ES2220114T3 - Variantes de proteinas poco alergenicas. - Google Patents

Abstract

Método para seleccionar una variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con una proteína precursora, que incluye las etapas de: selección de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios con anticuerpos preparados contra cualquier proteína de interés, secuenciación de la secuencia de aminoácidos de los péptidos de unión a anticuerpos, o la secuencia de ADN que codifica los péptidos de unión a anticuerpos, identificación de modelos de epítopos por alineación de secuencias de la secuencia peptídica reactiva, localización de modelos de epítopos estructurales en la estructura tridimensional de la proteína precursora, definición de una región de epítopos que incluye aminoácidos situados a una distancia de 5 A de los aminoácidos del epítopo, cambio de los modelos de epítopos localizados, o los aminoácidos que definen la región de epítopos de la proteína precursora, mediante mutaciones por ingeniería genética de una secuencia de ADN que codifica la proteína precursora sin perjudicar la funcionalidad de la proteína, usando la base de datos de epítopos emergentes para eliminar las sustituciones de aminoácidos que crean nuevos modelos de epítopos o duplican los ya existentes, introducción de la secuencia de ADN mutada en un huésped adecuado, cultivo de dicho huésped y expresión de la variante de proteína, y evaluación de la inmunogenicidad de la variante de proteína usando la proteína precursora como referencia.

Description

Variantes de proteínas poco alergénicas.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar una variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con la proteína precursora.

Antecedentes de la invención

Un número cada vez mayor de proteínas, incluyendo las enzimas, son producidas industrialmente para su uso en diversas industrias, productos del hogar y medicamentos. Al tratarse de proteínas, es posible que estimulen una respuesta inmunológica en el ser humano y en animales, incluyendo una respuesta alérgica.

En el presente contexto los términos respuesta alérgica, alergia, alergénico y alergenicidad se usan según sus definiciones usuales, es decir, para describir la reacción debida a las respuestas inmunes, siendo el anticuerpo más habitual el IgE y en menos ocasiones el IgG_{4}, y las enfermedades debidas a esta respuesta inmune. Las enfermedades alérgicas comprenden urticaria, fiebre del heno, asma y dermatitis atópica. Pueden incluso evolucionar a un shock anafiláctico.

La prevención de la alergia en individuos susceptibles es, en consecuencia, un área de investigación de gran importancia. Dependiendo de la aplicación, los individuos son sensibilizados a los respectivos alérgenos por inhalación, contacto directo con la piel y los ojos o inyección. El mecanismo general que hay detrás de una respuesta alérgica se divide en una fase de sensibilización y una fase sintomática. La fase de sensibilización implica una primera exposición de un individuo a un alérgeno. Este acto activa los linfocitos T y B específicos y favorece la producción de anticuerpos de inmunoglobulina E específicos al alérgeno (IgE) . Estos anticuerpos IgE facilitan eventualmente la captura y presentación del alérgeno a los linfocitos T en el inicio de la fase sintomática. Esta fase se inicia con una segunda exposición al mismo antígeno o a un antígeno parecido. Los anticuerpos IgE específicos se unen a receptores IgE específicos en los mastocitos y basófilos, entre otros, y capturan al mismo tiempo el alérgeno. La naturaleza policlonal de este proceso ocasiona una conexión y un reagrupamiento de los receptores IgE, y posteriormente la activación de los mastocitos y los basófilos. Esta activación desencadena la liberación de varios mediadores químicos implicados en las reacciones de fase temprana y tardía de la fase sintomática de la alergia.

En el presente contexto, los anticuerpos se denominan de la forma habitual, es decir la inmunoglobulina E es IgE, etc.

Se han llevado a cabo varios intentos para reducir la inmunogenicidad de polipéptidos y proteínas. Se ha descubierto que pequeños cambios en un epítopo pueden influir en su unión a un anticuerpo. Esto puede dar como resultado una importancia menor de dicho epítopo, convirtiéndolo quizá de un epítopo de alta afinidad a un epítopo de baja afinidad, o quizá incluso puede dar como resultado la pérdida del epítopo, es decir, que el epítopo no pueda unirse suficientemente a un anticuerpo para suscitar una respuesta inmune.

En el documento WO92/10755 se describe un método para modificar proteínas con el objetivo de obtener variantes menos inmunogénicas. Las variantes de proteína construidas de forma aleatoria que revelan un enlace reducido de los anticuerpos a la enzima precursora, en comparación con la propia enzima precursora, son seleccionadas para su medición en modelos animales en términos de alergenicidad. Finalmente, se valora si la reducción de la inmunogenicidad se debe a una eliminación real de un epítopo o una reducción en la afinidad de los anticuerpos. Un inconveniente de este planteamiento es su carácter "prueba y error", lo cual supone un proceso largo y caro. Además, no se proporciona información sobre el epítopo como tal, lo cual implica que la información obtenida para una proteína puede no aplicarse en otra, puesto que el limitado número de animales implicados no permite la identificación de modelos de epítopos. S.C. Wiliams et al, J. Immunol. Meth., 213, págs. 1-17, 1998, revela la identificación de epítopos en betalactoglobulina reconocidos por anticuerpos policlonales usando la visualización de fagos y PEPSCAN. Moola et al. Biochem. J. (Inglaterra), 302, págs 921-927, 1994, se refiere a la antigenicidad de Erwinia chrisantemi L-asparainasa sometida a mutagénesis dirigida.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un método de selección de una variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con la proteína precursora, que incluye las etapas de:

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selección de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios con anticuerpos preparados contra cualquier proteína de interés,

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secuenciación de la secuencia de aminoácidos de los péptidos de unión al anticuerpo, o de la secuencia de ADN que codifica los péptidos de unión al anticuerpo,

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identificación de los modelos de epítopos mediante la alineación secuencial de la secuencia peptídica reactiva,

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localización de los modelos de epítopos en la estructura primaria y tridimensional de la proteína precursora,

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definición de una región de epítopos incluyendo los aminoácidos situados a una distancia de 5 A de los aminoácidos del epítopo,

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cambio de los modelos de epítopos localizados, o de los aminoácidos que definen la región de los epítopos de la proteína precursora, mediante mutaciones por ingeniería genética de una secuencia de ADN que codifica la proteína precursora, sin perjudicar la funcionalidad de la proteína, usando la base de datos de epítopos emergentes para eliminar las sustituciones de aminoácidos que crean nuevos modelos de epítopos o duplican los ya existentes,

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introducción de la secuencia de ADN mutada en un huésped adecuado, cultivo de dicho huésped y expresión de la variante de proteína, y

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evaluación de la inmunogenicidad de la variante de la proteína usando la proteína precursora como referencia.

La secuencia de aminoácidos de la variante de proteína difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora con respecto a al menos un modelo de epítopo de la proteína precursora, de manera que la inmunogenicidad de la variante de proteína se reduce en comparación con la inmunogenicidad de la proteína precursora. Preferiblemente, la inmunogenicidad de la variante de proteína de una enzima detergente es al menos 10 veces inferior a la inmunogenicidad de la proteína precursora, preferiblemente 25 veces inferior a la inmunogenicidad de la proteína precursora. En particular para una variante de proteína usada en productos para el cuidado personal, la inmunogenicidad es preferiblemente 100 veces inferior, más preferiblemente 200 veces inferior, incluso más preferiblemente 500 veces inferior a la inmunogenicidad de la proteína precursora. Además,para productos alimenticios y fármacos, la inmunogenicidad es preferiblemente 1000 veces inferior a la inmunogenicidad de la proteína precursora. Normalmente, una inmunogenicidad reducida como mucho 50.000 veces es suficiente para cualquier objetivo de una aplicación de la proteína. En este contexto la inmunogenicidad es evaluada según el potencial de la proteína para inducir una respuesta de anticuerpo, centrándose en las respuestas IgE.

La reducción de la inmunogenicidad en el contexto anterior se define por las diferencias observadas entre la cinética obtenida con diferentes dosis de la proteína precursora en comparación con las variantes en investigación. En el presente estudio, el efecto de la ingeniería de proteínas guiada por epítopos es evaluado por estudios cinéticos que usan una dosis individual de la proteína en investigación.

La inmunogenicidad de la variante de proteína es medida en ensayos con animales, en los cuales los animales son inmunizados con la variante de proteína y se mide la respuesta inmune. En la presente invención la inmunogenicidad es reducida al menos 100 veces en comparación con la inmunogenicidad de la proteína precursora, preferiblemente reducida 200 veces, más preferiblemente 500 veces.

No obstante, los presentes inventores han demostrado que el rendimiento según el ensayo competitivo ELISA concuerda aproximadamente con las respuestas inmunogénicas medidas en los ensayos con animales.

Para obtener una reducción útil de la inmunogenicidad de una proteína, la inmunogenicidad de la variante de proteína debe ser reducida por lo menos por debajo del 75%, preferiblemente por debajo del 50%, de la inmunogenicidad de la proteína precursora, medida según el rendimiento en el ensayo competitivo ELISA, suponiendo que el valor para la inmunogenicidad de la proteína precursora se establece en el 100%. Cuando la inmunogenicidad es inferior al 50% de la inmunogenicidad de la proteína precursora, la variante de proteína es prácticamente no alérgica, es decir, no se podrá medir ninguna respuesta IgE en los ensayos animales.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la estructura 3D de Savinase y Lipoprime con la localización de 4 epítopos y sus regiones de epítopos correspondientes.

La figura 2 muestra los datos del ensayo competitivo ELISA.

Descripción detallada de la invención

Mediante el término "variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con la proteína precursora" se entiende una variante de proteína que difiere de la proteína precursora en uno o más aminoácidos, por lo cual se reduce la inmunogenicidad de la variante. La reducción de la inmunogenicidad puede ser confirmada mediante la evaluación de la capacidad de la variante de proteína para suscitar una respuesta IgE.

En el presente contexto, el término "proteína" incluye oligopéptidos, polipéptidos, así como proteínas como tales.

El paquete de visualización puede ser, por ejemplo, derivado de virus bacterianos. Un paquete de visualización preferido puede ser un sistema de visualización de fagos. En un sistema de visualización de fagos, una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos deseada es incorporada en un gen de fago que codifica una proteína visualizada en la superficie del fago. Así, el fago hará y visualizará la proteína híbrida en su superficie, donde ésta podrá interactuar con agentes objetivo específicos. Suponiendo que a cada fago se le da una secuencia específica de una longitud determinada, una biblioteca de visualización de fagos media puede expresar 10^{8} - 10^{12} secuencias aleatorias diferentes. Si la secuencia incorporada es un epítopo, el agente objetivo podría ser por ejemplo un anticuerpo específico del epítopo. Por tanto, es posible seleccionar fagos específicos de un gran número de fagos, cada uno expresando su propia proteína híbrida.

En una forma de realización preferida, la longitud del péptido incorporado es de 9 aminoácidos.

Los anticuerpos usados para reaccionar con el paquete de visualización son preferiblemente anticuerpos IgE, para asegurar que los epítopos identificados son epítopos IgE, es decir, epítopos que inducen y se unen al IgE. En una forma de realización preferida, los anticuerpos son anticuerpos policlonales, opcionalmente anticuerpos monoespecíficos.

Mediante el término "anticuerpos monoespecíficos" se entiende anticuerpos policlonales aislados según su especificidad para un determinado modelo de epítopo. Dichos anticuerpos monoespecíficos sólo se unirán a un modelo de epítopo, pero más a menudo serán producidos por un número de células de producción de anticuerpos, que reconocen modelos de epítopos similares, siendo de este modo policlonales.

Para los objetivos de la presente invención se prefieren anticuerpos policlonales con el fin de obtener un conocimiento más amplio sobre los epítopos de una proteína.

Además, el anticuerpo IgE normalmente se encuentra en concentraciones muy bajas en suero. La concentración normal de anticuerpos IgE en suero es inferior a 10^{-3} g/l, en comparación con la concentración normal de IgG de 12 g/l. En consecuencia, en la práctica es muy difícil obtener una biblioteca de anticuerpos monoclonales que cubra todos los modelos de epítopos posibles en una proteína intacta. No obstante, después de una purificación de afinidad de los anticuerpos IgE de suero preparados contra la proteína, es posible obtener anticuerpos IgE policlonales o monoespecíficos adecuados para la presente invención.

En general, las partes de una proteína reconocidas y unidas por los anticuerpos, es decir, los epítopos, pueden ser lineales o estructurales. Por epítopo lineal se entiende que los aminoácidos del epítopo están colocados secuencialmente en la estructura primaria de la proteína. Los epítopos estructurales difieren de los epítopos lineales en que no aparecen hasta que se forma la estructura tridimensional de la proteína. Un epítopo estructural está compuesto por secuencias de aminoácidos de distintas partes de la estructura primaria de la proteína, que sólo se juntan tras el pliegue de la secuencia de la proteína que forma las estructuras secundaria y/o terciaria, formando de este modo una superficie contigua del epítopo. Mediante el término "modelo de epítopo" o "motivo de epítopo" se entiende la superficie constitutiva del epítopo de la proteína, independientemente de si el epítopo es lineal o estructural. Algunos epítopos son más importantes (epítopos de alta afinidad) que otros (baja afinidad) con respecto a la afinidad de enlace.

Una proteína puede tener más de un epítopo. A partir de modelos teóricos se cree que las proteínas con un tamaño molecular de 30.000 Daltons pueden contener hasta 6 regiones de epítopos en su superficie. El número total de epítopos reales, no obstante, debe ser mucho más alto. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de 9-meros proporciona una unión por lo menos a 5 anticuerpos monoclonales diferentes, considerando 5-meros como el tamaño de epítopo mínimo.

Se ha descubierto que algunos de los epítopos que se unen al anticuerpo IgG1 no se unen a los anticuerpos IgE, y viceversa. En consecuencia, los epítopos pueden ser más o menos específicos para clases específicas de anticuerpos.

Más del 80% de los epítopos de IgE se consideran epítopos estructurales, de tal manera que los epítopos pueden ser destruidos mediante el calentamiento de la proteína, el uso de detergentes u otros procedimientos que implican su desnaturalización. Este porcentaje puede variar para proteínas diferentes. Consecuentemente, el uso de fragmentos superpuestos de péptidos que cubren toda la proteína para la identificación de los epítopos de IgE no es aplicable. No obstante, los presentes inventores consideran que mediante el uso de pequeñas secuencias de aminoácidos en un paquete de visualización es posible identificar modelos de epítopos lineales así como estructurales, debido al carácter aleatorio de la secuencia de los oligopéptidos expresados.

Los péptidos presentados en los paquetes de visualización e identificados por los anticuerpos son posteriormente secuenciados, o su secuencia es derivada mediante la traducción de la correspondiente secuencia de ADN. Ambas secuencias se obtienen mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica de la ingeniería genética.

Los modelos de epítopos son identificados mediante la comparación de las secuencias de los péptidos unidos por el anticuerpo. Posteriormente, los modelos identificados son localizados en la estructura primaria así como en la 5 estructura tridimensional de la proteína precursora, y eventualmente en cualquier proteína de interés. Dentro de los modelos de epítopos algunos aminoácidos pueden ser altamente conservadores, denominados aminoácidos de anclaje. Los aminoácidos de anclaje serán recurrentes en todos los péptidos unidos por anticuerpos monoespecíficos, y definen el modelo de epítopo.

Es muy importante que la secuencia de aminoácidos de los péptidos presentada por los paquetes de visualización sea lo suficientemente larga para presentar una parte significativa del epítopo que debe identificarse. En una forma de realización preferida de la invención, los péptidos de la biblioteca de paquetes de visualización de péptidos son oligopéptidos que tienen de 5 a 25 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 aminoácidos, como 9 aminoácidos. La complejidad de la biblioteca de paquetes, que es el número de paquetes de visualización necesarios para obtener una representación adecuada de todos los epítopos posibles, puede calcularse en base a la longitud estimada del epítopo que debe identificarse, como en la siguiente fórmula:

Número de paquetes = 20^{n}, siendo n el número de residuos en el epítopo.

Las acciones típicas requeridas para la construcción de una estructura modelo son: alineación de secuencias homólogas para las que existen estructuras tridimensionales, definición de Regiones Estructuralmente Conservadas (SCR), asignación de coordenadas a las SCR, búsqueda de fragmentos/bucles estructurales en bases de datos de estructuras para reemplazar las Regiones Variables, asignación de coordenadas a estas regiones, y refinamiento estructural por minimización de energía. Se sabe que las regiones que contienen insertos grandes (\geq3 residuos) en relación con las estructuras tridimensionales conocidas son bastante difíciles de modelar, y las predicciones estructurales deben ser consideradas cuidadosamente.

Una vez obtenida la estructura tridimensional del polipéptido en cuestión, o un modelo de la estructura basado en la homología con estructuras conocidas, esta estructura sirve como un requisito previo esencial para el cumplimiento del método descrito más abajo.

Una vez identificado el epitopo o epítopos, se puede producir una variante de proteína que exhiba una inmunogenicidad reducida cambiando el modelo de epítopo identificado en la proteína precursora por mutación y/o 5 ingeniería genética de una secuencia de ADN que codifica la proteína precursora.

El epítopo identificado puede ser cambiado sustituyendo al menos un aminoácido de la región del epítopo. En una forma de realización preferida, se cambia al menos un aminoácido de anclaje. El cambio se hará a menudo sustituyendo un aminoácido de diferente tamaño, hidrofilicidad y/o polaridad, por ejemplo un aminoácido pequeño versus un aminoácido grande, un aminoácido hidrofílico versus un aminoácido hidrofóbico, un aminoácido polar versus un aminoácido no polar y un aminoácido básico versus un aminoácido ácido.

Otros cambios pueden ser la adición o eliminación de al menos un aminoácido del epítopo, preferiblemente la eliminación de un aminoácido de anclaje. Además, un modelo de epítopo puede ser cambiado sustituyendo algunos aminoácidos, y eliminando/añadiendo otros.

Sustituciones/inserciones para la conjugación covalente posterior a los aminoácidos en la región del epítopo

Qué aminoácidos deben ser sustituidos y/o insertados depende en principio de la química de acoplamiento que se vaya a aplicar. La química para la preparación de bioconjugados covalentes puede encontrarse en "Bioconjugate Techniques", Hermanson, G.T. (1996), Academic Press Inc.

Es preferible conjugar polímeros activados a aminoácidos en la región del epítopo.

Es preferible hacer sustituciones conservadoras en el polipéptido cuando el polipéptido tiene que ser conjugado, puesto que las sustituciones conservadoras aseguran que el impacto de la sustitución en la estructura del polipéptido sea limitado.

En el caso de proporcionar grupos amino adicionales, esto se puede llevar a cabo mediante la sustitución de Arginina a Lisina, ambos residuos estando cargados positivamente, pero sólo la Lisina teniendo un grupo amino libre adecuado como grupo de fijación.

En el caso de proporcionar grupos de ácido carboxílico adicionales, la substitución conservadora puede ser por ejemplo una sustitución de Asparraguina a Ácido aspártico o de Glutamina a Ácido glutámico. Estos residuos se parecen en tamaño y forma, excepto los grupos carboxílicos que están presentes en los residuos ácidos.

En el caso de proporcionar grupos SH, la substitución conservadora puede hacerse por sustitución de Treonina o Serina a Cisteína.

Activación de polímeros

Si las moléculas poliméricas que van a ser conjugadas con el polipéptido en cuestión no son activas, deben ser activadas mediante el uso de una técnica adecuada. Se contempla igualmente, según la invención, la posibilidad de acoplar las moléculas poliméricas al polipéptido a través de un enlace. Los enlaces adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia.

Los métodos y la química para la activación de moléculas poliméricas, así como para la conjugación de polipéptidos, se describen extensamente en la literatura. Los métodos usados de forma común para la activación de polímeros insolubles comprenden la activación de grupos funcionales con bromuro cianógeno, periodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, sulfonil haluros, triclorotriazina, etc. (ver R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; D S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). Algunos de los métodos se refieren a la activación de polímeros insolubles, pero también son aplicables a la activación de polímeros solubles p. ej. periodato, triclorotriazina, sulfonilhaluros, divinilsulfona, carbodiimida etc. Los grupos funcionales son amino, hidroxilo, tiol, carboxilo, aldehído o sulfidril en el polímero, y el grupo de fijación elegido en la proteína debe ser tenido en cuenta en la elección de la química de activación y conjugación, que normalmente consiste en i) activación del polímero, ii) conjugación y iii) bloqueo de los grupos activos residuales.

A continuación se describirán brevemente varios métodos adecuados de activación de polímeros. No obstante, debe entenderse que también pueden usarse otros métodos.

El acoplamiento de moléculas poliméricas a grupos de ácidos libres de polipéptidos puede realizarse con la ayuda de diimida y, por ejemplo, amino-PEG o hidracino-PEG (Pollak et al., (1976), J. Amr. Chem. Soc., 98, 289-291) o diazoacetato/amida (Wong et al., (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press).

El acoplamiento de moléculas poliméricas a grupos hidroxi es generalmente muy difícil, puesto que debe realizarse en agua. Normalmente la hidrólisis predomina sobre la reacción con los grupos hidroxilo.

El acoplamiento de moléculas poliméricas a grupos sulfhidrilo libres puede lograrse con grupos especiales, como maleimido u orto-piridil disulfuro. También la vinilsulfona (patente US no. 5,414,135, (1995), Snow et al.) tiene preferencia por los grupos sulfhidrilo, pero no es tan selectiva como los otros mencionados.

Los residuos accesibles de Arginina en la cadena polipeptídica pueden ser el objetivo de grupos que comprenden dos grupos carbonilo vecinos.

También pueden resultar útiles las técnicas que implican el acoplamiento electrofílico de PEG activados a grupos amino de Lisinas. Muchos de los grupos de salida habituales para los alcoholes originan un enlace de amina. Por ejemplo, se pueden usar sulfonatos de alquilo, como tresilatos (Nilsson et al., (1984), Methods in Enzymology vol. 104, Jacoby, W. B., Ed., Academic Press: Orlando, p. 56-66; Nilsson et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135; Mosbach, K., Ed.; Academic Press: Orlando, págs. 65-79; Scouten et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135, Mosbach, K., Ed., Academic Press: Orlando, 1987; págs 79-84; Crossland et al., (1971), J. Amr. Chem. Soc. 1971, 93, págs. 4217-4219), mesilatos (Harris, (1985), supra; Harris et al., (1984), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, págs. 341-352), sulfonatos de arilo como tosilatos, y sulfonatos de para-nitrobenzeno.

Los sulfonil cloruros orgánicos, p. ej. Tresil cloruro, convierten eficazmente los grupos hidroxi de diferentes polímeros, p. ej. PEG, en buenos grupos de salida (sulfonatos) que, cuando son hechos reaccionar con nucleófilos, como los grupos amino en los polipéptidos, permiten la formación de enlaces estables entre el polímero y el polipéptido. Además de los buenos rendimientos de la conjugación, las condiciones de reacción son en general suaves (pH neutro o ligeramente alcalino, para evitar la desnaturalización y poca o ninguna ruptura de la actividad), y satisfacen los requisitos no destructivos del polipéptido.

El tosilato es más reactivo que el mesilato pero también más inestable al descomponerse en PEG, dioxano y ácido sulfónico (Zalipski, (1995), Bioconjugate Chem., 6, 150-165). También se pueden usar epóxidos para crear enlaces de amina, pero son mucho menos reactivos que los grupos anteriormente mencionados.

La conversión de PEG en un cloroformato con fosgeno ocasiona la aparición de enlaces de carbamato con Lisinas. Este aspecto puede ser tratado en muchas variantes sustituyendo el cloro por N-hidroxi succinimida (patente US no. 5,122,614, (1992); Zalipsky et al., (1992), Biotechnol. Appl. Biochem., 15, p. 100-114; Monfardini et al., (1995), Bioconjugate Chem., 6, 62-69), por imidazola (Allen et al., (1991), Carbohydr. Res., 213, pp 309-319), por para-nitrofenol, DMAP (EP 632 082 A1, (1993), Looze, Y.), etc. Los derivados se hacen normalmente reaccionando el cloroformato con el grupo de salida deseado. Todos estos grupos originan enlaces de carbamato con el péptido.

Además, se pueden emplear isocianatos e isotiocianatos que producen ureas y tioureas, respectivamente.

Se pueden obtener amidas a partir de ácidos PEG usando los mismos grupos de salida mencionados anteriormente, y imid tronas cíclicas (patente US no. 5,349,001, (1994), Greenwald et al.). La reactividad de estos compuestos es altísima pero puede acelerar la hidrólisis.

El succinato PEG realizado a partir de la reacción con anhídrido succínico también puede ser usado. El grupo éster comprendido aquí hace el conjugado mucho más susceptible a la hidrólisis (patente US no. 5,122,614, (1992), Zalipsky). Este grupo puede ser activado con N-hidroxi succinimida.

Además, se puede introducir un enlace especial. El más antiguo es cloruro de cianuro (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; Patente US no. 4,179,337, (1979), Davis et al.; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378.

El acoplamiento de PEG a una amina aromática, seguido por diazotación, produce una sal de diazonio muy reactiva que puede ser hecha reaccionar con un péptido in situ. Un enlace de amida puede también obtenerse reaccionando una azlactona derivada de PEG (Patente US no. 5,321,095, (1994), Greenwald, R. B.) introduciendo así un enlace de amida adicional.

Como algunos péptidos no comprenden muchas Lisinas, puede ser ventajoso fijar más de un PEG a la misma Lisina. Esto puedo hacerse p. ej. usando 1,3-diamino-2-propanol.

Los PEG también pueden ser fijados a los grupos amino de la enzima con enlaces de carbamato (WO 95/11924, Greenwald et al.). Los residuos de Lisina también pueden usarse como esqueleto.

La técnica de acoplamiento usada en los ejemplos es la técnica de conjugación de N-succinimidil carbonato descrita en WO 90/13590 (Enzon).

Conjugación de moléculas poliméricas para la sustitución y/o inserción de variantes para la conjugación covalente

Sólo las sustituciones y/o inserciones que proporcionan conjugados de polipéptidos con respuesta inmune reducida al ser evaluados en modelos animales están dentro del concepto de la presente invención.

Las mutaciones realizadas pueden realizarse mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, como mutagénesis dirigida (ver, p. ej., Sambrook et al. (1989), Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY.

Una descripción general de sustitución de nucleótidos puede encontrarse en p. ej. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2, p. 95-107.

La secuencia de ADN anteriormente mencionada puede ser producida por cualquier técnica adecuada conocida por los expertos en la técnica de la ingeniería genética. La secuencia de ADN es introducida en un huésped adecuado, que es cultivado, y la variante de proteína es expresada.

El riesgo asociado al uso de la ingeniería de proteínas con el objetivo de eliminar epítopos, es que se pueden crear nuevos epítopos, o que los epítopos existentes pueden duplicarse. Para reducir este riesgo, las mutaciones planificadas en una posición dada fueron colocadas en una estructura tridimensional de la proteína de interés, y la constelación de aminoácidos emergente fue examinada en la base de datos de epítopos. Esta invención prueba que el riesgo de mutaciones puede ser identificado por este procedimiento, reduciendo de este modo el número de mutaciones posibles por posición.

Es un hecho bien establecido que los aminoácidos que rodean los epítopos de las células B y T pueden influir en la unión de los anticuerpos o los receptores de células T con el ligando. Para anticiparse a esta posibilidad, se definió una región de epítopos en la estructura tridimensional de la proteína de interés.

Resulta de gran importancia el hecho de que los cambios del epítopo o los epítopos no interfieran ni perjudiquen la funcionalidad de la proteína precursora. En consecuencia, los cambios no deben cambiar significativamente la estructura secundaria de la proteína. Mediante modelización por ordenador es posible evaluar si los cambios realizados en uno o más epítopos interferirán sustancialmente en la funcionalidad de la proteína. Mediante el término "funcionalidad" se entiende la función normal de la proteína, como la actividad enzimática, la termoestabilidad, la estabilidad química y la glicosilación.

En una forma de realización preferida de la invención, más de un residuo aminoácido es sustituido, añadido o eliminado, dichos aminoácidos preferiblemente estando localizados en regiones de epítopos diferentes. En este caso, puede ser difícil de evaluar a priori como de bien se mantiene la funcionalidad de la proteína, mientras se reduce la antigenicidad, la inmunogenicidad y/o la alergenicidad, especialmente debido a que el número posible de combinaciones de mutaciones es muy grande, incluso para un número pequeño de mutaciones. En este caso, será una ventaja establecer una biblioteca de mutantes diversificados, cada uno teniendo uno o más aminoácidos cambiados introducidos, y seleccionando aquellas variantes que muestren un buen mantenimiento de la función y al mismo tiempo una buena reducción de la antigenicidad. En el caso de la proteasa, ésta puede ser evaluada valorando las variantes segregadas según su actividad enzimática y según su unión al antígeno (p. ej. mediante ELISA competitivo) (tal y como se describe abajo en la sección experimental). El alcance de estas formas de realización de la invención no se limita de ningún modo a la proteasa, que sirve tan sólo para proporcionar un ejemplo. Una biblioteca diversificada puede ser establecida mediante una serie de técnicas conocidas por los expertos en la técnica (Reetz MT; Jaeger KE, en Biocatalysis - from Discovery to Application editado por Fessner WD, Vol. 200, págs. 31-57 (1999); Stemmer, Nature, vol. 370, p.389-391, 1994; Zhao y Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 94, págs. 7997-8000, 1997; o Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 95, págs. 5511-5515, 1998). En una forma de realización más preferida, las sustituciones se consiguen por un método que comprende las siguientes fases: 1) catalogación de una serie de sustituciones, adiciones y/o eliminaciones conteniendo diferentes regiones de epítopos, 2) diseño de una biblioteca que introduce un subconjunto aleatorio de estos cambios en la secuencia de aminoácidos en el gen objetivo, p. ej. por mutagénesis aleatoria, 3) expresión de la biblioteca, y selección de las variantes preferidas. En la forma de realización más preferida, este método se complementa con turnos adicionales de selección y/o redistribución en familias de los valores principales del primer turno de selección (J.E. Ness, et al, Nature Biotechnology, vol. 17, págs. 893-896, 1999) y/o la combinación con otros métodos de reducción de la alergenicidad por medios genéticos (como los que se describen en WO 92/10755).

La reducción de la inmunogenicidad puede ser confirmada mediante un ensayo de la capacidad de la variante de proteína para suscitar una respuesta IgE en una prueba con animales. El animal de la prueba puede ser cualquier animal adecuado. Preferiblemente, el animal de la prueba puede ser una rata, como las ratas Brown Norway, o un ratón, como las cepas BaBallb/c, BDF1 y CB6F1. El ensayo con animales puede realizarse como se describe a
continuación.

La siguiente descripción muestra los procesos implicados en la determinación de la inmunogenicidad en animales de prueba. En el ejemplo los 5 animales de prueba son ratas Brown Norway.

Materiales Moléculas de una variante de proteína

Reactivos ELISA:

Ig de cerdo anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano (Dako, DK, P217, dilución 1:1000).

IgE de rata anti-ratón (Serotec MCA419; dilución 1:100).

IgE de ratón anti-rata (Serotec MCA193; dilución 1:200).

Anticuerpo monoclónico IgG1 de ratón anti-rata marcado con biotina (Zymed 03-9140; dilución 1:1000)

Anticuerpo monoclónico IgG1 de rata anti-ratón marcado con biotina (Serotec MCA336B; dilución 1:2000)

Peroxidasa de rábano estreptavidina (Kirkeg\ring{a}rd & Perry 14-30-00; dilución 1:1000).

Tampones y Soluciones:

- PBS (pH 7.2 (1 litro))

NaCI

\hskip1,4cm

8.00 g

KCI

\hskip1,6cm

0.20 g

K_{2}HPO_{4}

\hskip1cm

1.04 g

KH_{2}PO_{4}

\hskip1cm

0.32 g

- tampón de lavado PBS, 0.05% (v/v) Tween 20

- tampón de bloqueo PBS, 2% (p/v) Leche desnatada en polvo

- tampón de dilución PBS, 0.05% (v/v) Tween 20, 0.5% (p/v) Leche desnatada en polvo

- tampón de citrato (0.1 M, pH 5.0-5.2 (1 litro))

NaCitrato

\hskip1cm

20.60 g

Acido cítrico

\hskip0,7cm

6.30 g

- solución de parada (tampón DMG)

- Borato de sodio, borax (Sigma)

- Ácido 3,3-dimetil glutárico (Sigma)

- CaCl_{2} (Sigma)

- Tween 20: poli oxietileno sorbitán mono laurato (Merck cat no. 822184)

- N-Hidroxi succinimida (Fluka art. 56480))

- Fosgeno (Fluka art. 79380)

- Lactosa (Merck 7656)

- PMSF (fenil metil sulfonil floururo) de Sigma

- Succinil-Alanina-Alanina-Prolina-Fenilalanina-paranitro-anilida (Suc-AAPF-pNP) Sigma no. S-7388, PM 624.6 g/mol.

- mPEG (Fluka)

Sustrato colorante:

OPD: o-fenileno-diamina, (Kementec cat no. 4260)

Animales de prueba:

Ratones hembra Balb/C (aproximadamente 20 gramos) adquiridos de Bomholdtgaard Ry, Dinamarca.

Equipamiento:

XCEL II (Novex)

Lector ELISA (UVmax, Molecular Devices)

HPLC (Waters)

PFLC (Pharmacia)

Columna Superdex-75, Mono-Q, mono S de Pharmacia, SW.

SLT: Fotometer de SLT LabInstruments

Cromatógrafo de exclusión por tamaño (Spherogel TSK-G2000 SW).

Cromatógrafo de exclusión por tamaño (Superdex 200, Pharmacia, SW)

Célula de amicón

Métodos Inmunización subcutánea (SC) de ratones Balb/C

Para la administración SC de moléculas, se depositan 0.05 ml de una solución de las moléculas. Los animales de prueba son ratones Balb/C en grupos de 10. El peso en el momento de inicio es superior a 20 gramos.

Procedimiento ELISA para determinar las concentraciones relativas de anticuerpos IgE en ratones Balb/C

Se utiliza un sándwich ELISA de tres capas para determinar las concentraciones relativas de anticuerpos IgE específicos en suero.

1)

Revestimiento de la placa Elisa con 10 mg de tampón 1 de IgE de rata anti-ratón (50 microL/pocillo). Incubar durante una noche a 4°C.

2)

Vacío de las placas y bloqueo con un tampón de bloqueo durante al menos 1/2 hora a temperatura ambiente (200 microL/pocillo). Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces con un tampón de lavado.

3)

Incubación con sueros de ratón (50 microL/pocillo), empezando por uno no diluido y continuando con diluciones dobles. Mantener algunos pocillos libres sólo para el tampón 4 (blanco). Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces con un tampón de lavado.

4)

Dilución de la enzima en un tampón de dilución hasta la concentración de proteína apropiada. Incubar 50 microL/pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en un tampón de lavado.

5)

Dilución del suero de antisuero específico de anti-enzima policlonal (plg) para detectar el anticuerpo enlazado en el tampón de dilución. Incubar 50 microl/pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en un tampón de lavado.

6)

Dilución del anti-plg-anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano en un tampón de dilución. Incubar 50 microL/pocillo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agitar suavemente. Lavar las placas 3 veces en un tampón de lavado.

7)

Mezcla de 0.6 mg de ODP/ml + 0.4 microL de H_{2}O_{2}/ml en un tampón de substrato. La solución se prepara justo antes del uso. Incubar durante 10 minutos. 50 microL/pocillo.

8)

Para parar la reacción, añadir 50 microL de solución de parada/pocillo.

9)

Lectura de las placas a 492 nm con 620 nm como referencia.

Determinación del peso molecular

Se lleva a cabo una separación electroforética de proteínas por métodos estándares usando geles de poliacrilamida SDS en gradiente 4-20% (Novex). Las proteínas fueron detectadas por coloración en plata. El peso molecular fue medido en relación a la movilidad de los estándares de peso molecular de amplia gama Mark-12® de Novex.

Actividad proteasa Análisis con Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa

Las proteasas disocian el enlace entre el péptido y la p-nitroanilina dando un color amarillo visible absorbente a 405 nm.

Tampón: p. ej. tampón Britton y Robinson pH 8.3

Substrato: 100 mg de suc-AAPF-pNa se disuelven en 1 ml de dimetilsulfóxido

(DMSO). Se diluyen 100 \muL en 10 ml con tampón Britton y Robinson.

Análisis

El substrato y la solución de proteasa se mezcla y la absorbencia se controla a 405 nm como una función del tiempo y ABS_{405} nm/minutos. La temperatura debería ser controlada (20-50°C dependiendo de la proteasa). Ésta es una medida de la actividad proteasa en la muestra.

La proteína precursora puede ser cualquier proteína, como cualquier proteína de origen natural así como cualquier variante de las mismas, opcionalmente una variante con el fin de obtener una mejor funcionalidad de la proteína en cuestión.

Polipéptidos farmacéuticos

El término "polipéptidos farmacéuticos" se define como polipéptidos, incluyendo péptidos, como hormonas peptídicas, proteínas y/o enzimas, que son fisiológicamente activos cuando se introducen en el sistema circulatorio del cuerpo de seres humanos y/o animales.

Los polipéptidos farmacéuticos son potencialmente inmunogénicos cuando son introducidos en el sistema circulatorio.

Ejemplos de "polipéptidos farmacéuticos" tal como se contemplan en la invención comprenden insulina, ACTH, glucagón, somatostatina, somatotropina, timosina, hormona paratiroidea, hormonas pigmentarias, somatomedina, eritropoyetina, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, hormona estimuladora del tiroides, relaxina, interferón, trombopoietina (TPO) y prolactina.

No obstante, las proteínas son usadas preferiblemente en la industria, en productos del hogar y/o en medicamentos, por ejemplo, las proteínas usadas en productos para el cuidado personal (por ejemplo champús; jabones; lociones de piel, manos y cara; cremas para piel, manos y cara; tintes de pelo; pasta dental), alimentos (por ejemplo en la industria panadera), detergentes y fármacos.

En una forma de realización de la invención, la proteína es una enzima, como glicosil hidrolasas, carbohidrasas, peroxidasas, proteasas, lipasas, fitasas, liasas polisacáridas, oxidorreductasas, transglutaminasas y glicosaisomerasas, en particular las siguientes.

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Proteasas precursoras

Las proteasas precursoras (es decir las enzimas clasificadas bajo el Número de clasificación de Enzimas E.C. 3.4, según las "Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" (IUBMB)) comprenden las proteasas dentro de este grupo.

Algunos ejemplos comprenden las proteasas seleccionadas entre aquellas clasificadas bajo los Números Clasificación de Enzimas (E.C.):

3.4.11 (es decir las denominadas aminopeptidasas), incluyendo 3.4.11.5 (Prolil aminopeptidasa), 3.4.11.9 (X-pro aminopeptidasa), 3.4.11.10 (leucil-aminopeptidasa bacteriana), 3.4.11.12 (aminopeptidasa termófila), 3.4.11.15 (Lisil aminopeptidasa), 3.4.11.17 (Triptofanil aminopeptidasa), 3.4.11.18 (Metionil aminopeptidasa).

3.4.21 (es decir, las denominadas endopeptidasas de serina), incluyendo 3.4.21.1 (Quimiotripsina), 3.4.21.4 (Tripsina), 3.4.21.25 (Cucumisina), 3.4.21.32 (Brachiurina), 3.4.21.48 (Cerevisina) y 3.4.21.62 (Subtilisina);

3.4.22 (es decir, las denominadas endopeptidasas de cisteína), incluyendo 3.4.22.2 (Papaína), 3.4.22.3 (Ficaína), 3.4.22.6 (Quimopapaína), 3.4.22.7 (Asclepaína), 3.4.22.14 (Actinidaína), 3.4.22.30 (Caricaína) y 3.4.22.31 (Ananaína);

3.4.23 (es decir, las denominadas endopeptidasas aspárticas), incluyendo 3.4.23.1 (Pepsina A), 3.4.23.18 (Aspergilopepsina 1), 3.4.23.20 (Penicilopepsina) y 3.4.23.25 (Saccharopepsina); y

3.4.24 (es decir, las denominadas metaloendopeptidasas), incluyendo 3.4.24.28 (Bacilolisina).

Ejemplos de subtilisinas relevantes comprenden subtilisina BPN', subtilisin amylosacchariticus, subtilisina 168, subtilisin mesentericopeptidasa, subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, subtilisina 147, termitasa, aqualisina, proteasa Bacillus PB92, endopeptidasa K, proteasa TW7 y Proteasa TW3.

Ejemplos específicos de estas proteasas comerciales fácilmente disponibles comprenden Esperase®, Alcalase®, Neutrase®, Dyrazym®, Savinase®, Pyrase®, Pancreatic Trypsin NOVO (PTN), Bio-FeedTM Pro, Clear-Lens Pro (todas las enzimas disponibles por Novo Nordisk A/S).

Ejemplos de otras proteasas comerciales comprenden Maxtase®, Maxacal®, Maxapem® comercializadas por Gist-Brocades N.V., Opticlean® comercializada por Solvay et Cie. y Purafect® comercializada por Genencor International.

Debe entenderse que también las variantes de proteasa se consideran como proteasa precursora. Ejemplos de dichas variantes de proteasa están descritos en EP 130.756 (Genentech), EP 214.435 (Henkel), WO 87/04461 (Amgen), WO 87/05050 (Genex), EP 251.446 (Genencor), EP 260.105 (Genencor), Thomas et al., (1985), Nature. 318, P. 375-376, Thomas et al., (1987), J. Mol. Biol., 193, págs. 803-813, Russel et al., (1987), Nature, 328, p. 496-500, WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S), WO 91/00345 (Novo Nordisk A/S), EP 525 610 (Solvay) y WO 94/02618 (Gist-Brocades N.V.).

La actividad de las proteasas puede ser determinada como se describe en "Metods of Enzymatic Analysis", tercera edición, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol. 5.

Lipasas precursoras

Las lipasas precursoras (es decir, las enzimas clasificadas bajo el Número de Clasificación de Enzimas E.C. 3.1.1 (Hidrolasas de éster carboxílico) según las Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)) comprenden las lipasas dentro de este grupo.

Ejemplos que comprenden lipasas seleccionadas entre aquellas clasificadas bajo los Números de Clasificación de Enzimas (E.C.):

3.1.1 (es decir, las denominadas Hidrolasas de éster carboxílico), incluyendo (3.1.1.3) triacilglicerol Lipasas, (3.1.1.4.) Fosforlipasa A_{2}.

Ejemplos de lipasas que comprenden lipasas derivadas de los siguientes microorganismos. Las publicaciones de patentes indicadas se incorporan en la presente a modo de referencia:

Humicola, p. ej. H. brevispora, H. lanuginosa, H. brevis var. thermoidea y H. insolens (US 4,810,414).

Pseudomonas, p. ej. Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia y Ps. fluorescens (WO 89/04361), o Ps. plantarii o Ps. gladioli (US n°. 4,950,417 (Solvay enzymes)) o Ps. alcaligenes y Ps. pseudoalcaligenes (EP 218 272) o Ps. mendocina (WO 88/09367; US 5,389,536).

Fusarium, p. ej. F. oxysporum (EP 130,064) o F. solani pisi (WO 90/09446).

Mucor (también llamado Rhizomucor), p. ej. M. miehei (EP 238 023).

Chromobacterium (especialmente C. viscosum).

Aspergillus (especialmente A. Níger).

Candida, p. ej. C. cylindracea (también llamada C.rugosa) o C. antarctica (WO 88/02775) o lipasa A o B C. antarctica (WO 94/01541 y WO 89/02916).

Geotricum, p. ej. G. candidum (Schimada et al., (1989), J. Biochem., 106, 383-388).

Penicillium, p. ej. P. camembertii (Yamaguchi et al.,(1991)), Gene 103, 61-67).

Rhizopus, p. ej. R. delemar (Hass et al., (1991), Gene 109, 107-113) o R. niveus (Kugimiya et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56, 716-719) o R. oryzae.

Bacillus, p. ej. B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260) o B. stearothermophilus (J P 64/7744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

Ejemplos específicos de lipasas comerciales fácilmente disponibles comprenden Lipolase®, Lipolase^{TM} Ultra, Lipozyme®, Palatase®, Novozym® 435, Lecitase® (todas disponibles por Novo Nordisk A/S).

Ejemplos de otras lipasas son Lumafast^{TM}, lipasa Ps. mendocian de Genencor Int. Inc.; Lipomax^{TM}, lipasa Ps. pseudoalcaligenes de Gist Brocades/Genencor Int. Inc.; lipasa Fusarium solani (cutinasa) de Unilever; lipasa Bacillus sp. de Solvay enzymes. Existen otras lipasas disponibles por otras empresas.

Debe entenderse que también las variantes de lipasa están contempladas como enzimas precursoras. Ejemplos de éstas se describen en p. ej. WO 93/01285 y WO 95/22615. La actividad de las lipasas puede ser determinada como se describe en "Metods of Enzymatic Analysis", tercera Edición, 1984, Verlag Chemie, Weinhein, vol. 4, o como se describe en AF 95/5 GB (disponible contra pedido a Novo Nordisk A/S).

Oxidorreductasas precursoras

Las oxidorreductasas precursoras (es decir, las enzimas clasificadas bajo el Número de Clasificación de Enzimas E.C.1 (Oxidorreductasas) según las "Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" (IUBMB)) comprenden las oxidorreductasas dentro de este grupo.

Los ejemplos comprenden oxidorreductasas seleccionadas entre aquellas clasificadas bajo los Números de Clasificación de enzimas (E.C.):

Glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa_NAD^{+}_(1.1.1.8), glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa_NAD(P)^{+} fato 1-deshidrogenasa_NADP_(1.1.1.94), glucosa oxidasa (1.1.3.4), hexosa oxidasa (1.1.3.5), catecol oxidasa (1.1.3.14), bilirrubina oxidasa (1.3.3.5), alanina-deshidrogenasa (1.4.1.1), glutamato-deshidrogenasa (1.4.1.2), glutamato-deshidrogenasa_NAD(P)^{+}_(1.4.1.3), glutamato-deshidrogenasa_NADP^{+}_(1.4.1.4), ácido L-Amino deshidrogenada (1.4.1.5), serina deshidrogenada (1.4.1.7), valina deshidrogenada_NADP^{+}_(1.4.1.8), leucina deshidrogenada (1.4.1.9), glicina-deshidrogenasa (1.4.1.10), ácido L-Amino oxidasa (1.4.3.2.), ácido D-Amino oxidasa (1.4.3.3)), L-Glutamato oxidasa (1.4.3.11), proteína-lisina 6-oxidasa (1.4.3.13), L-lisina oxidasa (1.4.3.14), L-Aspartato oxidasa (1.4.3.16), ácido D-amino deshidrogenada (1.4.99.1), proteína disulfuro reductasa (1.6.4.4),Tioredoxin reductasa (1.6.4.5), proteína disulfuro reductasa (glutatión) (1.8.4.2), lacasa (1.10.3.2), catalasa (1.11.1.6), peroxidasa (1.11.1.7), lipoxigenasa (1.13.11.12), superóxido dismutasa (1.15.1.1)

Estas Glucosa oxidasas pueden ser derivadas de Aspergillus niger.

Dichas Lacasas pueden ser derivadas de Polyporus pinsitus, Myceliophtora thermophila, Coprinus cinereus, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia praticola, Scytalidium thermophilum y Rhus vemicifera.

Las bilirrubina oxidasas pueden ser derivadas de Myrothechecium verrucaria.

Las peroxidasas pueden ser derivadas de p. ej. soja, rábano o Coprinus cinereus.

La proteína disulfuro reductasa puede ser cualquiera de las mencionadas en WO 95/00636 y WO 95/11964 (Novo Nordisk A/S), incluyendo proteínas disulfuro reductasas de origen bovino, proteínas disulfuro reductasas derivadas de Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, y DsbA o DsbC derivadas de Escherichia coli.

Ejemplos específicos de oxidorreductasas comerciales fácilmente disponibles comprenden Gluzyme^{TM} (enzima disponible por Novo Nordisk A/S). No obstante, existen otras oxidorreductasas disponibles por otras empresas.

Debe entenderse que también las variantes de oxidorreductasas están contempladas como enzimas precursoras.

La actividad de las oxidorreductasas puede ser determinada como se describe en "Methods of Enzymatic Analysis", tercera edición, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol. 3.

Carbohidrasas precursoras

Las carbohidrasas precursoras pueden definirse como cualquier enzima capaz de romper las cadenas de carbohidratos (p. ej. almidones) de estructuras de anillos de especialmente cinco y seis elementos (es decir las enzimas clasificadas bajo el Número de Clasificación de Enzimas E.C.3.2 (glicosidasas) según las "Recommendations (1992) of the Intemational Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB))". También incluidas en el grupo de las carbohidrasas según la invención están las enzimas capaces de isomerizar carbohidratos, p. ej. estructuras de anillos de seis elementos, como D-glucosa, en p. ej. estructuras de anillos de cinco elementos como D-fructosa.

Los ejemplos comprenden carbohidrasas seleccionadas entre aquellas clasificadas bajo los Números de Clasificación de Enzimas (E.C.):

\alpha-amilasa (3.2.1.1) \beta-amilasa (3.2.1.2), glucano 1,4-\alpha-glucosidasa (3.2.1.3), celulasa (3.2.1.4), endo-1,3 (4)-\beta-glucanasa (3.2.1.6), endo-1,4-\beta-xilanasa (3.2.1.8), dextranasa (3.2.1.11), chitinasa (3.2.1.14), poligalacturonasa (3.2.1.15), lisozima (3.2.1.17), \beta-glucosidasa (3.2.1.21), \alpha-galactosidasa (3.2.1.22), \beta-galactosidasa (3.2.1.23), amilo-1,6-glucosidasa (3.2.1.33), xilano 1,4-\beta-xilosidasa (3.2.1.37), glucano endo-1,3-\beta-D-glucosidasa (3.2.1.39), \alpha-dextrina endo-1,6-glucosidasa (3.2.1.41), sacarosa \alpha-glucosidasa (3.2.1.48), glucano endo-1,3-\alpha-glucosidasa (3.2.1.59), glucano 1,4-\beta-glucosidasa (3.2.1.74), glucan endo-1,6-\beta-glucosidasa (3.2.1.75), arabinano endo-1,5-\alpha-arabinosidasa (3.2.1.99), lactasa (3.2.1.108), chitonanasa (3.2.1.132) y xilosa isomerasa (5.3.1.5).

Ejemplos de carbohidrasas relevantes comprenden \alpha-1,3-glucanasas derivadas de Trichoderma harzianum; \alpha-1,6-glucanasas derivadas de una cepa de Paecilomyces; \beta-glucanasas derivadas de Bacillus subtilis; \beta-glucanasas derivadas de Humicola insolens; \beta-glucanasas derivadas de Aspergillus niger, \beta-glucanasas derivadas de una cepa de Trichoderma; \beta-glucanasas derivadas de una cepa de Oerskovia xanthineolytica; exo-1,4-\alpha-D-glucosidasas (glucoamilasas) derivadas de Aspergillus niger, \alpha-amilasas derivadas de Bacillus subtilis; \alpha-amilasas derivadas de Bacillus amiloliquefaciens; \alpha-amilasas derivadas de Bacillus stearothermophilus; \alpha-amilasas derivadas de Aspergillus oryzae; \alpha-amilasas derivadas de microorganismos no patógenos; \alpha-galactosidasas derivadas de Aspergillus niger, Pentosanasas, xilanasas, celobiasas, celulasas, hemi-celulasas derivadas de Humicola insolens; celulasas derivadas de Trichoderma reesei; celulasas derivadas de mohos no patógenos; pectinasas, celulasas, arabinasas, hemicelulosas derivadas de Aspergillus niger, dextranasas derivadas de Penicillium lilacinum; endoglucanasa derivada de mohos no patógenos; pululanasas derivadas de Bacillus acidopullyticus; \beta-galactosidasas derivadas de Kluyveromyces fragilis; xilanasas derivadas de Trichoderma reesei;

Ejemplos específicos de carbohidrasas comerciales fácilmente disponibles comprenden Alpha-Ga^{TM}, Bio-Feed^{TM} Alpha, Bio-Feed^{TM} Beta, Bio-Feed^{TM} Plus, Bio-Feed^{TM} Plus, Novozyme® 188, Carezyme®, Celluclast®, Cellusoft®, Ceremyl®, Citrozym^{TM}, Denimax^{TM}, Dezyme^{TM}, Dextrozyme^{TM} Finizym®, Fungamyl^{TM}, Gamanase^{TM}, Glucanex®, Lactozym®, Maltogenase^{TM} Pentopan^{TM}, Pectinex^{TM}, Promozyme®, Pulpzyme^{TM}, Novamyl^{TM}, Termamyl®, AMG (Amyloglucosidase Novo), Maltogenase®, Sweetzyme®, Aquazym®, Natalase® (todas las enzimas están disponibles por Novo Nordisk A/S). Otras carbohidrasas están disponibles por otras empresas.

Debe entenderse que también las variantes de carbohidrasas están contempladas como enzimas precursoras.

La actividad de las carbohidrasas puede ser determinada como se describe en "Methods of Enzymatic Analysis", tercera edición, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol. 4.

Transferasas precursoras

Las transferasas precursoras (es decir, las enzimas clasificadas bajo el Número de Clasificación de enzimas E.C.2 según las "Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Bíology" (IUBMB)) comprenden las transferasas dentro de este grupo.

Las transferasas precursoras pueden ser cualquier transferasa en los subgrupos de transferasas: transferasas que transfieren grupos de un carbono (E.C.2.1); transferasas que transfieren aldehído o residuos (E.C.2.2); aciltransferasas (E.C.2.3); glucosiltransferasas (E.C.2.4); transferasas que transfieren grupos alquilo o arilo, excepto grupos metilo (E.C.2.5); transferasas que transfieren grupos nitrogenados (2.6).

En una forma de realización preferida la transferasa precursora es una transglutaminasa E.C 2.3.2.13 (Protein-glutamina (\mu-glutamiltransferasa).

Las transglutaminasas son enzimas capaces de catalizar una reacción de transferencia de ácilo, en la que un grupo gamma-carboxiamida de un residuo de glutamina unido al péptido es el donante de ácilo. Los grupos amino primarios en una variedad de compuestos pueden funcionar como aceptores de acilo con la formación posterior de gamma amidas monosustituidas de ácido glutámico unido al péptido. Cuando el grupo epsilon amino de un residuo de lisina en una cadena peptídica sirve como aceptor de acilo, las transferasas forman reticulaciones intramoleculares o intermoleculares de gamma-glutamil-epsilon-lisilo.

Ejemplos de transglutaminasas se describen en WO 96/06931 (Novo Nordisk A/S).

La transglutaminasa precursora puede ser de origen humano, animal (p. ej. bovino) o microbiano.

Ejemplos de estas transglutaminasas precursoras son las transglutaminasas derivadas de animal, FXIIIa; las transglutaminasas microbianas derivadas de Physarum polycephalum (Klein et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, P. 2599-2605); las transglutaminasas derivadas de Streptomyces sp., incluyendo Streptomyces lavendulae, Streptomyces lydicus (antes Streptomyces liban) y Streptoverticillium sp., incluyendo Streptoverticillium mobaraense, Streptoverticillium cinnamoneum, y Streptoverticillium griseocameum (Motoki et al., US 5,156,956; Andou et al., US 5,252,469; Kaempfer et al., Journal of General Microbiology, Vol. 137, p. 1831-1892; Ochi et al., International Journal of Sytematic Bacteriology, Vol. 44, p. 285-292; Andou et al., US 5,252,469; Williams et al., Journal of General Microbiology, Vol. 129, p. 1743-1813).

Debe entenderse que también las variantes de transferasas están contempladas como enzimas precursoras.

La actividad de las transglutaminasas puede ser determinada como se describe en "Methods of Enzymatic Analysis", tercera edición, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol. 1-10.

Fitasas precursoras

Las fitasas precursoras están incluidas en el grupo de enzimas clasificadas bajo el Número de Clasificación de Enzimas E.C.3.1.3 (Hidrolasas de monoéster fosfórico) según las "Recommendations (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" (IUBMB)).

Las fitasas son enzimas producidas por microorganismos que catalizan la conversión de pitato a inositol, y los microorganismos que producen fitasa de fósforo inorgánica comprenden bacterias como Bacillus subtilis, Bacillus natto y Pseudomonas; levaduras como Saccharomyces cerevisiae; y hongos tales como Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus o Aspergillus nidulans, y otras varias especies de Aspergillus).

Ejemplos de fitasas precursoras comprenden las fitasas seleccionadas entre las clasificadas bajo los Números de Clasificación de Enzimas (E.C.): 3-fitasa (3.1.3.8) y 6-fitasa (3.1.3.26).

La actividad de las fitasas puede ser determinada como se describe en "Methods of Enzymatic Analysis", tercera edición, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol. 1-10, o puede ser medida según el método descrito en EP-A1-0 420 358, ejemplo 2 A.

Liasas

Liasas adecuadas comprenden liasas polisacáridas: pectato liasas (4.2.2.2) y pectin liasas (4.2.2.10), como aquellas de Bacillus licheniformis descritas en WO 99/27083.

La variante de proteína que se puede obtener según el método de la invención puede ser usada en una composición. La composición puede comprender otros polipéptidos, proteínas o enzimas y/o ingredientes normalmente usados en productos para el cuidado personal, como champús, pastillas de jabón, lociones para la piel, cremas para la piel, tintes de pelo, pasta dental, artículos para el hogar, productos agroquímicos, productos de cuidado personal, como preparaciones de limpieza p. ej. para lentes de contacto, cosméticos, artículos de baño, fármacos orales y dermales, composiciones usadas para el tratamiento de textiles, composiciones usadas para la producción de alimentos, p. ej. cocción, y piensos, etc.

Ejemplos de variantes de proteínas que se pueden obtener a partir del método de la invención comprenden enzimas que exponen actividad proteasa, lipasa, oxidorreductasa, carbohidrasa, transferasa, como transglutaminasa, fitasa y/o polipeptídica anti-microbiana. Estas enzimas pueden estar presentes como conjugados con actividad reducida.

Las variantes de proteínas que se pueden obtener a partir del método de la invención pueden además ser usadas normalmente en composiciones de detergente. Pueden estar incluidas en una composición de detergente en forma de un granulado no espolvoreado, un líquido estabilizado, o una enzima protegida. Los granulados no espolvoreados pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 (ambas de Novo Industri A/S) y pueden ser revestidos opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de óxido de poli(etileno) (polietileno glicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman una película, adecuados para ser aplicados mediante técnicas de lecho fluidificado, se dan en la patente GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden ser estabilizadas, por ejemplo, añadiendo un poliol, como propilenoglicol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, según métodos establecidos. Otros estabilizadores enzimáticos se conocen bien en la técnica. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas según los métodos descritos en EP 238,216.

La composición de detergente puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej. polvo, gránulos, pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta un 70% de agua y un 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no fónico, catiónico, o anfotérico. El detergente contendrá normalmente un 0-50% de un agente tensioactivo aniónico, como alquilobencenosulfonato lineal (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), alquil sulfato (sulfato de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES), alcanosulfonatos secundarios (SAS), alfa-sulfo metil ésteres de ácidos grasos, ácido alquil o alquenilsuccínico, o jabón. También pueden contener un 0-40% de un agente tensioactivo no iónico, como etoxilato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácidos grasos etoxilados, monoetanolamida de ácidos grasos, o polihidroxi alquil amida de ácidos grasos (p. ej. como se describe en WO 92/06154).

La composición de detergente puede comprender además una o más enzimas diferentes, como p. ej. proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas, y otros polipéptidos anti-microbianos.

El detergente puede contener un 1-65% de un constructor de detergente o un agente de complejación como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTMPA), ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst). El detergente puede también ser no construido, es decir, esencialmente sin constructor de detergente.

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Algunos ejemplos son carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), alcohol (polivinílico) (PVA), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de ácido lauril metacrilato/acrílico.

El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2}, como perborato o percarbonato, la cual puede ser combinada con un activador del blanqueamiento formador de perácidos, como tetraacetiletilenodiamina (TAED) o nonanoiloxibenzenosulfonato (NOBS). De forma alternativa, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos, p. ej. de tipo amida, imida o sulfona.

La composición de detergente puede ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionales, p. ej. un poliol, como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico como, p. ej., un éster de borato aromático, y la composición puede ser formulada como se describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente puede también contener otros ingredientes de detergente convencionales como acondicionadores del tejido incluyendo arcillas, desencadenadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de la suciedad, agentes anti-redeposición de la suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos o perfumes.

El pH (medido en solución acuosa en la concentración de uso) normalmente será neutro o alcalino, p. ej. en la gama de 7-11.

Composición de lavavajillas

Además, una enzima modificada que puede obtenerse a partir del método según la invención pueden también ser usada en detergentes para lavavajillas.

Las composiciones detergentes para lavavajillas comprenden un agente tensioactivo que puede ser aniónico, no iónico, catiónico, anfotérico o una mezcla de estos tipos. El detergente contendrá un 0-90% de agente tensioactivo no-fónico, como alcoholes de cadena recta propoxilados etoxilados con de poca a ninguna espumación.

La composición de detergente puede contener sales constructoras de detergente de tipo inorgánico y/o orgánico. Los constructores de detergente pueden ser subdivididos en dos tipos, con contenido en fósforo y sin contenido en fósforo. La composición de detergente normalmente contiene un 1-90% de constructores de detergente.

Ejemplos de constructores de detergente alcalinos inorgánicos con contenido en fósforo, cuando están presentes, comprenden sales hidrosolubles, especialmente pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, y polifosfatos. Un ejemplo de constructor de detergente alcalino orgánico con contenido en fósforo, cuando está presente, incluye las sales hidrosolubles de fosfonatos. Ejemplos de constructores inorgánicos sin contenido en fósforo, cuando están presentes, comprenden carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, boratos y silicatos, así como varios tipos de alumino silicatos insolubles en agua cristalinos o amorfos, de los cuales las zeolitas son los ejemplos representativos más conocidos.

Ejemplos de constructores orgánicos adecuados comprenden metal alcalino, amonio y amonio sustituido, citratos, succinatos, malonatos, sulfonatos de ácidos grasos, carboximetoxi succinatos, amonio poliacetatos, carboxilatos, policarboxilatos, aminopolicarboxilatos, poliacetil carboxilatos y polihidroxsulfonatos.

Otros constructores orgánicos adecuados comprenden polímeros y copolímeros de peso molecular alto conocidos por tener propiedades constructoras, por ejemplo, ácido poliacrílico apropiado, ácido polimaleico y poliacrílico/polimaleico, copolímeros y sus sales derivadas.

La composición de detergente para lavavajillas puede contener agentes blanqueadores de tipo cloro-bromo o de tipo oxígeno. Ejemplos de blanqueadores inorgánicos de tipo cloro-bromo son hipoclorito de litio, sodio o calcio, así como fosfato de trisodio clorado. Ejemplos de blanqueadores orgánicos de tipo cloro-bromo son imidas heterocíclicas de N-bromo y N-cloro, como los ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibromoisocianúrico y dicloroisocianúrico, y sales derivadas con cationes de solubilización en agua como el potasio y el sodio. Los compuestos de hidantoína son también adecuados.

Los blanqueadores de oxígeno son los preferidos, por ejemplo en forma de una percal inorgánica, preferiblemente con un precursor del blanqueamiento o como un compuesto de ácido peróxido. Ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido adecuados son perboratos de metal alcalino, tanto tetrahidratos como monohidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos y perfosfatos. Los materiales activadores preferidos son TAED y triacetato de glicerol.

La composición de detergente para lavavajillas puede ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionales para enzima(s), p. ej. un poliol como p. ej. propilenoglicol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej. un éster de borato aromático.

La composición de detergente para lavavajillas también puede contener otros ingredientes convencionales de los detergentes, p. ej. un material defloculante, un material de relleno, depresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de la suciedad, agentes aislantes, agentes antiredeposición de la suciedad, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y perfumes.

Finalmente, la enzima que puede obtenerse por el método de la invención puede ser usada en detergentes convencionales para lavavajillas, p. ej. en cualquiera de los detergentes descritos en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente:

EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 516554, EP 516555, GB 2200132, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, WO 93/17089, DE 4205071, WO 52/09680, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, EP 429124, WO 93/21299, US 5141664, EP 561452, EP 561446, GB 2234980, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 346137, US 5112518, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, GB 2228945, CA 2006687, WO 93/25651, EP 530635, EP 414197, US 5240632.

Aplicaciones para el cuidado personal

La proteína que puede obtenerse a partir del método según la invención es también interesante en cuanto a sus aplicaciones para el cuidado personal.

Proteasas

Las proteasas son ingredientes activos muy conocidos para la limpieza de lentes de contacto. Hidrolizan la suciedad proteínica sobre la lente y de ese modo la hacen soluble. La eliminación de la suciedad proteínica es esencial para la comodidad durante el uso.

Las proteasas son también ingredientes eficaces en productos para la limpieza de la piel, donde eliminan la capa superior de células muertas de piel queratinosa y de ese modo hacen que la piel parezca más brillante y fresca.

Las proteasas se usan también en productos para el cuidado bucal, especialmente para la limpieza de dentaduras, pero también en dentífricos. Además, las proteasas se usan en productos de aseo, baño y ducha, incluyendo champús, acondicionadores, lociones, cremas, pastillas de jabón, jabones de baño y jabones líquidos.

Lipasas

Las lipasas pueden ser aplicadas en usos cosméticos como ingredientes activos en productos para la limpieza de la piel y productos anti-acné para la eliminación del exceso de lípidos en la piel, y en productos de baño y ducha como cremas y lociones como ingredientes activos para el cuidado de la piel.

Las lipasas también pueden ser usadas en productos para la limpieza del pelo (p. ej. champús) para la eliminación eficaz del sebo y otras materias grasas de la superficie del pelo.

Las lipasas son también ingredientes eficaces en productos para la limpieza de lentes de contacto, donde eliminan los depósitos de lípidos de la superficie de la lente.

Oxidorreductasas

La oxidorreductasa más común para objetivos de cuidado personal es una oxidasa (normalmente glucosa oxidasa) con un substrato (p. ej. glucosa) que asegura la producción de H_{2}O_{2}, el cual iniciará la oxidación de por ejemplo SCN^{-} o I^{-} en reactivos antimicrobianos (SCNO^{-} o I_{2}) por una peroxidasa (normalmente lactoperoxidasa). Este complejo enzimático es conocido en la naturaleza en p. ej. la leche y la saliva.

Se suele usar comercialmente como sistema anti-microbiano en productos para el cuidado bucal (enjuague bucal, dentífrico, goma de mascar), donde también puede ser combinado con una amiloglucosidasa para producir la glucosa. Estos sistemas son también conocidos en productos cosméticos para su conservación.

Se conocen sistemas anti-microbianos que comprenden la combinación de una oxidasa y una peroxidasa para la limpieza de lentes de contacto.

Otra aplicación de las oxidorreductasas son los tintes de pelo oxidantes que usan oxidasas, peroxidasas y lacasas.

Los radicales libres que se forman en la superficie de la piel (y pelo) están relacionados con el proceso de envejecimiento de la piel (deterioro del pelo). Los radicales libres activan reacciones en cadena que conducen a la destrucción de membranas, colágeno y células grasas. La aplicación de barredores de radicales libres como Superóxido dismutasa en cosméticos se conoce muy bien (R. L. Goldemberg, DCI, Nov. 93, P. 48-52).

La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es también una oxidorreductasa. Puede utilizarse para ondular el cabello (reducción y reoxidación de los enlaces disulfuro en el pelo) y para reparar el pelo dañado (cuando el daño es principalmente la reducción de los enlaces disulfuro existentes).

Carbohidrasas

La placa formada en la superficie de los dientes está compuesta principalmente por polisacáridos. Éstos se pegan a la superficie de los dientes y de los microorganismos. Los polisacáridos son principalmente \alpha-1,6 glucosa unida (dextrano) y \alpha-1,3 glucosa unida (mutano). La aplicación de diferentes tipos de glucanasas, como mutanasa y dextranasa, ayuda a hidrolizar la red pegajosa de la placa, haciéndola más fácil de eliminar mediante acción mecánica.

También otros tipos de biopelículas, por ejemplo la biopelícula que se forma en las cajitas de las lentes de contacto, pueden ser extraídas por la acción de las glucanasas.

Alimentos y piensos

Además, las enzimas o polipéptidos conjugados con inmunogenicidad reducida que pueden obtenerse mediante el método según la invención pueden usarse ventajosamente en la producción de alimentos y piensos.

Proteasas

El gluten en la harina de trigo es el ingrediente esencial responsable de la capacidad de la harina para ser usada en productos alimenticios horneados. Las enzimas proteolíticas son a veces necesarias para modificar la fase del gluten de la masa, p. ej. una harina de trigo dura puede ser suavizada por una proteasa.

Neutrase® es una metaloproteasa neutral comercialmente disponible que puede utilizarse para asegurar una calidad de la masa y una textura uniforme del pan, y para mejorar el sabor. Las proteínas de gluten se degradan moderadamente o más extensamente en péptidos, por lo que es necesario un control con el objetivo de evitar un reblandecimiento excesivo de la masa.

Las proteasas también se usan para modificar la proteína de la leche. Para coagular caseína en la leche durante la producción de queso, se pueden usar proteasas tales como el cuajo o la quimosina.

En la industria de la producción de cerveza, se usan proteasas para la cocción de los cereales no maltados, y para controlar el contenido de nitrógeno.

En productos de alimentación de animales se usan proteasas para de alguna manera expandir el sistema de digestión de los animales.

Lipasas

La aplicación de lipasas en la industria panadera es más bien nueva. La adición de lipasa proporciona mejoras en las propiedades de la masa y en la calidad de producción del pan en lo que se refiere a un volumen más grande, una mejor estructura de la miga y un color de la miga más blanco. El efecto observado puede explicarse por un mecanismo en el que la lipasa cambia la interacción entre el gluten y algunos fragmentos de lípidos durante la mezcla de la masa. Esto proporciona una red de gluten mejorada.

El desarrollo del sabor del queso de roano azul (p. ej. Danablue), cierto queso de tipo italiano y otros productos lácteos que contienen mantequilla grasa, depende de la degradación de la grasa de leche en ácidos grasos libres. Las lipasas pueden usarse para desarrollar el sabor en este tipo de productos.

En la industria de la producción de aceite y grasas, las lipasas se usan p. ej. para minimizar la cantidad de productos secundarios indeseables, para modificar las grasas por interesterificación y para la síntesis de los ésteres.

Oxidorreductasas

Otras oxidorreductasas con inmunogenicidad reducida que se pueden obtener según el método de la invención pueden ventajosamente ser usadas en la producción de alimentos y piensos.

Diferentes oxidorreductasas son usadas para hornear, como glucosa oxidasa, lipoxigenasa, peroxidasa, catalasa y combinaciones de éstas.

Tradicionalmente, los panaderos refuerzan el gluten añadiendo ácido ascórbico y bromato de potasio. Algunas oxidorreductasas pueden utilizarse para reemplazar el bromato en los sistemas de masa mediante la oxidación de las unidades de sulfidril libres en proteínas de gluten. En la presente invención se forman enlaces de disulfuro, dando como resultado masas más fuertes, más elásticas y con una resistencia mayor.

Gluzyme^{TM} (Novo Nordisk A/S) es una preparación de glucosa oxidasa con actividad catalasa que puede utilizarse para reemplazar el bromato. La fuerza de la masa se mide como una mayor resistencia al impacto mecánico, una mejor subida de la masa en el horno y un mayor volumen de la barra de pan.

Carbohidrasas

La harina tiene un contenido variable de amilasas, lo cual produce diferencias en la calidad del horneado. La adición de amilasas puede ser necesaria con el fin de estandarizar la harina. Las amilasas y pentosanasas generalmente proporcionan azúcar para la fermentación de levadura, mejoran el volumen del pan, retardan la retrogradación y reducen la velocidad de endurecimiento y la viscosidad producida de las gomas pentosano. A continuación se dan ejemplos de carbohidrasas.

Ciertas amilasas maltogénicas pueden ser usadas para prolongar el tiempo de conservación del pan durante dos o más días sin provocar la gomosidad en el producto. Selectivamente modifican el almidón gelatinizado disociando desde el extremo no reductor de las moléculas de almidón, azúcares y dextrinas de bajo peso molecular. El almidón es modificado de tal manera que es menos probable que se produzca la retrogradación. Los azúcares de bajo peso molecular producidos mejoran la capacidad de retención de agua de los productos horneados sin crear las dextrinas de longitud intermedia que darían como resultado la gomosidad del producto final. La enzima es desactivada durante la cocción del pan, por lo que se puede considerar un aditivo del tratamiento que no tiene que ser declarado en la etiqueta. Una sobredosis de Novamyl puede ser casi descartada.

El volumen del pan puede ser mejorado por \alpha-amilasas fúngicas que proporcionan una mejor estructura y una miga de pan más uniforme. Dichas \alpha-amilasas son endoenzimas que producen maltosa, dextrinas y glucosa. Las \alpha-amilasas de cereales y algunas bacterianas son inactivadas a temperaturas por encima de la temperatura de gelatinización del almidón, en consecuencia, cuando son añadidas a la masa de trigo producen poco volumen del pan y un pan viscoso en el interior. El Fungamyl tiene la ventaja de que es termolábil y es inactivado justo por debajo de la temperatura de gelatinización.

Las preparaciones enzimáticas que contienen diferentes actividades pentosanasa y hemicelulasa pueden mejorar la manipulación y la estabilidad de la masa y mejora la frescura, la estructura de la miga y el volumen del pan.

Al hidrolizar la fracción de pentosanas en la harina, perderá gran parte de su capacidad de enlace con el agua, y el agua estará disponible para el almidón y el gluten. El gluten se hace más plegable y extensible, y el almidón se gelatiniza más fácilmente. Las pentosanasas pueden ser usadas en combinación con emulgentes o como una alternativa a los mismos.

Otras carbohidrasas son usadas para producir jarabes de almidón, que se usan generalmente en refrescos, dulces, productos cárnicos, productos lácteos, productos de panadería, helados, alimentos para bebés, mermeladas, etc.

La conversión del almidón normalmente se lleva a cabo en tres fases. En primer lugar el almidón es licuado mediante el uso de \alpha-amilasas. Se obtienen maltodextrinas, que consisten principalmente en oligosacáridos y dextrinas.

La mezcla es posteriormente tratada con una amiloglucosidasa para hidrolizar los oligosacáridos y las dextrinas en glucosa. De este modo se obtiene un producto más dulce. Si se desean jarabes con mucha maltosa, se pueden usar \alpha-amilasas solas o en combinación con una pululanasa (enzima desramificada).

La mezcla de glucosa puede hacerse incluso más dulce mediante la isomerización a fructosa. Para lograr esto se puede usar una isomerasa de glucosa inmovilizada.

En la industria azucarera, es práctica común acelerar la ruptura del almidón presente en el zumo de las cañas. De este modo el contenido de almidón en el azúcar en bruto se reduce y se facilita la filtración en el refinería.

Además, se utilizan dextranasas para romper el dextrano en los zumos y jarabes de azúcar bruto .

En la industria alcohólica, las \alpha-amilasas se usan ventajosamente para clarear el almidón en las infusiones de destilación.

En la industria de la producción de cerveza, las \alpha-amilasas se usan para la licuefacción complementaria.

En la industria lechera, las \beta-galactosidasas (lactasa) se usan para la producción de leche con poca lactosa para personas que sufren una mala absorción de la lactosa.

En la producción de bebidas lácteas aromatizadas a partir de leche tratada con lactasa, se puede reducir la adición de azúcar sin reducir el dulzor del producto.

En la producción de leche condensada, la cristalización de la lactosa puede evitarse mediante el tratamiento de la lactasa y, de esta manera, se reduce el riesgo de espesamiento provocado por la coagulación de la caseína n cristales de lactosa.

En la producción de helados hechos a partir de leche tratada con lactasa (o lactosuero) no se formarán cristales de lactosa ni se producirá el defecto de arenilla.

Además, las xilanasas son conocidas por su uso en varias aplicaciones industriales para alimentos/piensos, como se describe en WO 94/21785 (Novo Nordisk A/S).

Las \alpha-amilasas se usan en la industria de piensos para animales añadidas a los piensos que contienen cereales para mejorar la digestibilidad del almidón.

Polipéptidos anti-microbianos

Ciertas enzimas bacteriolíticas pueden ser usadas p. ej. para el lavado de carcasas en la industria del embalaje de carne (ver patente US no. 5,354,681 de Novo Industri A/S)

Transferasas

Las transglutaminasas con inmunogenicidad reducida que se pueden obtener según el método de la invención pueden ventajosamente ser usadas en la producción de alimentos y piensos.

Las transglutaminasas tienen la capacidad de reticular las proteínas.

Esta propiedad puede ser usada para gelificar las fases acuosas que contienen proteínas. Esto se puede usar en la producción de productos para untar (WO 96/08156 de Novo Nordisk A/S).

Las transglutaminasas se usan para mejorar la calidad de la cocción de la harina p. ej. para modificar la harina de trigo usada en la preparación de pasteles con propiedades mejoradas, como un mejor sabor y sensación en la boca y dientes, y un mayor volumen (ver JP 1-110147).

Otros materiales para la producción de alimentos en forma de pastas p. ej. usados como sustitutos de la grasa en alimentos como helados, guarniciones, postres congelados, mayonesas y productos para untar con poca grasa (ver WO 93/22930 de Novo Nordisk A/S).

Además, para la preparación de geles para yogures, mousses, quesos, pudines, zumos de naranja, productos lácteos y pseudo-lácteos, y la unión de productos cárnicos troceados, la mejora del sabor y la textura de proteínas alimenticias (ver WO 94/21120 y WO 94/21129 de Novo Nordisk A/S).

Fitasas

Las fitasas que se pueden obtener por el método de la invención pueden ser usadas ventajosamente en la producción de alimentos, como cereales de desayuno, pasteles, dulces, bebidas, pan o sopas etc., y piensos animales.

Las fitasas pueden ser usadas para aprovechar el fósforo unido en el ácido pitato/fítico presente en las fuentes de proteínas vegetales, o bien para aprovechar los minerales importantes nutricionalmente unidos a los complejos de ácido fítico.

La fitasa microbiana puede ser añadida a los preparados alimenticios para animales monogástricos con el objetivo de evitar los suplementos alimenticios de fosfato inorgánico (ver patente US n° .3,297,548).

Otras fitasas pueden ser usadas en el tratamiento de la soja. La harina de soja puede contener altos niveles de pitato de factor anti-nutritivo, lo cual hace esta fuente proteínica inadecuada para su aplicación en alimentos para bebés y alimentos para peces, vacas y otros no rumiantes, puesto que el pitato forma quelatos en los minerales esenciales presentes (ver EP 0 420 358).

Las fitasas también pueden usarse con fines de panadería. Se puede preparar un pan de mejor calidad horneando pedazos divididos de una masa que contiene harina de trigo etc. y fitasas (ver JP-0-3076529-A).

Una alta actividad fitasa, como en el moho koji, es conocida por ser usada en la producción de sake refinado (ver JP-0-6070749-A).

Aplicaciones textiles Proteasas

Las proteasas se usan para desgomar y lavar con arena la seda.

Lipasas

Las lipasas se usan para la eliminación de materias grasas que contienen ésteres hidrofóbicos (p. ej. triglicéridos) durante el acabado de los textiles (ver p. ej. WO 93/13256 de Novo Nordisk A/S).

Oxidorreductasas

En el lavado blanqueador de textiles, las catalasas pueden servir para eliminar el peróxido de hidrógeno en exceso.

Carbohidrasas

Las enzimas celulolíticas se usan ampliamente en el acabado de prendas de tela vaquera con el objetivo de proporcionar una variación localizada de la densidad del color del tejido ("lavado a la piedra" facilitado por la enzima).

Las enzimas celulolíticas también encuentran uso en el proceso de bio-pulido. El bio-pulido es un tratamiento específico de la superficie del hilado que mejora la calidad del tejido con respecto al manejo y la apariencia sin perder la humectabilidad del tejido. El bio-pulido puede obtenerse aplicando el método descrito p. ej. en WO 93/20278.

Durante el tejido de los textiles, los hilos son expuestos a una tensión mecánica considerable. Con el objetivo de evitar la rotura, los hilos son normalmente reforzados mediante un revestimiento (encolado) con una sustancia gelatinosa (cola). El agente de encolado más común es el almidón en forma nativa o modificada. Un acabado uniforme y duradero sólo puede lograrse, por tanto, después de la eliminación del encolado del tejido, el denominado desencolado. El desencolado de tejidos encolados con una cola que contiene almidón o almidón modificado es facilitado preferiblemente usando enzimas amilolíticas.

Fármacos orales y dermales Proteasas

Combinaciones diferentes de proteasas altamente purificadas (p. ej. Tripsina y Quimiotripsina) se usan en fármacos orales y en fármacos dermales para combatir p. ej. inflamaciones, edemas y heridas.

Producción de cuero Transferasa

Se sabe que la transglutaminasa se usa para el acabado del cuero con caseína, actuando como un agente de endurecimiento (ver WO 94/13839 de Novo Nordisk).

Limpieza de superficies duras

La limpieza de superficies duras p. ej. en la industria alimentaria es a menudo difícil, ya que el equipamiento usado para la producción de productos lácteos, carnes, productos derivados de mariscos, bebidas, etc. a menudo tienen una forma complicada. El uso de composiciones con agentes tensioactivos en forma de geles y espumas que contienen enzimas ha demostrado que facilitan y mejoran la limpieza de las superficies duras. Las enzimas que pueden añadirse ventajosamente a tales composiciones de agentes tensioactivos son en particular proteasas, lipasas, amilasas y celulasas.

Estas composiciones para la limpieza de superficies duras que comprenden enzimas pueden también ventajosamente ser usadas en el sector del transporte, por ejemplo para el lavado de coches y para el lavado de recipientes en general.

Ante todo, el conjugado o las composiciones que se pueden obtener mediante el método de la invención pueden ventajosamente ser usadas en productos para el cuidado personal, tales como productos para el cuidado y el tratamiento del cabello. Se incluyen productos como champús, bálsamos, acondicionadores del cabello, composiciones que ondulan el cabello, composiciones para el tinte del cabello, tónicos capilares, líquidos capilares, cremas para el cabello, champús, enjuagues capilares, fijadores.

Además se contemplan productos para el cuidado bucal como dentífricos, enjuagues bucales o goma de mascar.

También se contemplan productos para el cuidado de la piel y cosméticos, como cremas para la piel, leche hidratante para la piel, crema limpiadora, loción limpiadora, leche limpiadora, crema de efecto frío, jabón en crema, esencia nutritiva, loción para la piel, loción lechosa, loción de calamina, crema de manos, jabón en polvo, jabón transparente, aceite solar, pantalla solar, espuma de afeitado, crema de afeitado, lápiz de labios, aceite para bebés, crema de labios, base cremosa, polvos para la cara, sombra de ojos en polvo, polvos, bases, bases de maquillaje, polvos de esencia, polvos de blanqueamiento.

El conjugado que se puede obtener mediante el método de la invención también se puede usar ventajosamente para productos de la higiene de las lentes de contacto. Tales productos comprenden productos de limpieza y desinfección de lentes de contacto.

También se contempla el uso de detergentes como polvo de lavado, jabón, barras de jabón y jabón líquido.

Además, las variantes de proteínas que se pueden obtener mediante el método de la invención pueden ser sintetizadas y expresadas en células huésped. Esto se consigue mediante el cultivo de células huésped capaces de expresar un polipéptido en un medio de cultivo adecuado con el fin de obtener la expresión y secreción del polipéptido en el medio, seguido del aislamiento del polipéptido del medio de cultivo. La célula huésped puede ser cualquier célula adecuada para la producción a gran escala de proteínas, siendo capaz de expresar una proteína y siendo transformada por un vector de expresión.

La célula huésped comprende una construcción de ADN, tal como se ha definido anteriormente, opcionalmente las células pueden ser transformadas con un vector de expresión que comprende una construcción del ADN tal como se ha definido anteriormente. La célula huésped es seleccionada de cualquier célula adecuada, como una célula bacteriana, una célula micótica, una célula animal, por ejemplo una célula de insecto o una célula de mamífero, o una célula vegetal.

Células huésped

Las células huésped recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica las variantes de polipéptidos que se pueden obtener mediante el método de la invención, son usadas ventajosamente para la producción recombinante de los polipéptidos. El término "célula huésped" incluye cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a las mutaciones que se producen durante la replicación.

La célula es preferiblemente transformada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de proteína que se puede obtener según el método de la invención, seguido de la integración del vector en el cromosoma huésped.

"Transformación" significa la introducción de un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de proteína que se puede obtener según el método de la presente invención, en una célula huésped, de tal modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autoreplicante. La integración se considera generalmente una ventaja, puesto que la secuencia de ácido nucleico es más probable que se mantenga estable en la célula. La integración del vector en el cromosoma huésped puede ocurrir por recombinación homóloga o no homóloga del modo descrito anteriormente.

La elección de una célula huésped depende en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej. un procariote, o un microorganismo no unicelular, p. ej. un eucariote. Las células unicelulares útiles son las células bacterianas, como las bacterias gram positivas que incluyen, pero sin limitarse, una célula Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es un célula Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus or Bacillus subtilis. La transformación de una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada mediante la transformación del protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), usando células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, o Dubnar y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), por electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o por conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278).

La célula huésped puede ser un eucariote, como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula micótica. Las células mamíferas útiles comprenden células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster joven (BHK), células COS, o cualquier número de otra línea disponible de células inmortalizadas, p. ej. de la American Type Culture Collection.

En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula micótica. Los "hongos", como se utiliza en este caso, incluyen phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (tal como se define en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8' edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) así como Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra). Grupos representativos de Ascomycota comprenden, p. ej., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus), y las levaduras reales catalogadas anteriormente. Ejemplos de Basidiomycota comprenden hongos, royas y tizones. Grupos representativos de Chytridiomycota comprenden, p. ej., Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces, y hongos acuáticos. Grupos representativos de Oomycota comprenden, p. ej., hongos acuáticos Saprolegniomycetous (moho de agua) como el Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos comprenden Aspergillus, Penicillium, candida y Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota comprenden, p. ej., Rhizopus y Mucor.

En una forma de realización preferida, la célula huésped micótica es una célula de levadura. Las "levaduras", como se utilizan en este caso, incluyen levadura ascosporogenous (Endomycetales), levadura basidiosporogenous, y levadura que pertenece a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Las levaduras ascosporogenous están divididas en las familias Spermophtoraceae y Saccharomycetaceae. Ésta última está compuesta por cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (p. ej. del género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae y Saccharomycoideae (p. ej., de los géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces). Las levaduras basidiosporogenous comprenden los géneros Leucosporidim, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium y Filobasidiella. Las levaduras que pertenecen a los Fungui Imperfecti están divididas en dos familias, Sporobolomycetaceae (p. ej., los géneros Sorobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (p. ej., género Candida). Puesto que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura será definida tal como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). La biología de las levaduras y la manipulación genética de las levaduras se conoce bien en la técnica (ver, p. ej., Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., y Stopani, A.O.M., editores, 2ª edición, 1987; The Yeasts, Rose, A.H., y Harrison, J.S., editores, 2ª edición, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editores, 1981).

En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de las especies Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, o Yarrowia.

En otra forma de realización preferida, la célula huésped de levadura es una Saccharomyces uvae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Gandida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., Geotrichum fermentans, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.

En otra forma de realización, las variantes de proteínas pueden ser producidas en células seleccionadas entre otros hongos, como Aspergillus spp, o Humicola lanuginosa o Aspergillus oryzae.

En una forma de realización preferida, la célula huésped micótica es una célula micótica filamentosa. Los "hongos filamentosos" comprenden todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (tal como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosana, manana, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por el alargamiento hifal, y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras como Saccharomyces cerevisiae es mediante el brote de un talo unicelular, y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de una de las siguientes especies, pero sin limitarse a las mismas, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma o un teleomorfo o un sinónimo del mismo.

Además, en una forma de realización preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula Aspergillus.

En otra forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula Acremonium, una célula Fusarium, una célula Humicola, una célula Mucor, una célula Myceliophthora, una célula Neurospora, una célula Penicillium, una célula Thielavia, una célula Tolypocladium o una célula Trichoderma.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

En otra forma de realización preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula Fusarium de la sección Discolor (también conocida como sección Fusarium). Por ejemplo, la célula precursora micótica filamentosa puede ser una célula Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, o Fusarium trichothecioides.

En otra forma de realización más preferida, la célula precursora micótica filamentosa es una cepa de Fusarium de la sección Elegans, p. ej., Fusarium oxysporum.

Además en otra forma de realización preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una Humicola insolens, una célula Humicola lanuginosa, una célula Mucor miehei, una célula Myceliophthora thermophilum, una célula Neurospora crassa, una célula Penicillium purpurogenum, una célula Thielavia terrestris.

En otra forma de realización preferida, la célula Trichoderma es una célula Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las células micóticas pueden ser transformadas mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la membrana celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Un método adecuado para la transformación de especies de Fusarium está descrito en Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 o en US 5,837,847. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920. Las células mamíferas pueden ser transformadas por absorción directa usando el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y Van der Eb (1978, Virology 52:546).

En otra forma más de realización, el huésped es seleccionado entre células vegetales, como células de patata, o bien el huésped es seleccionado entre células animales, como células de insecto, por ejemplo células de ovario de Spodoptera frugiperda Sf9 y Sf21 y la línea High Five de los huevos de Trichoplusia ni, o células mamíferas, como células de mono CV1 y COS, fibroblastos murina C127 y células de ovario de hámster chino (CHO).

El vector de expresión puede ser cualquier vector sometido al procedimiento de ADN recombinante, seguido de una expresión satisfactoria en un organismo huésped. Una vez introducido en la célula, el vector puede funcionar de forma autónoma. Con un origen de replicación, un plásmido puede replicar independientemente de la célula huésped. De forma alternativa puede ser incorporado en el genoma de la célula huésped, y ser replicado con el genoma de la célula huésped.

Otra forma de realización de la invención se refiere al uso de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios, como un sistema de visualización de fagos para seleccionar una variante de proteína del modo descrito anteriormente.

Ejemplos Ejemplo 1 Modelos de epítopos

Una selección de una biblioteca de visualización de fagos de péptidos aleatorios con anticuerpos IgG preparados contra la proteína precursora reveló los siguientes modelos de epítopos.

Las secuencias marcadas con (*) pueden existir en el contexto de un puente Cys-Cys.

Negrita: aminoácido de anclaje

Cursiva: mutaciones conservadoras

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Tabla 1

1) Proteína precursora Lacasa Modelos de epítopos

3

4

2) Proteína precursora JE-1 (NATALASE) (amilasa) Modelos de epítopos

5

3) Proteína precursora Lipoprime Modelos de epítopos

6

4) Proteína precursora PD498 (proteasa) Modelos de epítopos

7

5) Proteína precursora Carezvme(*) Modelos de epítopos

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9

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6) Proteína precursora Savinase Modelos de epítopos

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Ejemplo 2 Mapeo de epítopos usando bibliotecas de visualización de fagos y Análisis tridimensional Identificación de secuencias de epítopos y modelos de epítopos

Se seleccionaron bibliotecas de gran diversidad (10^{12}) de fagos que expresaban hexa-, nona- o dodecapétidos aleatorios como parte de sus proteínas de membrana, según su capacidad para unirse a anticuerpos IgG específicos de conejo purificado y a anticuerpos IgG1 y IgE purificados de rata y ratón. Las bibliotecas de fagos fueron obtenidas según la técnica precedente (ver WO 9215679 incorporada en la presente como referencia).

Los anticuerpos fueron preparados en los respectivos animales por inyección subcutánea, intradermal o intratraqueal de proteínas relevantes (p. ej.proteasas, lipasas, amilasas, oxidorreductasas) disueltas en suero salino tamponado con fosfato (PBS). Los respectivos anticuerpos fueron purificados del suero de los animales inmunizados por cromatografía de afinidad usando inmunoesferas paramagnéticas (Dynal AS) cargadas con anticuerpos IgG de cerdo anticonejo, IgG1 o IgE de ratón anti-rata o de rata anti-ratón.

Las respectivas bibliotecas de fagos fueron incubadas con esferas revestidas por los anticuerpos IgG, IgGl y IgE. Los fagos que expresaron oligopéptidos con afinidad a los anticuerpos IgG de conejo o IgG1 o IgE de rata o ratón fueron recogidos exponiendo estas esferas paramagnéticas a un campo magnético. Los fagos recogidos fueron eluidos de los anticuerpos inmovilizados por tratamiento suave de ácido, o por elución con la enzima intacta. Los fagos aislados fueron amplificados de la manera conocida por los expertos. De forma alternativa, los fagos inmovilizados fueron incubados directamente en E .coli para la infección. En resumen, E. coli de factor F positivo (p. ej. XL-1 Blue, JM101, TG1) fueron infectados con un vector derivado M13 en presencia de un fago auxiliar (p. ej. M13K07), e incubados, normalmente en 2xYT con contenido en glucosa o IPTG, y antibióticos apropiados para la selección. Finalmente, las células fueron extraídas por centrifugado. Este ciclo de acciones fue repetido en los respectivos sobrenadantes de la célula, como mínimo 2x y como máximo 5x. Después de las rondas de selección 2, 3, 4 y 5, una fracción del E. coli infectada fue incubada en placas de ágar 2xYT selectivas, y la especificidad de los fagos emergentes fue evaluada immunológicamente. De esta manera, los fagos fueron transferidos a una membrana de nitrocelulasa (NC). Para cada placa se hicieron 2 réplicas NC. Una réplica fue incubada con los anticuerpos de selección, la otra réplica fue incubada con los anticuerpos de selección y el inmunogen fue usado como competidor para obtener los anticuerpos. Las placas que estuvieron ausentes en presencia del inmunogen fueron consideradas específicas, y fueron amplificadas según el procedimiento anteriormente descrito.

Los clones de fagos específicos fueron aislados del sobrenadante de la célula por centrifugado en presencia de polietilenoglicol. El ADN fue aislado, la secuencia de ADN que codifica el oligopéptido fue amplificada por PCR, y se determinó la secuencia de ADN, todo según procedimientos estándar. La secuencia de aminoácidos del oligopéptido correspondiente fue deducida de la secuencia de ADN.

De esta manera se obtuvieron varias secuencias de péptidos con especificidad a los anticuerpos específicos de la proteína anteriormente descrita. Estas secuencias fueron recogidas en una base de datos y analizadas por alineación de secuencias para identificar los modelos de epítopos. Los cambios conservadores (p. ej. aspartato por glutamato, lisina por arginina, serina por treonina) fueron considerados como uno. Esto mostró que la mayoría de las secuencias eran específicas para la proteína contra la que los anticuerpos habían sido preparados. No obstante, se obtuvieron diferentes secuencias de reacción cruzada a partir de los fagos que sólo habían pasado a través de 2 rondas de selección. Aún así, se identificaron 22 modelos de epítopos.

Los modelos de epítopos se muestran en la siguiente Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Un extracto de la base de datos de epítopos

1

En este ejemplo, el epítopo S R S A fue encontrado en cuatro enzimas diferentes (lacasa, una lipasa micótica y dos proteasas bacterianas). De forma similar, el epítopo L > G R S S fue también encontrado en proteínas de precursores diferentes. Esto demuestra que proteínas de diferente estructura, función y origen microbiano pueden compartir uno o más modelos de epítopos.

Ejemplo 3 Localización de los epítopos y regiones de epítopos respectivos en la estructura 3D de las proteínas

Cada epítopo fue evaluado en la estructura 3D de la proteína de interés usando un software apropiado (p. ej. Swiss Pdb Viewer, WebLite Viewer).

En una primera fase, los modelos de epítopos identificados fueron ajustados a la estructura 3D de las enzimas. Una secuencia de al menos 3 aminoácidos, que define un modelo de epítopo específico, fue localizada en la estructura 3D de la proteína. Las mutaciones conservadoras (p. ej. aspartato por glutamato, lisina por arginina, serina por treonina) fueron consideradas como una para aquellos modelos para los cuales la visualización de fagos había mostrado que tales cambios ocurrirían. Entre las posibles secuencias proporcionadas por la estructura de la proteína, sólo fueron retenidas aquellas donde la secuencia coincidía con una secuencia primaria, o donde coincidía con una secuencia estructural de aminoácidos, donde cada aminoácido estaba situado dentro de una distancia de 5\ring{A} del siguiente. Ocasionalmente, la movilidad de las cadenas secundarias de aminoácidos, proporcionadas según el programa de software, tuvo que ser tenida en cuenta para que este criterio se cumpliera. Esta fase dio normalmente entre 0 y 7 epítopos posibles por proteína.

En segundo lugar, los aminoácidos de anclaje restantes, así como los aminoácidos variables, es decir los aminoácidos que no definían un modelo pero que estaban presentes en las secuencias individuales identificadas por la selección de la biblioteca de fagos, fueron evaluados en la región alrededor de las distintas secuencias de aminoácidos localizadas en el paso 1. Sólo los aminoácidos situados dentro de una distancia de 5\ring{A} del siguiente fueron incluidos. Esta fase normalmente dio entre 0 y 3 posibles candidatos.

Finalmente, se introdujo un criterio de accesibilidad. El criterio fue que al menos la mitad de los aminoácidos de anclaje tenían una superficie >30% accesible. Normalmente, <2 epítopos fueron retenidos.

De este modo, un número de secuencias de epítopos fue identificado y localizado en la superficie de varias proteínas. Como se ha sugerido por la alineación de secuencias, el análisis estructural confirmó que la mayoría de los epítopos eran enzimas específicas, con solo unas pocas excepciones. Normalmente, los epítopos fueron localizados en regiones muy discretas de las enzimas, y diferentes epítopos a menudo compartían aminoácidos (puntos
clave).

Es un conocimiento común que los aminoácidos que rodean las secuencias de unión pueden afectar la unión de un ligando sin participar activamente en el proceso de unión. Basándose en este conocimiento, las regiones cubiertas por aminoácidos con efectos estéricos potenciales en la interacción epítopos-anticuerpos, fueron definidas alrededor de los epítopos identificados. En la práctica se incluyeron todos los aminoácidos situados a una distancia de 5\ring{A} de los aminoácidos que definen el epítopo. El criterio de accesibilidad no fue incluido, ya que los aminoácidos escondidos pueden tener un efecto en las estructuras de alrededor.

Las estructuras 3D que muestran los epítopos y las regiones de epítopos respectivos de las diferentes enzimas se muestran en la Figura 1.

Ejemplo 4 Producción, selección y evaluación de variantes de enzimas con antigenicidad o inmunogenicidad reducida

Los puntos clave o epítopos fueron mutados usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (p. ej. mutagénesis dirigida, PCR con propensión a error).

En los ejemplos mostrados abajo, las variantes se realizaron por mutagénesis dirigida. Los cambios en los aminoácidos que daban nuevos epítopos o duplicaban epítopos ya existentes según la información recogida en la base de datos de epítopos (Ver Ejemplo 1) fueron evitados en el proceso de mutagénesis.

Las variantes enzimáticas fueron seleccionadas según su unión reducida a anticuerpos preparados contra el esqueleto de la enzima. Esta unión de los anticuerpos fue evaluada por ensayos establecidos (p. ej. ensayo competitivo ELISA, ensayo de aglutinación).

Las variantes con capacidad reducida de unión al anticuerpo fueron evaluadas posteriormente en estudios de animales.

Se inmunizaron ratones de forma subcutánea semanalmente durante un periodo de 20 semanas, con 50 \mul 0.9% (p/v) NaCl (grupo de control), o 50 \mul 0.9% (p/v) NaCl conteniendo 10 mg de proteína. Una semana después de cada segunda inmunización se recogieron muestras de sangre (100 \mul) del ojo. El suero se obtuvo por coagulación sanguínea y centrifugado.

Se determinaron niveles específicos de IgG1 y IgE usando el ensayo ELISA específico para IgG1 o IgE de ratón o rata. Se analizaron las diferencias entre grupos de datos usando métodos estadísticos apropiados.

A. Mutagénesis dirigida de aminoácidos que definen epítopos, con un efecto en las respuestas IgG1 y/o IgE en ratones.

Epítopo: A172/A169 R170 A194 G193 N261

Modelo: A R> R> A> N

Anticuerpo: IgG1 + IgE

Esqueleto: Savinase

La variante dio la mutación R170F. En un ensayo competitivo ELISA para IgE, esta variante fue menos efectiva al competir por los anticuerpos anti-savinase, dando una inhibición del extremo final un 15% inferior en comparación con el esqueleto de savinase.

Estudios con ratones han revelado una reducción del 80% de los niveles específicos de IgE, en comparación con el esqueleto de savinase (p<0.01). Los niveles de IgG1 no se vieron afectados significativamente.

Epítopo: S216 E219 Y220

Modelo: E Y > M

Anticuerpo: IgG1

Esqueleto: Lipoprime

La variante dio la mutación S216W. En un ensayo competitivo ELISA para IgG, la variante fue menos efectiva al competir por los anticuerpos Lipolase, dando una reducción del 38% en la inhibición del extremo final en comparación con el esqueleto de la enzima.

Estudios con ratones han revelado una reducción del 69% en los niveles específicos de IgG1, en comparación con el esqueleto de lipolasa (p<0.05). Los niveles de IgE no se vieron afectados significativamente.

B. Mutagénesis dirigida de epítopos, con ejemplos de duplicación de epítopos y formación de nuevos epítopos, respectivamente, predicha por la base de datos de epítopos.

Epítopo: T143 N173 N140 E136 L135

Modelo: S/T N N > E L

Anticuerpo: IgG1

Esqueleto: Savinase

La variante dio la mutación E136R. En un ensayo competitivo ELISA de IgG, la variante fue menos efectiva al competir por anticuerpos savinase, dando una reducción del 38% en la inhibición del extremo final en comparación con el esqueleto de savinase.

Estudios con ratones han revelado un aumento espectacular en los niveles específicos de IgGl, en comparación con el esqueleto de savinase (p<0.01). Los niveles de IgE no se vieron afectados significativamente.

La mutación E136R establece un epítopo de IgG1 del modelo R Y P R/K, previamente identificado en PD498. Aparentemente, este nuevo epítopo era más antigénico en ratones que el epítopo existente. La introducción de un epítopo de savinase no relacionado en el esqueleto de savinase podría explicar la discrepancia observada entre el ensayo competitivo ELISA y los estudios en animales.

En este ejemplo se descubrió que usando la información derivada exclusivamente de la selección de las bibliotecas de fagos con anticuerpos anti-PD498 (para identificar el modelo de epítopo R Y P R/K de la Tabla 2) se pudo predecir el resultado de un experimento de ingeniería genética con Savinase en el que la mutación E136R creó el epítopo PD498 en la superficie de Savinase, ocasionando una inmunogenicidad aumentada de esta variante de Savinase. Esto demuestra que los modelos de epítopo identificados pueden ser usados para predecir el efecto en la inmunogenicidad de las sustituciones en proteínas que son diferentes de las proteínas precursoras usadas para identificar el modelo de epítopo.

C. Mutagénesis dirigida de aminoácidos que definen regiones de epítopos, con un efecto diferencial en los niveles de los anticuerpos IgG1 y IgE en ratones, y un efecto de inhibición en la unión del IgG, respectivamente. Epítopo: A172/A169 R170 A194 G193 N261

Modelo: A R> R> A> N

Anticuerpo: IgG1 + IgE

Esqueleto: Savinase

Región de epítopos: P131, S132, A133, L135, E136, V139, A151, A152, S153, G161, S162, 1165, S166, Y167, P168, Y171, N173, A174, A176, Q191, Y192, G195, L196, R247, S259, T260, L262, Y263, G264.

La variante fue diferente en la posición Y167 por la mutación de Y1671. En un ensayo competitivo ELISA para IgE, la variante fue menos efectiva al competir por anticuerpos anti-savinase, dando una inhibición del extremo final del 8% más inferior en comparación con su esqueleto.

Estudios con ratones han revelado una reducción del 75% de los niveles específicos de IgE, en comparación con el esqueleto (p<0.01). Por el contrario, los niveles de IgG1 aumentaron espectacularmente (p<0.01).

Epítopo: T143 N173 N140 E136 L135

Modelo: S/T N N > E L

Anticuerpo: IgG 1

Esqueleto: Savinase

Región de epítopos: V10A, 1107, A108, L111, E112, G115, S132, A133, T134, Q137, A138, V139, S141, A142, S144, R145, G146, V147, V149, Y167, P168, Y171, A172, A174, M175, N243, R247.

Mientras que la variante n° 1 fue mutada en la posición de epítopo (N140D), la variante n° 2 fue mutada en N140 (N140D), pero también en la posición de la región de epítopos (A172D).

En un ensayo competitivo ELISA de IgG, la variante n° 1 fue menos efectiva al competir por anticuerpos anti-savinase, en comparación con savinase. Esta variante reveló una reducción del 21% de la inhibición del extremo final en comparación con su esqueleto.

La variante n° 2 ocasionó una inhibición del extremo final del 60% más inferior en comparación con savinase, y del 40% en comparación con la variante n° 1.

Ejemplo 5 Conjugación de la variante de Savinase E136K con bis-PEG-1000 activado

Se incubaron 4,9 mg de la variante de Savinase en 50 mM de Borato de Sodio pH 9.5 con 12 mg de bis-PEG 1000 activado con N-succinimidil carbonato en un volumen de reacción de aproximadamente 2 ml. La reacción se efectuó a temperatura ambiente usando agitación magnética mientras se mantenía el pH dentro del intervalo 9.0-9.5 mediante la adición de NaOH 0.5 M. El tiempo de reacción fue de 2 horas.

Los derivados fueron purificados y los reactivos en exceso extraídos por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex-75 (Pharmacia) equilibrada en 50 mM de Borato de Sodio, 5 mM de ácido succínico, 150 mM de NaCI, 1 mM de CaCl_{2} pH 6.0.

El conjugado fue almacenado a - 20°C, en el tampón anteriormente descrito.

En comparación con la variante de la enzima precursora, la actividad proteasa del conjugado se mantuvo (97% usando Dimetil-caseína como substrato a un pH 9).

Ejemplo 6

Se realizó un ensayo competitivo ELISA según procedimientos establecidos. En resumen, una placa ELISA de 96 pocillos fue revestida con la proteína precursora. Después del bloqueo y lavado apropiados, el antígeno revestido fue incubado con antisuero policlonal anti-enzima de conejo en presencia de varias cantidades de proteína modificada (el competidor).

Las cantidades de antisuero de conejo residual fueron detectadas por inmunoglobulina de cerdo anticonejo marcada con peroxidasa de rábano.

Epítopo: T143 N173 N140 E136 L135

Modelo: S/T N N > E L

Anticuerpo: IgG 1

esqueleto: Savinase

Mutación: E136K

Modificación: bis-NHS-PEGI000

Ensayo competitivo ELISA en la enzima no modificada del derivado de PEG-ilado. El resultado se muestra en la Figura 2.

Los datos muestran que el derivado (inhibición del 60% del extremo final) tiene una capacidad reducida para unirse a las inmunoglobulinas específicas de las enzimas, en comparación con la proteína precursora (inhibición del 100% del extremo final).

Claims (22)

1. Método para seleccionar una variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con una proteína precursora, que incluye las etapas de:

selección de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios con anticuerpos preparados contra cualquier proteína de interés,

secuenciación de la secuencia de aminoácidos de los péptidos de unión a anticuerpos, o la secuencia de ADN que codifica los péptidos de unión a anticuerpos,

identificación de modelos de epítopos por alineación de secuencias de la secuencia peptídica reactiva,

localización de modelos de epítopos estructurales en la estructura tridimensional de la proteína precursora,

definición de una región de epítopos que incluye aminoácidos situados a una distancia de 5 A de los aminoácidos del epítopo,

cambio de los modelos de epítopos localizados, o los aminoácidos que definen la región de epítopos de la proteína precursora, mediante mutaciones por ingeniería genética de una secuencia de ADN que codifica la proteína precursora sin perjudicar la funcionalidad de la proteína, usando la base de datos de epítopos emergentes para eliminar las sustituciones de aminoácidos que crean nuevos modelos de epítopos o duplican los ya existentes,

introducción de la secuencia de ADN mutada en un huésped adecuado, cultivo de dicho huésped y expresión de la variante de proteína, y

evaluación de la inmunogenicidad de la variante de proteína usando la proteína precursora como referencia.

2. Método según la reivindicación 1, por el que la variante de proteína tiene una alergenicidad reducida.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que las variantes de proteína son seleccionadas según la evaluación de la antigenicidad y/o funcionalidad antes de la evaluación de la alergenicidad.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que los anticuerpos preparados contra la proteína precursora son usados para la selección de la biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que los modelos de epítopos de una proteína precursora son identificados mediante la comparación de las secuencias peptídicas con la estructura secuencial y tridimensional de la proteína precursora.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que la región de epítopos de la proteína precursora es identificada mediante la comparación de las secuencias peptídicas con la estructura secuencial y tridimensional de la proteína.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que la proteína precursora es una enzima.

8. Método según la reivindicación 7, por el que la enzima es seleccionada del grupo consistente en glicosil hidrolasas, carbohidrasas, peroxidasas, proteasas, lipasas, fitasas, liasas polisacáridas, oxidorreductasas, transglutaminasas y glicosaisomerasas.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que los anticuerpos son anticuerpos IgG o IgE.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que la biblioteca de paquetes de visualización de péptidos es una biblioteca de visualización de fagos.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que los péptidos de la biblioteca de paquetes de visualización de péptidos son oligopéptidos que tienen de 5 a 25 aminoácidos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que la región de epítopos es cambiada mediante la substitución de al menos un aminoácido de la región de epítopos.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, por el que la región de epítopos es cambiada mediante la adición o eliminación de al menos un aminoácido de la región de epítopos.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, por el que el modelo de epítopo es cambiado mediante la substitución de al menos un aminoácido del modelo de epítopo.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, por el que el modelo de epítopo es cambiado mediante la adición o eliminación de al menos un aminoácido del modelo de epítopo.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que los aminoácidos en la región de epítopos son cambiados mediante la substitución y/o inserción de al menos un aminoácido por un aminoácido que hace que el aminoácido sustituido y/o insertado sea el objetivo de la conjugación covalente para un molécula activada.

17. Método según la reivindicación 16, por el que el aminoácido para la sustitución y/o inserción es seleccionado del grupo consistente en K, R, C, D, E.

18. Método según la reivindicación 16, por el que la molécula para la conjugación covalente es seleccionada del grupo de polímeros activados sintéticos o naturales.

19. Método según la reivindicación 18, por el que el polímero sintético activado es un polietileno glicol.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, por el que la inmunogenicidad se mide mediante el ensayo competitivo ELISA.

21. Método según la reivindicación 20, por el que la inmunogenicidad de la variante de proteína es inferior al 75%, preferiblemente inferior al 50% de la inmunogenicidad de la proteína precursora.

22. Uso de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios para la selección de una variante de proteína con inmunogenicidad reducida en comparación con la proteína precursora, que incluye las etapas de:

selección de una biblioteca de paquetes de visualización de péptidos aleatorios con anticuerpos preparados contra la proteína precursora,

secuenciación de la secuencia de aminoácidos de los péptidos de unión a los anticuerpos, o la secuencia de ADN que codifica los péptidos de unión a los anticuerpos,

identificación de modelos de epítopos estructurales de la proteína precursora mediante la comparación de las secuencias peptídicas con la estructura secuencial y tridimensional de la proteína precursora,

cambio del modelo de epítopo identificado de la proteína precursora mediante mutaciones por ingeniería genética de una secuencia de ADN que codifica la proteína precursora sin perjudicar la funcionalidad de la proteína,

introducción de la secuencia de ADN mutada en un huésped adecuado, cultivo de dicho huésped y expresión de la variante de proteína, y

evaluación de la inmunogenicidad de la variante de proteína usando la proteína precursora como referencia.