar.

[00188] Várias referências são aqui citadas, as descobertas das quais são incorporadas por referência nas suas totalidades.

Claims (10)

1. Uso de uma xilanase, caracterizado pelo fato de ser em ração animal, a dita xilanase tendo a sequência como definida nos aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2.

2. Uso de uma xilanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma composição para uso em ração animal.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a solubilização de polissacarídeos que não são amido durante a digestão gástrica e intestinal.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a degradação de polissacarídeos diferentes de amido durante a digestão gástrica e intestinal.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o pré-tratamento de ração animal ou de componentes de ração animal.

6. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de compreender uma xilanase como definida na reivindicação 1, e (a) uma vitamina lipossolúvel; (b) uma vitamina solúvel em água; e/ou (c) um mineral traço.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma enzima selecionada do seguinte grupo de enzimas: outra xilanase e/ou beta-glucanase.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que é um aditivo de ração animal.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de ter um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/Kg e compreendendo uma xilanase, como definida na reivindicação 1.

10. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que uma xilanase, como definida na reivindicação 1, ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 é adicionada à ração.