BRPI0517540B1 - polipeptídeo isolado,uso de pelo menos um polipeptídeo, método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, aditivo de ração animal, e, composição de ração animal - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NU-CLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINAN-TE, USO DE PELO MENOS UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, E, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL A invenção refere-se a uma fitase derivada de Citrobacter braakii e às fitases relacionadas. As fitases pertencem à família de histidina fosfatases ácidas, são estáveis a ácido, de um desem-penho excelente em ração animal, de uma especificidade elevada na direção do substrato fitato, e esperadamente de uma atividade específica alta. A invenção também se refere ao DNA corres-pondente, à produção de fitases de tipo selvagem e recombinante, bem como ao uso das mes-mas.

Description

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados possuindo atividade de fitase e aos polinucleotídeos codificadores de polipeptídeos. Os polipeptídeos são relacionados a uma fitase derivada de Citrobacter braakii, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada na listagem de seqüências apendida como SEQ ID NO: 4. A invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico, aos vetores, e às células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como aos métodos para produzir e usar os polipeptídeos, em particular em ração animal.

Descrição da Arte Relacionada

Fitases são enzimas bem conhecidas, como o são as vantagens da adição delas em gêneros alimentícios para animais, incluindo humanos. As fitases têm sido isoladas de muitas fontes variadas, incluindo numerosas cepas bacterianas e fúngicas.

A histidina fosfatase ácida appA de Escherichia coli bem como outras fitases de bactérias gram-negativas são conhecidas por possuírem uma atividade específica alta.

A produção por Citrobacter braakii YH-15 de uma fitase intracelular é relatada por Kim et al em Biotechnology Letters 25: 1231-1234, 2003. KR-2004-A-045267 e WO-2004/085638 descrevem, como SEQ ID NO: 7, a sequência de aminoácidos de uma fitase de Citrobacter braakii YH- 15, depositada como KCCM 10427. Esta seqüência de aminoácidos é aqui incluída como SEQ ID NO: 5. WO-2004/085638 foi publicada aos 5 07.10.2004, a saber após a primeira data de prioridade do presente pedido.

Um objetivo da presente invenção é proporcionar polipeptídeos alternativos possuindo atividade de fitase e polinucleotídeos codificadores de polipeptídeos. Os polipeptídeos da invenção são preferivelmente de propriedades aperfeiçoadas, mais preferivelmente melhoradas, por exemplo de uma especificidade para substrato diferente, de uma atividade específica mais alta, de uma estabilidade aumentada (tal como estabilidade a ácido, estabilidade ao calor, e/ou estabilidade à protease, em particular estabilidade à pepsina), de um pH ótimo aperfeiçoado (tal como um pH ótimo menor, ou maior), e/ou de um desempenho melhorado em ração 15 animal (tal como uma liberação melhorada e/ou degradação de fitato melhorada).

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se aos polipeptídeos possuindo atividade de fitase, selecionados do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo —0 possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 98,6% de identidade com (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) a parte de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) uma variante compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais aminoácidos de (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) a parte de 25 polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e/ou (c) um fragmento de (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) a parte de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

A invenção também se refere aos polinucleotídeos isolados codificadores de um polipeptídeo possuindo atividade de fitase, selecionados 3 e do grupo consistindo de: (a) um polinucleotideo codificador de um polipeptideo possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 98,6% de identidade com aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2; e (b) um polinucleotideo possuindo pelo menos 98,3% de identidade com nucleotídeos 5 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1.

A invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico, aos vetores de expressão recombinantes, e às células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos.

A invenção também se refere aos métodos para produzir tais J_p polipeptídeos possuindo atividade de fitase compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotideo codificador de polipeptideo sob condições que conduzem à produção do polipeptideo; e (b) recuperar o polipeptideo. 15 A invenção também se refere aos métodos de usar os polipeptídeos da invenção em ração animal, bem como às composições de ração animal e de aditivo de ração animal contendo os polipeptídeos.

A invenção refere-se em adição a um construto de ácido nucleico compreendendo um gene codificador de uma proteína ZD operacionalmente ligado em uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um peptídeo de sinal consistindo de: (i) nucleotídeos 1 a 66 de SEQ ID NO: 1 ou (ii) nucleotídeos 1 a 66 de SEQ ID NO: 3; o qual o gene é estranho para a seqüência de nucleotídeos. Definições 25 Atividade de fitase: No contexto presente um polipeptideo possuindo atividade de fitase (uma fitase) é uma enzima que catalisa a hidrólise de fitato (mio-inositol hexaquisfosfato a (1) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos do mesmo e(3) fosfato inorgânico. O sítio ENZYME na internet (http://www.expasY.ch/enzyme/)4 ri:: é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. E primariamente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB) e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual tem sido 5 proporcionado um número de EC (Enzyme Commission) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Veja também o manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992).

De acordo com o sítio ENZYME, são conhecidos três tipos diferentes de fítases: Uma 3-fitase (mio-inositol hexafosfato 3-fosfo- |0 hidrolase, EC 3.1.3.8), uma 6-fitase (mio-inositol hexafosfato-6-fosfo- hidrolase, EC 3.1.3.26), e uma 5-fitase (EC 3.1.3.72). Para os propósitos da presente invenção, todos os tipos estão incluídos na definição de fitase.

Em uma modalidade particular, as fítases da invenção pertencem à família de histidina fosfatases ácidas, que inclui a fosfatase ácida 15 de pH 2,5 de Escherichia coli (gene appA) bem como as fítases fúngicas de Aspergillus awamorii fítases A e B (EC: 3.1.3.8) (gene phyA e phyB). As histidina fosfatases ácidas compartilham duas regiões de similaridade de seqüência, cada uma centrada ao redor de um resíduo de histidina conservado. Estas duas histidinas parecem estar envolvidas no mecanismo catalítico de 0 enzimas. A primeira histidina está localizada na seção N-terminal e forma um intermediário de fósforo-histidina enquanto que a segunda está localizada na seção C-terminal e possivelmente atua como doadora de prótons.

Em uma outra modalidade particular, as fítases da invenção possuem um motivo de sítio ativo conservado, a saber R-H-G-X-R-X-P, no 25 qual X designa qualquer aminoácido (veja aminoácidos 16 a 22 de SEQ ID NOs: 2 e 4).

Para os propósitos da presente invenção a atividade de fitase é determinada na unidade de FYT, um FYT sendo a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgânico por min. sob as seguintes condições: pH 5,5; temperatura 37°C; substrato: fitato de sódio (CβHgC^PδNa^) em uma concentração de 0,0050 mol/L. Ensaios de fitase adequados são os ensaios FYT e FTU descritos no Exemplo 1 de WO 00/20569. FTU é para determinar a atividade de fitase em ração e pré-mistura. A atividade de fitase também pode ser determinada utilizando os ensaios de fitase de Exemplos 4, 7 e 8 aqui.

O pH ótimo de um polipeptídeo da invenção é determinado pela incubação da fitase em vários valores de pH, usando um substrato em uma concentração predeterminada e uma temperatura de incubação fixa. O pH ótimo é então determinado de uma representação gráfica de atividade de fitase versus pH. Em uma modalidade particular, o ensaio FYT é usado, a saber o substrato é fitato de sódio 5 mM, a temperatura de reação 37°C, e a atividade é determinada em unidades FYT em vários valores de pH, por exemplo pH 2-12, usando tampões adequados, tais como: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCE 1 mM, KC1 150 mM, Triton X-100 0,01% ajustado para valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, e 12,0 com HC1 ou NaOH. Em outra modalidade particular, o ensaio de fitase de qualquer um dos Exemplos 4, 7 e 8 é usado, a saber o substrato é fitato de Na 0,5 mM, preferivelmente 5 mM, que é dissolvido em um tampão do pH desejado (tal como aqueles mencionados acima), e fosfato solúvel é determinado por complexação com molibdato / feno e medição de densidade óptica a 750 nm, ou, usando o ensaios dos Exemplos 7 e 8, com molibdato / vanadato e medição de absorbância a 405 nm. Cego (teste de Exemplo 4): 20 μL de amostra, 100 μL de substrato e 120 μL de reagente de cor são misturados, incubados 5 min a 37°C e ODcego é medida a 750 nm. Amostra: 20 μL de amostra 100 μL de substrato são misturados, incubados 30 min a 37°C, 120 μL de reagente de cor são adicionados, incubados 5 min a 37°C, e ODamostra é medida a 750 nm. A atividade de fitase é medida como OD = ODamostra - ODcego. Um pH ótimo relativamente baixo significa um pH ótimo abaixo de pH 5,0, por exemplo abaixo de pH 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, ou mesmo abaixo de 2,0. Um pH ótimo relativamente alto significa um pH ótimo acima de pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, ou mesmo acima de 9,0.

Polipeptideo isolado: O termo “polipeptideo isolado” como aqui usado refere-se a um polipeptideo que é pelo menos 20% puro, preferivelmente pelo menos 40% puro, com maior preferência pelo menos 60% puro, com preferência bem maior pelo menos 80% puro, mais preferivelmente pelo menos 90% puro, e muito mais preferivelmente pelo menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptideo substancialmente puro: O termo “polipeptideo substancialmente puro” denota aqui uma preparação de polipeptideo que contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, com maior preferência no máximo 6%, com maior preferência no máximo 5%, com maior preferência no máximo 4%, no máximo 3%, com ainda maior preferência no máximo 2%, mais preferivelmente no máximo 1%, e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptideo com o qual está nativamente associado. Portanto é preferido que o polipeptideo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, com maior preferência pelo menos 95% puro, com maior preferência pelo menos 96% puro, com maior preferência pelo menos 96% puro, com maior preferência pelo menos 97% puro, com maior preferência pelo menos 98% puro, com preferência ainda maior pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro, e ainda mais preferivelmente 100% puro em peso do material de polipeptideo total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polipeptídeos estejam na forma “essencialmente pura”, i.e., que a preparação de polipeptídeo esteja essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual ele está nativamente associado. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por intermédio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássica.

Aqui, o termo “polipeptídeo substancialmente puro” é sinônimo dos termos “polipeptídeo isolado” e “polipeptídeo na forma isolada”.

Identidade: A relação entre duas seqüências de aminoácidos ou entre duas seqüências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade”.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos, bem como o grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos, é determinado pelo programa "align" que é um alinhamento de Needleman-Wunsch (i.e. alinhamento global), útil para ambos alinhamentos de proteínas e de DNAs. A matriz de resultados pré- definida BLOSUM50 e a matriz de identidade pré-definida são usadas para alinhamentos de proteínas e de DNAs respectivamente. A penalidade para o primeiro resíduo em um hiato é -12 para proteínas e -16 para DNA. Enquanto que as penalidades para resíduos adicionais em um hiato são -2 para proteínas e -4 para DNA.

"Align" é uma parte do pacote FASTA de versão v20u6 (veja W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98). Alinhamentos de proteínas por FASTA usam o algoritmo de Smith-Waterman sem limitação sobre o tamanho de hiato (veja "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

O algoritmo de Needleman-Wunsch é descrito em Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, e o programa de alinhamento por Myers e W. Miller em "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. 5 O grau de identidade entre a seqüência alvo (ou amostra, ou teste) e uma seqüência especificada (por exemplo aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2) também pode ser determinada como segue: As sequências são alinhadas usando o programa "align." O número de combinações perfeitas ("Nperfect-match") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita o significa mesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento, normalmente designado com um “|” no alinhamento). O comprimento da seqüência especificada (o número de resíduos de aminoácido) é determinado ("N-specified", no exemplo mencionado acima = 411). O grau de identidade é calculado como a razão entre "N-perfect-match" e "N-specified" (para 15 conversão para identidade percentual, multiplicar por 100).

Em uma modalidade alternativa, o grau de identidade entre uma seqüência alvo (ou amostra, ou teste) e a seqüência especificada (por exemplo os aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2) é determinado como segue: As duas seqüências são alinhadas usando o programa "align." O —0 número de combinações perfeitas ("N-perfect-match") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita significa o mesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento, normalmente designado com um “I” no alinhamento). O comprimento comum das duas seqüências alinhadas também é determinado, a saber o número total de aminoácidos na 25 parte de recobrimento do alinhamento ("N-overlap"). O grau de identidade é calculado como a razão entre "N-perfect-match" e "N-overlap" (para conversão para identidade percentual, multiplicar por 100). Em uma modalidade, N-overlap inclui hiatos trailing e leading formados pelo alinhamento, se houver. Em outra modalidade, N-overlap exclui os hiatos trailing e leading formados pelo alinhamento, se houver.

Em outra modalidade alternativa, o grau de identidade entre ‘ uma seqüência alvo (ou amostra, ou teste) e uma seqüência especificada (por exemplo aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2) é determinado como segue: 5 As seqüências são alinhadas usando o programa "align." O número de combinações perfeitas ("N-perfect-match") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita significa o mesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento, normalmente designado com um “|” no alinhamento). O comprimento da seqüência alvo (o número de resíduos de aminoácido) é determinado ("N-target"). O grau de identidade é calculado como a razão entre "N-perfect-match" e "N-target" (para conversão para identidade percentual, multiplicar por 100).

Preferivelmente, o recobrimento é pelo menos 20% da seqüência especificada ("N-overlap" como definido acima, dividido pelo 15 número de aminoácidos na seqüência especificada ("N-specified"), e multiplicado por 100), com maior preferência pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos 95%. Isto significa que pelo menos 20% (preferivelmente 25-95%) dos aminoácidos da seqüência especificada terminam sendo incluídos no recobrimento, quando a seqüência amostra for alinhada com a seqüência especificada.

Altemativamente, o recobrimento é pelo menos 20% da seqüência alvo (ou amostra, ou teste) ("N-overlap" como definido acima, dividido por "N-target" como definido acima, e multiplicado por 100), com 25 maior preferência pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos 95%. Isto significa que pelo menos 20% (preferivelmente 25-95%) dos aminoácidos da seqüência alvo terminam sendo incluídos nos aminoácidos da seqüência alvo, quando alinhados contra a seqüência especificada.

Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” é aqui definido como um polipeptídeo possuindo um ou mais aminoácidos deletados da terminação amino e/ou carboxila da parte de peptídeo maduro da sequência especificada, por exemplo SEQ ID NO: 2 ou 4, 5 ou uma sua seqüência homóloga, na qual o fragmento possui atividade de fitase. Em modalidades particulares, o fragmento contém pelo menos 350, 360, 370, 380, 390, 400, 405, ou pelo menos 410 resíduos de aminoácido.

Subseqüência: O termo “subseqüência” é aqui definido como uma seqüência de nucleotídeos possuindo um ou mais nucleotídeos deletados X) da extremidade 5’ e/ou 3’ da parte codificadora de peptídeo maduro da seqüência especificada, por exemplo SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sua seqüência homóloga, na qual a subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo possuindo atividade de fitase. Em modalidades particulares, a subseqüência contém pelo menos 1050, 1080, 1110, 1140, 1170, 1200, 1215, 15 ou pelo menos 1230 nucleotídeos.

Variante alélica: O termo “variante alélica” denota aqui quaisquer duas ou mais formas de um gene ocupando o mesmo locus cromossômico. Variação alélica decorre naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. Mutações de gene o podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos possuindo seqüências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo 25 “polinucleotídeo substancialmente puro” como aqui usado refere-se a uma preparação de polinucleotídeo livre de nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso em sistemas de produção de proteína geneticamente engenhada. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, more preferivelmente no máximo 6%, more preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, bem mas preferivelmente no máximo 1%, e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material 5 de polinucleotideo com o qual ele está naturalmente associado. Um polinucleotideo substancialmente puro pode, contudo, incluir regiões não traduzidas 5’ e 3’ naturalmente ocorrentes, tais como promotores e terminadores. É preferido que o polinucleotideo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelo menos 92% puro, more O preferivelmente pelo menos 94% puro, more preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, bem mais preferivelmente pelo menos 99%, e ainda bem mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção 15 estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeos aqui descritos estejam na “forma essencialmente pura”, i.e. que a preparação de polinucleotideo esteja essencialmente livre de outro material de polinucleotideo com o qual ela está nativamente associada. Aqui, o termo “polinucleotideo substancialmente —0 puro” é sinônimo dos termos “polinucleotideo isolado” e “polinucleotideo na forma isolada”. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou quaisquer combinações das mesmas.

Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucleico, de 25 fita quer única quer dupla, que é isolada de um gene naturalmente ocorrente ou que está modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos em uma maneira que de outro modo não existiria na natureza. O termo construto de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência codificadora da presente invenção. 12

Seqüência de controle: O termo “seqüência de controle” é aqui definido para incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser 5 nativa ou estranha à seqüência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo.

Tais seqüências de controle incluem, mas não são limitadas a. uma seqüência líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor, seqüência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor, e sinas de terminação de 10 transcrição e de tradução. As seqüências de controle podem ser proporcionadas com ligadores para o propósito de introdução de sítios de restrição específicos facilitando a ligação das seqüências de controle com a região codificadora da seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo. 15 Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” denota aqui uma configuração na qual uma seqüência de controle está posicionada em uma posição apropriada relativa à seqüência codificadora da seqüência de polinucleotídeo de tal modo que a seqüência de controle direciona a expressão da seqüência codificadora de um polipeptídeo. 0 Seqüência codificadora: Quando aqui usado o termo “seqüência codificadora” significa uma seqüência de nucleotídeos , que diretamente especifica a seqüência de aminoácidos de seu produto de proteína. Os limites da seqüência codificadora são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta, que normalmente inicia no códon de 25 iniciação ATG ou códons de iniciação alternativos tais como GTG e TTG. A seqüência codificadora pode ser um DNA, cDNA, ou uma seqüência de nucleotídeos recombinante.

Parte de polipeptídeo maduro: Quando aqui usados os termos “parte de polipeptídeo maduro” ou "parte de peptídeo maduro” referem-se àquela parte do polipeptídeo que é secretada por uma célula que contém, como parte de sua equipe genética, um polinucleotídeo codificador de polipeptídeo. Em outras palavras, a parte de polipeptídeo maduro refere-se àquela parte do polipeptídeo que permanece após a clivagem da parte de 5 peptídeo de sinal uma vez que ela tem satisfeito sua função de dirigir o polipeptídeo codificado para dentro da rota secretória da célula. A parte de peptídeo de sinal predita de SEQ ID NOs: 2 e 4 é de aminoácidos -22 a -1 da mesma, o que significa que a parte de polipeptídeo maduro predita de SEQ ID NOs: 2 e 4 corresponde aos aminoácidos 1 a 411 da mesma. Contudo, uma ZD ligeira variação pode ocorrer de célula hospedeira a célula hospedeira, e portanto a parte de polipeptídeo maduro de expressão é preferida.

Parte codificadora de polipeptídeo maduro: Quando aqui usado o termo “parte codificadora de polipeptídeo maduro” ou “seqüência codificadora de polipeptídeo maduro” refere-se àquela parte do 15 polinucleotídeo codificador de polipeptídeo que codifica a parte de polipeptídeo maduro. Por exemplo, para SEQ ID NO: 1, a parte codificadora de polipeptídeo maduro predita corresponde aos nucleotídeos 67 a 1299 (codificando aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2).

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa Z) envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada a, transcrição, modificação de pós-transcrição, modificação de pós-tradução, e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” é aqui definido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um 25 polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo da invenção, e que está operacionalmente ligado em nucleotídeos adicionais que proporcionam sua expressão.

Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira”, como aqui usado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução, e semelhantes com um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotideo da presente invenção. Modificação: O termo “modificação” significa aqui qualquer modificação química do polipeptideo especificado, por exemplo do 5 polipeptideo consistindo dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 ou 4, bem como manipulação genética do DNA codificador daquele polipeptideo. A(s) modificação(ões) pode(m) ser substituição(ões), deleção(ões) e/o inserção(ões) de aminoácido(s) bem como reposição(ões) de cadeia(s) lateral(ais) de aminoácido. K) Variante artificial: Quando aqui usado, o termo “variante artificial” significa um polipeptideo possuindo atividade de fitase produzida por um organismo expressando uma seqüência de nucleotídeos modificada de SEQ ID NO: 1 ou 3. A seqüência de nucleotídeos modificada é obtida por intervenção de humano por modificação da seqüência de nucleotídeos descrita 15 em SEQ ID NO: 1 ou 3.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos Possuindo Atividade de Fitase

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui -K) um grau de identidade aos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 (i.e., o polipeptideo maduro) de pelo menos 98,6%.

Em modalidades particulares, o grau de identidade é pelo menos 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou pelo menos 99,9%, que possuem atividade 25 de fitase (daqui em diante “polipeptídeos homólogos”).

Em outras modalidades particulares, os polipeptídeos homólogos possuem uma seqüência de aminoácidos que difere em vinte, dezoito, dezesseis, quatorze, doze, dez, oito, seis, cinco, quatro, três, dois, ou um aminoácido dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2.

Em modalidades alternativas, o grau de identidade aos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 (i.e., o polipeptídeo maduro) é pelo menos 70, 80, 85,90, 95, 97, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, ou 98,5%.

Em modalidades particulares, o polipeptídeo da presente invenção compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou é uma sua variante alélica, ou um seu fragmento que possui atividade de fitase. Em ainda outras modalidades particulares, o polipeptídeo compreende aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica do mesmo, ou um fragmento do mesmo que possui atividade de fitase.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui um grau de identidade aos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4 (i.e., o polipeptídeo maduro) de pelo menos 99,1%.

Em modalidades particulares, o grau de identidade é pelo menos 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou pelo menos 99,9%, que possuem atividade de fitase (aqui em diante “polipeptídeos homólogos”).

Em outras modalidades particulares, os polipeptídeos homólogos possuem uma seqüência de aminoácidos que difere em vinte, dezoito, dezesseis, quatorze, doze, dez, oito, seis, cinco, quatro, três, dois, ou um aminoácido dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4.

Em modalidades alternativas, o grau de identidade aos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4 (i.e. o polipeptídeo maduro) é pelo menos 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, ou pelo menos 99,0%.

Em modalidades particulares, o polipeptídeo da presente invenção compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou uma sua variante alélica; ou um seu fragmento que possui atividade de fitas. Em ainda outras modalidades particulares, o polipeptídeo compreende aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou uma sua variante alélica, ou um seu fragmento que possui atividade de fitase.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados possuindo atividade de fitase que são codificados pelos 5 polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência pelo menos média, preferivelmente média com (i) nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1, (ii) a parte codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, e/ou (iii) uma fita complementar de qualquer um de (i), e (ii), e/ou (iv) uma subseqüência de (i), (ii), ou (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatas, |0 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). Uma subseqüência de SEQ ID NO: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que possui atividade de fitase. 15 Em modalidades particulares, a hibridização ocorre sob condições de estringência pelo menos média-alta, pelo menos alta, ou pelo menos muito alta, preferivelmente sob condições de estringência média-alta, alta ou muito alta.

Em modalidades alternativas, a hibridização é conduzida sob “0 condições de estringência muito baixa, ou baixa.

A seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou uma sua subseqüência, bem como a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento, pode ser usada para planejar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificador de polipeptídeos possuindo 25 atividade de fitase a partir de cepas de espécies ou gêneros diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou da espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, com o propósito de identificar e isolar o gene correspondente 17 : no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, mas devem ser de pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e muito mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Contudo, é preferido que a 5 sonda de ácido nucleico seja de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ser de pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou muito mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos em comprimento. Até mesmo sondas mais o longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que são pelo menos de 600 nucleotídeos, pelo menos preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos, ou muito mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Sondas tanto de DNA quanto de RNA podem ser utilizadas. As sondas são 15 tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 3;>S, biotina, ou avidina). Tais sondas são incluídas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico preparada a partir de tais outros organismos pode, por conseguinte, ser tríada para DNA que hibridiza "0 com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptideo possuindo atividade de fitase. DNA genômico ou outro DNA de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado sobre nitro-celulose ou outro material 25 veículo apropriado. Com o objetivo de identificar um clone ou DNA que é homólogo à SEQ ID NO: 1, ou uma sua subseqüência, o material veículo é empregado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, hibridização indica que a seqüência de nucleotídeos hibridiza em uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo à seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, sua fita complementar, ou uma sua subseqüência, sob condições de estringência muito baixa a muito alta. Moléculas nas quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando filme de raios-X.

Em uma modalidade particular, a sonda de ácido nucleico é qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, e 38. Em outra modalidade particular, a sonda de ácido nucleico é a fita complementar de nucleotídeos 67 a 450, nucleotídeos 450 a 900, ou nucleotídeos 900 a 1299 de SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade particular, a sonda de ácido nucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou uma sua subseqüência. Em ainda uma outra modalidade específica, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1, em particular qualquer uma das suas regiões codificadoras de polipeptídeo maduro.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, SDS 0,3%, 200 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado, e quer formamida 25% para estringências muito baixas e baixas, formamida 35% para estringências médias e médias-altas, ou formamida 50% para estringências altas e muito altas, seguido por procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 2X SSC, SDS 0,2% preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65 °C (estringência alta), e muito mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que são cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e pós-hibridização de lavagem a cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo de Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCI 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 0,5%, solução deIX Denhardt, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato de sódio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para sondas curtas que são de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X SCC mais SDS 0,1% por 15 minuto e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo de Tm calculado.

Sob condições de hibridização contendo sal, o Tm efetivo é aquele que controla o grau de identidade requerido entre a sonda e o DNA ligado em filtro para hibridização bem sucedida. O Tm efetivo pode ser definido usando a fórmula abaixo para determinar o grau de identidade para dois DNAs para hibridizar sob várias condições de estringência.

Tm efetivo = 81,5 + 16,6(log M[Na+]) + 0,41(%G+C) - 0,72(% formamida) (Veja www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc73 l/dna/dna6.htm) "G+C" designa o conteúdo de nucleotídeos G e T na sonda.

Para estringência média, por exemplo, a formamida é 35% e a concentração de Na+ para 5X SSPE é 0,75 M.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados possuindo atividade de fitase, e as seguintes propriedades físico-químicas (como analisadas em polipeptídeos substancialmente puros): (i) uma atividade específica alta, tal como atividade específica sobre fitato de pelo menos 50% da atividade específica de E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88), a atividade específica sendo preferivelmente medida nas unidades de FYT por mg de proteína de enzima fitase; (ii) estabilidade a ácido, tal como: 5 (a) pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, de atividade residual após incubação durante a noite a 37°C em tampão de glicina / ácido clorídrico de pH 2,2, relativa à atividade residual após incubação durante a noite a 37°C em tampão HEPES de pH 7,0; 0 (b) pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, de atividade residual após incubação durante a noite a 37°C em tampão de glicina / ácido clorídrico de pH 3,0, relativa à atividade residual após incubação durante a noite a 37°C em tampão HEPES de pH 7,0; e/ou 15 (c) um atividade de fitase residual após incubação de 2 horas em uma temperatura de 25, 30, 35, ou 37°C, preferivelmente 37°C, e em um pH de 2,2, 2,4, 2,5, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, ou 3,5, preferivelmente tampões de glicina / ácido clorídrico de pH 2,2, ou 3,0, de pelo menos 50%, comparada com a atividade residual de E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88); “0 (iii) estabilidade ao calor, tal como uma atividade de fitase residual após 0,5, 1, 1,5, ou 2 horas, preferivelmente 0,5 hora, de incubação em um pH de 5,5 e em uma temperatura de 55, 60, 65,70,75, 80, 85 ou 95°C, preferivelmente 70°C, de pelo menos 50%, comparada com a atividade residual de E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88); 25 (iv) estabilidade à protease, tal como uma atividade de protease residual após 0,5, 1, 1,5, ou 2 horas, preferivelmente 1 hora, de incubação em uma temperatura de 20, 25, 30, 35, ou 37°C, preferivelmente 37°C, e em um pH de 5,5, na presença de 0,1 mg/mL de pepsina, de pelo menos 50%, comparada com a atividade residual de E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88); e/ou (v) um pH ótimo abaixo de pH 5,0, por exemplo abaixo de pH 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, ou até mesmo abaixo de 2,0, determinado usando o ensaio FYT, e/ou empregando o ensaio de Exemplo 4, como descrito aqui acima.

Em modalidades específicas de aspecto (i) acima, a atividade específica é pelo menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 1-30, 140, ou pelo menos 150% da atividade específica de E. coli appA. Em modalidade particulares de cada um dos aspectos (ii) to (iv) acima, a atividade residual é 13 pelo menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, ou pelo menos 150% da atividade residual de E. coli appA.

Em um quinto aspecto, a atividade da enzima da invenção, em pH 5,0 e a 37°C, medida sobre o substrato pNP-fosfato é menor do que 1% da atividade da enzima medida sobre o substrato fitato, referência aqui sendo 15 feita ao Exemplo 7. Preferivelmente, a razão é menor do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, ou menor do que 5%. A razão de hidrólise de pNP a fitato é indicativa de natureza de fitase verdadeira da enzima. Uma razão alta de atividade sobre pNP relativa à atividade sobre fitato pode indicar que a enzima em questão é uma fosfatase com especificidade para substrato o relativamente baixa, enquanto que uma razão baixa, como é o caso para a fitase testada no Exemplo 7, indica que esta é uma enzima mais especificamente aceitadora de fitato como um substrato.

Em um sexto aspecto, a fitase da invenção possui uma liberação maior de fósforo (P) no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui, em 25 comparação com a fitase de Peniophora lycii, preferivelmente pelo menos 110 % da mesma, mais preferivelmente pelo menos 120%, 130%, ou pelo menos 140% da mesma. Em uma modalidade, a fitase da invenção, dosada 0,25 FYT/g de alimentação, libera pelo menos 150% de fósforo (P), em relação ao fósforo liberado pela fitase de Peniophora lycii, também dosada 0,25 FYT/g de alimentação, no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui. Preferivelmente, a liberação é pelo menos 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, ou pelo menos 180%. Em outra modalidade, a fitase da invenção, dosada 0,75 FYT/g de alimentação, libera pelo menos 150% de fósforo (P), relativo ao 5 fósforo liberado pela fitase de Peniophora lycii, também dosada 0,75 FYT/g de alimentação, no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui. Preferivelmente, a liberação é de pelo menos 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, ou de pelo menos 190% (veja Tabela 2 em Exemplo 6: 367/190 perfaz 193).

Em um sétimo aspecto, a fitase da invenção possui uma o atividade residual após incubação a 37°C e em um tampão de Glicina / HC1 0,1 M, pH 2,0, por 4 horas de pelo menos 20%, em comparação com a atividade em tempo, t = 0, a atividade (e a atividade residual) sendo ensaiada a 37°C e pH 5,5 sobre fitato de Na 1% (p/v) usando um tampão de acetato de Na 0,25 M de pH 5,5, tampão cego subtraído. Em modalidades preferidas, a 15 atividade residual é pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou pelo menos 80%. Em outra modalidade, a fitase da invenção possui uma atividade residual após incubação a 37°C e em tampão de Glicina / HC1 0,lM, pH 2,5, por 1 dia (24 horas) de pelo menos 20%, em comparação com a atividade no tempo, t = 0, a atividade (e a atividade —0 residual) sendo ensaiada a 37°C e pH 5,5 sobre fitato de Na 1% (p/v) usando

um tampão de acetato de Na 0,25 M de pH 5,5, tampão cego subtraído. Em modalidades preferidas, a atividade residual é pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou pelo menos 80%.

Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere-se às 25 variantes artificiais compreendendo uma substituição conservative, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou o seu polipeptídeo maduro. Uma inserção pode ser dentro da molécula, e/ou na extremidade N- e/ou C-terminal da molécula em cujo caso também é designada extensão. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é substituições de aminoácido conservativas; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões amino- ou carboxil-terminais pequenas, tal como um resíduo de metionina amino- terminal; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma 5 extensão que facilita a purificação por mudança da carga eficaz ou de outra função, tal como um trecho de poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação - em outras palavras: Mudanças que não afetam significativamente a dobragem e/ou a atividade da proteína.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo 43 de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenil-alanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). 15 Outros exemplos de substituições conservativas são substituições dos 20 aminoácidos padrão por aminoácidos não-padrão (tais como 4-hidróxi-prolina, 6-N-metil-lisina, ácido 2-amino-isobutírico, isovalina, e alfa-metil-serina). Substituições conservativas também podem incluir uma substituição em aminoácidos que não são codificados pelo código o genético, e aminoácidos não naturais. “Aminoácidos não naturais” têm sido modificados após síntese de proteína, e/ou possuem uma estrutura química em sua(s) cadeia(s) lateral(ais) diferente daquela dos aminoácidos padrão; Aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, estão comercialmente disponíveis, e incluem ácido 25 pipecólico, ácido tiazolidina-carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metil-prolina e 3,3-dimetil-prolina.

Em uma modalidade particular, a variante não compreende todas as seguintes quatro substituições em combinação: N31 D, Q139K, L197F, N316K. Em outra modalidade particular, a variante não compreende todas as quatro seguintes substituições em combinação: N31D, N121T, K132T.Q139K.

Altemativamente, as mudanças de aminoácido são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. 5 Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade para substrato, a mudança de pH ótimo, e semelhantes.

Aminoácidos essenciais no polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, tal como 0 mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de uma alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (i,e., atividade de fitase) para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos 15 para a atividade da molécula. Veja também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, conforme determinado por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação de fotoafinidade, conjuntamente com mutação de 0 aminoácidos de sítio de contato putativo. Veja, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com um polipeptídeo de acordo com a 25 invenção. Substituições de um ou múltiplos aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou rearranjo, seguido por um procedimento de triagem relevante, tal como aqueles descritos por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; 25 r* : : : 7: : 7: :

Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser utilizados incluem PCR propensa a erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e 5 mutagênese sítio-direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Métodos de mutagênese / rearranjo podem ser combinados com métodos de triagem automáticos, de rendimento alto para detectar a atividade de polipeptídeos mutados, clonados expressados pelas células O hospedeiras. Moléculas de DNA mutadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente seqüenciadas usando métodos padrão na arte. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados aos polipeptídeos de 15 estrutura desconhecida.

O número total de substituições de aminoácido (preferivelmente substituições conservativas), deleções e/ou inserções na seqüência de aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 é no máximo 10, preferivelmente no máximo 9, mais preferivelmente no máximo 8, mais 0 preferivelmente no máximo 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente no máximo 5, mais preferivelmente no máximo 4, ainda mais preferivelmente no máximo 3, muito mais preferivelmente no máximo 2, e ainda muito mais preferivelmente 1.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções de 25 aminoácido dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente no máximo 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, mais preferivelmente 2, e ainda muito mais preferivelmente 1. Em alternativa, número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2 é no máximo 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, ou no máximo 11.

Em uma modalidade específica, o polipeptideo da invenção é 5 uma variante alergênica-baixa, planejada para invocar uma resposta imunológica reduzida quando exposta a animais, incluindo homem. O termo resposta imunológica é para ser entendido como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto ao polipeptideo. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica que acarreta níveis aumentados de IgE o no animal exposto. Variantes alergênicas-baixas podem ser preparadas usando técnicas conhecidas na arte. Por exemplo o polipeptideo pode ser conjugado com grupos poliméricos protegendo porções ou epitopos envolvidos em uma resposta imunológica. Conjugação com polímeros pode envolver copulação química in vitro de polímero no polipeptideo, por exemplo, como descrito em 15 WO 96/17929, WO98/30682, WO98/35026, e/ou W099/00489. Conjugação pode em adição ou altemativamente à mesma envolver copulação in vivo de polímeros no polipeptideo. Tal conjugação pode ser realizada por engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificadora do polipeptideo, inserção de seqüências de consenso codificadoras de sítios de glicosilação adicionais —0 no polipeptideo em um hospedeiro capaz de glicosilar o polipeptideo, veja por exemplo WOOO/26354. Outro modo de proporcionar variantes alergênicas- baixas é engenharia genética de seqüência de nucleotídeos codificadora do polipeptideo de modo a causar a auto-olimerização do polipeptideo, fazendo com que os monômeros de polipeptideo possam proteger os epitopos de 25 outros monômeros de polipeptideo e deste modo abaixar a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e sua preparação são descritos em WO96/16177. Epitopos envolvidos em resposta imunológica podem ser identificados por vários métodos tais como o método de exibição de fago descrito em WO 00/26230 e WO 01/83559, ou a abordagem aleatória descrita em EP 561907.

Uma vez tendo sido identificado um epitopo, sua seqüência de aminoácidos pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas do polipeptídeo por técnicas de manipulação de gene conhecidas tal como mutagênese sítio-direcionada (veja por exemplo WO 00/26230, WO 00/26354 5 e/ou WO00/22103) e/ou conjugação de um polímero pode ser feita em proximidade suficiente ao epitopo para o polímero proteger o epitopo.

Fontes de Polipeptídeos Possuindo Atividade de Fitase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido de microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente 0 invenção, o termo “obtido de” como aqui usado em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual a seqüência de nucleotídeos tem sido inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente. 15 Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria gram-positiva tal como um polipeptídeo de Bacillus, ou um polipeptídeo de Streptomyces; ou um polipeptídeo de bactéria gram- negativa, por exemplo, um polipeptídeo de Escherichia coli, Yersinia, “0 Klebsiella, Citrobacter, ou um polipeptídeo de Pseudomonase. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo é derivado de Proteobacteria, tal como de Gammaproteobacteria, por exemplo de Enterobacteriales, tal como de Enterobacteriaceae.

Em um aspecto particular, o polipeptídeo derivado de 25 Enterobacteriaceae é um polipeptídeo de Citrobacter, tal como um polipeptídeo de Citrobacter amalonaticus, Citrobacter braakii, Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedins, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae, ou polipeptídeo de espécies Citrobacter,

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Citrobacter braakii, e mais preferivelmente um polipeptídeo de Citrobacter braakii ATCC 51113, por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID 5 • NO: 4. A cepa específica está publicamente disponível na American Type Culture Collection, ATCC.

Um polipeptídeo da presente invenção também pode ser um polipeptídeo fúngico, tal como um polipeptídeo de levedura ou um polipeptídeo de fungo filamentoso. o Cepas dos microorganismos acima são prontamente acessíveis ao público em numerosas coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional 15 Research Center (NRRL).

Ainda mais, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, adubos compostos, água, etc) usando as sondas acima mencionadas.Técnicas para isolamento de microorganismos de hábitats —0 naturais são bem conhecidas na arte. O polinucleotídeo pode ser então obtido similarmente por triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA de outro microorganismo. Uma vez tendo sido detectado com sonda(s) uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um polipeptídeo, o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado pela utilização de técnicas que são bem conhecidas por 25 aquelas pessoas experientes na arte (veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra),

Polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fusionados ou polipeptídeos de fusão cliváveis nos quais outro polipeptídeo é fusionado na terminação-N ou na terminação-C do polipeptideo ou seu fragmento. Um polipeptideo fusionado é produzido pela fusão de uma seqüência de nucleotídeos (ou uma sua porção) codificadora de outro polipeptideo em uma seqüência de nucleotídeos (ou uma sua porção) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos são conhecidas na 5 arte, e incluem ligação das seqüências codificadoras de polipeptídeos de modo quantidade eficaz estejam em matriz e que a expressão do polipeptideo fusionado esteja sob o controle de mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Polinucleotídeos

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos o isolados possuindo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo da presente invenção. Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeos é mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeos é a região codificadora de polipeptideo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 ou 3. A presente 15 invenção também inclui seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptideo possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 ou 4, ou os seus polipeptídeos maduros, que diferem de SEQ ID NOs: 1 ou 3, respectivamente, em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção também refere-se às subseqüências de SEQ ID NOs: 1 ou 3, que 0 codificam os fragmentos de SEQ ID NOs: 2 ou 4, que possuem atividade de fitase.

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos mutantes compreendendo pelo menos uma mutação na seqüência codificadora de polipeptideo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 ou 3, nos quais 25 a seqüência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptideo que consiste de aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NOs: 2 ou 4.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotideo codificador de um polipeptideo são conhecidas na arte e incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, pelo uso de reação em cadeia de polimerase (PCR) bem conhecida ou por triagem de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturais compartilhadas. Veja, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como reação em cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação baseada em seqüência de nucleotídeos (NASBA) podem ser utilizados. Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Citrobacter, ou de outro organismo relacionado e assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécie da região codificadora de polipeptídeo da seqüência de nucleotídeos.

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos possuindo seqüências de nucleotídeos que possuem um grau de identidade à seqüência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 (i.e., nucleotídeos 67 a 1299) de pelo menos 98,3%, e que codificam um polipeptídeo possuindo atividade de fitase. Em modalidades particulares, o grau de identidade é de pelo menos 98,4, 98,5, 98,6, 98,7, 98,9, 99, 99,0, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, ou pelo menos 99,9%. Em modalidades alternativas, o grau de identidade é de pelo menos 61%, ou pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 94, 97, 98, 98,0, 98,1, 98,2, ou de pelo menos 98,3%.

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos possuindo seqüências de nucleotídeos que possuem um grau de identidade à seqüência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (i.e., nucleotídeos 67 a 1299) de pelo menos 98,9%, e que codificam um polipeptídeo possuindo atividade de fitase. Em modalidades particulares, o grau de identidade é de pelo menos 99,0, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, ou pelo menos 99,9%. Em modalidades alternativas, o grau de identidade é de pelo menos 61%, ou pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 94| 97, 98, 98,0, 98,1, 98,2, 98,3, 98,4, 98,5, 98,6, 98,7, ou de pelo menos 98,8%. 5 Modificação de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “sübstancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas não- naturalmente ocorrentes do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir ZJ em alguma maneira engenhada do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou semelhante. A seqüência variante pode ser construída tendo por base a seqüência de nucleotídeos apresentada como a região codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma sua 15 subseqüência, e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não produzem outra seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos, mas que correspondem ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para produção do polipeptídeo, ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem produzir uma ZX) seqüência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, veja, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Será evidente para aquelas pessoas experientes na arte que tais substituições podem ser feitas fora de regiões críticas para a função da 25 molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácido essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção, e portanto preferivelmente não sujeitos à substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, tais como mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese de varredura de  alanina (veja, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085). Na última técnica, mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de fitase para identificar os resíduos de aminoácido 5 que são críticos para a atividade da molécula. Sítios de interação de substrato- polipeptídeo também podem ser determinados por análise da estrutura tridimensional conforme determinado por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia ou marcação de fotoafínidade (veja, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. ^0 Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64.

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos isolados codificadores de um polipeptideo da presente invenção, que hibridiza sob condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média-alta, e ainda mais preferivelmente condições de 15 estringência alta, e muito mais preferivelmente condições de estringência muito alta com (i) nucleotídeos 67 a 1299 of SEQ ID NO: 1, (ii) a parte codificadora de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, e/ou (iii) uma fita complementar de qualquer um de (i), e/ou (ii); ou suas variantes alélicas e subseqüências (Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definido. Em —0 modalidades alternativas a hibridização é conduzida sob condições de estringência muito baixa, ou baixa.

A presente invenção também se refere aos polipeptídeos isolados obtidos, ou obteníveis, por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência muito baixa, baixa, média, média-alta, 25 alta, ou muito alta com (i) nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1, (ii) a parte codificadora de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, e/ou (iii) uma fita complementar de qualquer um de (i), e/ou (ii); e (b) isolamento do polinucleotideo de hibridização, que codifica um polipeptideo possuindo atividade de fitase.

Construtos de Ácido Nucleico

A presente invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção operacionalmente ligado em uma ou mais seqüência de controle que dirigem a 5 expressão da seqüência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar a expressão do polipeptídeo. Manipulação da seqüência de PP polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as seqüências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na arte.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotor 15 apropriada, uma seqüência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo da presente invenção. A seqüência de promotor contém seqüências de controle de transcrição que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeos que -0 mostra atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificadores de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares quer homólogos quer heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição 25 de construtos de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos de operon lac de E. coli, gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de luvansucrase de Bacillus (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene de beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 2125). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável a ácido de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou de Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, fosfatase alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), tripsina-semelhante protease de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidade de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, Trichoderma reesei endoglucanase III, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

Em uma levedura hospedeira, os promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase / gliceraldeído-3- fosfato de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato 5 isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, e álcool oxidase de Pichia pastoris (AOX1). Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. —0 A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de terminador de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência de terminador está operacionalmente ligada na terminação 3’ da seqüência de nucleotídeos codificadora de polipeptideo. Qualquer terminador que é funcional na célula 15 hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Terminadores preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glicosamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, e tripsina-semelhante protease ZZO de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para 25 células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A seqüência líder está operacionalmente ligada na terminação 5’ da seqüência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para 5 tradução pela célula hospedeira. A seqüência líder está operacionalmente ligada na terminação 5’ da seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Líderes preferidas para células hospedeiras fúngicas Z) filamentosas são obtidas dos genes para TAKA polimerase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Líderes adequadas para células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae(ENO-l), 3- fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de 15 Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase / gliceraldeído-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A seqüência de controle também pode ser uma sinal de poliadenilação, uma seqüência operacionalmente ligada na terminação 3’ da seqüência de nucleotídeos e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina em mRNA transcrito. Qualquer poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Seqüências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas de genes para TAKA amilase 25 de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, tnpsina-semelhante protease de Fusarium oxysporum, e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

Seqüências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 37

A seqüência de controle também pode ser uma região codificadora de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidos ligada na terminação amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo 5 codificado para a dentro da rota secretória da célula. A extremidade 5’ da seqüência codificadora da seqüência de nucleotídeos pode inerentemente conter uma região codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligada na matriz de leitura de tradução com o segmento da região codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5’ da ' 0 seqüência codificadora pode conter uma região codificadora de peptídeo de sinal que é estranha à seqüência codificadora. A região codificadora de peptídeo de sinal estanha pode ser requerida onde a seqüência codificadora na contém naturalmente uma região codificadora de peptídeo de sinal. Altemativamente, a região codificadora de peptídeo de sinal estranha podem 15 simplesmente substituir a região codificadora de peptídeo de sinal natural com o objetivo de intensificar a secreção do polipeptídeo. Contudo, qualquer região codificadora de peptídeo de sinal que dirige o polipeptídeo expressado para dentro da rota secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção. 20 Regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazs para células hospedeiras bacterianas são as regiões codificadoras de peptídeo de sinal obtidas de genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus 25 stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazs para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as regiões codificadoras de peptídeo de sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Peptídeos de sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidas de genes para fator-alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiões codificadoras de peptídeo de sinal são descritas por Romanos et al., 1992, supra, e por Xiong et al em Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 418-428.

Em um aspecto preferido, a região codificadora de peptídeo de sinal é de nucleotídeos 1 a 66 de SEQ ID NO: 1, que codifica aminoácidos 1 a 22 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, a região codificadora de peptídeo de sinal é de nucleotídeos 1 a 66 de SEQ ID NO: 3, que codifica aminoácidos 1 a 22 de SEQ ID NO: 4.

A seqüência de controle também pode ser região codificadora de propeptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidos posicionada na terminação amino de um polipeptideo. O polipeptideo resultante é conhecido como um propolipeptídeo ou propolipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um -0 polipeptideo nativo maduro por divagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do propolipeptídeo. A região codificadora de propeptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator-alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase termófila de 25 Myceliophthora thermophila(WO 95/33836). Onde ambas as regiões de propeptídeo e peptídeo de sinal estão presentes na terminação amino de um polipeptideo, a região de propeptídeo está posicionada ao lado da terminação amino de um polipeptideo e a região de peptídeo de sinal está posicionada ao lado da terminação amino da região de propeptídeo. Também pode ser desejável adicionar seqüências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativo ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são 5 aqueles que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser utilizados. Em fungos filamentosos, o promotor o de TAKA alfa-amilase, promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como seqüências regulatórias. Outros exemplos de seqüências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação de gene.

Vetores de Expressão 15 A presente invenção também se refere aos vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação de transcrição e de tradição. Os vários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritos acima podem ser unidos juntos para produzirem um vetor de expressão recombinante que -O pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção pode ser expressada pela inserção da seqüência de nucleotídeos ou de um construto de ácido nucleico compreendendo a 25 seqüência em um vetor apropriado para expressão. Na preparação do vetor de expressão, a seqüência codificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadora esteja operacionalmente ligada nas seqüências de controle apropriadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode ocasionar a expressão da seqüência de nucleotídeos. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o 5 vetor é para ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como um a entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um o elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) tem sido integrado. Em adição, um plasmídeo ou vetor único 15 ou dois ou mais plasmídeos ou vetores que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células ~0 transformadas. Um marcador selecionável é um gene cujo produto para resistência a biocida ou virai, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos, e semelhantes.

Um gene condicionalmente essencial pode funcionar como um marcador selecionável não-antibiótico. Exemplos não limitantes de 25 marcadores selecionáveis não-antibióticos bacterianos condicionalmente essenciais são os genes dal de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ou outros Bacilli, que são apenas essenciais quando a bactéria é cultivada na ausência de D-alanina. Também os genes codificadores de enzimas envolvidas na modificação de UDP-galactose podem funcionar como marcadores condicionalmente essenciais em uma célula quando a célula é crescida na presença de galactose ou crescida em um meio que ocasiona a presença de galactose. Exemplos não limitantes são aqueles de B. subtilis ou B. licheniformis codificadores de UTP-dependente fosforilase (EC 2.7.7.10), 5 UDP-glicose-dependente uridililtransferase (EC 2.7.7.12), ou UDP-galactose epimerase (EC 5.1.3.2). Também um gene de xilose isomerase tal como xylA, de Bacilli pode ser usado como marcadores selecionáveis em células crescidas em meio mínimo com xilose como a única fonte de carbono. Os genes necessários para utilização de gliconato, gntK, e gntP também podem ser ^0 usados como marcadores selecionáveis em células crescidas em meio mínimo com gliconato como a única fonte de carbono. Outros exemplos de genes condicionalmente essenciais são conhecidos na arte. Marcadores selecionáveis antibióticos conferem resistência antibiótica a tais antibióticos como ampicilina, canamicina, cloranfenicol, entromicina, tetraciclina, 15 neomicina, higromicina ou metotrexato.

Tais marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (omitina —0 carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus 25 oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento(s) que permite integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a seqüência de polinucleotideo codificadora do polipeptideo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não-homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter seqüências de nucleotídeos adicionais para dirigir a integração por 5 recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem preferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, preferivelmente 400 a 10,000 pares de bases, e mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de bases, que possuem um grau alto de identidade com a seqüência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Em adição, os elementos de integração 15 podem ser seqüências de nucleotídeos codificadoras ou não-codificadoras.

Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não-homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode adicionalmente compreender uma origem de replicação permitindo que o vetor replique —0 autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicação autônoma mediadora de replicador de plasmídeo que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” é aqui definido como uma seqüência de nucleotídeos que permite que um plasmídeo ou vetor replique in vivo. 25 Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUBHO, pE194, pTAlOóO, e pAMβl permitindo replicação em Bacillus. Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula • •• hospedeira de bactéria são a origem de 2 microns de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula . fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; 5 Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). - Isolamento de gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser realizados de acordo com os métodos descritos em WOOO/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópias de polipeptídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias 15 amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas pelo cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente —0 invenção são bem conhecidos por uma pessoa experiente na arte (veja, por exemplo, Sambrook et ah, 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção também se refere às células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, que 25 são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico auto- replicante como descrito no início. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progénie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em uma grande extensão do gene codificador do polipeptideo e de sua fonte. 5 A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo., um procarioto, ou um microorganismo não-unicelular, por exemplo, um eucarioto.

Microorganismos unicelulares úteis são células bacterianas tais como bactérias gram-positivas incluindo, mas não limitadas a, uma célula de o Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividans e 15 Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus subtilis. Em outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um alcalófico. -0 A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (veja, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 16S: 111-115), usando células competentes (veja, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, 25 Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (veja, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (veja, por exemplo Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771- 5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero de inseto, de planta, ou de fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira [e uma célula fúngica. “Fungo” como aqui usado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definidos por 5 Hawksworth et al., em, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitostóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngica é 10 uma célula de levedura. “Levedura” como aqui usado inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencente aos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes). Visto quantidade eficaz a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, levedura deve ser definida como descrito em “Biology and 15 Activities of Yeast” (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia. !0 Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em outro aspecto mais preferido, a célula 25 hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolítica.

Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngica é uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todos as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são em geral caracterizados por uma parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, manana, e outros polissacarideos complexos. Crescimento 5 vegetative e por alongamento de hifa e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, crescimento vegetative por leveduras tal como Saccharomyces cerevisiae é por germinação de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentative.

Em um aspecto ainda mais preferido, as célula hospedeira o fúngica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, 15 Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto mais preferido, a célula 0 hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, 25 Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia 5 terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou célula de cepa de Trichoderma viride.

Células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e —K) regeneração da parede celular em uma maneira per se conhecida.

Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e de Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos apropriados para a transformação de espécies Fusarium são descritos 15 por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. Levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology —0 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também se refere aos métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar 25 uma célula, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condições que conduzem à produção dos polipeptídeos; e (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é do gênero Citrobacter, e mais preferivelmente é Citrobacter braakii.

A presente invenção também se refere aos métodos para produzir um polipeptideo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições que conduzem á produção do polipeptideo; e (b) recuperar o polipeptideo.

A presente invenção também se refere aos métodos para 5 produzir um polipeptideo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições que conduzem à produção do polipeptideo, no qual a célula hospedeira compreende uma seqüência de nucleotídeos mutante possuindo pelo menos uma mutação na região codificadora de polipeptideo maduro de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 3, no qual a seqüência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptideo que consiste dos aminoácidos 1 a 411 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 e 4, e (b) recuperar o polipeptideo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptideo 15 usando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em frasco agitado, e fermentação em escala pequena ou escala grande (incluindo fermentações continuas, em batelada, em batelada alimentada, ou no estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem —0 que o polipeptideo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American 25 Type Culture Collection). Se o polipeptideo for secretado para dentro do meio nutriente, o polipeptideo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptideo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na arte que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de polipeptideo, ou desaparecimento de um substrato de polipeptideo. Por exemplo, um ensaio de polipeptideo pode ser usado para determinar a atividade do polipeptideo como aqui descrito. 5 O polipeptideo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, o polipeptideo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação. —0 Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, cromatografía (por exemplo, cromatografia de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e de exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica), 15 solubilidade diferencial (p°r exemplo, precipitação por sulfato de amónio), SDS-PAGE, ou extração (veja, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas Transgênicas

A presente invenção também se refere a uma planta S0 transgênica, parte de planta transgênica, ou célula de planta transgênica que tem sido transformada com uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptideo possuindo atividade de fitase da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptideo em quantidades recuperáveis. O polipeptideo pode ser recuperado da planta ou da parte de planta. 25 Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptideo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou de uma ração, por exemplo melhorar o valor nutricional, a palatabilidade, e as propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo é direcionado para os vacúolos de armazenagem de endosperma em sementes. Isto pode ser obtido por síntese dele como um precursor com um peptídeo de sinal * adequado, veja Horvath et al em PNAS, Feb. 15,2000, vol. 97, no. 4, p. 1914- 5 1919. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot) ou suas variantes engenhadas. Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como grama do prado (capim azul, Poa), capim de forragem tal como Festuca, Lolium, capim temperado, tal como, tal S) como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, triticale (híbrido estabilizado de trigo (Triticum) e centeio (Secale), e milho (Zea mays). Exemplos de plantas dicot são tabaco, leguminosas, tais como girassol (Helianthus), algodão (Gossypium), tremoço, batata, beterraba- sacarina, ervilha, feijão e feijão-soja, e planta crucíferas (família 15 Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo proximamente relacionado Arabidopsis thaliana. Plantas baixas em fitato como descritas por exemplo na Patente U.S. 5.689.054 e Patente U.S. 6.111.168 são exemplos de plantas engenhadas.

Exemplos de partes de planta são caule, calo, raiz, frutas, 0 sementes e tubérculos, bem como tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Também compartimentos de célula de planta específicos, tais como cloroplasto, apoplasto, mitocôndria, vacúolo, peroxissomos, e citoplasma são considerados como uma parte de planta. Ainda mais, qualquer 25 célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada uma parte de planta. Igualmente, partes de planta tais como células e tecidos de planta isolados para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes de planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e capas de semente.

Também está incluída dentro do escopo da presente invenção a progénie de tais plantas, partes de planta e células de planta.

A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com 5 métodos conhecidos na arte. Resumidamente, a planta ou célula de planta é construída pela incorporação de um ou mais construtos de expressão codificadores de um polipeptídeo da presente invenção no genoma da planta hospedeira e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica. P) Convenientemente, o construto de expressão é um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo da presente invenção operacionalmente ligada com seqüências regulatórias apropriadas para expressão da seqüência de ácido nucleico na planta ou parte de planta de escolha. Em adição, o construto de 15 expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células hospedeiras nas quais o construto de expressão tem sido integrado e seqüências de DNA necessárias para introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de seqüências regulatórias, tais como seqüências de -0 promotor e de terminador e opcionalmente seqüências de trânsito ou de sinal é determinada, por exemplo, baseando-se quando, onde, e como o polipeptídeo é desejado para ser expressado, Por exemplo, a expressão do gene codificador de um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica para desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto 25 de gene pode ser direcionado para um tecido, compartimento de célula específico ou parte de planta específica tais como sementes ou folhas. Seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506. Para expressão constitutiva, os seguintes promotores podem li ser usados: O promotor de 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), a ubiquitina 1 de milho (Christensen AH, Sharrock RA e Quail 1992. Genes de poliubiquitina de milho: estrutura, perturbação térmica de expressão e editoração de transcrito, e atividade de promotor após transferência para 5 protoplastos por eletroporação), ou o promotor de actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689; Zhang W, McElroy D. e Wu R 1991, “Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants.” Plant Cell 3, 1155-1165). Promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de escoamento de armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de escoamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de legumina B4 15 de Vicia faba e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenagem napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido —O na arte, e.g., como descrito em WO 91/14772. Ademais, o promotor pode ser um promotor específico de folha, tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor de gene de adenina metil-transferase do vírus de cólera (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya 25 et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferimento tal como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Igualmente, o promotor pode induzível por tratamentos abióticos tais como temperatura, secura ou alterações em salinidade ou induzíveis por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo etanol, estrogênios, hormônios de planta como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico e/ou metais pesados.

Um elemento intensificador de promotor também pode ser usado para alcançar expressão maior do polipeptídeo na planta. Por exemplo, 5 o elemento intensificador de promotor pode ser um intron que está posicionado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra descrevem o uso do primeiro intron do gene de actina 1 de arroz para intensificar a expressão. T) Ainda mais, o uso de códon pode ser otimizado para a espécie de planta em questão para melhorar a expressão (veja Horvath et al referido acima).

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na arte. 15 O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partícula, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, o Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Presentemente, transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para geração de dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, veja Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), e também pode ser usada para 25 transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação sejam mais freqüentemente usadas para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para geração de monocotiledôneas transgênicas, suplementação de abordagem de Agrobacterium, é bombardeio de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungsténio revestidas com DNA de transformação) de embriões em desenvolvimento ou calos embriônicos (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocotiledôneas é baseado 5 em transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Após a transformação, os transformantes possuindo incorporados neles o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Muitas o vezes o procedimento de transformação é planejado para a eliminação seletiva de genes de seleção quer durante regeneração quer nas gerações seguintes pelo uso de por exemplo co-transformação com dois construtos de T-DNA separados ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica. 15 A presente invenção também se refere aos métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo possuindo atividade de fitase da presente invenção sob condições que conduzem à produção do 0 polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Animais Transgênicos

A presente invenção também se refere a um animal não- humano, transgênico e aos produtos ou seus elementos, cujos exemplos são fluidos corporais tais como leite e sangue, órgãos, carne, e células de animal. 25 Técnicas para expressar proteínas, por exemplo em células de mamífero, são conhecidas na arte, veja por exemplo o manual “Protein Expression: A Practical Approach”, Higgins e Hames (eds), Oxford University Press (1999), e os outros três manuais nesta série relacionados à Transcrição de Gene, Processamento de RNA, e Processamento de Pós-tradução. Geralmente falando, para preparar um animal transgênico, células selecionadas de um animal selecionado são transformadas com uma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptideo possuindo atividade de fitase da presente invenção de modo a expressarem e produzirem o polipeptideo. O polipeptideo pode ser recuperado do animal, por exemplo do leite de animais fêmeas, ou o polipeptideo pode ser expressado para o benefício do próprio animal, por exemplo para ajudar na digestão do animal. Exemplos de animais são mencionados abaixo na seção encabeçada por Ração Animal. Para produzir um animal transgênico tendo em vista a recuperação do polipeptideo do leite do animal, um gene codificador do polipeptideo pode ser inserido em ovos fertilizados de um animal em questão, por exemplo pelo uso de um vetor de expressão transgênico que compreende um promotor de proteína de leite adequado, e o gene codificador do polipeptideo. O vetor de expressão transgênico é microinjetado em ovos fertilizados, e preferivelmente permanentemente integrado no cromossomo. Uma vez comece o ovo a crescer e se dividir, o embrião potencial é implantado em uma mãe substituta, e os animais trazendo o transgene são identificados. O animal resultante pode ser então multiplicado por procriação convencional. O polipeptideo pode ser purificado do leite do animal, veja por exemplo Meade, H.M. et al (1999): “Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression.” J. M. Fernandez e J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press.

Altemativamente, com o propósito de produzir um animal não- humano transgênico que traz no genoma de suas células somáticas e/ou germinativas uma seqüência de ácido nucleico incluindo um construto de transgene heterólogo incluindo um transgene codificador de polipeptideo, o transgene pode ser operacionalmente ligado em uma primeira seqüência regulatória para expressão específica em glândula salivar do polipeptideo, como descrito em WO 00/064247.

Composições e Usos

Em ainda outros aspectos, a presente invenção refere-se às composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção, bem como aos métodos de uso destas. 5 As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na arte e podem estar na forma de uma composição seca ou líquida. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de granulados ou microgranulados. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos ZZ) conhecidos na arte.

A fitase da invenção pode ser usada para degradação, em qualquer contexto industrial, de, por exemplo, fitato, ácido fítico, e/ou de mono-, di-, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos de mio-inositol. É bem sabido que os grupos fosfato destes compostos quelam cátions divalentes e trivalentes 15 tais como íons de metal, i.e. os íons nutricionalmente essenciais de cálcio, ferro, zinco e magnésio bem como os minerais traço manganês, cobre e molibdênio. Além disso, o ácido fítico também em uma certa extensão se liga em proteínas por interação eletrostática.

Conseqüentemente, usos preferidos dos polipeptídeos da "0 invenção são em preparações de ração animal (incluindo alimento de humano) ou em aditivos para tais preparações.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção pode ser usado para melhorar o valor nutricional de uma ração animal. Exemplos não limitantes de melhoria do valor nutricional de ração animal 25 (incluindo alimento de humano), são: melhoria da digestibilidade da ração; promoção do crescimento do animal; melhoria da utilização da ração; melhoria da biodísponibilidade das proteínas; aumento do nível de fosfato digerível; melhoria da liberação e/ou da degradação de fitato. melhoria da biodísponibilidade de minerais traço; melhoria da disponibilidade de macrominerais; eliminação da necessidade de adição de fosfato suplementar, minerais traço, e/ou macrominerais; - e/ou melhoria da qualidade da casca de ovo. O valor nutricional da ração é portanto aumentado, e a velocidade de crescimento e/o o ganho de peso e/ou a conversão de ração (i.e. o peso de 5 ração ingerido relativo ao ganho de peso) do animal podem ser melhorados.

Além disso, o polipeptídeo da invenção pode ser usado para reduzir o nível de fitato de adubo.

Animais, Ração Animal, e Aditivos de Ração Animal

O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres Z) humanos. Exemplos de animais são não-ruminantes, e ruminantes. Animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, cavalos, e gado bovino, por exemplo, gado de corte, vacas, e novilhos jovens. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não-ruminante. Animais não- ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo porcos ou suíno 15 (incluindo, mas não limitados a, leitões, porcos em crescimento, e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não limitados a frangos jovens, galinhas poedeiras); bezerros novos; e peixes (incluindo mas não limitados a, salmão, truta, tilápia, lampreia, e carpas; e crustáceos (incluindo mas não limitados a camarões e pitus). ^0 O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição adequada para, ou intencionada para ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção o polipeptídeo pode ser alimentando ao animal antes, após, ou simultaneamente com a dieta. O último 25 é preferido.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo, na forma na qual é adicionado à ração, quando estiver sendo incluído em um aditivo de ração, está substancialmente puro. Em uma modalidade particular ele está bem definido. O termo “bem definido” significa que a preparação de fitase está pelo menos 50% pura conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (veja Exemplo 12 de WO 01/58275). Em outras modalidades particulares a preparação de fitase está pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95% pura conforme determinado por este 5 método.

Uma preparação de polipeptideo substancialmente pura, e/ou bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil de dosar corretamente na ração um polipeptideo que está essencialmente livre de outros polipeptídeos contaminantes ou interferentes. O termo dosar ZD corretamente refere-se em particular ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e a capacidade de otimizar a dosagem baseada no efeito desejado.

Para uso na ração animal, contudo, o polipeptideo fitase da invenção não precisa ser aquele puro; pode incluir por exemplo outros 15 polipeptídeos, em cujo caso poderia ser chamado de uma preparação de fitase.

A preparação de fitase pode ser (a) adicionada diretamente na ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou (b) pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos ou pré-misturas de ração que é subseqüentemente ) adicionada na ração (ou usada em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparação de polipeptideo original, seja usada de acordo com (a) ou (b) acima.

Preparações de polipeptideo com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de 25 produção, desde que elas não sejam obtidas e também submetidas a uma variação maior de batelada para batelada quando o polipeptideo for produzido por métodos de fermentação tradicionais.

Claro que tal preparação de polipeptideo pode ser misturada com outros polipeptídeos. 59 : **: : 7: : • • « • β • • •

O polipeptídeo pode ser adicionado na ração em qualquer forma, seja como um polipeptídeo relativamente puro, seja em mistura com outros componentes intencionados para adição em ração animal, i.e. na forma de aditivos de ração animal, tais como as denominadas pré-misturas para 5 ração animal.

Em um outro aspecto a presente invenção refere-se às composições para uso em ração animal, tal como ração animal, e aditivos de ração animal, por exemplo pré-misturas.

Além do polipeptídeo da invenção, os aditivos de ração animal o da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço. Os aditivos de ração também podem conter pelo menos um macromineral.

Ainda mais, ingredientes aditivos de ração, opcionais, são agentes colorantes, por exemplo carotenóides tais como beta-caroteno, 15 astaxantina, e luteína; compostos aromatizantes; estabilizadores; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poliinsaturados; espécies geradoras de oxigênio reativo; e/ou pelo menos um outro peptídeo selecionado dentre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-); fosfolipase Al (EC "0 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4.); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

Em uma modalidade particular estes outros polipeptídeos são 25 bem definidos (como definidos acima para preparações de fitase).

Em uma modalidade particularmente preferida, a fitase da invenção possuindo um pH ótimo relativamente baixo é combinada com pelo menos uma fitase possuindo um pH ótimo alto. Exemplos preferidos de fitases de pH ótimo maior são fitases de Bacillus, tais como as fitases de

Bacillus licheniformis e de fítases de Bacillus subtilis, bem como seus derivados, variantes, ou fragmentos possuindo atividade de fitase.

A fitase da invenção também pode ser combinada com outras fítases, por exemplo fítases de ascomicetos tais como fítases de Aspergillus, 5 por exemplo derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger, ou Aspergillus awamori; ou fítases de basidiomicetos, por exemplo derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe periates; Trametes pubescens, ou Paxillus involutus; ou seus derivados, variantes, ou fragmentos possuindo atividade de fitase. Z3 Assim, nas modalidades preferidas de uso em ração animal da invenção, e em modalidades preferidas de aditivo de ração animal e de ração animal da invenção, a fitase da invenção é combinada com tais fítases.

As fítases de ascomicetos e de basidiomicetos acima mencionadas, em particular a fitase RONOZYME P derivada de Peniophora 15 lycii bem como seus derivados, variantes, ou fragmentos possuindo atividade de fitase, também podem ser combinados com fítases de Bacillus, em particular a fitase de B. licheniformis bem como com um seu derivado, fragmento ou variante, em particular para propósitos de ração animal.

Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP 18, —0 Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Lectoferrin, Lactofemcin, e Ovispirin tal como Novispirin (Robert Lehrer, 2000), Plectasins, e Statins, incluindo os compostos e polipeptídeos descritos em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como as variantes ou fragmentos dos acima que retenham atividade antimicrobiana. 25 Exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP’s) são os peptídeos de Aspergillus giganteus, e de Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retêm atividade antifungica, como descritos em WO 94/01459 e WO 02/090384. Exemplos de ácidos graxos poliinsaturados de ácidos graxos 61 poliinsaturados são ácidos graxos poliinsaturados Cl8, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosahexaenóico, ácido eicosapentaenóico e ácido gama-linoleico.

Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são 5 compostos químicos tais como perborato, persulfato, ou percarbonato; e polipeptídeos tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Normalmente vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traço formam parte de uma denominada pré-mistura intencionada para adição na ração, enquanto que macrominerais são _|_p normalmente adicionados separadamente na ração. Qualquer um destes tipos de composições, quando enriquecidos com um polipeptideo da invenção, é um aditivo de ração animal da invenção.

Em uma modalidade particular, o aditivo de ração animal da invenção é intencionado para ser incluído (ou determinado como tendo que 15 ser incluído) em dietas ou ração anima em níveis de 0,01 a 10,0%; mais particularmente de 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração. Isto é assim em particular para as pré-misturas.

As seguintes são listas não-exclusivas destes componentes:

Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, o vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo vitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colinea, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo D-pantotenato de Ca.

Exemplos de minerais traço são manganês, zinco, ferro, cobre, 25 iodo, selênio, e cobalto.

Exemplos de macrominerais são cálcio, fósforo e sódio.

Os requerimentos nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas, porcos / leitões) são listados na Tabela A de WO 01/58275. Requerimento nutricional significa que estes componentes devem ser proporcionados na dieta nas concentrações indicadas.

Altemativamente, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um, ou 5 dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na razão dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A. X) A presente invenção também se refere às composições de ração animal. As composições ou dietas de ração animal possuem um conteúdo relativamente alto de proteína. Dietas de aves domésticas e de porcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. Dietas de peixe podem ser caracterizadas como 15 indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além disso tais dietas de peixe normalmente possuem um conteúdo de gordura crua de 200-310 g/kg. WO 01/58275 corresponde a US 09/779334 que é por meio desta aqui incorporada como referência.

Uma composição de ração animal de acordo com a invenção M) possui um conteúdo de proteína crua de 50-800 g/kg, e adicionalmente compreende pelo menos um polipeptídeo como aqui reivindicado.

Ainda mais, ou altemativamente (ao conteúdo de proteína crua indicado acima), a composição de ração animal da invenção possui um conteúdo de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um conteúdo de 25 cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um conteúdo de lisina de 0,5-50 g/kg.

Em modalidades particulares, o conteúdo de energia metabolizável, proteína crua, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).

Proteína crua é calculada como nitrogênio (N) multiplicado 5 por um fator 6,25, i.e. Proteína crua (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O conteúdo de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Energia metabolizável pode ser calculada baseando-se na ZD publicação de NRC “Nutrient requeriments in swine”, nona edição revisada de 1988, subcomitê sobre nutrição suína, comitê sobre nutrição animal, equipe de agricultura, conselho de pesquisa national. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e a “European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs”, Spelderholt centre for poultry research and extension, 15 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen by, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

O conteúdo dietético de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas animais completas é calculado baseando-se em tabletes de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische o samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pkLelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma modalidade particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína. A proteína pode ser uma proteína animal, tal como carne ou farinha de osso, e/ou farinha de peixe; ou 25 pode ser uma proteína vegetal. O termo proteína vegetal como aqui usado refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou originária de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em modalidades particulares, o conteúdo de proteína das proteínas vegetai é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60% (p/p).

Proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tais como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosas), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, 5 tais como farinha de feijão-soja, farinha de tremoço e farinha de semente de colza.

Em uma modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo feijão- soja, tremoço, ervilha, ou feijão. Z3 Em outra modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, . beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são semente de colza, semente de girassol, semente de algodão, e repolho. 15 Feijão-soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, tricicale, e sorgo.

Em ainda outras modalidades específicas, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% de milho; e/ou 0-80% de sorgo; e/ou —0 0-70% de trigo; e/ou 0-70% de cevada; e/ou 0-30% de aveia; e/ou 0-40% de farinha de feijão-soja; e/ou 0-25% de farinha de peixe; e/ou 0-25% de farinha de osso ou de came; e/ou 0-20% de soro de leite.

Dietas de animal podem ser por exemplo manufaturadas como ração triturada (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, as rações 25 moídas são misturadas e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. Polipeptídeos podem ser adicionados como formulações de polipeptideo sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação de polipeptideo sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa de li « • • « • • • • • •••«<» • • • misturação; e uma preparação de polipeptídeo líquida é tipicamente adicionada após a etapa de pelotização. O polipeptídeo também pode ser incorporado em uma pré-mistura ou aditivo de ração.

A concentração de polipeptídeo final na dieta está dentro da 5 faixa de 0,01-200 mg de proteína de polipeptídeo por kg de dieta, por exemplo dentro da faixa de 5-30 mg de proteína de polipeptídeo por kg de dieta.

Claro que a fitase da invenção deve ser aplicada em uma quantidade eficaz, i.e. em uma quantidade adequada para melhorar a S0 solubilização e/ou para melhorar o valor nutricional da ração. Presentemente é contemplado que o polipeptídeo é administrado em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01-200; 0,01-100; 0,5-100; 1- 50; 5-100; 10-100; 0,05-50; ou 0,1010 - todas estas faixas sendo em mg de proteína de polipeptídeo de fitase por kg de ração (ppm). 15 Para determinar mg de proteína de polipeptídeo de fitase por kg de ração, a fitase é purificada da composição de ração, e a atividade específica da fitase purificada é determinada usando um ensaio relevante. A atividade de fitase da composição de ração como tal também é determinada usando o mesmo ensaio, e baseando-se nestas determinações, a dosagem em "0 mg de proteína de fitase por kg de ração é calculada.

Os mesmos princípios aplicam-se para determinar mg de proteína de polipeptídeo de fitase em aditivo de ração. Claro que, se uma amostra estiver disponível da fitase usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada desta amostra (sem necessidade 25 de purificar a fitase do aditivo ou da composição de ração). Peptídeo de Sinal

A presente invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico compreendendo um gene codificador de uma proteína operacionalmente ligado em uma primeira seqüência de nucleotídeos 66 :consistindo de nucleotídeos 1 a 66 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 ou 3, codificadores de um peptídeo de sinal consistindo de aminoácidos 1 a 22 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 ou 4, na qual o gene é estranho às primeiras seqüências de nucleotídeos. 5 A presente invenção também se refere aos vetores de expressão recombinantes e às células hospedeiras recombinantes compreendendo tais construtos de ácido nucleico.

A presente invenção também se refere as métodos para produzir uma proteína compreendendo (a) cultivar uma tal célula hospedeira Z) recombinante sob condições adequadas para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

As primeiras seqüências de nucleotídeos podem estar operacionalmente ligadas em genes estranhos individualmente com outras seqüências de controle ou em combinação com outras seqüências de controle. 15 Tais outras seqüências de controle são descritas supra.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui para se referir a um comprimento específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo “proteína” também inclui dois ou mais "0 polipeptídeos combinados para formarem o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de seqüências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas de pelo menos duas proteínas diferentes nas quais uma ou mais podem ser heterólogas ou nativas à célula hospedeira. Proteínas adicionalmente incluem variações 25 engenhadas e alélicas naturalmente ocorrentes das proteínas híbridas e das proteínas mencionadas acima.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou sua variante; polipeptídeo, receptor ou sua porção, anticorpo ou sua porção, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, polipeptideo pectinolítico, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, polipeptideo proteolítico, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou de outra fonte.

Várias Modalidades

As seguintes são modalidades adicionais da presente invenção. Também estão aqui incluídos os aspectos correspondentes relacionados com seqüências de ácido nucleico, construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras recombinantes, métodos para a produção de polipeptídeos, plantas e animais transgênicos, e os vários usos, métodos de uso e aditivos/composições de ração, todos como reivindicados.

Um polipeptideo isolado possuindo atividade de fitase e uma atividade residual após incubação a 37°C e em um tampão de GlicinajHCl 0,1 M, pH 2,0, por 4 horas de pelo menos 20%, em comparação com a atividade no tempo, t = 0, a atividade sendo ensaiada a 37°C e em pH 5,5 sobre fitato de Na 1% (p/v), usando um tampão de acetato de Na 0,25 M de pH 5,5, tampão cego subtraído; preferivelmente com uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%.

Um polipeptideo isolado possuindo atividade de fitase e uma atividade residual após incubação a 37°C e em um tampão de Glicina/HCl 0,1 M, pH 2,5, por 24 horas de pelo menos 20%, em comparação com a atividade no tempo, t = 0, a atividade sendo ensaiada a 37°C e pH 5,5 sobre fitato de na 1% (p/v), usando um tampão de acetato de Na 0,25 M de pH 5,5, tampão cego subtraído; 5 preferivelmente com uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%.

Um polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, no qual ZD a atividade do polipeptídeo, em pH 5,0 e a 37°C, medida sobre um substrato de pNP-fosfato é menor do que 11% da atividade do polipeptídeo medida sobre o substrato fitato; preferivelmente com uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo 15 menos 50%, preferivelmente de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%.

Um polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, no qual o polipeptídeo possui uma liberação maior de fósforo (P), em comparação com a fitase de Peniophora lycii; o preferivelmente conforme medido no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui; e/ou, no qual o polipeptídeo preferivelmente possui uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 25 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%.

Um polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, no qual o polipeptídeo, dosado 0,25 FYT/g de ração, libera pelo menos 150% de fósforo (P), relativo ao fósforo liberado pela fitase de Peniophora lycii, também dosada 0,25 FYT/g de alimentação;preferivelmente conforme medido no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui; e/ou, no qual o polipeptídeo preferivelmente possui uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 5 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%. Um polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, no qual o polipeptídeo, dosado 0,75 FYT/g de ração, libera pelo menos 150% de fósforo (P), relativo ao fósforo liberado pela fitase de Peniophora lycii, o também dosada 0,75 FYT/g de ração; preferivelmente conforme medido no modelo in vitro de Exemplo 6 aqui; e/ou, no qual o polipeptídeo preferivelmente possui uma identidade aos i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, ou ii) aminoácidos 1 15 a 411 de SEQ ID NO: 2, de pelo menos 50%, preferivelmente de pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou de pelo menos 98%. I. Um polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 98,2% de identidade com (i) 30 aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) a parte de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, (b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1, (ii) a parte codificadora de polipeptídeo madura de SEQ ID NO: 1, e/ou (iii) uma fita 25 complementar de qualquer um de (i), ou (ii); (c) uma variante de qualquer um dos polipeptídeos de (a)(i)-(a)(ii), compreendendo uma substituição conservativa, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; e (d) um fragmento de qualquer um dos polipeptídeos de (a)(i)-(a)(ii). II. Um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptideo da seção I. III. Um polinucleotideo isolado codificador de um polipeptideo possuindo atividade de fitase, selecionado do grupo consistindo de: (a) a polinucleotideo codificador de um polipeptideo possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 98,2% de identidade com aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2; (b) a polinucleotideo possuindo pelo menos 95% de identidade com nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1; e (c) um polinucleotideo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 1, (ii) a parte codificadora de polipeptideo madura de SEQ ID NO: 1, (iii) uma fita complementar de qualquer um de (i), ou (ii). IV. O polinucleotideo isolado de qualquer uma das seções H e III, possuindo pelo menos uma mutação na seqüência codificadora de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, no qual a seqüência de nucleotídeos mutante codifica um polipeptideo compreendendo aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2. V. Um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotideo de qualquer uma das seções III-IV operacionalmente ligado em uma ou mais das seqüências de controle que dirigem a produção do polipeptideo em um hospedeiro de expressão VI. Um vetor de expressão recombinante compreendendo o construto de ácido nucleico da seção V. VII. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o construto de ácido nucleico da seção V. VIII. Um método para produzir o polipeptideo da seção I compreendendo (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptideo, sob condições que conduzem a produção do polipeptideo; e (b) recuperar o polipeptideo. IX. Um método para produzir o polipeptideo da seção I 71 :compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um construto de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de polipeptídeo sob condições que conduzem a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. 5 X. Célula de planta, parte de planta ou planta transgênica, que tem sido transformada com um polinucleotídeo codificador de polipeptídeo da seção I. XI. Um animal não-humano, transgênico, ou produtos, ou elementos do mesmo, sendo capaz de expressar o polipeptídeo da seção I. XII. Uso de pelo menos um polipeptídeo da seção I em ração animal. XIII. Uso de pelo menos um polipeptídeo da seção I na preparação de uma composição para utilização em ração animal. XIV. Um método para melhorar o valor nutricional de uma 15 ração animal, no qual pelo menos um polipeptídeo da seção I é adicionado na ração. XV. Um aditivo de ração animal compreendendo (a) pelo menos um polipeptídeo da seção I; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (d) pelo menos -0 um mineral traço. XVI. O aditivo de ração animal da seção XV, que compreende adicionalmente pelo menos uma amilase, pelo menos uma fitase adicional, pelo menos uma xilanase, pelo menos uma galactanase, pelo menos uma alfa- galactosidase, pelo menos uma protease, pelo menos uma fosfolipase, e/ou 25 pelo menos uma beta-glucanase. XVII. O aditivo de ração animal da seção XVI, no qual a fitase adicional possui um pH ótimo que é maior do que o pH ótimo do polipeptídeo possuindo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2. IIXX. Uma composição de ração animal possuindo um conteúdo de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e compreendendo pelo menos um polipeptídeo da seção I. Um polipeptídeo possuindo atividade de fitase selecionado do 5 grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 99,1 % de identidade com: (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, e/ou (ii) a parte de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; K) (b) uma variante de qualquer um dos polipeptídeos de (a)(i)- (a)(ii), compreendendo uma deleção, inserção, e/ou substituição conservativa de um ou mais aminoácidos; e (c) um fragmento de qualquer um dos polipeptídeos de (a)(i)- (a)(ii). 15 Um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo possuindo atividade de fitase, selecionado do grupo consistindo de: (a) a polinucleotídeo codificador um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 99,1% de identidade com aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4; e “0 (b) a polinucleotídeo possuindo pelo menos 98,9% de identidade com nucleotídeos 67 a 1299 de SEQ ID NO: 3. Um polipeptídeo possuindo atividade de fitase que compreende, preferivelmente possui, uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 98,6% de identidade com aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID 25 NO: 2. Um polipeptídeo possuindo atividade de fitase que compreende, preferivelmente possui, uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 99,1% de identidade com aminoácidos 1-411 de SEQ ID NO: 4, Uden identitet, men med variant og fragment Um polipeptideo possuindo atividade de fitase que compreende, preferivelmente possui, a seqüência de: (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2, e/ou (ii) a parte de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 2; ou cujo 5 polipeptideo (a) é uma variante de qualquer um dos polipeptídeos de (i)-(ii), compreendendo uma deleção, inserção, e/ou substituição conservativa de um ou mais aminoácidos; ou (c) é um fragmento de qualquer um dos polipeptídeos de (i)- =D (ii). Um polipeptideo possuindo atividade de fitase que compreende, preferivelmente possui, a seqüência de: (i) aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 4, e/ou (ii) a parte de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 4; ou cujo 15 polipeptideo (a) é uma variante de qualquer um dos polipeptídeos de (i)-(ii), compreendendo uma deleção, inserção, e/ou substituição conservativa de um ou mais aminoácidos; ou (c) é um fragmento de qualquer um dos polipeptídeos de (i)- -0 (ii).

A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como limitantes do escopo da invenção. Exemplos 25 Exemplo 1: Clonagem de uma fitase de Citrobacter braakii Um alinhamento múltiplo foi realizado das seguintes histidina fosfatases ácidas: appA Escherichia coli (SPTREMBL:Q8GN88), phyk Klebsiella terrigena (SPTREMBL:Q7WSY1), e ypol648 Yersinia pestis CO92 (SPTREMBL:Q8ZFP6). Dois oligonucleotídeos iniciadores degenerados foram planejados baseando-se nas seqüências de consenso: 5'- TGG TGA TTG TGT CCC GTC AYG GNG TNM G -3’ (SEQ ID NO: 6, iniciador direto) 5’- GCC CGG CGG GGT RTT RTC NGG -3‘ (SEQ ID NO: 7, iniciador reverso).

Os iniciadores foram usados para triagem por PCR de numerosas espécies de bactérias em temperaturas de anelamento de 45, 48 e 50°C.

Um gene de fitase parcial na forma de um fragmento de DNA de 900 pb foi identificado em Citrobacter braakii ATCC 51113.

O fragmento de PCR foi clonado no pEZSeq blunt cloning kit (no. de catálogo 405011 da Lucigen Corporation, 2120 West Greenview Dr., Ste 9, Middleton, WI 53562, US). Primeiro, o fragmento de PCR foi tratado com o PCRTerminator End Repair Kit (parte do pEZSeq blunt cloning kit), que contém uma mistura de atividades de enzima que tem sido otimizada para preparar extremidades 5’-fosforiladas, cegas em qualquer tipo de produto de PCR. Após clonagem no vetor pEZSeq, o clone foi seqüenciado usando dois iniciadores vetores específicos. Por tradução da seqüência de nucleotídeos, foi confirmado que o fragmento de DNA clonado era parte do gene de fitase.

Para obter a seqüência de nucleotídeos de comprimento total do gene o DNA Walking SpeedUp Kit (DWSK-V102 da Seegene, Inc., 2nd FL, Myungji Bldg., 142-21, Samsungdong, Kangnam-gu, Seul, 135-090, Coréia) foi usado, o qual é planejado para capturar sítios alvos desconhecidos. Para este propósito, 4 oligonucleotídeos específicos foram planejados e usados com o kit. TSP1N: 5’- ACATTTTGGTGCTAACCCAGCC-3’ (SEQ ID NO: 8) TSP1C: 5'- AGAAGTTGCCCGTAGTAGGGCC-3’ (SEQ ID NO: 9) TSP2N: 5'- ATTCAGAAACAAGTTCTCCCCCACG-3' (SEQ ID NO: 10) TSP2C: 5’- ACCAATCTTGCAAATTTAAGCGGGG-3' (SEQ ID NO: 11)

A seqüência de nucleotídeos de comprimento total correta codificadora de fitase de Citrobacter braakii ATCC 51113 é mostrada na listagem de seqüências como SEQ ID NO: 3, e a seqüência de aminoácidos codificada correspondente possui SEQ ID NO: 4. E esperado que os primeiros • 22 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 sejam um peptídeo de sinal (predito Por 5 Signal P V3.0).

O gene de fitase de Citrobacter braakii ATCC 51113 foi clonado no vetor pET-30a(+) de expressão em E. coli sem marcadores de fusão (no. de catálogo 69909 de Novagen, comercialmente disponível na Bie & Berntsen A/S, 7 Sandbaekvej, DK-2610 Roedovre, Dinamarca). Neste X3 sistema, a expressão do gene é induzida pela provisão de uma fonte de T7 RNA polimerase na cepa hospedeira E. coli BL21star(DE)pLysS (no. de catálogo 69388 da Novagen, comercialmente disponível na Bie & Berntsen) que contém uma cópia cromossômica do gene de T7 RNA polimerase sob o controle do operon lacUV5. A indução do gene alvo foi realizada pela adição 15 de lactose no meio. Lactose se ligará no repressor e induzirá sua dissociação do operador, permitindo a transcrição do promotor.

Para expressão do gene de fitase, uma colônia única da cepa de E. coli transformada foi transferida para uma cultura de inoculo em meio não indutor (contendo glicose como a única fonte de carbono) que não permite a —0 expressão da T7 RNA polimerase. Como um controle negativo E.coli (BL21star(DE)pLysS) contendo um vetor pET-30(+) vazio foi usada. Uma alíquota pequena (aproximadamente de 150 microlitros) da cultura de inoculo foi transferida para frascos contendo lactose como a única fonte de carbono. A cultura de indução foi crescida durante a noite com agitação a 300 rpm a 25 37°C.

As células foram colhidas por centrifugação e alíquotas de 15 microlitros do sobrenadante foram analisadas por SDS-PAGE. Como um marcador de peso molecular (MW) 10 microlitros do padrão de proteína Precision Plus foram usados (no, de catálogo 161-0363, comercialmente disponível na Bio-Rad Laboratories Headquarters, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, US). Uma banda de MW distinta de aproximadamente 50 kDa foi identificada no sobrenadante da cepa de E. coli recombinante, mas não no controle negativo. 5 A pelota de célula colhida foi lisada e a fração intracelular solúvel também foi analisada por SDS-PAGE como descrito acima. Também aqui uma banda de MW de 50 kDa apareceu.

Isto é evidência de que a proteína de fitase recombinante é parcialmente secretada para o meio. Contudo, uma coleção de enzima ainda 44) permanece na fração intracelular.

A atividade de fitase do sobrenadante e da fração intracelular foi confirmada pelo uso do ensaio do Exemplo 4. Exemplo 2: Preparação de uma preparação de fitase de Citrobacter braakii 15 Citrobacter braakii ATCC 51113 foi crescida durante a noite com agitação (225 rpm) a 30°C em meio LB (25 g de LB Bouillon, Merck 0285, água íon-trocada ad 1.000 mL) com adição de 0,1% (p/p) de fitato de sódio. As células foram colhidas por centrifugação (4000 rpm, 60 min) e o sobrenadante descartado. A pelota celular foi ressuspensa em dois volumes de 0 água destilada com 100 mg/mL de lisozima e lisada por incubação noturna a 37°C. As células lisadas foram centrifugadas (4.000 rpm, 2 h) e o sobrenadante foi recuperado e usado para análise de estabilidade a ácido. Exemplo 3: Estabilidade a ácido da fitase de Citrobacter braakii 25 50 microlitros do lisado obtido no Exemplo 2 foram misturados com 50 microlitros de tampões 100 mM com valores de pH de 2,2, 3,0 (glicina/ácido clorídrico) e 7,0 (HEPES) respectivamente. As amostras foram incubadas durante a noite a 37°C e analisadas para atividade de fitase residual usando o procedimento analítico descrito no Exemplo 4. A atividade de fitase residual, expressada como a densidade óptica, é mostrada na Tabela 1 abaixo. Em adição, a atividade é calculada em percentagem relativa à atividade residual em pH 7. Tabela 1

Exemplo 4: Ensaio de fitase

O ensaio é baseado na determinação de fosfato solúvel por complexação com molibdato/ferro e medição fotométrica da cor azul em placas de microtítulo.

O substrato é fitato de Na 0,5 mM (Sigma, P-8810) dissolvido em tampão acetato 0,1 M, pH - 55,. Em uma modalidade particular a concentração de substrato é 5 mM.

O reagente de cor é preparado como segue: Molibdato de amónio 1% (Merck 1181, (NH4)6Mo7O24.4H2O) é dissolvido em ácido sulfurico 3,2% (Merck 731). 1,1 g de ferrossulfato (Merck 3965) são dissolvidos em 15 mL do reagente molibdato acima e 10 mL de ácido sulfurico 0,5 M são adicionados. É recém-preparado todo dia, e armazenado no escuro. Cego: 20 μL de amostra, 100 μL de substrato e 120 mL de reagente de cor são misturados, incubados 5 min a 37°C e ODccgo é medida a 750 nm. Amostra: 20 μL de amostra, 100 μL de substrato são misturados, incubados 30 min a 37°Cm 120 μL de reagente de cor são adicionados, incubados 5 min a 37°C, e ODcego é medida a 750 nm. OD ~ ODamostra ~ θDcego

Exemplo 5: Preparação de fitase recombinante

A fitase de SEQ ID NO: 4 foi expressada em Bacillus subtilis e purificada usando métodos convencionais: Centrifugação, filtração de germe, precipitação por sulfato de amónio (saturação de sulfato de amónio de 80%), centrifugação, ressuspensão de pelotas em tampão A (acetato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 1,5 M pH 4,5), filtração, cromatografia de 5 interação hidrofóbica (Phenyl Toyopearl, carregamento com tampão A, eluição com tampão B (acetato de sódio 50 mM pH 4,5)), e cromatografia de troca catiônica (SP-sepharose, carregamento com citrato de sódio 10 mM pH 4,0, eluição com um gradiente de sal linear (citrato de sódio 10 mM pH 4,0 + NaCl 1 M). Z) Um gel de SDS-PAGE corado de azul coomassie mostrou que a fitase madura purificada é mais do que 50% pura em uma base de proteína. Contudo foi verificado que a maior parte das bandas de não-fitase refere-se a produtos de degradação ou formas truncadas da fitas de C. braakii. Consequentemente a pureza foi bem acima de 80%, quando expressada como 15 a quantidade de fitase e produtos de degradação de fitase relativa à quantidade total de proteína.

Exemplo 6: Desempenho em ração animal

O desempenho em ração animal da fitase purificada de Citrobacter braakii do Exemplo 5 foi comparado, em um modelo in vitro, com K) o desempenho de uma fitase comercial de Peniophora lycii descrita em WO 98/28408, comercialmente disponível na DSM Nutritional Products, como a fitase RONOZYME P. O modelo in vitro simula digestão em um animal monogástrico e correlaciona-se bem com os resultados obtidos em testes de animal in vivo. 25 Amostras de ração compostas de 30% de farinha de feijão-soja e 70% de farinha de milho com CaCl2 adicionado para uma concentração de 5 g de cálcio por kg de ração foram preparadas e pré-íncubadas a 40°C e pH 3,0 por 30 minutos seguido por adição de pepsina (3000 U/g ração) e duas dosagens diferentes das duas fitases, a saber 0,25 ou 0,75 unidade de fitase (FYT)/g de ração. Um branco sem atividade de fitase também foi incluído. As amostras foram incubadas a 40°C e em pH 3,0 por 60 minutos seguido por pH 4,0 por 30 minutos.

As reações foram interrompidas e ácido fítico e inositol- 5 fosfatos foram extraídos pela adição de HC1 para uma concentração final de 0,5 M e incubação a 40°C por 2 horas, seguida por um ciclo de congelamento/descongelamento e incubação de 1 hora a 40°C.

Ácido fítico e inositol-fosfatos foram separados por cromatografia iônica de desempenho alto como descrito por "Chen,Q.C. e Li, ’ 0 B.W. (2003). “Separation of phytic acid and other related inositol phosphates by high-performance ion chromatography and its applications.” Journal of Chromatography A 1018, 41-52" e quantificados de acordo com "Skoglund, E., Carlsson, N.G., e Sandberg, A.S. (1997). “Determination of isomers of inositol mono- to hexa phosphates in selected foods and intestinal contents 15 using high-performance ion chromatography.” J. Agric. Food Chem. 45, 431- 436". Fósforo liberado foi calculado como a diferença em fósforo ligado em inositol-fosfato (IP-P) entre amostras tratadas com fitase e não tratadas. 20 Dos resultados mostrados na tabela 2 está claro que a fitase de C. braakii da invenção é muito mais eficaz do que a fitase comercial na liberação de fosfato da ração. Tabela 2

Exemplo 7: Especificidade para substrato 25 A atividade em pH 5,0 e a 37°C da fitase de Citrobacter braakii purificada do Exemplo 5 foi testada sobre dois substratos, a saber fitato e fosfato de p-nitro-fenila (pNP-fosfato). Mais em particular, a atividade sobre pNP-fosfato relativa à atividade sobre fitato foi determinada por comparação de leituras de ensaio de cada substrato com curvas padrão de fosfato (tampão cego subtraído).

Materiais

Tampão de diluição de enzima: acetato de Na 0,25 M, pH 5,0 incluindo 0,005% de Tween-20

Substrato de fitase: fitato de sódio de arroz (Aldrich 274321) 10 mg/mL em tampão acetato de Na 0,25 M pH 5,0

Substrato de pNP-fosfato: dois tabletes de 5 mg de fosfato de p-nitro-fenila (Sigma N9389) dissolvido em 10 mL de tampão acetato de na 0,1 MpH5

Solução de molibdato (heptamolibdato de amónio 10% em solução de amónia 0,25%): 10 g de heptamolibdato de amónio (Merck 1.001182) dissolvidos em 90 mL de H2O deionizada, 1 mL de solução de amónia 25% (Merck 1.05432) Vol. ajustado para 100 mL com H2O deionizada Reagente de monovanadato de amónio (solução de NH4VO3 0,24% (p/v) emHNO3 3,25%, Bie & Bemtsen, Dinamarca, LABÍ7650). Reagente de interrupção (reagente molibdato/vanadato em HNO3): 10 mL de solução de molibdato + 10 mL de reagente monovanadato de amónio + 20 mL de ácido nítrico 21,7% Procedimento 75 μL/cavidade de solução de enzima (ou tampão cego) foram dispensados em uma placa de microtítulo (Nunc 269620). 75 μL de substrato (fitato de sódio ou pNP-fosfato) foram adicionados e a placa foi vedada com um pedaço de vedante adesivo de placa. A placa foi rapidamente posicionada em um Thermomixer Eppendorff equipado com um suporte de placa de microtítulo e agitada com 750 rpm a 37°C por 15 min. 75 μL de reagente de interrupção foram adicionados. Absorbância a 405 nm foi medida em um espectrofotômetro de placa de microtítulo (Molecular Devices Spectramax 384 Plus). Como é bem conhecido pela pessoa experiente na arte, várias diluições da enzima foram testadas com o objetivo de obter leituras adequadas de absorbância a 405 nm.

Resultados

A hidrólise de fosfato de pNP-fosfato verificada foi de 4% daquela de fitato. Tabela 6 de KR-2004-A-045267 (WO-2004/085638) relata que a atividade da fitase YH-15 sobre pNP-fosfato é de 11,27% relativa à atividade sobre fitato, o que significa que a fitase de Citrobacter braakii da presente invenção é diferente com respeito a isto. Exemplo 8: Estabilidade a ácido A estabilidade a ácido da fitase purificada de Citrobacter braakii do Exemplo 5 foi determinada como atividade de hidrólise de fosfato residual após incubação a 37°C e em pH 2,0, 2,5 ou 3.0 (tampão Glicina/HCl 0,lM). A atividade residual sobre fitato de Na foi ensaiada em pH 5,5, 37°C, tampão cego subtraído, e os resultados foram comparados com atividade em tempo, t = 0.

Materiais

Tampão de diluição de enzima: tampão acetato de Na 0,25 M pH 5,5 incluindo 0,005% de Tween-20 Substrato de fitase: fitato de Na 1% (p/v) (Aldrich 274321) dissolvido em acetato de Na 0,25 M pH 5,5 Reagente de interrupção: 10 mL de solução de (NH4)gMo7024 4H2O 10% (p/v) 10 mL de solução de NH4VO3 0,24% (p/v) 20 mL de solução de HNO3 21,7% solução de (NH4)GMO7O24 4H2O 10% (p/v) 10 g de (NH4)6Mo7O24 4H2O (Merck 1.001182) dissolvidos em 90 mL de água deionizada 1 mL de solução de NH3 25% (p/v) (Merck 1.05432) Volume ajustado para 100 mL usando água deionizada 5 Solução de NH4VO3 0,24% (p/v) em HNO3 3,25% (Bie & Berntsen, Dinamarca, LAB 17650).

Uma solução de estoque purificada de fitase de Citrobacter braakii armazenada em NaAc 20 mM pH 4,0 foi diluída usando tampão Glicina/HCl 0,1 M (diluição suficiente para garantir que o valor de pH intencionado seja obtido) e incubada em um Thermomixer Eppendorf a 37°C, 750 rpm (1,5 mL de Eppendorf Protein LoBind Tube, PCR clean, no. de catálogo 2243108-1). Atividade residual foi analisada empregando o procedimento descrito abaixo.

A atividade de fitase por mL da solução de estoque de fitase 15 deve mostrar 1) diluição usando solução tampão de Glicina/HCl 0,1 M com o propósito de obter o pH desejado, seguido por 2) diluição usando tampão de diluição (veja acima) com o objetivo de obter p pH das condições de ensaio, resultado deste modo em uma leitura de absorbância adequada a 405 nm. Procedimento de ensaio O Após tempo, t = x horas, uma amostra foi retirada de cada mistura de incubação de pH usando tampão de diluição de enzima (diluição suficiente para garantir que fosse obtido um pH de 5,5). 75 μL de solução de enzima (ou tampão cego, consistindo de tampão de diluição de enzima) foram adicionados nas cavidades em uma placa de microtítulo (Nunc 269620). 75 25 μL de solução de substrato foram adicionados, a placa foi vedada com vedante adesivo de placa, seguido por transferência rápida para um Thermomixer Eppendorf equipado com um suporte de placa de microtítulo. A placa foi incubada a 37°C com agitação (750 ipm) por 15 min. 75 μL de reagente de interrupção foram adicionados e a absorbância foi lida a 405 nm em um espectrofotômetro de placa de microtítulo (Molecular Devices Spectramax 190).

Resultados

Uma atividade significativa foi observada após incubação em pH 2,0, 37°C por 4 horas. Igualmente, uma atividade residual significativa foi observada após 1 dia de incubação em pH 2,5, 37°C.

Exemplo 4-2 de KR-2004-A-045267 (veja a parte inferior de p. 27 de WO-2004/085638) explica que a atividade de enzima de fitase YH- 15 foi quase perdida após incubação sob pH 3,0 por 4 horas. A aplicação de KR é silenciosa ao redor do tampão usado, mas da publicação relacionada por Kim et al (Biotechnology Letters 25: 1231-1234, 2003), parece da Fig. 2 que um tampão glicina/HCl foi usado, e este tampão portanto também foi utilizado no presente exemplo.

Em conclusão, a fitase de Citrobacter braakii da presente invenção é muito mais estável a ácido em comparação com a fitase YH-15.

A invenção aqui descrita e reivindicada não é para ser limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui descritos, porque estes aspectos são intencionados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são intencionados para estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas aqui mostradas e descritas se tomarão evidentes para aquelas pessoas experientes na arte a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas para caírem dentro do escopo das reivindicações apendidas. No caso de conflito, a presente descrição incluindo definições controlará.

Várias referências são aqui citadas, cujas descrições são incorporadas como referências em suas totalidades.

Claims (7)

1. Polipeptídeo isolado possuindo atividade de fitase, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID NO: 2.

2. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser em ração animal.

3. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para utilização em ração animal.

4. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 é adicionado na ração.

5. Aditivo de ração animal, caracterizado pelo fato de compreender: (a) pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (d) pelo menos um mineral traço.

6. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender pelo menos uma amilase, pelo menos uma fitase adicional, pelo menos uma xilanase, pelo menos uma galactanase, pelo menos uma alfa-galactosidase, pelo menos uma protease, pelo menos uma fosfolipase, e/ou pelo menos uma beta-glucanase.

7. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de possuir um conteúdo de proteína crua de 50 a 800 g/kg, e de compreender pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1.