BR112019018969A2

BR112019018969A2 - serina proteases similar à tripsina e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112019018969A2
Application number: BR112019018969A
Authority: BR
Inventors: Yu Shukun; Shipovskov Stepan; Gu Xiaogang; Zou Zhengzheng
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2020-04-22
Also published as: CN110621777A; WO2018169784A1; MX2019010815A; EP3596210A1; WO2018169784A8; US20200015499A1

Abstract

a presente invenção refere-se à serina protease similar à tripsina e uso das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SERINA PROTEASES SEMELHANTES Â TRIPSINA E USOS DAS MESMAS. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido PCT/CN2017/076768, depositado em 15 de março de 2017, que está incorporado aqui a titulo de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA A TÍTULO DE REFERÊNCIA [0002] A listagem de sequência fornecida no arquivo nomeado NB40985WOPCT_SequenceListing_ST25 com um tamanho de 131 KB que foi criado em 8 de março de 2017 e que é depositado com o presente pedido, é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

CAMPO [0003] O campo refere-se a serina proteases semelhantes a tripsina inovadoras e usos das mesmas.

ANTECEDENTES [0004] Proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas que têm capacidade para clivar ligações peptídicas. Proteases evoluíram diversas vezes, e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação através de mecanismos catalíticos completamente diferentes. Proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, arquebactérias e vírus.

[0005] Proteólise pode ser alcançada por enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases (tais como, por exemplo, subtilisinas ou proteases semelhantes a tripsina), treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0006] Serina proteases são um subgrupo de carbonii hidrolases que compreendem uma classe diversa de enzimas que têm uma am

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2/139 pia faixa de especificidades e funções biológicas. Não obstante à essa diversidade de função, a maquinaria catalítica de serina proteases foi abordada por pelo menos duas famílias de enzimas geneticamente distintas: 1) as subtilisinas; e 2) serina proteases semelhantes a tripsina (também conhecidas como relacionadas a quimiotripslna). Essas duas famílias de serina proteases ou serina endopeptidases têm mecanismos catalíticos muito semelhantes. A estrutura terciária dessas duas famílias de enzima traz uma tríade catalítica conservada de aminoácldos que consiste em serina, histidina e aspartato.

[0007] Grande parte da pesquisa foi conduzida sobre as serina proteases, em particular, subtilisinas devido, em grande parte, à sua utilidade em aplicações industriais. Trabalho adicional esteve focado em condições ambientais adversas (por exemplo, exposição a agentes oxidantes, agentes quelante, extremos de temperatura e/ou pH) que podem impactar de maneira negativa na função dessas enzimas em uma variedade de aplicações.

[0008] Assim, há uma necessidade contínua em encontrar novas serina proteases, tais como proteases semelhantes a tripsina de origem procariótica que podem ser usadas sob condições adversas e podem reter ou ter estabilidade e/ou atividade proteolítica melhorada. SUMÁRIO [0009] Em uma primeira modalidade é descrito um polipeptídeo isolado, que tem atividade de serina protease, selecionado dentre o grupo que consiste em:

a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

b) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 94% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

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c) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.

[0010] Em uma segunda modalidade, é descrito um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease que compreende uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre: SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9; e SEQ ID NO:12.

[0011] Em uma terceira modalidade, é descrito um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease que compreende uma região catalítica de protease selecionada dentre:

a) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 96% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18;

b) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19;

c) uma sequência de aminoácidos da SEQ iD NO:20;

d) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21.

[0012] Em uma quarta modalidade, é descrito um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease selecionado dentre o grupo que consiste em:

a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de

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4/139 aminoácidos com pelo menos 94% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

c) um poiipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

d) um poiipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.

[0013] O hospedeiro de produção pode ser um hospedeiro selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

[0014] Em uma quinta modalidade, é descrito um método para produzir pelo menos uma serina protease que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante descrito no presente documento; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que o pelo menos um poiipeptídeo que tem atividade de serina protease seja produzido.

[0015] De acordo com esse método pelo menos um poiipeptídeo que tem serina protease é opcionalmente recuperado do hospedeiro de produção.

[0016] Em outro aspecto, um sobrenadante de cultura contendo serina protease pode ser obtido com o uso de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

Em ainda outro aspecto, o hospedeiro de produção microbiano recombinante para expressar pelo menos um poiipeptídeo que tem atividade de serina protease, compreende um construto recombinante conforme descrito no presente documento.

[0017] Ademais, o hospedeiro de produção é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos e algas.

[0018] Em uma sexta modalidade, é descrita uma ração para aniPetição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 29/171

5/139 mais que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease descrita no presente documento, em que a serina protease está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/ton de ração. [0019] Ademais, essa ração para animais pode compreender (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, ou b) pelo menos uma outra enzima, ou (c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[0020] Em uma sétima modalidade, é descrita uma ração, gênero alimentício, a composição de aditivo de ração ou pré-mistura que compreende pelo menos um dos polipeptídeos que têm atividade de serina protease descrita no presente documento. Ademais, essa ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou prémistura descrita no presente documento pode compreender (a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, ou b) pelo menos uma outra enzima, ou (c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.

[0021] Em uma sétima modalidade, há uma composição de aditivo de ração, conforme descrita no presente documento, em que a dita composição compreende, ainda, pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sa~ carose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[0022] Em uma oitava modalidade, é descrita uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração para animais que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina pro

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6/139 tease, conforme descrito no presente documento, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomizaçâo por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima.

[0023] Em outra modalidade, as partículas desta composição de aditivo de ração granulada podem ter um diâmetro médio maior que 50 microns e menor que 2.000 microns.

[0024] Em outro aspecto, essa composição de aditivo de ração pode estar em uma forma líquida e, ademais, está em uma forma líquida adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQUÊNCIAS

Figura 1. Plasmídeo AprE-SspCPro29 para expressão de AprE-SspCPro29 protease.

Figura 2. Respostas de dose de atividade enzimática de serina proteases SspCPro29, SspCPro33 e ProAct em substrato de AAPF-pNA.

Figura 3. Perfil de pH de serina proteases SspCPro23, SspCPro29, SspCPro33 e SspCPro59.

Figura 4. Perfil de temperatura de serina proteases SspCPro23, SspCPro29, SspCPro33 e SspCPro59.

Figura 5A. Hidrólise de farelo de soja de milho detectada por OPA para serina proteases SspCPro29 e SspCPro33 em pH 6.

Figura 5B. Hidrólise de farelo de soja de milho detectada por BCA para serina proteases SspCPro29 e SspCPro33 em pH 6.

Figura 6. Desempenho de limpeza de SspCPro29 e

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SspCPro33 proteases em detergente GSM-B ADW em pH 10,3,

Figura 7. Desempenho de limpeza de SspCPro29, SspCPro33 e ΒΡΝΎ217Ι. proteases em detergente de roupa líquido a 16°C.

Figura 8. Desempenho de limpeza de SspCPro29, SspCPro33 e BPN’Y217L proteases em detergente de roupa líquido a 32°C.

Figura 9. Desempenho de limpeza de SspCPro29, SspCPro33 e GG36 proteases em detergente de roupa em pó a 16°C.

Figura 10. Desempenho de limpeza de SspCPro29, SspCPro33 e GG36 proteases em detergente de roupa em pó a 32°C.

Figuras 11A a 11D. Alinhamento de múltiplas sequências de sequência de comprimento inteiro de várias serina proteases semelhantes a tripsina de Streptomyces sp.

Figuras 12A a 12B. Alinhamento de múltiplas sequências de sequências de núcleo catalítico previstas de serina proteases semelhantes a tripsina de Streptomyces sp.

[0025] As seguintes sequências cumprem com o Título 37, Seções 1.821 a 1.825 do C.F.R. (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules) e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) (2009) e as solicitações de listagem de sequência das Regras da Convenção Européia de Patente (EPC) e do Tratado de Cooperação em Matéria de Patente (PCT) 5.2 e 49.5(a-bis), e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e formato usados para dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras apresentadas no Título 37, seção 1.822 do C.F.R.

SEQ ID NO:1 apresenta a sequência de nucleotídeos do gene SspCPro29 isolado de Streptomyces sp. C009.

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SEQ ID N0:2 apresenta a sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro29.

SEQ ID NO:3 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro29.

SEQ ID NO:4 apresenta a sequência de nucleotídeos do gene SspCPro33 isolado de Streptomyces sp. C001.

SEQ ID NO:5 apresenta a sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro33.

SEQ ID NO:6 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro33.

SEQ ID NO:7 apresenta a sequência de nucleotídeos do gene SspCPro23 isolado de Streptomyces sp. C003.

SEQ ID NO:8 apresenta a sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro23.

SEQ ID NO:9 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro23.

SEQ ID NO: 10 apresenta a sequência de nucleotídeos do gene SspCPro59 isolado de Streptomyces sp. C055.

SEQ ID NO:11 apresenta a sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro59.

SEQ ID NO: 12 apresenta a sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro59.

SEQ ID NO: 13 apresenta de AprE-SspCPro23 sintético,

SEQ ID NO:

apresenta as as sequências sequências de de nucleotídeos nucleotídeos de AprE-SspCPro29_;

SEQ ID NO:

de AprE~SspCPro33,

SEQ ID NO:

de gene AprE-SspCPro59.

apresenta as sequências de nucleotídeos apresenta as sequências de nucleotídeos

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SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência sinal de AprE que foi usada para direcionar as proteínas recombinantes para secreção em B. subtilis.

SEQ ID NO: 18 apresenta o domínio catalítico previsto para SspCPro29.

SEQ ID NO: 19 apresenta o domínio catalítico previsto para SspCPro23.

SEQ ID NO: 20 apresenta o domínio catalítico previsto para SspCPro33.

SEQ ID NO: 21 apresenta o domínio catalítico previsto para

SspCPro59.

SEQ ID NO:22 apresenta a sequência de aminoácidos de comprimento inteiro prevista para SspCPro29.

SEQ ID NO:23 apresenta a sequência de aminoácidos de comprimento inteiro prevista para SspCPro33.

SEQ ID NO:24 apresenta a sequência de aminoácidos de comprimento inteiro prevista para SspCPro23.

SEQ ID NO:25 apresenta a sequência de aminoácidos de comprimento inteiro prevista para SspCPro59.

SEQ ID NO:26 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ364069271.

SEQ ID NO:27 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ343225562.

SEQ ID NO:28 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPj024756173.

SEQ ID NO:29 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WP_030548298.

SEQ ID NO:30 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ305320871.

SEQ ID NO:31 apresenta a sequência de serina protease

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10/139 de Streptomyces sp WPJ355639793.

SEQ ID NO:32 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WO2015048332-44360.

SEQ ID NO:33 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WO2015048332-44127.

SEQ ID NO:34 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ330313004.

SEQ ID NO:35 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ330212164.

SEQ ID NO:36 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WP_030749137.

SEQ ID NO:37 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WPJ331004112.

SEQ ID NO:38 apresenta a sequência de serina protease de Streptomyces sp WP_026277977.

SEQ ID NO:39 apresenta a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de Streptgrisin C.

SEQ ID NO:40 apresenta a sequência de aminoácidos de proteína BPN’-Y217L.

SEQ ID NO:41 apresenta a sequência de aminoácidos de proteína GG36.

SEQ ID NO:42 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 204 a 394 de S_albulus WP 064069271.

SEQ ID NO:43 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 204 a 394 de proteína S_sp_NRRL_F-5193_mWP_043225562.

SEQ ID NO:44 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 201 a 391 de S_exfoliatus_WP_024756173.

SEQ ID NO:45 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 207 a 397 de S_albusJ/VPJ)30548298.

SEQ ID NO:46 apresenta a sequência de aminoácidos de

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11/139 resíduos 204 a 394 de S_pristinaespiralis_WP_005320871.

SEQ ID NO:47 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 138 a 328 de SJeeuwenhoekiM/VP_029386953.

SEQ ID NO:48 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 207 a 397 de Streptomyces sp. CNT372J/VP_026277977.

SEQ ID NO:49 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 208 a 398 de Streptomyces cyaneognseus_PJ34438323Q.

SEQ ID NO:50 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 193 a 383 de Streptomyces n/vet/s_WP_069630550.

SEQ ID NO:51 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 201 a 391 de Streptomyces venezue/ae_WP_055639793.

SEQ ID NO:52 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 211 a 401 de Streptomyces sp. NRRL F5755J/VPJJ53699044

SEQ ID NO:53 apresenta a sequência de aminoácidos de resíduos 205 a 395 de Streptomyces frad/ae_WP__031135572.

SEQ ID NO 54 apresenta a sequência de consenso de domínio catalítico previsto da Figura 12.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0026] Todos os documentos de patente, pedidos de patente e publicações citados estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0027] Nesta descrição, diversos termos e abreviações são usados. As seguintes definições se aplicam a menos que seja especificamente afirmado de outra forma.

[0028] Os artigos um, uma, o e a que antecedem um elemento ou componente devem ser não restritivos com relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto um”, uma, o” e a” devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente

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12/139 também inclui o plural a menos que o número deva significar obviamente o singular.

[0029] O termo que compreende significa a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes afirmados conforme citado nas reivindicações, porém, esse não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo que compreende deve incluir modalidades englobadas pelos termos que consiste essencialmente em e que consiste em. De maneira similar, o termo que consiste essencialmente em deve incluir modalidades englobadas pelo termo que consiste em.

[0030] Quando presente, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de 1 a 5 é citada, a faixa citada deve ser interpretada incluindo faixas de 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 1 a 2 e 4 a 5, 1 a 3 e 5, e semelhantes.

[0031] Conforme usado no presente documento em conexão com um valor numérico, o termo cerca de se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja definido especificamente de outra forma no contexto. Por exemplo, a frase um valor de pH de cerca de 6 se refere aos valores de pH de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outra forma.

[0032] Se pretende que toda limitação numérica máxima dada ao longo deste relatório descritivo inclua toda limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores estivessem expressamente escritas no presente documento. Toda limitação numérica mínima dada ao longo deste relatório descritivo incluirá toda limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores estivessem expressamente escritas no presente documento. Toda faixa numérica dada ao longo deste relatório descritivo incluirá toda faixa numérica mais estreita que está dentro de tal faixa numérica mais ampla, como

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13/139 se tais faixas numéricas mais estreitas estivessem expressamente escritas no presente documento.

[0033] O termo protease significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um micro-organismo, por exemplo, um fungo, bactéria, ou de uma planta ou animal, e que tem a capacidade para catalisar divagem de ligações peptídicas em uma ou mais dentre várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exemplo, E.C. 3.4). Os termos protease, peptidase e proteinase podem ser usados de modo intercambiável. Proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, arquebactérias e vírus. Proteólise pode ser obtida através de enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos com base em seus mecanismos catalíticos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases semelhantes à tripsina, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0034] O termo serina protease se refere a enzimas que clivam ligações peptídicas em proteínas, em que a serina serve com o aminoácido nucleofílico no sítio ativo da enzima. Serina proteases estão em duas categorias amplas com base em sua estrutura: as semelhantes à quimiotripsina (semelhantes à tripsina) e as subtilisinas. No sistema de classificação de protease MEROPS, proteases são distribuídas entre 16 superfamílias e diversas famílias. A família S8 inclui as subtilisinas e a família S1 inclui as enzimas semelhantes a quimiotripsina (semelhantes a tripsina). A subfamília S1E inclui as serina proteases semelhantes a tripsina de organismos Streptomyces, tais como Estreptogricinas A, B e C. Os termos serina protease, serina protease semelhante a tripsina e protease semelhante a quimiotripsina são usados de modo Intercambiável no presente documento.

[0035] Os termos animal e indivíduo são usados de modo intercambiável no presente documento. Um animal inclui todos os animais não ruminantes (que incluem seres humanos) e ruminantes. Em uma

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14/139 modalidade particular, o animal é um animal não ruminante, tal como um cavalo e um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástricôs incluem, porém sem limitação, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves, tais como perus, patos, galinhas, frangos, aves de postura; peixe, tal como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos, tais como camarões. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante que inclui, porém sem limitação, gado, jovens bezerros, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervos, iaque, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antilooapra e nilgó.

[0036] Uma ração e um alimento, respectivamente, significam qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou semelhantes ou componentes de tais refeições destinadas ou adequadas para serem comidas, admitidas, digeridas, por um animal não humano e um ser humano, respectivamente.

[0037] Conforme usado no presente documento, o termo alimento é usado em um sentido amplo e cobre alimento e produtos de alimento para seres humanos, assim como alimento para animais não humanos (isto é, uma ração).

[0038] O termo ração é usado com referência a produtos que são alimentados aos animais na criação de pecuária. Os termos ração e ração para animais são usados de modo intercambiável.

[0039] O termo micro-organismo de alimentação direta (DFM) conforme usado no presente documento é fonte de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). Um DFM pode compreender um ou mais dentre tais micro-organismos de ocorrência natural, tal como cepas bacterianas. Categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias de Ácido Láctico e Leveduras. Assim, o termo DFM engloba uma ou mais dentre as seguintes: bactérias de alimentação direta, levedura de alimentação direta, levedura de alimentação direta e combinações das

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15/139 mesmas, [0040] Bacilli são hastes únicas gram positivas que formam esporos. Esses esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais, tais como calor, umidificação e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em dietas peletizadas e refeição. Bactérias de Ácido Láctico são cocci gram positivas que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Visto que Bactérias de Ácido Láctico parecem ser um pouco sensíveis ao calor, as mesmas não são usadas em dietas peletizadas. Tipos de Bactérias de Ácido Láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus.

[0041] O termo pré-biótico significa um não ingrediente de alimento digestivo que afeta de maneira benéfica o hospedeiro estimulando-se seletivamente o crescimento e/ou a atividade de uma ou um número limitado de bactérias benéficas.

[0042] O termo cultura probiótica conforme usado no presente documento define micro-organismos vivos (que incluem bactérias ou leveduras, por exemplo) que, quando, por exemplo, ingeridos ou aplicados de maneira local em quantidades suficientes, afeta de maneira benéfica o organismo hospedeiro, isto é, conferindo-se um ou mais benefícios para a saúde demonstráveis no organismo hospedeiro. Probióticos podem melhorar o saldo microbiano em uma ou mais superfícies da mucosa. Por exemplo, a superfície da mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo probiótico conforme usado no presente documento também engloba micro-organismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imunológico e ao mesmo tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície da mucosa, por exemplo, o intestino. Enquanto não há nenhum limite inferior ou superior para ingestão probiótica, sugere-se que pelo menos 10⁶ a 10¹², preferencialmente pelo me

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16/139 nos 10⁶ a 1O¹⁰, preferencialmente 10⁸ a 10⁹ de ufc como uma dose diária seja eficaz para obter os efeitos benéficos de saúde em um indivíduo.

[0043] O termo UFC conforme usado no presente documento significa unidades formadoras de colônia e é uma medida de células viáveis em que uma colônia representa um agregado de células derivadas de uma única célula progenitora.

[0044] O termo isolado significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos sem limitação de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, porém sem limitação, qualquer céiula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com o qual está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem com relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quantidade da substância com relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada. Os termos moiécula de ácido nucleico isolado, polinucleotídeo isolado e fragmento de ácido nucleico isolado serão usados de modo intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita única ou dupla que contém, opcionalmente, bases de nucleotídeo sintéticas, não-naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0045] O termo purificado conforme aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos denota, de modo geral, um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente isento de outros componentes, conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na arte (por

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17/139 exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugação de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que gera essencialmente uma banda em um gel eletroforético é purificado. Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso sobre uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo enriquecido se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que está presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que é superior a uma composição de partida.

[0046] Conforme usado no presente documento, o termo ensaio funcional se refere a um ensaio que fornece uma indicação de uma atividade da proteína. Em algumas modalidades, o termo se refere a sistemas de ensaio nos quais uma proteína é analisada por sua capacidade para funcionar em sua capacidade normal. Por exemplo, no caso de uma protease, um ensaio funcional envolve determinar a eficácia da protease em hidrolisar um substrato proteináceo.

[0047] Os termos peptídeos, proteínas e polipeptídeos são usados de modo Intercambiável no presente documento e se referem a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma proteína ou polipeptídeo compreende a sequência polimérica de

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18/139 resíduos de aminoácido. O código de uma letra e 3 letras para aminoácidos, conforme definido em conformidade com a IUPAC-IUB Comissão Conjunta sobre Nomenclatura Bioquímica (JCBN), é usado ao longo desta descrição. A letra única X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Também se compreende que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneraçâo do código genético. Mutações podem ser nomeadas pelo código de uma letra para o aminoácido parente, seguido por um número de posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como G087S ou G87S. Ao descrever modificações, uma posição seguida por aminoácidos listados em parênteses indica uma lista de substituições naquela posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L,I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma ieucina ou isoleucina. Por vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V, indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina naquela posição.

[0048] Uma pró-sequência ou sequência de propeptídeos se refere a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo sinal e sequência de protease madura que é necessária para o enovelamento e secreção apropriados da protease; por vezes, são denominadas chaperonas intramoleculares. Clivagem da prossequência ou sequência de propeptídeos resulta em uma protease ativa madura. Proteases são frequentemente expressadas como pró-enzimas.

[0049] Os termos sequência sinal·' e peptídeo sinal” se referem a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência sinai está tipicamente localizada N-terminal na sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência sinal pode

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19/139 ser endógena ou exógena, Uma sequência sinal está normalmente ausenta da proteína madura. Uma sequência sinal é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase sinal após a proteína ser transportada.

[0050] O termo forma madura de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo se refere à forma funcional da proteína, polipeptídeo ou enzima sem a sequência de peptídeo sinal e sequência de propeptídeos. [0051] O termo forma precursora de uma proteína ou peptídeo se refere a uma forma madura da proteína que tem uma prossequência operacionalmente ligada ao terminal amlno ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência de sinal operacionalmente ligada ao terminal amino da prossequência. O precursor também pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos em atividade pós-translacional (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou peptídeo).

[0052] O termo tipo selvagem em referência a uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo de ocorrência natural se refere a qualquer elemento (por exemplo, sequências de proteínas, aminoácidos ou ácidos nucleicos) que seja encontrado na natureza. Por outro lado, o termo de ocorrência não natural se refere a qualquer elemento que não seja encontrado na natureza (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos e proteínas recombínantes produzidas em laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[0053] Conforme usado no presente documento com relação a posições de resíduo de aminoácido, que corresponde a ou corresponde a ou corresponde se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou peptídeo, ou um resíduo de ami

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20/139 noácido que é análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou peptídeo. Conforme usado no presente documento, região correspondente se refere, de modo geral, a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.

[0054] Os termos derivado de e obtido a partir de se referem não só a uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também a uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.

[0055] O termo referência, com relação a um polipeptídeo descrito no presente documento, se refere a um polipeptídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção feita pelo homem em uma ou mais posições de aminoácido, assim como um polipeptídeo de ocorrência natural ou sintético que inclui uma ou mais substituições, inserções, ou deleções feitas pelo homem em uma ou mais posições de aminoácido. De maneira similar, o termo referência, com relação a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção feita pelo homem de um ou mais nucleosídeos, assim como um polinucleotídeo de ocorrência natural ou sintético que inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções feitas pelo homem em um ou mais nucleosídeos. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de tipo selvagem ou parental não é limitado a um polinucleotídeo de ocorrência natural, e engloba qualquer polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de tipo selvagem ou parental.

[0056] O termo aminoácido se refere à unidade de estrutura

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21/139 química básica de uma proteína ou polipeptídeo. As seguintes abreviações usadas no presente documento para identificar aminoácidos es pecíficos podem ser encontradas na Tabela 2.

Tabela 2. Abreviações de Aminoácido de Uma e Três Letras

	Três Letras	Uma Letra
Aminoácido	Abreviação	Abreviação
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N
Ácido de serina termoestável	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Glutamina	Gin	Q
Ácido glutâmico	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	lie	1
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	s
Treonina	Thr	T
Triptofano	Trp	w
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Vai	V
Qualquer aminoácido ou conforme	Xaa	X
definido no presente documento

[0057] Deve ser reconhecido, por uma pessoa de habilidade comum na técnica, que modificações de sequências de aminoácidos reveladas no presente documento podem ser feitas enquanto se mantém a função associada às sequências de aminoácidos reveladas. Por

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22/139 exemplo, são bem conhecidas na técnica que as alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um dado sitio, porém, não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada são comuns. Por exemplo, qualquer aminoácido particular em uma sequência de aminoácidos revelada no presente documento pode ser substituído por outro aminoácido funcionalmente equivalente. Para os fins desta descrição, substituições são definidas como trocas dentro de um dos seguintes cinco grupos:

1. Resíduos alifáticos, não polares ou levemente polares pequenos: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Resíduos negativamente carregados polares e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gin;

3. Resíduos positivamente carregados polares: His, Arg, Lys;

4. Resíduos não polares alifáticos grandes: Met, Leu, lie, Vai (Cys); e

5. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.

[0058] Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). De maneira similar, também se espera que alterações que resultam em substituição de um resíduo negativamente carregado por outro (tal como ácido de serina termoestável para ácido glutâmico) ou um resíduo positivamente carregado por outro (tal como lisina por arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, também não se espera que alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula de proteína alterem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está muito dentro da habilidade de rotina na técnica, como é a determinação de retenção de

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23/139 atividade biológica dos produtos codificados.

[0059] O termo códon otimizado, na medida em que se refere a genes ou regiões codificadoras de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração de códons no gene ou regiões codificadoras das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA se codifica.

[0060] O termo gene se refere a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, que inclui sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras de 5’) e seguintes (sequências não codificadoras de 3^!) à sequência codificadora. Gene nativo se refere a um gene, conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Gene quimérico se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, porém, dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Gene endógeno se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene externo se refere a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, porém, introduzido no organismo hospedeiro por transferência genética. Genes externos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um transgene é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

[0061] O termo sequência codificadora se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Sequências reguladoras adequadas se referem a sequências

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24/139 de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificadores de 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificadores de 3') de uma sequência codificadora, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação efetoras e estruturas de alça em formato de grampo.

[0062] O termo operacionalmente ligado se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando tem capacidade para afetar a expressão daquela sequência codificadora, isto é, a sequência codificadora está sob o controle transcricional do promotor. Sequências codificadoras podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras na orientação de sentido ou antissenso.

[0063] Os termos sequência reguladora ou sequência de controle são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir expressão de genes específicos dentro de um organismo. Exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência sinal, operadores e semelhantes. Conforme observado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas na orientação de sentido ou antissenso na sequência codificadora/gene de interesse.

[0064] Promotor ou sequências promotoras se referem a sequências de DNA que definem onde a transcrição de um gene por RNA polimerase começa. Sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de iniciação de transcrição. Promotores podem ser derivados em sua to

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25/139 talidade a partir de uma sequência nativa ou de ocorrência natural, ou ser compostos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Entende-se que, por aqueles versados na técnica, diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipo celular ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas (promotores induzíveis).

[0065] As sequências não codificadoras de 3’ se referem a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificadora e incluem sequências que codificam sinais reguladores que têm capacidade para afetar o processamento de mRNA ou expressão genética, tal como terminação de transcrição.

[0066] O termo transformação, conforme usado no presente documento, se refere à transferência ou introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que se replica autonomamente, ou pode se Integrar ao genoma de um hospedeiro de produção. Hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos transformados ou recombinantes ou transgênlcos ou transformantes.

[0067] O termo recombinante, conforme usado no presente documento, se refere a uma combinação artificial de dois segmentos separados de outra forma das sequências de ácido nucleico, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, seja através de manipulação natural ou laboratorial, a partir de uma molécula diferente, a partir de outra parte da mesma molécula, ou uma se

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26/139 quência artificial, que resulta na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos recombinante, transgênico, transformado, projetado ou modificado para expressão de gene exógeno são usados de modo intercambiável no presente documento.

[0068] Os termos construto recombinante, construto de expressão, construto de expressão recombinante e cassete de expressão são usados de modo intercambiável no presente documento. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e codificadoras que não se encontram todas juntas na natureza. Por exemplo, um construto pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, porém, dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado por si só ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor é usado, então, a escolha de vetor é dependente do método que será usado para transformar células hospedeiras, conforme bem conhecido por aqueies versados na técnica. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado. O especialista habilidoso está bastante ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor de modo a transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O especialista habilidoso também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e modelos de expressão (Jones et ai, (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, assim, que diversos eventos são tipicamente examinados de modo a obter linhas que exibem o nível e modelo de expressão desejáveis. Tal exame pode ser ensaios biológicos moleculares padrão, bioquímicos e outros ensaios realiza

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27/139 dos que incluem análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de mRNA, PCR, PCR quantitativo em tempo real (qPCR), transcrição reversa de PCR (RT-PCR), análise immunoblotting de expressão de proteína, ensaios de enzima ou atividade, e/ou análise fenotípica.

[0069] Os termos hospedeiro de produção, hospedeiro e célula hospedeira são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humana ou não humana em que um construto recombinante pode ser introduzido de maneira estável ou transiente de modo a expressar um gene. Esse termo engloba qualquer progenitura de uma célula parente, que não é idêntica à célula parente devido a mutações que ocorrem durante a propagação.

[0070] O termo percentual de identidade é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, como pode ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correspondentes entre cadeias das tais sequências. Identidade e similaridade podem ser prontamente calculadas através de métodos conhecidos, que incluem, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Pr/mer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Métodos para determinar a identidade e similaridade são

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28/139 codificados em programas de computador publicamente disponíveis, [0071] Conforme usado no presente documento,% de identidade ou percentual de identidade ou PID se refere à identidade de sequência de proteína. Percentual de identidade pode ser determinado com o uso de técnicas padrão conhecidas na arte. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci, E.U.A., 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de busca, em sua maioria definidos para os valores padrão. O algoritmo BLAST de NCBI encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, porém, não é recomendado para sequências de busca de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Parâmetros BLAST padrão exemplificativos para buscas de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Valor de corte Ε = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, divergência = 3); Abertura de Lacuna = 5; e Extensão de Lacuna 2, Parâmetros BLAST padrão exemplificativos para buscas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; valor de corte E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de Lacuna = 11; e Extensão de lacuna = 1, Um valor de identidade de percentual (%) de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondente dividido pelo número total de resíduos da sequência de referência que inclui quaisquer intervalos criados pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Algoritmos BLAST se referem à sequência de referência como a sequência de busca.

[0072] Conforme usado no presente documento, o termo proteínas homólogas ou proteases homólogas se refere a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciá

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29/139 ria. Homologia de proteína pode se referir à similaridade em sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. Busca homóloga de sequências de proteínas pode ser realizada com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de BLAST de NCBI com limite (valor de corte E) em 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, setembro de 1997, 1 ;25(17):3.389 a 402). Com o uso dessa informação, sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos.

[0073] Alinhamentos de sequência e cálculos de percentual de identidade podem ser realizados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl), do programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD), ou da suíte de software aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). Diversos alinhamentos das sequências podem ser realizados com o uso do método CLUSTAI (tai como CLUSTALW; por exemplo, a versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res, 31 (13):3.497 a 500 (2003)), disponível pelo Laboratório de Biologia Molecular Europeu por meio do Instituto de Bioinformática Europeu) com os parâmetros-padrão. Parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de lacuna = 15, Extensão de lacuna = 0,2, matriz ~ Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína “· -1, GAPDIST de proteína = 4 e KTUPLE = 1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com as definições padrão de um alinhamento lento. Altemativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também

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KTUPLE 1, penalidade por lacuna · 10, extensão de lacuna ™ 1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), janela = 5, e diagonais superiores salvas - 5, [0074] O programa MUSCLE (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797) é ainda outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências.

[0075] Várias sequências de aminoácidos e polipeptídeos e sequências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento. Variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90%, ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em determinadas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante em determinadas modalidades pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada, ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função da sequência revelada.

[0076] O termo variante, com relação a um polipeptídeo, se refere a um polipeptídeo que se difere de um polipeptídeo de tipo selvagem, parental ou de referência especificado, em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de ocorrência natural ou feitas pelo homem de um aminoácido. De maneira similar, o termo variante, com relação a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo que se difere em sequência de nucleotídeos de um poli

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31/139 nucleotídeo de tipo selvagem, parental ou de referenda espedficado. A identidade do polipeptídeo ou polinudeotídeo de tipo selvagem, parental ou de referência será aparente a partir do contexto.

[0077] Os termos plasmídeo, vetor e cassete se referem a um elemento extracromossômico que carrega frequentemente genes que não são parte do metabolismo central da célula, e normalmente na forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências autonomamente replicantes, sequências de integração de genoma, fago, ou sequências de nudeotídeos, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita única ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que diversas sequências de nudeotídeos foram unidas ou recombinadas em uma única construção que tem capacidade para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula. Cassete de transformação se refere a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionais ao gene que facilitam transformação de uma célula hospedeira particular. Os termos cassete de expressão e vetor de expressão são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionais ao gene que permitem expressão daquele gene em um hospedeiro.

[0078] O termo expressão, conforme usado no presente documento, se refere à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. Expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.

[0079] Expressão de um gene envolve transcrição do gene e tradução do mRNA em uma proteína precursora ou madura. Proteína madura se refere a um polipeptídeo pós-traducionalmente processado; isto é, um dentre quaisquer pré ou propeptídeos presentes no produto de tradução primário foi removido. Proteína precursora se refere

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32/139 ao produto primário de tradução de mRNA; isto é, com pré e propeptídeos ainda presentes. Pré e propeptídeos podem ser, porém sem limitação, sinais de localização intracelular. Transformação estável se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para um genoma de um organismo hospedeiro, que inclui ambos genomas nuclear e organelar, que resulta em herança geneticamente estável. Por outro lado, transformação transiente se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro que resulta em expressão genética sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados como organismos transgênicos.

[0080] O vetor de expressão pode ser um dentre vários vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete incluirá sequências que direcionam transcrição e tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores adequados incluem geralmente uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla terminação transcricional. Ambas regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos aos genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem ser derivadas.

[0081] Regiões de controle de iniciação ou promotores possíveis que podem ser incluídos no vetor de expressão são diversos e familiares àqueles versados na técnica. Virtualmente, qualquer promotor que tem capacidade para conduzir esses genes é adequado, incluindo, porém sem limitação, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPl (úteis para a expres

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33/139 são em Saccharomyces)', A0X1 (útil para a expressão em Pichia); e lac, araB, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac e trc (úteis para a expressão em Escherichia coli) assim como os promotores amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para a expressão em Bacillus. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo ou induzível. Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo na maior parte das condições ambientais e desenvolvimento. Um promotor induzível ou repressivo é um promotor que está ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou repressivos devido às alterações em fatores ambientais que incluem, porém sem limitação, disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a presença de metal (ou metais) pesado, a concentração de inibidor (ou inibidores), estresse ou uma combinação dos supracitados, conforme conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis ou repressivos são induzíveis ou repressivos por fatores metabólicos, tais como o nível de determinadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos, ou uma combinação do supracitado conforme conhecido na técnica. Em uma modalidade, o promotor é um que seja nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promitor de T. reesei nativo, tal como o promotor cbh1 que é depositado em GenBank sob o Número de Acesso D86235.

[0082] Exemplos não limitantes adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, egU, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn1, e xyn2, promotor de gene de ácido fosfatase repressivo (phoA) de P. chrysogenus (consultar, por exemplo, Graessle et ah, (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 :753 a 756), promotor PCK1 repressivo de glicose (consultar, por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192:235 a 240), promotor MET3 induzível de maltose e repressivo de glicose (consultar Liu et al., (2006), Eukary.

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Cell, 5:638 a 649), promotor pKi e promotor cpd. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes glicoamilase A. awa~ mori e A. niger (consultar, por exemplo, Nunberg et a!., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2.306 a 2.315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1.581 a 1.585). Além disso, os promotores do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (consultar, por exemplo, EPA 137280AI).

Fragmentos de DNA que controlam terminação transcricional também podem ser derivados de vários genes nativos para uma célula hospedeira de produção preferencial. Em determinadas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em determinadas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial. [0083] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem sobre uma ampla faixa de temperatura, valores de pH e tolerâncias de solvente. Por exemplo, é contemplado que qualquer uma das bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e levedura podem hospedar de maneira adequada o vetor de expressão.

[0084] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse, de modo que a mesma possa residir de maneira intracelular, extracelular ou uma combinação de ambas dentro e fora da célula. Expressão extracelular gera recuperação da proteína desejada a partir de um produto de fermentação mais superficial que métodos para recuperação de proteína produzida através de expressão intracelular.

[0085] Determinadas modalidades da presente descrição se referem a um polipeptídeo isolado, que tem atividade de serina protease,

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35/139 selecionado dentre:

b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 94% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

c) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24;

d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.

[0086] Em outra modalidade, é revelado um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease que compreende uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre: SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9; e SEQ ID NO:12.

[0087] Em ainda outra modalidade, é revelado um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease e que compreende uma região catalítica de protease, selecionado dentre o grupo que consiste em:

a) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 96% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18

c) uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20;

d) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21 [0088] Outras modalidades incluem um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospe

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36/139 deiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease selecionado dentre:

d) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.

[0089] O hospedeiro de produção é selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas, [0090] O hospedeiro de produção pode, então, ser usado em um método para produzir pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante descrito no presente documento; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease seja produzido.

[0091] De acordo com esse método, pelo menos um polipeptídeo descrito no presente documento é opcionalmente recuperado do hospedeiro de produção. Em outro aspecto, um sobrenadante de cultura contendo serina protease é obtido através do uso de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

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37/139 [0092] Além disso é descrito no presente documento um hospedeiro de produção microbiano recombinante para expressar pelo menos um polipeptídeo descrito no presente documento, sendo que o dito hospedeiro de produção microbiano recombinante compreende um construto recombinante descrito no presente documento. Em outra modalidade, esse hospedeiro de produção microbiano recombinante é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos e algas. [0093] Expressão será entendida por incluir qualquer etapa envolvida na produção de pelo menos um polipeptídeo descrito no presente documento que inclui, porém sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-tradução e secreção.

Técnicas para modificar sequências de ácidos nucleicos que utilizam métodos de clonagem são bem conhecidas na arte.

[0094] Um polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante a tripsina pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer para expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira Bacillus. Manipulação da sequência de polinucleotídeos antes de sua inserção em um construto ou vetor de ácido nucleico pode ser desejável ou necessário dependendo do construto ou vetor de ácido nucleico ou a célula hospedeira Bacillus. As técnicas para modificar sequências de nucleotídeos que utilizam métodos de clonagem são bem conhecidas na arte.

[0095] Sequências reguladoras são definidas acima. As mesmas incluem todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de uma serina protease semelhante a tripsina. Cada sequência de controle pode ser nativa ou externa na sequência de nucleotídeos que codifica a serina protease semelhante a tripsina. Tais sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, um líder, uma sequência poliadenilação, uma sequência de propeptídeos, um promotor, uma sequência sinal e um terminador de transcrição. As sequên

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38/139 cias reguladoras podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam ligação ou as sequências reguladoras com a região codificadora da sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease semelhante a tripsina. [0096] Um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante a tripsina pode ser operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que têm capacidade para direcionar a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira Bacillus sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0097] Cada sequência de controle pode ser nativa ou externa ao polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante à tripsina. Tais sequências de controle incluem, porém sem limitação, um líder, um promotor, uma sequência sinal e um terminador de transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de parada transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam ligação das sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante a tripsina.

[0098] A sequência de controle pode ser uma região promotora apropriada, uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira Bacillus para expressão do polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante à tripsina. A região promotora contém sequências de controle de transcrição que medeiam a expressão de uma serina protease semelhante a tripsina. A região promotora pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que demonstra atividade transcricional na célula hospedeira Bacillus de escolha e pode ser obtida a partir de genes que direcionam síntese de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares que têm atividade biológica ho

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39/139 móloga ou heteróloga para célula hospedeira Bacillus.

[0099] A região promotora pode compreender um promotor único ou uma combinação de promotores. Quando a região promotora compreende uma combinação de promotores, os promotores estão preferencialmente em paralelo. Um promotor da região promotora pode ser qualquer promotor que possa iniciar transcrição de um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica em uma célula hospedeira Bacillus de interesse. O promotor pode ser nativo, externo ou uma combinação dos mesmos, para a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica. Tal promotor pode ser obtido a partir de genes que direcionam síntese de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares que têm atividade biológica homóloga ou heteróloga para a célula hospedeira Bacillus.

[00100] Assim, em determinadas modalidades, a região promotora compreende um promotor obtido a partir de uma fonte bacteriana. Em outras modalidades, a região promotora compreende um promotor obtido a partir de uma bactéria gram positiva ou gram negativa. Bactérias gram positivas incluem, porém sem limitação, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus e Oceanobacillus. Bactérias gram negativas incluem, porém sem limitação, E. coll, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobactenum, Fusobactehum, llyobacter, Neisseria e Urea plasma.

[00101] A região promotora pode compreender um promotor obtido a partir de uma cepa Bacillus (por exemplo, Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus llchenifonmis, Bacillus megatenum, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuhngiensis, ou de uma cepa Streptomyces (por exemplo, Strep

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40/139 tomyces lividans ou Streptomyces murinus).

[00102] Exemplos de promotores adequados para direcionar transcrição de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica nos métodos da presente descrição são os promotores obtidos a partir do operão /ac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de protease alcalina de Bacillus lentus ou Bacillus clausii (aprH), gene de protease alcalina de Bacillus lichen!formis (gene Carlsberg de subtilisina), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene alfa-amilase de Bacillus subtilis (amyE), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene tenebfionis CrylllA de subespécie de Bacillus thuringiensis (crylllA) ou porções dos mesmos, gene beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A. 75:3.727 a 3.731), e gene xylA de Bacillus megaterium (Rygus e Hillen, 1992, J. Bacteriol. 174: 3.049 a 3.055; Kim et al., 1996, Gene 181: 71 a 76). Outros exemplos são o promotor do promotor de fago bacteriano spo1 e o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A. 80:21 a 25). Promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Scientific American, 1980, 242:74 a 94; e em Sambrook, Fritsch e Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor, N.Y.

[00103] A região promotora pode compreender um promotor que é um promotor de consenso que tem a sequência TTGACA para a região -35 e TATAAT para a região -10. O promotor de consenso pode ser obtido a partir de qualquer promotor que pode funcionar em uma célula hospedeira de Bacillus. A construção de um promotor de

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41/139 consenso pode ser realizada por mutagênese de sítio direcionado com o uso de métodos bem conhecidos na técnica para criar um promotor que se conforma mais perfeitamente nas sequências de consenso estabelecidas para as regiões -10 e -35 dos promotores do tipo sigma A vegetatlvos para Bacillus subtills (Voskuil et ah, 1995, Molecular Microbiology 17: 271 a 279).

[00104] A sequência de controle também pode ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, tal como uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira de Bacillus para terminar a transcrição. A sequência terminadora é operacionalmente ligada à terminação 3' da sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease semelhante a tripsina. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de Bacillus pode ser usado.

[00105] A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução por uma célula hospedeira de Bacillus. A sequência líder é operacionalmente ligada à terminação 5^! da sequência de nucleotídeos que direciona síntese do poiipeptídeo que tem atividade biológica. Qualquer sequência líder que é funcional em uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na presente invenção.

[00106] A sequência de controle também pode ser uma sequência estabilizadora de mRNA. O termo sequência estabilizadora de mRNA é definido no presente documento como uma sequência localizada a jusante de uma região promotora e a montante de uma sequência codificadora de um polinucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante a tripsina à qual a região promotora é operacionalmente ligada, de modo que todos os mRNAs sintetizados da região promotora possam ser processados para gerar transcrições de mRNA com uma sequência estabilizadora na extremidade 5' das transcrições. Por

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42/139 exemplo, a presença de tal sequência estabilizadora na extremidade 5’ das transcrições de mRNA aumenta sua meia-vida (Agaisse e Lereclus, 1994, supra, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471). O processamento/sequência estabilizadora de mRNA é complementar à extremidade 3' de RNA rlbossômico 16S bacteriano. Em determinadas modalidades, o processamento/sequência estabilizadora de mRNA gera essencialmente transcrições de tamanho único com uma sequência estabilizadora na extremidade 5’ das transcrições. O processamento/sequência estabilizadora de mRNA é preferencialmente uma que é complementar à extremidade 3' de um RNA ribossômico 16S bacteriano. Consultar, os documentos de Patente n° U.S. 6.255.076 e U.S. 5.955.310.

[00107] O construto de ácido nucleico pode, então, ser introduzido em uma célula hospedeira de Bacillus com o uso de métodos conhecidos na técnica ou aqueles métodos descritos no presente documento para introduzir e expressar uma serina protease semelhante a tripsina. [00108] Um construto de ácido nucleico que compreende um DNA de interesse que codifica uma proteína de interesse também pode ser construído de maneira similar, conforme descrito acima.

[00109] Para obter a secreção da proteína de interesse do DNA introduzido, a sequência de controle também pode compreender uma região codificadora de peptídeo sinal, que codifica uma sequência de aminoácidos ligada à terminação amino de um polipeptídeo que pode direcionar o polipeptídeo expresso na via secretora da célula. A região codificadora de peptídeo sinal pode ser nativa para o polipeptídeo ou pode ser obtida a partir de fontes externas. A extremidade 5' da sequência codificadora da sequência de nucleotídeos pode conter inerentemente uma região codificadora de peptídeo sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução ao segmento da região codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a ex

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43/139 tremidade 5' da sequência codificadora pode conter uma região codificadora de peptídeo sinal que é externa àquela porção da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. A região codificadora de peptídeo sinal externa pode ser necessária quando a sequência codificadora não contém, normalmente, uma região codificadora de peptídeo sinal. Alternativamente, a região codificadora de peptídeo sinal externa pode simplesmente substituir a região codificadora de peptídeo sinal natural de modo a obter secreção aprimorada do polipeptídeo relativo à região codificadora de peptídeo sinal natural normalmente associada à sequência codificadora. A região codificadora de peptídeo sinal pode ser obtida a partir de uma amilase ou um gene protease de uma espécie de Bacillus. No entanto, qualquer região codificadora de peptídeo sinal tem capacidade para direcionar o polipeptídeo expresso na via secretora de uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na presente invenção.

[00110] Uma região codificadora de peptídeo sinal eficaz para uma célula hospedeira de Bacillus, é a região codificadora de peptídeo sinal obtida a partir do gene amilase maltogênico de Bacillus NCIB 11837, do gene alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, do gene subtilisina de Bacillus lichenlformls, do gene beta-lactamase de Bacillus licheniformis, dos genes de proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e do gene prsA de Bacillus subtilis.

[00111] Assim, um construto de polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um construto de serina protease semelhante a tripsina que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (POI) pode ser construído de modo que seja expresso por uma célula hospedeira. Devido às degenerações conhecidas no código genético, diferentes polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica podem ser projetados e produzidos com habilidades de rotina na técnica. Por exemplo, otimiza

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44/139 ções de códon podem ser aplicadas para otimizar a produção em uma célula hospedeira particular.

[00112] Ácidos nucleicos que codificam proteínas de interesse podem ser incorporadas em um vetor, em que o vetor pode ser transferido para uma célula hospedeira com o uso de técnicas de transformação bem conhecidas, tais como aquelas reveladas no presente documento.

[00113] O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser transformado em e replicado dentro de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um POI pode ser transformado e replicado em uma célula hospedeira bacteriana como um meio de propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser transformado em um hospedeiro de expressão de Bacillus da descrição, de modo que a proteína que codifica ácido nucleico (por exemplo, um ORF) possa ser expressa como uma proteína funcional.

[00114] Um vetor representativo que pode ser modificado com habilidade de rotina para compreender e expressar um ácido nucleico que codifica um POI é o vetor p2JM103BBI.

[00115] Um pollnucleotídeo que codifica uma serina protease semelhante a tripsina ou um POI pode ser operacionalmente ligado a um promotor adequado, que permite transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira. Meios para avaliar atividade/força de promotor são de rotina para o especialista versado.

[00116] Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codificam polipeptídeo comS1 ou um POI da descrição, especialmente em um hospedeiro bacteriano, incluem o promotor do operão lac de E coli, os

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45/139 promotores dagA ou celA de gene agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene amilase maltogênico de Bacillus stearothermcphilus (amyM), os promotores da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e semelhantes.

[00117] Um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um POI pode ser um promotor aprE de tipo selvagem, um promotor aprE mutante ou um promotor aprE de consenso apresentados na Publicação Internacional PCT n° W02001/51643. Em outras determinadas modalidades, um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um POI é um promotor spoVG de tipo selvagem, um promotor spoVG mutante ou um promotor spoVG de consenso (Frisby e Zuber, 1991).

[00118] Um promotor para direcionar a transcrição da sequência de polinucleotídeos que codifica uma serina protease semelhante a tripsina ou um POI é um promotor ribossômico, tal como um promotor de RNA ribossômico ou um promotor de proteína ribossômico. O promotor de RNA ribossômico pode ser um promotor rrn derivado de B. subtilis, mais particularmente, o promotor rrn pode ser um promotor ribossômico rrnB, rrni ou rrnE de B. subtilis. Em determinadas modalidades, o promotor de RNA ribossômico é um promotor rrn! P2 de B. subtilis apresentado na Publicação Internacional PCT n° WO2013/086219.

[00119] Um vetor adequado pode compreender adicionalmente uma sequência de ácidos nucieicos que permite que o vetor se replique na célula hospedeira. Exemplos de tais sequências habilitadoras incluem as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, plJ702 e semelhantes.

[00120] Um vetor adequado também pode compreender um marca

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46/139 dor selecionável, por exemplo, um gene que o produto do mesmo complementa um defeito na célula hospedeira isolada, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. lichenlformls', ou um gene que confere resistência antibiótica, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à canamicina, resistência à cloranfenicol, resistência à tetraoiclina e semelhantes.

[00121] Um vetor de expressão adequado inclui tipicamente componentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um elemento que permite replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para fins de seleção. Vetores de expressão também compreendem tipicamente sequências de controle de nucleotídeos, tais como, por exemplo, promotor, operador, sítio de ligação ribossômico, sinal de iniciação de tradução e opcionalmente, um gene repressor, uma ou mais sequências de genes ativadores, ou semelhantes.

[00122] Adicionalmente, um vetor de expressão adequado pode compreender adicionalmente uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos que tem capacidade para alvejar a proteína de interesse para uma organela de célula hospedeira, tal como um peroxissoma, ou para um compartimento de célula hospedeira particular. Tal sequência de alvejamento pode ser, por exemplo, a sequência de aminoácidos SKL. Para expressão sob a direção de sequências de controle, a sequência de ácidos nucleicos da proteína de interesse pode ser operacionalmente ligada às sequências de controle de uma maneira adequada, de modo que a expressão ocorra.

[00123] Protocolos, tais como os descritos no presente documento, usados para ligar o construto de DNA que codifica uma proteína de interesse, promotores, terminadores e/ou outros elementos, e para inserir os mesmos em vetores adequados que contêm a informação necessária para replicação, são bem conhecidos por pessoas versadas

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47/139 na técnica.

[00124] Uma célula isolada, que compreende um construto de polinucleotideo ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de um POI. A célula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica o POI, integrando-se de modo conveniente o construto (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. A integração é geralmente considerada uma vantagem, na medida em que a sequência de DNA assim introduzida é mais propensa a ser estavelmente mantida na célula. A integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada aplicando-se métodos convencionais, por exemplo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Por exemplo, a Publicação Internacional PCT n° W02002/14490 descreve métodos de transformação de Bacillus, transformantes do mesmo e bibliotecas do mesmo. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme descrito acima em conexão com os tipos diferentes de células hospedeiras.

[00125] Em outras modalidades, é vantajoso deletar genes de hospedeiros de expressão, quando a deficiência de gene pode ser curada por um vetor de expressão. Métodos conhecidos podem ser usados para obter uma célula hospedeira bacteriana que tem um ou mais genes inativos. Inativação de gene pode ser realizada através de deleção completa ou parcial, através de inativação de inserção ou através de quaisquer outros meios que geram um gene não funcional para seu fim desejado, de modo que o gene evite expressão de uma proteína funcional.

[00126] Técnicas para transformação de bactérias e cultivo das bactérias são padrões e bem conhecidas na arte. Podem ser usadas para transformar os hospedeiros melhorados da presente invenção para a produção de proteínas recombinantes de interesse. Introdução

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48/139 de um construto ou vetor de DNA em uma célula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e mediada por DEAE-Dextrina), incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio, bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis de DNA revestido, transformação de biolística e fusão de protoplasto, e semelhantes. Métodos de transformação e expressão para bactérias também são revelados em Brigidi et al. (1990). Um protocolo de transformação e expressão geral para cepas de Bacillus de protease deletada é descrito em Ferrari et al. (documento de Patente n° U.S. 5.264.366).

[00127] Métodos para transformar ácidos nucleicos em fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp., por exemplo, A. oryzae ou A. niger, H. grlsea, H. insolens e T. reesei. são bem conhecidos na técnica. Um procedimento adequado para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito, por exemplo, no documento n° EP238023. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Trichoderma é descrito, por exemplo, em Steiger et al 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:114 a 121.

[00128] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qualquer micro-organismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas. [00129] Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a serina protease semelhante a tripsina e sua fonte.

[00130] Introdução de um construto ou vetor de DNA em uma célula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, (por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e mediada por DEAE-Dextrina); incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio; bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis de DNA revestido; e fusão de protoplasto. Textos básicos que revelam os métodos gerais que podem ser

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49/139 usados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2^a edição 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)). Os métodos de transformação da presente invenção podem resultar na integração estável de todo ou parte do vetor de transformação no genoma de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira fúngica filamentosa. No entanto, a transformação que resulta na manutenção de um vetor de transformação extra cromossômico de autorreplicação também é contemplado.

[00131] Diversos métodos de transfeoção padrão podem ser usados para produzir linhas de célula bacteriana e fúngica filamentosa (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam grandes quantidades da protease. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA em cepas produtoras de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155-164, consultar também USP 6.022.725; USP 6.268.328 e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brig id i, DeRossi, Bertarlni, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135 a 138).

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50/139 [00132] No entanto, qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos externas em células hospedeiras pode ser usado. Esses incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, biolística, lipossomas, microinjeção, vetores de plasma, vetores virais e qualquer um dos outros métodos bem conhecidos para introduzir DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético ou outro material genético externo em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra). Além do uso de método de transfecção mediado por Agrobactéria descrito no documento de Patente n° U.S. 6.255.115. É necessário apenas que o procedimento de modificação genética particular usado tenha capacidade para introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira que tem capacidade para expressar o gene.

[00133] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem expressão de genes sob controle das sequências promotoras.

[00134] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula hospedeira e obter expressão de um polipeptídeo alfa-glicosidase. Meios e componentes de meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito nos catálogos da Coleção de Cultura do Tipo Americano).

[00135] Um polipeptídeo de serina termoestável secretado das células hospedeiras pode ser usado, com processamento de pós-produção mínimo, como uma preparação de caldo inteiro.

[00136] Dependendo da célula hospedeira usada modificações póstranscricionais e/ou pós-translacionais podem ser feitas. Um exemplo

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51/139 sem limitação de uma modificação pós-transcricional e/ou póstranslacional é clipagem ou truncação de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma serina protease semelhante a tripsina de um estado inativo ou substancialmente inativo para um estado ativo como no caso de um propeptídeo que passa por processamento pós-translacional adicional para um peptídeo maduro que tem a atividade enzimática. Em outro exemplo, essa clipagem pode resultar em obter um polipeptídeo de serina protease termoestável maduro e remover mais aminoácidos N ou C terminal para gerar formas truncadas da serina protease termoestável que retém atividade enzimática.

[00137] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa habilidosa verificará que o tipo de modificações póstranscricionais ou pós-translacionais que uma proteína pode passar podem depender do organismo hospedeiro no qual a proteína é expressa.

[00138] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação de gasto completo de um micro-organismo recombinante pode ser obtida com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica que resulta na expressão de uma serina protease semelhante a tripsina.

[00139] A fermentação pode, portanto, ser entendida por compreender cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (que inclui fermentações contínua, em batelada, em batelada alimentado ou de estado sólido) em fermentadoras de laboratório ou industriais realizadas em um meio adequado e sob condições que permitem que a alfa-glicosidase seja expressa ou isolada. O termo caldo de fermentação de gasto completo é definido no presente do

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52/139 cumento como teor não fracionado de material de fermentação que inclui meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo caldo de fermentação de gasto completo também engloba biomassa celular que foi lisada ou permeablllzada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica. [00140] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem expressão de uma serina protease semelhante a tripsina. Expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que sejam continuamente produzidas, ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso de expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando necessário, por exemplo, através da adição de uma substância indutora no meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG ou soforose.

[00141] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser adequadamente usado para fermentar a cepa transformada ou a cepa fúngica derivada conforme descrito acima. Em algumas modalidades, células fúngicas são cultivadas sob condições de fermentação em batelada ou contínua.

[00142] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, onde a composição do meio é definida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado. Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de nenhum componente no sistema de fermentação todo.

[00143] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma batelada com relação à adição da fonte de carbono. Além disso, tentativas são feitas, frequentemente, para controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio ao longo do processo de fermentação. Tipicamente, o metabólito e composições de biomassa

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53/139 do sistema em batelada se alteram constantemente até o tempo de a fermentação ser paralisada. Dentro das culturas em batelada, o progresso de células através de uma fase de latência estática para uma fase de latência de alto crescimento e finalmente para uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Células sem tratamento na fase estacionária eventualmente morreríam. Em geral, células em fase de latência são responsáveis pelo volume de produção do produto. Uma variação adequada no sistema em batelada padrão é o sistema de fermentação em batelada alimentada. Nessa variação de um sistema em batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação avança. Sistemas em batelada alimentados são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiría o metabolismo das células, e/ou quando se deseja ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato real em sistemas em batelada alimentados é difícil e é, portanto, estimada com base nas alterações de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases de refugo, tal como CO2. Fermentações em batelada e em batelada alimentadas são bem conhecidos na técnica.

[00144] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. É um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente em um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para processamento. A fermentação contínua mantém, de modo geral, as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase de latência. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, pode ser mantido em uma taxa fixada e permite-se que todos os outros parâme

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54/139 tros sejam moderados. Em outros sistemas, diversos fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida porturbidez de meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos buscam manter condições de crescimento de estado estável. Assim, a perda de célula devido ao meio ser extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos para modular nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidas na técnica de microbiologia industrial.

[00145] Técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica e métodos convencionais podem ser usadas para preparar uma solução concentrada ou caldo que compreende um polipeptídeo de serina protease semelhante a tripsina da invenção.

[00146] Após fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, que inciuem materiais de fermentação brutos residuais, são removidos através de técnicas de separação convencionais de modo a obter uma solução de serina protease semelhante a tripsina. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração de tambor de vácuo giratório, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia, ou semelhantes, são geralmente usadas.

[00147] Pode ser desejável, por vezes, concentrar uma solução ou caldo que compreende polipeptídeo de alfa-glicosidase para otimizar recuperação. Uso de soluções não concentradas ou caldo tipicamente aumentaria o tempo de incubação de modo a coletar o precipitado enzimático enriquecido ou purificado.

[00148] A solução que contém enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até que o nível de enzima desejado seja obtido. A concentração da solução que contém en

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55/139 zima pode ser obtida através de qualquer uma das técnicas abordadas no presente documento. Exemplos de métodos de enriquecimento e purificação incluem porém sem limitação, filtração e/ou ultrafiltração a vácuo giratório.

[00149] A solução que contém serina protease semelhante a tripsins ou caldo pode ser concentrada até que tal tempo da atividade de enzima do concentrado, uma solução que contém serina protease semelhante a tripsina polipeptídeo ou caldo esteja em um nível desejado. [00150] A concentração pode ser realizada com o uso, por exemplo, de um agente de precipitação, tal como um agente de precipitação de haleto de metal. Agentes de precipitação de haleto de metal incluem porém sem limitação, cloretos de metal alcalino, brometos de metal alcalino e mesclas de dois ou mais desses haletos de metal.

[00151] Haletos de metal exemplificativos incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e mesclas de dois ou mais desses haletos de metal. O agente de precipitação de haleto de metal, cloreto de sódio, também pode ser usado como um conservante. Para recuperação em escala de produção, serina protease semelhante a tripsina polipeptídeos pode ser enriquecida ou parcialmente purificada conforme descrito de modo geral acima removendo-se células por meio de floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou purificada através de microfiltração seguida por concentração por ultrafiltração com o uso de membranas e equipamento disponíveis. No entanto, para algumas aplicações, a enzima não precisa ser enriquecida ou purificada, e cultura de caldo completo pode ser iisada e usada sem tratamento adicional. A enzima pode, então, ser processada, por exemplo, em grânulos.

[00152] Serina proteases podem ser isoladas ou purificadas em uma variedade de maneiras conhecidas por aqueles versados na téc

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56/139 nica dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Métodos de purificação padrão incluem, porém sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, exclusão hidrofóbica, de cromatofoco, imunológica e por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, foco Isoelétrico preparativo), solubllldade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfate de amônia), microfiltração de extração, separação de duas fases. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser purificada com o uso de uma coluna de anticorpo de anti-proteína padrão de interesse. Técnicas de ultrafiltração e diafiltraçâo, em conjunto com concentração de proteína, também são úteis. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessário variará dependendo do uso da proteína de interesse. Em alguns casos, nenhuma purificação será necessária.

[00153] Ensaios para detectar e medir a atividade enzimática de uma enzima, tal como um polipeptídeo de serina protease semelhante a tripsina, são bem conhecidos. Vários ensaios para detectar e medir atividade de proteases (por exemplo, polipeptídeos de serina protease termoestáveis), também são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Em particular, ensaios estão disponíveis para medir atividade de protease que são com base na liberação de peptídeos solúveis em ácido de caseína ou hemoglobina, medida como absorvância a 280 nm ou colorimetricamente com o uso do método Folin, e hidrólise da azocaseína marcada por molde, medida como absorvância a 440 a 450 nm.

[00154] Ouros ensaios exemplificativos envolvem a solubilização de substratos cromogênicos (Consultar, por exemplo, Ward, Proteinases, em Fogarty (ed.), Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, Londres, [1983], páginas 251 a 317). Um método de ensaio de detecção de protease que usa caseína de isotiocianato de fluores

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57/139 ceína altamente marcada (FITO) como o substrato, uma versão modificada do procedimento descrito por Twining [Twining, S.S., (1984) Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes Anal. Biochem. 143:30 a 34] também pode ser usado.

[00155] Outros ensaios exemplificativos incluem, porém sem limitação: divagem de caseína em peptideos solúveis em ácido tricloroacético que contêm resíduos de tirosina e triptofano, seguido por reação com reagente Folin-Ciocalteu e detecção colorimétrica de produtos a 660 nm, divagem de substratos de peptídeo internamente arrefecidos FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) seguida por detecção de produto com o uso de um fluorometro. Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) é a transferência não radioativa de energia de um fluoróforo excitado (ou doador) para uma molécula arrefecedora (ou aceitante) adequada. FRET é usada em uma variedade de aplicações que incluem a medição de atividade de protease com substratos, em que o fluoróforo é separado do arrefecedor por uma curta sequência de peptideos que contém o sítio de divagem de enzima. Proteólise do peptídeo resulta em fluorescência conforme o fluoróforo e arrefecedor são separados. Diversas referências adicionais conhecidas por aqueles na técnica fornecem métodos adequados (Consultar, por exemplo, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7.911 a 7.925 [1983]; Christianson et al., Anal. Biochem. 223:119 a 129 [1994]; e Hsia et al., Anal Biochem. 242:221 a 227 [1999]).

[00156] Em ainda outro aspecto, é revelada uma ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease, conforme descrito no presente documento, sozinho ou (a) em combinação com pelo menos um microorganismo de alimentação direta ou (b) em combinação com pelo me

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58/139 nos uma outra enzima ou (c) em combinação com pelo menos um microorganismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima. [00157] A pelo menos uma enzima pode ser selecionada dentre, porém sem limitação, enzimas, tais como, por exemplo, alfa-amilase, amiloglicosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase, xilanase, etc.

[00158] Qualquer uma dessas enzimas pode ser usada em uma quantidade na faixa de 0,5 a 500 microgramas/g de ração ou matériaprima.

[00159] As alfa-amilases (alfa-1 ^-glucan-A-glucano-hidrolase, EC

3.2.1.1.) hidrolisam ligações alfa-1,4~glicosídicas internas em amido, em grande parte aleatoriamente, para produzir dextranos de menor peso molecular. Esses polipeptídeos são usados, inter alia, no processamento de amido e na produção de álcool. Quaisquer alfa-amilases podem ser usadas, por exemplo, aquelas descritas na nas patentes U.S. 8.927.250 e 7.354.752.

[00160] A amiloglicosidase catalisa a hidrólise de resíduos alfa-D~ glicose ligados ao terminal 1,4 sucessivamente a partir das extremidades não redutoras de malto-oligo e polissacarídeos com liberação de beta-D-glicose. Qualquer amiloglicosidase pode ser usada.

[00161] Fitase refere-se a uma proteína ou polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de fitato em (1) mlo-inosltol e/ou (2) mono, dl, tri, tetra e/ou penta-fosfatos do mesmo e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas que têm atividade catalítica conforme definido em Enzyme Commission, número EC 3.1.3.8 ou número EC 3.1.3.26. Qualquer fitase pode ser usada, tal como descrito nas patentes U.S. 8.144.046, 8.673.609 e 8.053.221.

[00162] Pululanase (EC 3.2.1.41) é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima amilolítica que degrada pulano (um polímero de polissacarídeos que consiste em unidades de maltotriose, também co

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59/139 nhecido como alfa-1,4-; alfa-1,6-glucano. Assim, é um exemplo de uma enzima desramificadora. Pululanase também é conhecida como pululan-6-glucano-hidrolase. Pululanases são normalmente secretadas por uma espécie de Bacillus. Por exemplo, Bacillus deramificans (Patente U.S. n² 5.817.498; 1998), Bacillus acidopullulyticus (Patente Européia n² 0 063 909) e Bacillus naganoensis (patente U.S. n²5.055.403). As enzimas que têm atividade de pululanase usadas comercialmente são produzidas, por exemplo, a partir de espécies de Bacillus (nome comercial OPITMAX® 1-100 da DuPont-Genencor e Promozyme® D2 da Novozymes). Outros exemplos de enzimas desramificadoras incluem, porém sem limitação, iso-amilase de Sulfolobus solfataricus, Pseudomonas sp. e pululanase termoestável de Fervidobacterium nodosum (por exemplo, documento n² WO2010/76113). A iso-amilase de Pseudomonas sp. está disponível como enzima purificada na Megazyme International. Qualquer pululanase pode ser usada.

[00163] Glucanases são enzimas que quebram um glucano, um po~ lissacarídeo que produz diversas subunidades de glicose. Como realizam a hidróllse da ligação glicosídica, as mesmas são hidrolases. [00164] As enzimas beta-glucanase (EC 3.2.1.4) digerem fibras. Isso ajuda na quebra de paredes de plantas (celulose).

[00165] As celulases são qualquer uma dentre as diversas enzimas produzidas por fungos, bactérias e protozoários que catalisam celulólise, a decomposição de celulose e de alguns polissacarídeos relacionados. O nome também é usado para qualquer mistura ou complexo de ocorrência natural de várias dessas enzimas, que atuam em série ou sinergicamente para decompor material celulósico. Quaisquer celulases podem ser usadas.

[00166] Xilanase (EC 3.2.1.8) é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose,

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60/139 aqueles que quebram a hemicelulose, um dos principais componentes de paredes celulares das plantas. Quaisquer xilanases podem ser usadas.

[00167] Pelo menos um DFM pode compreender pelo menos um micro-organismo viável, tal como uma cepa bacteriana viável ou uma levedura viável ou um fungo viável. De preferência, o DFM compreende pelo menos uma bactéria viável.

[00168] É possível que o DFM possa ser uma cepa bacteriana formadora de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido ou conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Assim, o termo micro-organismo viável, conforme usado no presente documento, pode incluir esporos microbianos, tais como endósporos ou conídios. Alternativamente, o DFM na composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode não compreender ou pode não conter esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídios.

[00169] O micro-organismo pode ser um micro-organismo de ocorrência natural ou pode ser um micro-organismo transformado.

[00170] Um DFM, conforme descrito no presente documento, pode compreender micro-organismos de um ou mais dentre os seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera, e combinações dos mesmos.

[00171] De preferência, o DFM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dentre os seguintes Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus lichenlformls, Bacillus pumilis e Bacillus amyloliquefaciens.

[00172] O gênero fíac///us, conforme usado no presente documento, inclui todas as espécies do gênero Bacillus, conforme conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica, incluindo, porém sem

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61/139 limitação, B. subtíiís, B. licheniformis, B. ientus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaclens, B. clausli,

B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thuringiensis. Reconhece-se que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganização taxonômlca. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que tenham sido reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que agora é denominado Geobacillus stearothermophilus, ou Bacillus polymyxa, que atualmente é Paenibacillus polymyxa”. A produção de endósporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada a característica definidora do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recentemente denominados Allcyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibaci·· llus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.

[00173] Em um outro aspecto, o DFM pode ser combinado, ainda, com os seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e combinações dos mesmos.

[00174] O DFM pode ser combinado, ainda, com os seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farcimlnis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonli e Lactobacillus jensenii, e combinações de qualquer um dos mesmos.

[00175] Em ainda um outro aspecto, o DFM pode ser combinado,

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62/139 ainda, com os seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenuiatum, Bifidobacterium pseudocatenuiatum, Bifidobacterium adoiescentis e Bifidobacterium angulatum, e combinações dos mesmos. [00176] Podem ser mencionadas bactérias das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumlils, Enterococcus , Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp_; Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farcimlnis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e combinações das mesmas.

[00177] Um micro-organismo de alimentação direta descrito no presente documento, que compreende uma ou mais cepas bacterianas, pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[00178] Alternativamente, um DFM pode ser combinado com um ou mais dentre os produtos ou os micro-organismos contidos nesses produtos revelados no documento n²WO2012110778 e resumidos da seguinte forma:

cepa 2084 de Bacillus subtilis, n² de registro NRRI B-50013, cepa LSSAO1 de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50104, e cepa 15A-P4 ATCC de Bacillus subtilis, n² de registro PTA-6507 (da Enviva Pro®, (anteriormente conhecido como Avicorr®); cepa C3102 de Bacillus subtilis (da Calsporin®); cepa PB6 de Bacillus subtilis (da Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); NCIMB 10415 de Enterococcus (SF68) (da Cylactin®); cepa C3102 de Bacillus subtilis (da Gallipro® e

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GalliproMax®); Bacillus licheniformis (da Gallipro®Tect®); Enterococcus e Pediococcus (da Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococcus (da Protexin®); cepa QST 713 de Bacillus subtilis (da Proflora®); CECT-5940 de Bacillus amyloliquefaciens (da Ecobiol® e Ecobiol® Plus); SF68 de Enterococcus faecium (da Fortiflora®); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (da BioPlus2B®); bactérias de ácido láctico 7 Enterococcus faecium (da Lactiferm®); cepa de Bacillus (da CSI®); Saccharomyces cerevisiae (da Yea-Sacc®); Enterococcus (da Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (da Biomin C5®); Lactobacillus farciminls (da Biacton®); Enterococcus (da Oralin E1707®); Enterococcus (2 cepas), Lactococcus lactis DSM 1103 (da Probios-pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminls (da Sorbiflore®); Bacillus subtilis (da Animavit®); Enterococcus (da Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (da Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (da Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (da Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (da ActiSaf® (anteriormente BioSaf®)); NCYC Sc47 de Saccharomyces cerevisiae (da Actisaf® SC47); Clostridium butyrlcum (da Miya-Gold®); Enterococcus (da Fecinor e Fecinor Plus®); NCYC R-625 de Saccharomyces cerevisiae (da InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (da BioSprint®); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (da Provita®); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (da PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (da Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM 1-1012 (da TOYOCERIN®) ou outros DFMs, tais como Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis (da BioPlus® YC) e Bacillus subtilis (da GalliPro®).

[00179] O DFM pode ser combinado com Enviva® PRO, que está comercialmente disponível junto à Danisco A/S. Enviva Pro® é uma combinação da cepa 2084 de Bacillus, n² de registro NRRI B-50013,

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64/139 cepa LSSA01 de Bacillus, n-^Q de registro NRRL B-50104, e cepa 15AP4 ATCC de Bacillus, n° de registro PTA-6507 (conforme apresentado no documento n^eUS 7.754.469 B - incorporado ao presente documento a título de referência).

[00180] Também é possível combinar o DFM descrito no presente documento com uma levedura do gênero: Saccharomyces spp.

[00181] De preferência, o DFM descrito no presente documento compreende micro-organismos que são geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) e, de preferência, são aprovados por GRAS.

[00182] Um indivíduo de habilidade comum na técnica estará prontamente ciente de espécies e/ou cepas específicas de microorganismos dos gêneros descritos no presente documento, os quais são usados nas indústrias alimentícias e/ou agrícolas e que são geralmente considerados adequados para o consumo animal.

[00183] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Esse é particularmente o caso quando a ração é peletizada. Portanto, em uma outra modalidade, o DFM pode ser um micro-organismo termotolerante, tal como uma bactéria termotolerante, incluindo, por exemplo, Bacillus spp.

[00184] Em outros aspectos, pode ser desejável que o DFM compreenda uma bactéria produtora de esporos, tal como Bacilli, por exemplo, Bacillus spp. Bacilli têm capacidade para formar endósporos estáveis, quando as condições para o crescimento são desfavoráveis, e são muito resistentes ao calor, ao pH, à umidificação e a desinfetantes.

[00185] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de micro-organismos patogênicos (tal como Clostridium perfríngens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser antipatogênico. O termo antipatogênico, conforme usado no presente docu

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65/139 mento, significa que o DFM neutraliza um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[00186] Conforme descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o seguinte ensaio ENSAIO DFM pode ser usado para determinar a adequação de um micro-organismo a um DFM. O ensaio DFM, conforme usado no presente documento, é explicado com mais detalhes no documento n^a US2009/0280090. Para evitar dúvidas, o DFM selecionado como uma cepa inibidora (ou um DFM antipatogênico) de acordo com o ENSAIO DFM apresentado no presente documento é um DFM adequado para uso de acordo com a presente descrição, isto é, na composição de aditivo de ração de acordo com a presente descrição.

[00187] Tubos foram semeados, cada um com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) proveniente de um grupamento representativo.

[00188] O sobrenadante de um potencial DFM, desenvolvido aeróbica ou anaerobicamente, é adicionado aos tubos semeados (exceto para o controle, ao qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubado. Após a incubação, a densidade óptica (OD) dos tubos de controle e tratados com o sobrenadante foi medida para cada patógeno. As colônias de cepas (de potencial DFM) que produziram uma OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qualquer sobrenadante) podem, então, ser classificadas como uma cepa inibidora (ou um DFM antipatogênico). Assim, o ensaio DFM, conforme usado no presente documento, é explicado com mais detalhes no documento nUS2009/0280090.

[00189] De preferência, um patógeno representativo usado nesse ensaio DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostrídio, tal como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coll e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade prefe

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66/139 rencial, o ensaio é conduzido com um ou mais dentre Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coli, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, com mais preferência, Clostridium perfringens.

[00190] DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais dentre as seguintes bactérias e estão descritos no documento n² WO2013029013: cepa 3BP5 de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50510, cepa 918 ATCC de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50508 e cepa 1013 ATCC de Bacillus subtilis, n² de registro NRRL B-50509.

DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e veículo (veículos) (quando usados) e podem ser adicionados a um misturador he~ licoidal ou de pás e misturados por cerca de 15 minutos, embora a temporização possa ser aumentada ou diminuída. Os componentes são mesclados de modo que resulte uma mistura uniforme das culturas e veículos. O produto final é, de preferência, um pó seco fluidificável. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode, então, ser adicionado à ração para animais ou a uma prémistura de ração, adicionado a uma água do animal ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente documento.

[00191] A inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ocorrer em proporções que variam de 1 % a 99% e, de preferência, de 25% a 75% [00192] Dosagens adequadas do DFM na ração para animais podem variar de cerca de 1x10³ CFU/g de ração a cerca de 1x10¹⁰CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 1x10⁴ CFU/g de ração e cerca de 1x10⁸ CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 7,5x10⁴ CFU/g de ração e cerca de 1x10⁷ CFU/g de ração.

[00193] Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado no gênero alimentício em mais que cerca de 1x10³ CFU/g de ração, adequada

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67/139 mente, mais que cerca de 1x10⁴ CFU/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 5x10⁴ CFU/g de ração ou, adequadamente, mais que cerca de 1x10⁵ CFU/g de ração.

[00194] O DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração de cerca de 1x10³ CFU/g de composição a cerca de 1x10¹³CFU/g de composição, de preferência, 1x10⁵ CFU/g de composição a cerca de 1x10¹³ CFU/g de composição, com mais preferência, entre cerca de 1x10⁶ CFU/g de composição e cerca de 1x10¹² CFU/g de composição e, com máxima preferência, entre cerca de 3,75x10⁷CFU/g de composição e cerca de 1x10¹¹ CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração em mais que cerca de 1x10⁵ CFU/g de composição, de preferência, mais que cerca de 1x10⁶ CFU/g de composição e, com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x10⁷ CFU/g de composição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição de aditivo de ração em mais que cerca de 2x10⁵ CFU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 2x10® CFU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 3,75x10⁷ CFU/g de composição.

[00195] Uma composição de aditivo de ração para uso na ração para animais pode compreender pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease, conforme descrito no presente documento, usado isoladamente ou (a) em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) em combinação com pelo menos uma outra enzima ou (c) em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima, e (d) pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potás

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68/139 sio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[00196] Em ainda um outro aspecto, é revelada uma composição de aditivo de ração granulada para uso na ração para animais que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease, conforme descrito no presente documento, usado isoladamente ou em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou em combinação com pelo menos uma outra enzima ou em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervaçâo, preparação de comprimidos ou quaisquer combinação dos processos acima.

[00197] Além disso, as partículas da composição de aditivo de ração granulada podem ter um diâmetro médio maior do que 50 microns e menor do que 2.000 microns [00198] A composição de aditivo de ração pode ter uma forma líquida, e a forma líquida também pode ser considerada adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.

[00199] Rações para animais podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetal para aves, porcos, ruminantes, aquacultura e animais de estimação. ContemplaPetição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 93/171

69/139 se que parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingestão de ração e eficácia da ração, mas também uniformidade melhorada, concentração reduzida de amônia no estabelecimento para animais e, consequentemente, melhoria do bem-estar e do estado de saúde dos animais serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, desempenho animal pode ser determinada pela eficácia da ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão da ração e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digerível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade dos animais para evitar os efeitos negativos de entente necrótica e/ou pela resposta imunológica do indivíduo.

[00200] De preferência, o desempenho animal é determinado pela eficácia da ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão da ração.

[00201] Por desempenho animal melhorado entende-se que há um aumento da eficácia da ração, e/ou aumento de ganho de peso e/ou redução da razão de conversão da ração e/ou melhora da digestibilidade de nutrientes ou energia em uma ração e/ou por melhor retenção de nitrogênio e/ou por melhor capacidade para evitar os efeitos negativos da entente necrótica e/ou por uma melhora na resposta imunológica do indivíduo resultante do uso da composição de aditivo de ração da presente invenção na ração em comparação com a ração que não compreende a dita composição de aditivo de ração.

[00202] De preferência, por desempenho animal melhorado entende-se que há aumento da eficácia da ração e/ou aumento de ganho de peso e/ou redução da razão de conversão da ração. Conforme usado no presente documento, o termo eficácia da ração refere-se à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o

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70/139 animal é alimentado ad-iibitum ou com uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.

[00203] Por aumento da eficácia da ração entende-se que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um aumento de ganho de peso por unidade de ingestão de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.

[00204] Conforme usado no presente documento, o termo razão de conversão da ração refere-se à quantidade de ração com a qual um animal foi alimentado para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada.

[00205] Uma melhor razão de conversão da ração significa uma menor razão de conversão da ração.

Por menor razão de conversão da ração ou melhor razão de conversão da ração entende-se que o uso de uma composição de aditivo de ração na ração resulta em uma menor quantidade de ração necessária para alimentar um animal de modo a aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando a ração não compreende a dita composição de aditivo de ração.

[00206] Digestibilidade de nutriente, conforme usado no presente documento, significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou de um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutriente pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do indivíduo, ou entre o que é administrado ao indivíduo e o que permanece na regurgitação em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[00207] A digestibilidade de nutriente, conforme usado no presente

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71/139 documento, pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excremento durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal, e permite que o pesquisador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu em todo o trato gastrointestinal ou em um segmento do trato gastrointestinal. Tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração ou como unidades de massa de nutriente digerível por unidades de massa de nutriente na ração.

[00208] A digestibilidade de nutriente, conforme usado no presente documento, abrange digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.

[00209] Digestibilidade de energia, conforme usado no presente documento, significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta nas fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta na regurgitação restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo. Energia metabolizável, conforme usado no presente documento, refere-se à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou na regurgitação presente no segmento especificado do trato gastrointestinal com o uso dos mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções adequadas para excreção de nitrogênio para calcular a energia metabolizável da ração.

[00210] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento podem melhorar a digestibilidade ou a utilização

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72/139 de hemicelulose ou fibra dietária em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um porco.

[00211] Retenção de nitrogênio, conforme usado no presente documento, significa a capacidade do indivíduo para reter nitrogênio da dieta como massa corporal. Um saldo negativo de nitrogênio ocorre quando a excreção de nitrogênio excede a ingestão diária e é frequentemente observado quando há perda muscular. Um saldo positivo de nitrogênio está frequentemente associado ao crescimento muscular, particularmente em animais em crescimento.

[00212] A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado por meio da coleta total de excremento e urina durante um período de tempo. Compreende-se que o nitrogênio excretado inclui proteína não digerida da ração, secreções proteicas endógenas, proteína microbiana e nitrogênio urinário.

[00213] O termo sobrevivência, conforme usado no presente documento, significa o número de indivíduo que permanecem vivos. O termo sobrevivência melhorada pode ser uma outra forma de dizer mortalidade reduzida.

[00214] O termo rendimento de carcaça, conforme usado no presente documento, significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso do corpo vivo, após um processo comercial ou experimental de abate. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido para fins alimentares, com a cabeça, as entranhas, parte dos membros e penas ou pele removidos. O termo rendimento de carne, conforme usado no presente documento, significa a quantidade de carne comestível como uma proporção do peso do corpo vivo, ou a quantidade de um corte especificado de carne como uma proporção do peso do corpo vivo.

[00215] Um aumento de ganho de peso refere-se a um animal que

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73/139 tem aumento de peso corporal ao ser alimentado com a ração que compreende uma composição de aditivo de ração em comparação com um animal que é alimentado com uma ração sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.

[00216] O termo animal, conforme usado no presente documento, inclui todos os animais ruminantes e não ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, tal como um cavalo e um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástrlcos incluem, porém sem limitação, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves, tais como perus, patos, galinhas, frangos, aves de postura; peixes, tais como salmão, truta, tilápia, bagre e caspas; e crustáceos, tais como camarões. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante que inclui, porém sem limitação, gado, jovens bezerros, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervos, iaques, búfalo de água, veados, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.

[00217] No presente contexto, pretende-se que o termo alimento para animais de estimação seja compreendido como um alimento para um animal doméstico, tal como, porém sem limitação, cães, gatos, gerbos, hamsters, chinchilas, ratos de estimação, porquinhos-da-índia; aves domésticas, tais como canários, periquitos e papagaios; répteis domésticos, tais como tartarugas, lagartos e cobras; e animais domésticos aquáticos, tais como peixes e sapos tropicais.

[00218] Os termos composição de ração para animais, ração, gênero alimentício e forragem são usados de modo intercambíável e podem compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, tais como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, tais como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, grãos secos de destilaria

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74/139 com solúveis (DDGS) (particularmente grãos secos de destilaria com solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmeas de trigo, polvilho de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma e polpa cítrica; c) proteína obtida a partir de fontes, tais como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, feijões-fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[00219] As serina proteases semelhantes à tripsina descritas no presente documento ou uma composição de aditivo de ração pode ser usado como uma ração ou na preparação da mesma. Os termos composição de aditivo de ração e composição enzimática são usados de modo intercambiável no presente documento.

[00220] A ração pode estar sob a forma de uma solução ou como um sólido ou como um semissólido, dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[00221] Quando usada como uma ração ou na preparação da mesma, como ração funcional, a composição enzimática ou de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser usada em conjunto com um ou mais dentre: um veículo nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, é mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de

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75/139 magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[00222] Em uma modalidade preferencial, a composição enzimática ou de aditivo de ração da presente invenção é misturada por adição com um componente de ração para formar um gênero alimentício. O termo componente de ração, conforme usado no presente documento, significa a totalidade ou parte do gênero aiimentício. Parte do gênero alimentício pode significa um constituinte do gênero aiimentício ou mais de um constituinte do gênero alimentício, por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou mais. Em uma modalidade, o termo componente de ração abrange uma pré-mistura ou os constituintes da pré-mistura. De preferência, a ração pode ser uma forragem ou uma pré-mistura da mesma, uma ração composta ou uma pré-mistura da mesma. Uma composição de aditivo de ração pode ser misturada por adição com uma ração composta, um componente de ração composta ou a uma pré-mistura de uma ração composta ou a uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00223] Quaiquer gênero alimentício descrito no presente documento pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, tais como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, tais como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, bagaço úmido (particularmente bagaço úmido à base de milho), grãos secos de destilaria (DDG) (particuiarmente grãos secos de destilaria à base de milho (cDDG)), grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS) (particularmente grãos secos de destilaria com solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmeas de trigo, polvilho de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma e polpa cítri

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76/139 ca; c) proteína obtida a partir de fontes, tais como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, feijões-fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00224] O termo forragem, conforme usado no presente documento, significa qualquer alimento que seja fornecido a um animal (em vez de o animal ter que se alimentar por si mesmo). A forragem abrange plantas que foram cortadas. Além disso, a forragem inclui silagem, alimentos prensadas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos e legumes germinados.

[00225] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais plantas selecionadas dentre: milho (mais), alfalfa (luzerna), cevada, trevocorniculado, brássica, Chau moellier, couve, colza (canola), rutabaga (sueca), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo-violeta, trevo-subterrâneo, trevo-banco, festuca, bromo, painço, aveia, sorgo, soja, árvores (brotos de árvore em talhadia para feno), trigo e legumes.

[00226] O termo ração composta significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, frutos secos, bagaço ou uma migalha. Rações compostas podem ser mescladas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Essas mesclas são formuladas de acordo com as necessidades específicas do animal-alvo.

[00227] As rações compostas podem ser rações completas que fornecem todos os nutrientes diariamente necessários, concentrados que fornecem uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que fornecem apenas micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.

[00228] Os ingredientes principais usados na ração composta são os grãos de ração, que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, soja, sorgo, aveia e cevada.

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77/139 [00229] Adequadamente, uma pré-mistura, conforme mencionado no presente documento, pode ser uma composição composta por ml· croingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. Pré-misturas são normalmente composições adequadas para mescla em rações comerciais.

[00230] Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tal como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00231] Em uma modalidade, o componente de ração pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tal como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00232] Um gênero alimentício descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou de milho e soja com gordura total, ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00233] Por exemplo, um gênero alimentício pode conter entre cerca de 5 e cerca de 40% de DDGS à base de milho. Para aves, o gênero alimentício em média pode conter entre cerca de 7 e 15% de DDGS à base de milho. Para suínos (porcos), o gênero alimentício pode conter em média 5 a 40% de DDGS à base de milho. O mesmo também pode conter milho como um único grão, caso em que o gênero alimentício pode compreender entre cerca de 35% e cerca de 80% de milho.

[00234] Em gêneros alimentícios que compreendem grãos mistos, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, o gênero alimentício pode compreender pelo menos 10% de milho.

[00235] Adicional ou alternativamente, um gênero alimentício também pode compreender pelo menos um material de ração com alto

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78/139 teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras para fornecer um gênero alimentício com alto teor de fibras. Exemplos de materiais de ração com alto teor de fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, ração de glúten de milho, bagaço úmido, grãos secos de destilaria (DDG), grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmeas de trigo, polvilho de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de avela, caroço de palma e polpa cítrica. Algumas fontes de proteína também podem ser consideradas com alto teor de fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, feijões-fava e algodão. Em um aspecto, o gênero alimentício, conforme descrito no presente documento, compreende pelo menos um material com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras selecionado dentre o grupo que consiste em grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), particularmente cDDGS, bagaço úmido, grãos secos de destilaria (DDG), particularmente cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, o gênero alimentício da presente invenção compreende pelo menos um material com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras selecionado dentre o grupo que consiste em grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), particularmente cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.

[00236] A ração pode ser uma ou mais dentre as seguintes: uma ração e pré-mistura compostas, incluindo péletes, frutos secos ou bagaço (para gado); uma plantio ou resíduo de plantio: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, palhiço, refugo de beterraba sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaço; bagaço de óleo e bagaço prensado; oligossacarídeos; plantas forrageiras conservadas: silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou prepara

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79/139 dos por tritu ração, moagem, etc.; grãos e legumes germinados; extrato de levedura.

[00237] O termo ração, conforme usado no presente documento, abrange, em algumas modalidades, alimentos para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é um material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimentos para cães ou alimentos para gatos. Alimentos para animais de estimação, tais como alimentos para cães e gatos, podem estar sob uma forma seca, tal como flocos para cães, ou sob forma úmida enlatada. Alimentos para gatos podem conter o aminoácido taurina.

[00238] A ração para animais também pode incluir um alimento para peixes. Um alimento para peixes normalmente contém macronutrientes, oligoelementos e vitaminas necessárias para manter os peixes de cativeiro em boa saúde. Alimentos para peixes podem estar sob a forma de lascas, péletes ou tabletes. As formas peletizadas, algumas das quais afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixes maiores ou espécies que se alimentam em profundidade. Alguns alimentos para peixes também contêm aditivos, tais como beta caroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor dos peixes ornamentais.

[00239] Em ainda um outro aspecto, a ração para animais abrange alimentos para pássaros. Alimentos para pássaros incluem o alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros quanto para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, alimentos para pássaros compreendem uma variedade de sementes, mas também pode abranger sebo (carne bovina ou gordura de carneiro).

[00240] Conforme usado no presente documento, o termo colocado em contato refere-se à aplicação indireta ou direta de uma enzima de serina protease semelhante à tripsina (ou composição que compreende a serina protease termoestável) a um produto (por exemplo, a

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80/139 ração). Exemplos de métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratar o produto em um material que compreende a composição de aditivo de ração, aplicação direta misturando-se a composição de aditivo de ração com o produto, aspergindo-se a composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imergindo-se o produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é, de preferência, misturada por adição com o produto (por exemplo, gênero alimentício). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes brutos de um gênero alimentício. Para algumas aplicações, é importante que a composição esteja disponibilizada sobre a superfície de um produto a ser afetado/tratado ou na mesma. Isso permite que a composição conceda um benefício de desempenho.

[00241] Em alguns aspectos, as serina proteases termoestáveis descritas são usadas para o pré-tratamento de alimento ou ração. Por exemplo, a ração que tem 10 a 300% de umidificação é misturada e incubada com as proteases a 5 a 80°C, de preferência, a 25 a 50°C, com mais preferência, entre 30 e 45°C por 1 mln a 72 horas sob condições aeróbicas ou 1 dia a 2 meses sob condições anaeróbicas. Os animais podem ser alimentados diretamente com o material prétratado (chamada de alimentação líquida). O material pré-tratado também pode ser peletizado a vapor a temperaturas elevadas de 60 a 120°C. As proteases podem ser impregnadas no material de ração ou alimento por um revestldor a vácuo.

[00242] Serina proteases semelhantes à tripsina (ou a composição que compreende as serina proteases termoestáveis) podem ser aplicadas para espargir, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, gênero alimentício ou ingredientes brutos de um gênero alimentício) com uma quantidade controlada da dita enzima.

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81/139 [00243] De preferência, a composição de aditivo de ração será termicamente estável ao tratamento térmico de até cerca de 70°C; até cerca de 85°C; ou até cerca de 95°C. O tratamento térmico pode ser realizado por até cerca de 1 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minutos. O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 75% dos componentes da enzima e/ou DFM que estavam presentes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada ainda estão presentes/ativos após o resfriamento à temperatura ambiente. De preferência, pelo menos cerca de 80% dos componentes de protease e/ou DFM que compreendem uma ou mais cepas bacteríanas que estavam presentes e ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada ainda estão presentes e ativos após o resfriamento à temperatura ambiente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição de aditivo de ração é homogeneizada para produzir um pó.

[00244] Alternativamente, a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, conforme descrito no documento n^QW02007/044968 (denominados grânulos TPT), incorporado ao presente documento a título de referência.

[00245] Em uma outra modalidade preferencial, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo da proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é melhoria da termotolerância, melhoria da estabilidade no armazenamento e proteção contra outros aditivos de ração que, de outra forma, têm efeitos adversos na pelo menos uma protease e/ou DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas. De preferência, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade em água superior a 0,25 ou umidificação constante superior a 60% a 20°C. De preferência, o revestimento de sal

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82/139 compreende um NasSCU [00246] O método para preparar uma composição de aditivo de ração também pode compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de um molde e os filamentos resultantes são cortados em péletes adequados de comprimento variável.

[00247] Um método para preparar serina proteases semelhantes à tripsina (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) também pode compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de um molde e os filamentos resultantes são cortados em péletes adequados de comprimento variável.

[00248] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento a vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100°C; temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de permanência pode variar de segundos a minutos e até horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto a 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será compreendido que as serina proteases termoestáveis (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) descritas no presente documento são adequadas para adição a qualquer material de ração adequado.

[00249] Será compreendido pelo versado na técnica que animais diferentes necessitam de gêneros alimentícios diferentes, e até o mesmo animal pode necessitar de gêneros alimentícios diferentes, de

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83/139 pendendo do propósito para o qual o animal é criado, [00250] Opcionalmente, o gênero alimentício também pode conter minerais adicionais, tais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, o gênero alimentício é uma mistura de farinha de milho e de soja.

[00251] O gênero alimentício é tipicamente produzido em moinhos de ração nos quais matérias-primas são, primeiramente, trituradas até um tamanho de partícula adequado e, então, misturadas com aditivos adequados. O gênero alimentício pode, então, ser produzido como um mosto ou péletes; o último tipicamente envolve um método no qual a temperatura é elevada até um nível-alvo e, então, a ração é passada através de um molde para produzir péletes de um tamanho específico. Permite-se que os péletes resfriem. Subsequentemente, aditivos líquidos, tais como gordura e enzima, podem ser adicionados. A produção do gênero alimentício também pode envolver uma etapa adicional que inclui a extrusão ou expansão antes da peletização, em particular, por meio de técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00252] O gênero alimentício pode ser um gênero alimentício para um animal monogástrico, tal como aves (por exemplo, frangos, aves de postura, frangos reprodutores, perus, patos, gansos, aves aquáticas) e suínos (todas as categorias de idade), um ruminante, tal como gado (por exemplo, vacas ou touros (incluindo bezerros)), cavalos, ovelhas, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixes (por exemplo, peixes agástrícos, peixes gástricos, peixes de água doce, tais como salmão, bacalhau, trutas e carpas, por exemplo, caspas koi, peixes de água salgada, tais como robalo, e crustáceos, tais como camarões, mexilhões e vieiras). De preferência, o gênero alimentício se destina a aves.

[00253] A composição de aditivo de ração e/ou o gênero alimentício

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84/139 que compreende a mesma podem ser usados em qualquer forma adequada. A composição de aditivo de ração pode ser usada sob a forma de preparações sólidas ou líquidas ou alternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolus, cápsulas, péletes, tabletes, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por aspersão ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas e orgânicas.

[00254] Em algumas aplicações, as composições de aditivo de ração podem ser misturadas ou administradas na água potável.

[00255] Uma composição de aditivo de ração que compreende a mistura por adição de uma protease, conforme apresentado no presente documento, com um veículo, diluente ou excipiente para ração aceitável e (opcionalmente) a embalagem.

[00256] O gênero alimentício e/ou a composição de aditivo de ração podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. As composições derivadas dessa forma podem ser denominadas, no presente documento, uma pré-mistura.

[00257] Em algumas modalidades, a serina protease semelhante à tripsina pode estar presente no gênero alimentício na faixa de 1 ppb (partes por bilhão) a 10% (p/p), com base na proteína enzimática pura. Em algumas modalidades, a protease presente no gênero alimentício está na faixa de 1 a 100 ppm (partes por milhão). Uma dose preferencial pode ser de 1 a 20 g de serina protease semelhante à tripsina por tonelada de produto de ração ou composição de ração ou uma dose final de 1 a 20 ppm de serina protease semelhante à tripsina no produto final.

[00258] De preferência, uma serina protease semelhante à tripsina presente no gênero alimentício deveria ser de pelo menos cerca de 200 PU/kg ou pelo menos cerca de 300 PLJ/kg de ração ou pelo menos

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85/139 cerca de 400 PU/kg de ração ou peto menos cerca de 500 PU/kg de ração ou peto menos cerca de 600 PU/kg de ração, peto menos cerca de 700 PU/kg de ração, pelo menos cerca de 800 PU/kg de ração, pelo menos cerca de 900 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 1.000 PU/ kg de ração, ou pelo menos cerca de 1.500 PU/kg de ração, ou peto menos cerca de 2.000 PU/kg de ração ou peto menos cerca de 2.500 PU/kg de ração, ou peto menos cerca de 3.000 PU/kg de ração, ou peto menos cerca de 3.500 PU/kg de ração, ou peto menos cerca de 4.000 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 4.500 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 5.000 PU/kg de ração.

[00259] Em um outro aspecto, uma serina protease semelhante à tripsina pode estar presente no gênero alimentício em menos que cerca de 60.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 70.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 80.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 90.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 100.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 200.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 60.000 PU/kg de ração ou em menos que cerca de 70.000 PU/kg de ração.

[00260] Faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferiores ou superiores discutidas acima.

[00261] Será compreendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera 2,3 microgramas de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) de um substrato de caseína por minuto a pH 10,0 a 50°C. Isso pode ser denominado o ensaio para determinar 1 PU.

[00262] Formulações que compreendem qualquer uma dentre as serina proteases semelhantes à tripsina e as composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer maneira adequada para garantir que a formulação compreenda enzimas ativas. Tais formulações podem ser um líquido, um pó seco ou um grânulo.

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De preferência, a composição de aditivo de ração está sob uma forma líquida, e a forma líquida pode ser adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração.

[00263] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos pelos versados na técnica, tais como granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, aspersão de leito fluidizado.

[00264] Serina proteases semelhantes à tripsina e as composições descritas no presente documento podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas contra o calor e pode ser considerado um termoprotetor.

[00265] A composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser formulada em um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento n² W02007/044968 (denominados grânulos TPT) ou nos documentos n^ W01997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência).

[00266] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dentre a) um processo de peletizaçâo de ração, b) um processo de pré-tratamento de ração aquecido por vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura-base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado dentre oligoelementos minerais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e

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87/139 compostos que resultam em uma mistura-base de ração ou prémistura de ração ácida ou básica.

[00267] Em relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira contra umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode constituir entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira contra umidificação pode constituir entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira contra umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro e amido.

[00268] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração, e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C por até diversos minutos, tal como entre 85°C e 95°C.

[00269] A composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração para animais que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor, em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira contra umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade em água inferior a 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.

[00270] O grânulo pode ter um revestimento de barreira contra umidificação selecionado dentre polímeros e gomas, e o material de hidra

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88/139 tação por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação por umidificação pode constituir entre 25% e 45% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira contra umidificação pode constituir entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[00271] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85°C e 95°C por até diversos minutos.

[00272] Alternativamente, a composição encontra-se em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal consumo líquido contém um ou mais dentre os seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00273] Além disso, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato veículo, tal como trigo triturado, por exemplo. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como uma pré-mistura. Apenas a título de exemplo, a prémistura pode compreender um ou mais componentes de ração, tais como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[00274] Em uma modalidade, um mlcro-organismo de alimentação direta (DFM) e/ou serina proteases termoestáveis são formulados com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente do trigo, sacarose, amido, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propilenoglicol, 1,3-propanodiol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formato e misturas dos mesmos.

[00275] Exemplos não limitantes de composições e métodos revelados no presente documento incluem:

1. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina pro

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89/139 tease selecionado dentre o grupo que consiste em:

2. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease que compreende uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre: SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9; e SEQ ID NO:12.

3. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de serina protease que compreende uma região catalítica de protease selecionada dentre:

a) uma região catalítica de protease que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 96% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18;

c) uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20;

d) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21;

4. Um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção operaci

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90/139 onalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica peio menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease, de acordo com as modalidades 1 a 3.

5. O construto recombinante, de acordo com a modalidade 5, em que o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.

6. Um método para produzir pelo menos um polipeptídeo que tem serina protease que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, de acordo com a modalidade 4; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que o pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease seja produzido.

7. Um método, de acordo com modalidade 6, em que a serina protease é opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.

8. Um sobrenadante de cultura contendo serina protease obtido pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades 6 ou 7.

9. Um hospedeiro de produção microbiano recombinante para expressar pelo menos um polipeptídeo, sendo que o dito hospedeiro de produção microbiano recombinante compreende o construto recombinante, de acordo com a modalidade 4.

10. Um hospedeiro de produção, de acordo com modalidade 9, em que o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos e algas.

11. Ração para animais que compreende pelo menos um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o dito polipeptídeo está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/ton de ração.

12. A ração para animais, de acordo com a modalidade 11,

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91/139 que compreende, ainda, pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

13. A ração para animais, de acordo com a modalidade 11 ou 12, que compreende, ainda, pelo menos uma outra enzima.

14. Uma ração, um gênero alimentício, uma composição de aditivo de ração ou uma pré-mistura que compreende pelo menos um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3.

15. A ração, o gênero alimentício, a composição de aditivo de ração ou a pré-mistura, de acordo com a modalidade 14, que compreende, ainda, pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.

16. A ração, o gênero alimentício, a composição de aditivo de ração ou a pré-mistura, de acordo com a modalidade 14 ou 15, que compreende, ainda, pelo menos uma outra enzima.

17. A composição de aditivo de ração, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 17, em que a dita composição compreende, ainda, pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

18. Uma composição de aditivo de ração granulada para uso na ração para animais que compreende pelo menos um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em

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92/139 granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos e combinação dos mesmos.

19. A composição de aditivo de ração granulada, de acordo com a modalidade 18, em que o diâmetro médio das partículas é maior do que 50 microns e menor do que 2.000 microns.

20. A composição de aditivo de ração, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 17, em que a dita composição está em uma forma líquida.

21. A composição de aditivo de ração, de acordo com a modalidade 20, em que a dita composição está em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração. EXEMPLOS [00276] A menos que definido de outra forma no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente compreendo por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et a/„ DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2^a edição, John Wiley e Sons, Nova York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) fornecem ao especialista um dicionário geral de muitos dos temos usados nesta descrição.

[00277] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indiquem determinadas modalidades, são fornecidos apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode verificar características essenciais desta descrição e,

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93/139 sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode realizar várias mudanças e modificações de modo a se adaptar aos vários usos e condições.

EXEMPLO 1

Clonagem de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces so [00278] Quatro cepas bacterianas (C004 de Streptomyces sp., C009 de Streptomyces sp., C001 de Streptomyces sp. e S055 de Streptomyces sp.) foram selecionadas como fontes potenciais de enzimas que podem ser úteis em várias aplicações industriais. O DNA cromossômico foi isolado das quatro cepas e sequenciado com o uso de tecnologia de sequenciamento da próxima geração da Illumina. Os genes que codificam serina proteases semelhantes à tripsina foram identificados após a anotação nas quatro espécies de Streptomyces supracitadas; e identificou-se sua sequência de nucleotídeos ou aminoácidos.

[00279] Os genes para todos as 4 proteínas têm um peptídeo sinal N terminal conforme previsto pelo software SignalP, versão 4.0 (Nordahl Petersen et al. (2011) Nature Methods, 8:785 a 786), sugerindo que todas são enzimas secretadas.

[00280] A sequência de nucleotídeos do gene SspCPro29 isolado de C009 de Streptomyces sp. é apresentada como a SEQ ID NO:1. A sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro29 é apresentada como a SEQ ID NO:2. A sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro29 é apresentada como a SEQ ID NO:3. [00281] A sequência de nucleotídeos do gene SspCPro33 isolado de C001 de Streptomyces sp. é apresentada como a SEQ ID NO:4: A sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro33 é apresentada como a SEQ ID NO:5. A sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro33 é apresentada como a SEQ ID NO:6.

[00282] A sequência de nucleotídeos do gene SspCPro23 isolado

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94/139 de C003 de Streptomyces sp. é apresentada como a SEQ ID NO:7. A sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro23 é apresentada como a SEQ ID NO:8. A sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro23 é apresentada como a SEQ ID NO:9. [00283] A sequência de nucleotídeos do gene SspCPro59 isolado de C055 de Streptomyces sp. é apresentada como a SEQ ID NO:10. A sequência sinal prevista da proteína precursora de SspCPro59 é apresentada como a SEQ ID NO:11. A sequência de aminoácidos da proteína precursora de SspCPro59 é apresentada como a SEQ ID NO:12. Com base na previsão da sequência sinal, as sequências de aminoácidos de comprimento total são previstas da seguinte forma: SspCPro29 (SEQ ID NO:22); SspCPro33 (SEQ ID NO: 23); SspCPro23 (SEQ ID NO:24); e SspCPro59 (SEQ ID NO:25).

EXEMPLO 2

Expressão de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00284] As sequências de DNA que codificam a forma madura do propeptídeo (proteína precursora menos sequência sinal) dos homólogos de tripsina de Streptomyces sp SspCPro23, SspC29, SspC33 e SspC59 foram sintetizadas e foram, cada uma, Inseridas no vetor de expressão de Bacillus subtills p2JM103BBI (Vogtentanz, Protein Expr Puríf, 55:40 a 52, 2007) por Generay (Shanghai, China). Os plasmídeos resultantes foram designados pGX384(AprE-SspCPro23), pGX390 (AprE-SspCPro29), pGX394(AprE-SspCPro33) e pGX738 (AprESspCPro59). Os genes sintéticos têm um códon inicial alternativo (GTG). [00285] O mapa de plasmídeo de pGX390(AprE-SspCPro29) é fornecido na Figura 1 e os outros três plasmídeos têm composição similar, com a exceção do gene inserido que codifica cada gene de interesse (GOI) da serina protease. As sequências de nucleotídeos dos genes sintéticos AprE-SspCPro23, AprE-SspCPro29, AprE-SspCPro33, AprESspCPro59 são apresentadas como as SEQ ID NOs: 13, 14, 15 e 16,

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95/139 respectivamente. A ligação do gene que codifica cada GOI no vetor de expressão linearizado resultou na adição de três códons (resíduos de codificação Ala-Gly-Lys) entre a extremidade 3’ da sequência que codifica o sinal AprE de B. subtilis e a extremidade 5’ da sequência que codifica a sequência madura de propeptídeo. A sequência sinal AprE (SEQ ID NO: 17) foi usada para direcionar as proteínas recombinantes para secreção em B. subtilis.

[00286] Os píasmídeos de expressão foram, então, transformados em células adequadas de B. subtilis, e as células transformadas foram cultivadas em placas de ágar Luria suplementadas com 5 ppm de cioranfenicol e leite desnatado a 1,2% (n² Cat 232100, Difco). Colônias que formam os maiores halos claros foram colhidas e usadas para culturas líquidas inoculadas. A fermentação foi realizada em frascos de agitação de 250 ml com o uso de um meio definido à base de MOPS, suplementado com CaCh 5 mM.

[00287] Para purificação de proteases SspCPro29 e SspCPro33, o sobrenadante clarificado das culturas do frasco de agitação foi submetido à cromatografia em coluna com o uso de interação hidrofóbica e resinas de troca iônica. As frações de proteína ativa resultantes foram, então, agrupadas e concentradas por meio dos dispositivos 10K Amicon Ultra, e armazenadas em glicerol a 40% a -20°C até o uso.

[00288] Com a utilização das anotações sobre a sequência de proteínas para a serina protease de Streptomyces griseus, Estreptogrisina C (número de registro Uniprot P52320), as várias regiões de sequência do SspCPro29, SspCPro 23, SspCPro 33 e SspCPro 59 foram adícionalmente analisadas para identificar os resíduos de aminoácido putativos que compreendem os domínios catalíticos dessas proteases. Estreptogrisina C é expressa como um polipeptídeo do resíduo 457 que compreende uma sequência sinal (resíduos 1 a 34), uma região de propeptídeos (resíduos 35 a 202) e uma cadeia madura (resíduos 203 a 457).

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96/139 [00289] A cadeia madura é compreendida, ainda, por um domínio catalítico (resíduos 203 a 393, SEQ ID NO:39), um ligante (resíduos 394 a 413) e uma região de ligação à quitina (resíduos 415 a 457). Com base nessas informações, os domínios catalíticos para SspCPro29, SspCPro 23, SspCPro 33 e SspCPro 59 foram previstos como: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, respectivamente.

EXEMPLO 3

Atividade proteolítica de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00290] As atividades proteolíticas de SspCPro29 e SspCPro33 purificados foram medidas em tampão de HEPES 50 mM (pH 8), com o uso de Suc-Aia-Ala-Pro-Phe-pNA (AAPF-pNA, rP Cat L-1400.0250, BACHEM) como um substrato. Uma amostra da protease de produto comercial RONOZYME® ProAct (DSM) foi usada como uma referência. Antes da reação, as enzimas foram diluídas com água purificada (Millipore) em concentrações específicas. O AAPF-pNA foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO, n^Q Cat STBD2470V, Sigma) até uma concentração final de 10 mM.

[00291] Para iniciar a reação, primeiramente, 5 μΙ de AAPF-pNA foram misturados com 85 μΙ de tampão de HEPES em uma placa de microtitulação de 96 poços sem ligação (96-MTP) (Corning Life Sciences, n^e3641) e incubados a 40°C por 5 min a 600 rpm em um termomisturador (Eppendorf), então, 10 μΙ da enzima diluída (ou H2O purificado Isoladamente como 0 controle em bruto) foram adicionados. Após 10 min de incubação em um termomisturador a 40°C e 600 rpm, a placa de reação foi lida diretamente em 410 nm com 0 uso de um SpectraMax 190. A parte líquida A410 foi calculada subtraindo-se ο A410 do controle em bruto daquele da enzima e, então, plotada contra concentrações diferentes de proteína (de 0,02 ppm a 0,3125 ppm). Cada

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97/139 valor foi a média de três ensaios.

[00292] A atividade proteolítica no substrato AAPF-pNA é mostrada na Figura 2 como a parte líquida A410. As atividades proteolíticas de SspCPro23 e SsCPro59 foram medidas com 0 uso de sobrenadante clarificado de culturas do frasco de agitação. O sobrenadante de cultura clarificado de células de B. subtilis transformadas com p2JM103BBI (que carecem de um gene de protease) foi usado como 0 controle do vetor. Antes da reação, os sobrenadantes foram diluídos 200 vezes com água purificada. O procedimento de ensaio foi realizado conforme descrito acima, e a parte líquida A410 foi calculada subtraindo-se ο A410 do controle do vetor daquele da amostra enzimática. Cada valor foi a média de três ensaios. A atividade proteolítica é mostrada como a parte líquida A410 na Tabela 1, indicados que SspCPro23 e SspCPro59 são proteases ativas.

Tabela 1. Atividade enzimática de SspCPro59 e SspCPro23 no substrato pNA-AAPF
ID de proteína	Absorvância de líquido 410 nm
SspCPro23	0,24
SspCPro59	0,27

EXEMPLO 4

Perfil de pH de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00293] Com AAPF-pNA como 0 substrato, 0 perfil de pH de homólogos de tripsina foi estudado em tampão de glioina/aoetato de sódio/HEPES 25 mM com diferentes valores de pH (na faixa de pH 3 a 10). Antes do ensaio, 85 μί de tampão de glicina/acetato de sódio/HEPES 25 mM com um valor de pH específico foram, primeiramente, misturados com 5 μί de AAPF-pNA 10 mM em uma 96-MTP e, então, com 10 μΙ de água purificada. A enzima diluída (0,2 ppm para SspCPro29 e SspCPro33 purificados, ou sobrenadante clarificado de SspCPro23 e SspCPro59 diluído 200 vezes) foi, então, adicionada pa

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98/139 ra iniciar a reação. Água ou o sobrenadante do controle do vetor (200 vezes diluído) foi usado como o controle em bruto para enzimas purificadas ou não purificadas, respectivamente. A reação foi realizada e analisada conforme descrito no Exemplo 3. A atividade enzimática em cada pH foi relatada como atividade relativa, em que a atividade no pH ideal foi definida como 100%. Os valores de pH testados para enzimas purificadas (SspCPro29 e SspCPro33) foram 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10; e para as não purificadas (SspCPro23 e SspCPro59) foram 3, 5,5, 8, 9, 10. Cada valor foi a média de três ensaios.

[00294] Conforme mostrado na Figura 3, todos os homólogos de tripsina eram proteases alcalinas.

EXEMPLO 5

Perfil de temperatura de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00295] O perfil de temperatura de homólogos de tripsina foi analisado em tampão de HEPES 50 mM (pH 8) com o uso do ensaio AAPF-pNA. Antes da reação, 85 μΙ de tampão de HEPES 50 mM, pH 8,0, e 5 μΙ de AAPF-pNA 10 mM foram adicionados em um tubo PCR de 200 μΙ, que foi, então subsequentemente incubado em um ciclador térmico Peltier (BioRad) em temperaturas desejadas (entre 30 e 80°C) por 5 min. Após a incubação, 10 μΙ de amostra enzimática (0,2 ppm para SspCPro29 e SspCPro33 purificados, e sobrenadante clarificado (200 vezes diluído) para SspCPro23 e SspCPro59) foram adicionados ao substrato para iniciar a reação. Água, isoladamente, ou o sobrenadante do controle do vetor (200 vezes diluído) foi adicionado como o controle em bruto para enzimas purificadas ou não purificadas, respectivamente. Após 10 min de incubação no ciclador térmico Peltier em diferentes temperaturas, 80 μΙ da mistura de reação foram transferidos para uma nova 96-MTP, e a absorvância foi lida em 410 nm. A atividade foi relatada como atividade relativa, em que a atividade na tempera

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99/139 turn ideal foi definida como 100%. As temperaturas testadas para enzimas purificadas (SspCPro29 e SspCPro33) foram 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 e 80°C; e, para proteínas não purificadas, SspCPro23 e SspCPro59 foram testadas a 35, 40, 50, 60 e 70°C. Cada valor relatado é a média de três ensaios. Os resultados são mostrados na Figura 4.

EXEMPLO 6

Hidrólise de farinha de milho e soja por serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00296] A extensão da hidrólise de farinha de milho e soja (uma mistura que tem 40% de farinha de soja e 60% de farinha de milho) pelos homólogos de tripsina foi avaliada com o uso de OPA (o» ftalaldeído) ou dos ensaios de detecção de BCA (ácido bicinconínico) descritos abaixo, para medir a quantidade de grupos amina N terminal ou peptídeos solúveis recém-produzidos, respectivamente, liberados no sobrenadante após as reações enzimáticas. Para conduzir os ensaios, 140 μΙ do substrato de farinha de milho e soja (10% (p/p) pasta fluida de farinha de milho e soja suspensa em tampão de MES, pH 6) foram misturados com 20 μΙ de uma amostra de enzima diluída purificada (SspCPro29 e SspCPro33) ou com 60 μΙ do sobrenadante clarificado (SspCPro23 e SspCPro59) em uma 96-MTP. Após a incubação por 2 h a 40°C em uma incubadora, as placas foram centrifugadas a 3.700 rpm por 15 min a 4°C. O sobrenadante resultante foi diluído 10 vezes em água para se preparar para a detecção de produto de reação subsequente com o uso dos ensaios com OPA e BCA. Para proteases purificadas, uma amostra de protease RONOZYME® ProAct (DSM) foi incluída como a protease de referência comercial, e água foi usada como o controle em bruto (sem enzima). Para as não purificadas, o sobrenadante do controle do vetor foi aplicado como o controle em bruto.

[00297] O reagente OPA foi preparado misturando-se 30 ml de

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100/139 tampão de fosfato trissódico a 2% (pH 11), 800 μΙ de OPA a 4% (nCat P1378, Sigma, dissolvido em etanol a 96%), 1 ml de ditiotreitol a 3,52% (n² Cat D0632, Sigma) e 8,2 ml de H2O, A reação foi iniciada adicionando-se 10 μΙ da reação de protease diluída 10X aos 175 μΙ de reagente OPA em uma 96-MTP (n² Cat 3635, Coming Life Sciences). Após 2 min de incubação a 20°C, a absorvância da solução resultante foi medida a 340 nm (A340) com 0 uso de um espectrofotômetro. A parte líquida A340 foi calculada subtraindo-se ο A340 do controle em bruto (água para SspCPro29 e SspCPro33; sobrenadante do controle do vetor para SspCPro23 e SspCPro59) daquele de cada reação de protease, para medir a extensão da hidrólise de farinha de milho e soja alcançada por cada amostra de protease. Os resultados são mostrados na Figura 5A e na Tabela 2.

[00298] A reação de BCA foi conduzida misturando-se 10 μΙ de sobrenadante diluído com 200 μΙ de reagente BCA seguindo as diretrizes do fabricante. A incubação foi conduzida em um termomisturador a 37°C por 30 min, e 0 produto das reações foi medido em um espectrofotômetro como uma leitura de absorvância do finai do teste em 562 nm. A parte líquida A562 foi calculada subtraindo-se 0 Asez do controle em bruto (água para SspCPro29 e SspCPro33; sobrenadante do controle do vetor para SspCPro23 e SspCPro59) daquele de cada reação de protease, para medir a extensão da hidrólise de farinha de milho e soja alcançada por cada amostra de protease. Os resultados são mostrados na Figura 5B e na Tabela 2.

Tabela 2. Hidrólise de farinha de milho e soja com OPA e BCA por proteases SspCPro23 e SspCPro59 a pH 6
	OPA (Parte Líquida34o)	BCA (Parte Líquidassz)
SspCPro23	0,04	0,04
SspCPro59	0,06	0,06

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EXEMPLO 7

Estabilidade de pepsina de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00299] A estabilidade de pepsina de homólogos de tripsina foi analisada incubando-os com pepsina (Sigma, n- Cat P7000) em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 3,0) e com o uso de AAPF-pNA como o substrato para a medição de atividade restante. Homólogos de tripsina e a pepsina foram, primeiramente, misturados em razões (p/p) de 1:0, 1:25, 1:250 ou 1:2.500, em que os homólogos de tripsina foram dosados em 20 ppm; e a mistura resultante foi subsequentemente incubada a 37°C por 30 min. Enquanto isso, alíquotas de 20 ppm de cada homólogo de tripsina foram mantidas em gelo como controles não tratados. Para a medição de atividade restante, 5 μΙ de AAPF-pNA 10 mM foram misturados com 85 pl de tampão de HEPES (50 mM, pH 8,0) em uma 96-MTP, então, 10 pl da mistura diluída em água purificada (0,2 ppm ou H2O isoladamente como 0 controle em bruto) foram adicionados. A reação foi realizada e analisada conforme descrito no Exemplo 3.

[00300] A Tabela 3 mostra a atividade enzimática residual após tratamento com pepsina, em que a atividade das amostras não tratadas mantidas em gelo foi definida como 100%.

Tabela 3. Estabilidade de pepsina de serina proteases SspCPro29 e SspCPro33
Amostra	não tratada	apenas tripsina	tripsina:	pepsina (razões)
			1:25	1:250	1:2500
SspCPro29	100	82	87	97	104
SspCPro33	100	97	95	98	106
Pro Act	100	101	102	100	94

EXEMPLO 8

Estabilidade de protease SspCPro29 sob condições de peletização de ração [00301] As condições de peletização foram as seguintes: 62,5 g de

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102/139 uma solução concentrada de protease SspCPro29 que consiste em 38,37 g de proteína foram diluídos em água de torneira até 600 ml e misturados com 120 kg de ração de milho e soja (60% de milho, 31,5% de farinha de soja, 4,0% de óleo de soja, 0,4% de sal, 0,2% de DL· metionina, 1,16% de calcário, 1,46% de fosfato de cálcio e 1,25% de mistura de vitaminas e minerais, em peso. Essa mistura foi peletizada a 90°C, ou 95°C por 30 segundos. Uma mistura preparada de maneira similar de amostra enzimática e ração de milho e soja (ração em mosto) que não sofreu peletização serve como o controle. As condições de extração foram as seguintes: 1 g de ração peletizada ou ração em mosto foi moído, misturado com 10 ml de tampão (tampão de Tris 100 mM com SDS a 1%, pH 10), em um béquer de 10 ml com uma barra de agitação magnética à temperatura ambiente (22°C) por 10 min, então, centrifugados a 4.000 rpm com o uso de uma centrífuga de bancada por 10 min. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de fibra de vidro. O filtrado foi diretamente usado no ensaio de atividade enzimática. As condições do ensaio de atividade enzimática foram as seguintes: 0,18 ml de tampão de tricina 0,1 M (pH 9,75 com SDS a 1%), 1 μΙ de extrato de ração de enzima e 20 μΙ de substrato AAPF-pNA (10 mg/ml em DMSO) foram misturados a 900 rpm por 1 min. As amostras foram incubadas a 30°C por 120 min com agitação constante.

[00302] A extensão da reação foi determinada medindo-se a absorvância em 410 nm em um espectrofotômetro. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Estabilidade de peletização de SspCPro29 medida como a recuperação da atividade enzimática de péletes versus mosto não tratado
Amostra	% de recuperação	cv
não peletização	100	3,6
peletização a 90°C	78,7	3,6
peletização a 95°C	62,0	4,1

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EXEMPLO 9

Hidrólise e solubilização de proteína na ração de milho e soja com protease SspCPro29 e protease SspCPro33 [00303] A reação continha, na MTP de 96 poços, 140 μΙ de pasta fluida de ração de milho e soja a 10% (p/p) (Yu S, Cowleson A, Gilbert C, Plumstead P, Dalsgaard S., Interactions of fitato and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. J. Anim. ScL 2012, 90:1.824 a 1.832) com pH ajustado para pH 3,0, 20 μΙ da protease em acetado de NA 50 mM, pH 3,0, gerando uma concentração final para a ração de milho e soja a 0, 250, 500, 750, 1.000 e 1.250 ppm, e 10 μΙ de pepsina (Sigma P7000 dissolvido em água a 1,69 mg/ml). A placa foi incubada a 40°C por 45 min em uma incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific) a 1.150 rpm. No final da incubação, 34 μΙ de pancreatina porcina (Sigma P7545, 0,4636 mg/ml em bicarbonato de sódio 1 M) foram adicionados e a placa foi mais uma vez incubada a 40°C por 60 min no agitador iEMS a 1.150 rpm. Após a incubação, a placa foi centrifugada a 5°C, 4.000 rpm por 15 min. 10 μΙ de sobrenadante foram transferidos para uma nova MTP de 96 poços contendo 90 μΙ de água (diluição de 10x). O sobrenadante diluído 10 vezes foi determinado quanto aos valores de OPA (hidrólise de proteína) e BCA (solubilização de proteína) em 340 nm e 562 nm, respectivamente.

[00304] A hidrólise de proteína com o uso de reagente o-ftalal~ deídeo (OPA) foi realizada basicamente conforme descrito anteriormente com pequenas modificações (P.M. NIELSEN, D. PETERSEN e

C. DAMBMANN, Improved method for determining food protein degree of hydrolysis, J. Food Sci. 66:642 a 646, 2001). O reagente OPA fol preparado novamente misturando-se 30 ml de fosfato trissódico (Na3PO4.12H2O, 2% em p/v em água com pH justado para pH 11), 0,8 ml de OPA (0,4 g de o-ftalaldeido a 97% (OPA) em 10 ml de etanol

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104/139 a 96%, conservado a -20°C), 1 ml de solução de DTT (0,352 g de DLditiotreitol (DTT) a 99% em 10 ml de água) e água até urn volume final de 40 ml. O reagente foi mantido no escuro e usado logo após a preparação. 20 μΙ de sobrenadante diluído 10x foram misturados com 175 μΙ do reagente OPA por 5 segundos e lido a 340 nm exatamente após 2 min.

[00305] A solubilização de proteína foi medida com o uso do kit de ensaio proteico Pierce BCA (Cat n^23225 da Thermo Fisher Scientific). 20 μί de sobrenadante foram misturados com 200 μΙ do reagente BCA (preparado antes do uso misturando-se 50 ml de reagente BCA A com 1 ml de reagente BCA B de acordo com as instruções do fabricante). A mistura foi incubada a 37°C por 30 min antes da absorvância a 562 nm ter sido medida.

[00306] As Tabelas 5.1 e 5.2 mostram que a hidrólise de proteína e a solubilização de proteína na ração de milho e soja aumentou com o aumento da dose de proteases SspCPro29 e SspCPro33 (respectivamente) de 0 para 1.250 ppm na presença tanto de pepsina quanto de pancreatina. Os respectivos coeficientes de correlação (R²) para hidrólise e solubilização foram 0,90 e 0,97.

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Tabela 5.1 Hidrólise e solubiiização de proteína de ração de milho e soja com protease SspCPro29

Concentração enzimátíca (ppm)	0	250	5ÕÕ	750	1000	1250	Coeficiente de correlação (R²)
Hidrólise de proteína (ensaio com OPA OD340)	0,529	0,689	0,761	0,806	0,835	0,884	0,900
Solubilização de proteína (ensaio com BCA OD562)	0,818	0,856	0,897	0,911	0,936	0,992	0,970

Tabela 5.2 Hidrólise e solubiiização de proteína de ração de milho e soja com protease SspCPro33
Concentração enzimátíca (ppm)	0	250	500	750	1000	1250	Coeficiente de correlação (R²)
Hidrólise de proteína (ensaio com OPA OD340)	0,513	0.634	0.682	0.698	0,717	0.753	0,854
Solubilização de proteína (ensaio com BCA OD562)	0,806	0,807	0,844	0,839	0,844	0,895	0,818

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EXEMPLO 10

Desempenho da limpeza de SspCPro29 e SspCPro33 em ADW [00307] O desempenho de limpeza das proteases SspCPro29 e SspCPro33 foi testado com o uso de microamostras de tecido PA-S-38 (gema de ovo, com pigmento, envelhecida por aquecimento) (CFTVlaardingen, Países Baixos) a pH 10,3 com o uso de um detergente modelo para lavagem automática (ADW). Para preparar amostras de tecido PAS38 enxaguadas, 180 μΙ de tampão de CAPS 10 mM (pH 11) foram adicionados às 96-MTPs contendo amostras de tecido PAS38. As placas foram vedadas e incubadas em uma incubadora iEMs por 30 min a 60°C, 1.100 rpm. Após a incubação, o tampão foi removido e as amostras de tecido foram enxaguadas com HzO purificado. As placas foram secas ao ar antes do uso no ensaio de desempenho.

[00308] Amostras de protease purificadas foram diluídas para 200 ppm em NaCI 10 mM contendo CaCL 0,1 mM e TWEEN®80 a 0,005%. Os testes foram realizados em 3 g/l de detergente GSM-B. A composição de detergente GSM-B (em percentual em peso) é a seguinte: citrato de sódio desidratado a 30%, dissilicato de sódio a 25% (Protil A, Cognis), sal de sódio de copolímero de ácido maleico/ácido acrílico a 12% (SOKALAN® CP5 BASF), mono-hidrato de perborato de sódio a 5%, TAED a 2%, etoxilado de álcool graxo linear a 2% e carbonato de sódio anidro adicionado até 100%. Uma alíquota de 190 μΙ do detergente GSM-B foi adicionada a uma 96-MTP contendo 1 microamostra de tecido PAS38 enxaguada por poço, e a reação foi iniciada pela adição de 10 μΙ de enzimas diluídas (ou a solução de diluição isoladamente como o controle em bruto). A 96-MTP foi vedada e colocada em uma incubadora/agitador por 30 min a 40°C e 1.150 rpm. Após a incubação, 100 μΙ de líquido de lavagem de cada poço foram transferidos para uma nova 96-MTP, e sua absorvância foi medida a 405 nm com o uso de um espectrofotômetro. A atividade de protease na mancha do

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107/139 modelo PAS38 é relatada como a parte líquida A405, subtraindo-se 0 A405 do controle em bruto daquele da amostra tratada com enzima.

[00309] As respostas à dose nas microamostras de tecido PAS38 com 0 uso do detergente GSM-B a pH 10,3 para SspCPro29 e SspCPro33 são mostradas na Figura 6.

EXEMPLO 11

Desempenho da limpeza de SspCPro29 e SspCPro33 em condições de lavanderia [00310] O desempenho de limpeza das proteases SspCPro29 e SspCPro33 em detergente de lavanderia líquido e em pó foi testado com 0 uso de microamostras de tecido EMPA-116 (algodão sujo com salgue/leite/tinta) (obtidas junto à CFT Vlaardingen, Países Baixos) a pH 8,0 ou pH 10,0. Antes dos testes, detergente líquido comercial (Tide Clean Breeze®, Proctor & Gamble, EUA) foi incubado a 95°C por 1 hora para inativar as enzimas presentes no detergente. O detergente termicamente tratado foi ainda mais diluído com HEPES 5 mM (pH 8,0) até uma concentração final de 0,788 g/l. A dureza da água desse detergente líquido tamponado foi ajustada para 100 ppm de Ca²⁺: Mg²⁺(razão de 3:1). Para a preparação de detergente em pó tamponado, 0 detergente comercial (Tide®, Proctor & Gamble, China) foi dissolvido para 2 g/l em água com dureza da água a 100 ppm e aquecido em um micro-ondas até fervura simples para inativar as enzimas. Os ensaios proteolíticos foram subsequentemente realizados para confirmar a inativação de proteases nos detergentes comerciais.

[00311] Antes dos testes, as microamostras de tecido EMPA-116 foram enxaguadas com água e secas ao ar. Para iniciar as reações, 190 μΙ de detergente tamponado foram adicionados aos poços das 96MTPs contendo as microamostras de tecido EMPA-116 enxaguadas, seguido pela adição de 10 μΙ de enzima diluída (ou H2O como controle em bruto). As 96-MTPs foram vedadas e incubadas por 20 min em

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108/139 iEMs a 32°C e em um termomisturador a 16°C, respectivamente. Após a incubação, 100 μΙ de líquido de lavagem de cada poço foram transferidos para uma nova 96-MTP, e a absorvância foi medida a 600 nm com o uso de um espectrofotômetro. A parte líquida Asoo foi calculada subtraindo-se o Aeoo do controle em bruto daqueles das amostras tratadas com enzima. As curvas de resposta à dose para SspCPro29 e SspCPro33 em microamostras de tecido EMPA-116 em detergente de lavanderia líquido e em pó foram realizadas a 16°C e 32°C. A BPN’ Y217L protease (SEQ ID NO:40) foi usada como referência para avaliação de HDL, e a GG36 protease (SEQ ID NO:41) foi usada como referência para avaliação de HDD.

[00312] Os resultados de desempenho de limpeza são mostrados na Figura 7 e na Figura 8, com o uso do detergente HDL a 16 e 32°C, e na Figura 9 e na Figura 10, com o uso do detergente HDD a 16 e 32°C.

EXEMPLO 12

Análise de sequência de proteínas de serina proteases do tipo tripsina de comprimento total previsto de Streptomyces sp [00313] Proteínas relacionadas foram identificadas por uma pesquisa BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997) com o uso das sequências de aminoácidos de comprimento total previsto para SspCPro29 (SEQ ID NO:22); SspCPro33 (SEQ ID NO: 23); SspCPro23 (SEQ ID NO:24 ); e SspCPro59 (SEQ ID NO:25 ) contra o banco de dados de patentes para busca pública e genômica com parâmetros de pesquisa definidos para valores padrão e um subconjunto é mostrado nas Tabelas 6A e 6B (SspCPro29); Tabelas 7A e 7B (SspCPro33); Tabelas 8A e 8B (SspCPro23); e Tabelas 9A e 9B (SspCPro59), respectivamente. O percentual de Identidade (PID) para ambos os conjuntos de pesquisa é definido como o número de resíduos idênticos divido pelo número de resíduos alinhados no alinha

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109/139 mento em pares. O valor rotulado como comprimento de sequência nas tabelas corresponde ao comprimento (em aminoácidos) das proteínas referenciadas com os números de registro listados, enquanto o comprimento alinhado refere-se à sequência usada para alinhamento e cálculo de PÍD.

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Tabela 6A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro29 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJ364069271	90,8	Streptomyces albulus	453	426
WPJ330548298	80,7	Streptomyces aibus	459	424
WPJ305320871	79,3	Streptomyces pristinaespiralis	453	430
WP..026277977	79,0	Streptomyces sp. CNT372	458	428
WP„ 019886521	75,7	Streptomyces purpureus	463	432
WP..029386953	75,3	Streptomyces leeuwenhoekii	394	393
WP..030027622	75,1	Streptomyces flavotricini	348	353
WP„ 030212164	74,8	Streptomyces bikiniensis	454	421
WP..055639793	74,8	Streptomyces venezuelae	451	428

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Tabela 6B: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro29 identificada a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
US8076468-0024	79,5	Streptomyces griseus	255	253
WO2015048332-44022	79,3	Streptomyces pristinaespíralis ATCC 25486	453	463
EP2205730-0009	77,7	Streptomyces sp.	256	255

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Tabela 7A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro33 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N² de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ43225562	93,7	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	426
WPJJ31004112	92,7	Streptomyces sp. NRRL F-5727	454	426
WPJJ30498660	91,8	Microtetraspora glauca	455	426
WP_030749137	87,3	Streptomyces griseus	456	426
WP_030212164	86,2	Streptomyces bikiniensis	454	419
WP_062759972	85,2	Streptomyces sp. WAC04657	454	419
WP..030027622	84,5	Streptomyces flavotrícini	348	349
WP..053644256	83,8	Streptomyces sp. NRRL F-6492	455	419
WP..030313004	83,2	Streptomyces flavochromogenes	456	422
WP..015038204	82,9	Streptomyces venezuelae ATCC 10712	456	422
WP__055639793	82,8	Streptomyces venezuelae	451	425
WP__030016658	82,7	Streptomyces lavendulae	369	369
WP__055599201	82,6	Streptomyces aureus	456	420
WP__053685358	82,6	Streptomyces sp. XY593	451	419
WP__024756173	82,4	Streptomyces exfoliatus	451	425
WP__030658602	82,3	Streptomyces sp. H036	451	419

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Tabela 7A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro33 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI -continuação-
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ53627230	82,1	Streptomyces sp. XY511	451	419
WPJJ30965679	81,9	Streptomyces sp. NRRL S-378	449	419
WPJJ30208917	81,8	Streptomyces griseoluteus	456	424
WP... 017236541	81,8	Streptomyces sp. SS	456	424
WP...056557852	81,8	Streptomyces sp. Root66D1	454	418
WP...030545445	81,6	Streptomyces exfoiiatus	456	424
WP„ 033200913	81,6	Streptomyces viridochromogenes	456	424
WP..046779091	81,5	Streptomyces yangpuensis	451	426
WP..033218333	81,4	Streptomyces virginiae	449	420
WP..031153386	81,4	Streptomyces erythrochromogenes	448	419
WP__030850543	81,2	Streptomyces	450	426
WP__053171320	81,1	Streptomyces virginiae	449	419
WP__030896075	81,0	Streptomyces virginiae	451	426
BAU88265	81,0	Streptomyces iaurentii	445	426
WP__053705101	81,0	Streptomyces sp. WM6368	449	420
WP__030385747	81,0	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	420

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Tabela 7A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro33 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI -continuação-
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP__045323790	80,9	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	425
WPJJ53634074	80,8	Streptomyces sp. MMG 1064	451	426
WP__053679192	80,8	Streptomyces sp. XY66	451	426
WP...030829885	80,8	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	426
WP... 030712260	80,7	Streptomyces sp. NRRL S-237	449	420
WP... 037919299	80,6	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	428
WP...05363258Q	80,5	Streptomyces sp. H021	451	426
WP...052876505	80,1	Streptomyces sp. NRRL F-4335	451	422
WP...030774478	80,0	Streptomyces sp. NRRL F-2664	450	426
WP.. .031144485	80,0	Streptomyces xanthophaeus	447	419
WP__007266194	77,8	Streptomyces sp. C	455	427
WP__005320871	76,8	Streptomyces pristinaespiralís	453	431
WP__030548298	75,9	Streptomyces albus	459	428
WP__026277977	75,1	Streptomyces sp. CNT372	458	430
WP__019886521	74,7	Streptomyces purpureus	463	430
WP__029386953	74,6	Streptomyces ieeuwenhoekii	394	393

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Tabela 7B: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro33 identificada a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PiD	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-44360	82,9	Streptomyces venezuelae	456	422
WO2015048332-44127	77,8	Streptomyces sp. C	455	427
WO2015048332-44022	76,8	Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486	453	431
US8076468-0024	76,0	Streptomyces griseus	255	254
US8076468-0009	75,0	Streptomyces sp.; Strain 1AG3	256	256

Tabela 8A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro23 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP 024756173	97,1	Streptomyces exfoliatus	451	421
WP 055639793	94,8	Streptomyces venezuelae	451	421
WPJ330313004	89,4	Streptomyces flavochromogenes	456	425
WP 033200913	89,3	Streptomyces viridochromogenes	456	422
WP„ 017236541	89,1	Streptomyces sp. SS	456	422
WP 055599201	89,0	Streptomyces aureus	456	418
WPJ330545445	88,5	Streptomyces exfoliatus	456	419
WPJ130208917	88,5	Streptomyces griseoluteus	456	419
WP 015038204	88,3	Streptomyces venezuelae ATCC 10712	456	419
WP..056557852	87,7	Streptomyces sp. Root66D1	454	423

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Tabela 8A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro23 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJ353644256	85,7	Streptomyces sp. NRRL F-6492	455	419
WPJ362759972	85,4	Streptomyces sp. WAC04657	454	419
WP 030212164	85,4	Streptomyces bikiniensis	454	419
BAU88265	85,0	Streptomyces laurentii	445	419
WP 030749137	84,6	Streptomyces griseus	456	422
WPJ343225562	84,6	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	422
WP 031004112	84,5	Streptomyces sp. NRRL F-5727	454	420
WP-030498660	83,6	Microtetraspora glauca	455	421
WP..030027622	83,3	Streptomyces flavotricini	348	347
WP 053685358	81,8	Streptomyces sp. XY593	451	417
WP..030658602	81,5	Streptomyces sp. H036	451	417
WP-037919299	81,5	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	416
WP-053627230	81,3	Streptomyces sp. XY511	451	417
WP„ 030016658	81,0	Streptomyces lavendulae	369	368
WP 045323790	80,9	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	419
WP..030965679	80,7	Streptomyces sp. NRRL S-378	449	420
WP 007266194	80,4	Streptomyces sp. C	455	424
WP-030896075	80,3	Streptomyces virginiae	451	421
WPJ153634074	80,3	Streptomyces sp. MMG 1064	451	421

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Tabela 8A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro23 identificada a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP 053679192	80,3	Streptomyces sp. XY66	451	421
WPJ153705101	80,2	Streptomyces sp. WM6368	449	420
WP 031153386	80,2	Streptomyces erythrochromogenes	448	419
WP„ 031144485	80,1	Streptomyces xanthophaeus	447	418
WP 046779091	80,0	Streptomyces yangpuensis	451	421
WPJ330829885	80,0	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	421
WP 053632580	80,0	Streptomyces sp. H021	451	421
WP-030385747	80,0	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	420
WP„ 053171320	79,8	Streptomyces virginiae	449	420
WP 030712260	79,8	Streptomyces sp. NRRL S-237	449	420
WP„ 033218333	79,5	Streptomyces virginiae	449	420
WP 030850543	79,5	Streptomyces	450	420
WP-030774478	79,3	Streptomyces sp. NRRL F-2664	450	421
WP..052876505	78,9	Streptomyces sp. NRRL F-4335	451	422
WP 019886521	78,9	Streptomyces purpureus	463	426
WP„ 005320871	78,0	Streptomyces pristinaespiralis	453	419
WP 030548298	76,6	Streptomyces albus	459	427
WP 064069271	75,5	Streptomyces albuius	453	421
WPJ126277977	75,3	Streptomyces sp. CNT372	458	417

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Tabela 8B: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro23 identificada a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-44360	88,3	Streptomyces venezuelae	456	419
WO2015048332-44127	80,4	Streptomyces sp. C	455	424
WO2015048332-44022	78,0	Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486	453	419
US8076468-0024	77,1	Streptomyces griseus	255	253
EP2205730-0009	76,5	Streptomyces sp.; Strain 1AG3	256	255

Tabela 9A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro59 identificada a
partir do banco de	dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP-029386953	78,1	Streptomyces Ieeuwenhoekii	394	392
WP 046250145	77,3	Streptomyces sp. MBT28	357	357
WP 069630550	76,9	Streptomyces niveus	444	429
WPJD31232554	76,5	Streptomyces niveus	444	429
EST18641	76,5	Streptomyces niveus NCI MB 11891	459	429
WP 064729342	76,3	Streptomyces parvulus	457	427
WP 047121827	75,8	Streptomyces Ieeuwenhoekii	464	434
WP..063482838	75,7	Streptomyces ambofaciens	454	419
WP 044383230	75,6	Streptomyces cyaneogriseus	464	434
AJP05780	75,6	Streptomyces cyaneogriseus subsp. non- cyanogenus	452	434
WP 055418378	75,5	Streptomyces pactum	457	429

117/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 142/171

Tabela 9A: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro59 identificada a
partir do banco de	dados de proteínas não redundantes NCBI
N⁵ de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP 069979026	75,4	Streptomyces rubrolavendulae	454	427
WP 030027622	75,3	Streptomyces fíavotricini	348	352
WP 031135572	75,2	Streptomyces fradiae	454	427
WP..030970235	75,1	Streptomyces sp. NRRL F-4835	437	426
CAH04620	74,9	Streptomyces fradiae	454	427
WP 019329665	74,9	Streptomyces sp. TOR3209	457	426
WP 031022018	74,9	Streptomyces sp. NRRL WC-3795	457	426
WP 053135598	74,6	Streptomyces ambofaciens ATCC 23877	454	426
WP 023590970	74,5	Streptomyces thermolilacinus SPC6	455	428
WP 059300010	74,5	Streptomyces canus	455	427

118/139

Tabela 9B: Lista de sequências com percentual de identidade com a proteína de comprimento total SspCPro59 identificada a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
US8076468-0024	79,8	Streptomyces gríseus	255	253
EP2205730-0009	76,9	Streptomyces sp.; Strain 1AG3	256	255
WO2015048332-43724	75,2	Streptomyces fradiae	454	427
WO2015048332-43726	74,9	Streptomyces fradiae	454	427

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 143/171

119/139 [00314] As sequências de aminoácidos para SspCPro29 (SEQ ID NO:22); SspCPro33 (SEQ ID NO:23); SspCPro23 (SEQ ID NO:24); e SspCPro59 (SEQ ID NO:25) e as sequências de outras serina proteases de Streptomyces sp: WPJJ64069271 (SEQ ID NO:26); WP„043225562 (SEQ ID NO:27); WPJ324756173 (SEQ ID NO:28); WPJJ30548298 (SEQ ID NO:29); WPJ305320871 (SEQ ID NO:30); WP__055639793 (SEQ ID NO:31); WO2015048332-44360 (SEQ ID NO:32); WO2015048332-44127 (SEQ ID NO:33); WPJJ30313004 (SEQ ID NO:34); WPJ330212164 (SEQ ID NO:35); WPJ330749137 (SEQ ID NO:36); WPJ331004112 (SEQ ID NO:37); e WPJ326277977 (SEQ ID NO:38) foram alinhadas com parâmetros padrão com o uso do programa MUSCLE da Geneious software (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797). O alinhamento de múltiplas sequências para as regiões sobrepostas é mostrado na Figura 11.

EXEMPLO 13

Análise de sequência de proteínas de domínios catalíticos previstos de serina proteases do tipo tripsina de Streptomyces sp [00315] Proteínas relacionadas foram identificadas por uma pesquisa BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997) com o uso das sequências de domínio catalítico previsto para SspCPro29 (SEQ ID NO:18); SspCPro33 (SEQ ID NO:19); SspCPro23 (SEQ ID NO:20); e SspCPro59 (SEQ ID NO:21) contra banco de dados de patentes para busca pública e genômica com parâmetros de pesquisa definidos para valores padrão e um subconjunto é mostrado nas Tabelas 10A e 10B (SspCPro29); Tabelas 11A e 11B (SspCPro33); Tabelas 12A e 12B (SspCPro23); e Tabelas 13A e 13B (SspCPro59), respectivamente.

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 144/171

Tabela 10A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro29 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI

N^s de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„064069271	95,3	Streptomyces albulus	453	191
WP_026277977	91,6	Streptomyces sp. CNT372	458	191
WP__030548298	88,5	Streptomyces albus	459	191
WP_044383230	88,4	Streptomyces cyaneogríseus	464	190
AJP05780	88,4	Streptomyces cyaneogríseus subsp. noncyanogenus	452	190
WP__005320871	88,0	Streptomyces prístinaespiralis	453	191
WP__047121827	87,9	Streptomyces leeuwenhoekii	464	190
WP__029386953	87,9	Streptomyces leeuwenhoekii	394	190
WP„069630550	87,4	Streptomyces niveus	444	191
WP_069979026	86,9	Streptomyces rubrolavendulae	454	191
WP__055639793	86,9	Streptomyces venezuetae	451	191
WPJ331003261	86,8	Streptomyces sp. NRRL WC-3773	461	190
WP__053699044	86,8	Streptomyces sp. NRRL F-5755	460	190
WP__060732661	86,8	Streptomyces albus subsp. albus	460	190
WP__030590236	86,8	Streptomyces gríseofíavus	460	190
WP„045323790	86,7	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	188
WP_030027622	86,7	Streptomyces flavotrícini	348	188

120/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 145/171

Tabela 10A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro29 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„031135572	86,4	Streptomyces fradiae	454	191
WP_031232554	86,4	Streptomyces niveus	444	191
EST18641	86,4	Streptomyces niveus NCI MB 11891	459	191
WP__043225562	86,4	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	191
WP__053800418	86,3	Streptomyces rimosus subsp. pseudoverticillatus	460	190
WP__033032149	86,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP__031188739	86,3	Streptomyces rimosus subsp. rimosus	460	190
WP__030639316	86,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP„030633274	86,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP_030372610	86,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP__030659657	86,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP__053685358	86,2	Streptomyces sp. XY593	451	188
CAH04620	85,9	Streptomyces fradiae	454	191
WP__046779091	85,9	Streptomyces yangpuensis	451	191
WP_019886521	85,9	Streptomyces purpureus	463	191
WP„030022977	85,8	Streptomyces monomycini	461	190
WP_003983795	85,8	Streptomyces rimosus subsp. rimosus	460	190

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 146/171

N^s de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„053632580	85,6	Streptomyces sp. H021	451	188
WP_053627230	85,6	Streptomyces sp. XY511	451	188
WP__053634074	85,6	Streptomyces sp. MMG1064	451	188
WP__053679192	85,6	Streptomyces sp. XY66	451	188
WP__030896075	85,6	Streptomyces virginiae	451	188
WP__030829885	85,6	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	188
WP__030658602	85,6	Streptomyces sp. H036	451	188
WP„037919299	85,6	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	188
WP_030850543	85,6	Streptomyces	450	188
WP__055599201	85,3	Streptomyces aureus	456	191
WP__030313004	85,3	Streptomyces fíavochromogenes	456	191
WP__030965679	85,3	Streptomyces sp. NRRL S-378	449	191
WP__024756173	85,3	Streptomyces exfoliatus	451	191
WP__030774478	85,1	Streptomyces sp. NRRL F-2664	450	188
WP„031153386	85,1	Streptomyces erythrochromogenes	448	188
WP_053705101	85,1	Streptomyces sp. WM6368	449	188
WP__053171320	85,1	Streptomyces virginiae	449	188
WP__030385747	85,1	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	188

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 147/171

Tabela 10B: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro29 identificado a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-44022	88,0	Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486	453	191
WO2015048332-43724	86,4	Streptomyces fradiae	454	191
WO2015048332-43726	85,9	Streptomyces fradiae	454	191

Tabela 11 A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro33 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N- de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP_043225562	97,4	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	191
WP__031004112	96,3	Streptomyces sp. NRRL F-5727	454	190
WP__030498660	95,3	Microtetraspora glauca	455	191
WP__015038204	93,2	Streptomyces venezuelae ATCC 10712	456	191
WP__030212164	92,7	Streptomyces bikiniensis	454	191
WP__007266194	92,7	Streptomyces sp. C	455	191
WP...030712260	92,6	Streptomyces sp. NRRL S-237	449	188
WP__055599201	92,1	Streptomyces aureus	456	191
WP__030749137	92,1	Streptomyces griseus	456	191

123/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 148/171

Tabela 11 A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro33 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP__030313004	92,1	Streptomyces flavochromogenes	456	191
WP__053705101	92,1	Streptomyces sp. WM6368	449	191
WP__053171320	92,1	Streptomyces virginiae	449	191
WP__030385747	92,1	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	191
WP___053685358	92,1	Streptomyces sp. XY593	451	189
WP...024756173	91,6	Streptomyces exfoliatus	451	191
WP_055639793	91,6	Streptomyces venezuelae	451	191
WP__030965679	91,6	Streptomyces sp. NRRL S-378	449	191
WP_053632580	91,5	Streptomyces sp. HQ21	451	189
WP_053627230	91,5	Streptomyces sp. XY511	451	189
WP__053634074	91,5	Streptomyces sp. MMG 1064	451	189
WP__053679192	91,5	Streptomyces sp. XY66	451	189
WP__030896075	91,5	Streptomyces virginiae	451	189
WP-030829885	91,5	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	189
WP-030658602	91,5	Streptomyces sp. H036	451	189
WP_062759972	91,1	Streptomyces sp. WÃC04657	454	191

124/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 149/171

Tabela 11 A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro33 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP__033218333	91,1	Streptomyces virginiae	449	191
WP__037919299	91,1	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	191
WP__046779091	91,1	Streptomyces yangpuensis	451	191
WP__045323790	91,1	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	191
WP__030027622	91,1	Streptomyces fíavotricini	348	191
WP...030016658	91,1	Streptomyces lavenduiae	369	191
WP__030850543	91,0	Streptomyces	450	189
WP__030545445	90,6	Streptomyces exfoliatus	456	191
WP__030208917	90,6	Streptomyces griseoluteus	456	191
WP__033200913	90,6	Streptomyces viridochromogenes	456	191
WP__017236541	90,6	Streptomyces sp. SS	456	191
WP__019886521	90,6	Streptomyces purpureus	463	191
WP__031144485	90,6	Streptomyces xanthophaeus	447	191
WP_052876505	90,6	Streptomyces sp. NRRL F-4335	451	191
WP-056557852	90,1	Streptomyces sp. Root66D1	454	191
WP-053644256	90,1	Streptomyces sp. NRRL F-6492	455	191

125/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 150/171

Tabela 11 A: Lista de sequências com percentual de identidade com dominio catalítico previsto de SspCPro33 identificado a partir do banco de dados de proteinas não redundantes NCBI
N2 de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP__031153386	89,5	Streptomyces erythrochromogenes	448	191
WP__030774478	89,0	Streptomyces sp. NRRL F-2664	450	191
BAU88265	88,0	Streptomyces laurentii	445	191
WP__030548298	86,4	Streptomyces albus	459	191
WP__064069271	86,4	Streptomyces albulus	453	191
WP__047121827	86,3	Streptomyces leeuwenhoekii	464	190
WP__029386953	86,3	Streptomyces leeuwenhoekii	394	190
WP__005320871	85,9	Streptomyces pristinaespiralís	453	191
WP__026277977	85,9	Streptomyces sp. CNT372	458	191
WP__069630550	85,3	Streptomyces niveus	444	191
WP__064729342	85,3	Streptomyces parvuius	457	191
WP__069979026	85,3	Streptomyces rubroiavenduiae	454	191
WP__031135572	84,8	Streptomyces fradiae	454	191

126/139

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 151/171

Tabela 11B: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro33 identificado a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-44360	93,2	Streptomyces venezuelae	456	191
WO2015048332-44127	92,7	Streptomyces sp. C	455	191
WO2015048332-44022	85,9	Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486	453	191
WO2015048332-43724	84,8	Streptomyces fradiae	454	191

Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do bando de dados de proteínas não redundantes NCBI
N² de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP__024756173	99,0	Streptomyces exfoliatus	451	191
WPJJ55599201	98,4	Streptomyces aureus	456	191
WPJJ30313004	98,4	Streptomyces flavochromogenes	456	191
WP__055639793	98,4	Streptomyces venezuelae	451	191
WP „015038204	96,9	Streptomyces venezuelae ATCC 10712	456	191
WP_030545445	95,8	Streptomyces exfoliatus	456	191
WP_030208917	95,3	Streptomyces griseoluteus	456	191
WP..019886521	95,3	Streptomyces purpureus	463	191

Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 152/171

Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do bando de dados de proteínas não redundantes NCBI
N² de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ33200913	94,8	Streptomyces virídochromogenes	456	191
WPJJ17236541	94,2	Streptomyces sp. SS	456	191
WPJJ43225562	94,2	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	191
WP_056557852	93,2	Streptomyces sp. Root66D1	454	191
WP_053685358	93,1	Streptomyces sp. XY593	451	189
WP_053632580	92,6	Streptomyces sp. H021	451	189
VVP..053627230	92,6	Streptomyces sp. XY511	451	189
WP..053634074	92,6	Streptomyces sp. M MG 1064	451	189
WP„ 053679192	92,6	Streptomyces sp. XY66	451	189
WP..030896075	92,6	Streptomyces virginiae	451	189
WP__030829885	92,6	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	189
WP__030658602	92,6	Streptomyces sp. H036	451	189
WP__031004112	92,1	Streptomyces sp. NRRL F-5727	454	190
WP__030712260	92,0	Streptomyces sp. NRRL S-237	449	188
WP__053644256	91,6	Streptomyces sp. NRRL F-6492	455	191
WP__030749137	91,6	Streptomyces griseus	456	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 153/171

Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do bando de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ07266194	91,6	Streptomyces sp. C	455	191
WPJJ53705101	91,6	Streptomyces sp. WM6368	449	191
WPJJ53171320	91,6	Streptomyces virginiae	449	191
WP...030965679	91,6	Streptomyces sp. NRRL S-378	449	191
WP...030385747	91,6	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	191
WP...037919299	91,6	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	191
WP...030498660	91,1	Microtetraspora glauca	455	191
WP...030212164	90,6	Streptomyces bikiniensis	454	191
WP...033218333	90,6	Streptomyces virginiae	449	191
WP...046779091	90,6	Streptomyces yangpuensis	451	191
WP__030850543	90,5	Streptomyces	450	189
WP__062759972	90,1	Streptomyces sp. WAC04657	454	191
WP__052876505	90,1	Streptomyces sp. NRRL F-4335	451	191
WP__045323790	90,1	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	191
WP__031153386	90,1	Streptomyces erythrochromogenes	448	191
WP__030027622	90,1	Streptomyces flavotricini	348	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 154/171

Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do bando de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ30016658	90,1	Streptomyces lavendulae	369	191
WPJJ31144485	89,5	Streptomyces xanthophaeus	447	191
BAU88265	89,5	Streptomyces laurentii	445	191
WP...030774478	89,0	Streptomyces sp. NRRL F-2664	450	191
WP„005320871	89,0	Streptomyces pristinaespiralis	453	191
WP...030548298	89,0	Streptomyces albus	459	191
WP..069630550	89,0	Streptomyces niveus	444	191
WP..031232554	88,0	Streptomyces niveus	444	191
EST18641	88,0	Streptomyces niveus NCI MB 11891	459	191
WP„ 064069271	87,4	Streptomyces albulus	453	191
WP__069979026	87,4	Streptomyces rubrolavendulae	454	191
WP__031135572	86,9	Streptomyces fradiae	454	191
WP__026277977	86,4	Streptomyces sp. CNT372	458	191
CAH04620	86,4	Streptomyces fradiae	454	191
WP__030659657	85,3	Streptomyces rimosus	460	190
WP__047121827	84,7	Streptomyces leeuwenhoekii	464	190

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 155/171

Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do bando de dados de proteínas não redundantes NCBI
N2 de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WPJJ29386953	84,7	Streptomyces leeuwenhoekii	394	190
WPJJ53699044	84,7	Streptomyces sp. NRRL F-5755	460	190
WPJJ60732661	84,7	Streptomyces albus subsp. albus	460	190
WP...030590236	84,7	Streptomyces gríseofíavus	460	190

Tabela 12B: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro23 identificado a partir do banco de dados de busca genômica
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-44360	96,9	Streptomyces venezuelae	456	191
WO2015048332-44127	91,6	Streptomyces sp. C	455	191
WO2015048332-44022	89,0	Streptomyces prístinaespiralis ATCC 25486	453	191
WO2015048332-43724	86,9	Streptomyces fradiae	454	191
WO2015048332-43726	86,4	Streptomyces fradiae	454	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 156/171

Tabela 13A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„047121827	90,5	Streptomyces Ieeuwenhoekii	464	190
WP_029386953	90,5	Streptomyces Ieeuwenhoekii	394	190
WP_069630550	89,5	Streptomyces niveus	444	191
WP_044383230	89,5	Streptomyces cyaneogriseus	464	190
AJP05780	89,5	Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus	452	190
WP__053800418	88,9	Streptomyces rimosus subsp. pseudoverticillatus	460	190
WP__033032149	88,9	Streptomyces rimosus	460	190
WP_031188739	88,9	Streptomyces rimosus subsp. rimosus	460	190
WP„030639316	88,9	Streptomyces rimosus	460	190
WP_030633274	88,9	Streptomyces rimosus	460	190
WP_030212164	88,5	Streptomyces bikiniensis	454	191
WP_031232554	88,5	Streptomyces niveus	444	191
EST18641	88,5	Streptomyces niveus NCI MB 11891	459	191
WP__030372610	88,4	Streptomyces rimosus	460	190
WP_063482838	88,0	Streptomyces ambofaciens	454	191
WP„053135598	88,0	Streptomyces ambofaciens ATCC 23877	454	191
WP_064069271	88,0	Streptomyces albulus	453	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 157/171

Tabela 13A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„043225562	88,0	Streptomyces sp. NRRL F-5193	456	191
WP_031003261	87,9	Streptomyces sp. NRRL WC-3773	461	190
WP_003983795	87,9	Streptomyces rimosus subsp. rimosus	460	190
WP__053699044	87,9	Streptomyces sp. NRRL F-5755	460	190
WP__062759972	87,4	Streptomyces sp. WAC04657	454	191
WP__064729342	87,4	Streptomyces parvuius	457	191
WP_060732661	87,4	Streptomyces albus subsp. albus	460	190
WP„030590236	87,4	Streptomyces griseofiavus	460	190
WP_053627230	87,3	Streptomyces sp. XY511	451	189
WP_053685358	87,3	Streptomyces sp. XY593	451	189
WP__030658602	87,3	Streptomyces sp. H036	451	189
WP__053644256	86,9	Streptomyces sp. NRRL F-6492	455	191
WP__046250145	86,9	Streptomyces sp. MBT28	357	191
WP_031022018	86,9	Streptomyces sp. NRRL WC-3795	457	191
WP„030970235	86,9	Streptomyces sp. NRRL F-4835	437	191
WP_055418378	86,9	Streptomyces pactum	457	191
WP_069979026	86,9	Streptomyces rubrolavendulae	454	191
WP_030965679	86,9	Streptomyces sp. NRRL S-37B	449	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 158/171

Tabela 13A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„030022977	86,8	Streptomyces monomycini	461	190
WP_030659657	86,8	Streptomyces rímosus	460	190
WP_053632580	86,8	Streptomyces sp. H021	451	189
WP__053634074	86,8	Streptomyces sp. MMG 1064	451	189
WP__053679192	86,8	Streptomyces sp. XY66	451	189
WP__030896075	86,8	Streptomyces virginiae	451	189
WP_030829885	86,8	Streptomyces sp. NRRL S-104	451	189
WP„019329665	86,4	Streptomyces sp. TOR3209	457	191
WP_015038204	86,4	Streptomyces venezuelae ATCC 10712	456	191
WP_055639793	86,4	Streptomyces venezuelae	451	191
WP__037919299	86,4	Streptomyces sp. PCS3-D2	454	191
WP_031135572	86,4	Streptomyces fradiae	454	191
WP__046779091	86,4	Streptomyces yangpuensis	451	191
WP_026277977	86,4	Streptomyces sp. CNT372	458	191
WP„043506163	85,9	Streptomyces glaucescens	442	191
WP_037929773	85,9	Streptomyces toyocaensis	435	191
AIR96443	85,9	Streptomyces glaucescens	457	191
KES08095	85,9	Streptomyces toyocaensis	457	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 159/171

Tabela 13A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio cataiítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PID	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„030548298	85,9	Streptomyces aibus	459	191
WP_005320871	85,9	Streptomyces pristinaespiraiis	453	191
WP_031144485	85,9	Streptomyces xanthophaeus	447	191
CAH04620	85,9	Streptomyces fradiae	454	191
WP_031153386	85,9	Streptomyces erythrochromogenes	448	191
WP__045323790	85,9	Streptomyces sp. NRRL F-4428	449	191
WP_030027622	85,9	Streptomyces flavotrícini	348	191
WP„023590970	85,9	Streptomyces thermolilacinus SPC6	455	191
WP_055569787	85,9	Streptomyces atriruber	455	191
WP_069884582	85,9	Streptomyces luteocolor	456	191
WP_055698079	85,9	Streptomyces silaceus	456	191
WP__059300010	85,9	Streptomyces ca nus	455	191
WP__039831526	85,8	Streptomyces viridosporus	442	190
WP_050793881	85,8	Streptomyces ghanaensis	439	190
EFE67698	85,8	Streptomyces ghanaensis ATCC 14672	461	190
WP_018959758	85,7	Streptomyces sp. CNB091	459	189
WP__030712260	85,6	Streptomyces sp. NRRL S-237	449	188
WP__058941217	85,3	Streptomyces kanasensis	459	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 160/171

Tabela 13A: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de proteínas não redundantes NCBI
N^s de registro	PiD	Organismo	Comprimento de sequência	Comprimento de alinhamento
WP„053705101	85,3	Streptomyces sp. WM6368	449	191
WP_053171320	85,3	Streptomyces virginiae	449	191
WP_030385747	85,3	Streptomyces sp. NRRL S-241	449	191
WP__037835235	85,3	Streptomyces sp. NRRL F-5650	447	191
WP__030793011	85,3	Streptomyces sp. NRRL S-920	459	191
WP__031004112	85,3	Streptomyces sp. NRRL F-5727	454	190
WP_030850543	85,2	Streptomyces	450	189
WP„055599201	84,8	Streptomyces aureus	456	191
WP_030313004	84,8	Streptomyces fíavochromogenes	456	191
WP_019886521	84,8	Streptomyces purpureus	463	191
WP__024756173	84,8	Streptomyces exfoiiatus	451	191
WP_033218333	84,8	Streptomyces virginiae	449	191
WP__053913363	84,8	Streptomyces sp. TP-A0875	457	191
WP_051821392	84,8	Streptomyces sp. NRRL F-5065	457	191
WP„030016658	84,8	Streptomyces iavenduiae	369	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 161/171

Tabela 13B: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio cataiítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de busca genômica
identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-43724	86,4	Streptomyces fradiae	454	191
WO2015048332-44360	86,4	Streptomyces venezuelae	456	191
WO2015048332-43726	85,9	Streptomyces fradiae	454	191
WO2015048332-44022	85,9	Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486	453	191
WO2015048332-43751	85,8	Streptomyces ghanaensis ATCC 14672	461	190
WO2015048332-44127	84,3	Streptomyces sp. C	455	191
US8535927-0035	84,2	Streptomyces griseus	195	190
US8076468-0024	84,2	Streptomyces griseus	255	190
WO2015048332-44248	84,2	Streptomyces sp. W007	457	190
WO2015048332-43810	84,2	Streptomyces griseus	457	190
WO2015048332-43844	84,2	Streptomyces griseus	457	190
US8076468-0023	84,2	Streptomyces griseus	457	190
WO2015048332-43602	83,3	Streptomyces coeiicoflavus ZG0656	355	191
WO2015048332-44050	83,2	Streptomyces roseosporus NRRL 15998	455	190
WO2015048332-43682	82,1	Streptomyces davawensis JCM 4913	450	190
WO2015048332-43645	81,7	Streptomyces coelicolor	463	191
WO2015048332-43956	81,7	Streptomyces lividans TK24	358	191
US8535927-0036	81,7	Streptomyces coelicoior	197	191

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 162/171

Tabela 13B: Lista de sequências com percentual de identidade com domínio catalítico previsto de SspCPro59 identificado a partir do banco de dados de busca genômíca
Identificador GQ	PID	Organismo	Comprimento	Comprimento de alinhamento
WO2015048332-43953	81,2	Streptomyces lividans	458	191
WO2015048332-44149	80,5	Streptomyces sp. e14	457	190
US8076468-0009	80,1	Streptomyces sp.	256	191
US8076468-0003	80,1	Streptomyces sp.	453	191
US8076468-0011	80,1	Streptomyces sp.	428	191
W02005052161-0649	79,9	Streptomyces	381	189
WO2015048332-44081	79,9	Streptomyces sp.	382	189
W02005052146-0038	79,9	Streptomyces sp.	187	189
WO2015048332-43913	79,0	Streptomyces hygroscopicus	439	190
WO2015048332-44186	78,4	Streptomyces sp. SírexAA-E	449	190
WO2015048332-44289	77,0	Streptomyces sviceus ATCC 29083	454	191
WO2015048332-44213	76,8	Streptomyces sp. SM8	453	190
WO2015048332-43423	76,8	Streptomyces albus J1074	453	190
WO2015048332-43766	76,3	Streptomyces griseoaurantiacus M045	449	190

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Petição 870190100653, de 08/10/2019, pág. 163/171

139/139 [00316] Um alinhamento das sequências de domínio catalítico previsto de SspCPro29 (SEQ ID NO: 18; aminoácidos 213 a 403 da SEQ ID NO:3); SspCPro33 (SEQ ID NO: 19, aminoácidos 204 a 394 da SEQ ID NO:6); SspCPro23 (SEQ ID NO: 20, aminoácidos 201 a 391 da SEQ ID NO:9); SspCPro59 (SEQ ID NO: 21, aminoácidos 206 a 395 da SEQ ID NO: 12); WPJ364069271 (SEQ ID NO:42, aminoácidos 204 a 394 da SEQ ID NO:26); WP„ 043225562 (SEQ ID NO:43, aminoácidos 204 a 394 da SEQ ID NO:27); WP„.024756173 (SEQ ID NO:44, aminoácidos 201 a 391 da SEQ ID NO:28); WP_030548298 (SEQ ID NO:45, aminoácidos 207 a 397 da SEQ ID NO:29); WPJ305320871 (SEQ ID NO:46, aminoácidos 204 a 394 da SEQ ID NO:30); resíduos de aminoácido 138 a 328 de WPJj29386953 (SEQ ID NO:47); WPJ326277977 (SEQ ID NO:48, aminoácidos 207 a 397 da SEQ ID NO:38); resíduos de aminoácido 208 a 398 de WPJJ44383230 (SEQ ID NO:49); resíduos de aminoácido 193 a 383 de WP_069630550 (SEQ ID NO:50); WPJ355639793 (SEQ ID NO:51, aminoácidos 201 a 391 da SEQ ID NO:31); resíduos de aminoácido de 211 a 401 de WPJJ53699044 (SEQ ID NO:52); resíduos de aminoácido 205 a 395 de WPJ331135572 (SEQ ID NO:53) foi realizado conforme descrito acima e é mostrado na Figura 12. A sequência consenso de domínio catalítico previsto da Figura 12 é apresentada como a SEQ ID NO:54. Para as posições nas sequências consenso em que múltiplos aminoácidos são considerados, as mesmas são representadas com o uso de X~l ou L e os códigos IUPAC: B = D ou N.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que tem atividade de serina protease selecionado dentre:

a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22;

b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 94% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

c) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24; e

d) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25.
2. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que que tem atividade de serina protease e que compreende uma sequência de aminoácidos precursora prevista selecionada dentre: SEQ ID NO:3: SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9; e SEQ ID NO:12.
3. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tem atividade de serina protease e que compreende uma região catalítica de protease selecionada dentre:

a) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 96% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18;

b) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19;

c) uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e

d) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 91% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21;
4. Construto recombinante, caracterizado pelo fato de que

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2/4 compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Construto recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em fungos, bactérias e algas.
6. Método para produzir pelo menos um polipeptídeo, caracterizado pelo fato que compreende:

(a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, como definido na reivindicação 4; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que pelo menos um polipeptídeo seja produzido.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é opcionalmente recuperado do hospedeiro de produção.
8. Sobrenadante de cultura contendo serina protease, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método, como definido na reivindicação 6 ou 7.
9. Hospedeiro de produção microbiano recombinante para expressar pelo menos um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que o dito hospedeiro de produção microbiano recombinante compreende o construto recombinante, como definido na reivindicação 4.
10. Hospedeiro de produção, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito hospedeiro é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos e algas.
11. Ração para animais, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito polipeptídeo está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/ton de ração.

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12. Ração para animais, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda: a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou b) pelo menos uma outra enzima ou c) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.
13. Ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de serina protease, como definido em qualquer das reivindicações 1 a 3.
14. Ração, gênero alimentício, composição de aditivo de ração ou pré-mistura, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda:

a) pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou b) pelo menos uma outra enzima ou c) pelo menos um microorganismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima.
15. Composição de aditivo de ração, de acordo com as reivindicações 13 e 14, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende, ainda, pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
16. Composição de aditivo de ração granulada para uso em ração para animais, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo serina protease, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a composição de aditivo de ração granulada

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4/4 compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou qualquer combinação dos processos acima.
17. Composição de aditivo de ração granulada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas é maior do que 50 microns e menor do que 2,000 microns.
18. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a dita composição está em uma forma líquida.
19. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita composição está em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração.