CN103820423A

CN103820423A - 具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶变体

Info

Publication number: CN103820423A
Application number: CN201410023007.5A
Authority: CN
Inventors: S.米宁; H.德拉伯格; E.L.罗根; N.K.索尼; N.W.贝格; S.T.林斯特兰德
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2004-04-02
Filing date: 2005-04-01
Publication date: 2014-05-28
Also published as: ATE491025T1; WO2005095592A3; CN1969042B; US20110009308A1; US7824896B2; DE602005025202D1; CN1969042A; EP1735433A2; WO2005095592A2; US20080280344A1; EP1735433B1; US8389262B2

Abstract

本发明涉及具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶变体，特别是具有降低的变应原性的枯草杆菌酶。另外，本发明涉及所述枯草杆菌酶变体的表达及其在如洗涤剂和口腔护理产品中的用途。

Description

具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶变体

本申请是2005年4月1日提交的申请号为200580013992.0的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶（subtilase）变体及其用途，以及产生所述枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的方法。

背景技术

包括酶在内的越来越多蛋白质正在通过工业化方式生产并用于各种工业、家务管理和医药中。作为蛋白质，它们很可能刺激人和动物体内的免疫反应，如变态反应。

已进行了各种尝试以改变蛋白质的免疫原性。通常这种改变只局限于蛋白质中负责诱导免疫反应的部分，即，表位。表位由多个氨基酸组成，这些氨基酸在一级序列中可以是连续的，但更常见的是在蛋白质的三维结构中相互间处于邻近的位置。已发现在表位中的小变化就可能影响它与抗体的结合。这可能导致该表位的重要性降低，可能将其从高亲合力表位转变成低亲合力表位，或甚至可能导致表位的丢失，即，该表位不足以结合抗体从而引起免疫反应。

改变蛋白质免疫原性的另一种方法是通过如往蛋白质中添加PEG等化合物“掩盖表位”。

文献WO00/26230和WO01/83559公布了选择与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的两种不同方法。

文献WO99/38978公布了通过修饰IgE结合位点来修饰变应原使其变应原性降低的方法。

文献WO99/53038公布了在人体内具有较低变应原反应的突变蛋白质和构建、鉴别和生产这些蛋白质的方法。

枯草杆菌酶普遍应用于洗涤剂工业中，是潜在地可能引起变态反应等免疫反应的一组酶。因此持继需要具有改变的免疫原性（尤其是具有降低的变应原性）且同时仍保留了其应用时所必需的酶促活性的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体。

文献WO00/22103公布了免疫反应减少的多肽，而文献WO01/83559公布了免疫原性已被修饰的蛋白质变体。

发明内容

在第一个方面中，本发明涉及SEQ ID NO:1的亲本枯草杆菌酶的变体，或与亲本枯草杆菌酶具有至少80%同源性，优选85%或90%或95%或98%或99%同源性的枯草杆菌酶的变体，所述变体与亲本枯草杆菌酶相比具有改变的免疫原性。变体的氨基酸序列与亲本枯草杆菌酶的氨基酸序列存在至少两个突变的差异，至少一个突变发生在亲本枯草杆菌酶的四个已鉴定的表位之一。

在第二方面中，本发明涉及SEQ ID NO:1枯草杆菌酶的变体，其中在位置99后插入了谷氨酸（*99aE）。

在第三方面中，本发明涉及SEQ ID NO:1的变体，其中在已鉴定的表位中发生两个或更多突变。所述突变可以与位置99后的谷氨酸插入（*99aE）组合发生。

在第四方面中，本发明涉及SEQ ID NO:1的变体，其中表位以外的突变发生在22、141、191、247、252和259中的一个或多个位置。所述突变可以与位置99后的谷氨酸插入（*99aE）组合发生。

在第五方面中，本发明涉及选自以下的变体：S57P+*99aE+R247Q和*99aE+A158V和*99aE+E136G和*99aE+E136K和l79T+*99aE+Q191E和*99aE+S141N+S156D和T58A+*99aE+S156N和*99aE+S141G+S156N+Q191E和S78P+*99aE+N185S+Q206L和*99aE+G195P+T260L和*99aE+G160S+G211S+T260N和*99aE+G195D+G211N+T260L和*99aE+G160S+G195P+G211S+T260N和*99aE+A158N+S161D和*99aE+S259N+T260I和*99aE+S259N和*99aE+S259R和T22A+*99aE+G160N+T260L和*99aE+G160DG+195P+G211P+T260N和*99aE+G160S+G211D+T260L。

在第六方面中，本发明涉及通过上皮测定衡量为具有降低的免疫原性的SEQ ID NO:1的变体。

在第七方面中，本发明涉及通过MINT研究或C-ELISA衡量为具有降低的免疫原性的SEQ ID NO:1的变体。

在其他方面中，本发明涉及编码本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的DNA序列和含有所述DNA序列的载体以及含有所述载体的宿主细胞。

在最后方面中，本发明涉及含有本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的组合物。

更具体地，本发明涉及下述各项：

1.SEQ ID NO:1亲本枯草杆菌酶的变体，其特征在于与亲本枯草杆菌酶相比，通过引入两个或更多突变降低了免疫原性，其中至少一个突变在亲本枯草杆菌酶表位区1到4中。

2.根据项1的变体，其中所述突变之一是在位置99之后插入谷氨酸。

3.根据项1的变体，其中所有突变都在表位区1到4中。

4.根据项2的变体，其中所有其他突变都在表位区1到4中。

5.根据项1的变体，其中至少一个突变在表位区1中且至少一个突变在表位区2中。

6.根据项2的变体，其中至少一个突变在表位区1中且至少一个突变在表位区2中。

7.根据项1的变体，其中至少一个突变在表位区3中且至少一个突变在表位区4中。

8.根据项2的变体，其中至少一个突变在表位区3中且至少一个突变在表位区4中。

9.根据项1的变体，其中至少一个突变在表位区2中且至少一个突变在表位区3中。

10.根据项2的变体，其中至少一个突变在表位区2中且至少一个突变在表位区3中。

11.根据项1的变体，其中表位区1到4以外的突变发生在选自由位置22、141、191和247组成的列表的一个或多个位置。

12.根据项2的变体，其中表位区1到4以外的突变发生在选自由位置22、141、191和247组成的列表的一个或多个位置。

13.根据项12的变体，其中

a.当替换发生在位置22时，用来替换的氨基酸为丙氨酸；

b.当替换发生在位置141时，用来替换的氨基酸选自天冬酰胺和甘氨酸；

c.当替换发生在位置191时，用来替换的氨基酸为谷氨酸；

d.当替换发生在位置247时，用来替换的氨基酸为谷氨酰胺。

14.根据项1的变体，其中当替换发生在表位区1时，替换发生在位置57、58和136中的一个或多个位置，其中

a.当替换发生在位置57时，用来替换的氨基酸为脯氨酸；

b.当替换发生在位置58时，用来替换的氨基酸为丙氨酸；

c.当替换发生在位置136时，用来替换的氨基酸选自甘氨酸和赖氨酸。

15.根据项1的变体，其中当替换发生在表位区2时，替换发生在位置156、158、160、161和195中的一个或多个位置，其中

a.替换发生在位置156时，用来替换的氨基酸选自天冬氨酸和天冬酰胺；

b.当替换发生在位置158时，用来替换的氨基酸选自缬氨酸和天冬酰胺；

c.当替换发生在位置160时，用来替换的氨基酸选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸；

d.当替换发生在位置161时，用来替换的氨基酸为天冬氨酸；

e.当替换发生在位置195时，用来替换的氨基酸为谷氨酸。

16.根据项1的变体，其中当替换发生在表位区3时，替换发生在位置78、79、206和211中的一个或多个位置，其中

a.当替换发生在位置78时，用来替换的氨基酸为脯氨酸；

b.当替换发生在位置79时，用来替换的氨基酸为苏氨酸；

c.当替换发生在位置206时，用来替换的氨基酸为亮氨酸；

d.当替换发生在位置211时，用来替换的氨基酸选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸。

17.根据项1的变体，其中当替换发生在表位区4时，突变可以发生在位置158、160、161、185、195、259和260中的一个或多个位置，其中

a.当替换发生在位置158时，用来替换的氨基酸选自缬氨酸和天冬酰胺；

b.当替换发生在位置160时，用来替换的氨基酸选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸；

c.当替换发生在位置161时，用来替换的氨基酸为天冬氨酸；

d.当替换发生在位置185时，用来替换的氨基酸为丝氨酸；

e.当替换发生在位置195时，用来替换的氨基酸为谷氨酸；

f.当替换发生在位置259时，用来替换的氨基酸选自天冬酰胺和精氨酸；

g.当替换发生在位置260时，用来替换的氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸和天冬酰胺。

18.根据项1的变体，其中所述变体选自S57P+*99aE+R247Q和*99aE+A158V和*99aE+E136G和*99aE+E136K和l79T+*99aE+Q191E和*99aE+S141N+S156D和T58A+*99aE+S156N和*99aE+S141G+S156N+Q191E和S78P+*99aE+N185S+Q206L和*99aE+G195P+T260L和*99aE+G160S+G211S+T260N和*99aE+G195D+G211N+T260L和*99aE+G160S+G195P+G211S+T260N和*99aE+A158N+S161D和*99aE+S259N+T260I和*99aE+S259N和*99aE+S259R和T22A+*99aE+G160N+T260L和*99aE+G160DG+195P+G211P+T260N和*99aE+G160S+G211D+T260L。

19.根据项1的变体，所述变体通过“上皮测定”章节所描述的上皮测定测量为具有降低的免疫原性。

20.根据项19的变体，其中所述变体选自I79T+*99aE+Q191E和*99aE+S141N+S156N+Q191E和*99aE+G195P+T260L和*99aE+G160S+G211S+T260N和*99aE+G160S+G195P+G211S+T260N和T22A+*99aE+G160N+T260L和*99aE+G160D+G195P+G211P+T260N。

21.根据项1的变体，所述变体通过MINT研究测量为具有降低的免疫原性。

22.根据项21的变体，其中所述变体选自I79T+*99aE+Q191E和*99aE+G195P+T260L。

23.根据项1的变体，所述变体通C-ELISA测量为具有降低的免疫原性。

24.根据项1的变体，在“洗涤性能”章节所述进行测试时，所述变体与亲本酶相比具有提高的洗涤性能。

25.根据项24的变体，所述变体与亲本亲本酶相比在液体洗涤剂中具有提高的洗涤性能。

26.编码前述任一项的枯草杆菌酶变体的DNA序列。

27.含有项26的DNA序列的载体。

28.含有项27的载体的宿主细胞。

29.含有根据项1-25中任一项的枯草杆菌酶变体的组合物。

30.根据项29的组合物，其为清洁组合物。

31.根据项29的组合物，其为个人护理组合物。

定义

术语“枯草杆菌酶”在本发明的上下文中应理解为如下文献所述的丝氨酸蛋白酶亚类：Siezen等，Protein Engng.4（1991）719－737和Siezen等，ProteinScience6（1997）501－523。

plg是多免疫球蛋白混合物的缩写。

术语“亲本”在本发明的上下文中应理解为被修饰以产生蛋白质变体的蛋白质。亲本蛋白质可以是天然存在（野生型）的多肽或是通过任何适当手段制备的天然多肽的变体。例如，亲本蛋白质可以是对天然存在蛋白质进行修饰得到的天然存在蛋白质的变体，其中修饰可以是替换、化学修饰、缺失或截短一个或多个氨基酸残基，或在氨基酸序列中添加或插入一个或多个氨基酸残基。因此，术语“亲本枯草杆菌酶”指被修饰以产生枯草杆菌酶变体的枯草杆菌酶。

术语“变体”在本发明的上下文中应理解为与亲本蛋白质比较在一个或多个氨基酸残基上被修饰的蛋白质。

术语“突变”、“修饰”或“已修饰”在本发明的上下文中应理解为包括对蛋白质的化学修饰以及对编码蛋白质的DNA的遗传操作。修饰可以是在目的氨基酸内或目的氨基酸位置进行氨基酸侧链的置换、氨基酸的替换、缺失和/或插入。因此术语“（已）修饰的蛋白质”，如“（已）修饰的枯草杆菌酶”应理解为与亲本蛋白质相比含有修饰的蛋白质。

术语“位置”在本发明的上下文中应理解为是蛋白质中从N－末端氨基酸开始的编号。本发明中所用的位置编号指来自淀粉液化芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo（BPN’）的位置。不过，其它枯草杆菌酶也在本发明的范围内。用GAP软件通过与来自淀粉液化芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo（BPN’）进行序列比对，可以确定其它枯草杆菌酶的相应位置。GAP提供于GCG软件包中（用于Wisconsin软件包的软件手册（Program Manual forWisconsin Package），第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575ScienceDrive，Madison,Wisconsin，USA53711）（Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，（1970），Journal of Molecular Biology，48，443－45）。除非特别说明，本发明中所提及的位置以BPN’编号给出，且可通过序列比对（alignment）转换。

术语“蛋白质”在本发明的上下文中意指包括寡肽、多肽以及蛋白质等等。

术语“缺失”或“已缺失”，涉及某位置或某氨基酸时，在本发明的上下文中指在此特定位置处的氨基酸已被删除或缺失。

术语“插入”或“已插入”，涉及某位置或某氨基酸时，在本发明的上下文中指于此特定位置的氨基酸之后已插入一个或多个氨基酸，如1－5个氨基酸，或存在一个或多个氨基酸，如1－5个氨基酸。

术语“替换”或“已替换”，涉及某位置或氨基酸时，在本发明的上下文中指在此特定位置的氨基酸已被另一氨基酸代替或出现了与指定蛋白质（如蛋白质序列）中某一氨基酸不同的氨基酸。

氨基酸

使用了众所周知的三字母和单字母氨基酸缩写（参阅，如Creighton TE（1993），蛋白质；结构和分子特性（Proteins；Structures and MolecularProperties），第2版，W.H.：Freeman and Company，图1.1，第3页）。缩写“X”或“Xaa”用于指任何氨基酸。本发明上下文中的缩写“aa”用于指“氨基酸”。

变体

为了描述氨基酸的缺失、插入和/或替换，本发明中使用了以下命名法：

原始氨基酸、位点、缺失/插入/替换的氨基酸

由此用谷氨酸替换第195位的甘氨酸被表示为：

Gly195Glu或G195E

在同一位置处甘氨酸的缺失是：

Gly195* 或G195*

在指出了与编号所用序列相比而言的缺失时，在这一位置的插入表示为：

*36Asp或*36D

指在第36位插入了天冬氨酸。

插入或添加一个氨基酸残基，如天冬氨酸，表示为：

*36a Asp或*36aD

表示在亲本蛋白质中紧靠位置36后插入的天冬氨酸。

多个突变用加号分开，即：

Arg170Tyr＋Gly195Glu或R170Y＋G195E

表示在第170和195位的突变，即酪氨酸和谷氨酸分别替换了精氨酸和甘氨酸。

多个突变也可以用逗号分开，即：

Arg170Tyr,Gly195Glu或R170Y,G195E

术语化合物的“免疫原性”在本发明中指该化合物在包括人在内的动物体内诱导免疫反应的能力。“免疫反应”在本发明中是生物体对化合物的反应，该反应根据四种标准反应（Coombs&Gell所述的类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）中任一种涉及免疫系统。可以通过动物实验（如MINT和SC小鼠）评估免疫原性，C-ELISA（竞争性ELISA）和上皮测定是免疫原性的其他预计方式。

术语化合物的“变应原性”在本发明中是指该化合物在包括人在内的动物体内诱导“变态反应”的能力。本发明的上下文中术语“变态反应”是为生物体对化合物的反应，该反应涉及IgE介导的应答（Coombs&Gell所述的类型I反应）。应理解由于与某化合物接触而致敏（即，产生化合物特异的IgE抗体）是包括在“变态反应”的定义范围内的。

在本发明的上下文中“同源”或“与……同源”应理解为其常规含义，并且两氨基酸序列间的“同源性”应使用威斯康辛大学遗传学计算组（University of Wisconsin Genetic Computer Group）（UWGCG）的软件包中的GAP程序所定义的“相似性”来测定，对于比对参数、比较矩阵、缺口和缺口罚分均使用默认设置。GAP罚分的默认值，即缺口创建罚分为3.0而缺口延伸罚分为0.1（Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711）。该方法在S.B.Needleman和C.D.Wunsch,Journalof Molecular Biology,48,443-445（1970）中也有描述。同一性可由相同的计算得到。两氨基酸序列间的同源性还可以用由UWGCG软件包9.1版的GAP程序计算出的“同一性”或“相似性”测定，使用默认序列比对参数、比较矩阵、缺口和缺口延伸罚分，也可将下列参数用于枯草杆菌酶：缺口创建罚分＝8而缺口延伸罚分＝8，所有其他参数保持为其默认值。程序的输出除了氨基酸序列比对外还有两序列间“同一性百分比”和“相似性”的计算结果。用UWGCG软件包9.1版计算出的数字与8.0版略有差别。

附图简述

图1显示在BDF1小鼠鼻内滴入SEQ ID NO:1枯草杆菌酶和两种本发明的枯草杆菌酶（5P和10P）后第31天的特异性IgE应答，组平均值。

图2a-c显示在BDF1小鼠鼻内滴入SEQ ID NO:1枯草杆菌酶和两种本发明的枯草杆菌酶（5P和10P）后第31天的特异性IgE应答的个体值。

图3显示暴露于SEQ ID NO:1酶和带有*99aE插入的SEQ ID NO:1酶的人上皮细胞培养物的M-CSF-酶剂量/应答曲线。

图4显示枯草菌素BPN’（a）和洒维奈斯(Savinase)（SEQ ID NO:1）之间的比对。可以通过GCG软件包9.1版的GAP程序编号变体得到该比对，使用以下参数：缺口产生罚分＝8，缺口延伸罚分＝8，所有其他参数保持为其默认值。

序列列表

本申请包含以序列列表形式的信息，其附带于本申请并随本申请一起提交数据载体。数据载体的内容在本文中完整引入作为参考。

发明详述

本发明的枯草杆菌酶变体

本发明涉及其中引入了两个或更多突变的SEQ ID NO:1（洒维奈斯）的枯草杆菌酶变体，至少一个突变在亲本枯草杆菌酶的四个表位之一中。本发明人已发现所述枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶（洒维奈斯）相比具有改变的免疫原性。

可以通过对编码亲本枯草杆菌酶的DNA的遗传操作修饰本发明的枯草杆菌酶位置上的氨基酸。具体而言，可以通过对编码亲本枯草杆菌酶的DNA进行遗传处理（如通过缺失、插入或替换）修饰所述的位置。突变通常可以包括插入1－5个氨基酸，如1、2、3、4或5个氨基酸。

突变可以发生在1到4个表位（如1、2、3或4个表位）中。

在本发明的一个具体的实施方案中，突变之一是在位置99后插入谷氨酸(E)（突变表述为*99aE）。表位外的其他突变可以发生在22（如用丙氨酸替换(T22A)）、141（如用天冬酰胺(S141N)或甘氨酸(S141G)替换）、191（如用谷氨酸替换(Q191E)）和247（如用谷氨酰胺替换(R247Q)）中的一个或多个位置。

在本发明的另一个具体实施方案中，可以随机地产生在一个或多个位点被修饰的基因文库，如通过掺入寡聚体诱变改变表位内存在的若干氨基酸。然后可以从这些文库中筛选活性变体（如通过在含有脱脂乳和生长培养基的琼脂板上涂布转化的芽孢杆菌菌落）并选择表达活性变体的克隆用于相关变体基因的测序。

表位中的突变可以发生在57、58和136中的一个或多个位置，其中当替换发生在位置57时用于替换的氨基酸可以是脯氨酸，当替换发生在位置58时用于替换的氨基酸可以是丙氨酸，当替换发生在位置136时用于替换的氨基酸可以选自甘氨酸和赖氨酸；或者表位中的突变可以发生在156、158、160、161和195中的一个或多个位置，其中当替换发生在位置156时用于替换的氨基酸可以选自天冬氨酸和天冬酰胺，当替换发生在位置158时用于替换的氨基酸可以选自缬氨酸和天冬酰胺，当替换发生在位置160时用于替换的氨基酸可以选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，当替换发生在位置161时用于替换的氨基酸可以是天冬氨酸，当替换发生在位置195时用于替换的氨基酸可以是谷氨酸；或者表位中的突变可以发生在78、79、206和211中的一个或多个位置，其中当替换发生在位置78时用于替换的氨基酸可以是脯氨酸，当替换发生在位置79时用于替换的氨基酸可以是苏氨酸，当替换发生在位置206时用于替换的氨基酸可以是亮氨酸，当替换发生在位置211时用于替换的氨基酸可以选自丝氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；或者表位中的突变可以发生在158、160、161、185、195、259和260中的一个或多个位置，其中当替换发生在位置158时用于替换的氨基酸可以选自缬氨酸和天冬酰胺，当替换发生在位置160时用于替换的氨基酸可以选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸，当替换发生在位置161时用于替换的氨基酸可以是天冬氨酸，当替换发生在位置185时用于替换的氨基酸可以是丝氨酸，当替换发生在位置195时用于替换的氨基酸可以是谷氨酸，当替换发生在位置259时用于替换的氨基酸可以选自天冬酰胺和精氨酸，，当替换发生在位置260时用于替换的氨基酸可以选自亮氨酸、异亮氨酸和天冬酰胺。

具体地，本发明的枯草杆菌酶变体可以是以下之一：I79T+*99aE+Q191E；和*99aE+G195P+T260L；和*99aE+G160D+G195P+G211P+T260N。

在另一具体的实施方案中，本发明涉及具有提高的洗涤性能的变体。

在其他实施方案中，本发明涉及本发明枯草杆菌酶变体的表达。

在其他实施方案中，本发明涉及含有本发明枯草杆菌酶变体的组合物，特别是清洁和个人护理组合物。

枯草杆菌酶

如上所述，依照文献Siezen等，Protein Engng.4（1991）719－737和Siezen等，Protein Science6（1997）501－523，枯草杆菌酶组成了丝氨酸蛋白酶的一个亚类。通过以前被称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的170多种丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的同源性分析定义了枯草杆菌酶。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、Thermitase家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。枯草杆菌蛋白酶家族可进一步划分成3个亚组，即，I－S1（“真正的”枯草杆菌蛋白酶）、I－S2（高碱性蛋白酶）和细胞内枯草杆菌蛋白酶。不过，酶的定义或分类是可以变化或改变的，在本发明的上下文中，以上将枯草杆菌酶分为亚部或亚组的划分应按文献所述进行理解：Siezen等，Protein Engng.4（1991）719－737和Siezen等，Protein Science6（1997）501－523。

通过对SEQ ID NO:1亲本枯草杆菌酶或与SEQ ID NO:1亲本枯草杆菌酶具有至少80%同源性、优选85%或90%或95%或98%或99%同源性的枯草杆菌酶进行修饰来获得本发明的枯草杆菌酶变体。

亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶可以是分离自天然来源的枯草杆菌酶，即，野生型枯草杆菌酶，或者可以是分离自天然来源且随后在保留枯草杆菌酶特征的同时已进行了修饰的枯草杆菌酶。可以是亲本枯草杆菌酶的这些枯草杆菌酶变体的例子包括以下文献中所公布的那些：EP130.756、EP214.435、WO87/04461、WO87/05050、EP251.446、EP260.105、WO88/08028、WO88/08033、WO89/06279、WO91/00345、EP525610和WO94/02618。在另一实施方案中，亲本枯草杆菌酶可以是通过DNA改组技术，如文献J.E.Ness等，Nature Biotechnology17，893－896（1999）中所述的技术制备的枯草杆菌酶。此外，还可通过人为产生多样性的标准技术构建亲本枯草杆菌酶，如对不同枯草杆菌酶基因进行DNA改组（WO95/22625；Stemmer WPC，Nature370：389－91（1994））。

可以如《Methods of Enzymatic Analysis》,第三版,1984,Verlag Chemie,Weinheim,第5卷所述测定枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的活性。

在计算机芯片上鉴定枯草杆菌酶中表位模式和表位

可以使用如WO00/26230和WO01/83559详细公开的享有专利权的的计算机芯片作图工具对枯草杆菌酶进行表位作图。简言之，这种工具包含表位模式的数据库（从输入的已知与抗蛋白质抗体特异性结合的肽序列确定）和针对表位模式数据库分析给定蛋白质的3D结构的算法。这会确定蛋白质上可能的表位和表位部分的蛋白质序列中每个氨基酸的偏好。

本文所使用的术语“表位模式”应理解为与抗体结合的肽的共有序列。实例为表位模式ARR*R。该符号中“*”号代表比对的与抗体结合的肽在第二个和第三个精氨酸之间含有一个非共有部分。这个部分可以是任一氨基酸或一些氨基酸或没有氨基酸。表位模式用于鉴定表位和复合抗原上最小的表位。

鉴定与抗体结合的肽

可以通过许多不同方法鉴定与抗体结合的肽。其中之一是合成大量已知序列的肽，并用ELISA或其他免疫化学测定测试其与目的抗体结合的能力。文献中提供了大量这种数据。

特别有效的方法是制备许多不同随机肽序列的文库并通过实验仅选择与抗体结合良好且特异的那些（即与抗体针对其产生的蛋白质完全竞争）。噬菌体展示技术非常适合于这种发现与抗体结合的肽的方法。

在噬菌体展示系统中，将编码目的氨基酸序列的序列整合进编码在噬菌体表面展示的蛋白质的噬菌体基因。从而噬菌体将制造并在其表面展示杂合蛋白，在表面蛋白质可以与特异性靶物质相互作用。由于每个噬菌体含有确定长度的一条特定序列的密码子，中等的噬菌体展示文库可以表达10⁸-10¹²个不同的随机序列。如果展示的序列装配成表位，则可通过表位特异性抗体选择该噬菌体。因此，可以从大量各表达一个杂合蛋白的噬菌体中选择特定的噬菌体。

重要的是噬菌体展示系统所呈递的（寡）肽要具有足够的长度，以呈递待鉴定表位显著的部分。寡肽可以具有从5到25个氨基酸，优选至少8个氨基酸，如至少9个氨基酸。

用于与寡肽反应的抗体可以是多克隆或单克隆的。特别的，它们可以是IgE抗体，以保证所鉴定的表位是IgE表位（即诱导并结合IgE的表位）。抗体也可以是单一特异性的，即它们根据其对某种蛋白质的特异性分离。建立用于计算机芯片作图工具的与抗体结合的肽的数据优选多克隆抗体，以得到对多肽表位更广范的了解。

由于其对抗体的反应性，这些反应性肽在某种程度上装配成全长多肽表位的形态。

从反应性肽鉴定表位模式

比较和比对（如通过噬菌体展示）所鉴定的反应性（寡）肽，以鉴定共同表位模式，然后可将所述共同表位模式用于在3维多肽上鉴定抗体结合表位。

在比对中，氨基酸的保守性替换物（如天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸和精氨酸、丝氨酸和苏氨酸）认为是相同或等价的。因此，比对可得到大量模式，这取决于选择的肽的残基数。以七肽为例，模式可以具有以下形式：

X X**X X X

该记法中“*”表示非共有部分，可以是任一氨基酸或氨基酸组或无氨基酸，而X是以下13个残基类型之一：

AG、C、DE、FY、H、IL、KR、M、NQ、P、ST、V和W，其中AG、DE、FY、IL、KR、NQ、ST对为保守性替换物，视为相同。因此，如

AKSNNKR

AKSMNKR

AKTPNKK

的三个肽产生[AG][KR][ST]*[NQ][KR][KR]的模式，其中残基AGKR ST和NQ KR KR是全部三个肽共享的共有残基，因此表位模式为AG KRST*NQ KR KR。选择模式以用最少可能的模式描述（如通过噬菌体展示和抗体反应得到的）反应性（寡）肽的完全集。

可以从反应性肽直接确定表位模式，例如，如果产生了七肽的反应性肽文库，可以在考虑保守性替换物的情况下使用每个不同的反应性七肽作为下述表位作图方法中的表位模式。还可以通过去除冗余模式和/或使用本领域已知的实验设计减少表位作图中待检查的表位模式数（参阅实施例1）。

表位作图算法

已鉴定表位模式后，接着将其与目的多肽的氨基酸序列的三维坐标进行比较，以鉴定多肽表面与共有序列或表位模式对应的残基组合。由此可以鉴定对抗体结合具有重要性的氨基酸残基。

已经鉴定了一种或多种表位模式，可以对三维结构已知的蛋白质进行表位分析以与表位模式匹配。通过以下方法搜索多肽表面来发现多肽上的表位：

（1）对于多肽中的所有氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与表位模式中的第一个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，该域值使氨基酸为免疫球蛋白反应性。选择满足1（a）和1（b）的氨基酸。

（2）对于所有在选定距离（如10埃）内的步骤1所选择的氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与模式中第二个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，该域值使氨基酸为免疫球蛋白反应性。选择满足2（a）和2（b）的氨基酸。

（3）对于所有在选定距离（如10埃）内的步骤2所选择的氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与模式中第三个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，该域值使氨基酸为免疫球蛋白反应性。选择满足3（a）和3（b）的氨基酸。

对表位模式共有序列中的所有氨基酸重复这一程序（步骤3）。其C-α原子的坐标定义氨基酸的空间位置。按具体残基类型的平均值以百分数给出表面溶剂接近性阈值（参阅实施例1）。

如果表位模式中所有氨基酸的匹配氨基酸都可见于多肽结构中，则强烈指出已经发现了表位。

然而，还要检查表位的大小是否满足，即任何两个残基间的距离小于给定的阈值（通常为

）。

可以根据其总体可及表面区对发现的表位评分和加权，以进一步提高工具的预测性。

最后，当对目的蛋白质所有可能的表位作图后，可以通过把出现在表位模式中的次数相加给出每个氨基酸的分数。这个分数是修饰（替换、插入、缺失、糖基化或化学缀合）该氨基酸会产生具有较低免疫原性的变体的可能性的指标。然后可根据这个分数对蛋白质中的所有氨基酸排序，可以选择分数最高的用于诱变。

可以调整表位作图工具，以仅用已知反应性肽的子集作为建立表位模式的数据集，以此进行表位作图。例如，可以选择仅包括与IgE抗体（而不是IgG或其他抗体）反应的肽，或者可以仅包括与人抗体反应的肽等等。可以选择仅包括与靶蛋白反应的肽，以得到更特异性的结果，然而，一般包括与针对任何蛋白质产生的抗体反应的肽。

如果目的蛋白质没有可用的三维结构坐标，可以直接在目的蛋白质的一级序列上进行表位模式作图。

从以上信息可知，显然可以使用这种表位作图工具便利地确定表位。

另外，计算机芯片表位作图工具可以用于预测突变一个氨基酸残基是否会引起新变体总体具有较少的表位。因此，可以在给定位置测试19种替换可能的一些或全部，重复表位作图程序以模拟这些假想变体的结构，并通过诱变构建最佳变体并进行实验测试。

亲本枯草杆菌酶已鉴定的表位

使用表位作图工具，本发明人已经鉴定了与SEQ ID NO:1的以下位置相对应的四个表位：

表位1:P52-N62、A98-S105、G127-E136、Y167、R170。

表位2:G127、P129、N155-S161、Y167、R170、S188、Y192-G195、N218、N261-L262。

表位3:A1-W6、P14-N18、T38-I44、Q59-N62、L75-I79、S87、N155、N204-N218。

表位4:N6、Q12、G157-S161、D181-N185、Y192-G195、T255-S265。选择突变位置

一旦确定了多肽的表位，可以通过诱变表位中包含的一个或多个氨基酸残基产生具有修饰的免疫特性的多肽变体。在本文中，突变包括缺失和/或替换氨基酸残基和/或在该残基之前或之后插入一个或多个氨基酸。

在提供适于作为酶的多肽变体时，特别需要改变IgE表位以减少IgE结合，而同时维持变体的活性和稳定性，因此需要该多肽保留亲本多肽的三维构象。

可以通过替换表位的至少一个氨基酸突变所鉴定的表位。突变经常是用不同大小、亲水性、极性和/或酸度的氨基酸进行替换，如用小氨基酸替换大氨基酸、用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸、用极性氨基酸替换非极性氨基酸和用碱性氨基酸替换酸性氨基酸。

可以通过本领域技术人员熟知的标准技术实施突变，如定向诱变（参阅如Sambrook等(1989),《Molecular Cloning.A Laboratory Manual》,ColdSpring Harbor,NY）。

诱变可以是spiked诱变（定向诱变的一种形式），其中用一个或多个位置的寡核苷酸混和物合成所使用的引物。

核苷酸替换的一般描述可见如Ford等,1991,《Protein Expression andPurification2》,95-107页。

本发明的枯草菌素变体涉及这样的变体：其中至少一个突变在已鉴定的表位之一中，以改变变体与亲本枯草杆菌酶相比的免疫原性。特别是变体与亲本枯草杆菌酶相比具有改变的抗体结合谱，更特别是与保留的性能和/或活性和/或稳定性相组合。更特别的，与亲本枯草杆菌酶相比，变体在暴露的动物（包括人）中具有改变的免疫原性谱。另外，与亲本枯草杆菌酶相比，变体在暴露的动物（包括人）中诱导改变的免疫应答，优选减少变应原性的应答。

具有改变的免疫特性的变体的验证

如表位的计算机芯片确定所预测，表位中包含的氨基酸突变会使多肽的免疫性质发生变化。然而，应用多种体内或体外模型系统适当地测定突变对免疫原性（对抗体结合和抗体的免疫原性）的定量效果。可以通过使用枯草杆菌酶变体的纯化制剂测试本发明的枯草杆菌酶变体改变的变应原性和/或免疫原性。因此在测试枯草杆菌酶变体改变的变应原性和/或免疫原性之前可以通过常规方法对其进行大规模表达和/或纯化。

可以使用剂量应答曲线和例如直接或竞争性ELISA(c-ELISA)（如WO99/47680所述）或通过其他固相免疫测定或细胞测定详细检测抗体结合。

在具体的实施方案中，多肽变体的残留结合至少为5%，如10%或20%或30%，更优选至少40%如50%或60%或70%，最优选至少80%，如85%或90%或95%或98%或99%或100%。

在另一具体的实施方案中，结合亲和力不为1。与亲本酶相比，结合亲和力可以低于1，如低于0.9，如0.8或0.7或0.6，或低于0.5，如0.4或0.3或0.2，或低于0.15，如0.1或0.05或0.01。与亲本酶相比，结合亲和力也可以高于1，如高于1.5或2.0或3.0或4.0或5.0或高于7.0，如10或15或20或30，或高于40，如50或60或70或80或90或100或150或200。

在具体的实施方案中，可以在人气升上皮细胞测定中体外筛选降低的变应原性和协助(adjuvancy)。将人肺上皮细胞接种于聚碳酸酯组织培养插片(insert)上，置于组织培养平板的孔中。将细胞培养至汇合。然后去除插片中的培养基，将细胞在由此产生的液气界面再培养3天。然后用提高剂量的酶刺激细胞4小时。然后收获上清液并测量上清液中酶触发的M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。具有降低的变应原性和协助的变体需要较高的剂量以引发与亲本蛋白质可比较的M-CSF应答。实施例7所述的上皮测定显示，为引发与用亲本蛋白质刺激可比较的M-CSF应答，上皮细胞应答于酶变体刺激的M-CSF产生需要更高的酶剂量（表3）。具体而言，对于具有降低的变应原潜能的酶变体，与亲本蛋白质相比，酶变体触发的M-CSF应答降低至少2倍，优选至少5、10、25倍或40、60、80、100倍，或甚至150或200倍。此外，当用较高量的蛋白酶触发时，通过上皮细胞M-CSF释放降低测定的变体毒潜能有所降低。

在具体的实施方案中，体内验证包括皮肤刺痛实验（SPT），其中使枯草杆菌酶过敏性受试者/个体的皮肤接触枯草杆菌酶，接着用针刺，其后以风团和潮红反应的直径衡量IgE反应性，将应答于本发明多肽变体的应答与亲本枯草杆菌酶引起的应答进行比较（Kronquist等,Clin.Exp.Allergy,2000,30卷,670-676页）。

也可以适当的在动物测试中衡量本发明多肽变体的体内免疫性质，其中使测试动物接触亲本枯草杆菌酶，并测量对变体和亲本枯草杆菌酶变应原的应答。免疫应答测量可以包括比较来自测试动物的血清IgE或T细胞与亲本枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的反应性。

在具体的实施方案中，体内验证包括通过鼻内途径使小鼠接触亲本枯草杆菌酶，并验证血清IgE与枯草杆菌酶变体的反应性低于与亲本枯草杆菌酶的反应性。有用的体内动物模型包括小鼠鼻内测试（MINT）模型（Robinson等,Fund.Appl.Toxicol.34,15-24页,1996）。因此涉及本发明的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶时，术语降低的变应原性应理解为与亲本枯草杆菌酶相比更低的IgE应答或无应答。具体而言，在所述测定中测量的应答于所述枯草杆菌酶变体和/或所得到的IgE水平可以是分别是应答于亲本枯草杆菌酶/洒维奈斯所得到的IgE水平的35%，如30%或25%或20%或15%或10%。

另外，体内验证可以包括通过气管内途径使测试动物接触多肽变体，并验证豚鼠中的特异性IgE效价或IgG效价是否低于亲本枯草杆菌酶。有用的体内动物模型包括豚鼠气管内模型(GPIT)（Ritz等，Fund.Appl.Toxicol.，21，第31－37页，1993）和大鼠气管内模型（大鼠IT）（WO96/17929，NovoNordisk）。

另外体内验证还包括使测试动物皮下接触枯草杆菌酶变应原和枯草杆菌酶变体。同样的可以测量这种接触途径后的IgE结合和交叉反应。合适的模型为小鼠皮下模型（小鼠SC）模型（WO98/30682,Novo Nordisk）。

生产枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶的方法

本发明的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶可以用本领域内的任何已知方法生产，且本发明还涉及编码本发明枯草杆菌酶变体或枯草杆菌的核酸、含所述核酸的DNA构建体和含所述核酸序列的宿主细胞。

一般而言，天然存在的蛋白质可以通过培养表达该蛋白质的生物体且随后纯化该蛋白质而产生，或者可以通过将编码该蛋白质的核酸如基因组DNA或cDNA克隆入表达载体中，然后将所述的表达载体引入宿主细胞中，培养此宿主细胞并纯化所表达的蛋白质而产生。

通常，可以通过亲本蛋白质的定点诱变以及引入表达载体、宿主细胞中等步骤产生蛋白质变体。亲本蛋白质可以克隆自产生所述多肽的株系或表达文库，即，它可以分离自基因组DNA或从cDNA制备而来，或者使用两种方法相结合而获得。

一般而言，为了获得亲本枯草杆菌酶或本发明的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体，可以利用基因克隆和/或在所述基因中引入突变（随机的和/或定点的）的标准方法。有关合适的技术的进一步描述，参阅以下文献：分子克隆：实验室手册（Molecular cloning：A laboratory manual）（Sambrook等，（1989），冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等（编辑））；分子生物学通用方法（Current protocols in Molecular Biology）（John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.（编辑））；有关芽孢杆菌的分子生物学方法（Molecular Biological Methods for Bacillus）（John Wiley and Sons，1990）；DNA克隆：实用方法（DNA Clonging：A Practical Approach），卷I和II（D.N.Glover编辑，1985）；寡核苷酸合成（Oligonucleotide Synthesis）（M.J.Gait编辑，1984）；核酸杂交（Nucleic Acid Hybridization）（B.D.Hames&S.J.Higgins编辑（1985））；转录和翻译（Transcription And Translation）（B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑（1984））；动物细胞培养（Animal Cell Culture）（R.I.Freshney，编辑（1986））；固定化细胞和酶（Immobilized Cell AndEnzymes）（IRL出版社，（1986））；分子克隆实用指南（A Practical GuideTo Molecular Cloning）（B.Perbal，（1984））和WO96/34946。

表达载体

含有编码本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的核酸序列的重组表达载体可以是便于进行重组DNA操作且可以引起所述核酸序列表达的任何载体。

载体的选择通常取决于它要导入的宿主细胞。适宜载体的例子包括线性或闭环质粒或病毒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制是不依赖于染色体的复制的，如，质粒，染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何元件。细菌的复制起点的例子有质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子有：2μ复制起点、CEN6和ARS4的联合以及CEN3和ARS1的联合。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中具有温度敏感功能的突变体（参阅，如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1433）。

或者，载体可以在被引入宿主细胞后整合入基因组中并与所整合的染色体一起复制。待整合入宿主细胞基因组中的载体可以包含能使向基因组中的整合成为可行的任何核酸序列，尤其是它可以包含利于通过同源或非同源重组方式整合入基因组的核酸序列。载体系统可以是单个的载体，如质粒或病毒，或者是两个或多个载体，如多个质粒或多个病毒（它们一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA）或者是转座子。

载体尤其可以是表达载体，其中编码本发明枯草杆菌酶的DNA序列与DNA转录所需的其它区段或调控序列可操作地连接。术语“可操作连接”指对区段进行排列，从而使它们为其预期目的协同地发挥作用，如，转录起始于启动子内并沿着编码枯草杆菌酶变体的DNA序列进行。其它区段或调控序列包括启动子、前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号序列和转录终止子。调控序列至少包括启动子和转录及翻译终止信号。

启动子可以是在所选择宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括枯草杆菌（B.subtilis）果聚糖蔗糖酶基因（sacB）、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因（amyM）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）α－淀粉酶基因（amyL）、淀粉液化芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）α－淀粉酶基因（amyQ）、枯草杆菌碱性蛋白酶基因、或短小芽胞杆菌（B.pumilus）木糖苷酶基因、淀粉液化芽孢杆菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP）、枯草杆菌xylA和xylB基因和原核β－内酰胺酶基因（Villa－Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：3727－3731）的启动子。其它例子包括λ噬菌体P_R或P_L启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子或天蓝色链霉菌（streptomyces coelicolor）琼脂酶基因（dagA）。其它的启动子如文献所述：“来自重组细菌的有用蛋白质”（Useful proteins fromrecombinant bacteria），《Scientific American》，1980，242：74－94；和Sambrook等，1989，见上引文。

在丝状真菌宿主细胞中使用的适宜启动子的例子有：来自编码米曲霉（A.oryzae）TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉（A.niger）中性α－淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α－淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉（A.awamori）葡糖淀粉酶（glaA）、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉（A.nidulans）乙酰胺酶、尖镰孢（Fusarium Oxysporum）胰蛋白酶样蛋白酶（如美国专利4288627所述，该文件在此收编作为参考）的基因的启动子及其杂合物。尤其优选用于丝状真菌宿主细胞中的启动子是TAKA淀粉酶、NA2－tpi（来自编码黑曲霉中性α－淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合物）和glaA启动子。另外的适用于丝状真菌宿主细胞的启动子是ADH3启动子（McKnight等，TheEMBO J.4（1985），2093－2099）或tpiA启动子。

适用于酵母宿主细胞的启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因（Hitzeman等，J.Biol.Chem.255（1980），12073－12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1（1982），419－434）或醇脱氢酶基因（Young等，化学制品中所用的微生物遗传工程（Genetic Engineering of Microorganisams forChemicals）（Hollaender等编辑），Plenum出版社，纽约，1982）的启动子，或TPI1（US4599311）或ADH2－4c（Russell等，Nature304（1983），652－654）启动子。

其它的有用启动子可以获自酿酒酵母烯醇化酶（ENO－1）基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因（GAL1）、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因（ADH2/GAP）和酿酒酵母3－磷酸甘油酸盐激酶基因。对于酵母宿主细胞来说有用的其它启动子如文献所述：Romanos等，1992，Yeast8：423－488。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括病毒启动子，如那些来自猿猴病毒40（SV40）、劳氏肉瘤病毒（RSV）、腺病毒和牛乳头瘤病毒（BPV）的启动子。

适用于哺乳动物细胞的启动子的例子有SV40启动子（Subramani等，Mol.Cell Biol.1（1981），854－864）、MT－1（金属硫蛋白基因）启动子（Palmiter等，Sciences222（1983），809－814）或腺病毒2主要晚期启动子。

适用于昆虫细胞的启动子的例子是多角体蛋白启动子（US4745051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311，（1992）7－11）、P10启动子（J.M.Vlak等，J.Gen.Virology69，1988，第765－776页）、苜蓿银纹夜蛾多角体病毒碱性蛋白启动子（EP397485）、杆状病毒立即早期基因1启动子（US5155037；US5162222）或杆状病毒39K延迟早期基因启动子（US5155037；US5162222）。

如果有必要，编码本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的DNA序列还可以与适当的终止子可操作地连接。

本发明的重组载体可以进一步含有使载体能在所关心的宿主细胞内复制的DNA序列。

所述的载体还可以包含选择性标记，如，其产物补充了宿主细胞中的不足的基因，或者抗性基因，如抗氨卡青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等抗生素的抗性基因，或者抗重金属、病毒或除草剂的抗性基因，或其产物造成原养型或营养缺陷型的基因。细菌选择标记的例子是来自枯草杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，具抗性。常常使用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶基因（DHFR）。适用于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可选自以下，但不局限于此：amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（膦丝菌素乙酰转移酶）、hygB（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清酸核苷－5’－磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺苷酰转移酶）、trpC（氨基苯甲酸合酶）和glufosinate抗性标记，以及来自其它物种的等价物。具体而言，用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）的bar标记。此外，可以通过共转化完成选择，如WO91/17243所述，其中的选择性标记在分开的载体上。

为了指引本发明的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列（也称为前导序列、前原序列或前序列）。分泌信号序列在正确的阅读框中与编码所述酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常置于编码该酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是正常与所述酶相关的序列，或者可以来自编码另一分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子以及任选地终止子和/或分泌信号序列，或者通过适当的PCR扩增方案装配这些序列并将它们插入含复制或整合所必需信息的合适载体的技术都是本领域技术熟练人员众所周知的（参阅，例如，Sambrook等的著作）。

可以将一个以上拷贝的编码本发明酶的核酸序列插入宿主细胞中以扩增核酸序列的表达。用本领域众所周知的方法将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞中并对转化体进行选择可以实现核酸序列的稳定扩增。

本发明的核酸构建体还可包含编码一种或多种有利于多肽表达的因子的一个或多个核酸序列，所述因子如，激活物（如，反式作用因子）、陪伴分子和加工蛋白酶。在所选宿主细胞内起作用的任何因子都可用于本发明中。编码一个或多个这样因子的核酸不一定与编码本发明多肽的核酸串联。

宿主细胞

编码本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的DNA序列对于其所进入的宿主细胞来说可以是同源或异源的。如果它与宿主细胞同源，即，由宿主细胞天然产生，它通常可操作地连接非其天然环境中的另一启动子序列，或者，如果适当的话，另一分泌信号序列和/或终止序列。术语“同源的”意图包括所编码酶对于所述宿主生物体是天然酶的DNA序列。术语“异源的”意图包括不是由宿主细胞天然表达的DNA序列。从而，该DNA序列可以来自另一生物体，或者可以是合成的序列。

本发明的DNA构建体或重组载体所导入的宿主细胞可以是能生产本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的任何细胞，诸如原核生物如细菌等或真核生物，如酵母或丝状真菌等真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

培养时能产生本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌，如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、短芽孢杆菌（B.brevis）、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌（B.coagulans）、环状芽胞杆菌（B.cirulans）、灿烂芽孢杆菌（B.lautus）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）或苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）等，或变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)等链霉菌(streptomyces)菌株，或者是大肠杆菌(E.cdi)或假单胞菌（Pseudomonas sp.）等革兰氏阴性细菌。

可通过原生质体转化、电穿孔、接合或通过用感受态细胞以本质已知的方式完成细菌的转化（参阅，Sambrook等人，见上引文）。

当在芽孢杆菌或链霉菌菌株等革兰氏阳性菌中表达枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体时，所述的酶可以保留在细胞质中，或者可以在细菌分泌序列的指引下到达细胞外培养基。在后一种情况下，如下所述从培养基中回收所述的酶。

宿主酵母细胞的例子包括假丝酵母属（candida）、克鲁维酵母属（kluyveromyces）、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、假丝酵母（candida）、毕赤氏酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)或Yarrowia属种的细胞。在一个具体的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母(S.carlsbergensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母（S.diastaticus）、saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母（S.kluyveri）、诺地酵母（saccharomyces norbensis）或卵形酵母（S.oviformis）细胞。其它有用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Yarrowia lipolytica、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilgo maylis)、Candida maltose、季尔蒙氏毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Pichia methanolio细胞（参阅，Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，1986，第3459－3465页；US4882279和US4879231）。因为酵母的分类在未来有可能会改变，就本发明的目的而言，应按如下文献所述定义酵母：酵母的生物学和活性（Biology and Activities of Yeast）（Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编辑，Soc.App.Bacteriol.学术会议系列号9，1980）。酵母的生物学和酵母遗传操作是本领域众所周知的（参阅，如，酵母的生化和遗传学（Biochemistry and Genetics of Yeast），Bacil，M.，Horecker，B.J.，和Stopani，A.O.M.，编辑，第二版，1987；酵母（The Yeasts），Rose，A.H.，和Harrison，J.S.，编辑，第二版，1987；和酵母属的分子生物学（The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces），Strathem等，编辑，1981）。可以用以下文献所述的方法转化酵母：Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology），第194卷，第182－187页，Academic Press Inc.，纽约；Ito等，1983，Journal of Bacteriology153：163；和Hinnen等，1978，Proceeding of theNational Academy of Sciences USA75：1920。

丝状真菌细胞的例子包括丝状形式的真菌亚门（Eumycota）和卵菌亚门（Oomycota）（按文献所定义的：Hawksworth等，1995，同上引文），尤其是它可以是以下菌属的细胞：枝顶孢属(Acremonium)，如A.chrysogenum等；曲霉属(Aspergillus)，如泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)或米曲霉(A.oryzae)；镰孢霉(Fusarium)，如杆孢状镰孢(F.bactridioides)、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminerarum)、禾赤镰孢(F.graminum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、合欢木镰孢(F.negundi)、多枝镰孢(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、肤色镰孢(F.sarcochroum)、硫色镰孢(F.sulphureum)、F.trichothecioides或尖镰孢(F.oxysporum)；腐质霉属(Humicola)，如H.insolens或H.lanuginose；毛霉属(Mucor)，如米黑毛霉(M.miehei)；毁丝霉属(Myceliophthora)，如M.thermophilum；脉孢霉属(Neurospora)，如粗糙脉孢霉(N.crassa)；青霉属(Penicillium)，如产紫青霉(P.purpurogenum)；梭孢壳属(Thielavia)，如T.terrestris；Tolypocladium；或木霉属(Trichoderma)，如T.harzianum、康宁木霉(T.koningii)、T.longibrachiatum、T.reesei或绿色木霉(T.viride)，或者其有性型或同物异名。利用曲霉属菌种表达蛋白质可参见如文献EP272277、EP230023所述。

昆虫细胞的例子包括鳞翅目细胞系，如秋粘虫细胞(spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞（参阅US5077214）。培养条件可适宜地如WO89/01029或WO89/01028所述。可按文献所述进行昆虫细胞的转化和异源多肽的生产：US4745051；US4775624；US4879236；US5155037；US5162222；EP397485。

哺乳动物细胞的例子包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、COS细胞或可来自如美国典型培养物保藏中心等机构的其它永生化细胞系。转染哺乳动物细胞并表达引入该细胞的DNA序列的方法参阅以下文献：Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159（1982），601－621；Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1（1982），327－341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982),422-426;Wigler等，Cell14（1978），725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics7（1981），603；Ausubel等，分子生物学通用方法（Current Protocols in Molecular Biology），John Wiley andSons，Inc.，纽约，1987，Hawley－Nelson等，Focus15（1993），73；Ciccarone等，Focus15（1993），80；Graham和van der Eb，Virology52（1973），456；和Neumann等，EMBO J.1（1982），841－845。可以用Graham和Van der Eb的磷酸钙沉淀法（1978，Virology52：546）通过直接摄取转染哺乳动物细胞。

表达和分离蛋白质的方法

为了表达本发明的酶，通常将用含有编码本发明酶的核酸序列的载体所转化或转染的上述宿主细胞在允许期望分子产生的条件下培养于适当的营养培养基中，然后从细胞或培养液中回收这些分子。

用于培养宿主细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常规培养基，如含适当补充物的基本或复杂培养基。适当的培养基可获自供应商或可以按已公布的配方制备（如，参阅美国典型培养物保藏中心的目录）。培养基也可以用本领域已知的方法制备（参阅，如，有关细菌和酵母的文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.编辑，真菌中更多的基因操作（More GeneManipulations in Fungi），Academic Press，CA，1991）。

如果本发明的酶分泌至营养培养基中，它们可以直接从培养基中回收。如果它们不分泌，则可以从细胞裂解物中回收。本发明的酶可以用常规方法回收自培养基，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，用硫酸铵等盐沉淀上清液或滤液中的蛋白质性组分，用各种层析方法进行纯化，如，离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析等等，具体方法取决于目的酶。

本发明的酶可以用本领域已知对这些蛋白质特异的方法进行检测。这些检测方法包括特异抗体的使用、产物的形成或底物的消失。例如，酶检测法可以用于测定所述分子的活性。用于测定各种活性的方法是本领域所已知的。

本发明的酶可以用本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不局限于，层析法（如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）、电泳方法（如，制备型等电聚焦（IEF））、差异溶解（如，硫酸铵沉淀）或提取（参阅，如，蛋白质纯化（Protein Purification），J－C Janson和Lars Ryden，编辑，VCH Publishers，纽约，1989）。

当含有编码本发明酶的DNA序列的表达载体被转化/转染入异源宿主细胞后，可以实现该酶的异源重组生产。使用异源宿主细胞的优势是，可以产生高度纯化的酶组合物，其特征是不含有同源杂质（当蛋白质或肽表达于同源宿主细胞中时常常存在这些同源杂质）。在此上下文中，同源杂质指来源于本发明酶最初来自的细胞的同源细胞的任何杂质（如，除了本发明酶之外的其它多肽）。

商品化的酶应用

本发明还涉及含本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的组合物。例如，可以将枯草杆菌酶/枯草杆菌酶变体应用于个人护理用的组合物，如洗发香波、皂条、润肤液、润肤霜、染发剂、牙膏、隐形眼镜、化妆品（cosmetics）、化妆用品(toiletries)，或者是处理纺织品的组合物、制备食品的组合物(如烘焙的食物或饲料)，或者是清洁组合物，如洗涤剂、洗盘组合物或清洁硬表面的组合物。

洗涤剂

本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体可用于如洗涤剂组合物中。它可以以无粉尘颗粒、稳定液体或受保护的酶的形式包含于洗涤剂组合物中。无粉尘颗粒可以按，如US4106991和4661452所述产生，且可任选的用本领域已知方法进行包衣。蜡样包衣材料的例子有平均分子量1000－20000的聚（环氧乙烷）产品（聚乙二醇，PEG）；含16－50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中的醇具有12－20个碳原子且其中有15－80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适于通过流化床技术应用的形成薄膜的包衣材料的例子可见于专利GB1483591。例如，按照已建立的方法通过添加多羟基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸可以稳定液体枯草杆菌酶/枯草杆菌酶制品。其它的酶稳定剂是本领域众所周知的。受保护的枯草杆菌酶/枯草杆菌酶变体可以按EP238216中所公布的方法制备。

洗涤剂组合物可以制备成任何方便的形式，如粉、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含多达70%的水和0－30%的有机溶剂，或者是非水性的。

洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，其中每一种都可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或两性离子的。洗涤剂通常含0－50%阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐（LAS）、α－烯烃磺酸盐（AOS）、烷基硫酸盐（脂肪醇硫酸盐）（AS）、醇乙氧基硫酸盐（AEOS或AES）、仲型链烷磺酸盐（SAS）、α－磺基脂肪酸甲酯、烷基－或烯基琥珀酸或皂。它还可以包含0－40%的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物（AEO或AE）、羧基化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺（如，WO92/06154中所述）。

洗涤剂组合物可另外含有一种或多种其它酶，如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪分解酶、角质酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶和其它抗微生物多肽。

洗涤剂可以含有1－65%的助洗剂或络合剂，如，沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸（NTA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二亚乙基三胺五乙酸（DTMPA）、烷基或烯基－琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐（如，来自Hoechst的SKS－6）。洗涤剂也可以是未复配的，即，基本上不含助洗剂。

洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。例如，羧甲基纤维素（CMC）、聚（乙烯吡咯烷酮）（PVP）、聚乙二醇（PEG）、聚（乙烯醇）（PVA）、聚羧酸盐、聚丙烯酸盐、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白体系，其中可以包括过硼酸盐或过碳酸盐等过氧化氢来源，它们可以与四乙酰基乙二胺（TAED）或壬酰氧基苯磺酸盐（NOBS）等形成过酸的漂白活化剂组合。或者，漂白体系中可以含有酰胺、酰亚胺或砜类等过氧酸。

洗涤剂组合物可以用常规的稳定剂稳定，如，丙二醇或丙三醇等多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸衍生物，且可以按例如WO92/19709和或WO92/19708所述配制所述的组合物。

洗涤剂中还可以包含其它常规的洗涤剂成分，如织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。

pH（在使用浓度的水溶液中检测到的）值通常是中性或碱性的，如，在7－11的范围内。

洗盘组合物

此外，本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体还可用于洗盘洗涤剂中。

洗盘洗涤剂组合物通常含有表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、兼性的或这些类型的混合物。该洗涤剂可以含有0－90%的非离子表面活性剂，如低泡至无泡型乙氧基化丙氧基化直链醇。

所述的洗涤剂组合物可以含有无机和/或有机类型的助洗剂盐。此助洗剂可以细分为含磷和不含磷的类型。所述的洗涤剂组合物通常含1－90%的助洗剂。

当存在含磷无机碱性助洗剂时，其例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷有机碱性助洗剂时，其例子包括膦酸的水溶性盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性结晶的或无定形的硅铝酸盐，其中沸石是最熟知的代表。

适宜的有机助洗剂的例子包括(碱金属、铵和取代的铵的)柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵盐、羧酸盐、多羧酸盐、氨基多羧酸盐、聚乙酰基羧酸盐和多羟基磺酸盐。

其它合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂特性的较高分子量的聚合物和共聚物，例如，适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及它们的盐。

洗盘洗涤剂组合物可以包含氯型/溴型或氧型的漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的例子是杂环N－溴和N－氯酰亚胺如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸和二氯异氰尿酸，以及它们与钾和纳等水溶性阳离子的盐。乙内酰脲化合物也是适合的。

氧漂白剂可以是无机过酸盐的形式，尤其是与漂白前体一起或作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白剂化合物的例子包括碱金属过硼酸盐，如四水化物和一水化物，以及碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。活化剂物质尤其可以是TAED和甘油三乙酸酯。

洗盘洗涤剂组合物可用常规的酶稳定剂进行稳定，如多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸衍生物。

洗盘洗涤剂组合物还可包含其它的常规洗涤剂成分，如，抗絮凝剂物质、填充物质、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂、增稠剂和香料。

最后，本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体可用于常规的洗盘洗涤剂中，如用于以下专利文献所述的任何洗涤剂中：

EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP516554、EP516555、GB2200132、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、WO93/17089、DE4205071、WO52/09680、WO93/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、EP429124、WO93/21299、US5141664、EP561452、EP561446、GB2234980、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP346137、US5112518、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、GB2228945、CA2006687、WO93/25651、EP530635、EP414197、US5240632。

个人护理应用

本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的另一应用领域是个人护理领域，其中目的用户与蛋白质有紧密的接触，且在实验设置中已遇到了某些变应原性问题（Kelling等，J.All.Clin.Imm.，1998，第101卷，第179－187页，和Johnston等，Hum.Exp.Toxicol.，1999，第18卷，第527页）。

首先，本发明的缀合物或组合物可以有利地用于个人护理产品，如头发护理和头发处理产品。这包括香波、香膏、头发调理剂、卷发剂、染发组合物、生发油、美发液、发乳、洗发水、护发素、喷发胶等产品。

此外所考虑的是口腔护理产品，如洁齿剂、漱口水、口香糖。

还考虑的是皮肤护理产品和化妆品，如护肤霜、护肤乳、清洁霜、清洁露、清洁蜜、冷霜、皂膏、滋养精华、皮肤洗液、乳状洗液、炉甘石洗液、护手霜、皂粉、透明皂、晒黑油（sun oil）、防晒剂、剃须泡沫、剃须膏、婴儿润肤油、唇膏、唇霜、膏状粉底、搽脸粉、眼影粉、脂粉、粉底、化妆底霜、香精粉（essence powder）、增白粉。

本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体还可有利地用于隐形眼镜卫生产品中。这些产品包括清洁和消毒隐形眼镜的产品。

食品和饲料

本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶还可用于食品或饲料产品中。例如，所述的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶可用于改变生面团的面筋状态，如，用蛋白酶使硬的小麦面粉变软。另一例子是在酿酒工业中，其中所述的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶可用于未制成麦芽的谷物一起酿造并/或用于控制氮含量。

在动物饲料工业中，所述的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可用于好比扩大动物的消化系统。

材料和方法

材料

ELISA试剂：

标记了辣根过氧化物酶的猪抗兔Ig（Dako，DK，P217，稀释度1：1000）

小鼠抗大鼠IgE（Serotec MCA193；稀释度1：200）

生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体（Zymed03－9140；稀释度1：1000）

生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体（Serotec MCA336B；稀释度1：2000）

链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Kirkegard&Perry14－30－00；稀释度1：1000）

OPD：邻苯二胺（Kementec目录号4260）

常规方法制备的兔抗洒维奈斯多克隆IgG

常规方法制备的大鼠抗洒维奈斯多克隆IgE

缓冲液和溶液：

PBS(pH7.2(1升))

方法

用ELISA测量s.c.小鼠模型中特异性IgE的浓度

按照以下步骤用三层夹层ELISA法测定小鼠中应答皮下（S.C.）注射的蛋白质产生的特异IgE血清抗体的相对浓度：

1）用10μg大鼠抗小鼠IgE（Serotech MCA419；稀释度1：100）缓冲液1包被ELISA－平板（50μL/孔）。在4℃保温过夜。

2）倾空平板，并用含2%（重量/体积）脱脂乳的PBS在室温封闭至少半小时（200μL/孔）。轻轻摇晃。用含0.05%（体积/体积）Tween20的PBS洗平板3次。

3）平板与小鼠血清一起保温（50μL/孔），所述血清从未稀释的浓度开始并持继作2倍稀释。保留某些孔不加血清而仅加入缓冲液4（空白）。室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05%（体积/体积）Tween20的PBS漂洗平板3次。

4）用含0.05%（体积/体积）Tween20、0.5%（重量/体积）脱脂乳的PBS将枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体稀释至适当的蛋白浓度。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05%（体积/体积）Tween20的PBS漂洗平板3次。

5）将用于检测所结合抗体的特异多克隆抗枯草杆菌酶或抗枯草杆菌酶变体抗血清的血清稀释于含0.05%（体积/体积）Tween20、0.5%（重量/体积比）脱脂乳的PBS中。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05%（体积/体积）Tween20的PBS漂洗平板3次。

6）将缀合了辣根过氧化物酶的抗pIg抗体稀释于含0.05%（体积/体积）Tween20、0.5%（重量/体积比）脱脂乳的PBS中。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05%（体积/体积）Tween20的PBS漂洗平板3次。

7）将0.6mg ODP/ml+0.4μL H₂O₂/ml于pH5.2的柠檬酸盐缓冲液中混合。

8）溶液在临用前制备并保温10分钟。

9）50μL/孔。

10）加入50μL2N H₂SO₄/孔终止反应。

11）平板在492nm波长处读数，以620nm的读数为参照。

用抗小鼠IgG和标准大鼠IgG试剂可以进行IgG的类似测定。

用ELISA测定在MINT试验中特异IgE的浓度

按照以下步骤用三层夹层ELISA法测定小鼠体内应答鼻内施用的蛋白质产生的特异IgE血清抗体的相对浓度：

1）用100μL/孔大鼠抗小鼠IgE重链（1：100稀释于0.05M碳酸盐缓冲液pH9.6中的HD-212-85-IgE3）包被ELISA平板（Nunc Maxisorp）。在4℃保温过夜。

2）倾空平板，并用200μL/孔含2%脱脂乳的0.15M PBS缓冲液（pH7.5）在4℃封闭1小时。用含0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。

3）平板与小鼠血清稀释物一起保温（100μL/孔），所述稀释物从8倍稀释开始并由此2倍稀释于含0.5%脱脂乳和0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液中。包括适当稀释度的阳性和阴性对照血清样品加上缓冲液对照。室温保温1小时。轻轻摇晃。用含0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。

4）将在含0.5%脱脂乳和0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液中稀释至1μg蛋白/ml的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体以100μL/孔的量加入平板中。将平板在4℃保温1小时。用含0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。

5）将用于检测所结合抗原的特异多克隆抗枯草杆菌酶或抗枯草杆菌酶变体抗血清的血清稀释于含0.5%脱脂乳和0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液中。以100μL/孔的量在4℃保温1小时。用含0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。

6）将1：1000稀释于含0.5%脱脂乳和0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液中且与辣根过氧化物酶缀合的猪抗兔Ig以100μL/孔的量加入平板中。4℃保温1小时。用含0.05%Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。

7）在平板中加入250μL/孔0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH5.0。保温约1分钟。然后倾空平板。

8）在平板中加入100μL/孔的邻苯二胺（OPD）溶液（10mg OPD稀释于12.5ml柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH5.0中，临用前加入12.5μL30%过氧化氢）。室温保温4分钟。

9）加入150μL/孔的1M H₂SO₄终止反应。

10）平板在490nm波长处读数，以620nm的读数为参照。

实施例

实施例1洒维奈斯中表位的鉴定

从以表面蛋白的一部分表达随机寡聚肽（六肽、九肽或十二肽）的高度多样性噬菌体文库中筛选它们结合抗体的能力。噬菌体文库得自Schafer-N,Copenhagen,Denmark和New England Biolabs Inc,UK。

通过胃肠外或粘膜施用以下列出的每种蛋白质，在动物（大鼠、兔或小鼠）中产生抗体样品。将抗体溶于磷酸缓冲液（PBS）。在一些情况下，可以通过辛酸沉淀（对于总IgG）从免疫动物的血清分离特定亚类的抗体，或者为了分离靶特异性大鼠IgG、小鼠IgG、小鼠IgE和兔IgG，通过使用装载特异性抗体亚型（纯化IgG1、IgG4、IgE）或靶蛋白（如迟缓芽孢杆菌蛋白酶（洒维奈斯^TM））的顺磁性免疫珠（Dynal AS）的亲和层析进行分离。

还从得自致敏的人的血清获得蛋白质特异性的抗体。将噬菌体文库与包被抗体的珠子孵育。如用表达对小鼠IgE抗体有亲和力的寡肽的噬菌体俘获大鼠抗小鼠IgE包被的珠子，然后通过将这些顺磁性珠子置于磁场中进行收集。通过温和的酸处理、噬菌体敏感型大肠杆菌菌株直接感染、用各抗体样品特异性的完整蛋白质抗原洗脱或这些方法的组合将收集的噬菌体从固化的抗体上洗脱。可以使用本领域已知的方法扩增分离的噬菌体。

通过在聚乙二醇存在下的离心从细胞上清液中分离特定的噬菌体克隆。根据本领域已知的标准方法分离DNA，通过PCR扩增编码寡肽的DNA序列并测定其DNA序列。从DNA序列推出相应寡肽的氨基酸序列。

用文献中已公开的信息补充这些试验测定的反应性肽。

将序列收集于数据库中，并通过序列比对进行分析，以鉴定表位模式。

鉴定表位模式

原则上，每个反应性（寡）肽序列代表一个表位模式。然而，一些表位模式是冗余的，为了从表位模式中去除冗余性，将反应性（寡）肽序列提交计算机数据分析。

首先在考虑保守性替换物的情况下产生13²种不同组合所对应的所有可能的二肽。列出反应性（寡）肽序列中每个二肽的存在和频率。接着产生与13³种不同组合相对应的所有可能的三肽，然后再次列出所有每个三肽中反应性（寡）肽序列中的存在和频率。然后产生列出的二肽和三肽所有可能的组合，包括在二肽和三肽之间含有1、2、3或4个插入残基的组合，这些残基选自可能的残基类型。这一过程产生氨基酸的不同肽组合的列表，每个组合含有来自最初列表的至少一个二肽和至少一个三肽以及其间的0到4个残基。对每个肽组合在反应性（寡）肽序列中的频率进行排序，并通过如下程序选择相关的表位模式：首先选择频率最高的组合覆盖的反应性肽，并将其从反应性肽组中分离。接着选择频率次高的组合覆盖的反应性肽，并将其从剩余的组中分开。重复这个程序直至建立覆盖全部反应性肽的组合。

预测表位

SEQ ID NO:1的三维结构描述于Betzel,C.等:Journal of MolecularBiology223427页(1992)中的"Crystal structure of the alkaline proteinaseSavinase from Bacillus lentus at1.4A resolution"。

以氨基酸标准值的百分数用DSSP程序衡量SEQ ID NO:1中每个氨基酸的表面接近性（参阅W.Kabsch和C.Sander,Biopolymers22(1983)2577-2637）。通过用DSSP程序分析螺旋构象的均一20肽中氨基酸的平均表面可接进性的成熟方法产生标准值。13种不同残基类型（考虑保守性替代物）的每一种的平均表面接近性如下：

使用如上述鉴定的表位模式通过计算机程序在SEQ ID NO:1的三维结构模型上预测表位：

(1)对于SEQ ID NO:1中的所有氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与表位模式中的第一个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，如20%。选择满足1（a）和1（b）的氨基酸。

(2)对于所有在

距离内的步骤1所选择的氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与模式中第二个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，如20%。选择满足2（a）和2（b）的氨基酸。

(3)对于所有在

距离内的步骤2所选择的氨基酸，检查其是否（a）氨基酸类型与模式中第三个氨基酸匹配和（b）表面接近性大于或等于选定的阈值，如20%。选择满足3（a）和3（b）的氨基酸。

(4)对表位模式中的所有氨基酸重复步骤3。

另外，任意两个表位残基间的距离限制设定为

以每个以下表面接近性的设定值对所有表位模式实施该程序：30%、40%、50%、60%、70%和80%。按此方法在SEQ ID NO:1的三维结构中发现的匹配的表位模式被预测为表位。

最后，对于七个溶剂接近性设定中的每一个，产生SEQ ID NO:1的所有氨基酸的表，其中通过将其（中该溶剂设置下）在表位之一中出现的次数相加对每个氨基酸残基评分。此分数将指示修饰（替换、插入、缺失、糖基化或化学缀合）该氨基酸产生较低免疫原性的变体的可能性。然后可根据此分数对蛋白质中所有的氨基酸排序，选择分数最高的用于诱变。

通过研究评分在前10%的氨基酸的位置结合下述SEQ ID NO:1三维结构模型拓扑作图，可以鉴定相关的表位。

表位作图数据的拓扑分析

为得到实际表位的知识，通过形象化相关3D结构的作图数据来鉴定氨基酸连续碎片(coherent patches)。将≥5个连续氨基酸的片段（每个基序的最小长度）定义为潜在表位的构建块。对每个鉴定的片段，用SwissProt Pdb察看器(viewer)（http://www.ExPASy.com/）确定邻近的氨基酸。邻近经验性的定义为位于选定的氨基酸片段中任一氨基酸

距离以内。

应用上述工具已经可以在分子中定义了四个表位。它们是：

表位1:P52-N62、A98-S105、G127-E136、Y167、R170；

表位2:G127、P129、N155-S161、Y167、R170、S188、Y192-G195、N218、N261-L262；

表位3:A1-W6、P14-N18、T38-I44、Q59-N62、L75-I79、S87、N155、N204-N218；

表位4:N6、Q12、G157-S161、D181-N185、Y192-G195、T255-S265；

实施例2

文库构建

应用上文实施例1中概述的程序，可以通过诱变相应的核酸序列获得枯草杆菌酶变体，如Sambrook等(1989),《Molecular Cloning.A LaboratoryManual》,Cold Spring Harbour,NY)所述。

实施例3

枯草杆菌酶变体的克隆和表达

通过使用含有所需突变的寡聚物的PCR所产生的DNA片段的常规克隆（Sambrook等,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》,第二版.,ColdSpring Harbor,1989）产生含有特定的插入/缺失/替换的本发明变体。

模版质粒DNA可以是含有SEQ ID NO:1酶的变体的pSX222或其类似物。通过对构建变体的寡聚物定向诱变引入突变。

将变体转化进大肠杆菌。通过限制性内切核酸酶消化、纯化DNA片段、连接、转化枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，将从这些转化体的过夜培养物纯化的DNA转化进枯草芽孢杆菌。如Dubnau等,1971,J.MoI.Biol.56,209-221页所述进行枯草芽孢杆菌转化。

定向诱变以在特定区域引入突变：

进行定向诱变的总体策略为：

对应于突变位点两侧的DNA序列合成诱变引物（寡核苷酸），由定义插入/缺失/替换的DNA碱基对分开。

接着将得到的诱变引物用于具有修饰的质粒pSX222的PCR反应。纯化得到的PCR片段并在第二轮PCR反应中延伸，纯化得到的PCR产物并在第三轮PCR反应中延伸，然后用内切核酸酶消化并克隆进大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭质粒pSX222。在正常条件下进行PCR反应。通过熟知的技术将质粒DNA转化进大肠杆菌中，并对一个大肠杆菌菌落测序以证实设计的突变。

发酵

将含有100ml BPX培养基的500ml锥形瓶置于旋转摇床（300r.p.m）中，在37℃发酵5天以产生枯草杆菌酶。

接着，为产生如2升培养液，同时发酵20个锥形瓶。

培养基：

BPX培养基组成（每升）

马铃薯淀粉 100g

大麦粉 50g

大豆粉 20g

Na₂HPO₄×12H₂O 9g

Pluronic 0.1g

酪蛋白酸钠 10g

用α淀粉酶将培养基中的淀粉液化，通过在120℃加热45分钟灭菌培养基。灭菌后，通过加入NaHCO₃至0.1M将培养基的pH调整至9。

实施例4

枯草杆菌酶变体的纯化

该过程涉及到对用于在芽孢杆菌宿主细胞中产生本发明枯草杆菌酶的2升规模发酵物进行纯化。

用1升的烧杯于5000转／分钟离心约1.6升发酵肉汤35分钟。用10%醋酸将上清调节至pH6.5，并通过Seitz Supra S100过滤板过滤。

用配备有Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF单元浓缩滤液至约400ml。离心并过滤该UF浓缩物，然后室温下吸附于pH7的杆菌肽亲和柱上。使用pH调节至7的25%异丙醇和1M氯化钠（在具有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液中）将蛋白酶从该杆菌肽柱上室温洗脱下来。

合并来自Sephadex G25柱的具蛋白酶活性的级分，并加至用pH调节至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的150ml CM Sepharose CL6B阳离子交换柱（直径为5cm）上。

使用上述构建和发酵技术和上文的分离方法产生并分离了本发明的新枯草杆菌酶。

在纯化表1列出的本发明枯草杆菌酶时应用此方法。

在纯化表2列出的本发明枯草杆菌酶时应用WO03/037914（NovozymesA/S）所述的方法。

实施例5

竞争性ELISA

用适当的剂量或剂量范围的野生型变应原将免疫平板（Nunc Maxisorb;Nunc）包被过夜。然后用含有0.05%Tween20的磷酸缓冲盐溶液（PBST）彻底洗涤平板，用含有2%脱脂奶粉（SMP）的PBS封闭剩余的结合位点。以一定的剂量范围将重组竞争者蛋白酶多肽稀释在含有0.5%SMP、0.05%Tween20的PBS中，并与一般以2000-10000倍稀释于同一缓冲液的抗原特异性兔多克隆抗体混合。在每个孔中加入混合物并在温和搅拌下以20℃孵育2小时。

用PBST彻底洗涤之后，通过与抗兔抗体（DAKO）和偶联辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体连续孵育检测变应原-IgG复合物。通过以下步骤测定酶活性：加入TMB Plus（Kem-En-Tec）作为底物、用等体积的0.2M H₂SO₄中止反应并在ELISA读板器中测定450nm处的吸光度（OD450）来检测显色。如果抗原特异性兔抗体与溶液中的蛋白酶多肽结合，将会降低其与结合在平板上的野生型多肽的结合，从而降低OD450。

对大量的变体应用了以上方法。通过竞争性ELISA选择目的蛋白酶变体基于：

1.和与平板结合的带有*99aE插入的SEQ ID NO:1蛋白质相比，在竞争后变体的抗体残余结合（%）具有提高的量，和

2.IC50%（IC：抑制浓度）转移到较高或较低的浓度，反映了结合亲和力的差异。

在纯化或微量纯化后评估变体。

残余结合（%）是在最高竞争者浓度测定的OD450和在无竞争者时测定的OD450的比值。以亲本蛋白质作为竞争者的残余结合一般为0%。变体一般使残余结合向100%移动。

一般以与亲本蛋白质本身相比，达到对亲本蛋白质抗体结合的50%抑制时所需变体数量提高或降低的X倍来表示结合亲和力的差异。本发明人惊奇地观察到，变体与抗亲本蛋白质特异性抗体较高的亲和力和在动物中变应原潜力的降低有极高的相关性。对显示＞50%残余结合的变体不能确定结合亲和力的差异。

纯化的蛋白酶变体的竞争性ELISA

表1：纯化的蛋白酶变体的评估

上文表1中所使用缩写的释义：

n.m：不可测量；n.d.：未测定。

“>REF.”表示洗涤性能高于参照酶。

“<REF.”表示洗涤性能低于参照酶。

“同REF”表示洗涤性能与参照酶相同。

参照酶是带有*99aE插入的SEQ ID NO:1所公开的酶。

接着将以上全部候选者按照实施例6所述方法评估了洗涤性能。

洗涤性能评估的结果显示于表1。

微量纯化的蛋白酶变体的竞争性ELISA

微量纯化了大量变体，在微量纯化后评估了残余结合和结合亲和力。

表2：微量纯化的蛋白酶变体的评估

n.m.：不可测量

实施例6

测试变体的洗涤性能

洗涤条件：温度30℃，洗涤时间14分钟，水硬度6°dH，洗涤剂浓度1.5g/l（酶浓度为5、10和30nM）。用带有*99aE插入的SEQ ID NO:1酶作为基准酶。

洗涤剂为商品洗涤剂，通过制成洗涤剂溶液并在微波炉中在85℃加热5分钟失活。

PH保持洗涤剂溶液中原样未调整。

通过在milli-Q水中加入CaCI₂*2H₂O、MgCI₂*6H₂O、NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-"=2:1:6)调整水硬度。

测试材料为用血/乳/碳黑（EMPA117,可得自EMPA testmaterials,Móvenstrasse12,CH-9015St.Gallen）污损的聚酯/棉样品。

洗涤后使用J&M Tidas MMS分光光度计测量460nm处的反射率（R）。按照生产商的程序进行测量。

R_变体：用变体洗涤的测试材料的反射率；

R_空白：不用酶洗涤的测试材料的反射率；

δ反射率：R_变体-R_空白

δ反射率越高则洗涤性能越好。以5nM酶剂量计算δ反射率。

实施例7

上皮细胞测定

通过用酶变体刺激人气升上皮细胞体外验证降低的变应原性。通过夹层ELISA测量应答于酶接触而分泌到孔中培养基里的M-CSF的存在。比较M-CSF应答于酶变体和参照蛋白质的剂量应答曲线（见表3）。发现具有降低的变应原性和协助的变体需要更高的剂量以引发相当的细胞因子应答。

该研究中的参照蛋白质为带有*99aE插入的SEQ ID NO:1酶。图3显示对SEQ ID NO:1和带有*99aE插入的SEQ ID NO:1酶的应答曲线。该图清楚的表明，与本实施例的参照酶相比显示降低的M-CSF产生的蛋白质与SEQID NO:1相比也显示降低的M-CSF产生。

细胞培养物质

上皮细胞和细胞生长培养基：

来自人肺癌的人II型肺泡细胞系A549购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。在补充了0.5%Ultroser G（BioSepra）的含L-谷氨酰胺、15MMHEPES,10.000IE青霉素/10.000μg/ml链霉素(GIBCO Invitrogen)的Dulbecco’s MEM/MUT混合F12（DMEM/F12）培养基中培养A549细胞。此培养基称为细胞培养基。

在组织培养瓶内的细胞培养基中培养A549细胞（37℃,5%CO2和100%湿度）。在加入细胞前，在室温下用2%Ultroser G包被组织培养瓶。孵育10分钟后，移去Ultroser G，将细胞培养基中的细胞置入瓶中，并孵育7－10天。每隔一天更换培养基。当细胞达到70-80%单层汇合时，将其传代到新的用2%Ultroser G包被的组织培养瓶中。从组织培养瓶中去除细胞培养基，并用不含钙和镁的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO)漂洗附着的A549细胞。去除HBSS并加入1x胰蛋白酶EDTA溶液，在37℃孵育10分钟（或直至细胞脱壁）。加入新的细胞培养基，吹吸并将含有脱壁细胞的培养基分派到新的用2%Ultroser G包被的组织培养瓶中，或者接种到气升人细胞刺激测定中的用1%Ultroser G包被的0.4μm聚碳酸酯膜（插片）（Nunc）上。用台盼蓝染色分析细胞成活力，发现在75-95%之间。使用80-95代之间的细胞。

人气升上皮细胞培养物

将25mm聚碳酸酯组织培养插片置于组织培养平板的孔中。在室温下将聚碳酸酯组织培养片用1%Ultroser G包被10分钟。孵育10分钟后，去除Ultroser G。将1.5ml1.33×10⁵个细胞/ml的细胞培养基转移到聚碳酸酯组织培养片上并在孔中加入1.5ml细胞培养基。将细胞在插片中培养10天，每隔一天在插片和孔中加入新鲜的细胞培养基。在第7天将细胞气升并产生液气界面。这是通过从插片和孔中去除培养基进行。然后在孔中加入新鲜细胞培养基并将气升细胞培养物再培养三天。在第10天，在孔中加入新鲜细胞培养基，在插片上（细胞上面）加入150μl含提高浓度的酶的细胞培养基。酶孵育4小时后，收获孔中（细胞下面）的细胞培养基并储存于-20℃直至用细胞因子ELISA分析。去除细胞培养基后，用AlamarBlue测定（SeroTec）测量细胞成活力。将聚碳酸酯插片剪到孔中，并在每个孔中加入1ml新鲜细胞培养基和125μl AlamarBlue，并在5%CO2中于37℃孵育4小时。接着荧光测定AlarmarBlue还原，并计算每个剂量的每种测试酶变体的细胞成活力（成活力%＝（有酶的信号/只有培养基的信号）×100%）。发现90-110%的成活力是可接受的。

细胞因子ELISA

使用夹层ELISA测量应答于酶接触而分泌到细胞培养基中的细胞因子M-CSF的存在。

使用细胞上皮测定在所选的变体上得到了以下数据：

表3：人气升上皮细胞培养物应答于酶变体刺激的M-CSF分泌

^a用参照蛋白质将不同实验中应答于酶刺激的M-CSF产生标准化。本实施例中参照蛋白质为带有*99aE插入的SEQ ID NO:1。

表3公开的数据显示，5P和10P两个变体与参照酶相比具有降低的变应原性。

实施例8

测试SEQ ID NO:1变体在体内降低的变应原性（MINT测定）

小鼠鼻内（MINT）模型（Robinson等，Fund.Appl.Toxicol.34，第15－24页，1996年）。

在实验的第一天和第三天用蛋白质对小鼠进行鼻内施药，随后每周给药，持续5周。收集开始给药后第15、31和45天的血液样品。随后分析IgG1（第15天）或IgE（第31和45天）水平。

将变体5P（l79T+*99aE+Q191E）和10P（*99aE+G195P+T260L）（均失活）与SEQ ID NO:1（在0.9%NaCl中）比较。

平均效价示于图1：

IgG1和IgE效价表示为给出阳性ELISA读数的最高稀释度的倒数（转换成log2）。如果读数高于阴性对照的平均OD值＋2x标准差，此读数被认为是阳性的。每个剂量水平用了6只小鼠且结果表示为组平均效价。

从图1可以得出结论，与基准蛋白质SEQ ID NO:1相比，变体5P（l79T+*99aE+Q191E）和10P（*99aE+G195P+T260L）引发抗原特异性IgG1和IgE抗体产生的潜力要低得多。

实施例9

测试枯草杆菌酶变体在自动洗盘机（ADW）中的洗涤性能

使用标准条件测试家用洗盘组合物中的本发明枯草杆菌酶变体在原尺寸ADW中的洗涤性能。所用污渍为在铁盘上的卵/乳混合物。此外还加入了含有多种食物的碴质。

实例：

洗涤剂：商品或模式洗涤剂

洗涤剂剂量 5.0g/l

pH 原样

水硬度： 3°dH到21°dH

温度： 45℃到65℃

酶浓度： 10nM到230nM，基于机器中洗涤用水的总体积

测试方法：下述铁盘上的卵/乳或卵黄污渍。

机器： Bosch或其他市售机器。

洗涤程序：

使用自来水；应用以下步骤：

步骤	时间（秒）	温度
			主洗涤	1200¹⁾	50℃²⁾
漂洗	300¹⁾	39℃²⁾
			干燥	1530	65℃

1）在标明的时间段内加热自来水。

2）加热自来水后的终温度。

用于原尺寸ADW测试的卵/乳污损

材料：

220ml全脂乳

15个中等大小的卵

直径18cm的铁盘。

在微波炉中将洗盘组合物在85℃加热5分钟，以失活组合物中的酶。

污损铁盘：

在Braun UK20厨房机中将220ml全脂乳与15个生卵混合2分钟。过滤后，将铁盘浸入混合物中污损。

以竖立位置将盘在室温下干燥过夜。将干燥的盘在120℃加热45分钟以使表面的蛋白质变性。

用于原尺寸ADW测试的卵黄污损

材料:

3dL巴氏消毒的卵黄；

直径18cm的铁盘。

污损铁盘：

在天平上称重铁盘，给出3位小数。

将约3dL巴氏消毒的卵黄彻底混合并用厨房滤网过滤。

使用如油漆滚将卵黄液以薄层涂布在盘上。进行两次（之间不干燥，并且第二次业蘸取卵黄）。得到的卵黄薄层应为约1g。

在室温下使盘至少晾干4小时。

将污损的盘和架子在煮沸除去矿物质的水中浸入精确的30秒。

在室温下使盘晾干30分钟。

室温干燥后，将盘在炉中80℃干燥30分钟。

使盘晾至室温约30-60分钟，然后再次称重。

洗涤并室温干燥后，使盘在炉中80℃干燥30分钟。

晾至室温30-60分钟后，再次称重盘。

ADW实验

对于每个实验，按照上文列出的条件洗涤10个污损的盘。

除了污损的盘以外，用10个瓷盘、4个玻璃杯、4个茶杯和16个刀叉填满机器。此外，向机器中加入50g碴浆(ballast slurry)，碴浆的组成如下：

制备3000g，称出以下组分：

1.低温溶解人造黄油、猪油和油炸油。之后在充分搅拌下加入滤过的肉汤粉，冷却到40℃。

2.混合菜籽油和卵。

3.将番茄酱和芥末加入油/卵混合物中并混合5分钟。

4.将1）产生的（冷却的）脂肪/肉汤缓慢加入3）中产生的混合物中，再混合5分钟。

5.将双脂乳和全脂乳加入混合物，混合5分钟。

6.加入剩余的面粉和粉末（表中步骤5）。将碴浆混合成均匀混合物。

7.将碴浆称出50g的部分。

卵/乳的测量和计算

使用Minolta Chroma Meter（型号:CR-300）在盘上六个不同的位置测量光反射值（R值）。在干净盘（R_干净）、加热后的污损盘（R_污）和洗涤后的盘（R_洗后）上进行测量。

根据下式计算除去的蛋白质膜（%RPF）：

%RPF＝100%×（R_洗后－R_污）/（R_干净－R_污）

卵黄的测量和计算

性能数据来自干净、污损和洗涤后铁盘的重量测量。性能计算为：

数据分析

将%RPF调整为加入的mg酶蛋白的函数。

通过写成下式的四参数对数模型调整数据：

F(z)=Y₀+V_max*C^λ/(K_s ^λ+C^λ)

其中F(z)是以Y₀截距计算的应答，Y₀+V_max为最大值，C是酶剂量，Ks是半饱和值。λ是陡度参数，在Michaelis-Menten模型中是1，但由于我们允许调整S形曲线，因此在本文中可以等于或不等于1。

将每个曲线调整与参照酶的性能进行比较。

Claims

2.根据权利要求1的变体，其中所述突变之一是在位置99之后插入谷氨酸。

3.根据权利要求2的变体，其中表位区1到4以外的突变发生在选自由位置22、141、191和247组成的列表的一个或多个位置。

4.根据权利要求3的变体，其中

a.当替换发生在位置22时，用来替换的氨基酸为丙氨酸；

c.当替换发生在位置191时，用来替换的氨基酸为谷氨酸；

d.当替换发生在位置247时，用来替换的氨基酸为谷氨酰胺。

5.根据权利要求1的变体，其中当替换发生在表位区1时，替换发生在位置57、58和136中的一个或多个位置，其中

a.当替换发生在位置57时，用来替换的氨基酸为脯氨酸；

b.当替换发生在位置58时，用来替换的氨基酸为丙氨酸；

6.根据权利要求1的变体，其中所述变体选自S57P+*99aE+R247Q和*99aE+A158V和*99aE+E136G和*99aE+E136K和l79T+*99aE+Q191E和*99aE+S141N+S156D和T58A+*99aE+S156N和*99aE+S141G+S156N+Q191E和S78P+*99aE+N185S+Q206L和*99aE+G195P+T260L和*99aE+G160S+G211S+T260N和*99aE+G195D+G211N+T260L和*99aE+G160S+G195P+G211S+T260N和*99aE+A158N+S161D和*99aE+S259N+T260I和*99aE+S259N和*99aE+S259R和T22A+*99aE+G160N+T260L和*99aE+G160DG+195P+G211P+T260N和*99aE+G160S+G211D+T260L。

7.编码前述任一权利要求的枯草杆菌酶变体的DNA序列。

8.含有权利要求7的DNA序列的载体。

9.含有权利要求7的载体的宿主细胞。

10.含有根据权利要求16中任一项的枯草杆菌酶变体的组合物。