BR112021009639A2

BR112021009639A2 - Polipeptídeos do clado tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021009639A2
Application number: BR112021009639-6A
Authority: BR
Inventors: Lilia Maria Babe; Robin Anton Sorg; Trine Christensen; Svend Haaning; Hye-Sook Kim; Rie Mejldal; Igor Nikolaev; Jahnavi Chandra Prasad; Sina Pricelius; Jens Frisbaek Sørensen
Original assignee: Dupont Nutrition Biosciences Aps
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-09-28
Also published as: TW202033100A; SG11202105296UA; JP2022513085A; CA3120360A1; PH12021551136A1; US20240174993A1; MX2021005825A; KR20210094587A; CN113301809A; IL283241A; WO2020106796A1; AU2019384024A1; EP3883388A1

Abstract

polipeptídeos do clado tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos. trata-se de polipeptídeos do clado tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos. são também descritos métodos para produzir tais polipeptídeos do clado tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos e o uso dos mesmos no melhoramento do desempenho do animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS DO CLADO TM-FITASE ALTA ROBUSTOS

GENETICAMENTE MODIFICADOS E FRAGMENTOS DOS MESMOS".

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório No U.S. 62/769.713, depositado em 20 de novembro de 2018, do Pedido de Patente Provisório No U.S. 62/851.122, depositado em 22 de maio de 2019 e do Pedido de Patente Provisório No U.S. 62/887.714, depositado em agosto 16 de 2019, cujas descrições são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0002] A listagem de sequência fornecida no arquivo denominado 20191115_NB41175-PCT_Sequence Listing_ST25 com um tamanho de 324 KB, que foi criado em 15 de novembro de 2019 e que é depositado com o presente documento, é incorporada a título de referência ao presente documento em sua totalidade.

CAMPO

[0003] O campo pertence a polipeptídeos do clado Tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos, métodos de produção de tais polipeptídeos do clado Tm-fitase alta robustos geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos e uso dos mesmos para melhorar o desempenho animal.

ANTECEDENTES

[0004] A fitase é a enzima exógena mais comumente usada em rações para animais monogástricos. A fitase pode reduzir o efeito antinutricional do fitato e melhorar a digestibilidade do fósforo, cálcio, aminoácidos e energia, bem como reduzir o impacto negativo da excreção de fósforo inorgânico no meio ambiente.

[0005] O fitato é a principal forma de armazenamento de fósforo em cereais e leguminosas. No entanto, animais monogástricos como suínos, aves e peixes não são capazes de metabolizar ou absorver fitato (ou ácido fítico) de forma eficiente em sua dieta e, portanto, o mesmo é excretado, levando à poluição por fósforo em áreas de produção pecuária intensiva. Além disso, o ácido fítico também atua como um agente antinutricional em animais monogástricos por agentes quelantes de metais como cálcio, cobre e zinco e formando complexos insolúveis com proteínas e aminoácidos em vários segmentos do trato digestivo.

[0006] Há muito se supõe que os animais não ruminantes carecem de fitase endógena e são, portanto, incapazes de utilizar fitato. No entanto, foi descrito que as fosfatases endógenas da mucosa e as fitases bacterianas têm atividade no intestino delgado e cecos de aves. Maenz, D. D.; Classen, H. L., Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken. Poult Sci 1998, 77, 557-63. Abudabos, A. M., Phytate phosphorus utilization and intestinal phytase activity in laying hens. Italian Journal of Animal Science 2012, 11, e8. Zeller, E.; Schollenberger, M.; Kuhn, I.; Rodehutscord, M. A fim de fornecer fosfatos suficientes para o crescimento e saúde desses animais, fosfato inorgânico é adicionado às suas dietas. Essa adição pode ser cara e aumenta ainda mais os problemas de poluição.

[0007] Através da ação da fitase, o fitato é geralmente hidrolisado para fornecer menos fosfatos de inositol e fosfato inorgânico. As fitases são úteis como aditivos para rações animais, em que as mesmas melhoram a disponibilidade de fósforo orgânico para o animal e diminuem a poluição do meio ambiente por fosfato (Wodzinski RJ, Ullah A H. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

[0008] A origem de diversas fitases de fungos (Wyss M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R. M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al., Appl.

Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) e bacterianas (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W. et al., Biotechnol. Lett. 25, 1231- 1234 (2003); Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S. J. et al., Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)) foi descrita na literatura.

[0009] A Patente No U.S. 8.053.221 concedida a Miasnikov et al. em 8 de novembro de 2011, se refere a fitases derivadas da bactéria Buttiauxella sp. e variantes/formas modificadas da mesma selecionadas e/ou geneticamente modificadas para características melhoradas em comparação com a enzima de do tipo selvagem (precursora).

[0010] As patentes Nº U.S. 6.110.719 emitidas para Short em 29 de agosto de 2000 e 6.183.740 emitidas para Short et al. em 6 de fevereiro de 2001 se referem a enzimas fitase derivadas de Escherichia coli B.

[0011] A Patente Nº U.S. 9.365.840 emitida para Sjoeholm et al. em 4 de junho de 2016 se refere a polipeptídeos que têm atividade fitase.

[0012] As patentes Nos U.S. 8.206.962 emitida para Lassen et al. em 26 de junho de 2011 e 8.507.240 emitida para Lassen et al. em 13 de agosto de 2013 se referem a variantes da fitase de Hafnia.

[0013] A Patente Nº U.S. 8.557.552 concedida a Haefner et al. em 15 de outubro de 2013 se refere a variantes sintéticas de fitase.

[0014] O documento WO2015/012890 que tem data de publicação internacional de 29 de janeiro de 2015 se refere a polipeptídeos que têm atividade de fitase.

[0015] Novas gerações de fitases foram desenvolvidas na última década. No entanto, nenhuma dessas fitases têm uma robustez adequada quando aplicada à ração em uma forma líquida antes do condicionamento e peletização para suportar os altos níveis de estresse em condições de peletização de ração comercialmente relevantes. Portanto, os produtos de fitase termoestáveis no mercado adequados para peletização comercial são produtos secos e muitos têm revestimentos protetores para reter a atividade. No entanto, a aplicação de fitases em uma forma líquida à ração é desejável, devido ao fato de que, por exemplo, a fitase adicionada e uma forma líquida será distribuída uniformemente e liberada imediatamente no animal quando entregue por meio da ração. Permanece a necessidade de fitases e fragmentos das mesmas que sejam robustos quando aplicados em uma forma líquida antes do condicionamento e peletização em condições comercialmente relevantes e permaneçam capazes de melhorar o desempenho animal.

SUMÁRIO

[0016] Em uma primeira modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado (tal como uma 6-fitase bacteriana biossintética) ou um fragmento do mesmo que compreende atividade de fitase com pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

[0017] Em uma segunda modalidade, é descrito o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo tem uma pontuação de Modelo Oculto de Markov (HMM) de pelo menos 1200, como apresentado na Tabela 11 para os polipeptídeos do clado Tm- fitase alta e fragmentos dos mesmos.

[0018] Em uma terceira modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 78% de identidade de sequência com as posições de aminoácidos 14-325 que correspondem à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

[0019] Em uma quarta modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo (tal como aqueles das modalidades 1, 2 ou 3) que tem recuperação de peletização em alimentação de pelo menos cerca de 50% quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos, com o uso de um teste de recuperação de peletização em alimentação padrão, como descrito no Exemplo 5.

[0020] Em uma quinta modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo (tal como aqueles das modalidades 1, 2, 3 ou 4) que tem uma razão de recuperações de peletização em alimentação de pelo menos cerca de 0,7 quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, com o uso de um teste padrão de peletização em alimentação, como descrito no Exemplo

5.

[0021] Em uma sexta modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4 ou 5, em que o dito polipeptídeo ou fragmento compreende uma temperatura Tm de pelo menos cerca de 92,5°C sob condições de ensaio calorimétrico de varredura diferencial descrito no Exemplo 3.

[0022] Em uma sétima modalidade, é descrito o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 6, em que o dito polipeptídeo ou fragmento do mesmo compreende uma atividade específica de pelo menos cerca de 100 U/mg em pH 3,5 sob as condições de ensaio descritas no Exemplo 3.

[0023] Em uma oitava modalidade, é descrito o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que a) o dito polipeptídeo de fitase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3, SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5, SEQ ID Nº:6, SEQ ID Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:9, SEQ ID Nº:10, SEQ ID Nº:11, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:13, SEQ ID Nº:14, SEQ ID Nº:16, SEQ ID Nº:17, SEQ ID Nº:18, SEQ ID Nº:19, SEQ ID Nº:20, SEQ ID Nº:21, SEQ ID Nº:22, SEQ ID Nº:23, SEQ ID Nº:24, SEQ ID Nº:25, SEQ ID Nº:26, SEQ ID Nº:27, SEQ ID Nº:28, SEQ ID Nº:29, SEQ ID Nº:30, SEQ ID Nº:31, SEQ ID Nº:32, SEQ ID:NO:33, SEQ ID Nº:34, SEQ ID Nº:35, SEQ ID Nº:36, SEQ ID Nº:37, e SEQ ID Nº:64 ou b) o dito polipeptídeo de fitase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº:67, SEQ ID Nº:68, SEQ ID Nº:69, SEQ ID Nº:70, SEQ ID Nº:71, SEQ ID Nº:72, SEQ ID Nº:73, SEQ ID Nº:74, SEQ ID Nº:75, SEQ ID Nº:76, SEQ ID Nº:77, SEQ ID Nº:78, SEQ ID Nº:79, SEQ ID Nº:80, SEQ ID Nº:81, SEQ ID Nº:82, SEQ ID Nº:83, SEQ ID Nº:84, SEQ ID Nº:85, SEQ ID Nº:86, e SEQ ID Nº:87.

[0024] Em uma nona modalidade, é descrito uma ração para animais, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo pode ser usado (i) sozinho ou (ii) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana ou (iii) com pelo menos uma outra enzima ou (iv) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende em pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma outra enzima ou (v) qualquer um de (i), (ii), (iii) ou (iv) que compreende adicionalmente pelo menos um outro componente de aditivo de ração e, opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo está presente em uma quantidade de pelo menos 0,1 g/tonelada de ração.

[0025] Em uma décima modalidade, é descrito um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligada operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou

8.

[0026] Em uma décima primeira modalidade, o hospedeiro de produção é selecionado a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos, leveduras, plantas e algas.

[0027] Em uma décima segunda modalidade, é descrito um método para a produção de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, que compreende: (a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante da modalidade 9 e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo é produzido.

[0028] Em uma décima terceira modalidade, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo produzido pelo método da décima modalidade, opcionalmente, é recuperado do hospedeiro de produção.

[0029] Em uma décima quarta modalidade, é descrito um sobrenadante de cultura contendo fitase obtido pelos métodos da modalidade dez ou onze.

[0030] Em uma décima quinta modalidade, é descrita uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0031] Em uma décima sexta modalidade, é descrita uma composição enzimática seca para uso em ração para animais que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0032] Em uma décima sétima modalidade, é descrita a composição enzimática seca da modalidade 15, em que a composição enzimática seca é uma composição de aditivo de ração granulado.

[0033] Em uma décima oitava modalidade, é descrita uma composição enzimática líquida para uso em ração para animais que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0034] Em uma décima nona modalidade, é descrito um método para melhorar o valor nutricional de uma ração para animais, em que a fitase geneticamente modificada ou fragmento da mesma da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 é adicionada à ração para animais.

[0035] Em uma vigésima modalidade, é descrito um método para melhorar o desempenho animal em uma ou mais métricas, que compreende a administração de uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou da ração para animais, gênero alimentício, pré- mistura ou composição de aditivo de ração da modalidade 9 ou 10 para o animal.

[0036] Em uma vigésima primeira modalidade, é descrito o método da modalidade 20, em que uma ou mais métricas são selecionadas do grupo que consiste em eficiência de ração aumentada, ganho de peso aumentado, razão de conversão alimentar reduzida, digestibilidade melhorada de nutrientes ou energia em uma ração, retenção de nitrogênio melhorada, capacidade melhorada para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e resposta imunológica melhorada.

[0037] Em uma vigésima segunda modalidade, é descrito o método da modalidade 20 ou 21, em que o animal é um animal monogástrico selecionado do grupo que consiste em suínos e aves.

[0038] Em uma vigésima terceira modalidade, é descrito o método da modalidade 22, em que o suíno é selecionado do grupo que consiste em leitões, porcos em crescimento e porcas.

[0039] Em uma vigésima quarta modalidade, é descrito o método da modalidade 22, em que as aves são selecionadas do grupo que consiste em perus, patos, frangos, frangos de corte, poedeiras, gansos, faisões, codornas e emas.

[0040] Em uma vigésima quinta modalidade, é descrito o método da modalidade 20 ou 21, em que o animal é um animal ruminante selecionado do grupo que consiste em gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisões, alces, cervos, iaques, búfalos, veados, renas, caribus, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DAS SEQUÊNCIAS

[0041] As Figuras 1A-1BB (painéis A a 1BB) mostram as pontuações de probabilidade de HMM para cada posição ao longo da sequência de polipeptídeos do clado Tm-fitase alta. As pontuações compostas (COMP) para o HMM são mostradas nos 3 painéis superiores da Figura 1A, em negrito. A posição (P) e o consenso (C) para cada aminoácido são mostrados na coluna 1 em P/C.

[0042] A Figura 2 representa uma árvore filogenética que mostra o parentesco entre várias fitases, incluindo os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos descritos no presente documento com base em semelhanças e diferenças na sequência de aminoácidos.

[0043] A Figura 3 representa a estrutura tridimensional de uma fitase de clado de alta Tm representativa modelada com o uso da estrutura de cristal publicada para a 6-fitase Hafnia alvei intimamente relacionada e mostrada como um diagrama de fita.

[0044] As sequências a seguir estão em conformidade com título 37 parágrafos 1821-1825 do C.F.R. ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) (2009) e os requisitos de listagem de sequência da Convenção Europeia de Patentes (EPC) e do Tratado de Cooperação de Patentes (PCT), Regras 5.2 e 49.5 (a-bis), e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos estão em conformidade com as regras estabelecidas no título 37 parágrafo 1.822 do C.F.R.

[0045] SEQ ID Nº:1 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13594.

[0046] SEQ ID Nº:2 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-10931.

[0047] SEQ ID Nº:3 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-10957.

[0048] SEQ ID Nº:4 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11569.

[0049] SEQ ID Nº:5 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11658. SEQ ID Nº:6 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11673.

[0050] SEQ ID Nº:7 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11680.

[0051] SEQ ID Nº:8 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11895.

[0052] SEQ ID Nº:9 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-11932.

[0053] SEQ ID Nº:10 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-12058.

[0054] SEQ ID Nº:11 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-12663.

[0055] SEQ ID Nº:12 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-12784.

[0056] SEQ ID Nº:13 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13177.

[0057] SEQ ID Nº:14 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13371.

[0058] SEQ ID Nº:15 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13460.

[0059] SEQ ID Nº:16 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13513.

[0060] SEQ ID Nº:17 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13637.

[0061] SEQ ID Nº:18 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13705.

[0062] SEQ ID Nº:19 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13713.

[0063] SEQ ID Nº:20 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13747.

[0064] SEQ ID Nº:21 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13779.

[0065] SEQ ID Nº:22 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13789.

[0066] SEQ ID Nº:23 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13798.

[0067] SEQ ID Nº:24 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13868.

[0068] SEQ ID Nº:25 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13883.

[0069] SEQ ID Nº:26 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13885.

[0070] SEQ ID Nº:27 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-13936.

[0071] SEQ ID Nº:28 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14004.

[0072] SEQ ID Nº:29 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14215.

[0073] SEQ ID Nº:30 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14256.

[0074] SEQ ID Nº:31 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14277.

[0075] SEQ ID Nº:32 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14473.

[0076] SEQ ID Nº:33 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14614.

[0077] SEQ ID Nº:34 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14804.

[0078] SEQ ID Nº:35 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-14945.

[0079] SEQ ID Nº:36 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-15459.

[0080] SEQ ID Nº:37 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-16513.

[0081] SEQ ID Nº:38 corresponde a Buttiauxella noackiae WP

064555343.1.

[0082] SEQ ID Nº:39 corresponde a Citrobacter braakii AAS45884.1

[0083] SEQ ID Nº:40 corresponde à bactéria Coxiellaceae RDH40465.1.

[0084] SEQ ID Nº:41 corresponde a Enterobacteriaceae WP

094337278.1.

[0085] SEQ ID Nº:42 corresponde a Escherichia coli WP

001297112.

[0086] SEQ ID Nº:43 corresponde a Hafnia alvei WP 072307456.1.

[0087] SEQ ID Nº:44 corresponde a Rouxiella badensis WP

084912871.1.

[0088] SEQ ID Nº:45 corresponde a Serratia sp. WP 009636981.1.

[0089] SEQ ID Nº:46 corresponde a Yersinia aldovae WP

004701026.1.

[0090] SEQ ID Nº:47 corresponde a Yersinia frederiksenii WP

050140790.1.

[0091] SEQ ID Nº:48 corresponde a Yersinia kristensenii WP

004392102.1.

[0092] SEQ ID Nº:49 corresponde a Yersinia mollaretii WP

049646723.1.

[0093] SEQ ID Nº:50 corresponde a Yersinia rohdei WP

050539947.1.

[0094] SEQ ID Nº:51 corresponde à SEQ ID Nº:3 no documento EP322271.

[0095] SEQ ID Nº:52 corresponde à SEQ ID Nº:2 no documento US8101391.

[0096] SEQ ID Nº:53 corresponde à SEQ ID Nº:4 no documento US8101391.

[0097] SEQ ID Nº:54 corresponde à SEQ ID Nº:35 no documento US8101391.

[0098] SEQ ID Nº:55 corresponde à SEQ ID Nº:49 no documento US8101391.

[0099] SEQ ID Nº:56 corresponde à SEQ ID Nº:1 no documento US8143046.

[0100] SEQ ID Nº:57 corresponde à SEQ ID Nº:3 no documento US8143046.

[0101] SEQ ID Nº:58 corresponde à SEQ ID Nº:2 no documento US8460656.

[0102] SEQ ID Nº:59 corresponde à SEQ ID Nº:13 no documento US8557555.

[0103] SEQ ID Nº:60 corresponde à SEQ ID Nº:24 no documento US8557555.

[0104] SEQ ID Nº:61 corresponde à SEQ ID Nº:3 no documento US20160083700.

[0105] SEQ ID Nº:62 corresponde à SEQ ID Nº:1 no documento WO2010034835-0002.

[0106] SEQ ID Nº:63 corresponde à sequência de sinal de aspartato protease de T. reesei.

[0107] SEQ ID Nº:64 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-16812.

[0108] SEQ ID Nº:65 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17403.

[0109] SEQ ID Nº:66 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17336.

[0110] SEQ ID Nº:67 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17225.

[0111] SEQ ID Nº:68 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17186.

[0112] SEQ ID Nº:69 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17195.

[0113] SEQ ID Nº:70 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17124.

[0114] SEQ ID Nº:71 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17189.

[0115] SEQ ID Nº:72 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17218.

[0116] SEQ ID Nº:73 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17219.

[0117] SEQ ID Nº:74 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17204.

[0118] SEQ ID Nº:75 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17215.

[0119] SEQ ID Nº:76 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17201.

[0120] SEQ ID Nº:77 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17205.

[0121] SEQ ID Nº:78 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17224.

[0122] SEQ ID Nº:79 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17200.

[0123] SEQ ID Nº:80 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17198.

[0124] SEQ ID Nº:81 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17199.

[0125] SEQ ID Nº:82 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17214.

[0126] SEQ ID Nº:83 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17197.

[0127] SEQ ID Nº:84 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17228.

[0128] SEQ ID Nº:85 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17229.

[0129] SEQ ID Nº:86 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17152.

[0130] SEQ ID Nº:87 corresponde à sequência madura prevista de fitase geneticamente modificada PHY-17206.

[0131] SEQ ID Nº:88 corresponde ao terminal N NCIMB 41248 de Buttiauxella.

[0132] SEQ ID Nº:89 corresponde ao terminal N AAS45884 de C. braakii.

[0133] SEQ ID Nº:90 corresponde ao terminal N YP007628727 de E. tarda.

[0134] SEQ ID Nº:91 corresponde ao terminal N de PHY-13594.

[0135] SEQ ID Nº:92 corresponde ao terminal N de PHY-13789.

[0136] SEQ ID Nº:93 corresponde ao terminal N de PHY-13885.

[0137] SEQ ID Nº:94 corresponde ao Terminal C da SEQ ID Nº:1 no documento WO2010034835-0002.

[0138] SEQ ID Nº:95 corresponde ao terminal C WP032813045 de Y. mollaretii.

[0139] SEQ ID Nº:96 corresponde ao terminal C NCIMB 41248 de Buttiauxella.

[0140] SEQ ID Nº:97 corresponde ao terminal C de PHY-13594.

[0141] SEQ ID Nº:98 corresponde ao terminal C de PHY-13789.

[0142] SEQ ID Nº:99 corresponde ao terminal C de PHY-13885.

[0143] SEQ ID Nº:100 corresponde à região de núcleo de PHY-

13594.

[0144] SEQ ID Nº:101 corresponde à região de núcleo de PHY-

13789.

[0145] SEQ ID Nº:102 corresponde à região de núcleo de PHY-

13885.

[0146] SEQ ID Nº:103 corresponde à região de núcleo de PHY-

16812.

[0147] SEQ ID Nº:104 corresponde à SEQ ID Nº:4 no documento US7081563.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0148] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0149] Nesta invenção, são usados muitos termos e abreviações. As definições a seguir se aplicam, a menos que especificamente declarado de outro modo.

[0150] Como usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, que incluem misturas dos mesmos. Os termos "um", "uma", "o", "a", "um ou mais" e "pelo menos um", por exemplo, podem ser usados indistintamente no presente documento.

[0151] O termo "e/ou" e "ou" são usados indistintamente no presente documento e se referem a uma invenção específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A e/ou B" no presente documento se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (sozinho) e "B" sozinho. Da mesma forma, o termo "e/ou", como usado em uma frase como "A, B e/ou C", destina-se a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0152] Palavras que usam o singular incluem o plural e vice- versa.

[0153] Os termos "compreende", "que compreende", "inclui", "que inclui", "que tem" e seus conjugados são usados indistintamente e significam "que inclui, porém, sem limitação". Entende-se que sempre que os aspectos são descritos no presente documento com a linguagem "que compreende", aspectos análogos descritos de outra forma em termos de "que consiste em" e/ou "que consiste essencialmente em" também são fornecidos.

[0154] O termo "que consiste em" significa "que inclui e limitado a".

[0155] O termo "que consiste essencialmente em" significa o material especificado de uma composição, ou as etapas especificadas de um método e aqueles materiais ou etapas adicionais que não afetam materialmente as características básicas do material ou método.

[0156] Ao longo deste pedido, várias modalidades podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo das modalidades descritas no presente documento. Consequentemente, deve ser considerado que a descrição de uma faixa tenha descrito especificamente todas as subfaixas possíveis bem como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, deve ser considerado que a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 tenha descrito especificamente subfaixas tais como de 1 a 2, de 1 a 3, de 1 a 4 e de 1 a 5, de 2 a 3, de 2 a 4, de 2 a 5, de 2 a 6, de 3 a 4, de 3 a 5, de 3 a 6, etc. bem como números individuais dentro desse faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.

[0157] O termo "cerca de", como usado no presente documento, pode permitir um grau de variabilidade em um valor ou faixa, por exemplo, dentro de 10%, dentro de 5%, ou dentro de 1% de um valor declarado ou de um limite declarado de uma faixa.

[0158] O termo "fitase" (mio-inositol hexaquisfosfato fosfo- hidrolase) se refere a uma classe de enzimas fosfatase que catalisa a hidrólise do ácido fítico (mio-inositol hexaquisfosfato ou IP6) - uma forma orgânica indigerível de fósforo que é encontrada em grãos e sementes de oleaginosas - e libera uma forma utilizável de fósforo inorgânico.

[0159] Os termos "animal" e "indivíduo" são usados indistintamente no presente documento e se referem a qualquer organismo pertencente ao reino Animalia e inclui, sem limitação, mamíferos (excluindo seres humanos), animais não humanos, animais domésticos, gado, animais de fazenda, animais de zoológico, reprodutores e similares. Por exemplo, podem ser mencionados todos os animais não ruminantes e ruminantes. Em uma modalidade, o animal é um não ruminante, isto é, um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástricos incluem, mas sem limitação, porcos e suínos, como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves domésticas, como perus, patos, frango, frangos de corte, galinhas poedeiras; peixe, como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos, como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, mas sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisões, alces, cervos, iaques, búfalos, veados, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.

[0160] O termo "clado", também conhecido como grupo monofilético, se refere a um grupo de organismos ou sequências relacionadas que têm um ancestral comum e todos os seus descendentes diretos.

[0161] O termo "Tm" é a temperatura na qual uma proteína desnatura ou a energia livre dos estados desdobrado e dobrado é igual e metade da população está desdobrada e a outra metade está dobrada. O comportamento de desdobramento térmico de enzimas é tipicamente estudado com o uso de calorimetria ou técnicas ópticas tais como dicroísmo circular, fluorescência ou espalhamento de luz.

[0162] O termo "clado Tm-fitase alta" se refere a um clado de polipeptídeos de fitase ou fragmentos dos mesmos que têm uma Tm de pelo menos 92,5 ° com o uso de calorimetria de varredura diferencial como descrito abaixo no Exemplo 3. Os termos "polipeptídeos do clado

Tm-fitase alta" e "polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos" são usados indistintamente no presente documento.

[0163] Os termos "aplicação líquida de misturador" e "MLA" são usados indistintamente no presente documento e se referem à produção de ração para animais em que compostos sensíveis ao calor, especificamente, enzimas podem ser aplicadas em uma forma líquida à ração para animais antes do condicionamento e peletização e permanecem funcionais na ração após o condicionamento e peletização.

[0164] Uma "ração" significa qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou similares ou componentes de tais refeições destinadas ou adequadas para serem comidas, ingeridas, digeridas por um animal não humano, respectivamente. De preferência, o termo "ração" é usado com referência a produtos que são dados a animais na criação de gado. Os termos "ração" e "ração para animais" são usados no presente documento indistintamente.

[0165] Um "aditivo de ração", como usado no presente documento, se refere a um ou mais ingredientes, produtos de substâncias (por exemplo, células), usados sozinhos ou em conjunto, na nutrição (por exemplo, para melhorar a qualidade de um alimento (por exemplo, uma ração para animais), para melhorar o desempenho e/ou saúde de um animal e/ou para melhorar a digestibilidade de um alimento ou materiais dentro de um alimento.

[0166] Como usado no presente documento, o termo "alimento" é usado em um sentido amplo - e abrange alimentos e produtos alimentícios em qualquer forma para humanos, bem como alimentos para animais (ou seja, uma ração).

[0167] O alimento ou ração pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração. Em algumas modalidades, as enzimas mencionadas no presente documento podem ser usadas como - ou na preparação ou produção de - uma substância de alimento ou ração.

[0168] Como usado no presente documento, o termo "ingrediente de alimento ou ração" inclui uma formulação que é ou pode ser adicionada a alimentos ou gêneros alimentícios e inclui formulações que podem ser utilizadas em níveis baixos em uma ampla variedade de produtos. O ingrediente de alimento ou ração pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração. As enzimas descritas no presente documento podem ser utilizadas como ingrediente ou na preparação ou produção de alimento ou ração. As enzimas podem ser - ou podem não ser adicionadas a - suplementos alimentares. As composições de ração para animais monogástricos incluem tipicamente composições que compreendem produtos vegetais que contêm fitato. Essas composições incluem, porém, sem limitação, rações à base de farinha de milho, farinha de soja, farinha de colza, farinha de semente de algodão, milho, trigo, cevada e sorgo.

[0169] Como usado no presente documento, o termo "peletização" se refere à produção de péletes que podem ser comprimidos sólidos, redondos, esféricos e cilíndricos, particularmente péletes de ração e ração sólida extrudada para animais. Um exemplo de um processo de fabricação de peletização de ração conhecido geralmente inclui misturar ingredientes de alimento ou ração pelo menos 1 minuto à temperatura ambiente, transferir a mistura para um silo pulmão, transportar a mistura para um condicionador de vapor (ou seja, condicionar), opcionalmente transferir a mistura condicionada no vapor para um expansor, transferir a mistura para o moinho ou extrusora de péletes e, finalmente, transferir os péletes para um resfriador de péletes. (Fairfield, D. 1994. Capítulo 10, Pelleting Cost Center. In Feed Manufacturing Technology IV.

(McEllhiney, editor), American Feed Industry Association, Arlington, Va., páginas 110-139).

[0170] O termo "pélete" se refere a uma composição de ração para animais (geralmente derivada de grãos) que foi submetida a um tratamento térmico, como um tratamento a vapor (ou seja, condicionamento), e prensada ou extrudada por meio de uma máquina. O pélete pode incorporar enzima na forma de uma preparação líquida ou uma preparação seca. A preparação seca pode ser revestida ou não revestida e pode estar na forma de um grânulo. O termo "grânulo" é usado para partículas compostas por enzimas (tal como uma fitase, por exemplo, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados descritos no presente documento) e outros produtos químicos tais como sais e açúcares, e podem ser formadas com o uso de qualquer uma de uma variedade de técnicas, que incluem abordagens de granulação em leito fluido para formar grânulos em camadas.

[0171] Os termos "recuperação de peletização em alimentação", "atividade recuperada" ou "recuperação da atividade" se referem à razão de (i) a atividade de uma enzima alimentar após um tratamento envolvendo um ou mais dos seguintes estressores: aquecimento, pressão aumentada, pH aumentado, pH diminuído, armazenamento, secagem, exposição a tensoativo (ou tensoativos), exposição a solvente (ou solventes) e estresse mecânico para (ii) a atividade da enzima antes do tratamento. A atividade recuperada pode ser expressa como uma porcentagem. A atividade recuperada percentual é calculada como segue: (atividade após tratamento) atividade recuperada % = × 100% (tividade antes do tratamento)

[0172] Uma fitase pode exibir estabilidade mostrando qualquer uma de "recuperação de peletização em alimentação", "atividade recuperada", "termoestabilidade" ou "reversibilidade de inatividade" melhorada.

[0173] No contexto de experimentos de peletização, a "atividade antes do tratamento" pode ser aproximada medindo-se a atividade da fitase presente no farelo que não sofre tratamento de uma maneira que é correspondida de outra forma com a fitase que é submetida ao tratamento. Por exemplo, a fitase no farelo não tratado é manuseada e armazenada por um tempo semelhante e sob condições semelhantes à fitase no farelo tratado, para controlar possíveis interações ou outros efeitos fora do tratamento especificado por si só.

[0174] Os termos "teste de recuperação de peletização em alimentação" e "teste de peletização em alimentação padrão" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um teste para medir ou avaliar a estabilidade de uma enzima alimentar para resistir ao tratamento térmico de condicionamento e peletização.

[0175] Por exemplo, um teste de recuperação de peletização em alimentação como esse é apresentado no Exemplo 5 abaixo.

[0176] O termo atividade de fitase em relação à determinação em preparações sólidas ou líquidas significa 1 FTU (unidade de fitase), que é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 micromol de ortofosfato inorgânico de um substrato de fitato de sódio 5,0 mM (de arroz) em um minuto sob as condições de reação, pH 5,5 a 37°C, que também são definidas no ensaio de fitase ISO 2009 - A standard assay for determining phytase activity found at International Standard ISO/DIS 30024: 1-17, 2009.

[0177] Alternativamente, como usado no presente documento, uma unidade de fitase (U) pode ser definida como a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgânico de um substrato de fitato de sódio 0,2 mM (de arroz) em um minuto nas condições de reação de

25°C, em pH 5,5 ou 3,5, respectivamente, no ensaio de Verde Malaquita, como ilustrado no Exemplo 3.

[0178] O termo "atividade específica", como utilizado no presente documento, é o número de unidades de enzima por ml dividido pela concentração de proteína (total) em mg/ml. Os valores de atividade específica são, portanto, normalmente cotados como unidades/mg. Alternativamente, a atividade específica é o número de unidades de enzima por ml dividido pela concentração de fitase em mg/ml.

[0179] O termo "calorimetria de varredura diferencial" ou "DSC", como usado no presente documento, é uma técnica termoanalítica na qual a diferença na quantidade de calor necessária para aumentar a temperatura de uma amostra e a referência é medida como uma função da temperatura. Tanto a amostra quanto a referência são mantidas quase à mesma temperatura durante todo o experimento. Geralmente, o programa de temperatura para uma análise DSC é projetado de modo que a temperatura do suporte da amostra aumente linearmente como uma função do tempo. A amostra de referência deve ter uma capacidade térmica bem definida ao longo da faixa de temperatura a ser varrida.

[0180] O termo "prebiótico" significa um ingrediente de alimento não digerível que afeta beneficamente o hospedeiro ao estimular seletivamente o crescimento e/ou a atividade de uma ou de um número limitado de bactérias benéficas.

[0181] O termo "microrganismo de alimentação direta" ("DFM"), como utilizado no presente documento, é fonte de microrganismos vivos (viáveis) que, quando aplicados em número suficiente, podem conferir um benefício ao seu receptor, isto é, um probiótico. Um DFM pode compreender um ou mais desses microrganismos tais como cepas bacterianas. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Dessa forma, o termo DFM abrange um ou mais dentre os seguintes: bactérias diretamente alimentadas, levedura diretamente alimentada e combinações das mesmas.

[0182] Bacilli são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais, como calor, umidificação e uma faixa de pH. Estes esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As Bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonísticos a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser um tanto sensíveis ao calor, as mesmas não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de Bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus.

[0183] Os termos "probiótico", "cultura probiótica" e "DFM" são usados indistintamente no presente documento e definem microrganismos vivos (incluindo bactérias ou leveduras, por exemplo) que, por exemplo, quando ingeridos ou aplicados localmente em número suficiente, afetam beneficamente o organismo hospedeiro, isto é, conferindo um ou mais benefícios de saúde demonstráveis ao organismo hospedeiro tais como um benefício de saúde, digestivo e/ou de desempenho. Os probióticos podem melhorar o equilíbrio microbiano em uma ou mais superfícies da mucosa. Por exemplo, a superfície mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo "probiótico", como usado no presente documento, também abrange microrganismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imunitário e ao mesmo tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície da mucosa, por exemplo, o intestino. Enquanto ainda não há limites inferiores ou superiores para ingestão probiótica, foi sugerido que pelo menos 106 a

1012, preferencialmente pelo menos 106 a 1010, preferencialmente 108 a 109 cfu como uma dose diária será eficaz para alcançar os efeitos de saúde benéficos em um indivíduo.

[0184] O termo "CFU" como usado no presente documento significa "unidades formadoras de colônias" e é uma medida de células viáveis nas quais uma colônia representa um agregado de células derivadas a partir de uma única célula progenitora.

[0185] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza e não reflete a extensão em que um isolado foi purificado, mas indica isolamento ou separação de uma forma nativa ou ambiente nativo. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém, sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, enzima geneticamente modificada, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou de todos os constituintes naturais aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância encontrada na natureza ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico isolado" serão usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0186] Os termos "purificar", "purificado" e "purificação" significam tornar substancialmente puro ou livre de componentes indesejados, impureza do material, mistura ou imperfeição. Por exemplo, como aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos, a purificação geralmente denota um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componentes, como determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na arte (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda distinta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio sujeito a centrifugação em gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, usualmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo "enriquecido" se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.

[0187] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos são usados indistintamente no presente documento e se referem a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma "proteína" ou um "polipeptídeo" compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint

Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta invenção. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídio pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguido por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S". Ao descrever as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L, I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leucina ou uma isoleucina. Às vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V, indica que a posição pode ter uma fenilalanina ou valina naquela posição.

[0188] Os termos "sequência de sinalização" e "peptídeo de sinalização" referem-se a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no terminal N da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exógena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada.

[0189] O termo forma "madura" de uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo se refere à forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de pró-peptídeo.

[0190] O termo "tipo selvagem" em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Como usado no presente documento, o termo "de ocorrência natural" se refere a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácido nucleico) que seja encontrada na natureza. Por outro lado, o termo "de ocorrência não natural" se refere a qualquer coisa que não seja encontrada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes/geneticamente modificados e sequências de proteínas produzidas em laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[0191] Como usado no presente documento em relação às posições dos resíduos de aminoácidos, "que corresponde a" ou "corresponde a" ou "correspondem a" ou "corresponde" se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que é análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou peptídeo. Como usado no presente documento, "região correspondente", em geral, se refere a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.

[0192] Os termos "derivado de" e "obtido a partir de" referem-se a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.

[0193] O termo "aminoácido" se refere à unidade estrutural química básica de uma proteína ou um polipeptídeo. As abreviações a seguir usadas no presente documento para identificar aminoácidos específicos podem ser encontradas na Tabela 1. Tabela1. Abreviações de Aminoácidos de Uma e Três Letras Três Letras Uma Letra Aminoácido Abreviação Abreviação Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido de serina termoestável Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido glutâmico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Qualquer aminoácido ou como Xaa X definido no presente documento

[0194] Seria reconhecido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que modificações das sequências de aminoácidos descritas no presente documento podem ser feitas ao mesmo tempo que se retém a função associada com as sequências de aminoácidos descritas. Por exemplo, é bastante conhecido na técnica que alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada, são comuns.

[0195] O termo "códon otimizado", uma vez que se refere a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para a transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração de códons no gene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso típico de códons do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.

[0196] O termo "gene" se refere a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (sequências de não codificação 3') à sequência de codificação. "Gene nativo" se refere a um gene como encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas disposta de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" se refere a um gene que não é normal- mente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

[0197] O termo "íntron" significa qualquer sequência de nucleotídeos dentro de um gene que é removida por splicing de RNA durante a maturação do produto final de RNA. O termo "íntron" se refere tanto à sequência de DNA dentro de um gene quanto à sequência correspondente nos transcritos de RNA.

[0198] O termo "sequência de codificação" se refere a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras adequadas" referem-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências de iniciação de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de haste- laço.

[0199] O termo "ligado operacionalmente" se refere à associação de sequências de ácido nucleico em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequências de codificação podem ser ligadas de maneira funcional às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[0200] Os termos "sequência reguladora" ou "sequência de controle" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, operadores e similares. Como indicado acima, as sequências reguladoras podem ser ligadas de maneira funcional em orientação senso ou antissenso à sequência de codificação/gene de interesse.

[0201] "Promotor" ou "sequências promotoras" se referem a uma sequência reguladora que está envolvida na ligação da RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene. O promotor pode ser um promotor indutível ou um promotor constitutivo. Um promotor preferencial utilizado na invenção é Trichoderma reesei cbh1, que é um promotor induzível.

[0202] As "sequências de não codificação 3'" referem-se a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de gene, tal como terminação de transcrição.

[0203] O termo "transformação", como usado no presente documento, se refere à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente ou pode se integrar ao genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "recombinantes" ou "transgênicos" ou "transformantes".

[0204] Os termos "recombinante" e "geneticamente modificado" se referem a uma combinação artificial de dois segmentos separados de sequências de ácido nucleico, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "modificado", "geneticamente modificado" e "modificado para expressão de gene exógena" são usados indistintamente no presente documento.

[0205] Os termos "construto recombinante", "construto de expressão", "construto de expressão recombinante" e "cassete de expressão" são usados indistintamente no presente documento. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências regulatórias e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras como é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado. O indivíduo versado na técnica está bem ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar de modo bem-sucesso células hospedeiras. O especialista também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86) e, portanto, que vários eventos são normalmente selecionados para obter linhas que exibem o nível e padrão de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada com o uso de ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), análise de imunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotípica.

[0206] Os termos "hospedeiro de produção", "hospedeiro" e "célula hospedeira" são usados indistintamente no presente documento e se referem a qualquer planta, organismo ou célula de qualquer planta ou organismo, seja humano ou não humano no qual um construto recombinante pode ser estável ou transitoriamente introduzido para expressar um gene. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não é idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem durante a propagação.

[0207] O termo "porcentagem de identidade" é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, como determinado através da comparação de sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, como possa ser o caso, como determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987) e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

[0208] Como usado no presente documento, "% de identidade" ou porcentagem de identidade" ou "PID" se refere à identidade de sequência de proteínas. A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990 e Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para sequências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de‐valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, não correspondência = ‐3); Abertura de Intervalo = 5; e Extensão de Intervalo = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de lacuna= 11; e Extensão de lacuna = 1. Uma porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinada pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de "referência". Os algoritmos BLAST referem- se à sequência "de referência" como a sequência "de consulta".

[0209] Como usado no presente documento, o termo "proteínas homólogas" ou "fitases homólogas" se refere a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res setembro de 1997 1;25(17):3389-402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas.

[0210] Alinhamentos de sequência e cálculos de percentual de identidade podem ser realizados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), do programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD), ou da suíte de software aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-3500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade de existência de LACUNA = 15, extensão de LACUNA = 0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína = 4 e KTUPLE = 1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz =

BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WINDOW=5 e TOP DIAGONALS SAVED=5. Alternativamente, o alinhamento de múltiplas sequências pode ser derivado com o uso do alinhamento MAFFT de Geneious® versão 10.2.4 com configurações padrão, matriz de pontuação BLOSUM62, penalidade de lacuna aberta 1,53 e valor de deslocamento 0,123.

[0211] O programa MUSCLE (Robert C. Edgar. MUSCLE: alinhamento de múltiplas sequências com alta precisão e alto rendimento Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1792-1797) é ainda outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências.

[0212] Uma árvore filogenética ou evolutiva é representada na Figura 2 mostra o parentesco entre várias fitases que incluem os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos com base em semelhanças e diferenças na sequência de aminoácidos.

[0213] Outra maneira de identificar semelhanças de sequência é gerar um Modelo de Markov Oculto (HMM). Os HMMs são estruturas probabilísticas em que os dados observados (como um DNA ou sequência de aminoácidos) são modelados em uma série de saídas (ou emissões) geradas por um de vários estados internos (ocultos). Os HMMs são frequentemente usados para a análise estatística de alinhamentos de múltiplas sequências de DNA. Os mesmos podem ser usados para identificar características genômicas tais como ORFs, inserções, deleções, substituições e domínios de proteínas, entre muitas outras. Os HMMs também podem ser usados para identificar homologias; o banco de dados Pfam amplamente utilizado (Punta et al., 2012), por exemplo, é um banco de dados de famílias de proteínas identificadas com o uso de HMMs. Os HMMs podem ser significativamente mais precisos do que a solução de ferramentas de comparação de sequências, BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool), produzido pela primeira vez em 1990 (Altschul et al., 1990, 1997). Consequentemente, as sequências de polipeptídeo dos polipeptídeos do Clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos mostrados no Exemplo 4 foram usados para gerar um Modelo de Markov Oculto (HMM) para identificar semelhanças de sequência.

[0214] O termo "polipeptídeo de fitase modificado" significa que o polipeptídeo não ocorre naturalmente e tem atividade de fitase.

[0215] Observa-se que um fragmento do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado é uma porção ou subsequência do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado que é capaz de funcionar como o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado, ou seja, o mesmo retém a atividade da fitase.

[0216] O termo "vetor" se refere a uma sequência de polinucleotídeos projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem, porém, sem limitação, vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de transporte, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e similares.

[0217] Um "vetor de expressão", como utilizado no presente documento, significa um construto de DNA que compreende uma sequência de DNA que está ligada operacionalmente a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência codificando locais de ligação a ribossomo adequados no mRNA, intensificadores e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução.

[0218] O termo "expressão", como usado no presente documento, se refere à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. A expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.

[0219] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do mRNA em um precursor ou proteína madura. Proteína "madura" se refere a um polipeptídeo processado pós- traducionalmente, isto é, um a partir do qual qualquer sequência de sinalização, pré ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos. Proteína "precursora" se refere ao produto primário da tradução de mRNA, isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- ou pró-peptídeos podem ser, porém sem limitação, sinais de localização intracelulares. "Transformação estável" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto organelares, resultando na herança geneticamente estável. Em contraste, "transformação temporária" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem integração ou herança estável.

[0220] Assim, em uma modalidade, é descrito um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligada operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado e fragmentos dos mesmos como descrito no presente documento.

[0221] Este construto recombinante pode compreender uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligada operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos descritos no presente documento. Além disso, o hospedeiro de produção é selecionado a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos, leveduras, plantas ou algas. O hospedeiro de produção preferencial é o fungo filamentoso, Trichoderma reesei.

[0222] Alternativamente, pode ser possível usar a síntese de proteínas isenta de células como descrito em Chong, Curr Protoc Mol Biol. 2014; 108: 16.30.1–16.30.11.

[0223] Também é descrito no presente documento um método para a produção de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, que compreende: (a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante descrito no presente documento e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo é produzido.

[0224] Opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo pode ser recuperado do hospedeiro de produção.

[0225] Em outro aspecto, um sobrenadante de cultura contendo fitase pode ser obtido por qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[0226] Em outra modalidade, é descrita uma sequência de polinucleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos, como descrito no presente documento.

[0227] Possíveis regiões de controle de iniciação ou promotores que podem ser incluídos no vetor de expressão são numerosos e familiares para aqueles que são versados na técnica. Um "promotor constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" ou "reprimível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou reprimíveis devido a mudanças em fatores ambientais incluindo, porém sem limitação, a disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a presença de metal (ou metais) pesado, a concentração de inibidor (ou inibidores), tensão ou uma combinação dos anteriores, como conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis ou reprimíveis são induzíveis ou reprimíveis por fatores metabólicos, tais como o nível de determinadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos ou uma combinação dos anteriores como conhecido na técnica.

[0228] Em uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, em alguns casos, quando Trichoderma reesei é o hospedeiro, o promotor pode ser um promotor de T. reesei nativo, tal como o promotor cbh1 que é depositado no GenBank com o Número de Acesso D86235. Outros exemplos não limitantes adequados de promotores úteis para expressão fúngica incluem cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn1 e xyn2, promotor de gene de fosfatase de ácido reprimível (phoA) de P. chrysogenus (consultar, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 :753-756), promotor de PCK1 reprimível por glicose (consultar, por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192:235-240), promotor de MET3 reprimível por glicose, induzível por maltose (consultar Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5:638-649), promotor pKi e promotor cpc1. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes glicoamilase A. awamori e A. niger (consultar, por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2306- 2315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581-1585). Ademais, os promotores do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (consultar, por exemplo, o documento EPA 137280Al).

[0229] Os fragmentos de DNA que controlam a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeiro de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.

[0230] Os termos "hospedeiro de produção", "célula hospedeira de produção", "célula hospedeira" e "cepas hospedeiras" são usados no presente documento indistintamente e significam um hospedeiro adequado para um vetor de expressão ou construto de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fitase ou fragmento do mesmo. A escolha de um hospedeiro de produção pode ser selecionada do grupo que consiste em bactérias, fungos, leveduras, plantas e algas. Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo e sua fonte.

[0231] Especificamente, as cepas hospedeiras são preferencialmente células fúngicas filamentosas. Em uma modalidade preferencial da invenção, "célula hospedeira" significa tanto as células como os protoplastos criados a partir das células de uma cepa de fungo filamentoso e, em particular, de Trichoderma sp. ou um Aspergillus sp.

[0232] O termo "fungos filamentosos" se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (Consultar, Alexopoulos, C.J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York). Esses fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfológica, fisiológica e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é por alongamento das hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Na presente invenção, a célula precursora do fungo filamentoso pode ser uma célula de uma espécie de, porém, sem limitação, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei (anteriormente classificado como T.

longibrachiatum e atualmente também conhecido como Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, Humicola insolens e Humicola grisea); Chrysosporium sp. (e.g., C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, e A. awamori), Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., e Emericella sp. (Consultar também, Innis et al., (1985) Sci. 228:21–26).

[0233] Como usado no presente documento, o termo "Trichoderma" ou "Trichoderma sp." se referem a qualquer gênero de fungo anteriormente ou atualmente classificado como Trichoderma.

[0234] Um cassete de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente nas células de hospedeiros de produção microbiana. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias de fungos e que crescem em uma ampla faixa de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solventes. Por exemplo, é contemplado que qualquer uma das bactérias, leveduras, plantas, algas ou fungos, tais como fungos filamentosos, possa hospedar adequadamente o vetor de expressão.

[0235] A inclusão do cassete de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse de modo que a mesma possa residir intracelularmente, extracelularmente ou uma combinação de dentro e fora da célula. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.

[0236] Os métodos para transformar ácidos nucleicos em fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp., por exemplo, A. oryzae ou A. niger, H. grisea, H. insolens e T. reesei., são bem conhecidos na técnica. Um procedimento adequado para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito, por exemplo, no documento no EP238023.

[0237] Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Trichoderma é descrito, por exemplo, em Steiger et al 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:114 a 121. A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. é dependente da concentração de íon de cálcio. Geralmente, entre CaCl2 10 mM e CaCl2 50 mM é usado em uma solução de absorção. Além da necessidade do íon cálcio na solução de absorção, outros compostos geralmente incluídos são um sistema de tamponamento, tal como tampão TE (Tris 10 Mm, pH 7,4; EDTA 1 mM) ou tampão MOPS 10 mM, pH 6,0 (ácido morfolinopropanossulfônico) e polietileno glicol (PEG). Acredita-se que o polietilenoglicol atue fundindo as membranas celulares, permitindo assim que o conteúdo do meio seja entregue no citoplasma da cepa Trichoderma sp. e o DNA do plasmídeo seja transferido para o núcleo. Essa fusão deixa frequentemente múltiplas cópias do DNA de plasmídeo integradas no cromossomo hospedeiro.

[0238] Normalmente uma suspensão contendo protoplastos Trichoderma sp. ou células que foram submetidos a um tratamento de permeabilidade a uma densidade de 105 a 107/ml, preferencialmente 2 × 106/ml, são usados na transformação. Um volume de 100 μl desses protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo, sorbitol 1,2 M; CaCl2 50 mM) é misturado com o DNA desejado. Em geral, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplasto. No entanto, é preferível adicionar cerca de 0,25 volumes à suspensão de protoplasto. Aditivos tais como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares também podem ser adicionados à solução de absorção e auxiliar na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. (consultar, por exemplo, Pat. nos U.S.

6.022.725 e 6.268.328, ambas incorporadas a título de referência).

[0239] De preferência, os transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetores em que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de fitase ou fragmento do mesmo é integrado de forma estável em um cromossomo da cepa hospedeira. Os transformantes são então purificados por técnicas conhecidas.

[0240] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras.

[0241] Geralmente, as células são cultivadas em um meio padrão contendo sais fisiológicos e nutrientes (consultar, por exemplo, Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, JP et al., Academic Press, páginas 71- 86, 1988 e IImen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:1298– 1306). Os meios preparados comuns comercialmente (por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedura (YM), caldo Luria Bertani (LB) e caldo Sabouraud Dextrose (SD)) também encontram uso na presente invenção.

[0242] As condições de cultura também são padrão (por exemplo, as culturas são incubadas a aproximadamente 28 °C em meio apropriado em culturas agitadas ou fermentadores até que os níveis desejados de expressão de fitase sejam alcançados). As condições de cultura preferenciais para um dado fungo filamentoso são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou na fonte dos fungos, tais como American Type Culture Collection e Fungal Genetics Stock Center.

[0243] Após o crescimento do fungo ter sido estabelecido, as células são expostas a condições eficazes para causar ou permitir a expressão de uma fitase e, particularmente, de uma fitase como definida no presente documento. Nos casos em que uma sequência de codificação de fitase está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor (por exemplo, um açúcar, sal de metal ou antimicrobiano), é adicionado ao meio em uma concentração eficaz para induzir a expressão de fitase. Um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo secretado das células hospedeiras pode ser usado, com processamento de pós-produção mínimo, como uma preparação de caldo inteiro.

[0244] A preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um microrganismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica, resultando na expressão de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo.

[0245] O termo "caldo de fermentação inteiro gasto" é definido no presente documento como teor não fracionado do material de fermenta- ção que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fermen- tação inteiro gasto" também abrange biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[0246] Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, que incluem materiais de fermentação residuais em bruto, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução de fitase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.

[0247] É possível recuperar opcionalmente a proteína desejada do hospedeiro de produção. Em outro aspecto, um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo contendo sobrenadante de cultura é obtido com o uso de qualquer um dos métodos conhecidos por aqueles que são versados na técnica.

[0248] Exemplos dessas técnicas incluem, porém, sem limitação, cromatografia de afinidade (Tilbeurgh et a., (1984) FEBS Lett. 16:215), métodos cromatográficos de troca iônica (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al, (1984) J. Appl. Biochem. 6:336; e Ellouz et al., (1987) Chromatography 396:307), que inclui troca iônica com o uso de materiais com poder de alta resolução (Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808:153), cromatografia de interação hidrofóbica (Consultar, Tomaz e Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865:123; partição de duas fases (Consultar, Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287); precipitação com etanol; HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio e filtração em gel (por exemplo, Sephadex G-75). O grau de purificação desejado irá variar dependendo do uso do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, a purificação não será necessária.

[0249] Por outro lado, pode ser desejável concentrar uma solução contendo um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, a fim de otimizar a recuperação. O uso de soluções não concentradas exige tempo de incubação aumentado a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado. A solução contendo enzima é concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os métodos exemplificativos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.

[0250] Além disso, a concentração do produto de proteína desejado pode ser realizada com o uso de, por exemplo, um agente de precipitação, tal como um agente de precipitação de haleto de metal. O agente de precipitação de haleto de metal, cloreto de sódio, pode ser também usado como um conservante. O agente de precipitação de haleto de metal é usado em uma quantidade eficaz para precipitar o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo. A seleção de pelo menos uma quantidade eficaz e uma quantidade ideal de haleto de metal eficaz para causar a precipitação da enzima, assim como as condições da precipitação para máxima recuperação incluindo o tempo de incubação, pH, temperatura e concentração de enzima, serão prontamente evidentes para uma pessoa de habilidade comum na técnica, após testes de rotina. Geralmente, pelo menos 5% em p/v (peso/volume) a 25% em p/v de haleto de metal é adicionado à solução de enzima concentrada e usualmente pelo menos 8% em p/v.

[0251] Outro modo alternativo para precipitar a enzima é usar compostos orgânicos. Os agentes de precipitação de composto orgânico exemplificativos incluem: ácido 4-hidroxibenzoico, sais de metais alcalinos de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres alquílicos de ácido 4-hidroxibenzoico e mesclas de dois ou mais desses compostos orgânicos. A adição dos agentes de precipitação de composto orgânico pode ocorrer antes, simultaneamente ou subsequente à adição do agente de precipitação de haleto de metal, e a adição de ambos os agentes de precipitação, composto orgânico e haleto de metal pode ser executada sequencial ou simultaneamente. Geralmente, os agentes de precipitação orgânicos são selecionados dentre o grupo que consiste em sais de metais alcalinos de ácido 4-hidroxibenzoico, tais como sais de sódio ou potássio, e ésteres alquílicos lineares ou ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, em que o grupo alquila contém de 1 a 12 átomos de carbono, e mesclas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Os compostos orgânicos adicionais também incluem, porém sem limitação, éster metílico de ácido 4-hidroxibenzoico (nomeado metil PARABENO), éster propílico de ácido 4-hidroxibenzoico (nomeado PARABENO). Para descrições adicionais, consultar, por exemplo, a Patente No U.S. 5.281.526. A adição do agente de precipitação de composto orgânico fornece a vantagem de alta flexibilidade das condições de precipitação em relação ao pH, temperatura, concentração, agente de precipitação, concentração de proteína e tempo de incubação. Geralmente, pelo menos cerca de 0,01% em p/v e no máximo cerca de 0,3% em p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicionado à solução de enzima concentrada.

[0252] Após o período de incubação, a enzima enriquecida ou purificada é, então, separada do pigmento dissociado e outras impurezas coletadas por técnicas de separação convencionais, tais como filtração, centrifugação, microfiltração, filtração giratória a vácuo, ultrafiltração, filtração por prensa, microfiltração por membrana cruzada, microfiltração por membrana de fluxo cruzado ou similares. O enriquecimento ou purificação adicional do precipitado de enzima pode ser obtida lavando-se o precipitado com água. Por exemplo, o precipitado de enzima enriquecido ou purificado é lavado com água contendo o agente de precipitação de haleto de metal ou com água contendo o haleto de metal e os agentes de precipitação de composto orgânico.

[0253] Algumas vezes, é vantajoso deletar genes dos hospedeiros de expressão, em que a deficiência de gene pode ser curada pelo vetor de expressão. Quando for desejado obter uma célula hospedeira fúngica que tenha um ou mais genes inativados, podem ser usados métodos conhecidos (por exemplo, métodos descritos na Pat. Nº U.S.

5.246.853, Pat. Nº U.S. 5.475.101 e WO92/06209). A inativação de gene pode ser realizada por deleção completa ou parcial, por inativação por inserção ou por qualquer outro meio que dê origem a um gene não funcional para seu propósito previsto (de modo que o gene seja impedido contra a expressão de uma proteína funcional).

[0254] Qualquer gene de um Trichoderma sp ou outro hospedeiro fúngico filamentoso, que tenha sido clonado, pode ser deletado, por exemplo, os genes cbh1, cbh2, egl1 e egl2. Em algumas modalidades, a deleção do gene pode ser realizada por inserção de uma forma do gene desejado a ser inativado em um plasmídeo por métodos conhecidos na técnica. O plasmídeo de deleção é então cortado em local (ou locais) apropriado de enzimas de restrição, interno à região codificante do gene desejado, e a sequência codificante do gene ou parte da mesma é substituída por um marcador selecionável. As sequências de DNA de flanqueamento do local do gene a ser deletado (preferencialmente entre 0,5 e 2,0 kb) permanecem em qualquer um dos lados do gene marcador. Um plasmídeo de deleção apropriado geralmente terá locais de enzima de restrição únicos presentes no mesmo para permitir que o fragmento contendo o gene deletado, que inclui as sequências de DNA flanqueadoras e o gene de marcadores selecionáveis, seja removido como uma única porção linear.

[0255] Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcricionais e/ou pós-traducionais. Um exemplo não limitante de uma modificação pós-transcricional e/ou pós- traducional é "recorte" ou "truncamento" de um polipeptídeo. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tomar um polipeptídeo de fitase maduro e remover adicionalmente os aminoácidos N ou C-terminais para gerar formas truncadas da fitase que retêm atividade enzimática.

[0256] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações pós- transcricionais ou pós-traducionais que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.

[0257] Modificações de sequência adicionais de polipeptídeos pós- expressão podem ocorrer. Isso inclui, porém, sem limitação, oxidação, desglicosilação, glicação, etc. Sabe-se que a glicação pode afetar a atividade da fitase quando submetida à incubação com glicose ou outros açúcares redutores, especialmente em temperaturas acima de 30ºC e pH neutro ou alcalino. A engenharia de proteínas para eliminar resíduos de lisina pode ser usada para evitar tal modificação. Um exemplo disso pode ser encontrado no documento US 8.507.240. Por exemplo, a expressão de levedura pode resultar em polipeptídeos altamente glicosilados, resultando em um aparente aumento do peso molecular. Além disso, o documento WO2013/119470 (incorporado ao presente documento a título de referência) com data de publicação internacional em 15 de agosto de 2013 se refere a fitases que têm estabilidade aumentada que se acredita ser devido a glicosilação aumentada.

[0258] O termo "glicosilação", como usado no presente documento, se refere à fixação de glicanos a moléculas, por exemplo a proteínas. A glicosilação pode ser uma reação enzimática. A fixação formada pode ser por meio de ligações covalentes. A frase "altamente glicosilada" se refere a uma molécula tal como uma enzima que é glicosilada em muitos locais e em todos ou quase todos os locais de glicosilação disponíveis, por exemplo locais de glicosilação ligada a N. Alternativa ou adicionalmente a frase "altamente glicosilado" pode se referir a ramificação glicolítica extensiva (tal como, o tamanho e o número de porções químicas glicolíticas associadas a um local de glicosilação ligado a N particular) em todos ou substancialmente todos os locais de glicosilação ligados a N. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado é glicosilado em todos ou substancialmente todos os locais de glicosilação ligados a N de consenso (ou seja, um local de glicosilação NXS/T ligado a N de consenso).

[0259] O termo "glicano", como utilizado no presente documento, se refere a um polissacarídeo ou oligossacarídeo, ou à seção de carboidrato de um glicoconjugado tal como uma glicoproteína. Os glicanos podem ser homo- ou heteropolímeros de resíduos de monossacarídeo. Podem ser moléculas lineares ou ramificadas.

[0260] Uma fitase pode ter graus de glicosilação variados. Sabe-se que tais glicosilações podem melhorar a estabilidade durante o armazenamento e nas aplicações. Extensivas

[0261] A atividade de qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento pode ser determinada como discutido acima.

[0262] Como aqueles que são versados na técnica reconhecerão, as enzimas são proteínas frágeis, sempre sob ameaça no ambiente hostil da fábrica de rações. Extremos de temperatura, pressão, atrito, pH e atividade microbiana podem degradar ou destruir enzimas adicionadas à ração. O estresse na atividade enzimática acontece principalmente durante as fases de condicionamento e peletização do processamento. Por exemplo, a ração absorve a maior parte de sua energia térmica durante o condicionamento, antes da peletização. No entanto, a passagem do condicionador através da matriz do pélete também aquece a ração. Muitos fatores podem contribuir para o aumento da temperatura através da matriz, tais como formulação da ração, espessura da matriz, velocidade da matriz, especificação da matriz (tamanho e formato do orifício), temperatura de processamento inicial, capacidade de peletização, etc.

[0263] Assim, as condições durante a peletização da ração em escala industrial podem variar. A capacidade ou robustez de uma enzima para resistir a essas variações nas condições de peletização é muito importante. Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que as temperaturas de condicionamento podem variar de uma fábrica para outra. Além disso, a legislação local precisa ser considerada na determinação das condições sob as quais o processo de peletização é realizado. Por exemplo, a lei dinamarquesa exige a peletização 81°C de ração para aves (Miljø- og Fødevareministeriet, fødevarestyrelsen, j.nr. 2017-32-31-00378).

[0264] Além disso, condições de peletização de temperatura mais alta podem ser usadas na indústria para aumentar a qualidade do pélete, como melhor durabilidade e redução de finos e para aumentar a capacidade da prensa de pélete. Portanto, existe a necessidade de uma fitase robusta que, quando incorporada na ração antes do condicionamento e peletização, possa produzir péletes de atividade consistente em uma ampla faixa de temperaturas acima de 80°C. Isso é importante tanto para fitases aplicadas líquidas quanto para fitases aplicadas sólidas, como descrito no presente documento.

[0265] Fatores além da temperatura de condicionamento que podem influenciar o estresse real a que uma enzima de ração pode estar sujeita incluem, porém, sem limitação, matérias-primas de rações, localização geográfica da fábrica de rações, equipamento usado, tamanho da matriz, uso de auxiliares de peletização, controle de vapor, controle de temperatura e quaisquer outras condições de peletização comercialmente relevantes, como a presença de quaisquer outras enzimas exógenas que modificam a ração de modo a reduzir o estresse de peletização.

[0266] Esses fatores de estresse são adicionalmente agravados por uma tendência para alta temperatura ou supercondicionamento que leva à aplicação de enzimas e uma forma líquida aplicada após a peletização. E se uma enzima robusta pudesse ser geneticamente modificada para que pudesse ser aplicada como um líquido antes do condicionamento e peletização?

[0267] Os termos "robusto" e "robustez" são usados indistintamente no presente documento e significam a capacidade da fitase geneticamente modificada ou fragmento da mesma descritos no presente documento para suportar as variações nos processos de condicionamento e peletização na produção de ração industrial. Os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos descritos no presente documento como parte dos polipeptídeos do clado Tm-fitase alta e fragmentos dos mesmos são exemplos de tais enzimas robustas que podem ser aplicadas à ração em uma forma líquida antes do condicionamento e peletização.

[0268] Em outras palavras, os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados inovadores e fragmentos dos mesmos são capazes de suportar tais variações nos processos industriais de peletização de ração em uma forma não formulada, não revestida, desprotegida, quando aplicados em uma forma líquida ou forma sólida não formulada, não revestida, não protegida à ração antes do condicionamento e peletização.

[0269] Os termos "líquida", "forma líquida" e "preparação líquida" são usados indistintamente e significam que uma enzima pode ser aplicada em uma forma líquida à ração de qualquer maneira antes do condicionamento e peletização.

[0270] Acredita-se que a aplicação de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado robusto ou fragmento do mesmo à ração em uma forma líquida é benéfico em comparação com a aplicação de tal fitase como um grânulo revestido. Este grânulo revestido é a abordagem comercial atual para produzir produtos de fitase adequados para condicionamento e peletização em temperatura alta. Os benefícios da aplicação líquida de enzimas robustas incluem; 1) a enzima começará a funcionar imediatamente após a ingestão por um animal, uma vez que não precisa ser liberada do grânulo revestido antes que possa interagir com a ração, 2) há uma distribuição melhorada da enzima por toda a ração, garantindo assim uma entrega mais consistente da enzima ao animal, o que é particularmente importante para animais jovens que comem pequenas quantidades de ração, 3) a distribuição uniforme na ração torna mais fácil medir a enzima na ração e 4) no caso de uma fitase robusta, como o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado e fragmento descritos no presente documento, a mesma pode começar a degradar o fitato já presente na alimentação.

[0271] Em outras palavras, os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados inovadores e fragmentos dos mesmos são tão robustos que nenhum revestimento ou formulação especial é considerada necessária para aplicá-los à alimentação antes do condicionamento e peletização, uma vez que foram geneticamente modificados para suportar o estresse do condicionamento e peletização usados na produção industrial de rações. Consequentemente, a robustez dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados inovadores e fragmentos dos mesmos descritos no presente documento é tal que podem ser aplicados como um grânulo ou partícula não revestida ou não revestidos e desprotegidos quando colocados em um líquido.

[0272] Deve-se notar que os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos podem ser formulados de forma barata em um transportador sólido sem necessidade específica de revestimentos protetores e ainda manter a atividade ao longo do processo de condicionamento e peletização. Um revestimento protetor para fornecer termoestabilidade adicional quando aplicado em uma forma sólida pode ser benéfico para obter estabilidade de peletização quando necessário em certas regiões onde condições mais severas são usadas ou se as condições o justificarem, por exemplo, como no caso de ração de supercondicionamento acima de 90°C.

[0273] Os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos foram derivados com o uso de uma combinação de métodos e técnicas conhecidas no campo da engenharia de proteínas que incluem, análise filogenética, bibliotecas de avaliação de local, bibliotecas combinatórias, triagem de alto rendimento e análise estatística.

[0274] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que também tem pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº:1.

[0275] Aqueles que são versados na técnica reconhecerão que pelo menos 82% de identidade de sequência também inclui 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0276] Aqueles que são versados na técnica reconhecerão que pelo menos 79% de identidade de sequência também inclui 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0277] Também pode ser mencionado o seguinte, em que em algumas modalidades, é fornecido: a) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que também tem pelo menos 81% (tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs:2, 3, 8, 10, 12, 18, 19, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, e/ou 36. b) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem pelo menos 82% (tal como 82%, 83%,

84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs:1, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 21, 25, 34 e/ou 35; c) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que também tem pelo menos 83% (tal como 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº:13; d) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que também tem pelo menos 79% (tal como 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 22 e/ou 64; e/ou e) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que também tem pelo menos 80% (tal como 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID Nºs:16, 20, 23, 29 e/ou 37.

[0278] Em aspectos adicionais, o polipeptídeo compreende um domínio de núcleo de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou é um fragmento de domínio de núcleo de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado. Um "fragmento de domínio de núcleo" é definido no presente documento como um polipeptídeo que tem um ou mais aminoácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila do polipeptídeo. Como usado no presente documento, a frase "domínio de núcleo" se refere a uma região de polipeptídeo que abrange os aminoácidos necessários para manter a estrutura e função (tal como hidrólise de ácido fítico) do polipeptídeo. Os aminoácidos no domínio de núcleo podem ser adicionalmente modificados para melhorar a termoestabilidade ou atividade catalítica sob várias condições, tais como, sem limitação, pH. Em algumas modalidades não limitantes, o domínio de núcleo dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmento dos mesmos descritos no presente documento correspondem às posições de aminoácidos 14-325 da SEQ ID Nº:1. Em outras modalidades não limitantes, o domínio de núcleo corresponde às posições de aminoácidos 13-326, 12-327, 11-328, 10- 329, 9-330, 8-331, 7-332, 6-333, 5-334, 4-335, 3-336, 2-337, ou 1-338 da SEQ ID Nº:1. Em outras modalidades, o terminal N do domínio de núcleo corresponde à posição de aminoácido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 da SEQ ID Nº:1 e o terminal C do domínio de núcleo corresponde à posição de aminoácido 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, ou 413 of SEQ ID Nº:1.

[0279] Consequentemente, também são fornecidos no presente documento: f) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 78% (tal como 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 das SEQ ID Nºs:6 e/ou 64, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1;

g) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 79% (tal como 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 das SEQ ID Nºs:2, 8, 27 e/ou 37, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1; h) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 81% (tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 das SEQ ID Nºs:3, 10, 12, 18, 25, 26, 28, 30, 32, 35, 65, 70 e/ou 86, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1; i) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 82% (tal como 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 das SEQ ID Nºs:1, 4, 5, 7, 9, 11, 13-17, 21, 22, 31, 33, 34, 36, 64, 66-69, e/ou 71-84, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1; j) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 83% (tal como 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 das SEQ ID Nºs:19, 20, 23 e/ou 24, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1 e/ou k) um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 84%

(tal como 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de identidade de sequência com os aminoácidos 14-325 da SEQ ID Nº:29, em que as ditas posições de aminoácidos correspondem àquelas da SEQ ID Nº:1

[0280] Em ainda outro aspecto, os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmento dos mesmos que têm pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº:1 também podem ter uma sequência de aminoácidos que tem uma pontuação de Modelo de Markov Oculto (HMM) de pelo menos 1200 (tal como pelo menos cerca de 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750 ou 1800) como apresentado na Tabela 11 para os polipeptídeos do clado Tm-fitase alta.

[0281] Em ainda outros aspectos, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos específicos em uma ou mais posições dentro de sua sequência de polipeptídeos. Como tal, em algumas modalidades, são fornecidos no presente documento polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma ou mais (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12) substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em 30(L, I), 37Y, 45P, 89T, 182R, 194M, 195F, 202S, 228Y, 256H, 261H e 298V, em que as posições correspondem à numeração das SEQ ID Nºs:1 ou 57.

[0282] Além disso ou adicionalmente, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos pode compreender uma ou mais (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11) substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em 3T, 6S, 9Q, 73I, 76K, 78S, 118Q, 123A, 130V, 163P, 186D, 187K, 209A, 284S, 288A, 289R, 337V, 345A e 347K, em que as posições correspondem à numeração da SEQ ID Nº:1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID Nº:67, SEQ ID Nº:68, SEQ ID Nº:69, SEQ ID Nº:70, SEQ ID Nº:71, SEQ ID Nº:72, SEQ ID Nº:73, SEQ ID Nº:74, SEQ ID Nº:75, SEQ ID Nº:76, SEQ ID Nº:77, SEQ ID Nº:78, SEQ ID Nº:79, SEQ ID Nº:80, SEQ ID Nº:81, SEQ ID Nº:82, SEQ ID Nº:83, SEQ ID Nº:84, SEQ ID Nº:85, SEQ ID Nº:86, e SEQ ID Nº:87.

[0283] Os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos contendo uma ou mais substituições de aminoácidos podem exibir uma ou mais propriedades melhoradas ou aprimoradas, tais como, porém, sem limitação, termoestabilidade melhorada (tal como qualquer um de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% ou maior (inclusive de todas as porcentagens entre esses valores) de melhoria na termoestabilidade) ou melhoria da atividade (por exemplo, melhoria de atividade específica e/ou atividade em pH 3,5 em comparação com a atividade em pH 5,5) (tal como qualquer um de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% ou maior (inclusive de todas as porcentagens entre esses valores) de melhoria na atividade) em comparação com polipeptídeos de fitase ou fragmentos dos mesmos que não compreendem as ditas uma ou mais substituições de aminoácidos.

[0284] Em ainda outros aspectos, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento podem ter uma ou mais substituições (tais como uma ou mais das substituições descritas acima) que aumentam a razão entre a atividade (por exemplo, atividade específica) da fitase em pH 3,5 versus pH 5,5. Consequentemente, em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento têm uma razão de atividade (por exemplo, atividade específica) em pH 3,5 em comparação com a atividade (por exemplo, atividade específica) em pH 5,5, maior ou igual a cerca de 1,2 (tal como qualquer um dentre cerca de 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 ou superior).

[0285] Também é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem recuperação de peletização em ração de pelo menos 50% quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos com o uso de um teste de recuperação de peletização em ração padrão. Além disso, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem recuperação de peletização em ração de pelo menos 50%, como descrito no presente documento, também pode ter pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

[0286] A recuperação de peletização em ração pode variar de cerca de 50% a cerca de 100%, especificamente, cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%. 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0287] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo tem uma recuperação de peletização em ração de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 70%, 85%, 90%, 95% ou 99% quando aplicado como um sólido a 95°C.

[0288] Aqueles que são versados na técnica reconhecerão que as recuperações de peletização em rações podem variar com base no tipo de alimentação usada, condições de condicionamento e peletização usadas, por exemplo, temperatura e teor de umidade, ensaio usado para determinar a atividade, etc.

[0289] Qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento têm uma razão de recuperações de peletização em rações de pelo menos 0,7 quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, com o uso de um teste de peletização em rações padrão. Essa razão inclui cerca de 0,7, 0,8, 0,9, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 e 0,99.

[0290] Em outra modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem uma razão de recuperações de peletização em rações quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, de pelo menos cerca de 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0,4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ou 5,0, em comparação com a) SEQ ID Nº:60; b) SEQ ID Nº:60 com substituições de A25F e G157R; c) SEQ ID Nº:104 e/ou d) aminoácidos 22-431 da SEQ ID Nº:104.

[0291] Em outra modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem uma razão de razão de recuperações de peletização em rações quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, de pelo menos cerca de 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0,4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ou 5,0, em comparação com a) SEQ ID Nº:60; b) SEQ ID Nº:60 com substituições de A25F e G157R; c) SEQ ID Nº:104 e/ou d) aminoácidos 22-431 da SEQ ID Nº:104.

[0292] Qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento pode compreender adicionalmente uma temperatura Tm de pelo menos cerca de 92,5°C, cerca de 93°C, cerca de 94°C, cerca de 95°C, cerca de 96°C, cerca de 97°C, cerca de 98°C, cerca de 99°C, cerca de 100°C ou cerca de 101°C, com o uso das condições de ensaio calorimétrico de varredura diferencial descritas no Exemplo 3 e os resultados são fornecidos no Exemplo 4.

[0293] Em outra modalidade, é descrito um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem uma razão de temperatura Tm de pelo menos cerca de 1,08, 1,10, 1,12, 1,14, 1,16, 1,18 ou 1,20 2,1, 2,4, 2,7, 3,0 ou 3,3 como medido por calorimetria de varredura diferencial, em comparação com a) SEQ ID Nº:60; b) SEQ ID Nº:60 com substituições de A25F e G157R; c) SEQ ID Nº:104 e/ou d) aminoácidos 22-431 da SEQ ID Nº:104.

[0294] Em outro aspecto, qualquer um dos polipeptídeos geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento compreendem uma atividade específica de pelo menos cerca de 100 U/mg em pH 3,5 sob condições de ensaio, tais como aquelas descritas no Exemplo 4. A faixa de atividade específica (U/mg em pH 3,5) inclui, porém, sem limitação, cerca de 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 2000, etc.

[0295] Em outro aspecto, alguns dos polipeptídeos geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento compreendem uma atividade específica de pelo menos cerca de 100 U/mg em pH 5,5 sob condições de ensaio, tais como aquelas descritas no Exemplo 4. A faixa de atividade específica (U/mg em pH 5,5) inclui, porém, sem limitação, cerca de 100, 125, 150, 175,

200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 2000, etc.

[0296] Em ainda outro aspecto, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento podem ser estáveis em uma forma líquida em um pH de cerca de 3,0 ou inferior. Isso é muito relevante quando os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento estão passando através do trato digestivo de um animal como é discutido abaixo.

[0297] Em outra modalidade, é descrita uma ração para animais, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento.

[0298] É importante ressaltar que as enzimas de aditivo de ração, por exemplo, uma fitase, são submetidas a condições muito adversas ao passar pelo trato digestivo de um animal, ou seja, baixo pH e presença de enzimas digestivas. A pepsina é uma das enzimas digestivas proteolíticas mais importantes presentes no trato gastrointestinal de animais monogástricos. A pepsina tem baixa especificidade e alta tolerância ao pH na área ácida (pH 1,5-6,0 estável até pH 8,0). Os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento são amplamente resistentes contra pepsina, o que é necessário para um bom desempenho in vivo.

[0299] A ração para animais, gênero alimentício, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento podem ser usados (i) sozinhos ou (ii) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana ou (iii) com pelo menos uma outra enzima ou (iv) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende em pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma outra enzima ou (v) qualquer um de (i), (ii), (iii) ou (iv) que compreende adicionalmente pelo menos um outro componente de aditivo de ração e, opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo está presente em uma quantidade de pelo menos 0,1 g/tonelada de ração.

[0300] Os termos "aditivo de ração", "componentes de aditivos de ração" e/ou "ingredientes de aditivo de ração" são usados no presente documento indistintamente.

[0301] Os aditivos de ração podem ser descritos como produtos usados na nutrição animal com o objetivo de melhorar a qualidade da ração e a qualidade dos alimentos de origem animal ou para melhorar o desempenho e a saúde dos animais, por exemplo, proporcionando maior digestibilidade dos materiais de ração.

[0302] Os aditivos de ração se enquadram em várias categorias tais como aditivos sensoriais que estimulam o apetite do animal de forma que o mesmo naturalmente queira comer mais. Os aditivos nutricionais fornecem um nutriente particular que pode ser deficiente na dieta de um animal. Os aditivos zootécnicos melhoram o valor nutricional geral da dieta de um animal por meio de aditivos na ração.

[0303] Exemplos de tais aditivos de ração incluem, porém, sem limitação, prebióticos, óleos essenciais (tais como, sem limitação, timol e/ou cinamaldeído), ácidos graxos, ácidos graxos de cadeia curta tais como ácido propiônico e ácido butírico, etc., vitaminas, minerais, aminoácidos, etc.

[0304] As composições ou formulações de aditivos de ração também podem compreender pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, parabeno de metila e parabeno de propila.

[0305] Pelo menos uma outra enzima (ou seja, além de qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento) pode ser incluída nas composições ou formulações de aditivos de ração descritas no presente documento que podem incluir, porém, sem limitação, uma xilanase, amilase, outra fitase, beta-glucanase e/ou uma protease.

[0306] Xilanase é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear β-1,4-xilano em xilose, quebrando assim a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares das plantas. As xilanases, por exemplo, endo-β-xilanases (EC

3.2.1.8) hidrolisam a cadeia principal do xilano.

[0307] Em uma modalidade, a xilanase pode ser qualquer xilanase disponível comercialmente. Adequadamente, a xilanase pode ser uma endo-1,4-Pd-xilanase (classificada como E.G. 3.2.1.8) ou uma 1,4β- xilosidase (classificada como E.G. 3.2.1.37). Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento em combinação com uma endoxilanase, por exemplo, uma endo-1,4-Pd-xilanase e outra enzima. Todas as classificações de enzimas EC referenciadas no presente documento se referem às classificações fornecidas em

Enzyme Nomenclature - Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology—ISBN 0-12-226164-3, que é incorporado ao presente documento.

[0308] Em outra modalidade, a xilanase pode ser uma xilanase de Bacillus, Trichodermna, Therinomyces, Aspergillus, Humicola e Penicillium. Em ainda outra modalidade, a xilanase pode ser a xilanase em Axtra XAP® ou Avizyme 1502®, ambos produtos comercialmente disponíveis na Danisco A/S. Em uma modalidade, a xilanase pode ser uma mistura de duas ou mais xilanases. Em ainda outra modalidade, a xilanase é uma endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-xilosidase.

[0309] Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma xilanase. Em uma modalidade, a composição compreende 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600- 650, 650-700, 700-750, e mais do que 750 unidades de xilanase/g de composição.

[0310] Em uma modalidade, a composição compreende 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000, e mais do que 8000 unidades de xilanase/g de composição.

[0311] Será entendido que uma unidade de xilanase (XU) é a quantidade de enzima que libera 0,5 µmol de equivalentes de açúcar redutor (como xilose pelo método de ensaio de açúcar redutor com ácido dinitrosalicílico (DNS)) a partir de um substrato de xilana de espelta de aveia por min. em pH 5,3 e 50°C (Bailey, et al., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), maio de 1992, 257-270).

[0312] Amilase é uma classe de enzimas com a capacidade para hidrolisar amido em oligossacarídeos de cadeia mais curta, tal como maltose. A porção química glicose pode, então, ser mais facilmente transferida da maltose para um monoglicerídeo ou glicosilmonoglicerídeo do que da molécula de amido original. O termo amilase inclui α-amilases (E.G. 3.2.1.1), amilases formadoras de G4 (E.G. 3.2.1.60), β-amilases (E.G. 3.2.1.2) e γ-amilases (E.C. 3.2.1.3). As amilases podem ser de origem bacteriana ou fúngica, ou mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia de proteínas.

[0313] Em uma modalidade, a amilase pode ser uma mistura de duas ou mais amilases. Em outra modalidade, a amilase pode ser uma amilase, por exemplo, uma α-amilase, de Bacillus licheniformis e uma amilase, por exemplo, uma α-amilase, de Bacillus amyloliquefaciens. Em uma modalidade, α-amilase pode ser α-amilase em Axtra XAP® ou Avizyme 1502®, ambos produtos comercialmente disponíveis na Danisco A/S. Em ainda outra modalidade, a amilase pode ser uma α- amilase resistente à pepsina, tal como uma alfa amilase de Trichoderma (tal como Trichoderma reesei) resistente à pepsina. Uma α-amilase resistente à pepsina adequada é ensinada no pedido do Reino Unido número 101 1513.7 (que é incorporado ao presente documento a título de referência) e PCT/IB2011/053018 (que é incorporado ao presente documento a título de referência).

[0314] Será entendido que uma unidade de amilase (AU) é a quantidade de enzima que libera 1 mmol de ligações glucosídicas de um substrato de polímero de amido reticulado insolúvel em água por minuto em pH 6,5 e 37°C (isso pode ser referenciado no presente documento como o ensaio para determinar 1 AU).

[0315] Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma amilase. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento, xilanase e amilase. Em uma modalidade, a composição compreende 10-50, 50-100, 100-150, 150- 200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, e mais do que 750 unidades de amilase/g de composição.

[0316] Em uma modalidade, a composição compreende 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000, 8000-8500, 8500-9000, 9000-9500, 9500- 10000, 10000-11000, 11000-12000, 12000-13000, 13000-14000, 14000-15000, e mais do que 15000 unidades de amilase/g de composição.

[0317] O termo "protease", como usado no presente documento, é sinônimo de peptidase ou proteinase. A protease pode ser uma subtilisina (E.G. 3.4.21.62) ou uma bacilolisina (E.G. 3.4.24.28) ou uma serina protease alcalina (E.G. 3.4.21.x) ou uma queratinase (E.G.

3.4.X.X). Em uma modalidade, a protease é uma subtilisina. Proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana.

[0318] Mutantes quimicamente modificados ou geneticamente modificados por proteína também são adequados. A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease microbiana alcalina ou uma protease tipo tripsina. Em uma modalidade, são fornecidas no presente documento composições que compreendem qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma ou mais proteases.

[0319] Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas,

especialmente aquelas derivadas de Bacillus sp., por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 (consultar, por exemplo, Pat. No 6.287.841), subtilisina 147 e subtilisina 168 (consultar, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e proteases de Fusarium (consultar, por exemplo, os documentos WO 89/06270 e WO 94/25583). Os exemplos de proteases úteis também incluem, porém, sem limitação, as variantes descritas nos documentos WO 92/19729 e WO 98/20115.

[0320] Em uma modalidade, a protease é selecionada a partir do grupo que consiste em subtilisina, uma bacilolisina, uma alquina serina protease, uma queratinase e uma protease de Nocardiopsis.

[0321] Será entendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera do substrato (solução de caseína a 0,6%) um micrograma de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) em um minuto em pH 7,5 (tampão de Na2PO4/ácido láctico 40 mM) e 40°C. Isso pode ser referenciado como o ensaio para determinar 1 PU.

[0322] Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma protease. Em outra modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma xilanase e uma protease. Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma amilase e uma protease. Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento e uma xilanase, uma amilase e uma protease.

[0323] Em uma modalidade, a composição compreende cerca de 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, e mais do que 750 unidades de protease/g de composição.

[0324] Em uma modalidade, a composição compreende cerca de 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000, 8000-8500, 8500-9000, 9000-9500, 9500-10000, 10000-11000, 11000-12000, 12000-13000, 13000-14000, 14000-15000, e mais do que 15000 unidades de protease/g de composição.

[0325] Pelo menos um microrganismo de alimentação direta (DFM) pode compreender pelo menos um microrganismo viável tal como uma cepa bacteriana viável ou uma levedura viável ou um fungo viável. Preferencialmente, o DFM compreende pelo menos uma bactéria viável.

[0326] É possível que o DFM possa ser uma cepa bacteriana de formação de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido por ou conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Assim, o termo "microrganismo viável" como usado no presente documento pode incluir esporos microbianos, tais como endósporos ou conídia. Alternativamente, o DFM na composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode não compreender ou pode não conter esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídia.

[0327] O microrganismo pode ser um microrganismo de ocorrência natural ou pode ser um microrganismo transformado.

[0328] Um DFM como descrito no presente documento pode compreender microrganismo de um ou mais dos seguintes gêneros:

Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos.

[0329] De preferência, o DFM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dentre as seguintes Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis e Bacillus amyloliquefaciens.

[0330] O gênero "Bacillus", como usado no presente documento, inclui todas as espécies dentro do gênero "Bacillus", como conhecido por aqueles que são versados na técnica, que incluem, porém, sem limitação, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a sofrer uma reorganização taxonômica. Assim, entende-se que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas, que incluem, porém, sem limitação organismos como Bacillus stearothermophilus, que agora é denominado "Geobacillus stearothermophilus", ou Bacillus polymyxa, que agora é "Paenibacillus polymyxa". A produção de endosporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada a característica definidora do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique ao recentemente nomeado Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.

[0331] Em outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e combinações das mesmas.

[0332] O DFM pode ser adicionalmente combinado com os seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii e combinações de qualquer um dos mesmos.

[0333] Em ainda outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum, e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0334] Podem ser mencionadas bactérias das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Enterococcus, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e combinações das mesmas.

[0335] Um microrganismo de alimentação direta descrito no presente documento que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[0336] Alternativamente, um DFM pode ser combinado com um ou mais dos produtos ou os microrganismos contidos naqueles produtos descritos no documento número WO2012110778 e resumidos como se segue: Bacillus subtilis cepa 2084 no de Acesso NRRLB-50013, Bacillus subtilis cepa LSSAO1 No de Acesso NRRL B-50104 e Bacillus subtilis cepa 15A-P4 ATCC No de Acesso PTA-6507 (da Enviva Pro®. (anteriormente conhecido como Avicorr®); Bacillus subtilis cepa C3102 (da Calsporin®); Bacillus subtilis cepa PB6 (da Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); Enterococcus NCIMB 10415 (SF68) (da Cylactin®); Bacillus subtilis cepa C3102 (da Gallipro® & GalliproMax®); Bacillus licheniformis (da Gallipro®Tect®); Enterococcus e Pediococcus (da Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococcus da Protexin®); Bacillus subtilis cepa QST 713 (da Proflora®); Bacillus amyloliquefaciens CECT- 5940 (da Ecobiol® & Ecobiol® Plus); Enterococcus faecium SF68 (da Fortiflora®); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (da BioPlus2B®); Bactéria de ácido lático 7 Enterococcus faecium (da Lactiferm®); Bacillus cepa (da CSI®); Saccharomyces cerevisiae (da Yea-Sacc®); Enterococcus (da Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (da Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (da Biacton®); Enterococcus (da Oralin E1707®); Enterococcus (2 cepas), Lactococcus lactis DSM 1103(da Probios- pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminis (da Sorbiflore®); Bacillus subtilis (da Animavit®); Enterococcus (da Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (da Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (da Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (da Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (da ActiSaf® (anteriormente BioSaf®)); Saccharomyces cerevisiae NCYC Sc47 (da Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (da Miya-Gold®);

Enterococcus (da Fecinor e Fecinor Plus®); Saccharomyces cerevisiae NCYC R-625 (da InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (da BioSprint®); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (da Provita®); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (da PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (da Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 (da TOYOCERIN®) ou outros DFMs tais como Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis (da BioPlus® YC) e Bacillus subtilis (da GalliPro®).

[0337] O DFM pode ser combinado com Enviva® PRO que é comercialmente disponível a partir de Danisco A/S. Enviva Pro® é uma combinação de Bacillus cepa 2084 Número de Acesso NRRLB-50013, Bacillus cepa LSSAO1 Número de Acesso NRRL B-50104 e Bacillus cepa 15A-P4 ATCC Número de Acesso PTA-6507 (como ensinado no documento No U.S. 7.754.469 B – incorporado ao presente documento a título de referência).

[0338] Também é possível combinar o DFM descrito no presente documento com uma levedura dos gêneros: Saccharomyces spp.

[0339] Preferencialmente, o DFM descrito no presente documento compreende microrganismos que são geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) e são preferencialmente aprovados por GRAS.

[0340] Uma pessoa versada na técnica estará prontamente ciente de espécies e/ou cepas específicas de microrganismos dentro dos gêneros descritos no presente documento que são usadas nas indústrias alimentar e/ou agrícola e que são geralmente consideradas adequadas para consumo animal.

[0341] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Isto é particularmente o caso quando o alimento é peletizado. Portanto, em outra modalidade, o DFM pode ser um microrganismo termotolerante, tal como bactérias termotolerantes, que incluem, por exemplo, Bacillus spp.

[0342] Em outros aspectos, pode ser desejável que o DFM compreenda uma bactéria de produção de esporo, como Bacilli, por exemplo, Bacillus spp. Os bacilos têm capacidade para formar endósporos estáveis quando as condições para o crescimento não são favoráveis e são muito resistentes ao calor, pH, umidade e desinfetantes.

[0343] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de microrganismos patogênicos (tais como Clostridium perfringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser antipatogênico. O termo "antipatogênico", como usado no presente documento, significa que o DFM neutraliza um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[0344] Como descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o seguinte ensaio "ENSAIO DE DFM" pode ser usado para determinar a adequação de um microrganismo para ser um DFM. O ensaio de DFM, como usado no presente documento, é explicado em maiores detalhes no documento no US2009/0280090. Para evitar dúvidas, o DFM selecionado como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico), de acordo com o "ENSAIO DE DFM" ensinado no presente documento, é um DFM adequado para o uso de acordo com a presente invenção, isto é, na composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção.

[0345] Os tubos foram inoculados, cada um, com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) de um agrupamento representativo.

[0346] O sobrenadante de um DFM potencial, desenvolvido de maneira aeróbica ou anaeróbica, é adicionado aos tubos inoculados (exceto para o controle a qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubados. Após incubação, a densidade óptica (OD) do controle e tubos tratados com sobrenadante foi medida para cada patógeno.

[0347] As colônias de cepas (DFM potencial) que produziram uma

OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qualquer sobrenadante) podem ser, então, classificadas como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico). Dessa forma, o ensaio de DFM, como usado no presente documento, é explicado em maiores detalhes no documento No US2009/0280090.

[0348] De preferência, um patógeno representativo nesse ensaio de DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostridium, tais como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é conduzido com um ou mais de Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coli, preferencialmente Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, mais preferencialmente Clostridium perfringens.

[0349] DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais das seguintes bactérias e são descritos no documento número WO2013029013.: cepa de Bacillus subtilis 3BP5 no de acesso NRRL B-50510, cepa de Bacillus amyloliquefaciens 918 ATCC de nº de acesso NRRL B-50508, e cepa de Bacillus amyloliquefaciens 1013 ATCC de nº de acesso NRRL B-50509.

[0350] Os DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e carreador (ou carreadores) (quando usados) e podem ser adicionados a um misturador de fita ou pá e misturados durante cerca de 15 minutos, apesar de o tempo poder ser aumentado ou diminuído. Os componentes são misturados de modo que resulte uma mistura uniforme das culturas e carreadores. O produto final é preferencialmente um pó fluxível seco. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser, então, adicionado à ração para animais ou uma pré-mistura de ração, adicionado à água de um animal ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente documento.

[0351] Inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ser nas proporções que variam de 1% a 99% e, preferencialmente, de 25% a 75%

[0352] Dosagens adequadas do DFM na ração para animais podem variar de cerca de 1x103 CFU/g de ração a cerca de 1x1010 CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 1x104 CFU/g de ração e cerca de 1x108 CFU/g de ração, adequadamente entre cerca de 7,5x104 CFU/g de ração e cerca de 1x107 CFU/g de ração.

[0353] Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado no gênero alimentício em mais que cerca de 1x103 CFU/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 1x104 CFU/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 5x104 CFU/g de ração ou, adequadamente, mais que cerca de 1x105 CFU/g de ração.

[0354] O DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração de cerca de 1x103 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, de preferência, 1x105 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, com mais preferência, entre cerca de 1x106 CFU/g de composição e cerca de 1x1012 CFU/g de composição e, com máxima preferência, entre cerca de 3,75x107 CFU/g de composição e cerca de 1x1011 CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração em mais que cerca de 1x105 CFU/g de composição, de preferência, mais que cerca de 1x106 CFU/g de composição e, com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição de aditivo de ração em mais que cerca de 2x105 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 2x106 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição.

[0355] Em ainda outro aspecto, é descrita uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração para animais que compreende pelo menos um polipeptídeo com atividade de fitase como descrito no presente documento, usado sozinho ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta ou em combinação com pelo menos um outra enzima ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima, em que a composição de aditivo de ração pode estar em qualquer forma, tal como uma partícula granulada. Tais partículas granuladas podem ser produzidas por um processo selecionado do grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, formação de tablete, ou qualquer combinação dos processos acima.

[0356] Além disso, as partículas da composição de aditivo de alimento granulada podem ter um diâmetro médio maior do que 50 mícrons e menor do que 2000 mícrons

[0357] Aqueles que são versados na técnica entenderão que a alimentação animal pode incluir material vegetal tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetais para aves, porcos, ruminantes, aquicultura e animais de estimação. É contemplado que os parâmetros de desempenho do animal, tais como crescimento, ingestão de ração e eficácia de ração, mas também uniformidade melhorada, concentração de amônia reduzida no alojamento de animais e, consequentemente, bem-estar melhorado e a situação de saúde dos animais será melhorada.

[0358] Assim, é descrito um método para melhorar o valor nutricional de uma ração para animais, em que qualquer uma das fitases geneticamente modificadas ou fragmentos das mesmas como descrito no presente documento, podem ser adicionados à ração para animais.

[0359] A frase, uma "quantidade eficaz" como usada no presente documento, se refere à quantidade de um agente ativo (tal como, uma fitase, por exemplo, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados descritos no presente documento) necessária para conferir desempenho melhorado em um animal em uma ou mais métricas, sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes ativos (tais como, sem limitação, uma ou mais enzima (ou enzimas) adicional, um ou mais DFM (ou DFMs), um ou mais óleos essenciais, etc.).

[0360] O termo "desempenho animal" como usado no presente documento, pode ser determinado por qualquer métrica, tal como, sem limitação, a eficiência de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão alimentar e/ou pela digestibilidade de um nutriente em um alimento (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos ou digestibilidade de fósforo) e/ou energia digestível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade dos animais de evitar os efeitos negativos de doenças ou pela resposta imune do indivíduo.

[0361] As características de desempenho animal podem incluir, porém, sem limitação: peso corporal; ganho de peso; massa; percentual de gordura corporal; altura; distribuição de gordura corporal; crescimento; taxa de crescimento; tamanho do ovo; peso do ovo; massa de ovo; taxa de postura de ovos; absorção de minerais; excreção de minerais, retenção de minerais; densidade óssea; resistência óssea; razão de conversão alimentar (FCR); ingestão média diária de ração (ADFI); retenção de Ganho médio diário (ADG) e/ou secreção de qualquer um ou mais de cobre, sódio, fósforo, nitrogênio e cálcio;

retenção ou absorção de aminoácidos; mineralização, mineralização óssea, rendimento de carcaça e qualidade de carcaça. Por "desempenho animal melhorado em uma ou mais métricas" entende-se que há maior eficiência de ração e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão alimentar reduzida e/ou digestibilidade melhorada de nutrientes ou energia em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio melhorada e/ou por capacidade melhorada de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou por uma resposta imune melhorada no indivíduo resultante do uso de ração que compreende a composição de aditivo de ração descrita no presente documento em comparação com uma ração que não compreende a dita composição de aditivo de ração.

[0362] Preferencialmente, por "desempenho melhorado do animal", se entende que existe uma eficácia de alimento aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão de alimento reduzida. Como usado no presente documento, o termo "eficiência de ração" se refere à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado ad-libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. "Uma melhoria em uma métrica" ou "métrica melhorada", como usado no presente documento, se refere a uma melhoria em pelo menos um dos parâmetros listados nas métricas em uma definição de animal.

[0363] Por "eficiência de ração aumentada" se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção em ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de alimento em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.

[0364] Como usado no presente documento, o termo "razão de conversão alimentar" se refere à quantidade de ração fornecida a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada.

[0365] Uma razão de conversão alimentar melhorada significa uma razão de conversão alimentar mais baixa.

[0366] Por "razão de conversão alimentar mais baixa" ou "razão de conversão alimentar melhorada" se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração em alimentação resulta em é exigido que uma quantidade de ração mais baixa seja alimentada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal pela mesma quantidade quando o alimento não compreende a dita composição de aditivo de ração.

[0367] A melhoria nos parâmetros de desempenho pode ser em relação a um controle em que o alimento usado não compreende uma fitase.

[0368] O termo Cinza da tíbia se refere a um método de quantificação para mineralização óssea. Este parâmetro indica se o fósforo é deficiente (por exemplo, o teor deve ser baixo nas dietas de controle negativo com deficiência de fósforo) ou suficiente (por exemplo, o teor em tratamentos com fitase é comparável a dietas de controle positivo que atendem às exigências de fósforo em frangos de corte).

[0369] O termo "dieta deficiente em fósforo" se refere a uma dieta na qual o nível de fósforo não é suficiente para satisfazer as necessidades nutricionais de um animal, por exemplo, uma ração formulada com níveis de fósforo muito mais baixos do que os níveis recomendados pelo National Research Council (NRC) ou reprodutores de frangos de corte. A ração para animais contém níveis mais baixos do mineral do que o exigido para um crescimento ideal. Se a dieta carece de fósforo, o cálcio também não será absorvido pelo animal. O excesso de Ca pode levar a uma má digestibilidade do fósforo (P) e contribuir para a formação de complexos insolúveis de fitato-mineral. As deficiências tanto de P quanto de Ca podem causar integridade esquelética reduzida, crescimento subnormal e, por fim, perda de peso.

[0370] Os termos "mineralização" ou "mineralização" abrangem a deposição ou liberação de minerais. Os minerais podem ser depositados ou liberados do corpo do animal. Os minerais podem ser liberados da alimentação. Os minerais podem incluir quaisquer minerais necessários em uma dieta animal e podem incluir cálcio, cobre, sódio, fósforo, ferro e nitrogênio. Em uma modalidade preferencial, o uso dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos da invenção em um alimento ou ração leva ao aumento da deposição de cálcio no corpo do animal, especialmente nos ossos.

[0371] Digestibilidade de nutrientes, como utilizado no presente documento, significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou de um segmento específico do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade dos nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do indivíduo, ou entre o que é administrado ao indivíduo e o que permanece no digesto em um segmento específico do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[0372] A digestibilidade do nutriente, como utilizada no presente documento, pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excrementos durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal, e permite ao pesquisador calcular a quantidade de nutriente que desapareceu em todo o trato gastrointestinal ou em um segmento do trato gastrointestinal. Esse marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração, ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa na ração.

[0373] A digestibilidade dos nutrientes, como utilizada no presente documento, abrange a digestibilidade de fósforo, a digestibilidade de amido, a digestibilidade de gordura, a digestibilidade de proteína e a digestibilidade de aminoácidos. O fósforo digestível (P) pode ser definido como P digestível ileal que é a proporção do P total ingerido absorvido no final do íleo por um animal ou o P digestível fecal que é a proporção do P total ingerido que não é excretado nas fezes.

[0374] O termo "sobrevivência" como usado no presente documento significa o número de indivíduos que permanecem vivos. O termo "sobrevivência melhorada" é outra forma de dizer "mortalidade reduzida".

[0375] O termo "rendimento da carcaça", como usado no presente documento, significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo de abate comercial ou experimental. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido para alimento, com a cabeça, entranhas, parte dos membros e penas ou pele removidos. O termo rendimento da carne como usado no presente documento significa a quantidade de carne comestível como uma porção do peso corporal vivo ou a quantidade de uma carne especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo.

[0376] Os termos "qualidade da carcaça" e "qualidade da carne" são usados indistintamente e se referem à qualidade da composição (razão entre magra e gordura), bem como fatores de palatabilidade, como aparência visual, cheiro, firmeza, suculência, maciez e sabor. Por exemplo, produzir aves que não tenham "peito amadeirado". O peito amadeirado é um problema de qualidade decorrente de uma anormalidade muscular em uma pequena porcentagem da carne de frango nos Estados Unidos. Essa condição faz com que a carne do peito de frango seja dura ao toque e, muitas vezes, de cor pálida com textura de baixa qualidade. O peito amadeirado não cria nenhuma preocupação com a saúde ou segurança alimentar para as pessoas e o bem-estar do frango em si não é afetado negativamente.

[0377] Um "ganho de peso aumentado" se refere a um animal que tem peso corporal aumentado ao ser alimentado com ração que compreende uma composição de aditivo de ração em comparação com um animal sendo alimentado com uma ração sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.

[0378] No presente contexto, pretende-se que o termo "alimento de animal de estimação" seja entendido como significando um alimento para um animal doméstico, tal como, porém, sem limitação, cachorros, gatos, gerbos, hamsters, chinchilas, ratos extravagantes, porquinhos da índia; aves de estimação, tais como canários, periquitos e papagaios; répteis de estimação, como tartarugas, lagartos e cobras; e animais de estimação aquáticos, tais como peixe tropical e sapos.

[0379] Os termos "composição de ração para animais", "ração", "gênero alimentício" e "forragem" são usados indistintamente e podem compreender um ou mais materiais de ração selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[0380] Polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos, como descrito no presente documento, ou uma composição de aditivo para ração que compreende tais polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos podem ser usados como, ou na preparação de uma ração.

[0381] Assim, é descrita uma composição de enzima seca para uso em rações para animais que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmento dos mesmos, como descrito no presente documento.

[0382] Também é descrita uma composição de enzima líquida para uso em ração para animais que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmento dos mesmos, como descrito no presente documento.

[0383] Os termos "composição de aditivo de ração" e "composição enzimática" são usados indistintamente no presente documento.

[0384] O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido ou como um semissólido dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[0385] Em uma modalidade preferencial, a enzima ou composição de aditivo de ração descrita no presente documento é misturada com um componente de ração para formar um gênero alimentício.

[0386] O termo "componente de ração", como usado no presente documento, significa toda ou parte da ração. Parte da ração pode significar um constituinte do gênero alimentício ou mais de um constituinte da ração, por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou mais.

[0387] Em uma modalidade, o termo "componente de ração" abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. Preferencialmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma ração composta ou uma pré-mistura da mesma. Uma composição de aditivo de ração pode ser misturada por adição com uma ração composta, um componente de ração composta ou a uma pré- mistura de uma ração composta ou a uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[0388] A forragem abrange as plantas que foram cortadas. Além disso, forragem inclui silagem, rações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.

[0389] Adequadamente, uma pré-mistura como denominada no presente documento pode ser uma composição composta de microingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são usualmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.

[0390] Como usado no presente documento, o termo "colocado em contato" se refere à aplicação indireta ou direta de qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos (ou composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos) a um produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material compreendendo a composição de aditivo de ração, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, pulverização da composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é preferencialmente misturada com o produto (por exemplo, gênero alimentício). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de um gênero alimentício. Para algumas aplicações é importante que a composição seja tornada disponível na ou à superfície de um produto a ser afetado/tratado. Isto permite que a composição confira um benefício de desempenho.

[0391] Em alguns aspectos, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos podem ser usados para o pré-tratamento de alimentos ou rações. Por exemplo, a ração com 10-300% de umidade é misturada e incubada com os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos a 5-80ºC, preferencialmente a 25-50ºC, mais preferencialmente entre 30-45ºC por 1 min. a 72 horas sob condições aeróbicas ou 1 dia a 2 meses em condições anaeróbicas. O material pré-tratado pode ser alimentado diretamente aos animais (denominado alimentação líquida). O material pré-tratado pode também ser peletizado a vapor em temperaturas elevadas de 60-120°C. Os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos podem ser impregnados em material de ração ou alimento por um revestidor a vácuo.

[0392] Qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento (ou composição que compreende tais polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos) pode ser aplicado para intercalar, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, gênero alimentício ou ingredientes em bruto de um gênero alimentício) com uma quantidade controlada da dita enzima.

[0393] Em outro aspecto, a composição de aditivo de ração pode ser homogeneizada para produzir um pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de uma matriz e os fios resultantes são cortados em péletes adequados de comprimento variável.

[0394] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, como de 60 a 100°C, temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de residência pode variar de segundos a minutos. Será entendido que qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos (ou composição que compreende qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos) descritos no presente documento são adequados para adição a qualquer material de ração apropriado.

[0395] Em outras modalidades, o grânulo pode ser introduzido em um processo de peletização de ração em que o processo de pré- tratamento de ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C por até vários minutos, tal como entre 85°C e 95°C.

[0396] Em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos pode estar presente na ração na faixa de 1 ppb (partes por bilhão) a 10% (p/p) com base na proteína enzimática pura. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos estão presentes no gênero alimentício na faixa de 1-100 ppm (partes por milhão). Uma dose preferencial pode ser 1-20 g de um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo por tonelada de produto de ração ou composição de ração ou uma dose final de 1-20 ppm de polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo no produto de ração final.

[0397] De preferência, um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que está presente na ração deve ser de pelo menos cerca de 50-10000 FTU/kg correspondendo a cerca de 0,1 a 20 mg de polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento da proteína/kg.

[0398] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.

[0399] Formulações e/ou preparações que compreendem qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados ou fragmentos dos mesmos e composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer maneira adequada para garantir que a formulação compreenda enzimas fitase ativas. Tais formulações podem estar como um líquido, um pó seco ou um grânulo que pode ser não revestido/não protegido ou pode envolver o uso de um revestimento termoprotetor dependendo das condições de processamento. Como foi observado acima, os polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos podem ser formulados de forma barata em um carreador sólido sem necessidade específica de revestimentos protetores e ainda manter a atividade ao longo do processo de condicionamento e peletização. Um revestimento protetor para fornecer termoestabilidade adicional quando aplicado em uma forma sólida pode ser benéfico para obter estabilidade de peletização quando necessário em certas regiões onde condições mais severas são usadas ou se as condições o justificarem, por exemplo, como no caso de ração de supercondicionamento acima de 90°C.

[0400] A composição de aditivo de alimentação descrita no presente documento pode ser formulada para um pó seco ou grânulos como descrito no documento noWO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência).

[0401] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo (por exemplo, uma fitase,

tal como qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados descritos no presente documento) e pelo menos um revestimento, o agente ativo do grânulo que retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade depois de condições selecionadas a partir de uma ou mais de a) um processo de peletização de ração, b) um pré- tratamento de ração aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura à base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado a partir de minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares de redução, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de ração ou mistura a base de ração ácida ou básica.

[0402] No que diz respeito ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material hidratante por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento hidratante por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento hidratante por umidificação pode ser entre 25% e 60% em p/p do grânulo e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento hidratante por umidificação pode ser selecionado de sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado de polímeros, gomas, soro do leite e amido.

[0403] Em outras modalidades, o grânulo pode ser introduzido em um processo de peletização de ração em que o processo de pré- tratamento de ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C por até vários minutos, tal como entre 85°C e 95°C.

[0404] A composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração para animais que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira de umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade de água menor do que 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.

[0405] O grânulo pode ter um revestimento de barreira de umidificação selecionado de polímeros e gomas e o material hidratante por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento hidratante por umidificação pode ser entre 25% e 45% em p/p do grânulo e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[0406] Alternativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, preferencialmente tal consumo líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[0407] Ademais, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo.

[0408] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como uma pré-mistura. Apenas a título de exemplo, a pré- mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[0409] Em uma modalidade, um microrganismo de alimentação direta ("DFM") e/ou um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo são formulados com pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável selecionado dentre pelo menos um de maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propilenoglicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, metabissulfeto de cálcio, metabissulfeto, formato e misturas dos mesmos.

[0410] Deve-se notar que qualquer um dos polipeptídeos de fitase geneticamente modificados e fragmentos dos mesmos podem ser úteis em aplicações de grãos, por exemplo, processamento de grãos para aplicações não alimentares/rações, por exemplo, produção de etanol

[0411] Os exemplos não limitantes das composições e métodos descritos no presente documento incluem:

1. Um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou um fragmento do mesmo, que compreende a atividade da fitase com pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

2. O polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo tem uma pontuação de Modelo de Markov Oculto (HMM) de pelo menos cerca de 1200, como estabelecido na Tabela 11 para os polipeptídeos do clado Tm-fitase alta ou fragmentos dos mesmos.

3. Um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo que tem pelo menos 78% de identidade de sequência com as posições de aminoácidos 14-325 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

4. Um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo (tal como aqueles da modalidade 1, 2 ou 3) que tem recuperação de peletização em ração de pelo menos cerca de 50% quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos, com o uso de um teste padrão de recuperação de peletização em rações como descrito no Exemplo 5.

5. O polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1 ou 2, em que o dito polipeptídeo de fitase ou fragmento do mesmo tem uma recuperação de peletização em ração de pelo menos cerca de 50% quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos, com o uso de um em teste padrão de recuperação de peletização em rações como descrito no Exemplo 5.

6. Um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo (tal como aqueles da modalidade 1, 2, 3, 4 ou 5) que tem uma razão de recuperações de peletização em rações de pelo menos cerca de 0,7 quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos quando em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, com o uso de um teste de peletização em ração padrão, como descrito no Exemplo 5.

7. O polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 que tem uma razão de recuperações de peletização em rações de pelo menos cerca de 0,7 quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, com o uso de um teste padrão de peletização em rações, como descrito no Exemplo 5.

8. O polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que o dito polipeptídeo ou fragmento do mesmo compreende uma temperatura Tm de pelo menos cerca de 92,5°C com o uso de condições de ensaio calorimétrico de varredura diferencial descritas no Exemplo 3.

9. O polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o dito polipeptídeo ou fragmento do mesmo compreende uma atividade específica de pelo menos cerca de 100 U/mg em pH 3,5 sob as condições de ensaio descritas no Exemplo 3.

10. Uma ração para animais, gênero alimentício, pré- mistura ou composição de aditivo de ração que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo pode ser usado (i) sozinho ou (ii) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana ou (iii) com pelo menos uma outra enzima ou (iv) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende em pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma outra enzima ou (v) qualquer um de (i), (ii), (iii) ou (iv) que compreende adicionalmente pelo menos um outro componente de aditivo de ração e, opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo está presente em uma quantidade de pelo menos 0,1 g/tonelada de ração.

11. Um construto recombinante que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligada operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

12. O construto recombinante da modalidade 11, em que o hospedeiro de produção é selecionado a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos, leveduras, plantas e algas.

13. Um método para produzir um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, que compreende: (a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante da modalidade 11 e

(b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo é produzido.

14. O método de acordo com a modalidade 13, em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo é opcionalmente recuperado do hospedeiro de produção.

15. Um sobrenadante de cultura contendo fitase obtido pelo método da modalidade 13 ou 14.

16. Uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

17. Uma composição de enzima seca para uso na ração para animais, que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

18. A composição de enzima seca da modalidade 17, em que a composição de enzima seca é uma composição de aditivo de ração, granulada.

19. Uma composição de enzima líquida para uso na ração para animais, que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

20. Um método para melhorar o valor nutricional de uma ração para animais, em que a fitase geneticamente modificada ou fragmento da mesma da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 é adicionada à ração para animais.

21. Um método para melhorar o desempenho animal em uma ou mais métricas, que compreende a administração de uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 ou a ração para animais, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração da modalidade 10 ou 11 para o animal.

EXEMPLOS

[0412] A menos que definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2ª Edição, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994) e Hale e Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) fornecem um dicionário geral de muitos dos termos usados com esta invenção.

[0413] A invenção é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta invenção e, sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações para se adaptar a vários usos e condições. EXEMPLO 1 Geração de Moléculas de Fitase

[0414] As manipulações de DNA para gerar genes de fitase foram realizadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas na arte. Fragmentos de polinucleotídeos que correspondem às sequências de codificação para as várias fitases foram sintetizados com o uso de códons preferenciais para o hospedeiro de expressão fúngica Trichoderma reseei (T. reesei) e remontados aleatoriamente com o uso de técnicas de PCR. A sequência de sinal da aspartato protease pep1 de T. reseei (SEQ ID Nº: 63) que é interrompida artificialmente por um intron pep1 foi introduzida no terminal N (extremidade 5') de cada sequência do gene da fitase. A técnica de recombinação da Gateway® BP foi utilizada para introduzir os genes no vetor pDonor221 (Invitrogen, EUA) de acordo com as recomendações do fornecedor. Os plasmídeos de entrada resultantes foram recombinados com o vetor de destino pTTTpyr2 resultando em vetores de expressão finais. pTTTpyr2 é semelhante ao vetor pTTTpyrG descrito anteriormente (publicação PCT WO 2011/063308), exceto que o gene pyrG é substituído pelo gene pyr2. O vetor pTTTpyr2 contém as regiões promotoras e terminadoras de T. reesei cbhI, o marcador de seleção amdS de Aspergillus nidulans, o marcador de seleção pyr2 de T. reesei e sequências teloméricas de T. reseei (para replicação). Esses plasmídeos foram propagados em células de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, EUA), e o DNA foi purificado e a sequência verificada.

[0415] Todas as manipulações de fungos, que incluem transformações de alto rendimento, inoculações, fermentações e colheita foram realizadas em placas de microtitulação de 96 poços (MTP). Os plasmídeos foram transformados em cepa hospedeira de T. reesei adequada com o uso do método de protoplasto de polietilenoglicol (PEG). Em resumo, misturas de transformação contendo aproximadamente 0,5-2 µg de DNA e 5 x 106 protoplastos em um volume total de 50 µL foram tratadas com 200 µL de solução de PEG a 25% seguido por diluição com volume igual de sorbitol 1,2M/Tris 10mM/Solução de CaCl2 10mM pH 7,5. Em seguida, os protoplastos foram regenerados em um meio de crescimento líquido contendo sorbitol para manter a pressão osmótica. 100 µl da mistura de transformação foram transferidos para MTPs de 96 poços, contendo 300 µl de meio mínimo suplementado com sorbitol (0,30 M–0,84 M). As placas foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora com agitação a 28°C com 80% de umidade até a formação de micélios fúngicos. Se necessário, 20 µL de culturas crescidas foram transferidos para um meio mínimo fresco com 10 mM de acetamida para reforçar a pressão seletiva e foram cultivados por 2 dias adicionais.

[0416] Para a expressão de proteínas fitase, as cepas transformadas de T. reseei foram cultivadas como se segue: 20 µl das culturas líquidas foram usados para inocular 400 µl de meio de produção (9 g/l de casaminoácidos, 10 g/l de (NH4)2SO4, 4,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 1 g/l de CaCl2*2H2O, 33 g/l de tampão PIPPS (pH 5,5), oligoelementos de T. reesei a 0,25% (100%: 175 g/l de ácido cítrico (anidro), 200 g/l de FeSO4*7H2O, 16 g/l de ZnSO4*7H2O, 3,2 g/l de CuSO4*5H2O, 1,4 g/l de MnSO4*H2O, 0,8 g/l de H3BO3) em MTPs de 96 poços. As MTPs foram incubadas em uma incubadora com agitação sob as mesmas condições de crescimento descritas acima. Após 5 dias de fermentação, as culturas foram filtradas por centrifugação com o uso de membranas PVDF hidrofílicas para obter sobrenadantes clarificados usados para análise das enzimas fitase recombinantes. EXEMPLO 2 Preparação e Caracterização de Enzimas Fitase Purificação e Normalização de Proteínas

[0417] As cepas de T. reseei que codificam as enzimas fitase recombinantes foram cultivadas como descrito acima e os sobrenadantes clarificados foram usados para purificar as enzimas fitase. Os sobrenadantes da cultura filtrada foram diluídos 5 vezes com tampão de lavagem (acetato de Na 25 mM, pH 5,5) e carregados em uma resina de troca catiônica (WorkBeads 40S da Bio-Works) equilibrada com água purificada em placa de filtro MTP (Placa de Filtro Millipore Multiscreen Solvinert Deep Well MTP de 96 poços, membrana hidrofílica de 0,45 uM, No MDRLN0410). As MTPs foram colocadas em centrífuga, o fluxo atravessante foi descartado durante 1 min de centrifugação (100 x g). Amostras de proteína fitase foram eluídas com o uso de tampão de eluição (acetato de Na 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 5,5)

durante 1 min de centrifugação (100 x g). As amostras da etapa de purificação da proteína foram diluídas 5 vezes com tampão de acetato de Na (acetato de Na 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 5,5) para um volume final de 100 µl em MTPs UV de 96 poços (Costar, 3635). A absorbância das amostras foi medida a 280 nm, e as concentrações de proteína foram calculadas de acordo com uma curva padrão de proteína fitase com concentração conhecida cobrindo uma faixa de 0-1750 ppm. Com base nas concentrações de proteína determinadas, todas as amostras da purificação foram diluídas para um alvo de 150 ppm em tampão (acetato de Na 100 mM, NaCl 0,5 M pH 5,5) em MTPs de 96 poços e armazenadas a 5°C até serem usadas nos ensaios descritos abaixo.

[0418] A concentração da proteína fitase em cada amostra foi determinada por HPLC de fase reversa (RP-HPLC). Amostras normalizadas foram carregadas em uma coluna Agilent Zorbax 300 (SB- C3 2,1 x 50 mm) em um HPLC Agilent 1260. Um gradiente de solvente A (0,1% v/v de TFA em Água) e solvente B (0,07% de TFA em acetonitrila) foi aplicado de acordo com a Tabela 2. O volume de injeção da amostra foi de 10 µl, a temperatura da coluna foi de 60°C e a vazão foi de 1 ml/min. A absorbância do eluente foi medida a 220 nm e integrada com o uso do software ChemStation (Agilent Technologies). A concentração de proteína de amostras de fitase foi determinada com base em uma curva padrão de proteína de fitase com concentração conhecida cobrindo uma faixa de 0-350 ppm.

Tabela 2: Condições de gradiente de HPLC usadas para determinação da concentração de proteína de enzimas fitase normalizadas purificadas.

Tempo (minutos) Solvente A Solvente B 0 80 20 0,1 80 20 1,6 35 65 1,65 5 95 1,95 5 95 2 80 20 2,3 80 20

[0419] A purificação das amostras, Fitases PHY-11895, PHY-11932 e PHY-12663 e extratos de produtos comerciais Quantum Blue 5 G e Natuphos E 10000 G (método de extração descrito no Exemplo 5), foi realizada como segue. As amostras foram trocadas por tampão em colunas PD10 (pré-equilibradas com tampão, acetato de Na 10-30 mM, pH 5,5) e subsequentemente purificadas com o uso de cromatografia de interação hidrofóbica HIC. Dependendo da amostra, uma das seguintes colunas HIC foi usada (Phenyl HP XK26 ou HiTrap Phenyl HP ou Phenyl 15, HR5/5). A coluna HIC foi pré-equilibrada em tampão de carga (tampão de Acetato de Na 20 mM, pH 5,5 contendo sulfato de amônio 1,0-1,3 M). A proteína fitase ligada foi eluída com o uso de um gradiente linear de sulfato de amônio em acetato de Na 10 mM, pH 5,5. As frações coletadas da coluna HIC foram trocadas por tampão com o uso de colunas Sephadex G25 M, XK50/35 ou PD10 (pré-equilibradas com tampão, acetato de Na 10-30 mM, pH 5,5). Estima-se que a pureza final de todas as amostras de fitases purificadas (Fitases PHY-11895, PHY-

11932 e PHY-12663 e extratos de produtos comerciais Quantum Blue 5 G e Natuphos E 10000 G) exceda 95%. A concentração de proteína nas amostras purificadas finais foi determinada medindo-se a absorbância espectrofotometricamente a 280 nm e com o uso de coeficientes de extinção calculados. Para os dois produtos comerciais (Quantum Blue 5 G e Natuphos E 10000 G) foi usado o coeficiente de extinção calculado de duas sequências de fitase públicas intimamente relacionadas (SEQ ID Nº:61 e SEQ ID Nº:60). Os coeficientes de extinção molar foram calculados com o uso do software Geneious® versão 10.2.4. EXEMPLO 3 Ensaios in vitro para enzimas fitase

[0420] Os ensaios que se seguem foram usados para medir várias propriedades dos polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos, bem como fitases comercialmente disponíveis. Atividade de fitase de referência (FTU)

[0421] As amostras de fitase foram testadas quanto à atividade pelo método de atividade de fitase de referência (FTU). O seguinte procedi- mento ISO 30024 modificado: "Animal feeding stuffs – Determination of phytase activity" foi usado: Para se preparar para a análise, as amostras de fitase líquidas foram diluídas em tampão de ensaio (acetato de Na 250 mM, CaCl2 1 mM e Tween-20 a 0,01%, pH 5,5) para obter a medição dentro da faixa linear de uma curva padrão de fosfato no ensaio de fitase FTU que se segue. Para amostras sólidas, 1,0 g de amostra foi pesado e extraído em 100 ml de tampão de ensaio misturando-se em um agitador magnético por 20 min. Os sobrenadantes foram coletados após filtração (Filtro de fibra de vidro, GA-55, Advantec) e posteriormente diluídos para aproximadamente 0,04 FTU/ml. A análise das amostras foi realizada de acordo com o seguinte procedimento: 1 ml das amostras de fitase diluídas foram misturadas com 2 ml de uma solução de substrato IP6 7,5 mM (Fitato de Sódio da Rice, Shanghai AZ

Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd no Z0201301181) em tampão de ensaio e incubadas em banho-maria durante 60 minutos a 37°C. As reações foram interrompidas com 2 ml de reagente de Molibdato/vanadato ácido e o teor de fosfato inorgânico foi quantificado por espectrofotometria a 415 nm. Os resultados foram corrigidos subtraindo-se a absorbância de um branco de tampão da absorbância das amostras de fitase. Uma curva padrão de fosfato foi gerada a partir de hidrogenofosfato de potássio seco e usada para calcular a quantidade de fosfato liberado de cada amostra. Um FTU foi definido como a quantidade de enzima fitase que gera 1 µmol de fosfato/min. Atividade específica no substrato IP6 em pH 3,5 ou 5,5

[0422] As fitases foram testadas quanto à atividade da fitase com o uso de solução de substrato IP6 (Fitato de Sódio da Rice, Shanghai AZ Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd No Z0201301181). Para avaliação em pH 5,5, as amostras de enzima fitase a uma concentração de 150 ppm foram diluídas em série para uma concentração final de 0,18 ppm com o uso de tampão de acetato de Na 100 mM, Tween-20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 5,5 em uma MTP 384 antes da análise. 47 µl do substrato IP6 (0,20 mM) em acetato de Na 100 mM, Tween 20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 5,5 foram adicionados a cada poço da MTP 384 e 3 µl da amostra de enzima fitase diluída foram adicionados para um volume final de 50 µl.

[0423] Para avaliação da atividade em pH 3,5, as amostras de enzima fitase a uma concentração de 150 ppm foram diluídas em série para uma concentração final de 0,11 ppm em tampão de acetato de Na 100 mM, Tween-20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 5,5 na MTP 384 antes da análise. 47 µl do substrato IP6 (0,20 mM) em glicina 100 mM, Tween- 20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 3,3 foram adicionados a cada poço da MTP 384 e 3 µl da amostra de enzima fitase diluída foram adicionados para um volume final de 50 µl.

[0424] As placas de reação MPT foram incubadas por 10 minutos a 25°C em um agitador iEMS (Thermo Scientific) com mistura contínua (1400 rpm) e as reações foram interrompidas pela adição de 45 µl de reagente de parada Pi Blue (Kit de Ensaio de Fosfato PiBlue™, POPB- DP, BioAsay Systems, EUA). As placas foram misturadas e vedadas antes de incubadas para desenvolvimento de cor por 30 min a 25°C em um agitador iEMS (650 rpm). Após a incubação, a formação de cor foi determinada medindo-se a absorbância a 620 nm em um leitor de placas (Spectramax, Molecular Devices). A atividade no substrato IP6 de cada amostra de fitase foi calculada com base em uma curva padrão ajustada de proteína fitase com concentração e atividade conhecidas cobrindo uma faixa de 0-350 ppm como a média de três repetições. A atividade específica em µmoles de fosfato/mg/min de cada amostra de fitase foi subsequentemente calculada com o uso da atividade em pH 3,5 ou 5,5 dividida pela concentração de proteína fitase na amostra determinada por RP-HPLC (como descrito no Exemplo 2).

[0425] Para as variantes de fitase descritas na Tabela 3B e na Tabela 21, a preparação da amostra e a análise da atividade foram realizadas como descrito no presente documento. Alíquotas de proteína purificada (Exemplo 2) foram diluídas para uma concentração alvo de 100 ppm em tampão (acetato de Na 100 mM, NaCl 0,5 M pH 5,5) seguido por uma diluição em série para uma concentração final de 0,1 ppm com o uso de tampão acetato de Na 100 mM, Tween-20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 5,5. Subsequentemente, a atividade em pH 5,5 e 3,5 foi determinada como descrito no Exemplo 3, exceto por MTPs de 96 poços em vez de MTPs de 384 poços (70 µl do substrato IP6 (0,20 mM) em acetato de Na 100 mM, Tween 20 0,025% e CaCl2 0,05 mM, pH 5,5 foram feitos reagir com uma alíquota de 10 µl da enzima diluída. A reação foi interrompida com o uso de 170 µl de reagente Pi Blue).

Determinação da Temperatura de Fusão (Tm) por DSC

[0426] As medições de calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram realizadas com o uso de um MicroCal™ VP-Capillary DSC System (GE Healthcare). A DSC é uma ferramenta analítica poderosa para caracterizar a estabilidade de proteínas e outras biomoléculas. A mesma mede a entalpia (ΔH) e a temperatura (Tm) das transições estruturais induzidas termicamente em solução. Amostras de proteína fitase diluídas para uma concentração final de 0,4 mg/ml em tampão acetato de Na 100 mM, pH 5,5 foram preparadas. 400 µl dessas amostras de proteína, bem como uma referência contendo uma quantidade idêntica de tampão isento de proteína, foram adicionados a uma placa de 96 poços. A placa foi colocada no compartimento do amostrador automático com temperatura controlada mantida a 10°C. As amostras de proteína e a referência foram submetidas à varredura de 20 a 120°C a uma taxa de varredura de 2°C por minuto. A temperatura de fusão (Tm) foi determinada como a temperatura no pico máximo da transição do estado dobrado para o desdobrado. A variação máxima na Tm foi de ± 0,2°C. O pacote de software ORIGIN (MicroCal, GE Healthcare) foi usado para subtração da base de referência e cálculo dos valores de Tm. EXEMPLO 4 Avaliação de atividade específica e termoestabilidade de enzimas fitase

[0427] Amostras de polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos gerados com o uso do método descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2 foram avaliadas quanto à sua atividade de fitase específica em pH 3,5 e 5,5 e quanto à sua termoestabilidade, com o uso de métodos descritos no Exemplo 3. Os produtos de fitase comerciais Quantum Blue® (AB Vista) e Natuphos® 10000 E (BASF Nutrition) foram incluídos no estudo. Esses dois produtos foram escolhidos porque estão entre os produtos mais intrinsecamente termoestáveis disponíveis comercialmente.

As Tabelas 3A e 3B fornecem os resultados para a atividade específica em pH 3,5 e pH 5,5 como µmoles de fosfato/mg/min, e a termoestabilidade (Tm) em °C medida por DSC, em que ND denota valor não determinado.

Os resultados mostram que todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos exibem um valor de Tm bem acima dos produtos comerciais.

Esses polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos mostram atividade específica que é comparável ou superior à atividade específica de produtos comerciais em pH 5,5. Em pH 3,5, as atividades específicas dos polipeptídeos do clado Tm-fitase alta e fragmentos dos mesmos são todas superiores aos produtos comerciais.

A termoestabilidade mais alta pode ser altamente benéfica em condições de peletização, especialmente em MLA ou quando aplicada em uma formulação sólida.

A atividade específica mais elevada em pH ácido pode ser altamente benéfica nas condições ácidas que existem no trato digestivo de animais monogástricos.

Tabela 3A: Atividade específica medida em pH 3,5 e pH 5,5 e termoestabilidade medida por DSC para várias enzimas fitase.

Nome da amostra Atividade específica em pH 5,5 Atividade específica em pH Tm por DSC (µmoles de fosfato/mg/min) 3,5(µmoles de fosfato/mg/min) (°C) PHY-10931 402 ND 94 PHY-10957 365 ND 93 PHY-11569 335 ND 94 PHY-11658 614 ND 94 PHY-11673 246 ND 93 PHY-11680 425 ND ND PHY-11895 335 526 97 PHY-11932 436 622 93 PHY-12058 275 ND 94 PHY-12663 363 741 94 PHY-12784 478 ND 93 PHY-13177 612 ND 94 PHY-13371 263 572 96 PHY-13460 408 708 98 PHY-13513 267 624 99 PHY-13594 449 686 97 PHY-13637 319 654 98 PHY-13705 489 775 97 PHY-13713 261 589 98 PHY-13747 679 646 96 PHY-13779 744 880 97 PHY-13789 475 696 101 PHY-13798 288 602 98 PHY-13868 348 574 97 PHY-13883 387 508 95 PHY-13885 340 608 99 PHY-13936 270 635 98 PHY-14004 423 574 98 PHY-14215 430 410 ND PHY-14256 669 847 98 PHY-14277 407 696 98 PHY-14473 360 702 96 PHY-14614 367 605 97 PHY-14804 268 489 95 PHY-14945 367 692 97 PHY-15459 535 434 ND PHY-16513 476 342 ND Natuphos E 10000 320 290 86 Quantum Blue 274 400 88

ND denota valor não determinado

Tabela 3B: Atividade específica medida em pH 3,5 e pH 5,5 e termoestabilidade medida por DSC para várias enzimas fitase.

Nome da Atividade específica em pH 5,5 Atividade específica em pH 3,5 Tm por amostra (µmoles de fosfato/mg/min) (µmoles de fosfato/mg/min) DSC (°C) PHY-16812 476 717 98 PHY-17403 ND ND 101 PHY-17336 ND ND 100 PHY-17225 366 418 101 PHY-17186 ND ND 101 PHY-17195 ND ND 100 PHY-17124 341 555 99 PHY-17189 ND ND 101 PHY-17218 423 597 101 PHY-17219 402 548 101 PHY-17204 415 586 100 PHY-17215 ND ND 101 PHY-17201 480 625 101 PHY-17205 449 657 101 PHY-17224 ND ND 101 PHY-17200 483 670 101 PHY-17198 ND ND 101 PHY-17199 ND ND 101 PHY-17214 ND ND 101 PHY-17197 ND ND 101 PHY-17228 376 410 101 PHY-17229 329 665 100 PHY-17152 259 422 99 PHY-17206 ND ND 100 PHY-13594 449 687 97 PHY-13885 340 596 99 PHY-13789 475 700 101

[0428] A espectroscopia de massa de alta resolução (MS) foi realizada para confirmar as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos do clado Tm-fitase alta e fragmentos dos mesmos, PHY- 13594, PHY-11895, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885, PHY-13936, PHY-14004, PHY-14256 e PHY-14277 (SEQ ID Nº: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31). As análises de MS confirmaram o terminal C previsto da SEQ ID Nº: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31. Além disso, as análises de MS revelaram truncamentos do terminal N da SEQ ID Nº: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31. O aminoácido de terminal N mais comumente observado corresponde à posição 4 em relação à sequência madura prevista, mas também foram observados truncamentos na posição 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10. EXEMPLO 5 Estudos de Estabilidade de Peletização de Enzimas Fitase

[0429] Os testes de recuperação de peletização em ração de polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos foram realizados na instalação de peletização do Instituto Tecnológico (Sdr. Stenderup, Dinamarca). Deve-se observar que as recuperações da peletização em rações dependem de vários fatores, que incluem; a matriz de ração específica, condições de condicionamento e peletização, ensaio usado para determinar a atividade, etc.

[0430] A recuperação de peletização em ração de enzimas fitase: PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13594, PHY-13637, PHY- 13789, PHY-13885, PHY-13936, PHY-14256, PHY-14277 e as fitases comerciais de referência Quantum® Blue 5G (AB Vista) e Natuphos® E 10000 G (BASF Nutrition). Amostras líquidas de amostras de fitase comerciais de referência foram obtidas pela extração da enzima fitase dos produtos em pó Quantum Blue 5 G e Natuphos E 10000 G com o uso de tampão de acetato de Na 100 mM, pH 5,5. A atividade das amostras de enzima fitase líquida foi medida com o uso do ensaio de atividade da fitase de referência (FTU) descrito no Exemplo 3, e dosadas em conformidade na ração. Amostras sólidas para estudo de estabilidade de peletização foram feitas aplicando amostras líquidas de PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY- 13885 a um carreador de trigo em grão integral de acordo com o seguinte procedimento. Trigo em grão integral moído foi transferido para um misturador de corte equipado com uma lâmina de faca irregular. A amostra de fitase líquida (máx. 40% v/p) foi adicionada ao pó de trigo de grão integral moído durante a mistura. A mistura da amostra de fitase líquida e pó de trigo em grão integral moído foi colocada em uma bandeja e seca a 40°C por 8-10 horas em um forno. Após a secagem, o produto de fitase sólido foi moído com o uso de um moinho Bühler (modelo MLT 204) com o espaço entre rolos ajustado em 0. A amostra do produto comercial de referência Quantum Blue 5 G foi dosada como sólido (tal como está) na ração para comparação. A análise dos produtos de fitase sólidos foi realizada com o uso do ensaio de atividade de fitase de referência (FTU), e os produtos foram dosados em conformidade na ração.

[0431] A composição da ração era uma dieta de milho/soja, compreendendo: 62,5% de milho, 31% de farelo de soja, 4,4% de óleo de soja, 1,2% de calcário, 0,5% de VIT/MIN (pré-mistura Farmix Leghennen) e 0,4% de cloreto de sódio. O teor de umidade da ração era de cerca de 12-14% (p/p). Entre 120 kg e 200 kg de ração pré-misturada descrita acima foram misturados com amostras de enzima de fitase líquida (MLA) ou sólida em um misturador de fita horizontal à temperatura ambiente (22-24 °C) por 10 minutos para atingir uma concentração final de fitase na ração de 5 FTU/g. A quantidade de amostra de fitase líquida adicionada à ração foi entre 0,2 e 0,5% (p/p).

[0432] Após a mistura, as amostras de ração contendo fitase foram condicionadas por 30 segundos a 60°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C em um misturador em cascata KAHL e subsequentemente peletizadas. O termo "condicionamento", como usado no presente documento, significa misturar a mistura de ração/enzima e tratá-la com vapor para atingir a temperatura alvo de 60°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C por um tempo de espera de 30 segundos. A temperatura de condicionamento foi controlada manualmente ajustando-se 3 válvulas de vapor a partir das quais o vapor a uma pressão de 2 atm foi direcionado para a mistura de ração/enzima. A temperatura foi mantida na temperatura alvo +/- 0,3°C na saída do condicionador. Este condicionamento de vapor normalmente aumenta o teor de água da ração em 2-5,5% em peso em temperaturas de condicionamento entre 60 e 95°C. Imediatamente após a etapa de condicionamento, as misturas de ração/enzima foram formadas em péletes em uma prensa de péletes Simon Heesen equipada com uma matriz de Ø 3 mm * 35 mm e um motor de 7,5 kW. A taxa do parafuso de alimentação foi ajustada para atingir uma taxa de produção de aproximadamente 300 kg/hora e a velocidade do rolo foi ajustada para 500 rpm. O sistema foi deixado funcionar por aprox. 8 minutos após a temperatura de condicionamento alvo ter sido atingida para aquecer a matriz do pélete. Posteriormente, amostras de ração peletizadas de 5-7,5 kg foram coletadas e resfriadas imediatamente em uma caixa de resfriamento com fundo perfurado, com fluxo de ar ambiente de 1500 m3 ar/h por 15 minutos. Durante o resfriamento, o teor de água do pélete cai para um nível comparável ao da mistura de ração contendo fitase antes do condicionamento com vapor (ração farelada). As amostras foram reduzidas com o uso de um divisor de amostra de acordo com a ISO_6497_2002 e a recuperação de fitase foi determinada como se segue.

[0433] As amostras de ração contendo fitase, tanto ração farelada quanto péletes, foram moídas com o uso de um moinho de laboratório Retch (Modelo ZM 200 equipado com peneira de 0,75 mm) e posteriormente analisadas para medir a atividade de fitase com o uso do método que se segue que é uma modificação do procedimento ISO 30024: "Animal feeding stuffs – Determination of phytase activity".

[0434] Para extrair a enzima fitase das amostras de ração, 20,0g (+/- 0,05g) da ração farelada e peletizada moída foram misturados com 100 ml de tampão de extração (acetato de Na 250 mM, CaCl2 1 mM, Tween-20 0,01%, pH 5,5,) em um misturador rotativo por 20 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram recolhidos após filtração (filtro de fibra de vidro, GA-55 da Advantec). Os sobrenadantes foram posteriormente diluídos em tampão de extração para obter a medição dentro da faixa linear da curva padrão de fosfato no ensaio de FTU fitase que se segue (0,04 FTU/ml).

[0435] Um ml das amostras de fitase extraídas diluídas foi misturado com 2 ml de uma solução de substrato IP6 7,5 mM (Fitato de Sódio da Rice, Shanghai AZ Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd no Z0201301181) em tampão de extração e incubada em banho maria por 60 min a 37°C. As reações foram interrompidas com 2mL do reagente molibdato/vanadato ácido e a liberação de fosfato inorgânico foi quantificada por espectrofotometria a 415 nm. Os resultados foram corrigidos subtraindo-se a absorbância de uma amostra de tempo zero correspondente (uma amostra que não foi incubada por 60 min, 37°C). Uma curva padrão de fosfato foi gerada a partir de hidrogenofosfato de potássio seco e usada para calcular a quantidade de fosfato liberado de cada amostra. Um FTU foi definido como a quantidade de enzima fitase que gera 1 µmol de fosfato/min. A porcentagem de recuperação de peletização em ração foi calculada com o uso da seguinte fórmula: (Atividade da Fitase do pélete (FTU/g) dividida pela atividade da Fitase da ração farelada (FTU/g)) * 100.

[0436] A Tabela 4 lista a porcentagem de recuperação de peletização em ração de enzimas fitase aplicadas em MLA nas temperaturas 60, 80, 85, 90 e 95°C mostrado na Tabela 3. A recuperação de peletização a 95°C foi de pelo menos 50% para todos os polipeptídeos testados de clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos aplicados em MLA. Para comparação, as fitases comerciais de referência extraídas de Quantum Blue e Natuphos E 10000 exibiram uma recuperação muito menor na ração, ou seja, 15% e 25%, respectivamente, nas mesmas condições. Esses dados ilustram a alta robustez dos polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos.

[0437] A 60°C, a recuperação de peletização em ração quando aplicada em MLA está entre 71% e 85% para todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos testados. Pode parecer à primeira vista contraditório que as fitases robustas descritas no presente documento perdem entre 15 e 29% da atividade quando condicionadas a 60°C e subsequentemente peletizadas, quando a temperatura de condicionamento de 60°C é mais de 30°C mais baixa do que a Tm das fitases robustas. Isso sugere que a perda inicial não está relacionada à inativação térmica no condicionador, o que é adicionalmente corroborado pelo fato de que há apenas uma perda adicional limitada quando a temperatura é elevada para 80°C. Sem estar vinculado à teoria, acredita-se e foi descrito para outras enzimas (phytase and xylanase; Trial report 875: Danish Agriculture & Food Council, pedido de patente WO2014120638 e Novus Insight, Issue 3, 2015) que pode haver uma fração de fitase e xilanase que é difícil de extrair/recuperar da ração após o condicionamento e peletização. Acredita-se, entretanto (novamente sem estar vinculado à teoria) que pelo menos parte dessa fração irrecuperável ainda é bioativa no animal - em outras palavras, a fração irrecuperável pode não ser irreversivelmente inativada devido ao estresse térmico. Em vez disso, acredita-se (novamente sem estar vinculado à teoria) que a fração irrecuperável está ligada na ração de tal forma que não pode ser extraída in vitro. Alternativamente, acredita-se (novamente sem estar vinculado à teoria) que de fato toda a proteína da enzima fitase é extraída, mas devido ao condicionamento e peletização, há uma atividade aparente menor das fitases quando medida em um ensaio in vitro. Sem estar vinculado à teoria, acredita-se que a aplicação das fitases em MLA em comparação com uma forma seca e/ou revestida aumentará a magnitude dessa forma irrecuperável, mas bioativa, das fitases devido à interação física direta com a ração.

[0438] Conclui-se que uma maneira apropriada de avaliar a robustez térmica das fitases aplicadas no MLA não é comparar a atividade recuperável na ração antes e depois do condicionamento e peletização, mas sim comparar a recuperação da atividade da fitase após o condicionamento e peletização a uma temperatura de condicionamento baixa, por exemplo, 80°C e uma alta, por exemplo, 95°C, que está dentro de uma faixa comercialmente relevante de temperaturas de condicionamento. Tabela 4. Comparação da atividade da enzima fitase recuperada após aplicação em MLA em temperaturas crescentes, de 60 a 95°C por 30 s. % De recuperação da atividade da enzima Amostra de fitase 60C 80C 85C 90C 95C PHY-11895 77 67 ND 66 64 PHY-11932 ND ND 68 66 50 PHY-12663 85 ND 70 67 51 PHY-13594 82 76 ND 67 55 PHY-13637 80 78 ND 75 68 PHY-13789 80 76 ND 77 74 PHY-13885 72 66 ND 63 55 PHY-13936 ND 79 ND 75 72 PHY-14256 76 71 ND 63 58 PHY-14277 75 70 ND 65 59 Quantum Blue 84 ND 66 53 15 Natuphos E 10000 87 77 ND 67 25 ND denota valor não determinado

[0439] A Tabela 5 mostra a razão de recuperações de peletização em rações quando aplicada em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos.

Para os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos aplicados em MLA, a razão de recuperação de peletização em ração a 95°C foi entre 0,72 e 0,98 quando comparada à aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos.

O número correspondente para a fitase comercial de referência extraída de Natuphos E 10000 foi de 0,32. Os dados mostram que os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos descritos no presente documento são altamente robustos a mudanças na temperatura de condicionamento dentro de uma faixa de temperatura comercialmente relevante.

Tabela 5. Razão de recuperações de peletização em ração quando aplicada em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação com a aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos Nome da amostra Razão PHY-11895 0,96 PHY-11932 ND PHY-12663 ND PHY-13594 0,72 PHY-13637 0,87 PHY-13789 0,98 PHY-13885 0,83 PHY-13936 0,91 PHY-14256 0,82 PHY-14277 0,84 Quantum Blue 0,22* Natuphos E 10000 0,32 * Resultado da razão dado como processo de 95°C em comparação com o processo de 85°C, não 80°C ND denota valor não determinado

[0440] A Tabela 6 mostra a recuperação de peletização em ração a 95°C das fitases PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885 e Quantum Blue 5G quando aplicadas como sólido. Todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos têm recuperações de peletização em rações de pelo menos 64% a 95°C quando aplicados como sólidos em um carreador de trigo em grão integral moído. O produto comercial em pó Quantum Blue 5G tem recuperação de 58% quando testado nas mesmas condições.

Tabela 6. Porcentagem de Recuperação de Peletização em ração de enzimas fitase aplicadas como sólido.

% De recuperação da atividade da enzima Amostra de fitase 95°C PHY-11895 71 PHY-11932 83 PHY-12663 64 PHY-13637 78 PHY-13789 75 PHY-13885 72 Quantum Blue 5 G 58 EXEMPLO 6 Avaliação in vivo de enzimas fitase Avaliação de desempenho de PHY-12663, PHY-11932 e PHY-11895

[0441] O desempenho in vivo das fitases PHY-12663, PHY-11932 e PHY-11895 foi avaliado em frangos de corte. O estudo foi realizado na universidade Texas A&M. Oito tratamentos dietéticos foram testados: uma dieta de controle positivo (PC) que foi formulada atendendo às necessidades nutricionais dos frangos de corte, um controle negativo (NC) que foi formulado com deficiência de fósforo digestível (0,16%

ponto inferior a PC) e cálcio (0,19 ponto percentual inferior a PC), e NC suplementado com fitases PHY-12663, PHY-11932 ou PHY-11895 dosadas a 500 e 1000 FTU/kg. A Tabela 7 fornece a composição dietética dos valores de nutrientes calculados e analisados usados nesse estudo. Tabela 7. Composição dietética (calculada e analisada) para avaliação in vivo das fitases PHY-12663, PHY-11932 e PHY-

11895. Ingrediente, g/kg como se Início de Início de Crescimen Crescimen Finalizador Finalizador encontra PC 0-10 NC 0-10 to de PC to de NC de PC 22- de NC 22-42 dias dias 11-21 dias 11-21 dias 42 dias dias Milho 587,5 609,5 625 647 664,5 686,5 Soja ml 48% 332 328,5 277 273,5 226,5 223 DL-met98 2,925 2,9 2,6 2,575 2,45 2,425 Lisina hcl 1,95 2,025 2,025 2,1 2,325 2,4 L-treonina 98,5% 0,675 0,7 0,7 0,7 0,925 0,925 Gordura, av misturado 15,5 8 24,5 17 29 21 Calcário 14,45 13 13,35 11,95 11,95 10,5 Fosfato monocálcio 15,45 6,5 13,9 4,9 11,75 2,8 Sal 4,325 4,325 3,325 3,35 2,6 2,625 Bicarb. de sódio 0 0 1 1 2 2 pré-mistura de vitaminas 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 Pré-mistura mineral vestigial 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Farelo de arroz 23,14 23,14 34,465 34,465 44,07 44,07 Nutrientes calculados, % Proteína bruta 21,81 21,82 19,59 19,60 17,63 17,65 Gordura bruta 4,40 3,73 5,53 4,86 6,20 5,49 Fibra bruta 2,85 2,88 2,84 2,88 2,84 2,88 Cálcio 0,9 0,7 0,82 0,622 0,72 0,521 Fósforo total 0,73 0,545 0,691 0,505 0,639 0,455 Fosfato disponível 0,45 0,263 0,411 0,222 0,359 0,172 ME de aves kcal/kg 3000 3000 3100 3100 3176 3174 Xantofila mg/kg 9,99 10,36 10,63 11,0 11,3 11,7 Dig-Met 0,59 0,589 0,533 0,532 0,496 0,494 Dig-Lis 1,18 1,18 1,05 1,05 0,949 0,95 Nutriente Analisado % Proteína bruta 19,87 19,74 18,8 18,6 17,5 17,2 Gordura 4,54 4,17 5,53 5,12 5,96 5,85 Cinza 5,98 5,25 4,71 3,96 4,53 3,97 Fósforo total 0,74 0,56 0,73 0,50 0,67 0,53 Cálcio 1,00 0,89 0,97 0,78 0,79 0,64 Casca de arroz moída foi usada como carreador da enzima fitase.

[0442] Frangos de corte machos Cobb 500 com um dia de idade foram designados aos tratamentos dietéticos, cada um contendo 10 galinheiros replicadas com 30 pintos por galinheiro. As dietas foram à base de milho, farelo de soja e farelo de arroz, na forma farelada. No dia 21, cinco aves por galinheiro replicada foram removidas e as tíbias foram coletadas para uma determinação de cinza de tíbia isenta de gordura. As dietas foram formuladas de acordo com um programa de alimentação trifásico (início 0-10 d, crescimento 11-21 d e finalização 22-42 d). Dietas e água foram aplicadas ad libitum ao longo dos 42 dias de estudo.

[0443] Os dados foram analisados por ANOVA, a média do tratamento foi separada com o uso do teste Tukey HSD, P <0,05 é considerado significativo. Os seguintes parâmetros de desempenho foram calculados: ADG (ganho médio diário), ADFI (ingestão média diária de ração) e FCR (razão de conversão alimentar) do período de estudo de 0-42 dias. A Tabela 8 mostra os resultados de desempenho de crescimento para frangos de corte alimentados com dietas suplementadas com diferentes fitases em diferentes dosagens durante 0-42 d de idade e cinza da tíbia medida aos 21 dias de idade. A redução de fósforo (P) e cálcio (Ca) em dietas NC correlaciona-se com um teor de ADG, ADFI e cinza da tíbia menor e um FCR maior em comparação com PC. Todas as fitases testadas: PHY-12663, PHY-11932 e PHY- 11895 melhoraram ADG, ADFI, cinza de tíbia e FCR em frangos de corte em comparação com a dieta de NC. Em média, o tratamento com as fitases PHY-12663, PHY-11932 e PHY-11895 melhorou ADG em 12 e 14%, ADFI em 8 e 10%, FCR em 3,3 e 3,7%, cinza da tíbia em 9 e 9,7% quando administrado em 500 e 1000 FTU/kg de ração, respectivamente, em comparação com a dieta de NC. Além disso, todas as fitases tiveram um desempenho melhor ou não significativamente diferente daquelas alimentadas com dieta de PC em todos os parâmetros. Esses dados mostram que os polipeptídeos do clado Tm- fitase Alta e fragmentos dos mesmos (PHY-12663, PHY-11932 e PHY- 11895) são capazes de melhorar significativamente o crescimento do esqueleto e desempenho de frangos de corte.

Tabela 8. Desempenho de crescimento ao longo de 42 dias e cinza de tíbia aos 21 dias de idade para frangos de corte alimentados com dietas suplementadas com fitases PHY-12663, PHY-11932 ou PHY-11895 a 500 e 1000 FTU/kg.

Tratamento Dose de fitase ADG ADFI FCR Cinza da tíbia (FTU/kg) % em d21 PC 0 69,9 a 114,5 a 1,639ab 52,4a NC 0 62,3b 103,3b 1,659 a 47,5b NC +PHY-12663 500 68,5 a 109,6ab 1,600c 51,8a NC +PHY-12663 1000 70,8 a 113,0 a 1,597c 52,0a NC +PHY-11932 500 70,0 a 113,0 a 1,614bc 51,8a NC +PHY-11932 1000 71,6 a 114,9 a 1,606c 52,2a NC +PHY-11895 500 70,4 a 112,4 a 1,599c 51,7a NC +PHY-11895 1000 70,7 a 112,5 a 1,591c 52,1a Estatísticas SEM 1,11 1,70 0,01 0,26 dietas P <.0001 0,0002 <.0001 <.0001 a, b, c: sobrescrito diferente em uma coluna indica diferença significativa, em P<0,05 FCR é mortalidade corrigida

Avaliação de desempenho de PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 e PHY-13885.

[0444] O desempenho in vivo de PHY-13789, PHY-13637, PHY- 14004 e PHY-13885 foi avaliado em frangos de corte na AH Pharma (Hebron, Maryland, EUA). Dez tratamentos foram testados incluindo uma dieta de controle positivo (PC) que foi formulada atendendo às necessidades nutricionais dos frangos de corte e uma dieta de controle negativo (NC). A dieta de NC foi formulada com deficiência de fósforo digestível (sem fosfato inorgânico, 0,24% ponto inferior a PC), cálcio (0,19% ponto inferior a PC), AA digestível (0,04%, 0,03% e 0,03% ponto inferior a PC para Lis, Met + Cys, Thr respectivamente) e ME (69 kcal/kg inferior vs PC).

[0445] O desempenho de PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 e PHY-13885 foi testado individualmente na dieta de NC em duas dosagens, 500 ou 1000 FTU/kg de ração. Pintos de corte machos (Ross 308) foram alimentados com a mesma dieta pré-inicial de 0 a 5 dias de idade e receberam dietas de teste durante 6 a 15 dias de idade. Os tratamentos dietéticos foram distribuídos aleatoriamente em nove gaiolas por tratamento, com 8 aves por gaiola. As dietas eram à base de milho, trigo, farelo de soja, farelo de colza e farelo de arroz (os ingredientes da dieta são mostrados na Tabela 9).

Tabela 9. Composição, nutriente calculado e analisado das dietas (% como alimentado). Ingrediente, % Iniciador Controle positivo Controle negativo (0-5 dias) (6-15 d) (6-15 d) Milho 28,26 27,57 34,48 Trigo 26 32 32 Farinha de Soja, 48% CP 29,95 21,79 19,4 Farinha de canola 3 6 6 Farelo de arroz 5 5 5 Gordura animal e vegetal 2,99 3,12 0,5 L-lisina HCl 0,212 0,22 0,246 DL-metionina 0,361 0,289 0,276 L-triptofano 0,033 0,036 Sal 0,366 0,363 0,262 Calcário 1,84 1,57 1,51 Fosfato Dicálcico 1,27 1,3 0 Pré-mistura de minera 0,25 0,25 0,25 vestigial e vitamina Dióxido de titânio 0,5 0,5 0,5 Nutrientes calculados ME, kcal/kg 2998 3025 2950 Proteína em Bruto 22 20 19,33 Cálcio 1 0,9 0,715 Fósforo Total 0,689 0,68 0,422 P disponível 0,45 0,45 0,209 Na 0,18 0,18 0,14 Dig Lis 1,27 1,1 1,06 Dig Met+Cis 0,94 0,84 0,81 Dig Thr 0,84 0,75 0,72 Nutrientes analisados ME*, kcal/kg ND 3022 2955 Proteína em Bruto ND 19,46 18,77 Cálcio ND 1,36 1,01 Fósforo Total ND 0,69 0,53 Na ND 0,208 0,164 ND significa valor não determinado * ME: energia metabolizável

[0446] Os pesos corporais e a ingestão de ração foram registrados nos dias 6 e 15. Durante os últimos 4 dias, os excrementos foram coletados diariamente, pesados e agrupados dentro de uma gaiola. Os excrementos combinados por gaiola foram usados para medição de retenção de fósforo (P) de acordo com o Método Oficial AOAC 965.17. No dia 15, a tíbia direita de seis pássaros por gaiola foi coletada e usada para a medição de cinza da tíbia.

[0447] Os dados foram analisados por ANOVA, as médias dos tratamentos foram separadas pelo teste Tukey HSD. P <0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente significativa. A Tabela 10 mostra o efeito no desempenho de PHY-13789, PHY-13637, PHY- 14004 e PHY-13885. A cinza da tíbia foi medida aos 15 dias de idade e a retenção de fósforo foi medida em frangos de 11-15 dias de idade. Todas as fitases testadas: PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 e PHY- 13885 melhoraram ADG, ADFI, cinza de tíbia e retenção de fósforo em frangos de corte em comparação com NC. Tabela 10. Desempenho de crescimento de 6 a 15 dias, cinza de tíbia no dia 15, retenção de fósforo de 11-15 dias em frangos de corte alimentados com dietas suplementadas com fitases PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 e PHY-13885 a 500 e 1000 FTU/kg. Tratamento Dose de ADG ADFI (g) FCR Cinza da Retenção de P fitase (g) tíbia d15 (% de ingestão (FTU/kg) de P) PC 0 34,7a 44,9 a 1,292 b 43,9abc 57,6c NC 0 32,1b 43,4 a 1,349 a 40,1f 57,4c NC+ PHY-13789 500 33,9a 44,1 a 1,303 b 42,0e 66,2b NC+ PHY-13789 1000 34,9a 44,6 a 1,280 b 43,7abcd 77,7a NC+ PHY-13637 500 34,1 a 44,3 a 1,298 b 42,7cde 67,6b NC+ PHY-13637 1000 34,9 a 44,4 a 1,272 b 44,0abc 78,0a NC+ PHY-14004 500 33,6 a 43,8 a 1,304 b 42,8bcde 68,5b NC+ PHY-14004 1000 34,5 a 44,3 a 1,281 b 44,2a 78,3a NC+ PHY-13885 500 33,9 a 44,1 a 1,300 b 42,4de 67,6b NC+ PHY-13885 1000 34,6 a 44,2 a 1,276 b 44,1ab 78,6a Estatísticas SEM 0,289 0,515 0,010 0,299 0,716 P <.0001 0,7565 <.0001 <.0001 <.0001 a, b, c, etc.: sobrescrito diferente em uma coluna indica diferenças significativas, em P <0,05

[0448] A fitase PHY-13789 melhorou o ADG em 5,4 e 8,4%, FCR em 3,4 e 5,1%, cinza da tíbia em 4,6 e 8,8%, retenção de fósforo em 15,3 e 35,4%, em comparação com NC quando administrada em 500 e 1000 FTU/kg, respectivamente. A fitase PHY-13637 melhorou o ADG em 6,1 e 8,6%, FCR em 3,8 e 5,7%, cinza da tíbia em 6,3 e 9,6%, retenção de fósforo em 17,7 e 35,8%, em comparação com NC quando administrada em 500 e 1000 FTU/kg, respectivamente. A fitase PHY- 14004 melhorou o ADG em 4,5 e 7,5%, FCR em 3,3 e 5%, cinza da tíbia em 6,5 e 10,1%, retenção de fósforo em 19,3 e 36,4%, em comparação com NC quando administrada em 500 e 1000 FTU/kg, respectivamente. A fitase PHY-13885 melhorou o ADG em 5,6 e 7,8%, FCR em 3,6 e 5,4%, cinza da tíbia em 5,5 e 9,8%, retenção de fósforo em 17,7 e 36,9%, em comparação com NC quando administrada em 500 e 1000 FTU/kg, respectivamente. Em média, os polipeptídeos do clado Tm- fitase Alta e fragmentos dos mesmos melhoraram ADG em 5,4 e 8,1%, FCR em 3,5 e 5,3%, cinza de tíbia em 5,7 e 9,6% e retenção de fósforo em 17,5 e 36,1% em comparação com NC. Todas as fitases em todas as dosagens testadas tiveram um desempenho não significativamente diferente de PC em ADG, ADFI e FCR, apesar da grande redução em nutrientes (remoção total de fósforo inorgânico e redução de Ca, AA dig e ME) de NC nesse ensaio. Todas as fitases tinham teor de cinza de tíbia semelhante em comparação com PC, exceto PHY-13789 e PHY- 13885 a 500 FTU/kg. A retenção de fósforo como porcentagem da ingestão de P foi melhorada em todos os tratamentos com fitase em comparação ao PC. Os resultados de retenção de P e cinza da tíbia confirmam que essas fitases são eficazes na liberação de fósforo.

[0449] Os resultados dos dois ensaios mostram que todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos testados estão fornecendo grandes melhorias no desempenho animal.

EXEMPLO 7 Identificação de um Clado Inovador de Enzimas Fitase

[0450] As sequências de polipeptídeo dos polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta e fragmentos dos mesmos mostrados no Exemplo 3 foram usados para gerar um Modelo de Markov Oculto (HMM) para identificar semelhanças de sequência. O MUSCLE versão 3.8.31 (MUSCLE: alinhamento de sequência múltipla com alta precisão e alto rendimento. RC Edgar (20014) Nucleic Acid Res 32:1792) foi usado para o alinhamento de sequência, com o uso de parâmetros padrão. Posteriormente, o software HMM builder HMMER versão 3.1 b1 (disponível em http://hmmer.org/) foi usado para gerar o HMM a partir do alinhamento de múltiplas sequências. Apenas dois parâmetros foram usados: Priors = Nenhum e Weights = Nenhum. O comando usado foi o seguinte: /usr/bin/hmmbuild --pnone --wnone Variants_for_filing_draft_5.hmm Variants_for_filing_draft_5.fsa, em que wnone= Sem pesos relativos (todas as sequências têm peso uniforme atribuído) e pnone = não usa nenhum prior, e os parâmetros são frequências. Todos os parâmetros de probabilidade são armazenados como probabilidades de log natural negativas com cinco dígitos de precisão à direita da vírgula decimal, arredondados. Por exemplo, uma probabilidade é armazenada como 0:25 log 0:25 = 1:38629. O caso especial de probabilidade zero é armazenado como símbolo *. A Figura 1 (painéis A a 1BB) mostra as pontuações de probabilidade HMM para cada posição ao longo da sequência de polipeptídeos das fitases de clado Tm-fitase Alta. As pontuações compostas (COMP) para o HMM são mostradas nos 3 painéis superiores da Figura 1A, em negrito. A posição (P) e o consenso (C) para cada aminoácido são mostrados na coluna 1 em P/C. Uma sequência de polipeptídeo de fitase de clado Tm- fitase Alta de consenso foi gerada a partir do HMM mostrado na Figura 1 e está listada como SEQ ID Nº:64.

[0451] O HMM foi então usado para gerar pontuações de sequências HMM para um conjunto global de aproximadamente 7000 fitases únicas, que incluíam sequências de fitase disponíveis nos bancos de dados públicos e patentes. A correlação de classificações e pontuações de sequência para termoestabilidade (Tunfold e Tm por DSC) foram comparadas para as várias sequências (dados não mostrados). Com base nesta análise, todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta inovadores têm pontuações de sequência HMM maiores do que 1200, como exemplificado na Tabela 11 para as fitases listadas na Tabela 3A e 3B.

Tabela 11. Pontuações de sequência geradas a partir de HMM para fitases de clado Tm-fitase Alta representativas.

ID da Amostra Pontuação de sequência HMM PHY-13594 1670 PHY-13885 1665 PHY-14945 1657 PHY-14277 1656 PHY-13637 1654 PHY-13705 1653 PHY-13779 1653 PHY-14614 1653 PHY-13789 1651 PHY-13936 1650 PHY-14256 1649 PHY-13371 1648 PHY-11895 1648 PHY-14004 1647 PHY-13713 1646

PHY-12663 1646 PHY-14804 1646 PHY-13460 1645

PHY-10957 1645

PHY-11658 1644

PHY-13177 1643

PHY-12058 1642 PHY-13798 1642

PHY-13883 1642 PHY-11932 1639

PHY-10931 1637

PHY-13747 1633

PHY-14473 1629 PHY-13513 1628

PHY-11569 1627

PHY-12784 1623

PHY-11673 1615 PHY-13868 1604 PHY-11680 1537

PHY-14215 1499 PHY-15459 1330

PHY-16513 1221 PHY-16812 1676 PHY-17403 1664

PHY-17336 1667

PHY-17225 1654

PHY-17186 1649 PHY-17195 1652 PHY-17124 1629 PHY-17189 1650 PHY-17218 1652 PHY-17219 1650 PHY-17204 1648 PHY-17215 1651 PHY-17201 1615 PHY-17205 1649 PHY-17224 1651 PHY-17200 1656 PHY-17198 1653 PHY-17199 1614 PHY-17214 1651 PHY-17197 1647 PHY-17228 1653 PHY-17229 1612 PHY-17152 1625 PHY-17206 1649

[0452] Um alinhamento de sequência múltipla de sequências maduras previstas das enzimas do clado Tm-fitase Alta listadas na Tabela 11: [PHY-13594 (SEQ ID Nº: 1); PHY-10931 (SEQ ID Nº: 2); PHY-10957 (SEQ ID Nº: 3); PHY-11569 (SEQ ID Nº: 4); PHY-11658 (SEQ ID Nº: 5); PHY-11673 (SEQ ID Nº: 6); PHY-11680 (SEQ ID Nº: 7); PHY-11895 (SEQ ID Nº: 8); PHY-11932 (SEQ ID Nº: 9); PHY-12058 (SEQ ID Nº: 10); PHY-12663 (SEQ ID Nº: 11); PHY-12784 (SEQ ID Nº:

12); PHY-13177 (SEQ ID Nº: 13); PHY-13371 (SEQ ID Nº: 14); PHY- 13460 (SEQ ID Nº: 15); PHY-13513 (SEQ ID Nº: 16); PHY-13637 (SEQ ID Nº: 17); PHY-13705 (SEQ ID Nº: 18); PHY-13713 (SEQ ID Nº: 19); PHY-13747 (SEQ ID Nº: 20); PHY-13779 (SEQ ID Nº: 21); PHY-13789 (SEQ ID Nº: 22); PHY-13798 (SEQ ID Nº: 23); PHY-13868 (SEQ ID Nº: 24); PHY-13883 (SEQ ID Nº: 25); PHY-13885 (SEQ ID Nº: 26); PHY- 13936 (SEQ ID Nº: 27); PHY-14004 (SEQ ID Nº: 28); PHY-14215 (SEQ ID Nº: 29); PHY-14256 (SEQ ID Nº: 30); PHY-14277 (SEQ ID Nº: 31); PHY-14473 (SEQ ID Nº: 32); PHY-14614 (SEQ ID Nº: 33); PHY-14804 (SEQ ID Nº: 34); PHY-14945 (SEQ ID Nº: 35); PHY-15459 (SEQ ID Nº: 36); PHY-16513 (SEQ ID Nº: 37)]; PHY-16812 (SEQ ID Nº: 64); PHY- 17403 (SEQ ID Nº: 65); PHY-17336 (SEQ ID Nº: 66); PHY-17225 (SEQ ID Nº: 67); PHY-17186 (SEQ ID Nº: 68); PHY-17195 (SEQ ID Nº: 69); PHY-17124 (SEQ ID Nº: 70); PHY-17189 (SEQ ID Nº: 71); PHY-17218 (SEQ ID Nº: 72); PHY-17219 (SEQ ID Nº: 73); PHY-17204 (SEQ ID Nº: 74); PHY-17215 (SEQ ID Nº: 75); PHY-17201 (SEQ ID Nº: 76); PHY- 17205 (SEQ ID Nº: 77); PHY-17224 (SEQ ID Nº: 78); PHY-17200 (SEQ ID Nº: 79); PHY-17198 (SEQ ID Nº: 80); PHY-17199 (SEQ ID Nº: 81); PHY-17214 (SEQ ID Nº: 82); PHY-17197 (SEQ ID Nº: 83); PHY-17228 (SEQ ID Nº: 84); PHY-17229 (SEQ ID Nº: 85); PHY-17152 (SEQ ID Nº: 86); e PHY-17206 (SEQ ID Nº: 87) com fitases microbianas descritas publicamente: [Buttiauxella noackiae WP 064555343.1 (SEQ ID Nº: 38); Citrobacter braakii AAS45884.1 (SEQ ID Nº: 39); Coxiellaceae bacterium RDH40465.1 (SEQ ID Nº: 40); Enterobacteriaceae WP

094337278.1 (SEQ ID Nº: 41); Escherichia coli WP 001297112 (SEQ ID Nº: 42); Hafnia alvei WP 072307456.1 (SEQ ID Nº: 43); Rouxiella badensis WP 084912871.1 (SEQ ID Nº: 44); Serratia sp. WP

009636981.1 (SEQ ID Nº: 45); Yersinia aldovae WP 004701026.1 (SEQ ID Nº: 46); Yersinia frederiksenii WP 050140790.1 (SEQ ID Nº: 47); Yersinia kristensenii WP 004392102.1 (SEQ ID Nº: 48); Yersinia mollaretii WP 049646723.1 (SEQ ID Nº: 49); Yersinia rohdei WP

050539947.1 (SEQ ID Nº: 50); fitase APPM EP3222714-0003 (SEQ ID Nº: 51); US8101391-0002 (SEQ ID Nº: 52); US8101391-0004 (SEQ ID Nº: 53); US8101391-0035 (SEQ ID Nº: 54); US8101391-0049 (SEQ ID Nº: 55); US8143046-0001 (SEQ ID Nº: 56); US8143046-0003 (SEQ ID Nº: 57); US8460656-0002 (SEQ ID Nº: 58); US8557555-0013 (SEQ ID Nº: 59); US8557555-0024 (SEQ ID Nº: 60); US20160083700-0003 (SEQ ID Nº: 61); WO2010034835-0002 (SEQ ID Nº: 62)] foi produzido com o uso do alinhamento MAFFT em Geneious® versão 10.2.4. Com base neste alinhamento de sequência MAFFT, uma árvore filogenética mostrando as relações de sequência foi gerada com o uso do Geneious Tree Builder no Geneious® versão 10.2.4 e é mostrada na Figura 2. EXEMPLO 8 Avaliação in vivo de Enzimas Fitase em Pássaros

[0453] Este Exemplo avaliou a utilidade de uma 6-fitase bacteriana biossintética representativa produzida por uma cepa geneticamente modificada de Trichoderma reesei quando adicionada a uma dieta basal reduzida em Ca e P, em cinza da tíbia de frango de corte e digestibilidade ileal de P (AID P), quando comparada com uma dieta nutricionalmente adequada e não suplementada. Além disso, foram feitas observações sobre a ingestão de ração, desempenho de crescimento e conversão alimentar. Materiais e Métodos

[0454] Dietas experimentais e de controle: Dietas de controle positivo (PC) à base de milho e farelo de soja foram formuladas para atender aos requisitos recomendados de nutrientes (adequadas em P e Ca) das aves nas fases inicial (d 1-21) e finalização (d 22-42) [National Research Council. Nutrient Requirements of Poultry. 9th rev. ed. Natl Acad Press, Washington, DC; 1994]. As dietas de controle negativo (NC) foram formuladas com reduções de cálcio (Ca) e fósforo disponível

(P) de 2,0 g/kg e 1,9 g/kg na fase inicial e 2,0 g/kg e 1,8 g/kg nas dietas da fase de finalização, respectivamente.

Consultar a Tabela 12. Todas as dietas iniciais continham dióxido de titânio (adicionado a 4 g/kg) como marcador indigestível.

As dietas de controle negativo foram testadas como dietas independentes ou suplementadas com 250, 500 ou 1000 FTU/kg de uma 6-fitase bacteriana biossintética produzida por uma cepa geneticamente modificada da cepa Trichoderma reesei.

As dietas foram fornecidas às aves ad libitum na forma farelada.

Tabela 12: Ingrediente e composição de nutrientes (g/kg, base como alimentada) das dietas de controle negativo (NC) e controle positivo (PC) nas fases inicial (d 0-21) e finalização (d 22-42)

Inicial (d 0–21) Finalização (d 22–42)

Ingrediente (g/kg) PC NC PC NC

Maís 526 549 627 646

Farinha de soja (48% CP) 338 333,5 242 240,5

Farinha de canola 50 50 50 50

Óleo de soja 38,9 31,0 43,3 36,1

Fosfato monocálcio 14,9 5,55 10,8 2,15

Calcário 15,3 14,0 15,4 13,8

Bicarbonato de sódio - - 2,00 2,00

Sal 4,70 4,75 2,78 2,80

DL-metionina 2,83 2,80 2,03 2,00

Lisina HCl 2,13 2,20 1,78 1,80

L-treonina 0,80 0,80 0,60 0,60

Dióxido de titânio 4,00 4,00 - -

Pré-mistura de minerais de aves 0,35 0,35 0,35 0,35

Pré-mistura de vitaminas de aves 2,00 2,00 2,00 2,00

Nutrientes calculados (g/kg)

Matéria seca 882,73 880,59 883,353 881,48

Proteína bruta 217,61 217,42 180,83 181,65

Fibra bruta 16,38 16,67 15,98 16,27

Cálcio total 9,99 8,00 9,01 6,99 Fósforo total 7,15 5,22 5,95 4,18 Fósforo disponível 4,5 2,56 3,50 1,70 Energia metabolizável (ME) (kcal/kg) 3024,94 3025,25 3174,97 3174,90 Metionina disponível 5,87 5,85 4,67 4,67 Aminoácido de enxofre total disponível 9,00 8,99 7,40 7,41 Lisina disponível 12,00 11,99 9,49 9,51 Triptofano disponível 2,09 2,08 1,62 1,62 Treonina disponível 7,91 7,89 6,45 6,47 Arginina disponível 13,03 12,97 10,45 10,46 Valina disponível 9,00 9,00 7,53 7,57

[0455] Aves, alojamento e projeto experimental: Frangos de corte Cobb 500 de sexos mistos (50% machos, 50% fêmeas) foram obtidos no dia da eclosão de um incubatório comercial onde foram vacinados contra bronquite infecciosa e doença de Newcastle, por meio de água potável. A vacinação contra a Doença Infecciosa da Bursa foi administrada nos dias 11-14 também por meio de água potável. As aves foram alocadas em galinheiros com base no peso corporal inicial (BW) de modo que cada galinheiro contivesse aves com peso corporal aproximadamente igual. Um total de 1176 aves foi distribuído em 49 galinheiros com 24 aves por galinheiro, 9 galinheiros para NC e 10 galinheiros para todos os outros tratamentos, com cada galinheiro contendo 50% de machos e 50% de fêmeas, em um projeto inteiramente aleatorizado. Os galinheiros foram instalados em um aviário com controle ambiental, com regime de iluminação de LD 18:6 e temperatura inicial de 35°C, reduzido para 24°C no dia 28.

[0456] Amostragem e medições: Subamostras representativas de todas as dietas foram analisadas quanto à matéria seca (DM), proteína bruta (CP), gordura bruta (CF), cinzas, P, potássio (K), magnésio (Mg), Ca, sódio (Na), fitato e fitase.

[0457] O peso corporal e a ingestão de ração (FI) foram medidos nos dias 1, 21 e 42 em uma base por galinheiro e usados para calcular o peso corporal, o ganho de peso médio diário (ADG), a ingestão média diária de ração (ADFI) e a taxa de conversão alimentar corrigida para mortalidade (FCR). A mortalidade foi verificada e registrada diariamente.

[0458] Nos dias 21 e 42, 4 aves (2 machos, duas fêmeas, sexo determinado no ponto de amostragem) e 6 aves (3 machos e 3 fêmeas), respectivamente, foram selecionadas aleatoriamente por galinheiro, mortas por gás CO2 e suas tíbias esquerdas coletadas e agrupadas (por galinheiro) para a determinação de cinza de tíbia desengordurada. O digesto ileal foi coletado de aves sacrificadas no dia 21, agrupado por galinheiro e congelado em uma máquina de desidratação Labconco FreeZone 12+ (Labconco, Kansas City, Missouri). Amostras de ração e digesto secas foram analisadas quanto ao teor de P e Ca para calcular a digestibilidade dos nutrientes com o uso de dióxido de titânio como marcador inerte.

[0459] Análise química: As amostras foram analisadas em duplicado para todas as análises. Os nutrientes da ração e do digesto ileal foram analisados de acordo com os seguintes métodos: proteína bruta, NEN-EN-ISO 16634 [NEN-ISO 6492, en. Animal feedstuffs – Determination of fat content. International Organization for Standardization, Switzerland; 1999]; gordura bruta, NEN-ISO 6492 [NEN-ISO 6865, en. Animal feeding stuffs -- Determination of crude fibre content -- Method with intermediate filtration. International Organization for Standardization, Switzerland; 2000]; fibra bruta, NEN-ISO 6865 [NEN-EN-ISO 16634, en. Animal Feeding Stuff – Determination of Nitrogen Content using Dumas combustion. International Organization for Standardization, Switzerland; 2008]. Fósforo, Ca, magnésio, potássio e sódio na ração e P e Ca no digesto foram analisados por digestão de micro-ondas e Espectrometria de Emissão Óptica por Plasma Acoplado Indutivamente (OES) de acordo com o método AOAC

2011.14 [AOAC International. Method 2011.14: Calcium, Copper, Iron, Magnesium, Manganese, Potassium, Phosphorus, Sodium, and Zinc in Fortified Food Products. Official Methods of Analysis of AOAC International; 2011]. As concentrações de fósforo no fitato (PP [hexa- fosfato de inositol (IP6)]) nas dietas e as atividades de fitase nas dietas foram determinadas pelos Laboratórios DuPont (Brabrand, Dinamarca), com o uso dos métodos descritos por Yu et al. [Yu, S, Cowieson, A, Gilbert, C, Plumstead, P, Dalsgaard, S. Interactions of phytate and myo- inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. J Anim Sci 2012;90:1824-1832]. Uma unidade de fitase (FTU) foi definida como a quantidade de enzima que liberou 1 µmol de ortofosfato inorgânico de um substrato de fitato de sódio por minuto em pH 5,5 e 37ºC [AOAC International. Method

2000.12: Phytase activity in feed: Colorimetric enzymatic method. Official Methods of Analysis of AOAC International. 17a edição; Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA; 2000].

[0460] A cinza da tíbia foi medida com o uso do método descrito abaixo: a fíbula, o músculo e o tecido conjuntivo foram removidos e os ossos secos a 100°C por pelo menos 12 h antes de desengordurar em éter dietílico por 7-8 h e secar ao ar. As tíbias desengorduradas foram secas novamente a 100°C por pelo menos 12 horas e depois incineradas em cadinhos de cerâmica a 600°C por 24 horas.

[0461] Cálculos: A razão de conversão alimentar (FCR) foi calculada com base no BWG total e na ingestão total de ração (corrigida para peso de mortalidade) de d 0-21, d 22-42 e d 0-42. Tanto o ADG quanto a ADFI foram calculados pela correção da mortalidade, por exemplo, a ADFI foi calculada pela ingestão total de ração em cada fase e dividida pelo número total de dias de alimentação. O ADG corrigido para mortalidade foi calculado a partir do ADFI corrigido para mortalidade dividido pelo FCR corrigido para mortalidade.

[0462] A digestibilidade ileal aparente (AID,%) de P e Ca foi calculada com base na seguinte fórmula, com o uso de dióxido de titânio como marcador inerte: AID = 1 – [(Tid/Tii) × (Ni/ Nd)]

[0463] Em que Tid é a concentração de titânio na dieta, Tii é a concentração de titânio no digesto ileal, Ni é a concentração de nutrientes (P ou Ca) no digesto ileal e Nd é a concentração de nutrientes na dieta. Todos os valores analisados foram expressos em gramas por quilograma de matéria seca.

[0464] Análise estatística: Os dados são relatados por galinheiro como unidade experimental. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) com o uso da plataforma Fit Model do JMP 14.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2019) para investigar o efeito dos tratamentos em um projeto aleatorizado. A separação de médias foi alcançada com o uso do teste de Diferença Significativa Honesta de Tukey. As respostas linear e quadrática com o aumento da dose de fitase foram analisadas com o uso de polinômios ortogonais. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para P <0,05; P <0,10 foi considerado uma tendência. Resultados

[0465] Análise da dieta: As atividades de fitase analisadas nas dietas finais confirmaram os níveis de dose alvo (Tabela 13). Os valores analisados de CP nas dietas basais (controle) estavam dentro de 10% dos valores calculados. As reduções obtidas no teor de P nas dietas NC se enquadraram bem às reduções desejadas; com base nos valores analisados, o teor de P total foi reduzido em 1,8 g/kg na dieta inicial e 2,3 g/kg nas dietas finais.

Tabela 13: Valores nutricionais analisados (g/kg) das dietas finais, por fase Inicial (0-21 d) Finalização (22-42 d) Ingrediente PC NC* PC NC* Matéria seca 886 883 889 886 Proteína bruta 221 228 186 184 Gordura bruta 59,8 54,3 62,2 62,0 Cinza 58,8 44,4 51,4 43,6 Fitato 8,32 8,38 8,70 9,09 Fitato-P 2,35 2,4 2,45 2,56 Fósforo 7,1 5,3 7,0 4,8 Potássio 10,1 10,1 9,6 9,0 Magnésio 1,9 1,9 1,8 1,7 Cálcio 10,3 8,6 10,4 8,0 *Os valores são os valores médios para NC e tratamentos NC+fitase como um lote de dieta basal NC foram produzidos.

[0466] A atividade de fitase analisada (FTU/kg) foi 43, 24, 282, 480, 882 na fase inicial e <50, <50, 253, 594, 1110 na fase de finalização para PC, NC, NC+250 FTU/kg, NC+500 FTU/kg e NC+1000 FTU/kg, respectivamente. A atividade da fitase nas dietas foi analisada por DuPont Feed Technical Service, Brabrand, Dinamarca

[0467] Digestibilidade de nutrientes: A AID de P não foi significativamente reduzida em aves alimentadas com as dietas NC vs. PC (Tabela 14). A um nível de dose de 500 FTU/kg ou acima, a suplementação de fitase aumentou AID de P vs NC e em 1000 FTU/kg, a fitase melhorou a AID de P em comparação com PC (P <0,05). Expresso em uma base de g/kg, o P digestível ileal nas dietas foi melhorado pela fitase quando dosado em 500 FTU/kg ou superior (+ 1,39 g/kg vs. NC em 500 FTU/kg e + 1,76 g/kg vs. NC em 1000 FTU/kg;

P <0,05). Nesses níveis de dose, o P digestível expresso como g/kg na dieta foi equivalente ao da dieta de PC. A AID de Ca não foi afetada pelo tratamento dietético, mas tendeu a aumentar linearmente (P <0,10) com o aumento da dose de fitase de 0 a 1000 FTU/kg.

Tabela 14: Efeito da fitase experimental na digestibilidade ileal aparente (AID) de P e Ca em frangos de corte e P digestível nas dietas em g/kg, no dia 21 Parâmetros medidos PC NC NC + Fitase (FTU/kg)1 SEM valor de

P 250 500 1,000 AID P (%)2 50,1bc 39,0c 57,7abc 65,2ab 72,2a 5,77 <0,001 AID Ca (%)2 40,2 39,2 47,0 51,1 55,3 4,93 0,240 P digestível (g/kg de dieta)2 3,55a 2,06b 3,06ab 3,46a 3,82a 0,3 <0,001 1 Uma 6-fitase bacteriana biossintética produzida pelo microrganismo geneticamente modificado Trichoderma reesei (T. reesei). 2 O aumento da dose de fitase de 0 (NC) para 1000 FTU/kg resultou em aumento linear e quadrático na AID P (P < 0,05) e aumento linear quase significativo no Ca (P = 0,052) a, b, c, Médias dos mínimos quadrados dentro de uma linha com diferentes letras sobrescritas diferem (P < 0,05, teste de Tukey).

[0468] Cinza da tíbia: O efeito do tratamento dietético na cinza da tíbia foi altamente significativo (P < 0,001) e é apresentado na Tabela

15. Em comparação com PC, as aves alimentadas com a dieta de NC exibiram redução de cinza da tíbia no dia 21 e no dia 42 (-6,7 e -4,1 pontos percentuais, respectivamente; P < 0,05). Em comparação com a NC, a suplementação com fitase melhorou a cinza da tíbia amostrada no dia 21 e no dia 42 em todos os três níveis de dose (P < 0,05); a cinza da tíbia em todos os tratamentos com fitase foi equivalente ao PC.

Tabela 15: Efeito da fitase experimental no desempenho de crescimento e teor de cinza da tíbia em frangos de corte, por fase1,2

PC NC NC + Fitase (FTU/kg)3 SEM valor de P

250 500 1,000

Inicial (d 0–21)

BW d 21 (kg/ave) 0,90a 0,71b 0,86a 0,88a 0,89a 0,010 <0,001

ADFI (g/d) 56,6a 46,3b 54,1a 54,3a 55,4a 0,764 <0,001

ADG (g/d) 40,6ab 31,7c 39,0b 39,5ab 40,8a 0,431 <0,001

FCR (g/g) 1,396ab 1,460a 1,390b 1,377b 1,358b 0,016 <0,01

Cinza da tíbia d 21 (% 50,4a 43,7b 49,3a 49,9a 50,9a 0,463 <0,001 DM)

Finalização (d 22–42)

BW d 42 (kg/ave) 2,70a 1,85b 2,64a 2,70a 2,74a 0,031 <0,001

ADFI (g/d) 157,7a 121,5b 154,4a 156,1a 156,0a 1,89 <0,001

ADG (g/d) 86,9a 58,2b 84,7a 87,2a 87,8a 1,135 <0,001

FCR (g/g) 1,815b 2,093a 1,823b 1,792b 1,779b 0,029 <0,001

Cinza da tíbia d 42 (% 46,4a 42,3b 46,5a 46,5a 47,0a 0,70 <0,001 DM)

Geral (d 0–42)

ADFI (g/d) 118,3a 92,9b 115,1a 116,4a 116,7a 1,186 <0,001

ADG (g/d) 71,3ab 50,6c 69,1b 70,9ab 71,8a 0,648 <0,001

FCR (g/g) 1,661b 1,835a 1,666b 1,643b 1,626b 0,019 <0,001 1 Todos os dados de desempenho são corrigidos para mortalidade 2 O aumento da dose de fitase de 0 (NC) para 1000 FTU/kg resultou em aumento linear e quadrático em todos os parâmetros medidos (P < 0,05) 3 Uma 6-fitase bacteriana biossintética produzida pelo microrganismo geneticamente modificado Trichoderma reesei (T. reesei). a, b, c, Médias dos mínimos quadrados dentro de uma linha com diferentes letras sobrescritas diferem (P < 0,05, teste de Tukey).

[0469] Desempenho de Ingestão de Ração e Crescimento: O efeito do tratamento dietético na ingestão de ração, peso corporal e conversão alimentar também é apresentado na Tabela 15. O tratamento afetou todas as medidas de resposta durante todas as fases de crescimento (inicial, finalização, geral; P < 0,01 em todos os casos). Nenhuma diferença significativa foi observada para mortalidade (dados não mostrados).

[0470] Em comparação com PC, as aves alimentadas com a dieta de NC exibiram BW reduzido no dia 21 e no dia 42, aumento da FCR durante a fase de finalização e no geral, e ADG e ADFI reduzidos durante todas as fases (P < 0,05).

[0471] A suplementação com a fitase experimental, em qualquer nível de dose, permitiu que as aves superassem a deficiência de P nas dietas NC com ADFI, BW e ADG melhorados e FCR durante todas as fases (P < 0,05) de forma que os mesmos fossem equivalentes com o PC durante todas as fases, independentemente da dose de fitase. Um nível de dose de 1000 FTU/kg da fitase experimental produziu aves com um BW médio em d 42 de 2,74 kg e um FCR geral médio de 1,626 (vs. 1,661 em PC).

[0472] Em conclusão, este estudo demonstrou que a fitase variante experimental foi eficaz na manutenção do desempenho de crescimento, cinza da tíbia e digestibilidade do P ileal equivalente a uma dieta nutricionalmente adequada, quando adicionada a dietas formuladas com redução de 1,8 a 1,9 g/kg no P inorgânico de MCP e administrada em níveis de dose entre 250 e 1000 FTU/kg. Os efeitos benéficos foram maiores com 1000 FTU/kg. O valor de substituição de fósforo do fosfato monocálcico foi estimado em 1,64 e 2,07 gramas por quilograma de dieta, respectivamente a 500 e 1000 FTU/kg (igual a 1,39 e 1,76 g/kg de P digestível de MCP), com base no aumento observado no fósforo digestível.

EXEMPLO 9 Avaliação in vivo de enzimas fitase em suínos

[0473] O objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia da suplementação dietética com uma 6-fitase bacteriana biossintética experimental representativa em leitões desmamados alimentados com uma dieta à base de milho e farelo de soja sem adição de fosfato inorgânico, em comparação com a adição de P inorgânico de MCP, nas cinzas de ossos e mineralização e no desempenho do crescimento. Uma fitase comercial existente foi incluída no estudo para fins comparativos. O segundo objetivo foi determinar o valor de equivalência de P digestível da fitase no ambiente testado. Materiais e Métodos

[0474] Dietas experimentais e de controle: Uma dieta de controle positivo (PC) à base de milho e SBM foi formulada para atender às necessidades nutricionais de leitões com peso de 10 a 25 kg (NRC, 2012), contendo 2,9 g/kg de P digestível e 7,0 g/kg de Ca (Tabela 16). Uma dieta de controle negativo (NC) foi formulada sem fosfato inorgânico (1,1 g/kg de P digestível) e reduzida em Ca (5,0 g/kg). O NC foi testado como uma dieta independente e também quando suplementado com 500 ou 1000 FTU/kg de dieta de uma fitase comercial, 250, 500 ou 1000 FTU/kg de uma fitase experimental, ou com MCP adicionado em 3 níveis (+0,7, +1,4 e +1,8g/kg de P digestível de MCP), o que equivale a um teor de P digestível de 1,8, 2,5 e 2,9 g/kg (este último constituindo a dieta de PC). Isso produziu um total de 9 tratamentos dietéticos. Calcário adicional foi adicionado às dietas suplementadas com MCP a fim de manter a razão entre Ca e P na faixa de 1,2 a 1,3 (Tabela 16). A fitase comercial foi uma 6-fitase microbiana de Buttiauxella sp. expressa em Trichoderma reesei (Axtra® PHY, DuPont Nutrition and Biosciences), descrito no presente documento como PhyB. A fitase experimental foi uma fitase bacteriana biossintética,

descrita no presente documento como PhyX. A PhyX é produzida por fermentação com uma cepa de produção de fungo (Trichoderma reesei) que expressa uma variante biossintética de um gene consenso da fitase bacteriana montado por meio de reconstrução ancestral com viés de sequência para Buttiauxella sp. (DuPont Nutrition and Biosciences). As dietas foram fornecidas aos leitões ad libitum na forma de farelo e a água estava disponível livremente, Tabela 16: Composição de ingrediente e nutriente (g/kg, com base na alimentação) do controle negativo (NC) e NC com aumento do nível de P digestível das dietas de inclusão de MCP fornecidas a leitões desmamados (42 a 70 dias de idade).

NC NC + P digestível de MCP (g/kg) 0,7 1,4 1,8 (PC) Ingrediente (g/kg) Milho 400 400 400 400 Farinha de soja (48% CP) 293,35 292,85 292,65 292,65 Arroz 150 150 150 150 Farelo de arroz 50,0 50,0 50,0 50,0 Polpa de beterraba sacarina 30,0 30,0 30,0 30,0 Gordura animal 36,7 36,7 36,7 36,7 Fosfato monocálcico (MCP) - 3,30 6,70 8,80 Carbonato de cálcio 6,70 7,40 8,20 8,60 Sal 4,10 4,10 4,10 4,10 L-lisina HCl 4,00 4,00 4,00 4,00 DL-metionina 1,70 1,70 1,70 1,70 L-treonina 1,50 1,50 1,50 1,50 L-triptofano 0,50 0,50 0,50 0,50 Noxyfeed1 0,20 0,20 0,20 0,20 Dióxido de titânio 5,00 5,00 5,00 5,00 Carga (terra diatomácea) 10,0 6,50 2,50 - Pré-mistura de vitaminas e 6,00 6,00 6,00 6,00 minerais2

Teste de produto com 0,25 0,25 0,25 0,25 carreador3

Nutrientes calculados (g/kg)

Energia metabolizável (ME), 3,35 3,35 3,35 3,35 (Mcal/kg)

Energia líquida (NE) (Mcal/kg) 2,52 2,52 2,52 2,52

Proteína bruta 194 194 194 194

Extrato etéreo 63,3 63,3 63,2 63,2

Cálcio total 5,00 5,75 6,53 7,00

Fósforo total 4,00 4,76 5,53 6,00 fósforo dig. 1,06 1,76 2,46 2,90

Fósforo não fitato 1,28 2,00 2,80 3,30

Lisina Total 13,4 13,4 13,4 13,4

Lisina SID4 12,3 12,3 12,3 12,3

Treonina SID 7,70 7,70 7,70 7,70

Metionina SID 4,43 4,43 4,43 4,43

Triptofano SID 2,42 2,42 2,42 2,42 1 Antioxidante, contendo BHT, Galato de propila e Ácido cítrico. 2 Fornecido, por quilograma de dieta: Ferro (de FeSO4•H2O), 120 mg; Iodo (de Ca(IO3)2) 0,75 mg; Cobalto (de 2CoCO3•3Co(OH)2•H2O), 0,6 mg; Cobre (de CuSO4•5H2O), 6 mg; Manganês (de MnO) 60 mg; Zinco (de ZnO) 100 mg; Selênio (E8) (de Na2SeO3) 0,37 mg; Vitamina A, 10000 UI; Vitamina D3, 2000 UI; Vitamina E (alfa tocoferol), 25 mg; Vitamina B1, 1,5 mg; Vitamina B2, 3,5 mg; Vitamina B6, 2,4 mg; Vitamina B12, 20 µg; Vitamina K3, 1,5 mg; Pantotenato de cálcio 14 mg; Ácido nicotínico, 20 mg; Ácido fólico, 0,5 mg; Biotina, 50 µg. 3 O produto de teste é misturado com carreador de trigo para obter a dose desejada, o tratamento de controle recebeu apenas carreador sem produto de teste 4 SID = digestível ileal padronizado.

[0475] Porcos, alojamento e projeto experimental: Os procedimentos experimentais estavam em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE e as diretrizes espanholas para o cuidado e uso de animais em pesquisa (BOE número 252, Real Decreto 2010/2005). Um total de 162 leitões Pietrain cruzados x (Large White x Landrace), de 21 dias de idade, de sexos mistos (50% machos, 50% fêmeas) foram obtidos no desmame (peso corporal inicial (BW) 6 ± 1 kg) e alimentados com uma dieta de adaptação pré-inicial comum até 42 dias de idade (~10-11 kg de BW). Os leitões foram então bloqueados com base no peso corporal e sexo e alocados em pocilgas, com 2 porcos/pocilgas e 9 pocilgas/tratamento), em um projeto de blocos completamente aleatorizado. As dietas de teste foram administradas a porcos de 42 dias até 70 dias de idade. As pocilgas foram agrupadas em um biotério com ambiente controlado, em que a temperatura foi inicialmente mantida a 30 ºC e posteriormente reduzida em 1°C por semana.

[0476] Amostragem e medições: Subamostras representativas de todas as dietas foram analisadas quanto à matéria seca (DM), matéria orgânica (OM), proteína bruta (CP), extrato etéreo (EE), cinzas, minerais, fitato e fitase.

[0477] Os porcos foram pesados individualmente antes do início do experimento e novamente nos dias 14 e 28 para calcular o ganho médio diário (ADG). O desaparecimento da ração foi avaliado no dia 14 e no dia 28 e usado para calcular a ingestão média diária de ração (ADFI). A taxa de conversão alimentar (FCR) foi calculada a partir de ADFI e ADG.

[0478] No dia 28 do ensaio, um leitão por pocilga foi sacrificado por overdose intravenosa de pentobarbital sódico e os pés direitos das patas dianteiras e traseiras foram excisados a fim de determinar as cinzas ósseas e a mineralização dos metacarpos/metatarsos (Ca e P). Os pés foram armazenados a -20°C até a análise.

[0479] Análise Química: Todas as amostras foram analisadas em duplicata. Matéria seca, cinza, CP e extrato etéreo na ração foram analisados de acordo com os métodos AOAC (2000a) (92509, 942.05,

968.06 e 920.39, respectivamente). O teor de nitrogênio foi determinado pelo procedimento de Dumas, por meio do analisador Nitrogen FP-528 (Leco corp., St Joseph, Mo, EUA). A matéria orgânica (OM) foi calculada como a diferença entre a DM e as cinzas. A análise da atividade da fitase exógena em alimentos foi realizada de acordo com Engelen et al (1994). Uma unidade de fitase (FTU) foi definida como a quantidade de fitase que liberou 1 mmol de fosfato inorgânico por minuto de 0,0051 mol/l de fitato de sódio a um pH padrão de 5,5 e temperatura de 37°C (AOAC, 2000b).

[0480] A cinza óssea foi determinada nos metacarpos III/IV e nos metatarsos III/IV do pé dianteiro e pé traseiro direitos, respectivamente. Após a extração, os ossos foram usados pela primeira vez para caracterizar sua integridade em um teste mecânico de 3 pontos com o uso de um sistema de teste Instron (Norwood, MA, US) modelo 2519- 106 equipado com uma célula de carga de 2 kN. Parâmetros biomecânicos como rigidez extrínseca, força máxima, deslocamento e trabalho até a falha foram usados para caracterizar a integridade dos ossos (Turner, 2006). Em seguida, os ossos foram utilizados para determinar seu teor de DM em um forno a 103°C por 4 horas antes de serem queimados em um forno secador por 3 horas a 200°C antes de sua introdução em uma mufla a 550°C por 72 horas e determinar seu teor de cinzas. Cinzas de ossos de metacarpos foram então trituradas com o uso de pilão e almofariz e enviadas para o laboratório SCT (Universidade de Lérida, Espanha) para determinação de minerais (Ca, P, Mg) por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS; Agilent Technologies modelo 7700X) após digestão com ácido sulfúrico. A composição mineral (Ti, Ca, P, Mg, Fe,

Zn e Cu) das rações também foi analisada em amostras de cinzas por ICP-MS no laboratório SCT (Pacquette e Thompson, 2018).

[0481] Análise estatística: Os dados tiveram como base a pocilga como unidade experimental, exceto para cinzas e resistência óssea, que tiveram como base o porco como unidade experimental. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) com o uso da plataforma Fit Model do JMP 14.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2019) para investigar o efeito dos tratamentos em um projeto aleatorizado. A separação de médias foi alcançada com o uso do teste de Diferença Significativa Honesta de Tukey. Além disso, uma análise ANOVA de duas vias foi realizada com fatores 'fitase' (PhyG vs PhyB) e dose (500 e 1000) para comparar duas fitases em dois níveis de dose de 500 e 1000 FTU/kg. As respostas linear e quadrática com o aumento da dose de fitase foram analisadas com o uso de polinômios ortogonais. Além disso, regressão linear foi realizada com aumento de P digestível com MCP adicionado (por exemplo, NC, NC+0,7, NC+1,4 e NC+1,8g/kg de P digestível de MCP) para cinzas de ossos metacarpos, ADG e FCR. A equivalência de P digestível foi calculada aplicando-se os valores Y a uma dada dose de fitase e calculados os valores X correspondentes. As diferenças foram consideradas significativas para P <0,05; P <0,10 foi considerado uma tendência. Resultados

[0482] Análise da dieta: Os valores analisados de nutrientes nas dietas são apresentados na Tabela 17. As atividades da fitase nas dietas de NC foram  50 FTU/kg, indicando a ausência de contaminação cruzada com fitase. As atividades nas dietas suplementadas com fitase estiveram dentro de 10% dos valores-alvo, exceto para o tratamento NC+PhyX 250 e NC+PhyX 500 em que as atividades foram, respectivamente, -20 e +27% vs. dose alvo. O teor de P analisado das dietas de NC contendo P adicionado de MCP foi próximo aos valores esperados com base nos níveis pretendidos de adição de MCP. Tabela 17: Valores nutricionais analisados das dietas experimentais 1 Uma 6-fitase bacteriana biossintética representativa. 2 Uma 6-fitase microbiana de Buttiauxella sp. expressa em Trichoderma reesei (Axtra® PHY, DuPont Animal Nutrition). 3 Energia metabolizável e energia líquida calculada como 0,79 e 0,58 da energia bruta e digestível, respectivamente, de acordo com as tabelas do AFZ-INRA (Sauvant et al., 2002). 4 A atividade da fitase nas dietas foi analisada por DuPont Laboratories, Brabrand, Dinamarca.

[0483] Minerais nas cinzas de osso e resistência óssea: Aos 70 dias de idade (dia 28 do experimento), a cinza de ossos metacarpos, o teor de Ca e P foram reduzidos em leitões alimentados com a dieta NC basal versus PC (P < 0,05; Tabela 18). A suplementação com ambas as fitases e em todos os níveis de dosagem melhorou a cinza de osso e o teor de P ósseo (%) em comparação com NC (P < 0,05). A 500 e 1000 FTU/kg, a cinza de ossos metacarpos e o teor de P ósseo foram equivalentes ao PC. O aumento da dose de PhyX de 0 (NC) para 1000 FTU/kg resultou em aumentos lineares e quadráticos na cinza de ossos metacarpos no dia 28 (P < 0,05). O teor de Ca nos ossos metacarpos não foi afetado pela suplementação de fitase. Uma resposta linear foi observada para a cinza de ossos metacarpos e o teor de P com o aumento dos níveis de MCP-P nas dietas (P < 0,05). O teor de cinzas de metatarsos mostrou a mesma resposta que os resultados de cinzas de ossos metacarpos. Tabela 18: Efeito do aumento da dose de duas fitases ou do teor de P inorgânico sobre a mineralização e a cinza dos metatarsos e metacarpos (% com base na matéria seca) e a resistência dos ossos metacarpos em leitões aos 70 dias de idade 1 Uma 6-fitase bacteriana biossintética experimental 2 Uma 6-fitase microbiana de Buttiauxella sp. expressa em Trichoderma reesei (Axtra® PHY, DuPont Nutrition and Biosciences).

[0484] A influência dos tratamentos dietéticos nos parâmetros biomecânicos do osso metacarpo é apresentada na Tabela 18. A força final (N) foi menor no NC (P < 0,05) em comparação com todos os outros tratamentos. Todos os tratamentos com fitase em todos os níveis de dosagem melhoraram a força final em comparação com NC. Ambas as fitases a 1000 FTU/kg mantiveram a mesma força final vs. PC. Ambas as fitases a 500 FTU e 1000 FTU melhoraram a Rigidez (mPa) vs. NC e a 1000 FTU/kg mantiveram a rigidez (mPa) e trabalho até a falha (J) em comparação com o PC contendo um adicional de 1,8 g de P digestível de MCP por kg de dieta. Na comparação de dois níveis de dose em duas fitases, a fitase a 1000 FTU/kg mostrou maior cinza de osso, força final (N), rigidez (mPa) e trabalho até a falha (J) em comparação com 500 FTU/kg (P < 0,05). Nenhuma interação foi encontrada entre a fonte de fitase e os níveis de dose.

[0485] Desempenho de Crescimento: O efeito do tratamento dietético no desempenho do crescimento é apresentado na Tabela 19. Exceto para ADFI durante d 0-14 (tendência, P = 0,08), todas as medidas de resposta de desempenho de crescimento foram prejudicadas (ADG e ADFI reduzidos; FCR aumentado) em leitões alimentados com a dieta NC em comparação com a dieta PC (P < 0,05).

[0486] Durante a primeira fase do experimento (d 0-14), tanto PhyX quanto PhyB a 1000 FTU/kg produziram um maior ADG e um FCR reduzido (P < 0,05) versus NC, e foram equivalentes à dieta PC que continha 1,8 g/kg adicionado de P de MCP.

[0487] Durante a segunda fase do experimento (d 15-28), PhyX em 250 FTU/kg ou mais melhorou ADG versus NC, e em 500 FTU/kg ou superior FCR melhorou versus NC (P < 0,05). PhyB também melhorou ADG e FCR vs. NC em ambos os níveis de dose (P < 0,05). A 500 FTU/kg ou mais, ambas as fitases produziram valores de ADG e FCR equivalentes a PC que continha 1,8 g/kg de P adicionado de MCP.

Tabela 19: Efeito do aumento da dose de duas fitases ou do teor de P inorgânico no desempenho de leitões desmamados (42 a 70 dias de idade).

1 Uma 6-fitase bacteriana biossintética representativa. 2 Uma 6-fitase de Buttiauxella sp. expressa em Trichoderma reesei (Axtra® PHY, DuPont Nutrition and Biosciences). 3 O aumento da dose de PhyX de 0 (NC) para 1000 FTU/kg resultou em aumentos lineares e quadráticos em ADG e FCR para a fase geral (d 0- 28) (P < 0,05). a,b , Médias dos mínimos quadrados dentro de uma linha com diferentes letras sobrescritas diferem (P < 0,05, teste de Tukey).

[0488] Durante a fase geral (d 0-28), ambas as fitases em todos os níveis de dose melhoraram ADG versus NC, e ambas as fitases melhoraram FCR versus NC em ou acima de 500 FTU/kg (P < 0,05). Para qualquer fitase, a 500 FTU/kg ou superior, ADG e FCR foram equivalentes a PC que continha 1,8 g/kg de P adicionado de MCP. Além disso, o aumento da dose de PhyX de 0 para 1000 FTU/kg resultou em um aumento linear e quadrático no ADG e redução no FCR durante a fase geral (P < 0,05). Uma resposta linear foi observada para ADG e FCR com o aumento dos níveis de MCP-P nas dietas (P < 0,05). Na comparação de dois níveis de dose em duas fitases, o FCR foi inferior em 1000 FTU/kg vs 500 FTU/kg (1,59 vs 1,66, P < 0,05). Uma tendência de ADG maior foi observada a 1000 FTU/kg vs 500 FTU/kg (635 vs 590, P = 0,08), nenhuma diferença foi encontrada na ingestão de ração (dados não mostrados). Nenhuma interação foi encontrada entre a fonte de fitase e os níveis de dose.

[0489] Equivalência de P inorgânico: Os valores de equivalência de P digestível da dieta (g/kg de dieta) de PhyX e PhyB foram calculados com base na cinza de osso, ADG e FCR como parâmetros de resposta, com o uso das respostas observadas ao aumento de P digestível de MCP como referência. As respostas ao aumento do P digestível de MCP foram lineares e positivas para todas as três medidas de resposta (P < 0,001; Tabela 20). Independentemente do parâmetro de resposta usado, os valores calculados de equivalência de P digestível aumentaram com o aumento da dose de fitase e foram mais altos com 1000 FTU/kg (Tabela 20). Nesse nível de dose, os valores de equivalência de P digestível foram maiores para PhyX do que PhyB (média dos parâmetros de resposta 1,83 g/kg vs. 1,66 g/kg, respectivamente) e foram maiores para ADG e menores para cinzas de ossos como o parâmetro de resposta. Tabela 20: Análise de regressão linear em cinza de osso, ADG, FCR em resposta ao aumento da digestibilidade de MCP1,2 a b R2 valor de P Cinza de ossos metacarpos 25,0 4,27 0,99 <0,001 ADG 465,9 83,5 0,97 <0,001 FCR 1,9 -0,17 0,98 <0,001 1 A regressão linear foi realizada com aumento de P digestível adicionado de MCP (por exemplo, NC, NC+0,7, NC+1,4 e NC+1,8g/kg de P digestível de MCP) contra cinza de ossos metacarpos, ADG e FCR, com uma equação de Y = a+bX, em que Y são os parâmetros de resposta e X é o aumento adicionado de P digestível de MCP.

R2 tem como base a regressão das médias de tratamento. A equivalência de P digestível foi calculada aplicando-se os valores dos parâmetros de resposta (Y, por exemplo, cinza de osso) a uma determinada dose de fitase e calculados os valores de substituição de MCP-P (X) correspondentes.

[0490] Em conclusão, este estudo mostrou que uma fitase experimental (PhyX) foi eficaz na manutenção de cinza de ossos metacarpos de leitões, teor de P ósseo e desempenho de crescimento equivalente a uma dieta nutricionalmente adequada (contendo 2,9 g/kg de P digestível, com 1,8 g/kg de P digestível de MCP), quando adicionado a uma dieta à base de milho-farelo de soja sem adição de P inorgânico, na dose de 500 ou 1000 FTU/kg. As respostas foram maiores em um nível de dose de 1000 FTU/kg, no qual foi estimado que a fitase experimental poderia substituir um P digestível estimado de 1,83 g/kg na dieta de leitões desmamados alimentados com dietas à base de milho-SBM contendo arroz e farelo de arroz. EXEMPLO 10 Projeto e avaliação de polipeptídeos quiméricos do clado de fitase de Tm alta

[0491] Uma série de polipeptídeos quiméricos foi geneticamente modificada para avaliar a contribuição das regiões de troca/substituição no terminal N e ou no terminal C de polipeptídeos do clado Tm-fitase Alta descritos no Exemplo 4 (PHY-13594, PHY-13789 e PHY- 13885). Para o propósito desse estudo, o terminal N é definido nos resíduos 1- 13 de acordo com SEQ ID Nº:1, a região de núcleo é definida como resíduos 14-325 de acordo com SEQ ID Nº:1, e o terminal C é definido como os resíduos 326 ao final de cada polipeptídeo descrito no Exemplo 7, de acordo com SEQ ID Nº:1. As proteínas foram geradas com o uso de métodos descritos no Exemplo 1, e amostras de sobrenadantes de cultura clarificados foram usadas para medir termoestabilidade por DSC e atividade de fitase específica em pH 3,5 e pH 5,5 com o uso de métodos descritos no Exemplo 3. O efeito da criação de moléculas quiméricas contendo as regiões de terminal N das fitases HAP encontradas em Buttiauxella sp (Buttiauxella NCIMB 41248, SEQ ID Nº:88), C. brakii (Citrobacter braakii AAS45884, SEQ ID Nº:89), e E. piscicida (Edwardsiella tarda YP007628727, Edwardsiella piscicida WP_015461291.1, SEQ ID Nº:90), com o uso de fitases PHY-13594, PHY-13789 e PHY-13885 para comparação.

Da mesma forma, o efeito da criação de moléculas quiméricas contendo as regiões de terminais C das fitases HAP encontradas em H. alvei (Hafnia alvei WO2010034835- 0002, SEQ ID Nº:94), Y. mollaretii (Yersinia mollaretii WP032813045, SEQ ID Nº:95 e Buttiauxella sp (Buttiauxella NCIMB 41248, SEQ ID Nº:96), com o uso de fitases PHY-13594, PHY-13789 e PHY-13885 para comparação.

As regiões de núcleo de fitase usadas são as seguintes: SEQ ID Nº: 100 para PHY-13594, SEQ ID Nº: 101 para PHY-13789 e SEQ ID Nº: 102 para PHY-13885. A Tabela 21 descreve os vários construtos quiméricos testados e fornece resultados para termoestabilidade, atividade específica em pH 3,5 e a razão entre atividade específica em pH 3,5 versus pH 5,5. Como mostrado na Tabela 21, modificações no terminal N ou terminal C das três fitases de Tm alta avaliadas resultam em enzimas com termoestabilidade muito semelhante, indicando que os determinantes estruturais para manter a termoestabilidade dessas fitases de alta Tm residem dentro da sequência de aminoácidos das regiões de núcleo.

Todos os polipeptídeos do clado Tm-fitase alta descritos na Tabela 21 também exibem mais do que 100 FTU/mg quando testados com o uso do ensaio descrito no Exemplo 2.

Tabela 21. Resultados de termoestabilidade medidos por DSC para várias enzimas fitase quiméricas.

elemento Tm por Atividade Razão de Nome da Núcleo de quimérico terminais N terminais C DSC específica em Atividade amostra Fitase modificado (°C) pH 3,5 (µmoles específica em de P/mg/min) pH 3,5 vs pH 5,5 PHY-17434 terminais N Buttiauxella sp PHY-13594 PHY-13594 91 ND ND PHY-17230 terminais C PHY-13594 PHY-13594 H. alvei 94 436 1,2 PHY-17240 terminais C PHY-13594 PHY-13594 Y. mollaretii 95 567 1,3 PHY-13594 nenhuma PHY-13594 PHY-13594 PHY-13594 97 687 1,5 PHY-17041 terminais N Buttiauxella sp PHY-13789 PHY-13789 99 862 1,5 PHY-17050 terminais N C. brakii PHY-13789 PHY-13789 100 690 1,4 PHY-17202 terminais N E. piscicida PHY-13789 PHY-13789 100 771 1,7 PHY-17117 terminais C PHY-13789 PHY-13789 Hafnia 96 754 1,5 PHY-17032 terminais C PHY-13789 PHY-13789 Buttiauxella sp 97 419 1,1 PHY-17126 terminais C PHY-13789 PHY-13789 Y. mollaretii 98 645 1,4 PHY-13789 nenhuma PHY-13789 PHY-13789 PHY-13789 101 700 1,5 PHY-17059 terminais N Buttiauxella sp PHY-13885 PHY-13885 97 552 1,7 PHY-17068 terminais N C. brakii PHY-13885 PHY-13885 98 605 1,8 PHY-17174 terminais C PHY-13885 PHY-13885 Buttiauxella sp 95 448 1,6 PHY-17088 terminais C PHY-13885 PHY-13885 Y. mollaretii 96 436 1,5 PHY-13885 nenhuma PHY-13885 PHY-13885 PHY-13885 99 596 1,8

[0492] Para ilustração, a Figura 3 representa a estrutura tridimensional de uma fitase do clado de Tm alta representativa modelada com o uso da estrutura cristalina publicada para a 6-fitase Hafnia alvei intimamente relacionada (código de entrada PDB: 4ARO, fitase em complexo com sulfato de hexaquis de mio-inositol) e mostrada como um diagrama de fita. O modelo foi construído com o uso de MOE (v2013.08, Chemical Computing Group Inc.) e visualizado com o uso do programa de software PyMol (versão 1.8.4.2, Schrodinger, LLC). Em preto está representado o domínio de "núcleo" e em tons de cinza claro estão as regiões terminais N e C que foram substituídas/trocadas nos experimentos mostrados no presente documento.

Este modelo é consistente com o alinhamento de sequência múltipla com base na estrutura apresentado por Ariza et al (Degradation of Phytate by the 6- Phytase from Hafnia alvei: A Combined Structural and Solution Study, PLOS, 8:1-13) com o uso da estrutura cristalina da 6-fitase Hafnia alvei.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende atividade de fitase que tem pelo menos 82% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

2. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo tem uma pontuação de Modelo Oculto de Markov (HMM) de pelo menos cerca de 1200 conforme apresentado na Tabela 11 para os polipeptídeos do clado Tm- fitase alta.

3. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento de domínio de núcleo do mesmo, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 78% de identidade de sequência com as posições de aminoácidos 14-325 que correspondem à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº:1.

4. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou fragmento tem uma recuperação de peletização em alimentação de pelo menos cerca de 50% quando aplicado em aplicação líquida de misturador (MLA) a 95°C por 30 segundos, com o uso de um teste de recuperação de peletização em alimentação conforme descrito no Exemplo 5.

5. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou fragmento tem uma razão de recuperações de peletização em alimentação de pelo menos cerca de 0,7 quando aplicado em MLA a 95°C por 30 segundos em comparação à aplicação em MLA a 80°C por 30 segundos, com o uso de um teste de recuperação de peletização em alimentação padrão conforme descrito no Exemplo 5.

6. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou fragmento do mesmo compreende uma temperatura Tm de pelo menos cerca de 92,5°C com o uso das condições de ensaio de calorimetria de varredura diferencial descritas no Exemplo 3.

7. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou fragmento do mesmo compreende uma atividade específica de pelo menos cerca de 100 U/mg a pH 3,5 sob as condições de ensaio descritas no Exemplo 3.

8. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo de fitase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3, SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5, SEQ ID Nº:6, SEQ ID Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:9, SEQ ID Nº:10, SEQ ID Nº:11, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:13, SEQ ID Nº:14, SEQ ID Nº:16, SEQ ID Nº:17, SEQ ID Nº:18, SEQ ID Nº:19, SEQ ID Nº:20, SEQ ID Nº:21, SEQ ID Nº:22, SEQ ID Nº:23, SEQ ID Nº:24, SEQ ID Nº:25, SEQ ID Nº:26, SEQ ID Nº:27, SEQ ID Nº:28, SEQ ID Nº:29, SEQ ID Nº:30, SEQ ID Nº:31, SEQ ID Nº:32, SEQ ID:NO:33, SEQ ID Nº:34, SEQ ID Nº:35, SEQ ID Nº:36, SEQ ID Nº:37 e SEQ ID Nº:64.

9. Polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo de fitase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:67, SEQ ID Nº:68, SEQ ID Nº:69,

SEQ ID Nº:70, SEQ ID Nº:71, SEQ ID Nº:72, SEQ ID Nº:73, SEQ ID Nº:74, SEQ ID Nº:75, SEQ ID Nº:76, SEQ ID Nº:77, SEQ ID Nº:78, SEQ ID Nº:79, SEQ ID Nº:80, SEQ ID Nº:81, SEQ ID Nº:82, SEQ ID Nº:83, SEQ ID Nº:84, SEQ ID Nº:85, SEQ ID Nº:86 e SEQ ID Nº:87.

10. Ração para animais, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo pode ser usado (i) sozinho ou (ii) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana ou (iii) com pelo menos uma outra enzima ou (iv) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma outra enzima ou (v) qualquer um dentre (i), (ii), (iii) ou (iv) que compreende adicionalmente pelo menos um outro componente de aditivo de ração e, opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo está presente em uma quantidade de pelo menos cerca de 0,1 g/tonelada de ração.

11. Ração para animais, gênero alimentício, pré-mistura ou composição de aditivo de ração, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo pode ser usado (i) sozinho ou (ii) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana ou (iii) com pelo menos uma outra enzima ou (iv) em combinação com um microrganismo de alimentação direta que compreende pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma outra enzima ou (v) qualquer um dentre (i), (ii), (iii) ou

(iv) que compreende adicionalmente pelo menos um outro componente de aditivo de ração e, opcionalmente, o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo está presente em uma quantidade de pelo menos cerca de 0,1 g/tonelada de ração.

12. Construto recombinante caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

13. Construto recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência reguladora funcional em um hospedeiro de produção ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.

14. Construto recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de produção é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos, levedura, plantas e algas.

15. Construto recombinante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de produção é selecionado dentre o grupo que consiste em bactérias, fungos, levedura, plantas e algas.

16. Método para produzir um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, como definido na reivindicação 12; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo seja produzido.

17. Método para produzir um polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar um hospedeiro de produção com o construto recombinante, como definido na reivindicação 13; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) sob condições de modo que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo seja produzido.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo é opcionalmente recuperado do hospedeiro de produção.

19. Sobrenadante de cultura contendo fitase, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método, como definido na reivindicação 16 ou 17.

20. Sobrenadante de cultura contendo fitase caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método, como definido na reivindicação

18.

21. Sequência de polinucleotídeos, caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

22. Sequência de polinucleotídeos, caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo que tem atividade de fitase, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.

23. Composição enzimática seca para uso em ração para animais caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

24. Composição enzimática seca para uso em ração para animais caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.

25. Composição enzimática seca, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a composição enzimática seca é uma composição de aditivo de ração granulada.

26. Composição enzimática seca, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a composição enzimática seca é uma composição de aditivo de ração granulada.

27. Composição enzimática líquida para uso em ração para animais, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

28. Composição enzimática líquida para uso em ração para animais, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fitase geneticamente modificado ou fragmento do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.

29. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração para animais caracterizado pelo fato de que a fitase geneticamente modificada ou fragmento da mesma, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, é adicionado à ração para animais.

30. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração para animais, caracterizado pelo fato de que a fitase geneticamente modificada ou fragmento da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, é adicionada à ração para animais.

31. Método para melhorar o desempenho do animal em uma ou mais métricas, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fitase geneticamente modificado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou da ração para animais, gênero alimentício, pré- mistura ou composição de aditivo de ração, como definido na reivindicação 10 ou 11, ao animal.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais métricas são selecionadas dentre o grupo que consiste em eficiência de ração aumentada, ganho de peso aumentado, razão de conversão alimentar reduzida, digestibilidade melhorada de nutrientes ou energia em uma ração, retenção de nitrogênio melhorada, capacidade melhorada para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e resposta imunológica aumentada.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal monogástrico selecionado dentre o grupo que consiste em suínos e aves.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o suíno é selecionado dentre o grupo que consiste em leitões, porcos em crescimento e porcas.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a ave é selecionada dentre o grupo que consiste em perus, patos, frangos, frangos de corte, poedeiras, gansos, faisões, codorna e emas.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal ruminante selecionado dentre o grupo que consiste em gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervo, iaques, búfalo de água, veado, rena, caribu, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.