TW202033100A - 經改造之強健高Tm值的植酸酶類多肽及其片段 - Google Patents

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Abstract

本文描述了經改造之強健高Tm植酸酶類多肽及其片段。還描述了製備此類經改造之強健高Tm植酸酶進化枝及其片段之方法，以及此類經改造之強健高Tm植酸酶進化枝及其片段在增強動物性能中之用途。

Description

經改造之強健高Tm值的植酸酶類多肽及其片段
本領域涉及經改造之強健高Tm值的植酸酶類（clade）多肽及其片段、產生此類經改造之強健高Tm植酸酶類多肽及其片段之方法、以及此類經改造之強健高Tm植酸酶類多肽及其片段在增強動物性能中之用途。
植酸酶係單胃動物飼料中最常用的外源酶。植酸酶可以降低植酸鹽的抗營養作用，並提高磷、鈣、胺基酸和能量的消化率，以及減少無機磷排泄物對環境的負面影響。
植酸鹽係穀類和豆類中磷的主要存儲形式。然而，例如豬、家禽和魚的單胃動物不能有效地代謝或吸收其飲食中的植酸鹽（或植酸），因此會將其排泄，從而導致畜牧生產密集地區的磷污染。此外，植酸還藉由螯合鈣、銅和鋅等金屬劑，並在消化道的各個部位與蛋白質和胺基酸形成不溶性複合物，從而在單胃動物中也起到抗營養劑的作用。
長期以來一直認為非反芻動物缺乏內源植酸酶，並且因此不能利用植酸鹽。但是，內源粘膜磷酸酶和細菌植酸酶已被描述為在家禽的小腸和盲腸中具有活性。Maenz, D. D.；Classen, H. L.，Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken.[雞小腸刷狀緣膜的植酸酶活性]Poult Sci [家禽科學]1998 ,77 , 557-63。Abudabos, A. M.，Phytate phosphorus utilization and intestinal phytase activity in laying hens.[蛋雞的植酸磷利用率和腸道植酸酶活性]Italian Journal of Animal Science [義大利動物科學雜誌]2012 ,11 , e8。Zeller, E.；Schollenberger, M.；Kuhn, I.；Rodehutscord, M。為了給該等動物的生長和健康提供足夠的磷酸鹽，將無機磷酸鹽添加到它們的飲食中。這種添加可能是昂貴的，並且進一步增加了污染問題。
藉由植酸酶的作用，植酸鹽通常被水解以產生較低級的肌醇磷酸酯和無機磷酸酯。植酸酶用作動物飼料的添加劑，其中它們改善有機磷對於動物的可用性並降低環境的磷酸鹽污染（Wodzinski R J, Ullah A H. Adv Appl Microbiol.[應用微生物學進展] 42, 263-302 (1996)）。
許多真菌（Wyss M.等人,Appl. Environ. Microbiol .[應用與環境微生物學] 65 (2), 367-373 (1999)；Berka R. M.等人,Appl. Environ. Microbiol. [應用與環境微生物學] 64 (11), 4423-4427 (1998)；Lassen S.等人,Appl. Environ. Microbiol .[應用與環境微生物學] 67 (10), 4701-4707 (2001)）和細菌（Greiner R.等人Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 303 (1), 107-113 (1993)；Kerovuo等人,Appl. Environ. Microbiol .[應用和環境微生物學] 64 (6), 2079-2085 (1998)；Kim H. W.等人, Biotechnol. Lett.[生物技術通訊] 25, 1231-1234 (2003)；Greiner R.等人,Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 341 (2), 201-206 (1997)；Yoon S. J.等人,Enzyme and microbial technol .[酶與微生物技術] 18, 449-454 (1996)；Zinin N. V.等人,FEMS Microbiol. Lett .[FEMS微生物學快報] 236, 283-290 (2004)）來源的植酸酶已經描述在文獻中。
在2011年11月8日授予Miasnikov等人的美國專利案號8,053,221涉及衍生自細菌布丘氏菌屬（Buttiauxella ）物種的植酸酶，以及與野生型（親本）酶相比針對改善的特徵選擇的和/或經改造之其變體/修飾形式。
在2000年8月29日授予Short的美國專利案號6,110,719以及2001年2月6日授予Short等人的美國專利案號6,183,740涉及衍生自大腸桿菌（Escherichia coli ）B的植酸酶。
在2016年6月4日授予Sjoeholm等人的美國專利案號9,365,840涉及具有植酸酶活性的多肽。
在2011年6月26日授予Lassen等人的美國專利案號8,206,962以及在2013年8月13日授予Lassen等人的美國專利案號8,507,240涉及哈夫尼菌屬（Hafnia ）植酸酶變體。
在2013年10月15日授予Haefner等人的美國專利案號8,557,552涉及合成植酸酶變體。
國際公開日期為2015年1月29日的WO 2015/012890涉及具有植酸酶活性的多肽。
在過去十年中已經開發了新一代的植酸酶。但是，該等植酸酶在調理和製粒之前以液體形式應用於飼料中時，都不具有合適的穩健性，以在商業相關的飼料製粒條件下承受高水平的緊迫。因此，市場上適用於商業製粒的熱穩定植酸酶產品係乾燥的產品，並且許多具有保護性包衣以保持活性。然而，期望將液體形式的植酸酶應用於飼料，因為例如以液體形式添加的植酸酶在藉由飼料遞送時將均勻地分佈並立即在動物中釋放。仍然需要如下植酸酶及其片段，該等植酸酶及其片段在商業相關的條件下在調理和製粒之前以液體形式應用時係強健的，並且仍然能夠改善動物性能。
在第一實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽（例如生物合成細菌6-植酸酶）或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段包含與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列具有至少82%序列同一性的植酸酶活性。
在第二實施方式中，揭露了如實施方式1所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段的胺基酸序列具有至少1200的隱瑪律科夫模型（HMM）評分，如表11中關於高Tm值的植酸酶類多肽及其片段所示。
在第三實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與對應於SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的胺基酸位置14-325具有至少78%的序列同一性。
在第四實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其片段（例如，如實施方式1、2或3所述的那些），使用如實例5中所述的標準進料製粒回收率測試（in-feed pelleting recovery test），在95ºC在MLA中應用30秒時，該經改造之植酸酶多肽或其片段具有至少約50%的進料製粒回收率（in-feed pelleting recovery）。
在第五實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其片段（例如，如實施方式1、2、3或4所述的那些），使用如實例5中所述的標準進料製粒測試，該經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少約0.7。
在第六實施方式中，揭露了如實施方式1、2、3、4或5所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在實例3中所述的差示掃描量熱分析測定條件下包含至少約92.5ºC的Tm溫度。
在第七實施方式中，揭露了如實施方式6所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在實例3中所述的測定條件下在pH 3.5處包含至少約100 U/mg的比活性。
在第八實施方式中，揭露了如實施方式1、2、3、4、5、6、或7所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中 a) 所述植酸酶多肽包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID:NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、和SEQ ID NO:64；或 b) 所述植酸酶多肽包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、和SEQ ID NO:87。
在第九實施方式中，揭露了一種動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物，該動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段可以 (i) 單獨使用，或 (ii) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物組合使用，或 (iii) 與至少一種其他酶一起使用，或 (iv) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物以及至少一種其他酶組合使用，或 (v) (i)、(ii)、(iii) 或 (iv) 中的任一種、進一步包含至少一種其他飼料添加劑組分，以及視需要該經改造之植酸酶多肽或其片段以至少約0.1 g/噸飼料的量存在。
在第十實施方式中，揭露了一種重組構建體，該重組構建體包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段的核苷酸序列。
在第十一實施方式中，該生產宿主選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物和藻類。
在第十二實施方式中，揭露了一種用於生產經改造之植酸酶多肽或其片段之方法，該方法包括： (a) 用如實施方式9所述的重組構建體轉化生產宿主；和 (b) 在產生該經改造之植酸酶多肽或其片段的條件下培養步驟 (a) 的生產宿主。
在第十三實施方式中，從該生產宿主中視需要回收藉由如第十實施方式所述的方法製備的經改造之植酸酶多肽或其片段。
在第十四實施方式中，揭露了一種含有植酸酶的培養物上清液，該含有植酸酶的培養物上清液藉由如實施方式十或十一所述的方法獲得。
在第十五實施方式中，揭露了一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段。
在第十六實施方式中，描述了一種用於在動物飼料中使用的乾燥的酶組成物，該乾燥的酶組成物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段。
在第十七實施方式中，揭露了如實施方式15所述的乾燥的酶組成物，其中乾燥的酶組成物係顆粒狀飼料添加劑組成物。
在第十八實施方式中，揭露了一種用於在動物飼料中使用的液體酶組成物，該液體酶組成物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段。
在第十九實施方式中，揭露了一種用於改善動物飼料的營養價值的方法，其中將如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶或其片段添加到動物飼料中。
在第二十實施方式中，揭露了一種用於在一個或多個指標方面改善動物性能之方法，該方法包括向該動物施用有效量的如實施方式1、2、3、4、5、6、7或8所述的經改造之植酸酶多肽或如實施方式9或10所述的動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物。
在第二十一實施方式中，揭露了如實施方式20所述的方法，其中該一個或多個指標選自由以下組成之群組：飼料效率增加、增重增加、飼料轉化率降低、飼料中營養素或能量的消化率改善、氮保留量改善、避免壞死性腸炎負面影響的能力改善、以及免疫應答改善。
在第二十二實施方式中，揭露了如實施方式20或21所述的方法，其中該動物係選自由豬和家禽組成的組的單胃動物。
在第二十三實施方式中，揭露了如實施方式22所述的方法，其中該豬選自由以下組成之群組：仔豬、生長豬、和母豬。
在第二十四實施方式中，揭露了如實施方式22所述的方法，其中該家禽選自由以下組成之群組：火雞、鴨、雞、肉仔雞、蛋雞、鵝、雉雞、鵪鶉和鴯鶓（emus）。
在第二十五實施方式中，揭露了如實施方式20或21所述的方法，其中該動物係選自由以下組成之群組的反芻動物：牛、小牛、山羊、綿羊、長頸鹿、美洲野牛、駝鹿（moose）、麋鹿（elk）、犛牛、水牛、鹿、馴鹿、北美馴鹿、駱駝、羊駝、美洲駝、羚羊、叉角羚和鹿牛羚（nilgai）。
引用的所有專利、專利申請和出版物均藉由引用以其全文併入本文。
在本揭露中，使用了許多術語和縮寫。除非另外特別說明，以下定義適用。
如本文所用的，單數形式「一種/一個（a/an）」和「該（the）」包括複數個指示物，除非上下文中另外明確指明。例如，術語「一種化合物」或「至少一種化合物」可以包括多種化合物，包括其混合物。例如，術語「一種/一個（a/an）」、「該（the）」、「一種或多種/一個或多個（one or more）」和「至少一種/至少一個（at least one）」在本文中可互換地使用。
術語「和/或」以及「或」在本文中可互換地使用，並且是指兩個指定的特徵或組分中的每一個具有或不具有另一個的特定揭露。因此，如本文中的短語「A和/或B」中所用的術語「和/或」旨在包括「A和B」、「A或B」、「A」（單獨）和「B」（單獨）。同樣，如本文中的短語「A、B和/或C」中所用的術語「和/或」旨在涵蓋以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；以及C（單獨）。
使用單數形式的單詞包括複數形式，反之亦然。
術語「包含（comprises/comprising）」、「包括（includes/including）」、「具有」及其變形可互換地使用，且意指「包括但不限於」。要理解的是，無論在何處用語言「包含」來描述方面，也都提供了以「由……組成」和/或「基本上由……組成」的術語描述的類似方面。
術語「由……組成」意指「包括並限於」。
術語「基本上由……組成」意指組成物的指定材料或方法的指定步驟，以及不會實質性影響該材料或方法的基本特徵的那些另外的材料或步驟。
貫穿本申請，能以範圍形式呈現各個實施方式。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便以及簡潔，並且不應被理解為對本文所述的實施方式的範圍的不靈活的限制。因此，範圍的描述應當被認為係具有確切揭露的所有可能的子範圍以及該範圍內的單獨數值。例如，如從1至6的範圍的描述應當被認為係具有確切揭露的子範圍，如從1至2、從1至3、從1至4、和從1至5、從2至3、從2至4、從2至5、從2至6、從3至4、從3至5、從3至6等，以及該範圍內的單獨數字，例如1、2、3、4、5、和6。無論範圍的寬度如何，這都適用。
如本文所用的，術語「約」可以允許值或範圍的變化程度例如在規定值或範圍的規定極限的10%以內、5%以內或1%以內。
術語「植酸酶」（肌醇六磷酸磷酸水解酶）係指催化植酸（肌醇六磷酸或IP6）（在穀物和油料種子中發現的一種難消化的有機形式的磷）的水解並釋放可用形式的無機磷的一類磷酸酶。
術語「動物」和「受試者」在本文中可互換地使用，並且是指屬於動物界的任何生物體，且包括但不限於哺乳動物（不包括人）、非人動物、家畜、牲畜、農場動物、動物園動物、種畜等。例如，可以提及所有非反芻動物和反芻動物。在一個實施方式中，該動物係非反芻動物，即單胃動物。單胃動物的實例包括但不限於豬（pigs和swine），例如仔豬、生長豬、母豬；家禽，例如火雞、鴨、雞、肉仔雞、蛋雞；魚，例如鮭魚、鱒魚、吳郭魚、鯰魚和鯉魚；以及甲殼動物，例如蝦和對蝦。在另外的實施方式中，該動物係反芻動物，包括但不限於牛、小牛、山羊、綿羊、長頸鹿、美洲野牛、駝鹿、麋鹿、犛牛、水牛、鹿、駱駝、羊駝、美洲駝、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
術語「進化枝」，也稱為單系群，係指具有共同祖先及其所有直系後代的一組生物體或相關序列。
術語「Tm 」係蛋白質變性、或未折疊和折疊狀態的自由能相等且一半群體未折疊而另一半群體折疊時的溫度。通常使用量熱法或光學技術（例如圓二色性、螢光或光散射）研究酶的熱解折疊行為。
術語「高Tm植酸酶進化枝」係指使用如下文實例3中所述的差示掃描量熱法的Tm為至少92.5°的植酸酶多肽或其片段的進化枝。術語「高Tm植酸酶類多肽」和「經改造之植酸酶多肽及其片段」在本文可互換地使用。
術語「混合機液體應用（mixer liquid application）」和「MLA」在本文中可互換地使用，並且是指動物飼料的生產，其中熱敏化合物（特別是酶）可以在調理和製粒之前以液體形式應用於動物飼料並在調理和製粒後在飼料中保持功能。
「飼料」意指任何天然或人工飲食、膳食等，或此類膳食的組分，其意在或適合於分別被非人動物食用、攝取、消化。較佳的是，關於在飼養家畜時飼餵動物的產品，使用術語「飼料」。術語「飼料」和「動物飼料」在本文可互換地使用。
如本文所用的，「飼料添加劑」係指在營養中單獨或一起使用的一種或多種成分，物質（例如細胞）的產物，例如以改善食物（例如，動物飼料）的品質，以改善動物的性能和/或健康，和/或以增強食物或食物中材料的消化率。
如本文所用的，術語「食物」以廣義使用 - 並且涵蓋以任何形式用於人的食物和食物產品以及用於動物的食物（即飼料）。
食物或飼料可以是溶液形式或固體形式，這取決於用途和/或應用方式和/或施用方式。在一些實施方式中，本文提及的酶可以用作食物或飼料物質或在食物或飼料物質的製備或生產中使用。
如本文所用的，術語「食物或飼料成分」包括被添加到或可以被添加到食物或食料中的製劑，並且該製劑包括可以在各種產品中以低水平使用的製劑。食物成分可以是處於溶液的形式或作為固體，這取決於用途和/或應用模式和/或施用模式。本文所述的酶可以用作食物或飼料成分或用於製備或生產中。該等酶可以添加到或可以不添加到食物補充劑中。用於單胃動物的飼料組成物通常包括含植物產品的組成物，該植物產品含有植酸鹽。此類組成物包括但不限於玉米粉、大豆粉、菜籽粉、棉籽粉、玉蜀黍、小麥、大麥和高粱基飼料。
如本文所用的，術語「製粒」係指可以是固體、圓形、球形和圓柱形片劑的丸粒，特別是飼料丸粒和固體擠出動物飼料的生產。已知飼料製粒製造製程的一個實例通常包括在室溫下將食物或飼料成分混合至少1分鐘，將混合物轉移到緩衝倉中，將混合物運輸至蒸汽調理器（即調理）中，視需要將經蒸汽調理的混合物轉移到膨脹器，將混合物轉移至製粒機或擠出機，最後將丸粒轉移至丸粒冷卻器。（Fairfield, D. 1994. 第10章, Pelleting Cost Center.[製粒成本中心] In Feed Manufacturing Technology IV.[飼料製造技術IV] (McEllhiney, 編輯), American Feed Industry Association[美國飼料工業協會], 阿靈頓, 維吉尼亞州, 第110-139頁）。
術語「丸粒」係指經過熱處理，例如蒸汽處理（即調理）並藉由機器壓制或擠出的動物飼料（通常衍生自穀物）的組成物。丸粒能以液體配製物或乾燥配製物的形式摻入酶中。乾燥配製物可以是包衣的或未包衣的，並且可以是顆粒形式。術語「顆粒」用於由酶（例如植酸酶，例如本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽）和其他化學物質（例如鹽和糖）組成的顆粒，並且可以使用多種技術（包括流化床製粒方法以形成層狀顆粒）中的任一種形成。
術語「進料製粒回收率」、「回收活性」或「活性回收率」係指 (i) 涉及以下一種或多種應激源的處理後的飼料酶活性：加熱、壓力增加、pH增加、pH降低、儲存、乾燥、暴露於一種或多種表面活性劑、暴露於一種或多種溶劑、以及機械應力與 (ii) 該處理前酶的活性的比率。回收活性可以表示為百分比。回收活性百分比計算如下：
Figure 02_image001
植酸酶可以藉由顯示改善「進料製粒回收率」、「回收活性」、「熱穩定性」或「無活性可逆性」中的任一種來表現穩定性。
在製粒實驗的上下文中，「處理前的活性」可以藉由以與經過處理的植酸酶相匹配的方式測量未經過處理的醪液中存在的植酸酶活性來近似估算。例如，未處理的醪液中的植酸酶的處理和儲存時間以及條件與已處理的醪液中的植酸酶相似，以控制可能在指定處理本身之外的可能的相互作用或其他影響。
術語「進料製粒回收率測試」和「標準進料製粒測試」在本文中可互換地使用，並且是指對飼料酶承受調理和製粒的熱處理的穩定性進行測量或評估的測試。
例如，在下面的實例5中提出了這種進料製粒回收率測試。
與在固體或液體配製物中的確定有關的術語植酸酶活性意指1 FTU（植酸酶單位），其定義為在反應條件下（在37ºC、pH 5.5下），在一分鐘內從5.0 mM植酸鈉底物（從稻）中釋放1微莫耳無機正磷酸鹽所需的酶量，這也在ISO 2009植酸酶測定法（一種用於確定植酸酶活性的標準測定法，見國際標準ISO/DIS 30024: 1-17, 2009 ）中進行了定義。
可替代地，如本文所用的，一單位植酸酶（U）可定義為在如實例3所示的孔雀綠測定法中的反應條件（25ºC，pH分別為5.5或3.5）下，在一分鐘內從0.2 mM植酸鈉底物（從稻）釋放1微莫耳無機正磷酸鹽的酶量。
如本文所用的，術語「比活性」係每毫升酶單位的數目除以（總）蛋白質的濃度（mg/ml）。因此，比活性值通常以單位/mg表示。可替代地，術語「比活性」係每毫升酶單位的數目除以植酸酶的濃度（mg/ml）。
如本文所用的，術語「差示掃描量熱法」或「DSC」係熱分析技術，其中增加樣品和參照物溫度所需的熱量的差異作為溫度的函數來測量。在整個實驗中，樣品和參照物均保持在幾乎相同的溫度下。通常，設計用於DSC分析的溫度程式，使得樣品支架溫度隨時間線性增加。參考樣品在待掃描的溫度範圍內應具有明確定義的熱容量。
術語「益生菌」意指藉由選擇性地刺激一種或有限數量的有益細菌的生長和/或活性來有益地影響宿主的不可消化食物成分。
如本文所用的，術語「直接飼餵微生物」（「DFM」）係活的（有活力的）微生物的來源，當以足夠數量應用時可為其接受者（即益生菌）帶來益處。DFM可以包含一種或多種此類微生物，例如細菌菌株。DFM的類別包括芽孢桿菌屬（Bacillus ）、乳酸菌和酵母。因此，術語DFM涵蓋以下中的一種或多種：直接飼餵細菌、直接飼餵酵母、直接飼餵酵母及其組合。
芽孢桿菌綱（Bacilli ）係獨特的、形成孢子的革蘭氏陽性桿菌。該等孢子非常穩定，並且可以承受環境條件，如熱、水分和一定範圍的pH。該等孢子當被動物攝入後會萌發成有活性的營養細胞，並可用於粉和壓成丸粒的飲食中。乳酸菌係革蘭氏陽性球菌，可產生對病原體有拮抗作用的乳酸。由於乳酸菌似乎有點對熱敏感，所以它們不能用於壓成丸粒的飲食中。乳酸菌的種類包括雙歧桿菌（Bifidobacterium ）、乳桿菌（Lactobacillus ）和鏈球菌（Streptococcus ）。
術語「益生菌」、「益生菌培養物」和「DFM」在本文中可互換地使用，且定義了當例如以足夠數量攝取或局部應用時，有益地影響宿主生物體（即藉由賦予宿主生物體一個或多個可證明的健康益處（例如健康、消化、和/或性能益處））的活的微生物（包括例如細菌或酵母）。益生菌可以改善一個或多個粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是腸、泌尿道、呼吸道或皮膚。如本文所用的，術語「益生菌」還涵蓋可以刺激免疫系統的有益分支並同時減少在粘膜表面（例如腸）中的炎症反應的活的微生物。雖然沒有益生菌攝入的下限或上限，但是已經表明，至少106 -1012 ，較佳的是至少106 -1010 ，較佳的是108 -109 cfu作為日劑量將在受試者中有效地實現有益的健康效果。
如本文所用的，術語「CFU」意指「集落形成單位」並且是代表衍生自單個祖細胞的細胞聚集的集落中的活細胞的測量。
術語「分離的」意指處於在自然界中不存在的形式的或環境中的物質，並且不反映分離物被純化的程度，而是表示與天然形式或天然環境的分離或分開。分離物質的非限制性實例包括 (1) 任何非天然存在的物質，(2) 任何物質，包括但不限於，任何宿主細胞、酶、經改造之酶、核酸、蛋白質、肽或輔因子，其至少部分地從與其天然相關的天然存在的成分中的一種或多種或全部中去除；(3) 任何經人手修飾的物質（相對於自然界中發現的物質）；或 (4) 相對於與其天然相關的其他成分，藉由增加物質的量進行修飾的任何物質。術語「分離的核酸分子」、「分離的多核苷酸」、和「分離的核酸片段」將可互換地使用並係指單鏈或雙鏈的RNA或DNA的聚合物，視需要含有合成的、非‑天然的或改變的核苷酸鹼基。呈DNA聚合物形式的分離的核酸分子可由cDNA、基因組DNA或合成的DNA的一個或多個區段構成。
術語「純化（purify）」、「純化的（purified）」和純化（purification）意指去除不需要的組分、材料污穢（material defilement）、混合物或瑕疵使得基本上純或乾淨。例如，純化如應用於核酸或多肽時通常表示基本上不含其他組分的核酸或多肽，如藉由本領域熟知的分析技術確定的（例如，純化的多肽或多核苷酸在電泳凝膠、層析洗脫液和/或經歷密度梯度離心的培養基中形成離散的帶）。例如，在電泳凝膠中產生基本上一條帶的核酸或多肽係「純化的」。純化的核酸或多肽係至少約50%純的，通常是至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%或更加純的（例如，在莫耳基礎上按重量計的百分比）。在相關意義上，當在應用純化或富集技術之後存在分子的濃度的大幅度增加時，對於該分子而言組成物被富集了。術語「富集」係指化合物、多肽、細胞、核酸、胺基酸或其他特定材料或組分以高於起始組成物的相對或絕對濃度存在於組成物中。
術語「肽」、「蛋白質」和「多肽」在本文中可互換地使用，並且是指藉由肽鍵連接在一起的胺基酸的聚合物。「蛋白質」或「多肽」包含胺基酸殘基的聚合序列。貫穿本揭露使用了遵照IUPAC-IUB生物化學術語聯合委員會（Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN）定義的胺基酸的單字母和3字母代碼。單字母X係指二十個胺基酸中的任一個。還應當理解，由於遺傳密碼的簡並性，多肽可以由多於一種核苷酸序列編碼。突變可以由親本胺基酸的單個字母代碼命名，隨後是位置編號，然後是變體胺基酸的單個字母代碼。例如，將在位置87處的甘胺酸（G）突變為絲胺酸（S）表示為「G087S」或「G87S」。當描述修飾時，位置後面在括弧中列出的胺基酸指示由任何列出的胺基酸在該位置處的取代清單。例如，6（L，I）意指位置6可以被白胺酸或異白胺酸取代。有時，在序列中，將斜線（/）用於定義取代，例如，F/V指示可以具有苯丙胺酸或纈胺酸的位置。
術語「訊號序列」和「訊息肽」係指可以參與蛋白質的成熟或前驅體形式的分泌或定向轉運的胺基酸殘基序列。通常，訊號序列位於前驅體或成熟蛋白序列的N-末端。訊號序列可以是內源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在訊號序列。通常，在蛋白質轉運後，訊號序列藉由訊息肽酶從蛋白質切割。
術語「成熟」形式的蛋白質、多肽或肽係指沒有訊息肽序列和前肽序列的蛋白質、多肽或酶的功能形式。
關於胺基酸序列或核酸序列，術語「野生型」指示胺基酸序列或核酸序列係天然的或天然存在的序列。如本文所用的，術語「天然存在的」係指在自然界中發現的任何物質（例如蛋白質、胺基酸或核酸序列）。相反，術語「非天然存在」係指在自然界中沒有發現的任何物質（例如，在實驗室中生產的重組/經改造之核酸和蛋白序列、或野生型序列的修飾）。
如本文所用的，關於胺基酸殘基位置，「對應於」（corresponding to或corresponds to或correspond to）或「對應」係指在蛋白質或肽中所列舉位置處的胺基酸殘基，或類似於、同源於或等同於蛋白質或肽中所列舉殘基的胺基酸殘基。如本文所用的，「對應區域」通常是指相關蛋白質或參考蛋白質中的類似位置。
術語「衍生自」和「獲得自」不僅是指由所討論的生物體的菌株生產或可以由其生產的蛋白質，而且是指由從此類菌株分離的DNA序列編碼並且在含有此類DNA序列的宿主生物體中生產的蛋白質。另外，該術語係指由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼並且具有所討論的蛋白質的鑒定特徵的蛋白質。
術語「胺基酸」係指蛋白質或多肽的基本化學結構單元。在表1中可以找到本文中使用的縮寫以鑒定特定胺基酸。
[表1]. 單個字母和三個字母的胺基酸縮寫
  胺基酸 三個字母 縮寫 單個字母 縮寫
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
熱穩定絲胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩醯胺酸 Gln Q
麩胺酸 Glu E
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
任意胺基酸或如在本文定義的胺基酸 Xaa X
熟悉該項技術者將認識到，在保留與揭露的胺基酸序列相關的功能的同時，可以對本文揭露的胺基酸序列進行修改。例如，基因的改變導致給定位點處產生化學上等價的胺基酸但不影響所編碼蛋白質的功能特性係常見的，這係本領域所熟知的。
術語「密碼子優化的」，如它係指用於轉化各種宿主的核酸分子的基因或編碼區，係指核酸分子的基因或編碼區中密碼子的改變，以反映宿主生物體的典型密碼子使用，而不改變DNA編碼的多肽。
術語「基因」係指表現特定蛋白質的核酸分子，包括該編碼序列之前（5'非編碼序列）和之後（3'非編碼序列）的調控序列。「天然基因」係指自然界中發現的具有其自身調控序列的基因。「嵌合基因」係指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被發現的調控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同來源的調控序列和編碼序列，或者包含衍生自同一來源但以不同於天然發生的方式排列的調控序列和編碼序列。「內源基因」係指位於生物體基因組的天然位置中的天然基因。「外來」基因係指通常不在宿主生物體中被發現，但藉由基因轉移引入宿主生物體中的基因。外來基因可以包含插入非天然生物體中的天然基因或嵌合基因。「轉基因」係藉由轉化程序引入基因組中的一種基因。
術語「內含子」意指在最終RNA產物成熟期間藉由RNA剪接去除的基因內的任何核苷酸序列。術語「內含子」係指基因內的DNA序列和RNA轉錄物中的相應序列。
術語「編碼序列」係指編碼特異性胺基酸序列的核苷酸序列。「合適的調控序列」係指位於編碼序列的上游（5'非編碼序列）、內部或下游（3'非編碼序列），並且影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性、或者翻譯的核苷酸序列。調控序列可以包括啟動子、翻譯前導序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖環結構。
術語「有效地連接」係指核酸序列在單個核酸分子上的締合，使得一個核酸片段的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表現時，它與編碼序列有效地連接（即編碼序列在啟動子的轉錄控制下）。編碼序列可以在正義或反義方向上有效地連接到調控序列上。
術語「調控序列」或「控制序列」在本文中可互換地使用，並且是指能夠增加或減少生物體內特定基因表現的核苷酸序列區段。調控序列的實例包括但不限於啟動子、訊號序列、操縱子等。如上所述，調控序列能以正義或反義方向有效地連接到目的編碼序列/基因。
「啟動子」或「啟動子序列」係指參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的調控序列。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。用於本發明的較佳的啟動子係裡氏木黴（Trichoderma reesei ）cbh1，其係誘導型啟動子。
該「3'非編碼序列」係指位於編碼序列下游的DNA序列，並包括編碼能夠影響mRNA加工或基因表現（如轉錄終止）的調控訊號的序列。
如本文所用的，術語「轉化」係指將核酸分子轉移或引入到宿主生物體中。該核酸分子可以作為線性或環狀形式的DNA引入。該核酸分子可以是自主複製的質體，或者它可以整合進生產宿主的基因組中。含有轉化的核酸的生產宿主被稱為「轉化的」或「重組的」或「轉基因的」生物體或「轉化體」。
術語「重組」和「經改造之」係指例如藉由化學合成或者藉由經基因工程技術操縱分離的核酸區段來將兩個原本分離的核酸序列區段進行人工組合。例如，其中一個或多個區段或基因已經被插入的DNA，其自然地或藉由實驗室操作，從不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列插入，導致在基因中引入新的序列並隨後在生物體中引入。術語「重組」、「轉基因」、「轉化的」、「經改造之」、「基因改造之」和「經修飾用於外源基因表現」在本文中可互換地使用。
術語「重組構建體」、「表現構建體」、「重組表現構建體」和「表現盒」在本文中可互換地使用。重組構建體包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起發現的調控序列和編碼序列的人工組合。例如，構建體可以包含衍生自不同來源的調控序列和編碼序列，或者包含衍生自相同來源但以不同於天然發生的方式排列的調控序列和編碼序列。這種構建體可以單獨使用或可以與載體結合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決於如熟悉該項技術者熟知的將用於轉化宿主細胞的方法。例如，可以使用質體載體。技術人員充分瞭解必須存在於載體上以便成功轉化，選擇和繁殖宿主細胞的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件可以導致不同水平和模式的表現（Jones等人, (1985)EMBO J [歐洲分子生物學學會雜誌] 4:2411-2418；De Almeida等人, (1989)Mol Gen Genetics [分子和普通遺傳學] 218:78-86），並且因此通常篩選多個事件，從而獲得顯示所需表現水平和模式的品系。此類篩選可以使用標準分子生物學測定、生物化學測定以及其他測定來完成，該測定包括DNA的Southern分析、mRNA表現的Northern分析、PCR、即時定量PCR（qPCR）、逆轉錄PCR（RT-PCR）、蛋白表現的免疫印跡分析、酶測定或活性測定、和/或表型分析。
術語「生產宿主」、「宿主」和「宿主細胞」在本文中可互換地使用，並且是指任何植物、生物體、或任何植物或生物體的細胞，無論是人類還是非人類，其中重組構建體可以穩定或暫態引入以表現基因。該術語涵蓋了親本細胞的任何後代，由於在繁殖期間發生的突變，其與親本細胞不同。
術語「百分比同一性」係如藉由比較序列所確定的兩個或更多個多肽序列或者兩個或更多個多核苷酸序列之間的關係。在本領域中，「同一性」也意指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，視情況而定，如藉由此類序列的串之間的匹配核苷酸或胺基酸的數目所確定的。可藉由已知方法容易地計算「同一性」和「相似性」，該方法包括但不限於以下文獻中所述的那些：Computational Molecular Biology [計算分子生物學] (Lesk, A. M.編輯) Oxford University Press [牛津大學出版社], 紐約州 (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects [生物計算：資訊學和基因組項目] (Smith, D. W.編輯), Academic Press [學術出版社], 紐約州 (1993)；Computer Analysis of Sequence Data [序列數據的電腦分析], 第I部分, (Griffin, A. M.和Griffin, H. G.編輯) Humana Press [胡瑪納出版社], 新澤西州 (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology [分子生物學的序列分析] (von Heinje, G.編輯), Academic Press [學術出版社] (1987)；Sequence Analysis Primer [序列分析引物] (Gribskov, M.和Devereux, J.編輯) Stockton Press [斯托克頓出版社], 紐約州 (1991)。確定同一性和相似性的方法被編入公開可用的電腦程式中。
如本文所用的，「%同一性」或「百分比同一性」或「PID」係指蛋白序列同一性。百分比同一性可以使用本領域已知的標準技術來確定。有用的演算法包括BLAST演算法（參見Altschul等人，J Mol Biol [分子生物學雜誌]，215:403-410, 1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA [美國科學院院報]，90:5873-5787, 1993）。BLAST程式使用幾個搜索參數，其中大部分設置為預設值。NCBI BLAST演算法按照生物相似性找到最相關的序列，但是不推薦用於少於20個殘基的查詢序列（Altschul等人，Nucleic Acids Res [核酸研究]，25:3389-3402, 1997；以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res. [核酸研究] 29:2994-3005, 2001）。核酸序列搜索的示例性預設BLAST參數包括：相鄰字長閾值 = 11；E值截止值 = 10；評分矩陣（Scoring Matrix） = NUC.3.1（匹配 = 1，錯配 = ‐3）；空位開放 = 5；以及空位延伸 = 2。胺基酸序列搜索的示例性預設BLAST參數包括：字長大小 = 3；E值截止值 = 10；評分矩陣 = BLOSUM62；空位開放 = 11；以及空位延伸 = 1。胺基酸序列同一性值百分比%由匹配的相同殘基數目除以「參考」序列的殘基總數來確定。BLAST演算法將「參考」序列稱為「查詢」序列。
如本文所用的，「同源蛋白質」或「同源植酸酶」係指在一級、二級和/或三級結構中具有不同相似性的蛋白質。當比對蛋白質時，蛋白質同源性可以是指線性胺基酸序列的相似性。蛋白序列的同源搜索可以使用來自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用閾值（E值截止值）0.001進行。（Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. [空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白質數據庫搜索程式]Nucleic Acids Res [核酸研究] 1997年第1組; 25(17):3389-402）。使用該資訊，可以將蛋白質序列分組。
可以使用LASERGENE生物資訊計算包的Megalign程式（DNASTAR公司，麥迪森，威斯康辛州）、Vector NTI v.7.0的AlignX程式（Informax公司，貝塞斯達，馬里蘭州）或EMBOSS開放套裝軟體（EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics [遺傳學趨勢] 16, (6):276-277 (2000)）進行序列比對和百分比同一性計算。可以使用具有預設參數的CLUSTAL比對方法（例如CLUSTALW；例如版本1.83）（Higgins和Sharp，CABIOS ，5:151-153 (1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res. [核酸研究] 22:4673-4680 (1994)；和Chenna等人，Nucleic Acids Res [核酸研究] 31 (13):3497-500 (2003)）（其可藉由歐洲生物資訊學研究所從歐洲分子生物學實驗室獲得）來執行序列的多重比對。用於CLUSTALW蛋白比對的適合參數包括GAP存在罰分= 15、GAP延伸= 0.2、矩陣= Gonnet（例如，Gonnet250）、蛋白ENDGAP = -1、蛋白GAPDIST = 4和KTUPLE = 1。在一個實施方式中，在慢比對情況下，使用快或慢比對以及預設設置。可替代地，可以修飾使用CLUSTALW方法（例如版本1.83）的參數以同樣使用KTUPLE = 1、空位罰分= 10、空位延伸= 1、矩陣= BLOSUM（例如BLOSUM64）、窗口（WINDOW）= 5和頂部存儲的對角線（TOP DIAGONALS SAVED）= 5。可替代地，可以使用來自Geneious®10.2.4版本的MAFFT比對（具有預設設置，評分矩陣BLOSUM62，空位開放罰分1.53和偏移值0.123）來匯出多重序列比對。
MUSCLE程式（Robert C. Edgar, MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput [MUSCLE：具有高精確度和高通量的多序列比對],Nucl. Acids Res .[核酸研究] (2004) 32 (5): 1792-1797）係多重序列比對演算法的又另一個實例。
圖2描繪的系統發生或進化樹基於胺基酸序列的相似性和差異顯示了包括經改造之植酸酶多肽及其片段的各種植酸酶之間的相關性。
鑒定序列相似性的另一種方式係生成隱瑪律可夫模型（HMM）。HMM係概率框架，其中觀察到的數據（例如DNA或胺基酸序列）係根據由幾種（隱藏）內部狀態之一產生的一系列輸出（或發射）建模的。HMM通常用於多重DNA序列比對的統計分析。它們可以用於鑒定基因組特徵，例如ORF、插入、缺失、取代和蛋白質結構域等。HMM還可以用於鑒定同源性；例如，廣泛使用的Pfam數據庫（Punta等人，2012）係使用HMM鑒定的蛋白質家族的數據庫。HMM比首次生產於1990年的序列比較工具的主力工具BLAST（基本局部比對搜索工具）要準確得多（Altschul等人, 1990, 1997）。因此，將實例4中所示的高Tm植酸酶類多肽的多肽序列及其片段用於產生隱瑪律可夫模型（HMM）以鑒定序列相似性。
術語「經改造之植酸酶多肽」意指多肽不是天然存在的並且具有植酸酶活性。
注意，經改造之植酸酶多肽的片段係經改造之植酸酶多肽的一部分或子序列，其能夠像經改造之植酸酶多肽一樣起作用，即，其保留了植酸酶活性。
術語「載體」係指設計用於將核酸引入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括但不限於選殖載體、表現載體、穿梭載體、質體、噬菌體顆粒、盒等。
如本文所用的，「表現載體」意指包含DNA序列的DNA構建體，該序列與能夠在合適的宿主中實現DNA表現的合適的控制序列有效地連接。此類控制序列可以包括影響轉錄的啟動子，控制轉錄的視需要的操縱子序列，編碼mRNA上適合的核糖體結合位點的序列，增強子以及控制轉錄和翻譯終止的序列。
如本文所用的，術語「表現」係指處於前驅體抑或成熟形式的功能性終產物（例如，mRNA或蛋白質）的生產。表現也可指將mRNA翻譯成多肽。
基因的表現涉及該基因的轉錄並將mRNA翻譯成前驅體或成熟蛋白。「成熟」蛋白指經翻譯後加工的多肽；即已經去除了存在於初級翻譯產物中的任何訊號序列、原肽（prepeptide）或前肽（propeptide）的多肽。「前驅體」蛋白質指mRNA的翻譯初級產物；即具有仍然存在的原肽和前肽。原肽或前肽可以是但不限於細胞內定位訊號。「穩定轉化」係指將核酸片段轉移至宿主生物體的基因組中，包括細胞核的和細胞器的基因組，導致遺傳穩定的遺傳。相比之下，「暫態轉化」係指將核酸片段轉移至宿主生物體的細胞核中或含有DNA的細胞器中，導致基因表現而無整合或穩定的遺傳。
因此，在一個實施方式中，描述了一種重組構建體，該重組構建體包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼如本文所述的經改造之植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列。
該重組構建體可以包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼本文所述的任何經改造之植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列。此外，該生產宿主選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物或藻類。較佳的生產宿主係絲狀真菌裡氏木黴。
可替代地，可以使用如Chong，Curr Protoc Mol Biol .[當前分子生物學協議] 2014; 108: 16.30.1–16.30.11中所述的無細胞蛋白質合成。
本文還描述了一種用於生產經改造之植酸酶多肽或其片段之方法，該方法包括： (a) 用本文所述的重組構建體轉化生產宿主；和 (b) 在產生該經改造之植酸酶多肽或其片段的條件下培養步驟 (a) 的生產宿主。
視需要，可以從生產宿主中回收經改造之植酸酶多肽或其片段。
在另一方面，可以藉由本文所述的任何方法獲得含有植酸酶的培養物上清液。
在另一實施方式中，描述了編碼如本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段的多核苷酸序列。
可以包含在表現載體中的可能的起始控制區或啟動子係眾多的並且是熟悉該項技術者熟悉的。「組成型啟動子」係一種在大多數環境和發育條件下具有活性的啟動子。「誘導型」或「阻抑型」啟動子係指在環境調節或發育調節下具有活性的啟動子。在一些實施方式中，啟動子係誘導型或阻抑型的，原因係環境因素的變化，該等環境因素包括但不限於碳、氮或其他營養素可用性、溫度、pH、滲透壓、一種或多種重金屬的存在、一種或多種抑制劑的濃度、緊迫或上述因素的組合，如在本領域中已知的。在一些實施方式中，誘導型或阻抑型的啟動子係藉由代謝因素誘導或阻抑的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代謝物的水平、或上述因素的組合，如在本領域中已知的。
在一個實施方式中，該啟動子係對宿主細胞天然的啟動子。例如，在一些情況下，當裡氏木黴為宿主時，啟動子可以是天然的裡氏木黴啟動子，例如cbh1 啟動子，其保藏在GenBank中的登錄號D86235下。其他合適的用於真菌表現的啟動子的非限制性實例包括cbh2 、 egl1 、 egl2 、 egl3 、 egl4 、 egl5 、 xyn1 、和xyn2 ，產黃青黴菌（P. chrysogenus ）的阻抑型酸性磷酸酶基因（phoA）啟動子（參見例如Graessle等人，(1997)Appl. Environ. Microbiol. [應用與環境微生物學], 63 :753-756），葡萄糖阻抑型PCK1啟動子（參見例如Leuker等人，(1997),Gene [基因], 192:235-240），麥芽糖誘導型、葡萄糖阻抑型MET3啟動子（參見Liu等人，(2006),Eukary. Cell [真核細胞], 5:638-649），pKi啟動子和cpc1啟動子。其他有用啟動子的實例包括來自泡盛麯黴（A. awamori ）和黑麯黴（A. niger ）葡糖澱粉酶基因的啟動子（參見Nunberg等人，(1984)Mol. Cell Biol. [分子與細胞生物學]15 4:2306-2315和Boel等人，(1984)EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 3:1581-1585）。此外，裡氏木黴xln1 基因的啟動子可能是有用的（參見例如EPA 137280Al）。
控制轉錄終止的DNA片段也可以衍生自對較佳的生產宿主細胞來說係天然的各種基因。在某些實施方式中，包括終止控制區係視需要的。在某些實施方式中，該表現載體包括衍生自較佳的宿主細胞的終止控制區。
術語「生產宿主」、「生產宿主細胞」、「宿主細胞」和「宿主菌株」在本文中可互換使用，並且意指表現載體或DNA構建體的合適宿主，該表現載體或DNA構建體包含編碼植酸酶多肽或其片段的多核苷酸。生產宿主的選擇可以選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物和藻類。通常，該選擇將取決於編碼經改造之植酸酶多肽或其片段的基因及其來源。
特別地，宿主菌株較佳的是絲狀真菌細胞。在本發明的一個較佳的實施方式中，「宿主細胞」意指由絲狀真菌菌株、並且特別是木黴屬（Trichoderma ）物種或麯黴屬（Aspergillus ）物種的細胞產生的細胞和原生質體。
術語「絲狀真菌」係指所有絲狀形式的真菌亞門（參見Alexopoulos, C. J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY[菌物學概論], Wiley [威利出版社], 紐約）。該等真菌的特徵在於具有由幾丁質、纖維素和其他複合多糖組成的細胞壁的營養菌絲體。本發明的絲狀真菌在形態學、生理學和遺傳學上與酵母不同。絲狀真菌的營養生長係藉由菌絲延伸，而碳分解代謝係專性需氧的。在本發明中，該絲狀真菌親本細胞可以是屬於以下物種的細胞，但不限於：木黴屬（例如，裡氏木黴（以前分類為長梗木黴（T. Longibrachiatum ），還稱為紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina ））、綠色木黴（Trichoderma viride ）、康氏木黴（Trichoderma koningii ）、哈茨木黴（Trichoderma harzianum ））；青黴屬（Penicillium ）物種、腐質黴屬（Humicola ）物種（例如，特異腐質黴（Humicola insolens ）和灰腐質黴（Humicola grisea ））；金孢黴屬（Chrysosporium ）物種（例如，盧克諾文思金孢子菌（C. lucknowense ））、粘帚黴屬（Gliocladium ）物種、麯黴屬物種（例如，米麯黴（A. oryzae ）、黑麯黴（A. niger）、和泡盛麯黴（A. awamori ））、鐮孢菌屬（Fusarium ）物種、脈孢菌屬（Neurospora ）物種、肉座菌屬（Hypocrea ）物種、和翹孢黴屬（Emericella ）物種（還參見Innis等人, (1985) Sci.[科學] 228:21–26）。
如本文所用的，術語「木黴菌」或「木黴屬物種」係指先前或目前分類為木黴屬的任何真菌屬。
該表現盒可以包括在該生產宿主中，具體是在微生物生產宿主的細胞中。該生產宿主細胞可以是在真菌家族中發現的微生物宿主，並且其在大範圍的溫度、pH值和溶劑耐受性下生長。例如，預期細菌、酵母、植物、藻類或真菌（例如絲狀真菌）中的任一種都可以合適地接納（host）表現載體。
在該生產宿主細胞中包括該表現盒可以用於表現目的蛋白質，使得其可以存在於細胞內、細胞外或細胞內和細胞外的組合中。與用於回收細胞內表現所產生的蛋白質的方法相比，細胞外表現使從發酵產物中回收所需蛋白質更容易。
將核酸轉化為絲狀真菌（例如麯黴屬物種（Aspergillus spp. ），例如米麯黴（A. oryzae ）或黑麯黴（A. niger ）、灰腐質酶（H. grisea ）、特異腐質黴（H. insolens ）和裡氏木黴）的方法係本領域熟知的。用於轉化麯黴屬宿主細胞的合適的程序描述於例如EP238023中。
用於轉化木黴屬宿主細胞的合適的程序描述於例如Steiger等人，2011, Appl. Environ. Microbiol .[應用與環境微生物學]77 :114-121。取決於鈣離子濃度，將DNA攝取到宿主木黴屬物種菌株中。通常，在攝取溶液中使用約10 mM CaCl2 至50 mM CaCl2 。除了在攝取溶液中需要鈣離子外，通常包括的其他化合物係緩衝系統，例如TE緩衝液（10 Mm Tris，pH 7.4；1 mM EDTA）或10 mM MOPS（pH 6.0）緩衝液（口末啉丙磺酸）和聚乙二醇（PEG）。據信，聚乙二醇起到融合細胞膜的作用，從而允許培養基的內容物被遞送到木黴屬物種菌株的細胞質中，並且將質體DNA轉移到細胞核中。該融合時常留下整合到宿主染色體中的多個拷貝的質體DNA。
通常，將含有以105 至107 /mL、較佳的是2×106 /mL的密度的已經經歷滲透性處理的木黴屬物種原生質體或細胞的懸浮液用於轉化。將100 μL體積的在合適的溶液（例如1.2 M山梨糖醇；50 mM CaCl2 ）中的該等原生質體或細胞與所需DNA混合。通常，向攝取溶液中添加高濃度的PEG。可以將從0.1至1體積的25% PEG 4000添加到原生質體懸浮液中。然而，向原生質體懸浮液中添加約0.25體積係較佳的。也可以將添加劑例如二甲亞碸、肝素、亞精胺、氯化鉀等添加到攝取溶液中並幫助轉化。類似的程序可用於其他真菌宿主細胞。（參見，例如美國專利案號6,022,725和6,268,328，其兩者都藉由引用併入本文）。
較佳的是，用載體系統構建了遺傳穩定的轉化體，由此編碼該植酸酶多肽或其片段的核酸被穩定地整合到宿主菌株染色體中。然後藉由已知技術純化轉化體。
將表現載體引入細胞後，在有利於表現在啟動子序列控制下的基因的條件下培養轉染或轉化的細胞。
通常，將細胞在含有生理鹽和營養素的標準培養基中培養，（參見，例如Pourquie, J.等人, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION[纖維素降解的生物化學和遺傳學], Aubert, J. P.等人編輯, Academic Press[學術出版社],71-86頁, 1988，以及IImen, M.等人, (1997)Appl. Environ. Microbiol. [應用與環境微生物學] 63:1298-1306）。常見的商業製備的培養基（例如，酵母麥芽提取物（YM）肉湯，盧裡亞-貝爾塔尼（Luria Bertani，LB）肉湯和沙氏葡萄糖（Sabouraud Dextrose，SD）肉湯也可用於本發明。
培養條件也是標準的（例如，將培養物在大約28ºC在合適培養基中在搖動培養物或發酵罐中孵育，直到達到所需的植酸酶表現水平）。給定絲狀真菌的較佳的培養條件係本領域已知的，並且可以在科學文獻中和/或從真菌的來源例如美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）和真菌遺傳學儲備中心（Fungal Genetics Stock Center）找到。
在真菌生長已經建立後，將細胞暴露於有效引起或允許植酸酶、並且特別是如本文定義的植酸酶表現的條件下。在植酸酶編碼序列在誘導型啟動子的控制下的情況中，將誘導劑（例如糖、金屬鹽或抗微生物劑）以有效誘導植酸酶表現的濃度添加至培養基中。可以使用從宿主細胞中分泌的經改造之植酸酶多肽或其片段，最少的後期處理，作為全肉湯配製物。
可以使用本領域已知的任何培養方法來實現重組微生物的所消耗的全發酵液的製備，從而導致經改造之植酸酶多肽或其片段的表現。
術語「所消耗的全發酵液」在本文中定義為包括培養基、胞外蛋白質（例如，酶）和細胞生物質的發酵材料的未分級內容物。應當理解，術語「所消耗的全發酵液」還涵蓋已經使用本領域熟知的方法裂解或透化的細胞生物質。
發酵後，獲得發酵液，藉由常規分離技術去除微生物細胞和各種懸浮固體（包括剩餘的粗發酵材料），以便獲植酸酶溶液。通常使用過濾、離心、微濾、旋轉真空鼓式過濾、超濾、離心然後超濾、提取或層析法等。
可以視需要從生產宿主中回收所需蛋白質。在另一方面，藉由使用熟悉該項技術者已知的任何方法獲得了含有培養物上清液的經改造之植酸酶多肽或其片段。
該等技術的實例包括但不限於親和層析法（Tilbeurgh等人, (1984)FEBS Lett. [歐洲生化學會聯盟通訊]16:215）、離子交換層析法（Goyal等人, (1991)Biores. Technol. [生物研究技術]36:37；Fliess等人, (1983)Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. [歐洲微生物學和生物技術] 17:314；Bhikhabhai等人, (1984)J. Appl. Biochem. [應用與生物化學] 6:336；以及Ellouz等人, (1987)Chromatography [層析法]396:307），包括使用具有高分辨力的材料的離子交換（Medve等人, (1998)J. Chromatography A [層析A雜誌] 808:153）、疏水相互作用層析法（參見Tomaz和Queiroz, (1999)J. Chromatography A [層析A雜誌] 865:123；兩相分配（參見Brumbauer,等人, (1999)Bioseparation [生物分離]7:287）；乙醇沈澱；反相HPLC、在二氧化矽或陽離子交換樹脂（如DEAE）上進行層析法、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱和凝膠過濾（例如Sephadex G-75）。所需純化程度將根據經改造之植酸酶多肽或其片段的用途而變化。在一些實施方式中，純化將不是必需的。
另一方面，可能需要濃縮含有經改造之植酸酶多肽或其片段的溶液以優化回收率。使用未濃縮的溶液需要增加孵育時間以收集富集或純化的酶沈澱物。使用常規濃縮技術濃縮含酶溶液，直至獲得所需的酶水平。含酶溶液的濃縮可以藉由在本文中所討論的技術中的任一種來實現。富集和純化的示例性方法包括但不限於旋轉真空過濾和/或超濾。
另外，可以使用例如沈澱劑（例如金屬鹵化物沈澱劑）來進行所需蛋白質產物的濃縮。金屬鹵化物沈澱劑氯化鈉也可用作防腐劑。金屬鹵化物沈澱劑以有效沈澱經改造之植酸酶多肽或其片段的量使用。常規測試後，選擇至少有效量和最佳量的金屬鹵化物以有效引起酶的沈澱，連同為了最大化回收的沈澱的條件，包括孵育時間、pH、溫度和酶濃度，對於熟悉該項技術者來說將是顯而易見的。通常，向濃縮的酶溶液中添加至少約5% w/v（重量/體積）至約25% w/v的金屬鹵化物，並且通常為至少8% w/v。
沈澱酶的另一種替代方式係使用有機化合物。示例性有機化合物沈澱劑包括：4-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸的鹼金屬鹽、4-羥基苯甲酸的烷基酯、以及該等有機化合物中的兩種或更多種的共混物。有機化合物沈澱劑的添加可以在添加金屬鹵化物沈澱劑之前、與之同時或之後進行，並且添加兩種沈澱劑，有機化合物和金屬鹵化物的添加可以依次或同時進行。通常，有機沈澱劑選自由以下組成之群組：4-羥基苯甲酸的鹼金屬鹽（例如鈉鹽或鉀鹽），和4-羥基苯甲酸的線性或支鏈烷基酯，其中烷基基團含有從1至12個碳原子，以及該等有機化合物中兩種或更多種的共混物。另外的有機化合物還包括但不限於4-羥基苯甲酸甲酯（稱為對羥基苯甲酸甲酯）、4-羥基苯甲酸丙酯（稱為對羥基苯甲酸丙酯）。有關進一步的描述，參見例如美國專利案號5,281,526。有機化合物沈澱劑的添加提供了沈澱條件在pH、溫度、濃度、沈澱劑、蛋白質濃度和孵育時間方面的高度靈活性的優點。通常，將至少約0.01% w/v且不超過約0.3% w/v的有機化合物沈澱劑添加到濃縮的酶溶液中。
孵育期後，然後藉由常規分離技術（例如過濾、離心、微濾、旋轉真空過濾、超濾、壓濾、交叉膜微濾、交叉流膜微濾等），將富集或純化的酶與解離的色素和其他雜質分離，並且收集。藉由用水洗滌沈澱物可以獲得酶沈澱物的進一步富集或純化。例如，用含有金屬鹵化物沈澱劑的水，或用含有金屬鹵化物和有機化合物沈澱劑的水洗滌富集或純化的酶沈澱物。
有時從表現宿主中缺失基因係有利的，其中基因缺陷可以藉由表現載體治癒。在需要獲得具有一種或多種滅活基因的真菌宿主細胞的情況下，可以使用已知的方法（例如，揭露於美國專利案號5,246,853、美國專利案號5,475,101、和WO 92/06209中的方法）。可以藉由完全或部分缺失，藉由插入失活或藉由使基因對其預期目的不起作用的任何其他方式（使得該基因被阻止表現功能性蛋白）來完成基因滅活。
已選殖的、來自木黴屬物種或其他絲狀真菌宿主的任何基因均可缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實施方式中，可以藉由在本領域中已知的方法將待滅活的所需基因的形式插入質體來完成基因缺失。然後在所需基因編碼區內部，在一個或多個適當的限制性酶位點處切割缺失質體，並且將基因編碼序列或其一部分置換為可選擇標記。來自待缺失的基因的基因座的側翼DNA序列（較佳的是在約0.5至2.0 kb之間）保留在標記基因的任一側。適當的缺失質體將通常具有存在於其中的獨特的限制性酶位點，以使包含缺失基因（包括側翼DNA序列）和可選擇標記基因的片段能夠作為單個線性片段被去除。
取決於所使用的宿主細胞，可以進行轉錄後和/或翻譯後修飾。轉錄後和/或翻譯後修飾的一個非限制性實例係多肽的「剪切」或「截短」。在另一個情況下，該剪切可導致獲得成熟植酸酶多肽並且進一步去除N或C-末端胺基酸以產生截短形式的保留酶促活性的植酸酶。
轉錄後或翻譯後修飾的其他實例包括但不限於肉豆蔻醯化，糖基化，截短，脂化，以及酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化。熟悉該項技術者將認識到蛋白質可能經歷的轉錄後或翻譯後修飾的類型可取決於表現蛋白質的宿主生物體。
表現後可能發生多肽的進一步序列修飾。這包括但不限於氧化、去糖基化、糖化等。已知當與葡萄糖或其他還原糖一起孵育時（尤其是在高於30ºC的溫度、以及中性或鹼性pH的條件下），糖化會影響植酸酶的活性。消除離胺酸殘基的蛋白質工程化可用於防止此類修飾。這樣的一個實例可見於US 8,507,240中。例如，酵母表現可以產生高度糖基化的多肽，從而導致分子量明顯增加。另外，國際公開日為2013年8月15日的WO 2013/119470（藉由引用併入本文）涉及具有增加的穩定性（據信這係由於糖基化增加）的植酸酶。
如本文所用的，術語「糖基化」係指聚糖與分子例如蛋白質的附接。糖基化可以是酶促反應。該附接可以藉由共價鍵形成。短語「高度糖基化的」係指分子（例如酶）在許多位點以及在所有或幾乎所有可用的糖基化位點（例如N-連接的糖基化位點）處被糖基化。可替代地或除此之外，短語「高度糖基化的」可以指在所有或基本上所有N-連接的糖基化位點處的廣泛的糖基化分支（例如，與特定N-連接的糖基化位點相關的糖分解部分的大小和數目）。在一些實施方式中，經改造之植酸酶多肽在所有或基本上所有共有序列N-連接的糖基化位點（即NXS/T共有序列N-連接的糖基化位點）處被糖基化。
如本文所用的，術語「聚糖」係指多糖或寡糖，或糖綴合物（例如糖蛋白）的碳水化合物部分。聚糖可以是單糖殘基的同聚物或雜聚物。它們可能是線性或支鏈分子。
植酸酶可能具有不同程度的糖基化。已知這樣的糖基化可以改善在儲存和應用期間的穩定性。廣泛的 可以如上所討論的確定本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段的活性。
如熟悉該項技術者將理解的，酶係易碎的蛋白質，總是在飼料廠的惡劣環境中受到威脅。極端的溫度、壓力、摩擦、pH和微生物活性會降解或破壞添加到飼料中的酶。酶活性的緊迫主要在加工的調理和製粒階段期間發生。例如，飼料在製粒之前在調理期間吸收了其大部分熱能。但是，從調理器穿過丸粒模具也會加熱飼料。許多因素可能會導致通過模具的溫度升高，例如進料製劑、模具厚度、模具速度、模具規格（孔尺寸和形狀）、初始加工溫度、製粒能力等。
因此，在工業規模的飼料製粒期間的條件可以變化。酶在製粒條件下承受該等變化的能力或穩健性非常重要。熟悉該項技術者將理解，調理溫度可以根據飼料廠而變化。此外，在確定進行製粒過程的條件時，需要考慮當地法律。例如，丹麥法律要求將家禽飼料的製粒設為81ºC（環境食品部（Miljø- og Fødevareministeriet），食品局（fødevarestyrelsen），編號2017-32-31-00378）。
同樣，較高溫度的製粒條件可用於工業中以提高製粒品質（例如更好的耐久性和減少的細粉）並增加丸粒壓制能力。因此，因此存在對強健植酸酶的需要，當在調理和製粒之前將其摻入飼料中時，該強健植酸酶可以在高於80ºC的寬溫度範圍內產生穩定活性的丸粒。這對於如本文所述的液體應用的植酸酶和固體應用的植酸酶都是重要的。
可能會影響飼料酶可能承受的實際壓力的、超出調理溫度的因素包括但不限於飼料原料、飼料廠的地理位置、所用設備、模具尺寸、製粒助劑的使用、蒸汽控制、溫度控制和任何其他與商業相關的製粒條件，例如是否存在以這樣的方式來修飾飼料以減少製粒壓力的任何其他外源酶。
該等緊迫因素進一步由於高溫或超調理（super conditioning）的趨勢而變得更加複雜，這導致在製粒後以液體形式應用酶。
如果可以將強健酶進行改造，以便在調理和製粒之前將其作為液體應用，會怎麼樣？
術語「強健」和「穩健性」在本文可互換地使用，並且是指本文揭露的經改造之植酸酶或其片段承受工業飼料生產中調理和製粒過程中變化的能力。作為高Tm-植酸酶類多肽及其片段的一部分，本文揭露的經改造之植酸酶多肽及其片段係可以在調理和製粒之前以液體形式應用於飼料的強健酶的實例。
換句話說，當在調理和製粒之前以液體形式應用或以未經配製、未經包衣、未經保護的固體形式應用時，新穎的經改造之植酸酶多肽及其片段能夠以未經配製、未經包衣、未經保護的形式在工業飼料製粒過程中承受此類變化。
術語「液體」、「液體形式」和「液體配製物」可互換地使用，並且意指在調理和製粒之前能以任何方式將酶以液體形式應用至飼料。
據信將強健經改造之植酸酶多肽或其片段以液體形式應用至飼料中與將這種植酸酶作為包衣顆粒應用相比係有益的。這種包衣顆粒係目前生產適於高溫調理和製粒的植酸酶產品的商業途徑。強健酶的液體應用的益處包括；1) 動物攝取後，酶將立即開始起作用，因為該酶在與飼料相互作用之前不必從包衣顆粒中釋放出來，2) 酶在整個飼料中的分佈得到改善，從而確保了酶向動物的遞送更一致，這對吃少量飼料的幼小動物尤其重要，3) 在飼料中分佈均勻使得更容易測量飼料中的酶，以及 4) 在強健植酸酶的情況下（例如，如本文揭露的經改造之植酸酶多肽和片段），它可能開始降解飼料中已經存在的植酸鹽。
換句話說，新穎的經改造之植酸酶多肽及其片段非常穩健，以至於在調理和製粒之前不需要特殊的包衣或配製來將其應用於飼料，因為它們已經被工程化以承受在工業飼料生產中所使用的調理和製粒的緊迫。因此，本文所述的新穎的經改造之植酸酶多肽及其片段的穩健性使得它們能以未包衣的顆粒（granule或particle）的形式或當置於液體中時能以未經包衣的和未經保護的形式應用。
應當指出，經改造之植酸酶多肽及其片段可以廉價地配製在固體運載體上而不特別需要保護性包衣，並且在整個調理和製粒過程中仍保持活性。當其中使用苛刻條件或條件允許（例如在高於90ºC的超調理飼料的情況下）的某些區域需要時，以固體形式應用時提供另外熱穩定性的保護性包衣對於獲得製粒穩定性可能是有益的。
使用蛋白質工程領域中已知的方法和技術的組合衍生了所揭露的經改造之植酸酶多肽或其片段，該方法和技術包括系統發育分析、位點評估文庫、組合文庫、高通量篩選和統計分析。
在一方面，本揭露涉及與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少82%序列同一性的經改造之植酸酶多肽或其片段。
熟悉該項技術者將理解，這種至少82%序列同一性還包括82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
熟悉該項技術者將理解，這種至少79%序列同一性還包括79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
還可以提及以下，因為在一些實施方式中，提供了： a) 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段還與SEQ ID NO:2、3、8、10、12、18、19、24、26、27、28、30、31、32、33、和/或36的胺基酸序列具有至少81%（例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性； b) 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段還與SEQ ID NO:1、4、5、7、9、11、14、15、17、21、25、34、和/或35的胺基酸序列具有至少82%（例如82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性； c) 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段還與SEQ ID NO:13的胺基酸序列具有至少83%（例如83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性； d) 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段還與SEQ ID NO:6、22、和/或64的胺基酸序列具有至少79%（例如79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性；和/或 e) 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段還與SEQ ID NO:16、20、23、29、和/或37的胺基酸序列具有至少80%（例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性。
在其他方面，該多肽包含經改造之植酸酶多肽的核心結構域或為經改造之植酸酶多肽的核心結構域片段。「核心結構域片段」在本文中定義為從多肽的胺基和/或羧基末端缺失的一個或多個胺基酸的多肽。如本文所用的，短語「核心結構域」係指涵蓋維持多肽的結構和功能（例如植酸水解）所必需的胺基酸的多肽區域。核心結構域中的胺基酸可以被進一步修飾以改善在各種條件下（例如但不限於pH）的熱穩定性或催化活性。在一些非限制性實施方式中，本文揭露的經改造之植酸酶多肽或其片段的核心結構域對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置14-325。在其他非限制性實施方式中，該核心結構域對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置13-326、12-327、11-328、10-329、9-330、8-331、7-332、6-333、5-334、4-335、3-336、2-337或1-338。在其他實施方式中，核心結構域的N-末端對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25，以及核心結構域的C-末端對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、或413。
因此，本文還提供了： f) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:6和/或64的胺基酸14-325具有至少78%（例如，78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置； g) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:2、8、27和/或37的胺基酸14-325具有至少79%（例如，79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置； h) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:3、10、12、18、25、26、28、30、32、35、65、70和/或86的胺基酸14-325具有至少81%（例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置； i) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:1、4、5、7、9、11、13-17、21、22、31、33、34、36、64、66-69和/或71-84的胺基酸14-325具有至少82%（例如，82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置； j) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:19、20、23和/或24的胺基酸14-325具有至少83%（例如，83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置；和/或 k) 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:29的胺基酸14-325具有至少84%（例如，84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）序列同一性，其中所述胺基酸位置對應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置。
在仍另一方面，與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少82%序列同一性的經改造之植酸酶多肽或其片段還可以具有隱瑪律可夫模型（HMM）評分至少為約1200（例如至少約1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750或1800）的胺基酸序列，如表11中關於高Tm植酸酶類多肽所示。
在仍其他方面，本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段可在其多肽序列內一個或多個位置處包含一個或多個特定胺基酸取代。同樣地，在一些實施方式中，本文提供了包含一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個）胺基酸取代的經改造之植酸酶多肽或其片段，該胺基酸取代選自由以下組成之群組：30(L、I)、37Y、45P、89T、182R、194M、195F、202S、228Y、256H、261H、和298V，其中位置對應於SEQ ID NO:1或57的編號。
另外或此外，任何經改造之植酸酶多肽或其片段可包含一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個）胺基酸取代，該胺基酸取代選自由以下組成之群組：3T、6S、9Q、73I、76K、78S、118Q、123A、130V、163P、186D、187K、209A、284S、288A、289R、337V、345A、和347K，其中位置對應於SEQ ID NO:1的編號。在一些實施方式中，該經改造之植酸酶多肽選自由以下組成之群組：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、和SEQ ID NO:87。
含有一個或多個胺基酸取代的經改造之植酸酶多肽或其片段與不包含所述一個或多個胺基酸取代的植酸酶多肽或其片段相比，可表現出一種或多種特性改善或增強，例如但不限於熱穩定性改善（例如，熱穩定性改善約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%或更多中任一項（包括介於該等值之間的所有百分比）或活性改善（例如，相比在pH 5.5處的活性，在pH 3.5處的比活性和/或活性改善）（例如，活性改善約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%或更多中任一項（包括介於該等值之間的所有百分比））。
在又其他方面，本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段可以具有一個或多個取代（例如以上揭露的取代中的一個或多個），其增加了在pH 3.5處與pH 5.5處的植酸酶的活性（例如比活性）的比率。因此，在一些實施方式中，本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段在pH 3.5處的活性（例如，比活性）與在pH 5.5處的活性（例如，比活性）的比率大於或等於約1.2（例如約1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高中的任一項）。
還描述了一種經改造之植酸酶多肽或其片段，使用標準進料製粒回收率測試，當在95ºC在MLA中應用30秒時，該經改造之植酸酶多肽或其片段具有至少50%的進料製粒回收率。此外，如本文所述的具有至少50%的進料製粒回收率的經改造之植酸酶多肽或其片段還可以具有與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列至少82%的序列同一性。
進料製粒回收率可以是從約50%至約100%範圍內的任何值，特別是約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在一些實施方式中，當在95ºC作為固體應用時，該經改造之植酸酶多肽或其片段具有至少約60%、65%、70%、75%、70%、85%、90%、95%或99%的進料製粒回收率。
熟悉該項技術者將理解，進料製粒回收率可以根據所用飼料的類型、所用的調理和製粒條件（例如溫度和水分含量，用於確定活性的測定法等）而變化。
使用標準進料製粒測試，本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少0.7。該比率包括約0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98和0.99。
在另一實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其片段，相比於：a) SEQ ID NO:60；b) 具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c) SEQ ID NO:104；和/或 d) SEQ ID NO:104的胺基酸22-431，該經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少約3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
在另一實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其片段，相比於：a) SEQ ID NO:60；b) 具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c) SEQ ID NO:104；和/或 d) SEQ ID NO:104的胺基酸22-431，該經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率的比率為至少約3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段可以進一步包含至少約92.5ºC、約93ºC、約94ºC、約95ºC、約96ºC、約97ºC、約98ºC、約99ºC、約100ºC、或約101ºC的Tm 溫度（使用實例3所述的差示掃描量熱測定條件），且結果提供於實例4中。
在另一實施方式中，揭露了一種經改造之植酸酶多肽或其片段，相比於：a) SEQ ID NO:60；b) 具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c) SEQ ID NO:104；和/或 d) SEQ ID NO:104的胺基酸22-431，該經改造之植酸酶多肽或其片段的Tm溫度比率為至少約1.08、1.10、1.12、1.14、1.16、1.18或1.20、2.1、2.4、2.7、3.0或3.3（如藉由差示掃描量熱法測量的）。
在另一方面，本文揭露的任何經改造之多肽或其片段在如實例4所述的那些測定條件下在pH 3.5處包含至少約100 U/mg的比活性。比活性範圍（pH 3.5處的U/mg）包括但不限於約100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
在另一方面，本文揭露的一些經改造之多肽或其片段在如實例4所述的那些測定條件下在pH 5.5處包含至少約100 U/mg的比活性。比活性範圍（pH 5.5時的U/mg）包括但不限於約100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
在仍另一方面，本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段可以在約3.0或更低的pH處以液體形式穩定。這點在本文所述的經改造之植酸酶多肽或其片段穿過動物的消化道時十分相關，如下所討論的。
在另一實施方式中，描述了包含本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段的動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物。
重要的是，飼料添加劑酶（例如植酸酶）在通過動物的消化道時會經受非常惡劣的條件，即低pH和存在消化酶。胃蛋白酶係單胃動物胃腸道中存在的最重要的蛋白水解消化酶之一。胃蛋白酶在酸性區域（pH 1.5-6.0穩定至pH 8.0）具有低特異性和高pH耐受性。本文所述的經改造之植酸酶多肽或其片段主要對胃蛋白酶具有抗性，而胃蛋白酶對於良好的體內性能係必需的。
包含本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段的動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物可以 (i) 單獨使用，或 (ii) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物組合使用，或 (iii) 與至少一種其他酶一起使用，或 (iv) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物以及至少一種其他酶組合使用，或 (v) (i)、(ii)、(iii) 或 (iv) 中的任一種、進一步包含至少一種其他飼料添加劑組分，以及視需要該經改造之植酸酶多肽或其片段以至少0.1 g/噸飼料的量存在。
術語「飼料添加劑」、「飼料添加劑組分」和/或「飼料添加劑成分」在本文可互換地使用。
飼料添加劑可描述為用於動物營養的產品，目的是改善飼料品質和動物來源食物的品質，或改善動物的性能和健康，例如提供增強的飼料材料消化率。
飼料添加劑可分為多種類別，例如感官類添加劑，該感官類添加劑刺激動物的食欲，使其自然而然地想多進食。營養添加劑提供了可能是動物飲食中缺乏的特定營養素。畜牧學添加劑藉由飼料中的添加劑改善了動物飲食的總體營養價值。
此類飼料添加劑的實例包括但不限於益生菌、精油（例如但不限於麝香草酚和/或肉桂醛）、脂肪酸、短鏈脂肪酸（例如丙酸和丁酸等）、維生素、礦物質、胺基酸等。
飼料添加劑組成物或製劑還可以包含至少一種選自由以下組成之群組的組分：蛋白質、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化鈉、硫酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、甲酸鈉、山梨酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、乙酸鉀、檸檬酸鉀、甲酸鉀、乙酸鉀、山梨酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、檸檬酸鎂、甲酸鎂、山梨酸鎂、焦亞硫酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。
至少一種其他酶（即除本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段外）可包括在本文揭露的飼料添加劑組成物或製劑中，可包括但不限於木聚糖酶、澱粉酶、另一種植酸酶、β-葡聚糖酶和/或蛋白酶。
木聚糖酶係向線性多糖β-1,4-木聚糖降解為木糖從而分解半纖維素（植物細胞壁的主要組分之一）的一類酶給出的名稱。木聚糖酶，例如內切-β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）水解木聚糖主鏈。
在一個實施方式中，該木聚糖酶可以是任何可商購的木聚糖酶。合適地，木聚糖酶可以是內切-1,4-P-d-木聚糖酶（分類為E.G.3.2.1.8）或1,4β-木糖苷酶（分類為E.G.3.2.1.37）。在一個實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段與木聚糖內切酶（例如內切-1,4-P-d-木聚糖酶）和另一種酶組合的組成物。本文提到的所有E.C.酶分類涉及在國際生物化學與分子生物學聯合會（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）命名委員會的Enzyme Nomenclature – Recommendations [酶命名法-推薦] （1992） – ISBN 0-12-226164-3中提供的分類，其藉由引用併入本文。
在另一實施方式中，該木聚糖酶可以是來自芽孢桿菌屬、木黴屬（Trichodermna ）、嗜熱真菌屬（Therinomyces ）、麯黴屬、腐質黴屬和青黴屬的木聚糖酶。在仍另一實施方式中，該木聚糖酶可以是Axtra XAP®或Avizyme 1502®中的木聚糖酶，兩者都是來自鄧尼斯科公司（Danisco A/S）的可商購的產品。在一個實施方式中，該木聚糖酶可以是兩種或更多種木聚糖酶的混合物。在仍另一實施方式中，該木聚糖酶係內切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。
在一個實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段和木聚糖酶的組成物。在一個實施方式中，該組成物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大於750的木聚糖酶單位/g組成物。
在一個實施方式中，該組成物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大於8000的木聚糖酶單位/g組成物。
應當理解，一個木聚糖酶單位（XU）係在pH 5.3和50ºC，每分鐘從燕麥木聚糖（oat-spelt-xylan）底物釋放0.5 µmol的還原糖等價物（為木糖，藉由二硝基水楊酸（DNS）測定 - 還原糖方法）的酶量。（Bailey等人，Journal of Biotechnology [生物技術雜誌]，第23卷(3)，1992年5月，257-270）。
澱粉酶係向能夠將澱粉水解為較短鏈的寡糖（例如麥芽糖）的一類酶。那麼，與從原始的澱粉分子轉移相比，葡萄糖部分可以更容易地從麥芽糖轉移到單甘油酯或糖基單甘油酯。術語澱粉酶包括α-澱粉酶（E.G. 3.2.1.1）、G4-形成澱粉酶（E.G. 3.2.1.60）、β-澱粉酶（E.G. 3.2.1.2）和γ-澱粉酶（E.G. 3.2.1.3）。澱粉酶可以是細菌或真菌來源的，或係化學修飾的或蛋白質經改造之突變體。
在一個實施方式中，該澱粉酶可以是兩種或更多種澱粉酶的混合物。在另一實施方式中，該澱粉酶可以是例如來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis ）的α-澱粉酶的澱粉酶和例如來自解澱粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens ）的α-澱粉酶的澱粉酶。 在一個實施方式中，該α-澱粉酶可以是Axtra XAP®或Avizyme 1502®中的α-澱粉酶，兩者都是來自鄧尼斯科公司（Danisco A/S）的可商購的產品。在又另一實施方式中，該澱粉酶可以是抗胃蛋白酶的-α澱粉酶，例如抗胃蛋白酶的木黴屬（例如裡氏木黴）α澱粉酶。在英國申請案號101 1513.7（其藉由引用併入本文）和PCT/IB2011/053018（其藉由引用併入本文）教導了合適的抗胃蛋白酶的α-澱粉酶。
應當理解，一個澱粉酶單位（AU）係在pH 6.5和37ºC，每分鐘從非水溶性交聯澱粉聚合物底物釋放1 mmol的糖苷鍵的酶量。（這在本文中可被稱為用於確定1 AU的測定法）。
在一個實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段和澱粉酶的組成物。在一個實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段、木聚糖酶和澱粉酶的組成物。在一個實施方式中，該組成物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大於750的澱粉酶單位/g組成物。
在一個實施方式中，該組成物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大於15000的澱粉酶單位/g組成物。
如本文所用的術語蛋白酶（protease）與肽酶或蛋白酶（proteinase）同義。該蛋白酶可以是枯草桿菌蛋白酶（E.G. 3.4.21.62）或芽孢桿菌溶素（E.G. 3.4.24.28）或鹼性絲胺酸蛋白酶（E.G. 3.4.21.x）或角蛋白酶（E.G. 3.4.x.x）。在一個實施方式中，該蛋白酶係枯草桿菌蛋白酶。適合的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。
化學修飾的或蛋白質經改造之突變體也是合適的。該蛋白酶可以是絲胺酸蛋白酶或金屬蛋白酶，例如鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。在一個實施方式中，本文提供了包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段和一種或多種蛋白酶的組成物。
鹼性蛋白酶的實例係枯草桿菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢桿菌屬物種的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309（參見例如，美國專利案號6,287,841）、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168（參見例如，WO 89/06279）。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例係胰蛋白酶（例如豬或牛來源的）和鐮孢菌屬蛋白酶（參見例如，WO 89/06270和WO 94/25583）。有用的蛋白酶的實例還包括但不限於WO 92/19729和WO 98/20115中描述的變體。
在一個實施方式中，該蛋白酶選自由以下組成之群組：枯草桿菌蛋白酶、芽孢桿菌溶素、鹼性絲胺酸蛋白酶、角蛋白酶和擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis ）蛋白酶。
應當理解，一個蛋白酶單位（PU）係在pH 7.5（40 mM Na2 PO4 /乳酸緩衝液）和40ºC，一分鐘內從底物（0.6%酪蛋白溶液）釋放一微克酚類化合物（表示為酪胺酸等價物）的酶量。這可被稱為用於確定1 PU的測定法。
在一個實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段和蛋白酶的組成物。在另一實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段以及木聚糖酶和蛋白酶的組成物。在仍另一實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段以及澱粉酶和蛋白酶的組成物。在又另一實施方式中，本揭露涉及包含本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽或其片段以及木聚糖酶、澱粉酶和蛋白酶的組成物。
在一個實施方式中，該組成物包含約10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大於750的蛋白酶單位/g組成物。
在一個實施方式中，該組成物包含約500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大於15000的蛋白酶單位/g組成物。
至少一種直接飼餵微生物（DFM）可以包含至少一種活的微生物，例如活的細菌菌株或活的酵母或活的真菌。較佳的是，DFM包含至少一種活的細菌。
DFM可能是一種形成孢子的菌株，因此術語DFM可能由孢子組成或包含孢子，例如細菌孢子。因此，如本文所用的「活的微生物」可能包括微生物孢子，如內孢子或分生孢子。可替代地，本文所述飼料添加劑組成物中的DFM可能不由微生物孢子組成或不包含微生物孢子，例如內孢子或分生孢子。
微生物可以是天然存在的微生物，也可以是轉化的微生物。
如本文所述的DFM可包含來自一個或多個以下屬的微生物：乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus ）、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus ）、腸球菌屬（Enterococcus ）、明串珠菌屬（Leuconostoc ）、肉食桿菌屬（Carnobacterium ）、丙酸菌屬（Propionibacterium ）、雙歧桿菌屬、梭菌屬（Clostridium ）和巨球型菌屬（Megasphaera ）及其組合。
較佳的是，DFM包含一種或多種選自以下的芽孢桿菌屬物種的細菌菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ）、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilis ）和解澱粉芽孢桿菌。
如本文所用的「芽孢桿菌屬」包括如熟悉該項技術者已知的「芽孢桿菌屬」內的所有物種，包括但不限於：枯草芽孢桿菌（B. subtilis ）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis ）、遲緩芽孢桿菌（B. lentus）、短芽孢桿菌（B. brevis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus ）、嗜鹼芽孢桿菌（B. alkalophilus ）、解澱粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens ）、克勞氏芽孢桿菌（B. clausii ）、耐鹽芽孢桿菌（B. halodurans ）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium ）、凝結芽孢桿菌（B. coagulans ）、環狀芽孢桿菌（B. circulans ）、吉氏芽孢桿菌（B. gibsonii ）、短小芽孢桿菌（B. pumilis ）和蘇雲金芽孢桿菌（B. thuringiensis ）。據認識，芽孢桿菌屬繼續經歷分類學重組。因此，該屬旨在包括已重新分類的物種，包括但不限於例如嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus ）（現在稱為「嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus ）」）或多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa ）（現在係「多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa ）」）的此類生物體。在緊迫環境條件下產生抗性內孢子被認為係芽孢桿菌屬的定義性特徵，儘管這個特徵也適用於最近命名的脂環酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus ）、雙芽孢桿菌屬（Amphibacillus ）、硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus ）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus ）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus ）、線性桿菌屬（Filobacillus ）、薄壁芽孢桿菌屬（Gracilibacillus ）、喜鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus ）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus ）、需鹽芽孢桿菌屬（Salibacillus ）、耐熱芽孢桿菌屬（Thermobacillus ）、脲芽孢桿菌屬（Ureibacillus ）和枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus ）。
在另一方面，DFM可以進一步與如下乳桿菌屬物種組合：乳脂鏈球菌（Lactococcus cremoris ）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）及其組合。
DFM可以進一步與如下乳桿菌屬物種組合：布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri ）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus ）、乾酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei ）、開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri ）、雙叉乳酸桿菌（Lactobacillus bifidus ）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis ）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus ）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、唾液乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus ）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus ）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei ）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）、發酵乳桿菌（Lactobacillus reuteri ）、香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis ）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis ）、戴耳布呂克氏乳桿菌（Lactobacillus delbreuckii ）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）、類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum ）、香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis ）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、捲曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus ）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri ）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii ）和詹氏乳桿菌（Lactobacillus jensenii ）及其任何組合。
在仍另一方面，DFM可以進一步與如下雙歧桿菌屬（Bifidobacteria ）物種組合：乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidium ）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum ）、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis ）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve ）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis ）、鏈狀雙歧桿菌（Bifidobacterium catenulatum ）、假小鏈雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum ）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis ）、和角雙歧桿菌（Bifidobacterium angulatum ）、及其任何組合。
可以提到的細菌有以下幾個物種：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、腸球菌、腸球菌屬物種和片球菌屬物種、乳桿菌屬物種、雙歧桿菌屬物種、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌（Pediococsus acidilactici ）、乳酸乳球菌、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum ）、枯草芽孢桿菌、特恩丙酸桿菌（Propionibacterium thoenii ）、香腸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii ）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum ）、動物雙歧桿菌動物亞種（Bifidobacterium animalis ssp.animalis ）、羅伊氏乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、唾液乳桿菌唾液亞種（Lactobacillus salivarius ssp.Salivarius ）、丙酸桿菌物種及其組合。
本文所述的直接飼餵微生物包含一種或多種細菌菌株，可以是同一類型的（屬、種和菌株），也可以包含屬、種和/或菌株的混合物。
可替代地，DFM可以與WO 2012110778中揭露的一種或多種產品或該等產品中包含的微生物組合，總結如下：枯草芽孢桿菌菌株2084登錄號NRRLB-50013、枯草芽孢桿菌菌株LSSAO1登錄號NRRL B-50104、和枯草芽孢桿菌菌株15A-P4 ATCC登錄號PTA-6507（來自Enviva Pro®.（以前稱為Avicorr®）；枯草芽孢桿菌菌株C3102（來自Calsporin®）；枯草芽孢桿菌菌株PB6（來自Clostat®）；短小芽孢桿菌（8G-134）；腸球菌NCIMB 10415 (SF68) （來自Cylactin®）；枯草芽孢桿菌菌株C3102（來自Gallipro® & GalliproMax®）；地衣芽孢桿菌（來自Gallipro®Tect®）；腸球菌和片球菌（來自Poultry star®）；乳桿菌、雙歧桿菌和/或腸球菌來自Protexin®）；枯草芽孢桿菌菌株QST 713（來自Proflora®）；解澱粉芽孢桿菌CECT-5940（來自Ecobiol® & Ecobiol® Plus）；屎腸球菌（Enterococcus faecium ）SF68（來自Fortiflora®）；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌（來自BioPlus2B®）；乳酸菌7 屎腸球菌（來自Lactiferm®）；芽孢桿菌菌株（來自CSI®）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）（來自Yea-Sacc®）；腸球菌（來自Biomin IMB52®）；乳酸片球菌、腸球菌、動物雙歧桿菌動物亞種、羅伊氏乳桿菌、唾液乳桿菌唾液亞種（來自Biomin C5®）；香腸乳桿菌（來自Biacton®）；腸球菌（來自Oralin E1707®）；腸球菌（2個菌株）、乳酸乳球菌DSM 1103（來自Probios-pioneer PDFM®）；鼠李糖乳桿菌和香腸乳桿菌（來自Sorbiflore®）；枯草芽孢桿菌（來自Animavit®）；腸球菌（來自Bonvital®）；釀酒酵母（來自Levucell SB 20®）；釀酒酵母（來自Levucell SC 0 & SC10® ME）；乳酸片球菌（來自Bactocell）；釀酒酵母（來自ActiSaf® （以前稱為BioSaf®））；釀酒酵母NCYC Sc47（來自Actisaf® SC47）；丁酸梭菌（來自Miya-Gold®）；腸球菌（來自Fecinor和Fecinor Plus®）；釀酒酵母NCYC R-625（來自InteSwine®）；釀酒酵母（來自BioSprint®）；腸球菌和鼠李糖乳桿菌（來自Provita®）；枯草芽孢桿菌和米麯黴（來自PepSoyGen-C®）；蠟樣芽孢桿菌（來自Toyocerin®）；蠟樣芽孢桿菌變體toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 （來自TOYOCERIN®）、或其他DFM，例如地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌（來自BioPlus® YC）和枯草芽孢桿菌（來自GalliPro®）。
DFM可能與Enviva®PRO組合，Enviva®PRO可商購自鄧尼斯科公司（Danisco A/S）。Enviva Pro®係一個芽孢桿菌屬菌株2084登錄號NRRL B-50013、芽孢桿菌屬菌株LSSAO1登錄號NRRL B-50104和芽孢桿菌屬菌株15A-P4 ATCC登錄號PTA-6507的組合（如在US 7,754,469 B中所教導的-藉由引用併入本文）。
也可以將本文所述的DFM與來自以下屬的酵母結合：酵母屬（ Saccharomyces ）物種。
較佳的是，本文所述的DFM包括通常被認為係安全（GRAS）的微生物，較佳的是經GRAS批准的微生物。
熟悉該項技術者將容易地知道來自本文所述屬中的特定微生物物種和/或菌株，其用於食品和/或農業工業中並且其通常被認為適合於動物消費。
在某些實施方式中，重要的是DFM具有對熱的耐受性，即耐熱性。當飼料被壓成丸粒時尤其如此。因此，在另一實施方式中，DFM可能是耐熱微生物，例如耐熱細菌，包括例如芽孢桿菌屬物種。
在其他方面，可能需要DFM包含產孢子細菌，例如芽孢桿菌綱，例如芽孢桿菌屬物種。芽孢桿菌綱能在生長不利的條件下形成穩定的內孢子，對熱、pH、水分和消毒劑有很強的抵抗力。
本文所述的DFM可減少或阻止致病性微生物（如產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens ）和/或大腸桿菌和/或沙門氏菌屬（Salmonella ）物種和/或彎曲桿菌屬（Campylobacter ）物種）在腸道內的建立。換句話說，DFM可能具有抗致病性。如本文所用的術語「抗致病性」，係指DFM抵抗病原體的作用（負面影響）。
如上所述，DFM可以是任何合適的DFM。例如，下面的測定「DFM測定」可以用來確定微生物是否適合成為DFM。如本文所用的DFM測定在US2009/0280090中有更詳細的說明。為了避免疑問，根據本文所講授的「DFM測定」，選擇作為抑制性菌株（或抗致病性DFM）的DFM，係一種適合於根據本揭露使用的DFM，即根據本揭露的飼料添加劑組成物中使用的DFM。
每個管中都植入了來自代表性簇的代表性病原體（如細菌）。
來自潛在DFM的上清液，經好氧或厭氧培養，被添加到接種的管中（不添加上清液的對照組除外）並孵育。孵育後，對每一種病原菌分別測定對照和處理的上清的管的光密度（OD）。
與對照組（不含任何上清液）相比，產生了較低的OD的（潛在的DFM）菌株的集落可以將其分類為抑制性菌株（或抗致病性DFM）。因此，如本文所用的DFM測定在US 2009/0280090中有更詳細的說明。
較佳的是，本DFM測定中使用的代表性病原體可以是下列一種（或多種）：梭菌屬，例如產氣莢膜梭菌和/或艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile ）、和/或大腸桿菌和/或沙門氏菌物種和/或彎曲桿菌物種。在一個較佳的實施方式中，該測定用一個或多個產氣莢膜梭菌和/或艱難梭狀芽孢桿菌和/或大腸桿菌，較佳的是產氣莢膜梭菌和/或艱難梭狀芽孢桿菌，更較佳的是產氣莢膜梭菌進行。
抗致病性DFM包括以下一種或多種細菌，並描述於WO 2013029013中： 枯草芽孢桿菌菌株3BP5登錄號NRRL B-50510、 解澱粉芽孢桿菌菌株918 ATCC登錄號NRRL B-50508、和 解澱粉芽孢桿菌菌株1013 ATCC登錄號NRRL B-50509。
DFM可以作為一種或多種培養物和一種或多種運載體製備（如果使用的話），並可以將它們添加到條帶或槳式混合機中，並且混合約15分鐘，儘管時間可以增加或減少。將組分共混，這樣使得導致培養物和運載體的均勻混合物。最終產物較佳的是為乾燥的可流動粉末。DFM包括含一種或多種細菌菌株，然後可以將其添加到動物飼料或飼料預混物，添加到動物的水，或以其他本領域已知的途徑施用（較佳的是與本文所述的酶同時）。
在DFM混合物中包含單個菌株的比例可以從1%到99%不等，較佳的是從25%到75%不等。
動物飼料中DFM的適合劑量範圍為約1x103 CFU/g飼料至約1x1010 CFU/g飼料，合適地在約1x104 CFU/g飼料至約1x108 CFU/g飼料之間，適當地在約7.5x104 CFU/g飼料至約1x107 CFU/g飼料之間。
在另一方面，餵養料中DFM的劑量超過約1x103 CFU/g飼料，適當地超過約1x104 CFU/g飼料，合適地超過約5x104 CFU/g飼料，或適當地超過約1x105 CFU/g飼料。
飼料添加劑組成物中DFM的劑量從約1x103 CFU/g 組成物至約1x1013 CFU/g 組成物，較佳的是1x105 CFU/g 組成物至約1x1013 CFU/g 組成物，更較佳的是在約1x106 CFU/g 組成物至約1x1012 CFU/g 組成物之間，並且最較佳的是在約3.75x107 CFU/g 組成物至約1x1011 CFU/g 組成物之間。在另一方面，飼料添加劑組成物中DFM的劑量大於約1x105 CFU/g 組成物，較佳的是大於約 1x106 CFU/g 組成物，並且最較佳的是大於約3.75x107 CFU/g 組成物。在一個實施方式中，飼料添加劑組成物中DFM的劑量大於約2x105 CFU/g 組成物，適當地大於約2x106 CFU/g 組成物，合適地大於約3.75x107 CFU/g 組成物。
在仍另一方面，揭露了顆粒狀飼料添加劑組成物，用於在動物飼料中使用，該動物飼料包含如本文所述的具有植酸酶活性的至少一種多肽，單獨的或與至少一種直接飼餵微生物組合、或與至少一種其他酶組合、或與至少一種直接飼餵微生物和至少一種其他酶組合使用，其中該飼料添加劑組成物包含的可以是任何形式，例如顆粒狀顆粒。此類顆粒狀顆粒可以藉由選自由以下組成之群組的方法產生：高剪切製粒、鼓式製粒、擠出、滾圓、流化床凝集、流化床噴塗、噴霧乾燥、冷凍乾燥、造粒、噴霧冷卻、旋轉式圓盤霧化、凝聚、壓片或上述方法的任何組合。
此外，顆粒狀飼料添加劑組成物的顆粒可具有大於50微米並且小於2000微米的平均直徑。
熟悉該項技術者將理解動物飼料可以包括植物材料，如玉米、小麥、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵，或針對家禽、豬、反芻動物、水產養殖和寵物的該等植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。預期動物性能參數，如生長、採食量和飼料效率，但同時均勻性改善、動物房內的氨濃度降低以及因此動物的福利和健康狀況改善，都將得到改進。
因此，揭露了一種用於改善動物飼料的營養價值的方法，其中可以將如本文所述的任何經改造之植酸酶或其片段添加到動物飼料中。
如本文所用的短語「有效量」係指在一個或多個指標方面賦予動物改善的性能所需的活性劑（例如植酸酶，例如本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽）的量，單獨或與一種或多種其他活性劑（例如但不限於一種或多種另外的酶、一種或多種DFM、一種或多種精油等）組合使用。
如本文所用的，術語「動物性能」可以藉由任何指標，例如但不限於動物的飼料效率和/或增重和/或藉由飼料轉化率和/或營養素在飼料中的消化率（例如胺基酸消化率或磷消化率）和/或飼料中的可消化能量或代謝能和/或藉由氮保留量和/或藉由動物避免疾病的負面影響的能力或藉由受試者的免疫應答來確定。
動物的性能特徵可以包括但不限於：體重；增重；質量；體脂百分比；高度；體脂分佈；生長；生長率；卵大小；卵重量；卵質量；產卵率；礦物質吸收；礦物質排泄；礦物質保留量；骨密度；骨強度；飼料轉化率（FCR）；平均日採食量（ADFI）；平均日增重（ADG）保留量和/或銅、鈉、磷、氮和鈣中任一種或多種的分泌；胺基酸保留量或吸收量；礦化、骨礦化屠體收率和屠體品質。
「在一個或多個指標方面的動物性能改善」意指與不包含本文所述的飼料添加劑組成物的飼料相比，由於使用包含該飼料添加劑組成物的飼料，受試者中的飼料效率增加和/或增重增加和/或飼料轉化率降低和/或飼料中的營養素或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免壞死性腸炎的負面影響的能力改善和/或免疫應答改善。
較佳的是，「動物性能改善」意指存在飼料效率增加和/或增重增加和/或飼料轉化率降低。如本文所用的，術語「飼料效率」係指當一段時間內給動物無限制地餵食或飼餵規定量的食物時出現的動物增重的量。如本文所用的「指標中的改善」或「改善的指標」係指在動物定義中指標下列出的至少一個參數的改善。
「飼料效率增加」意指與在不存在根據本發明的飼料添加劑組成物的情況下飼餵的動物相比，在飼料中使用本發明的飼料添加劑組成物導致每單位採食量中增重增加。
如本文所用的，術語「飼料轉化率」係指飼餵給動物以使動物體重增加的規定量的飼料量。
改善的飼料轉化率意指較低的飼料轉化率。
「較低的飼料轉化率」或「改善的飼料轉化率」意指在飼料中使用飼料添加劑組成物導致動物增重指定量飼餵給動物的所需要的飼料量低於飼料添加劑組成物的情況下使動物增重相同量時所需的飼料量。
性能參數的改善可以針對其中所用飼料不包含植酸酶的對照。
術語「脛骨灰分」係指骨礦化的量化方法。此參數指示磷是否不足（例如，磷缺乏的陰性對照飲食中的含量應低）或足夠（例如，植酸酶處理中的含量與滿足肉雞對磷的需求的陽性對照飲食相當） 術語「磷缺乏飲食」係指磷水平不足以滿足動物營養需求的飲食，例如，用磷水平遠低於國家研究委員會（NRC）推薦水平配製的飼料或肉用種雞。動物飼料中的礦物質水平低於最佳生長所需的礦物質水平。如果飲食中缺乏磷，動物也不會攝取鈣。Ca過多會導致磷（P）消化率變差，並造成不溶性礦物-植酸鹽複合物的形成。P和Ca的缺乏都會導致骨骼完整性下降、低於正常的生長並最終導致體重下降。
術語「礦化」或「礦化」涵蓋礦物質沈積或礦物質的釋放。礦物質可能會從動物體內沈積或釋放。礦物質可能會從飼料中釋放。礦物質可以包括動物飲食中必需的任何礦物質，並且可以包括鈣、銅、鈉、磷、鐵和氮。在一個較佳的實施方式中，本發明的經改造之植酸酶多肽或其片段在食物或飼料中的使用導致鈣在動物體內（特別是在骨中）的沈積增加。
如本文所用的營養素消化率意指從胃腸道或胃腸道特定區段（例如小腸）消失的營養素的比率。營養素消化率可測量為所施用至受試者的營養素與受試者糞便中所排出來的營養素之間的差值、或施用至受試者的營養素與保留在胃腸道指定區段（例如回腸）上的消化物中的營養素之間的差值。
如本文所用的，營養素消化率可以測量為藉由一段時間內營養素攝入量與藉由排泄物完全收集而得出的營養素的排出量之間的差異；或藉由使用惰性標記來測量，其中該惰性標記不被動物吸收並允許研究者可計算在整個胃腸道或胃腸道的一部分消失的營養素的量。這樣的惰性標記可以是二氧化鈦、氧化鉻或酸不溶性灰分。消化率可以表示為在飼料中營養素的百分比，或表示為可消化的營養素的質量單位/飼料中的營養素的質量單位。
如本文所用的營養素消化率涵蓋磷消化率、澱粉消化率、脂肪消化率、蛋白質消化率和胺基酸消化率。可消化磷（P）可定義為動物在回腸末端吸收的總P攝入量的部分的回腸可消化P，或可定義為糞便中未排泄的總P攝入量的部分的糞便可消化P。
如本文所用的術語「存活率」意指存活的受試者人數。術語「改善的存活率」係「降低的死亡率」的另一種說法。
如本文所用的術語「屠體收率」係指經過商業或實驗宰殺過程之後，作為活體重量一部分的屠體的量。術語屠體意指為食用而已被宰殺，並去除頭部、內臟、四肢部分、和羽毛或皮的動物軀體。如本文所用的，術語產肉量係指作為活體重量一部分的可食用肉量，或作為活體重量一部分的特定肉塊量。
術語「屠體品質」和「肉品質」可互換地使用，並且是指成分品質（肥瘦比率）以及適口性因素，例如目視外觀、氣味、堅實度、多汁性、嫩度和風味。例如，生產沒有「木質化胸肉（woody breast）」的家禽。木質化胸肉係品質問題，源於美國一小部分雞肉的肌肉異常。這種情況會導致雞胸肉摸上去很硬，並且顏色通常發白，質地較差。木質化胸肉不會給人們帶來任何健康或食品安全隱患，並且雞肉本身的福利也不會受到負面影響。
「增重增加」係指與飼餵不含所述飼料添加劑組成物的飼料的動物相比，飼餵包含飼料添加劑組成物的飼料時動物體重增加。
在本發明上下文中，術語「寵物食品」旨在被理解為意指用於以下的食品：家庭動物，例如但不限於狗、貓、沙鼠、倉鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鳥類寵物，例如金絲雀、長尾小鸚鵡和鸚鵡；爬行動物寵物，例如海龜、蜥蜴和蛇；以及水生寵物，例如熱帶魚和青蛙。
術語「動物飼料組成物」、「飼料」、「餵養料」和「秣料（fodder）」可互換地使用，並且可以包含選自下組的一種或多種飼料材料，該組包含：a) 穀類，如小粒穀物（如小麥、大麥、黑麥、燕麥及其組合）和/或大粒穀物，如玉蜀黍或高粱；b) 來自穀類的副產物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的乾酒糟（Distillers Dried Grains with Solubles）（DDGS）（具體是基於玉米的具有可溶物的乾酒糟（cDDGS））、麥麩、小麥粉、小麥次粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣；c) 獲得自以下來源的蛋白質：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、低芥酸菜籽、魚粉、乾血漿蛋白質、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、乾椰肉、芝麻；d) 獲得自植物和動物來源的油和脂肪；和/或 e) 礦物質和維生素。
如本文所述的經改造之植酸酶多肽或其片段或包含此類經改造之植酸酶多肽或其片段的飼料添加劑組成物可以用作飼料或用於製備飼料。
因此，描述了用於在動物飼料中使用的乾燥的酶組成物，該乾燥的酶組成物包含本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段。
還描述了用於在動物飼料中使用的液體酶組成物，該液體酶組成物包含如本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段。
術語「飼料添加劑組成物」和「酶組成物」在本文中可互換地使用。
取決於用途和/或應用模式和/或施用模式，飼料可呈溶液形式或呈固體形式或呈半固體形式。
在一個較佳的實施方式中，將本文所述的酶或飼料添加劑組成物與飼料組分混合以形成餵養料。
如本文所用的，「飼料組分」意指飼料的全部或部分。飼料的部分可意指餵養料的一種成分或飼料的一種以上（例如2種或3種或4種或更多種）成分。
在一個實施方式中，術語「飼料組分」涵蓋預混物或預混物成分。較佳的是，飼料可以是秣料或其預混物、複合飼料或其預混物。可以將該飼料添加劑組成物與複合飼料、複合飼料組分混合或將其混合至複合飼料的預混物或混合至秣料、秣料組分或秣料的預混物中。
秣料涵蓋已經切下的植物。此外，秣料包括青貯飼料、壓縮的和壓成丸粒的飼料、油和混合口糧，並且還包括發芽穀物和豆類。
合適地，如本文所提及的預混物可以是由微量成分構成的組成物，該微量成分為如維生素、礦物質、化學防腐劑、抗生素、發酵產物和其他必需成分。預混物通常是適合於共混進商業口糧內的組成物。
如本文所用的，術語「接觸」係指將任何經改造之植酸酶多肽或其片段（或包含任何經改造之植酸酶多肽或其片段的組成物）間接或直接應用至產品（例如飼料）。可以使用的應用方法的實例包括但不限於：在包含飼料添加劑組成物的材料中處理產品、藉由將飼料添加劑組成物與產品混合而直接應用、將飼料添加劑組成物噴塗至產品表面上或將產品浸入飼料添加劑組成物的配製物中。在一個實施方式中，較佳的是將本發明的飼料添加劑組成物與產品（例如餵養料）混合。可替代地，餵養料的乳液或原始成分中可包括飼料添加劑組成物。對於一些應用而言，重要的是，使組成物在待影響/處理的產品表面上可用或可用於待影響/處理的產品表面。這允許該組成物賦予性能益處。
在一些方面，任何經改造之植酸酶多肽或其片段可以用於食品或飼料的預處理。例如，將具有10%-300%的水分的飼料混合並與該經改造之植酸酶多肽或其片段在5ºC-80ºC（較佳的是在25ºC-50ºC，更較佳的是在30ºC-45ºC之間）孵育，其中在有氧條件下孵育1分鐘至72小時或在厭氧條件下孵育1天至2個月。經預處理的材料可以直接飼餵給動物（所謂的液體飼餵）。經預處理的材料也可以在升高的溫度（60ºC-120ºC）下蒸汽壓成丸粒。該經改造之植酸酶多肽或其片段可以藉由真空噴塗機（vacuum coater）浸漬到飼料或食品材料中。
可將本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段（或包含此類經改造之植酸酶多肽或其片段的組成物）和受控量的所述酶用以散佈、包衣和/或浸漬產品（例如餵養料或餵養料的原始成分）。
在另一方面中，可以將飼料添加劑組成物均化，以製成粉末。粉末可以與本領域已知的其他組分進行混合。可強加力使粉末、或包含粉末的混合物通過模具，並將所得線料切成適宜的不同長度的丸粒。
視需要，製粒步驟可包括在丸粒形成之前進行的蒸汽處理或調理階段。可將包含粉末的混合物置於調理器中，例如帶有蒸汽注射的混合機。將混合物在達到指定溫度的調理器中加熱，如從60ºC-100ºC，典型的溫度將是70ºC、80ºC、85ºC、90ºC、或95ºC。停留時間可以是從幾秒鐘到幾分鐘。應當理解，本文所述的任何經改造之植酸酶多肽或其片段（或包含任何經改造之植酸酶多肽或其片段的組成物）都適合添加到任何合適的飼料材料中。
在其他實施方式中，可以將顆粒引入飼料製粒過程中，其中飼料預處理過程可以在70ºC至95ºC之間進行多達幾分鐘，例如在85ºC至95ºC之間。
在一些實施方式中，基於純酶蛋白，任何經改造之植酸酶多肽或其片段在飼料中能以1 ppb（十億分之幾）到10% （w/w）的範圍存在。在一些實施方式中，經改造之植酸酶多肽或其片段在餵養料中以1-100 ppm（百萬分之一）的範圍存在。較佳的劑量可以是每噸飼料產品或飼料組成物中1-20 g經改造之植酸酶多肽或其片段，或在最終飼料產品中1-20 ppm經改造之植酸酶多肽或其片段的最終劑量。
較佳的是，飼料中存在的經改造之植酸酶多肽或其片段應該係至少約50 – 10,000 FTU/kg，相當於大約0.1至20 mg經改造之植酸酶多肽或其片段的蛋白質/kg。
範圍可以包括但不限於上面討論的較低和較高範圍的任何組合。
包含任何經改造之植酸酶多肽或其片段的製劑和/或配製物以及本文所述的組成物能以任何合適的方式製備以確保製劑包含活性植酸酶。此類製劑可以是液體、乾粉或顆粒，該顆粒可以是未經包衣的/未經保護的，或者可以取決於加工條件而涉及使用熱保護劑包衣。如上所述，經改造之植酸酶多肽及其片段可以廉價地配製在固體運載體上而不特別需要保護性包衣，並且在整個調理和製粒過程中仍保持活性。當其中使用苛刻條件或條件允許（例如在高於90ºC的超調理飼料的情況下）的某些區域需要時，以固體形式應用時提供另外熱穩定性的保護性包衣對於獲得製粒穩定性可能是有益的。
將本文所述的飼料添加劑組成物配製成乾粉或顆粒，如WO 2007/044968（稱為TPT顆粒）或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述（該文獻各自藉由引用併入本文）。
在一個實施方式中，可以將飼料添加劑組成物配製成用於飼料組成物的顆粒，該顆粒包含：芯；活性劑（例如，植酸酶，例如本文揭露的任何經改造之植酸酶多肽）；和至少一個包衣，在選自以下中的一種或多種的條件後，顆粒的活性劑保持至少50%活性、至少60%活性、至少70%活性、至少80%活性：a) 飼料製粒過程，b) 蒸汽加熱的飼料預處理過程，c) 儲存，d) 作為未壓成丸粒的混合物中的成分儲存，和 e) 作為包含選自以下的至少一種化合物的飼料基礎混合物或飼料預混物中的成分儲存：微量礦物質、有機酸、還原糖、維生素、氯化膽鹼以及產生酸性或鹼性飼料基礎混合物或飼料預混物的化合物。
關於顆粒，至少一個包衣可包含占該顆粒的至少55% w/w的水分水合材料；和/或至少一個包衣可包含兩個包衣。該兩個包衣可為水分水合包衣和防潮包衣。在一些實施方式中，該水分水合包衣可為該顆粒的25% w/w至60% w/w並且該防潮包衣可為該顆粒的2% w/w至15% w/w。該水分水合包衣可選自無機鹽、蔗糖、澱粉和麥芽糖糊精，並且該防潮包衣可選自聚合物、樹膠、乳清和澱粉。
在其他實施方式中，可以將顆粒引入飼料製粒過程中，其中飼料預處理過程可以在70ºC至95ºC之間進行多達幾分鐘，例如在85ºC至95ºC之間。
可將飼料添加劑組成物配製成用於動物飼料的顆粒，該顆粒包含：芯；活性劑，在儲存之後以及在顆粒作為一種成分的蒸汽加熱製粒過程之後，該顆粒的活性劑保持至少80%活性；防潮包衣；和水分水合包衣，其為該顆粒的至少25% w/w，該顆粒在蒸汽加熱製粒過程之前具有小於0.5的水活度。
該顆粒可具有選自聚合物和樹膠的防潮包衣並且該水分水合材料可為無機鹽。該水分水合包衣可為該顆粒的25% w/w至45% w/w並且該防潮包衣可為該顆粒的2% w/w至10% w/w。
可替代地，該組成物處於適合於消耗的液體製劑中，較佳的是，這種液體消費品含有以下中的一種或多種：緩衝液、鹽、山梨糖醇和/或甘油。
此外，可藉由將一種或多種酶施用（例如噴塗）於運載體底物（如磨碎的小麥）上來配製飼料添加劑組成物。
在一個實施方式中，飼料添加劑組成物可以被配製成預混物。僅舉個實例，該預混物可包含一種或多種飼料組分，如一種或多種礦物質和/或一種或多種維生素。
在一個實施方式中，將直接飼餵微生物（「DFM」）和/或經改造之植酸酶多肽或其片段與至少一種生理學上可接受的運載體一起配製，該運載體選自以下中的至少一種：麥芽糖糊精、石灰石（碳酸鈣）、環糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、澱粉、Na2 SO4 、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸鹽、山梨酸鹽、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、鈣、偏亞硫酸氫鹽、甲酸鹽及其混合物。
應當指出，任何經改造之植酸酶多肽及其片段都可用於穀物應用中，例如用於非食品/飼料應用（例如乙醇生產）中的穀物加工。
本文揭露的組成物和方法的非限制性實例包括：
1.     一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段包含與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列具有至少82%序列同一性的植酸酶活性。
2.     如實施方式1所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段的胺基酸序列具有至少約1200的隱瑪律科夫模型（HMM）評分，如表11中關於高Tm植酸酶類多肽或其片段所示。
3.     一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列的胺基酸位置14-325具有至少78%的序列同一性。
4.     一種經改造之植酸酶多肽或其片段（例如，如實施方式1、2或3所述的那些），使用如實例5中所述的標準進料製粒回收率測試，在95ºC在MLA中應用30秒時，該經改造之植酸酶多肽或其片段具有至少約50%的進料製粒回收率。
5.     如實施方式1或2所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中使用如實例5中所述的標準進料製粒回收率測試，在95ºC在MLA中應用30秒時，所述植酸酶多肽或其片段具有至少約50%的進料製粒回收率。
6.     一種經改造之植酸酶多肽或其片段（例如，如實施方式1、2、3、4或5所述的那些），使用如實例5中所述的標準進料製粒測試，該經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少約0.7。
7.     如實施方式1、2、3、4、5或6所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，使用如實例5中所述的標準進料製粒測試，該經改造之植酸酶多肽或其片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少約0.7。
8.     如實施方式1、2、3、4、5、6或7所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在使用實例3中所述的差示掃描量熱分析測定條件下包含至少約92.5ºC的Tm溫度。
9.     如實施方式1、2、3、4、5、6、7、或8所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在實例3中所述的測定條件下在pH 3.5處包含至少約100 U/mg的比活性。
10.   一種動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物，該動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段可以 (i) 單獨使用，或 (ii) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物組合使用，或 (iii) 與至少一種其他酶一起使用，或 (iv) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物以及至少一種其他酶組合使用，或 (v) (i)、(ii)、(iii) 或 (iv) 中的任一種、進一步包含至少一種其他飼料添加劑組分，以及視需要該經改造之植酸酶多肽或其片段以至少約0.1 g/噸飼料的量存在。
11.   一種重組構建體，該重組構建體包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8、9所述的經改造之植酸酶多肽或其片段的核苷酸序列。
12.   如實施方式11所述的重組構建體，其中該生產宿主選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物和藻類。
13.   一種用於生產經改造之植酸酶多肽或其片段之方法，該方法包括： (a) 用如實施方式11所述的重組構建體轉化生產宿主；和 (b) 在產生該經改造之植酸酶多肽或其片段的條件下培養步驟 (a) 的生產宿主。
14.   如實施方式13所述的方法，其中從該生產宿主中視需要回收該經改造之植酸酶多肽或其片段。
15.   一種含有植酸酶的培養物上清液，該含有植酸酶的培養物上清液藉由如實施方式13或14所述的方法獲得。
16.   一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶多肽或其片段。
17.   一種用於在動物飼料中使用的乾燥的酶組成物，該乾燥的酶組成物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶多肽或其片段或其片段。
18.   如實施方式17所述的乾燥的酶組成物，其中乾燥的酶組成物係顆粒狀飼料添加劑組成物。
19.   一種用於在動物飼料中使用的液體酶組成物，該液體酶組成物包含如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶多肽或其片段。
20.   一種用於改善動物飼料的營養價值之方法，其中將如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶或其片段添加到動物飼料中。
21.   一種用於在一個或多個指標方面改善動物性能之方法，該方法包括向動物施用有效量的如實施方式1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的經改造之植酸酶多肽或如實施方式10或11所述的動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物。 實例
除非在本文中另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY [微生物學和分子生物學詞典]，第2版，John Wiley and Sons [約翰威利父子公司]，紐約 (1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY [哈珀柯林斯生物學詞典]，Harper Perennial [哈珀永久出版社]，紐約州 (1991) 為技術人員提供了本揭露中所使用的許多術語的通用詞典。
本揭露在下面的實例中進一步定義。應該理解的是，該等實例雖然指示了某些實施方式，但僅以舉例說明的方式給出。從以上的討論和所述實例中，熟悉該項技術者能夠確定本揭露的本質特徵，並且在不脫離本揭露的實質和範圍的情況下，可進行各種變化和修改以使其適應各種用途和條件。實例 1 植酸酶分子的產生
使用本領域已知的分子生物學技術進行DNA操作以產生植酸酶基因。使用真菌表現宿主裡氏木黴（Trichoderma reseei ， T. reesei ）的較佳的密碼子合成對應於各種植酸酶編碼序列的多核苷酸片段，並使用PCR技術將其隨機重新組裝。將來自裡氏木黴（SEQ ID NO: 63）的pep1天冬胺酸蛋白酶的、被pep1內含子人工中斷的訊號序列引入每個植酸酶基因序列的N-末端（5'末端）。根據供應商的建議，使用Gateway® BP重組技術將該基因引入pDonor221載體（英傑公司（Invitrogen），美國）。將所得的進入質體（entry plasmid）與目的載體pTTTpyr2重組，得到最終表現載體。pTTTpyr2類似於之前描述的pTTTpyrG載體（PCT公開WO 2011/063308），不同之處在於pyrG 基因置換為pyr2 基因。載體pTTTpyr2含有裡氏木黴cbhI 啟動子和終止子區域、構巢麯黴（Aspergillus nidulans ）amdS 選擇標記、裡氏木黴pyr2 選擇標記和來自裡氏木黴的端粒序列（用於複製）。該等質體在大腸桿菌TOP10細胞（英傑公司（Invitrogen），美國）中增殖，並純化DNA並進行序列驗證。
所有真菌操作（包括高通量轉化、接種、發酵和收穫）均在96孔微量滴定板（MTP）中進行。使用聚乙二醇（PEG）-原生質體方法將質體轉化到合適的裡氏木黴宿主菌株中。簡言之，用200 µL 25% PEG溶液處理總體積為50 µL、含有約0.5-2 µg DNA和5 x 106 原生質體的轉化混合物，然後用等體積的1.2 M山梨糖醇/10 mM Tris/10 mM CaCl2 （pH 7.5）溶液稀釋。然後使原生質體在含有山梨糖醇的液體生長培養基中再生以維持滲透壓。將100 µl的轉化混合物轉移至96孔MTP（含有補充有山梨糖醇（0.30 M – 0.84 M）的300 µl基本培養基）中。使板在搖床孵育器中於28ºC、80%濕度下生長3天，直到形成真菌菌絲體。如有必要，將20 µL生長的培養物轉移到含有10 mM乙醯胺的新鮮基本培養基中以增強選擇壓力，並再生長2天。
為了表現植酸酶蛋白，按如下培養轉化的裡氏木黴菌株：20 µl的液體培養物用於接種96孔MTP中的400 µl生產培養基（9 g/L酪蛋白胺基酸、10 g/L (NH4 )2 SO4 、4.5 g/L KH2 PO4 、1 g/L MgSO4 *7H2 O、1 g/L CaCl2 *2H2 O、33 g/L PIPPS緩衝液（pH 5.5）、0.25%裡氏木黴痕量元素（100%：175 g/L檸檬酸（無水）、200 g/L FeSO4 *7H2 O、16 g/L ZnSO4 *7H2 O、3.2 g/L CuSO4 *5H2 O、1.4 g/L MnSO4*H2 O、0.8 g/L H3 BO3 ）。在如上所述的相同生長條件下，將MTP在搖床孵育器中孵育。發酵5天後，藉由使用親水性PVDF膜離心來過濾培養物，以獲得澄清的上清液用於分析重組植酸酶。實例 2 植酸酶的製備與表徵 蛋白質純化和標準化
如上該培養編碼重組植酸酶的裡氏木黴菌株，並使用澄清的上清液純化植酸酶。將過濾的培養物上清液用洗滌緩衝液（25 mM乙酸鈉，pH 5.5）稀釋5倍，並載入到MTP濾板（密理博公司（Millipore）Multiscreen Solvinert深孔濾板96孔MTP，0.45 uM親水性膜，#MDRLN0410）中的用純化水平衡的陽離子交換樹脂（來自美國拜沃股份有限公司（Bio-Works）的WorkBeads 40S）上。將MTP放置在離心機中，在1分鐘的離心（100 x g）期間丟棄流出物。在1分鐘的離心（100 x g）期間，使用洗脫緩衝液（25 mM乙酸鈉，0.5 M NaCl，pH 5.5）洗脫植酸酶蛋白樣品。在96孔UV MTP（柯仕達（Costar），3635）中，用乙酸鈉緩衝液（25 mM乙酸鈉，0.5M NaCl，pH 5.5）將蛋白質純化步驟中的樣品稀釋5倍至最終體積為100 μl。在280 nm處測量樣品的吸光度，並根據植酸酶蛋白的標準曲線計算蛋白質濃度，並且已知濃度範圍為0-1750 ppm。基於確定的蛋白質濃度，將來自純化的所有樣品在96孔MTP中在緩衝液（100 mM乙酸鈉，0.5M NaCl pH 5.5）中稀釋至150 ppm的目標值，並儲存在5ºC，直至用於下文所述的測定中。
藉由反相HPLC（RP-HPLC）確定每個樣品中的植酸酶蛋白濃度。將標準化的樣品載入到安捷倫1260 HPLC上的安捷倫（Agilent）Zorbax 300柱（SB-C3 2.1 x 50 mm）上。根據表2應用溶劑A（在水中的0.1 v/v % TFA）和溶劑B（在乙腈中的0.07% TFA）的梯度。樣品注射體積為10 µl，柱溫為60ºC，並且流速為1 mL/min。在220 nm處測量洗脫液的吸光度，並使用ChemStation軟體（安捷倫科技公司（Agilent Technologies））進行整合。根據植酸酶蛋白的標準曲線確定植酸酶樣品的蛋白質濃度，並且已知濃度範圍為0-350 ppm。
[表 2 ]：用於確定純化的標準化植酸酶的蛋白質濃度的 HPLC 梯度條件。
時間（分鐘） 溶劑 A 溶劑 B
0 80 20
0.1 80 20
1.6 35 65
1.65 5 95
1.95 5 95
2 80 20
2.3 80 20
如下進行樣品（植酸酶PHY-11895、PHY-11932和PHY-12663，以及商業產品Quantum Blue 5 G和Natuphos E 10000 G的提取物（實例5中所述的提取方法））的純化。將樣品在PD10柱（用緩衝液（10-30 mM乙酸鈉，pH 5.5）預平衡）上進行緩衝液交換，隨後使用疏水相互作用層析HIC純化。根據樣品，使用以下HIC柱之一（苯基HP XK26或HiTrap苯基HP或苯基15，HR5/5）。將HIC柱在載入緩衝液（20 mM乙酸鈉緩衝液，pH 5.5，含有1.0-1.3 M硫酸銨）中進行預平衡。使用在pH 5.5的10 mM乙酸鈉中的硫酸銨的線性梯度來洗脫結合的植酸酶蛋白。使用Sephadex G25 M、XK50/35或PD10柱（用緩衝液（10-30 mM乙酸鈉，pH 5.5）預平衡）對從HIC柱收集的級分進行緩衝液交換。據估計，所有純化的植酸酶樣品（植酸酶PHY-11895、PHY-11932和PHY-12663以及商業產品Quantum Blue 5 G和Natuphos E 10000 G的提取物）的最終純度均超過95%。藉由分光光度法測量280 nm處的吸光度並使用計算的消光係數來確定最終純化的樣品中的蛋白質濃度。對於該兩種商業產品（Quantum Blue 5 G和Natuphos E 10000 G），使用了兩個緊密相關的公共植酸酶序列（SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:60）的計算的消光係數。使用Geneious®軟體10.2.4版本計算莫耳消光係數。實例 3 植酸酶的體外測定
以下測定用於測量高Tm-磷酸酶進化枝多肽及其片段以及可商購的植酸酶的各種特性。參考植酸酶活性（ FTU ）
藉由參考植酸酶活性方法（FTU）測定植酸酶樣品的活性。使用以下經改善的ISO 30024程序：「動物飼料——植酸酶活性的測定（Animal feeding stuffs – Determination of phytase activity）」：為了分析做準備，將液體植酸酶樣品在測定緩衝液（250 mM乙酸鈉，1 mM CaCl2和0.01%Tween-20，pH 5.5）中稀釋，以在隨後的FTU植酸酶測定中獲得在磷酸鹽標準曲線的線性範圍內的測量。對於固體樣品，稱重1.0 g樣品，並藉由在磁力攪拌器上混合20 min在100 mL測定緩衝液中提取。過濾（玻璃纖維過濾器，GA-55，研華公司（Advantec））後收集上清液，並進一步將該上清液稀釋至約0.04 FTU/mL。按照以下程序進行樣品的分析：將1 mL稀釋的植酸酶樣品與2 mL的7.5 mM IP6底物溶液（來自稻的植酸鈉，上海AZ進出口公司（Shanghai AZ Import and Export），浙江東方植酸有限公司（Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd）＃Z0201301181）在測定緩衝液中混合，並在水浴中在37ºC孵育60 min。用2 mL酸性鉬酸鹽/釩酸鹽試劑終止反應，並藉由分光光度法在415 nm處量化無機磷酸鹽的含量。藉由從植酸酶樣品的吸光度中減去緩衝液空白的吸光度來校正結果。從乾燥的磷酸氫鉀中生成磷酸鹽的標準曲線，並用於計算每個樣品釋放的磷酸鹽量。一個FTU定義為每分鐘產生1微莫耳磷酸鹽的植酸酶的量。在 pH 3.5 或 5.5 處對 IP6 底物的比活性
使用IP6底物溶液（來自稻的植酸鈉，上海AZ進出口公司（Shanghai AZ Import and Export），浙江東方植酸有限公司（Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd）＃Z0201301181）測定植酸酶的植酸酶活性。為了在pH 5.5處進行評估，在分析前使用384 MTP中的100 mM乙酸鈉緩衝液、0.025% Tween-20和0.05 mM CaCl2 （pH 5.5）將濃度為150 ppm的植酸酶樣品連續稀釋至最終濃度為0.18 ppm。向384 MTP的每個孔中添加在100 mM乙酸鈉、0.025% Tween 20和0.05mM CaCl2 （pH 5.5）中的47 µL的IP6底物（0.20 mM），並添加3 µL稀釋的植酸酶樣品至最終體積為50 µL。
為了評估pH 3.5處的活性，在分析前將濃度為150 ppm的植酸酶樣品連續稀釋至在384 MTP中的100 mM乙酸鈉緩衝液、0.025% Tween-20和0.05 mM CaCl2 （pH 5.5）中最終濃度為0.11 ppm。向384 MTP的每個孔中添加在100 mM甘胺酸、0.025% Tween-20和0.05 mM CaCl2 （pH 3.3）中的47 µL的IP6底物（0.20 mM），並添加3 µL稀釋的植酸酶樣品至最終體積為50 µL。
在具有連續攪拌（1400 rpm）的iEMS搖床（賽默飛世爾科技公司（Thermo Scientific））中，將MPT反應板在25ºC孵育10分鐘，並藉由添加45 µL的Pi Blue終止試劑（PiBlue™磷酸鹽測定試劑盒，POPB-DP，生物測定系統公司（BioAsay Systems），美國）終止反應。將板混合並密封，然後在iEMS搖床（650 rpm）中於25ºC孵育30分鐘以顯色。孵育後，藉由在酶標儀（Spectramax，分子儀器公司（Molecular Device））上測量620 nm處的吸光度來確定顏色形成。基於植酸酶蛋白的擬合標準曲線計算每個植酸酶樣品對IP6底物的活性，並且已知濃度和活性的範圍為0-350 ppm，取三個重複的平均值。隨後，使用pH 3.5或5.5處的活性除以藉由RP-HPLC確定的樣品中植酸酶的蛋白質濃度（如實例2中所述），計算出每種植酸酶樣品中以微莫耳磷酸鹽/mg/min計的比活性。
對於表3B和表21中所述的植酸酶變體，按此處所述進行樣品製備和活性分析。在緩衝液（100 mM乙酸鈉，0.5M NaCl pH 5.5）中將純化的蛋白（實例2）的等分試樣稀釋至100 ppm的目標濃度，然後使用100 mM乙酸鈉緩衝液、0.025% Tween-20和0.05 mM CaCl2 （pH 5.5）進行連續稀釋至0.1 ppm的最終濃度。隨後如實例3中所述的確定pH 5.5和3.5處的活性，除了用96孔MTP代替384孔MTP（將在100 mM乙酸鈉、0.025% Tween 20和0.05mM CaCl2 （pH 5.5）中的70 µL的IP6底物（0.20 mM）與10µL等分的稀釋的酶反應；使用170 µL的Pi Blue試劑終止反應）。藉由 DSC 確定熔融溫度（ Tm ）
使用MicroCal™VP-毛細管DSC系統（通用電氣醫療公司（GE Healthcare））進行差示掃描量熱法（DSC）測量。DSC係表徵蛋白質和其他生物分子的穩定性的強大分析工具。它測量溶液中熱誘導結構轉變的焓（ΔH）和溫度（Tm ）。製備了在100 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5.5）中稀釋至最終濃度為0.4 mg/mL的植酸酶蛋白樣品。將400 µL該等蛋白樣品以及含有相同量的無蛋白緩衝液的參考樣品添加到96孔板中。將該板放置在保持在10ºC的溫度控制自動取樣器室中。將該蛋白樣品和參考樣品以每分鐘2ºC的掃描速率從20ºC至120ºC掃描。將熔融溫度（Tm）確定為從折疊狀態到未折疊狀態的轉變的最大峰處的溫度。Tm的最大變化為±0.2ºC。ORIGIN套裝軟體（微量熱公司（MicroCal），通用電氣醫療公司（GE Healthcare））用於基線減法和Tm值的計算。實例 4 植酸酶的比活性和熱穩定性評估
使用實例3中所述的方法，評估使用實例1和實例2中所述的方法產生的高Tm磷酸酶分支多肽及其片段的樣品在pH 3.5和5.5處的植酸酶比活性和熱穩定性。研究中包括商業植酸酶產品Quantum Blue®（AB Vista公司）和Natuphos®10000 E（巴斯夫營養公司（BASF Nutrition））。選擇這兩種產品係因為它們係可商購的最固有的熱穩定產品。表3A和3B提供了在pH 3.5和pH 5.5處以微莫耳磷酸鹽/mg/min計的比活性的結果，以及藉由DSC測量的以ºC計的熱穩定性（Tm），其中ND表示值未確定。結果表明，所有高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段均顯示出遠高於商業產品的Tm值。該等高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段在pH 5.5處顯示出與商業產品的比活性相當或比其更高的比活性。在pH 3.5處，高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段的比活性均高於商業產品。在製粒條件下，尤其是在MLA中或以固體製劑應用時，較高的熱穩定性係非常有益的。在單胃動物消化道中存在的酸性條件下，在酸性pH下較高的比活性可能是非常有益的。
[表 3A ]. 各種植酸酶在 pH 3.5 和 pH 5.5 處測量的比活性和藉由 DSC 測量的熱穩定性。
樣品名稱 pH 5.5 處的比活性 （微莫耳磷酸鹽 /mg/min ） pH 3.5 處的比活性 （微莫耳磷酸鹽 /mg/min ） 藉由 DSC 測量的 Tm （ ºC ）
PHY-10931 402 ND 94
PHY-10957 365 ND 93
PHY-11569 335 ND 94
PHY-11658 614 ND 94
PHY-11673 246 ND 93
PHY-11680 425 ND ND
PHY-11895 335 526 97
PHY-11932 436 622 93
PHY-12058 275 ND 94
PHY-12663 363 741 94
PHY-12784 478 ND 93
PHY-13177 612 ND 94
PHY-13371 263 572 96
PHY-13460 408 708 98
PHY-13513 267 624 99
PHY-13594 449 686 97
PHY-13637 319 654 98
PHY-13705 489 775 97
PHY-13713 261 589 98
PHY-13747 679 646 96
PHY-13779 744 880 97
PHY-13789 475 696 101
PHY-13798 288 602 98
PHY-13868 348 574 97
PHY-13883 387 508 95
PHY-13885 340 608 99
PHY-13936 270 635 98
PHY-14004 423 574 98
PHY-14215 430 410 ND
PHY-14256 669 847 98
PHY-14277 407 696 98
PHY-14473 360 702 96
PHY-14614 367 605 97
PHY-14804 268 489 95
PHY-14945 367 692 97
PHY-15459 535 434 ND
PHY-16513 476 342 ND
Natuphos E 10000 320 290 86
Quantum Blue 274 400 88
ND表示值未確定
[表 3B ] . 各種植酸酶在 pH 3.5 和 pH 5.5 處測量的比活性和藉由 DSC 測量的熱穩定性。
樣品名稱 pH 5.5 處的比活性 （微莫耳磷酸鹽 /mg/min ） pH 3.5 處的比活性 （微莫耳磷酸鹽 /mg/min ） 藉由 DSC 測量的 Tm （ ºC ）
PHY-16812 476 717 98
PHY-17403 ND ND 101
PHY-17336 ND ND 100
PHY-17225 366 418 101
PHY-17186 ND ND 101
PHY-17195 ND ND 100
PHY-17124 341 555 99
PHY-17189 ND ND 101
PHY-17218 423 597 101
PHY-17219 402 548 101
PHY-17204 415 586 100
PHY-17215 ND ND 101
PHY-17201 480 625 101
PHY-17205 449 657 101
PHY-17224 ND ND 101
PHY-17200 483 670 101
PHY-17198 ND ND 101
PHY-17199 ND ND 101
PHY-17214 ND ND 101
PHY-17197 ND ND 101
PHY-17228 376 410 101
PHY-17229 329 665 100
PHY-17152 259 422 99
PHY-17206 ND ND 100
PHY-13594 449 687 97
PHY-13885 340 596 99
PHY-13789 475 700 101
進行了高解析度質譜（MS）以確認高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段的胺基酸序列：PHY-13594、PHY-11895、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885、PHY-13936、PHY-14004、PHY-14256和PHY-14277（SEQ ID NO: 1、8、11、17、22、26、27、28、30、31）。MS分析確認了SEQ ID NO: 1、8、11、17、22、26、27、28、30、31的預測的C-末端。此外，MS分析顯示SEQ ID NO: 1、8、11、17、22、26、27、28、30、31的N-末端的截短。最常觀察到的N-末端胺基酸對應於相對於預測的成熟序列的位置4，但在位置2、3、5、6、7、9、10處也觀察到了截短。實例 5 植酸酶的製粒穩定性研究
高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段的進料製粒回收率測試係在技術學院（Technological Institute）（南斯滕納魯普（Sdr. Stenderup），丹麥）製粒設備中進行的。應當指出的是，進料製粒回收率取決於幾個因素，包括；特定的飼料基質、調理和製粒條件、用於確定活性的測定法等。
測量了植酸酶PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13594、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885、PHY-13936、PHY-14256、PHY-14277以及參考商業酶Quantum®Blue 5G（AB Vista）和Natuphos®E 10000 G（巴斯夫營養公司（BASF Nutrition））的進料製粒回收率。藉由使用100 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5.5）從粉末產品Quantum Blue 5 G和Natuphos E 10000 G中提取植酸酶來獲得參考商業植酸酶樣品的液體樣品。使用實例3中所述的參考植酸酶活性測定法（FTU）測量液體植酸酶樣品的活性，並相應地給予至飼料中。根據以下程序，將PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885的液體樣品應用到全穀物小麥運載體上，製成用於製粒穩定性研究的固體樣品。將磨碎的全穀物小麥被轉移到裝有鋸齒狀刀片的切割攪拌器（coupe mixer）中。在混合的同時，將液體植酸酶樣品（最多40% vol/w）添加到磨碎的全穀物小麥粉中。將液體植酸酶樣品和磨碎的全穀物小麥粉的混合物放在託盤上，並在烘箱中於40ºC乾燥8-10小時。乾燥後，使用Bühler研磨機（型號MLT 204）研磨固體植酸酶產品，並將輥隙設置為0。將參考商業產品樣品Quantum Blue 5 G以固體（原樣）給予至飼料中進行比較。使用參考植酸酶活性測定（FTU）進行了固體植酸酶產物的分析，並將產物相應地給予至飼料中。
飼料組成物係玉米/大豆飲食，其包含：62.5%的玉米、31%的大豆粉、4.4%的大豆油、1.2%的石灰石、0.5%的VIT/MIN（Farmix Leghennen預混物）和0.4%氯化鈉。飼料的水分含量為約12%-14%（w/w）。在水平帶式攪拌器中，在室溫（22ºC-24ºC）下，將120 kg至200 kg之間的上述預混合的飼料與液體（MLA）或固體植酸酶樣品混合10分鐘，以達到飼料中最終植酸酶濃度為5 FTU/g。添加到飼料中的液體植酸酶樣品的量在0.2%至0.5%（w/w）之間。
混合後，將含有植酸酶的飼料樣品在KAHL級聯攪拌器中在60ºC、80ºC、85ºC、90ºC或95ºC調理30秒，然後壓成丸粒。如本文所用的，術語「調理」意指混合飼料/酶混合物並用蒸汽處理以達到60ºC、80ºC、85ºC、90ºC或95ºC的目標溫度持續30秒保持時間。藉由調節3個蒸汽閥來手動控制調理溫度，將2 atm壓力下的蒸汽從該蒸汽閥導入飼料/酶混合物中。在調理器的出口處將溫度維持在目標溫度+/- 0.3ºC。在60ºC至95ºC之間的調理溫度下，這種蒸汽調理通常使飼料中的水含量增加2-5.5重量%。調理步驟後，立即將該飼料/酶混合物在裝有Ø 3 mm * 35 mm模具和7.5 kW電機的Simon Heesen壓粒機中製成丸粒。調節進料螺桿速度以達到約300 kg/小時的生產率，並且將輥速度設定為500 rpm。該系統可以在達到目標調理溫度以預熱製粒模具後運行約8分鐘。隨後收集5-7.5 kg的壓成丸粒的飼料樣品，並立即在具有多孔底的冷卻箱中冷卻，伴隨1500 m3空氣/h的環境空氣流15分鐘。在冷卻期間，丸粒的水含量下降到與蒸汽調理之前含有植酸酶的飼料混合物（醪液飼料）相當的水平。根據ISO_6497_2002，使用分樣器縮小樣品的尺寸，並按如下來確定植酸酶的回收率。
使用Retch實驗室研磨機（裝有0.75 mm篩的ZM 200型）研磨含有植酸酶的飼料樣品（醪液飼料和丸粒兩者），然後使用以下方法對植酸酶活性進行分析，該方法係對ISO 30024程序的改善：「動物飼料——植酸酶活性的測定（Animal feeding stuffs – Determination of phytase activity）」。
為了從飼料樣品中提取植酸酶，將20.0g（+/- 0.05g）的研磨的醪液和壓成丸粒的飼料與100 mL提取緩衝液（250 mM乙酸鈉，1 mM CaCl2 、0.01% Tween-20，pH 5.5）在旋轉攪拌器上在室溫混合20分鐘。過濾後收集上清液（玻璃纖維過濾器，購自研華公司（Advantec）的GA-55）。將上清液在提取緩衝液中進一步稀釋，以在以下FTU植酸酶測定（0.04 FTU/mL）中獲得在磷酸鹽標準曲線的線性範圍內的測量。
將1 mL稀釋的植酸酶稀釋樣品與2 mL的7.5 mM IP6（來自稻的植酸鈉，上海AZ進出口公司（Shanghai AZ Import and Export），浙江東方植酸有限公司（Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd）＃Z0201301181）底物溶液在提取緩衝液中混合，並在水浴中在37ºC孵育60 min。用2 mL酸性鉬酸鹽/釩酸鹽試劑終止反應，並藉由分光光度法在415 nm處量化無機磷酸鹽的釋放。藉由減去相應時間為零的樣品（在37ºC未孵育60 min的樣品）的吸光度來校正結果。從乾燥的磷酸氫鉀中生成磷酸鹽的標準曲線，並用於計算每個樣品釋放的磷酸鹽量。一個單位（FTU）定義為每分鐘產生1微莫耳磷酸鹽的植酸酶的量。使用以下公式計算進料製粒回收率：（顆粒的植酸酶活性（FTU/g）除以醪液飼料的植酸酶活性（FTU/g））*100。
表4列出了在表3中示出的在溫度60ºC、80ºC、85ºC、90ºC和95ºC應用於MLA的植酸酶的進料製粒回收率百分比。對於應用於MLA中的所有測試的高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段，在95ºC的製粒回收率為至少50%。為了進行比較，提取的商業參考植酸酶Quantum Blue和Natuphos E 10000在相同條件下的進料回收率低得多，分別為15%和25%。該等數據說明了高Tm-磷酸酶進化枝多肽及其片段的高穩健性。
在60ºC，對於測試的所有高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段，當應用於MLA中時的進料製粒回收率在71%至85%之間。起初似乎係矛盾的，即當60ºC調理溫度比強健植酸酶的Tm低多於30ºC時，本文揭露的強健植酸酶在60ºC調理並隨後壓成丸粒時損失15%至29%的活性。這表明初始損失與調理器中的熱失活無關，這進一步得到以下事實的證實：當溫度升高至80ºC時，另外的損失非常有限。不受理論的束縛，據信並且描述了對於其他酶（植酸酶和木聚糖酶；試驗報告875: Danish Agriculture& Food Council [丹麥農業與食品理事會]、專利申請WO 2014120638和Novus Insight，第3期，2015）中可能存在調理和製粒後很難從飼料中提取/回收的植酸酶和木聚糖酶的級分。但是，據信（再次不受理論的束縛），這種不可回收級分中至少有一部分仍在動物中具有生物活性——換句話說，該不可回收級分可能不會由於熱緊迫而被不可逆地滅活。相反，據信（再次不受理論的束縛）不可回收的級分以不能在體外提取的方式結合在飼料中。可替代地，據信（再次不受理論的束縛），實際上即使提取了所有植酸酶蛋白，但是由於調理和製粒，當在體外測定中測量時植酸酶的活性明顯降低。不受理論的束縛，據信與乾燥和/或包衣形式相比在MLA中應用植酸酶將增加植酸酶的這種不可回收的但具有生物活性形式的量，這係由於與飼料的直接物理相互作用。
因此，評估MLA中所應用的植酸酶的熱穩健性的合適方式不是比較調理和製粒之前和之後飼料中的可回收活性，而是比較在低（例如80ºC）和高（95ºC）的調理溫度下進行調理和製粒後植酸酶活性的回收率，該調理溫度係在商業相關的調理溫度範圍內。
[表 4 ]. 在升高的溫度（ 60ºC 至 95ºC ）下在 MLA 中應用 30 秒後回收的植酸酶活性的比較。
% 酶活性回收率
植酸酶樣品 60°C 80°C 85°C 90°C 95°C
PHY-11895 77 67 ND 66 64
PHY-11932 ND ND 68 66 50
PHY-12663 85 ND 70 67 51
PHY-13594 82 76 ND 67 55
PHY-13637 80 78 ND 75 68
PHY-13789 80 76 ND 77 74
PHY-13885 72 66 ND 63 55
PHY-13936 ND 79 ND 75 72
PHY-14256 76 71 ND 63 58
PHY-14277 75 70 ND 65 59
Quantum Blue 84 ND 66 53 15
Natuphos E 10000 87 77 ND 67 25
ND表示值未確定
表5顯示了在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率。對於在MLA中應用的高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段，在95ºC與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率在0.72至0.98之間。提取的商業參考植酸酶Natuphos E 10000的相應數值係0.32。數據表明，本文揭露的高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段對商業相關溫度範圍內的調理溫度變化具有高度穩健性。
[表 5 ]. 在 95ºC 在 MLA 中應用 30 秒與在 80ºC 在 MLA 中應用 30 秒相比的進料製粒回收率的比率。
樣品名稱 比率
PHY-11895 0.96
PHY-11932 ND
PHY-12663 ND
PHY-13594 0.72
PHY-13637 0.87
PHY-13789 0.98
PHY-13885 0.83
PHY-13936 0.91
PHY-14256 0.82
PHY-14277 0.84
Quantum Blue 0.22*
Natuphos E 10000 0.32
*比率結果以95ºC過程與85ºC過程（而不是80ºC）相比給出。 ND表示值未確定
表6顯示了當以固體應用時，植酸酶PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885和Quantum Blue 5G在95ºC的進料製粒回收率。當以固體應用到磨碎的全穀物小麥運載體上時，所有高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段在95ºC的進料製粒回收率至少為64%。在相同條件下測試時，商業粉末產品Quantum Blue 5G的回收率為58%。
[表 6 ]. 以固體應用的植酸酶的進料製粒回收率百分比。
% 酶活性回收率
植酸酶樣品 95°C
PHY-11895 71
PHY-11932 83
PHY-12663 64
PHY-13637 78
PHY-13789 75
PHY-13885 72
Quantum Blue 5 G 58
實例 6 植酸酶的體內評估 PHY-12663 、 PHY-11932 和 PHY-11895 的性能評估
在肉雞中評估植酸酶PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895的體內性能。該研究在德克薩斯農工大學（Texas A&M universit）進行。測試了八種膳食處理：配製為能滿足肉雞營養需求的陽性對照飲食（PC）、配製缺乏可消化磷（比PC低0.16%點）和鈣（比PC低0.19%點）的陰性對照（NC）、以及補充有PHY-12663、PHY-11932或PHY-11895植酸酶（劑量為500和1000 FTU/kg）的NC。表7提供了本研究中使用的計算和分析的營養值的膳食組成物。
[表 7 ].用於體內評估PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895植酸酶的（計算和分析的）膳食組成物。
成分， g/kg 原樣 PC 前期 0-10 天 NC 前期 0-10 天 PC 中期 11-21 天 NC 中期 11-21 天 PC 後期 22-42 天 NC 後期 22-42 天
玉米 587.5 609.5 625 647 664.5 686.5
大豆 ml 48% 332 328.5 277 273.5 226.5 223
DL-met98 2.925 2.9 2.6 2.575 2.45 2.425
離胺酸hcl 1.95 2.025 2.025 2.1 2.325 2.4
L-蘇胺酸98.5% 0.675 0.7 0.7 0.7 0.925 0.925
脂肪，共混平均值 15.5 8 24.5 17 29 21
石灰石 14.45 13 13.35 11.95 11.95 10.5
磷酸一鈣 15.45 6.5 13.9 4.9 11.75 2.8
鹽 4.325 4.325 3.325 3.35 2.6 2.625
碳酸氫鈉 0 0 1 1 2 2
維生素預混物 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25
微量礦物質預混物 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
米糠 23.14 23.14 34.465 34.465 44.07 44.07
計算的營養素， %
粗蛋白 21.81 21.82 19.59 19.60 17.63 17.65
粗脂肪 4.40 3.73 5.53 4.86 6.20 5.49
粗纖維 2.85 2.88 2.84 2.88 2.84 2.88
鈣 0.9 0.7 0.82 0.622 0.72 0.521
總磷 0.73 0.545 0.691 0.505 0.639 0.455
可用磷酸鹽 0.45 0.263 0.411 0.222 0.359 0.172
ME家禽 kcal/kg 3000 3000 3100 3100 3176 3174
葉黃素 mg/kg 9.99 10.36 10.63 11.0 11.3 11.7
可消化Met 0.59 0.589 0.533 0.532 0.496 0.494
可消化Lys 1.18 1.18 1.05 1.05 0.949 0.95
分析的營養素 %            
粗蛋白 19.87 19.74 18.8 18.6 17.5 17.2
脂肪 4.54 4.17 5.53 5.12 5.96 5.85
灰分 5.98 5.25 4.71 3.96 4.53 3.97
總磷 0.74 0.56 0.73 0.50 0.67 0.53
鈣 1.00 0.89 0.97 0.78 0.79 0.64
將磨碎的稻殼被用作植酸酶運載體。
為一天大的Cobb 500雄性肉雞分配膳食處理中，每個包含10個重複的欄，每欄30隻小雞。飲食以醪液形式的玉米、大豆粉和米糠為基礎。在第21天，每個重複的欄取五隻雞，並收集脛骨以確定無脂肪的脛骨灰分。根據3階段飼餵程式（前期（starter）第0-10天、中期（grower）第11-21天和後期（finisher）第22-42天）配製飲食。在42天的研究中飲食和水可隨意攝取。
使用ANOVA分析數據，使用Tukey HSD測試分離處理平均值，P >0.05被認為係顯著的。計算了以下性能參數：0-42天研究期中的ADG（日平均增重）、ADFI（日平均採食量）和FCR（飼料轉化率）。表8顯示了在0-42日齡期間飼餵補充了不同劑量的不同植酸酶的飲食的肉雞的生長性能結果和在21日齡測量的脛骨灰分。與PC相比，NC飲食中磷（P）和鈣（Ca）的減少與ADG、ADFI和脛骨灰分含量較低以及FCR較高相關。與NC飲食相比，所有測試的植酸酶PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895改善了肉雞的ADG、ADFI、脛骨灰分和FCR。平均而言，與NC飲食相比，當劑量為500和1000 FTU/kg的飼料時，用PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895植酸酶處理使ADG分別改善12%和14%，ADFI分別改善8%和10%，FCR分別改善3.3%和3.7%，脛骨灰分分別改善9%和9.7%。此外，在所有參數上，所有植酸酶與飼餵PC飲食的那些相比有更好表現或無顯著不同的表現。該等數據表明，高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段（PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895）能夠顯著改善肉雞骨骼生長和性能。
[表 8 ].飼餵補充有500和1000 FTU/kg的PHY-12663、PHY-11932或PHY-11895植酸酶的飲食的肉雞在42天內的生長性能和在21日齡的脛骨灰分。
處理 植酸酶劑量（ FTU/kg ） ADG ADFI FCR 脛骨灰分 在第 21 天的 %
PC 0 69.9a 114.5a 1.639ab 52.4a
NC 0 62.3b 103.3b 1.659a 47.5b
NC +PHY-12663 500 68.5a 109.6ab 1.600c 51.8a
NC +PHY-12663 1000 70.8a 113.0a 1.597c 52.0a
NC +PHY-11932 500 70.0a 113.0a 1.614bc 51.8a
NC +PHY-11932 1000 71.6a 114.9a 1.606c 52.2a
NC +PHY-11895 500 70.4a 112.4a 1.599c 51.7a
NC +PHY-11895 1000 70.7a 112.5a 1.591c 52.1a
           
統計學 SEM 1.11 1.70 0.01 0.26
P飲食 >.0001 0.0002 >.0001 >.0001
a 、 b 、 c ： 列中的不同上標表示顯著差異，P > 0.05 FCR係已校正的死亡率PHY-13789 、 PHY-13637 、 PHY-14004 和 PHY-13885 的性能評估。
在AH藥物公司（AH Pharma）（希伯倫，馬里蘭州，美國）的肉雞中評估了PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的體內性能。測試了十種處理，包括配製為能滿足肉雞營養需求的陽性對照飲食（PC）、以及陰性對照飲食（NC）。配製NC飲食，其中缺乏可消化的磷（不含無機磷酸鹽，比PC低0.24%點）、鈣（比PC低0.19%點）、可消化AA（對於Lys、Met+Cys、Thr分別比PC低0.04%、0.03%和0.03%）和ME（比PC低69 kcal/kg）。
在NC飲食中以500或1000 FTU/kg飼料的兩種劑量分別測試了PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的性能。雄性肉雞（Ross 308）從0至5日齡飼餵相同的前期前（pre-starter）飲食，並在6至15日齡期間接受測試飲食。將膳食處理隨機分配為九個籠/處理，每個籠中有8隻雞。飲食以玉蜀黍、小麥、大豆粉、菜籽粉和米糠為基礎（飲食成分示於表9）。
[表 9 ].飲食的組成，計算和分析的營養素（以飼餵的%計）。
成分， % 前期 （ 0-5 天） 陽性對照 （ 6-15 天） 陰性對照 （ 6-15 天）
玉米 28.26 27.57 34.48
小麥 26 32 32
大豆粉 48% CP 29.95 21.79 19.4
低芥酸菜籽粉 3 6 6
米糠 5 5 5
動物和蔬菜脂肪 2.99 3.12 0.5
L-離胺酸HCl 0.212 0.22 0.246
DL-甲硫胺酸 0.361 0.289 0.276
L-色胺酸 0.033 0.036
鹽 0.366 0.363 0.262
石灰石 1.84 1.57 1.51
磷酸氫鈣 1.27 1.3 0
維生素微量礦物質預混物 0.25 0.25 0.25
二氧化鈦 0.5 0.5 0.5
計算的營養素
ME，kcal/kg 2998 3025 2950
粗蛋白 22 20 19.33
鈣 1 0.9 0.715
總磷 0.689 0.68 0.422
可用P 0.45 0.45 0.209
Na 0.18 0.18 0.14
可消化Lys 1.27 1.1 1.06
可消化Met+Cys 0.94 0.84 0.81
可消化Thr 0.84 0.75 0.72
分析的營養素      
ME*，kcal/kg ND 3022 2955
粗蛋白 ND 19.46 18.77
鈣 ND 1.36 1.01
總磷 ND 0.69 0.53
Na ND 0.208 0.164
ND意指值未確定 *ME：代謝能
在第6和15天記錄體重和採食量。在最後4天期間，每天收集排泄物，稱重並將一個籠中的排泄物合併。根據AOAC官方方法965.17，將每個籠的合併的排泄物用於磷（P）保留量的測量。在第15天，收集每籠六隻雞的右脛骨，並將其用於脛骨灰分的測量。
使用ANOVA分析數據，使用Tukey HSD測試分離處理平均值。P >0.05被認為係統計學上的顯著差異。表10顯示了對PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的性能的影響。在15日齡時測量脛骨灰分，並在11-15日齡的肉雞中測量磷保留量。與NC相比，所有測試的植酸酶PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885改善了肉雞的ADG、ADFI、脛骨灰分和磷保留量。
[表 10 ]. 飼餵補充有500和1000 FTU/kg的PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885植酸酶的飲食的肉雞在6至15天的生長性能、在第15天的脛骨灰分、在11-15天的磷保留量。
處理 植酸酶劑量（ FTU/kg ） ADG （ g ） ADFI （ g ） FCR 脛骨灰分 d15 P 保留量（攝入的 P 的 % ）
PC 0 34.7a 44.9a 1.292b 43.9abc 57.6c
NC 0 32.1b 43.4a 1.349a 40.1f 57.4c
NC+ PHY-13789 500 33.9a 44.1a 1.303b 42.0e 66.2b
NC+ PHY-13789 1000 34.9a 44.6a 1.280b 43.7abcd 77.7a
NC+ PHY-13637 500 34.1a 44.3a 1.298b 42.7cde 67.6b
NC+ PHY-13637 1000 34.9a 44.4a 1.272b 44.0abc 78.0a
NC+ PHY-14004 500 33.6a 43.8a 1.304b 42.8bcde 68.5b
NC+ PHY-14004 1000 34.5a 44.3a 1.281b 44.2a 78.3a
NC+ PHY-13885 500 33.9a 44.1a 1.300b 42.4de 67.6b
NC+ PHY-13885 1000 34.6a 44.2a 1.276b 44.1ab 78.6a
統計學            
  SEM 0.289 0.515 0.010 0.299 0.716
  P >.0001 0.7565 >.0001 >.0001 >.0001
a 、 b 、 c 等： 列中的不同上標表示顯著差異，P > 0.05
當劑量為500和1000 FTU/kg時，與NC相比，植酸酶PHY-13789使ADG分別改善5.4%和8.4%，FCR分別改善3.4%和5.1%，脛骨灰分分別改善4.6%和8.8%，磷保留量分別改善15.3%和35.4%。當劑量為500和1000 FTU/kg時，與NC相比，植酸酶PHY-13637使ADG分別改善6.1%和8.6%，FCR分別改善3.8%和5.7%，脛骨灰分分別改善6.3%和9.6%，磷保留量分別改善17.7%和35.8%。當劑量為500和1000 FTU/kg時，與NC相比，植酸酶PHY-14004使ADG分別改善4.5%和7.5%，FCR分別改善3.3%和5%，脛骨灰分分別改善6.5%和10.1%，磷保留量分別改善19.3%和36.4%。當劑量為500和1000 FTU/kg時，與NC相比，植酸酶PHY-13885使ADG分別改善5.6%和7.8%，FCR分別改善3.6%和5.4%，脛骨灰分分別改善5.5%和9.8%，磷保留量分別改善17.7%和36.9%。平均而言，與NC相比，高Tm磷酸酶進化枝多肽及其片段使ADG分別改善5.4%和8.1%，使FCR分別改善3.5%和5.3%，使脛骨灰分分別改善5.7%和9.6%，並且使磷保留量分別改善17.5%和36.1%。儘管該試驗中NC的營養素大量減少（無機磷的總去除和Ca、可消化AA和ME的減少），但在所有劑量下測試的所有植酸酶在ADG、ADFI和FCR上的表現均與PC無顯著差異。除了500 FTU/kg的PHY-13789和PHY-13885外，所有植酸酶均具有與PC相似的脛骨灰分含量。與PC相比，在所有植酸酶處理中磷保留量（以P攝入的百分比計）均得到改善。脛骨灰分和磷保留量結果確認該等植酸酶可有效釋放磷。
兩項試驗的結果表明，測試的所有高Tm植酸酶類多肽及其片段都在動物性能方面提供了很大的改善。實例 7 植酸酶的新穎進化枝的鑒定
將實例3中所示的高Tm-植酸酶類多肽的多肽序列及其片段用於產生隱瑪律可夫模型（HMM）以鑒定序列相似性。使用預設參數將MUSCLE版本3.8.31（MUSCLE：具有高精度和高通量的多重序列比對；R.C Edgar (20014) Nucleic Acid Res[核酸研究] 32:1792）用於序列比對。隨後，將HMM構建器軟體（builder software）HMMER版本3.1 b1（可從http://hmmer.org/獲得）用於從多重序列比對中生成HMM。僅使用了兩個參數：先驗概率（Priors） = 無，以及權重 = 無。使用如下命令：/usr/bin/hmmbuild --pnone --wnone Variants_for_filing_draft_5.hmm Variants_for_filing_draft_5.fsa，其中wnone = 沒有相對權重（所有序列都分配有統一的權重），而pnone = 不使用任何先驗概率，並且參數係頻率。所有概率參數都存儲為負自然對數概率，其精度在小數點右邊五位四捨五入。例如，將概率存儲為0:25 log 0:25 = 1:38629。將零概率的特殊情況存儲為*符號。圖1（欄A至1BB）顯示了高Tm植酸酶進化枝植酸酶的多肽序列的每個位置的HMM概率評分。HMM的綜合評分（COMP）以粗體顯示在圖1A的頂部3欄。每個胺基酸的位置（P）和共有序列（C）在P/C下的第1列中顯示。共有序列高Tm植酸酶進化枝植酸酶多肽序列由圖1所示的HMM產生，並列為SEQ ID NO:64。
然後，將HMM用於為約7000個獨特的植酸酶的全域集合生成HMM序列評分，其中包括公開數據庫和專利中可獲得的植酸酶序列。比較了各種序列的等級和序列評分與熱穩定性的相關性（Tunfold，以及藉由DSC測量的Tm）（數據未顯示）。基於此分析，新穎的高Tm植酸酶類多肽均具有大於1200的HMM序列評分，如表11中關於表3A和3B列出的植酸酶所示。
[表 11 ].從HMM生成的代表性高Tm植酸酶進化枝植酸酶的序列評分。
樣品 ID HMM 序列評分
PHY-13594 1670
PHY-13885 1665
PHY-14945 1657
PHY-14277 1656
PHY-13637 1654
PHY-13705 1653
PHY-13779 1653
PHY-14614 1653
PHY-13789 1651
PHY-13936 1650
PHY-14256 1649
PHY-13371 1648
PHY-11895 1648
PHY-14004 1647
PHY-13713 1646
PHY-12663 1646
PHY-14804 1646
PHY-13460 1645
PHY-10957 1645
PHY-11658 1644
PHY-13177 1643
PHY-12058 1642
PHY-13798 1642
PHY-13883 1642
PHY-11932 1639
PHY-10931 1637
PHY-13747 1633
PHY-14473 1629
PHY-13513 1628
PHY-11569 1627
PHY-12784 1623
PHY-11673 1615
PHY-13868 1604
PHY-11680 1537
PHY-14215 1499
PHY-15459 1330
PHY-16513 1221
PHY-16812 1676
PHY-17403 1664
PHY-17336 1667
PHY-17225 1654
PHY-17186 1649
PHY-17195 1652
PHY-17124 1629
PHY-17189 1650
PHY-17218 1652
PHY-17219 1650
PHY-17204 1648
PHY-17215 1651
PHY-17201 1615
PHY-17205 1649
PHY-17224 1651
PHY-17200 1656
PHY-17198 1653
PHY-17199 1614
PHY-17214 1651
PHY-17197 1647
PHY-17228 1653
PHY-17229 1612
PHY-17152 1625
PHY-17206 1649
表11中列出的高Tm磷酸酶進化枝酶：[PHY-13594（SEQ ID NO: 1）；PHY-10931（SEQ ID NO: 2）；PHY-10957（SEQ ID NO: 3）；PHY-11569（SEQ ID NO: 4）；PHY-11658（SEQ ID NO: 5）；PHY-11673（SEQ ID NO: 6）；PHY-11680（SEQ ID NO: 7）；PHY-11895（SEQ ID NO: 8）；PHY-11932（SEQ ID NO: 9）；PHY-12058（SEQ ID NO: 10）；PHY-12663（SEQ ID NO: 11）；PHY-12784（SEQ ID NO: 12）；PHY-13177（SEQ ID NO: 13）；PHY-13371（SEQ ID NO: 14）；PHY-13460（SEQ ID NO: 15）；PHY-13513（SEQ ID NO: 16）；PHY-13637（SEQ ID NO: 17）；PHY-13705（SEQ ID NO: 18）；PHY-13713（SEQ ID NO: 19）；PHY-13747（SEQ ID NO: 20）；PHY-13779（SEQ ID NO: 21）；PHY-13789（SEQ ID NO: 22）；PHY-13798（SEQ ID NO: 23）；PHY-13868（SEQ ID NO: 24）；PHY-13883（SEQ ID NO: 25）；PHY-13885（SEQ ID NO: 26）；PHY-13936（SEQ ID NO: 27）；PHY-14004（SEQ ID NO: 28）；PHY-14215（SEQ ID NO: 29）；PHY-14256（SEQ ID NO: 30）；PHY-14277（SEQ ID NO: 31）；PHY-14473（SEQ ID NO: 32）；PHY-14614（SEQ ID NO: 33）；PHY-14804（SEQ ID NO: 34）；PHY-14945（SEQ ID NO: 35）；PHY-15459（SEQ ID NO: 36）；PHY-16513（SEQ ID NO: 37）]；PHY-16812（SEQ ID NO: 64）；PHY-17403（SEQ ID NO: 65）；PHY-17336（SEQ ID NO: 66）；PHY-17225（SEQ ID NO: 67）；PHY-17186（SEQ ID NO: 68）；PHY-17195（SEQ ID NO: 69）；PHY-17124（SEQ ID NO: 70）；PHY-17189（SEQ ID NO: 71）；PHY-17218（SEQ ID NO: 72）；PHY-17219（SEQ ID NO: 73）；PHY-17204（SEQ ID NO: 74）；PHY-17215（SEQ ID NO: 75）；PHY-17201（SEQ ID NO: 76）；PHY-17205（SEQ ID NO: 77）；PHY-17224（SEQ ID NO: 78）；PHY-17200（SEQ ID NO: 79）；PHY-17198（SEQ ID NO: 80）；PHY-17199（SEQ ID NO: 81）；PHY-17214（SEQ ID NO: 82）；PHY-17197（SEQ ID NO: 83）；PHY-17228（SEQ ID NO: 84）；PHY-17229（SEQ ID NO: 85）；PHY-17152（SEQ ID NO: 86）；和PHY-17206（SEQ ID NO: 87）與公然揭露的微生物植酸酶：[諾氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）WP 064555343.1（SEQ ID NO: 38）；布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）AAS45884.1（SEQ ID NO: 39）；柯克斯體科細菌（Coxiellaceae bacterium）RDH40465.1（SEQ ID NO: 40）；腸桿菌科（Enterobacteriaceae）WP 094337278.1（SEQ ID NO: 41）；大腸桿菌（Escherichia coli）WP 001297112（SEQ ID NO: 42）；蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）WP 072307456.1（SEQ ID NO: 43）；Rouxiella badensis WP 084912871.1（SEQ ID NO: 44）；沙雷氏菌屬物種（Serratia sp.）WP 009636981.1（SEQ ID NO: 45）；阿氏耶爾森氏菌（Yersinia aldovae）WP 004701026.1（SEQ ID NO: 46）；弗氏耶爾森氏菌（Yersinia frederiksenii）WP 050140790.1（SEQ ID NO: 47）；克氏耶爾森氏菌（Yersinia kristensenii）WP 004392102.1（SEQ ID NO: 48）；莫氏耶爾森氏菌（Yersinia mollaretii）WP 049646723.1（SEQ ID NO: 49）；羅氏耶爾森氏菌（ersinia rohdei）WP 050539947.1（SEQ ID NO: 50）；EP3222714-0003 APPM植酸酶（SEQ ID NO: 51）；US8101391-0002（SEQ ID NO: 52）；US8101391-0004（SEQ ID NO: 53）；US8101391-0035（SEQ ID NO: 54）；US8101391-0049（SEQ ID NO: 55）；US8143046-0001（SEQ ID NO: 56）；US8143046-0003（SEQ ID NO: 57）；US8460656-0002（SEQ ID NO: 58）；US8557555-0013（SEQ ID NO: 59）；US8557555-0024（SEQ ID NO: 60）；US20160083700-0003（SEQ ID NO: 61）；WO 2010034835-0002（SEQ ID NO: 62）]的預測的成熟序列的多重序列比對係在Geneious®版本10.2.4中使用MAFFT比對進行。基於此MAFFT序列比對，使用Geneious®版本10.2.4中的Geneious Tree Builder生成了顯示序列關係的系統發生樹，qi如圖2所示。實例 8 雞中植酸酶的體內評估
本實施方式評估了與營養充足、未補充植酸酶的飲食相比，當被添加到Ca和P降低的基礎飲食中時，基因改造之裡氏木黴的菌株產生的代表性生物合成細菌6-植酸酶對肉雞脛骨灰分和P的回腸消化率（AID P）的效用。此外，還觀察了採食量、生長性能和飼料轉化率。材料和方法
實驗和對照飲食： 配製了基於玉米和大豆粉的陽性對照（PC）飲食，以滿足在前期（第1 – 21天）和後期（第22至42天）階段期間雞的營養要求（P和Ca充足）[National Research Council [國家研究理事會]，Nutrient Requirements of Poultry [家禽的營養需求] 第9版修訂版，Natl Acad Press,[國家科學院出版社] 華盛頓特區 [DC]; 1994]。配製陰性對照（NC）飲食，其中鈣（Ca）和可用磷（P）在前期階段分別降低2.0 g/kg和1.9 g/kg，並且在後期階段飲食中分別降低2.0 g/kg和1.8 g/kg。參見表12。所有前期飲食中都含有二氧化鈦（添加量為4 g/kg）作為難消化的標記。陰性對照飲食作為獨立的飲食進行測試，或補充有250、500或1000 FTU/kg的由裡氏木黴基因改造之菌株產生的生物合成細菌6-植酸酶。飲食以醪液形式可供雞隨意攝取。
[表 12 ]：前期（第0 – 21天）和後期（第22 – 42天）階段的陰性對照（NC）和陽性對照（PC）飲食的成分和營養組分（g/kg，作為飼餵基礎）
  前期（第 0 – 21 天） 後期（第 22 – 42 天）
成分（g/kg）  PC NC PC NC
玉蜀黍 526 549 627 646
大豆粉（48% CP） 338 333.5 242 240.5
低芥酸菜籽粉 50 50 50 50
大豆油 38.9 31.0 43.3 36.1
磷酸一鈣 14.9 5.55 10.8 2.15
石灰石 15.3 14.0 15.4 13.8
碳酸氫鈉 - - 2.00 2.00
鹽 4.70 4.75 2.78 2.80
DL-甲硫胺酸 2.83 2.80 2.03 2.00
離胺酸HCl 2.13 2.20 1.78 1.80
L-蘇胺酸 0.80 0.80 0.60 0.60
二氧化鈦 4.00 4.00 - -
家禽礦物質預混物 0.35 0.35 0.35 0.35
家禽維生素預混物 2.00 2.00 2.00 2.00
         
計算的營養素（g/kg）        
乾物質 882.73 880.59 883.353 881.48
粗蛋白 217.61 217.42 180.83 181.65
粗纖維 16.38 16.67 15.98 16.27
總鈣 9.99 8.00 9.01 6.99
總磷 7.15 5.22 5.95 4.18
可用磷 4.5 2.56 3.50 1.70
代謝能（ME）（kcal/kg） 3024.94 3025.25 3174.97 3174.90
可用甲硫胺酸 5.87 5.85 4.67 4.67
可用總含硫胺基酸 9.00 8.99 7.40 7.41
可用離胺酸 12.00 11.99 9.49 9.51
可用色胺酸 2.09 2.08 1.62 1.62
可用蘇胺酸 7.91 7.89 6.45 6.47
可用精胺酸 13.03 12.97 10.45 10.46
可用纈胺酸 9.00 9.00 7.53 7.57
雞、雞舍和實驗設計： 孵化當天，從商業孵化場獲得了混合性別的Cobb 500肉仔雞（雄性50%，雌性50%），該肉仔雞已在孵化場藉由飲用水接種了針對傳染性支氣管炎和新城疫的疫苗。第11-14天也藉由飲用水施用了針對傳染性法氏囊病的疫苗。基於初始體重（BW）將雞分配到落地欄中，使每欄含有大約相等體重的雞。總共1176隻雞被分配到49個欄中，每欄24隻雞；NC係9欄，並且其他所有處理係10欄，每欄含有50%雄性和50%雌性，採用完全隨機化設計。欄位於環境受控的肉雞舍中，光照方案為LD 18:6，初始溫度為35ºC，在第28天降至24ºC。
採樣和測量： 分析了所有飲食的代表性子樣品的乾物質（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（CF）、灰分、P、鉀（K）、鎂（Mg）、鈣、鈉（Na）、植酸鹽和植酸酶。
在第1、21和42天以欄為基礎測量體重和採食量（FI），並用於計算BW、平均日增重（ADG）、平均日採食量（ADFI）和死亡率校正的飼料轉化率（FCR）。每天檢查並記錄死亡率。
在第21天和第42天，每欄分別隨機選擇4隻雞（2隻雄性，2隻雌性，在採樣點確定性別）和6隻雞（3隻雄性和3隻雌性），用CO2 氣體處死並收集它們左脛骨併合並（根據欄）以測定脫脂的脛骨灰分。在第21天從安樂死的雞中收集回腸消化物，按每欄進行合併，並在Labconco FreeZone 12+脫水機（Labconco，坎薩斯城，密蘇里州）上冷凍。對乾燥的飼料和消化物樣品中P和Ca含量進行了分析，以便使用二氧化鈦作為惰性標記來計算營養素消化率。
化學分析： 針對所有分析，將樣品以一式兩份進行分析。根據以下方法分析了飼料和回腸消化物中的營養素：粗蛋白，NEN-EN-ISO 16634 [NEN-ISO 6492，歐洲標準（en.）：動物飼料——脂肪含量的測定（Animal feedstuffs – Determination of fat content），國際標準組織（International Organization for Standardization），瑞士；1999]；粗脂肪，NEN-ISO 6492 [NEN-ISO 6865，歐洲標準（en.）：動物飼料——粗纖維含量的測定 -- 用中間體過濾的方法（Animal feeding stuffs -- Determination of crude fibre content -- Method with intermediate filtration），國際標準組織，瑞士；2000]；粗纖維，NEN-ISO 6865 [NEN-EN-ISO 16634，歐洲標準（en.）：動物飼料——使用杜馬斯燃燒法氮含量的測定（Animal Feeding Stuff – Determination of Nitrogen Content using Dumas combustion），國際標準組織，瑞士；2008]。根據方法AOAC 2011.14 [AOAC International. Method 2011.14: Calcium, Copper, Iron, Magnesium, Manganese, Potassium, Phosphorus, Sodium, and Zinc in Fortified Food Products[AOAC國際方法2011.14：強化食品中的鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、磷、鈉和鋅]. Official Methods of Analysis of AOAC International[AOAC國際官方分析方法]; 2011]，藉由微波消化和電感耦合電漿發射光譜法（OES）分析飼料中的磷、Ca、鎂、鉀和鈉以及消化物中的P和Ca。飲食中的植酸磷（PP [肌醇六磷酸（IP6）]）濃度和飲食中的植酸酶活性係由杜邦實驗室（DuPont Laboratories）（丹麥布拉布蘭）使用Yu等人[Yu, S, Cowieson, A, Gilbert, C, Plumstead, P, Dalsgaard, S. Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin.[植酸鹽和肌醇磷酸酯（IP1-5）（包括IP5異構物）與膳食蛋白和鐵的相互作用以及對胃蛋白酶的抑制作用] J Anim Sci[動物科學] 2012;90:1824-1832]所述的方法確定的。一個植酸酶單位（FTU）定義為在pH 5.5和37ºC每分鐘從植酸鈉底物中釋放1 µmol無機正磷酸鹽的酶的量[AOAC International. Method 2000.12: Phytase activity in feed: Colorimetric enzymatic method.[AOAC國際方法2000.12：飼料中植酸酶的活性：比色酶法] Official Methods of Analysis of AOAC International.[AOAC國際官方分析方法] 第17版; Association of Official Analytical Chemists[官方分析化學家協會], 阿靈頓，維吉尼亞州; 2000]。
使用以下所述方法測量脛骨灰分：去除腓骨、肌肉和結締組織，將骨骼在100ºC乾燥至少12小時，然後在乙醚中脫脂7-8小時並風乾。將脫脂的脛骨再次在100ºC乾燥至少12小時，然後在600ºC 的陶瓷坩堝中灰化24小時。
計算： 基於第0-21天、第22-42天和第0-42天的總BWG和總採食量（根據死亡率權重校正）計算飼料轉化率（FCR）。ADG和AFDI都是藉由校正死亡率來計算的，例如藉由每個階段的總採食量計算ADFI然後除以總的飼餵天數。由死亡率校正的ADFI除以死亡率校正的FCR來計算死亡率校正的ADG。
P和Ca的表觀回腸消化率（AID，%）係使用二氧化鈦作為惰性標記、基於以下公式計算的： AID = 1 – [(Tid /Tii ) × (Ni / Nd )] 其中Tid 係飲食中的鈦濃度，Tii 係回腸消化物中的鈦濃度，Ni 係回腸消化物中營養素（P或Ca）的濃度，以及Nd 係飲食中營養素的濃度。所有分析值均表示為克/千克乾物質。
統計分析： 數據以欄為實驗單位報告。使用JMP 14.0的Fit Model平台（SAS研究所有限公司（SAS Institute Inc.），凱裡，北卡羅來納州，1989-2019）藉由方差分析（ANOVA）來分析數據，以研究隨機化設計中處理的影響。藉由Tukey的誠實顯著性差異（Honest Significant Difference）測試實現平均值分離。使用正交多項式分析了隨著植酸酶劑量增加的線性和二次響應。差異被認為具有統計學意義，P > 0.05；P > 0.10被認為係一種趨勢。結果
飲食分析： 最終飲食中分析的植酸酶活性確認了目標劑量水平（表13）。基礎（對照）飲食中CP的分析值在計算值的10%以內。NC飲食中達到的P含量的減少與目標減少量非常相符；基於分析值，前期飲食中的總磷含量降低了1.8 g/kg，後期飲食中的總磷含量降低了2.3 g/kg。
[表 13 ]：分階段最終飲食的分析的營養價值（g/kg）
前期（第0-21天） 後期（第22-42天）
成分 PC NC* PC NC*
乾物質 886 883 889 886
粗蛋白 221 228 186 184
粗脂肪 59.8 54.3 62.2 62.0
灰分 58.8 44.4 51.4 43.6
植酸鹽 8.32 8.38 8.70 9.09
植酸磷 2.35 2.4 2.45 2.56
磷 7.1 5.3 7.0 4.8
鉀 10.1 10.1 9.6 9.0
鎂 1.9 1.9 1.8 1.7
鈣 10.3 8.6 10.4 8.0
*該值係製作一批NC基礎飲食時NC和NC + 植酸酶處理的平均值。
PC、NC、NC + 250 FTU/kg、NC + 500FTU/kg、和NC + 1,000 FTU/kg的分析的植酸酶活性（FTU/kg）分別在前期階段為43、24、282、480、882，以及在後期階段為>50、>50、253、594、1110。飲食中的植酸酶活性由丹麥布拉布蘭的杜邦飼料技術服務公司（DuPont Feed Technical Service）分析。
營養素消化率： 相對於PC飲食，飼餵NC飲食的雞中P的AID沒有明顯降低（表14）。在500 FTU/kg或更高的劑量水平下，植酸酶補充相對於NC增加了AID P；並且在1000 FTU/kg下，植酸酶相對於PC改善了P的AID（P > 0.05）。當給予500 FTU/kg或更高時，植酸酶改善飲食中的回腸可消化P（以g/kg基礎數據表示）（在500 FTU/kg時相對於NC為+ 1.39 g/kg，並且在1000 FTU/kg時相對於NC為 + 1.76 g/kg；P > 0.05）。在該等劑量水平下，以g/kg表示的可消化P在該飲食中與PC飲食中相當。Ca的AID不受膳食處理的影響，但隨著植酸酶劑量從0增加到1000 FTU/kg而呈線性增加（P >0.10）。
[表 14 ]：第21天實驗植酸酶對肉雞中P和Ca的表觀回腸消化率（AID）和飲食中的可消化P（g/kg）的影響
測量的參數 PC NC NC + 植酸酶（FTU/kg）1 SEM P - 值
      250 500 1,000    
               
AID P（%）2 50.1bc 39.0c 57.7abc 65.2ab 72.2a 5.77 >0.001
AID Ca（%）2 40.2 39.2 47.0 51.1 55.3 4.93 0.240
可消化P（g/kg飲食）2 3.55a 2.06b 3.06ab 3.46a 3.82a 0.3 >0.001
1 由基因修飾的微生物裡氏木黴產生的生物合成細菌6-植酸酶。2 植酸酶劑量從0（NC）增加到1,000 FTU/kg導致AID P的線性和二次增加（P > 0.05），而Ca幾乎呈顯著線性增加（P = 0.052） a、b、c：一行中具有不同上標字母的最小二乘方平均值不同（P > 0.05，Tukey測試）。
脛骨灰分： 膳食處理對脛骨灰分的影響非常顯著（P > 0.001），並列於表15中。與PC相比，顯示飼餵NC飲食的雞在第21天和42天時脛骨灰分降低（分別為-6.7和-4.1個百分點；P > 0.05）。與NC相比，在所有三個劑量水平下，植酸酶補充改善了在第21天和第42天採樣的脛骨灰分（P >0.05）；所有植酸酶處理中的脛骨灰分均與PC相當。
[表 15 ]：分階段實驗植酸酶對肉雞生長性能和脛骨灰分含量的影響1,2
  PC NC NC + 植酸酶（FTU/kg）3 SEM P - 值
      250 500 1,000    
前期（第0 – 21天）              
第21天的BW（kg/雞） 0.90a 0.71b 0.86a 0.88a 0.89a 0.010 >0.001
ADFI（g/d） 56.6a 46.3b 54.1a 54.3a 55.4a 0.764 >0.001
ADG（g/d） 40.6ab 31.7c 39.0b 39.5ab 40.8a 0.431 >0.001
FCR（g/g） 1.396ab 1.460a 1.390b 1.377b 1.358b 0.016 >0.01
第21天的脛骨灰分（% DM） 50.4a 43.7b 49.3a 49.9a 50.9a 0.463 >0.001
               
後期（第22 – 42天）              
第42天的BW（kg/雞） 2.70a 1.85b 2.64a 2.70a 2.74a 0.031 >0.001
ADFI（g/d） 157.7a 121.5b 154.4a 156.1a 156.0a 1.89 >0.001
ADG（g/d） 86.9a 58.2b 84.7a 87.2a 87.8a 1.135 >0.001
FCR（g/g） 1.815b 2.093a 1.823b 1.792b 1.779b 0.029 >0.001
第42天的脛骨灰分（% DM） 46.4a 42.3b 46.5a 46.5a 47.0a 0.70 >0.001
               
整個時期（第0 – 42天）              
ADFI（g/d） 118.3a 92.9b 115.1a 116.4a 116.7a 1.186 >0.001
ADG（g/d） 71.3ab 50.6c 69.1b 70.9ab 71.8a 0.648 >0.001
FCR（g/g） 1.661b 1.835a 1.666b 1.643b 1.626b 0.019 >0.001
1 所有性能數據均已根據死亡率進行校正 2 植酸酶劑量從 0 （ NC ）增加到 1,000 FTU/kg 導致所有測量的參數的線性和二次增加（ P >0.05 ） 3 基因修飾的微生物裡氏木黴產生的生物合成細菌 6- 植酸酶。 a 、 b 、 c ：一行中具有不同上標字母的最小二乘方平均值不同（ P > 0.05 ， Tukey 測試）。
採食量和生長性能： 表15還列出了膳食處理對採食量、體重和飼料轉化率的影響。處理影響了所有生長階段期間的所有應答測量（前期、後期、整個時期（overall）；在所有情況下P > 0.01）。沒有觀察到死亡率的顯著差異（數據未顯示）。
與PC相比，飼餵NC飲食的雞顯示在第21天和第42天的BW下降，在後期階段和整個時期的期間FCR增加，在所有階段期間的ADG和ADFI下降（P > 0.05）。
以任何劑量水平補充實驗植酸酶都使雞克服NC飲食中的P缺乏症，並且在所有階段期間都具有改善的ADFI、BW和ADG和FCR（P > 0.05），使得它們在所有階段期間與PC相當，無論植酸酶劑量如何。劑量水平為1,000 FTU/kg的實驗植酸酶使雞在第42天的平均BW為2.74 kg，並且平均總體FCR為1.626（相對於PC中的1.661）。
總之，這項研究表明，將實驗變體植酸酶添加到配製的飼料（其中來自MCP的無機磷降低1.8至1.9 g/kg）中並以250和1000 FTU/kg之間的劑量水平施用，該實驗變體植酸酶有效地維持生長性能、脛骨灰分和回腸P消化率，相當於營養充足的飲食。1000 FTU/kg時有最大的有益效果。基於觀察到的可消化磷的增加，估計來自磷酸一鈣的磷替代值在500和1000 FTU/kg時分別為1.64和2.07克/千克飲食（等於1.39和1.76 g/kg的來自MCP的可消化P）。實例 9 豬的植酸酶的體內評估
這項研究的目的是評估與添加來自MCP的無機P相比，在用其中未添加無機磷酸鹽的基於玉米-大豆粉的飲食飼餵的斷奶仔豬中，補充有代表性實驗性生物合成細菌6-植酸酶的膳食對骨灰分和礦化以及生長性能的功效。出於比較目的，該研究中包括現有的商業植酸酶。第二個目標係確定在測試環境中植酸酶的可消化P當量值。材料和方法
實驗和對照飲食： 配製了基於玉米和SBM的陽性對照（PC）飲食，以滿足體重10至25 kg的仔豬的營養要求（NRC，2012），該飲食中含有2.9 g/kg的可消化P和7.0 g/kg的Ca（表16）。配製不含無機磷酸鹽（1.1 g/kg可消化P）且Ca降低（5.0 g/kg）的陰性對照（NC）飲食。NC作為獨立的飲食進行測試，並且還補充有500或1,000 FTU/kg商業植酸酶飲食，250、500或1,000 FTU/kg實驗植酸酶或添加了3種水平的MCP（+0.7、+1.4和+ 1.8 g/kg來自MCP的可消化磷），相當於1.8、2.5和2.9 g/kg的可消化P含量（後者構成PC飲食）。這總共產生了9種膳食處理。在補充有MCP的飲食中添加另外的石灰石，以將Ca與P的比例維持在1.2至1.3的範圍內（表16）。商業植酸酶係來自在裡氏木黴中表現的布丘氏菌屬物種的微生物6-植酸酶（Axtra® PHY，杜邦營養生物科學公司（DuPont Nutrition and Biosciences）），在本文中稱為PhyB。實驗植酸酶係生物合成細菌植酸酶，在本文中稱為PhyX。PhyX由用真菌（裡氏木黴）生產菌株發酵而產生，該菌株表現藉由祖先重建而組裝的共有序列細菌植酸酶基因的生物合成變體，且對布丘氏菌屬物種（杜邦營養生物科學公司（DuPont Nutrition and Biosciences））的序列有偏差。飲食以醪液形式可供仔豬隨意攝取，並且水可自由獲取，
[表 16 ]：飼餵給斷奶仔豬（42至70日齡）的陰性對照（NC）和具有增加水平的可消化P含量（來自MCP）的NC的成分和營養組分（g/kg，作為飼餵基礎）。
  NC NC + 來自MCP的可消化P（g/kg）
    0.7 1.4 1.8（PC）
成分（ g/kg ）        
玉米 400 400 400 400
大豆粉（48% CP） 293.35 292.85 292.65 292.65
稻 150 150 150 150
米糠 50.0 50.0 50.0 50.0
甜菜粕 30.0 30.0 30.0 30.0
動物脂肪 36.7 36.7 36.7 36.7
磷酸一鈣（MCP） - 3.30 6.70 8.80
碳酸鈣 6.70 7.40 8.20 8.60
鹽 4.10 4.10 4.10 4.10
L-離胺酸HCl 4.00 4.00 4.00 4.00
DL-甲硫胺酸 1.70 1.70 1.70 1.70
L-蘇胺酸 1.50 1.50 1.50 1.50
L-色胺酸 0.50 0.50 0.50 0.50
Noxyfeed1 0.20 0.20 0.20 0.20
二氧化鈦 5.00 5.00 5.00 5.00
填充劑（矽藻土） 10.0 6.50 2.50 -
維生素-礦物質預混物2 6.00 6.00 6.00 6.00
含運載體的測試產品3 0.25 0.25 0.25 0.25
         
計算的營養素（ g/kg ）        
代謝能（ME），（Mcal/kg） 3.35 3.35 3.35 3.35
淨能（NE）（Mcal/kg） 2.52 2.52 2.52 2.52
粗蛋白 194 194 194 194
醚提取物 63.3 63.3 63.2 63.2
總鈣 5.00 5.75 6.53 7.00
總磷 4.00 4.76 5.53 6.00
可消化磷 1.06 1.76 2.46 2.90
非植酸鹽磷 1.28 2.00 2.80 3.30
總離胺酸 13.4 13.4 13.4 13.4
SID4 離胺酸 12.3 12.3 12.3 12.3
SID 蘇胺酸 7.70 7.70 7.70 7.70
SID 甲硫胺酸 4.43 4.43 4.43 4.43
SID 色胺酸 2.42 2.42 2.42 2.42
1 抗氧化劑，含有BHT、沒食子酸丙酯和檸檬酸。2 每千克飲食補充：鐵（來自FeSO4 •H2 O），120 mg；碘（來自Ca(IO3 )2 ） 0.75 mg；鈷（來自2CoCO3 •3Co(OH)2 •H2 O），0.6 mg；銅（來自CuSO4 •5H2 O），6 mg；錳（來自MnO） 60 mg；鋅（來自ZnO） 100 mg；硒（E8）（來自Na2 SeO3 ） 0.37 mg；維生素A，10000 UI；維生素D3，2000 UI；維生素E（α生育酚），25 mg；維生素B1，1.5 mg；維生素B2，3.5 mg；維生素B6，2.4 mg；維生素B12，20 µg；維生素K3，1.5 mg；泛酸鈣 14 mg；菸酸，20 mg；葉酸，0.5 mg；生物素，50 µg。3 將測試產品與小麥運載體混合以達到目標劑量，對照處理僅接受運載體而沒有測試產品4 SID = 標準化回腸消化率。
豬、豬舍和實驗設計： 實驗程序符合歐洲指令2010/63/EU和西班牙有關研究中動物護理和使用的準則（B.O.E.編號252，皇室法令（Real Decreto）2010/2005）。在斷奶（初始體重（BW）6±1 kg）並飼餵普通前期前適應飲食直至42日齡（約10 – 11 kg BW），共獲得總計162隻雜交皮特蘭豬（Pietrain ）×（大白豬（Large White）×長白豬（Landrace））混合性別的21日齡仔豬（雄性50%，雌性50%）。然後基於體重和性別對仔豬進行分組，並以完全隨機化的分組設計將其分配至欄，每欄2頭豬，每個處理9欄。對從42日齡到70日齡的豬施用測試飲食。在環境受控的動物房中將欄安排在一起，其中溫度最初保持在30ºC，然後每週降低1ºC。
採樣和測量： 分析了所有飲食的代表性子樣品的乾物質（DM）、有機物質（OM）、粗蛋白（CP）、醚提取物（EE）、灰分、礦物質、植酸鹽和植酸酶。
在實驗開始之前，分別對豬稱重，然後在第14和28天再次稱重，以計算平均日增重（ADG）。在第14天和第28天評估飼料的消失，並用於計算平均日採食量（ADFI）。飼料轉化率（FCR）由ADFI和ADG計算得出。
在試驗的第28天，藉由靜脈內過量的戊巴比妥鈉對每欄的一隻仔豬安樂死，並切下前腿和後腿右腳，以確定掌骨/蹠骨灰分和礦化（Ca和P）。將腳儲存在-20ºC直至分析。
化學分析： 所有樣品均一式兩份進行分析。根據AOAC（2000a）方法分析了飼料中的乾物質、灰分、CP和醚提取物（分別為925.09、942.05、968.06和920.39）。藉由Dumas程序藉由氮FP-528分析儀（萊科公司（Leco corp.），聖約瑟夫，密蘇里州，美國）確定氮含量。以DM和灰分之間的差計算有機物質（OM）。根據Engelen等人（1994）對飼料中的外源植酸酶活性進行了分析。一個植酸酶單位（FTU）定義為在5.5的標準pH和37ºC的溫度下從0.0051 mol/L植酸鈉中每分鐘釋放1 mmol無機磷酸鹽的植酸酶的量（AOAC，2000b）。
分別在來自右前腳和右後腳的掌骨III/IV和蹠骨III/IV上確定骨灰分。提取後，首先使用配備有2 kN測力感測器的Instron測試系統（諾伍德，麻塞諸塞州，美國）2519-106型在3點機械測試中表徵骨的完整性。將諸如外在剛度、極限力（ultimate force）、位移和破壞功（work to failure）的生物力學參數用於表徵骨的完整性（Turner，2006）。然後，將骨用於確定其在103ºC的烘箱中4h的DM含量，然後在200ºC烘乾箱中燃燒3h，然後放入550ºC的馬弗爐中72h並且確定其灰分含量。然後使用杵和研缽研磨掌骨獲得灰分，然後將該灰分送至SCT實驗室（萊裡達大學（University of Lérida），西班牙），用於在硫酸消化後藉由電感耦合電漿質譜法（ICP-MS；安捷倫科技公司（Agilent Technologies）型號7700X）確定礦物質（Ca、P、Mg）。還藉由SCT實驗室的ICP-MS在灰分樣品上分析了飼料中的礦物質組成（Ti、Ca、P、Mg、Fe、Zn和Cu）（Pacquette和Thompson，2018）。
統計分析： 除骨灰分和骨強度以豬為實驗單位外，數據均以欄為實驗單位。使用JMP 14.0的Fit Model平台（SAS研究所有限公司（SAS Institute Inc.），凱裡，北卡羅來納州，1989-2019）藉由方差分析（ANOVA）來分析數據，以研究隨機化設計中處理的效果。藉由Tukey的誠實顯著性差異（Honest Significant Difference）測試實現平均值分離。此外，還使用因子「植酸酶」（PhyG與PhyB）和劑量（500和1000）進行了雙因素方差分析，以比較兩種劑量水平（500和1000 FTU/kg）下的兩種植酸酶。使用正交多項式分析了隨著植酸酶劑量增加的線性和二次響應。此外，根據增加來自MCP的可消化P（例如NC、NC + 0.7、NC + 1.4、和NC + 1.8 g/kg來自MCP的可消化P）的添加對掌骨灰分、ADG和FCR進行線性回歸。藉由在給定的植酸酶劑量下應用Y值計算可消化P當量，並計算相應的X值。差異被認為係顯著的，P>0.05；P >0.10被認為係一種趨勢。結果
飲食分析： 飲食中營養成分的分析值列於表 17 。NC飲食中的植酸酶活性≤50 FTU/kg，表明不存在植酸酶交叉污染。補充植酸酶的飲食中的活性在目標值的10%以內，除了處理NC + PhyX 250和NC + PhyX 500中活性相對於目標劑量分別為- 20%和+ 27%。含有添加的來自MCP的P的NC飲食中分析的P含量接近於基於預期的MCP添加水平的預期值。
[表 17 ]：實驗飲食的分析的營養價值
  NC   NC + PhyX (FTU/kg)1   NC + PhyB (FTU/kg)2   NC + 來自 MCP 的可消化的 P (g/kg)
  0 250 500 1000   500 1000   0.7 1.4 1.8 (PC)
項目                      
乾物質(g/kg) 893 899 896 896   897 897   898 897 893
代謝能 (Mcal/kg)3 3.18 3.19 3.17 3.19   3.20 3.22   3.19 3.18 3.18
淨能 (Mcal/kg)3 2.33 2.34 2.32 2.34   2.35 2.36   2.34 2.34 2.34
有機物質 (g/kg) 834 839 834 831   835 835   834 834 833
粗蛋白質 (g/kg) 200 200 202 199   199 201   200 200 199
醚提取物 (g/kg) 61.3 61.6 69.0 65.8   65.5 63.8   66.9 66.5 68.1
灰分 (g/kg) 59.7 61.2 62.5 65.4   61.8 61.6   63.4 63.4 59.5
鈣 (g/kg) 5.96 5.94 6.32 6.41   6.29 6.15   7.26 7.65 8.73
磷 (g/kg) 4.29 4.50 4.67 4.89   4.63 4.48   5.48 5.65 6.33
分析的Ca:P 比率 1.39 1.32 1.35 1.31   1.36 1.37   1.32 1.35 1.38
鎂 (g/kg) 2.14 2.20 2.25 2.42   2.28 2.26   2.46 2.26 2.37
鐵 (g/kg) 0.21 0.22 0.23 0.24   0.23 0.37   0.24 0.19 0.19
銅 (mg/kg) 10 9 9 15   10 10   13 14 16
鋅 (mg/kg) 83 90 93 96   102 102   115 109 95
植酸磷 (g/kg) 2.6 - - -   - -   - - -
分析的植酸酶 (FTU/kg)4 >50 201 635 1058   552 1083   >50 >50 >50
1 代表性生物合成細菌6-植酸酶。2 來自在裡氏木黴中表現的布丘氏菌屬物種的微生物6-植酸酶（Axtra® PHY，杜邦動物營養公司（DuPont Animal Nutrition））。3 根據AFZ-INRA表（Sauvant等人，2002），可代謝能和淨能分別計算為總能量和可消化能量的0.79和0.58。4 飲食中的植酸酶活性由丹麥布拉布蘭的杜邦實驗室（DuPont Laboratories）分析。
骨灰分礦物質和骨強度： 在70日齡時（實驗第28天），相對於PC，用基礎NC飲食飼餵的仔豬的掌骨灰分、Ca和P含量降低（P >0.05；表 18 ）。與NC相比，補充兩種植酸酶以及在所有劑量水平下均改善了骨灰分和骨P含量（%）（P > 0.05）。在500和1000 FTU/kg下，掌骨灰分和骨P含量與PC相當。將PhyX的劑量從0（NC）增加到1,000 FTU/kg，導致在第28天掌骨灰分的線性和二次增加（P >0.05）。植酸酶補充不會影響掌骨Ca含量。隨著飲食中MCP-P水平的升高，掌骨灰分和P含量呈線性響應（P >0.05）。蹠骨灰分含量顯示與掌骨灰分的響應相同。
[表 18 ]：增加兩種植酸酶劑量或無機P含量對70日齡仔豬的蹠骨和掌骨灰分及礦化（%乾物質基礎）和掌骨強度的影響
  NC NC +PhyX (FTU/kg)1 NC + PhyB (FTU/kg)2 NC + 來自 MCP 的可消化的 P (g/kg) SEM P 值
    250 500 1000 500 1000 0.7 1.4 1.8 (PC)    
骨灰分和礦物質                      
蹠骨灰分3 22.1d 26.1c 27.5bc 30.1ab 27.1bc 29.3ab 25.8c 29.4ab 30.6a 0.68 >0.001
掌骨灰分3 25.1d 28.5bc 29.9abc 32.0a 30.0abc 32.0abc 27.8cd 31.0ab 32.7a 0.63 >0.001
掌骨 Ca3 7.7b 9.0ab 8.9ab 9.3ab 8.5ab 9.5ab 8.6ab 9.7a 10.0a 0.44 0.008
掌骨 P3 4.9c 5.6bc 6.1ab 6.5a 6.1ab 6.6a 5.4bc 6.1ab 6.8a 0.21 >0.001
骨強度                      
極限力 (N) 188d 258c 293bc 365a 290bc 373a 251c 328ab 371a 12.8 >0.001
剛度 (mPa) 112d 158cd 194abc 224a 182abc 225a 159bc 202ab 224a 9.5 >0.001
破壞功 (J) 0.60d 0.79bcd 0.78cd 1.11a 0.95abc 1.16a 0.78cd 1.03ab 1.11a 0.05 >0.001
位移 (mm) 4.5 4.3 3.7 4.3 4.5 4.4 4.3 4.3 4.3 0.18 0.156
1 實驗生物合成細菌6-植酸酶2 來自在裡氏木黴中表現的布丘氏菌屬物種的商業微生物6-植酸酶（Axtra® PHY，杜邦營養生物科學公司（DuPont Nutrition and Biosciences））。
膳食處理對掌骨生物力學參數的影響見表 18 。與所有其他處理相比，NC的極限力（N）較低（P >0.05）。與NC相比，所有劑量水平下的所有植酸酶處理均改善了極限力。相對於PC，兩種植酸酶在1000 FTU/kg下維持相同的極限力。與每kg飲食含有另外1.8 g來自MCP的可消化P的PC相比，兩種植酸酶在500 FTU和1000 FTU下均相對於NC改善了剛度（mPa），並且在1000 FTU/kg下維持剛度（mPa）和破壞功（J）。在比較兩種植酸酶的兩種劑量水平時，與500 FTU/kg的植酸酶相比，1000 FTU/kg的植酸酶顯示出更高的骨灰分、極限力（N）、剛度（mPa）和破壞功（J）（P >0.05）。在植酸酶來源和劑量水平之間未發現相互作用。
生長性能： 膳食處理對生長性能的影響見表 19 。除了在第0 – 14天期間的ADFI（趨勢，P = 0.08）外，在飼餵PC飼料的仔豬中，與飼餵NC飲食相比所有生長性能響應測量均受損（ADG和ADFI降低；FCR升高）（P > 0.05）。
在實驗的第一階段（第0 – 14天）期間，1,000 FTU/kg的PhyX和PhyB相對於NC產生更大的ADG和降低的FCR（P >0.05），並且相當於含有添加的1.8 g/kg來自MCP的P的PC。
在實驗的第二階段（第15至28天）期間，PhyX在250 FTU/kg或更高下相對於NC改善了ADG，並且在500 FTU/kg或更高下相對於NC改善了FCR（P >0.05）。在兩種劑量水平下，相對於NC，PhyB還改善了ADG和FCR（P >0.05）。在500 FTU/kg或更高時，兩種植酸酶均產生與含有添加的1.8 g/kg來自MCP的P的PC相當的ADG和FCR值。
[表 19 ]：增加兩種植酸酶或無機P含量對斷奶仔豬（42至70日齡）性能的影響。
Figure 02_image003
1 代表性生物合成細菌6-植酸酶2 來自在裡氏木黴中表現的布丘氏菌屬物種的商業6-植酸酶（Axtra® PHY，杜邦營養生物科學公司（DuPont Nutrition and Biosciences））。3 將PhyX的劑量從0（NC）增加到1,000 FTU/kg，導致整個階段（第0 - 28天）的ADG和FCR的線性和二次增加（P > 0.05）。a 、 b ：一行中具有不同上標字母的最小二乘方平均值不同（P > 0.05，Tukey測試）。
在整個階段（第0 – 28天）期間，所有劑量的兩種植酸酶相對於NC均改善了ADG，且500 FTU/kg或以上的兩種植酸酶相對於NC均改善了FCR（P >0.05）。在500 FTU/kg或更高時，任一種植酸酶均產生與含有添加的1.8 g/kg來自MCP的P的PC相當的ADG和FCR值。此外，PhyX劑量從0增加到1,000 FTU/kg導致整個階段期間ADG的線性和二次增加，以及FCR的降低（P >0.05）。隨著飲食中MCP-P水平的升高，ADG和FCR呈線性響應（P >0.05）。比較兩種植酸酶的兩種劑量水平，FCR在1000 FTU/kg相比在500 FTU/kg更低（1.59相比1.66，P >0.05）。在1000 FTU/kg相比500 FTU/kg下，觀察到ADG有增加的趨勢（635相比590，P = 0.08），採食量未發現差異（數據未顯示）。在植酸酶來源和劑量水平之間未發現相互作用。
無機 P 當量： 基於骨灰分、ADG和FCR作為響應參數，使用對增加來自MCP的可消化P的觀察的響應作為參考來計算PhyX和PhyB的膳食可消化P當量值（g/kg飲食）。對增加來自MCP的可消化P的響應係線性且針對所有三種響應測量呈陽性（P >0.001 ；表 20 ）。無論使用何種響應參數，計算的可消化P當量值均隨著植酸酶劑量的增加而增加，並且最高為1,000 FTU/kg（表20）。在此劑量水平下，PhyX相比PhyB的可消化P當量值更高（響應參數的平均值分別為1.83 g/kg和1.66 g/kg），ADG最高，而骨灰分最低（作為響應參數）。
[表 20 ]：骨灰分、ADG、FCR對增加來自MCP的可消化的響應的線性回歸分析1,2
  a b R2   P 值
             
掌骨灰分   25.0 4.27 0.99   >0.001
ADG   465.9 83.5 0.97   >0.001
FCR   1.9 -0.17 0.98   >0.001
1 線性回歸係藉由增加添加的來自MCP的可消化P（例如，NC、NC + 0.7、NC + 1.4和NC + 1.8 g/kg來自MCP的可消化P）相對掌骨灰分、ADG和FCR進行的，具有方程Y = a + bX，其中Y係響應參數，且X係增加添加的來自MCP的可消化P。2 R2 基於處理平均值的回歸。藉由在給定的植酸酶劑量下應用響應參數（Y，例如骨灰分）值計算可消化的P當量並計算相應的MCP-P替代（X）值。
總之，這項研究表明，以500或1,000 FTU/kg的劑量水平將實驗植酸酶（PhyX）添加到其中未添加無機P的基於玉米-大豆粉的飼料中時，該實驗植酸酶有效維持仔豬掌骨灰分、骨P含量和生長性能，相當於營養充足的飲食（含2.9 g/kg可消化P，其中1.8 g/kg來自MCP的可消化P）。劑量水平為1,000 FTU/kg時，響應最大，據估計在此劑量水平下，以含有稻和米糠的基於玉米-SBM的飲食餵養的斷奶仔豬中，實驗植酸酶可替代飲食中估計的1.83 g/kg可消化磷。實例 10 嵌合的高 Tm 植酸酶類多肽的設計和評估
設計了一系列嵌合多肽，以評估實例4中所述的高Tm植酸酶類多肽（PHY-13594、PHY-13789和PHY-13885）的N-末端和/或C-末端的交換/替換區域的貢獻。出於本研究的目的，N-末端定義為根據SEQ ID NO:1的殘基1-13，核心區域定義為根據SEQ ID NO:1的殘基14-325，而C-末端定義為根據SEQ ID NO:1的殘基326至實例7中所述的每個多肽的末端。使用實施方式1中所述的方法產生蛋白質，並使用實例3中所述的方法，將澄清的培養物上清液樣品用於藉由DSC測量熱穩定性以及在pH 3.5和pH 5.5處的植酸酶活性。使用PHY-13594、PHY-13789、和PHY-13885植酸酶進行比較，產生含有在如下中發現的HAP植酸酶的N-末端區域的嵌合分子的影響：布丘氏菌屬物種 （布丘氏菌NCIMB 41248，SEQ ID NO:88）、布氏檸檬酸桿菌（C. brakii ）（布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii ）AAS45884，SEQ ID NO:89）、和殺魚愛德華菌（E. piscicida ）（遲鈍愛德華菌YP007628727，殺魚愛德華菌WP_015461291.1，SEQ ID NO:90）。同樣，使用PHY-13594、PHY-13789、和PHY-13885進行比較，產生含有在如下中發現的HAP植酸酶的C-末端區域的嵌合分子的影響：蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）（（蜂房哈夫尼菌 WO 2010034835-0002，SEQ ID NO:94）、莫氏耶爾森氏菌（莫氏耶爾森氏菌 WP032813045，SEQ ID NO:95）和布丘氏菌屬物種（布丘氏菌NCIMB 41248，SEQ ID NO:96）。所使用的植酸酶核心區域如下：PHY-13594為SEQ ID NO: 100，PHY-13789為SEQ ID NO: 101，PHY-13885為SEQ ID NO: 102。表21描述了所測試的各種嵌合構建體，並提供了熱穩定性、在pH 3.5處的比活性以及在pH 3.5與pH 5.5處的比活性的比率的結果。如表21所示，所評估的三個高Tm植酸酶的N-末端或C-末端的修飾導致具有非常相似的熱穩定性的酶，表明用於維持該等高Tm植酸酶的熱穩定性的結構決定簇位於核心區域的胺基酸序列內。當使用實例2中所述的測定進行測試時，表21中所述的所有高Tm植酸酶類多肽也顯示出大於100 FTU/mg。
[表 21 ]. 藉由DSC測量的各種嵌合植酸酶的熱穩定性結果。
樣品名稱 修飾的嵌合元件 N- 末端 植酸酶核心 C- 末端 藉由 DSC 測量的 Tm （ ºC ） pH 3.5 處的比活性（微莫耳 P/mg/min ） pH 3.5 與 pH 5.5 處的比活性的比率
PHY-17434 N-末端 布丘氏菌屬物種 PHY-13594 PHY-13594 91 ND ND
PHY-17230 C-末端 PHY-13594 PHY-13594 蜂房哈夫尼菌 94 436 1.2
PHY-17240 C-末端 PHY-13594 PHY-13594 莫氏耶爾森氏菌 95 567 1.3
PHY-13594 無 PHY-13594 PHY-13594 PHY-13594 97 687 1.5
PHY-17041 N-末端 布丘氏菌屬物種 PHY-13789 PHY-13789 99 862 1.5
PHY-17050 N-末端 布氏檸檬酸桿菌 PHY-13789 PHY-13789 100 690 1.4
PHY-17202 N-末端 殺魚愛德華菌（ E. piscicida ） PHY-13789 PHY-13789 100 771 1.7
PHY-17117 C-末端 PHY-13789 PHY-13789 哈夫尼菌 96 754 1.5
PHY-17032 C-末端 PHY-13789 PHY-13789 布丘氏菌屬物種 97 419 1.1
PHY-17126 C-末端 PHY-13789 PHY-13789 莫氏耶爾森氏菌 98 645 1.4
PHY-13789 無 PHY-13789 PHY-13789 PHY-13789 101 700 1.5
PHY-17059 N-末端 布丘氏菌屬物種 PHY-13885 PHY-13885 97 552 1.7
PHY-17068 N-末端 布氏檸檬酸桿菌 PHY-13885 PHY-13885 98 605 1.8
PHY-17174 C-末端 PHY-13885 PHY-13885 布丘氏菌屬物種 95 448 1.6
PHY-17088 C-末端 PHY-13885 PHY-13885 莫氏耶爾森氏菌 96 436 1.5
PHY-13885 無 PHY-13885 PHY-13885 PHY-13885 99 596 1.8
用於說明，圖3描繪了代表性高Tm進化枝植酸酶的三維結構，其使用公佈的緊密相關的蜂房哈夫尼菌6-植酸酶（PDB入口代碼：4ARO，植酸酶與肌醇六烷基硫酸鹽複合）公開的晶體結構建模並顯示為條帶圖。使用MOE（v2013.08，化學計算集團公司（Chemical Computing Group Inc.））構建模型，並使用PyMol軟體程式（1.8.4.2版，薛定諤有限責任公司（Schrodinger，LLC））將其視覺化。黑色表示「核心」結構域，淺灰色調係在本文顯示的實驗中已替換/交換的N和C末端區域。該模型與Ariza等人使用蜂房哈夫尼菌6-植酸酶的晶體結構提出的基於結構的多重序列比對（Degradation of Phytate by the 6-Phytase fromHafnia alvei : A Combined Structural and Solution Study[來自蜂房哈夫尼菌的6-磷酸酶降解植酸鹽：組合結構和溶液研究], PLOS [公共科學圖書館], 8:1-13）一致。
無
[圖1A-1BB]（欄A至1BB）顯示了高Tm植酸酶進化枝的多肽序列的每個位置的HMM概率評分。HMM的綜合評分（COMP）以粗體顯示在圖1A的頂部3欄。每個胺基酸的位置（P）和共有序列（consensus）（C）在P/C下的第1列中顯示。
[圖2]描繪了系統發生樹，其基於胺基酸序列的相似性和差異顯示了包括本文所述的經改造之植酸酶多肽及其片段在內的各種植酸酶之間的相關性。
[圖3]描繪了代表性高Tm進化枝植酸酶的三維結構，其使用公佈的緊密相關的蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei ）6-植酸酶的晶體結構建模並顯示為條帶圖。
以下序列遵循37 C.F.R. §§ 1.821-1.825（「Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules [含有核苷酸序列和/或胺基酸序列揭露的專利申請的要求 - 序列規則]」）並符合世界智慧財產權組織（WIPO）標準ST.25（2009）、以及歐洲專利公約（EPC）和專利合作條約（PCT）法規第5.2和49.5（a-bis）條、以及行政章程第208款和附件C關於序列表的要求。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循37 C.F.R. § 1.822中所示的條例。
SEQ ID NO:1對應於經改造之植酸酶PHY-13594的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:2對應於經改造之植酸酶PHY-10931的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:3對應於經改造之植酸酶PHY-10957的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:4對應於經改造之植酸酶PHY-11569的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:5對應於經改造之植酸酶PHY-11658的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:6對應於經改造之植酸酶PHY-11673的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:7對應於經改造之植酸酶PHY-11680的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:8對應於經改造之植酸酶PHY-11895的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:9對應於經改造之植酸酶PHY-11932的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:10對應於經改造之植酸酶PHY-12058的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:11對應於經改造之植酸酶PHY-12663的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:12對應於經改造之植酸酶PHY-12784的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:13對應於經改造之植酸酶PHY-13177的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:14對應於經改造之植酸酶PHY-13371的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:15對應於經改造之植酸酶PHY-13460的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:16對應於經改造之植酸酶PHY-13513的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:17對應於經改造之植酸酶PHY-13637的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:18對應於經改造之植酸酶PHY-13705的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:19對應於經改造之植酸酶PHY-13713的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:20對應於經改造之植酸酶PHY-13747的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:21對應於經改造之植酸酶PHY-13779的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:22對應於經改造之植酸酶PHY-13789的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:23對應於經改造之植酸酶PHY-13798的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:24對應於經改造之植酸酶PHY-13868的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:25對應於經改造之植酸酶PHY-13883的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:26對應於經改造之植酸酶PHY-13885的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:27對應於經改造之植酸酶PHY-13936的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:28對應於經改造之植酸酶PHY-14004的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:29對應於經改造之植酸酶PHY-14215的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:30對應於經改造之植酸酶PHY-14256的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:31對應於經改造之植酸酶PHY-14277的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:32對應於經改造之植酸酶PHY-14473的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:33對應於經改造之植酸酶PHY-14614的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:34對應於經改造之植酸酶PHY-14804的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:35對應於經改造之植酸酶PHY-14945的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:36對應於經改造之植酸酶PHY-15459的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:37對應於經改造之植酸酶PHY-16513的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:38對應於諾氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae ）WP 064555343.1。
SEQ ID NO:39對應於布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii ）AAS45884.1。
SEQ ID NO:40對應於柯克斯體科（Coxiellaceae ）細菌RDH40465.1。
SEQ ID NO:41對應於腸桿菌科（Enterobacteriaceae ）WP 094337278.1。
SEQ ID NO:42對應於大腸桿菌WP 001297112。
SEQ ID NO:43對應於蜂房哈夫尼菌WP 072307456.1。
SEQ ID NO:44對應於Rouxiella badensis WP 084912871.1。
SEQ ID NO:45對應於沙雷氏菌屬（Serratia ）物種WP 009636981.1。
SEQ ID NO:46對應於阿氏耶爾森氏菌（Yersinia aldovae ）WP 004701026.1。
SEQ ID NO:47對應於弗氏耶爾森氏菌（Yersinia frederiksenii ）WP 050140790.1。
SEQ ID NO:48對應於克氏耶爾森氏菌（Yersinia kristensenii ）WP 004392102.1。
SEQ ID NO:49對應於莫氏耶爾森氏菌（Yersinia mollaretii ）WP 049646723.1。
SEQ ID NO:50對應於羅氏耶爾森氏菌（Yersinia rohdei ）WP 050539947.1。
SEQ ID NO:51對應於EP 322271中的SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:52對應於US 8101391中的SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:53對應於US 8101391中的SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:54對應於US 8101391中的SEQ ID NO:35。
SEQ ID NO:55對應於US 8101391中的SEQ ID NO:49。
SEQ ID NO:56對應於US 8143046中的SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:57對應於US 8143046中的SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:58對應於US 8460656中的SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:59對應於US 8557555中的SEQ ID NO:13。
SEQ ID NO:60對應於US 8557555中的SEQ ID NO:24。
SEQ ID NO:61對應於US 20160083700中的SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:62對應於WO 2010034835-0002中的SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:63對應於裡氏木黴（T. reesei ）天冬胺酸蛋白酶訊號序列。
SEQ ID NO:64對應於經改造之植酸酶PHY-16812的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:65對應於經改造之植酸酶PHY-17403的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:66對應於經改造之植酸酶PHY-17336的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:67對應於經改造之植酸酶PHY-17225的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:68對應於經改造之植酸酶PHY-17186的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:69對應於經改造之植酸酶PHY-17195的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:70對應於經改造之植酸酶PHY-17124的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:71對應於經改造之植酸酶PHY-17189的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:72對應於經改造之植酸酶PHY-17218的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:73對應於經改造之植酸酶PHY-17219的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:74對應於經改造之植酸酶PHY-17204的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:75對應於經改造之植酸酶PHY-17215的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:76對應於經改造之植酸酶PHY-17201的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:77對應於經改造之植酸酶PHY-17205的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:78對應於經改造之植酸酶PHY-17224的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:79對應於經改造之植酸酶PHY-17200的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:80對應於經改造之植酸酶PHY-17198的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:81對應於經改造之植酸酶PHY-17199的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:82對應於經改造之植酸酶PHY-17214的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:83對應於經改造之植酸酶PHY-17197的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:84對應於經改造之植酸酶PHY-17228的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:85對應於經改造之植酸酶PHY-17229的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:86對應於經改造之植酸酶PHY-17152的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:87對應於經改造之植酸酶PHY-17206的預測的成熟序列。
SEQ ID NO:88對應於布丘氏菌NCIMB 41248 N-末端。
SEQ ID NO:89對應於布氏檸檬酸桿菌AAS45884 N-末端。
SEQ ID NO:90對應於遲鈍愛德華菌（E. tarda ）YP007628727 N-末端。
SEQ ID NO:91對應於PHY-13594 N-末端。
SEQ ID NO:92對應於PHY-13789 N-末端。
SEQ ID NO:93對應於PHY-13885 N-末端。
SEQ ID NO:94對應於WO 2010034835-0002中的C-末端SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:95對應於莫氏耶爾森氏菌WP032813045 C-末端。
SEQ ID NO:96對應於布丘氏菌NCIMB 41248 C-末端。
SEQ ID NO:97對應於PHY-13594 C-末端。
SEQ ID NO:98對應於PHY-13789 C-末端。
SEQ ID NO:99對應於PHY-13885 C-末端。
SEQ ID NO:100對應於PHY-13594核心區域。
SEQ ID NO:101對應於PHY-13789核心區域。
SEQ ID NO:102對應於PHY-13885核心區域。
SEQ ID NO:103對應於PHY-16812核心區域。
SEQ ID NO:104對應於US7081563中的SEQ ID NO:4。
無
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Claims (36)

  1. 一種經改造之植酸酶多肽或其片段，該經改造之植酸酶多肽或其片段包含與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列具有至少82%序列同一性的植酸酶活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段的胺基酸序列具有至少約1200的隱瑪律科夫模型（HMM）評分，如表11中關於高Tm值植酸酶類多肽所示。
  3. 一種經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段，該經改造之植酸酶多肽或其核心結構域片段與對應於SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的胺基酸位置14-325具有至少78%的序列同一性。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中使用如實例5中所述之標準進料製粒回收率測試，在95ºC於混合機液體應用（MLA）中應用30秒時，該多肽或片段具有至少約50%的進料製粒回收率。
  5. 如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中使用如實例5中所述之標準進料製粒回收率測試，該多肽或片段在95ºC在MLA中應用30秒時與在80ºC在MLA中應用30秒相比的進料製粒回收率的比率為至少約0.7。
  6. 如申請專利範圍第1-5項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中使用實例3中所述之差示掃描量熱分析測定條件，所述多肽或其片段包含至少約92.5ºC的Tm溫度。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段於實例3中所述之測定條件下在pH 3.5包含至少約100 U/mg的比活性。
  8. 如申請專利範圍第1-2項或第4-7項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述植酸酶多肽包含選自由以下組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID:NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、和SEQ ID NO:64。
  9. 如申請專利範圍第1-2項或第4-7項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中所述植酸酶多肽包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、和SEQ ID NO:87。
  10. 一種動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物，所述動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物包含如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段可以 (i) 單獨使用，或 (ii) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物組合使用，或 (iii) 與至少一種其他酶一起使用，或 (iv) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物以及至少一種其他酶組合使用，或 (v) (i)、(ii)、(iii) 或 (iv) 中的任一種、進一步包含至少一種其他飼料添加劑組分，以及視需要該經改造之植酸酶多肽或其片段以至少約0.1 g/噸飼料的量存在。
  11. 一種動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物，該動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物包含如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段，其中該經改造之植酸酶多肽或其片段可以 (i) 單獨使用，或 (ii) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物組合使用，或 (iii) 與至少一種其他酶一起使用，或 (iv) 與包含至少一種細菌菌株的直接飼餵微生物以及至少一種其他酶組合使用，或 (v) (i)、(ii)、(iii) 或 (iv) 中的任一種、進一步包含至少一種其他飼料添加劑組分，以及視需要該經改造之植酸酶多肽或其片段以至少約0.1 g/噸飼料的量存在。
  12. 一種重組構建體，該重組構建體包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段的核苷酸序列。
  13. 一種重組構建體，該重組構建體包含在生產宿主中起作用的調控序列，該調控序列有效地連接到編碼如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段的核苷酸序列。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之重組構建體，其中該生產宿主選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物和藻類。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之重組構建體，其中該生產宿主選自由以下組成之群組：細菌、真菌、酵母、植物、和藻類。
  16. 一種用於生產經改造之植酸酶多肽或其片段之方法，該方法包括： (a) 用如申請專利範圍第12項所述之重組構建體轉化生產宿主；和 (b) 在產生該經改造之植酸酶多肽或其片段的條件下培養步驟 (a) 的生產宿主。
  17. 一種用於生產經改造之植酸酶多肽或其片段之方法，該方法包括： (a) 用如申請專利範圍第13項所述之重組構建體轉化生產宿主；和 (b) 在產生該經改造之植酸酶多肽或其片段的條件下培養步驟 (a) 的生產宿主。
  18. 如申請專利範圍第16或17項所述之方法，其中從該生產宿主中視需要回收該經改造之植酸酶多肽或其片段。
  19. 一種含有植酸酶的培養物上清液，該含有植酸酶的培養物上清液藉由如申請專利範圍第16或17項所述之方法獲得。
  20. 一種含有植酸酶的培養物上清液，該含有植酸酶的培養物上清液藉由如申請專利範圍第18項所述之方法獲得。
  21. 一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段。
  22. 一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之具有植酸酶活性的經改造之植酸酶多肽或其片段。
  23. 一種用於在動物飼料中使用的乾燥的酶組成物，該乾燥的酶組成物包含如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段。
  24. 一種用於在動物飼料中使用的乾燥的酶組成物，該乾燥的酶組成物包含如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段。
  25. 如申請專利範圍第23項所述之乾燥的酶組成物，其中該乾燥的酶組成物係顆粒狀飼料添加劑組成物。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之乾燥的酶組成物，其中該乾燥的酶組成物係顆粒狀飼料添加劑組成物。
  27. 一種用於在動物飼料中使用的液體酶組成物，該液體酶組成物包含如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段。
  28. 一種用於在動物飼料中使用的液體酶組成物，該液體酶組成物包含如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或其片段。
  29. 一種用於改善動物飼料的營養價值之方法，其中將如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶或其片段添加到動物飼料中。
  30. 一種用於改善動物飼料的營養價值之方法，其中將如申請專利範圍第6-9項中任一項所述之經改造之植酸酶或其片段添加到動物飼料中。
  31. 一種用於在一個或多個指標方面改善動物性能之方法，該方法包括向該動物施用有效量的如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之經改造之植酸酶多肽或如申請專利範圍第10項或申請專利範圍第11項所述之動物飼料、餵養料、飼料添加劑組成物或預混物。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中該一個或多個指標選自由以下組成之群組：飼料效率增加、增重增加、飼料轉化率降低、飼料中營養素或能量的消化率改善、氮保留量改善、避免壞死性腸炎負面影響的能力改善、以及免疫應答改善。
  33. 如申請專利範圍第31項或申請專利範圍第32項所述之方法，其中該動物係選自由豬和家禽組成的組的單胃動物。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該豬選自由以下組成之群組：仔豬、生長豬、和母豬。
  35. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該家禽選自由以下組成之群組：火雞、鴨、雞、肉仔雞、蛋雞、鵝、雉雞、鵪鶉和鴯鶓。
  36. 如申請專利範圍第31項或申請專利範圍第32項所述之方法，其中該動物係選自由以下組成之群組的反芻動物：牛、小牛、山羊、綿羊、長頸鹿、美洲野牛、駝鹿、麋鹿、犛牛、水牛、鹿、馴鹿、北美馴鹿、駱駝、羊駝、美洲駝、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
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