BR112019018381A2

BR112019018381A2 - fucosidases fúngicas e seu uso na prevenção e/ou no tratamento de uma infecção patogênica em um animal

Info

Publication number: BR112019018381A2
Application number: BR112019018381A
Authority: BR
Inventors: Zhang Zhenghong
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2020-04-07
Also published as: EP3592429A1; US20200071685A1; CN110505903A; WO2018164876A1

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos e composições que usam glicosídeo hidrolases, tais como uma alfa-l-fucosidase, para prevenir e/ou tratar uma infecção patogênica e/ou diarreia em um animal, em que a infecção patogênica é causada por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-l-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma glicosídeo hidrolase com capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-l-fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para FUCOSIDASES FÚNGICAS E SEU USO NA PREVENÇÃO E/OU NO TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO PATOGÊNICA EM UM ANIMAL. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [0001] O presente pedido reivindica a prioridade ao documento nPCT/CN2017/075743, depositado em 6 de março de 2017, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0002] A listagem de sequência fornecida no arquivo nomeado NB412207WOPCT_SequenceListing_ST25.txt com um tamanho de 165 KB que foi criado em 28 de fevereiro de 2017 e que é depositada com o mesmo está incorporada a título de referência ao presente documento em sua totalidade.

CAMPO [0003] O campo refere-se a glicosídeo hidrolases, em particular, alfa-L-fucosidases inovadoras, e seu uso em ração animal e na prevenção e/ou tratamento de infecções patogênicas intestinais e/ou diarréia em animais.

ANTECEDENTES [0004] O uso de antibióticos para tratar tanto seres humanos como animais resultou em resistência antimicrobiana, que agora se tornou um grande ameaça à saúde global. Assim, busca-se desenvolver alternativas a antibióticos para solucionar essa preocupação de saúde global.

[0005] Os consumidores estão muito preocupados sobre o uso amplamente difundido de antibióticos em alimento animal. Tanto varejistas como fazendeiro precisarão mudar em resposta a essa mudança na preferência do consumidor por carne sem antibiótico.

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2/93 [0006] Escherichia (E.) coli enterotoxigênica (ETEC) é o tipo mais comum de colibacilose em animais jovens, tais como porcos e bezerros, tipicamente aparecendo como diarréia aguada grave. O mesmo é também uma causa significativa de diarréia entre viajantes (Diarréia do Viajante) e crianças nos países em desenvolvimento.

[0007] Quase todas as bactérias ETEC são conhecidas por aderir aos receptores no epitélio do intestino delgado por apêndices de superfície proteica (fímbrias e pili) ou proteínas afimbriais. Além disso, secretam toxinas proteicas (enterotoxinas) para reduzir a absorção e aumentar a secreção de fluido e eletrólito das células epiteliais do intestino delgado. As enterotoxinas atuam localmente sobre os enterócitos. Os detalhes da epidemiologia, da patogênese, do diagnóstico e da prevenção de infecções por ETEC e diarréia em animais podem ser encontrados em Nagy e Fekete (1999) Vet Res. 30:259 a 284.

[0008] Mais especificamente, ETEC e (ETEEC) Escherichia coli Enterotoxaêmica (F18⁺ E. Coli) mostraram expressar fímbrias F18 que colonizam o intestino delgado e causam diarréia em animais muito jovens, tais como leitões e bezerros, e é uma causa importante de mortalidade humana no terceiro mundo. A proteção contra tais doenças pode ser estabelecida impedindo-se a adesão fimbrial de tais patógenos às células intestinais do animal. Assim, há uma necessidade de encontrar abordagens novas e alternativas para a prevenção e o tratamento de infecções patogênicas, tal como ETEC.

SUMÁRIO [0009] Em um aspecto, é revelado um polipeptídeo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase selecionado dentre o grupo que consiste em:

a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 93% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

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b) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

c) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 75% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

d) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 70% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25;

e) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26;

f) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 71% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; e

g) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 97% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

[0010] Em uma segunda modalidade, há um polipeptideo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase que é compreendido dentro de uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; e SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NQ:20; e SEQ ID NO:21.

[0011] Em uma terceira modalidade, é revelado um construto recombinante que compreende uma sequência regulatória funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa-fucosidase selecionada dentre o grupo que consiste em:

a) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoáciPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 8/122

4/93 dos madura prevista de pelo menos 93% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

b) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

c) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 75% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 70% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25;

e) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26;

f) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 71% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; e

g) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 97% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

[0012] Em uma quarta modalidade, é revelado um hospedeiro de produção selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

[0013] Em uma quinta modalidade, é revelado um método para produzir uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, conforme definido na reivindicação 3; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que a enzima que tem atividade de alfa-fucosidase

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5/93 seja produzida e, opcionalmente, a alfa-fucosidase possa ser recuperada do hospedeiro de produção.

[0014] Em uma sexta modalidade, é revelado um sobrenadante de cultura contendo alfa-fucosidase obtido por qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[0015] Em uma sétima modalidade, é revelado um hospedeiro de produção microbiana recombinante para expressar uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase, sendo que o dito hospedeiro de produção microbiana recombinante compreende o construto recombinante revelado no presente documento. Além disso, o hospedeiro de produção pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos e algas.

[0016] Em uma oitava modalidade, é revelada uma ração animal que compreende qualquer um dos polipeptídeos alfa-fucosidase das reivindicações 1 ou 2, em que a alfa-fucosidase está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/toneladas de ração.

[0017] Em uma nona modalidade, a ração animal revelada no presente documento pode compreender adicionalmente pelo menos outra enzima ou pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou tanto pelo menos uma outra enzima quanto um micro-organismo de alimentação direta.

[0018] Em uma décima modalidade, é revelada uma ração, um gênero alimentício, uma composição de aditivo de ração ou uma prémistura que compreende qualquer um dos polipeptídeos alfafucosidase revelados no presente documento.

[0019] Em uma décima primeira modalidade, é revelada uma ração, um gênero alimentício, uma composição de aditivo de ração ou uma pré-mistura, conforme revelado no presente documento, que compreende pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou pelo menos outra enzima ou tanto pelo menos uma outra enzima

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6/93 quanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

[0020] Em uma décima segunda modalidade, é revelada uma composição de aditivo de ração conforme descrito no presente documento, em que a dita composição compreende adicionalmente pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[0021] Em uma décima terceira modalidade, é descrita uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração de animal que compreende o polipeptídeo de alfa-fucosidase descrito no presente documento, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por pulverização, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima. O diâmetro médio das partículas é maior que 50 microns e menor que 2.000 microns. Além disso, a composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode estar em uma forma líquida e adicionalmente essa forma líquida pode ser adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.

[0022] Em uma décima quarta modalidade, é revelado um método

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7/93 para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica e/ou diarréia são causadas por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma alfa-fucosidase da reivindicação 1, em que a dita alfa-fucosidase tem capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno. Além disso, essa alfa-L-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose aglutinado a alfa-1,2 terminal de uma estrutura que contém glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A a um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B a antígeno sanguíneo de grupo H.

[0023] Em uma décima quinta modalidade, o patógeno pode ser Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

[0024] Em uma décima sexta modalidade, é revelado um método descrito no presente documento que compreende adicionalmente administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma alfa-L-fucosidase em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, ou (b) pelo menos uma outra enzima, ou (c) pelo menos uma outra enzima e pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

[0025] Em uma décima sétima modalidade, a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, ou (b) pelo menos uma outra enzima, ou (c) pelo menos uma outra enzima e pelo menos um micro-organismo de aliPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 12/122

8/93 mentação direta é administrada em uma ração animal ou pré-mistura. [0026] Em uma décima nona modalidade, a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, ou (b) pelo menos uma outra enzima, ou (c) pelo menos uma outra enzima e pelo menos um micro-organismo de alimentação direta pode estar na forma de um grânulo.

[0027] Em uma vigésima modalidade, é revelada uma composição para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica é causada por um patógeno com capacidade para se aglutinar à célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz da alfa-fucosidase, de acordo com a reivindicação 1, com capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

[0028] Em uma vigésima primeira modalidade, é revelada uma composição, conforme descrito no presente documento, em que a alfaL-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose alfa-1,2ligado terminal de uma estrutura contendo glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A em um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B em antígeno sanguíneo de grupo H.

[0029] Além disso, o patógeno pode ser Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

[0030] Em uma vigésima segunda modalidade, é revelada uma composição que compreende adicionalmente (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 13/122

9/93 zima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

[0031] Em uma vigésima terceira modalidade, a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta pode ser encapsulada.

[0032] Em uma vigésima quarta modalidade, a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta seja encapsulada ou não encapsulada pode ser administrada a um animal como uma ração ou pré-mistura.

[0033] Em uma vigésima quinta modalidade, a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta seja encapsulada ou não encapsulada pode ser administrada na forma de um grânulo a um animal como uma ração ou uma pré-mistura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DAS SEQUÊNCIAS [0034] A Figura 1 representa um mapa de plasmídeo exemplificative de fucosidases fúngicas.

[0035] A Figura 2 representa a atividade de fucosidase medida em pH 5 e 8 com o uso de substrato de 2'-fucosil-lactose.

[0036] A Figura 3 representa a atividade residual de fucosidases após incubação com dose crescente de pepsina em pH 3,5.

[0037] A Figura 4 representa a atividade residual de fucosidases após incubação com dose crescente de pepsina em pH 5,0.

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10/93 [0038] A Figura 5 representa a liberação de fucose de mucina gástrica porcina (tipo II) mediante incubação com duas concentrações (2 ppm e 20 ppm) de 6 fucosidases diferentes.

[0039] A Figura 6 representa a liberação de fucose de trissacarídeo de antígeno H (tipo I) mediante incubação com duas concentrações (0,25 ppm e 1 ppm) de 6 fucosidases diferentes.

[0040] A Figura 7 apresenta o alinhamento de múltiplas sequências de sequências de proteínas maduras previstas completas de fucosidase fúngica.

[0041] As sequências a seguir cumprem com 37 C.F.R. §§ 1.821 a 1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules) e são coerentes com o Padrão de Organização de Propriedade Intelectual Mundial (WIPO) ST.25 (2009) e as exigências de listagem de sequência da Convenção de Patente Européia (EPC) e as Regras de Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes (PCT) 5.2 e 49.5 (a-bis) e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e o formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras estabelecidas no Título 37 do C.F.R. § 1.822.

[0042] A SEQ ID NO:1 representa a sequência de nucleotídeos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra CRC04259.

[0043] A SEQ ID NO:2 representa a sequência de aminoácidos para a fucosidase fúngica do ID de amostra CRC06086.

[0044] A SEQ ID NO:3 representa a sequência de nucleotídeos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra

CRC06678.

[0045] A SEQ ID NO:4 representa a sequência de nucleotídeos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra

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CRC06719.

[0046] A SEQ ID NO:5 representa a sequência de nucleotideos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra CRC06800.

[0047] A SEQ ID NO:6 representa a sequência de nucleotideos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra CRC06807.

[0048] A SEQ ID NO:7 representa a sequência de nucleotideos para o gene que codifica fucosidase fúngica do ID de Amostra CRC06852.

[0049] As SEQ ID Nos:8 a 28 são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Lista de enzimas fucosidase fúngicas clonadas e expressas
ID da Amostra	Organismo Fonte	Sequência CDS SEQ ID NO	Polipeptideo de comprimento completo SEQ ID NO	Proteína madura SEQ ID NO
CRC04259	Rasamsonia composticola	8	15	22
CRC06086	Tríchoderma reesei QM6a	9	16	23
CRC06678	Chaetosartorya sp.N080	10	17	24
CRC06719	Penicillium sp. N085	11	18	25
CRC06800	Aspergillus sp.N092	12	19	26
CRC06807	Aspergillus sp. N092	13	20	27
CRC06852	Emerícella nidulans var.lata NRRL200	14	21	28

DESCRIÇÃO DETALHADA [0050] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0051] Nessa descrição, diversos termos e abreviações são usados. As definições a seguir se aplicam a menos que seja especificamente determinado de outro modo.

[0052] Os artigos um, uma e o, a que precedem um elemento ou componente são concebidos como não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, um, uma e o, a devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número obviamente signiPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 16/122

12/93 fique o singular.

[0053] O termo que compreende significa a presença das características, números inteiros, passos ou componentes afirmados como referidos nas reivindicações, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras suas características, números inteiros, passos, componentes ou grupos. O termo que compreende se destina a incluir modalidades englobadas pelos termos que consiste essencialmente em e que consiste em. Similarmente, o termo que consiste essencialmente em se destina a incluir modalidades englobadas pelo termo que consiste em.

[0054] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de 1 a 5 é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 1 a 2 e 4 a 5, 1 a 3 e 5 e similares.

[0055] Como usado aqui em conexão com um valor numérico, o termo cerca de se refere a uma gama de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja de outro modo especificamente definido no contexto. Por exemplo, a frase um valor de pH de cerca de 6 se refere a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.

[0056] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem,

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13/93 todas, expressamente escritas no presente documento.

[0057] O termo glicosídeo hidrolase é usado de forma intercambiável com glicosidases e glicosil hidrolases. As glicosídeo hidrolases auxiliam na hidrolase de ligações glicosídicas em açúcares complexos (polissacarídeos). Juntamente com as glicosiltransferases, as glicosidases formam o mecanismo catalítico principal para a síntese e quebra de ligações glicosídicas. As glicosídeo hidrolases são classificadas em EC 3.2.1 como enzimas que catalisam a hidrólise de O- ou S-glicosídeos. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas de acordo com o resultado estereoquímico da reação de hidrólise: assim, as mesmas podem ser classificadas como enzimas de retenção ou inversão. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas como exo ou endo atuantes, dependendo de se atual na extremidade (usualmente não redutora) ou no meio, respectivamente, de uma cadeia de oligo/polissacarídeos. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas por métodos baseados em sequência ou estrutura. As mesmas são tipicamente nomeadas de acordo com o substrato sobre as quais as mesmas atuam.

[0058] O termo glicosiltransferase refere-se a uma enzima que catalisa a formação de uma ligação glicosídica entre monossacarídeos.

[0059] Os termos alfa-L-fucosidase, alfa-L-fucosídeo fuco-hidrolase e alfa-fucosidase são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a uma enzima na classe EC n- 3.2.1.51 que remove uma L-fucose de uma alfa-L-fucosídeo. As alfa-L-fucosidases são exoglicosidases encontradas em uma variedade de organismos e mamíferos. As alfa-L-fucosidases foram divididas em duas famílias de glicosídeo hidrolase distintas: As alfa-L-fucosidases que catalisam a hidrólise com o uso de um mecanismo de retenção pertencem à família bem conhecida glicosídeo hidrolase 29 (GH29). As alfaPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 18/122

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L-fucosidases que catalisam a hidrólise com o uso de um mecanismo de inversão pertencem à família bem conhecida glicosídeo hidrolase 95 (GH95).

[0060] Os termos alfa-1,2-L-fucosidase, emulsina fucosidase II de amêndoa, alfa-2-L-fucopiranosil-beta-D-galactosídeo fuco-hidrolase e alfa-(1->2)-L-fucosidase são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a uma enzima na classe EC n²3.2.1.63 que catalisa a hidrólise de resíduos de L-fucose terminais não redutores ligados aos resíduos de D-galactose por uma 1,2-alfa ligação. Os termos alfa-1,3-L-fucosidase, emulsina fucosidase I de amêndoa e alfa-3-L-fucose-N-acetilglucosaminil-glicoproteína fucohidrolase são usados de forma intercambiável e referem-se a uma enzima na classe EC n² 3.2.1.111 que hidrolisa (1->3)-ligações entre resíduos de alfa-L-fucose e N-acetilglicosamina.

[0061] Os termos alfa-1,6-L-fucosidase, alfa-L-fucosidase e 1,6-L-fucose-N-acetil-D-glucosaminilglicopeptídeo fuco-hidrolase são usados de forma intercambiável no presente documento referem-se a uma enzima na classe EC n² 3.2.1.127 que hidrolisa (1->6)-ligações entre resíduos de alfa-L-fucose e N-acetil-D-glicosamina.

[0062] Os termos defucosilar e defucosilação são usados de forma intercambiável e referem-se a uma enzima com capacidade para remover um grupo fucosila de uma estrutura que contém glicano.

[0063] Os termos glicano e polissacarídeo são usados de forma intercambiável. O glicano refere-se a um polissacarídeo ou oligossacarídeo ou à seção de carboidrato de um glicoconjugado, tal como glicoproteína, um glicolipídio ou um proteoglicano, mesmo se o carboidrato for apenas um oligossacarídeo. Os glicanos podem ser homo- ou heteropolímeros de resíduos de monossacarídeo. Podem ser moléculas lineares ou ramificadas. Os glicanos podem ser encontrados ligados às proteínas como em glicoproteínas e proteoglicanos. Em geral, são

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15/93 encontrados na superfície externa das células. Os glicanos O- e Nligados são muito comuns em eucariontes, mas também são encontrados, embora menos comumente, em procariontes.

[0064] O termo estrutura que contém glicano, conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer estrutura, tais como proteínas, lipídios e similares, a qual um glicano pode ser ligado de qualquer maneira.

[0065] O termo porção química contendo N-acetilgalactosilamina é uma estrutura a qual uma N-acetil-galactosilamina está ligada. Tais estruturas incluem, porém sem limitação, carboidratos e similares.

[0066] O termo FUT I, conforme usado no presente documento, refere-se a alfa-1,2-fucosiltransferase 1. Uma fucosiltransferase é uma enzima que transfere um açúcar L-fucose de um substrato doador de GDP-fucose para um substrato aceitante. O substrato aceitante pode ser outro açúcar tal como a transferência de uma fucose para um açúcar GlcNAc nuclear como no caso de glicosilação N-ligada ou para uma proteína como no caso de glicosilação O-ligada por O-fucosiltransferase. Algumas das proteínas nesse grupo são responsáveis pela base molecular dos antigenos de grupo sanguíneo, marcadores de superfície no exterior da membrana da célula sanguínea.

[0067] O termo animal, conforme usado no presente documento, inclui todos os animais não ruminantes (incluindo seres humanos) e ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, como um cavalo ou animal monogástrico. Os exemplos de animais monogástricos incluem, mas sem limitação, porcos e suínos, como leitões, porcos em fase de crescimento, porcas; aves como perus, patos, galinhas, frangos de corte, galinha poedeira; peixe como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um aniPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 20/122

16/93 mal ruminante incluindo, mas sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antílope asiático.

[0068] O termo patógeno, conforme usado no presente documento, significa qualquer agente causador de doença. Tais agentes causadores podem incluir, porém sem limitação, agentes causadores bacterianos, virais, fúngicos e similares.

[0069] O termo sítio de aglutinação de patógeno, conforme usado o presente documento, significa uma região ou uma área em que uma enzima pode fixar-se a um composto e reagir com o mesmo. Na presente descrição, o sítio de aglutinação de patógeno preferencial é aquele que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose.

[0070] O termo F18⁺ E. Coli significa qualquer E. coli com capacidade para expressão fímbrias F18.

[0071] O gênero Bacillus, conforme usado no presente documento, inclui todas as espécies dentro do gênero Bacillus, conforme conhecido por aqueles indivíduos versados na técnica, o que inclui, porém sem limitação B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, e B. thuríngiensis.É reconhecido que o gênero Bacillus continua a ser submetido à reorganização taxonômica. Assim, entende-se que o gênero inclui espécies que foram reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que agora é nomeado Geobacillus stearothermophilus ou Bacillus polymyxa, que é agora Paenibacillus polymyxa. A produção de endosporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada o atributo de definição do gênero Bacillus, embora essa característica também se

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17/93 aplique aos recentemente nomeados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.

[0072] Uma ração e um alimento, respectivamente, significam qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou similares ou componentes de tais refeições destinados ou adequados para serem comidos, tomados, digeridos, por um animal não humano e um ser humano, respectivamente.

[0073] Conforme usado no presente documento, o termo alimento é usado em um sentido amplo - e abrange alimentos e produtos alimentícios para seres humanos assim como alimentos para animais não humanos (isto é, uma ração).

[0074] O termo ração é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos ração e ração animal são usados de forma intercambiável. Em uma modalidade preferencial, o alimento ou a ração é para consumo por não ruminantes e ruminantes.

[0075] O termo produto microbiano alimentado diretamente (DFM), conforme usado no presente documento, é originado de micro-organ ismos de ocorrência natural vivos (viáveis). As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais tais como calor, umidade e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As Bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonísticos a patógenos. Como as Bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser um tanto sensíveis

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18/93 ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses micro-organ ismos pertencem ao grupo fungos.

[0076] O termo protease, conforme usado no presente documento, refere-se a uma enzima com capacidade para clivar uma ligação peptídica. Os termos protease, peptidase e proteinase podem ser usados de forma intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serinaproteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0077] O termo isolado significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptideo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada. Os termos molécula de ácido nucleico isolada, polinucleotídeo isolado e fragmento de ácido nucleico isolado serão usados de forma intercambiável e referem-se a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômiPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 23/122

19/93 co ou DNA sintético.

[0078] O termo purificado, conforme aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos denota, de modo geral, um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente isento de outros componentes conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda distinta em um gel eletroforético, eluado cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugação de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é purificado. Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo enriquecido refere-se a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.

[0079] Os termos peptídeos, proteínas e polipeptídeos são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma proteína ou um polipeptídeo compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint

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Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídio pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguido por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como G087S ou G87S. Ao descrever as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L,I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leucina ou uma isoleucina. Algumas vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina nessa posição.

[0080] As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguidas por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como G087S ou G87S.

[0081] O termo forma madura de uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo refere-se à forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de pró-peptídeo.

[0082] O termo forma precursora de uma proteína ou de um peptídeo se refere a uma forma madura da proteína que tem uma prósequência ligada de modo operacional ao terminal amino ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência de sinalização ligada de modo operacional ao terminal amino da próPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 25/122

21/93 sequência. O precursor também pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos na atividade pós-transcrição (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou um peptídeo).

[0083] Uma pró-sequência ou sequência de pró-peptídeo refere-se a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo de sinalização e a sequência de enzima madura (por exemplo, uma fucosidase) que é necessária para o enovelamento e a secreção adequada de uma enzima; as mesmas são denominadas, às vezes, como chaperonas intramoleculares. A divagem da pró-sequência ou sequência de pró-peptídeos resulta em uma enzima ativa madura que é frequentemente expressa como pró-enzimas.

[0084] Os termos sequência de sinalização e peptídeo de sinalização se referem a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no terminal N da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exógena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada. O gene de interesse pode ser expresso com ou sem uma sequência de sinal.

[0085] O termo tipo selvagem em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo de ocorrência natural se refere a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos) que seja encontrada na natureza. Inversamente, o termo de

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22/93 ocorrência não natural se refere a qualquer coisa que não seja encontrada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes e sequências de proteínas produzidas no laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[0086] Conforme usado no presente documento em relação às posições de resíduo de aminoácido, que corresponde a ou corresponde a ou corresponde refere-se a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou um peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou um peptídeo. Conforme usado no presente documento, região correspondente, em geral, se refere a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.

[0087] Os termos derivado de e obtido a partir de se referem a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.

[0088] O termo aminoácido se refere à unidade estrutural química básica de uma proteína ou um polipeptídeo. Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). Similarmente, espera-se também que alterações que resultam em substituição de um resíduo negativamente carregado por outro (tal como ácido aspártico por ácido glutâmico) ou um resíduo positivamente carregado por outro (tal como lisina por arginina) produPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 27/122

23/93 zam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, não seria esperado também que as alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminais e C-terminais da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da habilidade comum na técnica, como está a determinação de manutenção de atividade biológica dos produtos codificados.

[0089] O termo com otimização de códon, em referência a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou regiões de codificação as moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.

[0090] O termo gene refere-se a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (sequências de não codificação 3') à sequência de codificação. Gene nativo refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Geme quimérico refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Gene endógeno refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene estranho refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos

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24/93 podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um transgene é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

[0091] O termo sequência de codificação refere-se a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Sequências reguladoras adequadas se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências de iniciação de tradução, local de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas de haste-laço.

[0092] O termo 'Operacionalmente ligado se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando o mesmo tem a capacidade de afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[0093] Os termos sequência reguladora ou sequência de controle são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, operadores e similares. Conforme indicado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas em orientação senso ou anPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 29/122

25/93 tissenso à sequência de codificação/gene de interesse.

[0094] Promotor ou sequências promotoras referem-se a sequências de DNA que definem onde a transcrição de um gene por RNA polimerase começa. As sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de iniciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas (promotores induzíveis).

[0095] As sequências de não codificação 3' referem-se a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de gene, tal como terminação de transcrição.

[0096] O termo transformação, como usado aqui, se refere à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente, ou pode integrar-se ao genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos transformados ou recombinantes ou transgênicos ou transformantes.

[0097] O termo recombinante, conforme usado no presente documento, refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de

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26/93 sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos recombinante, transgênico, transformado, geneticamente modificado ou modificado para expressão de gene exógena são usados indistintamente no presente documento.

[0098] Os termos construto recombinante, construto de expressão, construto de expressão recombinante e cassete de expressão são usados de forma intercambiável. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e codificantes que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, um construto pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, pode ser usado um vetor plasmidial. O indivíduo versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O indivíduo versado na técnica também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar

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27/93 em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411 a 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, dessa forma, que múltiplos eventos são tipicamente rastreados a fim de obter linhagens que exibam o padrão e nível de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada com o uso de ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), análise de imunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotípica.

[0099] Os termos hospedeiro de produção, hospedeiro e célula hospedeira são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humano ou não humano, em que um construto recombinante pode ser introduzido de modo estável ou temporário a fim de expressar um gene. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não seja idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem durante a propagação.

[00100] O termo porcentagem de identidade é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado através da comparação de sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. Identidade e similaridade podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press,

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NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

[00101] Conforme usado no presente documento,% de identidade ou porcentagem de identidade ou PID refere-se à identidade de sequência de proteínas. A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sei EUA, 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para sequências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, não correspondência = □3); Abertura de Lacuna = 5; e Extensão de Lacuna = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de lacuna= 11; e Extensão de lacuna = 1. Um valor de percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da

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29/93 sequência de referência que inclui quaisquer lacunas criadas pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Os algoritmos BLAST referem-se à sequência de referência como a sequência de consulta. [00102] Conforme usado no presente documento, proteínas homólogas ou enzimas homólogas refere-se a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos. [00103] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de identidade percentual podem ser realizados com o uso do programa Megalign do suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl), o programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) ou o Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3.497 a 3.500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Os parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade

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30/93 por existência de GAP=15, extensão de GAP=0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína=4 e KTUPLE=1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WIND0W=5 e TOP DIAGONALS SAVED=5.

[00104] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeo e sequências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento como características de certos aspectos. As variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em certas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante em determinadas modalidades pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada, ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função da sequência revelada.

[00105] O termo variante, em relação a um polipeptídeo, refere-se a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selvagem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo vaPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 35/122

31/93 riante, em relação a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotideos de um polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptideo ou polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência será evidente a partir do contexto.

[00106] Os termos plasmídeo, vetor e cassete referem-se a um elemento extracromossômico que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fago ou nucleotideos, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotideos foram unidas ou recombinadas numa construção exclusiva que é capaz de introduzir um polinucleotídeo de interesse numa célula. Cassete de transformação refere-se a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Os termos cassete de expressão e vetor de expressão são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que permitem a expressão daquele gene em um hospedeiro.

[00107] O termo expressão, conforme usado no presente documento, refere-se à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. A expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptideo.

[00108] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do mRNA em um precursor ou proteína madura. Inibição antissenso refere-se à produção de transcritos de RNA de antissenso

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32/93 com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada. Cossupressão se refere à produção de transcritos de RNA senso com capacidade para suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (Patente U.S. N²5,231,020). Proteína madura se refere a um polipeptídeo processado por pós-tradução, isto é, um polipeptídeo a partir do qual quaisquer pré- ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos. Proteína precursora se refere ao produto primário da tradução de mRNA, isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- e pró-peptídeos podem ser, porém sem limitação, sinais de localização intracelulares. Transformação estável refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto organelares, resultando em herança geneticamente estável. Em contraste, transformação temporária se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados de organismos transgênicos.

[00109] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para gePetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 37/122

33/93 nes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativo ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem ser assim derivadas.

[00110] Conforme usado no presente documento, proteínas homólogas ou enzimas homólogas se referem a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos. As sequências de aminoácidos podem ser inseridas em um programa como o conjunto de Vector NTI Advance e uma Guide Tree pode ser criada com o uso do método de Agrupamento de Vizinhos (NJ) (Saitou e Nei, Mol Biol Evol, 4:406 a 425, 1987). A construção da árvore pode ser calculada com o uso da correção de Kimura para a distância da sequência e ignorando as posições com lacunas. Um programa como AlignX pode exibir os valores de distância calculados entre parênteses a seguir ao nome da molécula exibido na árvore filogenética.

[00111] Compreendendo a homologia entre as moléculas pode revelar a história evolutiva das moléculas, bem como as informações sobre sua função; se uma proteína recentemente sequenciada for homóloga a uma proteína já caracterizada, há uma forte indicação da nova função bioquímica da proteína. A relação mais fundamental entre duas entidades é a homologia; diz-se que duas moléculas são homólogas

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34/93 se tiverem sido derivadas de um ancestral comum. As moléculas homólogas ou os homólogos podem ser divididos em duas classes, parálogos e ortólogos. Os parálogos são homólogos que estão presentes dentro de uma espécie. Os parálogos diferem frequentemente nas suas funções bioquímicas detalhadas. Os ortólogos são homólogos que estão presentes dentro de diferentes espécies e têm funções muito semelhantes ou idênticas. Uma superfamília de proteína é o maior agrupamento (ciado) de proteínas para os quais o ancestral comum pode ser inferido. Normalmente, esse ancestral comum se baseia no alinhamento de sequência e na similaridade mecânica. As superfamílias contêm, tipicamente, diversas famílias de proteína que mostram a similaridade de sequência na família. O termo clã de proteína é comumente usado para superfamílias de protease com base no sistema de classificação de protease MEROPS.

[00112] O algoritmo CLUSTAL W é um outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de sequência (Consultar, Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4.673 a 4.680, 1994). Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W incluem: Penalidade por abertura da lacuna = 10,0; Penalidade por extensão da lacuna = 0,05; Matriz de peso de proteína = série BLOSUM; Matriz de peso de DNA = IUB; % de sequências divergentes em atraso = 40; Distância de separação de lacuna = 8; Peso de transições de DNA = 0,50; Lista de resíduos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Uso de matriz negativa = DESATIVADO; Alternância de penalidades específicas de resíduo = ATIVADA; Alternância de penalidades hidrofílica = ATIVADA; e Alternância de penalidades de separação de lacuna final= DESATIVADA. Em algoritmos CLUSTAL, as deleções que ocorrem em qualquer terminal estão incluídas. Por exemplo, uma variante com uma deleção de cinco aminoácidos em qualquer terminal (ou dentro do polipeptídeo) de um polipeptídeo de 500 aminoácidos teria uma porcentagem de identidade de sequência

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35/93 de 99% (495/500 resíduos idêntico x 100) em relação ao polipeptídeo de referência. Tal variante seria abrangida por uma variante que tem pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo.

[00113] Conforme usado no presente documento, o termo ensaio funcional refere-se a um ensaio que fornece uma indicação de uma atividade de proteína. Em algumas modalidades, o termo refere-se a sistemas de ensaio em que uma proteína é analisada por sua habilidade para funcionar em sua capacidade normal. Por exemplo, no caso de uma alfa-L-fucosidase, um ensaio funcional pode envolver determinar a eficácia da alfa-L-fucosidase para hidrolisar um substrato de alfaL-fucosídeo.

[00114] Em uma modalidade, são reveladas alfa-fucosidases fúngicas inovadoras. Especificamente um polipeptídeo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase selecionado dentre o grupo que consiste em:

f) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci-

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36/93 dos madura prevista de pelo menos 71% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; e

[00115] Em uma segunda modalidade, é revelado um polipeptídeo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase que é compreendido dentro de uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; e SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20; e SEQ ID NO:21.

[00116] Glicoconjugados que contêm L-fucose são importantes para diversas atividades fisiológicas e patológicas, tal como inflamação, infecções bacterianas e virais, etc.

[00117] Os glicanos fucosilados são comuns dentro do trato gastrointestinal, onde são encontrados sobre as superfícies celulares e sobre mucinas. As mucinas são proteínas glicosiladas pesadas com alto peso molecular encontradas tanto associadas à membrana como em uma forma secretada.

[00118] A presença ou a ausência de receptores intestinais para F18 é geneticamente controlada. Foi demonstrado que a suscetibilidade à colonização por E.coli portadora de F18 em doença de edema é controlada por um alelo dominante e resistência por um alelo recessivo (Vogeli etal. (1996) Anim Genet. 27(5): 321 a 328).

[00119] O gene que controla a expressão do receptor F18 de E.coli mostrou estar ligado aos genes de alfa 1,2 L-fucosiltransferase 1 (FUT1). O gene FUT1 codifica galactosídeo 2-alfa-L-fucosiltransferase que modifica os terminais de glicano em que a adesão ocorre.

[00120] Os animais resistentes a ETEC mostraram níveis significativamente mais baixos da enzima FUT1 (Francis DH (2002) J Swine

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Health Prod. 10(4):171 a 175; Meijerink et al. (1997) Mammalian Genome 8:736 a 741). As fucosiltransferases mostraram estar envolvidas na fucosilação de epitélio intestinal e, além disso, o nível de fucosilação varia durante o desenvolvimento do animal (Torres-Pinedo and Mahmood (2004) Biochem Biophys Res Commun 125:546 a 553; Ruggiero-Lopez et al. (1991) Biochem J 279:801 a 806; Biol et al. (1987) Pediatr Res 22:250 a 256).

[00121] Os antigenos de grupo sanguíneo são marcadores de superfície em membranas de glóbulos vermelhos. Os mesmos são, de modo geral, definidos como moléculas formadas por adição sequencial de sacarídeos às cadeias laterais de carboidrato de lipídios e proteínas detectados em eritrócitos e certas células epiteliais, incluindo aquelas que forram os tratos gastrointestinal, urinário e respiratório.

[00122] Os antigenos de oligossacarídeo específicos ligam-se às proteínas e aos lipídios na superfície de eritrócitos. O oligossacarídeo mais básico ligado é chamado de antígeno O (também denominado o antígeno H). Os grupos sanguíneos humanos dependem do funcionamento de glicosiltransferases, enzimas que catalisam a formação de ligações glicosídicas entre monossacarídeos. Os antigenos de oligossacarídeo específicos ligam-se às proteínas e aos lipídios na superfície de eritrócitos.

[00123] Esse antígeno O (ou H) é o oligossacarídeo-base encontrado em todos os três tipos sanguíneos AB, A e B. O antígeno O está na forma (-Lipídio-Glicose-Galactose-/V-acetilglicosamina-Galactose-Fucose). O tipo sanguíneo O tem apenas o antígeno O ligado aos glóbulos vermelhos.

[00124] Concluiu-se que as alfa-1-2-fucosiltransferases são necessárias para a formação dos antigenos de grupo sanguíneo. O antígeno

O ou H é uma fucose, alfa-1,2-ligada a uma galactose. Em antigenos

A de grupo sanguíneo, uma GaINAc é adicionada à galactose no antíPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 42/122

38/93 geno H. Os antigenos H e A estão presentes em seres humanos e porcos.

[00125] O monossacarídeo imunodominante que determinar a especificidade de grupo sanguíneo A é uma /V-acetilgalactosamina alfa1,3-ligada terminal (GalNAc), enquanto o monossacarídeo correspondente de especificidade de grupo sanguíneo B é uma galactose alfa1,3-ligada (Gal). As células do grupo O carecem de ambos esses monossacarídeos nas terminações de suas cadeias de oligossacarídeo, que, em vez disso, são terminadas com resíduos de fucose alfa-1,2ligada (Fuc) e designadas o antígeno H.

[00126] Deve-se perceber que, embora mais bem conhecidos como antigenos sanguíneos, esses antigenos são expressos na maioria dos tecidos do corpo e em células epiteliais e endoteliais.

[00127] Os epítopos de trissacarídeo A e B são formados a partir do substrato de dissacarídeo H comum alfa-1,3-N-acetilgalactosiaminiltransferase (GTA) e alfa-galactosiltransferase (GTB). De modo contrário, a estratégia usada para conversão enzimática de antigenos do grupo sanguíneo A e B em H envolve exoglicosidases que hidrolisam especificamente a alfa-1,3-GalNAc (com o uso de uma alfa-N-acetilgalactosidase, A-zima) ou a alfa-1,3-galactose (com o uso de uma alfa-galactosidase, B-zima) para formar a estrutura H comum encontrada em RBCs O.

[00128] Conforme é demonstrado nos Exemplos abaixo, parece que a alfa-L-fucosidase tem capacidade para remover um resíduo de fucose de um trissacarídeo de antígeno H1, mas parece ter dificuldades de remover um resíduo de fucose de um tetrassacarídeo de antígeno A que pode ser possivelmente devido ao impedimento esférico. Entretanto, quando a alfa-L-fucosidase é combinada com uma enzima com capacidade para remover uma porção química que contém alfa-N-acetilgalactosilamina, então, a alfa-L-fucosidase pode remover a fucose de

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39/93 uma estrutura que contém glucano de antígeno A.

[00129] Pode ser também possível converter antígenos de grupo sanguíneo B em antígenos H com o uso de uma alfa-galactosidase. Os exemplos de tais enzimas com capacidade para remover uma porção química que contém alfa-N-acetilgalactosilamina de uma estrutura que contém glucano incluem, porém sem limitação, N-acetilgalactosaminidase.

[00130] A presente descrição também se refere a um método para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica e/ou diarréia são causadas por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das alfafucosidases fúngicas inovadoras reveladas no presente documento para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

[00131] Estão também dentro do escopo desta descrição composições para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica e/ou diarréia são causadas por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das alfa-fucosidases fúngicas inovadoras reveladas com capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-LPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 44/122

40/93 fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

[00132] Em todos os aspectos revelados no presente documento (ο método, a composição ou usos dos mesmos), uma alfa-L-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose aglutinado a alfa-1,2 terminal de uma estrutura que contém glicano sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para remover uma porção química que contém N-acetil-galactosilamina de uma estrutura que contém glicano. Isso é discutido adicionalmente nos Exemplos abaixo. [00133] Sem se ater à teoria, acredita-se que a hidrólise de fucose alfal ,2 ligada terminal impeça a adesão às células intestinais, por exemplo, como no caso de fimbria F18 expressa por ETEC.

[00134] Pode ser desejável modificar geneticamente a alfa-L-fucosidase de modo que a mesma seja estável em pH baixo e seja também estável à pepsina. Além disso, pode ser também desejável modificar geneticamente a alfa-L-fucosidase para ter uma especificidade de substrato mais ampla, por exemplo, para ter capacidade para ou aceitar antígenos de grupo sanguíneo A (e até mesmo B) como substrato. Em outras palavras, expandir a especificidade de substrato de modo que uma alfa-L-fucosidase modificada geneticamente tem capacidade para remover o resíduo de fucose de um tetrassacarídeo A sem a necessidade de adicionar uma alfa-N-acetilgalactosaminidase.

[00135] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de alfa-fucosidase fúngicos inovadores descritos no presente documento podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento de infecção patogênica e podem ser incorporados em composições profiláticas e/ou terapêuticas.

[00136] Homologia pode ser determinada por alinhamento de sequência de aminoácidos, por exemplo, com o uso de um programa como BLAST, ALIGN, ou CLUSTAL, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma enzima isolada, recombinante, substancialmente pura ou de ocorrência não

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41/93 natural que tem capacidade para remover, no mínimo, pelo menos uma porção química fucosila do sítio de aglutinação de patógeno. É possível que esse polipeptídeo possa remover uma porção maior do sítio de aglutinação de patógeno contanto que a pelo menos uma porção química fucosila seja também removida. De preferência, a enzima tem atividade de alfa-L-fucosidase ou catalisa a divagem de um grupo fucose alfa-1,2-ligado terminal de um polissacarídeo tal como um alfaL-fucosídeo.

[00137] Será evidente para a pessoa versada que as alfa-L-fucosidases de comprimento completo e/ou maduras, conforme descrito no presente documento, podem ser produzidas com o uso de qualquer técnica bem conhecida na técnica.

[00138] Em outro aspecto, qualquer ácido nucleico isolado, recombinante, substancialmente puro, sinteticamente derivado ou de ocorrência não natural que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer polipeptídeo (incluindo qualquer proteína de fusão, etc.) que tem capacidade para remover, no mínimo, pelo menos uma porção química fucosila do sítio de aglutinação de patógeno. É possível que esse polipeptídeo possa remover uma porção maior do sítio de aglutinação de patógeno contanto que a pelo menos uma porção química fucosila seja também removida.

[00139] É especificamente revelado no presente documento um construto recombinante que compreende uma sequência regulatória funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease selecionada dentre o grupo que consiste em:

b) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci-

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42/93 dos madura prevista de pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

[00140] É também revelado um hospedeiro de produção que pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

[00141] Além disso, é de interesse um método para produzir uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, conforme definido na reivindicação 3; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições através das quais a enzima que tem atividade de alfafucosidase é produzida.

[00142] A recuperação da alfa-fucosidase do hospedeiro de produção pode ser opcional.

[00143] Pode ser também mencionado um sobrenadante de cultura

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43/93 contendo alfa-fucosidase obtido por qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[00144] Além disso, um hospedeiro de produção microbiano recombinante para expressar uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase pode compreender o construto recombinante discutido no presente documento.

[00145] É também de interesse um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma glicose hidrolase, tal como uma enzima alfa-L-fucosidase enzima que hidrolisa uma porção química L-fucose de um alfa-1,2-L-fucosídeo.

[00146] Será evidente para a pessoa versada que o vetor pode ser qualquer vetor de expressão adequado e que a escolha de vetor pode variar dependendo do tipo de célula em que o vetor deve ser inserido. Os vetores adequados incluem pGAPT-PG, pRAX1, pGAMD, pGPTpyrG1, pC194, pJH101, pE194 e pHP13 (consultar Harwood e Cutting [eds.], Capítulo 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]). Consultar também Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, em Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], páginas 615 a 624), e p2JM103BBI.

[00147] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as rePetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 48/122

44/93 giões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativo ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem ser assim derivadas.

[00148] Os fragmentos de DNA que controlam a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeira de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.

[00149] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem ao longo de uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solvente. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e leveduras, podem adequadamente hospedar o vetor de expressão.

[00150] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse de modo que a mesma possa residir de modo intracelular, extracelular ou uma combinação de ambos dentro e fora das células. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.

[00151] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor, tal como um plasmídeo ou vírus, que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e levar à expressão da sequência de nucleotídeos. A escolha do vetor dependerá tipicaPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 49/122

45/93 mente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor replicante autonomamente, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido no hospedeiro de produção, seja integrado no genoma e replicado juntamente com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Os exemplos não limitantes de tais vetores são fornecidos no Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net»). Os exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396 a 428 e Patente n^ U.S. 5.874.276. Os vetores particularmente úteis incluem pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUClOO e pENTR/D. Os plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19 que permitem a replicação em E. coli e pE194, por exemplo, que permite a replicação em Bacillus.

[00152] Em suma, em relação à produção em células hospedeiras de produção, pode ser feita referência a Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) páginas 70 a 76 e 396 a 428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4:2.306 a 2.315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1.581 a 1.585; Finkelstein em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992),

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Chap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 a 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155 a 164; e Patente n^ U.S. 5.874.276. Uma lista de vetores adequados pode ser encontrada em Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www at fgsc.net). Os vetores adequados incluem aqueles obtidos junto à, por exemplo, Invitrogen Life Technologies e Promega. Vetores específicos adequados para uso em células hospedeiras fúngicas incluem vetores, tais como pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z e pGEM®4Z.

[00153] O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham, em conjunto, o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.

[00154] O vetor pode também conter um ou mais marcadores selecionáveis para permitir a seleção fácil das células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, cujo produto fornece resistência viral ou a biocida e similares. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência antimicrobiana. Os marcadores nutricionais também encontram uso na presente invenção, incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica, como amdS, argB e pyr4. Os marcadores úteis para a transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Finkelstein, capítulo 6, em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., EDS Butterworth-Heinemann, Boston MA (1992) e Kinghorn et al., (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres). Em algumas modalidades, os vetores de expressão também incluem um replicon, uma resistência a antibiótico de codificação de gene para permitir a seleção

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47/93 de bactérias que portam plasmídeos recombinantes, e sítios de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de sequências heterólogas. O gene de resistência antibiótica particular escolhido não é essencial; qualquer um dentre os muitos genes de resistência conhecidos na técnica é adequado. As sequências procarióticas são preferencialmente escolhidas de modo a não interferirem na replicação ou integração do DNA em Trichoderma reesei. [00155] O vetor pode também conter um elemento (ou elementos) que permita integração estável do vetor no genoma do hospedeiro produto ou replicação autônoma do vetor no hospedeiro de produção independente do genoma da célula. Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode basear-se na sequência de nucleotídeos que codifica a protease aspártica ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga.

[00156] Para replicação autônoma, o vetor pode, ainda, compreender uma origem de replicação que permite que o vetor replique autonomamente no hospedeiro de produção.

[00157] Mais de uma cópia da sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa-L-fucosidase pode ser inserido no hospedeiro de produção da alfa-L-fucosidase. Um aumento no número de cópias da sequência de nucleotídeos pode ser obtido integrando-se pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma do hospedeiro de produção ou incluindo-se um gene marcador selecionável amplificável e, assim, cópias adicionais da sequência de nucleotídeos podem ser selecionadas cultivando-se as células hospedeiras de produção na presença de um agente selecionável adequado.

[00158] Um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa-L-fucosidase é introduzido no hospedeiro de produção de modo que o vetor seja mantido como um integrante croPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 52/122

48/93 mossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante. A integração é, de modo geral, considerada como sendo uma vantagem visto que a sequência de nucleotídeos tem maior probabilidade se ser mantida estavelmente no hospedeiro de produção. A integração do vetor no cromossomo hospedeiro de produção pode ocorrer por recombinação homóloga ou não homóloga conforme foi discutido acima. [00159] Os vetores exemplificativos incluem, porém sem limitação, pGXT (igual ao vetor pTTTpyr2 conforme descrito no pedido publicado PCT WO2015/017256). Pode-se mencionar também os vetores de expressão bacterianos padrões que incluem bacteriófagos λ e M13, assim como plasmídeos, como plasmídeos com base em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, como MBP, GST e LacZ. As etiquetas de epítopo também podem ser adicionadas a proteínas recombinantes para fornecer métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc.

[00160] Os exemplos de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Bennett e Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press páginas 70 a 76 e páginas 396 a 428 e artigos mencionados nos mesmos; USP 5.874.276 e Fungal Genetic Stock Center Catalogue of Strains, (FGSC, www.fgsc.net.). Os vetores úteis podem ser obtidos junto à Promega e Invitrogen. Alguns vetores úteis específicos incluem pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pENTR™, pGEN®3Z e pGEN®4Z. Entretanto, outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que são ou se tornam conhecidos na técnica podem ser também usados. Assim, pode ser empregada uma ampla variedade de combinações de hospedeiros/vetores de expressão na expressão de sequências de DNA reveladas no presente documento. Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA sintético, não cromossômico e

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49/93 cromossômico tais como vários derivados conhecidos de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli, incluindo col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 e derivados dos mesmos, palsmídeos de gama de hospedeiro mais ampla, por exemplo, RP4, fago de DNA, por exemplo, os numerosos derivados de fago .lambda., por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos filamentosos de DNA de cadeia simples, plasmídeos de leveduras tais como o plasmídeo 2.mu ou derivados dos mesmos.

[00161] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qualquer microrganismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas. Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a alfa-L-fucosidase.

[00162] Os exemplos de hospedeiros de produção adequados incluem, porém sem limitação, células bacterianas, fúngicas, vegetais, etc. De preferência, o hospedeiro de produção pode ser selecionado dentre E. coli, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma (particularmente T. reesei), Bacillus, Lactobacillus, Aspergillus (particularmente A. niger), uma célula vegetal e/ou esporos de Bacillus, Trichoderma ou Aspergillus.

[00163] Em algumas modalidades, uma enzima alfa-L-fucosidase recombinante pode ser usada nos métodos e nas composições revelados no presente documento. Em um aspecto preferencial, é fornecido um aditivo de alimento ou ração que compreende uma enzima alfaL-fucosidase que tem capacidade para hidrolisar L-fucose a partir de uma alfa-L-fucosidase.

[00164] Muitos métodos de transformação padrão podem ser usados para produzir linhagens celulares de bactérias e fundos filamentosos (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam quantidades grandes da glicosídeo hidrolase desejada, tal como uma alfa-Lfucosidase. Alguns dos métodos publicados para a introdução de

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50/93 construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também USP 6.022.725; USP 6.268.328 e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brig id i, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

[00165] Entretanto, pode ser usado qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolística, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra). Também é de uso o método de transfecção mediada por Agrobacterium descrito na Patente n² U.S. 6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar

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51/93 o gene.

[00166] Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcricionais e/ou pós-traducionais. Um exemplo não limitative de uma modificação pós-transcrição e/ou pós-tradução é recorte ou truncamento de um polipeptideo. Por exemplo, isso pode resultar em tirar uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento, tal como uma alfa-L-fucosidase, de um estado inativo ou substancialmente inativo para um estado ativo como no caso de um pró-peptídeo que passa, ainda, por processamento pós-traducional em um peptídeo maduro que tem uma atividade enzimática. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tornar madura uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento, tal como um polipeptideo alfa-L-fucosidase, e remover, ainda, aminoácidos N ou Cterminais para gerar formas truncadas da alfa-L-fucosidase que mantém atividade enzimática.

[00167] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações póstranscricionais ou pós-traducionais que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.

[00168] Os métodos de transformação para Aspergillus e Tríchoderma são descritos, por exemplo, em Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1.470 a 1.474; Berka et al., (1991) em Applications of enzima Biotechnology, Eds. Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9:991 a 1.001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53 a 56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 a 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839 a 842; USP 6.022.725; USP 6.268.328 e EP 238 023. A expressão de proteína heteróloga em Tiichoderma é descrita nos documentos USP 6.022.725; USP 6.268.328;

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Harkki et ale (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227 a 233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596 a 603; documento EP 244.234; documento EP 215.594; e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes, em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148). Também é feita referência ao documento W096100787 e Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8.202 a 28.212 para transformação de cepas de Fusarium.

[00169] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras. Em alguns casos, a sequência promotora é o promotor de cbh1. Grandes bateladas de células transformadas podem ser cultivadas conforme descrito em llmen et al 1997 (Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Appl. Envir. Microbiol. 63:1.298 a 1.306).

[00170] A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. depende da concentração de íon de cálcio. Em geral, CaCI2 a cerca de 10 a 50 mM é usado em uma solução de absorção. Compostos adequados adicionais incluem um sistema de tamponamento, tais como tampão TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) ou MOPS 10 mM, pH 6,0 e polietileno glicol. Acredita-se que o polietileno glicol se funde a membranas celulares, permitindo, assim, que o conteúdo do meio seja entregue ao citoplasma da cepa de Trichoderma sp. Essa fusão deixa frequentemente múltiplas cópias do DNA de plasmídeo integradas no cromossomo hospedeiro.

[00171] Em geral, a transformação de Trichoderma sp. usa protoplastos ou células que foram submetidos a um tratamento de permeabilidade, tipicamente em uma densidade de 105 a 107/ml, particularPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 57/122

53/93 mente, 2x106/ml. Um volume de 100 μΙ desses protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo, sorbitol a 1,2 M e CaCI2 50 mM) pode ser misturado com o DNA desejado. Em geral, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos; entretanto, é útil adicionar cerca de 0,25 volume à suspensão de protoplastos. Aditivos, tais como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares, podem também ser adicionados à solução de absorção para facilitar a transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Consultar, por exemplo, a Patente n² U.S. 6.022.725.

[00172] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivo da célula hospedeira e obtenção da expressão de um polipeptideo de alfa-fucosidase. Meios e componentes de meio adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito em catálogos da American Type Culture Collection).

[00173] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica resultando na expressão da enzima de interesse. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo o cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batelada alimentada ou de estado sólido) em fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. O termo caldo de fermentação inteiro gasto é definido no presente documento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por

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54/93 exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo caldo de fermentação inteiro gasto também abrange biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[00174] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de uma alfa-glucosidase. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG ou soforose.

[00175] Polipeptídeos podem também ser produzidos de modo recombinante em um sistema isento de células in vitro, tal como o sistema de reticulócitos de coelho TNT™ (Promega). Um hospedeiro de expressão pode também ser cultivado no meio apropriado para o hospedeiro, sob condições aeróbicas. Sacudidela ou uma combinação de agitação e aeração pode ser fornecida, com a produção ocorrendo na temperatura apropriada para esse hospedeiro, por exemplo, de cerca de 25°C a cerca de 75°C (por exemplo, 30°C a 45°C), dependendo das necessidades do hospedeiro e da produção da alfa-glucosidase desejada. A cultura pode ocorrer de cerca de 12 a cerca de 100 horas ou mais (e qualquer valor de hora entre os mesmos, por exemplo, de 24 a 72 horas). Tipicamente, o caldo de cultura está a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 8,0, dependendo novamente das condições de cultura necessárias para o hospedeiro em relação à produção da enzima de interesse, tal como uma fucosidase. Desde a produção, hospedeiros e células transformadas podem ser cultivadas em meio de nutriente convencional. O meio de cultura para células hospedeiras apropriadas pode ser modificado conforme apropriado para ativar promotores e

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55/93 selecionar células transformadas. As condições de cultura específicas, tais como temperatura, pH e similares, podem ser aquelas que são usadas para a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados na técnica. Adicionalmente, as condições de cultura preferenciais podem ser encontradas na literatura científica, tal como Sambrook, (1982) supra' Kieser, T, MJ. Bibb, MJ. Buttner, KF Chafer e D.A. Hopwood (2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido; Harwood, et al., (1990) Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley e/ou da American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org).

[00176] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado para fermentar a cepa fúngica transformada ou derivada conforme descrito acima.

[00177] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado. Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.

[00178] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma batelada em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fermentação. Tipicamente, o metabolite e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática até uma fase logarítmica de crescimento elevado e finalmente até uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou retida. DeixaPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 60/122

56/93 das não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morreríam. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pelo volume de produção de produto. Uma variação adequada no sistema de batelada padrão é o sistema de fermentação em batelada alimentada. Nessa variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiría o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tal como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.

[00179] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para 0 processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam 0 crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam 0 crescimento podem ser alterados continuamente, embora a concentração celular, medida por turvação de meios, seja mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de estado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído

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57/93 deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00180] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de alfa-glucosidase da invenção.

[00181] Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução contendo enzima. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.

[00182] Pode ser, às vezes, desejável concentrar uma solução ou caldo que compreende um polipeptídeo de interesse para otimizar a recuperação. O uso de caldo ou soluções não concentradas aumentaria tipicamente o tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.

[00183] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os exemplos de métodos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.

[00184] Uma enzima alfa-L-fucosidase, conforme descrito no presente documento, pode ser testada quanto à atividade com o uso de

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58/93 uma variedade de testes conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade pode ser testada combinando-se a enzima com glicoproteína ou oligossacarídeo e água, conforme necessário. A atividade pode ser medida pela análise de produtos de reação que podem ser separados e visualizados, por exemplo, por cromatografia de camada fina ou espectrofotometria. Um exemplo de um ensaio espectrofotométrico de fucose é o kit Megazyme K-FUCOSE (Cao et al. (2014) J Biol Chem 289(37): 25.624 a 25.638.

[00185] O método revelado no presente documento compreende adicionalmente administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das alfa-L-fucosidases inovadoras reveladas no presente documento sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, tal como protease.

[00186] Além disso, a alfa-L-fucosidases revelada no presente documento, sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, pode ser encapsulada para uso em ração animal ou uma pré-mistura. Adicionalmente, qualquer uma dessas alfa-Lfucosidases, sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, seja encapsulada ou não, pode estar na forma de um grânulo.

[00187] Acredita-se que a enzima alfa-L-fucosidase, conforme desPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 63/122

59/93 crito no presente documento, pode ser usada em combinação com uma ou mais enzimas adicionais. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas a partir do grupo que consiste naquelas envolvidas na degradação de proteína incluindo carboxipeptidases, de preferência, carboxipeptidase A, carboxipeptidase Y, ácido aspártico proteases de A. niger de PEPAa, PEPAb, PEPAc e PEPAd, elastase, amino peptidases, pepsina ou semelhante à pepsina, tripsina ou proteases semelhantes à tripsina, proteases fúngicas ácidas e proteases bacterianas incluindo subtilisina e suas variantes e naquelas envolvidas em metabolismo de amido, degradação de fibra, metabolismo de lipídio, proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo de glicogênio, enzimas que degradam outros contaminantes, acetil esterases, amilases, arabinases, arabinofuranosidases, exo e endo-peptidases, catalases, celulases, quitinases, quimosina, cutinase, desoxirribonucleases, epimerases, esterases, formamidase, galactosidases, por exemplo, α ou β-galactosidases, exo-glucanases, glucano liases, endo-glucanases, glucoamilases, glicose oxidases, glucosidases, por exemplo, α ou β-glucosidases, glucuronidases, hemicelulases, hidrolases, invertases, isomerases, lacases, fend oxidases, lipase, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectinase, pectato liases, pectina acetil esterases, pectina despolimerases, peptidase, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitase, poligalacturonases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (D-hexose: (3/4-oxidorredutase, EC 1.1.3.5), fosfatases ácidas e/ou outras ou combinações das mesmas. As mesmas incluem enzimas que, por exemplo, modulam a viscosidade da composição ou ração.

[00188] Além disso, as alfa-L-fucosidases sozinhas ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta

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60/93 ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, podem ser encapsuladas de modo a suportar o pH ácido encontrado no estômago. [00189] Tais alfa-L-fucosidases sozinhas ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima tal como uma protease, sejam encapsuladas ou não, podem ser administrada em uma ração animal ou uma prémistura.

[00190] Além disso, a administração de alfa-L-fucosidases sozinhas ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, tal como uma protease, sejam encapsuladas ou não, em uma ração animal ou pré-mistura e a alfa-fucosidase pode estar na forma de um grânulo ou líquido. A forma preferencial é um grânulo.

[00191] Estão também incluídas no escopo desta descrição composições para prevenir e/ou tratar um animal que tem uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica é causada por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos um estrutura de glicano substituída por pelo menos uma alfa-1,2-L qualquer uma das alfa-fucosidases inovadoras reveladas no presente documento, que têm capacidade de remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno. [00192] Conforme notado acima, uma alfa-L-fucosidase deve ter a

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61/93 capacidade de remover um grupo fucose aglutinado a alfa-1,2 terminal de uma estrutura que contém glicano ou sozinha ou em combinação com uma enzima com capacidade para remover uma porção química que contém N-acetil-galactosilamina de uma estrutura que contém glicano. Preferencialmente, a alfa-L-fucosidase é selecionada dentre o grupo que consiste na família glicosídeo hidrolase 95 (GH95).

[00193] Essa composição pode ser usada para prevenir e/ou tratar qualquer infecção patogênica intestinal conforme foi discutido acima. Um patógeno de interesse é Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

[00194] Fica evidente a partir da discussão supracitada que a composição pode compreender adicionalmente pelo menos um produto microbiano alimentado diretamente ou sozinho ou em combinação com pelo menos uma protease.

[00195] As rações animais podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetais para aves, porcos, ruminantes, aquicultura e animais de estimação. É contemplado que os parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingesta de ração e eficácia de ração, mas também uniformidade aprimorada, concentração de amônia reduzida no alojamento de animais e, consequentemente, bem-estar e situação de saúde dos animais aprimorados, serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, o desempenho do animal pode ser determinado pela eficácia de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de ração e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digestível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade de animais de evitar os efeitos negativos da entente necrótica e/ou pela resposta imunolóPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 66/122

62/93 gica do sujeito.

[00196] Os termos ração animal, ração, gênero alimentício e forragem são usados de modo intercambiável e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[00197] Quando usada como, ou na preparação de uma ração, tal como ração funcional, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada em conjunção com um ou mais dentre: um transportador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, poderia ser mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de

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63/93 magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[00198] Em uma modalidade preferencial, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar um gênero alimentício. O termo componente de ração, conforme usado no presente documento, significa todo o ou parte do gênero alimentício. Parte do gênero alimentício pode significar um constituinte do gênero alimentício ou mais do que um constituinte do alimento para animais, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo componente de ração engloba uma prémistura ou constituintes de pré-mistura. Preferencialmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma sua pré-mistura, uma ração de composto ou uma sua pré-mistura. A composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma ração de composto, um componente de ração de composto ou com uma prémistura de uma ração de composto ou com uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00199] Qualquer gênero alimentício descrito no presente documento pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmida (particularmente, torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria à base de milho (cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol,

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64/93 amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00200] O termo forragem conforme usado no presente documento significa qualquer alimento que seja proporcionado a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por si próprio). A forragem engloba plantas que foram cortadas. Ademais, forragem inclui silagem, alimentações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e grãos germinados e legumes.

[00201] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas dentre: milho (mais) alfafa (luzerna), cevada, comichão, brássicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, festuca, bromus, painço, aveia, sorgo, sojas, árvores (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legumes.

[00202] O termo ração de composto significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. As rações de composto podem ser mescladas a partir de várias matériasprimas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal-alvo.

[00203] As rações de composto podem ser rações completas que fornecem todos os nutrientes diários necessários, concentrados que fornecem uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que fornecem somente micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.

[00204] Os principais ingredientes usados em ração de composto são os grãos de ração que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.

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65/93 [00205] Adequadamente, uma pré-mistura denominada aqui pode ser uma composição composta por microingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são normalmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.

[00206] Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00207] Em uma modalidade, o componente de ração pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00208] Um gênero alimentício descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00209] Por exemplo, um gênero alimentício pode conter entre cerca de 5 a cerca de 40% de DDGS de milho. Para aves, o gênero alimentício pode conter, em média, entre cerca de 7 a 15% de DDGS de milho. Para suínos (porcos), o gênero alimentício pode conter, em média, 5 a 40% de DDGS de milho. O mesmo pode conter milho como um único grão, em tal caso, o gênero alimentício pode compreender entre cerca de 35% a cerca de 80% de milho.

[00210] Nos gêneros alimentícios que compreendem grãos misturados, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, o gênero alimentício pode compreender pelo menos 10% de milho.

[00211] Adicional ou alternativamente, um gênero alimentício ode também compreender pelo menos um material de ração com alto teor

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66/93 de fibra e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibra para fornecer um gênero alimentício com alto teor de fibra. Os exemplos de materiais de ração com alto teor de fibra incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, ração de milho com glúten, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, favas e algodão. Em um aspecto, o gênero alimentício conforme descrito no presente documento compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente cDDGS, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), particularmente cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, o gênero alimentício da presente invenção compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.

[00212] A ração pode ser um ou mais dos seguintes: uma ração de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 71/122

67/93 agem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[00213] O termo ração conforme usado no presente documento engloba, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[00214] A ração animal pode também incluir um alimento para peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutrientes, elementos vestigiais e vitaminas necessários para manter o peixe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais se afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixe maior ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns alimentos para peixes também contêm aditivos, como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor de peixe ornamental.

[00215] Em ainda outro aspecto, a ração de animal engloba alimento para pássaros. O alimento para pássaros inclui alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).

[00216] Conforme usado no presente documento, o termo colocado em contato refere-se à aplicação indireta ou direta de uma alfa-Lfucosidase ou uma composição que compreende uma alfa-Lfucosidase) a um produto (por exemplo, a ração). Os exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material que compreende a comPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 72/122

68/93 posição de aditivo de ração, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, pulverização da composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é preferencialmente misturada com o produto (por exemplo, gênero alimentício). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de um gênero alimentício. Isto permite que a composição confira um benefício de desempenho.

[00217] O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 98% da enzima que está presente/ativo no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada está ainda presente/ativo após resfriar até a temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% da enzima que está presente e ativa no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada está ainda presente e ativa após resfriar até a temperatura ambiente.

[00218] É também possível que as alfa-L-fucosidases (ou uma composição que compreende alfa-L-fucosidases) descritas no presente documento sejam homogeneizadas para produzir um pó.

[00219] Em uma modalidade preferencial alternativa, uma alfa-Lfucosidase (ou composição que compreende uma alfa-L-fucosidase) pode ser formulada em grânulos conforme descrito no documento n²W02007/044968 (denominados grânulos TPT) ou documentos n²W01997/016076 ou W01992/012645 incorporados no presente documento a título de referência. TPT significa Tecnologia de Proteção Térmica.

[00220] Em outro aspecto, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem

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69/93 de tal revestimento de sal é termotolerância melhorada, estabilidade no armazenamento melhorada e proteção contra outros aditivos de ração tendo de outro modo efeito adverso na enzima. Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água maior do que 0,25 ou umidade constante maior do que 60% a 20°C. Em algumas modalidades, o revestimento de sal compreende Na2SO4.

[00221] Um método para preparar um alfa-L-fucosidase (ou composição que compreende uma alfa-L-fucosidase) pode também compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura compreendendo o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.

[00222] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100°C, temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será compreender que uma alfa-L-fucosidase (ou composição que compreende uma alfaL-fucosidase) descrita no presente documento é adequada para adição a qualquer material de ração adequado.

[00223] Será entendido pela pessoa versada que diferentes animais exigem diferentes gêneros alimentícios, e mesmo o mesmo animal pode exigir diferentes gêneros alimentícios, dependendo do propósito

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70/93 para o qual o animal é criado.

[00224] Opcionalmente, o gênero alimentício pode também conter minerais adicionais tais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, o gênero alimentício é uma mistura de farinha de milho e soja.

[00225] O gênero alimentício é tipicamente produzido em moinhos de ração nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar trituradas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. O gênero alimentício pode ser depois produzido como um mingau ou péletes; estes últimos envolvem tipicamente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um nível-alvo e depois a ração é passada através de uma fieira para produzir péletes de um tamanho particular. É permitido que os péletes resfriem. Subsequentemente, podem ser adicionados aditivos líquidos, tais como gordura e enzima. A produção de gênero alimentício pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização - em particular por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00226] O gênero alimentício pode ser um gênero alimentício para um animal monogástrico, tal como aves (por exemplo, frango de corte, poedeira, reprodutores de frangos de corte, peru, pato, ganso, galinha d'água) e suínos (todas as categorias de idade), um ruminante, tal como gado (por exemplo, vacas ou touros (incluindo bezerros)), cavalos, ovelha, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixes (por exemplo, peixe agástrico, peixe gástrico, peixe de água doce, tais como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa koi, peixe marinho, tal como badejo, e crustáceos, tais como camarões, mexilhões e vieiras). Preferencialmente, o gênero alimentício é para porcos.

[00227] A composição de aditivo de ração e/ou o gênero alimentício

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71/93 que compreende a mesma podem ser usados em qualquer forma adequada. A composição de aditivo de ração pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou suas alternativas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolo alimentar, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.

[00228] Em algumas aplicações, as composições de aditivo de ração podem ser misturadas com a ração ou administradas na água potável.

[00229] Uma composição de aditivo de ração que compreende misturar por adição uma fucosidase conforme ensinado no presente documento com um carreador diluente ou excipiente aceitável de ração e (opcionalmente) embalar.

[00230] O gênero alimentício e/ou a composição de aditivo de ração podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. As composições assim derivadas podem ser referidas no presente documento como uma pré-mistura. O gênero alimentício pode compreender pelo menos 0,0001% em peso do aditivo de ração. Adequadamente, o gênero alimentício pode compreender pelo menos 0,0005%; pelo menos 0,0010%; pelo menos 0,0020%; pelo menos

0,0025%; pelo menos 0,0050%; pelo menos 0,0100%; pelo menos

0,020%; pelo menos 0,100%; pelo menos 0,200%; pelo menos

0,250%; pelo menos 0,500% em peso do aditivo de ração.

[00231] Preferencialmente, um alimento ou composição de aditivo de ração pode compreender adicionalmente pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável. O carreador fisiologicamente aceitável é, de preferência, selecionado dentre pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente

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72/93 de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o alimento ou aditivo de ração pode compreender adicionalmente um quelador de íon de metal. O quelador de íon de metal pode ser selecionado dentre EDTA ou ácido cítrico.

[00232] Em algumas modalidades, o alimento ou composição de aditivo de ração compreende uma alfa-L-fucosidase a um nível de pelo menos 0,0001 g/kg, 0,001 g/kg, pelo menos 0,01 g/kg, pelo menos 0,1 g/kg, pelo menos 1 g/kg, pelo menos 5 g/kg, pelo menos 7,5 g/kg, pelo menos 10,0 g/kg, pelo menos 15,0 g/kg, pelo menos 20,0 g/kg, pelo menos 25,0 g/kg. Em algumas modalidades, o alimento ou aditivo de ração compreende a alfa-L-fucosidase a um nível de modo que, quando adicionado a um material de ração ou alimento, o material de ração compreenda a alfa-L-fucosidase em uma faixa de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 2 a 50 mg/kg ou 2 a 10 mg/kg. Em algumas modalidades da presente invenção, o material de alimento ou ração compreende pelo menos 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 500000, 1000000 ou 2000000 unidades de uma alfaL-fucosidase por quilograma de material de ração ou alimento. Em algumas modalidades, uma unidade de atividade de a-1,2-fucosidase pode ser definida como a quantidade de enzima que pode catalisar a liberação de um pmol de L-fucose por minuto de 2'-fucosil-lactose sob as condições de ensaio descritas no Exemplo 2.

[00233] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.

[00234] Formulações que compreendem qualquer uma das alfa-Lfucosidases e composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer modo para assegurar que a formulação compreende enzimas ativas. Tais formulações podem ser como um líquido, um pó seco ou um grânulo. Preferencialmente, a composição

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73/93 de aditivo de ração está em uma forma sólida adequada para adição a um pélete de ração.

[00235] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, secagem por pulverização em leito fluidizado.

[00236] Qualquer uma das alfa-L-fucosidases e composições descritas no presente documento podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do calor e pode ser considerado um termoprotetor. Em uma modalidade, o revestimento protege a enzima de baixo pH. Eudragit® é um exemplo de um material de revestimento que pode ser usado.

[00237] A composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser formulada em um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento n² W02007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência).

[00238] Em uma modalidade, a ração animal pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dentre a) um processo de peletização de ração, b) um processo de pré-tratamento de ração aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e

e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado dentre minerais vestigiais, ácidos orgânicos,

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74/93 açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de ração ou mistura de base de ração ácida ou básica.

[00239] Em relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro de leite e amido.

[00240] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração, e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C por até diversos minutos, tal como entre 85°C e 95°C.

[00241] A composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração animal que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira de umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade de água menor do que 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.

[00242] O grânulo pode ter um revestimento de barreira de umidificação selecionado dentre polímeros e gomas, e o material de hidrataPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 79/122

75/93 ção por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 45% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[00243] Um grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85 °C e 95 °C por até diversos minutos.

[00244] Alternativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal consumo de líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00245] Também, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo. [00246] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como uma pré-mistura. A título de exemplo apenas, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[00247] Em uma modalidade, pelo menos um DFM e/ou glicosídeo hidrolase, tal como uma alfa-L-fucosidase (encapsulada u não) e/ou pelo menos uma protease são formulados com pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável selecionado a partir de pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propileno glicol, 1,3propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formato e suas misturas.

[00248] Em algumas modalidades, uma alfa-L-fucosidase estará em um carreador fisiologicamente aceitável. Os carreadores adequados podem ser grandes macromoléculas lentamente metabolizadas, tais

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76/93 como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoates. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter, adicionalmente, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais transportadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao sujeito. Os sujeitos a serem tratados podem ser animais. Entretanto, em uma ou mais modalidades, as composições são adaptadas para administração a sujeitos humanos.

[00249] Os exemplos não limitantes das composições e métodos revelados no presente documento incluem:

1. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase selecionado dentre o grupo que consiste em:

c) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 75% de identidade com a sequência

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77/93 de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

2. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de alfafucosidase que é compreendido dentro de uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; e SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NQ:20; e SEQ ID NO:21.

3. Um construto recombinante que compreende uma sequência regulatória funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa-fucosidase selecionada dentre o grupo que consiste em

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78/93 de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

4. Um hospedeiro de produção, de acordo com a modalidade 3, em que o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

5. Um método para produzir uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante da modalidade 3; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições através das quais a enzima que tem atividade de alfa-fucosidase é produzida.

6. Um método da modalidade 5, em que a alfa-fucosidase é opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.

7. Um sobrenadante de cultura contendo alfa-fucosidase obtido pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades 5 ou 6.

8. Um hospedeiro de produção microbiana recombinante para expressar uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase,

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79/93 sendo que o dito hospedeiro de produção microbiana recombinante compreende o construto recombinante da modalidade 3.

9. Ração animal que compreende qualquer um dos polipeptídeos alfa-fucosidase da modalidade 1 ou 2, em que a alfa-fucosidase está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/toneladas de ração.

10. A ração animal da modalidade 9, que compreende adicionalmente: (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

11. Uma ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura que compreende qualquer um dos polipeptídeos de alfa-fucosidase da modalidade 1 ou 2.

12. A ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura modalidade 11, que compreende, ainda: (a) pelo menos uma outra enzima ou (b) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (c) pelo menos uma outra enzima e pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

13. A composição de aditivo de ração das modalidades 11 ou 12, em que a dita composição compreende adicionalmente pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

14. Uma composição de aditivo de ração granulada para

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80/93 uso em ração de animal que compreende o polipeptídeo de alfafucosidase das modalidades 1 ou 2, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por pulverização, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima.

15. A composição de aditivo de ração granulada da modalidade 14, em que o diâmetro médio das partículas é maior do que 50 microns e menor do que 2.000 microns.

16. A composição de aditivo de ração da modalidade 15, em que a dita composição é em uma forma líquida.

17. A composição de aditivo de ração da modalidade 16, em que a dita composição é em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração.

18. Um método para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica e/ou diarréia são causadas por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das alfa-fucosidases da reivindicação 1, em que a dita alfa-fucosidase tem capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

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19. O método da modalidade 18, em que a alfa-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose alfa-1,2-ligado terminal de uma estrutura contendo glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A em um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B em antígeno sanguíneo de grupo Η.

20. O método da modalidade 18 ou 19, em que o patógeno é Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

21. O método da modalidade 18 ou 19, em que o método compreende adicionalmente administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima.

22. O método da modalidade 21, em que a alfa-fucosidase é administrada a um animal como ração ou pré-mistura.

23. O método das modalidades 21 ou 22, em que a alfafucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima é administrada na forma de um grânulo.

24. Uma composição para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, em que a infecção patogênica é causada por um patógeno com capacidade para se aglutinar à célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que com-

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82/93 preende administrar ao animal uma quantidade eficaz da alfa-fucosidase da modalidade 1, com capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose do sítio de aglutinação de patógeno.

25. A composição da modalidade 24, em que a alfa-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose alfa-1,2-ligado terminal de uma estrutura contendo glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A em um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B em antígeno sanguíneo de grupo H.

26. A composição, de acordo com a reivindicação 25, em que o patógeno é Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

27. A composição da modalidade 25 ou 26, em que a dita composição compreende adicionalmente: (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima.

28. A composição da modalidade 27, em que a alfa-fucosidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima é encapsulada.

29. A composição da modalidade 28, em que a alfa-fucosidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, encapsulada ou não, é administrada a um animal como uma ração ou uma pré-mistura.

30. A composição da modalidade 29, em que a alfa-fuco-

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83/93 sidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, encapsulada ou não, é administrada em uma forma de grânulo.

EXEMPLOS [00250] A menos que seja definido de outro modo aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2^a ED., John Wiley and Sons, Nova lorque (1994) e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionam a uma pessoa versada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[00251] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a mesma para vários usos e condições. Métodos Gerais [00252] As técnicas de clonagem de DNA e molecular padrão são bem conhecidas na técnica e são descritas por Sambrook, J. e Russell, D., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M. et. al., Short Protocols in MolecuPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 88/122

84/93 lar Biology, 5^a edição. Current Protocols e John Wiley e Sons, Inc., N.Y., 2002.

EXEMPLO 1

Identificação, Clonagem e Expressão de Fucosidases Fúngicas [00253] A família GH95 (clarificação CaZy) de enzimas inclui as αL-fucosidases (E.C. 3.2.1.51) e as a-1,2-L-fucosidases (E.C. 3.2.1.33). As sequências de proteínas pertencentes à família GH95 foram extraídas de vários genomas fúngicos. A Tabela 1 fornece os nomes, organismo fonte e números SEQ ID para as sequências de nucleotídeos e polipeptídeos das enzimas fúngicas GH95 inovadoras identificadas.

Tabela 1: Lista de enzimas fucosidase fúngicas clonadas e expressas
ID da Amostra	Organismo Fonte	Sequência CDS SEQ ID NO	Polipeptídeo de comprimento completo SEQ ID NO	Proteína madura SEQ ID NO
CRC04259	Rasamsonia composticola	8	15	22
CRC06086	Trichoderma reesei QM6a	9	16	23
CRC06678	Chaetosartorya sp. N080	10	17	24
CRC06719	Penicillium sp. N085	11	18	25
CRC06800	Aspergillus sp. N092	12	19	26
CRC06807	Aspergillus sp. N092	13	20	27
CRC06852	Emericeíía niduíans var.lata NRRL200	14	21	28

[00254] Os genes que codificam as enzimas CRC04259 (SEQ ID NO: 1), CRC06086 (SEQ ID NO: 2), CRC06678 (SEQ ID NO: 3), CRC06719 (SEQ ID NO: 4), CRC06800 (SEQ ID NO: 5), CRC06807 (SEQ ID NO: 6), e CRC06852 (SEQ ID NO: 7) foram amplificados a partir de DNA genômico. Os genes amplificados foram inseridos em vetores pGXT (similar ao vetor pTTTpyr2 descrito no Pedido PCT publicado WO2015/017256) sob o controle do promotor de CBH1 (descrito no pedido PCT publicado WO2011/063308) e os peptídeos de sinalização nativos correspondentes foram usados para expressão de cada enzima.

[00255] Um mapa de plasmídeo de expressão exemplificativo (para

CRC04259) é mostrado na Figura 1. As sequências de codificação ou

CDS (éxons que codificam as enzimas deste estudo) são fornecidas conforme segue: CRC04259 (SEQ ID NO: 8), CRC06086 (SEQ ID NO:

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9), CRC06678 (SEQ ID NO: 10), CRC06719 (SEQ ID NO: 11), CRC06800 (SEQ ID NO: 12), CRC06807 (SEQ ID NO: 13), e CRC06852 (SEQ ID NO: 14).

[00256] Uma cepa de Trichoderma reesei adequada foi transformada com os plasmídeos de expressão (método descrito no pedido PCT publicado WO 05/001036) com o uso de transformação de protoplasto (Te'o et al. (2002) J. Microbiol. Methods 51:393 a 399). Os transformantes foram selecionados em um meio selecionado em um meio que contém acetamida como uma única fonte de nitrogênio. Após 5 dias de cultivo em placas de acetamida, transformantes foram coletados e submetidos à fermentação em frascos de agitação de 250 ml em mídias definidas que contêm uma mistura de glicose e soforose. O sobrenadante do caldo de fermentação foi coletado por filtração e foi submetido a SDS-PAGE para expressão. A expressão de fucosidase fúngica foi confirmada visualmente por SDS-PAGE de amostras de sobrenadante de cultura.

[00257] As sequências de polipeptídeos de comprimento completo para as enzimas deste estudo são fornecidas conforme segue: CRC04259 (SEQ ID NO: 15), CRC06086 (SEQ ID NO: 16), CRC06678 (SEQ ID NO: 17), CRC06719 (SEQ ID NO: 18), CRC06800 (SEQ ID NO: 19), CRC06807 (SEQ ID NO: 20), e CRC06852 (SEQ ID NO: 21). A sequência madura é prevista removendo-se o peptídeo de sinalização que foi previsto por SignalP 4.0. As sequências de polipeptídeos maduras previstas para as enzimas deste estudo são fornecidas conforme segue: CRC04259 (SEQ ID NO: 22), CRC06086 (SEQ ID NO: 23), CRC06678 (SEQ ID NO: 24), CRC06719 (SEQ ID NO: 25), CRC06800 (SEQ ID NO: 26), CRC06807 (SEQ ID NO: 27), e CRC06852 (SEQ ID NO: 28).

EXEMPLO 2

Caracterização bioquímica de fucosidases com o uso de substraPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 90/122

86/93 to de fucosil lactose

1. Ensaio para atividade de a-1,2-fucosidase em sobrenadantes de cultura brutos [00258] Para medir a atividade de a-1,2-fucosidase, sobrenadantes de cultura brutos de fucosidases CRC04259, CRC06086, CRC06678, CRC06719, CRC06800, CRC06807, CRC06852 foram avaliados a 37°C com o uso de 2'-fucosil-lactose 10 mM (Carbosynth, OF06739) como substrato.

[00259] As reações foram iniciadas adicionando-se 5 μΙ de sobrenadante de cultura contendo cada enzima até 45 μΙ de solução de substrato em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) ou em tampão NaOH-HEPES 50 mM (pH 8,2). Uma amostra de sobrenadante de cultura sem enzima foi avaliada sob as mesmas condições para servir como um controle branco. Após 10 min, a L-fucose liberada foi detectada com o uso do kit K-fucose (Megazyme, Irlanda). A atividade de fucosidase observada foi medida por absorbância a 340 nm, e os resultados (branco de enzima subtraído) em pH 5 e pH 8 é relatada na Figura 2.

2. Medição da atividade de a-1,2-fucosidase específica [00260] A atividade específica de fucosidases purificadas CRC04259, CRC06086, CRC06678, CRC06719, CRC06800,

CRC06807, CRC06852 foi medida com 2'-fucosil-lactose 10 mM. Antes da reação, as amostras de enzima foram preparadas com 6 diluições 2 vezes em série a partir de uma concentração adequada. As reações foram iniciadas adicionando-se 5 μΙ de amostra de enzima diluída ou água (controle branco) a 45 μΙ de solução de substrato em tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), seguido por incubação a 37°C por 10 min. A L-fucose liberada foi detectada com o uso do kit Kfucose. As curvas de resposta à dose foram geradas com alterações de absorbância como valores de Y e doses de enzima como valores

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87/93 de X, e a parte linear das curvas foi usada para cálculo de atividade específica das amostras de enzima purificadas. Uma unidade de atividade de a-1,2-fucosidase foi definida como a quantidade de enzima que pode catalisar a liberação de um pmol de L-fucose por minuto sob as condições de ensaio descritas. A atividade de a-1,2-fucosidase específica de fucosidases CRC04259, CRC06086, CRC06678, CRC06719,

CRC06800, CRC06807 e CRC06852 é fornecida na Tabela 2.

Tabela 2: Atividade específica de fucosidases medida com o uso de 2'fucosil-lactose como substrato.
Enzima	Atividade específica (U/mg)
CRC04259	1
CRC06086	26
CRC06678	56
CRC06719	15
CRC06800	62
CRC06807	22
CRC06852	52

EXEMPLO 3

Perfil de pH e Temperatura para fucosidases [00261] As fucosidases CRC06678, CRC06800 foram avaliadas para determinar seus perfis de pH e temperatura. Para determinar o pH ideal, a capacidade das a-1,2-fucosidases de hidrolisar 2'-fucosillactose a 37°C foi medida em tampão de acetato de sódio/HEPES/ Glicina a 50 mM com uma faixa de pH de 3,0 a 10,0. Para determinar a temperatura ideal, a capacidade das fucosidases para hidrolisar 2'fucosil-lactose foi medida em tampão fosfato de sódio 50 mM em intervalos de 10°C entre 30°C e 90°C. Todas as reações foram realizadas em duplicatas e foram executadas por 10 min. A Tabela 3 fornece o pH e a temperatura ideais, e as faixas em que a enzima manteve 70% de sua atividade máxima.

Tabela 3. Faixas e ideal de pH e temperatura de CRC06678 e CRC06800

Enzima	faixa de pH	ideal de pH	Faixa de T (°C)	Ideal de T (°C)
CRC06678	<3,0-6,6	4,0	55-85	80
CRC06800	<3,0-6,5	4,0-5,0	47-75	70

EXEMPLO 4

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Avaliação da capacidade de fucosidases para suportar estressores gástricos [00262] Para determinar a estabilidade sob condições de estresse gástrico (baixo pH e presença de pepsina), as amostras de fucosidases: CRC06086, CRC06678, CRC06719, CRC06800, CRC06807 e CRC06852 foram incubadas com pepsina (Sigma, Cat. P7000) em tampão Glicina-HCI a 50 mM (pH 3,5) ou tampão acetato de sódio a 50 mM (pH 5,0). Alíquotas de 100 ppm de enzima foram misturadas com pepsina em razões de 1:0, 1:2,5, 1:25 e 1:250 (entre fucosidase e pepsina) e as misturas de enzima foram incubadas a 37°C. Como controle, 100 ppm de fucosidase foram incubados sem pepsina em tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8) a 37°C e 4°C, respectivamente. Após uma incubação por 30 min, as amostras foram diluídas adequadamente e avaliadas com o uso de substrato de 2'-fucosil-lactose a 37°C em tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8). Água foi usada em vez de amostras de enzima como um controle branco. A atividade de a-1,2-fucosidase residual percentual foi calculada como OD340 Líquida (enzima incubada)/OD340 Líquida (enzima armazenada a 4°C) x 100. Todas as reações foram executadas em duplicata. A resistência à pepsina de CRC06086, CRC06678, CRC06719, CRC06800, CRC06807 e CRC06852 em pH 3,5 e pH 5 é ilustrada nas Figuras 3 e 4, respectivamente.

EXEMPLO 5

Avaliação de atividade de fucosidase em relação a vários substratos naturais [00263] A atividade enzimática de CRC04259, CRC06086, CRC06678, CRC06719, CRC06800, CRC06807 e CRC06852 foi avaliada em relação a dois substratos naturais: mucina gástrica porcina (tipo II) (Sigma, M2378) e trissacarídeo de antígeno H (tipo I) (Elicityl, GLY031-1). Duas concentrações de cada fucosidase (2 e 20 ppm) foPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 93/122

89/93 ram incubadas com 40 mg/ml de mucina gástrica porcina (tipo II) por 10 minutos a 37°C, pH 6,8, e a fucose liberada foi quantificada com o uso do kit K-fucose, conforme anteriormente descrito. Similarmente, 0,25 ppm e 1 ppm de cada fucosidase foram incubados com trissacarídeo de antígeno H (tipo I) 3 mM por 10 minutos a 37°C, pH 6,8, e a fucose liberada foi quantificada com o uso do kit K-fucose, conforme anteriormente descrito. Como controle, água foi usada em vez de enzima. O OD340 líquido de hidrólise de mucina gástrica porcina (tipo II) é mostrado na Figura 5 e o OD340 líquido da hidrólise de trissacarídeo de antígeno H (tipo I) é mostrado na Figura 6. CRC06086 não aparece na Figura 5 visto que não estava ativo em relação à mucina gástrica porcina.

EXEMPLO 6

Análise de Sequências de Fucosidases Fúngicas [00264] As sequências de proteínas relacionadas foram identificadas por uma pesquisa BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997) com o uso da sequência madura prevista de CRC04259 (SEQ ID NO: 22), CRC06086 (SEQ ID NO: 23), CRC06678 (SEQ ID NO: 24), CRC06719 (SEQ ID NO: 25), CRC06800 (SEQ ID NO: 26), CRC06807 (SEQ ID NO: 27), e CRC06852 (SEQ ID NO: 28) contra os bancos de dados de patente Genome Quest e Públicos com parâmetros de pesquisa ajustados em valores padrão e um subconjunto é mostrado nas Tabelas 4A e 4B (CRC04259); Tabelas 5A e 5B (CRC06086); Tabelas 6A e 6B (CRC06678); Tabelas 7A e 7B (CRC06719); Tabelas 8A e 8B (CRC06800); Tabelas 9A e 9B (CRC06807); e Tabelas 10A e 10B (CRC06852) respectivamente. A identidade percentual (PID) para ambos os conjuntos de pesquisa é definida como o número de resíduos idênticos divididos pelo número de resíduos alinhados no alinhamento de pares de sequências. Os valores identificados com Comprimento de sequência nas tabelas corPetição 870190099540, de 04/10/2019, pág. 94/122

90/93 respondem ao comprimento (em aminoácidos) para as proteínas denominadas com os números de acesso listados, enquanto Comprimento alinhado refere-se à sequência usada para alinhamento e cál culo de PID.

Tabela 4A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC04259 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
KKP06905.1	53	Trichoderma harzianum	789	756
KKP06841.1	49	Trichoderma harzianum	782	790
XP 681418,1	49	Aspergillus nidulans	809	788
KFH48941.1	49	Acremonium chrysogenum	819	787
XP 391692,1	47	Fusarium graminearum	798	774
KDQ52890.1	40	Jaapia argillacea	862	795

Tabela 4B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC04259 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2014202616-31814	92,3	Rasamsonia emersonii	776	777
WO2014202616-27905	92,3	Rasamsonia emersonii	807	777
WO2014138983-1456	88,5	Rasamsonia byssochlamydoides	810	771
WO2015048332-4759	63,1	Aspergillus niger	793	780
WO2010115156-15996	51,5	Muscodor strobelii	802	763
WO2013181760-2759	51,3	Aureobasidium pullulans	787	762
WO2014110675-0472	50,3	Amorphotheca resinae	800	778

Tabela 5A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06086 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
KKP06905.1	89	Trichoderma harzianum	789	771
KKP06841.1	55	Trichoderma harzianum	782	780
KFH48941.1	46	Acremonium chrysogenum	819	804
XP 681418,1	45	Aspergillus nidulans	809	799
XP 391692,1	43	Fusarium graminearum	798	790

Tabela 5B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína	madura prevista
CRC06086 identificada a	partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2014202616-31814	53,2	Rasamsonia emersonii	776	763
WO2014202616-27905	53,2	Rasamsonia emersonii	807	763
WO2014138983-1456	52,7	Rasamsonia byssochlamydoides	810	756
WO2015048332-4759	50,1	Aspergillus niger	793	760
WO2010115156-15996	48,5	Muscodor strobelii	802	767

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Tabela 6A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06678 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
XP 681418,1	52	Aspergillus nidulans	809	788
KKP06905.1	51	Trichoderma harzianum	789	753
KKP06841.1	51	Trichoderma harzianum	782	766
KFH48941.1	50	Acremonium chrysogenum	819	795
XP 391692,1	50	Fusarium graminearum	798	760

Tabela 6B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06678 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-4759	73,3	Aspergillus niger	793	771
WO2014202616-31814	64,4	Rasamsonia emersonii	776	777
WO2014202616-27905	64,4	Rasamsonia emersonii	807	777
WO2014138983-1456	64,1	Rasamsonia byssochlamydoides	810	769
WO2013181760-2759	53,2	Aureobasidium pullulans	787	767
WO2014110675-0472	53,0	Amorphotheca resinae	800	761
WO2010115156-15996	52,8	Muscodor strobelii	802	773
WO2015048332-5506	51,5	Aspergillus nidulans	809	788

Tabela 7A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06719 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
KFH48941.1	54	Acremonium chrysogenum	819	800
XP 681418,1	53	Aspergillus nidulans	809	796
XP 391692,1	52	Fusarium graminearum	798	781
KKP06905.1	46	Trichoderma harzianum	789	779
KKP06841.1	43	Trichoderma harzianum	782	787

Tabela 7B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06719 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
JP2005176602-?	69,8	Aspergillus oryzae	706	706
WO2015048332-4883	64,9	Aspergillus oryzae	723	769
WO2014110675-0472	55,4	Amorphotheca resinae	800	784
WO2010115156-15996	52,9	Muscodor strobelii	802	783
WO2015048332-5506	52,8	Aspergillus nidulans	809	796
WO2013181760-2759	52,6	Aureobasidium pullulans	787	782
WO2015048332-4759	50,1	Aspergillus niger	793	778

Tabela 8A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06800 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
KKP06841.1	50	Trichoderma harzianum	782	760
KKP06905.1	49	Trichoderma harzianum	789	754
XP 681418.1	50	Aspergillus nidulans	809	786
KFH48941.1	48	Acremonium chrysogenum	819	783
XP 391692.1	47	Fusarium graminearum	798	781

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92/93

Tabela 8B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06800 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-4759	94,7	Aspergillus niger	793	773
WO2014138983-1456	64,2	Rasamsonia byssochlamydoides	810	773
WO2014202616-31814	62,7	Rasamsonia emersonii	776	781
WO2014202616-27905	62,7	Rasamsonia emersonii	807	781
WO2014110675-0472	52,1	Amorphotheca resinae	800	775
WO2013181760-2759	52,0	Aureobasidium pullulans	787	762
WO2010115156-15996	51,6	Muscodor strobelii	802	761
WO2015048332-5506	50,6	Aspergillus nidulans	809	785

Tabela 9A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06807 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
XP 681418.1	51	Aspergillus nidulans	809	787
KFH48941.1	50	Acremonium chrysogenum	819	800
XP 391692.1	49	Fusarium graminearum	798	783
KKP06905.1	49	Trichoderma harzianum	789	771
KKP06841.1	48	Trichoderma harzianum	782	757

Tabela 9B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06807 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-4759	70,3	Aspergillus niger	793	772
WO2014138983-1456	61,0	Rasamsonia byssochlamydoides	810	772
WO2014202616-31814	60,9	Rasamsonia emersonii	776	778
WO2014202616-27905	60,9	Rasamsonia emersonii	807	778
WO2015048332-5506	52,3	Aspergillus nidulans	809	767
WO2013181760-2759	51,6	Aureobasidium pullulans	787	768
WO2014110675-0472	51,3	Amorphotheca resinae	800	762
WO2010115156-15996	51,9	Muscodor strobelii	802	775

Tabela 10A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06852 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI
n° de Acesso	PID	Organismo	Comprimento de Sequência	Comprimento de Alinhamento
XP 681418.1	96	Aspergillus nidulans	809	790
XP 391692.1	62	Fusarium graminearum	798	789
KFH48941.1	59	Acremonium chrysogenum	819	809
KKP06905.1	46	Trichoderma harzianum	789	780
KKP06841.1	44	Trichoderma harzianum	782	808

Tabela 10B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura prevista CRC06852 identificada a partir do banco de dados Genome Quest
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-5506	96,2	Aspergillus nidulans	809	790
WO2010115156-15996	60,9	Muscodor strobelii	802	792
WO2014110675-0472	54,1	Amorphotheca resinae	800	798
WO2013181760-2759	53,7	Aureobasidium pullulans	787	792
JP2005176602-?	52,0	ergillus oryzae	706	719
WO2014202616-31814	50,1	Rasamsonia emersonii	776	786
WO2014202616-27905	50,5	Rasamsonia emersonii	807	783
WO2015048332-4759	50,1	Aspergillus niger	793	789

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93/93 [00265] A sequência de aminoácidos para as proteínas maduras previstas: CRC04259 (SEQ ID NO: 22), CRC06086 (SEQ ID NO: 23), CRC06678 (SEQ ID NO: 24), CRC06719 (SEQ ID NO: 25), CRC06800 (SEQ ID NO: 26), CRC06807 (SEQ ID NO: 27), CRC06852 (SEQ ID NO: 28), e homólogos: KKP06905 (aa 19 a 789 da SEQ ID NO: 29), XP_681418 (aa 20 a 809 da SEQ ID NO: 30), WQ2015048332-4759 (aa 21 a 793 da SEQ ID NO: 31) e WQ2014202616-31814 (SEQ ID NO: 32) foram alinhadas com parâmetros padrão com o uso do programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1792-1797). O alinhamento de múltiplas sequências para as regiões sobrepostas é mostrado na Figura 7.

Claims

1. Polipeptideo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase selecionado dentre o grupo, caracterizado pelo fato de que consiste em:

a) um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos madura prevista de pelo menos 93% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

2. Polipeptideo isolado que tem atividade de alfa-fucosidase, caracterizado pelo fato de que é compreendido dentro de uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; e SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NQ:20; e SEQ ID

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2/8

N0:21.

3. Construto recombinante que compreende uma sequência regulatória funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma alfafucosidase selecionada dentre o grupo, caracterizado pelo fato de consiste em

4. Hospedeiro de produção, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato deque o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

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3/8

5. Método para produzir uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, como definido na reivindicação 3; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições através das quais a enzima que tem atividade de alfafucosidase é produzida.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a alfa-fucosidase é opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.

7. Sobrenadante de cultura, caracterizado pelo fato de que contém alfa-fucosidase obtida pelo método, como definido na reivindicação 5 ou 6.

8. Hospedeiro de produção microbiana recombinante para expressar uma enzima que tem atividade de alfa-fucosidase, caracterizado pelo fato de que o dito hospedeiro de produção microbiana recombinante compreende o construto recombinante, como definido na reivindicação 3.

9. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos polipeptídeos alfa-fucosidase, como definidos na reivindicação 1 ou 2, em que a alfa-fucosidase está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/toneladas de ração.

10. Ração animal, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: (a) pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos uma outra enzima quanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

11. Ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer um dos polipeptídeos de alfa-fucosidase, como definidos na

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4/8 reivindicação 1 ou 2.

12. Ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (a) pelo menos uma outra enzima ou (b) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (c) pelo menos uma outra enzima e pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

13. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende ainda pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

14. Composição de aditivo de ração granulada para uso em ração de animal, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de alfa-fucosidase, como definido na reivindicação 1 ou 2, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado a partir do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por pulverização, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima.

15. Composição de aditivo de ração granulada, de acordo

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5/8 com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas é maior do que 50 microns e menor do que 2.000 microns.

16. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita composição está em uma forma líquida.

17. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita composição está em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração.

18. Método para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, caracterizado pelo fato de que a infecção patogênica e/ou diarréia são causadas por um patógeno com capacidade para se aglutinar a uma célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa-1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de qualquer uma das alfa-fucosidases, como definidas na reivindicação 1, em que a dita alfa-fucosidase tem capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-Lfucose do sítio de aglutinação de patógeno.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a alfa-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose alfa-1,2-ligado terminal de uma estrutura contendo glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A em um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B em antígeno sanguíneo de grupo H.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, carac-

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6/8 terizado pelo fato de que o patógeno é Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao animal uma quantidade eficaz de uma alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a alfa-fucosidase é administrada a um animal como ração ou pré-mistura.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a alfa-fucosidase sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima é administrada na forma de um grânulo.

24. Composição para prevenir e/ou tratar um animal de modo que não tenha uma infecção patogênica intestinal e/ou diarréia, caracterizada pelo fato de que a infecção patogênica é causada por um patógeno com capacidade para se aglutinar à célula intestinal animal, em que a dita aglutinação do patógeno depende da presença de um sítio de aglutinação de patógeno que tem pelo menos uma estrutura de glicano substituída por pelo menos uma porção química de alfa1,2-L-fucose, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz da alfa-fucosidase, como definida na reivindicação 1, com capacidade para remover a pelo menos uma porção química de alfa-1,2-Lfucose do sítio de aglutinação de patógeno.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, carac-

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7/8 terizada pelo fato de que a alfa-fucosidase tem capacidade para remover um grupo fucose alfa-1,2-ligado terminal de uma estrutura contendo glicano, ou sozinho ou em combinação com uma enzima com capacidade para (a) converter um antígeno sanguíneo de grupo A em um antígeno sanguíneo de grupo H, ou (b) converter um antígeno sanguíneo de grupo B em antígeno sanguíneo de grupo H.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o patógeno é Escherichia coli que expressa fímbrias F18.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende ainda:

(a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um micro-organismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a alfa-fucosidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima é encapsulada.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a alfa-fucosidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, encapsulada ou não, é administrada a um animal como uma ração ou uma pré-mistura.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a alfa-fucosidase ou sozinha ou em combinação com (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou

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8/8 (b) pelo menos uma outra enzima ou (c) tanto pelo menos um microorganismo de alimentação direta quanto pelo menos uma outra enzima, encapsulada ou não, é administrada em uma forma de grânulo.