JP5096152B2 - フィターゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
発明の分野:
本発明は、フィターゼ活性を有する単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。前記ポリペプチドは、シトラバクターゼ・ブラアキ(Citrobacter braakii)に関連し、このアミノ酸配列は、配列番号4として付随する配列の列挙に示されている。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、及び前記ポリペプチドの生成方法及び特に動物飼料内への前記ポリペプチドの使用にも関する。
フィターゼは、動物、例えばヒトのための食品にそれらを添加するために好都合であるので、良く知られている酵素である。フィターゼは、多くの菌類及び細菌株を包含する非常に多くの源から単離されて来た。
E. コリ及び他のグラム陰性細菌フィターゼの酸性ヒスチジンホスファターゼappAは、高い比活性を有することが知られている。
本発明は、(a)(i)配列番号2のアミノ酸1〜411、及び/又は(ii)配列番号2の成熟ポリペプチドと、少なくとも98.6%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;(b)(i)配列番号2のアミノ酸1〜411、及び/又は(ii)配列番号2の成熟ポリペプチド部分の1又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る変異体;及び(c)(i)配列番号2のアミノ酸1〜411、及び/又は(ii)配列番号2の成熟ポリペプチド部分のフラグメントから成る群から選択された、フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。
本発明はまた、フィターゼ活性を有するポリペプチドの生成方法にも関し、ここで前記方法は、(a)前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
本発明はさらに、(i)配列番号1のヌクレオチド1〜66、又は(ii)配列番号3のヌクレオチド1〜66から成るシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されるタンパク質をコードする遺伝子(前記ヌクレオチド配列に対して外来性である)を含んで成る核酸構造体に関する。
フィターゼ活性:
本発明においては、フィターゼ活性(フィターゼ)を有するポリペプチドは、(1)myo−イノシトール及び/又は(2)その一、二、三、四及び/又は五リン酸、及び(3)の無機リン酸へのフィテート(myo−イノシトール六リン酸)の加水分解を触媒する酵素である。
同一性:2種のアミノ酸配列間の又は2種のヌクレオチド配列間の関連性が、パラメーター“同一性”により記載される。
コード配列:本明細書において使用される場合、用語“コード配列”とは、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列を包含する。コード配列の境界は一般的に、ATG開始コドン又は他の開始コドン、例えばGTG及びTTGにより通常開始する読取枠により決定される。コード配列は、DNA、cDNA、又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
発現ベクター:本明細書においては、用語“発現ベクター”とは、本発明のポリペプチドとコードするポリヌクレオチドを含んで成り、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに作用可能に連結される線状又は環状DNA分子を包含する。
修飾:用語“修飾”とは本明細書において、特定されるポリペプチド、例えば配列番号2又は4のアミノ酸1〜411から成るポリペプチドのいずれかの化学的修飾、及び前記ポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作を意味する。前記修飾は、アミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入、及びアミノ酸側鎖の置換であり得る。
フィターゼ活性を有するポリペプチド:
第1の観点においては、本発明は、少なくとも98.6%の配列番号2のアミノ酸1〜411(すなわち、成熟ポリペプチド)に対する同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。
他の特定の態様においては、相同ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜411とは、20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 又は1個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含んで成り、又はフィターゼ活性を有する、対立遺伝子変異体又はそのフラグメントである。さらに特定の態様においては、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜411又はその対立遺伝子変異体;又はフィターゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る。
特定の態様においては、同一性の程度は、フィターゼ活性(この後、“相同ポリペプチド”)を有する、少なくとも99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%又は少なくとも99.9%である。
他の態様においては、配列番号4のアミノ酸1〜411(すなわち、成熟ポリペプチド)に対する同一性の程度は、少なくとも70, 80, 85, 90, 95, 97, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9% 又は少なくとも99.0%である。
他の態様においては、ハイブリダイゼーションは、非常に低い又は低い緊縮条件下で行われる。
塩−含有ハイブリダイゼーション条件下で、効果的Tmは、好結果をもたらすハイブリダイゼーションのためにプローブとフィルター結合されたDNAとの間で必要とされる同一性の程度を調節するものである。効果的Tmは、種々の緊縮条件下でハイブリダイズする2種のDNAのために必要とされる同一性の程度を決定するために下記式を用いて決定され得る。
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htmを参照のこと)。
“G+C”は、プローブにおけるヌクレオチドG及びTの含有率を示す。中位の緊縮下で、ホルムアミドは35%であり、そして5×SSPEのためのNa+濃度は0.75Mである。
(i)高い比活性、例えばE. コリappA(SPTREMBL:Q8GN88)の比活性の少なくとも50%のフィテートに対する比活性、比活性は好ましくは、mgフィターゼ酵素タンパク質当たりFYTの単位として測定される;
(a)HEPES緩衝液pH7.0における37℃での一晩のインキュベーションの後の残留活性に比較して、グリシン/塩酸緩衝液pH2.2における37℃でのインキュベーションの後の少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、少なくとも70%又は少なくとも75%の残留活性;
(b)HEPES緩衝液pH7.0における37℃での一晩のインキュベーションの後の残留活性に比較して、グリシン/塩酸緩衝液pH3.0における37℃でのインキュベーションの後の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の残留活性;及び/又は
(c)E. コリappA(SPTREMBL:Q8GN88)の残留活性に比較して、25, 30, 35又は37℃、好ましくは37℃の温度、及び2.2, 2.4, 2.5, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4 又は3.5のpHで、好ましくはpH2.2、又は3.0のグリシン/塩酸緩衝液における2時間のインキュベーションの後、少なくとも50%の残留フィターゼ活性;
(iv)プロテアーゼ−安定性、例えばE. コリappA(SPTREMBL:Q8GN88)の残留活性に比較して、0.1mg/mlのペプシンの存在下で、20, 25, 30, 35, 又は37℃、好ましくは37℃の温度及び5.5のpHでの0.5, 1, 1.5又は2時間、好ましくは1時間のインキュベーションの後、少なくとも50%の残留フィターゼ活性;及び/又は
(v)上記に記載のように、FYTアッセイ、及び/又は例4のアッセイを用いて決定される、pH5.0以下、例えばpH4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5以下又はさらに2.0以下のpH−最適性。
他方では、アミノ酸変化は、ポリペプチドの生理化学的性質が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質変異性を変更し、pH最適性を変え、そして同様のことをする。
本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又はその源からのヌクレオチド配列が挿入されている細胞により生成されることを意味する。好ましい態様においては、所定の源から得られるポリペプチドは細胞外に分泌される。
上記微生物の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる:American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドにも関する。好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、配列番号1又は3のいずれか1つにより示される。もう1つの好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、配列番号1又は3のいずれか1つの成熟ポリペプチドコード領域である。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により、それぞれ配列番号1又は3とは異なる、配列番号2又は4のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそれらの成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、フィターゼ活性を有する、配列番号2又は4のフラグメントをコードする配列番号1又は3の副配列にも関する。
本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指図する1又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体にも関する。
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、ポリヌクレオチド配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。組換えDNA方法を用いてポリヌクレオチド配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の2ミクロン起点、すなわちARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組み合わせ、及びARS4及びCEN6の組み合わせである。
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ(Ascomycota)、バシジオミコタ(Basidiomycota)、キトリジオミコタ(Chytridiomycota)及びヅイゴミコタ(Zygomycota)(Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される)、及びオーミコタ(Oomycota)(Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される)、並びに栄養胞子菌(Hawksworh など., 1995, 前記)を包含する。
さらにより好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hunsenula)、クレベロミセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)又はヤロウィア(Yarrowia)である。
本発明はまた、(a)その野生型において、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下でポリペプチドを生成することができる細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生成方法にも関する。好ましくは、細胞は、シトロバクター属及びより好ましくは、シトロバクター・ブラキのものである。
本発明はまた、(a)ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し;そして(b)ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により、栄養培地から回収され得る。
本発明はまた、ポリペプチドを、回収できる量で発現し、そして生成するために、本発明のフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換されているトランスジェニック植物、その植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
特定の態様においては、ポリペプチドは、種子の内生精子貯蔵液胞にも標的化される。これは、適切なシグナルペプチドにより前駆体としてそれを合成することによって行われる。Horvath など .、 PNAS, Feb. 15,2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919を参照のこと。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする、1又は複数の発現構造体を、植物宿主ゲノム中に導入し、そして得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞中に成長せしめることによって構成される。
発現構造体の選択マーカー遺伝子及びいずれか他の部分は、当業界において入手できるそれらから選択され得る。
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物及びその生成物又は要素にも関し、その例は体液、例えば乳汁及び血液、器官、肉及び動物細胞である。例えば、哺乳類細胞においてタンパク質を発現するための技法は当業界において知られている。例えば、ハンドブック Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), 及びGene Transcription, RNA processing, and Post-translational Processingに関するこのシリーズの他の3種のハンドブックを参照のこと。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物、及びそれらの使用方法に関する。
ポリペプチド組成物は、当業者において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、粒子又は微粒子の形で存在することができる。組成物に含まれるポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
従って、本発明のポリペプチドの好ましい使用は、動物飼料調製物(ヒト食品を包含する)又はそのような調製物の添加剤においてである。
用語、動物とは、ヒトを包含するすべての動物を包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物である。反芻動物は例えば、動物、例えば羊、ヤギ、馬及び蓄牛、例えば肉ウシ、乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えばブタ又はイノシシ(子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない);家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏(ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない);子牛;及び魚(サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない);及び甲殻類(小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない)を包含する。
本発明に従っての使用においては、ポリペプチドは、食事の前、後又は同時に動物に供給され得る。後者が好ましい。
フィターゼ調製物は、(a)飼料に直接的に添加され得(又はタンパク質の処理工程に直接的に使用され得る)、又は(b)1又は複数の中間体組成物、例えば続いて飼料に添加される(又は処理工程に使用される)飼料添加物又はプレミックスの生成に使用され得る。上記純度の程度は、上記(a)又は(b)のいずれに従って使用されても、元のポリペプチド調製物の純度を言及する。
そのようなポリペプチド調製物はもちろん、他のポリペプチドと共に混合され得る。
さらなる観点においては、本発明は、動物の飼料への使用のための組成物、例えば動物飼料及び動物飼料添加物、例えばプレミックスに関する。
特定の態様においては、それらの他のポリペプチドは、十分に定義されている(フィターゼ調製物について上記に定義されるように)。
上記子嚢菌及び担子菌フィターゼ、特にペニオフォラ・リシ由来のRONOZYMO Pフィターゼ、及びそれらの誘導体、変異体及びフラグメントはまた、バチルスフィターゼ、特にB. リケニホルミスフィターゼ、及びそれらの誘導体、フラグメント又は変異体と共に、特に動物飼料目的のために組合され得る。
多不飽和脂肪酸の例は、C18, C20及びC22多不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸及びγ−リノール酸である。
通常、脂−及び水−溶性ビタミン、及び微量鉱物は、飼料への添加のために意図された、いわゆるプレミックスの一部を形成し、そしてマクロ鉱物は通常、別々に飼料に添加される。本発明のプロテアーゼにより富化される場合、それらの組成物のいずれかは、本発明の動物飼料添加物の例である。
次のものは、それらの成分の例の非制限的列挙である:
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE及びビタミンK、例えばビタミンK3である。
微量鉱物の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン及びコバルトである。
マクロ鉱物の例は、カルシウム、リン及びナトリウムである。
それらの成分(家禽、及び子豚/豚により例示される)の栄養必要条件は、WO01/58275号の表Aに列挙される。栄養必要条件とは、それらの成分が示される濃度で規定食に供給されるべきであることを意味する。
WO01/58275号は、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許09/77334号に対応する。
さらに、又は他方では(上記に示される粗タンパク質含有率)、本発明の動物飼料組成物は、10−30MJ/kgの代謝可能エネルギー含有率;及び/又は0.1−200g/kgのカルシウム含有率;及び/又は0.1−200g/kgの利用できるリン含有率;及び/又は0.1−100g/kgのメチオニン含有率:及び/又は0.1−150g/kgのメチオニン及びシステイン含有率;及び/又は0.5−50g/kgのリシン含有率を有する。
粗タンパク質は、係数6.25により掛け算される窒素(N)、すなわち粗タンパク質(g/kg)=N(g/kg)×6.25として計算される。窒素含有率は、Kjeldahl方法 (A. O. A. C. , 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)により決定され得る。
特定の態様においては、植物タンパク質源は、1又は複数のマメ科植物、例えば大豆、ルピナス、エンドウ又はインゲン豆からの材料である。
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ種子、ヒマワリ種子、綿種子及びキャベツである。
大豆は、好ましい植物タンパク質源である。
植物タンパク質源の他の例は、穀物、例えば大麦、小麦ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、ライコムギ及びモロコシである。
フィターゼはもちろん、有効量で、すなわち飼料の溶解性及び/又は栄養価値を改良するための適切な量で適用され得る。ポリペプチドは次の量(用量範囲)で投与されることが現在企画される:0.01-200 ; 0.01-100 ; 0.5-100 ; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50 ;又は0.10-10−すべてのそれらの範囲はmgフィターゼポリペプチドタンパク質/kg飼料(ppm)である。
本発明はまた、配列番号2又は4のいずれか1つのアミノ酸1〜22から成るシグナルペプチドをコードする、配列番号1又は3のいずれか1つのヌクレオチド1〜66から成る第1ヌクレオチド配列に作用可能に連結されるタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列に対して外来性の遺伝子を含んで成る核酸構造体にも関する。
本発明はまた、(a)そのような組換え宿主細胞を、タンパク質の生成のために適切な条件で培養し;そして(b)タンパク質を回収することを含んで成るタンパク質の生成方法にも関する。
前記第1ヌクレオチド配列は、他の制御配列と共に、又は他の制御配列と組合して、それぞれ、外来性遺伝子に作用可能に連結され得る。そのような他の制御配列は、前記の通りである。
前記遺伝子は、いずれかの原核、真核生物又は他の源から得られる。
次のものは、本発明の追加の態様である。核酸配列、核酸構造体、組換え発現ベクター、組換え宿主細胞、ポリペプチドの生成方法、トランスジェニック植物及び動物、及び種々の使用、使用方法及び飼料組成物/添加剤に関するそれらの対応する観点もまた、本明細書に包含される。
フィターゼ活性、及び時間t=0での活性に比較して、少なくとも20%の、37℃で及び0.1Mのグリシン/HCl緩衝液pH2.5において24時間のインキュベーションに続いての残留活性を有する単離されたポリペプチド(前記活性は、0.25Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH5.5を用いて、1%(w/w)フィチン酸ナトリウムに基づいて、27℃及びpH5.5でアッセイされ、バッファーブラインドは控除される;
フィターゼ活性を有する単離されたポリペプチド、ここで、基質pNP−ホスフェートに基づいて測定された、pH5.0及び37℃でのポリペプチドの活性は、基質フィテートに基づいて測定されたポリペプチドの活性の11%以下であり;
好ましくは、i)配列の番号4のアミノ酸1〜411、又はii)配列番号2のアミノ酸1〜411に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%又は少なくとも98%の同一性を有する。
好ましくは、本明細書における例6のインビトロモデルにおいて測定される場合;
及び/又は前記ポリペプチドは好ましくは、i)配列の番号4のアミノ酸1〜411、又はii)配列番号2のアミノ酸1〜411に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%又は少なくとも98%の同一性を有する。
好ましくは、本明細書における例6のインビトロモデルにおいて測定される場合;
及び/又は前記ポリペプチドは好ましくは、i)配列の番号4のアミノ酸1〜411、又はii)配列番号2のアミノ酸1〜411に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%又は少なくとも98%の同一性を有する。
好ましくは、本明細書における例6のインビトロモデルにおいて測定される場合;
及び/又は前記ポリペプチドは好ましくは、i)配列の番号4のアミノ酸1〜411、又はii)配列番号2のアミノ酸1〜411に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%又は少なくとも98%の同一性を有する。
III . (a)配列番号2のアミノ酸1〜411と、少なくとも98.2の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;(b)配列番号1のヌクレオチド67〜1299と、少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド;及び(c)(i)配列番号1のヌクレオチド67〜1299、(ii)配列番号1の成熟ポリペプチドコード部分、(iii)上記(i)又は(ii)のいずれか1つの相補的鎖と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから成る群から選択された、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
V. 発現宿主におけるポリペプチドの生成を指図する1又は複数の制御配列に操作可能に連結される、セクションII〜IVのいずれか1つのポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体。
VII . セクションVの核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
VIII. (a)その野生型において、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下でポリペプチドを生成することができる細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、セクションIのポリペプチドの生成方法。
X. セクションIのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞。
XII. 動物飼料へのセクションIの少なくとも1つのポリペプチドの使用。
XIII . 動物飼料への使用のための組成物の調製へのセクションIの少なくとも1つのポリペプチドの使用。
XV. (a)少なくとも1つのセクションIのポリペプチド、(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は(d)少なくとも1つの微量鉱物を含んで成る動物飼料添加剤。
IIXX. 50〜800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そして少なくとも1つのセクションIのポリペプチドを含んで成る動物飼料組成物。
(ii)配列番号4の成熟ポリペプチドと、少なくとも99.1%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)1又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る、(a)(i)〜(a)(ii)のいずれか1つのポリペプチドの変異体;及び
(c)上記(a)(i)〜(a)(ii)のいずれか1つのポリペプチドのフラグメントから成る群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチド。
(b)配列番号3のヌクレオチド67〜1299と、少なくとも98.9%の同一性を有するポリヌクレオチドから成る群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
配列番号4のアミノ酸1〜411と、少なくとも99.1%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成り、好ましくは有するフィターゼ活性を有するポリペプチド。
(ii)配列番号2の成熟ポリペプチド部分の配列を含んで成り、好ましくは有するフィターゼ活性を有するポリペプチド;又は
(a)1又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る、(i)〜(ii)のポリペプチドのいずれか1つの変異体;又は
(c)(i)〜(ii)のポリペプチドのいずれか1つのフラグメントであるポリペプチド。
(ii)配列番号4の成熟ポリペプチド部分の配列を含んで成り、好ましくは有するフィターゼ活性を有するポリペプチド;又は
(a)1又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る、(i)〜(ii)のポリペプチドのいずれか1つの変異体;又は
(c)(i)〜(ii)のポリペプチドのいずれか1つのフラグメントであるポリペプチド。
本発明は次の例により、さらに記載されるが、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
複数の一列整列を、次の酸性ヒスチジンホスファターゼから製造した:appA E.コリ (SPTREMBL:Q8GN88)、 phyk クレブシエラ・テリゲナ(SPTREMBL:Q7WSY1)及び ypo1648 エルシア・ペスチス CO92 (SPTREMBL:Q8ZFP6)。2種の変性オリゴヌクレオチドプライマーを、コンセンサス配列に基づいて企画した:
5'- TGG TGA TTG TGT CCC GTC AYG GNG TNM G -3' (配列番号6、前方向プライマー)
5'- GCC CGG CGG GGT RTT RTC NGG -3' (配列番号7、逆方向プライマー)。
プライマーを、45、48及び50℃のアニーリング温度で多くの細菌種のPCRスクリーニングのために使用した。
TSP1N: 5'- ACATTTTGGTGCTAACCCAGCC-3' (配列番号8)
TSP1C: 5'- AGAAGTTGCCCGTAGTAGGGCC-3' (配列番号9)
TSP2N: 5'- ATTCAGAAACAAGTTCTCCCCCACG-3' (配列番号10)
TSP2C: 5’- ACCAATCTTGCAAATTTAAGCGGGG-3' (配列番号11)。
これは、組換えフィターゼタンパク質が培地に一部、分泌されたことの証拠である。しかしながら、酵素のプールは細胞内画分にまだ残存する。
上清液及び細胞内画分のフィターゼ活性を、例4のアッセイの使用により確めた。
シトロバクター・ブラキATCC51113を、0.1%(w/w)フィチン酸ナトリウムの添加を伴って、LB培地(25gのLB Bouillon, Merck 0285, 1000mlまでのイオン交換された水)において、30℃で振盪しながら(225rpm)、一晩、増殖した。細胞を、遠心分離(4000rpm、60分)により収穫し、そして上清液を捨てた。細胞ペレットを、2体積の蒸留水及び100mg/mlのリゾチームに再懸濁し、そして37℃での一晩インキュベーションにより溶解した。溶解された細胞を遠心分離し(4000rpm、2時間)、そして上清液を保存し、そして酸安定性分析のために使用された。
例2で得られた溶解物50μlを、それぞれ、2.2、3.0(グリシン/塩酸)及び7.0(HEPES)のpH値を有する100mMの緩衝液50μlと共に混合した。それらのサンプルを37℃で一晩インキュベートし、そして例4に記載される分析方法を用いて、残留フィターゼ活性について分析した。光学密度として示される残留フィターゼ活性が下記表1に示されている。さらに、活性を、pH7での残留活性に対する%として計算する。
アッセイは、モリブデート/鉄との錯化による可溶性ホスフェートの決定、及びマイクロタイタープレートにおける青色の光学的測定に基づかれている。
基質は、0.1Mの酢酸緩衝液pH=5.5に溶解された0.5mMのフィチン酸ナトリウム(Sigma, P−8810)である。特定の態様においては、基質濃度は5mMである。
サンプル:20μlのサンプル、100μlの基質を混合し、37℃で30分間インキュベートし、120μlの着色試薬を添加し、37℃で5分間インキュベートし、そしてODSampleを750nmで測定する。
OD=ODSample−ODBland
配列番号4のフィターゼを、バチルス・サブチリスにおいて発現し、そして次の従来の方法を用いて精製した:遠心分離、細菌濾過、硫酸アンモニウム沈殿(80%硫酸アンモニウム飽和)、遠心分離、緩衝液A(50mMの酢酸ナトリウム、1.5Mの硫酸アンモニウム、pH4.5)におけるペレットの再懸濁、濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー(Phenyl Toyopearl, 緩衝液Aによる充填、緩衝液B(50mMの酢酸ナトリウムpH4.5)による溶出)、及びカチオン交換クロマトグラフィー(SP−セファロース、10mMのクエン酸ナトリウムpH4.01による充填、線状塩グラジエント(10mMのクエン酸ナトリウムpH4.0+1MのNaCl)による溶出)。
例5の精製されたシトロバクター・ブラキフィターゼの動物飼料における性能を、RONOZYME PフィターゼとしてDSM Nutritional Productsからの市販されている、WO98/28408号に記載されるペニオフォラ・リシからのフィターゼの性能と、インビトロモデルにおいて比較した。そのインビトロモデルは、単胃動物における消化を仮装し、そしてインビボでの動物試験において得られた結果と十分に相互関係する。
下記表2に示される結果から、本発明のC. ブラキフィターゼが飼料からのホスフェートの開放において、市販のフィターゼよりもより効果的であることが明白である。
例5の精製されたシトロバクター・ブラキフィターゼのpH5.0及び37℃での活性を、2種の基質、すなわちフィテート及びp−ニトロフェニルホスフェート(pNP−ホスフェート)に対して試験した。さらに特に、フィテートに基づく活性に対するpNP−ホスフェートに基づく活性を、ホスフェート標準曲線(控除された緩衝液ブラインド)に対して、個々の基質からのアッセイ読出しを比較することにより決定した。
酵素希釈緩衝液:0.25Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0、0.005% Tween20
フィターゼ基質:0.25Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中、10mg/mlの米からのフィチン酸ナトリウム(Aldrich 274321)
pNP−ホスフェート基質:10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に溶解された2個の5mgのp−ニトロフェニルホスフェート錠剤(Sigma N9389)
アンモニウムモノ−バナデート試薬(3.25%HNO3中、0.24%(w/v)NH4VO3溶液、Bie & Bemtsen, Denmark, LAB17650)
停止試薬(HNO3中、モリブデート/バナデート試薬);10mlのモリプデート試薬+10mlのアンモニウムモノ−バナデート試薬+20mlの21.7%硝酸
75μl/ウェルの酵素溶液(又は緩衝液ブラインド)を、マイクロタイタープレート(Nunc 269620)に分散した。75μlの基質(フィチン酸ナトリウム又はpNP−ホスフェート)を添加し、そしてプレートを、少々の接着剤プレートシーラーにより密閉した。プレートをすばやく、マイクロタイタープレートホルダーを備えたEppendorff Thermomixerに配置し、そして37℃で15分間、750rpmで振盪した。75μlの停止試薬を添加した。405nmでの吸光度を、マイクロタイタープレート分光計(Molecular Devices Spectramax 384 Plus)により測定した。当業者に良く知られているように、酵素の種々の希釈溶液を、405nmでの適切な吸光度読取を得るために試験した。
pNP−ホスフェートのホスフェート加水分解は、フィテートのその加水分解の4%であることが見出された。KR-2004-A-045267 号(WO-2004/085638号)の表6は、pNP−ホスフェートに対するYH−15フィターゼの活性がフィテートに対するその活性に対して、11.27%であることを報告しており、これは、本発明のシトロバクター・ブラキフィターゼがこの点から異なることを意味する。
例5の精製されたシトロバクター・ブラキフィターゼの酸安定性を、37℃及びpH2.0、2.5又は3.0(0.1Mのグリシン/HCl緩衝液)でのインキュベーションに続いての残留ホスフェート加水分解活性として決定した。Na−フィテートに対する残留活性を、pH5.5、37℃でアッセイし、緩衝液ブラインドを控除し、そして結果を、時間t=0での活性に比較した。
酵素希釈緩衝液:0.25Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0、0.005% Tween20
フィターゼ基質:0.25Mの酢酸ナトリウムpH5.5に溶解された1%(w/v)フィチン酸ナトリウム(Aldrich 274321)
停止試薬:
10 mlの 10% (w/v) (NH4)6Mo7024-4H20溶液
10 mlの 0.24% (w/v) NH4VO3溶液
20 ml の21.7% HNO3溶液
10% (w/v) (NH4)6Mo7024-4H20溶液:
90mlの脱イオン水に溶解された10gの(NH4)6Mo7024・4H20 (Merck 1.001182)
1mlの25%(w/v)NH3溶液(Merch 1.05432)
体積を、脱イオン水を用いて、100mlに調節した
3.25%HNO3中、0.24%(w/v)NH4VO3溶液(Bie & Berntsen, Denmark, LAB17650)。
時間t=x(時)の後、サンプルを個々のpHインキュベーション混合物から取り出し、そして酵素希釈緩衝液を用いて希釈した(5.5のpHを得るための十分な希釈度)。75mlの酵素溶液(又は酵素希釈緩衝液から成る緩衝液ブラインド)を、マイクロタイタープレート(Nunc 269620)中のウェルに添加した。75μlの基質溶液を添加し、プレートを接着剤プレートシーラーにより密閉し、続いて、マイクロタイタープレートホルダーを備えたEppendorf Thermomixerに、すばやく移した。プレートを振盪(750rpm)しながら37℃で15分間インキュベートした。75μlの停止試薬を添加し、そして吸光度を、マイクロタイタープレート分光計(Molecular Devices Spectramax 190)により405nmで読み取った。
pH2.0、37℃での4時間インキュベーションの後、有意な残留活性を観察した。同様に、有意な残留活性を、pH2.5、37℃での1日のインキュベーションの後、観察した。
KR-2004-A-045267号の例4〜2(WO-2004/085638号の27ページの下部を参照のこと)は、YH−15フィターゼの酵素活性が、pH3.0下での4時間のインキュベーションの後、ほとんど失われたことを説明している。KR適用は、使用される緩衝液についてサイレントであるが、しかしKimなど.(Biotechnology Letters 25: 1231-1234, 2003)による関連する出版物から、グリシン/HCl緩衝液から使用され、そして従って、この緩衝液がまた本発明の例にも使用されたことが図2から明白である。
本明細書及び請求項に記載される発明は、それらの態様は本発明を単に例示するものであるので、本明細書に開示される特定の態様によりその範囲を制限されない。いずれかの同等の態様は、本発明の範囲内に包含される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に、本発明の種々の修飾は、当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は本発明の範囲内にある。
種々の引例が本明細書に引用され、それらの開示は引用により本明細書に組込まれる。
Claims (15)
- (a)(i)配列番号2のアミノ酸1〜411、及び/又は
(ii)配列番号2の成熟ポリペプチドと、
少なくとも99.4%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号2において1又は2個のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る、ポリペプチドの変異体;及び
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドのフラグメント;
から成る群から選択される、フィターゼ活性を有し、且つpH 2.0、37℃での4時間のインキュベーションの後に有意な残存活性を示すポリペプチド。 - (a)(i)配列番号4のアミノ酸1〜411、及び/又は
(ii)配列番号4の成熟ポリペプチドと、
少なくとも99.6%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号4において1個のアミノ酸の欠失、挿入及び/又は保存性置換を含んで成る、ポリペプチドの変異体;及び
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドのフラグメント;
から成る群から選択される、フィターゼ活性を有し、且つpH 2.0、37℃での4時間のインキュベーションの後に有意な残存活性を示すポリペプチド。 - 請求項1又は2記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
- (a)配列番号1のヌクレオチド67〜1299と、少なくとも99.3%の同一性を有するポリヌクレオチド;及び
(b)配列番号3のヌクレオチド67〜1299と、少なくとも99.7%の同一性を有するポリヌクレオチド;
から成る群から選択される請求項3記載のポリヌクレオチド。 - 発現宿主においてポリペプチドの生成を指図する1又は複数の制御配列に作用可能に連結される請求項4に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体。
- 請求項5記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項5に記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)その野生型において、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で前記ポリペプチドを生成することができるシトロバクター・ブラキ(Citrobacter braakii)の細胞、又は前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収する、
ことを含んで成る方法。 - 請求項1又は2記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換されており、そして請求項1又は2記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換された、植物、植物部分若しくは植物細胞、又はトランスジェニック非ヒト動物、或いは生成物又はその要素。
- 動物飼料への少なくとも1つの請求項1又は2記載のポリペプチドの使用。
- 動物飼料への使用のための組成物の調製における少なくとも1つの請求項1又は2記載のポリペプチドの使用。
- 少なくとも1つの請求項1又は2記載のポリペプチドが飼料に添加される、動物飼料の栄養価値を改良するための方法。
- (a)少なくとも1つの請求項1又は2記載のポリペプチド;
(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン;
(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン;及び/又は
(d)少なくとも1つの微量金属;
を含んで成る動物飼料添加剤。 - 少なくとも1つのアミラーゼ、少なくとも1つの追加のフィターゼ、少なくとも1つのキシラナーゼ、少なくとも1つのガラクターゼ、少なくとも1つのα−ガラクトシダーゼ、少なくとも1つのプロテアーゼ、少なくとも1つのホスホリパーゼ、及び/又は少なくとも1つのβ−グルカナーゼをさらに含んで成る請求項13記載の動物飼料添加剤。
- 50〜800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そして少なくとも1つの請求項1又は2記載のポリペプチドを含んで成る動物飼料組成物。
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